JP2024526635A - 新規の昆虫阻害タンパク質 - Google Patents

Abstract

鱗翅目及び半翅目害虫種に対する毒性活性を示す殺虫性タンパク質が開示され、ＴＩＣ２１９９が含まれるが、これに限定されない。本開示の殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸配列を含むＤＮＡ構築物が提供される。本発明の殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸配列を含む、鱗翅目及び半翅目の蔓延に耐性のあるトランスジェニック植物、植物細胞、種子、及び植物部分が提供される。生体試料中の本発明の組換え核酸配列またはタンパク質の存在を検出する方法、及びＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質を使用して鱗翅目及び半翅目種の害虫を駆除する方法も提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の参照
本出願は、２０２１年７月８日に出願された米国仮出願第６３／２１９，６０４号、及び２０２２年６月２日に出願された同第６３／３４８，２７８号の利益を主張するものであり、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

配列表の援用
配列表のコンピュータ可読形態を含む「ＭＯＮＳ５３０ＷＯ．ｔｘｔ」と名付けられたファイルは、２０２２年６月１３日に作成された。このファイルは、７２，１１５バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であり、（米国特許庁ＥＦＳ－Ｗｅｂ出願システムを使用して）電子提出によって同時に出願され、その全体が参照により組み込まれる。

本発明は、概して、昆虫阻害タンパク質の分野に関する。新規クラスの毒素タンパク質が、作物植物及び種子の農業関連害虫、特に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）種の昆虫類害虫に対して、昆虫阻害活性を示すことが開示されている。開示される毒素タンパク質のうちの１つ以上をコードする組換えポリヌクレオチド構築物を含有する、植物、植物部分、種子、植物及び微生物細胞を含む細胞、ならびにベクターが提供される。

とりわけ、トウモロコシ、ダイズ、サトウキビ、イネ、コムギ、ワタ、野菜、トウジンビエ、キマメ、ピーナッツ、ジャガイモ、オオムギ、オートムギ、果樹などを含む農業的に重要な植物からの作物収量を改善することがますます重要になっている。増加する人口に食料、衣類、及びエネルギーを供給するための農産物のニーズが高まっていることに加えて、気候関連の影響と、農業以外で土地を使用するための増加する人口からの圧力とにより、耕作のために利用可能な耕地の量が減少すると予測されている。これらの要因は、特に植物バイオテクノロジーと農業慣行の大幅な改善がない場合、食料安全保障の厳しい予測につながっている。これらの要因に照らして、技術、農業技術、及び害虫管理の環境的に持続可能な改善は、耕作のために利用可能な耕地の量がますます限られている作物産生を拡大するための重要なツールである。

昆虫、特に鱗翅目の昆虫は、畑作物への被害の主な原因であり、それによって、蔓延している地域の作物収量が減少する。農業に悪影響を及ぼす鱗翅目害虫種には、チャイロハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｃｒｙ１Ｆａ１耐性ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、旧大陸タバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、スポッテッドボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サンフラワールーパー（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られている）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、及びベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。

歴史的には、農業における害虫駆除剤として、合成化学殺虫剤の集中的な適用が頼りにされてきた。環境及びヒトの健康への懸念は、新興の耐性問題、及びそのような害虫駆除剤が益虫及び他の生物を区別及び標的としないという事実に加えて、作物の損失を引き起こす害虫を駆除するために特別に標的とされた生物学的殺虫剤の研究開発を刺激した。この研究努力は、細菌を含む様々な昆虫病原性微生物種の漸進的な発見及び使用につながった。

昆虫病原性細菌、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌の可能性が発見され、生物学的害虫駆除剤として開発されると、生物学的駆除のパラダイムが転換した。細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）の株は、Ｂｔ株が特定の昆虫に対して高い毒性を示すことが発見されてから、殺虫性タンパク質の供給源として使用されてきた。Ｂｔ株は、胞子形成の開始時及び定常増殖期中に副胞子結晶状封入体内に局在するデルタ－エンドトキシン（例えば、Ｃｒｙタンパク質）を産生することが知られており、また、分泌型殺虫性タンパク質を産生することも知られている。感受性の昆虫が摂取すると、デルタ－エンドトキシン及び分泌毒素は、中腸上皮の表面でその効果を発揮し、細胞膜を破壊し、細胞破壊及び細胞死をもたらす。殺虫性タンパク質をコードする遺伝子は、Ｂｔ以外の細菌種（他のＢａｃｉｌｌｕｓ及びＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（「Ｌｓ」は、以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓとして知られていた）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ、ならびにＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓなどの多様な追加の細菌種を含む）においても同定されている。加えて、殺虫性毒素は、シダ、クモ毒を含む様々な非細菌源からも同定されており、必須遺伝子の抑制を標的とする、害虫の餌中のｄｓＲＮＡの送達は、効果的な害虫管理戦略として同定されている。

結晶状及び分泌型の可溶性殺虫性毒素は、その宿主に高度に特異的であり、化学殺虫剤の代替物として世界的に受け入れられている。例えば、殺虫性毒素タンパク質は、農業的に重要な植物を昆虫の蔓延から保護し、化学殺虫剤の適用の必要性を減らし、収量を増加させるために、様々な農業用途で用いられてきた。殺虫性毒素タンパク質は、様々な細菌株を含む微生物製剤を植物表面に分散させるための噴霧などの機械的方法によって、及び遺伝子組換え技術を使用して、殺虫性毒素タンパク質（複数可）を発現するトランスジェニック植物及び種子を産生することによって、作物植物の農業関連害虫を駆除するために使用される。

殺虫性毒素タンパク質を発現するトランスジェニック植物の使用は、世界的に普及している。例えば、２０１６年には、２３１０万ヘクタールにＢｔ毒素を発現するトランスジェニック作物が植えられ、７５４０万ヘクタールに除草剤耐性形質が追加されたＢｔ毒素を発現するトランスジェニック作物が植えられた（ＩＳＡＡＡ．２０１６．Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＭ Ｃｒｏｐｓ：２０１６．ＩＳＡＡＡ Ｂｒｉｅｆ Ｎｏ．５２．ＩＳＡＡＡ：Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）。トランスジェニック昆虫保護作物の世界的な使用及びこれらの作物で使用される限られた数の殺虫性毒素タンパク質により、現在利用されている殺虫性タンパク質に対して耐性を付与する既存の昆虫対立遺伝子の選択圧が生じた。

殺虫性毒素タンパク質に対する標的害虫の耐性の発達により、殺虫性毒素タンパク質を発現するトランスジェニック作物に対する昆虫耐性の増加を管理するのに有用な新しい形態の殺虫性毒素タンパク質の発見及び開発の継続的な必要性が生じている。有効性が改善され、より広範囲の感受性昆虫種の駆除を示す新しいタンパク質毒素は、耐性対立遺伝子を発達させ得る昆虫の生存数を減らすであろう。加えて、同じ昆虫類害虫に毒性があり、異なる作用様式、または代替的に２つ以上の異なる毒性作用様式を示す２つ以上のトランスジェニック殺虫性毒素タンパク質（例えば、同じ昆虫種に毒性があるペプチドまたはタンパク質毒素をコードする導入遺伝子と結合された抑制のための必須遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡをコードする導入遺伝子）を１つの植物で使用することにより、任意の単一の標的昆虫種における耐性の確率が減少する。加えて、Ｏｘｉｔｅｃ Ｌｔｄによって提供されるような自己制限技術を使用すると、本発明のタンパク質とともに使用した場合、本発明のタンパク質を発現するトランスジェニック作物に付与された形質の耐久性を改善するであろう（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ／ｒｅｆｕｇｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｉｎｓｅｃｔｓ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ－ａ ｔｅｓｔ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｓｏｃｏｓｍｓ．Ｅｖｏｌ Ａｐｐｌ １１（５）：７２７－７３８；Ａｌｐｈｅｙ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｐｅｓｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：ｓｙｎｅｒｇｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎｓｅｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｂｔ ｃｒｏｐｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，１０２：７１７－７３２）。

したがって、本発明者らは、本明細書において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来の新規のタンパク質、ならびに天然毒素と比較して修飾されたアミノ酸配列を示す改良され操作されたタンパク質、及び各々が以下の標的に対して殺虫活性を示す例示的な組換えタンパク質を開示する：鱗翅目種、特に、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、及びウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、ならびに半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）種、サビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）及び新熱帯区褐色カメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）。

本明細書において、作物植物の１つ以上の害虫に対して阻害活性を示すことが示されている、新規の殺虫性タンパク質ＴＩＣ２１９９が開示される。ＴＩＣ２１９９タンパク質は、単独で、または製剤中及び植物中で他の殺虫性タンパク質及び毒剤と組み合わせて使用することができ、したがって、農業システムで現在使用されている殺虫性タンパク質及び殺虫化学物質の代替物を提供する。

一実施形態では、本出願において、殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸分子が開示され、殺虫性タンパク質が、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７のアミノ酸配列を含むか、または殺虫性タンパク質が、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはポリヌクレオチドセグメントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。組換え核酸分子は、植物において殺虫性タンパク質を発現するように機能し、植物細胞において発現されると、殺虫有効量（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）の殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片を産生する配列を含み得る。

本出願の別の実施形態では、組換え核酸分子は、細菌または植物宿主細胞内に存在する。企図される細菌宿主細胞は、少なくともＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、及びＥｒｗｉｎｉａ属を含む。ある特定の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓであり、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。想定される植物宿主細胞としては、双子葉植物細胞及び単子葉植物細胞が挙げられる。想定される植物細胞としては、さらに、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ属（例えば、キャノーラ）、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ミカン属、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐ．）、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、シバクサ、スイカ、及びコムギの植物細胞が挙げられる。

別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、少なくともタマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、及びモロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）を含む、鱗翅目昆虫に対する活性を示す。

別の実施形態では、殺虫性タンパク質は、少なくともサビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）及び新熱帯区褐色カメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）を含む、半翅目昆虫に対する活性を示す。

本出願では、殺虫性タンパク質ＴＩＣ２１９９またはその断片をコードする組換え核酸分子を含む細菌及び植物及び植物部分も企図される。組換え分子（例えば、構築物）は、殺虫性タンパク質をコードする作動可能に連結されたポリヌクレオチドセグメントの細菌または植物細胞における発現のための異種プロモーターを含んでいてもよい。双子葉植物及び単子葉植物の両方が企図される。別の実施形態では、植物は、さらに、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ属（例えば、キャノーラ）、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ミカン属、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ（例えば、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐ．）、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トウモロコシ（すなわち、メイズ）（例えば、スイートコーンまたはフィールドコーン）、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、シバクサ、スイカ、及びコムギからなる群から選択される。植物部分は、例えば、限定されないが、葉、塊茎、根、茎、種子、胚、花、花序、莢、花粉、果実、動物飼料、及びバイオマスを含み得る。処理された植物部分、例えば、本発明のタンパク質をコードする核酸を含む、及び／または殺虫有効量のコードされた毒素タンパク質を含む、木材、または油、生存不能な粉砕種子もしくは分別種子、小麦粉、または植物の葉、花、根、種子もしくは塊茎から生産されたデンプンも企図される。

特定の実施形態では、組換え核酸分子及び殺虫有効量のＴＩＣ２１９９毒素タンパク質を含む種子が開示される。

さらに別の実施形態では、本出願に開示される組換え核酸分子を含む昆虫阻害組成物が企図される。昆虫阻害組成物は、当該殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも１つの他の殺虫剤をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの他の殺虫剤は、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、及び補助タンパク質からなる群から選択される。昆虫阻害組成物中の少なくとも１つの他の殺虫剤が、鱗翅目、鞘翅目、または半翅目の１つ以上の害虫種に対して活性を示すことも企図される。昆虫阻害組成物中の少なくとも１つの他の殺虫剤は、一実施形態では、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ－８８、ＡＸＭＩ－９７、ＡＸＭＩ－１０２、ＡＸＭＩ－１１２、ＡＸＭＩ－１１７、ＡＸＭＩ－１００、ＡＸＭＩ－１１５、ＡＸＭＩ－１１３、及びＡＸＭＩ－００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ－１５０、ＡＸＭＩ－１７１、ＡＸＭＩ－１８４、ＡＸＭＩ－１９６、ＡＸＭＩ－２０４、ＡＸＭＩ－２０７、ＡＸＭＩ－２０９、ＡＸＭＩ－２０５、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２２ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ、ＡＸＭＩ－２２４ｚ及びＡＸＭＩ－２２５ｚ、ＡＸＭＩ－２３８、ＡＸＭＩ－２７０、ＡＸＭＩ－２７９、ＡＸＭＩ－３４５、ＡＸＭＩ－３３５、ＡＸＭＩ－Ｒ１及びそのバリアント、ＩＰ３及びそのバリアント、ＤＩＧ－３、ＤＩＧ－５、ＤＩＧ－１０、ＤＩＧ－６５７、ＤＩＧ－１１タンパク質、ＩＤＰ１０２Ａａ及びそのホモログ、ＩＤＰ１１０Ａａ及びそのホモログ、ＴＩＣ８６８、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７、ＢＣＷ００３、ＴＩＣ１１００、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６７＿２３、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７６４１、ＩＤＰ０７２Ａａ、ＴＩＣ５２９０、ＴＩＣ３６６８、ＴＩＣ３６６９、ＴＩＣ３６７０、ＩＤＰ０７２Ａａ及びＩＤＰ１０３及びそのホモログ、ＰＩＰ－５０及びＰＩＰ－６５及びそのホモログ、ＰＩＰ－８３及びそのホモログ、ならびにＣｒｙ１Ｂ．３４からなる群から選択され、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制の実施形態には、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ種遺伝子Ｄｖ ｓｎｆ７及びＤｖ ｓｓｊ１の抑制を標的とするものが含まれる。

本出願に開示される検出可能な量の組換え核酸分子及び毒素タンパク質を含む商品も企図される。かかる商品としては、穀物取扱業者によって袋詰めされたトウモロコシの商品（コーンフレーク、コーンケーキ、コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンサイレージ、コーンスターチ、コーンシリアルなど）、ならびに対応するダイズ、イネ、コムギ、ソルガム、キマメ、ピーナッツ、果物、メロン、及び野菜の商品が挙げられ、該当する場合、ジュース、濃縮物、ジャム、ゼリー、マーマレード、ならびに本出願の検出可能な量のかかるポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを含むかかる商品の他の食用形態、全粒または加工綿実、綿実油、リント、種子、及び飼料用または食品用に処理された植物部分、繊維、紙、バイオマス、綿花油由来の燃料または綿繰り廃棄物由来のペレットなどの燃料製品、全粒または加工ダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズ粕、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズふすま、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む動物飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、ならびにダイズ植物及びダイズ植物の部分を使用して製造された燃料製品が含まれる。

本出願では、組換え核酸分子及び殺虫有効量のコードされたＴＩＣ２１９９毒素タンパク質を含む種子を産生する方法も企図される。本方法は、本出願に開示される組換え核酸分子を含む少なくとも１つの種子を植えることと、種子から植物を生育することと、植物から種子を採取することと、を含み、採取された種子が、参照された組換え核酸分子及び／または殺虫有効量のコードされたＴＩＣ２１９９毒素タンパク質を含む。

別の例示的な実施形態では、鱗翅目昆虫の蔓延に耐性のある植物が提供され、当該植物の細胞は、本明細書に開示される組換え核酸分子を含む。

本出願には、鱗翅目種の害虫を駆除し、植物、特に作物植物の鱗翅目種の害虫の蔓延を駆除するための方法も開示される。本方法は、一実施形態では、最初に、害虫を、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７に示される殺虫有効量の殺虫性タンパク質と接触させること、または害虫を、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫有効量の１つ以上の殺虫性タンパク質と接触させることを含む。

本明細書において、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質クラスの組換え核酸分子の存在を検出する方法がさらに提供され、本方法は、核酸の試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に提供される殺虫性タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズするが、かかるハイブリダイゼーション条件下で、セグメントを含まないそれ以外はアイソジェニックな植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズしない、核酸プローブと接触させることであって、プローブが、配列番号３、６、９、１２、１４、１６、もしくは１８と相同もしくは相補的であるか、または配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質をコードする配列である、接触させることと、試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供することと、プローブと試料のＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質クラスのメンバーの存在を検出するステップは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含み得る。

また、本明細書において、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質クラスからの殺虫性タンパク質またはその断片の存在を検出する方法が提供され、本方法が、試料を、ＴＩＣ２１９９タンパク質を検出するために設計されたＴＩＣ２１９９毒素タンパク質クラスの免疫反応性抗体または組換えタンパク質と接触させることと、抗体のＴＩＣ２１９９毒素タンパク質クラスタンパク質への結合を検出し、それによって、試料中のタンパク質の存在を確認することと、を含む。いくつかの実施形態では、検出するステップは、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含む。

また、本出願において、野外において鱗翅目害虫種または害虫の蔓延を駆除するための方法も企図され、本方法は、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７に示される殺虫有効量の殺虫性タンパク質を発現する作物植物を生育するか、または配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫有効量の１つ以上の殺虫性タンパク質を発現する作物植物を生育することと、１種以上の鱗翅目害虫種の毒素タンパク質への耐性の発現を防止または遅延させる目的で、本発明の毒素タンパク質をコードする遺伝子を含む作物、各々自己制限遺伝子を有する１種以上のトランスジェニック鱗翅目害虫種を野外に放出することと、を含む。一実施形態では、作物植物は、単子葉性または双子葉性であり得る。別の実施形態では、単子葉作物植物は、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、イネ、ライムギ、またはアワであり得る。さらに別の実施形態では、双子葉作物植物は、ダイズ、ワタ、またはキャノーラであり得る。

配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ種ＥＧ８６３９から得られるＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質をコードする核酸配列である。

配列番号２は、配列番号１に示される配列によってコードされるＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号３は、ＴＩＣ２１９９をコードする合成コード配列であり、植物細胞で使用することができる。

配列番号４は、分泌ペプチドを含むＮ末端４４アミノ酸が除去され、Ｃ末端６４アミノ酸も除去された、ＴＩＣ２１９９のバリアント、ＴＩＣ２１９９＿３のアミノ酸配列である。

配列番号５は、配列番号４のＴＩＣ２１９９＿３バリアントをコードするＤＮＡ配列である。

配列番号６は、配列番号４のＴＩＣ２１９９＿３バリアントをコードする合成コード配列であり、植物細胞で使用することができる。

配列番号７は、分泌ペプチドを含むＮ末端４４アミノ酸が除去されたＴＩＣ２１９９のバリアント、ＴＩＣ２１９９＿１のアミノ酸配列である。

配列番号８は、配列番号７のＴＩＣ２１９９＿１バリアントをコードするＤＮＡ配列である。

配列番号９は、配列番号７のＴＩＣ２１９９＿１バリアントをコードする合成コード配列であり、植物細胞で使用することができる。

配列番号１０は、Ｃ末端６４アミノ酸も除去されている、ＴＩＣ２１９９のバリアント、ＴＩＣ２１９９＿２のアミノ酸配列である。

配列番号１１は、配列番号１０のＴＩＣ２１９９＿２バリアントをコードするＤＮＡ配列である。

配列番号１２は、配列番号１０のＴＩＣ２１９９＿２バリアントをコードする合成コード配列であり、植物細胞で使用することができる。

配列番号１３は、開始メチオニンが除去され、葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用されるバリアント、ＴＩＣ２１９９＿１バリアントのアミノ酸配列である。

配列番号１４は、開始メチオニンコドンが除去され、葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用され、植物細胞で使用することができるＴＩＣ２１９９＿１バリアントをコードする合成コード配列である。

配列番号１５は、開始メチオニンが除去され、葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用されるバリアント、ＴＩＣ２１９９＿２バリアントのアミノ酸配列である。

配列番号１６は、開始メチオニンコドンが除去され、葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用され、植物細胞で使用することができるＴＩＣ２１９９＿２バリアントをコードする合成コード配列である。

配列番号１７は、開始メチオニンが除去され、葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用されるバリアント、ＴＩＣ２１９９＿３バリアントのアミノ酸配列である。

配列番号１８は、開始メチオニンコドンが除去され、葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用され、植物細胞で使用することができるＴＩＣ２１９９＿３バリアントをコードする合成コード配列である。

農業の害虫駆除の分野における１つの問題は、標的害虫に対して有効であり、標的害虫種に対して広範囲の毒性を示し、望ましくない農学的問題を引き起こすことなく植物において発現させることができ、植物において商業的に使用される現在の毒素と比較して、代替的な作用様式を提供する、新しい毒素タンパク質の必要性として特徴付けることができる。

ＴＩＣ２１９９によって例示される新規の殺虫性タンパク質が、本明細書に開示される。殺虫有効量でのタンパク質の使用は、当該技術分野における問題である昆虫、特に、広範囲の鱗翅目昆虫類害虫、より具体的には、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、及びウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、ならびに半翅目種のサビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）及び新熱帯区褐色カメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）の蔓延に対して対処することができる。

本出願におけるＴＩＣ２１９９、「ＴＩＣ２１９９タンパク質」、「ＴＩＣ２１９９タンパク質毒素」、「ＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質」、「ＴＩＣ２１９９関連毒素」、「ＴＩＣ２１９９関連毒素」、「ＴＩＣ２１９９タンパク質毒素クラス」、「ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質クラス」などへの言及は、そのようなタンパク質とＴＩＣ２１９９とのアラインメントが約９６％～約１００％（パーセント）の任意の割合（パーセンテージ）の同一性のアミノ酸配列をもたらす場合、殺虫活性または昆虫阻害活性を示す任意のタンパク質を含む鱗翅目害虫に対して活性を付与する、ＴＩＣ２１９９（配列番号２）の任意の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質の配列、及びその殺虫性もしくは昆虫阻害セグメント、またはそれらの組み合わせを含むか、それからなるか、それらと実質的に相同か、それらと類似しているか、またはそれらに由来する、任意の新規の殺虫性タンパク質もしくは昆虫阻害タンパク質を指す。ＴＩＣ２１９９タンパク質は、タンパク質のプラスチド標的化形態及び非プラスチド標的化形態の両方を含む。

「セグメント」または「断片」という用語は、本出願において、ＴＩＣ２１９９タンパク質を記載する完全なアミノ酸配列または核酸配列よりも短い連続したアミノ酸配列または核酸配列を記載するために使用される。昆虫阻害活性を示すセグメントまたは断片はまた、そのようなセグメントまたは断片と配列番号２に示されるＴＩＣ２１９９タンパク質の対応するセクションとのアラインメントが、セグメントまたは断片とＴＩＣ２１９９タンパク質内のアミノ酸の対応するセグメントとの間に約９６％～約１００％の任意の割合（パーセンテージ）のアミノ酸配列同一性をもたらす場合、本出願にも開示される。本明細書に記載の断片は、ＴＩＣ２１９９タンパク質の少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、または少なくとも８００個の連続したアミノ酸残基を含み得る。例えば、配列番号２の断片は、配列番号４として提示される。配列番号４のアミノ酸配列は、ＴＩＣ２１９９のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む。提案された分泌シグナルペプチドのＮ末端４４アミノ酸は、他のＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質とのアラインメントに基づいて除去され（Ｒｕｉｚ ｄｅ Ｅｓｃｕｄｅｒｏ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｒｙ１Ｉ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｃ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｉｅｓ Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ，Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ，Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ，ａｎｄ Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７２（７）：４７９６－４８０４）、Ｎ末端メチオニン残基を留保する。加えて、予測されるトリプシン切断カルボキシ末端プロ毒素ドメインも、配列番号４において除去されている。トリプシン切断部位は、プロ毒素ドメインの開始近くのドメインＩＩＩ、ブロック５の末端で高度に保存されている「ＤＲＩＥＦ」配列の後の最初のリジン（Ｋ）であると予測される（Ｓｃｈｎｅｐｆ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２（３）：７７５－８０６）。配列番号４は、例えば、細菌における発現のために配列番号５によって、または植物細胞における発現のために配列番号６によってコードされ得る。

加えて、配列番号２の断片は、配列番号７として提示される。配列番号７のアミノ酸は、ＴＩＣ２１９９のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む。提案された分泌シグナルペプチドのＮ末端４４アミノ酸は、他のＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質とのアラインメントに基づいて除去されている。配列番号７は、例えば、細菌における発現のために配列番号８によって、または植物細胞における発現のために配列番号９によってコードされ得る。配列番号２の断片は、配列番号１０として提示される。配列番号１０は、ＴＩＣ２１９９のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む。予測されるトリプシン切断カルボキシ末端プロ毒素ドメインも、配列番号１０において除去されている。配列番号１０は、例えば、細菌における発現のために配列番号１１によって、または植物細胞における発現のために配列番号１２によってコードされ得る。配列番号２の断片は、配列番号１３として提示される。配列番号１３のアミノ酸は、ＴＩＣ２１９９のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む。提案された分泌シグナルペプチドのＮ末端４４アミノ酸は、他のＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質とのアラインメントに基づいて除去されており、開始メチオニンを欠いている。配列番号１３は、ＴＩＣ２１９９＿１アミノ酸配列を葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用される。配列番号１３は、植物細胞における発現のために配列番号１４によってコードされる。配列番号２の断片は、配列番号１５として提示される。配列番号１５のアミノ酸は、ＴＩＣ２１９９のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む。予測されるトリプシン切断カルボキシ末端プロ毒素ドメインも、開始メチオニンとともに配列番号１５において除去されており、ＴＩＣ２１９９＿２アミノ酸配列を葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用される。配列番号１５は、植物細胞における発現のために配列番号１６によってコードされる。配列番号１７のアミノ酸は、ＴＩＣ２１９９のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む。提案された分泌シグナルペプチドのＮ末端４４アミノ酸は、他のＣｒｙ１Ｉ殺虫性タンパク質とのアラインメントに基づいて除去されており、予測されたトリプシン切断カルボキシ末端プロ毒素ドメインも、開始メチオニンとともに配列番号１７において除去されており、ＴＩＣ２１９９＿３アミノ酸配列を葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結するために使用される。

本出願において、「活性（ａｃｔｉｖｅ）」または「活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、「殺虫活性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「殺虫性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ）」または「殺虫活性（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、「昆虫阻害性（ｉｎｓｅｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）」、「殺虫有効性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」、または「殺虫性（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ）」という用語への言及は、有効量のＴＩＣ２１９９タンパク質を含有するタンパク質毒素などの毒剤が、害虫を、阻害する（成長、摂食、繁殖力、もしくは生存能力を阻害する）、抑制する（成長、摂食、繁殖力、もしくは生存能力を抑制する）、駆除する（害虫の蔓延を駆除する、特定の作物に対する害虫の摂食活動を駆除する）、または殺傷する（罹患率、死亡率、もしくは繁殖率の低下を引き起こす）ことにおける有効性を指す。これらの用語は、害虫を毒性タンパク質に曝露させることにより、罹患率、死亡率、繁殖力の低下、または発育阻害が生じる場合、害虫に殺虫有効量の毒性タンパク質を提供した結果を含むことを意図している。これらの用語はまた、植物においてまたは植物に対して殺虫有効量の毒性タンパク質を提供した結果としての、植物、植物の組織、植物部分、種子、植物細胞からの、または植物が生育し得る特定の地理的位置からの、害虫の忌避を含む。一般に、殺虫活性は、毒性タンパク質が、生育、発達、生存率、摂食行動、交尾行動、繁殖力を阻害するのに有効である能力、または昆虫の摂食によって引き起こされる任意の測定可能な有害作用の減少に有効である能力を指す。毒性タンパク質は、植物によって産生され得るか、または植物に、もしくは植物が位置する場所内の環境に適用され得る。「生物活性」、「有効」、「効果的」という用語、またはそれらの変形はまた、標的昆虫類害虫に対する本発明のタンパク質の効果を説明するために本出願において互換的に利用される用語でもある。

殺虫有効量の毒剤は、標的害虫の食餌に提供される場合、毒剤が害虫に接触すると、殺虫活性を示す。毒剤は、殺虫性タンパク質または当該技術分野で既知の１つ以上の化学物質であり得る。殺虫剤または殺虫化学物質は、単独で、または互いに組み合わせて使用することができる。化学物質としては、標的害虫の抑制のための特定の遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子、有機塩化物、有機リン酸塩、カルバミン酸塩、ピレスロイド、ネオニコチノイド、及びリアノイドが挙げられるが、こられに限定されない。殺虫性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ）または殺虫性（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ）タンパク質薬剤としては、本出願に示されるタンパク質毒素、ならびに鱗翅目を標的とするものを含む他のタンパク質性毒剤、ならびに鞘翅目、半翅目、及び同翅目種の駆除に使用するために当該技術分野で入手可能である、他の植物害虫を駆除するために使用されるＣｒｙ、Ｖｉｐ、及びＣｙｔタンパク質などのタンパク質毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ昆虫毒性タンパク質、及びシダ種に由来する昆虫毒素タンパク質が挙げられる。

害虫、特に作物植物の害虫への言及は、作物植物の昆虫類害虫、特にＴＩＣ２１９９タンパク質毒素クラスによって駆除されるそれらの鱗翅目昆虫類害虫を意味することが意図されている。しかしながら、害虫への言及はまた、植物の鞘翅目、半翅目（例えば、サビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ））及び新熱帯区褐色カメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）、及び同翅目の昆虫類害虫、ならびにこれらの害虫を標的とする毒剤がＴＩＣ２１９９タンパク質またはＴＩＣ２１９９タンパク質と９５～約１００パーセント同一であるタンパク質と共局在化もしくは共存する場合、線虫及び真菌を含むことができる。「共存する」または「共局在化した」という語句は、標的昆虫類害虫がＴＩＣ２１９９毒素タンパク質で接触した任意の事例、ならびに標的昆虫類害虫に対して殺虫有効量でも存在する任意の他の毒剤を含むことが意図されている。「接触された」とは、特定の実施形態では、標的害虫の食餌に存在することを指すことが意図されており、食餌が標的害虫によって消費される。

鱗翅目の昆虫としては、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ科のアーミーワーム、カットワーム、ルーパー、及びＨｅｌｉｏｔｈｉｎｅ、例えば、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、チャイロハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、バーサアーミーワーム（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ソイビーンルーパー（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、サンフラワールーパー（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、グラニュレートカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、アーミーワーム（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、サンフラワールーパー（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）、サウスアメリカンポッドワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｇｅｌｏｔｏｐｏｅｏｎ）、ウエスタンカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）、Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科のボーラー、ケースベアラー、ウェブワーム、コーンワーム、キャベッジワーム、及びスケルトナイザー、例えば、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ネーブルオレンジワーム（Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、コーンルートウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、クロオビクロノメイガ（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、サンフラワーモス（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ科のリーフローラー、バッドワーム、シードワーム、及びフルーツワーム、例えば、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、ブドウホソハマキ（Ｅｎｄｏｐｉｚａ ｖｉｔｅａｎａ）、ナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）、サンフラワーバッドモス（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）、及び多くの他の経済的に重要な鱗翅目、例えば、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ピンクボールワーム（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、及びマイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。鱗翅目の他の昆虫類害虫としては、例えば、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、フルーツツリーリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ）、ヨーロピアンリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ｒｏｓａｎａ）、及び他のＡｒｃｈｉｐｓ種（Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、ニカメイガ、またはライスステムボーラー）、コブノメイガ（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、コーンルートウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ブルーグラスウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、スパイニーボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｉｎｓｕｌａｎａ）、スポッテッドボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、ソイビーンポッドワーム及びコットンボールワームとしても知られている）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、クロオビクロノメイガ（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、ヨーロピアングレープバインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ）、ミカンハモグリガ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ）、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ、インポーテッドキャベッジワームとしても知られている）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られている）、ならびにトマトキバガ（Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ）が挙げられる。

半翅目の昆虫には、Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科のカメムシ：Ｃｈｉｎａｖｉａ属（Ｃｈｉｎａｖｉａ ｈｉｌａｒｉｓ、Ｃｈｉｎａｖｉａ ｍａｒｇｉｎａｔａ、及びＣｈｉｎａｖｉａ ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）のアオクサカメムシ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ属のカメムシ（Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｇｒａｎｕｌｏｓｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｋａｎｅｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｌｉｇａｔａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｌｉｎｅａｔｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｐｅｒｓｉｍｉｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｒｏｓｓｉａｎａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｓａｙｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｕｈｌｅｒｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｂｅｌｆｒａｇｉｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｆａｃｅｔａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｏｓｂｏｒｎｉ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｓａｕｃｉａ、及びＣｈｌｏｒｏｃｈｒｏａ ｓｅｎｉｌｉｓ）、ミナミアオカメムシ（Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ）、Ｅｄｅｓｓａ属のカメムシ（Ｅｄｅｓｓａ ｍｅｄｉｔａｂｕｎｄａ、Ｅｄｅｓｓａ ｂｉｆｉｄａ、及びＥｄｅｓｓａ ｆｌｏｒｉｄａ）、新熱帯区褐色カメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ属のカメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｃｏｎｓｐｅｒｓｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｃｒｅｎａｔｏｒ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｅｇｇｌｅｓｔｏｎｉ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｉｃｔｅｒｉｃｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｉｎｆｌａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｌａｔｉｍａｒｇｉｎａｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｏｂｓｃｕｒｅｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｐｏｌｉｔｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｑｕａｄｒａｔｏｒ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｖｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｔｒｅｎｕｏｕｓ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｔｒｉｓｔｉｇｍｕｓ、及びＥｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ）、クサギカメムシ（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ ｈａｌｙｓ）、レッドショルダードスティンクバグ（Ｔｈｙａｎｔａ ａｃｃｅｒｒａ）、Ｔｈｙａｎｔａ属のカメムシ（Ｔｈｙａｎｔａ ｃａｌｃｅａｔａ、Ｔｈｙａｎｔａ ｃｕｓｔａｔｏｒ、Ｔｈｙａｎｔａ ｐａｌｌｉｄｏｖｉｒｅｎｓ、Ｔｈｙａｎｔａ ｐｅｒｄｉｔｏｒ、Ｔｈｙａｎｔａ ｍａｃｕｌａｔｅ、及びＴｈｙａｎｔａ ｐｓｅｕｄｏｃａｓｔａ）、グリーンベリースティンクバグ（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｍｅｌａｃａｎｔｈｕｓ）及びＤｉｃｈｅｌｏｐ属の他のカメムシ（Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ａｖｉｌａｐｉｒｅｓｉ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｄｉｍｉｄａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｆｕｒｃａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｆｕｒｃｉｆｒｏｎｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｌｏｂａｔｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｍｉｒｉａｍａｅ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｎｉｇｒｕｍ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｐｅｒｕａｎｕｓ、Ｄｉｃｈｅｌｏｐｓ ｐｈｏｅｎｉｘ、及びＤｉｃｈｅｌｏｐｓ ｓａｌｔｅｎｓｉｓ）、レッドバンデッドスティンクバグ（Ｐｉｅｚｏｄｏｒｕｓ ｇｕｉｌｄｉｎｎｉ）及びＰｉｅｚｏｄｏｒｕｓ ｌｉｔｕｒａｔｕｓ、ならびにＰｌａｔａｓｐｉｄａｅ科の昆虫（例えば、マルカメムシ（Ｍｅｇａｃｏｐｔａ ｃｒｉｂｒａｒｉａ）、ウエスタンサビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）及びサビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。

本出願における「単離されたＤＮＡ分子」、または等価の用語もしくは表現への言及は、ＤＮＡ分子が、単独で、または他の組成物と組み合わせて存在するが、その自然環境内には存在しないものであることを意味するように意図されている。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列などのような、生物のゲノムのＤＮＡ内で天然に見出される核酸エレメントは、当該エレメントが生物のゲノム内にあり、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りは、「単離された」とはみなされない。ただし、これらのエレメントの各々、及びこれらのエレメントの下位部分は、当該エレメントが生物のゲノム内になく、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離されている」ものである。同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の天然に生じる任意の殺虫性バリアントをコードするヌクレオチド配列は、当該ヌクレオチド配列が、当該タンパク質をコードする配列が天然に見出される細菌のＤＮＡ内にない限り、単離されたヌクレオチド配列と考えられる。天然に存在する殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的において単離されているとみなされる。本開示の目的において、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム内に挿入されるか、または染色体外ベクター内に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞の形質転換に使用されるプラスミドもしくは同様の構造内に存在しても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在しても、または植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生物学的試料、もしくは商品の中に検出可能量で存在しても、単離されたヌクレオチド配列であるとみなされる。

本出願における「自己制限遺伝子」という用語への言及は、宿主の生存を制限し、宿主集団の減少をもたらす遺伝子を指す。そのような技術は、Ｏｘｉｔｅｃｈ Ｌｔｄ．によって提供されている。トランスジェニック自己制限遺伝子を有するトランスジェニック雄昆虫が放出され、野生の雌と繁殖する。その結果、子孫は、自己制限遺伝子のコピーを継承する。自己制限遺伝子は、昆虫の細胞内でタンパク質を過剰に産生し、発生に必要な他の必須タンパク質を産生する細胞の能力に干渉することによって、昆虫の細胞の適切な機能を妨害する。この遺伝子は、昆虫の正常な発生を妨害することによって、成虫になるまで生き残ることを妨げる。例えば、自己制限型コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）株ＯＸ４３１９Ｌは、Ｏｘｉｔｅｃｈ Ｌｔｄ．によって開発され、性決定遺伝子ｄｏｕｂｌｅｓｅｘ（ｄｓｘ）からの配列を利用する雄選択遺伝子を有する。この遺伝子は、性選択的スプライシングを発現して、雌の子孫が幼虫期を超えて生存するのを妨げ、雄のみの自己制限ガのコホートの産生を可能にする、自己制限遺伝子の雌特異的発現を操作する。放出後、雄は害虫雌と交尾し、次世代の雌の子孫の数が減少し、それによって、Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａの集団が局所的に抑制される。コナガ生産施設内で放出するための多数の雄の飼育を容易にするために、ＯＸ４３１９Ｌ株内の雌特異的ｄｓｘの発現は、幼虫飼料にテトラサイクリンまたは好適な類似体を添加することによって抑制される。ＯＸ４３１９Ｌはまた、蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄを発現して、当該技術分野におけるこの株の存在の効果的なモニタリングを可能にする（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｅｍａｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｅｓｔ Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：１６０－１６６）。本技術は、本発明の毒素遺伝子を含む植物を用いて野外に適用する場合、本発明の毒素遺伝子及びタンパク質による駆除を標的とする害虫種の耐性の発現を遅延または防止し、したがって、本発明の毒素遺伝子及びタンパク質を含む任意の植物産物の耐久性を高めることができる。

本出願でさらに記載されるように、ＴＩＣ２１９９（配列番号１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ種ＥＧ８６３９から得られたＤＮＡにおいて発見された。ＴＩＣ２１９９の微生物宿主細胞由来タンパク質を使用したバイオアッセイは、鱗翅目種のタマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、イラクサギンウワバ（ＣＬＷ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ヨーロッパアワノメイガ（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、サザンアーミーワーム（ＳＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、サウスウエスタンコーンボーラー（ＳＷＣ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビメイガ（ＳＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（ＶＢＣ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、及びウエスタンビーンカットワーム（ＷＢＣ、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、ならびに半翅目種のサビイロメクラガメ（ＴＰＢ、Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）及び新熱帯区褐色カメムシ（ＮＢＳＢ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）に対する活性を実証した。

植物細胞における使用のために設計された合成コード配列を、特に、植物機能性プロモーター及び植物におけるタンパク質の発現のための所望のレベル及び空間特性を媒介するように機能する他の要素に操作的に／機能的に連結されている場合に、ＴＩＣ２１９９（配列番号３）、ＴＩＣ２１９９＿１（配列番号９及び１４）、ＴＩＣ２１９９＿２（配列番号１２及び１６）、ならびにＴＩＣ２１９９＿３（配列番号６及び１８）を発現するように生成した。ＴＩＣ２１９９、ＴＩＣ２１９９＿１、ＴＩＣ２１９９＿２、及びＴＩＣ２１９９＿３を発現するトウモロコシ植物は、鱗翅目種のヨーロッパアワノメイガ（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）及びサウスウエスタンコーンボーラー（ＳＷＣ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）に対して有効な活性を示した。ブラジルでは、ＴＩＣ２１９９を発現するトウモロコシ植物は、ＳＣＢに対して有効であり、ＬＣＳＢに対して非常に有効であった。

植物細胞における発現のために、ＴＩＣ２１９９（配列番号２、４、７、１０、１３、１５、または１７）タンパク質を発現させ、細胞質に局在化させるか、または植物細胞の様々な細胞小器官を標的化することができる。例えば、タンパク質を葉緑体に標的化すると、発現されたタンパク質毒素が任意の予期しない様式で細胞生物学と反応する場合に、オフ表現型（ｏｆｆ－ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が生じるのを防ぎながら、トランスジェニック植物で発現するタンパク質のレベルを増加させることができる。標的化はまた、トランスジェニック事象における害虫耐性有効性の増加をもたらす可能性もある。標的ペプチドまたは輸送ペプチドは、核、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、葉緑体、アポプラスト、ペルオキシソーム、及び形質膜を含む、細胞内の特定の領域へのタンパク質の輸送を指示する短い（３～７０アミノ酸長の）ペプチド鎖である。いくつかの標的ペプチドは、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。葉緑体を標的化する場合、タンパク質は、約４０～５０アミノ酸長の輸送ペプチドを含む。葉緑体輸送ペプチドの使用の記載については、米国特許第５，１８８，６４２号及び同第５，７２８，９２５号を参照されたい。多くの葉緑体局在化タンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に標的化される。そのような単離されたＣＴＰの例としては、リブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光複合体タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、及び米国特許第７，１９３，１３３号に記載されている輸送ペプチドに関連するものが挙げられるが、これらに限定されない。非葉緑体タンパク質は、異種ＣＴＰとのタンパク質融合を使用することによって葉緑体を標的化することができ、ＣＴＰが、タンパク質を葉緑体に標的化するのに十分であることが、インビボ及びインビトロで実証されている。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＥＰＳＰＳ ＣＴＰ（ＣＴＰ２）（Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：４３７－４４２，１９８７を参照）またはＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａのＥＰＳＰＳ ＣＴＰ（ＣＴＰ４）（ｄｅｌｌａ－Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：６８７３－６８７７，１９８６を参照）などの好適な葉緑体輸送ペプチドの組み込みは、トランスジェニック植物において異種ＥＰＳＰＳタンパク質配列を葉緑体に標的化することが示されている（米国特許第５，６２７，０６１号、同第５，６３３，４３５号、及び同第５，３１２，９１０号、ならびにＥＰ０２１８５７１、ＥＰ１８９７０７、ＥＰ５０８９０９、及びＥＰ９２４２９９を参照）。ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質を葉緑体に標的化するために、葉緑体輸送ペプチドをコードする配列を、植物細胞における発現のために設計されたＴＩＣ２１９９毒素タンパク質をコードする合成コード配列に対して作動可能な連結で、及びインフレームで５’に配置される。

ＴＩＣ２１９９に関連する追加の毒素タンパク質配列は、ＴＩＣ２１９９のアミノ酸配列を使用して生成して、新規の特性を有する新規のタンパク質を生成することができることが企図される。ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質をアラインメントして、アミノ酸配列レベルでの相違を新規のアミノ酸配列バリアントに組み合わせ、バリアントをコードする組換え核酸配列に適切な変更を加えることができる。

ＴＩＣ２１９９タンパク質毒素クラスの改良されたバリアントは、当該技術分野で既知の様々な遺伝子編集方法を使用することによって、植物において操作することができることが企図される。ゲノム編集に使用されるそのような技術としては、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、及びＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムが挙げられるが、これらに限定されない。これらのゲノム編集方法を使用して、植物細胞内で形質転換された毒素タンパク質コード配列を異なる毒素コード配列に改変することができる。具体的には、これらの方法を通して、毒素コード配列内の１つ以上のコドンを改変して、新しいタンパク質のアミノ酸配列を操作することができる。あるいは、コード配列内の断片を置き換えるか、もしくは欠失させてもよく、または追加のＤＮＡ断片をコード配列に挿入して、新しい毒素のコード配列を操作することができる。新しいコード配列は、昆虫類害虫に対する活性またはスペクトルの増加などの新しい特性を有する毒素タンパク質をコードすることができるだけでなく、元の昆虫毒素タンパク質に対して耐性が発達しているまたは耐性が生じる可能性が高い１種以上の昆虫類害虫種に対する活性を提供することができる。遺伝子編集された毒素コード配列を含む植物細胞は、当該技術分野で既知の方法によって、新しい毒素タンパク質を発現する植物全体を生成するために使用することができる。

ＴＩＣ２１９９またはそのタンパク質バリアントの断片は、１つ以上のアミノ酸がＮ末端、Ｃ末端、タンパク質の中央、またはそれらの組み合わせから欠失され、断片及びバリアントが昆虫阻害活性を保持する、切断型形態であり得ることも企図される。これらの断片は、ＴＩＣ２１９９または由来タンパク質バリアントの天然に存在する、または合成バリアントであり得るが、少なくともＴＩＣ２１９９の昆虫阻害活性を保持している必要がある。

ＴＩＣ２１９９タンパク質に類似するタンパク質は、当該技術分野で既知の様々なコンピュータベースのアルゴリズムを使用して同定され、互いに比較され得る。本出願で報告されるアミノ酸配列同一性は、以下のデフォルトパラメータを使用したＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントの結果である：重量マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップオープニングペナルティ：１０．０、ギャップエクステンションペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、残基特異的ギャップペナルティ：オン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３－４６８０）。パーセントアミノ酸同一性は、１００％との積（アミノ酸同一性／対象タンパク質の長さ）によってさらに計算される。他のアラインメントアルゴリズムも当該技術分野で利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを使用して得られたものと同様の結果を提供し、本明細書で企図される。

鱗翅目昆虫種に対する昆虫阻害活性を示すタンパク質は、タンパク質がクエリにおいて使用される場合（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント）、ＴＩＣ２１９９に関連し、配列番号２または４として示される本発明のタンパク質は、クエリタンパク質が、かかるアラインメントにおいてヒットとして同定される（約９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこの範囲内の任意の割合（パーセンテージ）であるクエリタンパク質の全長にわたって、少なくとも９６％～約１００％のアミノ酸同一性を示す）ことが意図される。

パーセント同一性に加えて、ＴＩＣ２１９９及びＴＩＣ２１９９のバリアントは、一次構造（保存されたアミノ酸モチーフ）、長さ、及び他の特徴によっても関連付けることができる。表１に、ＴＩＣ２１９９の特徴及びＴＩＣ２１９９タンパク質毒素のバリアントを報告する。

本出願の実施例にさらに記載されるように、配列番号３、６、９、１２、１４、１６、及び１８によってコードされるＴＩＣ２１９９をコードする合成核酸分子配列及びＴＩＣ２１９９のバリアントは、植物における使用のために設計された。遺伝コードの冗長性を考慮すると、毒素タンパク質をコードする任意の数の他の配列を産生することは、当該分野の技術の範囲内であるが、特に米国特許第５，５００，３６５号に記載されているように、植物における発現のために産生される配列は、コード配列の効率的な発現を妨害または制限する当該技術分野で既知の問題を回避する必要があることが理解される。

組換え核酸配列分子を含む発現カセット及びベクターを構築し、当該技術分野で既知の形質転換方法及び技術に従って、植物（特に、トウモロコシ、ダイズ、またはワタの植物細胞など）に導入することができる。例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換は、米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５Ａ１号（ダイズ）、同第２００８／０２８０３６１Ａ１号（ダイズ）、同第２００９／０１４２８３７Ａ１号（トウモロコシ）、同第２００８／０２８２４３２号（ワタ）、同第２００８／０２５６６６７号（ワタ）、同第２００３／０１１０５３１号（コムギ）、同第２００１／００４２２５７Ａ１号（サトウダイコン）、米国特許第５，７５０，８７１号（キャノーラ）、同第７，０２６，５２８号（コムギ）、及び同第６，３６５，８０７号（イネ）、ならびにＡｒｅｎｃｉｂｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．７：２１３－２２２（サトウキビ）に記載されており、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。形質転換細胞は、形質転換植物に再生され得、これらは、ＴＩＣ２１９９を発現し、形質転換植物から得られた植物葉ディスクを使用して、鱗翅目害虫の幼虫の存在下で行われるバイオアッセイを通して殺虫活性を示す。植物は、再生、種子、花粉、または成長点の形質転換技術によって植物細胞から誘導され得る。植物を形質転換する方法は、当該技術分野で既知である。

従来の形質転換方法の代替として、導入遺伝子、発現カセット（複数可）などのＤＮＡ配列を、部位特異的組み込みを介して、植物または植物細胞のゲノム内の特定の部位または遺伝子座に挿入または組み込むことができる。したがって、本開示の組換えＤＮＡ構築物（複数可）及び分子（複数可）は、植物または植物細胞のゲノムへの挿入のための少なくとも１つの導入遺伝子、発現カセット、または他のＤＮＡ配列を含むドナー鋳型配列を含み得る。部位特異的組み込みのためのそのようなドナー鋳型は、挿入配列（すなわち、植物ゲノムに挿入される配列、導入遺伝子、カセットなど）に隣接する１つまたは２つの相同性アームをさらに含み得る。本開示の組換えＤＮＡ構築物（複数可）は、部位特異的ヌクレアーゼ及び／または部位特異的組み込みを行うための任意の関連タンパク質（複数可）をコードする発現カセット（複数可）をさらに含み得る。これらのヌクレアーゼ発現カセット（複数可）は、ドナー鋳型と同じ分子もしくはベクター内（シス）、または別個の分子もしくはベクター上（トランス）に存在し得る。部位特異的組み込みのためのいくつかの方法は、ゲノムＤＮＡを切断して、所望のゲノム部位または遺伝子座で二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを生成する異なるタンパク質（またはタンパク質及び／またはガイドＲＮＡの複合体）を含み、当該技術分野で既知である。簡潔に、当該技術分野で理解されているように、ヌクレアーゼ酵素によって導入されるＤＳＢまたはニックを修復するプロセス中、ドナー鋳型ＤＮＡは、ＤＳＢまたはニックの部位でゲノムに組み込まれ得る。ドナー鋳型内の相同性アーム（複数可）の存在により、相同組換えを介した修復プロセス中の植物ゲノムへの挿入配列の導入及び標的化が促進され得るが、挿入事象は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じることもある。使用され得る部位特異的ヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されたまたは天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ、及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）が挙げられる。ＲＮＡ誘導部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）を使用する方法の場合、組換えＤＮＡ構築物（複数可）はまた、ヌクレアーゼを植物ゲノム内の所望の部位に誘導するための１つ以上のガイドＲＮＡをコードする配列を含む。

細菌及び植物で発現されるＴＩＣ２１９９タンパク質をコードする組換え核酸分子組成物は、タンパク質をコードするＯＲＦを有するポリヌクレオチド分子が、プロモーターなどの遺伝子発現エレメント及び構築物が意図されているシステムにおける発現に必要な任意の他の調節エレメントに作動可能に連結されている組換えＤＮＡ構築物を用いて発現することができる。非限定的な例としては、植物におけるタンパク質の発現のためのＴＩＣ２１９９タンパク質のコード配列に作動可能に連結された植物機能性プロモーター、またはＢｔ細菌または他のＢａｃｉｌｌｕｓ種におけるタンパク質の発現のためのＴＩＣ２１９９タンパク質のコード配列に作動可能に連結されたＢｔ機能性プロモーターが挙げられる。エンハンサー、イントロン、非翻訳リーダー、コードされたタンパク質固定化タグ（ＨＩＳタグ）、移行ペプチド（すなわち、プラスチド輸送ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のためのポリペプチド配列、リボソーム結合部位、及びＲＮＡｉ標的部位を含むがこれらに限定されない、他のエレメントを、ＴＩＣ２１９９タンパク質のコード配列に作動可能に連結することができる。本明細書で提供される例示的な組換えポリヌクレオチド分子としては、ＴＩＣ２１９９またはＴＩＣ２１９９の切断型バリアントをコードする配列番号１、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１６、もしくは１８などのポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーター、または配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。異種プロモーターはまた、プラスチド標的化ＴＩＣ２１９９をコードする合成ＤＮＡコード配列に作動可能に連結され得る。本明細書に開示されるタンパク質をコードする組換え核酸分子のコドンは、同義コドン（当該技術分野ではサイレント置換として知られている）によって置換され得る。

ＴＩＣ２１９９タンパク質のコード配列を含む組換えＤＮＡ構築物は、ＴＩＣ２１９９タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、または補助タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同時に発現または共発現するように構成され得る１つ以上の昆虫阻害剤をコードするＤＮＡ領域をさらに含み得る。補助タンパク質としては、例えば、昆虫阻害剤の発現を補助し、植物におけるその安定性に影響を及ぼし、オリゴマー化のための自由エネルギーを最適化し、その毒性を増強し、その活性のスペクトルを増加させることによって、補因子、酵素、結合パートナー、または昆虫阻害剤の有効性を補助するように機能する他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。補助タンパク質は、例えば、１つ以上の昆虫阻害剤の取り込みを促進するか、または毒剤の毒性効果を増強することができる。

組換えＤＮＡ構築物は、すべてのタンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子が、１つのプロモーターから発現されるように、または各タンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子が、別個のプロモーターもしくはそれらのいくつかの組み合わせの制御下にあるように構築することができる。本発明のタンパク質は、多遺伝子発現系から発現させることができ、選択された発現系のタイプに応じて、ＴＩＣ２１９９が、他のオープンリーディングフレーム及びプロモーターも含む共通のヌクレオチドセグメントから発現される。例えば、細菌多遺伝子発現系は、単一のプロモーターを利用して、単一のオペロン内からの多重連結／タンデムオープンリーディングフレームの発現（すなわち、ポリシストロン発現）を駆動することができる。別の例では、植物多遺伝子発現系は、多重に連結されていないまたは連結された発現カセットを利用することができ、各カセットが、異なるタンパク質または１つ以上のｄｓＲＮＡ分子などの他の薬剤を発現する。

ＴＩＣ２１９９タンパク質のコード配列を含む組換えポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ構築物は、ベクター（例えば、プラスミド、バキュロウイルス、合成染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージ、またはウイルスベクター）によって宿主細胞に送達され得る。そのようなベクターを使用して、宿主細胞におけるＴＩＣ２１９９タンパク質のコード配列の安定な発現もしくは一過性の発現、またはコードされたポリペプチドのその後の発現を達成することができる。ＴＩＣ２１９９タンパク質のコード配列を含み、宿主細胞に導入される外因性組換えポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ構築物は、本出願において「導入遺伝子」と称される。

本明細書において、ＴＩＣ２１９９または関連するファミリー毒素タンパク質のコード配列を発現する組換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック細菌、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物、及びトランスジェニック植物部分が提供される。「細菌細胞」または「細菌」という用語には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。「植物細胞」または「植物」という用語には、双子葉植物または単子葉植物が含まれ得るが、これらに限定されない。「植物細胞」または「植物」という用語には、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ属（例えば、キャノーラ）、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ミカン属、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トウモロコシ（すなわち、メイズ）（例えば、スイートコーンまたはフィールドコーン）、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、シバクサ、スイカ、及びコムギの植物細胞または植物も含まれ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、トランスジェニック植物細胞から再生されたトランスジェニック植物及びトランスジェニック植物部分が提供される。ある特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、切断、スナップ、粉砕、または他の方法で植物から部分を解離することによって、トランスジェニック種子から得ることができる。ある特定の実施形態では、植物部分は、種子、莢、葉、花、茎、根、もしくはそれらの任意の部分、またはトランスジェニック植物部分の再生不能な部分であり得る。この文脈で使用される場合、トランスジェニック植物部分の「再生不能な」部分は、植物全体を形成するように誘導することができない部分、または有性生殖及び／または無性生殖が可能な植物全体を形成するように誘導することができない部分である。特定の実施形態では、植物部分の再生不能部分は、トランスジェニック種子、莢、葉、花、茎、または根の部分である。

昆虫の鱗翅目阻害量または半翅目阻害量のＴＩＣ２１９９タンパク質を含むトランスジェニック植物の作製方法が提供される。そのような植物は、本出願で提供されるタンパク質のいずれかをコードする組換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、昆虫の鱗翅目阻害量のタンパク質を発現する当該植物細胞に由来する植物を選択することによって作製することができる。植物は、再生、種子、花粉、または成長点の形質転換技術によって植物細胞から誘導され得る。植物を形質転換する方法は、当該技術分野で既知である。

処理された植物産物も本明細書に開示され、処理された産物は、検出可能な量のＴＩＣ２１９９、昆虫阻害セグメントもしくはその断片、またはその任意の特徴的な部分を含む。ある特定の実施形態では、処理された産物は、植物部分、植物バイオマス、油、食事、糖、動物飼料、粉末、破片、ふすま、リント、殻、処理された種子、及び種子からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、処理された産物は、再生不能である。植物産物には、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物部分に由来する商品または他の商業産物が含まれ得、商品または他の産物は、ＴＩＣ２１９９の特徴的な部分をコードするかまたはそれを含むヌクレオチドセグメントまたは発現ＲＮＡまたはタンパク質を検出することによって商業を通して追跡することができる。

ＴＩＣ２１９９タンパク質を発現する植物は、他の毒素タンパク質を発現する、及び／または除草剤耐性遺伝子、収量もしくはストレス耐性形質を付与する遺伝子などの他のトランスジェニック形質を発現するトランスジェニック事象と交配することによって交配することができ、またはかかる形質は、単一のスタックされたベクターに形質がすべて連結されるように組み合わせることができる。

実施例にさらに記載されるように、ＴＩＣ２１９９タンパク質のコード配列及びＴＩＣ２１９９とかなりの割合の同一性を有する配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、熱増幅、及びハイブリダイゼーションなどの当業者に既知の方法を使用して同定することができる。例えば、タンパク質ＴＩＣ２１９９は、関連タンパク質に特異的に結合する抗体を産生するために使用することができ、密接に関連する他のタンパク質メンバーをスクリーニングし、検出するために使用することができる。

さらに、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、熱サイクルまたは等温増幅及びハイブリダイゼーション法を使用して、クラスの他のメンバーを同定するためのスクリーニング用のプローブ及びプライマーとして使用することができる。例えば、配列番号３、６、９、または１２に示される配列に由来するオリゴヌクレオチドを使用して、商品に由来するデオキシリボ核酸試料中のＴＩＣ２１９９導入遺伝子の存在または不在を決定することができる。オリゴヌクレオチドを用いる特定の核酸検出方法の感度を考慮すると、配列番号３に示される配列に由来するオリゴヌクレオチドを使用して、プールされた供給源に由来する商品（商品のごく一部が導入遺伝子のいずれかを含むトランスジェニック植物に由来する）中のＴＩＣ２１９９導入遺伝子を検出することができると予想される。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、配列番号１、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１６、及び１８の各々にヌクレオチド配列のバリエーションを導入することができることがさらに認識される。そのような「変異誘発」オリゴヌクレオチドは、トランスジェニック植物宿主細胞において昆虫阻害活性または多様な発現の範囲を示すＴＩＣ２１９９アミノ酸配列バリアントの同定に有用である。

ヌクレオチド配列相同体、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本出願に開示される配列の各々またはいずれかにハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる殺虫性タンパク質もまた、本発明の実施形態である。本発明はまた、第２のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列を検出するための方法も提供し、第１のヌクレオチド配列（またはその逆相補配列）は、殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードし、第２のヌクレオチド配列にハイブリダイズする。そのような場合、第２のヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１６、または１８として示されるヌクレオチド配列のいずれかであり得る。ヌクレオチドコード配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件などの適切なハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズし、これらのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は、他のタンパク質のいずれか１つに対して産生された抗血清と交差反応する。厳密なハイブリダイゼーション条件は、本明細書で定義される場合、少なくとも４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、室温での２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる各々５分間の２回の洗浄、続いて、６５℃での０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の各々３０分間の２回の洗浄を含む。さらに高い温度での洗浄は、さらにストリンジェントな条件、例えば、６８℃のハイブリダイゼーション条件、続いて、６８℃での０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中の洗浄を構成する。

当業者であれば、遺伝コードの冗長性に起因して、多くの他の配列がそのような関連タンパク質をコードすることができ、それらの配列は、それらがＢａｃｉｌｌｕｓ株または植物細胞のいずれかで殺虫性タンパク質を発現するように機能する限り、本発明の実施形態であることを認識し、もちろん、そのような冗長なコード配列の多くが、これらの条件下で、ＴＩＣ２１９９バリアントをコードする天然のＢａｃｉｌｌｕｓ配列にハイブリダイズしないことを認識するであろう。本出願は、ＴＩＣ２１９９バリアントタンパク質をコードする配列及びＴＩＣ２１９９バリアントタンパク質をコードする配列とかなりの割合の同一性を有する配列を同定するために、これらの同定方法及び当業者に既知の他の同定方法の使用を企図する。

本開示は、殺虫性タンパク質由来のタンパク質のキメラを含む商業的に有用なタンパク質を操作及びクローニングするための当該技術分野で既知の分子方法の使用も企図する。例えば、キメラは、ＴＩＣ２１９９タンパク質及び関連タンパク質とは異なる多様なタンパク質のセグメントを有するＴＩＣ２１９９タンパク質のセグメントのアセンブリを含む、ＴＩＣ２１９９タンパク質のセグメントからアセンブリされて、追加の有用な実施形態を導き出すことができる。ＴＩＣ２１９９タンパク質は、互いに、及び他のＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、または他の殺虫性タンパク質（これらが系統発生的に密接にまたは遠くに関連するかどうかにかかわらず）とアラインメントに供されてもよく、アラインメントしたタンパク質間の置換に有用であり、キメラタンパク質の構築をもたらすそのような各タンパク質のセグメントが同定される可能性がある。かかるキメラタンパク質は、害虫バイオアッセイ分析に供されてもよく、キメラにおけるそのような各セグメントが由来した親タンパク質と比較して、増加した生物活性または拡大した標的害虫スペクトルの存在または不在について特徴付けることができる。ポリペプチドの殺虫活性は、ドメインまたはセグメントを他のタンパク質と入れ替えることによって、または当該技術分野で既知の定向進化法を使用することによって、特定の害虫またはより広範囲の害虫に対する活性のためにさらに操作され得る。

本出願には、ＴＩＣ２１９９タンパク質を用いて昆虫、特に作物植物の鱗翅目の蔓延を駆除する方法が開示されている。そのような方法は、昆虫または鱗翅目の阻害量のＴＩＣ２１９９毒素タンパク質を含む植物を生育することを含み得る。特定の実施形態では、かかる方法は、以下のうちのいずれか１つ以上をさらに含み得る：（ｉ）ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質を含むかまたはコードする任意の組成物を、植物または植物を生じる種子に適用すること、及び（ｉｉ）植物または植物を生じる植物細胞を、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換すること。一般に、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質は、鱗翅目昆虫に対して昆虫阻害活性を付与するために、組成物中に提供されてもよく、微生物中に提供されてもよく、またはトランスジェニック植物中に提供されてもよいことが企図される。

ある特定の実施形態では、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質の組換え核酸分子は、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質を発現するように形質転換された組換えＢａｃｉｌｌｕｓまたは任意の他の組換え細菌細胞を、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質を発現するのに好適な条件下で培養することによって調製される昆虫阻害組成物の殺虫活性成分である。かかる組成物は、当該組換えポリペプチドを発現／産生する、かかる組換え細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、または濃縮によって調製され得る。そのようなプロセスにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたは他の昆虫病原性細菌の細胞抽出物、細胞懸濁液、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞上清、細胞濾液、または細胞ペレットを得ることができる。そのように生成された組換えポリペプチドを得ることによって、組換えポリペプチドを含む組成物には、細菌細胞、細菌胞子、及び傍胞子封入体が含まれ得、農業用昆虫阻害スプレー製品として、または食餌バイオアッセイにおける昆虫阻害性製剤として含む、様々な用途のために製剤化され得る。

一実施形態では、耐性発達の可能性を低減するために、ＴＩＣ２１９９タンパク質を含む昆虫阻害組成物は、同じ鱗翅目昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すが、ＴＩＣ２１９９毒素タンパク質とは異なる少なくとも１つの追加のポリペプチドをさらに含むことができる。そのような組成物のための可能な追加のポリペプチドとしては、昆虫阻害タンパク質及び昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子が挙げられる。昆虫類害虫を駆除するためにそのようなリボヌクレオチド配列を使用する一例は、Ｂａｕｍ，ｅｔ ａｌ．（米国特許公開第２００６／００２１０８７Ａ１号）に記載されている。鱗翅目害虫の駆除のためのそのような追加のポリペプチドは、例えば、以下の昆虫阻害タンパク質からなるがそれらに限定されない群から選択することができる：Ｃｒｙ１Ａ（米国特許第５，８８０，２７５号）、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許公開第１０／５２５，３１８号）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許第６，０３３，８７４号）、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｄａ、及びそれらのバリアント、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、及びＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許第７，０７０，９８２号、６，９６２，７０５号、及び６，７１３，０６３号）、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ１型のキメラ、例えば、限定されないが、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、及びＴＩＣ１１００（国際出願公開第２０１６／０６１３９１（Ａ２）号）、ＴＩＣ２１６０（国際出願公開第２０１６／０６１３９２（Ａ２）号）、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ（米国特許第７，０６４，２４９号）、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ１４１５、Ｖｉｐ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＶＩＰ３Ｂ、ＡＸＭＩ－００１、ＡＸＭＩ－００２、ＡＸＭＩ－０３０、ＡＸＭＩ－０３５、及びＡＸＭＩ－０４５（米国特許公開第２０１３－０１１７８８４Ａ１号）、ＡＸＭＩ－５２、ＡＸＭＩ－５８、ＡＸＭＩ－８８、ＡＸＭＩ－９７、ＡＸＭＩ－１０２、ＡＸＭＩ－１１２、ＡＸＭＩ－１１７、ＡＸＭＩ－１００（米国特許公開第２０１３－０３１０５４３Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１１５、ＡＸＭＩ－１１３、ＡＸＭＩ－００５（米国特許公開第２０１３－０１０４２５９Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１３４（米国特許公開第２０１３－０１６７２６４Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１５０（米国特許公開第２０１０－０１６０２３１Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１８４（米国特許公開第２０１０－０００４１７６Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１９６、ＡＸＭＩ－２０４、ＡＸＭＩ－２０７、ＡＸＭＩ－２０９（米国特許公開第２０１１－００３００９６Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０（米国特許公開第２０１４－０２４５４９１Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２２ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ、ＡＸＭＩ－２２４ｚ、ＡＸＭＩ－２２５ｚ（米国特許公開第２０１４－０１９６１７５Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２３８（米国特許公開第２０１４－００３３３６３Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２７０（米国特許公開第２０１４－０２２３５９８Ａ１号）、ＡＸＭＩ－３４５（米国特許公開第２０１４－０３７３１９５Ａ１号）、ＡＸＭＩ－３３５（国際出願公開第２０１３／１３４５２３（Ａ２）号）、ＤＩＧ－３（米国特許公開第２０１３－０２１９５７０Ａ１号）、ＤＩＧ－５（米国特許公開第２０１０－０３１７５６９Ａ１号）、ＤＩＧ－１１（米国特許公開第２０１０－０３１９０９３Ａ１号）、ＡｆＩＰ－１Ａ及びその派生物（米国特許公開第２０１４－００３３３６１Ａ１号）、ＡｆＩＰ－１Ｂ及びその派生物（米国特許公開第２０１４－００３３３６１Ａ１号）、ＰＩＰ－１ＡＰＩＰ－１Ｂ（米国特許公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、ＰＳＥＥＮ３１７４（米国特許公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、ＡＥＣＦＧ－５９２７４０（米国特許公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、Ｐｐｕｔ＿１０６３（米国特許公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、ＤＩＧ－６５７（国際出願公開第２０１５／１９５５９４Ａ２号）、Ｐｐｕｔ＿１０６４（米国特許公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、ＧＳ－１３５及びその派生物（米国特許公開第２０１２－０２３３７２６Ａ１号）、ＧＳ１５３及びその派生物（米国特許公開第２０１２－０１９２３１０Ａ１号）、ＧＳ１５４及びその派生物（米国特許公開第２０１２－０１９２３１０Ａ１号）、ＧＳ１５５及びその派生物（米国特許公開第２０１２－０１９２３１０Ａ１号）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２０１２－０１６７２５９Ａ１号に記載）、２配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２０１２－００４７６０６Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２０１１－０１５４５３６Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２０１１－０１１２０１３Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２０１０－０１９２２５６Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２０１０－００７７５０７Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２０１０－００７７５０８Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２００９－０３１３７２１Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許公開第２０１０－０２６９２２１Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許第７，７７２，４６５（Ｂ２）号に記載）、ＣＦ１６１＿００８５及びその派生物（ＷＯ２０１４／００８０５４Ａ２に記載）、鱗翅目毒性タンパク質及びそれらの派生物（米国特許公開第２００８－０１７２７６２Ａ１号、同第２０１１－００５５９６８Ａ１号、及び同第２０１２－０１１７６９０Ａ１号に記載）、配列番号２または４及びその派生物（ＵＳ７５１０８７８（Ｂ２）に記載）、配列番号２または４及びその派生物（米国特許第７８１２１２９（Ｂ１）号に記載）など。

他の実施形態では、かかる組成物／製剤は、得られる昆虫阻害の範囲を拡大するために、そうでなければ本発明の昆虫阻害タンパク質によって阻害されない、昆虫に対する昆虫阻害活性を示す少なくとも１つの追加のポリペプチドをさらに含むことができる。例えば、半翅目害虫の駆除のために、本発明の昆虫阻害タンパク質の組み合わせは、半翅目活性タンパク質、例えば、ＴＩＣ１４１５（米国特許公開第２０１３－００９７７３５Ａ１号）、ＴＩＣ８０７（米国特許第８６０９９３６号）、ＴＩＣ８３４（米国特許公開第２０１３－０２６９０６０Ａ１号）、ＡＸＭＩ－０３６（米国特許公開第２０１０－０１３７２１６Ａ１号）、及びＡＸＭＩ－１７１（米国特許公開第２０１３－００５５４６９Ａ１号）とともに使用することができる。さらに、鞘翅目害虫の駆除のためのポリペプチドは、例えば、以下の昆虫阻害タンパク質からなるがそれらに限定されない群から選択することができる：Ｃｒｙ３Ｂｂ（米国特許第６，５０１，００９号）、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３４／３５、５３０７、ＡＸＭＩ１３４（米国特許公開第２０１３－０１６７２６４Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１８４（米国特許公開第２０１０－０００４１７６Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２０５（米国特許公開第２０１４－０２９８５３８Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２０７（米国特許公開第２０１３－０３０３４４０Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０（米国特許公開第２０１４－０２４５４９１Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ（米国特許公開第２０１４－０１９６１７５Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２７９（米国特許公開第２０１４－０２２３５９９Ａ１号）、ＡＸＭＩ－Ｒ１及びそのバリアント（米国特許公開第２０１０－０１９７５９２Ａ１号）、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、ＤＩＧ－１０（米国特許公開第２０１０－０３１９０９２Ａ１号）、ｅＨＩＰ（米国特許出願公開第２０１０／００１７９１４号）、ＩＰ３及びそのバリアント（米国特許公開第２０１２－０２１０４６２Ａ１号）、ならびにω－Ｈｅｘａｔｏｘｉｎ－Ｈｖ１ａ（米国特許出願公開第２０１４－０３６６２２７Ａ１号）。

ＴＩＣ２１９９クラスの昆虫阻害タンパク質と組み合わせることができる鞘翅目、鱗翅目、及び半翅目の昆虫類害虫の駆除のための追加のポリペプチドは、Ｎｅｉｌ Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅによって維持されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素命名法のウェブサイト（ワールドワイドウェブのｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ）で見出すことができる。概して、当業者に既知の任意の昆虫阻害タンパク質は、植物において（育種もしくは分子スタッキングを通して組み合わされる）、またはバイオ殺虫剤もしくはバイオ殺虫剤の組み合わせとしての組成物もしくは製剤においての両方で、ＴＩＣ２１９９ファミリーのタンパク質と組み合わせて使用され得ることが企図される。

昆虫が特定の殺虫剤に対する耐性を発達させる可能性は、当該技術分野で文書化されている。１つの昆虫耐性管理戦略は、異なる作用様式を介して作用する２つの異なる昆虫阻害剤を発現するトランスジェニック作物を用いることである。したがって、昆虫阻害剤のいずれか１つに耐性を有する任意の昆虫は、他の昆虫阻害剤によって駆除され得る。別の昆虫耐性管理戦略は、標的となる鱗翅目害虫種から保護されていない植物を使用して、そのような保護されていない植物の救済を提供する。１つの特定の例は、米国特許第６，５５１，９６２号（その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。

種子処理、スプレーオン、ドリップオン、またはワイプオン製剤においてタンパク質とともに使用される、本明細書に開示されるタンパク質によっても駆除される害虫を駆除するために設計されている局所適用殺虫化学物質などの他の実施形態では、土壌に直接適用されるか（土壌ドレンチ）、本明細書に開示されるタンパク質を発現する植物の生育に適用されるか、または開示されるタンパク質のうちの１つ以上をコードする１つ以上の導入遺伝子を含む種子に適用されるように製剤化することができる。種子処理で使用するためのそのような製剤は、当該技術分野で既知の様々な粘着剤及び粘着付与剤とともに適用することができる。そのような製剤は、開示されたタンパク質と相乗的な作用様式である殺虫剤を含有することができるため、製剤殺虫剤は、開示されたタンパク質によって駆除され得る同じもしくは類似の害虫を駆除するために異なる作用様式を通して作用するか、またはそのような殺虫剤は、ＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質によって効果的に駆除されないより広い宿主範囲内の害虫もしくは植物害虫種を駆除するように作用する。

前述の組成物／製剤は、餌、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、スプレー、乳剤、コロイド懸濁液、水溶液、Ｂａｃｉｌｌｕｓ胞子／結晶調製物、種子処理、１つ以上のタンパク質を発現するように形質転換された組換え植物細胞／植物組織／種子／植物、または１つ以上のタンパク質を発現するように形質転換された細菌などの農業的に許容される担体をさらに含むことができる。組換えポリペプチドに固有の昆虫阻害または殺虫阻害のレベル及び植物または食餌アッセイに適用される製剤のレベルに応じて、組成物／製剤は、様々な量の（重量で）組換えポリペプチド、例えば、０．０００１重量％～０．００１重量％、～０．０１重量％、～１重量％、～９９重量％の組換えポリペプチドを含むことができる。

上記を考慮すると、当業者は、開示され、なおかつ本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得る特定の態様において変更を行うことができることを理解すべきである。したがって、本明細書に開示される特定の構造及び機能の詳細は、限定として解釈されるべきではない。本明細書に引用される各参考文献の開示全体が本出願の開示内に組み込まれることが理解されるべきである。

実施例１
ＴＩＣ２１９９の発見、クローニング、及び発現
ＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）株ＥＧ８６３９のゲノムの配列解析によって同定した。Ｂｔ株ＥＧ８６３９は、胞子形成、結晶、及びプラスミドを含むＢｔまたはＢｔ様細菌の株として最初に同定された。ＤＮＡをＥＧ８６３９から単離し、配列を決定した。次いで、アセンブリされた配列を生物学的に分析した。ＴＩＣ２１９９タンパク質は、エンドトキシンドメインのヒット数及び既知のＣｒｙ１Ｉｂ３毒素（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＤ７５５１５）との同一性に対するｐｆａｍ分析によって同定した。全長ＴＩＣ２１９９タンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＤ７５５１５のＣｒｙＩｂ３タンパク質のアミノ酸配列と９５．１３％の同一性を示す。

Ｂｔ株ＥＧ８６３９から単離された全ゲノムＤＮＡ由来のＴＩＣ２１９９のコード領域の全長コピーを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーを設計した。ＰＣＲアンプリコンを、当該技術分野で既知の方法を使用して、２つのプラスミド構築物（１つは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅｃ）で発現可能なプロモーター及びタンパク質精製に使用されるヒスチジンタグと作動可能に連結されたＥｃ発現ベクター、もう１つは、Ｂｔで発現可能なプロモーターと作動可能に連結されたＢｔ発現ベクター）にクローニングした。Ｅｃ及びＢｔの両方に由来するＴＩＣ２１９９の調製物を、バイオアッセイで使用した。

実施例２
ＴＩＣ２１９９は、昆虫バイオアッセイにおいて鱗翅目活性を示した
殺虫性タンパク質ＴＩＣ２１９９を、実施例１に記載のベクターを使用して組換えＥｃ及びＢｔで発現させ、これらの系において発現される得られたタンパク質を、鱗翅目、鞘翅目、及び半翅目の様々な種に対する毒性についてアッセイした。

鱗翅目昆虫種のタマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、ソイビーンポッドワームとしても知られている）、イラクサギンウワバ（ＣＬＷ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ヨーロッパアワノメイガ（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、サザンアーミーワーム（ＳＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ）、サトウキビメイガ（ＳＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、サウスウエスタンコーンボーラー（ＳＷＣ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、及びベルベットビーンキャタピラー（ＶＢＣ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、鞘翅目種のウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、サザンコーンルートワーム（ＳＣＲ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉｉ）、半翅目種のサビイロメクラガメ（ＴＰＢ、Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、ウエスタンサビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、及び新熱帯区褐色カメムシ（ＮＢＳＢ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）に対する毒性について、ＴＩＣ２１９９をアッセイした。以下の表２に、バイオアッセイの結果を示す。ここで、「＋」は活性を示し、「－」は不活性を示す。

表２に提示されたデータから分かるように、ＴＩＣ２１９９は、鱗翅目種ＢＣＷ、ＣＬＷ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＳＡＷ、ＳＢＬ、ＳＣＢ、ＳＷＣ、ＶＢＣ、及びＷＢＣ、ならびに半翅目種ＴＰＢ及びＮＢＳＢに対する活性を実証した。

実施例３
植物での発現における使用のためのＴＩＣ２１９９の人工コード配列の設計。
ＴＩＣ２１９９をコードする配列番号３、６、９、１２、１４、１６、及び１８の人工コード配列、ならびにＴＩＣ２１９９の切断型を、植物細胞における発現のために設計した。人工（あるいは合成と称される）配列を、米国特許第５，５００，３６５号に概して記載されている方法に従って合成して、天然Ｂａｃｉｌｌｕｓタンパク質のアミノ酸配列を保存しながら、ＡＴＴＴＡ及びＡ／Ｔリッチ植物ポリアデニル化配列などの特定の不利な問題配列を回避した。

ＴＩＣ２１９９、ＴＩＣ２１９９＿１、ＴＩＣ２１９９＿２、及びＴＩＣ２１９９＿３をコードする人工配列を、当該技術分野で既知の技術を使用して、植物形質転換ベクターに、植物細胞におけるコード配列の発現を駆動する植物プロモーターの下流に、機能的に連結させてクローニングした。トウモロコシ植物を形質転換するために使用される得られた形質転換ベクターのうちの５つは、ＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質の発現のために、第１の導入遺伝子カセットであって、構成的プロモーターを含み、リーダーの５’側に作動可能に連結され、イントロンの５’側に作動可能に連結され、ＴＩＣ２１９９をコードする人工コード配列の５’側に作動可能に連結され、これが次に３’ＵＴＲの５’側に作動可能に連結された、第１の導入遺伝子カセットと、グリホサート選択を使用して形質転換植物細胞を選択するための、第２の導入遺伝子カセットと、を含んだ。９つの植物形質転換ベクターはまた、葉緑体中のタンパク質の蓄積を指示する、ＴＩＣ２１９９コード配列の５’側に作動可能に連結され、インフレームでクローニングされた、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）も含んだ。葉緑体輸送ペプチドを含む９つの植物形質転換ベクターのうち６つは、配列番号３、６、９、または１２のコード配列を含んだ。葉緑体輸送ペプチドを含む９つの植物形質転換ベクターのうちの３つは、配列番号１４、１６、または１８のコード配列を含んだ。

実施例４
ＴＩＣ２１９９は、
安定的に形質転換されたトウモロコシ植物において発現された場合、鱗翅目活性を示す。
ＴＩＣ２１９９及びＴＩＣ２１９９切断バリアントの殺虫性タンパク質を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリ植物形質転換ベクターを、当該技術分野で既知の方法を使用してクローニングした。得られたベクターを使用して、トウモロコシ植物を安定的に形質転換した。組織を、形質転換体から採取し、様々な鱗翅目昆虫種に対する昆虫バイオアッセイに使用した。

トウモロコシ植物を、アグロバクテリウム媒介形質転換法を使用して、実施例３に記載されている６つのバイナリ形質転換ベクターで形質転換した。形質転換細胞を、当該技術分野で既知の方法によって、植物を形成するように誘導した。植物葉ディスクを使用したバイオアッセイは、米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているものと同様に行った。１日齢未満の単一の孵化したばかりの新生幼虫を、各葉ディスク試料に配置し、約４日間給餌した。非形質転換トウモロコシ植物を使用して、組織を得て、陰性対照として使用した。各バイナリベクターからの複数の形質転換Ｒ_０単一コピー挿入事象を、タマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ヨーロッパアワノメイガ（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、及びサウスウエスタンコーンボーラー（ＳＷＣ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）に対して評価した。バイオアッセイにおける葉の損傷の割合（％）に基づいて、０～３の範囲の有効性評価スコア（０は効果なし、３は非常に有効）を各事象に割り当てた。

有効性評価スコアに基づいて、ＴＩＣ２１９９、ＴＩＣ２１９９＿１、ＴＩＣ２１９９＿２、及びＴＩＣ２１９９＿３は、ＣＴＰの有無にかかわらず、ＥＣＢ及びＳＷＣに対する形質転換Ｒ_０単一コピー事象において、３の有効性評価スコアを示し、これら２つの害虫種に対して非常に有効であった。

ＴＩＣ２１９９を発現する３つの形質転換ベクターに由来する選択されたＲ_０植物を、形質転換されていない野生型エリート品種植物と交配して、ハイブリッド種子を産生した。ＴＩＣ２１９９を含むヘテロ接合性Ｆ_１種子を生育し、タマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、ヨーロッパアワノメイガ（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、及びサウスウエスタンコーンボーラー（ＳＷＣ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）に対して上記のようにアッセイした。有効性評価スコアに基づいて、ＴＩＣ２１９９を発現する安定的に形質転換されたヘテロ接合性Ｆ_１トウモロコシ植物は、ＣＴＰの有無にかかわらず、ＥＣＢ及びＳＷＣに対して非常に有効であった。

ＴＩＣ２１９９を発現する植物を、上記のものと同様の葉ディスクアッセイを使用して、サトウキビメイガ（ＳＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）及びモロコシマダラメイガ（ＬＣＳＢ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）に対してアッセイした。ＴＩＣ２１９９は、ＳＣＢに対して有効であり、ＬＣＳＢに対して非常に有効であった。

実施例５
安定的に形質転換されたダイズ植物における鱗翅目昆虫類害虫に対するＴＩＣ２１９９の活性のアッセイ
ＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリ植物形質転換ベクターを、当該技術分野で既知の方法を使用してクローニングする。得られたベクターは、安定的に形質転換されたダイズ植物を形質転換するために使用される。組織は、形質転換体から採取され、様々な鱗翅目昆虫種に対する昆虫バイオアッセイに使用される。

ＴＩＣ２１９９及びＴＩＣ２１９９切断バリアントをコードする人工コード配列を、当該技術分野で既知の技術を使用して、植物形質転換ベクター構築物にクローニングする。得られた形質転換ベクター構築物は、ＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質の発現のための第１の導入遺伝子カセットであって、植物発現性プロモーターを含み、リーダーの５’側に作動可能に連結され、任意選択的に、イントロンの５’側に作動可能に連結され、ＴＩＣ２１９９をコードする人工コード配列の５’側に作動可能に連結され、これが次に、３’ＵＴＲの５’側に作動可能に連結される、第１の導入遺伝子カセットと、スペクチノマイシン選択を使用して形質転換植物細胞を選択するための第２の導入遺伝子カセットと、を含む。葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）は、任意選択的に、人工ＴＩＣ２１９９コード配列と５’及びインフレームでクローニングすることができる。

ダイズ植物を、アグロバクテリウム媒介形質転換法を使用して形質転換する。形質転換細胞は、当該技術分野で既知の方法によって植物を形成するように誘導される。植物葉ディスクを使用するバイオアッセイは、米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているものと同様に行われる。１日齢未満の単一の孵化したばかりの新生幼虫を各葉ディスク試料に配置し、約４日間給餌する。形質転換されていないトウモロコシ植物を使用して組織を得て、陰性対照として使用する。各バイナリベクターからの複数の形質転換Ｒ_０単一コピー挿入事象を、限定されないが、チャイロハスモンヨトウ（ＢＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）、サザンアーミーワーム（ＳＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、アメリカタバコガ（ＳＰＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、サンフラワールーパー（ＳＦＬ、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）、及びベルベットビーンキャタピラー（ＶＢＣ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）などの鱗翅目昆虫種に対して評価する。０～３の範囲の有効性評価スコアは、各事象についてのバイオアッセイにおける葉の損傷の割合、及び表３に示されるように、最も低い損傷範囲の割合（浸透率）を共有した事象の割合に基づいて、各事象に割り当てられる。

実施例６
安定的に形質転換されたダイズ植物における半翅目昆虫類害虫
に対するＴＩＣ２１９９の活性のアッセイ
ＴＩＣ２１９９殺虫性タンパク質を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリ植物形質転換ベクターを、当該技術分野で既知の方法を使用してクローニングする。得られたベクターは、安定して形質転換されたダイズ植物を形質転換するために使用される。組織は、形質転換体から採取され、様々な鱗翅目昆虫種に対する昆虫バイオアッセイに使用される。

ＴＩＣ２１９９をコードする人工コード配列を、当該技術分野で既知の技術を使用して、植物形質転換ベクター構築物にクローニングする。得られた形質転換ベクター構築物は、上記の実施例５に記載のものと同様である。葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）は、任意選択的に、人工ＴＩＣ２１９９コード配列と５’及びインフレームでクローニングすることができる。

ダイズ植物を、アグロバクテリウム媒介形質転換法を使用して形質転換する。形質転換細胞は、当該技術分野で既知の方法によって植物を形成するように誘導される。半翅目害虫に対する活性のアッセイは、様々な技術を使用して行われ、それらは、半翅目害虫の種及びその害虫の好ましい標的組織に依存することになる。例えば、カメムシの半翅目害虫種は、典型的には、ダイズ植物の発生中の種子及び莢を餌とする。カメムシに対する活性をアッセイするために、Ｒ５ステージの莢を、ＴＩＣ２１９９を発現するトランスジェニックダイズ植物から採取し、寒天または湿紙のいずれかの層を含む被覆されたペトリディッシュまたは大型マルチウェルプレートに配置して、給餌環境に湿度を提供する。２齢のカメムシの若虫を、ペトリディッシュまたは大型マルチウェルプレートに配置する。乾燥を防ぎながら酸素の交換を提供するカバーを、給餌環境の上に配置する。カメムシの若虫に、数日間給餌させる。発育阻害及び死亡率の測定を行い、形質転換されていないダイズ植物の莢を餌とするカメムシの若虫と比較する。

あるいは、活性のアッセイはまた、安定的に形質転換された植物全体に対して行うことができる。ＴＩＣ２１９９を発現する形質転換植物を、生育箱または温室で生育させる。Ｒ５段階では、植物を、通気性プラスチック「受粉」シート（Ｖｉｌｕｔｉｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＬ）で作られたケージに入れる。Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）タイを使用して、シートスリーブを土壌表面のすぐ上の主茎に固定する。各植物には、特定の数の２齢のカメムシの若虫を蔓延させる。ケージサイドの小さなスリットを通して、若虫を個々のケージに放ち、昆虫が逃げないように、ケージをしっかり閉じる。若虫は、数日間から１週間またはそれ以上、ダイズの莢を餌とすることができる。発育阻害及び死亡率の測定値を決定するために、毎日観察が行われる。給餌期間の終わりに、生きた若虫及び死んだ若虫を回収する。植物を、ケージの下で切り取り、実験室に移し、植物ごとに昆虫を回収する。ケージを開く前に、植物を激しく振って、すべての昆虫が摂食部位からケージの基部に落ちたことを確認する。次いで、ケージの基部を開け、すべての植物材料を除去し、黒いシートの上に置く。アスピレータまたはいくつかの他の手段を使用して、昆虫を回収することができる。昆虫の数及びその発生段階を、植物ごとに記録する。また、死んだ若虫の数及び発生段階も記録する。これらの測定値は、形質転換されていない植物から得られた陰性対照の測定値と比較される。

カメムシの若虫の発達の遅延（発育阻害）または死亡率は、形質転換されていない対照と比較したときに有意差がある場合、毒性の指標として解釈される。

実施例７
安定的に形質転換されたワタ植物における半翅目昆虫類害虫
に対するＴＩＣ２１９９の活性のアッセイ
この実施例は、ＴＩＣ２１９９を発現するように安定的に形質転換されたワタ植物における半翅目昆虫類害虫に対する活性のアッセイを記載する。

プラスチド標的化ＴＩＣ２１９９及び非標的化ＴＩＣ２１９９の両方を発現するように設計された導入遺伝子カセットを含むバイナリ植物形質転換ベクターを、当該技術分野で既知の方法を使用してクローニングする。

ワタ植物を、バイナリ植物形質転換ベクターを使用して形質転換する。形質転換されたワタ植物細胞を誘導して、植物全体を形成する。半翅目害虫に対する活性のアッセイは、様々な技術を使用して行われ、それらは、半翅目害虫の種及びその害虫の好ましい標的組織に依存することになる。例えば、カメムシの半翅目害虫種は、典型的には、種子摂食性であり、したがって、綿実（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌ）への損傷が主な懸念である。それらは主に綿実に穴を開け、種子を食べることによってワタを損傷させる。それらの摂食活動は、摂食が行われたより大きな綿実の外側に直径約１／１６インチの黒い斑点が生じる可能性がある。種子の摂食は、摂食部位の近くでリントの生成が減少し、リントが汚れる可能性がある。成虫及び４齢及び５齢の若虫は、その大きさのため、綿実を損傷させる可能性が最も高く、したがって、より早い若虫段階で昆虫を殺すことが重要である。カスミカメムシ（Ｌｙｇｕｓ）の半翅目害虫種は、主にスクエア（ｓｑｕａｒｅｓ）及び若い綿実（ｂｏｌｌ）を食べる。若虫はより貪欲な摂食者であり、最も深刻な損傷を引き起こす傾向がある。カスミカメムシは、スクエアを食べるとき、発生中の葯を標的とし、多くの場合、スクエアが枯れて植物から落下する。綿実に発生するそれらのスクエアのために、綿実は、花粉を形成することができない葯、未受精の種子、及び空の子房室（ｌｏｃｕｌｅ）を有する可能性がある。カスミカメムシは、綿実を摂食するとき、発生中の種子を標的とし、綿実の外側に窪んだ小さな黒い斑点を生じる。

安定的に形質転換されたワタ植物におけるＴＩＣ２１９９の活性をアッセイする１つの方法は、昆虫バイオアッセイでスクエアを使用することである。スクエアは、ＴＩＣ２１９９を発現する形質転換されたワタ植物から採取される。スクエアを、ペトリディッシュに入れるか、各スクエアを大型ウェルプレートのウェルに入れてもよい。若い新生カスミカメムシまたはカメムシ若虫を、ペトリディッシュまたは大型ウェルプレートに入れて、所定の時間給餌する。発育阻害及び死亡率の測定を、給餌の期間にわたって行い、対照（形質転換されていないワタ植物に由来するスクエアがアッセイで使用される）と比較する。

あるいは、形質転換されたワタ植物全体に対して、活性のアッセイを行ってもよい。例えば、カスミカメムシ種に対するアッセイの場合、１つのＴＩＣ２１９９を発現する植物に由来するＲ_１種子を、１０インチ鉢に播種する。好ましくは、形質転換植物と同じ品種由来の形質転換されていないワタ植物を、陰性対照として使用する。植物は、３２℃で１６時間の明期、２３℃で８時間の暗期、及び８００～９００マイクロアインシュタインの光強度を有する環境室内で維持される。栽植４０～４５日後、個々の植物を、通気性プラスチック「受粉」シート（Ｖｉｌｕｔｉｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＬ）で作られたケージに入れる。Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）タイを使用して、シートスリーブを土壌表面のすぐ上の主茎に固定する。実験室での培養からの性的に成熟した雄及び雌のＬｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓまたはＬｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓの成虫（６日齢）の２対を、１４ミリリットル丸底プラスチックチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に回収し、各植物に使用する。ケージサイドの小さなスリットを通して、成虫を個々のケージに放ち、昆虫が逃げないように、ケージをしっかり閉じる。昆虫を交尾させ、植物をケージで２１日間維持する。

次いで、２１日後、植物を、ケージの下で切り取り、実験室に移し、植物ごとに昆虫を回収し、カウントする。ケージを開く前に、植物を激しく振って、すべての昆虫が摂食部位からケージの基部に落ちたことを確認する。次いで、ケージの基部を開け、すべての植物材料を除去し、黒いシートの上に置く。アスピレータを使用して、昆虫を回収する。次いで、植物を十分に検査して、残っている昆虫を回収する。回収した昆虫の数及びその発生段階を、植物ごとに記録する。昆虫の数を、カスミカメムシの成熟度に基づいて、いくつかのグループ（３齢までの若虫、４齢までの若虫、５齢までの若虫、成虫）に分ける。

カメムシ種をアッセイするために、ＴＩＣ２１９９を発現する植物に由来するＲ１種子を鉢に蒔き、上記のように生育させ、ケージに入れた。形質転換されていないワタ植物も陰性対照として使用される。２齢のカメムシ若虫は、植物に蔓延させるために使用され、数日間または数週間、スクエアや綿実を食べさせる。ケージに入れられた植物を、上記のように回収し、採取したカメムシを検査し、死亡率をスコアリングし、ならびに若虫の成熟度を記録する。次いで、これらのスコアを、陰性対照植物と比較する。

本明細書に開示され、特許請求される組成物のすべては、本開示に照らして過度の実験をすることなく、作製及び実行することができる。本発明の組成物は、前述の例示的な実施形態に関して説明されてきたが、本発明の真の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、変形、変更、修正、及び改変が本明細書に記載の組成物に適用され得ることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤を本明細書に記載の薬剤の代わりに使用しても、同じまたは同様の結果が達成されることが明らかになるであろう。当業者には明らかなすべてのそのような類似の置換及び修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念の範囲内であるとみなされる。

本明細書で引用されたすべての刊行物及び公開された特許文献は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (35)

1. 殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸分子であって、任意選択的に、
   ａ．前記殺虫性タンパク質が、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７のアミノ酸配列を含むか、
   ｂ．前記殺虫性タンパク質が、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または
   ｃ．前記ポリヌクレオチドセグメントが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする、前記組換え核酸分子。
2. ａ．前記組換え核酸分子が、植物細胞で発現されて、殺虫有効量の前記殺虫性タンパク質もしくは殺虫性断片を産生するか、または
   ｂ．前記組換え核酸分子が、ベクターと作動可能に連結され、前記ベクターが、プラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド、及び細菌もしくは酵母人工染色体からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
3. 宿主細胞内に存在し、前記宿主細胞が、細菌細胞及び植物細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
4. 前記細菌宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、及びＥｒｗｉｎｉａからなる群から選択される細菌属に由来する、請求項３に記載の組換え核酸分子。
5. 前記Ｂａｃｉｌｌｕｓが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｏｕｓであり、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項４に記載の組換え核酸分子。
6. 前記植物細胞が、双子葉植物細胞または単子葉植物細胞である、請求項２に記載の組換え核酸。
7. 前記植物細胞が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ属、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ミカン属、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トウモロコシ、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、シバクサ、スイカ、及びコムギの植物細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の組換え核酸。
8. 前記タンパク質が、鱗翅目昆虫に対する活性を示す、請求項１に記載の組換え核酸分子。
9. 前記鱗翅目昆虫が、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、サウスウエスタンコーンボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、及びモロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）からなる群から選択される、請求項８に記載の組換え核酸分子。
10. 前記タンパク質が、半翅目昆虫に対する活性を示す、請求項１に記載の組換え核酸分子。
11. 前記半翅目昆虫が、サビイロメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）及び新熱帯区褐色カメムシ（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の組換え核酸分子。
12. 請求項１に記載の組換え核酸分子またはその部分を含む、植物。
13. 前記植物が、単子葉植物もしくは双子葉植物、またはその部分である、請求項１２に記載の植物。
14. 前記植物が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ属、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ミカン属、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、ワタ、ウリ科、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トウモロコシ、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、チャ、タバコ、トマト、ライコムギ、シバクサ、スイカ、及びコムギからなる群から選択される、請求項１２に記載の植物。
15. 前記植物の前記その部分が、種子であり、前記種子が、前記組換え核酸分子を含む、請求項１２に記載の植物。
16. 請求項１に記載の組換え核酸分子を含む、昆虫阻害組成物。
17. 前記殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも１つの他の殺虫剤をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１６に記載の昆虫阻害組成物。
18. 前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、化学分子、及び補助タンパク質からなる群から選択され、前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、前記殺虫性タンパク質またはその殺虫性断片と同じ害虫に対して毒性である、請求項１７に記載の昆虫阻害組成物。
19. 前記少なくとも１つの他の殺虫剤が、鱗翅目、鞘翅目、または半翅目の１つ以上の害虫種に対する活性を示す、請求項１７に記載の昆虫阻害組成物。
20. 前記少なくとも１つの他の殺虫性タンパク質が、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｄバリアント、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ－８８、ＡＸＭＩ－９７、ＡＸＭＩ－１０２、ＡＸＭＩ－１１２、ＡＸＭＩ－１１７、ＡＸＭＩ－１００、ＡＸＭＩ－１１５、ＡＸＭＩ－１１３、及びＡＸＭＩ－００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ－１５０、ＡＸＭＩ－１７１、ＡＸＭＩ－１８４、ＡＸＭＩ－１９６、ＡＸＭＩ－２０４、ＡＸＭＩ－２０７、ＡＸＭＩ－２０９、ＡＸＭＩ－２０５、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２２ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ、ＡＸＭＩ－２２４ｚ及びＡＸＭＩ－２２５ｚ、ＡＸＭＩ－２３８、ＡＸＭＩ－２７０、ＡＸＭＩ－２７９、ＡＸＭＩ－３４５、ＡＸＭＩ－３３５、ＡＸＭＩ－Ｒ１及びそのバリアント、ＩＰ３及びそのバリアント、ＤＩＧ－３、ＤＩＧ－５、ＤＩＧ－１０、ＤＩＧ－６５７、ＤＩＧ－１１タンパク質、ＩＤＰ１０２Ａａ及びそのホモログ、ＩＤＰ１１０Ａａ及びそのホモログ、ＴＩＣ８６８、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７、ＢＣＷ００３、ＴＩＣ１１００、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６７＿２３、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７６４１、ＩＤＰ０７２Ａａ、ＴＩＣ５２９０、ＴＩＣ３６６８、ＴＩＣ３６６９、ＴＩＣ３６７０、ＩＤＰ１０３及びそのホモログ、ＰＩＰ－５０及びＰＩＰ－６５及びそのホモログ、ＰＩＰ－８３及びそのホモログ、ならびにＣｒｙ１Ｂ．３４からなる群から選択される、請求項１７に記載の昆虫阻害組成物。
21. 請求項１に記載の組換え核酸分子から前記殺虫性タンパク質を発現する植物細胞を含むと定義される、請求項１６に記載の昆虫阻害組成物。
22. 請求項１２に記載の植物またはその部分から産生される商品であって、前記商品が、検出可能な量の前記組換え核酸分子、前記殺虫性タンパク質、またはその殺虫性断片を含む、前記商品。
23. 穀物取扱業者によって袋詰めされたトウモロコシの商品（コーンフレーク、コーンケーキ、コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンサイレージ、コーンスターチ、コーンシリアルなど）、ならびに対応するダイズ、イネ、コムギ、ソルガム、キマメ、ピーナッツ、果物、メロン、及び野菜の商品であって、該当する場合、ジュース、濃縮物、ジャム、ゼリー、マーマレード、ならびに本出願の検出可能な量のかかるポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを含むかかる商品の他の食用形態、全粒または加工綿実、綿実油、リント、種子、及び飼料用または食品用に処理された植物部分、繊維、紙、バイオマス、及び綿花油由来の燃料または綿繰り廃棄物由来のペレットなどの燃料製品、全粒または加工ダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズ粕、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズふすま、豆乳、ダイズチーズ、ダイズワイン、ダイズを含む動物飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、ならびにダイズ植物及びダイズ植物の部分を使用して製造された燃料製品を含む、前記商品からなる群から選択される、請求項２２に記載の商品。
24. 請求項１に記載の組換え核酸分子を含む子孫種子を産生する方法であって、前記方法が、
    ａ．前記組換え核酸分子を含む第１の種子を植えることと、
    ｂ．ステップａの前記種子から植物を生育することと、
    ｃ．前記植物から前記子孫種子を採取することであって、前記採取された種子が、前記組換え核酸分子を含む、前記採取することと、を含む、前記方法。
25. 昆虫の蔓延に耐性のある植物であって、前記植物の細胞が、請求項１に記載の組換え核酸分子を含む、前記植物。
26. 鱗翅目種の害虫または害虫の蔓延を駆除するための方法であって、前記方法が、
    ａ．前記害虫を、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７に示される、殺虫有効量の殺虫性タンパク質と接触させること、または
    ｂ．前記害虫を、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫有効量の１つ以上の殺虫性タンパク質と接触させること、を含む、前記方法。
27. 植物ゲノムＤＮＡを含む試料中の請求項１に記載の組換え核酸分子の存在を検出する方法であって、
    ａ．前記試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１に記載の組換え核酸分子を含む植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズするが、かかるハイブリダイゼーション条件下で、請求項１に記載の組換え核酸分子を含まないそれ以外はアイソジェニックな植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズしない、核酸プローブと接触させることであって、前記プローブが、配列番号３、６、９、１２、１４、１６、もしくは１８と相同もしくは相補的であるか、または配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫性タンパク質をコードする配列である、前記接触させることと、
    ｂ．前記試料及び前記プローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供することと、
    ｃ．前記核酸プローブと前記組換え核酸分子とのハイブリダイゼーションを検出することと、を含む、前記方法。
28. タンパク質を含む試料中の殺虫性タンパク質またはその断片の存在を検出する方法であって、前記殺虫性タンパク質が、２配列番号２もしくは４のアミノ酸配列を含むか、または前記殺虫性タンパク質が、配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記方法が、
    ａ．前記試料を免疫反応性抗体と接触させることと、
    ｂ．前記殺虫性タンパク質またはその断片の存在を検出することと、を含む、前記方法。
29. 検出するステップが、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含む、請求項２６に記載の方法。
30. 配列番号２、４、７、１０、１３、１５、または１７に示されるアミノ酸配列を含む、殺虫有効量のタンパク質。
31. 野外において鱗翅目害虫種または害虫の蔓延を駆除するための方法であって、前記方法が、
    ａ．配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７に示される殺虫有効量の殺虫性タンパク質を発現する作物植物を生育すること、または
    ｂ．配列番号２、４、７、１０、１３、１５、もしくは１７と少なくとも９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは約１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む殺虫有効量の１つ以上の殺虫性タンパク質を発現する作物植物を生育すること、及び、任意選択的に、
    ｃ．自己制限遺伝子を有するトランスジェニック鱗翅目害虫種を前記野外に放出して、前記殺虫性タンパク質に対する前記害虫種の耐性の発達の可能性を低減すること、を含む、前記方法。
32. 前記作物植物が、単子葉作物植物または双子葉作物植物である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記単子葉作物植物が、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、イネ、ライムギ、またはアワである、請求項３２に記載の方法。
34. 前記単子葉作物植物が、トウモロコシである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記双子葉作物植物が、ダイズ、ワタ、またはキャノーラである、請求項３１に記載の方法。