JP2024525789A

JP2024525789A - 細胞ベースの療法のためのポリシストロニックベクター

Info

Publication number: JP2024525789A
Application number: JP2024502009A
Authority: JP
Inventors: アルバートルゾーマティアス; ウィリアムダウドル; エレノアタム; ジェシカエス．エルマン; アダムジョンソン
Original assignee: サナバイオテクノロジー，インコーポレイテッド
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2022-07-18
Publication date: 2024-07-12
Also published as: AU2022312508A1; IL310099A; CA3224974A1; WO2023288338A3; EP4370699A2; KR20240046833A; WO2023288338A2; MX2024000713A

Abstract

１つ以上の免疫寛容原性因子、１つ以上のＣＡＲ、及び任意で１つ以上の安全スイッチを共発現させるためのポリシストロニックベクター、前記ポリシストロニックベクターを含む組成物、前記ポリシストロニックベクターを含む細胞、及びこれらの細胞を作製する方法、ならびにがん、糖尿病、及び神経疾患などの疾患を治療するために、開示の前記ベクター、組成物、及び細胞を使用する方法を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月１６日に出願された米国特許仮出願第６３／２２２，９５４号及び２０２１年１１月２４日に出願された米国特許仮出願第６３／２８２，９６１号の利益を主張するものである。これらの仮出願のそれぞれの内容の全体を参照によって本書に援用する。

概要
養子細胞移植（ＡＣＴ）と呼ばれる新たな細胞療法のアプローチにより、ヒト疾患治療の状況は急速に変わりつつある。ＡＣＴでは、患者（自己）または健康なドナー（同種）から細胞を採取し、これらの細胞を適合し、患者に細胞を移植して疾患と闘わせる。最も臨床的な成功を収めたＡＣＴは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞療法であり、腫瘍関連抗原に対して特異的なＣＡＲ改変Ｔ細胞を作製して患者の体内に注入し、表面に抗原を有するがん細胞を認識させて殺すというものである。臨床開発が最も進んでいるＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ＣＤ１９（ＣｌｕｓｔｅｒｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ１９）と呼ばれるＢ細胞上にみられる抗原を標的としたものであり、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療に承認されている（例えば、チサゲンレクルユーセル、リソカブタゲンマラルユーセル、ブレクスカブタゲンアウトルーセル、アキシカブタゲンシロルユーセルを参照）。

自己細胞ベースの戦略と比較して、既製品の同種細胞には、患者アクセスの改善、品質管理、ならびに治療の遅延、悪性細胞の混入、及び細胞機能不全の防止をはじめとする、いくつかの利点がある。しかしながら、同種細胞は、重篤な移植片対宿主効果を引き起こすことがあり、宿主免疫系によって速やかに排除されてしまう可能性がある。したがって、免疫不適合性は、ＡＣＴの臨床応用にとって大きな障壁となっており、患者の免疫系を免れる移植細胞の能力が同種細胞療法の成功の要因となる。したがって、細胞ベースの療法を作り出すための新規なアプローチ、組成物、及び方法が必要とされている。

本技術は、１つ以上の免疫寛容原性因子、１つ以上のＣＡＲ、及び任意で１つ以上の安全スイッチを共発現させるためのポリシストロニックベクター、ならびにがん、糖尿病及び神経疾患などの疾患を治療するためのポリシストロニックベクターを使用した組成物及び方法を提供する。例えば、一実施形態では、本技術は、免疫原性因子（例えば、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４など）と、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、ＢＣＭＡＣＡＲなど）と、を共発現させるためのバイシストロニックベクター、ならびに疾患を治療するためのバイシストロニックベクターを使用した組成物及び方法を提供する。別の実施形態では、本技術は、免疫原性因子（例えば、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４など）と、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、ＢＣＭＡＣＡＲなど）と、安全スイッチと、を共発現させるためのトリシストロニックベクター、ならびに疾患を治療するためのトリシストロニックベクターを使用した組成物及び方法を提供する。

いくつかの態様では、（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、第１の発現カセットが、５’から３’方向の順序で第２の発現カセットの前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＣＬ２２、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＣＲ１、ＤＵＸ４、ＦＡＳＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＩＤＯ１、ＩＬ１５－ＲＦ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、セルピンｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８を含む群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７、例えば、ヒトＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７は、配列番号１～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２９～１３４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３５に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲは、シグナルペプチド、ＣＤ１９に特異的な細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、またはＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９に特異的な細胞外結合ドメインは、ｓｃＦｖ、例えば、ＦＭＣ６３の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２１～２３及び２６～２８に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２１～２３に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６～２８に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、またはＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通は、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１６に記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１１６に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号３２、３４、もしくは３６に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３２、３４、もしくは３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３１、３３、もしくは３５に記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号３１、３３、もしくは３５に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２０ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲは、シグナルペプチド、ＣＤ２０に特異的な細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、またはＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０に特異的な細胞外結合ドメインは、ｓｃＦｖ、例えば、Ｌｅｕ１６のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈを含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３９～４１及び４３～４４に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３９～４１に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号４３～４４に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、またはＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通は、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２２ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲは、シグナルペプチド、ＣＤ２２に特異的な細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、またはＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２に特異的な細胞外結合ドメインは、ｓｃＦｖ、例えば、ｍ９７１のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号４７～４９及び５１～５３に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号４７～４９に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５１～５３に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２に特異的な細胞外結合ドメインは、ｓｃＦｖ、例えば、ｍ９７１－Ｌ７のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５６～５８及び６０～６２に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５６～５８に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６０～６２に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、またはＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通は、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲは、シグナルペプチド、ＢＣＭＡに特異的な細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、またはＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡに特異的な細胞外結合ドメインは、ｓｃＦｖ、例えば、Ｃ１１Ｄ５．３のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈを含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６５～６７及び６９～７１に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６５～６７に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６９～７１に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡに特異的な細胞外結合ドメインは、ｓｃＦｖ、例えば、Ｃ１２Ａ３．２のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈを含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７４～７６及び７８～８０に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７４～７６に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７８～８０に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＴ１０３ＡのｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２０～１２２及び１２４～１２６に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２０～１２２に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２４～１２６に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡに特異的な細胞外結合ドメインは、完全ヒト重鎖可変ドメイン（ＦＨＶＨ）、例えば、ＦＨＶＨ３３を含む。いくつかの実施形態では、ＦＨＶＨは、配列番号８２～８４に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、またはＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通は、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上の切断部位は、自己切断部位、例えば、２Ａ部位を含む。いくつかの実施形態では、２Ａ部位は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａを含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上の切断部位は、プロテアーゼ部位、例えば、フーリン部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、フーリン部位は、ＦＣ１、ＦＣ２、またはＦＣ３部位を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ部位は、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、１つ以上の切断部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、ラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＱＲ８、及びＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーター、例えば、ＥＦ１α、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ、ＵＢＣまたはＣＡＧプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、ＡｌｃＡ、ＬｅｘＡ、またはＣｒｅプロモーターである。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼの使用によるゲノム座位への相同組換え修復（ＨＤＲ）による挿入を行うために、発現カセットに隣接したホモロジーアームをさらに含む。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、２Ａ部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、ＣＤ１９ＣＡＲが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子はＣＤ４７を含む。

いくつかの態様では、（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、ＣＤ１９ＣＡＲが、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子はＣＤ４７を含む。

いくつかの態様では、（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、ＣＤ１９ＣＡＲが、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子はＣＤ４７を含む。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、２Ａ部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、２Ａ部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットと、（ｄ）任意の２つの隣り合う発現カセットを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットと、（ｄ）任意の２つの隣り合う発現カセットを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｅ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第４の発現カセットをさらに含み、第４の発現カセットは、２Ａ部位によって第１の発現カセット、第２の発現カセット及び／または第３の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、２Ａ部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、ＢＣＭＡＣＡＲが、ＢＢ２１２１バインダー、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子はＣＤ４７を含む。

いくつかの態様では、（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、ＢＣＭＡＣＡＲが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＴ１０３ＡｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡは、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子はＣＤ４７を含む。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。

いくつかの態様では、本技術のさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含むウイルスが提供される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはファージである。

いくつかの態様では、本技術のさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、自己細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、同種細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、β膵島細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリア前駆細胞（ＧＰＣ）である。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントは、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択される宿主細胞の特定のゲノム座位に挿入される。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、挿入は、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼを用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）によって行われる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つ以上のＭＨＣＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣＩＩ分子の低下した発現を有するように改変され、任意で、１つ以上のＭＨＣＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃからなる群から選択され、任意で、１つ以上のＭＨＣＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、及びＨＬＡ－ＤＯからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡの低下した発現を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡノックアウトは、両方のアレルに行われる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂのノックアウトは、両方のアレルに行われる。

いくつかの態様では、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含むＴ細胞であって、ポリシストロニックベクターが、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、を含む、Ｔ細胞が提供される。いくつかの態様では、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含むＴ細胞であって、ポリシストロニックベクターが、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、を含み、Ｔ細胞がＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトを有する、Ｔ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡノックアウトは、両方のアレルに行われる。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントは、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択されるＴ細胞の特定のゲノム座位に挿入される。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２０ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、またはＢＣＭＡＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１９ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１９ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１９ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＣＤ１９ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３２、３４、もしくは３６に記載のアミノ酸配列または配列番号３２、３４、もしくは３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＴ１０３ＡｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＢＣＭＡＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１２８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＢＣＭＡＣＡＲである。

いくつかの態様では、ＨＤＲによって改変されたゲノム座位を有する細胞であって、ゲノム座位が、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択される、細胞が提供される。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＤＲは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼを用いる。

いくつかの態様では、（１）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現と、（２）セーフハーバー座位に挿入された、ＣＤ４７及び安全スイッチを含む導入遺伝子と、を有する、ｉＰＳＣ由来β膵島細胞であって、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、ｉＰＳＣ由来β膵島細胞が提供される。いくつかの態様では、（１）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現と、（２）ＣＬＹＢＬホモロジーアームで挟まれた、ＣＤ４７及びＨＳＶｔｋを含む導入遺伝子と、を有する、ｉＰＳＣ由来β膵島細胞であって、導入遺伝子がＣＬＹＢＬ座位に挿入されている、ｉＰＳＣ由来β膵島細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来β膵島細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡノックアウトは、両方のアレルに行われる。

いくつかの態様では、（１）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現と、（２）セーフハーバー座位に挿入された、ＣＤ４７及び安全スイッチを含む導入遺伝子と、を有する、ＥＳＣ由来ＧＰＣであって、セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、ＥＳＣ由来ＧＰＣが提供される。いくつかの態様では、（１）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現と、（２）ＣＬＹＢＬホモロジーアームで挟まれた、ＣＤ４７及びＨＳＶｔｋを含む導入遺伝子と、を有する、ＥＳＣ由来ＧＰＣであって、導入遺伝子がＣＬＹＢＬ座位に挿入されている、ＥＳＣ由来ＧＰＣが提供される。いくつかの実施形態では、ＥＳＣ由来ＧＰＣは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡノックアウトは、両方のアレルに行われる。

いくつかの態様では、本技術のさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターを含む組成物が提供される。いくつかの態様では、本技術のさまざまな実施形態によるウイルスを含む組成物が提供される。いくつかの態様では、本技術のさまざまな実施形態による宿主細胞または細胞を含む医薬組成物が提供される。

いくつかの態様では、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択されるゲノム座位への導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入に使用するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が提供される。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及び任意でｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを２個の別々の分子として含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、相補的領域、ｃｒＲＮＡ反復領域、テトラループ、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ反復領域は、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０３、もしくは配列番号１０８に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、テトラループは、配列番号９６もしくは配列番号１０７に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、もしくは配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。

いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ＡＡＶＳ１、ＣＬＹＢＬ、またはＣＣＲ５座位のある領域に対して特異的な相補的領域を含む。いくつかの実施形態では、領域は、コード配列（ＣＤＳ）、エクソン、イントロン、エクソンの一部と隣接イントロンの一部とにまたがる配列、または調節領域である。いくつかの実施形態では、相補的領域は、配列番号１１０、配列番号１１１、もしくは配列番号１１２に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。

いくつかの態様では、ゲノム座位への導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入に使用するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、ゲノム座位が、第１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６、第１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０、または第３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する、ガイドＲＮＡが提供される。これらの実施形態の特定のものでは、座位は、第１９番染色体の５５，１１５，６７４、第１３番染色体の９９，８２２，９８０、または第３番染色体の４６，３７３，１８０から、４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内にある。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第１９番染色体の５５，１１５，６７４に、第１３番染色体の９９，８２２，９８０に、もしくは第３番染色体の４６，３７３，１８０に、または第１９番染色体の５５，１１５，６７４、第１３番染色体の９９，８２２，９８０、もしくは第３番染色体の４６，３７３，１８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内に、切断部位を生じるように構成されている。

いくつかの実施形態では、本技術のさまざまな実施形態によるｇＲＮＡを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、本明細書に記載の部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、本技術のさまざまな実施形態によるｇＲＮＡを含む組成物は、細胞内への送達のために製剤化される。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、本明細書に記載の部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、ｇＲＮＡ、部位特異的ヌクレアーゼまたは部位特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、及びホモロジーアームで挟まれた導入遺伝子を、宿主細胞に導入する工程を含む、ゲノム座位への導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入の方法であって、部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ゲノム座位は、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、方法は、本技術のさまざまな実施形態に従ってｇＲＮＡを導入することを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム座位は、第１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６、第１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０、または第３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する。これらの実施形態の特定のものでは、座位は、第１９番染色体の５５，１１５，６７４、第１３番染色体の９９，８２２，９８０、または第３番染色体の４６，３７３，１８０から、４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内にある。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第１９番染色体の５５，１１５，６７４に、第１３番染色体の９９，８２２，９８０に、もしくは第３番染色体の４６，３７３，１８０に、または第１９番染色体の５５，１１５，６７４、第１３番染色体の９９，８２２，９８０、もしくは第３番染色体の４６，３７３，１８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内に、切断部位を生じるように構成されている。

いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットと、及び／または（ｄ）第１の発現カセット、第２の発現カセット、及び／または第３の発現カセットを隔てる１つ以上の切断部位と、を含む。

いくつかの態様では、導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入のための新たなゲノム座位を特定する方法であって、（ａ）既知のｇＲＮＡに基づいてゲノム座位の位置を特定する工程と、（ｂ）ゲノム座位のどちらかの側にある約５００～４０００ｂｐの領域をＰＡＭ配列についてスキャンする工程と、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、ゲノム座位は、第１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６、第１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０、または第３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する。いくつかの実施形態では、ゲノム座位は、第１９番染色体の５５，１１５，６７４、または第１９番染色体の５５，１１５，６７４から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置、第１３番染色体の９９，８２２，９８０、または第１３番染色体の９９，８２２，９８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置、及び第３番染色体の４６，３７３，１８０、または第３番染色体の４６，３７３，１８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置からなる群から選択される位置に位置する。

いくつかの態様では、その必要がある対象の疾患を治療する方法であって、対象に、本技術のさまざまな実施形態による宿主細胞または細胞、または宿主細胞または細胞を含む組成物を投与する工程を含む、方法が提供される。

いくつかの実施形態では、疾患は、がん、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及び／またはＢＣＭＡの発現と関連するがんである。いくつかの実施形態では、がんは、悪性血液疾患である。いくつかの実施形態では、悪性血液疾患は、骨髄新生物、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖／骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、悪性血液疾患は、Ｂリンパ球由来悪性疾患である。

いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、例えば、ループス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、アジソン病、バセドウ病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、及びセリアック病を含む。

いくつかの実施形態では、疾患は、例えば１型糖尿病、２型糖尿病、前糖尿病及び妊娠糖尿病を含む、糖尿病である。

いくつかの実施形態では、疾患は、例えば、カタレプシー、てんかん、脳炎、髄膜炎、片頭痛、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、及び多発性硬化症を含む、神経疾患である。

いくつかの態様では、第１のポリシストロニックベクター及び第２のポリシストロニックベクターを含む組成物であって、第１のポリシストロニックベクターが、１つ以上の切断部位によって隔てられた、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列と第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とを含み、第２のポリシストロニックベクターが、１つ以上の切断部位によって隔てられた、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列と第２のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とを含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、第１の免疫寛容原性因子及び第２の免疫寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＣＬ２２、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＣＲ１、ＤＵＸ４、ＦＡＳＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＩＤＯ１、ＩＬ１５－ＲＦ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、セルピンｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、第１の免疫寛容原性因子及び第２の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７は、配列番号１～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲとが異なり、かつＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２０ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、及びＢＣＭＡＣＡＲからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲ及び／または第２のＣＡＲは、配列番号３２、３４、３６、１１７、１２８、及び１３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３２、３４、３６、１１７、１２８、及び１３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲであり、第２のＣＡＲは、ＣＤ２２ＣＡＲである。

いくつかの態様では、第１のポリシストロニックベクターを含む第１のウイルスと第２のポリシストロニックベクターを含む第２のウイルスとを含む組成物であって、第１のポリシストロニックベクターが、１つ以上の切断部位によって隔てられた、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列と第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とを含み、第２のポリシストロニックベクターが、１つ以上の切断部位によって隔てられた、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列と第２のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とを含む、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、第１のウイルス及び／または第２のウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはファージである。いくつかの実施形態では、第１の免疫寛容原性因子及び第２の免疫寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＣＬ２２、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＣＲ１、ＤＵＸ４、ＦＡＳＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＩＤＯ１、ＩＬ１５－ＲＦ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、セルピンｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、第１の免疫寛容原性因子及び第２の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７は、配列番号１～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲとが異なり、かつＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２０ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、及びＢＣＭＡＣＡＲからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲ及び／または第２のＣＡＲは、配列番号３２、３４、３６、１１７、１２８、及び１３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３２、３４、３６、１１７、１２８、及び１３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲであり、第２のＣＡＲは、ＣＤ２２ＣＡＲである。

いくつかの態様では、宿主細胞の不均一集団を生成する方法であって、本技術のさまざまな実施形態による組成物を宿主細胞の集団に導入する工程を含む、方法が提供される。いくつかの態様では、記載される方法によって生成された宿主細胞の不均一集団が提供される。いくつかの態様では、記載される宿主細胞の集団を含む医薬組成物が提供される。いくつかの態様では、その必要がある対象の疾患を治療する方法であって、対象に、記載される宿主細胞の集団または宿主細胞の集団を含む医薬組成物を投与する工程を含む、方法が提供される。

いくつかの態様では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現と、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の増加した発現とを有する宿主細胞であって、１つ以上の免疫寛容原性因子が、請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントに保有されている、宿主細胞が提供される。

いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の低下した発現は、Ｂ２Ｍの低下した発現によるものである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の低下した発現は、ＣＩＩＴＡの低下した発現によるものである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の低下した発現は、ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現によるものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及びＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及びＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、ノックアウトは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼの使用により行われる。

いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ２４を含む１つ以上の免疫寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤ－Ｌ１を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４６を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ５５を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ５９を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、Ｃ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターを含む。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、ＥＳＣまたはｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、β膵島細胞、またはＧＰＣである。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、さらなる外因性構成要素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、さらなる外因性構成要素は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される安全スイッチである。

いくつかの態様では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現と、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の増加した発現とを有するＴ細胞であって、１つ以上の免疫寛容原性因子が、請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントに保有されている、Ｔ細胞が提供される。

いくつかの態様では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現と、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の増加した発現とを有するＮＫ細胞であって、１つ以上の免疫寛容原性因子が、請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントに保有されている、ＮＫ細胞が提供される。

いくつかの態様では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現と、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の増加した発現とを有する膵島細胞であって、１つ以上の免疫寛容原性因子が、請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントに保有されている、膵島細胞が提供される。

いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子の低下した発現は、Ｂ２Ｍの低下した発現によるものである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の低下した発現は、ＣＩＩＴＡの低下した発現によるものである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の低下した発現は、ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現によるものである。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及びＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及びＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、ノックアウトは、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼの使用により行われる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。

本技術の特定の実施形態によるバイシストロニックベクターの設計及び代替的な設計を示す概略図である。ベクターが、ＥＦ１αプロモーター、ＣＤ４７のコード配列、切断部位、及びＣＤ１９ＣＡＲのコード配列を有するＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックベクターの一般的な設計を示す。切断部位は、任意で２Ａ部位に加えてフーリン部位（上）を有するかまたは２Ａ部位のみ（下）を有し得る。ＦＣ＝フーリン切断部位。本技術の特定の実施形態によるバイシストロニックベクターの設計及び代替的な設計を示す概略図である。細胞に形質導入するためにそれぞれＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ４７をコードする２つのレンチウイルスベクターを使用した共形質導入設計を示す。本技術の特定の実施形態によるバイシストロニックベクターの設計及び代替的な設計を示す概略図である。ＣＤ４７とＣＤ１９ＣＡＲの５’から３’方向の順序が逆転している、すなわち、バイシストロニックベクターの第１の発現カセット内にＣＤ１９ＣＡＲが配置され、第２の発現カセット内にＣＤ４７が配置されたＣＤ１９ＣＡＲ－ＣＤ４７ベクターの代替的な設計を示す。図に示されるベクターコンストラクト（複数可）でトランスフェクトした初代Ｔ細胞におけるＣＤ４７（縦のスケール）及びＣＤ１９ＣＡＲ（横のスケール）の発現レベルを示すフローサイトメトリーのプロットである。ＬＶ＝レンチウイルスウイルス、＊ｃｏ＝コドン最適化、Ｋｏｚ＝Ｋｏｚａｋコンセンサス配列。図に示される異なるベクターコンストラクトで形質導入した細胞におけるＣＤ４７の発現レベルを示す。図に示される異なるベクターコンストラクトで形質導入した細胞におけるＣＤ１９ＣＡＲの発現レベルを示す。図に示される異なるベクターコンストラクトで形質導入したＨＩＰＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ欠失によるＨＬＡ－Ｉ／ＩＩノックアウト（ＫＯ）を有する）における総ＣＤ４７分子量を示す。ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲで形質導入したＨＩＰＣＡＲ－Ｔ細胞における自然殺滅（ＮＫ）及びマクロファージ殺滅のインビトロｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイの結果を示す。ＫＯ＝ノックアウト、ｃｏｐｔ＝コドン最適化。Ａは、ＣＤ４７及び安全スイッチを共発現させるためのバイシストロニックベクターの設計を示す概略図である。バイシストロニックベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ４７のコード配列、及び安全スイッチ（例えば、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ））のコード配列、その後に続くＨＡタグを含むコンストラクトを含む。ＣＤ４７のコード配列と安全スイッチのコード配列とは２Ａ部位によって隔てられている。５’から３’方向の順序で、安全スイッチのコード配列をＣＤ４７のコード配列の前に配置するか（上）、またはその逆（下）とすることができる。コンストラクトは、相同組換え修復（ＨＤＲ）による部位特異的挿入を行うために、ＣＬＹＢＬセーフハーバー座位に隣接する領域と相補的な左右のホモロジーアーム（ＬＨＡ、ＲＨＡ）で挟むことができる。Ｂは、本技術の特定の実施形態によるＣＤ４７とＣｙＤの共発現のためのバイシストロニックベクターの設計を示す。バイシストロニックベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＣｙＤのコード配列とその後に続くＨＡタグ、２Ａ部位、及びＣＤ４７のコード配列を有するコンストラクトを含む。コンストラクトは、ＣＬＹＢＬのセーフハーバー座位に部位特異的挿入を行うためのＣＬＹＢＬのＬＨＡとＲＨＡとで挟まれている。Ｃは、本技術の特定の実施形態によるＣＤ４７とＨＳＶｔｋの共発現のための別のバイシストロニックベクターの設計を示す。このバイシストロニックベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ４７のコード配列、２Ａ部位、及びＨＳＶｔｋのコード配列と、その後に続くＨＡタグを有するコンストラクトを含む。コンストラクトは、ＣＬＹＢＬのセーフハーバー座位に部位特異的挿入を行うためのＣＬＹＢＬのＬＨＡとＲＨＡとで挟まれている。野生型（ＷＴ）ｉＰＳＣとＣｙＤ－ＣＤ４７を形質導入した（クローン２－Ｇ１１を代表例として示す）ｉＰＳＣ及び分化後のＣＤ４７の発現レベルを示す。異なる濃度（μΜ）の５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）の存在下でのクローン２－Ｇ０９及び２－Ｇ１１の細胞数により測定したＣｙＤの殺滅曲線を示す。白抜きの三角形は、ｉＰＳＣを表し、黒塗りの三角形は、分化後の細胞を表す。２週間にわたったＣＤ４７－ＨＳＶｔｋクローン１－Ｂ１０、１－Ｃ０２、２－Ｆ０９、及び１－Ｈ０４におけるＣＤ４７発現レベルを示す。コントロールとしてＣｙＤ－ＣＤ４７クローン２－Ｇ０９を用いた、ＣＤ４７－ＨＳＶｔｋクローン１－Ｂ１０、１－Ｃ０２、２－Ｆ０９、及び１－Ｈ０４におけるＣＤ４７の過剰発現レベル（倍率）を、ＷＴに対して示す。異なる濃度（μΜ）のガンシクロビル（ＧＣＶ）の存在下でのＣＤ４７－ＨＳＶｔｋクローン１－Ｂ１０、１－Ｃ０２、２－Ｆ０９、１－Ｇ１０、及び１－Ｈ０４における、生細胞数（％）により測定したＨＳＶｔｋの殺滅曲線を示す。各クローンについて計算されたＩＣ５０及びＲ２乗（Ｒ^２）値も示す。ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックベクター（上）及びＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲバイシストロニックベクター（下）の設計を示す。ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ（ＰＬＡＳ２１９９）、及びＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７（ＰＬＡＳ２２１８）レンチウイルスの物理的及び機能的アッセイを示す。左側のパネル＝ゲノム定量アッセイ（ＧＱＡ）、中央のパネル＝機能性力価アッセイ、右側のパネル＝粒子対感染性アッセイ。ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ／ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７レンチウイルスを用いた二重形質導入アプローチのワークフローを示す。ＣＤ４７、ＣＤ１９ＣＡＲ、及びＣＤ２２ＣＡＲの発現レベルを調べるための形質導入したＴ細胞のフローサイトメトリー分析の例示的なゲーティング戦略を示す。図に示されたレンチウイルス（複数可）を用いて形質導入したＣＤ４＋（上のパネル）及びＣＤ８＋（下のパネル）Ｔ細胞におけるＣＤ１９ＣＡＲ（縦のスケール）及びＣＤ２２ＣＡＲ（横のスケール）の発現レベルを示すフローサイトメトリープロットである。異なるドナー及びウイルスロットにわたった、ＣＡＲ発現細胞の割合（％）により示される単一及び二重形質導入アプローチの効率を示す。上の各パネルは、全生成細胞集団の割合（％）を示し、下の各パネルは、全形質導入細胞の割合（％）を示す。各記号の色は、それぞれ、独立したドナー、ＣＤ１９ＣＡＲウイルス、またはＣＤ２２ＣＡＲウイルスを表す。図に示されるレンチウイルス（複数可）で形質導入したドナー細胞におけるＣＤ４７、ＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ２２ＣＡＲ発現レベルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す。図に示されるレンチウイルス（複数可）で形質導入したドナー細胞におけるＱｉＦｉ（Ａｇｉｌｅｎｔ）分析及びベクターコピー数（ＶＣＮ）によって定量化したＣＤ４７発現レベルを示す。Ａは、図に示されるレンチウイルス（複数可）を用いた単一及び二重形質導入アプローチのＶＣＮを試験するアッセイのワークフローを示す。Ｂは、二重及び単一形質導入した細胞のＶＣＮを示す。図に示されるＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲで単一形質導入したＴ細胞（ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞）、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲで単一形質導入したＴ細胞（ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞）、またはＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ／ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲで二重形質導入したＴ細胞（ＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞）で処理した赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）標識コントロールＮＡＬＭ、ＮＡＬＭＣＤ１９ノックアウト（ＫＯ）、及びＮＡＬＭＣＤ２２ＫＯ細胞の細胞傷害性（ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）、上の各パネル）及びサイトカイン（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ、下の各パネル）アッセイの結果を示す。細胞傷害性は、時間に対するＲＦＰの全積分強度により測定した。図に示される異なるエフェクター（Ｅ）対標的（Ｔ）（Ｅ：Ｔ）比の異なるＮＡＬＭ及びＲＡＪＩ腫瘍細胞に対して（１）モック、（２）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスのみ、（２）ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７レンチウイルスのみ、（３）ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲレンチウイルスのみ、（４）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスとＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７レンチウイルスとの混合物（ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７）、及び（５）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスとＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲレンチウイルスとの混合物（ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ）で形質導入したＴ細胞のルシフェラーゼアッセイにより測定した細胞傷害性を示す。Ｅ：Ｔ比は、Ｔ細胞数とＮＡＬＭまたはＲＡＪＩ細胞数との比として定義した。単一または二重形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞の作製、選別及び試験のワークフローを示す。ＣＡＲ選択１は、ＣＤ１９ＣＡＲ及び二重形質導入したＴ細胞については、抗イディオタイプ－ビオチン及び抗ビオチンマイクロビーズを用い、ＣＤ２２ＣＡＲについては可溶性ＣＤ２２－ビオチンを用いる。ＣＡＲ選択２は、二重形質導入集団中のＣＤ２２ＣＡＲについて可溶性ＣＤ２２－ビオチンを用いる。選別の前（上の各パネル）及び後（下の各パネル）に図に示されたレンチウイルス（複数可）で形質導入したＣＤ４＋（左側の各パネル）及びＣＤ８＋（右側の各パネル）Ｔ細胞におけるＣＤ１９ＣＡＲ（縦のスケール）及びＣＤ２２ＣＡＲ（横のスケール）の発現レベルを示すフローサイトメトリープロットである。図に示されるモック細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理したＲＦＰ標識ＮＡＬＭ細胞の細胞傷害性曲線を示す。細胞傷害性は、時間に対するＲＦＰの全積分強度により測定した。Ｅ：Ｔ比を、各グラフの左下隅に示し、ＣＡＲ発現Ｔ細胞数とＮＡＬＭ細胞数との比に基づいている。図に示されるモック細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理したＲＦＰ標識ＣＤ１９ノックアウトＮＡＬＭ細胞の細胞傷害性曲線を示す。細胞傷害性は、時間に対するＲＦＰの全積分強度により測定した。Ｅ：Ｔ比を、各グラフの左下隅に示し、ＣＡＲ発現Ｔ細胞数とＮＡＬＭ細胞数との比に基づいている。図に示されるモック細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理したＲＦＰ標識ＣＤ２２ノックアウトＮＡＬＭ細胞の細胞傷害性曲線を示す。細胞傷害性は、時間に対するＲＦＰの全積分強度により測定した。Ｅ：Ｔ比を、各グラフの左下隅に示し、ＣＡＲ発現Ｔ細胞数とＮＡＬＭ細胞数との比に基づいている。図に示される異なるＥ：Ｔ比（横のスケール）で、モック細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理したコントロールＮＡＬＭ細胞、ＣＤ１９ノックアウトＮＡＬＭ細胞、及びＣＤ２２ノックアウトＮＡＬＭ細胞のサイトカインレベル（縦のスケール）を示す。ＣＤ１９ノックアウトＮＡＬＭ腫瘍移植マウスモデルにおいてＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞及び二重形質導入ＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍増殖抑制能力を試験する試験設計を示す。腫瘍細胞の生物発光により測定された、ＣＤ１９ノックアウトＮＡＬＭマウスモデルにおけるＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍増殖の効果的な阻害を示す。マウス全身イメージングにより測定された、ＣＤ１９ノックアウトＮＡＬＭマウスモデルにおけるＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍増殖の効果的な阻害を示す。腫瘍細胞の生物発光により測定された、ＲＡＪＩマウスモデルにおけるＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍増殖の効果的な阻害を示す。マウス全身イメージングにより測定された、ＲＡＪＩマウスモデルにおけるＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍増殖の効果的な阻害を示す。ＮＡＬＭ腫瘍移植マウスモデルにおいて、二重形質導入した、または二重形質導入して選別したＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍増殖抑制能力を、ＣＤ１９ＣＡＲ－細胞とＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞との組み合わせと比較する試験設計を示す。腫瘍細胞の生物発光によって測定された、ＮＡＬＭマウスモデルにおける単一形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞の混合物と比較した、二重形質導入した、または二重形質導入して選別したＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞による腫瘍増殖のより効果的な阻害を示す。

詳細な説明
本開示は、細胞ベースのさまざまな療法のための、宿主細胞中で１つ以上の免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４など）、１つ以上のＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、ＢＣＭＡＣＡＲなど）、及び任意で１つ以上の安全スイッチを共発現させるためのポリシストロニックベクターを提供する。本明細書で説明されるように、例えば同種細胞中での、しばしば他の遺伝子改変（例えば、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡノックアウト）と併せた、免疫寛容原性因子の過剰発現は、得られる細胞の低免疫原性を向上させることができ、それにより、細胞がレシピエントに移植される際に免疫拒絶反応を受けなくなることから、細胞ベースの療法の有効性が高められる。これに対して、ポリシストロニックベクターに安全スイッチを含めることにより、レシピエントに対する細胞傷害性または他の悪影響が生じた場合に細胞を制御して死滅させることが可能となり、これにより免疫寛容原性因子を使用するものを含む細胞ベースの療法の安全性が高められる。

本開示は、さまざまな形態で実施可能であるが、以下のいくつかの実施形態の説明は、本開示は本発明の例示とみなされるべきものであって、本発明を示される特定の実施形態に限定することを目的とするものではないという理解のもとになされるものである。各見出しはあくまで便宜的に示されるものであり、いかなる形でも本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。いずれの見出しのもとに示される実施形態も、いずれかの他の見出しのもとに示される実施形態と組み合わせることができる。

本出願で指定されるさまざまな定量値における数値の使用は、特に明記されない限り、あたかも記載される範囲内の最小値及び最大値の両方の前に「約」なる語が付けられているものと同様の近似値として記載される。常に明示されているわけではないが、すべての数値指定の前に「約」という用語が付けられている点は理解されるべきである。かかる範囲形式は便宜上、かつ簡略化のために使用されるものであり、ある範囲の限定値として明示的に示される数値を含むのみでなく、個々の数値及びその範囲内に包含される部分範囲のすべてを、あたかも各数値及び部分範囲が明示的に指定されているのと同様に含むものとして柔軟に解釈されるべきである点は理解されよう。例えば、約１～約２００の範囲の比は、約１及び約２００という明示的に記載された限定値を含むのみでなく、例えば、約２、約３、及び約４などの個々の比、ならびに例えば約１０～約５０、約２０～約１００といった部分範囲も含む点も理解されるべきである。また、常に明示的に記載されているわけではないが、本明細書に記載される試薬はあくまで例示的なものに過ぎず、その均等物は当該技術分野では周知のものである点も理解されるべきである。

参照によって本明細書に援用されるいずれかの資料が本開示と矛盾する限りにおいて、本開示が優先する。

定義
量または濃度等の測定可能な値について言う場合、本明細書で使用される「約」という用語は、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。

「抗体」という用語は、天然抗体に加えて、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または合成抗体を含む、免疫グロブリンまたはその部分の遺伝子操作または他の形で改変された形態を示して用いられる。抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体が免疫グロブリン分子の免疫原性活性部分であるこれらの実施形態では、抗体は、一本鎖可変フラグメント抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、またはダイアボディを含み得る（ただしこれらに限定されない）。ｓｃＦｖ抗体は、免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域を短いリンカーペプチドで連結することによって抗体から誘導される。同様に、ジスルフィド結合Ｆｖ抗体は、ドメイン間ジスルフィド結合を用いてＶ_ＨとＶ_Ｌとを連結することによって作製することができる。これに対して、ｓｄＡｂは、重鎖または軽鎖のいずれかの可変領域のみからなり、通常、抗体の最小の抗原結合フラグメントである。ＶＨＨ抗体は重鎖のみの抗原結合フラグメントである。ダイアボディは、小さなペプチドリンカーによって非共有結合的に連結されるかまたは互いに共有結合により連結されたＶ_ＨとＶ_Ｌ領域とからなるｓｃＦｖフラグメントの二量体である。免疫グロブリン分子の免疫原性活性部分を含む抗体を含む、本明細書に開示される抗体は、特定の抗原に結合する能力を保持している。

本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き起こすことができる分子を指す。抗原としては、限定されるものではないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖複合体、多糖類及び他の分子のペプチドならびに非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルス及びウイルス抽出物、ならびに寄生虫などの多細胞生物、及びアレルゲンが挙げられる。抗原という用語には、広義には、宿主免疫系によって異物として認識されるあらゆる種類の分子が含まれる。

「自己免疫疾患」、「自己免疫障害」、「炎症性疾患」、または「炎症性障害」という用語は、対象がそれ自身の組織及び／または細胞に対する免疫反応を生じるあらゆる疾患または障害を指す。自己免疫障害は、神経系、胃腸管系、及び内分泌系、ならびに皮膚及び他の結合組織、眼、血液及び血管の疾患を含む（ただし、これらに限定されない）対象（例えば、ヒト）のほぼすべての臓器系を侵す可能性がある。自己免疫疾患の例としては、限定されるものではないが、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、バセドウ病、強皮症、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、及び糖尿病が挙げられる。

「結合ドメイン」は「結合領域」とも呼ばれ、標的と特異的かつ非共有結合的に会合、統合または結合する能力を有する抗体またはその一部を指す。結合ドメインには、生物学的分子、分子複合体、または他の目的の標的に対する、あらゆる天然、合成、半合成、または組換えにより作製された結合パートナーが含まれる。例示的な結合ドメインとしては、受容体エクトドメイン、リガンド、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨＨ抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ダイアボディ、または生体分子、分子複合体、または他の目的の標的に結合するそれらの特異的な能力について選択された他の合成ポリペプチドを含む。

「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても知られ、抗原結合機能とＴ細胞の活性化機能の双方を組み合わせた人工的に操作された受容体を指す。ＣＡＲは、抗体から得られるまたは誘導される結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）などの結合ドメインを含む細胞外部分を含むことができる。細胞外部分は、膜貫通ドメインを介して１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインまたはエフェクタードメインに連結されてもよい。ＣＡＲは、任意で細胞内共刺激ドメイン（複数可）を含むことができる。（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ．，３（４）：３８８－３９８（２０１３）を参照；Ｈａｒｒｉｓ＆Ｋｒａｎｚ，ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，３７（３）：２２０－２３０（２０１６）、Ｓｔｏｎｅｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，６３（１１）：１１６３－１１７６（２０１４）も参照）。ＣＡＲを導入してＴ細胞の表面上に発現させることができ、それにより、Ｔ細胞は、抗原（ＣＡＲはこれに結合するように設計されている）を発現する標的細胞（例えば、がん細胞）を標的として死滅させることができる。

ヌクレオチド配列について言う場合の「コドン最適化された」または「コドン最適化」という用語は、コーディングヌクレオチド中の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の発生頻度が、異なる種で偏っているという発見に基づいている。そのようなコドン縮重のため、同一のポリペプチドがさまざまなヌクレオチド配列によってコードされうる。コドン最適化とは、コーディングヌクレオチド配列中の特定のコドンを、得られるポリペプチド配列を変えることなく、宿主細胞の選択に基づいた同義コドンに置換するプロセスを指す。さまざまなコドン最適化法が当該技術分野で知られており、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号及び同第６，１１４，１４８号に開示される方法が挙げられる。

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義であり、当該技術分野では一般に、抗原特異性及び／または結合親和性を付与し、かつ一次構造においてフレームワーク配列によって互いに隔てられている、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指すことが知られている。場合によっては、フレームワークアミノ酸も結合に寄与する場合がある。一般に、各可変領域には３つのＣＤＲが存在する。可変ドメイン配列は、番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、ＥＵ、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））及びＡｈｏ）に沿ってアラインすることができ、これにより、同等の残基位置にアノテーションを付すことができ、異なる分子をＡｎｔｉｂｏｄｙＮｕｍｂｅｒｉｎｇａｎｄＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＮＡＲＣＩ）（抗体番号付け及び抗原受容体分類）ソフトウェアツール（２０１６，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１５：２９８－３００）を使用して比較することができる。

「コンストラクト」という用語は、組換え核酸分子を含む任意のポリヌクレオチドを指す。コンストラクトは、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）中に存在してもよいし、ゲノムに組み込んでもよい。「ベクター」とは、特定の核酸配列を細胞または別の核酸配列に導入することができる、または別の核酸分子を輸送する手段としての核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、または染色体性、非染色体性の半合成もしくは合成核酸分子を含み得る線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子とすることができる。例示的なベクターとしては、自己複製が可能なベクター（エピソームベクター）、細胞ゲノムにポリヌクレオチドを送達することが可能なベクター（例えば、ウイルスベクター）、またはベクターが連結された核酸分子を発現することが可能なベクター（発現ベクター）がある。

「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞レセプター、または他の結合分子、ドメイン、もしくはタンパク質などの、同族結合分子によって認識され、特異的に結合されるあらゆる分子、構造、アミノ酸配列、またはタンパク質決定基を含む。

「発現」という用語は、遺伝子などの核酸分子のコード配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。このプロセスには、転写、転写後調節、転写後修飾、翻訳、翻訳後調節、翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。発現された核酸分子は、通常、発現調節配列（例えば、プロモーター）に機能的に連結されている。

本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、目的のタンパク質またはポリペプチドを発現させるためのヌクレオチド配列を保有するコンストラクトまたはベクターの導入による遺伝子改変の対象とされる細胞または微生物を指す。特定の実施形態では、発現させようとするタンパク質がＣＡＲを含む場合、宿主細胞は通常、Ｔ細胞である。

「低免疫原性」、「低免疫原性の（ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｉｃ）」、「低免疫原性の（ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）」、「低免疫性」または「低免疫の」という用語は、これらの細胞が移植される対象による免疫拒絶を受けにくい細胞を記述するために互換的に使用される。例えば、かかる低免疫原性細胞は、かかる細胞を移植された対象による免疫拒絶反応を、未変更または未改変の野生型細胞と比べて約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上、受けにくいと考えられる。本明細書に記載されるいくつかの例では、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ遺伝子の発現を調節し、ひいては低免疫原性細胞を作製するためにゲノム編集技術を利用する。本明細書に記載される他の例では、免疫寛容原性因子が細胞に導入され、これが発現されると、宿主免疫系によって認識される細胞の能力を調節または影響し、それにより低免疫原性を付与することができる。細胞の低免疫原性は、細胞が適応免疫応答及び自然免疫応答を誘発する能力を評価することによって決定することができる。かかる免疫応答は、当業者に認識されるアッセイを用いて、例えば、Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の殺滅、ＮＫ細胞の増殖、ＮＫ細胞の活性化、及びマクロファージ活性に対する低免疫原性細胞の効果を測定することにより測定することができる。低免疫原性細胞は、対象に投与される際に未改変または野生型の細胞と比較して、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞による殺滅が減少するかまたはマクロファージによる貪食が減少すると考えられる。場合によっては、低免疫原性細胞がレシピエント対象で誘発する免疫応答は、対応する非改変野生型細胞と比較して低減または減少する。場合によっては、低免疫原性細胞は、非免疫原性であるか、またはレシピエント対象において免疫応答を誘発することができない。低免疫原性細胞、その作製方法、及びその使用方法の詳細な説明は、２０１５年５月９日出願のＷＯ２０１６１８３０４１、２０１８年１月１４日出願のＷＯ２０１８１３２７８３、２０１８年３月２０日出願のＷＯ２０１８１７６３９０、２０１９年７月１７日出願のＷＯ２０２００１８６１５、２０１９年７月１７日出願のＷＯ２０２００１８６２０、２０２０年７月３１日出願のＷＯ２０２１０２２２２３、２０２０年７月３１日出願のＷＯ２０２１０２２２２３、２０２０年８月２４日出願のＷＯ２０２１０４１３１６、２０２１年４月２７日出願のＷＯ２０２１２２２２８５、２０２０、及び２０２１年４月２７日出願のＷＯ２０２１２２２２８５にみられ、実施例、配列表、及び図面を含めたこれらの開示内容を、参照によって本明細書にその全容を援用するものである。

「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「エフェクタードメイン」は、適切なシグナルを受け取ると細胞内での生物学的または生理学的応答を直接的または間接的に促進し得るＣＡＲまたは受容体の細胞内部分またはドメインである。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、標的または同族分子に結合する際に、またはタンパク質もしくはその部分またはタンパク質複合体が標的または同族分子に直接結合して、エフェクタードメインからのシグナルを誘発する際にシグナルを受け取るタンパク質またはその部分またはタンパク質複合体に由来する。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、天然のサブユニット（例えば、プリン塩基またはピリミジン塩基）を含む、共有結合によって結合されたヌクレオチドを含むポリマー化合物を指す。プリン塩基にはアデニン及びグアニンが含まれ、ピリミジン塩基にはウラシル、チミン、及びシトシンが含まれる。核酸分子には、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれ、ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ、これらのいずれも、一本鎖または二本鎖であってよい。あるアミノ酸配列をコードする核酸分子は、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。

「機能的に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能に影響されるような、単一の核酸フラグメント上の２つ以上の核酸分子の関連性を指す。

「患者」という用語は、本明細書に記載される細胞による、予防処置を含む処置が与えられる動物、例えばヒトを指す。特定の動物、例えば、ヒト患者に特異的な感染症、病態または疾患状態の治療に関し、患者という用語は、その特定の動物を指す。「患者」という用語はまた、哺乳動物、爬虫類、両生類及び魚類を含むが、これらに限定されないあらゆる脊椎動物も包含する。しかしながら、患者は、哺乳動物、例えば、ヒト、または他の哺乳動物、例えば、家庭用哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなど、または生産用哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタなどであることが有利である。

「セーフハーバー」または「セーフハーバー座位」とは、導入遺伝子または外因性遺伝子の安全な発現を可能とする遺伝子座を指す。導入遺伝子または外因性遺伝子は、例えば、セーフハーバー座位内のイントロン、エクソン、またはコード配列領域（ＣＤＳ）を含む、遺伝子の安全な発現を可能とするセーフハーバー座位の任意の適当な領域に挿入することができる。

本明細書で使用される「安全スイッチ」という用語は、目的の遺伝子またはタンパク質の発現が下方制御または上方制御された場合に、例えば、宿主の免疫系による認識を通じて細胞の排除または死を引き起こす、目的の遺伝子またはタンパク質の発現を制御するためのシステムを指す。安全スイッチは、有害臨床事象の際に外因性分子によって発動されるように設計することができる。安全スイッチは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質レベルで発現を制御することによって操作することができる。安全スイッチには、有害事象に応じて細胞活性の制御を可能にするタンパク質または分子が含まれる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、不活性状態で発現される「殺滅スイッチ」であり、外部から与えられる選択的な薬剤によってスイッチが活性化されると、安全スイッチを発現している細胞にとって致死的となる。いくつかの実施形態では、安全スイッチ遺伝子は、コンストラクト中の目的の遺伝子に対してシス作用する。安全スイッチの活性化によって、細胞はそれ自体のみ、またはそれ自体と隣接する細胞をアポトーシスまたは壊死により殺滅する。

「対象」という用語は、哺乳動物対象、好ましくはヒトを指す。「その必要がある対象」とは、疾患を診断されているかまたは疾患を発症するリスクが高い対象を指す場合がある。「対象」と「患者」という語句は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書で使用する場合、「治療有効量」とは、対象に疾患を治療するうえで所望の効果を生じる量である。特定の実施形態では、治療有効量は、最大の治療効果をもたらす量である。他の実施形態では、治療有効量は、最大治療効果より小さい治療効果をもたらす。例えば、治療有効量は、治療効果を最大にする用量に関連する１つ以上の副作用を回避しつつ治療効果を生じる量であり得る。特定の組成物の治療有効量は、治療組成物の特性（例えば、活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティー）、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、性別、疾患の種類及びステージ、病歴、一般的な身体状態、所定の投与量に対する応答性、及び他の現在の薬剤）、組成物中の薬学的に許容される担体の性質、賦形剤、及び防腐剤の性質、ならびに投与経路を含むが、これらに限定されないさまざまな要因に基づいて異なる。臨床及び薬理分野の当業者であれば、通常の実験により、すなわち、宿主細胞または宿主細胞を含有する医薬組成物の投与に対する対象の応答を監視し、それに応じて投与量を調整することによって、治療有効量を決定することができるであろう。さらなる手引きについては、例えば、参照によって本明細書にその全開示内容を援用するところの、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０１２及びＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，２０１１を参照されたい。

本明細書で使用される「免疫寛容原性因子」とは、細胞が投与、移植、または生着時に宿主またはレシピエント対象の免疫系によって認識される能力を調節するかまたはそれに影響を及ぼす、低免疫性因子、補体インヒビター、及び他の因子を含む。

「膜貫通領域」とは、細胞膜に挿入またはまたがっていてよい膜貫通タンパク質の部分である。

がんに関して本明細書で使用される「治療する」、「治療の」及び「治療」という用語は、がんを部分的または完全に緩和すること、がんを予防すること、がんの発生または再発の可能性を低下させること、がんの進行または発生を遅らせること、がんに関連する１つ以上の症状の発症を取り除く、減少させる、または遅らせること、またはがんの無増悪生存期間または全生存期間を長くすることを指す。例えば、「治療の」とは、既存のがんの増殖を防ぐまたは遅くすること、がんの形成または転移を防ぐまたは遅くすること、及び／またはがんの特定の症状の発現を遅くすることを指す場合がある。いくつかの実施形態では、「治療する」、「治療の」または「治療」という用語は、対象が、治療が投与されていない対象に比べてがん細胞の数またはサイズが減少していることを意味する。いくつかの実施形態では、「治療する」、「治療の」または「治療」という用語は、本明細書に開示及び記載される治療を受けている対象において、そのような治療を受けていない対象と比較して、がんの１つ以上の症状が緩和されることを意味する。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖の部分を指す。抗体重鎖（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変ドメインは、一般的にそれぞれ４つの概ね保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含んでいる。各フレームワーク領域は各ＣＤＲを分離しており、各ＣＤＲがフレームワーク領域間に位置している。

「ベクター」とは、適当な宿主中で核酸分子を発現させることが可能な適当な制御配列に機能的に連結された核酸分子を含むＤＮＡコンストラクトを指す。このような制御配列は、転写を行うためのプロモーター、このような転写を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を制御する配列を含み得る。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、または単に潜在的なゲノムインサートであってよい。ベクターは、適当な宿主に形質転換されると、宿主ゲノムとは独立して複製及び機能することができ、または場合によっては、ゲノム自体に組み込まれることもある。

ポリシストロニックベクター及びその組成物
いくつかの態様では、本技術は、宿主細胞中で２つ以上の目的のタンパク質を共発現させるための２つ以上の発現カセットを含むポリシストロニックベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、２つの発現カセットを含み、すなわちバイシストロニックである。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、３つの発現カセットを含み、すなわちトリシストロニックである。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、４つの発現カセットを含み、すなわちクアドシストロニックである。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、４つよりも多い発現カセットを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、発現カセットのそれぞれは、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、発現させようとする２つ以上の遺伝子は単一のプロモーターの制御下にあり、１つ以上の切断部位によって互いに隔てられていることで１つの転写物から目的の各タンパク質を共発現させることができる。他の実施形態では、２つ以上の遺伝子は、別々のプロモーターの制御下にあってもよい。

免疫寛容原性因子
特定の実施形態では、ポリシストロニックベクターは、免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列をそれぞれが含む１つ以上の発現カセットを含むことができる。１つ以上の発現カセットによって発現される各免疫寛容原性因子は、同じであっても異なってもよい。いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＣＬ２２、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、補体受容体（ＣＲ１）、ＤＵＸ４、ＦＡＳＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＩＤＯ１、ＩＬ１５－ＲＦ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、セルピンｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及び上記のいずれかの短縮体、改変体、及び融合体からなる群から選択される。ポリシストロニックベクターが、２つ以上の免疫寛容原性因子をコードする２つ以上の発現カセットを含む実施形態では、２つ以上の免疫寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＣＬ２２、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、補体受容体（ＣＲ１）、ＤＵＸ４、ＦＡＳＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＩＤＯ１、ＩＬ１５－ＲＦ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、セルピンｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、上記のいずれかの短縮体、改変体、及び融合体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択することができる。

いくつかの実施形態では、免疫寛容原性因子は、ＣＤ４７である。ＣＤ４７は白血球表面抗原であり、インテグリンの細胞接着及び調節に一定の役割を有する。ＣＤ４７は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面上に発現し、循環中のマクロファージに、細胞を食作用により食べないようにシグナル伝達する。したがって、ＣＤ４７の過剰発現は、細胞が移植される場合にその免疫原性を低下させ、同種レシピエントにおける免疫保護性を改善することができる。ＣＤ４７は、ヒトではＣＤ４７遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４７の分子量は約５０ｋＤａである。ＣＤ４７はグリコシル化され、ヒト体内の実質的にすべての細胞で普遍的に発現される。ＣＤ４７は、そのＮ末端の単一のＩｇＶ様ドメイン、５つの膜貫通セグメントを有する高度に疎水性のストレッチ、及びそのＣ末端の選択的スプライシングされた細胞質テールを有する。さらに、ＣＤ４７は、２つの細胞外領域と２つの細胞内領域を、隣接する膜貫通セグメントの間に有している。シグナルペプチドは、ＣＤ４７アイソフォーム上に存在する場合、ＩｇＶ様ドメインのＮ末端に位置する。

ＣＤ４７は、アポトーシス、増殖、接着、及び遊走など、さまざまな細胞プロセスに関与している。ＣＤ４７は、ＴＳＰ－１、インテグリン、他のＣＤ４７タンパク質、及びＳＩＲＰαなどの複数の細胞外リガンドと相互作用する。ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用は、免疫系などの多くの生体システムでさまざまな細胞間相互作用を調節し、リンパ球の恒常性、樹状細胞（ＤＣ）の成熟及び活性化、二次リンパ器官における特定のＤＣサブセットの適切な局在化、ならびに細胞遊出を調節する。移植または細胞療法用途との関連におけるドナー細胞を含む細胞上のＣＤ４７は、「自己のマーカー」として機能することができ、循環免疫細胞の表面上のＳＩＲＰαと結合して抑制性の「私を殺さないで（ｄｏｎ’ｔｋｉｌｌｍｅ）」シグナルを送達することで食作用を調節することができる。ＣＤ４７－ＳＩＲＰαの結合は、ＳＩＲＰα上の免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）のリン酸化をもたらし、これによりＳＨＰ１及びＳＨＰ２Ｓｒｃホモロジーホスファターゼの動員が誘発される。次いで、これらのホスファターゼは、食作用シナプスにおけるミオシンＩＩの蓄積を阻害し、食作用を妨げる（Ｆｕｊｉｏｋａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：６８８７－６８９９（１９９６））。マクロファージによる標的細胞の食作用は、最終的には、活性化信号（例えばＦｃγＲ、ＣＲＴ、ＬＲＰ－１）と抑制性信号（例えばＳＩＲＰα－ＣＤ４７）とのバランスによって調節される。ＣＤ４７の発現の増加は、細胞が免疫サーベイランス、その後の破壊、及び自然免疫細胞による殺滅を免れる助けとなり得る。したがって、ＣＤ４７は、例えば、本来であれば正常な免疫応答の病的なまたは望ましくない活性化がみられる場合に、免疫寛容を誘導するための免疫寛容原性因子として利用することができる。これは、例えば、患者が、同種移植または同種細胞療法を受けた後にドナー抗原に対する免疫反応を生じる場合、または自己免疫疾患に関与する自己抗原に身体が不適切に反応する場合に生じ得る。

ヒトＣＤ４７遺伝子は、６つの天然に存在する転写物を有し、そのうちの５つは、ＣＤ４７のタンパク質アイソフォームをそれぞれコードしている（Ｅｎｓｅｍｂｌ，Ｇｅｎｅ：ＣＤ４７，ＥＮＳＧ０００００１９６７７６）。６つの転写物は、ＣＤ４７－２０１、ＣＤ４７－２０２、ＣＤ４７－２０３、ＣＤ４７－２０４、ＣＤ４７－２０５、及びＣＤ４７－２０６と名付けられている。６つの転写物のコードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）は、それぞれ配列番号１２９～１３４に記載されている。５つのタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１～５に記載されている（表１を参照）。

転写物ＣＤ４７－２０１（配列番号１２９）は、３０５個のアミノ酸を有するアイソフォームＣＤ４７－２０１（配列番号１）をコードしている。アイソフォームＣＤ４７－２０１はアイソフォームＣＤ４７－２０２からアミノ酸１８個のＣ末端短縮化を有する。ＣＤ４７－２０１転写物のすべてのスプライス接合部は、少なくとも１つのノンサスペクトｍＲＮＡ（ｎｏｎ－ｓｕｓｐｅｃｔｍＲＮＡ）によって支持されている。

転写物ＣＤ４７－２０２（配列番号１３０）は、３２３個のアミノ酸を有するアイソフォームＣＤ４７－２０２（配列番号２）をコードしている。ＣＤ４７－２０２は、ヒトＣＤ４７遺伝子の最長の転写物である。これは、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースで代表的な転写物として指定されている。代表的転写物を特定する際、Ｅｎｓｅｍｂｌは、保存されたエクソンの最も高いカバレッジ、最も高い発現率、最も長いコード配列をバランスよく有し、かつＮＣＢＩ及びＵｎｉＰｒｏｔなどの他の主要なリソースにおいて代表される転写物を特定することを念頭に置いている。ＣＤ４７－２０２転写物のすべてのスプライス接合部は、少なくとも１つのノンサスペクトｍＲＮＡによって支持されている。アミノ酸１～１８はシグナルペプチドである。

転写物ＣＤ４７－２０３（配列番号１３１）は、８６個のアミノ酸を有するアイソフォームＣＤ４７－２０３（配列番号３）をコードしている。転写物モデルの唯一のサポートは、単一の発現配列タグ（ＥＳＴ）からのものである。

転写物ＣＤ４７－２０４（配列番号１３２）は、タンパク質をコードしていない。この転写物のすべてのスプライス接合部は、少なくとも１つのノンサスペクトｍＲＮＡによって支持されている。

転写物ＣＤ４７－２０５（配列番号１３３）は、１０９個のアミノ酸を有するアイソフォームＣＤ４７－２０５（配列番号４）をコードしている。アイソフォーム２０５は、アイソフォームＣＤ４７－２０２由来の３つの膜貫通ドメインと短縮化細胞内ドメインを含む。この転写物モデルの最良のサポートｍＲＮＡは、サスペクトとしてフラグ付けされているか、またはサポートは複数のＥＳＴからのものである。

転写物ＣＤ４７－２０６（配列番号１３４）は、１８３個のアミノ酸を有するアイソフォームＣＤ４７－２０６（配列番号５）をコードしている。アイソフォーム２０６は、アイソフォームＣＤ４７－２０２由来の短縮化細胞外ドメイン及び５つの膜貫通ドメインを含んでいる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７はヒトＣＤ４７であり、これらのうちのいくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７は、配列番号１～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるか、または配列番号１～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ４７は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるか、または配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４７のｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２９～１３４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３０に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である。

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞での発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１３５に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である。

ＣＡＲ
特定の実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列をそれぞれが含む１つ以上の発現カセットを含むことができる。ＣＡＲ（別名キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、または人工Ｔ細胞受容体）は、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）に、特定のタンパク質を標的とする新たな能力を付与するように操作された受容体タンパク質である。その受容体は、抗原結合及びＴ細胞活性化機能の両方を単一の受容体に組み合わせるのでキメラである。本技術のポリシストロニックベクターは、さまざまな標的抗原に対する細胞ベースの療法において使用するための宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）において１つ以上のＣＡＲを発現させるために使用され得る。１つ以上の発現カセットによって発現されるＣＡＲは、同じであっても異なってもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＡＲは、標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン（「バインダー」とも呼ばれる）、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のシグナルペプチド、１つ以上の細胞外ヒンジドメイン、及び／または１つ以上の細胞内共刺激ドメインを含む、１つ以上の追加の因子をさらに含む。ドメインは、互いに直接隣接し得るか、またはドメインを連結する１つもしくは複数のアミノ酸が存在し得る。ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、哺乳動物配列（例えばマウス配列、霊長動物配列、ヒト配列、またはそれらの組み合わせ）に由来し得る。ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が非ヒトの事例において、ＣＡＲの配列は、ヒト化され得る。ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）における発現のためにコドン最適化もされ得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であり得る。配列変動は、コドン最適化、ヒト化、制限酵素ベースのクローニングスカー、及び／または機能的ドメインを連結する追加のアミノ酸残基などに起因し得る。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端でシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドの非限定的な例には、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、及び顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体サブユニットアルファ（ＧＭＣＳＦＲ－α、別名コロニー刺激因子２受容体サブユニットアルファ（ＣＳＦ２ＲＡ））シグナルペプチド、及びそれらの変異体が含まれ、そのアミノ酸配列は、以下の表２で提供される。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、バインダーとも呼ばれる細胞外結合ドメインを含むことができる。特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、１つの標的抗原または複数の標的抗原に特異的な１つ以上の抗体を含むことができる。抗体は、抗体フラグメント（例えばｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体フラグメント（例えばＶＨＨ）とすることができる。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、リンカーによって接続された抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含み得る。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、いずれかの順序（すなわちＶ_Ｈ－リンカー－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈ）で接続され得る。リンカーの非限定的な例には、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（ｎは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５、６などであり得る）リンカー、及びその変異体が含まれる。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍細胞でのみ、または腫瘍細胞で優先的に発現される抗原、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に特徴的な抗原であり得る。例示的な標的抗原としては、限定されるものではないが、Ｂ細胞成熟因子（ＢＣＭＡ）、ＣＡ９、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７０、ＣＤ１３３、ＣＤ１７４、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＦＡＰ、ＦＯＬＨ１、ＦＯＬＲ１、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ３ＢＡ、ＩＬ１３ＲＡ２、κ、ＫＤＲ、Ｌ１ＣＡＭ、λ、ＭＥＴ、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ１、ＰＤＣＤ１、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＥＭ１、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＵＬＢＰ１ＵＬＢＰ２、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）（白血病に関連）；ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＴＡＣＩ、及びＢＣＭＡ（骨髄腫に関連）；ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ７Ｈ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲα、ＩＬ－１３Ｒα、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、及びＲＯＲ１（固形腫瘍に関連）が挙げられる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得るか、または細胞外結合ドメインの機能を増加させるためにバリアント配列を有し得る。

特定の実施形態において、ＣＡＲは、スペーサーとも称されるヒンジドメインを含み得る。「ヒンジ」及び「スペーサー」という用語は、本開示において互換的に使用され得る。ヒンジドメインの非限定的な例には、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、及びそれらの変異体が含まれ、そのアミノ酸配列は、以下の表３で提供される。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはそれらの機能的バリアントの膜貫通領域を含み、これらの配列の各々のヒトバージョンを含み得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂ、またはそれらの機能的バリアントの膜貫通領域を含み、これらの配列の各々のヒトバージョンを含み得る。表４は、数個の例示的な膜貫通ドメインのアミノ酸配列を提供する。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内共刺激ドメイン及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを有することができる。特定の実施形態では、細胞内共刺激ドメイン及び／または細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＤＣＤ６、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦβ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦα、ＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、イカロス、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰＲ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ζ、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、及びそれらの機能的バリアントから選択される１つ以上のシグナル伝達ドメインを含み、これらの配列の各々のヒトバージョンを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメイン及び／または細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメイン、ＩＴＡＭ、ＣＤ２８ドメイン、４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントから選択される１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。表５は、数個の例示的な細胞内共刺激及び／またはシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を提供する。特定の実施形態では、以下に記載されるチサゲンレクルユーセルの場合のように、配列番号１８のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、アミノ酸位置１４で変異、例えば、グルタミン（Ｑ）からリジン（Ｋ）への変異を有し得る（配列番号１１５を参照されたい）。

ポリシストロニックベクターが２つ以上のＣＡＲをコードする特定の実施形態において、２つ以上のＣＡＲは、記載されるように、同じ機能的ドメインまたは１つもしくは複数の異なる機能的ドメインを含み得る。例えば、２つ以上のＣＡＲは、配列の類似性による組換えのリスクを最小限にするために異なるシグナルペプチド、細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。または代替的に、２つ以上のＣＡＲは、同じ機能ドメインを含んでもよい。同じドメイン（複数可）及び／または骨格が使用される事例において、組換えのリスクを最小限にするために、ヌクレオチド配列レベルで、コドン多様性を導入することは任意選択である。

ＣＤ１９ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲであり、これらの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲは、シグナルペプチド、ＣＤ１９に特異的に結合する細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインをタンデムで含み得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲのシグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号６に定められるアミノ酸配列または配列番号６に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＫシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号７に定められるアミノ酸配列または配列番号７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチドは、配列番号８に定められるアミノ酸配列または配列番号８に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ１９、例えば、ヒトＣＤ１９に特異的である。ＣＤ１９ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得るか、または細胞外結合ドメインの機能を増加させるためにバリアント配列を有し得る。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、免疫グロブリン分子の免疫原的に活性のある部分（例えばｓｃＦｖ）を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、リンカーによって接続されたＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ＦＭＣ６３）の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む、ＦＭＣ６３に由来するｓｃＦｖを含む。ＦＭＣ６３及び由来するｓｃＦｖは、参照によって本明細書にそれぞれの全容を援用するＮｉｃｈｏｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）及びＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１８２１３３３７号に記載されている。いくつかの実施形態では、ＦＭＣ６３由来ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３ｓｃＦｖとも称される）の全体及びその異なる部分のアミノ酸配列は、下記表６に示される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖは、配列番号１９、２０、もしくは２５に定められるアミノ酸配列または配列番号１９、２０、もしくは２５に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖは、配列番号２１～２３及び２６～２８に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖは、配列番号２１～２３に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖは、配列番号２６～２８に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、または特定された配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲを含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖのＶ_ＨとＶ_Ｌ部分を連結するリンカーは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＷｈｉｔｌｏｗリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーは、異なるリンカー、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（ｎは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５、または６であってよい）リンカーに置き換えることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する３×Ｇ_４Ｓリンカーであり、これにより、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有する異なるＦＭＣ６３由来ｓｃＦｖが得られる。これらの実施形態の特定のものでは、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列、または配列番号２９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的な抗体に由来し、例えばＳＪ２５Ｃ１（Ｂｅｊｃｅｋｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５５：２３４６－２３５１（１９９５））、ＨＤ３７（Ｐｅｚｕｔｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８（９）：２７９３－２７９９（１９８７））、４Ｇ７（Ｍｅｅｋｅｒｅｔａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ３：３０５－３２０（１９８４））、Ｂ４３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５））、ＢＬＹ３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５））、Ｂ４（Ｆｒｅｅｄｍａｎｅｔａｌ．，７０：４１８－４２７（１９８７））、Ｂ４ＨＢ１２ｂ（Ｋａｎｓａｓ＆Ｔｅｄｄｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４０９４－４１０２（１９９１）、Ｙａｚａｗａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１５１７８－１５１８３（２００５）、Ｈｅｒｂｓｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３５：２１３－２２２（２０１０））、ＢＵ１２（Ｃａｌｌａｒｄｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４８（１０）：２９８３－２９８７（１９９２））、及びＣＬＢ－ＣＤ１９（ＤｅＲｉｅＣｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８：３６８－３８１（１９８９））が挙げられる。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ１９ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体のうちの任意のもののＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、及び／または１つまたは複数のＣＤＲを含むか、それらからなり得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲのヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメイン、例えば、ヒトＣＤ８αヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号９に定められるアミノ酸配列または配列番号９に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８ヒンジドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号１０に定められるアミノ酸配列または配列番号１０に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、配列番号１１もしくは配列番号１２に定められるアミノ酸配列または配列番号１１もしくは配列番号１２に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメインは、配列番号１３に定められるアミノ酸配列または配列番号１３に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、例えば、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号１４に定められるアミノ酸配列または配列番号１４に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１５に定められるアミノ酸配列または配列番号１５に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲの細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。ＣＤ１３７としても知られている４－１ＢＢは、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを伝達し、Ｔリンパ球の分化を促進し、その長期生存を強化する。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、ヒトである。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１６に定められるアミノ酸配列または配列番号１６に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む。ＣＤ２８は、Ｔ細胞上の別の共刺激分子である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、ヒトである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１７に定められるアミノ酸配列または配列番号１７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ＣＡＲの細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン及び記載されるＣＤ２８共刺激ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と会合してシグナルを産生し、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化のために必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なζ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基を指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ヒトのものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号１８もしくは配列番号１１５に記載のアミノ酸配列、または配列番号１８もしくは配列番号１１５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号１９もしくは配列番号２９に記載の配列を有するＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ、配列番号９のＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ１９ＣＡＲを含む、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ１９ＣＡＲは、記載されるシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号１９もしくは配列番号２９に記載の配列を有するＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ、配列番号１１もしくは配列番号１２のＩｇＧ４ヒンジドメイン、配列番号１５のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ１９ＣＡＲを含む、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ１９ＣＡＲは、記載されるシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号１９もしくは配列番号２９に記載の配列を有するＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ、配列番号１０のＣＤ２８ヒンジドメイン、配列番号１５のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１７のＣＤ２８共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ１９ＣＡＲを含む、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ１９ＣＡＲは、記載されるシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、配列番号１１６に定められるＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有し、または配列番号１１６に定められるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である発現カセットを含む（表７を参照されたい）。コードされるＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号１１７に定められる対応するアミノ酸配列を有し、または配列番号１１７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であり、以下の構成要素：ＣＤ８αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ（Ｖ_Ｌ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－Ｖ_Ｈ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ＣＤ１９ＣＡＲの市販の実施形態をコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。Ｔ細胞によって発現される及び／またはコードされるＣＤ１９ＣＡＲの商業的に入手可能な実施形態の非限定例としては、チサゲンレクルユーセル、リソカブタゲンマラルユーセル、アキシカブタゲンシロルユーセル、及びブレクスカブタゲンアウトルーセルが挙げられる。

いくつかの実施形態において、ポリシストロニックベクターは、チサゲンレクルユーセルまたはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。チサゲンレクルユーセルは、以下の構成要素：ＣＤ８αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ（Ｖ_Ｌ－３×Ｇ_４Ｓリンカー－Ｖ_Ｈ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９ＣＡＲを含む。チサゲンレクルユーセルにおけるＣＤ１９ＣＡＲのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表７で提供され、併せて配列のアノテーションは、表８で提供される。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、リソカブタゲンマラルユーセルまたはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。リソカブタゲンマラルユーセルは、以下の構成要素：ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ（Ｖ_Ｌ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－Ｖ_Ｈ）、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９ＣＡＲを含む。リソカブタゲンマラルユーセルにおけるＣＤ１９ＣＡＲのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表７で提供され、併せて配列のアノテーションは表９で提供される。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、アキシカブタゲンシロルユーセルまたはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。アキシカブタゲンシロルユーセルは、以下の構成要素：ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ（Ｖ_Ｌ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－Ｖ_Ｈ）、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９ＣＡＲを含む。アキシカブタゲンシロルユーセルにおけるＣＤ１９ＣＡＲのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表７で提供され、併せて配列のアノテーションは、表１０で提供される。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ブレクスカブタゲンアウトルーセルまたはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。ブレクスカブタゲンアウトルーセルは、以下の構成要素：ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９ＣＡＲを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、配列番号３１、３３、もしくは３５に定められるＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有し、または配列番号３１、３３、もしくは３５に定められるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である発現カセットを含む。コードされるＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号３２、３４、もしくは３６にそれぞれ定められる対応するアミノ酸配列を有し、または配列番号３２、３４、もしくは３６にそれぞれ定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、配列番号３１、３３、もしくは３５に記載のＣＤ１９ＣＡＲをコードするか、または配列番号３１、３３、もしくは３５に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）のヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞での発現のためにコドン最適化することができる。コードされるＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号３２、３４、もしくは３６にそれぞれ記載の対応するアミノ酸配列を有するか、または配列番号３２、３４、もしくは３６にそれぞれ記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である。

ＣＤ２０ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２０ＣＡＲであり、これらの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。ＣＤ２０は、プロＢ段階で早期に及びＢ細胞成熟まで増加するレベルで徐々にＢ細胞の表面上にみられ、ほとんどのＢ細胞新生物の細胞上にもみられる抗原である。ＣＤ２０陽性細胞は、時にはホジキン病、骨髄腫、及び胸腺腫の症例においても見出される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２０ＣＡＲは、シグナルペプチド、ＣＤ２０に特異的に結合する細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインをタンデムに含み得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲのシグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号６に定められるアミノ酸配列または配列番号６に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＫシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号７に定められるアミノ酸配列または配列番号７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチドは、配列番号８に定められるアミノ酸配列または配列番号８に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ２０、例えば、ヒトＣＤ２０に特異的である。ＣＤ２０ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得るか、または細胞外結合ドメインの機能を増加させるためにバリアント配列を有し得る。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、免疫グロブリン分子の免疫原的に活性のある部分（例えばｓｃＦｖ）を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２０ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ２０に特異的な抗体に由来し、例えばＬｅｕ１６、ＩＦ５、１．５．３，リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、トシツムマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｕｍａｂ）、オドロネクスタマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブ、及びオクレリズマブが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲは、例えば、ＭＢ－１０６（ＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１３４（Ｓｕｐｐｌ．１）：３２３５（２０１９）を参照）、ＵＣＡＲＴ２０（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，ｗｗｗ．ｃｅｌｌｂｉｏｍｅｄｇｒｏｕｐ．ｃｏｍ）、またはＣ－ＣＡＲ０６６（ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅＧｒｏｕｐ、Ｌｉａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３９（１５）ｓｕｐｐｌ：２５０８（２０２１）を参照）を含む、ＣＤ２０に特異的なＣＡＲから誘導される。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ２０ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、いずれかの抗体のＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、及び／または１つ以上のＣＤＲを含むか、それらからなり得る。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２０ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、リンカーによって接続されたＬｅｕ１６の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む、Ｌｅｕ１６モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖを含む。Ｗｕｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１４（１２）：１０２５－１０３３（２００１）を参照されたい。いくつかの実施形態において、リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（ｎは、正の整数、例えば１、２、３、４、５または６であってよい）リンカー、例えば３×Ｇ_４Ｓリンカーである。他の実施形態において、リンカーは、本明細書において記載されるようなＷｈｉｔｌｏｗリンカーである。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕ１６由来ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖとも称される）全体のさまざまな部分及びそのさまざまな部分のアミノ酸配列は、以下の表１１で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖは、配列番号３７、３８、もしくは４２に定められるアミノ酸配列または配列番号３７、３８、もしくは４２に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖは、配列番号３９～４１、４３及び４４に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖは、配列番号３９～４１に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖは、配列番号４３～４４に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、または特定された配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲを含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲのヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメイン、例えば、ヒトＣＤ８αヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号９に定められるアミノ酸配列または配列番号９に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８ヒンジドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号１０に定められるアミノ酸配列または配列番号１０に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、配列番号１１もしくは配列番号１２に定められるアミノ酸配列または配列番号１１もしくは配列番号１２に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメインは、配列番号１３に定められるアミノ酸配列または配列番号１３に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、例えば、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号１４に定められるアミノ酸配列または配列番号１４に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１５に定められるアミノ酸配列または配列番号１５に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲの細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、例えば、ヒト４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１６に定められるアミノ酸配列または配列番号１６に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１７に定められるアミノ酸配列または配列番号１７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２０ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメイン、例えば、ヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号１８もしくは配列番号１１５に記載のアミノ酸配列、または配列番号１８もしくは配列番号１１５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号３７に記載の配列を有するＣＤ２０特異的ｓｃＦｖ、配列番号９のＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２０ＣＡＲを含む、ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号３７に記載の配列を有するＣＤ２０特異的ｓｃＦｖ、配列番号１０のＣＤ２８ヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２０ＣＡＲを含む、ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号３７に記載の配列を有するＣＤ２０特異的ｓｃＦｖ、配列番号１１もしくは配列番号１２のＩｇＧ４ヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２０ＣＡＲを含む、ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号３７に記載の配列を有するＣＤ２０特異的ｓｃＦｖ、配列番号９のＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号１５のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２０ＣＡＲを含む、ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号３７に記載の配列を有するＣＤ２０特異的ｓｃＦｖ、配列番号１０のＣＤ２８ヒンジドメイン、配列番号１５のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２０ＣＡＲを含む、ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号３７に記載の配列を有するＣＤ２０特異的ｓｃＦｖ、配列番号１１もしくは配列番号１２のＩｇＧ４ヒンジドメイン、配列番号１５のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２０ＣＡＲを含む、ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

ＣＤ２２ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２２ＣＡＲであり、これらの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達のための阻害性受容体として機能する成熟Ｂ細胞の表面上に大抵みられる膜貫通タンパク質であるＣＤ２２。ＣＤ２２は、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病（例えば、Ｂ－慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及びバーキットリンパ腫）の６０～７０％で発現し、Ｂ細胞発達の早期段階における細胞表面上または幹細胞上には存在しない。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２ＣＡＲは、シグナルペプチド、ＣＤ２２に特異的に結合する細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインをタンデムに含み得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲのシグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号６に定められるアミノ酸配列または配列番号６に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＫシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号７に定められるアミノ酸配列または配列番号７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチドは、配列番号８に定められるアミノ酸配列または配列番号８に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ２２、例えば、ヒトＣＤ２２に特異的である。ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得るか、または細胞外結合ドメインの機能を増加させるためにバリアント配列を有し得る。いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、免疫グロブリン分子の免疫原的に活性のある部分（例えばｓｃＦｖ）を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、例えばＳＭ０３、イノツズマブ、エプラツズマブ、モキセツモマブ、及びピナツズマブを包含する、ＣＤ２２に特異的な抗体に由来する。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体のうちの任意のもののＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、及び／または１つまたは複数のＣＤＲを含むか、それらからなり得る。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、リンカーによって接続されたｍ９７１モノクローナル抗体（ｍ９７１）の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む、ｍ９７１に由来するｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（ｎは、正の整数、例えば１、２、３、４、５または６であってよい）リンカー、例えば３×Ｇ_４Ｓリンカーである。他の実施形態において、その代りにＷｈｉｔｌｏｗリンカーが使用され得る。いくつかの実施形態では、ｍ９７１由来ｓｃＦｖ（ｍ９７１ｓｃＦｖとも称される）全体及びそのさまざまな部分のアミノ酸配列は、以下の表１２で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、配列番号４５、４６、もしくは５０に定められるアミノ酸配列または配列番号４５、４６、もしくは５０に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、配列番号４７～４９及び５１～５３に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、配列番号４７～４９に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、配列番号５１～５３に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、または特定された配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本明細書において記載されるような１つまたは複数のＣＤＲを含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ｍ９７１－Ｌ７に由来するｓｃＦｖを含み、ｍ９７１－Ｌ７は、親抗体ｍ９７１と比較して有意に改善した（約２ｎＭから５０ｐＭ未満に改善した）ＣＤ２２結合親和性を有するｍ９７１の親和性成熟バリアントである。いくつかの実施形態では、ｍ９７１－Ｌ７に由来するｓｃＦＶは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（ｎは、正の整数、例えば、１、２、３、４、５、または６であってよい）リンカー、例えば、３×Ｇ_４Ｓリンカーによって接続されたｍ９７１－Ｌ７のＶ_ＨとＶ_Ｌを含む。他の実施形態において、その代りにＷｈｉｔｌｏｗリンカーが使用され得る。いくつかの実施形態では、ｍ９７１－Ｌ７由来ｓｃＦｖ（ｍ９７１－Ｌ７ｓｃＦｖとも称される）全体及びそのさまざまな部分のアミノ酸配列は、以下の表１２で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、配列番号５４、５５、もしくは５９に定められるアミノ酸配列または配列番号５４、５５、もしくは５９に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、配列番号５６～５８及び６０～６２に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、配列番号５６～５８に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、配列番号６０～６２に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ２２特異的ｓｃＦｖは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、または特定された配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲを含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗毒素ＨＡ２２またはＢＬ２２を含む。抗毒素ＢＬ２２及びＨＡ２２は、細菌毒素へ融合されるＣＤ２２について特異的なｓｃＦｖを含み、したがってＣＤ２２を発現するがん細胞の表面に結合し、がん細胞を殺滅し得る治療剤である。ＢＬ２２は、緑膿菌外毒素Ａの３８ｋＤａの短縮形態へ融合された、抗ＣＤ２２抗体（ＲＦＢ４）のｄｓＦｖを含む（Ｂａｎｇｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１１：１５４５－５０（２００５））。ＨＡ２２（ＣＡＴ８０１５、モキセツモマブ・パスドトクス）は、ＢＬ２２を突然変異させた、より高親和性のバージョンである（Ｈｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（１）：６０７－１７（２００５））。ＣＤ２２に特異的なＨＡ２２及びＢＬ２２の抗原結合ドメインの好適な配列は、例えば米国特許第７，５４１，０３４号、同第７，３５５，０１２号、及び同第７，９８２，０１１号（それらの全体を参照することによって本明細書に援用される）中で開示される。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲのヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメイン、例えば、ヒトＣＤ８αヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号９に定められるアミノ酸配列または配列番号９に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８ヒンジドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号１０に定められるアミノ酸配列または配列番号１０に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、配列番号１１もしくは配列番号１２に定められるアミノ酸配列または配列番号１１もしくは配列番号１２に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメインは、配列番号１３に定められるアミノ酸配列または配列番号１３に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、例えば、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号１４に定められるアミノ酸配列または配列番号１４に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１５に定められるアミノ酸配列または配列番号１５に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、例えば、ヒト４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１６に定められるアミノ酸配列または配列番号１６に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１７に定められるアミノ酸配列または配列番号１７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメイン、例えば、ヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号１８もしくは配列番号１１５に記載のアミノ酸配列、または配列番号１８もしくは配列番号１１５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号４５もしくは配列番号５４に記載の配列を有するＣＤ２２特異的ｓｃＦｖ、配列番号９のＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２２ＣＡＲを含む、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号４５もしくは配列番号５４に記載の配列を有するＣＤ２２特異的ｓｃＦｖ、配列番号１０のＣＤ２８ヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２２ＣＡＲを含む、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号４５もしくは配列番号５４に記載の配列を有するＣＤ２２特異的ｓｃＦｖ、配列番号１１もしくは配列番号１２のＩｇＧ４ヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２２ＣＡＲを含む、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号４５もしくは配列番号５４に記載の配列を有するＣＤ２２特異的ｓｃＦｖ、配列番号９のＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号１５のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２２ＣＡＲを含む、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号４５もしくは配列番号５４に記載の配列を有するＣＤ２２特異的ｓｃＦｖ、配列番号１０のＣＤ２８ヒンジドメイン、配列番号１５のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２２ＣＡＲを含む、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、配列番号４５もしくは配列番号５４に記載の配列を有するＣＤ２２特異的ｓｃＦｖ、配列番号１１もしくは配列番号１２のＩｇＧ４ヒンジドメイン、配列番号１５のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＣＤ２２ＣＡＲを含む、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、配列番号１３６に記載のアミノ酸配列、または配列番号１３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を有するＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を、以下の構成要素、すなわち、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ｍ９７１ｓｃＦＶ（Ｖ_Ｈ－Ｇ４Ｓリンカー－Ｖ_Ｌ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に含む発現カセットを含む（表１２を参照されたい）。

ＢＣＭＡＣＡＲ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡＣＡＲであり、これらの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞系統の細胞上に発現する腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦＲ）メンバーであり、最終的に分化したＢ細胞または成熟Ｂリンパ球上で最も高い発現を有する。ＢＣＭＡは、長期的な液性免疫の維持のための形質細胞の生存の媒介に関与する。ＢＣＭＡの発現は、最近、多数のがん（多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、さまざまな白血病、ならびに神経膠芽腫等）に結びつけられた。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡＣＡＲは、シグナルペプチド、ＢＣＭＡに特異的に結合する細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインをタンデムに含み得る。

いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲのシグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号６に定められるアミノ酸配列または配列番号６に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＫシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号７に定められるアミノ酸配列または配列番号７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧＭＣＳＦＲ－αまたはＣＳＦ２ＲＡシグナルペプチドは、配列番号８に定められるアミノ酸配列または配列番号８に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＢＣＭＡ、例えば、ヒトＢＣＭＡに特異的である。ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得るか、または細胞外結合ドメインの機能を増加させるためにバリアント配列を有し得る。

いくつかの実施形態において、細胞外結合ドメインは、免疫グロブリン分子の免疫原的に活性のある部分（例えばｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、例えばベランタマブ、エルラナタマブ（ｅｒｌａｎａｔａｍａｂ）、テクリスタマブ、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ、及びシルタカブタゲンを含む、ＢＣＭＡに特異的な抗体に由来する。これらの実施形態のいずれにおいても、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体のうちの任意のもののＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、及び／または１つまたは複数のＣＤＲを含むか、それらからなり得る。

いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｃ１１Ｄ５．３（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９（８）：２０４８－２０６０（２０１３）中で記載されるマウスモノクローナル抗体）に由来するｓｃＦｖを含む。ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１０１０４９４９号も参照されたい。Ｃ１１Ｄ５．３由来ｓｃＦｖは、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーによって接続されたＣ１１Ｄ５．３の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含み得、そのアミノ酸配列は、以下の表１３で提供される。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号６３、６４、もしくは６８に定められるアミノ酸配列または配列番号６３、６４、もしくは６８に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号６５～６７及び６９～７１に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号６５～６７に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号６９～７１に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＢＣＭＡ特異的ｓｃＦｖは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、または特定された配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲを含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９（８）：２０４８－２０６０（２０１３）及びＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１０１０４９４９に記載される別のマウスモノクローナル抗体Ｃ１２Ａ３．２に由来するｓｃＦｖを含み、そのアミノ酸配列はまた、以下の表１３で提供される。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号７２、７３、もしくは７７に定められるアミノ酸配列または配列番号７２、７３、もしくは７７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号７４～７６及び７８～８０に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号７４～７６に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号７８～８０に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＢＣＭＡ特異的ｓｃＦｖは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、または特定された配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本明細書において記載されるような１つまたは複数のＣＤＲを含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｆｒｉｅｄｍａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２９（５）：５８５－６０１（２０１８））中でＢＢ２１２１と称される、ヒトＢＣＭＡへの高特異性を備えたマウスモノクローナル抗体を含む。ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１２１６３８０５号も参照されたい。

いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｚｈａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１１（１）：１４１（２０１８）中で記載されるような、ＢＣＭＡの２つのエピトープへ結合し得る２つの重鎖（ＶＨＨ）の単一可変フラグメントを含み、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍとも称される。ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１８０２８６４７号も参照されたい。

いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｌａｍｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１）：２８３（２０２０）中で記載されるような、完全にヒトの重鎖可変ドメイン（ＦＨＶＨ）を含み、ＦＨＶＨ３３とも称される。ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１９００６０７２号も参照されたい。ＦＨＶＨ３３及びそのＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の表１３で提供される。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号８１に定められるアミノ酸配列または配列番号８１に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号８２～８４に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、または特定された配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲを含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、米国特許第１１，０２６，９７５Ｂ２号に記載されるようなＣＴ１０３Ａ（またはＣＡＲ００８５）に由来するｓｃＦｖであり、アミノ酸配列は、以下の表１３で提供される。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号１１８、１１９、もしくは１２３に定められるアミノ酸配列または配列番号１１８、１１９、もしくは１２３に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号１２０～１２２及び１２４～１２６に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号１２０～１２２に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含み得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインは、配列番号１２４～１２６に定められるアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含み得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＢＣＭＡ特異的ｓｃＦｖは、１つ以上のアミノ酸置換を含む、または特定された配列のいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）の配列を含む１つ以上のＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本明細書において記載されるような１つまたは複数のＣＤＲを含むか、またはそれからなる。

また、ＢＣＭＡに仕向けられたＣＡＲ及び結合因子は、米国出願公開番号２０２０／０２４６３８１Ａ１及び２０２０／０３３９６９９Ａ１に記載されており、各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲのヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメイン、例えば、ヒトＣＤ８αヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号９に定められるアミノ酸配列または配列番号９に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８ヒンジドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ヒンジドメインは、配列番号１０に定められるアミノ酸配列または配列番号１０に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、配列番号１１もしくは配列番号１２に定められるアミノ酸配列または配列番号１１もしくは配列番号１２に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ－Ｃｈ２－Ｃｈ３ドメインは、配列番号１３に定められるアミノ酸配列または配列番号１３に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、例えば、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号１４に定められるアミノ酸配列または配列番号１４に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１５に定められるアミノ酸配列または配列番号１５に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞内共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、例えば、ヒト４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号１６に定められるアミノ酸配列または配列番号１６に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン、例えば、ヒトＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号１７に定められるアミノ酸配列または配列番号１７に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメイン、例えば、ヒトＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号１８もしくは配列番号１１５に記載のアミノ酸配列、または配列番号１８もしくは配列番号１１５に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、記載されるＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインのいずれか、配列番号９のＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１６の４－１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＢＣＭＡＣＡＲを含む、ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＢＣＭＡＣＡＲは、記載されるシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、記載されるＢＣＭＡ特異的細胞外結合ドメインのいずれか、配列番号９のＣＤ８αヒンジドメイン、配列番号１４のＣＤ８α膜貫通ドメイン、配列番号１７のＣＤ２８共刺激ドメイン、配列番号１８もしくは配列番号１１５のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及び／またはそれらのバリアント（すなわち、開示される配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を有する）を含むＢＣＭＡＣＡＲを含む、ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＢＣＭＡＣＡＲは、記載されるシグナルペプチドをさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、配列番号１２７に定められるＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含有し、または配列番号１２７に定められるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）である発現カセットを含む（表１４を参照されたい）。コードされるＢＣＭＡＣＡＲは、配列番号１２８に定められる対応するアミノ酸配列を有し、または配列番号１２８に定められるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば_、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であり、以下の構成要素：ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＴ１０３ＡｓｃＦｖ（Ｖ_Ｌ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－Ｖ_Ｈ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば、イデカブタゲンビクルユーセル（ｂｂ２１２１とも呼ばれるｉｄｅ－ｃｅｌ）を含む、ＢＣＭＡＣＡＲの市販の実施形態をコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、ポリシストロニックベクターは、イデカブタゲンビクルユーセルまたはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含む。イデカブタゲンビクルユーセルは、以下の構成要素：ＢＢ２１２１結合因子、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有するＢＣＭＡＣＡＲを含む。

安全スイッチ
特定の実施形態では、ポリシストロニックベクターは、安全スイッチをコードするヌクレオチド配列をそれぞれが含む１つ以上の発現カセットを含むことができる。本技術のポリシストロニックベクターに安全スイッチを使用することで、例えば、細胞が望ましくない形で増殖及び分裂するか、または宿主に対して過剰な毒性を引き起こす場合に、ポリシストロニックベクターを含む宿主細胞の死またはアポトーシスを誘導することができる。したがって、安全スイッチの使用は、インビボで異常細胞を条件によって排除することを可能にし、医療機関における細胞療法の適用のための重要なステップとなり得る。安全スイッチ及びその使用については、例えば、Ｄｕｚｇｕｎｅｓ，ＯｒｉｇｉｎｓｏｆＳｕｉｃｉｄｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（２０１９）、Ｄｕｚｇｕｎｅｓ（ｅｄｓ），ＳｕｉｃｉｄｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８９５（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）（ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼについて）、ＺｈｏｕａｎｄＢｒｅｎｎｅｒ，ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ４４（１１）：１０１３－１０１９（２０１６）（ｉＣａｓｐａｓｅ９について）、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１８（５）：１２５５－１２６３（２００１）（ｈｕＥＧＦＲについて）、米国特許出願公開第２０１８０００２３９７号（ＨＥＲ１について）、及びＰｈｉｌｉｐｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１２４（８）：１２７７－１２８７（２０１４）（ＲＱＲ８について）に記載されている。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、制御された形で、例えば、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的な外因性化合物による活性化に際して、細胞死を引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、安全スイッチの発現は、ゲノム位置に依存しない転写調節の場合には、ポリシストロニックベクターのプロモーターによって、または標的遺伝子座へのコンストラクトの部位特異的組み込みの場合には、内因性プロモーターによって調節される。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、「自殺遺伝子」または「自殺スイッチ」を含む。自殺遺伝子は、細胞が望ましくない形で増殖及び分裂するようなことがあれば、それらの細胞の死を引き起こすことができる。自殺遺伝子は、特定の化合物、例えば、非毒性化合物を強毒性の代謝産物に選択的に変換する酵素によって活性化された場合にのみ細胞死滅を引き起こすタンパク質をコードすることができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターの安全スイッチは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、ラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターの安全スイッチは、薬物またはプロドラッグによって活性化される際に、例えば、細胞内で非毒性のプロドラッグを毒性代謝物に変換することによって細胞殺滅能力を示す生成物をコードする導入遺伝子であってよい。これらの実施形態では、細胞の殺滅は、ベクターを含む細胞を薬物またはプロドラッグと接触させることにより活性化される。場合によっては、安全スイッチはＨＳＶｔｋであり、これは、ガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶ三リン酸に変換し、それによりＤＮＡ合成を妨げ、分裂細胞を死滅させる。場合によっては、安全スイッチは、ＣｙＤまたはそのバリアントであり、シトシンのウラシルへの加水分解による脱アミノ化を触媒することによって、抗真菌薬の５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を細胞傷害性５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換する。５－ＦＵはさらに細胞酵素によって強力な代謝拮抗薬（５－ＦｄＵＭＰ、５－ＦｄＵＴＰ、５－ＦＵＴＰ）に変換される。これらの化合物は、チミジル酸合成酵素ならびにＲＮＡ及びＤＮＡの産生を阻害し、細胞死をもたらす。場合によっては、安全スイッチは、ＮＴＲまたはそのバリアントであり、ニトロ基を増殖及び非増殖細胞中で毒性である反応性Ｎ－ヒドロキシルアミン中間体に還元することでプロドラッグＣＢ１９５４に作用することができる。場合によっては、安全スイッチはＰＮＰまたはそのバリアントであり、プロドラッグの６－メチルプリンデオキシリボシドまたはフルダラビンを増殖細胞及び非増殖細胞の両方に対する毒性代謝物に変換することができる。場合によっては、安全スイッチは西洋ワサビペルオキシダーゼまたはそのバリアントであり、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）の強力な細胞毒素への変換を触媒し、細胞を死滅させることができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターの安全スイッチはｉＣａｓｐ９とすることができる。カスパーゼ９は、生理的条件下で損傷ミトコンドリアからのチトクロムＣの放出によって活性化される内因性ミトコンドリアアポトーシス経路の構成要素である。活性化されたカスパーゼ９は次にカスパーゼ３を活性化し、カスパーゼ３は末端エフェクター分子をトリガーしてアポトーシスをもたらす。ｉＣａｓｐ９は、短縮化カスパーゼ９（その生理的二量化ドメインまたはカスパーゼ活性化ドメインを持たない）を、ペプチドリンカーを介してＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）であるＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖに融合させることによって生成することができる。ｉＣａｓｐ９は低い二量体非依存性基底活性を有し、宿主細胞の表現型、機能または抗原特異性を損なうことなく宿主細胞（例えばヒトＴ細胞）中で安定的に発現させることができる。しかしながら、例えばリミデュシド（ＡＰ１９０３）、ＡＰ２０１８７及びラパマイシンなどの二量体化の化学的誘導剤（ＣＩＤ）の存在下ではｉＣａｓｐ９は誘導性二量体化を起こして下流のカスパーゼ分子を活性化することができ、その結果、ｉＣａｓｐ９を発現する細胞のアポトーシスをもたらす（例えば、ＰＣＴ出願公開第２０１１／１４６８６２号、Ｓｔａｓｉｅｔａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．ＢｌｏｏｄＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ１３：９１３－９２４（２００７）を参照されたい）。詳細には、ラパマイシン誘導性カスパーゼ９バリアントは、ｒａｐａＣａｓｐ９と呼ばれる（Ｓｔａｖｒｏｕｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２６（５）：１２６６－１２７６（２０１８）を参照されたい）。したがって、本発明のポリシストロニックベクターにおける安全スイッチとしてｉＣａｓｐ９を使用することにより、宿主細胞の制御された殺滅を実現することができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターの安全スイッチは、膜発現タンパク質であってもよく、そのタンパク質に対する特異的な抗体の投与後の細胞の枯渇を可能にする。このカテゴリの安全スイッチには、例えば、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、またはＲＱＲ８が含まれ得る。これらのタンパク質は、特定の抗体の標的となり得る表面エピトープを有することができる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＣＲ４抗体によって認識され得るＣＣＲ４を含む。適当な抗ＣＣＲ４抗体の非限定的な例としては、モガムリズマブ及びそのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ１６または抗ＣＤ３０抗体によって認識され得るＣＤ１６またはＣＤ３０を含む。このような抗ＣＤ１６または抗ＣＤ３０抗体の非限定的な例としては、ＡＦＭ１３及びそのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ１９抗体によって認識され得るＣＤ１９を含む。このような抗ＣＤ１９抗体の非限定的な例としては、ＭＯＲ２０８及びそのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ２０抗体によって認識され得るＣＤ２０を含む。このような抗ＣＤ２０抗体の非限定的な例としては、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ及びそれらのバイオシミラーが挙げられる。したがって、安全スイッチを発現する細胞はＣＤ２０陽性であり、記載される抗ＣＤ２０抗体の投与によって殺滅の標的とすることができる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＥＧＦＲ抗体によって認識され得るＥＧＦＲを含む。このような抗ＥＧＦＲ抗体の非限定的な例としては、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオシミラーが含まれる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＧＤ２抗体によって認識され得るＧＤ２を含む。このような抗ＧＤ２抗体の非限定的な例としては、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジニツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＨＥＲ１抗体によって認識され得るＨＥＲ１を含む。このような抗ＨＥＲ１抗体の非限定的な例としては、セツキシマブ及びそのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＨＥＲ２抗体によって認識され得るＨＥＲ２を含む。このような抗ＨＥＲ２抗体の非限定的な例としては、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａＧＥＸ、及びそれらのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＭＵＣ１抗体によって認識され得るＭＵＣ１を含む。このような抗ＭＵＣ１抗体の非限定的な例としては、ガチポツズマブ及びそのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＰＳＭＡ抗体によって認識され得るＰＳＭＡを含む。このような抗ＰＳＭＡ抗体の非限定的な例としては、ＫＭ２８１２及びそのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＲＱＲ８抗体によって認識され得るＲＱＲ８を含む。このような抗ＲＱＲ８抗体の非限定的な例としては、セツキシマブ及びそのバイオシミラーが挙げられる。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、ＨＳＶｔｋと、膜発現タンパク質、例えばＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８とを含む。

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、改変細胞の表面上に発現する１つ以上の免疫寛容原性因子を認識する治療剤を含む。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、ＣＤ４７とシグナル調節性タンパク質α（ＳＩＲＰα）との相互作用を阻害または遮断する治療剤、例えば、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤を含む。ＳＩＲＰαは、循環免疫細胞上の膜貫通受容体タンパク質である。外来細胞によって発現されるＣＤ４７がＳＩＲＰαと結合すると、ＣＤ４７は、「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔｅａｔｍｅ）」という抑制性シグナルをレシピエントの免疫系に送達し、これによりレシピエントの免疫系による拒絶を免れる。したがって、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用を妨げると、免疫防御マスキングがなくなり、その結果、レシピエントの免疫系によって外来細胞が排除されることとなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＣＤ４７、ＳＩＲＰα、またはその両方の細胞表面での発現を中和、遮断、拮抗、または妨害する薬剤である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＣＤ４７、ＳＩＲＰαまたはその両方の相互作用を阻害または遮断する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤（例えば、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤、阻害剤、低減剤、拮抗剤、中和剤または妨害剤）は、ＣＤ４７に結合する抗体またはそのフラグメント、ＣＤ４７に結合する二重特異的抗体、ＣＤ４７に結合するイムノサイトカイン融合タンパク質、ＣＤ４７含有融合タンパク質、ＳＩＲＰαに結合する抗体またはそのフラグメント、ＳＩＲＰαに結合する二重特異的抗体、ＳＩＲＰαに結合するイムノサイトカイン融合タンパク質、ＳＩＲＰα含有融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される薬剤を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＣＤ４７結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７結合ドメインは、ＳＩＲＰαまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧＦｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１Ｆｃドメインは、ヒト抗体のフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＴＴＩ－６２１、ＴＴＩ－６２２、及びＡＬＸ１４８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＴＴＩ－６２１である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＴＴＩ－６２２である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、ＡＬＸ１４８である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧＦｃドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭＩＡＰ４１０、Ｂ６Ｈ１２、及びマグロリマブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭＩＡＰ４１０である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｂ６Ｈ１２である。いくつかの実施形態では、抗体は、マグロリマブである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＯ－１７６、ＩＢＩ１８８（レタプリマブ）、ＳＴＩ－６６４３、及びＺＬ－１２０１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＢＩ１８８（レタプリマブ）（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＳＴＩ－６６４３（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＺＬ－１２０１（Ｚａｉ）である。

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する有用な抗体またはそのフラグメントは、マグロリマブ（（Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４））（ＦｏｒｔｙＳｅｖｅｎ，Ｉｎｃ．；ＧｉｌｅａｄＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２（Ｃｅｌｇｅｎｅ；Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、ＩＢＩ－１８８（ＩｎｎｏｖｅｎｔＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＩＢＩ－３２２（ＩｎｎｏｖｅｎｔＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＴＧ－１８０１（ＴＧＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＮＩ－１７０１としても知られる、ＮｏｖｉｍｍｕｎｅＳＡ）、ＡＬＸ１４８（ＡＬＸＯｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪ０１１１３３（ＴＪＣ４としても知られる、Ｉ－ＭａｂＢｉｏｐｈａｒｍａ）、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ－１２０１（ＺａｉＬａｂＣｏ．，Ｌｔｄ）、ＡＫ１１７（ＡｋｅｓｂｉｏＡｕｓｔｒａｌｉａＰｔｙ，Ｌｔｄ．）、ＡＯ－１７６（ＡｒｃｈＯｎｃｏｌｏｇｙ）、ＳＲＦ２３１（ＳｕｒｆａｃｅＯｎｃｏｌｏｇｙ）、ＧｅｎＳｃｉ－０５９（ＧｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）、Ｃ４７Ｂ１５７（ＪａｎｓｓｅｎＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ１６１（ＪａｎｓｓｅｎＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ１６７（ＪａｎｓｓｅｎＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ２２２（ＪａｎｓｓｅｎＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ２２７（ＪａｎｓｓｅｎＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｖｘ－１００４（ＣｏｒｖｕｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＨＭＢＤ００４（ＨｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＰｔｅＬｔｄ）、ＳＨＲ－１６０３（Ｈｅｎｇｒｕｉ）、ＡＭＭＳ４－Ｇ４（ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＲＴＸ－ＣＤ４７（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｒｏｎｉｎｇｅｎ）、及びＩＭＣ－００２（ＳａｍｓｕｎｇＢｉｏｌｏｇｉｃｓ；ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｉａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を含む群から選択することができる。いくつかの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７、及びＩＭＣ－００２を含む群から選択される抗体とＣＤ４７結合について競合しない。いくつかの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７、及びＩＭＣ－００２から選択される抗体とＣＤ４７結合について競合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する抗体またはそのフラグメントは、ＣＤ４７に対する一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、ＣＤ４７に対するＦａｂ、ＣＤ４７に対するＶＨＨナノボディ、ＣＤ４７に対するＤＡＲＰｉｎ、及びそれらのバリアントを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に対するｓｃＦｖ、ＣＤ４７に対するＦａｂ、及びそれらのバリアントは、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７、及びＩＭＣ－００２を含む群から選択される抗体のいずれかの抗原結合ドメインに基づいたものである。ＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤に関するさらなる情報は、参照によって本明細書に全容を援用するところのＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０２２０７６９２８号に見出すことができる。

特定の実施形態では、ポリシストロニックベクターは、細胞療法、例えばがん療法に使用するための目的の導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列をそれぞれが含む１つ以上の発現カセットを含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ポリシストロニックベクターは、１つ以上の免疫寛容原性因子、１つ以上のＣＡＲ、１つ以上の安全スイッチ、及び／または細胞療法のための１つ以上の他の目的の導入遺伝子の共発現を可能にするように設計することができ、発現カセット同士は、記載された１つ以上の切断部位によって隔てられる。

具体的な例示的実施形態
いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、２Ａ部位、または２Ａ部位とフーリン部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、２Ａ部位、または２Ａ部位とフーリン部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、２Ａ部位、または２Ａ部位とフーリン部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットと、（ｄ）任意の２つの隣り合う発現カセットを隔てる２Ａ部位、または２Ａ及びフーリン部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｅ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第４の発現カセットをさらに含み、第４の発現カセットは、２Ａ部位、または２Ａとフーリン部位によって第１の発現カセット、第２の発現カセット及び／または第３の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と、を含む、ポリシストロニックベクターであって、フーリン部位が、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前に位置する、ポリシストロニックベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含み、第３の発現カセットは、２Ａ部位、または２Ａ部位とフーリン部位によって第１の発現カセット及び／または第２の発現カセットから隔てられている。

いくつかの態様では、（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、（ｂ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、（ｃ）第１の発現カセットと第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位、または２Ａ及びフーリン部位と、を含む、ポリシストロニックベクターが提供される。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって隔てられた、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、を含む。第１の発現カセットと第２の発現カセットの５’から３’方向の順序は逆転させてもよく、すなわち、ＣＤ４７遺伝子はＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子の前または後のいずれに位置してもよい。しかしながら、実施例に示されるように、５’から３’方向の順序でＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子の前にＣＤ４７遺伝子を配置することで、ＣＤ４７の発現を増加させて自然免疫細胞による殺滅からの宿主細胞の免疫保護を改善することができる。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって第１及び／または第２の発現カセットから隔てられた安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含むことができる。安全スイッチの配置は、例えば、５’から３’方向の順序でＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲカセットの前、ＣＤ４７とＣＤ１９ＣＡＲカセットとの間、またはＣＤ４７及びＣＤ２１９ＣＡＲカセットの後のように異なり得る。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって隔てられた、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、を含む。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって第１及び／または第２の発現カセットから隔てられた安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含むことができる。安全スイッチの配置は、例えば、５’から３’方向の順序でＣＤ４７及びＣＤ２０ＣＡＲカセットの前、ＣＤ４７とＣＤ２０ＣＡＲカセットとの間、またはＣＤ４７及びＣＤ２０ＣＡＲカセットの後のように異なり得る。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって隔てられた、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、を含む。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって第１及び／または第２の発現カセットから隔てられた安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含むことができる。安全スイッチの配置は、例えば、５’から３’方向の順序でＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲカセットの前、ＣＤ４７とＣＤ２２ＣＡＲカセットとの間、またはＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲカセットの後のように異なり得る。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットとを含み、これらはいずれも、記載される１つ以上の切断部位（例えば２Ａ部位、２Ａとフーリン部位）によって互いに隔てられている。このようなポリシストロニックベクターは、宿主細胞における２つのＣＡＲ（すなわち、ＣＤ２２ＣＡＲとＣＤ１９ＣＡＲ）の共発現を可能にするものである。例えば、配列の類似性による組換えのリスクを最小限にするため、ＣＤ２２ＣＡＲとＣＤ１９ＣＡＲとは、１つ以上の異なる非抗原結合ドメインを含んでもよく、例えば、各ＣＡＲは、異なるヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。１つの非限定的な例として、一方のＣＡＲは１つの膜貫通ドメイン（例えばＣＤ２８膜貫通ドメイン）を含み、他方のＣＡＲは異なる膜貫通ドメイン（例えばＣＤ８α膜貫通ドメイン）を含んでもよい。別の非限定的な例として、一方のＣＡＲは１つの共刺激ドメイン（例えば４－１ＢＢ共刺激ドメイン）を含み、他方のＣＡＲは異なる共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８共刺激ドメイン）を含んでもよい。あるいは、ＣＤ２２ＣＡＲとＣＤ１９ＣＡＲとが同じ非抗原結合ドメインを含んでもよいが、組換えの危険性を最小限に抑えるために、ヌクレオチド配列レベルのコドン多様性が導入されてもよい。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって第１、第２、及び／または第３の発現カセットから隔てられた安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第４の発現カセットをさらに含むことができる。安全スイッチの配置は、例えば、５’から３’方向の順序で他のすべての発現カセットの前、２つの発現カセットの間、または他のすべての発現カセットの後のように異なり得る。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって隔てられた、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、を含む。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって第１及び／または第２の発現カセットから隔てられた安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットをさらに含むことができる。安全スイッチの配置は、例えば、５’から３’方向の順序でＣＤ４７及びＢＣＭＡＣＡＲカセットの前、ＣＤ４７とＢＣＭＡＣＡＲカセットとの間、またはＣＤ４７及びＢＣＭＡＣＡＲカセットの後のように異なり得る。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって隔てられた、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、を含む。安全スイッチは、５’から３’方向の順序でＣＤ４７の前または後のどちらにも配置することができる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、記載される１つ以上の切断部位（例えば、２Ａ部位、２Ａ部位とフーリン部位）によって隔てられた、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、を含み、安全スイッチは、ＨＳＶｔｋ及び膜発現タンパク質（例えば、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＱＲ８、及びＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤）を含む。これらの実施形態の特定のものでは、ＣＤ４７及び安全スイッチの導入遺伝子は、例えば、記載される相同組換え修復（ＨＤＲ）ベースのアプローチによる宿主細胞の特定の座位への部位特異的挿入（ノックイン）に使用するためのホモロジーアームで挟まれている。例えば、導入遺伝子は、ＣＬＹＢＬ左ホモロジーアーム（ＬＨＡ）及び右ホモロジーアーム（ＲＨＡ）で挟まれ、宿主細胞、例えばβ膵島細胞またはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）のＣＬＹＢＬ座位に挿入することができる。

切断部位
特定の実施形態では、本技術のポリシストロニックベクターの２つ以上の発現カセットは、１つ以上の切断部位によって隔てることができる。その名が示すとおり、ポリシストロニックベクターは、宿主細胞中で１つのｍＲＮＡ転写物から２つ以上の別個のタンパク質を同時に発現させることを可能にする。切断部位をポリシストロニックベクターの設計に使用して、そのような複数の遺伝子の共発現を実現することができる。

いくつかの実施形態では、１つ以上の切断部位は、１つ以上の自己切断部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己切断部位は、２Ａ部位を含む。２Ａペプチドは、ピコルナウイルスで最初に発見された１８～２２アミノ酸長のペプチドのクラスであり、タンパク質の翻訳時にリボソームスキップを誘導することができ、それによって、同じｍＲＮＡ転写物から等量の複数の遺伝子が生じる。２Ａペプチドは、リボソームにＣ末端のペプチド結合の合成をグリシン（Ｇ）残基とプロリン（Ｐ）残基の間でスキップさせることで、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとを分離させ、ｍＲＮＡ転写物を「切断」する機能を担っている。Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＦ２Ａという、分子生物学で通常用いられる４つの２Ａペプチドが存在し、それらの配列を表１５に要約する。任意で２ＡペプチドのＮ末端にグリシン－セリン－グリシン（ＧＳＧ）リンカーを付加することで切断効率が高められる。本開示における配列を囲む「（）」の使用は、囲まれた配列が任意であることを意味する。

いくつかの実施形態では、１つ以上の切断部位は、１つ以上のプロテアーゼ部位をさらに含む。１つ以上のプロテアーゼ部位は、ポリシストロニックベクターの５’から３’方向の順序で自己切断部位（例えば、２Ａ部位）の前に位置しても後に位置してもよい。プロテアーゼ部位は、完全な転写物の翻訳後または各発現カセットの翻訳後にプロテアーゼによって切断されてよく、それにより、次の発現カセットが翻訳される前に第１の発現産物が放出される。これらの実施形態では、２Ａ部位に加えて、特に、５’から３’方向の順序で２Ａ部位の前にプロテアーゼ部位を有することにより、発現される目的のタンパク質に結合された余分なアミノ酸残基の数を減らすことができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ部位は、ＰＡＣＥ（ＰａｉｒｅｄｂａｓｉｃＡｍｉｎｏａｃｉｄＣｌｅａｖｉｎｇＥｎｚｙｍｅ）（対合塩基性アミノ酸切断酵素）部位としても知られるフーリン部位を含む。ＦＣ１、ＦＣ２及びＦＣ３という、少なくとも３つのフューリン切断配列が存在し、それらのアミノ酸配列を表１６に要約する。２Ａ部位と同様、任意で１つ以上のグリシン－セリン－グリシン（ＧＳＧ）配列が切断効率のために含まれていてもよい。

いくつかの実施形態では、１つ以上の切断部位は、１つ以上の自己切断部位、１つ以上のプロテアーゼ部位、及び／またはこれらの任意の組み合わせを含む。例えば、切断部位は２Ａ部位のみを含んでいてもよい。別の例では、切断部位は、ＦＣ２部位またはＦＣ３部位と、その後に続く２Ａ部位とを含むことができる。これらの実施形態では、１つ以上の自己切断部位同士は、同じであっても異なっていてもよい。同様に、１つ以上のプロテアーゼ部位同士は、同じであっても異なってもよい。

ベクター及びその組成物
いくつかの実施形態では、本技術の２つ以上のタンパク質のポリシストロン発現に使用されるベクターは、例えば、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージ、及び相同組換え修復（ＨＤＲ）ベースのドナーベクターを含む、宿主細胞へのヌクレオチド配列の導入に適した任意の種類のベクターであってよい。

いくつかの実施形態では、本技術のさまざまな実施形態による発現カセット及び切断部位を含むコンストラクトは、ベクターの特定の調節因子と機能的に連結されていてもよい。当業者には周知のように、発現ベクターは、一般的には、それらが機能的に連結されているコード配列の発現及びプロセシングに影響を及ぼすうえで必要とされるポリヌクレオチド配列を含むように操作される。発現制御配列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列；タンパク質の安定性を高める配列を含み得、タンパク質の分泌を高める配列を含む可能性もあり得る。発現制御配列は、それらが目的の遺伝子に近接しており、発現制御配列がトランスに作用するかまたは一定距離を置いて目的の遺伝子に作用する場合に機能的に連結されている。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物細胞における構成的遺伝子発現を誘導するものである。よく使用されているものとしては、例えば、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター（Ｇｒｅｅｎａｗａｙｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ１８：３５５－３６０（１９８２））、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター（Ｆｉｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３－１２０（１９７８））、脾臓病巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（Ａｄｒａｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ６０（１）：６５－７４（１９８７））、ヒトベータアクチンプロモーター、ポリユビキチンＣ遺伝子（ＵＢＣ）プロモーター、及びＣＡＧプロモーター（Ｎｉｔｏｓｈｉｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ１０８：１９３－１９９（１９９１））が挙げられる。哺乳動物細胞（例えば、Ｔ細胞）でＣＡＲ導入遺伝子を発現させることができるプロモーターの一例として、ＥＦ１αプロモーターがある。天然のＥＦ１αプロモーターは、リボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの酵素的送達を担う伸長因子－１複合体のアルファサブユニットの発現を誘導する。ＥＦ１αプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からＣＡＲ発現を誘導するうえで効果的であることが示されている（例えば、Ｍｉｌｏｎｅｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。構成的プロモーターとは異なり、誘導性プロモーターは、特定の刺激（例えば、化学物質、温度、光）に応じてオン状態とオフ状態との間で切り替わることができ、組織特異的または細胞特異的に調節され得る。よく使用されている誘導性プロモーターの非限定的な例としては、テトラサイクリンＯｎ（Ｔｅｔ－Ｏｎ）系及びテトラサイクリンＯｆｆ（Ｔｅｔ－Ｏｆｆ）系が挙げられ、これらは、最小プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の上流に配置されたテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）を利用している（Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９（１２）：５５４７－５５５１（１９９２））。ＴＲＥは、１９ヌクレオチドのテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列の７回反復配列からなり、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）によって認識されることができる。Ｔｅｔ－Ｏｆｆ系では、ｔｅｔＲを単純ヘルペスウイルスのビリオンタンパク質１６の活性化ドメインと融合させることにより、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）が開発されている。テトラサイクリンまたはその類似体（例えば、ドキシサイクリン）の非存在下では、ｔＴＡは、ＴＲＥのｔｅｔＯ配列に結合して発現を誘導するが、テトラサイクリンの存在下では、ｒＴＡは、テトラサイクリンに結合してＴＲＥには結合せず、その結果、遺伝子発現が低下する。逆に、Ｔｅｔ－Ｏｎ系では、テトラサイクリン依存的抑制に重要なアミノ酸残基の変異誘発により逆トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が作製されており、ｒｔＴＡはテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下でＴＲＥに結合して遺伝子発現を促進する（Ｇｏｓｓｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８（５２１８）：１７６６－１７６９（１９９５））。誘導性プロモーターの他の例としては、例えば、ＡｌｃＡ、ＬｅｘＡ、及びＣｒｅが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、第１の発現カセットの前にＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む。Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、ほとんどの真核生物のｍＲＮＡ転写物でタンパク質翻訳開始部位として機能し、リボソームアセンブリ及び翻訳開始を媒介する核酸モチーフである。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、ｒがプリン（すなわち、ａまたはｇ）である配列番号９２に記載の配列：（ｇｃｃ）ｇｃｃｒｃｃａｔｇｇ（配列番号９２）を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、第２の発現カセットの後に、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。ＷＰＲＥは、転写により三次構造増強発現を生じるＤＮＡ配列である。ＷＰＲＥ配列は、ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現を増加させる目的で一般的に使用されている。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、配列番号９３に記載のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるか、または配列番号９３：ａａｔｃａａｃｃｔｃｔｇｇａｔｔａｃａａａａｔｔｔｇｔｇａａａｇａｔｔｇａｃｔｇｇｔａｔｔｃｔｔａａｃｔａｔｇｔｔｇｃｔｃｃｔｔｔｔａｃｇｃｔａｔｇｔｇｇａｔａｃｇｃｔｇｃｔｔｔａａｔｇｃｃｔｔｔｇｔａｔｃａｔｇｃｔａｔｔｇｃｔｔｃｃｃｇｔａｔｇｇｃｔｔｔｃａｔｔｔｔｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｔａｔａａａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｃｔｇｔｃｔｃｔｔｔａｔｇａｇｇａｇｔｔｇｔｇｇｃｃｃｇｔｔｇｔｃａｇｇｃａａｃｇｔｇｇｃｇｔｇｇｔｇｔｇｃａｃｔｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａａｃｃｃｃｃａｃｔｇｇｔｔｇｇｇｇｃａｔｔｇｃｃａｃｃａｃｃｔｇｔｃａｇｃｔｃｃｔｔｔｃｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｇｃｔｔｔｃｃｃｃｃｔｃｃｃｔａｔｔｇｃｃａｃｇｇｃｇｇａａｃｔｃａｔｃｇｃｃｇｃｃｔｇｃｃｔｔｇｃｃｃｇｃｔｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｃｔｃｇｇｃｔｇｔｔｇｇｇｃａｃｔｇａｃａａｔｔｃｃｇｔｇｇｔｇｔｔｇｔｃｇｇｇｇａａａｔｃａｔｃｇｔｃｃｔｔｔｃｃｔｔｇｇｃｔｇｃｔｃｇｃｃｔｇｔｇｔｔｇｃｃａｃｃｔｇｇａｔｔｃｔｇｃｇｃｇｇｇａｃｇｔｃｃｔｔｃｔｇｃｔａｃｇｔｃｃｃｔｔｃｇｇｃｃｃｔｃａａｔｃｃａｇｃｇｇａｃｃｔｔｃｃｔｔｃｃｃｇｃｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｃｇｇｃｔｃｔｇｃｇｇｃｃｔｃｔｔｃｃｇｃｇｔｃｔｔｃｇｃｃｔｔｃｇｃｃｃｔｃａｇａｃｇａｇｔｃｇｇａｔｃｔｃｃｃｔｔｔｇｇｇｃｃｇｃｃｔｃｃｃｃｇｃ（配列番号９３）に記載の配列と少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターは、例えば記載される相同組換え修復（ＨＤＲ）ベースのアプローチによって宿主細胞の特定の遺伝子座への部位特異的挿入（ノックイン）に使用するための、発現カセット及び／またはプロモーターを含むフラグメントに隣接したホモロジーアームを含む。挿入しようとするポリシストロニックベクターのフラグメント（通常は少なくとも発現カセットを含み、任意でプロモーターも含む）は、標的挿入部位のすぐ上流及び下流の相同な配列（すなわち、左ホモロジーアーム（ＬＨＡ）及び右ホモロジーアーム（ＲＨＡ））で挟まれる。ホモロジーアームは、フラグメントがＨＤＲの鋳型として機能するよう標的ゲノム座位に対して特異的に設計される。各ホモロジーアームの長さは一般に、導入されるインサートのサイズによって決まり、より大きいインサートはより長いホモロジーアームを必要とする。

いくつかの態様では、本技術は、本明細書に開示されるさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターを含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に開示される一実施形態によるポリシストロニックベクターを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に開示される異なる実施形態による２つ以上のポリシストロニックベクターの混合物を含むことができる。これらの実施形態において、２つ以上のポリシストロニックベクターは異なり（例えば、異なる目的のタンパク質（例えば、異なるＣＡＲ）をコードする発現カセットを含む）、この組成物を使用してトランスフェクションまたは形質導入を行うことで宿主細胞の不均一集団を生成することができる。非限定的な例によれば、組成物は、一方がＣＤ４７とＣＤ１９ＣＡＲをコードし、他方がＣＤ４７とＣＤ２２ＣＡＲをコードする２つのポリシストロニックベクターを含むことができる。

いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、またはこれらの組み合わせをさらに含むことができる。「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、体の１つの組織、器官または部分から体の別の組織、器官または部分へと目的とする化合物を運ぶまたは輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを指す。例えば、担体または賦形剤は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくは封入材料、またはそれらの一部の組み合わせであってよい。担体または賦形剤の各構成成分は、製剤の他の成分と適合性でなければならないという点で、「薬学的に許容される」ものでなければならない。各成分はまた、成分が接触する可能性のあるあらゆる組織、器官または体の一部との接触に適している必要があり、つまり、それが毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性またはその治療上の利点を過度に上回る他の合併症のリスクを有してはならない。適当な賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等及びそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される宿主細胞を含む組成物は、適当な注入媒体をさらに含む。

ウイルス及びその組成物
いくつかの態様では、本技術は、宿主細胞に形質導入するための、本明細書に開示されるさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターを含むウイルスを提供する。特定の実施形態では、本技術のポリシストロニックベクターは、ウイルスの形態として、または宿主細胞への形質導入のためのウイルスにパッケージングすることができる。ウイルスは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、及びファージを含む、宿主細胞に形質導入を行い、宿主細胞にヌクレオチド配列を導入するのに適した任意の種類のウイルスであってよい。

いくつかの態様では、本技術は、本明細書に開示されるさまざまな実施形態によるウイルスを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に開示される一実施形態によるウイルスにパッケージングされたポリシストロニックベクターを含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に開示される異なる実施形態による２つ以上のウイルスの混合物を含むことができる。例えば、組成物は、第１のウイルスにパッケージングされた第１のポリシストロニックベクターと、第２のウイルスにパッケージングされた第２のポリシストロニックベクターとを含むことができる。これらの実施形態のいずれにおいても、２種以上のウイルスはそれぞれ、互いに異なるポリシストロニックベクターが第１のウイルスにパッケージングされ（例えば異なる目的のタンパク質（例えば、異なるＣＡＲ）をコードした発現カセットを含む）、この組成物を使用して宿主細胞に形質導入することで不均一集団を生成することができる。非限定的な例によれば、組成物は、一方がＣＤ４７とＣＤ１９ＣＡＲをコードするポリシストロニックベクターを含み、他方がＣＤ４７とＣＤ２２ＣＡＲをコードするポリシストロニックベクターを含む２つのウイルスを含むことができる。次いで、この組成物を使用して宿主細胞に形質導入することで、一部がＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲを発現し、一部がＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲを発現し、一部がＣＤ４７、ＣＤ１９ＣＡＲ、及びＣＤ２２ＣＡＲを発現する細胞の混合物を生成することができる。

宿主細胞を作製する方法、及びその組成物
宿主細胞を作製する方法
いくつかの態様では、本技術は、細胞療法のための本明細書に開示されるさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターを含む宿主細胞の集団を生成するための方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本方法は、本技術のさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクター、またはベクターを含む組成物またはウイルスを、養子細胞療法に使用するための宿主細胞集団に導入することを含む。宿主細胞は、例えば、ウイルス導入、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂質媒介型トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ヌクレオポレーション、リポソーム、ナノ粒子、または他の方法を含む当該分野における任意の既知の方法によってポリシストロニックベクターを組み込んで形質転換することができる。例えば、記載されたウイルスベクターまたはウイルスの形態のポリシストロニックベクターを使用して宿主細胞集団に形質導入することができる。形質転換された宿主細胞は、既知の技術を用いて回収及び／またはスクリーニングすることができ、多様な亜集団またはその組み合わせを、例えば、抗体へのアフィニティー結合、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または免疫磁気選択などの既知の技術によって濃縮または枯渇させることができる。宿主細胞への導入後、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを、記載されるランダム挿入または部位特異的挿入（ノックイン）のいずれかによって宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、記載される方法により生成される宿主細胞の集団は、集団中の宿主細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、細胞内に組み込まれたポリシストロニックベクターを有する。いくつかの実施形態では、本技術のさまざまな実施形態による方法によって生成される宿主細胞の集団は、集団中の宿主細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、ポリシストロニックベクターによりコードされる１つ以上の目的のタンパク質を発現する。

これらの実施形態の特定のものでは、方法は、本技術のさまざまな実施形態による第２のポリシストロニックベクター、またはベクターを含む組成物もしくはウイルスを、宿主細胞の集団に導入することをさらに含み得る。第２のポリシストロニックベクターまたはベクターを含む組成物もしくはウイルスを導入するこの工程は、第１のポリシストロニックベクターまたはベクターを含む組成物もしくはウイルスを宿主細胞に導入する工程と同時に、またはその後に行うことができる。これらの実施形態では、第１と第２のポリシストロニックベクターとは異なっていてもよく、例えば、異なる目的のタンパク質（例えば、異なるＣＡＲ）をコードする発現カセットを含んでもよく、生成される宿主細胞は不均一集団となり得る。非限定的な例によれば、ＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲをコードする第１のポリシストロニックベクターと、ＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲをコードする第２のポリシストロニックベクターとを順次、または組み合わせて使用して宿主細胞を形質転換することで、一部の細胞がＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲを発現し、一部の細胞がＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲを発現し、一部の細胞がＣＤ４７、ＣＤ１９、及びＣＤ２２ＣＡＲを発現する不均一集団を生成することができる。いくつかの実施形態では、記載される方法により生成される不均一な宿主細胞の集団は、集団中の宿主細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、細胞内に組み込まれた第２のポリシストロニックベクターを有する。いくつかの実施形態では、記載される方法によって生成される不均一な宿主細胞の集団は、集団中の宿主細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、第２のポリシストロニックベクターによりコードされる１つ以上の目的のタンパク質を発現する。これらの実施形態の特定のものでは、方法は、生成された宿主細胞の不均一集団の亜集団を選別または単離する工程をさらに含んでよく、亜集団中の宿主細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、細胞内に組み込まれた第１及び第２のポリシストロニックベクターの両方を有するか、または亜集団中の宿主細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、第１及び第２のポリシストロニックベクターの両方によってコードされた目的のタンパク質を発現する。

いくつかの実施形態では、方法は、本技術のさまざまな実施形態による２つ以上のポリシストロニックベクターの混合物または組み合わせ、またはベクターを含む組成物を宿主細胞の集団に導入することを含む。これらの実施形態では、２つ以上のポリシストロニックベクター同士は異なっていてもよく、例えば、異なる目的のタンパク質（例えば、異なるＣＡＲ）をコードする発現カセットを含んでもよく、生成される宿主細胞は不均一集団となり得る。ポリシストロニックベクターの混合物は、記載されるウイルスベクターまたはウイルスの混合物の形態であってよい。非限定的な例によれば、一方がＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲをコードし、他方がＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲをコードする２つのポリシストロニックベクターの混合物を使用して宿主細胞を形質転換することで、一部の細胞がＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲを発現し、一部の細胞がＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲを発現し、一部の細胞がＣＤ４７、ＣＤ１９、及びＣＤ２２ＣＡＲを発現する不均一集団を生成することができる。いくつかの実施形態では、記載される方法により生成される不均一な宿主細胞の集団は、集団中の宿主細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、細胞内に組み込まれた２つ以上のポリシストロニックベクターの少なくとも一方を有する。いくつかの実施形態では、記載される方法によって生成される不均一な宿主細胞の集団は、集団中の宿主細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、２つ以上のポリシストロニックベクターの少なくとも一方によりコードされる目的のタンパク質を発現する。これらの実施形態の特定のものでは、方法は、生成された宿主細胞の不均一集団の亜集団を選別または単離する工程をさらに含んでよく、亜集団中の宿主細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、細胞内に組み込まれた２つ以上のポリシストロニックベクターを有するか、または亜集団中の宿主細胞の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％が、２つ以上のポリシストロニックベクターによってコードされた目的のタンパク質を発現する。

これらの実施形態のいずれにおいても、方法は、宿主細胞のさらなる改変を行ってこれらの細胞の免疫原性を低下させることをさらに含み得る。細胞療法では、宿主細胞が同種である、すなわち、レシピエント以外の人に由来する場合、レシピエントへの注入後に起こり得る移植片対宿主のリスク、またはレシピエントの自然免疫系によって排除されるリスクを低減するためにさらなる改変が必要となる。いくつかの実施形態では、さらなる改変は、宿主細胞における主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及び／またはＩＩ（ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩ）分子の発現を低減またはなくすことを含む。ＭＨＣ１及び／またはＭＨＣＩＩ分子を改変するこの工程は、第１のポリシストロニックベクターもしくはそれを含む組成物を宿主細胞に導入する工程、及び／または第２のポリシストロニックベクターもしくはそれを含む組成物を宿主細胞に導入する工程の前、それと同時、またはその後に生じ得る。

ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩ遺伝子は、免疫細胞に抗原性ペプチドを提示するのに特化された細胞表面分子をコードしている。同種細胞におけるＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現により、レシピエントの免疫細胞によるこれらの細胞の認識、ひいては移植片の拒絶を防止することができる。ヒトのＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。ＭＨＣＩに対応するクラスＩのＨＬＡ（ＨＬＡＩ）としては、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子が挙げられ、ＭＨＣＩＩに対応するクラスＩＩのＨＬＡ（ＨＬＡＩ）としては、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、及びＨＬＡ－ＤＯ遺伝子が挙げられる。

いくつかの実施形態では、これらの細胞の免疫原性を低下させるための宿主細胞のさらなる改変には、例えば、ＣＩＩＴＡ、β_２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＮＬＲＣ５、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢＭ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、及びＴＡＰ１を含む１つ以上の免疫因子の発現を低下させるように細胞を遺伝子改変することが含まれる。

いくつかの実施形態では、同種宿主細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／またはＨＬＡ－Ｃなどの１つ以上のＨＬＡ座位を個別に標的化及び調節することによって、またはＨＬＡ－Ｒａｚｏｒでまとめて、ＭＨＣＩ遺伝子の低下した発現を有するように改変することができる。いくつかの実施形態では、この調節は、例えば、記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することによって、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／またはＨＬＡ－Ｃを含むＨＬＡ座位の１つ以上の挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）改変により行われる。ＨＬＡ遺伝子のいずれかの発現を調節（例えば、低減または消失）することにより、細胞を低免疫原性にすることができ、レシピエント対象で免疫応答を誘発する能力を低下させることができる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ座位のいずれかの低下した発現は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子のうちの１つ以上の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／またはＨＬＡ－Ｃのノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ座位のいずれかを標的とする遺伝子改変は、本明細書に開示される実施形態に従って、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメント）をＨＬＡ座位に挿入することを含む。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントの、ＨＬＡ座位のいずれかへの挿入によって、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／またはＨＬＡ－Ｃのノックアウトが生じる。

いくつかの実施形態では、同種宿主細胞は、Ｂ２Ｍ座位を標的として調節することによって、ＭＨＣＩ遺伝子の低下した発現を有するように改変することができる。Ｂ２Ｍ遺伝子は、ＭＨＣＩ分子の構成要素をコードする。いくつかの実施形態では、この調節は、例えば、記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することによって、Ｂ２Ｍ座位の挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）改変により行われる。Ｂ２Ｍの発現を調節すること（例えば、低減または消失させること）によって、ＭＨＣ－Ｉ分子の表面トラフィッキングが遮断され、それにより細胞が低免疫原性となる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＩ遺伝子の低下した発現を有するように改変された同種宿主細胞は、レシピエント対象に免疫応答を誘導する能力が低減される。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの低下した発現は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子のうちの１つ以上の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｂ２Ｍノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ座位を標的とする遺伝子改変は、本明細書に開示される実施形態に従って、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメント）をＢ２Ｍ座位に挿入することを含む。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントの、Ｂ２Ｍ座位への挿入によって、Ｂ２Ｍのノックアウトが生じる。

いくつかの実施形態では、同種宿主細胞は、ＴＡＰ１座位を標的として調節することによって、ＭＨＣＩ遺伝子の低下した発現を有するように改変することができる。ＴＡＰ１遺伝子によりコードされるＴＡＰ１は、ＴＡＰ２遺伝子によりコードされるＴＡＰ２と結合して抗原処理（ＴＡＰ）複合体関連トランスポーターを形成するが、ＴＡＰは小胞体（ＥＲ）にみられ、外来ペプチドをＥＲに輸送してＭＨＣクラスＩタンパク質と結合させ、細胞表面で免疫系に対して提示させる。いくつかの実施形態では、この調節は、例えば、記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することによって、ＴＡＰ１座位の挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）改変により行われる。ＴＡＰ１の発現を調節すること（例えば、低減または消失させること）によって、ＭＨＣ－Ｉ分子の表面トラフィッキングが遮断され、それにより細胞が低免疫原性となる。いくつかの実施形態では、ＴＡＰ１の低下した発現は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子のうちの１つ以上の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＴＡＰ１ノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、ＴＡＰ１座位を標的とする遺伝子改変は、本明細書に開示される実施形態に従って、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメント）をＴＡＰ１座位に挿入することを含む。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントの、ＴＡＰ１座位への挿入によって、ＴＡＰ１のノックアウトが生じる。

いくつかの実施形態では、同種宿主細胞は、ＣＤ７４の過剰発現によってＭＨＣＩＩ遺伝子の低下した発現を有するように改変することができる。

いくつかの実施形態では、同種宿主細胞は、クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）座位を標的として調節することによって、ＭＨＣＩＩ遺伝子の低下した発現を有するように改変することができる。ＣＩＩＴＡは、ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）ファミリーのタンパク質のメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによってＭＨＣＩＩの転写を制御する。いくつかの実施形態では、この調節は、例えば、記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することによって、ＣＩＩＴＡ座位の挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）改変により行われる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの低下した発現は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、及びＨＬＡ－ＤＯ遺伝子のうちの１つ以上の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＩＩＴＡノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ座位を標的とする遺伝子改変は、本明細書に開示される実施形態に従って、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする外因性核酸（例えば、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメント）をＣＩＩＴＡ座位に挿入することを含む。これらの実施形態の特定のものでは、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントの、ＣＩＩＴＡ座位への挿入によって、ＣＩＩＴＡのノックアウトが生じる。

いくつかの実施形態では、同種宿主細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡ座位に遺伝子改変を有するか、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡノックアウトを有するか、またはＣＤ７４過剰発現を有する。Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡノックアウトは、それぞれの遺伝子座の一方のアレルまたは両方のアレルに生じ得る。いくつかの実施形態では、同種宿主細胞のＢ２Ｍ、ＴＡＰ１及び／またはＣＩＩＴＡの低下した発現を有するかまたは発現を有しないように、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１及び／またはＣＩＩＴＡ座位をそれぞれ改変する。これらの実施形態では、同種宿主細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡの欠失もしくはノックアウト、またはＣＤ７４の過剰発現の結果として、ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩ遺伝子（ヒトのＨＬＡＩ及び／またはＨＬＡＩＩ）の低下した発現を有する。

特定の実施形態では、同種宿主細胞は、ＭＩＣ－Ａの遺伝子改変を有する。ＭＩＣ－Ａは、公知のアイソフォーム及びバリアント（例えば、２０２２年７月１８日にアクセスされたＵｎｉＰｒｏｔＱ２９９８３を参照されたい）を有するタンパク質であり、このようなＭＩＣ－Ａのすべての形態は、本明細書に示される開示に包含される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して行われる。例えば、いくつかの実施形態では、標的化配列ＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＡ（配列番号１３７）を有するｇＲＮＡを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びＭＩＣ－Ａを標的とするｇＲＮＡ、例えば標的化配列ＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＡ（配列番号１３７）を用いた遺伝子編集の方法は、宿主細胞などの細胞においてＭＩＣ－Ａのすべてのアレルをノックアウトする。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＭＩＣ－Ａ遺伝子を標的とする遺伝子改変などの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣ－Ａ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＭＩＣＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムを使用して行われる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターがＭＩＣ－Ａ遺伝子に挿入される。

特定の実施形態では、同種宿主細胞は、ＭＩＣ－Ｂの遺伝子改変を有する。ＭＩＣ－Ｂは、公知のアイソフォーム及びバリアント（例えば、２０２２年７月１８日にアクセスされたＵｎｉＰｒｏｔＱ２９９８０を参照されたい）を有するタンパク質であり、このようなＭＩＣ－Ｂのすべての形態は、本明細書に示される開示に包含される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して行われる。例えば、いくつかの実施形態では、標的化配列ＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＣＧＣ（配列番号１３８）を有するｇＲＮＡを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びＭＩＣ－Ｂを標的とするｇＲＮＡ、例えば標的化配列ＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＣＧＣ（配列番号１３８）を用いた遺伝子編集の方法は、宿主細胞などの細胞においてＭＩＣ－Ｂのすべてのアレルをノックアウトする。

いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＭＩＣ－Ｂ遺伝子を標的とする遺伝子改変などの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣ－Ｂ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＭＩＣ－Ｂ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムを使用して行われる。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターがＭＩＣ－Ｂ遺伝子に挿入される。

宿主細胞
いくつかの態様では、本技術は、本明細書に開示されるさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターを含む記載される方法によって作製された、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、多能性幹細胞（ＰＳＣ）またはこれらから誘導された細胞などの宿主細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不均一集団、例えば、本明細書に開示されるさまざまな実施形態による異なるポリシストロニックベクターを含む細胞の混合物であってよい。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、例えば、ナイーブＴ細胞、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）、幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示されるさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターによりコードされた免疫寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４）、ＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、ＢＣＭＡＣＡＲ）、及び／または安全スイッチを発現する。これらの実施形態では、宿主細胞は、ＣＡＲが標的とするように設計された抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ）を発現する標的細胞を認識して、標的細胞に対する免疫応答を開始し、宿主細胞は、免疫寛容原性因子の発現により、同種のレシピエントにおいて低免疫性を有する。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は自己である（すなわち、改変後のＴ細胞が投与される対象から得られる）。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は同種である（すなわち、改変後のＴ細胞が投与される対象以外の者から得られる）。これらの実施形態のどちらにおいても、Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から得られた初代Ｔ細胞であってよい。他の実施形態では、例えば同種Ｔ細胞の場合、Ｔ細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）などのＰＳＣから誘導または分化させることができる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＮＫ細胞である。ＮＫ細胞（「大顆粒リンパ球」とも定義される）は、リンパ球系共通前駆細胞（やはりＢリンパ球及びＴリンパ球を生じる）から分化した細胞系列を表す。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は、原形質膜でＣＤ３を天然で発現しない。重要な点として、ＮＫ細胞は、ＴＣＲを発現せず、また典型的には、他の抗原特異的細胞表面受容体も欠いている。ＮＫ細胞の細胞傷害性活性は感作を必要としないが、ＩＬ－２を含めたさまざまなサイトカインによる活性化によって増強される。ＮＫ細胞は、一般に、抗原－受容体媒介性シグナル伝達に必要な適切または完全なシグナル伝達経路が欠如していると考えられ、したがって、抗原受容体依存性シグナル伝達、活性化、及び増殖の能力があると考えられていない。ＮＫ細胞は細胞傷害性であり、活性化受容体シグナル伝達と阻害性受容体シグナル伝達のバランスを保つことでそれらの細胞傷害性活性を調節する。例えば、ＣＤ１６を発現しているＮＫ細胞は、感染細胞に結合した抗体のＦｃドメインに結合して、ＮＫ細胞の活性化をもたらし得る。対照的に、高レベルのＭＨＣクラスＩタンパク質を発現している細胞に対しては活性が低減される。ＮＫ細胞は、標的細胞に接触すると、パーフォリンなどのタンパク質、及びプロテアーゼ（グランザイム）等の酵素を放出する。パーフォリンは、標的細胞の細胞膜に孔を形成して、アポトーシスまたは細胞溶解を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は自己である（すなわち、改変後のＮＫ細胞が投与される対象から得られる）。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は同種である（すなわち、改変後のＮＫ細胞が投与される対象以外の者から得られる）。これらの実施形態のどちらにおいても、ＮＫ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から得られた初代ＮＫ細胞であってよい。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから誘導または分化させることができる。多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）からＮＫ細胞を生成するために使用することができる多くの技術が存在する（例えば、いずれも参照によりそれらの全容を、特に分化を行うための手法及び試薬に関して本明細書に援用するところの、Ｚｈｕｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．２０１９；２０４８：１０７－１１９、Ｋｎｏｒｒｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１３２（４）：２７４－８３．ｄｏｉ：１０．５９６６／ｓｃｔｍ．２０１２－００８４、Ｚｅｎｇｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ．２０１７Ｄｅｃ１２；９（６）：１７９６－１８１２、Ｎｉｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．２０１３；１０２９：３３－４１、Ｂｅｒｎａｒｅｇｇｉｅｔａｌ．，ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ．２０１９７１：１３－２３、Ｓｈａｎｋａｒｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒ．２０２０；１１（１）：２３４を参照されたい）。分化は、一般にＣＤ５６、ＫＩＲ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１２２、ＣＤ２７、ＣＤ２４４、ＮＫ１．１、ＮＫＧ２Ａ／Ｃ、ＮＣＲ１、Ｌｙ４９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１１ｂ、ＫＬＲＧ１、ＣＤ４３、ＣＤ６２Ｌ、及び／またはＣＤ２２６を含むが、これらに限定されないＮＫ細胞関連及び／または特異的マーカーの存在を評価することによって、当該技術分野で既知であるようにアッセイすることができる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＮＫＴ細胞である。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方の性質を共有するＴ細胞の不均質群である。これらの細胞の多くは、自己及び外来脂質ならびに糖脂質に結合する抗原提示分子である非多型ＣＤ１ｄ分子を認識する。ＮＫＴ細胞は、全末梢血Ｔ細胞の約１％のみを構成する。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞は自己である（すなわち、改変後のＮＫＴ細胞が投与される対象から得られる）。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞は同種である（すなわち、改変後のＮＫＴ細胞が投与される対象以外の者から得られる）。これらの実施形態のどちらにおいても、ＮＫＴ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から得られた初代ＮＫＴ細胞であってよい。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから誘導または分化させることができる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、例えばβ細胞（ベータ細胞またはβ膵島細胞とも称される）を含む膵島細胞である。例示的な膵島細胞種としては、限定されるものではないが、膵島前駆細胞、未成熟膵島細胞、成熟膵島細胞などが挙げられる。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は自己である（すなわち、改変後のβ膵島細胞が投与される対象から得られる）。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は同種である（すなわち、改変後のβ膵島細胞が投与される対象以外の者から得られる）。これらの実施形態のどちらにおいても、β膵島細胞は初代β膵島細胞であってよい。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから誘導または分化させることができる。多能性幹細胞を膵島細胞に分化させるうえで有用な方法は、例えば、ＵＳ９，６８３，２１５、ＵＳ９，１５７，０６２、及びＵＳ８，９２７，２８０に開示されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって作製されるβ膵島細胞は、インスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は、内在性膵島細胞の少なくとも２つの性質、例えば、限定されないが、グルコースの増加に応答したインスリンの分泌、及びベータ細胞マーカーの発現を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるβ膵島細胞は、糖尿病を治療するために対象に投与される。例示的なβ細胞マーカーまたはβ細胞前駆細胞マーカーとしては、限定されるものではないが、ｃ－ペプチド、Ｐｄｘ１、グルコース輸送体２（Ｇｌｕｔ２）、ＨＮＦ６、ＶＥＧＦ、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、プロホルモン変換酵素（ＰＣ１／３）、Ｃｄｃｐ１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ６．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、Ｐｔｆ１ａ、Ｉｓｌ１、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１７、及びＦｏｘＡ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、Ｉ型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植用に、ベータ様細胞または膵島オルガノイドに分化している。細胞システムは、Ｔ１ＤＭに対処するための有望な方法である（例えば、本明細書に参照によって援用するところのＥｌｌｉｓｅｔａｌ．，ＮａｔＲｅｖＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌＨｅｐａｔｏｌ．２０１７Ｏｃｔ；１４（１０）：６１２－６２８を参照されたい）。さらに、Ｐａｇｌｉｕｃａら（Ｃｅｌｌ，２０１４，１５９（２）：４２８－３９）は、ｈｉＰＳＣからのβ細胞の分化の成功に関して報告している（参照によって本明細書にその全容、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模生産について同文献に開示される方法及び試薬に関して援用する）。さらに、Ｖｅｇａｓらは、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の生産、続いてレシピエントによる免疫拒絶反応を回避するための封入について示している（Ｖｅｇａｓｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｄ，２０１６，２２（３）：３０６－１１（参照によって本明細書にその全容、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模生産について同文献に開示される方法及び試薬に関して援用する）。本技術で使用するためのβ膵島細胞を含めた膵島細胞のさらなる開示が、参照によって本明細書にその開示全容を援用するところのＷＯ２０２０／０１８６１５にみられる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＰＳＣ、例えばＥＳＣまたはｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化した細胞である。ＥＳＣ及びｉＰＳＣは、例えば、ニューロン、星細胞、乏突起細胞、網膜上皮細胞、表皮細胞、毛細胞、ケラチノサイト、肝細胞、膵臓β島細胞、腸上皮細胞、肺胞細胞、造血細胞、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、及び骨細胞を含む、身体のあらゆる細胞型に分化する能力を有している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、β膵島細胞またはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）である。

宿主細胞の組成物
いくつかの態様では、本技術は、本明細書に開示されるさまざまな実施形態による宿主細胞の集団を含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物は、適当な投与経路に応じてさまざまな製剤、例えば、注射製剤、凍結乾燥製剤、液体製剤、経口製剤などを有することができる。

いくつかの実施形態では、組成物は同じ投薬単位中に共配合することも、別個の投薬単位中で個別に配合することもできる。本明細書における「用量単位」及び「投与量単位」という用語は、治療効果を与える単回投与に適当な治療剤の量を含む組成物の部分を指す。そのような投与量単位は、１日に１回～複数回（すなわち１～１０回、１～８回、１～６回、１～４回、または１～２回）、または治療応答を誘発するのに必要な回数だけ投与することができる。

いくつかの実施形態では、単回投与量単位には、少なくとも約１×１０^２、５×１０^２、１×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、または５×１０^１０個の細胞が含まれる。

宿主細胞へのポリシストロニックベクターの挿入
いくつかの態様では、本技術のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントは、宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。本明細書では、特定の実施形態において、この組み込みを行うための方法及び組成物が提供される。ポリシストロニックベクターのフラグメントがゲノムに組み込まれる実施形態では、フラグメントは、目的の導入遺伝子（複数可）（例えば、免疫寛容原性因子、ＣＡＲ及び／または安全スイッチ）を含む発現カセットを少なくとも含み、任意でプロモーター（複数可）を含むことができる。

ランダム挿入
いくつかの実施形態では、本技術のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントは、宿主細胞のランダムなゲノム座位に挿入される。当業者には周知のように、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターを含むウイルスベクターは、宿主細胞内に遺伝物質を送達し、外来遺伝子または外因性遺伝子を宿主細胞ゲノムにランダムに挿入して、遺伝子の安定した発現及び複製を促進するために広く使用されている。

部位特異的挿入（ノックイン）
いくつかの実施形態では、本技術のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントは、宿主細胞の特定のゲノム座位に挿入される。多くの遺伝子編集方法を使用してポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを特定の選択されたゲノム座位に挿入することができる。遺伝子編集は、生物のゲノム内にヌクレオチド配列を挿入、欠失、改変、または置換することができる遺伝子工学の一種である。現在の遺伝子編集技術は一般的に、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞に本来備わるメカニズムを利用している。

真核細胞は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）の２つの一次修復経路によってＤＳＢを修復する。ＨＤＲは通常、姉妹染色分体が修復鋳型として利用可能である場合にＳ期後期またはＧ２期で生じる。ＮＨＥＪは、より一般的であり、細胞周期のいずれの期でも生じ得るが、よりエラーが生じやすい。遺伝子編集では、ＮＨＥＪは一般に、挿入／欠失変異（ｉｎｄｅｌ）を生成するために使用されるが、この変異は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をシフトさせ、コード領域または関連する調節領域に変化を生じさせることによって、標的遺伝子の狙った機能喪失を生じさせることができる。これに対して、ＨＤＲは、相同配列を有する修復鋳型の存在下で、狙い通りのノックイン、ノックアウト、または特定の突然変異の挿入を生じるのに好ましい経路である。例えば、化学的調節（例えば、ＮＨＥＪ経路の主要酵素の阻害剤による細胞の処理）、細胞周期のＳ期及びＧ２期に時間を合わせた遺伝子編集システムの送達、Ｓ期及びＧ２期での細胞周期の停止、ならびに相同配列を有する修復鋳型の導入を含む、ＨＤＲの効率を高めるためのいくつかの方法が当業者に知られている。本明細書で提供される方法では、ＨＤＲ媒介修復、ＮＨＥＪ媒介修復、プライム編集またはそれらの組み合わせを用いることができる。

プライム編集は、標的部位を特定するとともに所望の編集をコードしたプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）でプログラムされた、操作された逆転写酵素と融合した触媒機能が不全なＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、新たな遺伝子情報を指定されたＤＮＡ部位に直接書き込む、汎用性が高く、正確なゲノム編集方法である（例えば、いずれも参照によって本明細書にその全容を援用するところのＡｎｚａｌｏｎｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７６：１４９－１５７（２０１９）、ＷＯ２０２１０７２３２８、ＷＯ２０２２０６７１３０を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本明細書に示される部位特異的挿入を行うための方法は、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）／Ｃａｓシステムを含む部位特異的ヌクレアーゼを利用する。いくつかの実施形態では、部位特異的挿入は、プライム編集またはミスマッチ修復ベースの挿入によるものである。

ＺＦＮ
ＺＦＮは、細菌ＦｏｋＩ制限酵素のエンドヌクレアーゼドメインに結合したジンクフィンガー含有転写因子から適応された数々の部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である。ＺＦＮは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多く）のＤＮＡ結合ドメインまたはジンクフィンガードメインを有してもよい（例えば、Ｃａｒｒｏｌｌｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｍｅｒｉｃａ（２０１１）１８８：７７３－７８２、Ｋｉｍｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１１５６－１１６０を参照されたい）。各ジンクフィンガードメインは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質の構造モチーフであり、通常、３～４ｂｐのＤＮＡ配列を認識する。タンデムドメインは、故に、細胞のゲノム内で固有である長いヌクレオチド配列に結合する可能性があり得る。

特異性が知られている種々のジンクフィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５、または１８ｂｐの配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを生み出すことができる。ファジーディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッドシステム、ならびに哺乳類細胞を含む、特定の配列を認識するジンクフィンガー（及びこれらの組み合わせ）を生成するための種々の選択及びモジュール式組立て技法が利用可能である。ジンクフィンガーは、既定の核酸配列に結合するように操作され得る。既定の核酸配列に結合するようにジンクフィンガーを操作するための基準は、当技術分野で既知である。例えば、Ｓｅｒａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：７０７４－７０８１、Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００８）２４：１８５０－１８５７を参照されたい。

ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたは他の二量体ヌクレアーゼドメインを含有するＺＦＮは、二量体として機能する。故に、非回文型ＤＮＡ部位を標的とするためにＺＦＮの対が必要とされる。２つの個々のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適切に離間した状態でＤＮＡのそれぞれ反対の鎖に結合しなければならない。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：１０５７０－１０５７５を参照されたい。ゲノム内の特定の部位を切断するために、ＺＦＮの対は、一方が順方向鎖上、他方が逆方向鎖上で、当該部位の両側に位置する２つの配列を認識するように設計される。ＺＦＮが部位のどちらかの側で結合すると、ヌクレアーゼドメインは二量体化し、部位にてＤＮＡを切断して、５’オーバーハングを伴うＤＳＢを生じさせる。次いでＨＤＲを使用して、ホモロジーアームが両側に位置する所望の変異を含有する修復鋳型の一助により、特定の変異を誘導することができる。修復鋳型は通常、細胞に導入される外因性二本鎖ＤＮＡベクターである。Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３－１４８、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：７３１－７３４を参照されたい。

ＴＡＬＥＮ
ＴＡＬＥＮは、標的遺伝子を編集するために使用され得る人工ヌクレアーゼの別の例である。ＴＡＬＥＮは、長いＤＮＡ配列に結合し、それを認識する１０～３０個のリピートを有するタンデムアレイを通常含む、ＴＡＬＥリピートと呼ばれるＤＮＡ結合ドメインに由来する。各リピートは、３３～３５アミノ酸長であり、このうち２つの隣接するアミノ酸（反復可変性二残基（ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ）またはＲＶＤと呼ばれる）が４つのＤＮＡ塩基対のうちの１つに対する特異性を付与する。故に、標的ＤＮＡ配列においてリピートと塩基対との間に１対１の対応関係が存在する。

ＴＡＬＥＮは、１つ以上のＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多く）をヌクレアーゼドメイン、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインに融合することによって人工的に生産される。Ｚｈａｎｇ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４９－１５３を参照されたい。ＴＡＬＥＮにおける使用に向けてＦｏｋＩに対するいくつかの変異が作製されており、これらは、例えば、切断特異性または活性を改善する。Ｃｅｒｍａｋｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１１）３９：ｅ８２、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４３－１４８、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：７３１－７３４、Ｗｏｏｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）３３３：３０７、Ｄｏｙｏｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ（２０１０）８：７４－７９、Ｓｚｃｚｅｐｅｋｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ（２００７）２５：７８６－７９３、Ｇｕｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１０）２００：９６を参照されたい。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能するため、適切な向き及び間隔での、標的ゲノム内の部位に対する固有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つのコンストラクトを必要とする。ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとの間のアミノ酸残基の数、及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数の両方が、高レベルの活性を達成するために重要なパラメータであるようである。Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４３－１４８。

操作されたＴＡＬＥリピートをヌクレアーゼドメインと組み合わせることによって、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な部位特異的ヌクレアーゼを生産することができる。ＺＦＮに類似して、ＴＡＬＥＮを細胞に導入して、ゲノム内の所望の標的部位にてＤＳＢを生じさせることができるため、これを使用して、類似のＨＤＲ媒介性経路で遺伝子をノックアウトまたは変異をノックインすることができる。Ｂｏｃｈ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１３５－１３６、Ｂｏｃｈｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６：１５０９－１５１２、Ｍｏｓｃｏｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６：３５０１を参照されたい。

メガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、大きなＤＮＡ配列（１４～４０塩基対）を認識し、切断するそれらの能力によって特性化されるエンドヌクレアーゼファミリーにおける酵素である。メガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性及び／またはＤＮＡ認識に影響を及ぼすそれらの構造的モチーフに基づいてファミリーにグループ化される。最も広く、また、最もよく知られているメガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーにおけるタンパク質であり、それらの名称は保存されたアミノ酸配列に由来する。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。一方、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリーメンバーは、７０～１００残基長であるＧＩＹ－ＹＩＧモジュールを有し、４つの不変残基を有する４または５つの保存配列モチーフを含み、そのうち２つは、活性に必要とされる。ＶａｎＲｏｅｙｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（２００２）９：８０６－８１１を参照されたい。Ｈｉｓ－Ｃｙｓファミリーメガヌクレアーゼは、数百のアミノ酸残基を包含する領域にわたる高度に保存された一連のヒスチジン及びシステインによって特性化される。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。ＮＨＮファミリーのメンバーは、アスパラギン残基によって囲まれた２対の保存されたヒスチジンを含有するモチーフによって定義される。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。

特定の標的ＤＮＡ配列のための天然メガヌクレアーゼを同定するための可能性は、高い特異性が必要であるため低いので、変異誘発及びハイスループットスクリーニング法を含むさまざまな方法が、独自の配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体を生成するために使用されてきた。例えば、既定の核酸配列に結合するように変化したＤＮＡ結合特異性を有するメガヌクレアーゼを操作するためのストラテジーが当技術分野で知られている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．（２００２）１０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（２００３）３１：２９５２－２９６２、Ｓｉｌｖａｅｔａｌ．，ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００６）３６１：７４４－７５４、Ｓｅｌｉｇｍａｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（２００２）３０：３８７０－３８７９、Ｓｕｓｓｍａｎｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ（２００４）３４２：３１－４１、Ｄｏｙｏｎｅｔａｌ．，ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ（２００６）１２８：２４７７－２４８４、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ（２００９）２２：２４９－２５６、Ａｒｎｏｕｌｄｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．（２００６）３５５：４４３－４５８、Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２００６）３６３（２）：２８３－２９４を参照されたい。

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮのように、メガヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡにおけるＤＳＢを生成し得、これは、例えば、ＮＨＥＪを介して、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を生成し、細胞における標的遺伝子の低下した発現をもたらし得る。代替的には、外来ＤＮＡは、メガヌクレアーゼと共に細胞に導入され得る。外来ＤＮＡの配列及び染色体配列に応じて、このプロセスは、標的遺伝子を改変するために使用され得る。Ｓｉｌｖａｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（２０１１）１１：１１－２７を参照されたい。

トランスポザーゼ
トランスポザーゼは、トランスポゾンの末端に結合し、切り貼りメカニズムまたは複製的転座メカニズムによってゲノムの別の部分へのその移動を触媒する酵素である。トランスポサーゼを他のシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと連結させることによって、ゲノムＤＮＡの部位特異的挿入または操作を可能とするために新たな遺伝子編集ツールが開発され得る。非活性Ｃａｓエフェクタータンパク質及びＴｎ７様トランスポゾンを触媒的に使用するトランスポゾンを使用する２つの既知のＤＮＡ組み込み方法が存在する。トランスポザーゼ依存性ＤＮＡ組み込みは、ゲノムにおいてＤＳＢを誘発せず、これはより安全かつより特異的なＤＮＡ組み込みを保証し得る。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
ＣＲＩＳＰＲシステムは元々、原核生物（例えば、細菌及び古細菌）において、ある種の獲得免疫を与える、侵入するファージ及びプラスミドに対する防御に関与するシステムとして発見されたものである。現在では、研究及び臨床的用途において人気のある遺伝子編集ツールとして適応され、使用されている。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは通常、少なくとも２つの構成要素：１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質を含む。Ｃａｓタンパク質は、標的部位にＤＳＢを導入するヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、２つの主要なクラスに分類される：クラス１システムは、核酸を分解するために複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用する；クラス２システムは、同じ目的のために単一の大きなＣａｓタンパク質を使用する。クラス１は、タイプＩ、ＩＩＩ、及びＩＶに分けられ；クラス２は、タイプＩＩ、Ｖ、及びＶＩに分けられる。遺伝子編集用途のために適応されたさまざまなＣａｓタンパク質には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＭａｄ７が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｄａｎｇｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１６：２８０、Ｒａｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５）５２０：１８６－１９１、Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３：７５９－７７１、Ｓｔｒｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍ．（２０１９）１０：２１２、Ｙａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１９）３６３：８８－９１を参照されたい。最も広く使用されるＣａｓ９は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質であり、例示説明として本明細書に記載される。これらのＣａｓタンパク質は、異なる源種を起源とし得る。例えば、Ｃａｓ９は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に由来し得る。

元の微生物ゲノムにおいて、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、宿主ゲノム内のアレイとしてコードされるＣＲＩＳＰＲリピート配列間に侵入ＤＮＡからの配列を組み込んでいる。ＣＲＩＳＰＲリピートアレイからの転写産物は、「プロトスペーサー」配列として知られている、侵入ＤＮＡから転写された可変要素配列、及びＣＲＩＳＰＲリピートの一部をそれぞれ保有するＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へとプロセシングされる。各ｃｒＲＮＡは、第２のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズし、これらの２つのＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成する。ｃｒＲＮＡのプロトスペーサーコード部分は、相補的標的ＤＮＡ配列を切断するようにＣａｓ９複合体を誘導するが、ただし、それらは、「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）として知られている短い配列に隣接する。

上記の説明は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに焦点を当ててきたが、ここまでに記載したものとはいくつかの点で異なるｇＲＮＡを利用した他のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼも存在することを理解されたい。例えば、Ｃｐｆ１（プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ）由来のＣＲＩＳＰＲ１；Ｃａｓ１２ａとしても知られる）は、ｃｒＲＮＡのみを必要とし、機能するうえでｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないＲＮＡ誘導ヌクレアーゼである。

その発見以来、ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌からヒト細胞を含む真核細胞にわたる広範囲の細胞及び生物において配列特異的ＤＳＢ及び標的化ゲノム編集を誘導するために適応されてきた。遺伝子編集用途におけるその使用では、人工的に設計された合成ｇＲＮＡが、シングルｇＲＮＡによる特定の実施形態を含む元々のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体にとって代わりつつある。例えば、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ、テトラループ、及びｔｒａｃｒＲＮＡから構成される単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。ｃｒＲＮＡは通常、目的の標的ＤＮＡを認識するようにユーザが設計した相補的領域（スペーサーとも呼ばれ、通常は長さが約２０ヌクレオチド）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、Ｃａｓヌクレアーゼ結合のための骨格領域を含む。ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、テトラループによって連結され、各々は、互いのハイブリダイゼーションのための短いリピート配列を有し、よって、キメラｓｇＲＮＡを生成する。ｇＲＮＡに存在するスペーサーまたは相補的領域配列を単純に変更することによってＣａｓヌクレアーゼのゲノム標的を変更し得る。相補的領域は、標準的なＲＮＡ－ＤＮＡ相補的塩基対合規則を介して標的ＤＮＡ部位にＣａｓヌクレアーゼを導く。

Ｃａｓヌクレアーゼが機能するために、ゲノムＤＮＡにおいて標的配列のすぐ下流にＰＡＭが存在しなければならない。Ｃａｓタンパク質によるＰＡＭの認識は、隣接するゲノム配列を不安定化し、ｇＲＮＡによる配列の調査を可能にし、一致する配列が存在する場合にｇＲＮＡ－ＤＮＡ対合をもたらすと考えられている。ＰＡＭの具体的な配列は、Ｃａｓ遺伝子の種に応じて様々である。例えば、Ｓ．ピオゲネスに由来する最も一般的に使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、５’－ＮＧＧ－３’のＰＡＭ配列または、あまり効率的ではない速度では、５’－ＮＡＧ－３’（「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る）を認識する。代替的ＰＡＭを有する他のＣａｓヌクレアーゼバリアントもまた特性評価されており、ゲノム編集に効果的に使用されており、これらを下記表１７に要約する。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、それらの活性、特異性、認識、及び／または他の特性を変化させるための１つまたは複数の変異を含んでもよい。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、オフターゲット効果を軽減するためにその忠実度を変化させる１つ以上の変異を有してもよい（例えば、ｅＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＨｙｐａＳｐＣａｓ９、ＨｅＦＳｐＣａｓ９、及びｅｖｏＳｐＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９の高忠実度変異体である）。別の例として、Ｃａｓヌクレアーゼは、そのＰＡＭ特異性を変化させる１つ以上の変異を有してもよい。

特定の実施形態では、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントは、記載される遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）に関連するＨＤＲによって標的部位に組み込まれるＤＮＡ修復鋳型として機能することができる。一般に、挿入されるポリシストロニックベクターのフラグメントは、目的の導入遺伝子を含む発現カセット（例えば、免疫寛容原性因子、ＣＡＲ及び／または安全スイッチ発現カセット）を少なくとも含み、任意でプロモーターも含む。これらの実施形態の特定のものでは、挿入される発現カセット及び／またはプロモーターを含むフラグメントは、標的ゲノム座位がＨＤＲの鋳型として機能するように特に設計された、標的のすぐ上流及び下流の相同配列、すなわち、左側ホモロジーアーム（ＬＨＡ）と右側ホモロジーアーム（ＲＨＡ）で挟まれる。各ホモロジーアームの長さは一般に、導入されるインサートのサイズによって決まり、より大きいインサートはより長いホモロジーアームを必要とする。

いくつかの実施形態では、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントの部位特異的挿入を行うための特定のゲノム座位は、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択される。セーフハーバー座位の非限定的な例としては、限定されるものではないが、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとしても知られている）、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３（ＣＤ１４２としても知られる）、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１（ＣＤ９１としても知られる）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１遺伝子座が挙げられる。ベクターまたはそのフラグメントは、例えば、イントロン、エクソン及び／または遺伝子コード領域（ＣｏＤｉｎｇＳｅｑｕｅｎｃｅ、すなわち「ＣＤＳ」としても知られる）を含む、セーフハーバー座位の適当な領域に挿入することができる。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１座位、ＣＣＲ５座位、及びＣＬＹＢＬ座位からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、挿入は、特定のゲノム座位の１つのアレル内で生じる。いくつかの実施形態では、挿入は、特定のゲノム座位の両方のアレル内で生じる。これらの実施形態のどちらにおいても、標的ゲノム座位に挿入された導入遺伝子の向きは、その座位の遺伝子の方向と同じかまたは逆であってよい。いくつかの実施形態では、記載されるようなゲノム座位へのポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントの挿入は、内因性遺伝子のノックアウト（ＫＯ）をもたらす。

いくつかの実施形態では、記載される遺伝子編集システムのいずれかによって改変されたゲノム座位を有する宿主細胞またはその組成物が提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼの使用により行われる。これらの実施形態の特定のものでは、改変されるゲノム座位は、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、またはセーフハーバー座位である。セーフハーバー座位の非限定的な例としては、限定されるものではないが、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１遺伝子座が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、記載されているようなゲノム座位への改変（例えば、ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントの挿入）による内在性遺伝子のノックアウト（ＫＯ）を有する。

遺伝子編集用のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに関連して、本明細書で提供されるポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントの部位特異的挿入に使用されるｇＲＮＡが提供される。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列を含み、このｃｒＲＮＡ配列は、目的の相補的な標的ＤＮＡを認識して結合する相補的領域（スペーサーとも呼ばれる）を含んでいる。スペーサーまたは相補的領域の長さは、一般に１５～３０ヌクレオチドであり、通常、約２０ヌクレオチドの長さであるが、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の要件に応じて異なる。特定の実施形態では、スペーサーまたは相補的領域は、標的ＤＮＡ配列に対して完全に相補的である。他の実施形態では、スペーサーは標的ＤＮＡ配列に部分的に相補的であり、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相補的である。

特定の実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに結合するための足場領域を含むｔｒａｃｒＲＮＡ配列をさらに含む。ｔｒａｃｒＲＮＡの長さ及び／または配列は、編集に使用される特定のヌクレアーゼによって異なり得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡによるヌクレアーゼ結合は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を必要としない。ｇＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡを含む実施形態では、ｃｒＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするための反復領域をさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、２つ以上のｇＲＮＡ分子、例えばｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを、２つの別個の分子として含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子にｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含むｓｇＲＮＡなどのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。これらの実施形態の特定のものでは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとは、介在するテトラループによって連結される。

いくつかの実施形態では、１つのｇＲＮＡを、目的の遺伝子座の標的化編集のために部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて使用することができる。他の実施形態では、同じ目的の遺伝子座を標的とする２つ以上のｇＲＮＡを、部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて使用することができる。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）を含む、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする異なる一般的なＣａｓヌクレアーゼと共に使用するための例示的なｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を表１８に示す。例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｄａｎｇｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１６：２８０、Ｒａｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５）５２０：１８６－１９１、Ｓｔｒｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍ．（２０１９）１０：２１２を参照されたい。例示的なｇＲＮＡのそれぞれについて、相補的領域またはスペーサー、ｃｒＲＮＡ反復領域、テトラループ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、ｇＲＮＡの異なる部分の配列を示す。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号９４～９７に記載のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号９８～１０１に記載のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１０２～１０５に記載のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１０６～１０９に記載のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０３、もしくは配列番号１０８に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるｃｒＲＮＡ反復領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号９６もしくは配列番号１０７に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるテトラループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、もしくは配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、目的の遺伝子座、例えば、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、またはＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー座位に特異的な相補的領域を含む。相補的領域は、例えば、ＣＤＳ、エクソン、イントロン、エクソンの一部と隣接するイントロンの一部とにまたがる配列、または調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー）を含む、標的遺伝子座の任意の領域の配列に結合し得る。標的配列が、ＣＤＳ、エクソン、イントロン、またはエクソンの一部とイントロンの一部とにまたがる配列である場合、ＣＤＳ、エクソン、イントロン、またはエクソン／イントロン境界は、標的遺伝子の任意のスプライスバリアントによって定義することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的とされるゲノム座位は、記載される座位または領域のいずれかから４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内に位置する。さらに本明細書では、本明細書で提供される１つ以上のｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組成物が提供される。これらの実施形態の特定のものでは、１つ以上のｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ベクター、例えばウイルスベクター内に含まれる。

いくつかの実施形態では、導入遺伝子の部位特異的挿入を行うために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＡＡＶＳ１の標的配列を認識する相補的領域を含む。これらの実施形態の特定のものでは、標的配列は、ＡＡＶＳ１のイントロン１に位置している。ＡＡＶＳ１は、第１９番染色体の５５，０９０，９１８～５５，１１７，６３７逆鎖に位置し、ＡＡＶＳ１イントロン１（転写物ＥＮＳＧ０００００１２５５０３に基づく）は、第１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６逆鎖に位置する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６のどこかに位置する部位から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第１９番染色体の５５，１１５，６７４から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第１９番染色体の５５，１１５，６７４に、または第１９番染色体の５５，１１５，６７４から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、切断部位を生成するように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｌｉｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１６：８６６－８６９（２０１９）に記載される、「ｓｇＡＡＶＳ１－１」としても知られるＧＥＴ００００４６である。このｇＲＮＡは、配列番号１１０に記載の核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる相補的領域を含み、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとしても知られる）のイントロン１を標的とする。

いくつかの実施形態では、導入遺伝子の部位特異的挿入を行うために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＣＬＹＢＬの標的配列を認識する相補的領域を含む。これらの実施形態の特定のものでは、標的配列は、ＣＬＹＢＬのイントロン２に位置している。ＣＬＹＢＬは、第１３番染色体の９９，６０６，６６９～９９，８９７，１３４順鎖に位置し、ＣＬＹＢＬイントロン２（転写物ＥＮＳＴ０００００３７６３５５．７に基づく）は、第１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０順鎖に位置する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０のどこかに位置する部位から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第１３番染色体の９９，８２２，９８０から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第１３番染色体の９９，８２２，９８０に、または第１３番染色体の９９，８２２，９８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、切断部位を生成するように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡはＧＥＴ００００４７であり、このｇＲＮＡは、配列番号１１１に記載の核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる相補的領域を含み、ＣＬＹＢＬのイントロン２を標的とする。標的部位は、Ｃｅｒｂｉｎｉｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ，１０（１）：ｅ０１１６０３２（２０１５）に記載されるように、ＴＡＬＥＮの標的部位に類似している。

いくつかの実施形態では、導入遺伝子の部位特異的挿入を行うために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＣＣＲ５の標的配列を認識する相補的領域を含む。これらの実施形態の特定のものでは、標的配列は、ＣＣＲ５のエクソン３に位置している。ＣＣＲ５は、第３番染色体の４６，３７０，８５４～４６，３７６，２０６順鎖に位置し、ＣＣＲ５エクソン３（転写物ＥＮＳＴ０００００２９２３０３．４に基づく）は、第３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６順鎖に位置する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６のどこかに位置する部位から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第３番染色体の４６，３７３，１８０から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、第３番染色体の４６，３７３，１８０に、または第３番染色体の４６，３７３，１８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、切断部位を生成するように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｍａｎｄａｌｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１５：６４３－６５２（２０１４）に記載される「ｃｒＣＣＲ５＿Ｄ」としても知られるＧＥＴ００００４８である。このｇＲＮＡは、配列番号１１２に記載の核酸配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる相補的領域を含み、ＣＣＲ５のイントロン３（Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースではエクソン２として別名で注釈されている）を標的とする。Ｇｏｍｅｚ－Ｏｓｐｉｎａｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１０（１）：４０４５（２０１９）を参照されたい。

本明細書で使用されるｇＲＮＡの特定の実施形態では、表１９に記載の相補的領域の配列中の１つ以上のチミンがウラシルで置換される。

いくつかの実施形態では、記載される部位特異的遺伝子編集アプローチで使用するための新たな座位及び／またはｇＲＮＡ配列を特定する方法が提供される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、特定の座位（例えば、セーフハーバー座位の内部の）に対する既存のｇＲＮＡが知られている場合、「インチワーミング」アプローチを用いて、その座位のどちらかの側にあるフランキング領域をＰＡＭ配列（通常はゲノムにわたって約１００塩基対（ｂｐ）ごとに生じる）についてスキャンすることにより、導入遺伝子の標的化挿入のためのさらなる遺伝子座を特定することができる。異なるヌクレアーゼは通常、異なる対応するＰＡＭ配列を有することから、ＰＡＭ配列は、使用される特定のＣａｓヌクレアーゼに依存することになる。座位のどちらかの側にあるフランキング領域は、約５００～４０００ｂｐの長さ、例えば、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約３０００ｂｐ、約３５００ｂｐ、または約４０００ｂｐの長さであってよい。探索範囲内でＰＡＭ配列が同定されたなら、その座位の配列に基づいた新たなガイドを設計して導入遺伝子の部位特異的挿入に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを例示的なものとして記載しているが、この新たな座位を特定する方法では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、及びトランスポザーゼを使用するものを含む、記載されるいずれの遺伝子編集アプローチも使用することができる。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの活性、安定性、及び／または他の特性を、化学修飾及び／または連続的修飾を採り入れることによって改変することができる。一例として、一過的に発現または送達された核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼの分解を受けやすくなることがある。したがって、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性をもたらす１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載される特定の改変ｇＲＮＡは、細胞集団、特に本技術の細胞に導入される場合に引き起こされる自然免疫応答が低くなるものと考えられる。本明細書で使用する場合、「自然免疫応答」という用語には、一般にウイルス由来または細菌由来の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答が含まれ、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、及び細胞死が誘導される。安定性を改善し、ヌクレアーゼ耐性を高め、及び／または免疫応答を低減するためのｇＲＮＡの他の一般的な化学修飾としては、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート結合修飾、及び２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ修飾が挙げられる。

一般的な３’末端修飾の１つとして、１つ以上の（通常、５～２００個の）アデニン（Ａ）残基を含むポリＡトラクトを付加することがある。ポリＡトラクトは、ｇＲＮＡをコードする核酸配列に含まれるようにしてもよく、または化学合成の際に、またはポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用したインビトロ転写の後にｇＲＮＡに付加することができる。インビボでは、ポリＡトラクトは、ポリアデニル化シグナルを使用することにより、ＤＮＡベクターから転写された配列に付加することができる。かかるシグナルの例は、Ｍａｅｄｅｒに記載されている。他の適当なｇＲＮＡ修飾としては、限定されるものではないが、参照によって本明細書にそれぞれの全容を援用するところの米国特許出願公開第２０１７／００７３６７４Ａ１号及び国際公開第ＷＯ２０１７／１６５８６２Ａ１号に記載されるものが挙げられる。

宿主細胞内への遺伝子編集システムの送達
いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡ、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）または部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び任意で標的化挿入のための導入遺伝子を含む、本明細書に記載の遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞に送達するために製剤化される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡ、部位特異的ヌクレアーゼ（例えばＣａｓヌクレアーゼ）または部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び任意で標的化挿入のための導入遺伝子（例えば、本技術のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメント）を含む、本明細書で提供される遺伝子編集システムの構成要素を、送達ベクターの形態で細胞内に送達することができる。送達ベクターは、例えば、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージ、及びＨＤＲベースのドナーベクターを含む、細胞内へのヌクレオチド配列の導入に適した任意の種類のベクターであってよい。異なる構成要素を、一緒にまたは別々に細胞に導入してもよく、単一のベクターまたは複数のベクターで送達してもよい。

いくつかの実施形態では、送達ベクターは、例えば、ウイルス形質転換、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ヌクレオポレーション、リポソーム、ナノ粒子、または他の方法を含む、当該技術分野における任意の周知の方法によって細胞内に導入することができる。

いくつかの実施形態では、本技術は、本明細書に開示されるさまざまな実施形態による送達ベクターを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、防腐剤、またはこれらの組み合わせをさらに含むことができる。「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、体の１つの組織、器官または部分から体の別の組織、器官または部分へと目的とする化合物を運ぶまたは輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを指す。例えば、担体または賦形剤は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくは封入材料、またはそれらの一部の組み合わせであってよい。担体または賦形剤の各構成成分は、製剤の他の成分と適合性でなければならないという点で、「薬学的に許容される」ものでなければならない。各成分はまた、成分が接触する可能性のあるあらゆる組織、器官または体の一部との接触に適している必要があり、つまり、それが毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性またはその治療上の利点を過度に上回る他の合併症のリスクを有してはならない。適当な賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等及びそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細胞を含む組成物は、適当な注入媒体をさらに含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡ、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）または部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び任意で標的化挿入のための導入遺伝子を含む、本明細書に記載の遺伝子編集システムの１つ以上の構成要素を含む細胞またはその組成物が提供される。

治療方法
いくつかの態様では、本技術は、その必要がある対象の疾患を治療及び／または予防するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示されるさまざまな実施形態によるポリシストロニックベクターを含む治療有効量の宿主細胞の集団、またはそれを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は自己であってもよい（すなわち、改変後のＴ細胞が投与される対象から得られる）。あるいは、Ｔ細胞は同種であってもよい（すなわち、改変後のＴ細胞が投与される対象以外の者から得られる）。これらの実施形態のどちらにおいても、Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から得られた初代Ｔ細胞であってよい。他の実施形態では、例えば、同種Ｔ細胞の場合、Ｔ細胞をＥＳＣまたはｉＰＳＣから誘導することができる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、中央記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）、幹細胞メモリーＴ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）またはそれらの任意の組み合わせである。より具体的には、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞（抗原に曝露されたことがない；Ｔ_ＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡの高い発現、及びＣＤ４５ＲＯの低い発現）、メモリーＴ細胞（抗原に曝露されたことがあり、寿命が長い）、またはエフェクター細胞（抗原に曝露されたことがあり、細胞障害性である）であってよい。メモリーＴ細胞はさらに、Ｔ_ＣＭ（ナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ９５の高い発現、ならびにＣＤ５４ＲＡの低い発現）とＴ_ＥＭ（ナイーブＴ細胞またはＴ_ＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの低い発現、及びＣＤ１２７の高い発現）のサブセットに分類することができる。エフェクターＴ細胞とは、Ｔ_ＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現が低く、グランザイム及びパーフォリンについて陽性である、抗原に曝露されたことのあるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を指す。ヘルパーＴ細胞は、サイトカインの放出により他の免疫細胞の活性に影響を与えるＣＤ４＋細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫応答を活性化または抑制することができ、これらの２つの機能のどちらが誘導されるかは、他の細胞及びシグナルの存在に依存する。Ｔ細胞は、既知の技術を用いて採取することができ、多様な亜集団またはその組み合わせを、例えば、抗体へのアフィニティー結合、フローサイトメトリー、または免疫磁気選択などの既知の技術によって濃縮または枯渇させることができる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、例えばβ細胞（ベータ細胞またはβ膵島細胞とも称される）を含む膵島細胞である。例示的な膵島細胞種としては、限定されるものではないが、膵島前駆細胞、未成熟膵島細胞、成熟膵島細胞などが挙げられる。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は自己である（すなわち、改変後のβ膵島細胞が投与される対象から得られる）。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は同種である（すなわち、改変後のβ膵島細胞が投与される対象以外の者から得られる）。これらの実施形態のどちらにおいても、β膵島細胞は初代β膵島細胞であってよい。いくつかの実施形態では、β膵島細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから誘導または分化させることができる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、多能性幹細胞、例えばＥＳＣまたはｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化した細胞である。ＥＳＣ及びｉＰＳＣは、例えば、ニューロン、星細胞、乏突起細胞、網膜上皮細胞、表皮細胞、毛細胞、ケラチノサイト、肝細胞、膵臓β島細胞、腸上皮細胞、肺胞細胞、造血細胞、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、及び骨細胞を含む、身体のあらゆる細胞型に分化する能力を有している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、β膵島細胞またはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）である。

いくつかの実施形態では、疾患は、がんであり、例えばＣＤ１９、ＣＤ２２またはＢＣＭＡの発現に関連するものである（すなわち、がん細胞が、ＣＤ１９、ＣＤ２２またはＢＣＭＡを発現する）。これらの実施形態では、方法は、がん細胞と、本技術のポリシストロニックベクターを含み、対応するＣＡＲを発現する宿主細胞とを接触させることを含み、その結果、ＣＡＲは、がん細胞上で発現された抗原に応答して活性化された後、がん細胞の殺滅を開始する。

いくつかの実施形態では、がんは、悪性血液疾患である。悪性血液疾患の非限定的な例としては、骨髄新生物、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖／骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫が挙げられる。一実施形態では、悪性血液疾患は、ＣＤ１９＋のＢリンパ球由来悪性疾患である。

いくつかの実施形態では、本技術による宿主細胞集団または宿主細胞集団を含む医薬組成物は、当業者によって決定されるように、治療される疾患、状態または障害に適した形で投与することができる。上記の実施形態のいずれにおいても、宿主細胞集団または宿主細胞集団を含む医薬組成物は、標的抗原または細胞と接触するように、静脈内、腹腔内、腫瘍内、骨髄内、リンパ節内、または脳脊髄液中に投与することができる。投与の適切な用量、適当な期間、及び頻度は、患者の状態；疾患、状態または障害のサイズ、種類及び重症度；細胞の望ましくない種類またはレベルまたは活性；有効成分の特定の形態；及び投与方法などの要因によって決定される。

いくつかの実施形態では、医薬組成物中の宿主細胞の量は、通常、１０^２個の細胞よりも多い、例えば、約１×１０^２、５×１０^２、１×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０個の細胞、またはそれよりも多い細胞である。

いくつかの実施形態では、方法は、対象に宿主細胞の集団、またはそれを含む医薬組成物を、１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回で、約３日間、約５日間、約７日間、約１０日間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年、約１．２５年、約１．５年、約１．７５年、約２年、約２．２５年、約２．５年、約２．７５年、約３年、約３．２５年、約３．５年、約３．７５年、約４年、約４．２５年、約４．５年、約４．７５年、約５年、または約５年よりも長い期間にわたって投与することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞集団、またはそれを含む医薬組成物は、毎日、隔日、３日ごと、毎週、隔週（すなわち２週ごと）、３週ごと、毎月、隔月、または３ヶ月ごとに投与することができる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞集団、またはそれを含む医薬組成物は、所定の期間にわたって投与することができる。あるいは、宿主細胞の集団、またはそれを含む医薬組成物は、特定の治療ベンチマークに達するまで投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、がんバイオマーカーのレベル（ただし、これに限定されない）などの生体試料中の１つ以上の治療ベンチマークを評価して、宿主細胞または宿主細胞を含む医薬組成物の投与を継続するかどうかを判定する工程を含む。

いくつかの実施形態では、方法はさらに、手術、免疫療法、放射線療法、及び／または化学療法などの１つ以上の他のがん療法を、順次または同時に対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、対象に薬学的有効量の１つ以上のさらなる治療剤を投与して改善されたまたは相乗的な治療効果を得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる治療剤は、免疫療法剤、化学療法剤、及び生物製剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる治療剤は、宿主細胞または宿主細胞を含む医薬組成物の投与前に対象に投与された。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる治療剤と、宿主細胞または宿主細胞を含む医薬組成物とが、対象に共投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる治療剤は、宿主細胞または宿主細胞を含む医薬組成物の投与後に対象に投与された。

当業者には理解されるように、１つ以上の治療剤及び宿主細胞または宿主細胞を含む医薬組成物は、対象の診断及び予後に応じて、その必要がある対象に１回以上、同じまたは異なる用量で投与することができる。当業者であれば、所望の治療結果を得るために、これらの療法の１つ以上を異なる順序で組み合わせることが可能である。いくつかの実施形態では、併用療法によって、いずれかの治療を単独で投与した場合と比較して改善された効果または相乗的効果が得られる。

実施例１．ＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲを共発現するバイシストロニックベクターは、宿主対移植片に対する十分な保護を与えるものである
本試験では、３つのバイシストロニックベクターを開発し、ＣＤ４７／ＣＤ１９ＣＡＲの発現レベル、ＣＤ１９＋標的細胞の殺滅、及びインビトロでの低免疫性について評価した。

図１Ａは、本技術の特定の実施形態によるバイシストロニックベクターの一般的な設計を示す。図に示されるように、バイシストロニックベクターは、ＥＦ１αプロモーター、ＣＤ４７のコード配列、切断部位、及びＣＤ１９ＣＡＲのコード配列を有している。ただし、切断部位は、任意で２Ａ部位に加えてフーリン部位（上）または２Ａ部位のみ（下）を有することができる。

ＣＤ１９ＣＡＲ／ＣＤ４７の発現
最初に、バイシストロニックベクター設計の形質導入及び発現効率を、単一の遺伝子配列のみを含むベクターの形質導入、ならびにＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ４７をそれぞれコードする２つのレンチウイルスベクターを使用して細胞を共形質導入する共形質導入設計と比較して試験した（図１Ｂ）。ドナーから採取した初代Ｔ細胞に、（１）コンストラクトの導入なし（コントロール）、（２）ＣＤ４７をコードするレンチウイルスベクターのみ、（３）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターのみ、（４）ＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲの両方をコードするバイシストロニックベクター、（５）１つはＣＤ１９ＣＡＲをコードし、もう１つはＣＤ４７をコードする２つのレンチウイルスベクターを形質導入した。

簡単に言うと、Ｔ細胞を採取し、培地中に再懸濁し、カウントし、プレートに播種してレンチウイルスによる形質導入を行った。形質導入から７日後に、ＣＤ４７及びＣＤ１９ＣＡＲの発現をフローサイトメトリーによって調べた。

図２に示されるように、バイシストロニックレンチウイルスベクターによる処理は、共形質導入した初代Ｔ細胞よりも高いＣＤ４７／ＣＡＲ二重陽性細胞をもたらした。詳細には、ＣＤ４７－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ＣＡＲのバイシストロニックレンチウイルスベクターでは６０％のＣＤ４７＋、ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞が生じたのに対して、ＣＤ４７ベクターとＣＤ１９ＣＡＲベクターによる共形質導入で生じたＣＤ４７＋、ＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞は４２％であった。単一ベクター群における８２％のＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞と比較して、共形質導入群ではＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞の総パーセンテージは顕著に少なくなっている（４５％）。これらのデータは、単一のバイシストロニックレンチウイルスベクターによるＴ細胞の形質導入が、２つのベクターの共形質導入よりも多くのＣＤ４７／ＣＤ１９ＣＡＲ二重陽性細胞及びより多くのＣＤ１９ＣＡＲ＋細胞を生じたことを示唆している。

さらに、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９ＣＡＲのみのＣＡＲ－Ｔ細胞と同等のレベルで同等の力価を生じ、標的ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ－６細胞をインビトロで殺滅したことが見出され（データは示さず）、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックベクターが、想定通りに十分なレベルの機能的ＣＤ１９ＣＡＲを生じることができることを示唆している。

ＣＤ４７発現レベル及び低免疫性
Ｔ細胞上の内因性ＣＤ４７の発現は、免疫回避に高いＣＤ４７レベルを必要とする、同種宿主体内での自然の免疫細胞殺滅から細胞を保護するうえで十分ではない。したがって、本技術のバイシストロニックベクターが、低免疫性を付与するのに必要な閾値を少なくとも上回るような十分なＣＤ４７の発現を生じることが重要である。バイシストロニックベクター中のＣＤ１９ＣＡＲの前にＣＤ４７を配置することによってＣＤ４７の発現が最大化される助けとなるという仮説を立てた。この仮説を、ＣＤ１９ＣＡＲを最初に、ＣＤ４７を２番目に配置する代替的な設計と比較することによって試験した（図１Ｃ）。

図３及び図４に示されるように、バイシストロニックベクター中でＣＤ４７を最初に配置した場合、ＣＤ１９ＣＡＲを最初に配置した場合と比較して高いレベルのＣＤ４７が生じた（自然レベルと比較して６．５倍の増加）。逆に、バイシストロニックベクター中でＣＤ１９ＣＡＲを最初に配置すると、ＣＤ４７を最初に配置した場合と比較して高いレベルのＣＤ１９ＣＡＲが生成された（１．７倍の差）。

ＣＤ４７発現レベルを、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）を使用して分析した。図５に示されるように、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックコンストラクト及びＣＤ１９ＣＡＲ－ＣＤ４７バイシストロニックコンストラクトのいずれによるＣＤ４７発現も、単一の発現カセットを含むベクターによるＣＤ４７発現のレベルと同等またはそれ以上であった。ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックベクターによりＣＤ４７を発現するＨＩＰＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ欠失によるＨＬＡＩ／ＩＩノックアウト（ＫＯ）を有する）の低免疫性を試験した。図６に示されるように、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ形質導入細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して低いＮＫ細胞殺滅及びマクロファージ殺滅を示し、抗ＣＤ４７抗体を加えることによって免疫保護はブロックされた。まとめると、これらの結果は、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックベクターによってＣＤ４７を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞が低免疫性であることを示している。

３つのＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックベクターの作製及び試験
続いて、３つのＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックベクターを同定し、それらのＣＤ４７／ＣＤ１９ＣＡＲ発現レベル、ＣＤ１９＋標的細胞の殺滅及びインビトロでの低免疫性について特性評価した。

Ｐｓｆ２ウイルスベクター骨格を用いた、ＥＦ１α－ＫｏｚａｋＣＤ４７－ＦＣ２－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ＣＡＲ（コンストラクト１）、ＥＦ１α－ＫｏｚａｋＣＤ４７－ＦＣ３－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ＣＡＲ（コンストラクト２）、及びＥＦ１α－ＫｏｚａｋＣＤ４７－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ＣＡＲ（コンストラクト３）の３つの最も性能の高いバイシストロニックベクターを作製し、同定した。３つのコンストラクトはいずれも、ＥＦ１αプロモーター、ＣＤ４７のコード配列、切断部位の後にＣＤ１９ＣＡＲのコード配列を有するという点で、図１Ａに示す一般的な設計に従っている。ただし、コンストラクト１及び２の切断部位はＴ２Ａ部位の他にフーリン部位を有し（コンストラクト１はさらなるＦＣ３部位を有し、コンストラクト２はさらなるＦＣ２部位を有する）、コンストラクト３はＴ２Ａ部位のみを有する（図１Ａ）。それらのＣＤ４７及び／またはＣＤ１９ＣＡＲ発現レベルならびにＣＤ１９＋標的細胞の殺滅効率を、下記表２０に要約する。

したがって、コンストラクト１、２、及び３は、ＣＤ４７及び／またはＣＤ１９ＣＡＲの発現レベルならびにＣＤ１９を標的とする免疫応答に関して、互いに同等の高い性能を有する。

実施例２．ＣＤ４７及び安全スイッチを共発現するバイシストロニックベクターは、宿主細胞の制御された殺滅を可能とする
本試験では、ＣＤ４７及び安全スイッチを共発現させるためのバイシストロニックベクターを作製し、安全スイッチの発現による宿主細胞の制御された殺滅について試験した。

ＣＤ４７及び安全スイッチを共発現させるためのバイシストロニックベクターは、図７Ａに示すような一般的な設計を有するコンストラクトを含むことができる。このコンストラクトは、プロモーター（例えばＣＡＧプロモーター）、ＣＤ４７のコード配列、及び安全スイッチ導入遺伝子（例えば、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ））のコード配列、任意でその後に続くＨＡタグを含むことができる。５’から３’方向の順序でＣＤ４７のコーディング配列の前に安全スイッチのコーディング順序を有する第１の構成（図７Ａ、上）と、５’から３’方向の順序で安全スイッチのコーディング配列の前にＣＤ４７のコーディング配列を有する第２の構成（図７Ａ、下）の２つの構成のバイシストロニックベクターを作製することができる。２Ａ部位を用いて安全スイッチとＣＤ４７とを隔てることができる。コンストラクトは、相同組換え修復（ＨＤＲ）による部位特異的挿入を行うための目的の標的ゲノム座位（例えば、ＣＬＹＢＬセーフハーバー座位）に特異的な左右のホモロジーアーム（ＬＨＡ、ＲＨＡ）で挟むことができる。

図７Ｂに示されるように、ＣＤ４７及びＣｙＤを共発現させるために、ＣＡＧプロモーター、ＣｙＤのコード配列、その後に続く、ＨＡタグ、２Ａ部位、及びＣＤ４７のコード配列を有するコンストラクトを含むバイシストロニックベクターを作製した。このコンストラクトは、ＣＬＹＢＬセーフハーバー座位に部位特異的挿入を行うためにＣＬＹＢＬのＬＨＡとＲＨＡとで挟まれている。本明細書に記載されるように、ＣｙＤ安全スイッチは、プロドラッグ５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）の存在下で、細胞増殖を誘導により停止させ、及び／またはコンストラクトを有する増殖細胞を殺滅することができる。

このバイシストロニックベクターを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に形質導入し、これを分化させた。２ＤにおけるＣｙＤ－ＣＤ４７発現クローンの分化は、安全スイッチ発現に影響されなかった（データはここには示さない）。図８に示されるように、形質導入細胞では、野生型（ＷＴ）コントロールと比較してＣＤ４７発現が増加したが、ＣＬＹＢＬ座位への挿入後のバイシストロニックカセットの発現は分化後の形質導入細胞ではより低くなった（ＣＤ４７発現に基づく）。最後に、図９に示されるように、２つのクローン（２－Ｇ０９及び２－Ｇ１１）の結果に基づけば、分化細胞においてｉＰＳＣに対して同等のＩＣ５０で５－ＦＣの存在下におけるＣｙＤの殺滅効率が得られ、維持された（９９％よりも高い殺滅率）。これらの結果は、ＣｙＤ－ＣＤ４７バイシストロニックコンストラクトを有する細胞の効果的かつ制御可能な殺滅を示している。

ＣＤ４７と、異なる安全スイッチＨＳＶｔｋを共発現させるための別のバイシストロニックベクターも作製し、試験した。図７Ｃに示されるように、このバイシストロニックベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ４７のコード配列、２Ａ部位、及びＨＳＶｔｋのコード配列と、その後に続くＨＡタグを有するコンストラクトを含む。ＨＳＶｔｋは、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を、ＤＮＡ合成を妨げる毒性代謝物に変換し、それにより分裂細胞を殺滅することができる。上記と同様、このコンストラクトは、ＣＬＹＢＬセーフハーバー座位に部位特異的挿入を行うためにＣＬＹＢＬのＬＨＡとＲＨＡとで挟まれている。

ｉＰＳＣにＣＤ４７－ＨＳＶｔｋバイシストロニックコンストラクトで形質導入した後、クローンに分化させて試験を行った。図１０に示されるように、ＣＤ４７発現を、いくつかのクローン（１－Ｂ１０、１－Ｃ０２、２－Ｆ０９、及び１－Ｈ０４）で２週間にわたって試験したところ、２週間でＣＤ４７発現のサイレンシングは観察されなかった。いずれのクローンも、ＣＤ４７について少なくとも９８％陽性であった。図１１に示されるように、ＣｙＤ－ＣＫ４７クローン２－Ｇ０９をコントロールとして、これらのクローンで、野生型レベルに対するＣＤ４７過剰発現を試験した。１コピーのＣＤ４７を有するクローンで約７０倍の過剰発現が観察されたが、プラスミド骨格の挿入によってＣＤ４７発現レベルは低下した。

図１２に示されるように、異なる量のＧＣＶの存在下でのＨＳＶｔｋの殺滅効率及び用量反応を、ＣＤ４７－ＨＳＶｔｋクローンで、カウント用ビーズを用いたフローサイトメトリーにより３日後に試験した。コントロールクローンでは、試験した用量範囲でＧＣＶ毒性は観察されなかったのに対して、ＣＤ４７－ＨＳＶｔｋクローンでは、文献に報告されている値（１０～１００ｎＭ）と概ね同等のＩＣ５０で用量反応的なＨＳＶｔｋによる殺滅が得られた。これらの結果をまとめると、安定したＣＤ４７過剰発現及びＣＤ４７－安全スイッチバイシストロニックコンストラクトを有する細胞の制御可能な殺滅が示された。

実施例３．ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲバイシストロニックベクターによる二重形質導入は、単一の形質導入コントロールと比較して細胞傷害性及びサイトカイン応答を増加させる
本試験では、ＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲを共発現させるためのバイシストロニックベクターを作製し、特性評価を行って、Ｔ細胞の二重形質導入用のＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲバイシストロニックベクターと並行して試験した。次いで、単一及び二重形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞を、インビトロ及びマウス腫瘍モデルで、それらの腫瘍殺滅能力について調べた。

ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲバイシストロニックベクターの設計及び試験
図１３に示されるような設計を有するＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲバイシストロニックベクター（ＰＬＡＳ２１９９）を作製した。ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲバイシストロニックベクターは、ＥＦ１αプロモーター、ＣＤ４７のコード配列、フーリン部位、Ｔ２Ａ部位、及びＣＤ２２ＣＡＲのコード配列を含んでいる。ＣＤ２２ＣＡＲは、以下の機能ドメイン、すなわち、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、短いＧ４Ｓリンカーによって連結されたｍ９７１のＶ_ＨとＶ_ＬとからなるＣＤ２２特異的ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有している。ＣＤ２２ＣＡＲコンストラクトはまた、Ｖ_ＬドメインとＣＤ８αヒンジドメインとの間に短いＡＡＡリンカーを有している。

次に、記載のようにＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲコンストラクトの物理的及び機能的特性を試験し、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトと比較した。ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲの設計も図１３に示されている。ＣＤ１９ＣＡＲは、以下の機能ドメイン、すなわち、ＣＤ８αシグナルペプチド、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーによって連結されたＦＭＣ６３のＶ_ＨとＶ_ＬとからなるＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有している。ＣＤ１９ＣＡＲコード配列は、ＣＤ４７のコード配列の下流にあり、かつ２つのコード配列は、フーリン部位及びＴ２Ａ部位によって隔てられている。両方のコード配列は、ＥＦ１αプロモーターによって誘導される。ＣＤ２２ＣＡＲのコード配列とＣＤ４７のコード配列とを入れ替えることにより、コントロールとしてＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７バイシストロニックベクター（ＰＬＡＳ２２１８）も作製した。

ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ（ＰＬＡＳ２１９９）、及びＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７（ＰＬＡＳ２２１８）の３つのバイシストロニックベクターすべてを用いてレンチウイルスを作製した後、ゲノム定量アッセイ（ＧＱＡ）、機能性力価アッセイ、及び粒子対感染性（ｐａｒｔｉｃｌｅｔｏｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）アッセイを含む一連の物理的及び機能的アッセイで試験した。図１４に示されるように、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲレンチウイルスは、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスと同様の物理的及び機能的な力価プロファイルを示した。

ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ／ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ二重形質導入
次に、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲウイルスとＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲウイルスの両方を使用した二重形質導入アプローチを試験した。図１５に、二重形質導入のアプローチのワークフローを示す。簡単に言うと、０日目にドナーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍し、１：１の比で混合し、ＣＴＳ（商標）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に３：１の比で加えた。１日目に、Ｔ細胞にレンチウイルスで形質導入した。全部で以下の６つのレンチウイルス処理で試験した。すなわち、（１）モック、（２）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスのみ、（３）ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ（ＰＬＡＳ２１９９）レンチウイルスのみ、（４）ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７（ＰＬＡＳ２２１８）レンチウイルスのみ、（５）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスとＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ（ＰＬＡＳ２１９９）レンチウイルスの混合物（ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ）、及び（６）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスとＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７（ＰＬＡＳ２２１８）レンチウイルスの混合物（ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７）。４日目に、細胞をビーズから分離し、そのサブセットを７日目に後のアッセイに供した。１４日目に、細胞の別のサブセットを再び試験し、残りの細胞を凍結した。

図１６に、ＣＤ４７、ＣＤ１９ＣＡＲ、及びＣＤ２２ＣＡＲの発現レベルを調べるための単一または二重形質導入したＴ細胞のフローサイトメトリー分析の例示的なゲーティング戦略を示す。出発Ｔ細胞を、ＣＤ４及び／またはＣＤ８発現について、さらに任意でＣＤ４７発現について選択し、ＣＤ１９及びＣＤ２２の発現について試験した。図１７に示されるように、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスまたはＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ／ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７レンチウイルスのみによる形質導入は、予想されたとおり、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方でそれぞれ、ＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ２２ＣＡＲの発現をもたらし、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ／ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７バイシストロニックレンチウイルスが、汎Ｔ細胞を効果的に形質転換することができることを示唆した。さらに、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ／ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７レンチウイルスの両方の二重形質導入は、高レベルのＣＤ１９ＣＡＲ発現、ＣＤ２２ＣＡＲ発現、またはその両方を示すＴ細胞の不均一集団を生じた。二重形質導入のアプローチを異なるドナーで繰り返したところ、結果は、二重導入アプローチがドナー間及びウイルスのロット間で一貫した生成細胞の分布を生じたことを示した（図１８）。注目すべき点として、ＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７設計と比較して、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ設計は、３人のドナーのものでフローサイトメトリーの中央蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した場合に、より高いＣＤ４７及びＣＤ２２ＣＡＲの発現レベルをもたらした（図１９）が、このことはこれまでの結果と一致するものであり、ＣＤ４７コンストラクトの下流にＣＡＲコンストラクトを配置することが有益であり得ることを示唆するものである。さらに、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクトに対して同様のベクターコピー数（ＶＣＮ）で、低免疫に必要とされる閾値を上回る、より高いＣＤ４７発現レベルをもたらし（図２０）、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲコンストラクトから生じたＴ細胞が低免疫性であることを示唆している。ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲコンストラクトのＣＤ２２ＣＡＲ－ＣＤ４７コンストラクトよりも優れた特性のため、前者をその後の試験で使用した。

最後に、二重形質導入を行った細胞集団が、単一の形質導入を行った細胞集団と比較して、より高いＶＣＮを有するかどうかを試験した。図２１Ａに示されるように、３人のドナーから採取したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を０日目に解凍し、１：１の比で混合した後、ＣＴＳ（商標）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３：１の比で加えた。１日目にＴ細胞に以下のレンチウイルス、すなわち、（１）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスのみ；（２）ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲレンチウイルスのみ、及び（３）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲレンチウイルスとＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲレンチウイルス混合物（ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲ）により単一または二重形質導入を行った。４日目に細胞をビーズから分離し、８日目にフローサイトメトリー及びＶＣＮ分析を行った。図２１Ｂに示されるように、二重形質導入した集団は、単一のＣＡＲを形質導入した細胞よりも高いＶＣＮを有し、二重形質導入による生成物は、単一及び二重形質導入細胞のＶＣＮの平均であった。

二重ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ／ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲを形質導入したＴ細胞のインビトロ細胞傷害性
次に、二重ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ／ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲを形質導入したＴ細胞がインビトロで腫瘍の増殖を阻害できるかどうかを試験した。図２２に示されるように、ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲを単一形質導入したＴ細胞（ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞）、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲを単一形質導入したＴ細胞（ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞）、及びＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ／ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲを二重形質導入したＴ細胞（ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞）を、ＲＦＰ標識したコントロールＮＡＬＭ、ＣＤ１９ノックアウトＮＡＬＭまたはＣＤ２２ノックアウトＮＡＬＭ腫瘍細胞で試験し、細胞傷害性を時間に対するＲＦＰの全積分強度により測定した。単一質導入Ｔ細胞と比較して、二重形質導入Ｔ細胞は、抗原逃避を克服し、ＮＡＬＭ細胞におけるＣＤ１９またはＣＤ２２ノックアウト標的に対するサイトカインを産生した。図２３に示されるように、ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲは、抗原依存的にＮＡＬＭ及びＲＡＪＩ腫瘍細胞に対する傷害性を誘発した。

二重形質導入したＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞が単一ＣＡＲ発現細胞と比較して同様の細胞傷害性及びサイトカインプロファイルを誘発するかどうかをさらに調べるため、単一形質導入ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、単一形質導入ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞、及び二重形質導入ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞を磁気選択により選別した後、細胞傷害性（ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標））及びサイトカイン（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）分析によりアッセイして試験を行った（例示的なワークフローを示した図２４を参照されたい）。簡単に述べると、２人のドナーから採取したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を０日目に解凍し、１：１の比で混合した後、ＣＴＳ（商標）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３：１の比で加えた。１日目に、Ｔ細胞に、（１）モックコンストラクトで形質導入、（２）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲを単一形質導入（ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞）、（３）ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲを単一形質導入（ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞）、または（４）ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲを二重形質導入（ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞）した。４日目に細胞をビーズから分離し、サブセットを７日目に試験した。８日目にＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞及び二重形質導入Ｔ細胞を、抗イディオタイプ－ビオチン及び抗ビオチンマイクロビーズにより選別し、ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞を可溶性ＣＤ２２－ビオチンにより選別した。１２日目に二重形質導入集団を、可溶性ＣＤ２２－ビオチンにより再びＣＤ２２ＣＡＲについて選別した。選別工程は、単一または二重形質導入Ｔ細胞の亜集団を選択して、ＣＤ１９ＣＡＲ及び／またはＣＤ２２ＣＡＲの両方を発現する細胞を濃縮するために行った。図２５に示されるように、二重形質導入した細胞は、細胞の９０％超がＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ２２ＣＡＲの両方を発現している亜集団に効率的に選別（精製）された。１４日目に、細胞の別のサブセットをＣＡＲパネルについて試験し、残りを凍結した。図２６に示されるように、二重形質導入して選別したＣＡＲ－Ｔ細胞は、低いエフェクター（Ｅ）対標的（Ｔ）（Ｅ：Ｔ）比で、単一形質導入して選別したＣＡＲ－Ｔコントロールと比較して、腫瘍細胞の増殖をより効率的に阻害した。二重形質導入して選別したＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９ノックアウト（図２７）またはＣＤ２２ノックアウト（図２８）バックグラウンドでもより効果的な腫瘍増殖の抑制を示した。さらに、二重形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞は、コントロールのＣＤ１９ノックアウト及びＣＤ２２ノックアウトＮＡＬＭ細胞で試験した場合に、単一形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較してより高いレベルのサイトカインを誘発した（図２９）。以上をまとめるとこれらのデータは、二重形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞が、単一形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して優れた細胞傷害性及びサイトカイン応答をインビトロで示すことを示唆している。

二重ＣＤ４７－ＣＤ１９ＣＡＲ／ＣＤ４７－ＣＤ２２ＣＡＲを形質導入したＴ細胞のインビボ細胞傷害性
インビボでの二重形質導入ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を評価し、二重形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＤ１９抗原喪失を克服できるかどうかを試験するために、ＮＳＧマウスにＣＤ１９発現腫瘍細胞とＣＤ１９陰性ＮＡＬＭ（１．０×１０^６細胞／マウス）腫瘍細胞またはＲＡＪＩ（０．５×１０^６細胞／マウス）腫瘍細胞との混合物を静脈内注射した（図３０に代表例としてＮＡＬＭモデルを示す）。腫瘍細胞注射の３日後、腫瘍移植マウスを、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞、または二重形質導入ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞の静脈内注射で処理した。腫瘍増殖を生物発光及びカプラン－マイヤー生存曲線によってアッセイした。図３１～３４に示されるように、モック及びＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理したコントロールと比較して、ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理したマウスは、ＣＤ１９ノックアウトＮＡＬＭ（図３１～３２）及びＣＤ１９ノックアウトＲＡＪＩ（図３３～３４）マウスモデルで腫瘍細胞の生物発光（図３１、３３）及びマウス全身イメージング（図３２、３４）によって測定される腫瘍量の抑制を示した。これらのデータは、二重形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原逃避を克服し、ＮＡＬＭ及びＲＡＪＩ腫瘍の増殖をマウスモデルで阻害したのに対して、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞は、マウスが腫瘍の進行で死亡する前に一時的に腫瘍増殖を抑制したのみであることを示唆している。

二重形質導入ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞の混合物と比較して高い細胞傷害性をインビボで示した
最後に、二重形質導入ＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞との１：１混合物よりも腫瘍増殖を効率的に抑制できるかどうかについて試験を行った。二重形質導入した、または二重形質導入して選別したＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞の混合物と比較した。前述のように、ＮＳＧマウスにＮＡＬＭ腫瘍細胞を静脈内注射した（図３５）。腫瘍細胞注射の３日後、腫瘍移植マウスを、（１）二重形質導入した、または（２）二重形質導入して選別したＣＤ１９ＣＡＲ×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞、または（３）ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞との５０：５０の混合物の静脈内注射で処理した。腫瘍増殖を生物発光及びカプラン－マイヤー生存曲線によってアッセイした。驚くべきことに、図３６に示されるように、二重形質導入した、または二重形質導入して選別したＣＤ１９×ＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９ＣＡＲ細胞とＣＤ２２ＣＡＲ－Ｔ細胞の混合物と比較して腫瘍増殖のより効果的な阻害を示し、二重形質導入したＴ細胞の腫瘍殺滅能力が単一形質導入したＴ細胞を組み合わせた能力よりも高いことを示唆した。

結論として、これらのデータは、二重形質導入のアプローチによって作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞が、インビトロ及びインビボの両方で高いレベルのＣＡＲ発現、細胞傷害性、低免疫性、サイトカイン応答、及び腫瘍殺滅能力を有することを証明するものであった。二重形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原逃避を克服することができ、単一形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞の１：１混合物と比較して、腫瘍移植マウスモデルでより良好な腫瘍抑制能力を示したことから、細胞療法における使用に大きな可能性を有し得るものである。

結論
本技術の実施形態の上記の詳細な説明は、網羅的であることも、本技術を上記に開示された正確な形態に限定することも意図するものではない。本技術の具体的な実施形態、及びその実施例を、例示の目的で上記に記載したが、関連分野の当業者によれば認識されるように、本発明の範囲内でさまざまな同等の改変が可能である。例えば、各工程は所定の順序で示されているが、代替的な実施形態では異なる順序で各工程を実施してもよい。本明細書に記載される異なる実施形態を組み合わせることでさらなる実施形態を提供することもできる。

上記の記載より、本技術の特定の実施形態を説明の目的で本明細書に記載したが、周知の構成要素及び機能は、本技術の実施形態の説明を不要に曖昧にすることを避けるために詳細には図示または記載していない点は理解されよう。文脈上可能である場合、単数形または複数形は、それぞれ複数形または単数形の用語を含むことができる。さらに、本技術の特定の実施形態に関連する利点をそれらの実施形態との関連において記載したが、他の実施形態もそのような利点を発揮することができ、必ずしもすべての実施形態が本技術の範囲内に入るようにそのような利点を発揮する必要はない。したがって、本開示及び関連する技術は、本明細書に明示的に示されていない、または記載されていない他の実施形態をも包含しうるものである。

Claims

（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記第１の発現カセットが、５’から３’方向の順序で前記第２の発現カセットの前に位置する、
前記ポリシストロニックベクター。
前記免疫寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＣＬ２２、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＣＲ１、ＤＵＸ４、ＦＡＳＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＩＤＯ１、ＩＬ１５－ＲＦ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、セルピンｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
前記免疫寛容原性因子が、ＣＤ４７を含む、請求項２に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ４７が、ヒトＣＤ４７である、請求項３に記載のポリシストロニックベクター。
前記ヒトＣＤ４７が、配列番号１～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２９～１３４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、請求項３に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１３５に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、請求項７に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９ＣＡＲを含む、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ１９ＣＡＲが、シグナルペプチド、ＣＤ１９に特異的な細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項９に記載のポリシストロニックベクター。
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、またはＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチドを含む、請求項１０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ１９に特異的な細胞外結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項１０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、ＦＭＣ６３の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）及び重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む、請求項１２に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号２１～２３及び２６～２８に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１２に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号２１～２３に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む、請求項１２に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号２６～２８に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む、請求項１２に記載のポリシストロニックベクター。
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、またはＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む、請求項１０に記載のポリシストロニックベクター。
前記膜貫通が、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１０に記載のポリシストロニックベクター。
前記細胞内共刺激ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項１０に記載のポリシストロニックベクター。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ１９ＣＡＲが、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項１０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１１６に記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１１６に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、請求項２１に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ１９ＣＡＲが、配列番号３２、３４、もしくは３６に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３２、３４、もしくは３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項１０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３１、３３、もしくは３５に記載のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号３１、３３、もしくは３５に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である、請求項２２に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＡＲが、ＣＤ２０ＣＡＲを含む、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ２０ＣＡＲが、シグナルペプチド、ＣＤ２０に特異的な細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２５に記載のポリシストロニックベクター。
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、またはＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチドを含む、請求項２６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ２０に特異的な細胞外結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項２６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、Ｌｅｕ１６のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈを含む、請求項２８に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号３９～４１及び４３～４４に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む、請求項２８に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号３９～４１に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む、請求項２８に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号４３～４４に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む、請求項２８に記載のポリシストロニックベクター。
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、またはＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む、請求項２６に記載のポリシストロニックベクター。
前記膜貫通が、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項２６に記載のポリシストロニックベクター。
前記細胞内共刺激ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項２６に記載のポリシストロニックベクター。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項２６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＡＲが、ＣＤ２２ＣＡＲを含む、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ２２ＣＡＲが、シグナルペプチド、ＣＤ２２に特異的な細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項３７に記載のポリシストロニックベクター。
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、またはＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチドを含む、請求項３８に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＤ２２に特異的な細胞外結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項３８に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、ｍ９７１のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む、請求項４０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号４７～４９及び５１～５３に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む、請求項４０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号４７～４９に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む、請求項４０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号５１～５３に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む、請求項４０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、ｍ９７１－Ｌ７のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む、請求項４０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号５６～５８及び６０～６２に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む、請求項４０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号５６～５８に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む、請求項４０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号６０～６２に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む、請求項４０に記載のポリシストロニックベクター。
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、またはＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む、請求項３８に記載のポリシストロニックベクター。
前記膜貫通が、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項３８に記載のポリシストロニックベクター。
前記細胞内共刺激ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項３８に記載のポリシストロニックベクター。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項３８に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡＣＡＲを含む、請求項１に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＢＣＭＡＣＡＲが、シグナルペプチド、ＢＣＭＡに特異的な細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、及び／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項５３に記載のポリシストロニックベクター。
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＩｇＫシグナルペプチド、またはＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチドを含む、請求項５４に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＢＣＭＡに特異的な細胞外結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項５４に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、Ｃ１１Ｄ５．３のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈを含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号６５～６７及び６９～７１に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号６５～６７に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号６９～７１に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、Ｃ１２Ａ３．２のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈを含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号７４～７６及び７８～８０に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号７４～７６に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号７８～８０に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号１２０～１２２及び１２４～１２６に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号１２０～１２２に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する軽鎖を含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ｓｃＦｖが、配列番号１２４～１２６に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを有する重鎖を含む、請求項５６に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＢＣＭＡに特異的な細胞外結合ドメインが、完全ヒト重鎖可変ドメイン（ＦＨＶＨ）を含む、請求項５４に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＦＨＶＨが、ＦＨＶＨ３３を含む、請求項６５に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＦＨＶＨが、配列番号８２～８４に記載のアミノ酸配列を有する１つ以上のＣＤＲを含む、請求項６５に記載のポリシストロニックベクター。
前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、またはＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む、請求項５４に記載のポリシストロニックベクター。
前記膜貫通が、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項５４に記載のポリシストロニックベクター。
前記細胞内共刺激ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項５４に記載のポリシストロニックベクター。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項５４に記載のポリシストロニックベクター。
前記１つ以上の切断部位が、自己切断部位を含む、請求項１～７５のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクター。
前記自己切断部位が２Ａ部位を含む、請求項７６に記載のポリシストロニックベクター。
前記２Ａ部位が、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ部位を含む、請求項７７に記載のポリシストロニックベクター。
前記１つ以上の切断部位が、プロテアーゼ部位をさらに含む、請求項７７に記載のポリシストロニックベクター。
前記プロテアーゼ部位が、フーリン部位を含む、請求項７９に記載のポリシストロニックベクター。
前記フーリン部位が、ＦＣ１、ＦＣ２、またはＦＣ３部位を含む、請求項８０に記載のポリシストロニックベクター。
前記プロテアーゼ部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、請求項７９に記載のポリシストロニックベクター。
（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセット
をさらに含み、
前記第３の発現カセットが、１つ以上の切断部位によって前記第１の発現カセット及び／または前記第２の発現カセットから隔てられている、
請求項１～８２のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクター。
前記安全スイッチが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、ラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＱＲ８、及びＣＤ４７－ＳＩＲＰα遮断剤からなる群から選択される、請求項８３に記載のポリシストロニックベクター。
プロモーターをさらに含む、請求項１～８４のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクター。
前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項８５に記載のポリシストロニックベクター。
前記構成的プロモーターが、ＥＦ１α、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＰＧＫ、ＵＢＣ、またはＣＡＧプロモーターである、請求項８６に記載のポリシストロニックベクター。
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項８５に記載のポリシストロニックベクター。
前記誘導性プロモーターが、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、ＡｌｃＡ、ＬｅｘＡ、またはＣｒｅプロモーターである、請求項８８に記載のポリシストロニックベクター。
ゲノム座位への相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介挿入のための、発現カセットに隣接したホモロジーアームをさらに含む、請求項１～８９のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクター。
前記ＨＤＲが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼを使用する、請求項９０に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記フーリン部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、
前記ポリシストロニックベクター。
（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセット
をさらに含み、
前記第３の発現カセットが、２Ａ部位によって前記第１の発現カセット及び／または前記第２の発現カセットから隔てられている、
請求項９２または９３に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記ＣＤ１９ＣＡＲが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、
前記ポリシストロニックベクター。
前記免疫寛容原性因子が、ＣＤ４７を含む、請求項９５に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記ＣＤ１９ＣＡＲが、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、
前記ポリシストロニックベクター。
前記免疫寛容原性因子が、ＣＤ４７を含む、請求項９７に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記ＣＤ１９ＣＡＲが、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、
前記ポリシストロニックベクター。
前記免疫寛容原性因子が、ＣＤ４７を含む、請求項９９に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ２０ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記フーリン部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、
前記ポリシストロニックベクター。
（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセット
をさらに含み、
前記第３の発現カセットが、２Ａ部位によって前記第１の発現カセット及び／または前記第２の発現カセットから隔てられている、
請求項１０１または１０２に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記フーリン部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、
前記ポリシストロニックベクター。
（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセット
をさらに含み、
前記第３の発現カセットが、２Ａ部位によって前記第１の発現カセット及び／または前記第２の発現カセットから隔てられている、
請求項１０４または１０５に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットと、
（ｄ）任意の２つの隣り合う発現カセットを隔てる２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）ＣＤ２２ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセットと、
（ｄ）任意の２つの隣り合う発現カセットを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記フーリン部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、
前記ポリシストロニックベクター。
（ｅ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第４の発現カセット
をさらに含み、
前記第４の発現カセットが、２Ａ部位によって前記第１の発現カセット、前記第２の発現カセット、及び／または前記第３の発現カセットから隔てられている、
請求項１０７または１０８に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記フーリン部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、
前記ポリシストロニックベクター。
（ｄ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセット
をさらに含み、
前記第３の発現カセットが、２Ａ部位によって前記第１の発現カセット及び／または前記第２の発現カセットから隔てられている、
請求項１１０または１１１に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記ＢＣＭＡＣＡＲが、ＢＢ２１２１バインダー、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、
前記ポリシストロニックベクター。
（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）ＢＣＭＡＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる１つ以上の切断部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記ＢＣＭＡＣＡＲが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＴ１０３ＡｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、
前記ポリシストロニックベクター。
前記ＢＣＭＡが、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１４に記載のポリシストロニックベクター。
前記免疫寛容原性因子が、ＣＤ４７を含む、請求項１１３～１１５のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てる２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクター。
（ａ）ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、
（ｂ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットと、
（ｃ）前記第１の発現カセットと前記第２の発現カセットとを隔てるフーリン部位及び２Ａ部位と
を含む、ポリシストロニックベクターであって、
前記フーリン部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、
前記ポリシストロニックベクター。
請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含有する、ウイルス。
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはファージである、請求項１１９に記載のウイルス。
請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含有する、宿主細胞。
自己細胞である、請求項１２１に記載の宿主細胞。
同種細胞である、請求項１２１に記載の宿主細胞。
胚性幹細胞（ＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１２１～１２３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している、請求項１２１～１２３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
初代細胞である、請求項１２１～１２３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項１２５または１２６に記載の宿主細胞。
請求項１１７または１１８に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含有する、宿主細胞。
自己細胞である、請求項１２８に記載の宿主細胞。
同種細胞である、請求項１２８に記載の宿主細胞。
ＥＳＣまたはｉＰＳＣである、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
初代細胞である、請求項１２８～１３０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
β膵島細胞である、請求項１３２または１３３に記載の宿主細胞。
グリア前駆細胞（ＧＰＣ）である、請求項１３２または１３３に記載の宿主細胞。
前記ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントが、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択される宿主細胞の特定のゲノム座位に挿入されている、請求項１２１～１３５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、請求項１３６に記載の宿主細胞。
前記挿入が、ＨＤＲによるものである、請求項１３６または１３７に記載の宿主細胞。
前記ＨＤＲが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼを使用する、請求項１３８に記載の宿主細胞。
１つ以上のＭＨＣＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣＩＩ分子の低下した発現を有するように改変され、任意で、前記１つ以上のＭＨＣＩ分子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃからなる群から選択され、任意で、前記１つ以上のＭＨＣＩＩ分子が、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、及びＨＬＡ－ＤＯからなる群から選択される、請求項１２１～１３９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡの低下した発現を有する、請求項１４０に記載の宿主細胞。
Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトを有する、請求項１４１に記載の宿主細胞。
前記Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトが、両方のアレルに生じている、請求項１４２に記載の宿主細胞。
ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現を有する、請求項１４０に記載の宿主細胞。
ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する、請求項１４４に記載の宿主細胞。
前記ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂのノックアウトが、両方のアレルに生じている、請求項１４５に記載の宿主細胞。
ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含有する、Ｔ細胞であって、
前記ポリシストロニックベクターが、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットとを含む、
前記Ｔ細胞。
ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントを含有する、Ｔ細胞であって、
前記ポリシストロニックベクターが、ＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットと、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットとを含み、かつ前記Ｔ細胞が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトを有する、
前記Ｔ細胞。
前記Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトが、両方のアレルに生じている、請求項１４８に記載のＴ細胞。
前記ポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントが、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択される前記Ｔ細胞の特定のゲノム座位に挿入されている、請求項１４７～１４９のいずれか１項に記載のＴ細胞。
前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、請求項１５０に記載のＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２０ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、またはＢＣＭＡＣＡＲを含む、請求項１４７～１５１のいずれか１項に記載のＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１９ＣＡＲである、請求項１５２に記載のＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１９ＣＡＲである、請求項１５２に記載のＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＧＭＣＳＦＲ－αシグナルペプチド、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１９ＣＡＲである、請求項１５２に記載のＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤ１９ＣＡＲであるか、または配列番号１１７に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項１５２に記載のＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号３２、３４、もしくは３６に記載のアミノ酸配列または配列番号３２、３４、もしくは３６に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９ＣＡＲである、請求項１５２に記載のＴ細胞。
前記ＣＡＲが、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＴ１０３ＡｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＢＣＭＡＣＡＲである、請求項１５２に記載のＴ細胞。
前記ＣＡＲが、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含むＢＣＭＡＣＡＲであるか、または配列番号１２８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項１５２に記載のＴ細胞。
ＨＤＲによって改変されたゲノム座位を有する細胞であって、
前記ゲノム座位が、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択される、
前記細胞。
前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、請求項１６０に記載の細胞。
前記ＨＤＲが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼを使用する、請求項１６０または１６１に記載の細胞。
（１）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現と、
（２）セーフハーバー座位に挿入された、ＣＤ４７及び安全スイッチを含む導入遺伝子と
を有する、ｉＰＳＣ由来β膵島細胞であって、
前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、
前記ｉＰＳＣ由来β膵島細胞。
（１）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現と、
（２）ＣＬＹＢＬホモロジーアームで挟まれた、ＣＤ４７及びＨＳＶｔｋを含む導入遺伝子と
を有する、ｉＰＳＣ由来β膵島細胞であって、
前記導入遺伝子がＣＬＹＢＬ座位に挿入されている、
前記ｉＰＳＣ由来β膵島細胞。
Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトを有する、請求項１６３または１６４に記載のｉＰＳＣ由来β膵島細胞。
前記Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトが、両方のアレルに生じている、請求項１６５に記載のｉＰＳＣ由来β膵島細胞。
（１）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現と、
（２）セーフハーバー座位に挿入された、ＣＤ４７及び安全スイッチを含む導入遺伝子と
を有する、ＥＳＣ由来ＧＰＣであって、
前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、
前記ＥＳＣ由来ＧＰＣ。
（１）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの低下した発現と、
（２）ＣＬＹＢＬホモロジーアームで挟まれた、ＣＤ４７及びＨＳＶｔｋを含む導入遺伝子と
を有する、ＥＳＣ由来ＧＰＣであって、
前記導入遺伝子がＣＬＹＢＬ座位に挿入されている、
前記ＥＳＣ由来ＧＰＣ。
Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトを有する、請求項１６７または１６８に記載のＥＳＣ由来ＧＰＣ。
前記Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウトが、両方のアレルに生じている、請求項１６９に記載のＥＳＣ由来ＧＰＣ。
請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターを含む、組成物。
請求項１１９または１２０に記載のウイルスを含む、組成物。
請求項１２１～１７０のいずれか１項に記載の宿主細胞または細胞を含む、医薬組成物。
Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択されるゲノム座位への導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入に使用するための、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、請求項１７４に記載のｇＲＮＡ。
ｃｒＲＮＡ及び任意でｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１７４または１７５に記載のｇＲＮＡ。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを２個の別々の分子として含む、請求項１７６に記載のｇＲＮＡ。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として含む、請求項１７６に記載のｇＲＮＡ。
前記ｓｇＲＮＡが、相補的領域、ｃｒＲＮＡ反復領域、テトラループ、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１７８に記載のｇＲＮＡ。
前記ｃｒＲＮＡ反復領域が、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０３、もしくは配列番号１０８に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、請求項１７９に記載のｇＲＮＡ。
前記テトラループが、配列番号９６もしくは配列番号１０７に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、請求項１７９または１８０に記載のｇＲＮＡ。
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、もしくは配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、請求項１７９～１８１のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
前記ｃｒＲＮＡが、ＡＡＶＳ１、ＣＬＹＢＬ、またはＣＣＲ５座位のある領域に対して特異的な相補的領域を含む、請求項１７６～１８２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
前記領域が、コード配列（ＣＤＳ）、エクソン、イントロン、エクソンの一部と隣接イントロンの一部とにまたがる配列、または調節領域である、請求項１８３に記載のｇＲＮＡ。
前記相補的領域が、配列番号１１０、配列番号１１１、もしくは配列番号１１２に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、請求項１８３または１８４に記載のｇＲＮＡ。
ゲノム座位への導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入に使用するためのｇＲＮＡであって、
前記ゲノム座位が、第１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する、
前記ｇＲＮＡ。
前記ゲノム座位が、第１９番染色体の５５，１１５，６７４に、または第１９番染色体の５５，１１５，６７４から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、位置する、請求項１８６に記載のｇＲＮＡ。
ゲノム座位への導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入に使用するためのｇＲＮＡであって、
前記ゲノム座位が、第１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する、
前記ｇＲＮＡ。
前記ゲノム座位が、第１３番染色体の９９，８２２，９８０に、または第１３番染色体の９９，８２２，９８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、位置する、請求項１８８に記載のｇＲＮＡ。
ゲノム座位への導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入に使用するためのｇＲＮＡであって、
前記ゲノム座位が、第３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する、
前記ｇＲＮＡ。
前記ゲノム座位が、第３番染色体の４６，３７３，１８０に、または第３番染色体の４６，３７３，１８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、位置する、請求項１９０に記載のｇＲＮＡ。
請求項１７４～１９１のいずれか１項に記載のｇＲＮＡを含む、組成物。
部位特異的ヌクレアーゼを、または部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、さらに含む、請求項１９２に記載の組成物。
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される、請求項１９３に記載の組成物。
細胞内への送達のために製剤化されている、請求項１９２～１９４のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１７４～１９１のいずれか１項に記載のｇＲＮＡを含む、細胞。
部位特異的ヌクレアーゼを、または部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、さらに含む、請求項１９６に記載の細胞。
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される、請求項１９７に記載の組成物。
ｇＲＮＡ、部位特異的ヌクレアーゼまたは部位特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、及びホモロジーアームで挟まれた導入遺伝子を、宿主細胞に導入する工程を含む、ゲノム座位への導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入の方法であって、
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される、
前記方法。
前記ゲノム座位が、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位、及びセーフハーバー座位からなる群から選択される、請求項１９９に記載の方法。
前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、請求項２００に記載の方法。
前記ｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡ及び任意でｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１９９～２０１のいずれか１項に記載の方法。
前記ｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを２個の別々の分子として含む、請求項２０２に記載の方法。
前記ｇＲＮＡが、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとをシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として含む、請求項２０２に記載の方法。
前記ｓｇＲＮＡが、相補的領域、ｃｒＲＮＡ反復領域、テトラループ、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２０４に記載の方法。
前記ｃｒＲＮＡ反復領域が、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０３、もしくは配列番号１０８に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、請求項２０５に記載の方法。
前記テトラループが、配列番号９６もしくは配列番号１０７に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、請求項２０５または２０６に記載の方法。
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、もしくは配列番号１０６に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、請求項２０５～２０７のいずれか１項に記載の方法。
前記ｃｒＲＮＡが、ＡＡＶＳ１、ＣＬＹＢＬ、またはＣＣＲ５座位のある領域に対して特異的な相補的領域を含む、請求項２０２～２０８のいずれか１項に記載の方法。
前記領域が、コード配列（ＣＤＳ）、エクソン、イントロン、エクソンの一部と隣接イントロンの一部とにまたがる配列、または調節領域である、請求項２０９に記載の方法。
前記相補的領域が、配列番号１１０、配列番号１１１、もしくは配列番号１１２に記載のヌクレオチド配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、請求項２０９または２１０に記載の方法。
前記ゲノム座位が、第１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する、請求項１９９～２１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ゲノム座位が、第１９番染色体の５５，１１５，６７４に、または第１９番染色体の５５，１１５，６７４から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、位置する、請求項２１２に記載の方法。
前記ゲノム座位が、第１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する、請求項１９９～２１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ゲノム座位が、第１３番染色体の９９，８２２，９８０に、または第１３番染色体の９９，８２２，９８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、位置する、請求項２１４に記載の方法。
前記ゲノム座位が、第３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６におけるある座位から４０００ｂｐ以内に位置する、請求項１９９～２１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ゲノム座位が、第３番染色体の４６，３７３，１８０に、または第３番染色体の４６，３７３，１８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、位置する、請求項２１６に記載の方法。
前記導入遺伝子が、
（ａ）免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセット、
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセット、
（ｃ）安全スイッチをコードするヌクレオチド配列を含む第３の発現カセット、ならびに／または
（ｄ）前記第１の発現カセット、前記第２の発現カセット、及び／もしくは前記第３の発現カセットを隔てる１つ以上の切断部位
を含む、請求項１９９～２１７のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）既知のｇＲＮＡに基づいてゲノム座位の位置を特定する工程と、
（ｂ）前記ゲノム座位のどちらかの側にある約５００～４０００ｂｐの領域をＰＡＭ配列についてスキャンする工程と
を含む、導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入のための新たなゲノム座位を特定する方法。
前記ゲノム座位が、第１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６、第１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０、または第３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６におけるある座位から、４０００ｂｐ以内に位置する、請求項２１９に記載の方法。
前記ゲノム座位が、第１９番染色体の５５，１１５，６７４、または第１９番染色体の５５，１１５，６７４から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置、第１３番染色体の９９，８２２，９８０、または第１３番染色体の９９，８２２，９８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置、及び第３番染色体の４６，３７３，１８０、または第３番染色体の４６，３７３，１８０から５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド以内の位置からなる群から選択される位置に位置する、請求項２２０に記載の方法。
その必要がある対象の疾患を治療する方法であって、前記対象に、請求項１２１～１６８のいずれか１項に記載の宿主細胞もしくは細胞または請求項１７３に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
前記疾患が、がんである、請求項２２２に記載の方法。
前記がんが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及び／またはＢＣＭＡの発現と関連している、請求項２２３に記載の方法。
前記がんが、悪性血液疾患である、請求項２２３に記載の方法。
前記悪性血液疾患が、骨髄新生物、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖／骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項２２５に記載の方法。
前記疾患が、自己免疫疾患である、請求２２２に記載の方法。
前記自己免疫疾患が、ループス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、アジソン病、バセドウ病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、及びセリアック病からなる群から選択される、請求項２２７に記載の方法。
前記疾患が、糖尿病である、請求項２２２に記載の方法。
前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、及び妊娠糖尿病からなる群から選択される、請求項２２９に記載の方法。
前記疾患が、神経疾患である、請求項２２２に記載の方法。
前記神経疾患が、カタレプシー、てんかん、脳炎、髄膜炎、片頭痛、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、及び多発性硬化症からなる群から選択される、請求項２３１に記載の方法。
第１のポリシストロニックベクターと第２のポリシストロニックベクターとを含む、組成物であって、
前記第１のポリシストロニックベクターが、１つ以上の切断部位によって隔てられた、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列と第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とを含み、かつ
前記第２のポリシストロニックベクターが、１つ以上の切断部位によって隔てられた、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列と第２のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とを含む、
前記組成物。
前記第１の免疫寛容原性因子及び前記第２の免疫寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＣＬ２２、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＣＲ１、ＤＵＸ４、ＦＡＳＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＩＤＯ１、ＩＬ１５－ＲＦ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、セルピンｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から独立して選択される、請求項２３３に記載の組成物。
前記第１の免疫寛容原性因子及び前記第２の免疫寛容原性因子が、ＣＤ４７を含む、請求項２３４に記載の組成物。
前記ＣＤ４７が、配列番号１～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３５に記載の組成物。
前記第１のＣＡＲと前記第２のＣＡＲとが異なり、かつＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２０ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、及びＢＣＭＡＣＡＲからなる群から独立して選択される、請求項２３３～２３６のいずれか１項に記載の組成物。
前記第１のＣＡＲ及び／または前記第２のＣＡＲが、配列番号３２、３４、３６、１１７、１２８、及び１３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３２、３４、３６、１１７、１２８、及び１３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項２３３～２３６のいずれか１項に記載の組成物。
前記第１のＣＡＲがＣＤ１９ＣＡＲであり、かつ前記第２のＣＡＲがＣＤ２２ＣＡＲである、請求項２３３～２３８のいずれか１項に記載の組成物。
前記１つ以上の切断部位が、自己切断部位を含む、請求項２３３～２３９のいずれか１項に記載の組成物。
前記自己切断部位が２Ａ部位を含む、請求項２４０に記載の組成物。
前記２Ａ部位が、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ部位を含む、請求項２４１に記載の組成物。
前記１つ以上の切断部位が、プロテアーゼ部位をさらに含む、請求項２４１に記載の組成物。
前記プロテアーゼ部位がフーリン部位を含む、請求項２４３に記載の組成物。
前記フーリン部位が、ＦＣ１、ＦＣ２、またはＦＣ３部位を含む、請求項２４４に記載の組成物。
前記プロテアーゼ部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、請求項２４３に記載の組成物。
第１のポリシストロニックベクターを含む第１のウイルスと、第２のポリシストロニックベクターを含む第２のウイルスとを含む、組成物であって、
前記第１のポリシストロニックベクターが、１つ以上の切断部位によって隔てられた、第１の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列と第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とを含み、かつ
前記第２のポリシストロニックベクターが、１つ以上の切断部位によって隔てられた、第２の免疫寛容原性因子をコードするヌクレオチド配列と第２のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とを含む、
前記組成物。
前記第１のウイルス及び／または前記第２のウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはファージである、請求項２４７に記載の組成物。
前記第１の免疫寛容原性因子及び前記第２の免疫寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＣＬ２２、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＣＲ１、ＤＵＸ４、ＦＡＳＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＩＤＯ１、ＩＬ１５－ＲＦ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、セルピンｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から独立して選択される、請求項２４７または２４８に記載の組成物。
前記第１の免疫寛容原性因子及び前記第２の免疫寛容原性因子が、ＣＤ４７を含む、請求項２４９に記載の組成物。
前記ＣＤ４７が、配列番号１～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２５０に記載の組成物。
前記第１のＣＡＲと前記第２のＣＡＲとが異なり、かつＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ２０ＣＡＲ、ＣＤ２２ＣＡＲ、及びＢＣＭＡＣＡＲからなる群から独立して選択される、請求項２４７～２５１のいずれか１項に記載の組成物。
前記第１のＣＡＲ及び／または前記第２のＣＡＲが、配列番号３２、３４、３６、１１７、１２８、及び１３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３２、３４、３６、１１７、１２８、及び１３６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項２４７～２５１のいずれか１項に記載の組成物。
前記第１のＣＡＲがＣＤ１９ＣＡＲであり、かつ前記第２のＣＡＲがＣＤ２２ＣＡＲである、請求項２４７～２５３のいずれか１項に記載の組成物。
前記１つ以上の切断部位が、自己切断部位を含む、請求項２４７～２５４のいずれか１項に記載の組成物。
前記自己切断部位が２Ａ部位を含む、請求項２５５に記載の組成物。
前記２Ａ部位が、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ部位を含む、請求項２５６に記載の組成物。
前記１つ以上の切断部位が、プロテアーゼ部位をさらに含む、請求項２５６に記載の組成物。
前記プロテアーゼ部位がフーリン部位を含む、請求項２５８に記載の組成物。
前記フーリン部位が、ＦＣ１、ＦＣ２、またはＦＣ３部位を含む、請求項２５９に記載の組成物。
前記プロテアーゼ部位が、５’から３’方向の順序で前記２Ａ部位の前に位置する、請求項２５８に記載の組成物。
請求項２３３～２６１のいずれか１項に記載の組成物を宿主細胞の集団に導入する工程を含む、宿主細胞の不均一集団を生成する方法。
請求項２６２に記載の方法によって生成された、宿主細胞の不均一集団。
前記宿主細胞が自己細胞である、請求項２６３に記載の宿主細胞の集団。
前記宿主細胞が同種細胞である、請求項２６３に記載の宿主細胞の集団。
前記宿主細胞が、ＥＳＣまたはｉＰＳＣである、請求項２６３～２６５のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団。
前記宿主細胞が、ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している、請求項２６３～２６５のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団。
前記宿主細胞が初代細胞である、請求項２６３～２６５のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団。
前記宿主細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である、請求項２６７または２６８に記載の宿主細胞の集団。
請求項２６３～２６９のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団を含む、医薬組成物。
その必要がある対象の疾患を治療する方法であって、前記対象に、請求項２６３～２６９のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団または請求項２７０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、前記方法。
前記疾患が、がんである、請求項２７１に記載の方法。
前記がんが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及び／またはＢＣＭＡの発現と関連している、請求項２７２に記載の方法。
前記がんが、悪性血液疾患である、請求項２７２に記載の方法。
前記悪性血液疾患が、骨髄新生物、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖／骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項２７４に記載の方法。
前記疾患が、自己免疫疾患である、請求２７１に記載の方法。
前記自己免疫疾患が、ループス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、アジソン病、バセドウ病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、及びセリアック病からなる群から選択される、請求項２７６に記載の方法。
前記疾患が、糖尿病である、請求項２７１に記載の方法。
前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、及び妊娠糖尿病からなる群から選択される、請求項２７８に記載の方法。
前記疾患が、神経疾患である、請求項２７１に記載の方法。
前記神経疾患が、カタレプシー、てんかん、脳炎、髄膜炎、片頭痛、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、及び多発性硬化症からなる群から選択される、請求項２８０に記載の方法。
１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現と、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の増加した発現とを有する、宿主細胞であって、
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントに保有されている、
前記宿主細胞。
前記ＭＨＣクラスＩ分子の低下した発現が、Ｂ２Ｍの低下した発現によるものである、請求項２８２に記載の宿主細胞。
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子の低下した発現が、ＣＩＩＴＡの低下した発現によるものである、請求項２８２に記載の宿主細胞。
前記ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の低下した発現が、ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現によるものである、請求項２８２に記載の宿主細胞。
１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する、請求項２８２に記載の宿主細胞。
１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及びＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する、請求項２８２に記載の宿主細胞。
ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及びＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する、請求項２８２の宿主細胞。
前記ノックアウトが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼの使用によるものである、請求項２８６～２８８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅを含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ２４を含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ４７を含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１を含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤ－Ｌ１を含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ４６を含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ５５を含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ５９を含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣ１インヒビターを含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターを含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターを含む、請求項２８２～２８９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
多能性幹細胞（ＰＳＣ）である、請求項２８２～３００のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記ＰＳＣが、ＥＳＣまたはｉＰＳＣである、請求項３０１に記載の宿主細胞。
ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している、請求項２８２～３００のいずれか１項に記載の宿主細胞。
初代細胞である、請求項２８２～３００のいずれか１項に記載の宿主細胞。
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、β膵島細胞、またはＧＰＣである、請求項３０３または３０４に記載の宿主細胞。
前記ポリシストロニックベクターが、さらなる外因性構成要素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２８２～３０５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記さらなる外因性構成要素が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される安全スイッチである，請求項３０６に記載の宿主細胞。
１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現と、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の増加した発現とを有する、Ｔ細胞であって、
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントに保有されている、
前記Ｔ細胞。
１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現と、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の増加した発現とを有する、ＮＫ細胞であって、
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントに保有されている、
前記ＮＫ細胞。
１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現と、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターからなる群から選択される１つ以上の免疫寛容原性因子の増加した発現とを有する、膵島細胞であって、
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、請求項１～１１８のいずれか１項に記載のポリシストロニックベクターまたはそのフラグメントに保有されている、
前記膵島細胞。
前記ＭＨＣクラスＩ分子の低下した発現が、Ｂ２Ｍの低下した発現によるものである、請求項３０８～３１０のいずれか１項に記載の細胞。
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子の低下した発現が、ＣＩＩＴＡの低下した発現によるものである、請求項３０８～３１０のいずれか１項に記載の細胞。
前記ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の低下した発現が、ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの低下した発現によるものである、請求項３０８～３１０のいずれか１項に記載の細胞。
１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及び／またはＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する、請求項３０８～３１０のいずれか１項に記載の細胞。
１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及びＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する、請求項３０８～３１０のいずれか１項に記載の細胞。
ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣ－Ａ、及びＭＩＣ－Ｂのノックアウトを有する、請求項３０８～３１０のいずれか１項に記載の細胞。
前記ノックアウトが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼの使用によるものである、請求項３１４～３１６のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅを含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ２４を含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ４７を含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＰＤ－Ｌ１を含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤ－Ｌ１を含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ４６を含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ５５を含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣＤ５９を含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子がＣ１インヒビターを含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターを含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
前記１つ以上の免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣ１インヒビターを含む、請求項３０８～３１７のいずれか１項に記載の細胞。
ＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している、請求項３０８～３２８のいずれか１項に記載の細胞。
初代細胞である、請求項３０８～３２８のいずれか１項に記載の細胞。
前記ポリシストロニックベクターが、さらなる外因性構成要素をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３０８～３３０のいずれか１項に記載の細胞。
前記さらなる外因性構成要素が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される安全スイッチである、請求項３３１に記載の細胞。