JP2024535445A - オフターゲット効果を回避するための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

マイクロＲＮＡを標的とする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、修飾オリゴヌクレオチドがオフターゲット効果を回避するように設計された、化合物が本明細書に提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月８日に出願された米国仮出願第６３／２５３，９１７号の優先権の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

マイクロＲＮＡ活性の阻害のための組成物及び方法が本明細書に提供される。

ＲＮＡ機能の治療的調節のための方法は、ワトソン・クリック塩基対合によりＲＮＡ標的と結合し、標的と結合したら、その機能を調節するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を用いることが多い。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに所望の薬物動態及び薬力学的特性を付与するために化学修飾される。修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡと結合し、ＲＮＡの分解を促進することなくその機能に干渉することを含む機構（例えば、立体障害）、ならびにリボヌクレアーゼＨまたはアルゴノート２などの酵素の作用により修飾オリゴヌクレオチドの結合後にＲＮＡの分解を促進する機構を含む、様々な機構により標的ＲＮＡを調節することができる。修飾オリゴヌクレオチドの標的として、メッセンジャーＲＮＡ、プレメッセンジャーＲＮＡ、及び非コードＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡを含む、多数の種類のＲＮＡを選択することができる。

「成熟マイクロＲＮＡ」としても知られるマイクロＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）は小さく（約１８～２４ヌクレオチド長）、植物及び動物のゲノムにコードされている非コードＲＮＡ分子である。特定の例では、高度に保存された内因的に発現するマイクロＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に結合することによって遺伝子の発現を調節する。植物及び動物において、１０００を超える異なるマイクロＲＮＡが特定されている。特定の成熟マイクロＲＮＡは、多くの場合、数百ヌクレオチド長である、長い内因性の一次マイクロＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ－マイクロＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉｒ、ｐｒｉ－ｍｉＲ、またはｐｒｉ－ｐｒｅ－マイクロＲＮＡとしても知られている）に由来すると考えられている（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００２，２１（１７），４６６３－４６７０）。

実施形態１．修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、修飾オリゴヌクレオチドが、５’～３’の方向に以下の構造：
（Ｎ）_ｐ－（Ｎ”）－（Ｎ’）_ｑ
を有し、
ｐが、７～２４であり、
ｑが、０または１であり、
（Ｎ）_ｐの各Ｎが、独立して、修飾糖部分または非修飾糖部分を含み、（Ｎ）_ｐの核酸塩基配列が、マイクロＲＮＡの等長部分に相補的であり、（ｉ）マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、（ｉｉ）マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、あるいは（ｉｉｉ）マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、ウラシル及び／またはシトシン核酸塩基であり、マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、
Ｎ”が、修飾糖部分または非修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、Ｎ”の核酸塩基が、マイクロＲＮＡの位置２の反対側にあり、
ｑが１である場合、Ｎ’が、修飾糖部分または非修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、Ｎ’の核酸塩基が、マイクロＲＮＡの位置１の反対側にあり、
ｑが０である場合、Ｎ”の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さず、
ｑが１である場合、Ｎ’及びＮ”の少なくとも１つの核酸塩基が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、
化合物、または薬学的に許容されるその塩。
実施形態２．マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、ｑが１であり、Ｎ’が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、実施形態１に記載の化合物。
実施形態３．マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、実施形態１または２に記載の化合物。
実施形態４．マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、実施形態１または２に記載の化合物。
実施形態５．ｑが０である、実施形態３または実施形態４に記載の化合物。
実施形態６．マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、ｑが１であり、Ｎ’が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、実施形態１に記載の化合物。
実施形態７．マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、実施形態１または６に記載の化合物。
実施形態８．マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、実施形態１または６に記載の化合物。
実施形態９．ｑが０である、実施形態７または実施形態８に記載の化合物。
実施形態１０．Ｎ”の核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さないプリン核酸塩基である、実施形態１、３～５、及び７～９のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１１．Ｎ”の核酸塩基が、アデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及びイソグアノシンから選択される、実施形態１０に記載の化合物。
実施形態１２．Ｎ”の糖部分が、２’－Ｏ－メチル糖ではない、実施形態１～１１のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１３．Ｎ”の糖部分が、２’－Ｏ－メトキシエチル糖またはＳ－ｃＥｔ糖である、実施形態１～１１のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１４．Ｎ’の核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さないプリン核酸塩基である、実施形態１～４、６～８、及び１０～１３のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１５．Ｎ’の核酸塩基が、アデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及びイソグアノシンから選択される、実施形態１４に記載の化合物。
実施形態１６．Ｎ’の糖部分が、２’－Ｏ－メチル糖ではない、実施形態１～４、６～８、及び１０～１５のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１７．Ｎ’の糖部分が、２’－Ｏ－メトキシエチル糖またはＳ－ｃＥｔ糖である、実施形態１～４、６～８、及び１０～１５のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１８．少なくとも１つのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、実施形態１～１７のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態１９．各ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、実施形態１８に記載の化合物。
実施形態２０．ｐが、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４である、実施形態１～１９のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態２１．修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、マイクロＲＮＡの核酸塩基配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態２２．化合物が、修飾オリゴヌクレオチドからなる、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態２３．薬学的に許容される塩が、ナトリウム塩である、実施形態１～２２のいずれか１項に記載の化合物。
実施形態２４．実施形態１～２３のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
実施形態２５．薬学的に許容される希釈剤が、水溶液である、実施形態２４に記載の薬学的組成物。
実施形態２６．水溶液が、生理食塩水である、実施形態２５に記載の薬学的組成物。
実施形態２７．凍結乾燥組成物である、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
実施形態２８．生理食塩水中の実施形態１～２３のいずれか１項に記載の化合物から本質的になる、薬学的組成物。
実施形態２９．細胞内のマイクロＲＮＡの活性を阻害するための方法であって、細胞を、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、方法。
実施形態３０．対象におけるマイクロＲＮＡの活性を阻害するための方法であって、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の化合物、または実施形態２４～２８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
実施形態３１．対象が、マイクロＲＮＡに関連する疾患を有する、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２．治療有効量の化合物を投与することを含む、実施形態３０または３１に記載の方法。
実施形態３３．対象が、ヒト対象である、実施形態３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
実施形態３４．療法に使用するための、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の化合物、または実施形態２７～２８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。

プリン核酸塩基構造。 Ａは、ＰＫＤのＰｋｄ２－ＫＯモデルにおけるＲＧ－ＮＧ－１０１５の効力。腎臓対体重比に対する治療の影響。Ｂは、ＰＫＤのＰｋｄ１－Ｆ／ＲＣモデルにおけるＲＧ－ＮＧ－１０１５の効力。血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルに対する治療の影響。Ｃは、ＰＫＤのＰｋｄ１－Ｆ／ＲＣモデルにおけるＲＧ－ＮＧ－１０１５の効力。血中クレアチニンレベルに対する治療の影響。 ＲＧ－ＮＧ－１００１、ＲＧＬＳ４３２６、及びＲＧ－ＮＧ－１０１７の最大耐用量（ＭＴＤ）試験及び比較用量評価。６～７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、様々な用量レベルの、ＲＧ－ＮＧ－１００１及びＲＧＬＳ４３２６（ＡＭＰＡ－Ｒを阻害する抗ｍｉＲ－１７オリゴ）及びＲＧ－ＮＧ－１０１７（ＡＭＰＡ－Ｒを阻害しない抗ｍｉＲ－１７オリゴ、ＲＧ－ＮＧ－１０１７）の単回脳室内（ＩＣＶ）注射を４μＬ体積で投与し、７日間監視した。マウスの死亡率は、異なる投与量での３つの異なる化合物について示される。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。特別な定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医化学及び製薬化学に関連して用いられる命名法、ならびにそれらの手順及び技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。本明細書の用語に複数の定義がある場合は、本項の定義が優先される。標準的な技法が、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化及び送達、ならびに患者の治療のために使用され得る。特定のそのような技法及び手順は、例えば、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９９４、及び「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０に見ることができ、これは、任意の目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。許容される場合、本明細書の開示全体を通して参照されるすべての特許、特許出願、公開出願及び刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫシーケンス、ウェブサイト、ならびに他の公開された資料は、特に明記しない限り、それらの全体が参照により組み込まれる。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変わる可能性があり、インターネット上の特定の情報は変わる可能性があることが理解されるが、同等の情報は、インターネットを検索することによって見つけることができる。それらへの参照は、そのような情報の入手可能性と一般への普及を証明するものである。

本発明の組成物及び方法を開示及び記載する前に、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、限定的であることを意図するものではないことを理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上、別途明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含むことに留意されなければならない。

定義
「対象」とは、処置または療法のために選択されたヒトまたは非ヒトの動物を意味する。

「それを必要としている対象」とは、療法または治療を必要としていると特定された対象を意味する。

「有することが疑われる対象」とは、疾患の１つ以上の臨床的指標を呈する対象を意味する。

「投与すること」とは、対象に医薬品または組成物を提供することを意味し、限定されないが、医療専門家による投与及び自己投与を含む。

「非経口投与」とは、注入または注射を介する投与を意味する。
非経口投与としては、限定されないが、皮下投与、静脈内投与、及び筋肉内投与が挙げられる。

「皮下投与」とは、皮膚の直下への投与を意味する。

「静脈内投与」とは、静脈内への投与を意味する。

「同時に投与される」とは、両方の薬理学的効果が同時に患者に現れる、任意の方法での２つ以上の薬剤の共投与を指す。同時投与は、両方の薬剤が、単一の薬学的組成物で、同じ剤形で、または同じ投与経路によって投与されることを必要としない。両方の薬剤の効果は、同時にそれらが現れる必要はない。効果は、ある期間重なることのみを必要とし、同一の広がりを有する必要はない。

「期間」とは、活性または事象が継続している期間を意味する。特定の実施形態では、治療期間とは、ある用量の医薬品または薬学的組成物が投与される期間である。

「療法」とは、疾患の治療方法を意味する。特定の実施形態では、療法としては、疾患を有する対象に１つ以上の医薬品を投与することが含まれるが、これに限定されない。

「治療する」とは、疾患の少なくとも１つの指標の緩和のために使用される１つ以上の特定の手順を適用することを意味する。特定の実施形態では、特定の手順は、１つ以上の医薬品を投与することである。特定の実施形態では、ＰＫＤの治療としては、これらに限定されないが、総腎体積の減少、腎機能の改善、高血圧の減少、及び／または腎臓痛の減少が含まれる。

「改善する」とは、状態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度が低下することを意味する。特定の実施形態では、改善は、状態または疾患の１つ以上の指標の進行を遅延させることまたは減速させることを含む。指標の重症度は、当業者に既知である主観的尺度または客観的尺度によって決定され得る。

「発症のリスクがある」とは、対象が状態または疾患を発症する素因がある状態を意味する。特定の実施形態では、状態または疾患を発症するリスクのある対象は、状態または疾患の１つ以上の症状を呈するが、状態または疾患と診断されるのに十分な数の症状を呈さない。特定の実施形態では、状態または疾患を発症するリスクのある対象は、状態または疾患の１つ以上の症状を呈するが、状態または疾患と診断される必要がある程度は低い。

「発生を予防する」とは、疾患または状態を発症するリスクのある対象において、状態または疾患の発症を予防することを意味する。特定の実施形態では、疾患または状態を発症するリスクのある対象は、疾患または状態をすでに有する対象が受ける治療と同様の治療を受ける。

「発生を遅延させる」とは、疾患または状態を発症するリスクがある対象において、状態または疾患の発症を遅延させることを意味する。特定の実施形態では、疾患または状態を発症するリスクのある対象は、疾患または状態をすでに有する対象が受ける治療と同様の治療を受ける。

「用量」とは、単回投与で提供される医薬品の特定の量を意味する。特定の実施形態では、用量は、２回以上のボーラス、錠剤、または注射で投与され得る。例えば、皮下投与が所望される特定の実施形態では、所望の用量は、単回注射では容易に対応できない体積を必要とする。そのような実施形態では、２回以上の注射を使用して、所望の用量を達成し得る。特定の実施形態では、用量は、個体における注射部位反応を最小化するために、２回以上の注射で投与され得る。特定の実施形態では、用量は、緩徐な注入として投与される。

「投薬単位」とは、医薬品が提供される形態を意味する。特定の実施形態では、投薬単位は、凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。特定の実施形態では、投薬単位は、再構成されたオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。

「治療有効量」とは、対象に治療的利益をもたらす医薬品の量を指す。

「薬学的組成物」とは、個体への投与に好適な物質の混合物を意味し、医薬品を含む。例えば、薬学的組成物は、滅菌水溶液を含み得る。

「医薬品」とは、対象に投与される場合に治療的効果をもたらす物質を意味する。

「有効医薬成分」とは、所望の効果をもたらす薬学的組成物中の物質を意味する。

「薬学的に許容される塩」とは、本明細書に提供される化合物の生理学的及び薬学的に許容される塩、すなわち、化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ対象に投与される場合に望ましくない毒物学的効果を有しない塩を意味する。本明細書に提供される化合物の非限定的な例示的な薬学的に許容される塩としては、ナトリウム及びカリウムの塩形態が含まれる。本明細書で使用される場合、「化合物」、「オリゴヌクレオチド」、及び「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、特に明記しない限り、その薬学的に許容される塩を含む。

「生理食塩水」とは、塩化ナトリウムの水溶液を意味する。

「臓器機能の改善」とは、正常範囲に向けた臓器機能の変化を意味する。特定の実施形態では、臓器機能は、対象の血液または尿中に見出される分子を測定することによって評価される。特定の実施形態では、腎機能の改善は、血中尿素窒素の減少、タンパク尿の減少、アルブミン尿の減少などによって測定される。

「許容可能な安全性プロファイル」とは、臨床的に許容可能な範囲内にある副作用のパターンを意味する。

「副作用」とは、所望の効果以外の、治療に起因する生理学的応答を意味する。特定の実施形態では、副作用には、これらに限定されないが、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、及びミオパチーが含まれる。そのような副作用は、直接的または間接的に検出され得る。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベルの上昇は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。

本明細書で使用される場合、「血液」という用語は、血清及び血漿等の全血及び血液画分を包含する。

「抗ｍｉＲ」とは、マイクロＲＮＡに相補的な核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、抗ｍｉＲは、修飾オリゴヌクレオチドである。

「シード配列」とは、マイクロＲＮＡの５’末端から数えて、マイクロＲＮＡの核酸塩基２から７を意味する。

「標的核酸」とは、オリゴマー化合物がハイブリダイズするように設計される核酸を意味する。

「標的化」とは、標的核酸にハイブリダイズする核酸塩基配列の設計及び選択のプロセスを意味する。

「を標的とする」とは、標的核酸へのハイブリダイゼーションが可能になる核酸塩基配列を有することを意味する。

「変調」とは、機能、量、または活性の変動を意味する。特定の実施形態では、変調とは、機能、量、または活性の増加を意味する。特定の実施形態では、変調とは、機能、量、または活性の低下を意味する。

「発現」とは、遺伝子のコード化された情報が、細胞内に存在し、かつ細胞内で作動する構造に変換される任意の機能及びステップを意味する。

「核酸塩基配列」とは、オリゴマー化合物または核酸における隣接する核酸塩基の順序を意味し、典型的には、任意の糖、連結、及び／または核酸塩基の修飾とは関係なく、５’から３’の方向で列挙される。

「隣接する核酸塩基」とは、核酸内で互いに直接隣接する核酸塩基を意味する。

「核酸塩基相補性」とは、２つの核酸塩基が水素結合を介して非共有結合的に対合する能力を意味する。

「相補的」とは、１つの核酸が別の核酸またはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができることを意味する。特定の実施形態では、相補的とは、標的核酸にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。

「完全に相補的」とは、オリゴヌクレオチドの各核酸塩基が、標的核酸中の対応する各位置において、核酸塩基と対合できることを意味する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対して完全に相補的である（１００％相補的とも呼ばれる）。すなわち、オリゴヌクレオチドの各核酸塩基は、マイクロＲＮＡ内の対応する位置において、核酸塩基に対して相補的である。修飾オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに完全に相補的であり、かつマイクロＲＮＡの長さよりも短い複数の連結ヌクレオシドを有し得る。例えば、オリゴヌクレオチドの各核酸塩基がマイクロＲＮＡ中の対応する位置において核酸塩基に相補的である、１６個の連結ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに完全に相補的である。特定の実施形態では、各核酸塩基がマイクロＲＮＡステムループ配列の領域内の核酸塩基に相補性を有するオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡステムループ配列に完全に相補的である。

「パーセント相補性」とは、標的核酸の等長部分に相補的であるオリゴヌクレオチドの核酸塩基の割合を意味する。パーセント相補性は、標的核酸中の対応する位置において核酸塩基に相補的であるオリゴヌクレオチドの核酸塩基の数を、オリゴヌクレオチド中の核酸塩基の総数で割ることによって計算される。

「パーセント同一性」とは、第２の核酸中の対応する位置において核酸塩基と同一である第１の核酸中の核酸塩基の数を、第１の核酸中の核酸塩基の総数で割ったものを意味する。特定の実施形態では、第１の核酸は、マイクロＲＮＡであり、第２の核酸は、マイクロＲＮＡである。特定の実施形態では、第１の核酸は、オリゴヌクレオチドであり、第２の核酸は、オリゴヌクレオチドである。

「ハイブリダイズする」とは、核酸塩基の相補性によって起こる相補的な核酸のアニーリングを意味する。

「ミスマッチ」とは、第２の核酸の対応する位置において、核酸塩基とワトソンクリック対合することができない第１の核酸の核酸塩基を意味する。

核酸塩基配列の文脈における「同一」とは、糖、連結、及び／または核酸塩基修飾とは関係なく、かつ存在する任意のピリミジンのメチル化状態とは関係なく、同じ核酸塩基配列を有することを意味する。

「マイクロＲＮＡ」とは、長さが１８～２５核酸塩基である内因性非コードＲＮＡを意味し、酵素ダイサーによるプレマイクロＲＮＡの切断の産物である。成熟マイクロＲＮＡの例は、ｍｉＲＢａｓｅとして既知であるマイクロＲＮＡデータベースに見られる（ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡは、「ｍｉＲ」と略される。

「マイクロＲＮＡ調節転写物」とは、マイクロＲＮＡによって調節される転写物を意味する。

「シードマッチ配列」とは、シード配列に相補的であり、シード配列と同じ長さである核酸塩基配列を意味する。

「オリゴマー化合物」とは、複数の連結モノマーサブユニットを含む化合物を意味する。オリゴマー化合物としては、オリゴヌクレオチドが挙げられる。

「オリゴヌクレオチド」とは、各々が互いに独立して、修飾または非修飾であり得る、複数の連結ヌクレオシドを含む化合物を意味する。

「天然に存在するヌクレオシド間連結」とは、ヌクレオシド間の３’から５’へのホスホジエステル連結を意味する。

「天然糖」とは、ＤＮＡ（２’－Ｈ）またはＲＮＡ（２’－ＯＨ）に見られる糖を意味する。

「ヌクレオシド間連結」とは、隣接しているヌクレオシド間の共有結合を意味する。

「連結ヌクレオシド」とは、共有結合によって結合されたヌクレオシドを意味する。

「核酸塩基」とは、別の核酸塩基と非共有結合的に対合することができる複素環部分を意味する。

「ヌクレオシド」とは、糖部分に連結された核酸塩基を意味する。

「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合しているホスフェート基を有するヌクレオシドを意味する。

複数の連結ヌクレオシド「からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物」とは、特定の数の連結ヌクレオシドを有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を意味する。したがって、化合物は、追加の置換基またはコンジュゲートを含み得る。特に明記しない限り、修飾オリゴヌクレオチドは、相補鎖にハイブリダイズされず、化合物は、修飾オリゴヌクレオチドのものを超える任意の追加のヌクレオシドを含まない。

「修飾オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する末端、糖、核酸塩基、及び／またはヌクレオシド間連結と比較して１つ以上の修飾を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。修飾オリゴヌクレオチドは、非修飾ヌクレオシドを含み得る。

「修飾ヌクレオシド」とは、天然に存在するヌクレオシドからの任意の変化を有するヌクレオシドを意味する。修飾ヌクレオシドは、修飾糖及び非修飾核酸塩基を有し得る。修飾ヌクレオシドは、修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。修飾ヌクレオシドは、天然糖及び修飾核酸塩基を有し得る。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、二環式ヌクレオシドである。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、非二環式ヌクレオシドである。

「修飾ヌクレオシド間連結」とは、天然に存在するヌクレオシド間連結からの任意の変化を意味する。

「ホスホロチオエートヌクレオシド間連結」とは、非架橋原子のうちの１つが硫黄原子であるヌクレオシド間の連結を意味する。

「修飾糖部分」とは、天然糖からの置換及び／または任意の変化を意味する。

「非修飾核酸塩基」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡの天然に存在する複素環式塩基を意味し、プリンは、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）をベースとし、ピリミジンは、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）（５－メチルシトシンなど）、及びウラシル（Ｕ）をベースとする。

「５－メチルシトシン」とは、５位に付着しているメチル基を含むシトシンを意味する。

「非メチル化シトシン」とは、５位に付着しているメチル基を有しないシトシンを意味する。

「修飾核酸塩基」とは、非修飾核酸塩基ではない任意の核酸塩基を意味する。

「糖部分」とは、天然に存在するフラノシルまたは修飾糖部分を意味する。

「修飾糖部分」とは、置換糖部分または糖代理物を意味する。

「２’－Ｏ－メチル糖」または「２’－ＯＭｅ糖」とは、２’位にＯ－メチル修飾を有する糖を意味する。

「２’－Ｏ－メトキシエチル糖」または「２’－ＭＯＥ糖」とは、２’位にＯ－メトキシエチル修飾を有する糖を意味する。

「２’－フルオロ」または「２’－Ｆ」とは、２’位のフルオロ修飾を有する糖を意味する。

「二環式糖部分」とは、４～７員環の２個の原子を結合して第２の環を形成し、二環式構造をもたらす架橋を含む、４～７員環（限定されないが、フラノシルなど）を含む修飾糖部分を意味する。特定の実施形態では、４～７員環は、糖環である。特定の実施形態では、４～７員環は、フラノシルである。特定のそのような実施形態では、架橋は、フラノシルの２’－炭素と４’－炭素を結合する。非限定的な例示的な二環式糖部分としては、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥｔ、Ｓ－ｃＥｔ、及びＲ－ｃＥｔが挙げられる。

「ロックド核酸（ＬＮＡ）糖部分」とは、４’と２’フラノース環原子との間に（ＣＨ_２）－Ｏ架橋を含む置換糖部分を意味する。

「ＥＮＡ糖部分」とは、４’と２’フラノース環原子との間に（ＣＨ_２）_２－Ｏ架橋を含む置換糖部分を意味する。

「拘束エチル（ｃＥｔ）糖部分」とは、４’と２’フラノース環原子との間にＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ架橋を含む置換糖部分を意味する。特定の実施形態では、ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ架橋は、Ｓ方向に拘束されている。特定の実施形態では、ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏは、Ｒ方向に拘束されている。

「Ｓ－ｃＥｔ糖部分」とは、４’と２’フラノース環原子との間にＳ拘束ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ架橋を含む置換糖部分を意味する。

「Ｒ－ｃＥｔ糖部分」とは、４’と２’フラノース環原子との間にＲ拘束ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ架橋を含む置換糖部分を意味する。

「２’－Ｏ－メチルヌクレオシド」とは、２’－Ｏ－メチル糖修飾を有する２’－修飾ヌクレオシドを意味する。

「２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシド」とは、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾を有する２’－修飾ヌクレオシドを意味する。２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドは、修飾または非修飾核酸塩基を含み得る。

「２’－フルオロヌクレオシド」とは、２’－フルオロ糖修飾を有する２’－修飾ヌクレオシドを意味する。２’－フルオロヌクレオシドは、修飾または非修飾核酸塩基を含み得る。

「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を有する２’－修飾ヌクレオシドを意味する。二環式ヌクレオシドは、修飾または非修飾核酸塩基を有し得る。

「ｃＥｔヌクレオシド」とは、ｃＥｔ糖部分を含むヌクレオシドを意味する。ｃＥｔヌクレオシドは、修飾または非修飾核酸塩基を含み得る。

「Ｓ－ｃＥｔヌクレオシド」とは、Ｓ－ｃＥｔ糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「Ｒ－ｃＥｔヌクレオシド」とは、Ｒ－ｃＥｔ糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「β－Ｄ－デオキシリボヌクレオシド」とは、天然に存在するＤＮＡヌクレオシドを意味する。

「β－Ｄ－リボヌクレオシド」とは、天然に存在するＲＮＡヌクレオシドを意味する。

「ＬＮＡヌクレオシド」とは、ＬＮＡ糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「ＥＮＡヌクレオシド」とは、ＥＮＡ糖部分を含むヌクレオシドを意味する。

「水素結合アクセプター」とは、共有された水素原子を供給しない水素結合の成分を意味する。

「水素結合ドナー」とは、水素結合の水素原子を供給する結合または分子を意味する。

概要
抗ｍｉＲ－１７化合物であるＲＧＬＳ４３２６は、最適な薬学的特性について、抗ｍｉＲ－１７オリゴヌクレオチドの化学的に多様で合理的に設計されたライブラリをスクリーニングすることによって発見された。ＲＧＬＳ４３２６は、腎臓及び収集管由来嚢胞に優先的に分布し、ｍｉＲ－１７を翻訳活性ポリソームから置換し、Ｐｋｄ１及びＰｋｄ２を含む複数のｍｉＲ－１７ ｍＲＮＡ標的を抑制解除する。重要なことに、ＲＧＬＳ４３２６は、皮下投与後のヒトインビトロＡＤＰＫＤモデル及び複数のＰＫＤマウスモデルにおける嚢胞成長を減弱する。常染色体優性多嚢胞性腎疾患（ＡＤＰＫＤ）を有する患者の治療のためのＲＧＬＳ４３２６の第１ｂ相臨床試験を、２０２０年１０月に開始した。

第１ｂ相臨床試験の開始に続いて、非臨床毒性試験は、マウスにおける高用量のＲＧＬＳ４３２６での異常な歩行、運動活動の低下、及び／または衰弱を含む、ＣＮＳ関連の所見を明らかにした。ＲＧＬＳ４３２６は、高速興奮性神経伝達を媒介する中枢神経系（ＣＮＳ）の興奮性シナプス上のグルタミン酸受容体及びイオンチャネルであるＡＭＰＡ受容体（ＡＭＰＡＲ）の拮抗剤であることが見出され、したがって、すべてのニューロンネットワークの重要な構成要素である。ＡＭＰＡ受容体の拮抗作用は、非臨床毒性モデルにおいて、高用量のＲＧＬＳ４３２６で観察されたＣＮＳ媒介所見を説明することができる。そのようなＣＮＳ関連の所見は、ヒト対象において観察されなかったが、それにもかかわらず、ＡＭＰＡ受容体の拮抗作用を回避することが好ましい。したがって、ＡＭＰＡ受容体に拮抗しないＲＧＬＳ４３２６に匹敵する物理化学的及び薬理学的特性を有する化合物を同定するために、抗ｍｉＲ－１７化合物のライブラリをスクリーニングした。マイクロＲＮＡ活性を阻害し、ＡＭＰＡ受容体の拮抗作用のオフターゲット効果も回避する特定の抗ｍｉＲ構造が特定された。そのような構造及びマイクロＲＮＡを阻害するためのその使用が本明細書に提供される。

化合物
マイクロＲＮＡに相補的であるように設計された修飾オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡのシトシン核酸塩基に相補的な位置にグアノシン核酸塩基を含み得る。以下の構造に示されるとおり、グアノシン核酸塩基は、標準的なワトソン・クリック塩基対合によりシトシン核酸塩基と対合する。

以下の構造に示されるとおり、グアノシン核酸塩基はまた、Ｇ－Ｕゆらぎ塩基対合によりウラシル核酸塩基とも対合することができる：

Ｇ－Ｕゆらぎ塩基対は、Ｇ－Ｃワトソン・クリック塩基対の熱力学的安定性と同様の熱力学的安定性を有する。したがって、マイクロＲＮＡに相補的であるように設計された修飾オリゴヌクレオチドは、ウラシル核酸塩基に相補的であるように配置されたグアノシン核酸塩基を含み得る。

多くのマイクロＲＮＡ配列は、マイクロＲＮＡの（５’末端から数えて）１番目及び／または２番目の位置にウラシルまたはシトシン核酸塩基を含む。これらのマイクロＲＮＡに相補的な修飾オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの１番目及び／または２番目の位置に相補的な位置にグアノシン核酸塩基を含み得る。本明細書に示されるとおり、マイクロＲＮＡに相補的な修飾オリゴヌクレオチドの３’末端にあるグアノシンは、ＡＭＰＡ受容体に拮抗するオフターゲット効果をもたらすことがあり、これが、ひいては、インビボにおける望ましくない副作用につながる場合もある。したがって、ＡＭＰＡ受容体の拮抗作用を回避するように設計された修飾オリゴヌクレオチド構造が本明細書に提供される。

プリン核酸塩基の原子は、以下：

の構造に示されるように、核酸塩基の標準的な番号付け規則に従って、１から９まで番号付けされる。

核酸塩基環原子に結合した原子または基は、それらが結合している環原子と同じ数を有する。

特定の核酸塩基、例えば、グアノシン及びイノシンは、６位に水素結合アクセプターを含有する。グアノシンの６位の水素結合アクセプターは、６位の窒素に結合した酸素である。イノシンの６位の水素結合アクセプターは、６位の窒素に結合した酸素である。

６位に水素結合アクセプターを有しないプリン核酸塩基としては、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、イソグアノシン、及びアデノシンが含まれるが、これらに限定されない。２，６－ジアミノプリン、イソグアノシン、及びアデノシンのそれぞれの６位に存在するＮＨ_２は、水素結合ドナーとして機能する。２－アミノプリンの６位の窒素は、水素結合ドナーとしても機能する。

修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、修飾オリゴヌクレオチドが、５’～３’の方向に以下の構造：
（Ｎ）_ｐ－（Ｎ”）－（Ｎ’）_ｑ
を有し、
ｐが、７～２４であり、ｑが、０または１であり、（Ｎ）_ｐの各Ｎが、独立して、修飾糖部分または非修飾糖部分を含み、（Ｎ）_ｐの核酸塩基配列が、マイクロＲＮＡの等長部分に相補的であり、（ｉ）マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、（ｉｉ）マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、あるいは（ｉｉｉ）マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、ウラシル及び／またはシトシン核酸塩基であり、マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、Ｎ”が、修飾糖部分または非修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、Ｎ”の核酸塩基が、マイクロＲＮＡの位置２の反対側にあり、ｑが１である場合、Ｎ’が、修飾糖部分または非修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、Ｎ’の核酸塩基が、マイクロＲＮＡの位置１の反対側にあり、ｑが０である場合、Ｎ”の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さず、ｑが１である場合、Ｎ’及びＮ”の少なくとも１つの核酸塩基が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、化合物、または薬学的に許容されるその塩。

いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、ｑが１であり、Ｎ’が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない。

いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない。

いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない。

いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、ｑが１であり、Ｎ’が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない。

いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない。

いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない。

いくつかの実施形態では、ｑが０である。

いくつかの実施形態では、Ｎ”の核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さないプリン核酸塩基である。

いくつかの実施形態では、Ｎ”の核酸塩基が、アデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及びイソグアノシンから選択される。

いくつかの実施形態では、Ｎ”の糖部分が、２’－Ｏ－メチル糖ではない。

いくつかの実施形態では、Ｎ”の糖部分が、２’－Ｏ－メトキシエチル糖またはＳ－ｃＥｔ糖である。

いくつかの実施形態では、Ｎ’の核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さないプリン核酸塩基である。

いくつかの実施形態では、Ｎ’の核酸塩基が、アデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及びイソグアノシンから選択される。

いくつかの実施形態では、Ｎ’の糖部分が、２’－Ｏ－メチル糖ではない。

いくつかの実施形態では、Ｎ’の糖部分が、２’－Ｏ－メトキシエチル糖またはＳ－ｃＥｔ糖である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの実施形態では、各ヌクレオシド間連結はホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

いくつかの実施形態では、ｐが、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４である。

いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、マイクロＲＮＡの核酸塩基配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。

いくつかの実施形態では、化合物が、修飾オリゴヌクレオチドからなる。

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される塩が、ナトリウム塩である。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提供される化合物から本質的になる。

いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩は、分子当たりのホスホロチオエート及び／またはホスホジエステル連結よりも少ないカチオン性対イオン（Ｎａ^＋など）を含む（すなわち、いくつかのホスホロチオエート及び／またはホスホジエステル連結は、プロトン化される）。いくつかの実施形態では、Ｎヌクレオチド長を有する修飾オリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩は、１分子当たりＮ個未満のカチオン性対イオン（Ｎａ^＋など）を含み、残りの連結はプロトン化されている。

本発明の特定の使用
細胞を、マイクロＲＮＡに相補的な核酸塩基配列を含む、本明細書に提供される化合物と接触させることを含む、細胞内の１つ以上のマイクロＲＮＡの活性を阻害するための方法が本明細書に提供される。

本明細書に提供される化合物または薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象における１つ以上のマイクロＲＮＡの活性を阻害するための方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、対象は、１つ以上のマイクロＲＮＡに関連する疾患を有する。いくつかの実施形態では、治療有効量の化合物が、対象に投与される。

本明細書に提供される実施形態のいずれかでは、対象が、ヒト対象である。

本明細書に記載される化合物のいずれかは、療法に使用するためのものであり得る。

本明細書に記載される修飾オリゴヌクレオチドのいずれかは、療法に使用するためのものであり得る。

本明細書に提供される化合物のいずれかは、薬剤の調製に使用するためのものであり得る。

本明細書に提供される修飾オリゴヌクレオチドのいずれかは、薬剤の調製に使用するためのものであり得る。

本明細書に提供される薬学的組成物のいずれかは、療法に使用するためのものであり得る。

特定の追加の療法
多嚢胞性腎疾患または本明細書に列挙される状態のいずれかに対する治療は、２つ以上の療法を含み得る。

特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の療法は、医薬品を含む。

特定の実施形態では、医薬品は、抗炎症剤を含む。特定の実施形態では、抗炎症剤は、ステロイド性抗炎症剤である。特定の実施形態では、ステロイド抗炎症剤は、コルチコステロイドである。特定の実施形態では、コルチコステロイドは、プレドニゾンである。特定の実施形態では、抗炎症剤は、非ステロイド性抗炎症薬である。特定の実施形態では、非ステロイド性抗炎症剤は、イブプロフェン、ＣＯＸ－Ｉ阻害剤、またはＣＯＸ－２阻害剤である。

特定の実施形態では、医薬品は、線維原性シグナルに対する１つ以上の応答をブロックする医薬品である。

特定の実施形態では、追加の療法は、低用量シクロホスファミド、チモスチムリン、ビタミン、及び栄養補助食品（例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、β－カロテン、亜鉛、セレン、グルタチオン、コエンザイムＱ－１０、及びエキナセアを含む抗酸化剤）、ならびにワクチン、例えば、抗原の多量体提示及びアジュバントを組み合わせたワクチン製剤を含む免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含む、体の免疫系を増強する医薬品であり得る。

特定の実施形態では、追加の療法は、本発明の１つ以上の薬学的組成物の副作用を治療または緩和するために選択される。そのような副作用としては、これらに限定されないが、注射部位反応、肝機能異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、及びミオパチーが含まれる。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼレベルの上昇は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。

特定のマイクロＲＮＡ核酸塩基配列
特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、シード配列に相補的な核酸塩基配列を含む、すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡの位置２～７に相補的なシードマッチ配列を含む。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、８～２６個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、８～１２個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１２～２６個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１５～２６個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１５～１９個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１５～１６個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１７～２３個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１９～２３個の連結ヌクレオシドからなる。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、８個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、９個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１０個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１１個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１２個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１３個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１４個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１５個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１６個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１７個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１８個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１９個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、２０個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、２１個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、２２個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、２３個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、２４個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、２５個の連結ヌクレオシドからなる。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、２６個の連結ヌクレオシドからなる。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが、１つ以上の５－メチルシトシンを含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各シトシンが、５－メチルシトシンを含む。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの連結ヌクレオシド数は、標的マイクロＲＮＡの長さよりも短い。修飾オリゴヌクレオチドは、標的マイクロＲＮＡの長さよりも短い連結ヌクレオシドの数を有し、修飾オリゴヌクレオチドの各核酸塩基は、標的マイクロＲＮＡの対応する位置で核酸塩基に相補的であり、標的マイクロＲＮＡ配列の領域に対して完全に相補的（１００％相補的とも呼ばれる）な核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドであると考えられる。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、９個の連結ヌクレオシドからなり、各核酸塩基はマイクロＲＮＡの対応する位置に相補的であり、マイクロＲＮＡに完全に相補的である。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、標的マイクロＲＮＡの核酸塩基配列に関して１つのミスマッチを有する核酸塩基配列を有する。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、標的マイクロＲＮＡの核酸塩基配列に関して２つのミスマッチを有する核酸塩基配列を有する。特定のそのような実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、標的マイクロＲＮＡの核酸塩基配列に関して２つ以下のミスマッチを有する核酸塩基配列を有する。特定のそのような実施形態では、ミスマッチ核酸塩基は、連続的である。特定のそのような実施形態では、ミスマッチ核酸塩基は、連続的でない。

本出願に添付される配列表は、必要に応じて、各核酸塩基配列を「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」のいずれかとして特定するが、実際には、それらの配列は、本明細書に指定される化学修飾の組み合わせによって修飾され得る。当業者は、配列表において、修飾オリゴヌクレオチドを説明するための「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」などの指定がいくらか恣意的であることを容易に理解するであろう。例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル糖部分及びチミン塩基を含むヌクレオシドを含む本明細書に提供される修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドが修飾されており、天然ＤＮＡヌクレオシドではない場合でも、配列表のＤＮＡ残基として記載され得る。

したがって、配列表に提供される核酸配列は、修飾核酸塩基を有するそのような核酸を含むがこれらに限定されない、天然または修飾ＲＮＡ及び／またはＤＮＡの任意の組み合わせを含有する核酸を包含することを意図する。さらなる例として、限定されないが、配列表の核酸塩基配列「ＡＴＣＧＡＴＣＧ」を有する修飾オリゴヌクレオチドは、修飾または非修飾にかかわらず、これらに限定されないが、配列「ＡＵＣＧＡＵＣＧ」を有するものなどのＲＮＡ塩基、ならびに「ＡＵＣＧＡＴＣＧ」などのいくつかのＤＮＡ塩基及びいくつかのＲＮＡ塩基を有するもの、ならびに^ｍｅＣが５－メチルシトシンを示す、「ＡＴ^ｍｅＣＧＡＵＣＧ」などの他の修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドを含むそのような化合物を含む任意のオリゴヌクレオチドを包含する。

特定の修飾
特定の実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖、及び／またはヌクレオシド間連結に対する１つ以上の修飾を含み得、したがって、修飾オリゴヌクレオチドであり得る。例えば、細胞取り込みの増強、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的に対する親和性の増強、及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの望ましい特性のために、非修飾形態よりも修飾核酸塩基、糖、及び／またはヌクレオシド間連結のほうが選択され得る。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。

特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。特定のそのような実施形態では、糖修飾ヌクレオシドは、天然もしくは修飾複素環式塩基部分をさらに含み得、及び／または天然もしくは修飾ヌクレオシド間連結を介して別のヌクレオシドに結合され得、及び／または糖修飾とは独立したさらなる修飾を含み得る。特定の実施形態では、糖修飾ヌクレオシドは、２’－修飾ヌクレオシドであり、糖環は、天然リボースまたは２’－デオキシ－リボース由来の２’炭素で修飾される。

特定の実施形態では、２’－修飾ヌクレオシドは、二環式糖部分を有する。特定のそのような実施形態では、二環式糖部分は、アルファ配置のＤ糖である。特定のそのような実施形態では、二環式糖部分は、ベータ配置のＤ糖である。特定のそのような実施形態では、二環式糖部分は、アルファ配置のＬ糖である。特定のそのような実施形態では、二環式糖部分は、ベータ配置のＬ糖である。

そのような二環式糖部分を含むヌクレオシドは、二環式ヌクレオシドまたはＢＮＡと称される。特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドには、以下に示すように、（Ａ）α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチルまたはｃＥｔとも称される）、（Ｇ）メチレン－チオ（４’－ＣＨ_２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－２’）ＢＮＡ、（Ｊ）ｃ－ＭＯＥ（４’－ＣＨ（ＣＨ_２－ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、及び（Ｋ）プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ_２）_３－２’）ＢＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

式中、Ｂｘは、核酸塩基部分であり、Ｒは独立して、Ｈ、保護基、またはＣ_１－Ｃ_１２アルキルである。

特定の実施形態では、２’－修飾ヌクレオシドは、Ｆ、ＯＣＦ_３、Ｏ－ＣＨ_３（「２’－ＯＭｅ」とも称される）、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３（「２’－Ｏ－メトキシエチル」または「２’－ＭＯＥ」とも称される）、２’－Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）_２、－Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、及びＯ－ＣＨ_２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３から選択される２’－置換基を含む。

特定の実施形態では、２’－修飾ヌクレオシドは、Ｆ、Ｏ－ＣＨ_３、及びＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３から選択される２’－置換基を含む。

特定の実施形態では、糖修飾ヌクレオシドは、４’－チオ修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態では、糖修飾ヌクレオシドは、４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシドである。４’－チオ修飾ヌクレオシドは、４’－Ｏが４’－Ｓで置換されたβ－Ｄリボヌクレオシドを有する。４’－チオ－２’－修飾ヌクレオシドは、２’置換基で置換された２’－ＯＨを有する４’チオ修飾ヌクレオシドである。好適な２’－置換基としては、２’－ＯＣＨ_３、２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、及び２’－Ｆが含まれる。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシド間修飾を含む。特定のそのような実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結は、修飾ヌクレオシド間連結である。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、リン原子を含む。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、５－ヒドロキシメチルシトシン、７－デアザグアニン、及び７－デアザアデニンから選択される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、及び２－ピリドンから選択される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリンから選択される。

特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、多環式複素環である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、三環式複素環である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、フェノキサジン誘導体である。特定の実施形態では、フェノキサジンは、Ｇクランプとして当技術分野で既知の核酸塩基を形成するようにさらに修飾され得る。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する１つ以上の部分に複合される。特定のそのような実施形態では、部分は、コレステロール部分である。特定の実施形態では、部分は、脂質部分である。複合のための追加の部分としては、炭水化物、ペプチド、抗体または抗体断片、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が含まれる。特定の実施形態では、炭水化物部分は、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）である。特定の実施形態では、複合基は、オリゴヌクレオチドに直接結合される。特定の実施形態では、複合基は、アミノ、アジド、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重または三重結合）、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、６－アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸまたはＡＨＡ）、置換Ｃ１－Ｃ１０アルキル、置換または非置換Ｃ２－Ｃ１０アルケニル、及び置換または非置換Ｃ２－Ｃ１０アルキニルから選択される連結部分によって、修飾オリゴヌクレオチドに付着する。特定のそのような実施形態では、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、アジド、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択される。

特定のそのような実施形態では、化合物は、例えば、ヌクレアーゼ安定性などの特性を増強するために、修飾オリゴヌクレオチドの一方または両方の末端に付着している１つ以上の安定化基を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。安定化基には、キャップ構造が含まれる。これらの末端修飾は、修飾オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達及び／または局在化を助けることができる。キャップは、５’末端（５’キャップ）に存在し得るか、または３’末端（３’キャップ）に存在し得るか、または両方の末端に存在し得る。キャップ構造としては、例えば、逆デオキシ脱塩基性キャップが含まれる。

特定の薬学的組成物
本明細書に提供される化合物または修飾オリゴヌクレオチド、及び薬学的に許容される希釈剤を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。特定の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、水溶液である。特定の実施形態では、水溶液は、生理食塩水である。本明細書で使用される場合、薬学的に許容される希釈剤は、無菌の希釈剤であると理解されている。好適な投与経路としては、これらに限定されないが、静脈内及び皮下投与が挙げられる。特定の実施形態では、投与は、静脈内投与である。特定の実施形態では、投与は、皮下投与である。特定の実施形態では、投与は、経口投与である。

特定の実施形態では、薬学的組成物は、投薬単位の形態で投与される。例えば、特定の実施形態では、投薬単位は、錠剤、カプセル、またはボーラス注射の形態である。

特定の実施形態では、医薬品は、好適な希釈剤で調製され、調製中に酸または塩基でｐＨ７．０～９．０に調整され、次いで滅菌条件下で凍結乾燥されている、修飾オリゴヌクレオチドである。その後、凍結乾燥された修飾オリゴヌクレオチドは、好適な希釈剤、例えば、水などの水溶液、または生理食塩水、ハンクス液、もしくはリンゲル液などの生理学的に適合性のある緩衝液で再構成される。再構成された生成物は、皮下注射または静脈内注入として投与される。凍結乾燥製剤は、２ｍＬのＩ型の透明なガラスバイアル（硫酸アンモニウム処理）にパッケージされ、ブロモブチルゴムクロージャーで栓をされ、アルミニウムのオーバーシールで密封され得る。

特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、それらの当該技術分野で確立された使用レベルで、薬学的組成物に従来見られる他の補助成分をさらに含有し得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの、追加の適合性のある薬学的に活性な材料を含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、色素、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加の材料を含有し得、そのような追加の材料には、これらに限定されないが、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンなどの賦形剤も含まれる。様々な実施形態では、そのような材料は、追加される場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性を不当に妨害してはならない。製剤は、滅菌され、必要に応じて、製剤のオリゴヌクレオチド（複数可）と有害に相互作用しない補助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、香料及び／または芳香族物質などと混合することができる。注入用のある特定の薬学的組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンであり、懸濁化剤、安定化剤、及び／または分散剤等の製剤化剤を含有し得る。注入用の薬学的組成物における使用に好適なある特定の溶媒には、親油性溶媒及び脂肪油、例えば、ゴマ油、合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、及びリポソームが含まれるが、これらに限定されない。水性注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。任意に、そのような懸濁液は、好適な安定剤または高度に濃縮された溶液の調製を可能にする医薬品の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。

脂質部分は、様々な方法で核酸療法において用いられている。１つの方法では、核酸は、陽イオン性脂質及び中性脂質の混合物から作製された予め形成されたリポソームまたはリポプレックスに導入される。別の方法では、単陽イオン性脂質または多陽イオン性脂質とのＤＮＡ複合体は、中性脂質の存在なしに形成される。特定の実施形態では、脂質部分は、特定の細胞または組織への医薬品の分布を増加させるように選択される。特定の実施形態では、脂質部分は、脂肪組織への医薬品の分布を増加させるように選択される。特定の実施形態では、脂質部分は、筋肉組織への医薬品の分布を増加させるように選択される。

特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、核酸と複合体化されたポリアミン化合物または脂質部分を含む。特定の実施形態では、そのような調製物は、式（Ｚ）によって定義される構造またはその薬学的に許容される塩をそれぞれ個別に有する１つ以上の化合物を含み、

式中、各Ｘ^ａ及びＸ^ｂは、各出現に関して独立して、Ｃ_１～６アルキレンであり、ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、各Ｒは独立して、Ｈであり、調製物中の式（Ｚ）の化合物の分子の少なくとも約８０％のＲ部分の少なくともｎ＋２個は、Ｈではなく、ｍは、１、２、３、または４であり、Ｙは、Ｏ、ＮＲ^２、またはＳであり、Ｒ^１は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらの各々は任意選択により、１つ以上の置換基で置換され、Ｒ^２は、Ｈ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらの各々は任意選択により、１つ以上の置換基で置換されるが、但し、ｎが０の場合、少なくともｎ＋３個のＲ部分は、Ｈではない。このような調製物は、ＰＣＴ公開ＷＯ／２００８／０４２９７３に記述されており、脂質調製物の開示のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の追加の調製物は、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６，５６１－５６９（２００８年５月０１日）に記載されており、脂質調製物の開示のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、限定されないが、混合、溶解、造粒、糖衣形成、研和、乳化、封入、捕捉、または錠剤化プロセスを含む、既知の技術を使用して調製される。

特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、固体（例えば、粉末、錠剤、及び／またはカプセル）である。特定のそのような実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む固体薬学的組成物は、これらに限定されないが、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、及び崩壊剤を含む当該技術分野で既知の成分を使用して調製される。

特定の実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物は、デポ調製物として製剤化される。特定のそのようなデポ調製物は、典型的には、非デポ調製物よりも長時間作用する。特定の実施形態では、そのような調製物は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注入によって投与される。特定の実施形態では、デポ調製物は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳濁液）もしくはイオン交換樹脂を使用して、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として調製される。

特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、送達系を含む。送達系の例として、リポソーム及びエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の送達系は、疎水性化合物を含む薬学的組成物を含むある特定の薬学的組成物の調製に有用である。特定の実施形態では、ジメチルスルホキシド等のある特定の有機溶媒が用いられる。

特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、本発明の１つ以上の医薬品を特定の組織または細胞型に送達するように設計された１つ以上の組織特異的送達分子を含む。例えば、特定の実施形態では、薬学的組成物は、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームを含む。

特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、持続放出系を含む。かかる持続放出系の非限定的な例は、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスである。特定の実施形態では、持続放出系は、その化学的性質に応じて、数時間、数日、数週間、または数ヶ月にわたって医薬品を放出し得る。

注入用のある特定の薬学的組成物は、単位剤形で、例えば、アンプル単位で提供されるか、または多用量容器内に提供される。

特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物は、治療有効量の修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、治療有効量は、疾患の症状を防止するか、疾患の症状を軽減するか、もしくは疾患の症状を改善するか、または治療される対象の生存期間を延長させるのに十分な量である。

特定の実施形態では、本明細書に提供される１つ以上の修飾オリゴヌクレオチドは、プロドラッグとして製剤化される。特定の実施形態では、インビボ投与時、プロドラッグは、オリゴヌクレオチドの生物学的、薬学的、または治療的により活性な形態に化学的に変換される。特定の実施形態では、プロドラッグは、対応する活性形態よりも投与しやすいため、有用である。例えば、ある特定の事例において、プロドラッグは、対応する活性形態よりも生物学的に利用可能である（例えば、経口投与によって）。ある特定の事例において、プロドラッグは、対応する活性形態と比較して、改善された溶解度を有し得る。特定の実施形態では、プロドラッグは、対応する活性形態よりも水溶性が低い。ある特定の事例において、そのようなプロドラッグは、水溶解度が移動性に害を及ぼす細胞膜にわたって優れた透過性を有する。特定の実施形態では、プロドラッグは、エステルである。ある特定のそのような実施形態では、エステルは、投与時にカルボン酸に代謝的に加水分解される。ある特定の事例において、カルボン酸含有化合物は、対応する活性形態である。特定の実施形態では、プロドラッグは、酸基に結合される短ペプチド（ポリアミノ酸）を含む。ある特定のそのような実施形態では、ペプチドは、投与時に切断されて、対応する活性形態を形成する。

特定の実施形態では、プロドラッグは、活性化合物がインビボ投与時に再生されるように、薬学的に活性な化合物を修飾することによって産生される。プロドラッグは、薬物の代謝安定性または輸送特性を変更し、副作用または毒性を遮蔽し、薬物の風味を改善し、または薬物の他の特徴または特性を変更するように設計することができる。インビボでの薬物力学的プロセス及び薬物代謝の知識により、当業者は、薬学的に活性な化合物を認知すると、化合物のプロドラッグを設計することができる（例えば、Ｎｏｇｒａｄｙ（１９８５）Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３８８～３９２ページを参照されたい）。

追加の投与経路としては、これらに限定されないが、経口、直腸、経粘膜、腸、経腸、局所、坐薬、吸入、髄腔内、心臓内、脳室内、腹腔内、鼻腔内、眼内、腫瘍内、筋肉内、及び髄内投与が含まれる。特定の実施形態では、薬学的髄腔内薬が投与されて、全身曝露ではなく局所曝露を達成する。例えば、薬学的組成物は、効果の所望される領域（例えば、肝臓に）直接注入され得る。

特定のキット
本発明は、キットも提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される修飾オリゴヌクレオチドを含む１つ以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、化合物を対象に投与するために使用され得る。

特定の実施形態では、キットは、投与の準備ができた薬学的組成物を含む。特定の実施形態では、薬学的組成物は、バイアル内に存在する。１０個など複数のバイアルは、例えば、分配パック内に存在し得る。いくつかの実施形態では、バイアルは、注射器で利用できるように製造されている。キットは、化合物を使用するための説明書も含むことができる。

いくつかの実施形態では、キットは、バイアル内ではなく、事前に充填されたシリンジ（例えば、ニードルガードを有する２７ゲージ、１／２インチのニードルを有する単回投与シリンジなど）内に存在する薬学的組成物を含む。１０個など複数の事前に充填されたシリンジは、例えば、分配パック内に存在し得る。キットは、本明細書に開示される修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を投与するための説明書も含むことができる。

いくつかの実施形態では、キットは、凍結乾燥製剤として本明細書に提供される修飾オリゴヌクレオチド、及び薬学的に許容される希釈剤を含む。対象への投与の調整において、凍結乾燥製剤が、薬学的に許容される希釈剤中で再構成される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物に加えて、キットは、シリンジ、アルコールスワブ、綿球、及び／またはガーゼパッドのうちの１つ以上をさらに含むことができる。

特定の実験モデル
特定の実施形態では、本発明は、実験モデルにおいて本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使用及び／または試験する方法を提供する。当業者は、そのような実験モデルのプロトコルを選択及び改変して、本発明の医薬品を評価することができる。

一般に、修飾オリゴヌクレオチドは、最初に培養細胞で試験される。好適な細胞型としては、修飾オリゴヌクレオチドのインビボ送達が所望される細胞型に関連するものが含まれる。例えば、本明細書に記載の方法の研究に好適な細胞型には、初代または培養細胞が含まれる。

特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドが１つ以上のマイクロＲＮＡの活性を干渉する程度は、培養細胞で評価される。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ活性の阻害は、予測または検証されたマイクロＲＮＡ制御転写産物のうちの１つ以上のレベルを測定することによって評価され得る。マイクロＲＮＡ活性の阻害は、マイクロＲＮＡ制御転写産物、及び／またはマイクロＲＮＡ制御転写産物によってコードされるタンパク質（すなわち、マイクロＲＮＡ制御転写産物は、抑制解除される）の増加をもたらし得る。さらに、特定の実施形態では、特定の表現型転帰が測定され得る。

ヒトの疾患のモデルにおける１つ以上のマイクロＲＮＡの研究のために、いくつかの動物モデルが当業者に利用可能である。

特定の定量アッセイ
特定の実施形態では、マイクロＲＮＡレベルは、インビトロまたはインビボで細胞または組織中で定量化される。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡレベルの変化は、マイクロアレイ分析によって測定される。特定の実施形態では、マイクロＲＮＡレベルの変化は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのいくつかの市販のＰＣＲアッセイのうちの１つによって測定される。

抗ｍｉＲまたはマイクロＲＮＡ模倣物によるマイクロＲＮＡ活性の調節は、ｍＲＮＡのマイクロアレイプロファイリングによって評価され得る。抗ｍｉＲまたはマイクロＲＮＡ模倣物によって調節される（増加または減少のいずれか）ｍＲＮＡの配列は、マイクロＲＮＡの標的であるｍＲＮＡの調節をマイクロＲＮＡの標的ではないｍＲＮＡの調節と比較するためにマイクロＲＮＡシード配列を検索する。このようにして、抗ｍｉＲとその標的マイクロＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ模倣物とその標的との相互作用を評価することができる。抗ｍｉＲの場合、発現レベルが増加するｍＲＮＡは、抗ｍｉＲが相補的であるマイクロＲＮＡとのシードマッチを含むｍＲＮＡ配列についてスクリーニングされる。

抗ｍｉＲ化合物によるマイクロＲＮＡ活性の調節は、マイクロＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ標的のレベルを測定することによって、メッセンジャーＲＮＡ自体のレベル、またはそこから転写されるタンパク質のいずれかを測定することによって評価され得る。マイクロＲＮＡのアンチセンス阻害は、概して、マイクロＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ及び／またはメッセンジャーＲＮＡ標的のタンパク質のレベルの増加、すなわち、抗ｍｉＲ治療は、１つ以上の標的メッセンジャーＲＮＡの抑制解除をもたらす。

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に例示するために提示されている。しかしながら、それらは、決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

当業者は、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な化合物を設計するために、この発見の基礎となる原理を容易に採用するであろう。

実施例１：ＰＫＤにおけるｍｉＲ－１７の役割
マイクロＲＮＡにおけるｍｉＲ－１７～９２クラスターのｍｉＲ－１７ファミリーメンバーは、ＰＫＤのマウスモデルにおいて上方制御される。ＰＫＤのマウスモデルにおけるｍｉＲ－１７～９２クラスターの遺伝子欠失は、腎嚢胞の成長を減少させ、腎機能を改善し、生存を延長する（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１３；１１０（２６）： １０７６５－１０７７０）。ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、それぞれが異なる配列：ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９－ｂ－１及びｍｉＲ－９２ａ－１を有する６つの異なるマイクロＲＮＡを含む。

ｍｉＲ－１７～９２クラスターは、マイクロＲＮＡのｍｉＲ－１７ファミリーのメンバーである２つのマイクロＲＮＡである、ｍｉＲ－１７及びｍｉＲ－２０ａを含む。このファミリーの各メンバーは、シード配列同一性、及びシード領域外の様々な程度の配列同一性を共有する。ｍｉＲ－１７ファミリーの他のメンバーは、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ－１０６ａ、及びｍｉＲ－１０６ｂである。ｍｉＲ－２０ｂ及びｍｉＲ－１０６ａは、ヒトＸ染色体上のｍｉＲ－１０６ａ～３６３クラスター内に存在し、ｍｉＲ－９３及びｍｉＲ－１０６ｂは、ヒト７番染色体上のｍｉＲ－１０６ｂ～２５クラスター内に存在する。ｍｉＲ－１７ファミリーメンバーの配列を表１に示す。

抗ｍｉＲ－１７化合物ＲＧＬＳ４３２６は、最適な薬学的特性のために抗ｍｉＲ－１７オリゴヌクレオチドの化学的に多様で合理的に設計されたライブラリをスクリーニングすることによって発見された。ＲＧＬＳ４３２６は、腎臓及び収集管由来嚢胞に優先的に分布し、ｍｉＲ－１７を翻訳活性ポリソームから置換し、Ｐｋｄ１及びＰｋｄ２を含む複数のｍｉＲ－１７ ｍＲＮＡ標的を抑制解除する。重要なことに、ＲＧＬＳ４３２６は、皮下投与後のヒトインビトロ ＡＤＰＫＤモデル及び複数のＰＫＤマウスモデルにおける嚢胞成長を減弱する。健康なボランティアにおけるＲＧＬＳ４３２６の第１相単回上昇用量（ＳＡＤ）臨床試験が２０１７年１２月に開始され、続いて２０１８年５月に健康なボランティアにおける第１相多重上昇用量（ＭＡＤ）臨床試験が開始された。常染色体優性多嚢胞性腎疾患（ＡＤＰＫＤ）を有する患者の治療のためのＲＧＬＳ４３２６の第１ｂ相臨床試験を、２０２０年１０月に開始した。

第１相ＭＡＤ臨床試験の開始に続く非臨床毒性試験は、高用量のＲＧＬＳ４３２６で、異常な歩行、運動活動の低下、及び／または衰弱を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）関連の所見を明らかにした。オフターゲット薬理学の潜在的な候補を同定するために、Ｇタンパク質結合受容体、トランスポーター、イオンチャネル、核受容体、及びサイトカイン受容体を含む１７４個の標的のパネルを、インビトロで、ＲＧＬＳ４３２６との可能な相互作用について評価した。ＲＧＬＳ４３２６は、リガンド結合に基づいて４．６ｕＭ（１４．２ｕｇ／ｍＬ）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）、及びパッチクランプ活性に基づいて３００～６００ｎＭ（０．９～１．８ｕｇ／ｍＬ）の機能的ＩＣ５０を有する、ＡＭＰＡグルタミン酸受容体のアンタゴニストであることが見出された。ＡＭＰＡ受容体は、ＣＮＳの興奮性シナプス上のイオンチャネルであり、速い興奮性神経伝達を媒介し、したがって、すべてのニューロンネットワークの重要な構成要素である。ＡＭＰＡ受容体とのそのような相互作用は、非臨床毒性モデルにおいて、高用量のＲＧＬＳ４３２６で観察されたＣＮＳ媒介性所見を説明することができる。

実施例２：低減されたＡＭＰＡ受容体結合を有する抗ｍｉＲ－１７化合物のスクリーニング
ＲＧＬＳ４３２６は、以下の配列及び化学修飾パターン：Ａ_ＳＧ_ＳＣ_ＭＡ_ＦＣ_ＦＵ_ＦＵ_ＭＵ_ＳＧ_Ｓ（式中、下付き文字「Ｍ」が続くヌクレオシドが２’－Ｏ－メチルヌクレオシドであり、下付き文字「Ｆ」が続くヌクレオシドが２’－フルオロヌクレオシドであり、下付き文字「Ｓ」が続くヌクレオシドがＳ－ｃＥｔヌクレオシドであり、各シトシンが非メチル化シトシンであり、すべての連結がホスホロチオエート連結である）を有する。ＲＧＬＳ４３２６の化学修飾及び長さバリアントを、ＲＧＬＳ４３２６の効力及び薬物動態学的プロファイルを保持し、かつＡＭＰＡ受容体（ＡＭＰＡ－Ｒ）への結合の低減を示す化合物を特定するように設計及びスクリーニングした。

ＲＧＬＳ４３２６に対して、化合物のライブラリを、様々な化学修飾、核酸塩基配列、及び長さで設計した。

抗ｍｉＲ－１７化合物の活性を、増大する濃度の抗ｍｉＲ－１７化合物の存在下で、ラット脳シナプス膜上に存在するＡＭＰＡ－Ｒへの［^３Ｈ］ＡＭＰＡリガンドの結合を測定する放射性リガンド結合アッセイで評価した。ＡＭＰＡＲに対する親和性を有する抗ｍｉＲ－１７化合物は、［^３Ｈ］ＡＭＰＡリガンドに結合し、［^３Ｈ］ＡＭＰＡリガンドの結合と競合する。

アッセイは、以前に公開された方法に従って実施した（Ｈｏｎｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，１９８２，３８（１）：１７３－１７８；Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１９８７，４０２（２）：２４３－２５４）。５．０ｎＭのリガンド［^３Ｈ］ＡＭＰＡ、１．０ｍＭの非特異的リガンドＬ－グルタミン酸、及びｕＭ濃度の抗ｍｉＲ化合物を、Ｗｉｓｔａｒラット大脳皮質から調製したシナプス膜で９０分間インキュベートした。表２に示される化合物を３つの実験で試験した。ｍｉＲ－１７以外のマイクロＲＮＡを標的とする抗ｍｉＲを対照化合物として使用した（ｍｉＲ－３３ａを標的とするＲＧ５１２４；ｌｅｔ－７ａを標的とするＲＧ５３６５；ｍｉＲ－２１４を標的とするＲＧ８０９３）。ＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１００１もまた、ＡＭＰＡ－Ｒに結合し、その活性を阻害することが実証されたので、各実験で試験した。［^３Ｈ］ＡＭＰＡリガンドの量を、放射性リガンド結合によって定量し、表３、４、及び５に示す。データによって示されるように、化合物は、放射性標識リガンドのＡＭＰＡ－Ｒへの結合を阻害する能力が異なる。

ＡＭＰＡ－Ｒに対する抗ｍｉＲ－１７オリゴヌクレオチドの機能的拮抗を評価するために、特定のオリゴヌクレオチドを、ＡＭＰＡ－Ｒ活性の測定値として、膜電流を記録する手動全細胞パッチクランプ技術を使用して試験した。

手動全細胞パッチクランプ試験は、Ｍｅｔｒｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって実施した。全セル電圧クランプ実験を、Ｐａｔｃｈｍａｓｔｅｒソフトウェア（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）を使用してＥＰＣ１０パッチクランプ増幅器を使用して、室温（１８～２１℃）で行った。ホウケイ酸ガラス毛細管（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）から、１．４～２．５ＭΩの抵抗にガラスパッチピペットを作製した。膜電流は、全細胞パッチクランプ技術を使用して記録した。ＣｈａｎＴｅｓｔ（登録商標）ＧｌｕＡ１／ＧｌｕＡ４ ＥＺＣｅｌｌを－８０ｍＶの保持電位でクランプし、ＶＣ３８灌流システム（ＡＬＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して１０μＭ（Ｓ）－ＡＭＰＡによって送達された膜電流を引き出した。最小電流振幅値は、１０μＭ（Ｓ）－ＡＭＰＡの各適用で測定した。化合物の各濃度によって生成される電流振幅の分数変化を、対照電流（事前化合物）と比較して計算し、各細胞のパーセンテージ変化（％阻害）として表した。試験した化合物を表６に示す。ＲＧＬＳ４３２６を、表６の他のすべての化合物とは別の試験で試験した。

表６に示すように、ＲＧＬＳ４３２６と比較して、化合物ＲＧ－ＮＧ－１０１５、ＲＧ－ＮＧ－１０１６、及びＲＧ－ＮＧ－１０１７は、ヒトＣｈａｎＴｅｓｔ（登録商標）ＧｌｕＡ１／ＧｌｕＡ４ ＥＺ－Ｃｅｌｌにおける手動全細胞パッチクランプ研究に基づいて、ＡＭＰＡ－Ｒに対する機能的拮抗の減少を示した。

実施例３：核酸塩基特性とＡＭＰＡ－Ｒ結合との関係
ＡＭＰＡ－Ｒ結合及び全細胞パッチクランプ研究によって示されるように、ｍｉＲ－１７の第１のヌクレオチドに相補的な位置にある、抗ｍｉＲ－１７オリゴヌクレオチドの３’末端におけるグアノシンの存在は、ＡＭＰＡ－Ｒの機能的拮抗に影響を与える。グアノシンと同様に、アデノシンは、プリンであるが、アデノシンは、ＡＭＰＡ－Ｒを阻害しなかった。グアノシン及びアデノシンは、水素結合を除いていくつかの特性に関して類似しているため、プリン塩基の１、２、及び６位における水素結合の違いを評価した。試験したプリン核酸塩基を図１及び表７に示す。表７の「プリン位置」列において、「Ａ」は、水素アクセプターであるプリンの位置を示し、「Ｄ」は、水素ドナーであるプリンの位置を示す。表７の「プリン位置」列において、「Ｎ」は、水素アクセプターまたはドナーのどちらでもない自然な位置を示す。また、プリン核酸塩基上の様々な２’－糖部分を試験して、プリン核酸塩基が糖ＡＭＰＡ－Ｒを阻害する能力に対する２’－糖部分化学の影響を評価した。

化合物を、本明細書に記載の放射性リガンド結合アッセイで試験して、抗ｍｉＲ－１７化合物の、［^３Ｈ］ＡＭＰＡリガンドの結合に対する能力及びそれと競合する能力を決定した。表８に示すように、ＡＭＰＡ－Ｒへのリガンド結合の阻害と、オリゴヌクレオチドの３’末端の核酸塩基のプリンの６位に水素結合アクセプターの存在との間に相関が観察された。例えば、３’末端にグアノシンまたはイノシンを有する化合物は、ＡＭＰＡ－Ｒへのリガンド結合の阻害をもたらした。プリンの６位に水素結合アクセプターを有する３’末端核酸塩基を有する化合物、例えば、ＲＧ－ＮＧ－１０３７及びＲＧ－ＮＧ－１０３９は、ＡＭＰＡ－Ｒへのリガンド結合を阻害する可能性が低かった。

実施例４：抗ｍｉＲ－１７化合物のインビトロ及びインビボでの効力
特定の化合物のインビトロ効力を、ｍｉＲ－１７のためのルシフェラーゼレポーターベクターを使用するｍｉＲ－１７ルシフェラーゼセンサーアッセイを使用して、ルシフェラーゼ遺伝子の３’－ＵＴＲ内の２つの完全に相補的なｍｉＲ－１７結合部位をタンデムで評価した。ＨｅＬａ細胞を、ルシフェラーゼレポーターベクター及びルシフェラーゼシグナルを抑制するように作用する外因性ｍｉＲ－１７発現ベクターと共トランスフェクトした。次いで、ＨｅＬａ細胞を、０．０４５、０．１３７．０．４１２、１．２３、３．７０、１１．１、３３．３、１００、及び３００ｎＭの濃度の抗ｍｉＲ－１７オリゴヌクレオチドで個別に処理した。１８～２４時間のトランスフェクション期間の終了時に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＧ５１２４を、対照化合物として含めた。表９に示すように、これらの化合物は、インビトロのＲＧＬＳ４３２６と比較して、同様のＥＣ_５０値でｍｉＲ－１７機能を阻害し、ｍｉＲ－１７ルシフェラーゼレポーター活性を抑制解除した。

特定の化合物の活性を、６つの参照ハウスキーピング遺伝子によって正規化された１８の独自のｍｉＲ－１７標的遺伝子の発現からなるマウスｍｉＲ－１７薬力学的シグネチャ（ｍｉＲ－１７ ＰＤ－Ｓｉｇ）を使用して評価し、ｍｉＲ－１７活性の偏りのない包括的な評価を提供した。マウスｍｉＲ－１７ ＰＤ－Ｓｉｇスコアは、モックトランスフェクションと比較した１８個の遺伝子の個々のｌｏｇ２倍変化（６個のハウスキーピング遺伝子によって正規化される）の計算平均であった（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１９，１０，４１４８）。

表８に示すように、試験したオリゴヌクレオチドは、インビトロでのＲＧＬＳ４３２６と比較して、同様のＥＣ_５０値を有する正常及びＰＫＤ腎臓細胞株（マウス及びヒトの両方）において、ｍｉＲ－１７機能を阻害し、複数の直接ｍｉＲ－１７標的遺伝子の発現を抑制解除した（ｍｉＲ－１７ ＰＤシグネチャによって測定した）。ｍＩＭＣＤ３細胞におけるＲＧＬＳ４３２６のＰＤ－Ｓｉｇ（７７．２、「＊」で示される）は、この実験では生成されなかった。表１０の値は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１９，１０，４１４８によって報告されたものである。表中の空白セルは、化合物が特定の細胞株で試験されなかったことを示す。

インビボの効力を、マイクロＲＮＡポリソームシフトアッセイ（ｍｉＰＳＡ）を使用して評価した。このアッセイを使用して、化合物が、正常なマウス及びＰＫＤマウスの腎臓においてｍｉＲ－１７標的に直接結合する程度を決定した。ｍｉＰＳＡは、活性ｍｉＲＮＡが並進的に活性な高分子量（ＨＭＷ）ポリソームにおいてそれらのｍＲＮＡ標的に結合するのに対し、阻害されたｍｉＲＮＡは低ＭＷ（ＬＭＷ）ポリソームに存在するという原理に依存する。抗ｍｉＲを用いた処置により、マイクロＲＮＡのＨＭＷポリソームからＬＭＷポリソームへのシフトをもたらす。したがって、ｍｉＰＳＡは、相補的な抗ｍｉＲによるマイクロＲＮＡ標的の関与の直接測定を提供する（Ａｎｄｒｏｓａｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５，４４： ｅ１３）。

野生型マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与した。腎臓組織を、７日後に収集し、ｍｉＰＳＡに供した。各処置の平均変位スコアを表１１に示す（ＰＢＳ、ｎ＝１７；ＲＧＬＳ３２６ ３０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０；他のすべての処置、ｎ＝４～５）。試験したオリゴヌクレオチドは、正常マウス腎臓における翻訳活性ポリソーム（ｍｉＰＳＡで測定）からｍｉＲ－１７を変位させた。

実施例５：ＡＤＰＫＤの実験モデルにおけるＲＧ－ＮＧ－１０１５の有効性
ＲＧ－ＮＧ－１０１５の有効性を、ＫｓｐＣｒｅ／Ｐｋｄ１Ｆ／ＲＣ（Ｐｋｄ１－ＫＯ）マウスモデルで評価した。Ｐｋｄ１－ＫＯは、生殖細胞系低形態性Ｐｋｄ１変異（一方の対立遺伝子上のヒトＰＫＤ１－Ｒ３２７７Ｃ（ＲＣ変異）と、他方の対立遺伝子上のＰｋｄ１エクソン２及び４に隣接するｌｏｘＰ部位とのマウス相当物）と、を含むオーソロガスＡＤＰＫＤモデルである。ＫｓｐＣｒｅ媒介性組換えを使用して、フロックスされたＰｋｄ１エクソンを欠失させ、一方の対立遺伝子に腎小管特異的な体細胞ヌル変異を有し、他方に生殖細胞系低形質変異を有する、化合物変異マウスを作製した。これは、ＡＤＰＫＤの積極的であるが長寿命のモデルである（Ｈａｊａｒｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７，８，１４３９５）。

８日齢、１０日齢、１２日齢、及び１５日齢の各日に、性別が一致したＰｋｄ１－ＫＯマウスに、２０ｍｇ／ｋｇの用量（ｎ＝８、治療群ごとに４匹の雄及び４匹の雌）のＲＧＬＳ４３２６、２０ｍｇ／ｋｇの用量（ｎ＝８）のＲＧ５１２４、または２０ｍｇ／ｋｇの用量（ｎ＝８）のＲＧ－ＮＧ－１０１５、またはＰＢＳ（ｎ＝８）の皮下注射を投与した。１８日齢でマウスを屠殺し、腎臓重量、体重、嚢胞指数、血清クレアチニンレベル、及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを測定した。ＢＵＮレベルは、腎機能のマーカーである。より高いＢＵＮレベルは、腎機能の低下と相関するため、ＢＵＮレベルの低下は、腎損傷及び損傷の低下ならびに機能の改善の指標である。統計的有意性は、ダネットの多重補正を用いた一元配置分散分析によって計算した。

結果を、表１２及び図２に示す（＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎｓ＝有意でない）。ＲＧ－ＮＧ－１０１５の有効性は、ＲＧＬＳ４３２６の有効性と類似していた。ＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ１０１５で処置したＰｋｄ２－ＫＯマウスでは、それぞれ、ＰＢＳを投与したＰｋｄ２－ＫＯマウスの平均ＫＷ／ＢＷ比よりも、腎臓重量対体重の平均比（ＫＷ／ＢＷ比）が有意に低かった（図２Ａ）。平均ＢＵＮレベルは、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、それぞれ、ＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１０１５で処置したＰｋｄ２－ＫＯマウスにおいて有意に低下した（図２Ｂ）。ＰＢＳで処置したマウスと比較して、Ｐｋｄ２－ＫＯマウスにおける平均血清クレアチニンレベルは、ＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１０１５で処置したマウスにおいてそれぞれ減少したが、減少は統計的に有意ではなかった（図２Ｃ）。対照オリゴヌクレオチドＲＧ５１２４による処置は、腎臓重量対体重比、血清クレアチニン、または血清ＢＵＮを減少させず、ＲＧＬＳ４３２９及びＲＧ－ＮＧ－１０１５で観察された結果がｍｉＲ－１７の阻害に特異的であったことを例証した。

実施例６：ＡＭＰＡ－Ｒの結合及び阻害が低減した抗ｍｉＲ－１７化合物は、高用量試験においてＣＮＳ毒性を示さなかった。
ＲＧ－ＮＧ－１０１５、ＲＧ－ＮＧ－１０１６、及びＲＧ－ＮＧ－１０１７を、高用量マウス毒性試験で試験した。各化合物を、２０００ｍｇ／ｋｇの単回投与、及び漸増投与（１００、４５０、及び２０００ｍｇ／ｋｇ）で試験した。表１３に示すように、ＲＧ－ＮＧ－１００１及びＲＧＬＳ４３２６の漸増投与は、運動失調、昏睡をもたらし、ＲＧＬＳ４３２６の場合、最高用量での意識不明をもたらし、ＲＧ－ＮＧ－１０１５、ＲＧ－ＮＧ－１０１６、またはＲＧ－ＮＧ－１０１７について、ＣＮＳ毒性は観察されなかった。

実施例７：最大許容用量（ＭＴＤ）試験及び異なる化合物の比較用量評価
以下の研究からのデータは、ＡＭＰＡ－Ｒ拮抗が、ＲＧＬＳ４３２６の以前の毒性研究で観察されたＣＮＳ毒性及び死亡率の原因であることをさらに支持する。

研究１：ＲＧ－ＮＧ－１０１７、ＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１００１の最大耐用量（ＭＴＤ）試験及び比較用量評価
化合物（ＲＧ－ＮＧ－１０１７、ＲＧＬＳ４３２６、ＲＧ－ＮＧ－１００１）を、パイロット最大耐用量（ＭＴＤ）試験（以下で説明する）で評価した。ＲＧ－ＮＧ－１０１７、ＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１００１は、最初にそれぞれ４用量レベルで評価した。ＲＧ－ＮＧ－１０１７は、ＡＭＰＡ－Ｒに結合するＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１００１と比較して、非ＡＭＰＡ－Ｒ結合化合物として評価のために含まれた。６～７週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｃｓ）をこの研究で使用した。マウスを治療群に無作為に割り当て、研究を盲検化した。動物を５日間以上順応させ、１２時間の明／暗サイクル（午前７時に点灯）で飼育した。換気されたケージラックシステム内の各ケージには、４匹以下のマウスを収容した。食事は、標準的なげっ歯類飼料と自由な水で構成された。

ＭＴＤパイロット試験
以下のパラメータをこの研究に使用した：
１．投与経路（複数可）：ＲＧ－ＮＧ－１０１７、ＲＧ－ＮＧ－１００１、ＲＧＬＳ４３２６の脳室内（ＩＣＶ）投薬
２．用量体積（複数可）：４μＬ
３．製剤（複数可）：ビヒクル、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋不含ｄＰＢＳ
４．用量頻度：１回
５．試験期間：８日
６．群数：３
７．群当たりの動物の数：（各群２～４）
８．動物の総数：５４

ＩＣＶ投与のために、マウスを麻酔し、注射のために配置した。頭蓋骨上の皮膚を切開し、マイクロドリルを使用して標的の上の頭蓋骨に小さな穴を開けた。定位座標は、頭蓋骨の前項から左右両方の側脳室に注射するため、前後（ＡＰ）－０．４ｍｍ、内外方向（ＭＬ）＋／－１．０－１．５ｍｍ、背腹側（ＤＶ）－３．０ｍｍであった（Ｈｉｒｏｎａｋａ ｅｔ ａｌ，２０１５）。動物に、４μｌを右側脳室に一方的に注入した。化合物を１～２分間にわたって注射し、ニードルを所定の位置に０．５～１分間放置してから、抜去した。切開部は、縫合糸、創傷クリップ、またはＶｅｔＢｏｎｄで閉じた。

ＩＣＶ処置（０日目）後、動物を７日間モニタリングし、毎日の健康チェック、体重、及び死亡率を記録した。７日目に、脳及び腎臓を収集し、固定し（１０％ホルマリン）、保留中の組織型を保存した。

ＭＴＤ研究の結果を表１４及び図３に示す。すべての動物の死亡は、ＩＣＶ注入後の最初の５～８時間以内に生じることが報告された。２．５μｇのＲＧ４３２６を注射したマウスは、呼吸困難のいくつかの即時の徴候を示すことが報告され、加熱パッドが提供された。ＲＧ－ＮＧ－１０１７（非ＡＭＰＡ－Ｒ結合化合物）は、高用量で十分に忍容性があり、この化合物について確立されたＭＴＤはなかった（６００μｇ、１００μｇ、または５０μｇでは０の死亡；３００μｇでは１の死亡）。ＲＧ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１００１（例えば、６００、３００、１００μｇ）については、高用量で１００％の死亡率が観察され、加えて、両方のＡＭＰＡ－Ｒ結合化合物については、５０μｇ及び２５μｇで１００％の死亡率が観察された。ＲＧ－ＮＧ－１００１ ＭＴＤは本研究では達成されず、２．５μｇ未満であると予測された。ＲＧ４３２６のＭＴＤは、ＩＣＶによって約２．５＜５．０μｇと予測された。すべての動物は、観察の２日目に完全に回復することが報告された。

ＲＧＬＳ４３２６の最大許容用量（ＭＴＤ）試験
ＩＣＶによるＲＧＬ４３２６の第２のＭＴＤ試験を実施して、疾患モデルにおける化合物を評価するための用量選択を評価した（表１５）。この研究では、異なるマウス株を評価した（Ｓｗｉｓｓ：Ｒｊｏｒｌ雄マウス、５週齢、Ｊａｎｖｉｅｒから調達）。マウスをイソフルラン麻酔下（誘導の場合は５％、維持の場合は２％、１００％Ｏ_２未満）に置き、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．カルプロフェン（Ｒｉｍａｄｙｌ（登録商標））を与えた。次いで、それらを定位フレームに配置した。頭皮に正中矢状切開を行い、左側脳室の上に頭蓋骨に穴を開けた。ステンレススチール製カニューレ（外径０．５１ｍｍ）を、左側脳室に、以下：頭頂の後方に＋０．５、Ｌ±０．７ｍｍ、Ｖ＝－２．７ｍｍ、の座標に、定位的に配置した。脳組織がカニューレ上をスライドすることを可能にする２分間の遅延後、０．６２５ｍｇ／ｍＬのＲＧ４３２６を含む４μＬの溶液を２分間にわたってゆっくりと注入した。注入後、溶液がカニューレトラックに沿って逆流するのを防ぐために、カニューレをさらに５分間所定の位置に残した。マウスに、手術後２４時間及び４８時間に、５ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃ．カルプロフェン（Ｒｉｍａｄｙｌ（登録商標））を投与した。手術後３～７日間（ＩＣＶ投与後２４時間に開始）マウスをモニターし、体重を毎日測定して健康状態を確認した。７日間にわたってモニタリングされたマウスについて、健康状態を確認するために、手術後１日目及び７日目に体重を測定した。

研究１では、６匹のマウスに０．６２５ｍｇ／ｍＬの４μＬの溶液を注射した（ＩＣＶ当たり合計２．５μｇ）。麻酔の終了時に、マウスは片側に横になったままであった。静かであり、手術後の最初の数時間はひっかきがあった。投与された６匹のマウスにおいて、２４、４８、または７２時間に毒性効果は観察されなかった。研究２では、４匹のマウスに４つの異なる用量のＲＧＬＳ４３２６（０．７５、１．０、１．２５及び１．８７５ｍｇ／ｍＬ、体積４μＬ）を注射した。最高用量（１．８７５ｍｇ／ｍＬ、すなわち、７．５μｇ／マウス）を受けた１匹のマウスは、ＩＣＶ注射の約２４時間後に死亡した。他のすべてのマウスは、パイロット試験の終了（投与後７日）まで、良好な健康状態であった。

試験１及び２を組み合わせた結果は、ＲＧ４３２６が試験対象において概して忍容性が良好であったが、ＲＧ－ＮＧ－１０１７よりもかなり低い用量のみであったことを実証した（図３を参照されたい）。

表１６は、研究１及び２のマウスモデルのＲＧＬＳ４３２６のＭＴＤデータを要約する。研究２からのこれらの結果に基づいて、ＲＧＬＳ４３２６について、Ｓｗｉｓｓ：Ｒｊｏｒｌマウス株における約４μｇのＭＴＤを予測した。

要約すると、化合物ＲＧ－ＮＧ－１０１７、ＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１００１は、２つのＭＴＤ試験にわたって評価され、非ＡＭＰＡ－Ｒ結合化合物（ＲＧ－ＮＧ－１０１７）とＡＭＰＡ－Ｒ結合化合物（ＲＧＬＳ４３２６、ＲＧ－ＮＧ－１００１）との間の忍容性における有意差を例証した（図３を参照されたい）。３００μｇのＩＣＶ用量での１匹の死亡にもかかわらず、６００μｇのより高い試験用量では死亡は発生しなかったため、ＲＧ－ＮＧ－１０１７のＭＴＤは確立されなかった。さらに、ＲＧ－ＮＧ－１０１７については、１００及び５０μｇの用量で死亡率への影響は観察されなかった。比較すると、死亡率に対する明らかな影響は、ＡＭＰＡ－Ｒ結合化合物ＲＧＬＳ４３２６及びＲＧ－ＮＧ－１００１について明らかであり、２５μｇ～６００μｇの試験投与範囲にわたって生存している動物はいなかった。生存率の向上傾向は、低用量のＲＧＬＳ４３２６（１０μｇ）で見られ、５μｇでのＲＧＬＳ４３２６治療動物において５０％の生存率、及び２．５μｇでの１００％の生存率であった。同様に、ＲＧ－ＮＧ－１００１の場合（ＲＧＬＳ４３２６と比較して強いＡＭＰＡ－Ｒ結合を示す）、５μｇのより低い用量で１００％の死亡率が明らかであり、２．５μｇで生存率が改善する傾向があった。研究１からのＲＧＬＳ４３４２６の結果は、異なるマウス株を利用した第２のＭＴＤ研究（研究２）でさらに確認された。この研究では、株間のＲＧＬＳ４３２６の忍容性にわずかな差異が存在し得ることが見出され、生存は、Ｃ５７／Ｂｌ／６Ｊを使用した研究１において、７．５μｇの最高用量でのマウス対５μｇでのマウスのみに影響を及ぼすことが観察された。しかしながら、これらの結果は、ＡＭＰＡ－Ｒ結合ＲＧＬＳ４３２６についてのＭＴＤが、約２．５μｇ及び５～７．５μｇ（株に応じて）の間で生じることを、非ＡＭＰＡ－Ｒ結合ＲＧ－ＮＧ－１０１７についての有意に高いＭＴＤ（少なくとも＞４０倍、またはそれ以上）と比較して、依然として支持する（図３）。

Claims (34)

1. 修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、５’～３’の方向に以下の構造：
   （Ｎ）_ｐ－（Ｎ”）－（Ｎ’）_ｑ
   を有し、
   ｐが、７～２４であり、
   ｑが、０または１であり、
   （Ｎ）_ｐの各Ｎが、独立して、修飾糖部分または非修飾糖部分を含み、（Ｎ）_ｐの核酸塩基配列が、マイクロＲＮＡの等長部分に相補的であり、（ｉ）前記マイクロＲＮＡの位置１の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、（ｉｉ）前記マイクロＲＮＡの位置２の核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、あるいは（ｉｉｉ）前記マイクロＲＮＡの位置１の前記核酸塩基が、ウラシル及び／またはシトシン核酸塩基であり、前記マイクロＲＮＡの位置２の前記核酸塩基が、ウラシル核酸塩基及び／またはシトシン核酸塩基であり、
   Ｎ”が、修飾糖部分または非修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、Ｎ”の核酸塩基が、前記マイクロＲＮＡの位置２の反対側にあり、
   ｑが１である場合、Ｎ’が、修飾糖部分または非修飾糖部分を含むヌクレオシドであり、Ｎ’の核酸塩基が、前記マイクロＲＮＡの位置１の反対側にあり、
   ｑが０である場合、Ｎ”の前記核酸塩基が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、前記プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さず、
   ｑが１である場合、Ｎ’及びＮ”の少なくとも１つの核酸塩基が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、前記プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、
   前記化合物、または薬学的に許容されるその塩。
2. 前記マイクロＲＮＡの位置１の前記核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、ｑが１であり、Ｎ’が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、前記プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、請求項１に記載の化合物。
3. 前記マイクロＲＮＡの位置２の前記核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、前記プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、請求項１または２に記載の化合物。
4. 前記マイクロＲＮＡの位置２の前記核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、前記プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、請求項１または２に記載の化合物。
5. ｑが０である、請求項３または請求項４に記載の化合物。
6. 前記マイクロＲＮＡの位置１の前記核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、ｑが１であり、Ｎ’が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、前記プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、請求項１に記載の化合物。
7. 前記マイクロＲＮＡの位置２の前記核酸塩基が、シトシン核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、前記プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、請求項１または６に記載の化合物。
8. 前記マイクロＲＮＡの位置２の前記核酸塩基が、ウラシル核酸塩基であり、Ｎ”が、ウラシル核酸塩基、シトシン核酸塩基、またはプリン核酸塩基であるが、但し、前記プリン核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さない、請求項１または６に記載の化合物。
9. ｑが０である、請求項７または請求項８に記載の化合物。
10. Ｎ”の前記核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さないプリン核酸塩基である、請求項１、３～５、及び７～９のいずれか１項に記載の化合物。
11. Ｎ”の前記核酸塩基が、アデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及びイソグアノシンから選択される、請求項１０に記載の化合物。
12. Ｎ”の前記糖部分が、２’－Ｏ－メチル糖ではない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物。
13. Ｎ”の前記糖部分が、２’－Ｏ－メトキシエチル糖またはＳ－ｃＥｔ糖である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物。
14. Ｎ’の前記核酸塩基が、６位に水素結合アクセプターを有さないプリン核酸塩基である、請求項１～４、６～８、及び１０～１３のいずれか１項に記載の化合物。
15. Ｎ’の前記核酸塩基が、アデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及びイソグアノシンから選択される、請求項１４に記載の化合物。
16. Ｎ’の前記糖部分が、２’－Ｏ－メチル糖ではない、請求項１～４、６～８、及び１０～１５のいずれか１項に記載の化合物。
17. Ｎ’の前記糖部分が、２’－Ｏ－メトキシエチル糖またはＳ－ｃＥｔ糖である、請求項１～４、６～８、及び１０～１５のいずれか１項に記載の化合物。
18. 少なくとも１つのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の化合物。
19. 各ヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項１８に記載の化合物。
20. ｐが、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の化合物。
21. 前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、前記マイクロＲＮＡの核酸塩基配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の化合物。
22. 前記化合物が、前記修飾オリゴヌクレオチドからなる、請求項１～２０のいずれか１項に記載の化合物。
23. 前記薬学的に許容される塩が、ナトリウム塩である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の化合物。
24. 請求項１～２３のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
25. 前記薬学的に許容される希釈剤が、水溶液である、請求項２４に記載の薬学的組成物。
26. 前記水溶液が、生理食塩水である、請求項２５に記載の薬学的組成物。
27. 凍結乾燥組成物である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
28. 生理食塩水中の請求項１～２３のいずれか１項に記載の化合物から本質的になる、薬学的組成物。
29. 細胞内のマイクロＲＮＡの活性を阻害するための方法であって、前記細胞を、請求項１～２３のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、前記方法。
30. 対象におけるマイクロＲＮＡの活性を阻害するための方法であって、請求項１～２３のいずれか１項に記載の化合物、または請求項２４～２８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
31. 前記対象が、前記マイクロＲＮＡに関連する疾患を有する、請求項３０に記載の方法。
32. 治療有効量の前記化合物を投与することを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
33. 前記対象が、ヒト対象である、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 療法に使用するための、請求項１～２３のいずれか１項に記載の化合物、または請求項２７～２８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。

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