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JP2024517931A - 抗ｔｍｐｒｓｓ６抗体及びその使用 - Google Patents

抗ｔｍｐｒｓｓ６抗体及びその使用 Download PDF

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JP2024517931A JP2023569823A JP2023569823A JP2024517931A JP 2024517931 A JP2024517931 A JP 2024517931A JP 2023569823 A JP2023569823 A JP 2023569823A JP 2023569823 A JP2023569823 A JP 2023569823A JP 2024517931 A JP2024517931 A JP 2024517931A
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Abstract

本明細書では、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、及びその使用方法が提供される。本開示の様々な実施形態では、抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６に結合する完全ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ヒトのＴＭＰＲＳＳ６と関連する疾患、障害または状態を治療または予防するための方法に有用である。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０２１年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１８７，１５０号に対する優先権を主張するものであり、その開示全体が、本明細書での参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
ＡＳＣＩＩテキストファイル（ファイル名：７２８８２５＿ＲＧＮ９－００２ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：１４１．９キロバイト；作成日：２０２２年５月１０日）で電子的に提出された配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本明細書では、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）に特異的に結合する抗体及びその抗原結合性断片が開示される。本明細書ではまた、そのような抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、それを含む宿主細胞、及びかかる抗体及びその抗原結合性断片を使用する治療方法も開示される。
膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６；マトリプターゼ－２またはＭＴＰ－２としても知られる）は、短いＮ末端細胞内領域、それに続く、単一の膜貫通ドメイン、単一のＳＥＡドメイン、２つのＣＵＢドメイン、３つのＬＤＬＲａリピートドメイン、及びＣ末端の触媒的セリンプロテアーゼドメインで構成されるＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼである。ＴＭＰＲＳＳ６は肝臓で高発現し、ヘプシジン発現を負に調節することによって鉄恒常性において役割を果たしている。高レベルのヘプシジンは、細胞表面からの鉄排出チャネルであるフェロポーチンのレベルを低下させて細胞からの鉄輸送を遮断する。ＴＭＰＲＳＳ６はヘモジュベリン（ＨＪＶ）を切断し、これにより、ＳＭＡＤシグナル伝達の減少及びその後の、ヘプシジンをコードする遺伝子であるＨＡＭＰの転写の下方制御が生じる。
ヘプシジン発現量の減衰により、鉄過剰症またはヘモクロマトーシスが起こる可能性がある。鉄過剰障害は、体内に過剰な鉄の貯蔵を引き起こす障害の一群である。体が過剰な鉄を排出することができないため、過剰な鉄が、ある特定の臓器、例えば、肝臓、心臓、及び膵臓に貯蔵される。そのような臓器に貯蔵されている過剰な鉄は、臓器損傷及び他の関連疾患、例えば、糖尿病を引き起こす可能性がある。
鉄過剰障害の例としては、遺伝性ヘモクロマトーシス（ＨＨＣ）、食事から過量の鉄が体に吸収される遺伝性疾患、及びサラセミア（ヘモグロブリン産生の減少により引き起こされる遺伝性貧血の一種）または骨髄異形成症候群（後天性貧血をもたらす血液がん）等の特定の血液疾患の患者における合併症として生じ得る続発性ヘモクロマトーシスが挙げられる。ベータサラセミア及び／または骨髄異形成症候群の場合、疾患と関連する貧血を治療するための輸血を繰り返し行うことにより、しばしば鉄過剰を生じ得る。
鉄過剰障害の治療選択肢は限られており、典型的には、患者の生涯にわたり必要とされる。治療選択肢としては、鉄キレート療法、瀉血または静脈切開による鉄が豊富な血液の除去、及び鉄摂取を減らすための食事制限が挙げられる。当該技術分野では、鉄過剰障害の治療のための追加の改善された組成物及び方法が必要とされている。
開示の概要
本明細書では、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質と特異的に結合する抗体及びその抗原結合性断片（すなわち、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体）が開示される。ある特定の実施形態では、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６に高い親和性で結合し、かつ、そのプロテアーゼ活性を阻害する、完全ヒト抗体である。
一態様では、本開示は、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメインに結合するが、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）には結合しない。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片はさらに、ＴＭＰＲＳＳ６のＬＤＬＲａドメイン２内部に含まれる部位にて結合する。一実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ６に対する抗体またはその抗原結合性断片の結合は、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基を直接的には閉塞しない。他の実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ６に対する抗体またはその抗原結合性断片の結合は、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック調節を媒介する。ある特定の実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ６に対する抗体またはその抗原結合性断片の結合は、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック阻害を媒介する。
別の態様では、本開示は、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック阻害物質である。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６を、ＴＭＰＲＳＳ６基質に結合することはできるがそれを切断することができない不活性型立体構造に維持する。ある特定の実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ６基質は、ヘモジュベリン（ＨＪＶ）である。
別の態様では、本開示は、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体または抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基を立体的に閉塞する部位にてＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメイン内部で結合する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６への結合についてヘモジュベリン（ＨＨＶ）と競合する。
別の態様では、本開示は、ヒト膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ｈＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質（配列番号１２６）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、水素／重水素交換により決定されるように、ｈＴＭＰＲＳＳ６の細胞外ドメイン内に含有されている１個以上のアミノ酸と相互作用する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、水素／重水素交換により決定されるように、（ａ）配列番号１２６のアミノ酸１２５～１３３、（ｂ）配列番号１２６のアミノ酸５８６～５９４、（ｃ）配列番号１２６のアミノ酸６２６～６５０、（ｄ）配列番号１２６のアミノ酸６９３～７０３、（ｅ）配列番号１２６のアミノ酸７０４～７２４、及び／または（ｅ）配列番号１２６のアミノ酸７８０～８０５、から選択されるアミノ酸配列と相互作用する。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、水素／重水素交換により決定されるように、（ａ）配列番号１２６のアミノ酸６９３～７０３、及び／または（ｂ）配列番号１２６のアミノ酸７８０～８０５、から選択されるアミノ酸配列と相互作用する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、水素／重水素交換により決定されるように、（ａ）配列番号１２６のアミノ酸１２５～１３３、（ｂ）配列番号１２６のアミノ酸５８６～５９４、（ｃ）配列番号１２６のアミノ酸６２６～６５０、及び／または（ｄ）配列番号１２６のアミノ酸７０４～７２４、から選択されるアミノ酸配列と相互作用する。
別の態様では、本開示は、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、クライオ電子顕微鏡構造モデリングにより決定されるように、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（配列番号１２６）の残基Ｇ６９９、Ｈ７０１、Ｄ７２４、Ｑ７２６、Ｌ７２７、Ｉ７２８、Ｐ７２９、Ｌ７３２、Ｅ７３５、Ｇ７４９、Ｙ７５０、Ｒ７５１、Ｋ７５２、及びＮ７９１と相互作用する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片はさらに、クライオ電子顕微鏡構造モデリングにより決定されるように、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（配列番号１２６）の残基Ｖ４９０、Ｓ５０１、Ｔ５０２、Ｃ５０３、Ｉ５０４、Ｓ５０５、及びＫ５０８と相互作用する。
別の態様では、本開示は、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、クライオ電子顕微鏡構造モデリングにより決定されるように、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の残基Ｒ５９７、Ｒ５９９、Ｉ６０１、Ｄ６２２、Ｌ７１０、Ｒ７１１、Ｅ７１２、Ｇ７１３、Ｇ７１４、Ｐ７１５、及びＩ７１６と相互作用する。
別の態様では、本開示は、膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有されている３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有されている３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ３は、表１に記載のＨＣＤＲ３の配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、ＬＣＤＲ３配列は、表１に記載のＬＣＤＲ３の配列から選択されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、表１に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、表１に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列を含む。
ある特定の実施形態では、（ａ）ＨＣＤＲ１ドメインは、配列番号４、２４、３４、４４、６４、８４、または１０２から選択されるアミノ酸配列を有し、（ｂ）ＨＣＤＲ２ドメインは、配列番号６、２６、３６、４６、６６、８６、または１０４から選択されるアミノ酸配列を有し、（ｃ）ＨＣＤＲ３ドメインは、配列番号８、２８、３８、４８、６８、８８、または１０６から選択されるアミノ酸配列を有し、（ｄ）ＬＣＤＲ１ドメインは、配列番号１２、５２、７２、９２、または１１０から選択されるアミノ酸配列を有し、（ｅ）ＬＣＤＲ２ドメインは、配列番号１４、５４、または７４から選択されるアミノ酸配列を有し、（ｆ）ＬＣＤＲ３ドメインは、配列番号１６、５６、７６、９４、または１１２から選択されるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲセットのうちの１つを含む：（ａ）配列番号４（ＨＣＤＲ１）、配列番号６（ＨＣＤＲ２）、配列番号８（ＨＣＤＲ３）、配列番号１２（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１６（ＬＣＤＲ３）、（ｂ）配列番号２４（ＨＣＤＲ１）、配列番号２６（ＨＣＤＲ２）、配列番号２８（ＨＣＤＲ３）、配列番号１２（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１６（ＬＣＤＲ３）、（ｃ）配列番号３４（ＨＣＤＲ１）、配列番号３６（ＨＣＤＲ２）、配列番号３８（ＨＣＤＲ３）、配列番号１２（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１６（ＬＣＤＲ３）、（ｄ）配列番号４４（ＨＣＤＲ１）、配列番号４６（ＨＣＤＲ２）、配列番号４８（ＨＣＤＲ３）、配列番号５２（ＬＣＤＲ１）、配列番号５４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号５６（ＬＣＤＲ３）、（ｅ）配列番号６４（ＨＣＤＲ１）、配列番号６６（ＨＣＤＲ２）、配列番号６８（ＨＣＤＲ３）、配列番号７２（ＬＣＤＲ１）、配列番号７４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号７６（ＬＣＤＲ３）、（ｆ）配列番号８４（ＨＣＤＲ１）、配列番号８６（ＨＣＤＲ２）、配列番号８８（ＨＣＤＲ３）、配列番号９２（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号９４（ＬＣＤＲ３）、または（ｇ）配列番号１０２（ＨＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＨＣＤＲ２）、配列番号１０６（ＨＣＤＲ３）、配列番号１１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１１２（ＬＣＤＲ３）。
ある特定の実施形態では、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲセットを含む：配列番号４４（ＨＣＤＲ１）、配列番号４６（ＨＣＤＲ２）、配列番号４８（ＨＣＤＲ３）、配列番号５２（ＬＣＤＲ１）、配列番号５４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号５６（ＬＣＤＲ３）。他の実施形態では、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、以下のＣＤＲセットを含む：配列番号１０２（ＨＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＨＣＤＲ２）、配列番号１０６（ＨＣＤＲ３）、配列番号１１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１１２（ＬＣＤＲ３）。
別の態様では、本開示は、ＴＭＰＲＳＳ６に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＣＶＲ内に含有されている３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及びＬＣＶＲ内に含有されている３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＶＲは、（ｉ）配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、もしくは１００から選択されるアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、もしくは１００から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、もしくは１００から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または（ｉｖ）配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、もしくは１００から選択される配列に関して１２以下のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、を含む。
ある特定の実施形態では、ＬＣＶＲは、（ａ）配列番号１０、５０、７０、９０、もしくは１０８から選択されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１０、５０、７０、９０、もしくは１０８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１０、５０、７０、９０、もしくは１０８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または（ｄ）配列番号１０、５０、７０、９０、もしくは１０８から選択される配列に関して１０以下のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、を含む。
ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、または１００から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号１０、５０、７０、９０、または１０８から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２／１０、２２／１０、３２／１０、４２／５０、６２／７０、８２／９０、または１００／１０８から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号４２／５０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。他の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、配列番号１００／１０８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
別の態様では、本開示は、ＴＭＰＲＳＳ６に結合する抗体を提供し、抗体は、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含み、重鎖は、配列番号１８、３０、４０、５８、７８、９６及び１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、軽鎖は、配列番号２０、６０、８０、９８及び１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１８／２０、３０／２０、４０／２０、５８／６０、７８／８０、９６／９８または１１４／１１６から選択されるＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、５８／６０のＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む。他の実施形態では、抗体は、１１４／１１６のＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、以下から選択される１つ以上の特性を有する：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片である、（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約２１．２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する、（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、サルＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約２５．７ｎＭ未満のＫＤで結合する、（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、マウスＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約７０３ｎＭ未満のＫＤで結合する、（ｅ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約２．７ｎＭ未満である、（ｆ）サルＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約３．６ｎＭ未満である、（ｇ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約３５ｎＭ未満である、（ｈ）約９０％超の阻害パーセントで、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害する、（ｉ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、約２００ｐＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｊ）約４２％超の阻害パーセントで、マウスＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害する、（ｋ）マウスＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、約２７４ｐＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｌ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約６５％超の阻害パーセントで阻害する、（ｍ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｎ）サルＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約６６％超の阻害パーセントで阻害する、（ｏ）サルＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約５０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｐ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約５８％超の阻害パーセントで阻害する、（ｑ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約３５ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｒ）それを必要とする対象に投与した場合に、対象の血清鉄濃度を減少させる、（ｓ）それを必要とする対象に投与した場合に、対象の血清ヘプシジン濃度を増加させる、（ｔ）それを必要とする対象に投与した場合に、対象の成熟赤血球レベルを増加させる、（ｕ）それを必要とする対象に投与した場合に、対象の脾臓及び／または骨髄における成熟赤血球レベルを増加させる、（ｖ）それを必要とする対象に投与した場合に、対象のヘモグロビン濃度を増加させる、または（ｗ）それを必要とする対象に投与した場合に、対象のトランスフェリン飽和レベルを低下させる。ある特定の実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
別の態様では、本開示は、ＴＭＰＲＳＳ６への結合について本明細書に開示の抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示の抗体またはその抗原結合性断片と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるような、ＴＭＰＲＳＳ６に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片及び薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のベクター、及び本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターを含む、ベクターのセットを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるベクターまたはベクターのセットを含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本開示は、ＴＭＰＲＳＳ６に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を生産する方法であって、抗体またはその抗原結合性断片の産生を可能にする条件下で本開示の宿主細胞を培養すること、及びそのようにして産生された抗体またはその抗原結合性断片を回収すること、を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法はさらに、抗体またはその抗原結合性断片を、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化することを含む。
別の態様では、本開示は、鉄過剰と関連する疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を治療、予防、または改善する方法であって、治療的有効量の本開示の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、疾患または障害は、先天性赤血球形成異常性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、アルファサラセミア、ベータサラセミア、輸血依存性溶血性貧血、骨髄異形成症候群、鎌状赤血球症、真性多血症、遺伝性ヘモクロマトーシス、または慢性肝疾患であるである。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、ベータサラセミアである。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、重症型ベータサラセミアまたは中等症型ベータサラセミアである。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、骨髄異形成症候群である。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群である。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、輸血依存性溶血性貧血である。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、ピルビン酸キナーゼ欠乏症による輸血依存性溶血性貧血、または鉄芽球性輸血依存性溶血性貧血である。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、慢性肝疾患である。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、アルコール関連慢性肝疾患、Ｃ型肝炎、または自己免疫性肝炎である。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする対象に予防的または治療的に投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、または筋肉内に投与される。
他の実施形態は、後述の詳細な説明の概説から明らかになるであろう。
実施例１５におけるマウスの強制走行研究の研究計画を図式で示したものである。 Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスにおける、走行距離（Ａ）及び走行距離にわたる乳酸産生（Ｂ）に対するＲＥＧＮ７９９９処置の効果を示す。対照動物は、野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスである。注：図のデータはいずれも平均±標準偏差（ＳＤ）として示されており、Ｐ＜０．０５は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキー事後多重比較検定下で統計学的に有意な差を示す。 ＲＥＧＮ７９９９またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）のいずれかにより処置された野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの走行距離を示す。 ＲＥＧＮ７９９９またはＡｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃいずれかにより８週間処置されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスにおける血清ヘプシジン濃度（Ａ）、血清鉄濃度（Ｂ）、及び肝臓の鉄含有量（Ｃ）を示す。対照動物は、野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスである。 ＲＥＧＮ７９９９、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ、またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）による処置の８週間後のＷＴマウスまたはＨｂｂｔｈ３／＋マウスの平均体重（ｇ）を示す。アイソタイプ対照により処置されたＷＴマウス：円、黒い実線。アイソタイプ対照により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋マウス：四角、灰色の実線。ＲＥＧＮ７９９９により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋マウス：三角（上向き）、黒い点線。Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃにより処置されたＨｂｂｔｈ３／＋マウス：三角（下向き）、灰色の点線。 ＲＥＧＮ７９９９、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ、またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）による処置の８週間後のＷＴマウスまたはＨｂｂｔｈ３／＋マウスの平均脾臓重量（ｇ）を示す。 ＲＥＧＮ７９９９、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ、またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）による処置の８週間後のＷＴマウスまたはＨｂｂｔｈ３／＋マウスからの脾臓の成熟ＲＢＣの量（ＣＤ４４ｌｏｗＴｅｒ１１９＋細胞％）を示す。 ＲＥＧＮ７９９９、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ、またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）による処置の８週間後のＷＴマウスまたはＨｂｂｔｈ３／＋マウスからの網状赤血球の量（ＣＤ４４ｈｉｇｈＴｅｒ１１９＋細胞％）を示す。
本方法について説明する前に、特定の方法、及び実験条件は変動し得ることから、本開示はそれらに限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語は、個々の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、関連技術分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意の方法及び材料が、開示されている実施形態の実施または試験に使用可能であるが、好ましい方法及び材料についてここに記載する。本明細書で言及される刊行物はすべて、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
定義
「ＴＭＰＲＳＳ６」という用語は、「マトリプターゼ－２」または「ＭＴＰ－２」とも呼ばれ、膜貫通型セリンプロテアーゼ６を指す。ＴＭＰＲＳＳ６は、短いＮ末端細胞内領域（ヒトＴＭＰＲＳＳ６（配列番号１２６）の残基１～５５）それに続く、単一の膜貫通ドメイン（配列番号１２６の残基５６～７６）、単一のＳＥＡ（ウニ精子タンパク質、エンテロペプチダーゼ、及びアグリン（ｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ ｓｐｅｒｍ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｎｔｅｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ａｎｄ ａｇｒｉｎ））ドメイン（配列番号１２６の残基８４～２０９）、２つのＣＵＢ（Ｃｌｓ／Ｃｌｒ、ウニ胚性成長因子（ｕｒｃｈｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、及び骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＭＰ）－１）ドメイン（ＣＵＢドメイン１については配列番号１２６の残基２１３～３３６及びＣＵＢドメイン２については配列番号１２６の残基３３５～４５２）、３つのＬＤＬＲａ（低密度リポタンパク質受容体、クラスＡ）リピートドメイン（ＬＤＬＲａドメイン１については配列番号１２６の残基４５７～４８９、ＬＤＬＲａドメイン２については配列番号１２６の残基４９２～５２６、及びＬＤＬＲａドメイン３については配列番号１２６の残基５３０～５６７）、ならびにＣ末端の触媒的セリンプロテアーゼドメイン（配列番号１２６の残基５７７～８１１）で構成されるＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼである。触媒的セリンプロテアーゼドメインは、ヒスチジン（ヒトＴＭＰＲＳＳ６（配列番号１２６）の残基６１７）、アスパラギン酸（配列番号１２６の残基６６８）、及びセリン残基（配列番号１２６の残基７６２）の触媒三残基を含有する（Ｌｅｅ，Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．（２００９）１２２（２－３）：８７－９６、Ｒａｍｓａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．（２００８）１３：５６９－５７９）。ＴＭＰＲＳＳ６は、ＢＭＰ共受容体ヘモジュベリン（ＨＪＶ）の切断を介してヘプシジン産生の負の調節因子として作用することにより、鉄恒常性において役割を果たしていることが示されている（Ｄｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８：１２５６２）。全長ヒトＴＭＰＲＳＳ６タンパク質（アイソフォーム２）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔで受託番号Ｑ８ＩＵ８０として提供される８１１アミノ酸配列により例示され、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿７０５８３７．１に対応する（ＴＭＰＳ６＿ヒト；配列番号１２６）。ヒトＴＭＰＲＳＳ６タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１５３６０９．３（配列番号１２７）で表される核酸配列によってコードされる。全長カニクイザルＴＭＰＲＳＳ６タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔで受託番号Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＡＰ０として提供されるアミノ酸配列により例示され、ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿００５５６７４４１．１に対応する（Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＡＰ０＿ＭＡＣＦＡ；配列番号１２８）。カニクイザルＴＭＰＲＳＳ６タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列ＸＭ＿００５５６７３８４（配列番号１２９）で表される核酸配列によってコードされる。全長マウスＴＭＰＲＳＳ６タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔで受託番号Ｑ９ＤＢＩ０として提供されるアミノ酸配列により例示され、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０８２１７８．２に対応する（ＴＭＰＳ６＿マウス；配列番号１３０）。マウスＴＭＰＲＳＳ６タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２７９０２．２（配列番号１３１）で表される核酸配列によってコードされる。「ＴＭＰＲＳＳ６」という用語には、組換えＴＭＰＲＳＳ６タンパク質またはその断片が含まれる。かかる用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトのＦｃ、またはＲＯＲ１等のシグナル配列に結合されたＴＭＰＲＳＳ６タンパク質またはその断片（例えば、配列番号１１７～１１９）も包含する。
「約」という用語は、特定の記述されている数値に関して使用される場合、その値が、記述されている値から１％以下変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９及び１０１ならびにその間にあるすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、．．．１００．７、１００．８、１００．９）が含まれる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、４本のポリペプチド鎖である、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合性断片を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に細分することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域が散在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順序で並んでいる。本開示のある特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合性断片）のＦＲは、ヒト生殖細胞系配列と同一な場合もあれば、天然で、または人工的に修飾される場合もある。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
１つ以上のＣＤＲ残基の置換または１つ以上のＣＤＲの省略も可能である。抗体については科学文献に記載されており、それによると、結合のために１つまたは２つのＣＤＲを省くことができる。Ｐａｄｌａｎら（１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９）は、抗体とそれらの抗原との間の接触領域を、公開されている結晶構造に基づいて分析し、ＣＤＲ残基のうち約５分の１～３分の１のみが実際に抗原と接触すると結論づけた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲに抗原と接触するアミノ酸がない、多くの抗体を見出した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照のこと）。
抗原に接触していないＣＤＲ残基は、分子モデリングによって、及び／または経験的に、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、以前の研究に基づいて同定することができる（例えば、ＣＤＲＨ２の残基Ｈ６０－Ｈ６５は不要であることが多い）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）を省略する場合、それは通常、別のヒト抗体配列またはそのような配列のコンセンサスにおける対応する位置を占有しているアミノ酸で置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置及び置換するためのアミノ酸は、経験的に選択することもできる。経験的置換は、保存的置換でも非保存的置換でも可能である。
本明細書に開示される完全ヒト抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体は、対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖の可変ドメインのフレームワーク領域及び／またはＣＤＲ領域における１つ以上の、アミノ酸の置換、挿入及び／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公開されている抗体配列データベースから利用可能な生殖細胞系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本開示には、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する、抗体、及びそれらの抗原結合性断片が含まれ、１つ以上のフレームワーク領域及び／またはＣＤＲ領域内の１個以上のアミノ酸が、その抗体が由来した生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に、または別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に、または対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異している（そのような配列変化を、本明細書では総称して「生殖細胞系列変異」と呼ぶ）。当業者は、本明細書に開示される重鎖及び軽鎖の可変領域配列で開始して、１つ以上の個々の生殖細胞系列変異またはそれらの組み合わせを含む多数の抗体及び抗原結合性断片を容易に作製することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメイン内のフレームワーク残基及び／またはＣＤＲ残基のうちのすべてが、その抗体が由来した元の生殖細胞系列配列に見られる残基に復帰変異している。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元の生殖細胞系列配列に復帰変異しており、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみが復帰変異している。他の実施形態では、フレームワーク残基及び／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上が、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、その抗体が最初に由来した生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基（複数可）に変異している。さらに、本明細書に開示される抗体は、フレームワーク領域及び／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含有してよく、例えば、ある特定の個々の残基は特定の生殖細胞系列配列の対応する残基に変異している一方、元の生殖細胞系列配列とは異なる別の特定の残基は、維持されるかまたは異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に変異している。１つ以上の生殖細胞系列変異を含有する抗体及び抗原結合性断片が得られた後は、それらを、１つ以上の所望の特性、例えば、結合特異性の改善、結合親和性の向上、拮抗的生物学的特性の改善または増強、免疫原性の低下等について容易に検証することができる。この一般的方法で得られる抗体及び抗原結合性断片は、本開示内に包含される。
本明細書ではまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲのアミノ酸配列のうちのいずれかについてのバリアントを含む完全ヒト抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体も開示される。例えば、本開示には、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲのアミノ酸配列のうちのいずれかと比べて、例えば、１０以下、８以下、６以下、４以下等の保存的アミノ酸置換を含むＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／またはＣＤＲのアミノ酸配列を有する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が含まれる。
「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれることが意図される。本明細書に開示されるヒトｍＡｂには、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異な変異誘発によるか、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）が、例えば、ＣＤＲ内、特にＣＤＲ３内に含まれ得る。ただし、「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列にグラフトされているｍＡｂを含めることは意図していない。かかる用語には、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換えにより産生される抗体が含まれる。この用語は、ヒト対象から単離されるかまたはヒト対象において生成される抗体を含めることを意図していない。
「組換え」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ＤＮＡスプライシング及びトランスジェニック発現を含め、組換えＤＮＡ技術として当該技術分野で知られている技術または方法によって作製、発現、単離または取得される抗体もしくはその抗原結合性断片を指す。かかる用語は、非ヒト哺乳類（トランスジェニック非ヒト哺乳類、例えば、トランスジェニックマウスを含む）、もしくは細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系で発現されるか、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体を指す。
「特異的に結合する」、または「に特異的に結合する」等の用語は、抗体またはその抗原結合性断片が、生理学的条件下で比較的安定な複合体を抗原と形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－８Ｍまたはそれ以下の平衡解離定数（例えば、より小さいＫＤは、より強力な結合を表す）によって特徴付けることができる。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴法等が含まれる。本明細書に記載されるように、抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６に特異的に結合する、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって同定された。さらに、ＴＭＰＲＳＳ６の１つのドメイン及び１つ以上の追加の抗原に結合する多重特異性抗体、またはＴＭＰＲＳＳ６の２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、そうであるにもかかわらず、本明細書で使用される場合は「特異的に結合する」抗体と見なされる。
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液－親和性ＥＬＩＳＡにより測定される、ＫＤとして表されるＴＭＰＲＳＳ６に対する結合親和性が少なくとも１０－８Ｍ、好ましくは１０－９Ｍ、より好ましくは１０－１０Ｍ、よりさらに好ましくは１０－１１ＭであるｍＡｂを指す。
「低解離速度」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定した場合に、１×１０－３ ｓ－１またはそれ以下、好ましくは１×１０－４ ｓ－１またはそれ以下の速度定数でＴＭＰＲＳＳ６から解離する抗体を意味する。
抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性断片」等の用語には、本明細書で使用される場合、天然に存在するか、酵素により得られるか、合成であるか、もしくは遺伝子操作されている、抗原と特異的に結合して複合体を形成する任意のポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の「抗原結合性断片」、または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に結合する能力を保持している、抗体の１つ以上の断片を指す。
具体的な実施形態では、本開示の抗体または抗体断片は、リガンドもしくは治療用部分（「免疫複合体」）、第２の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体、またはＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患もしくは障害を治療するのに有用な任意の他の治療用部分のような、部分に結合され得る。
「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＴＭＰＲＳＳ６またはその断片と特異的に結合する単離された抗体は、ＴＭＰＲＳＳ６以外の抗原と特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）。
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用した、バイオセンサー基質内のタンパク質濃度の変化を検出することによってリアルタイムの生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。
「エピトープ」という用語は、抗体分子の可変領域にある特定の抗原結合部位（パラトープとして知られる）と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が複数のエピトープを有する場合がある。したがって、異なる抗体が、ある抗原上の異なる領域に結合する場合があり、異なる生物学的作用を有し得る。「エピトープ」という用語はまた、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞がそれに対して応答する抗原上の部位も指す。これはまた、抗体が結合している抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的と定義され得る。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、立体構造的、すなわち、非直鎖状アミノ酸で構成される場合もある。ある特定の実施形態では、エピトープには、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基等の化学的に活性な表面分子群である決定基が含まれ得、また、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特性、及び／または特定の電荷特性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の抗体及び抗原結合性断片は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（ＮＰ＿７０５８３７．１；配列番号１２６）のＧ６９９、Ｈ７０１、Ｄ７２４、Ｑ７２６、Ｌ７２７、Ｉ７２８、Ｐ７２９、Ｌ７３２、Ｅ７３５、Ｇ７４９、Ｙ７５０、Ｒ７５１、Ｋ７５２、及びＮ７９１を含むエピトープまたはエピトープの一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の抗体及び抗原結合性断片は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（ＮＰ＿７０５８３７．１；配列番号１２６）のＶ４９０、Ｓ５０１、Ｔ５０２、Ｃ５０３、Ｉ５０４、Ｓ５０５、及びＫ５０８を含むエピトープまたはエピトープの一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の抗体及び抗原結合性断片は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の２つの部分、すなわち、ヒトＴＭＰＲＳＳ６のＧ６９９、Ｈ７０１、Ｄ７２４、Ｑ７２６、Ｌ７２７、Ｉ７２８、Ｐ７２９、Ｌ７３２、Ｅ７３５、Ｇ７４９、Ｙ７５０、Ｒ７５１、Ｋ７５２、及びＮ７９１を含む第１の部分と、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（ＮＰ＿７０５８３７．１；配列番号１２６）のＶ４９０、Ｓ５０１、Ｔ５０２、Ｃ５０３、Ｉ５０４、Ｓ５０５、及びＫ５０８を含む第２の部分と、を含むエピトープを含む。
他の実施形態では、本明細書に開示の抗体及び抗原結合性断片は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（ＮＰ＿７０５８３７．１；配列番号１２６）のＲ５９７、Ｒ５９９、Ｉ６０１、Ｄ６２２、Ｌ７１０、Ｒ７１１、Ｅ７１２、Ｇ７１３、Ｇ７１４、Ｐ７１５、及びＩ７１６を含むエピトープまたはエピトープの一部を含む。
「交差競合する」という用語は、本明細書で使用される場合、ある抗体またはその抗原結合性断片が抗原に結合し、別の抗体またはその抗原結合性断片の結合を阻害または遮断することを意味する。かかる用語には、２つの抗体間の両方向の競合、すなわち、結合して、第２の抗体の結合を遮断する第１の抗体、及びその逆も含まれる。ある特定の実施形態では、第１の抗体及び第２の抗体は、同じエピトープに結合し得る。別法として、第１及び第２の抗体は、一方の結合が第２の抗体の結合を、例えば、立体障害により阻害または遮断するように、異なるが重複しているエピトープに結合し得る。抗体間の交差競合は、当該技術分野で知られる方法、例えば、リアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉法によって測定され得る。２つの抗体間の交差競合は、自己－自己結合（第１と第２の抗体が同じ抗体である）のためバックグラウンドシグナルより小さい第２の抗体の結合として表され得る。２つの抗体間の交差競合は、例えば、ベースラインの自己－自己バックグラウンド結合（第１と第２の抗体が同じ抗体である）より小さい第２の抗体の結合％として表され得る。
「実質的な同一性」または「実質的に同一な」という用語は、核酸またはその断片に言及している場合、以下に考察するように、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を行って別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させた場合に、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰ等の任意の周知の配列同一性アルゴリズムにより測定される、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％にヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子に対して実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合には、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同じかまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
ポリペプチドに適用される場合の「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用したＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラム等によって最適に整列された場合に、少なくとも９０％の配列同一性、よりさらに好ましくは、少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させることはない。２個以上のアミノ酸配列が、互いに保存的置換が異なる場合、類似性の割合または程度は、置換の保存的性質について修正するよう上方調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照のこと。化学的特性が類似した側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換の基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。代わりに、保存的置き換えは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において非負の値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含め、様々な置換、欠失及び他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアには、ＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴ等のプログラムが含まれており、これらをデフォルトのパラメータで使用して、異なる生物種からの相同ポリペプチド等の密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とその変異タンパク質間の、配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１に入っているプログラムＦＡＳＴＡをデフォルトまたは推奨されるパラメータで使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）では、クエリー配列と検索配列との間の最良重複領域のアラインメント及び配列同一性パーセントが提供される（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）（上掲））。ある配列を、異なる生物からの大量の配列を収めたデータベースに対して比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメータを使用するコンピュータプログラムのＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及び（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２を参照のこと。
「治療的有効量」という表現は、投与される理由となる所望の効果を生じる量を意味する。正確な量は、治療の目的に応じて異なり、既知の手法を使用して当業者により確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ベータサラセミアもしくは骨髄異形成症候群等のＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患もしくは障害の、改善、予防及び／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指す。かかる用語には、そのような疾患または障害を有するか、または有するリスクのあるヒト対象が含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、本明細書に開示の抗体または抗原結合性断片等の治療剤を、それを必要とする対象に投与することに起因する、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候の重症度の低減または改善を指す。かかる用語には、疾患の進行の阻害または症状／徴候の悪化の阻害が含まれる。かかる用語には、疾患の良好な予後も含まれ、すなわち、本明細書に開示の抗体または抗原結合性断片等の治療剤の投与時、対象が無病の場合もあれば、疾患が軽減している場合もある。治療剤は、治療用量で対象に投与され得る。
「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、本明細書に開示の抗体または抗原結合性断片の投与時、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患もしくは障害またはそのような疾患もしくは障害の任意の症状もしくは徴候の発現の阻害を指す。
抗体の抗原結合性断片
別段の具体的な指示がない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、２本の免疫グロブリン重鎖及び２本の免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）ならびにそれらの抗原結合性断片を包含すると理解されるものとする。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性断片」等の用語には、本明細書で使用される場合、天然に存在するか、酵素により得られるか、合成であるか、もしくは遺伝子操作されている、抗原と特異的に結合して複合体を形成する任意のポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の「抗原結合性断片」、または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つ以上の断片を指す。抗体断片には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲが含まれ得る。抗体の抗原結合性断片は、タンパク消化等の任意の好適な標準手法、または抗体の可変ドメイン及び（任意に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う組換え遺伝子操作手法を使用して、例えば、完全抗体分子に由来し得る。そのようなＤＮＡは、既知である、及び／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリー）から容易に入手可能である、または合成が可能である。ＤＮＡは配列決定されて、化学的に操作される場合もあれば、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／または定常ドメインを好適な立体配置に配置決定するため、あるいはコドンを導入する、システイン残基を作製する、アミノ酸を修飾、付加するかまたは欠失させる等のための分子生物学的手法を使用することによって操作される場合もある。
抗原結合性断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチド等の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））または拘束されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、及びサメＩｇＮＡＲ可変ドメインもまた、本明細書で使用される場合、「抗原結合性断片」という表現内に包含される。
抗体の抗原結合性断片は典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってよく、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接するかまたはそのフレーム内にある、少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと関連するＶＨドメインを有する抗原結合性断片では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、互いに対して任意の好適な配置で位置し得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬという二量体を含有し得る。別法として、抗体の抗原結合性断片は、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有し得る。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合で連結されている少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本明細書に開示される抗体の抗原結合性断片内に見出され得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的な例示的立体配置としては、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、及び（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。先に挙げた例示的立体配置の任意のものを含め、可変ドメイン及び定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されている場合もあれば、完全または部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって連結されている場合もある。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個以上）のアミノ酸からなり得、これが、単一ポリペプチド分子内で隣接する可変ドメイン及び／または定常ドメイン間に可動性または半可動性の結合をもたらす。さらに、本明細書に開示される抗体の抗原結合性断片は、互いに、及び／または１つ以上の単量体のＶＨドメインもしくはＶＬドメインと非共有結合で（例えば、ジスルフィド結合（複数可）によって）会合している、先に挙げた可変ドメインと定常ドメインとの立体配置のうちのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子の場合と同様、抗原結合性断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合性断片は典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、それぞれの可変ドメインが、別々の抗原かまたは同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含め、任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能なルーチンの手法を使用して、本明細書に開示される抗体の抗原結合性断片との関連における使用に適合させることができる。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を作製するための方法は、当該技術分野で知られている。そのような既知の方法のいずれも、ＴＭＰＲＳＳ６に特異的に結合するヒト抗体を作製するために本開示との関連で使用することができる。
ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に対する抗体を作製するために、以下のうちのいずれか１つを含む免疫原を使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、全長天然ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＩＵ８０を参照のこと）かまたはタンパク質もしくはその断片をコードするＤＮＡで免疫されたマウスから取得される。別法として、タンパク質またはその断片を、標準の生化学的手法を使用して生成し、修飾して免疫原として使用してよい。
いくつかの実施形態では、免疫原は、Ｅ．ｃｏｌｉかまたは任意の他の真核生物もしくは哺乳類の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現される、組換えＴＭＰＲＳＳ６タンパク質またはその断片であり得る（例えば、配列番号１１７～１１９）
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照のこと）またはモノクローナル抗体を作製するための他の任意の既知の方法を使用して、ＴＭＰＲＳＳ６に対する高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有して最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術では、マウスが、抗原刺激に応答して、ヒト可変領域とマウス定常領域とを含む抗体を産生するよう、内因性マウス定常領域部位に機能的に連結されたヒトの重鎖及び軽鎖の可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの作製を伴う。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒトの重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡに機能的に連結される。その後、完全ヒト抗体を発現することのできる細胞でＤＮＡが発現される。
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに目的抗原を投与し、抗体を発現するマウスからリンパ系細胞（Ｂ細胞等）を回収する。リンパ系細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死のハイブリドーマ細胞株を調製してよく、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングして選択し、目的抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、重鎖及び軽鎖の、望ましいアイソタイプの定常領域に連結され得る。そのような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞等の細胞内で産生され得る。別法として、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接単離され得る。
最初に、高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有して単離される。下記の実験の項と同様に、抗体は、特徴付けが行われ、親和性、選択性、エピトープ等を含めた望ましい特徴について選択される。マウス定常領域は、本明細書に開示されるような完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾されたＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を作製するために、所望のヒト定常領域で置き換えられる。選択される定常領域は特定の用途に応じて異なり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は可変領域に存在する。
生物学的同等物
本明細書に開示される抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及び抗体断片は、アミノ酸配列であって、記載されている抗体のものとは異なるが、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質と結合する能力を保持している、アミノ酸配列、を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体及び抗体断片は、親配列と比較した場合に、１つ以上の、アミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載されている抗体の生物学的活性と本質的に同等な生物学的活性を示す。同様に、本明細書に開示される、抗体をコードするＤＮＡ配列は、配列であって、本開示の配列と比較した場合に、１つ以上の、ヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本明細書に開示される抗体または抗体断片と本質的に生物学的同等性である抗体または抗体断片をコードする、配列、を包含する。
２つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えば、それらが、単回投与もしくは多回投与のいずれでも、類似の実験条件下で同じモル用量にて投与した場合に吸収の速度及び程度に顕著な差を示さない医薬同等物または医薬代替物である場合、生物学的に同等であると見なされる。いくつかの抗体は、それらが、それらの吸収速度ではなくそれらの吸収の程度において同等である場合に同等物または医薬代替物と見なされ、さらに、吸収速度のそのような差が、意図的であり、かつ、表示に反映されており、例えば慢性使用時、有効な体内薬物濃度の達成に不可欠ではなく、また試験される特定の医薬品の場合に医学的に重要ではないと見なされるために、生物学的に同等と見なされる場合がある。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、または効力に臨床的に意味のある差がない場合、生物学的に同等である。
一実施形態では、患者が、参照製品と生物由来製品との１回以上の切り替えを、そのような切り替えを行わずに治療を継続した場合と比較して、免疫原性の臨床的に重要な変化または有効性の減弱等の有害作用のリスクの点で予測される上昇を伴わずに行うことが可能な場合、その２つの抗原結合タンパク質は生物学的に同等である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質がいずれも共通の作用機序（複数可）によって、そのような機序で既知の程度で、使用の条件（複数可）に対して作用する場合、それらは生物学的に同等である。
生物学的同等性は、インビボ法及び／またはインビトロ法により示され得る。生物学的同等性の評価としては、例えば、（ａ）血液、血漿、血清、または他の生体液中の抗体もしくはその代謝物の濃度を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、（ｂ）ヒトのインビボバイオアベイラビリティのデータと相関しており、それが合理的に予測されるインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的作用を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、またはバイオアベイラビリティもしくは生物学的同等性を確立する、十分に管理された臨床試験、が挙げられる。
本開示の抗体の生物学的に同等なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うことによって、または末端もしくは内部の、生物学的活性に必要とされない残基もしくは配列を欠失させることによって構築され得る。例えば、再生時の不要または誤った分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐために、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸で置き換えることができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体には、抗体のグリコシル化特性を変更するアミノ酸変化を含む抗体バリアント、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含むものが含まれ得る。
Ｆｃバリアントを含む抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体
本明細書で言及される抗体は、典型的には、完全にヒトの可変領域を有するが、ヒトまたはマウスの定常領域を有する場合がある。当業者には理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換可能である（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換可能である等）が、いずれの場合も、表１に示す数字の識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、抗原に対する結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず同一であるかまたは実質的に類似することが予測される。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃは、二量体の安定化を促進するよう、ヒンジ領域（Ｓ１０８Ｐ）においてセリンからプロリンへの変異を含む。
本明細書に開示される特定の実施形態によれば、ＦｃＲｎ受容体への抗体の結合を、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、増強または減弱させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が提供される。例えば、本開示には、ＦｃドメインのＣＨ２領域またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が含まれ、変異（複数可）により、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲であるエンドソーム内）におけるＦｃドメインのＦｃＲｎに対する親和性が高まる。そのような変異は、動物に投与された場合、抗体の血清中半減期の延長をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）；２５０位及び４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、及び２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）における修飾；あるいは４２８位及び／または４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）及び／または４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦもしくはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４ＦもしくはＮ４３４Ｙ］）における修飾；あるいは２５０位及び／または４２８位における修飾；あるいは３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４位における修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７及び／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆもしくは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）及び／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）の修飾を含む。
例えば、本開示には、２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉ及び３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉ及び４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖ及び４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６Ｖ及びＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａ及び４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）から選択される１つ以上の変異対または変異群を含むＦｃドメインを含む抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が含まれる。本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の前述のＦｃドメイン変異及び他の変異についてのあらゆる可能な組み合わせが、本開示の範囲内で企図される。
本明細書ではまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体も開示され、キメラＣＨ領域は、複数の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本明細書に開示される抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部もしくは全部と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部もしくは全部を含むキメラＣＨ領域を含み得る。ある特定の実施形態によれば、本明細書に開示される抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けに従った２２８～２３６位のアミノ酸残基）と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４のヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けに従った２１６～２２７位のアミノ酸残基）を含み得る。ある特定の実施形態によれば、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４の上部ヒンジに由来するアミノ酸残基、及びヒトＩｇＧ２の下部ヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。本明細書に記載されるようなキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある特定の実施形態では、抗体の治療上の特性または薬物動態学的特性に悪影響を及ぼすことなく、修飾Ｆｃエフェクター機能を示し得る。（例えば、開示が参照によりその全体が本出願に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０４号を参照のこと）。
抗体及びその抗原結合性断片の生物学的特性
一般に、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に結合し、その活性（例えば、酵素活性）を阻害することによって機能する。いくつかの実施形態では、阻害されるＴＭＰＲＳＳ６活性は、タンパク質分解活性である。
本明細書では、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質と結合する抗体及びその抗原結合性断片（すなわち、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片）が開示される。ある特定の実施形態では、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメインに結合する。ある特定の実施形態では、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメインに結合するが、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基には結合しない。本明細書ではまた、ＴＭＰＲＳＳ６のＬＤＬＲａドメイン２（例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（配列番号１２６）の残基４９２～５２６）内に位置する部位にて結合する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。いくつかの実施形態では、抗体及びその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６上の複数の部位と結合または相互作用し得る。例えば、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメイン内の部位と結合する抗体またはその抗原結合性断片はまた、ＴＭＰＲＳＳ６のＬＤＬＲａドメイン２内部に含まれる部位（例えば、二次部位）にて結合し得る。
本明細書ではさらに、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメイン（例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（配列番号１２６）の残基５７７～８１１）と結合する抗体及びその抗原結合性断片が開示され、その結合は、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基を直接的には閉塞しない。理論に拘束されることなく、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片の結合がＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基を直接的には閉塞しない場合、ＴＭＰＲＳＳ６は、それが基質、例えば、ヘモジュベリン（ＨＪＶ）と結合する能力を保持し得る。例えば、ある特定の実施形態では、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６に結合して、ＴＭＰＲＳＳ６を、ＴＭＰＲＳＳ６基質に結合することはできるがそれを切断することができない不活性型立体構造に維持する。ある特定の実施形態では、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６に結合して、ＴＭＰＲＳＳ６を、ヘモジュベリンに結合することはできるがそれを切断することができない不活性型立体構造に維持する。そのような抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック調節を媒介し得る。ある特定の実施形態では、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック阻害を媒介する。本明細書ではまた、ヒトＴＭＰＲＳＳ６タンパク質と結合し、かつ、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック阻害物質である、抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書ではまた、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメインに結合する抗体及びその抗原結合性断片も開示され、その結合は、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基を直接閉塞する。理論に拘束されることなく、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基の閉塞は、ＴＭＰＲＳＳ６に結合する基質（例えば、ヘモジュベリン）の立体障害をもたらし得る。
本明細書では、例えば、本明細書で実施例３に定義されるアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６タンパク質と（例えば、２５℃において、または３７℃において）約２５ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体及び抗体の抗原結合性断片が開示される。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、本明細書で実施例３に定義されるアッセイフォーマット、もしくは実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６と約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ピコモル（ｐＭ）未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、または約１５０ｐＭ未満のＫＤで結合する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６と約１２８ｐＭ～約２１．２ｎＭの範囲のＫＤで結合する。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例３に定義されるアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、カニクイザル（例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質と（例えば、２５℃において、または３７℃において）約３０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体及び抗体の抗原結合性断片も開示される。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、本明細書で実施例３に定義されるアッセイフォーマット、もしくは実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、カニクイザルＴＭＰＲＳＳ６と約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ピコモル（ｐＭ）未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、または約７５ｐＭ未満のＫＤで結合する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、サルＴＭＰＲＳＳ６と約６５ｐＭ～約２５．７ｎＭの範囲のＫＤで結合する。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例３に定義されるアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、マウスＴＭＰＲＳＳ６タンパク質と（例えば、２５℃において、または３７℃において）約７５０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体及び抗体の抗原結合性断片も開示される。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、本明細書で実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、マウスＴＭＰＲＳＳ６と約７５０ｎＭ未満、約７００ｎＭ未満、約６５０ｎＭ未満、約６００ｎＭ未満、約５５０ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約４５０ｎＭ未満、約４００ｎＭ未満、約３５０ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０００ピコモル（ｐＭ）未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、または約１００ｐＭ未満のＫＤで結合する。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、マウスＴＭＰＲＳＳ６と約８２．９ｐＭ～約７０３ｎＭの範囲のＫＤで結合する。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例５に記載されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、または約７００ｐＭ未満のＥＣ５０で結合する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に約６７０ｐＭ～約２．７ｎＭの範囲のＥＣ５０で結合する。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例５に記載されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、カニクイザルＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、カニクイザルＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に約９４０ｐＭ～約３．６ｎＭの範囲のＥＣ５０で結合する。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例５に記載されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、マウスＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．９ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、マウスＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に約８４０ｐＭ～約３５ｎＭの範囲のＥＣ５０で結合する。
一実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片が本明細書に開示され、抗体またはその断片は、以下の特徴のうちの１つ以上を示す：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である、（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約２１．２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する、（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、サルＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約２５．７ｎＭ未満のＫＤで結合する、（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、マウスＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約７０３ｎＭ未満のＫＤで結合する、（ｅ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約２．７ｎＭ未満である、（ｆ）サルＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約３．６ｎＭ未満である、（ｇ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約３５ｎＭ未満である、（ｈ）表１に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、及び／または、表１に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、を含む、及び／または（ｉ）表１に記載のＨＣＶＲの配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、及び表１に記載のＬＣＶＲの配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、を含む。
本明細書では、例えば、本明細書で実施例１０、１１、及び１４に示されるように、ＴＭＰＲＳＳ６に結合し、血清鉄濃度の減少を必要とする対象のそれをもたらす抗体及びその抗原結合性断片が開示される。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例１０、１１、及び１４に示されるように、ＴＭＰＲＳＳ６に結合し、血清ヘプシジン濃度の増加を必要とする対象のそれをもたらす抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書ではまた、ＴＭＰＲＳＳ６に結合し、成熟赤血球レベルの増加を必要とする対象のそれをもたらす抗体及びその抗原結合性断片も開示される。ある特定の実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ６に結合する抗体及びその抗原結合性断片は、脾臓及び／または骨髄における成熟赤血球レベルの増加を必要とする対象のそれをもたらす。本明細書ではまた、ＴＭＰＲＳＳ６に結合し、脾臓の網状赤血球レベルの減少を必要とする対象のそれをもたらす抗体及びその抗原結合性断片も開示される。理論に拘束されることなく、そのようなＴＭＰＲＳＳ６に結合する抗体及びその抗原結合性断片は、赤血球新生の改善を必要とする対象のそれをもたらす。ある特定の実施形態では、本開示の抗体及びその抗原結合性断片は、例えば、本明細書で実施例１２に示されるように、ＴＭＰＲＳＳ６に結合し、赤血球新生の改善を必要とする対象のそれをもたらし、脾臓における二次的赤血球新生の必要性を低減させる。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例１３に示されるように、ＴＭＰＲＳＳ６に結合し、ヘモグロビン濃度の増加を必要とする対象のそれをもたらす抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書では、例えば、本明細書で実施例１４に示されるように、ＴＭＰＲＳＳ６に結合し、トランスフェリン飽和レベルの減少を必要とする対象のそれをもたらす抗体及びその抗原結合性断片が開示される。
本明細書では、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に特異的に結合する単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片が開示され、抗体またはその抗原結合性断片は、それを必要とする対象に投与した場合に以下の特徴のうちの１つ以上を示す：（ａ）対象の血清鉄濃度を減少させる、（ｂ）対象の血清ヘプシジン濃度を増加させる、（ｃ）対象の成熟赤血球レベルを増加させる、（ｄ）対象の脾臓及び／または骨髄における成熟赤血球レベルを増加させる、（ｅ）対象のヘモグロビン濃度を増加させる、または（ｆ）対象のトランスフェリン飽和レベルを低下させる。
本明細書では、血清鉄濃度を減少させることを必要とする対象のそれをもたらすのに有用な抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片が開示される。本明細書ではまた、血清ヘプシジン濃度を増加させることを必要とする対象のそれをもたらすのに有用な抗体またはその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、成熟赤血球レベルを上昇させることを必要とする対象のそれをもたらすのに有用な抗体またはその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、脾臓及び／または骨髄における成熟赤血球レベルを上昇させることを必要とする対象のそれをもたらすのに有用な抗体またはその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、ヘモグロビン濃度を増加させることを必要とする対象のそれをもたらすのに有用な抗体またはその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、トランスフェリン飽和レベルを低下させることを必要とする対象のそれをもたらすのに有用な抗体またはその抗原結合性断片も開示される。
本明細書では、血清鉄濃度の増加と関連する少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用な抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片が開示される。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、血清ヘプシジン濃度の減少と関連する少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、成熟赤血球レベルの低下と関連する少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、脾臓及び／または骨髄における成熟赤血球レベルの上昇と関連する少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヘモグロビン濃度の減少と関連する少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、トランスフェリン飽和レベルの増加と関連する少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。
抗体及びその抗原結合性断片は、前述の特徴のうちの１つ以上、またはその任意の組み合わせを有し得る。本開示の抗体及びその抗原結合性断片の他の特徴は、本明細書の研究実施例を含む本開示の概説から当業者に明らかとなるであろう。
ＴＭＰＲＳＳ６の阻害
本明細書では、細胞表面ヘモジュベリン（ＨＪＶ）のプロテアーゼ依存性放出の存在下でヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害する抗体及びその抗原結合性断片、例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、例えば、本明細書で実施例６に記載されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、阻害パーセントが約９０％超（例えば、約８９．２％超、約８９．４％超、約８９．６％超、約８９．８％超、約９０％超、約９０．２％超、約９０．４％超、約９０．６％超、約９０．８％超）である抗体及びその抗原結合性断片が開示される。本明細書ではまた、細胞表面ヘモジュベリン（ＨＪＶ）のプロテアーゼ依存性放出の存在下でヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害する抗体及びその抗原結合性断片、例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、例えば、本明細書で実施例６に記載されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、約７０ｐＭ～約２００ｐＭ（例えば、約６９．３ｐＭ、約７０ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１１０ｐＭ、約１２０ｐＭ、約１３０ｐＭ、約１４０ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１６０ｐＭ、約１７０ｐＭ、約１８０ｐＭ、約１９０ｐＭ、約２０２ｐＭ）の範囲のＩＣ５０値を示す抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書ではまた、細胞表面ヘモジュベリン（ＨＪＶ）のプロテアーゼ依存性放出の存在下でマウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害する抗体及びその抗原結合性断片、例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、例えば、本明細書で実施例６に記載されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、阻害パーセントが約４２％～約９８．５％（例えば、約４１．６％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％）である抗体及びその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、細胞表面ヘモジュベリン（ＨＪＶ）のプロテアーゼ依存性放出の存在下でマウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害する抗体及びその抗原結合性断片、例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、例えば、本明細書で実施例６に記載されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、約８２．６ｐＭ～約２７４ｐＭ（例えば、約８１．８ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１１０ｐＭ、約１２０ｐＭ、約１３０ｐＭ、約１４０ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１６０ｐＭ、約１７０ｐＭ、約１８０ｐＭ、約１９０ｐＭ、約２００ｐＭ、約２１０ｐＭ、約２２０ｐＭ、約２３０ｐＭ、約２４０ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２６０ｐＭ、約２７６ｐＭ）の範囲のＩＣ５０値を示す抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＣＭバイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を約６５％～約９８％（例えば、約６４．５％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８．９％）の阻害パーセントで阻害する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＣＭバイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害して、約７１０ｐＭ～約１０ｎＭ超の範囲（例えば、約７０３ｐＭ、約７５０ｐＭ、約８００ｐＭ、約８５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約９５０ｐＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０．１ｎＭ）のＩＣ５０値を示す抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＣＭバイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、サルＴＭＰＲＳＳ６を約６６％～約９８％（例えば、約６５．５％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８．９％）の阻害パーセントで阻害する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＣＭバイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、サルＴＭＰＲＳＳ６を阻害して、約７４０ｐＭ～約５０ｎＭ超の範囲（例えば、約７３３ｐＭ、約７５０ｐＭ、約８００ｐＭ、約８５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約９５０ｐＭ、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０．５ｎＭ）のＩＣ５０値を示す抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＨＥＫ２９３バイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を（例えば、２５℃において、または３７℃において）約８６％～約９０％（例えば、約８５．２％、約８５％、約９１％）の阻害パーセントで阻害する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＨＥＫ２９３バイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を（例えば、２５℃において、または３７℃において）阻害して、約３６０ｐＭ～約５．８ｎＭの範囲（例えば、約３５７ｐＭ、約４００ｐＭ、約５００ｐＭ、約６００ｐＭ、約７００ｐＭ、約８００ｐＭ、約９００ｐＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ）のＩＣ５０値を示す抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＨＥＫ２９３バイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、サルＴＭＰＲＳＳ６を（例えば、２５℃において、または３７℃において）約８１％～約９４％（例えば、約８０．２％、約８５％、約９０％、約９４．９％）の阻害パーセントで阻害する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＨＥＫ２９３バイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、サルＴＭＰＲＳＳ６を（例えば、２５℃において、または３７℃において）阻害して、約６６０ｐＭ～約３０ｎＭの範囲（例えば、約６５４ｐＭ、約７００ｐＭ、約７５０ｐＭ、約８００ｐＭ、約８５０ｐＭ、約９００ｐＭ、約９５０ｐＭ、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０．３ｎＭ）のＩＣ５０値を示す抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＨＥＫ２９３バイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、マウスＴＭＰＲＳＳ６を（例えば、２５℃において、または３７℃において）約５８％～約１０３％（例えば、約５７．５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１０４％）の阻害パーセントで阻害する抗体及びその抗原結合性断片も開示される。本明細書ではまた、例えば、本明細書で実施例７に記載される「ＨＥＫ２９３バイオアッセイ」フォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定した場合に、マウスＴＭＰＲＳＳ６を（例えば、２５℃において、または３７℃において）阻害して、約１．５ｎＭ～約３５ｎＭの範囲（例えば、約２ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５．３ｎＭ）のＩＣ５０値を示す抗体及びその抗原結合性断片も開示される。
一実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合性断片が本明細書に開示され、抗体またはその断片は、以下の特徴のうちの１つ以上を示す：（ａ）約９０％超の阻害パーセントで、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害する、（ｂ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、約２００ｐＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｃ）約４２％超の阻害パーセントで、マウスＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害する、（ｄ）マウスＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、約２７４ｐＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｅ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約６５％超の阻害パーセントで阻害する、（ｆ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｇ）サルＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約６６％超の阻害パーセントで阻害する、（ｈ）サルＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約５０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｉ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約５８％超の阻害パーセントで阻害する、（ｊ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約３５ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、（ｋ）完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である、（ｌ）表１に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、及び／または、表１に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、を含む、及び／または（ｍ）表１に記載のＨＣＶＲの配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、及び表１に記載のＬＣＶＲの配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、を含む。
抗体及びその抗原結合性断片は、前述の特徴のうちの１つ以上、またはその任意の組み合わせを有し得る。本開示の抗体及びその抗原結合性断片の他の特徴は、本明細書の研究実施例を含む本開示の概説から当業者に明らかとなるであろう。
エピトープマッピング及び関連技術
本明細書では、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質分子の１つ以上の領域内に見出される１個以上のアミノ酸と相互作用する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が開示される。抗体が結合するエピトープは、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質分子の前述のドメインのうちいずれかの内部に位置する３個以上（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上）のアミノ酸の単一連続配列からなり得る（例えば、ドメイン内の線状エピトープ）。別法として、エピトープは、タンパク質分子の前述のドメインのいずれか、または両方の内部に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなり得る。一実施形態では、エピトープは、立体構造エピトープである。
抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１個以上のアミノ酸と相互作用する」か否かを決定するために当業者に知られる様々な手法を使用することができる。例示的手法としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載のような、ルーチンの交差ブロッキングアッセイが挙げられる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析結晶構造研究及びＮＭＲ分析が挙げられる。さらに、エピトープ除去（ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ）、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾等の方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６）。
抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析法によって検出される水素／重水素交換である。例えば、本開示の実施例８を参照のこと。大まかに言えば、水素／重水素交換法では、目的タンパク質を重水素で標識し、その後、重水素標識されたタンパク質に抗体を結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移すと、抗体複合体により保護されているアミノ酸内の交換性のプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換性のプロトンよりも低速で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体の界面の一部を形成するアミノ酸は重水素を保持し得、したがって、界面には含まれないアミノ酸と比較して相対的に高い質量を示し得る。抗体の解離の後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照のこと。
抗原構造に基づく抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＡＳＡＰ）としても知られる、修飾を利用したプロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＭＡＰ）は、同一抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、化学的または酵素により修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って分類する方法である（参照により全体が本明細書に明確に組み込まれるＵＳ２００４／０１０１９２０を参照のこと）。各カテゴリは、別のカテゴリによって表されるエピトープとは明確に異なるかまたはそれと部分的に重複する、いずれかの特有のエピトープを反映し得る。この技術は、遺伝学的に同一な抗体の迅速なフィルタリングを可能にし、特徴付けでは、遺伝学的に異なる抗体に焦点を当てることができる。ハイブリドーマスクリーニングに適用すると、ＭＡＰにより、所望の特性を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定が容易になり得る。ＭＡＰは、本明細書に開示される抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に分類するために使用され得る。
本開示には、表１に記載の特定の例示的抗体のうちのいずれかと同じエピトープまたはエピトープの一部に結合する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が含まれる。同様に、本明細書では、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質またはその断片への結合について、表１に記載の特定の例示的抗体のうちのいずれかと競合する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体も開示される。例えば、本開示には、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質への結合について、表１に記載の１つ以上の抗体と交差競合する抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が含まれる。
抗体が、参照抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と同じエピトープに結合するか否か、または結合についてそれと競合するか否かを、当該技術分野で知られるルーチンの方法を使用して決定することができる。例えば、被験抗体が、本明細書に開示される参照抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と同じエピトープに結合するか否かを決定するには、参照抗体を、飽和条件下でＴＭＰＲＳＳ６タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、被験抗体がＴＭＰＲＳＳ６タンパク質分子に結合する能力を評価する。被験抗体が、参照抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体との飽和結合の後にＴＭＰＲＳＳ６に結合できる場合、その被験抗体は、参照抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のエピトープとは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。一方、被験抗体が、参照抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体との飽和結合の後にＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に結合できない場合は、その被験抗体は、本明細書に開示される参照抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が結合しているエピトープと同じエピトープに結合し得る。
ある抗体が、結合について参照抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体と競合するか否かを決定するには、上記の結合方法を２方向で実施する、すなわち、第１の方向では、参照抗体を、飽和条件下でＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に結合させ、その後、ＴＭＰＲＳＳ６分子に対する被験抗体の結合の評価を行う。第２の方向では、被験抗体を、飽和条件下でＴＭＰＲＳＳ６分子に結合させ、その後、ＴＭＰＲＳＳ６分子に対する参照抗体の結合の評価を行う。いずれの方向においても、第１の（飽和）抗体のみがＴＭＰＲＳＳ６分子に結合することができる場合は、被験抗体と参照抗体がＴＭＰＲＳＳ６への結合について競合すると結論づけられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するわけではないが、重複または隣接するエピトープと結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
２つの抗体が各々、抗原に対する他方の結合を競合的に阻害する（遮断する）場合、それらは同じかまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰の１つの抗体は、競合結合アッセイで測定した場合に、他方の結合を少なくとも５０％、好ましくは、７５％、９０％、さらには９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照のこと）。別法として、一方の抗体の結合を低下させるかまたは排除する、抗原のアミノ酸変異の本質的にすべてが、他方の結合を低下させるかまたは排除する場合、２つの抗体はエピトープが同じである。一方の抗体の結合を低下させるかまたは排除する、アミノ酸変異のいくつかが、他方の結合を低下させるかまたは排除する場合、２つの抗体はエピトープが重複している。
その後で、追加のルーチンの実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を行って、観察された被験抗体の結合欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものなのか否か、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリーまたは当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的な抗体結合アッセイを使用して実施可能である。
免疫複合体
本開示は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患または障害（例えば、鉄過剰障害）を治療するための、治療用部分（「免疫複合体」）に結合させたヒト抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体を包含する。本明細書で使用される場合、「免疫複合体」という用語は、放射活性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質または治療剤に化学的または生物学的に連結された抗体を指す。抗体は、それがその標的と結合できる限りは、分子に沿った任意の位置で放射活性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドまたは治療剤に連結され得る。免疫複合体の例としては、抗体薬物複合体及び抗体－毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施形態では、薬剤は、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に対する第２の異なる抗体であり得る。抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体に結合され得る治療用部分の種類には、治療されるべき状態及び達成されるべき所望の治療効果が考慮される。免疫複合体を形成するための好適な物質の例は、当該技術分野で知られており、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと。
治療的投与及び製剤
本開示は、本明細書に開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片を含む治療用組成物を提供する。本開示による治療用組成物は、改善された導入、送達、忍容性等を提供するために製剤に組み込まれる好適な担体、賦形剤、及び他の薬剤と共に投与される。すべての薬剤師に知られる医薬品集であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに多数の適切な製剤を見出すことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）等）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型乳剤、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照のこと。
例えば、リポソーム内封入、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照のこと）等の様々な送達システムが既知であり、本明細書に開示される医薬組成物を投与するために使用することができる。導入の方法としては、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口による経路が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜の層（ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸管粘膜等）を介した吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与され得る。投与は、全身投与または局所投与であり得る。医薬組成物はまた、ベシクル、特にリポソームで送達され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３を参照のこと）。
本明細書に開示される抗体を送達するためのナノ粒子の使用もまた本明細書で企図される。抗体結合ナノ粒子は、治療用途にも診断用途にも使用され得る。抗体結合ナノ粒子ならびに調製方法及び使用方法は、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００９（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” ｉｎ Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４３９３８９，２４頁，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）によって詳述されており、参照により本明細書に組み込まれる。ナノ粒子を作製して、細胞を標的とする医薬組成物に含有される抗体に結合させてよい。薬物送達のためのナノ粒子もまた、例えば、ＵＳ８２５７７４０またはＵＳ８２４６９９５に記載されており、それぞれ、その全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の状況では、医薬組成物は、放出制御システムで送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用され得る。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、放出制御システムを組成物の標的に近接して配置することができ、そのため、ごく少量の全身用量で済む。
注射用の調製物には、静脈内、皮下、頭蓋内、腹腔内及び筋肉内への注射、点滴注入等のための剤形が含まれ得る。これらの注射用の調製物は、公知の方法によって調製され得る。
本開示の医薬組成物は、標準的な針及びシリンジを用いて皮下または静脈内に送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本明細書に開示されるような医薬組成物を送達する際に容易に適用される。そのようなペン型送達デバイスは、再使用可能または使い捨てのいずれも可能である。再使用可能ペン型送達デバイスは一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内のすべての医薬組成物が投与されるとカートリッジは空になり、空のカートリッジを廃棄して医薬組成物を含有する新たなカートリッジに交換することが容易に行える。その後、ペン型送達デバイスを再度使用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスには、医薬組成物が予め充填され、デバイス内のリザーバに保持されている。リザーバの医薬組成物が空になったら、デバイスごと廃棄する。
有利なことに、上記の経口使用または非経口使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するよう合わせた単位用量で剤形に調製される。そのような単位用量での剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐剤等が含まれる。
抗体の治療的使用
本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及びその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６と関連する疾患もしくは障害もしくは状態の治療及び／または予防に、及び／またはそのような疾患、障害もしくは状態と関連する少なくとも１つの症状を改善するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６と関連する疾患または障害または状態を有する対象に治療用量で投与され得る。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患または障害は、鉄過剰障害である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、先天性赤血球形成異常性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、アルファサラセミア、ベータサラセミア、輸血依存性溶血性貧血、骨髄異形成症候群、鎌状赤血球症、真性多血症、遺伝性ヘモクロマトーシス、原発性ヘモクロマトーシス、続発性ヘモクロマトーシス、重度の若年性ヘモクロマトーシス、または慢性肝疾患の、少なくとも１つの症状を治療または予防するのに有用である。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、ベータサラセミアの少なくとも１つの症状、合併症、または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、ベータサラセミアは、重症型ベータサラセミアまたは中等症型ベータサラセミアである。ベータサラセミアの症状としては、疲労、脱力、青白いまたは黄色がかった皮膚、顔の骨の変形、成長の遅さ、腹部膨満、暗色尿、及び他の合併症（例えば、治療による合併症）が挙げられる。中等度から重度のベータサラセミアの合併症の例としては、鉄過剰症が挙げられ、これは、疾患の結果、または頻回の輸血による結果のいずれでもあり得、また心臓、肝臓、及び内分泌系（例えば、全身のプロセスを調節するホルモン産生腺）等の臓器への損傷、及び感染リスクの上昇と関連する。重度ベータサラセミアの合併症には、骨変形、腫大した脾臓、成長速度の低下、及び心臓の問題も含めることができる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、ヘモクロマトーシスの少なくとも１つの症状、合併症、または徴候を治療または予防するのに有用である。ヘモクロマトーシスの症状としては、例えば、関節痛、腹痛、脱力、疲労、糖尿病、性的欲求、インポテンス、心不全、肝不全、青銅色または灰色の皮膚色、及び記憶の曖昧さが挙げられる。ヘモクロマトーシスによる合併症としては、例えば、肝臓の問題、膵臓の問題、心臓の問題、生殖の問題、及び皮膚色の変化が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、鉄過剰と関連する少なくとも１つの症状、合併症、または徴候を治療または予防するのに有用である。鉄過剰は、遺伝性の疾患もしくは障害の結果、あるいは頻回の輸血を受けている、高濃度の鉄補充を消費している、及び／または鉄を含む注射を受けている結果であり得る。鉄過剰をもたらす遺伝性疾患としては、遺伝性ヘモクロマトーシス、鎌状赤血球病及び鉄芽球性貧血等の様々な貧血、アフリカ鉄過剰症（例えば、罹患者が多量の鉄を含有する飲料を飲んでいる場合）、酵素欠損（例えば、ピルビン酸キナーゼの欠損、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼの欠損）、ならびにタンパク質輸送障害、例えば、無セルロプラスミン血症及び無トランスフェリン血症が挙げられる。
鉄過剰の症状としては、例えば、疲労（例えば、慢性疲労）、関節痛、腹痛、肝疾患（例えば、肝硬変、肝癌、真性糖尿病、心臓に関する問題（例えば、不規則な心拍リズム、心臓発作、心不全）、皮膚色の変化（例えば、青銅色、灰緑色）、期間の消失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｐｅｒｉｏｄ）、性への関心喪失、インポテンス、不妊症、性腺機能低下、骨に関する問題（例えば、変形性関節症、骨粗鬆症）、脱毛、肝臓または脾臓の腫大、甲状腺機能低下、下垂体機能低下、うつ病、副腎機能の問題、早期発症神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、若年性パーキンソン病、ハンチントン病、てんかん、多発性硬化症）、ならびに血糖、肝酵素、血清鉄、血清トランスフェリン、及び血清フェリチン等のマーカーの上昇が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、輸血を受けていること、例えば、頻回及び／または定期的輸血を受けていることに関連する、少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、失血をもたらす身体的外傷と関連する少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、失血をもたらす身体的外傷は、輸血による治療を必要とする。したがって、失血をもたらす身体的外傷と関連する症状または徴候は、輸血による身体的外傷の治療と関連する任意の症状または徴候（例えば、鉄過剰）であり得る。例えば、身体的外傷は、輸血を要する失血をもたらす外傷性事故（例えば、四肢の喪失、鈍的外力による外傷、深傷につながるもの）であり得る。ある特定の実施形態では、必要とされる輸血（複数可）は、大量の輸血である。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、骨髄異形成症候群の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の開示される抗体またはその抗原結合性断片は、輸血依存性溶血性貧血の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、ピルビン酸キナーゼ欠乏症による輸血依存性溶血性貧血（すなわち、溶血性貧血）または鉄芽球性輸血依存性溶血性貧血（すなわち、鉄芽球性貧血）の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、鎌状赤血球貧血の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、赤血球異形成貧血の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、骨髄性ポルフィリン症の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、慢性肝疾患の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。ある特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、アルコール関連慢性肝疾患、Ｃ型肝炎、または自己免疫性肝炎の少なくとも１つの症状または徴候を治療または予防するのに有用である。
また、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患または障害を患うリスクのある対象における、本開示の抗体またはその抗原結合性断片の予防的使用も開示される。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に開示される疾患、障害、または状態を患う対象を治療するための医薬組成物もしくは医薬品の調製のために使用される。別の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に開示される疾患、障害または状態を治療または改善するのに有用な、当業者に知られる任意の他の薬剤もしくは任意の他の治療法を用いた補助療法として使用される。
併用療法
併用療法には、本開示の抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つ以上、及び本開示の抗体またはその抗原結合性断片と有利に組み合わせることができる任意の追加の治療剤が含まれ得る。本開示の抗体または抗原結合性断片は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患または障害を治療するために使用される１つ以上の薬物または治療法と相乗的に組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、前記の疾患または状態の１つ以上の症状を改善するために第２の治療剤と組み合わせることができる。
疾患、障害または状態に応じて、本明細書に開示の抗体または抗原結合性断片を、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用してよい。例えば、疾患、障害または状態が鉄過剰と関連する場合、本明細書に開示の抗体または抗原結合性断片は、１つ以上の除鉄療法及び／または鉄過剰を治療するために現在用いられている治療法と組み合わせて使用され得る。
ある特定の実施形態では、鉄過剰を治療するために鉄キレート療法が用いられ得る。鉄キレート療法は、鉄キレート剤を用いた鉄の薬理学的除去である。鉄キレート剤の例としては、デフェロキサミン、デフェラシロクス、及びデフェリプロンが挙げられる。（例えば、Ｍｏｂａｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．（２０１６）１０（４）：２３９－２４７を参照のこと）。鉄キレート剤の他の例は当業者に知られており、例えば、Ｈａｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００９）１（９）：１６４３－７０に概説されているものがある。
鉄過剰を治療するために用いられ得る他の治療法としては、限定することなく、ビタミンＥ、小麦胚芽油、トコフェルソラン、インジカキサンチン、葉酸、胎児ヘモグロビン濃度を上昇させる薬剤（例えば、ヒドロキシ尿素、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び／またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、酪酸誘導体、アザシチジン、デシタビン（５－アザ２－デオキシシチジン）及びトリコスタチン－Ａ）、ヘミン、ポマリドミド、サリドマイド、サイトカイン（幹細胞因子（ＳＣＦ）及びトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦベータ）等））、潰瘍を管理するための薬剤、感染を管理するための薬剤（例えば、抗生物質及び抗ウイルス薬）、血栓症を治療するための薬剤、または貧血を治療するための薬剤（例えば、ルスパテルセプト）等の薬剤の使用が挙げられる。
鉄過剰を、幹細胞または骨髄移植、輸血、または瀉血により治療することもできる。
本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」という用語は、追加の治療的活性成分（複数可）が、本明細書に開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体または抗原結合性断片の投与の前か、同時か、または後で投与され得ることを意味する。「と組み合わせて」という用語は、には、本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体または抗原結合性断片のうちの１つ以上及び第２の治療剤の、連続投与または併用投与も含まれる。
追加の治療的活性成分（複数可）は、本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つ以上の投与の前に対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、または３０分より前に投与される場合、第１の成分は、第２の成分「の前」に投与されると見なされ得る。
他の実施形態では、追加の治療的活性成分（複数可）は、本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つ以上の投与の後に対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、またはそれより後に投与される場合、第１の成分は、第２の成分「の後」に投与されると見なされ得る。
他の実施形態では、追加の治療的活性成分（複数可）は、本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つ以上の投与と同時に対象に投与され得る。「同時」投与には、本開示の目的の場合、例えば、本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つ以上及び追加の治療的活性成分の投与を単一剤形で対象に行うか、または互いに約３０分以内に対象に投与される別々の剤形で行うことが含まれる。別々の剤形で投与される場合、各剤形が同じ経路により投与される（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体及び追加の治療的活性成分の両方が静脈内等に投与され得る）場合もあれば、別法として、各剤形が異なる経路（例えば、開示の抗体または抗原結合性断片が静脈内投与され得、追加の治療的活性成分は、経口投与され得る）により投与される場合もある。成分を、単一剤形、同じ経路による別々の剤形、または異なる経路による別々の剤形で投与することはいずれも、本開示の目的の場合、「同時投与」と見なされる。本開示の目的の場合、追加の治療的活性成分の投与「の前」、それ「と同時」、またはそれ「の後」（それらの用語は本明細書で先に定義されているとおり）の本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つ以上の投与は、追加の治療的活性成分「と組み合わせた」本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片の投与と見なされる。
本明細書ではまた、本明細書に開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体または抗原結合性断片が、本明細書の他の箇所に記載されている追加の治療的活性成分（複数可）のうちの１つ以上と合剤化される医薬組成物も開示される。
抗体の診断的使用
本開示の抗体及びその抗原結合性断片は、試料中のＴＭＰＲＳＳ６を、例えば診断を目的として、検出及び／または測定するために使用され得る。本明細書では、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患または障害を検出するためのアッセイにおける本開示の抗体及びその抗原結合性断片の使用が開示される。ＴＭＰＲＳＳ６の例示的診断アッセイは、例えば、患者から取得された試料を、検出可能な標識またはレポーター分子で標識された本明細書に開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体または抗原結合性断片と接触させることを含み得る。本開示の抗体及びその抗原結合性断片は、対象からの試料からＴＭＰＲＳＳ６を選択的に単離するための捕捉リガンドとしても使用され得る。別法として、未標識の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体または断片を、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて診断用途に使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉ等のラジオアイソトープ；フルオレセインイソチオシアナート、もしくはローダミン等の蛍光部分または化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼ等の酵素であり得る。試料中のＴＭＰＲＳＳ６を検出または測定するために使用することができる特定の例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
ＴＭＰＲＳＳ６診断アッセイに使用することができる試料には、正常状態または病的状態下の、検出可能な量のＴＭＰＲＳＳ６タンパク質またはその断片を含有する、患者から取得可能な任意の組織試料または体液試料が含まれる。一般に、ＴＭＰＲＳＳ６のベースライン、または標準の濃度を最初に確立するために、健常対象（例えば、ＴＭＰＲＳＳ６と関連する疾患に罹患していない患者）から取得される特定の試料中のＴＭＰＲＳＳ６タンパク質の濃度が測定され得る。その後、このＴＭＰＲＳＳ６のベースライン濃度が、ＴＭＰＲＳＳ６関連状態、またはそのような状態と関連する症状を有することが疑われる個人から取得された試料で測定されたＴＭＰＲＳＳ６の濃度に対して比較され得る。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはその抗原結合性断片は、追加の標識または部分を含有しない場合もあれば、それらがＮ末端またはＣ末端の標識または部分を含有する場合もある。一実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識（存在する場合）の位置により、ペプチドが結合している表面に対するペプチドの方向が決定され得る。例えば、表面がアビジンでコートされている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端が表面に対して遠位となるような方向にある。
以下の実施例は、本明細書に開示される方法及び組成物を作製及び使用する方法に関する完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されており、発明者らが自身の発明であると見なす範囲を限定することは意図していない。使用する数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するべく試みがなされたが、実験上の一部の誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段に示されていない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
実施例１：膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）に対するヒト抗体の作製
ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質に対するヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて作製した。マウスに、流体力学的ＤＮＡ送達によりヒトＴＭＰＲＳＳ６ ＤＮＡで免疫及び追加免疫を行った。
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を、参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる米国特許第７，５８２，２９８号に記載のように、骨髄腫細胞への融合を行わずに抗原陽性マウスのＢ細胞から直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを有する抗体）を得た。
上記の開示のように作製された例示的抗体を、ｍＡｂ３７７４６、ｍＡｂ３７７６３、ｍＡｂ３７７７７、ｍＡｂ３７６９９、ｍＡｂ４１４２２、ｍＡｂ４１４６５、及びｍＡｂ４１４５０と命名し、表１及び表２において確認されるＨＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＶＲ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列及び核酸配列を有する。
本実施例の方法に従って作製された例示的抗体の生物学的特性は以下の実施例に詳述されている。
実施例２：重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列
表１は、選択された例示的抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の、重鎖及び軽鎖の可変領域配列、ＣＤＲ配列、ならびに重鎖配列及び軽鎖配列のアミノ酸配列識別子を示す。
Figure 2024517931000001
選択された例示的抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の対応する核酸配列識別子を表２に記載する。
Figure 2024517931000002
抗体は、ヒトまたはマウスのＦｃアイソタイプを有し得る。当業者には理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換可能である（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換可能である等）が、いずれの場合も、表１に示す数字の識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、抗原に対する結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず同一であるかまたは実質的に類似することが予測される。
別段に示されていない限り、以下の実施例に使用される抗体はすべて、ヒンジ領域（Ｓ１０８Ｐ）においてセリンからプロリンへの変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含む。ヒンジ領域（Ｓ１０８Ｐ）においてセリンからプロリンへの変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含むｍＡｂ３７７４６、ｍＡｂ３７７６３、ｍＡｂ３７７７７、ｍＡｂ３７６９９、ｍＡｂ４１４２２、ｍＡｂ４１４６５、及びｍＡｂ４１４５０の例示的抗体をそれぞれ、ＲＥＧＮ７９６９、ＲＥＧＮ７９７１、ＲＥＧＮ７９７３、ＲＥＧＮ８０２３、ＲＥＧＮ７９７４、ＲＥＧＮ７９７７、及びＲＥＧＮ７９９９と命名した。表３は、これらの抗体の全長重鎖配列及び全長軽鎖配列のアミノ酸配列識別子を示す。
Figure 2024517931000003
実施例３：表面プラズモン共鳴によって決定されるＴＭＰＲＳＳ６に結合する抗体
実験手順
異なるＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合するＴＭＰＲＳＳ６の平衡解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００装置を使用したリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定した。結合研究はいずれも、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５ｖ／ｖ％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）のランニング緩衝液中で２５℃及び３７℃にて実施された。異なるＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂを捕捉するため、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップの表面を最初にヒトＦｃ特異的マウスｍＡｂとのアミンカップリングにより誘導体化した。Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現されるＳ７６２Ａ変異を有するヒトＴＭＰＲＳＳ６細胞外ドメイン（ｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ；ＲＥＧＮ５３３０と呼ぶ；配列番号１１７）、Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現されるＳ７５１Ａ変異を有するＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ＴＭＰＲＳＳ６細胞外ドメイン（ｍｆＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７５１Ａ－ＭＭＨ；ＲＥＧＮ５９７７と呼ぶ；配列番号１１９）、及びＣ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現されるＳ７６２Ａ変異を有するマウスＴＭＰＲＳＳ６細胞外ドメイン（ｍＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ；ＲＥＧＮ６８４８と呼ぶ；配列番号１１８）が含まれる実験では、いくつかのＴＭＰＲＳＳ６試薬タンパク質を使用した。ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中に調製した異なる濃度（１００ｎＭ～３．７ｎＭ、３倍段階希釈）のＴＭＰＲＳＳ６試薬タンパク質を、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂが捕捉された表面にわたり３０μＬ／分の流速で１５０秒間注射し、ＨＢＳ－ＥＴランニング緩衝液中でのそれらの解離を１０分間モニタリングした。各サイクルの終了時、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂが捕捉された表面を、２０ｍＭのリン酸の１２秒間注射を用いて再生した。
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）曲線フィッティングソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムをマストランスポートリミテーションのある１：１結合モデルにフィッティングすることによって会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）を、
Figure 2024517931000004
として、動態から計算した。
結果
各ＴＭＰＲＳＳ６試薬タンパク質に対する異なる選択ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂの結合動態パラメータを表４から表９に示す。S
Figure 2024517931000005
表４に示すように、選択されたＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂは、２５℃においてｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨに約１２８ｐＭ～約２．６３ｎＭの範囲のＫＤ値で結合した。
Figure 2024517931000006
表５に示すように、選択されたＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂは、３７℃においてｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨに約２．２４ｎＭ～約２１．２ｎＭの範囲のＫＤ値で結合した。
Figure 2024517931000007
表６に示すように、選択されたＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂは、２５℃においてｍｆＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７５１Ａ－ＭＭＨに約６５ｐＭ～約７．１８ｎＭの範囲のＫＤ値で結合した。
Figure 2024517931000008
表７に示すように、選択されたＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂは、３７℃においてｍｆＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７５１Ａ－ＭＭＨに約７５０ｐＭ～約２５．７ｎＭの範囲のＫＤ値で結合した。
Figure 2024517931000009
表８に示すように、７つの選択ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂのうち３つは、２５℃においてｍＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨに約８２．９ｐＭ～約２３３ｎＭの範囲のＫＤ値で結合した。
Figure 2024517931000010
表９に示すように、７つの選択ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂのうち３つは、３７℃においてｍＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨに約３１７ｐＭ～約７０３ｎＭの範囲のＫＤ値で結合した。
実施例４：選択された抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体間の交差競合
実験手順
ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）間の結合の競合を、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）でリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイを使用して決定した。実験全体が、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｖ／ｖ％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｗｅｅｎ－２０、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）緩衝液中で、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪させながら２５℃にて実施された。２つのｍＡｂが、ＴＭＰＲＳＳ６上の各自のエピトープへの結合について互いに競合することができるか否かを評価するため、Ｓ７６２Ａ変異及びＣ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現されるヒトＴＭＰＲＳＳ６の細胞外ドメイン（ｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ；ＲＥＧＮ５３３０と呼ぶ、配列番号１１７）で構成される組換えタンパク質を、最初に、抗ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体（ＨＩＳ１Ｋ）でコートされたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップを１０μｇ／ｍＬのｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨの溶液を含有するウェルに１分間浸すことによってバイオセンサーチップに捕捉させた。その後、ｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨを捕捉したバイオセンサーチップを、５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ－１の溶液を含有するウェルに４分間浸漬させることによって、第１のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂ（ｍＡｂ－１と呼ぶ）で飽和にした。その後、続いてバイオセンサーチップを、５０μｇ／ｍＬの第２のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂ（ｍＡｂ－２と呼ぶ）の溶液を含有するウェルに３分間浸した。実験のステップの合間に毎回、バイオセンサーチップをＨＢＳ－ＥＢＴ緩衝液中で洗浄した。実験過程全体を通してリアルタイムの結合応答をモニタリングし、各ステップ終了時の結合応答を記録した。
結果
ｍＡｂ－１と事前に複合体化されたｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨに結合しているｍＡｂ－２の応答を比較し、異なる選択ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂの競合的／非競合的な挙動が表１０に示すように決定された。
Figure 2024517931000011
実施例５：ＴＭＰＲＳＳ６を発現する細胞に結合する抗体
実験手順
本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による細胞結合を評価するために、ヒト（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１２８９００１）、カニクイザル／Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（ＮＣＢＩ参照配列ＸＭ＿００５５６７３８４）、及びマウス（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２７９０２．２）からの全長ＴＭＰＲＳＳ６を安定的に過剰発現するようＨＥＫ２９３細胞を操作し、これらの細胞株をそれぞれ、ＨＥＫ２９３／ｈＴＭＰＲＳＳ６、ＨＥＫ２９３／ｍｆＴＭＰＲＳＳ６、及びＨＥＫ２９３／ｍＴＭＰＲＳＳ６と呼ぶ。さらに、触媒的に不活性な全長ヒトＴＭＰＲＳＳ６を安定的に過剰発現するようＨＥＫ２９３細胞を操作し、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１２８９００１の７５３位のセリンをアラニンに変更した。この細胞株をＨＥＫ２９３／ｈＴＭＰＲＳＳ６（Ｓ７６２Ａ）と呼ぶ。マウスＴＭＰＲＳＳ６の高発現に分けられたマウスＴＭＰＲＳＳ６細胞株（ＨＥＫ２９３／ｍＴＭＰＲＳＳ６）を除いては、細胞株はいずれも分類されなかった。
細胞表面に発現された受容体への本開示の抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の結合を評価するため、アッセイ緩衝液（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋を含まない、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）で抗体（ＩｇＧサブクラスの対照を含む）を３７５ｎＭから２２．９ｐＭに段階希釈し（加えて、被験分子を含まない試料含有アッセイ緩衝液単独）、アッセイ緩衝液中で０．５×１０６細胞／ウェルで４℃にて３０分間インキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、細胞を、４．０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）－６４７結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，抗ヒト＃１０９－６０７－００３）で４℃にて３０分間染色した。ＢＤ ＣｙｔｏＦｉｘ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、＃５５４６５５）を使用して細胞を固定し、ＩＱｕｅ（登録商標）またはＩＱｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（登録商標））いずれかで分析した。未染色及び二次抗体単独の対照もまた全細胞株について試験した。ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（登録商標））ソフトウェアを使用して結果を分析し、生存細胞の蛍光の幾何平均を決定し、試験条件の幾何平均値を、対応する未染色細胞の幾何平均値で正規化することによって結合率を計算した。
結果
表１１は、ｈＴＭＰＲＳＳ６、ｈＴＭＰＲＳＳ６（Ｓ７６２Ａ）、ｍｆＴＭＰＲＳＳ６、及びｍＴＭＰＲＳＳ６を発現するよう操作された細胞に対する選択された抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の結合を示す。
Figure 2024517931000012
表１１に示すように、選択された抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ＨＥＫ２９３細胞に発現された、ヒト、カニクイザル、及びヒトＳ７６２ＡのＴＭＰＲＳＳ６に対する結合を示した。最大結合倍率及びＥＣ５０値の範囲は、ｈＴＭＰＲＳＳ６発現細胞では約４７～６９倍及び約６７０ｐＭ～２．７ｎＭ、ｈＴＭＰＲＳＳ６（Ｓ７６２Ａ）発現細胞では約１４５～４２０倍及び約１．６～２．３ｎＭ、ならびにｍｆＴＭＰＲＳＳ６発現細胞では約５０～９１倍及び約９４０ｐＭ～３．６ｎＭであった。ｍＴＭＰＲＳＳ６発現細胞に結合した４つのｍＡｂでは、最大結合倍率及びＥＣ５０値の範囲は約４２～４２１倍及び約８４０ｐＭ～３５ｎＭであった。選択された抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体は、ＨＥＫ２９３親細胞への結合を約３～５倍の結合率で示した。ＩｇＧサブクラス対照抗体（ｈＩｇＧサブクラス対照）試料及び二次抗体単独（抗ヒト２”単独）試料は、約１～３倍の範囲の結合率を示した。
実施例６：ヒトヘモジュベリン（ＨＪＶ）の検出
実験手順
抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がＴＭＰＲＳＳ６を阻害する能力をさらに特徴付けるために、２つの異なるリードアウトを設けた細胞ベースのバイオアッセイを用いた。ＴＭＰＲＳＳ６は、細胞表面ヘモジュベリン（ＨＪＶ）を切断することによって、ヘプシジン発現の負の調節因子として作用する。例えば、Ｒａｕｓａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２０１５）１９：８７９－８８８、及びＬｅｅ Ｐ．，Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．（２００９）１２２：８７－９６を参照のこと。
アッセイでは、フローサイトメトリーを使用して細胞表面ヒトヘモジュベリン（ｈＨＪＶ）を測定し、ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、全長ヒトＨＪＶ及びヒトまたはマウスのいずれかのＴＭＰＲＳＳ６を発現しているＨＥＫ２９３細胞の可溶性ｈＨＪＶレベルを定量化した。ｈＨＪＶ発現ＨＥＫ２９３細胞（ｈＨＪＶ；アミノ酸１～４２６、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿９９８８１８．１）を親細胞株として使用して共発現バイオアッセイ細胞株を操作した。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００単位のペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン及び２９２μｇ／ｍｌのＬ－グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を用いてヒトＨＪＶを安定発現する親細胞株を選択した。その後、これらのｈＨＪＶ発現ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ）を、ＦＡＣＳ（抗ヘモジュベリン抗体；Ａｂｃａｍ ａｂ５４４３１、ロバ抗マウスＩｇＧ ＡＦ６４７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ－３１５７１）によってｈＨＪＶの細胞表面高発現について濃縮した。ＴＭＰＲＳＳ６を発現させるため、ＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶに、Ｃ末端の三重ｍｙｃタグを含む、全長ヒトＴＭＰＲＳＳ６（ｈＴＭＰＲＳＳ６；アミノ酸１～８１１、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１５３６０９．３）または全長マウスＴＭＰＲＳＳ６（ｍＴＭＰＲＳＳ６；アミノ酸１～８１１、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２７９０２．２）のいずれかについてのレンチウイルス上清で形質導入した。得られた細胞株をそれぞれ、ＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ／３ｘＭｙｃ．ｈＴＭＰＲＳＳ６及びＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ／３ｘＭｙｃ．ｍＴＭＰＲＳＳ６とした）。レンチウイルスで形質導入された細胞をさらに、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８及び１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢで２週間選択し、抗Ｍｙｃ－ＡＦ６４７抗体を使用して高発現ＴＭＰＲＳＳ６集団について分類した。
ＥＬＩＳＡでは、アッセイ細胞株を平底９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルで播種した。本開示の抗体及び対照を（０ｎＭから２００ｎＭに）段階希釈した後、１００μＬの最終体積を含有する各ウェルに加え、その後、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、上清を回収し、Ｈｕｍａｎ ＲＧＭ－Ｃ／Ｈｅｍｏｊｕｖｅｌｉｎ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ３７２０－０５）を製造者の操作手順に従って使用し、ＥＬＩＳＡを実施した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して光学濃度を取得し、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で結果を分析してＩＣ５０値を得た。以下の方程式：
Figure 2024517931000013
で阻害パーセンテージを計算した。
この方程式では、「可溶性ＨＪＶベースライン」は、抗体またはプロテアーゼ阻害剤の処理を行わないＨＪＶ－ＴＭＰＲＳＳ６過剰発現細胞の上清からの可溶性ＨＪＶの量を示す。「可溶性ＨＪＶ抗体」は、最大濃度の抗体で処理したアッセイ試料からの可溶性ＨＪＶの量を示し、「可溶性ＨＪＶプロテアーゼ阻害剤」は、セリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ：１０２３６６２４００１）で処理した試料からの可溶性ＨＪＶの量を示す。
ＦＡＣＳ解析では、ＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ／３ｘＭｙｃ．ｈＴＭＰＲＳＳ６細胞またはＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ／３ｘＭｙｃ．ｍＴＭＰＲＳＳ６細胞を５０ｎＭの抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体で一晩処理した。翌日、表面染色のために細胞を回収した。アッセイ細胞株で細胞表面ｈＨＪＶを染色するため、細胞をＦｃＲブロッカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０－０５９－９０１）でブロッキングし、抗ヘモジュベリン抗体で染色し（Ａｂｃａｍ ａｂ５４４３１、１：４００、氷上、１時間）、その後、ロバ抗マウスＩｇＧ ＡＦ６４７抗体とのインキュベーションを行った（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ－３１５７１、１：２０００、氷中、４０分）。染色された細胞をＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ）を使用して測定した。
ＥＬＩＳＡアッセイでは、セリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニン（２μｇ／ｍＬ）、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、カタログ：Ｐ－１８６０、１：２００）を、ＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ／３ｘＭｙｃ．ＴＭＰＲＳＳ６細胞におけるプロテアーゼ活性を遮断するための対照として含めた。ＦＡＣＳでは、アプロチニン（２μｇ／ｍＬ）を、ＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ／３ｘＭｙｃ．ＴＭＰＲＳＳ６細胞におけるプロテアーゼ活性を遮断するための対照として含めた。
結果
表１２は、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による、細胞表面からのＨＪＶのプロテアーゼ依存性放出の阻害を示す。
Figure 2024517931000014
表１２に示すように、選択されたＴＭＰＲＳＳ６抗体はいずれも、ヒトＴＭＰＲＳＳ６発現細胞において、細胞表面からのＨＪＶのプロテアーゼ依存性放出について９０％超の阻害、及び約７０～約２００ｐＭの範囲のＩＣ５０値を示した。２つの抗体、ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３は、マウスＴＭＰＲＳＳ６発現細胞において阻害作用を示し、それぞれ、約９８．５％及び約４２％のマウスＴＭＰＲＳＳ６プロテアーゼ活性阻害ならびに約８２．６ｐＭ及び約２７４ｐＭのＩＣ５０値を示した。
表１３は、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体による細胞表面ＨＪＶ発現の阻害を示す。
Figure 2024517931000015
表１３に示すように、選択されたＴＭＰＲＳＳ６抗体はいずれも、ＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ／３ｘＭｙｃ．ｈＴＭＰＲＳＳ６細胞の表面からのＨＪＶの切断を妨げた。ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３はまた、ＨＥＫ２９３．ｈＨＪＶ／３ｘＭｙｃ．ｍＴＭＰＲＳＳ６細胞の表面からのＨＪＶの切断も妨げた。
実施例７：ＴＭＰＲＳＳ６酵素活性の阻害
実験手順
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体のＴＭＰＲＳＳ６酵素活性の阻害を評価するために、２つのバイオアッセイを確立した。いずれのバイオアッセイにおいても、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体またはＩｇＧサブクラス対照をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋）で５００ｎＭから１２２．１ｐＭに段階希釈した（加えて、被験分子を含まない試料含有アッセイ緩衝液単独）。
第１のバイオアッセイ（「ＣＭバイオアッセイ」）は、条件培地（ＣＭ）として産生されたＴＭＰＲＳＳ６の細胞外ドメインを用いて実施された。ＣＭは、いずれもＮ末端の８×ヒスチジンに融合されている、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の細胞外ドメイン（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１２８９００１のアミノ酸６８～８０２）またはカニクイザルＴＭＰＲＳＳ６（ＮＣＢＩ参照配列ＸＭ＿００５５６７３８４のアミノ酸６６～８００、Ｖ６７３Ｍ）を産生し、分泌するよう、ＣＨＯ細胞を操作することによって作製された。ＣＭバイオアッセイでは、抗体を、０．２％ ｈＴＭＰＲＳＳ６ ＣＭまたは０．７５％ ｍｆＴＭＰＲＳＳ６ ＣＭのいずれかと共に２５℃で３０分間インキュベートし、ＣＭパーセントはすべてｖ／ｖ％として表される。
第２のバイオアッセイ（「ＨＥＫ２９３バイオアッセイ」）は、ヒト、カニクイザル、及びマウスからのＴＭＰＲＳＳ６をそれぞれ安定的に発現する、ＨＥＫ２９３／ｈＴＭＰＲＳＳ６細胞株、ＨＥＫ２９３／ｍｆＴＭＰＲＳＳ６細胞株、及びＨＥＫ２９３／ｍＴＭＰＲＳＳ６細胞株を用いて実施された。これらの細胞株の調製に関する詳細は実施例５に見出すことができる。ＨＥＫ２９３バイオアッセイでは、細胞を、９６ウェルプレートのＤＭＥＭ高グルコース＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ－グルタミン（完全ＤＭＥＭ）中に、１０，０００細胞／ウェル（３０分間のプレインキュベーション）及び２０，０００細胞／ウェル（一晩のプレインキュベーション）で播種し、５％ＣＯ２で３７℃にてインキュベートした。３０分のプレインキュベーション条件を用いたＨＥＫ２９３細胞バイオアッセイの場合、細胞播種の翌日、培地を細胞から除去し、すべての細胞をアッセイ緩衝液中で１回洗浄し、細胞に抗体を加えて、２５℃で３０分間インキュベートした。一晩のプレインキュベーション条件の場合、細胞播種の翌日、まだ完全ＤＭＥＭ中にある細胞に洗浄は行わずに抗体を加え、５％ＣＯ２で３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、培地（抗体を含む）を細胞から除去し、すべての細胞をアッセイ緩衝液中で１回洗浄した。
全アッセイについて、抗体／ＴＭＰＲＳＳ６のインキュベーション及びプレート洗浄の終了時、アッセイ緩衝液に溶解させた１５０ｕＭの蛍光ＴＭＰＲＳＳ６ペプチド基質（Ｂｏｃ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、Ｅｎｚｏ ＢＭＬ－Ｐ２３７）を、抗体処理した細胞またはＣＭ／抗体混合物に加え、５％ＣＯ２で３７℃にて１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で３８０ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長を用いて蛍光を測定した。結果を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）で非線形回帰（４－パラメータロジスティック）を使用して分析し、ＩＣ５０値を得た。以下の方程式：
Figure 2024517931000016
を使用して、ＲＦＵ（相対蛍光単位）値を用いて阻害パーセンテージを計算した。
この方程式では、「ＲＦＵベースライン」は、抗体を含まない、ある特定の濃度のＴＭＰＲＳＳ６ ＣＭまたはある特定の数のＨＥＫ２９３／ＴＭＰＲＳＳ６細胞のいずれかからの蛍光値であり、「ＲＦＵ阻害」は、前述の濃度のＴＭＰＲＳＳ６ ＣＭまたはある特定の数のＨＥＫ２９３／ＴＭＰＲＳＳ６細胞を用いた、特定の抗体の最大濃度に関する蛍光値であり、「ＲＬＵバックグラウンド」は、ＴＭＰＲＳＳ６ ＣＭまたはＨＥＫ２９３／ＴＭＰＲＳＳ６細胞を含まない場合の蛍光値である。
結果
７つの抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体を選択し、それらがＴＭＰＲＳＳ６ ＣＭ及びＨＥＫ２９３／ＴＭＰＲＳＳ６細胞の酵素活性を阻害する能力について試験した。表１４から表１６は、これらの実験結果を示す。
Figure 2024517931000017
表１４に示すように、選択された抗体のすべてが、約６５％～約９８％の範囲の約０．２％ ｈＴＭＰＲＳＳ６ ＣＭの阻害を、約７１０ｐＭ～約１０ｎＭ超の範囲のＩＣ５０値で示した。また、本明細書に開示される抗体のすべてが、約６６％～約９８％の範囲の約０．７５％ ｍｆＴＭＰＲＳＳ６ ＣＭの阻害を、約７４０ｐＭ～約５０ｎＭ超の範囲のＩＣ５０値で示した。
Figure 2024517931000018
表１５に示すように、抗体を１０，０００ＨＥＫ２９３／ＴＭＰＲＳＳ６細胞と共に３０分間プレインキュベートした場合、選択された抗体のすべてが、約８６％～約９０％の範囲のＨＥＫ２９３／ｈＴＭＰＲＳＳ６細胞阻害を、約３６０ｐＭ～約５．８ｎＭの範囲のＩＣ５０値で示した。また、選択された抗体のすべてが、約８１％～約９４％の範囲のＨＥＫ２９３／ｍｆＴＭＰＲＳＳ６細胞阻害を、約６６０ｐＭ～約３０ｎＭの範囲のＩＣ５０値で示した。選択された抗体のうち３つ（ＲＥＧＮ７９７７、ＲＥＧＮ７９９９、ＲＥＧＮ８０２３）は、約５８％～約８８％の範囲のＨＥＫ２９３／ｍＴＭＰＲＳＳ６細胞阻害を示し、これらの阻害抗体のＩＣ５０値は約１．５ｎＭ～約３５ｎＭの範囲であった。
Figure 2024517931000019
表１６に示すように、抗体を２０，０００ＨＥＫ２９３／ＴＭＰＲＳＳ６細胞と共に一晩プレインキュベートした場合、選択された抗体のすべてが、約８６％～約９０％の範囲のＨＥＫ２９３／ｈＴＭＰＲＳＳ６細胞阻害を、約１．１ｎＭ～約２．６ｎＭの範囲のＩＣ５０値で示した。また、選択された抗体のすべてが、約３１％～約９１％の範囲のＨＥＫ２９３／ｍｆＴＭＰＲＳＳ６細胞阻害を、約２．８ｎＭ～約１０ｎＭ超の範囲のＩＣ５０値で示した。選択された抗体のうち３つ（ＲＥＧＮ７９７７、ＲＥＧＮ７９９９、ＲＥＧＮ８０２３）は、約９７％～約１０３％の範囲のＨＥＫ２９３／ｍＴＭＰＲＳＳ６細胞阻害を示し、これらの阻害抗体のＩＣ５０値は約１．２ｎＭ～約１４ｎＭの範囲であった。ＩｇＧサブクラス対照抗体は、試験したフォーマットのいずれにおいても測定可能なＴＭＰＲＳＳ６阻害を示さなかった。
実施例８：ＨＤＸ－ＭＳによるヒトＴＭＰＲＳＳ６に対するエピトープマッピング
実験手順
本開示のＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体サブセットであるＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３と相互作用する、ヒトＴＭＰＲＳＳ６のアミノ酸残基を決定するため、水素－重水素交換質量分析法（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施した。ＨＤＸ－ＭＳ法の概要は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）２６７（２）：２５２－２５９、及びＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）７３：２５６Ａ－２６５Ａに記載されている。
ＨＤＸ－ＭＳ実験はカスタマイズされたプラットフォームで実施され、重水素標識及びクエンチのためのカスタムＨＤＸ自動化システム、試料の消化及び搭載のためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ、分析用グラジエントのための別のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ、及びペプチド同定及び質量測定のためのＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計で構成された。
Ｄ２Ｏ標識溶液をｐＤ７．０のＤ２ＯにＰＢＳ緩衝液として調製した（１０ｍＭのリン酸緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、及び３ｍＭ ＫＣｌ、２５℃でｐＨ７．４に相当）。重水素標識では、ＲＥＧＮ７９９９またはＲＥＧＮ８０２３のいずれかと予め混合した、Ｓ７６２Ａ変異及びＣ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現された組換えヒトＴＭＰＲＳＳ６細胞外ドメイン（ｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ；ＲＥＧＮ５３３０と呼ぶ；配列番号１１７）を１０μＬにて、９０μＬのＤ２Ｏ標識溶液と共に２０℃で様々な時点まで二連でインキュベートした（非重水素化対照は０分とし、重水素標識は５分間または１０分間）。９０μＬのクエンチ緩衝液（０．５Ｍ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、４Ｍの尿素、及び０．５％のギ酸）を各試料に加えて重水素化反応をクエンチし、２０℃で９０秒のインキュベーションに供した。その後、クエンチした試料を、オンラインのペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化のためにＬＣ系に注入した。消化されたペプチドをＣ１８カラム（２．１ｍｍ×５ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）により捕捉し、別のＣ１８カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）により、０％から９０％のＢに２０分のグラジエントで－５℃にて分離した（移動相Ａ：０．５％のギ酸及び４．５％のアセトニトリルを溶解させた水溶液、移動相Ｂ：０．５％のギ酸含有アセトニトリル溶液）。溶出したペプチドを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析法によってＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳモードで分析した。
非重水素化ｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ試料からのＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）を使用してヒトＴＭＰＲＳＳ６タンパク質、ペプシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、及びそれらの逆配列のアミノ酸配列が含まれているデータベースに対して検索した。検索パラメータは、一般的な可変の修飾として非特異的酵素消化及びヒトグリコシル化を使用するデフォルトのとおりに設定した。その後、同定されたペプチドの一覧をＨＤＥｘａｍｉｎｅｒソフトウェア３．１（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）にインポートして、重水素の取り込み（Ｄ取り込み）及び重水素取り込みパーセンテージ（Ｄ％）を全重水素化試料について計算した。以下の式：
Figure 2024517931000020
を使用してＤ％を計算した。
結果
ｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ単独試料及びＲＥＧＮ７９９９との複合体のｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ試料の両方から、ヒトＴＭＰＲＳＳ６からの合計２９４のペプチドが同定され、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の約７９．２％の配列範囲を占めた。重水素取り込みのパーセンテージにおいて５％以上の減少を示したペプチドは、顕著に保護されていると定義された（ΔＤ％＜－５％）。
表１７は、ｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ単独と比較してｈＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ－ＲＥＧＮ７９９９複合体の形成時に顕著な保護を有するヒトＴＭＰＲＳＳ６ペプチドを示す。ヒトＴＭＰＲＳＳ６上のアミノ酸６９３～７０３ ＳＨＦＦＥＰＧＬＨＣＷ（配列番号１２０）及び７８０～８０５ ＬＶＳＷＧＬＧＣＧＲＰＮＹＦＧＶＹＴＲＩＴＧＶＩＳＷ（配列番号１２１）に対応するペプチドは、ＲＥＧＮ７９９９によって顕著に保護された。
Figure 2024517931000021
ｈＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ単独試料及びＲＥＧＮ８０２３との複合体のｈＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ試料の両方から、ヒトＴＭＰＲＳＳ６からの合計３０２のペプチドが同定され、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の約７９．６％の配列範囲を占めた。重水素取り込みのパーセンテージにおいて５％以上の減少を示したペプチドは、顕著に保護されていると定義された（ΔＤ％＜－５％）。
表１８は、ｈＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ単独と比較してｈＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ－ＲＥＧＮ８０２３複合体の形成時に顕著な保護を有するヒトＴＭＰＲＳＳ６ペプチドを示す。ヒトＴＭＰＲＳＳ６上のアミノ酸１２５～１３３ ＬＩＴＳＴＲＬＧＴ（配列番号１２２）、５８６～５９４ ＧＥＷＰＷＱＡＳＬ（配列番号１２３）、６２６～６５０ ＳＴＶＬＷＴＶＦＬＧＫＶＷＱＮＳＲＷＰＧＥＶＳＦＫ（配列番号１２４）、及び７０４～７２４ ＩＴＧＷＧＡＬＲＥＧＧＰＩＳＮＡＬＱＫＶＤ（配列番号１２５）に対応するペプチドは、ＲＥＧＮ８０２３によって顕著に保護された。
Figure 2024517931000022
Figure 2024517931000023
実施例９：ＣｒｙｏＥＭによるヒトＴＭＰＲＳＳ６に対するエピトープマッピング
実験手順
選択されたＴＭＰＲＳＳ６抗体と関連するエピトープをさらに特徴付けるため、クライオ電子顕微鏡（ＣｒｙｏＥＭ）を使用した。
Ｆａｂ断片の調製のために、Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を製造者による標準の操作手順に従って使用し、ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３のＩｇＧをＦ（ａｂ’）２とＦｃ断片とに切断した。２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＦ（ａｂ’）２をＦａｂに還元し、その後、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－Ｆｃ（ｍｓ）アフィニティー樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＦｃ断片の除去を行った。Ｆａｂ断片を、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５クロマトグラフィー系（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １５／３００ ＧＬ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内に注入することによってさらに精製した。ランニング緩衝液は、２５ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有した。その後の複合体調製に使用するために、ピーク画分をプールし、３０ｋＤａのカットオフ遠心式フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）で濃縮した。
この実験に使用されるヒトＴＭＰＲＳＳ６タンパク質は、Ｃ末端のＭｙｃ－Ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグに融合されたヒトＴＭＰＲＳＳ６の細胞外ドメイン残基Ｇ７７－Ｔ８１１を包含し、タンパク質を触媒的に不活性にする変異を触媒ドメインに（Ｓ７６２Ａ）含有する（ヒトＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨと呼ぶ）。複合体形成では、２００μｇの精製ヒトＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨを、２５０μｇずつのＲＥＧＮ７９９９ Ｆａｂ及びＲＥＧＮ８０２３ Ｆａｂと混合し、その後、氷上で約３０分間インキュベートした。混合物を、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５クロマトグラフィー系（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続されたＳＥＣカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １５／３００ ＧＬ、ＧＥ）に注入した。ＳＥＣランニング緩衝液は、２５ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有した。ヒトＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ－－ＲＥＧＮ７９９９ Ｆａｂ－ＲＥＧＮ８０２３ Ｆａｂ複合体に対応する単一単分散ピークからの画分をプールし、３０ｋＤａのカットオフ遠心式フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）で３．５ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定）。
ＣｒｙｏＥＭ試料の調製及びデータ収集を以下のとおり実施した。精製したばかりのヒトＴＭＰＲＳＳ６＿Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ－－ＲＥＧＮ７９９９ Ｆａｂ－ＲＥＧＮ８０２３ Ｆａｂ複合体を、ｃｒｙｏＥＭ用グリッド調製のために２５ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液で２倍希釈して１．７５ｍｇ／ｍＬとした。ｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マルトピラノシド（Ａｎａｔｒａｃｅ）を加えて最終濃度を約６０μＭとしてから直ちにＵｌｔｒＡｕｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３、３００メッシュグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）上に３．５μＬの混合物をピペット操作した。過剰の液体は濾紙を用いて吸い取り、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してグリッドを、液体窒素で冷却された液体エタン中に急速凍結した（４℃、湿度１００％で操作）。その後、グリッドを、Ｋ３カメラ（Ｇａｔａｎ）を備えたＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ Ｇ３ｉ顕微鏡（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に挿入した。３，５８０本のムービーを公称倍率の８１，０００倍（０．８５Åピクセルサイズ）でカウントモードで収集した。各ムービーには、２秒の露光に対し４６の線量が含まれ、Å２あたりの総取得線量は約４０電子であった。
ＣｒｙｏＥＭのデータ処理及びマップ生成を以下のとおり実施した。最初にＣｒｙｏｓｐａｒｃ ｖ２．１４．２を使用してＣｒｙｏＥＭデータを処理した。Ｐａｔｃｈモーションコレクションによりムービーのモーションを補正し、ＣＴＦパラメータをＰａｔｃｈ ＣＴＦ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎによって推定した。最初に粒子をＢｌｏｂピッカーを使用してピックし、テンプレートピッキングのための２Ｄクラス平均を生成した。Ｔｅｍｐｌａｔｅピッカーを使用して９２７，８３５個の粒子をピックした。２Ｄ分類、初期再構成、及び不均一の精密化（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）の後、ＲＥＧＮ５３３０－－ＲＥＧＮ７９９９ Ｆａｂ－ＲＥＧＮ８０２３ Ｆａｂ複合体に対応する９４，０３６個の粒子を同定した。これらの粒子を、不均一な精密化を使用して３．４Åの分解能で再構成した。得られたマップを、Ｒｅｌｉｏｎにおける３Ｄ分類のための初期参照モデルとして使用した。モデル構築に使用されたマップを、Ｒｅｌｉｏｎバージョン３．１単一粒子処理パイプライン（ｓｉｎｇｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）を使用して計算した。ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２を使用してムービーにモーション補正を行い、ｇｃｔｆを使用してＣＴＦパラメータを推定した。４Åより良好な推定ＣＴＦ分解能を有する、ということに基づいて、さらなる処理のために３，４１１枚の並列化された顕微鏡画像を選択した。２Ｄテンプレートに基づく自動ピッキングを使用して、顕微鏡画像から１，４４５，５３４個の粒子をピックし、３回ビニングした粒子画像（ピクセルあたり２．５５Å）として抽出した。３回の２Ｄ分類を行って、偽陽性複合体及び切断されているかまたは不完全な複合体を除去し、１，０３４，４９４個の粒子が得られた。これらの粒子を、ＣｒｙｏＳｐａｒｃで計算された初期参照モデルを使用して、８つのクラスを要求する３Ｄ分類に供した。ヒトＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ－－ＲＥＧＮ７９９９ Ｆａｂ－ＲＥＧＮ８０２３ Ｆａｂ複合体に対応する２つの最良クラスからの２７０，０２１個の粒子を、ビニングされていない粒子画像として再抽出し、３Ｄ精密化に供し、これにより、３．４Å分解能のマップが作成され、Ｆａｂ及び触媒ドメインは十分に解像されたが、タンパク質の残りのＮ末端ドメインは解像が不良であった。Ｎ末端ドメインをより良好に解像するため、アラインメントは行わず、Ｆａｂ及び触媒ドメインを除外するソフトマスクを適用して、集中的分類（ｆｏｃｕｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ）を行った。１４６，０３５個の粒子を含有する単一のクラスが、Ｎ末端ドメインの密度改善を有するとして同定された。これらの粒子の精密化により、３．６Åの分解能のマップが得られた。２回のＣｔｆＲｅｆｉｎｅ及びベイジアンポリッシング（Ｂａｙｅｓｉａｎ ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）の後、さらに３回の集中的３Ｄ分類（ｆｏｃｕｓｅｄ ３Ｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を、アラインメントを行わずに実施し、ＣＵＢドメイン及びＳＥＡドメイン周辺のソフトマスクを適用して、１０５，１４２個の粒子の最終セットが得られた。その後、これらの粒子を、Ｎ末端ドメインの特徴が改善された３．３Åの分解能（ＦＳＣ＝０．１４３）のマップに精密化した。モデル構築では、マップを、Ｒｅｌｉｏｎで計算されたその局所分解能の値でフィルターにかけ、－７６Å２のＢ因子（Ｂ ｆａｃｔｏｒ）までシャープニングを行った。
モデル構築及び精密化を以下のとおり実施した。Ｃｏｏｔバージョン０．８．９を使用して手動によるモデル構築を行い、Ｐｈｅｎｉｘバージョン１．１７で実空間の精密化を行った。ＰｈｅｎｉｘのＳｃｕｌｐｔｏｒプログラムを使用して、ヒトマトリプターゼ－１触媒ドメイン（ＰＤＢ ４ＩＳ５）の公開されている結晶構造からヒトＴＭＰＲＳＳ６触媒ドメインのＳ７６２Ａ変異体の相同性モデルを作製した。このモデルを、Ｐｈｅｎｉｘ ＡｕｔｏＤｏｃｋを使用してヒトＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ－－ＲＥＧＮ７９９９ Ｆａｂ－ＲＥＧＮ８０２３ Ｆａｂ複合体のｃｒｙｏＥＭマップ中にドッキングさせ、手動で調整した。ＬＤＬＲａドメインは、ＬＤＬＲドメイン（ＰＤＢ １ＡＪＪ）の公開されている結晶構造をガイドとして使用して手動で密度に組み込まれた。ＣＵＢドメインの１及び２の手動による構築は、キュビリン（ＰＤＢ ３ＫＱ４）の公開されている結晶構造により導かれた。正しい配列レジスタは、かさ高い残基の側鎖及びＮ－結合型グリコシル化の密度、ならびにジスルフィド架橋の位置によって実証された。Ｎ末端ＳＥＡドメインは、断片化された密度が不十分なため構築されなかった。現在のモデルは、ヒトＴＭＰＲＳＳ６残基２１２～８１１を包含するが、ただし、無秩序なリンカー（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｌｉｎｋｅｒ）内に位置する残基５７３～５８１及び６６２～６６４は除かれている。ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３のＦａｂ断片の相同性モデルを、先に決定されたＲＥＧＮ Ｆａｂ構造から作製した。Ｆａｂモデルの、それぞれの密度への明確なドッキングは、それらの別個のＣＤＲ配列に対応する明確に解釈可能な側鎖密度によって促進された。ドッキング後、モデルを手動で調整し、その後、ヒトＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ－－ＲＥＧＮ７９９９ Ｆａｂ－ＲＥＧＮ８０２３ Ｆａｂ複合体全体の実空間の精密化を行った。
結果
ヒトＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ－－ＲＥＧＮ７９９９ Ｆａｂ－ＲＥＧＮ８０２３ Ｆａｂ複合体のＣｒｙｏＥＭ構造：
抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体がどのようにＴＭＰＲＳＳ６に結合及び阻害するかをより良く理解するために、抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体であるＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３のＦａｂ断片に結合した触媒的に不活性なヒトＴＭＰＲＳＳ６外部ドメイン（ヒトＴＭＰＲＳＳ６ Ｓ７６２Ａ－ＭＭＨ）からなるタンパク質複合体をＳＥＣによって単離し、その三次元構造を単一粒子ＣｒｙｏＥＭによって決定した。３．３Åの全体的分解能において、ＣｒｙｏＥＭ再構成は、その２つのＣＵＢドメイン、３つのＬＤＬＲａドメイン、及び触媒的セリンプロテアーゼドメインを包含する、ヒトＴＭＰＲＳＳ６外部ドメインの約８０％の原子モデルを構築するのに十分であった。また、再構成により、ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３のＦａｂ断片の明確なドッキング及び手動でのそれらの可変領域の再フィッティングが可能となった。両Ｆａｂのパラトープ－エピトープ界面における局所分解能は、３．１～３．５Åの範囲であり、抗体とＴＭＰＲＳＳ６の間の残基レベルでの相互作用の正確な決定が可能になる。また、三次複合体の構造から、ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３が、非重複エピトープにて結合することが確認される。
ＲＥＧＮ７９９９のエピトープ及び構造的阻害機構：
ＴＭＰＲＳＳ６上のＲＥＧＮ７９９９エピトープに寄与する残基を表１８にまとめている。これらの残基は、ＲＥＧＮ７９９９の非水素原子の４Å内にある非水素原子を有するＴＭＰＲＳＳ６残基と定義され、水素結合、電荷－電荷相互作用、または疎水性／ファンデルワールス相互作用を伴い得る。ＲＥＧＮ７９９９エピトープは、ＴＭＰＲＳＳ６上で２つのパッチに分割可能である。第１のパッチは触媒ドメインに存在し、ＴＭＰＲＳＳ６残基Ｇ６９９、Ｈ７０１、Ｄ７２４、Ｑ７２６、Ｌ７２７、Ｉ７２８、Ｐ７２９、Ｌ７３２、Ｅ７３５、Ｇ７４９、Ｙ７５０、Ｒ７５１、Ｋ７５２、及びＮ７９１からなる。このパッチにおける接触は、ＣＤＲのＨ３、Ｌ２、Ｌ３及びフレームワーク領域（ＦＲ）Ｌ３からの単一残基によって媒介される。第２のパッチはＬＤＬＲａリピートドメイン２上に存在し、残基Ｖ４９０、Ｓ５０１、Ｔ５０２、Ｃ５０３、Ｉ５０４、Ｓ５０５、及びＫ５０８からなる。第２のパッチのパラトープは、ＣＤＲ－Ｌ２及びＦＲ－Ｌ３の部分に広がる軽鎖残基の連続領域で構成される。ＣＵＢドメイン及びＳＥＡドメインは、ＲＥＧＮ７９９９結合界面から大きく除去され、そのＴＭＰＲＳＳ６上エピトープには寄与しない。ＲＥＧＮ７９９９についての水素重水素交換（ＨＤＸ）質量分析実験（実施例８）からのデータは、ＣｒｙｏＥＭ構造で観察された触媒ドメインパッチと概ね一致するが、エピトープに寄与するものとしてＬＤＬＲａドメイン２からの残基を強調するものではなかった。
そのエピトープには触媒ドメイン上のパッチが含まれるが、ＲＥＧＮ７９９９は、切断が生じる触媒部位三残基（Ｈ６１７、Ｄ６６８及びＳ６７２）には接触せず、活性部位への基質アクセスを立体的に閉塞するよう配向もしていない。ＴＭＰＲＳＳ６に結合している基質の位置は実験的に決定されていないが、この位置は、ペプチド阻害剤と複合体を形成したマトリプターゼセリンプロテアーゼドメインの相同構造から推測することができ、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．（２０１１）１１：３０で報告されている。これらの構造観察は、ＴＭＰＲＳＳ６外部ドメインへの可溶性ヘモジュベリンの結合は、ＲＥＧＮ７９９９の存在によって撹乱されないことを示唆している。いかなる理論にも拘束されることなく、ＲＥＧＮ７９９９は、基質と結合することはできるが、それを切断することができない不活性型立体構造にＴＭＰＲＳＳ６をアロステリックに「捕捉」することによって、ＴＭＰＲＳＳ６を阻害し得る可能性がある。
ＲＥＧＮ８０２３のエピトープ及び構造的阻害機構：
ＴＭＰＲＳＳ６上のＲＥＧＮ８０２３エピトープに寄与する残基を表１９にまとめている。これらの残基は、ＲＥＧＮ８０２３の非水素原子の４Å内にある非水素原子を有するＴＭＰＲＳＳ６残基と定義され、水素結合、電荷－電荷相互作用、または疎水性／ファンデルワールス相互作用を伴い得る。ＲＥＧＮ８０２３エピトープは触媒ドメインのみに存在し、ＴＭＰＲＳＳ６残基Ｒ５９７、Ｒ５９９、Ｉ６０１、Ｄ６２２、Ｌ７１０、Ｒ７１１、Ｅ７１２、Ｇ７１３、Ｇ７１４、Ｐ７１５、及びＩ７１６からなる。この構造で観察されたエピトープは、ＨＤＸ質量分析実験からのデータと概ね一致する。ＲＥＧＮ８０２３パラトープは主に重鎖内に含まれており、ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ３及びＦＲ－Ｈ３を含む。
ＲＥＧＮ８０２３は、上記モデルに基づいて、重鎖が触媒三残基に直接接触はしないが、活性部位への基質のアクセスを閉塞するような位置にあるように、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメインと結合する。いかなる理論にも拘束されることなく、ＲＥＧＮ８０２３は、活性部位への基質結合の立体障害を介してＴＭＰＲＳＳ６を阻害する可能性がある。このことは、ＲＥＧＮ８０２３が、ＴＭＰＲＳＳ６外部ドメインタンパク質への結合について可溶性ヘモジュベリンと競合することを示す結合データによっても示唆される。
Figure 2024517931000024
実施例１０：雌ＷＴマウスにおけるＲＥＧＮ７９９９とＲＥＧＮ８０２３の比較
実験手順
血清ヘプシジン及び血清鉄に対する選択されたＴＭＰＲＳＳ６抗体の効果を分析するため、２つのインビボ実験を実施した。いずれの研究にも、ヒト化ＨＪＶを有する雌野生型マウスが使用された（研究１：１１～１３週齢、及び研究２：６～９週齢）。両研究において、７日目にマウスに事前採血を行った。第１の研究（研究１）では、２つの選択されたＴＭＰＲＳＳ６抗体であるＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３、ならびにアイソタイプ対照抗体を、研究の０日目、２日目及び７日目に１０ｍｇ／ｋｇでマウスに皮下投与した。その後、９日目にマウスを安楽死させ、分析用に終末血液を採取した。第２の研究（研究２）では、同じ２つのＴＭＰＲＳＳ６抗体であるＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３、ならびにアイソタイプ対照抗体を、研究の０日目、２日目及び７日目に２５ｍｇ／ｋｇでマウスに皮下投与した。その後、１４日目にマウスを安楽死させ、分析用に終末血液を採取した。
両方の研究から、血清鉄を、Ｓｉｅｍｅｎｓ ＡＤＶＩＡ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＸＰＴ装置を使用して終末血液から測定した。Ｈｅｐｃｉｄｉｎ－ｍｕｒｉｎｅ－ｃｏｍｐｅｔｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ：ＨＭＣ－００１、ロット：５１４２０１９）を製造者の指示書に従って使用して血清ヘプシジンを終末血液から測定した。
結果
血清鉄（ｎｇ／ｍＬで表される）及び血清ヘプシジン（μｇ／ｄＬで表される）の測定値を、研究１からのものは表２０に示し、研究２からのものを表２１に示す。
Figure 2024517931000025
表２０に示すように、研究１では、ＲＥＧＮ７９９９処置により、アイソタイプ対照処置マウスと比較して健康なＲＥＧＮ７９９９処置マウスにおける血清ヘプシジンが顕著に増加し、血清鉄が顕著に減少した。ＲＥＧＮ８０２３処置はまた、健康なＲＥＧＮ８０２３処置マウスの血清ヘプシジンを増加させ、血清鉄を減少させたが、これは、アイソタイプ対照処置マウスと比較して統計学的に有意ではなかった。表２０では、すべての値は平均±ＳＤであり、群あたりｎ＝６～８である。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５は対アイソタイプ対照Ａｂ。
Figure 2024517931000026
表２１に示すように、研究２では、ＲＥＧＮ７９９９処置により、アイソタイプ対照処置マウスと比較して健康なＲＥＧＮ７９９９処置マウスにおける血清ヘプシジンが顕著に増加し、血清鉄が顕著に減少した。ＲＥＧＮ８０２３処置はまた、健康なＲＥＧＮ８０２３処置マウスの血清ヘプシジンを増加させ、血清鉄を減少させたが、血清鉄濃度のみがアイソタイプ対照処置マウスと比較して統計学的有意性に達した。表２１では、すべての値は平均±ＳＤであり、群あたりｎ＝４～５である。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５は対アイソタイプ対照Ａｂ。
両研究からのデータは、選択された抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体が、ＴＭＰＲＳＳ６の機能を遮断して、ヘプシジン及び血清鉄濃度に対する観察された効果をもたらすことができることを示唆している。
実施例１１：ヘモクロマトーシスのマウスモデルにおける肝臓鉄に対する抗ＴＭＰＲＳＳ６の効果
関連する疾患モデルにおいて抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体であるＲＥＧＮ７９９９の有効性をさらに検討するために、１型遺伝性ヘモクロマトーシス研究を実施した。遺伝性ヘモクロマトーシスは、不適切に低ヘプシジン濃度をもたらす、ＨＦＥタンパク質の変異により引き起こされる鉄過剰疾患である（Ｆｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１７（１７）：４５９０－４５９９）。
実験手順
１００％ Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでマウスＨＦＥ遺伝子の欠失に関してホモ接合体の雄マウス（ＨＦＥ－／－と呼ぶ）を１型遺伝性ヘモクロマトーシスのマウスモデルとして使用した。ＨＦＥ－／－マウス（ｎ＝５～７）に１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照またはＲＥＧＮ７９９９を毎週皮下注射したが、ただし、２回の注射を投与した１週間目を除く。野生型マウス対照群が含められ、アイソタイプ対照を投与した。８週間後、マウスを、ＣＯ２による窒息を用いて安楽死させた。終末血液を採取し、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ－Ｃｏｍｐｅｔｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ：ＨＭＣ－００１、ロット：０２０３２０２０）を製造者の操作手順に従って使用して血清ヘプシジンを測定した。マウスを屠殺した後、それらの肝臓をフラッシュ凍結した。後でこれらの肝臓を処理して、Ｔｏｒｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ｓ．Ａｆｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９６８）３３（１）：９－１１により記載されている方法に基づいて肝臓の鉄含有量を測定した。
結果
血清ヘプシジン（ｎｇ／ｍＬで報告）及び肝臓の鉄含有量（μｇ／ｇ乾燥重量で報告）の両方の値を表２２に示す。
Figure 2024517931000027
表２２に示すように、ＲＥＧＮ７９９９による処置の８週間後、ＨＦＥ－／－マウスは血清ヘプシジンが、アイソタイプ対照により処置されたマウス（約３３９．３ｎｇ／ｍＬ）と比較して顕著に増加していた（約１６３１ｎｇ／ｍＬ）。また、表２２に示すように、ＲＥＧＮ７９９９による処置の８週間後、ＨＦＥ－／－マウスは肝臓の鉄含有量が、アイソタイプ対照により処置されたマウス（約７７１．１μｇ／ｇ乾燥重量）と比較して顕著に低かった（約６１８．７μｇ／ｇ乾燥重量）。表２２では、すべての値は平均±ＳＤであり、群あたりｎ＝５～７である。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５は対ＨＦＥ＋／＋アイソタイプ対照；＊＊ｐ＜０．０５は対ＨＦＥ－／－アイソタイプ対照。
実施例１２：ベータサラセミアのマウスモデルにおける抗ＴＭＰＲＳＳ６の効果
本明細書に開示される２つの抗ＴＭＰＲＳＳ６抗体の有効性を評価するために、無効造血及び鉄調節不全と関連する鉄過剰障害である中等症型ベータサラセミアのマウスモデルにおいて研究を実施した。
ヒトにおける中等症型ベータサラセミアを再現する（Ｇｉｎｚｂｕｒｇ，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（１６）：４３２１－４３３０）、β１及びβ２遺伝子のヘテロ接合欠失を有し、Ｃ５７ＢＬ／６／１２９Ｓ６バックグラウンドにおいて、マウスＨＪＶの代わりにヒトヘモジュベリン（ＨＪＶ）のホモ接合体発現（Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎと呼ぶ）を有するマウスを作製した。Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウス（ｎ＝１０～１９）に、１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ７９９９、ＲＥＧＮ８０２３、またはアイソタイプ対照いずれかを毎週皮下注射した（ただし、２回の注射を投与した１週目を除く）。野生型（ＷＴ）マウス対照群が含められ、アイソタイプ対照を類似の様式で投与した。８週間後、マウスを、ＣＯ２による窒息を用いて安楽死させ、心臓穿刺により全血を採取し、ＥＤＴＡを含む、または含まない血清学検査用採血管に入れた。市販のＨｅｐｃｉｄｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ－Ｃｏｍｐｅｔｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ：ＨＭＣ－００１、ロット：０８２３２０１９）を製造者の指示に従って使用して血清ヘプシジンを測定した。Ｓｉｅｍｅｎｓ ＡＤＶＩＡ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＸＰＴ装置及びＯｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧＥＮＥＳＩＳ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、血清鉄ならびに網状赤血球及び成熟赤血球（ＲＢＣ）等の完全な血液学検査のパネルを測定した。
さらに、マウスを屠殺した後、それらの肝臓及び脾臓を以降の処理までフラッシュ凍結した。後で肝臓試料を処理して、Ｔｏｒｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ｓ．Ａｆｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９６８）３３（１）：９－１１により記載されている方法に基づいて肝臓の鉄含有量を測定した。脾臓を切り刻み、１０ｍＬ ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ：１３０－０９１－２２１）を含有する管に７０ｍｍストレーナーで濾過した。大腿骨から骨髄を採取するために、マウスから股関節端を切除し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ：１３０－０９１－３７６）を１００ｍＬ含有するチューブに入れた。チューブをすばやく遠心にかけ（１０秒、４００×ｇ）、骨髄を溶液中に遊離させた。
骨髄及び脾臓細胞を４００×ｇで４℃にて１０分間遠心にかけ、その後、抗マウスＣＤ４５磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ：１３０－０５２－３０１）とのインキュベーションを氷上で２０分間行った。この後、ｍｕｌｔｉ－２４カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ：１３０－０９５－６９１）で磁気分離を行った。成熟ＲＢＣ及び前駆体（物質）ＲＢＣの両方が濃縮されたフロースルーを回収し、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン２．４Ｇ２、カタログ：５５３１４２）と共に１０分間インキュベートした。この後、以下の市販抗体（すべてラット抗マウス）と共に３０分のインキュベーションを行った：ＦＩＴＣ抗Ｔｅｒ１１９、クローンＴＥＲ－１１９、カタログ：５５７９１５；ＡＰＣ抗ＣＤ４４、クローンＩＭ７、カタログ：５６１８６２；ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ４５、クローン３０－Ｆ１１、カタログ：５５７６５９；ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ＣＤ１１ｂ、クローンＭ１／７０、カタログ：５５７６５７；及びＡＰＣ－Ｃｙ７抗Ｌｙ６Ｇ、クローン１Ａ８、カタログ：５６０６００、いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製。
分析から死細胞を除外するためにＡＡＤｖａｎｃｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｓ１０３４９）を３０分間加えた。すべての染色手順を氷上で実施し、ＯｎｅＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ：０１－１１１１－４２）を使用して補正用対照（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）を含めた。標的集団のゲーティングを修正するためのｍｉｎｕｓ－Ｏｎｅコントロールのパネルを作成した。標的集団をゲートするため蛍光ｍｉｎｕｓ－ｏｎｅ－ｃｏｎｔｒｏｌを使用したＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で試料を測定した。
表２３に示すように、ＲＥＧＮ７９９９またはＲＥＧＮ８０２３による処置の８週間後、Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスは血清ヘプシジン濃度が、アイソタイプ対照により処置されたＷＴマウス及びＨｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスの両方（それぞれ、約２２５ｎｇ／ｍＬ及び約５１１ｎｇ／ｍＬ）と比較して顕著に増加していた（それぞれ、約１５１０ｎｇ／ｍＬ及び約１４５４ｎｇ／ｍＬ）。
さらに、ＲＥＧＮ７９９９またはＲＥＧＮ８０２３による処置の８週間後、Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎでは、アイソタイプ対照（約１２８μｇ／ｄＬ、表２３）と比較して血清鉄の顕著な低下があった（約５０μｇ／ｄＬ）。アイソタイプ対照処置群では、Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにＷＴマウスよりも多い肝臓鉄が蓄積していた。この増加は、雄マウス（約２１５μｇ／ｇ～約３６４μｇ／ｇ乾燥重量）と比較して雌マウス（約４６６μｇ／ｇ～約９８５μｇ／ｇ乾燥重量）において、より顕著であった（表２３）。また、ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３に応答した肝臓の鉄含有量の低下も、処置の８週間後、雌マウスの方が効果が大きかった。表２３では、すべての値は平均±ＳＤであり、群あたりｎ＝１０～１９である。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０１は対ＷＴアイソタイプ対照；＊＊ｐ＜０．０５は対Ｈｂｂｔｈ３／＋アイソタイプ対照。
Figure 2024517931000028
Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおけるＲＥＧＮ７９９９またはＲＥＧＮ８０２３の投与では、アイソタイプ対照により処置されたマウス（約８．７２Ｍ／μＬ、表２４）と比較して赤血球の増加（それぞれ、約１０．５１Ｍ／μＬ及び約１０．１８Ｍ／μＬ）がもたらされた。Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおけるＲＥＧＮ７９９９またはＲＥＧＮ８０２３による８週間の処置では、脾臓の網状赤血球の低下（アイソタイプ対照の約３８％から約１８％へ；Ｔｅｒ－１１９＋／ＣＤ４４ｈｉｇｈ）及び脾臓及び骨髄の両方の成熟ＲＢＣのレベル上昇（Ｔｅｒ－１１９＋／ＣＤ４４ｌｏｗ）がもたらされ、赤血球新生の改善及び脾臓における二次的赤血球新生の必要性の低さを示している（表２５）。また、脾臓重量において、アイソタイプ対照（約０．３０１ｇ）と比較して、抗ＴＭＰＲＳＳ６のＲＥＧＮ７９９９（約０．１４２ｇ）またはＲＥＧＮ８０２３（約０．１３０ｇ）により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおける顕著な低下も観察された（表２４）。表２４では、すべての値は平均±ＳＤであり、群あたりｎ＝１０～１９である。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５は対ＷＴアイソタイプ対照；＊＊ｐ＜０．０５は対Ｈｂｂｔｈ３／＋アイソタイプ対照。表２５では、すべての値は平均±ＳＤであり、群あたりｎ＝１０～１９である。一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．００１は対ＷＴアイソタイプ対照；＊＊ｐ＜０．０００１は対Ｈｂｂｔｈ３／＋アイソタイプ対照。
Figure 2024517931000029
Figure 2024517931000030
実施例１３：ベータサラセミアのマウスモデルにおけるＲＥＧＮ７９９９の効果
本明細書に開示されるＲＥＧＮ７９９９の有効性をさらに評価するために、ベータ－中間型サラセミアのマウスモデルにおいて、実施例１２に記載のように研究を実施した。
ヒトにおける中等症型ベータサラセミアを再現する（Ｇｉｎｚｂｕｒｇ，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（１６）：４３２１－４３３０）、β１及びβ２遺伝子のヘテロ接合欠失を有し、Ｃ５７ＢＬ／６／１２９Ｓ６バックグラウンドにおいて、マウスＨＪＶの代わりにヒトヘモジュベリン（ＨＪＶ）のホモ接合体発現（Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎと呼ぶ）を有するマウスを作製した。Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウス（ｎ＝７～９；これらのマウスの作製に関する詳細は実施例１２を参照のこと）に、５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ７９９９またはアイソタイプ対照を毎週皮下注射した（ただし、１週目に２回の注射を投与したことを除く）。野生型（ＷＴ）マウス対照群が含められ、アイソタイプ対照を類似の様式で投与した。８週間後、マウスに処置し、実施例１２に記載のように試料を採取した。血清ヘプシジン、血清鉄、ならびに網状赤血球及び成熟赤血球等の完全な血液学検査のパネルを実施例１２に記載のように測定した。
さらに、マウスを屠殺した後、それらの肝臓をフラッシュ凍結し、後で実施例１２に記載のように処理した。血清ヘプシジン（ｎｇ／ｍＬで報告）及び肝臓の鉄含有量（μｇ／ｇ乾燥重量で報告）の両方の値を表２６に示す。
Figure 2024517931000031
表２６に例示されるように、５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ７９９９による処置の８週間後、Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスは血清ヘプシジン濃度が、アイソタイプ対照により処置されたＷＴマウス及びＨｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスの両方（それぞれ、約３７６．８ｎｇ／ｍＬ及び約７１３．１ｎｇ／ｍＬ）と比較して顕著に増加していた（約１７８１ｎｇ／ｍＬ）。また、表２６に示すように、ＲＥＧＮ７９９９による処置では、血清鉄において、アイソタイプ対照により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウス（約１３８μｇ／ｄＬ）と比較して顕著な低下（約６６μｇ／ｄＬ）がもたらされた。アイソタイプ処置した対照研究群では、野生型マウスの約３７２μｇ／ｇ乾燥重量からＨｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスの約５４７μｇ／ｇ乾燥重量まで、肝臓の鉄含有量の増加が観察された。Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおいて、ＲＥＧＮ７９９９による処置は、アイソタイプ対照と比較して肝臓の鉄含有量を顕著に低下させることはなかったが（それぞれ、約５１３．９及び約５４７．２μｇ／ｇ乾燥重量）、野生型アイソタイプ対照により処置されたマウスと比較して顕著な低下が見られた（表２６）。表２６では、すべての値は平均±ＳＤであり、群あたりｎ＝７～９である；一元配置ＡＮＯＶＡ ＊ｐ＜０．０５は対ＷＴアイソタイプ対照；＊＊ ｐ＜０．０５は対Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎアイソタイプ対照。
Figure 2024517931000032
表２７に示すように、ヘマトクリット、赤血球数、及びヘモグロビン濃度は、予測されたとおり、野生型マウスと比較して、アイソタイプ対照により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスの方が低かった。ヘマトクリットは、野生型マウスにおける約３７％から、５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおける約２８％まで低下した。ＲＥＧＮ７９９９による処置では、Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎにおいて、アイソタイプ対照と比較してヘマトクリットに対する効果な何ら示されなかった（表２７）。赤血球（Ｍ／μＬで報告）は、野生型マウスにおける約９．５２から、アイソタイプ対照により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおける約８．９３となった。ＲＥＧＮ７９９９による８週間の処置後、Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおいて赤血球が約１１．２Ｍ μＬまで顕著に増加した（表２７）。野生型のアイソタイプ対照処置マウスでは、ヘモグロビン濃度は約１３ｇ／ｄＬであったが、表２７に示すように、Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおけるアイソタイプ対照による処置では、ヘモグロビンを約９．２２ｇ／ｄＬまで顕著に低下させた。ＲＥＧＮ７９９９による処置は、Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウスにおいて処置の８週間後にヘモグロビン濃度を約１０．１ｇ／ｄＬまで増加させた。理論に拘束されることなく、これらのデータは、ヘプシジン経路を調節することによって鉄を制限するという考え方に、赤血球に対する有益な効果があることを支持している。表２７では、すべての値は平均±ＳＤであり、群あたりｎ＝６～９である；一元配置ＡＮＯＶＡ ＊ｐ＜０．０５は対ＷＴアイソタイプ対照；＊＊ ｐ＜０．０５は対Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎアイソタイプ対照。
実施例１４：カニクイザルにおける薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）
本研究の目的を、２つの抗ＴＭＰＲＳＳ６ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の薬物動態学的（ＰＫ）特性及び薬物動態学的／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）関係を決定することとした。本研究のために、ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３を単回静脈内（ＩＶ）注入で雌カニクイザルに投与した。
表２８にまとめられているように、２１匹の雌カニクイザルを６群のうちの１群に割り付けた（群あたりｎ＝３または４匹の動物；５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇの用量群）。動物は、５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ７９９９、５ｍｇ／ｋｇＲＥＧＮ８０２３、１５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ７９９９、１５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ８０２３、または１５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体の単回ＩＶ注入を受けた（表２８）。総薬物濃度の決定のための血液試料を、投与前及び５６日の生存期間を通じて様々な時間に全動物から採取した。血清中総ヒトｍＡｂの濃度を、適格な抗ヒトＦｃ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定した。ノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）を使用してＰＫパラメータを推定した。薬力学検査のための血液試料を、研究期間を通じて様々な時点で採取し、標準の臨床化学による分析（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＵ６８０アナライザー）及び血液学的分析（Ａｖｉｄａ １２０アナライザー）を用いて分析した。市販のＨｅｐｃｉｄｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ－Ｃｏｍｐｅｔｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ：ＨＭＣ－００１、ロット：０８２３２０１９）を製造者の指示に従って使用して血清ヘプシジンを測定した。
Figure 2024517931000033
抗ＴＭＰＲＳＳ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＲＥＧＮ７９９９またはＲＥＧＮ８０２３のＰＫプロファイルは、低濃度における標的介在性クリアランス（ＴＭＣ）を伴う非線形の動態、及び高ｍＡｂ濃度における標的介在性排出経路の飽和と一致する線形の用量比例的動態により表される。単回投与ＩＶを行った後、総ＲＥＧＮ７９９９及び総ＲＥＧＮ８０２３の濃度時間プロファイルを最初の短時間分布相によって、その後、短時間線形ベータ消失相によって特徴付け、低濃度において、終末非線形標的介在性消失相及び標的介在性消失後の相によって特徴付けた。プロファイルに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）様の影響の決定的証拠及び曝露に対する明らかな影響は観察されず、したがって、どの濃度値も分析から除外されなかった。
薬物動態パラメータを表２９に記載する。５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇの抗体の単回ＩＶ投与後、ＲＥＧＮ７９９９ではそれぞれ約１２０μｇ／ｍＬ及び約４１０μｇ／ｍＬの最大血清濃度（Ｃｍａｘ）値が観察され、ＲＥＧＮ８０２３ではそれぞれ約１６２及び約５０８のＣｍａｘ値が観察された。対応する用量正規化Ｃｍａｘ（Ｃｍａｘ／用量）値は約１．４倍内であり、抗ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＡｂのＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３についてＩＶ用量増加に伴うＣｍａｘの用量比例的増加が示された。平均ｔｍａｘ（Ｃｍａｘ到達に要する時間）は、第１の測定時点である約０．５時間がすべての用量群で観察された。
ＲＥＧＮ７９９９への曝露（ＡＵＣｉｎｆ）は、用量比例を超えて増加し、１５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ７９９９の投与後のＡＵＣｉｎｆ／用量は、５ｍｇ／ｋｇの用量投与後より約１．６倍大きかった。これと一致して、より低濃度におけるＴＭＣの影響がより大きいことによる、より大きい全身クリアランス（ＣＬ）が５ｍｇ／ｋｇ用量で観察された。ＲＥＧＮ８０２３への曝露は、用量増加に伴い比例的に増加し、検討した用量におけるＴＭＣのより軽微な効果を示唆している。ＴＭＣを表す終末相半減期（ｔ１／２）は全用量群で約７～８日の範囲であった。
Figure 2024517931000034
表３０に示すように、血清ヘプシジン、血清鉄、及びトランスフェリン飽和度に対するＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３の薬力学的効果を５７日の研究期間を通して追跡した。５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ７９９９またはＲＥＧＮ８０２３により処置された群では、平均血清鉄が投与後１日目までにベースライン血清鉄濃度から約６０％低下した。
表３１に示すように、トランスフェリン飽和度は、１日目にベースライン時の約３５％から約１２％減少し、血清鉄運搬能の改善を表している。１日目のＰＤ効果は用量とは独立したものであったことから、ＲＥＧＮ７９９９及びＲＥＧＮ８０２３の低用量及び高用量の両方で１日目に達成された濃度におけるＴＭＰＲＳＳ６結合の飽和が示唆される。血清鉄及びトランスフェリン飽和度の低下は、５ｍｇ／ｋｇ用量群及び１５ｍｇ／ｋｇ用量群の両方で、ＲＥＧＮ７９９９投与後少なくとも６週間を通して維持された。５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ８０２３の用量群では、血清鉄に対する薬力学的効果はＩＶ投与後約１週間目にベースラインに向かって戻り始め、４週目までにはアイソタイプ対照処置との統計的差はなくなっていた。１５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ８０２３用量群では、持続的な高薬物濃度のため、薬力学的効果が５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ８０２３群の場合よりも持続時間が長かった。血清鉄及びトランスフェリン飽和度の両方とも、５７日目までには大半の動物においてほぼベースライン値まで戻った。
表３２に示すように、血清ヘプシジン濃度は、ＲＥＧＮ７９９９またはＲＥＧＮ８０２３の投与後わずかに増加したが、動物間の大きなばらつきが観察された。
Figure 2024517931000035
Figure 2024517931000036
Figure 2024517931000037
実施例１５：ベータサラセミアのマウスモデルにおける無酸素性能力に対するＲＥＧＮ７９９９の効果
ベータサラセミアのマウスモデルにおける無酸素性能力に対するＲＥＧＮ７９９９処置の効果を評価した。
ヒトにおける中等症型ベータサラセミアを再現する（Ｇｉｎｚｂｕｒｇ，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（１６）：４３２１－４３３０）、β１及びβ２遺伝子のヘテロ接合欠失を有し、Ｃ５７ＢＬ／６／１２９Ｓ６バックグラウンドにおいて、マウスＨＪＶの代わりにヒトヘモジュベリン（ＨＪＶ）のホモ接合体発現（Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎと呼ぶ）を有するマウスを作製した。Ｈｂｂｔｈ３／＋ × ＨＪＶＨｕｍＩｎマウス（これらのマウスの作製に関するさらなる詳細については実施例１２）。
Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスにおけるＲＥＧＮ７９９９処置は、より小さく、より健常に見える、ターンオーバーがより遅い赤血球の増加をもたらすと思われる（例えば、実施例１３を参照のこと）。しかしながら、このことが、ＲＥＧＮ７９９９処置後に赤血球の機能的改善につながるのかどうかは不明であった。例えば、これらのより小さく、より健常な赤血球が、疲労困憊走行時のような無酸素性条件下で十分な酸素を送達できるのかどうかは不明であった。
これを試験するため、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスを強制走行研究に供した（図１に示されている研究計画を参照のこと）。すべての実験の前に、マウスを、ショッカープレート付きで供給される６レーン電動トレッドミル（Ｓｅｒｉｅｓ ８ Ｔｒｅａｄｍｉｌｌ，ＩＩＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）のベルト上で２週間トレーニングした。疲労困憊走行のために、基本速度（１０ｍ／分）を５分ごとに５ｍ／分上げた。６０分目に距離の最大量を決定した。ショッカーユニットに対して不活動のままであるか、または５００回のショックを受けたマウスはトレッドミルから取り出した。
Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスは、アイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）により処置された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスよりも顕著に少ない距離を走行することが観察され、これらのマウスが速く疲労困憊したことが示唆された（図２Ａ）。１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ７９９９により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスは野生型動物と同様の距離を走行できたことから（図２Ａ）、ＲＥＧＮ７９９９処置の場合に観察された赤血球の健康状態の改善は、無酸素性能力の改善に反映されていることを示している。ＲＥＧＮ７９９９を注射された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、アイソタイプ処置マウスと比較して走行距離の差は示されなかったことから、ＲＥＧＮ７９９９は非Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスの走行能力を改善しないことを示している（図３）。
乳酸測定値も収集した。乳酸産生を決定するため、疲労困憊走行後に尾静脈から１５ｍＬの血液を採取した。Ｓｕｍｍｅｒｍａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３；１１０（２１）：８７３８－４３に記載のように乳酸測定器（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して乳酸濃度を決定した。対照Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスでは、ＲＥＧＮ７９９９により処置されたＨｂｂｔｈ３／＋マウスよりも少ない距離を走行したにもかかわらず、血中の乳酸がより多く産生されたことから、赤血球の健康状態の改善がさらに示唆される（図２Ｂ）。
実施例１６：肝臓の鉄及び赤血球新生の有効性に対するＲＥＧＮ７９９９及びＡｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃの効果
Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃは、マウス及びヒトにおいて無効造血を改善し、ヘモグロビンを増加させることが示されている（例えば、Ｃａｐｐｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０２０；３８２（１３）：１２１９－３１、Ｓｕｒａｇａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（２５）：３８６４－７２を参照のこと）。本明細書で示されるように、ＲＥＧＮ７９９９によるＴＭＰＲＳＳ６の遮断は、無効造血を改善し、より多くのより健常な赤血球をもたらすと思われる。ベータサラセミアのマウスモデルにおいて、肝臓の鉄及び赤血球新生の有効性に対するＲＥＧＮ７９９９処置の効果を評価し、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃによる処置と比較した。
ＲＥＧＮ７９９９処置（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＡｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ処置（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を比較するため、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスに２分子のうちの一方を８週間投与した。血清ヘプシジン、血清鉄、及び肝臓の鉄含有量を実施例１０に記載のように測定した。いずれかの分子による８週間の処置後、ＲＥＧＮ７９９９処置では血清ヘプシジンが増加し、血清鉄及び肝臓の鉄含有量が低下したが、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ処置ではこれらのパラメータに対する影響はなかったことが観察された（図４Ａ～Ｃ）。Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃは体重を増加させたが、肝臓重量に対する影響はなかった（図５）。ＲＥＧＮ７９９９処置は脾臓重量を減少させることが示されたが、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ処置では示されなかった（図６）。Ｈｂｂｔｈ３／＋対照マウスは顕著な脾腫を有するが、これが、ＲＥＧＮ７９９９による処置により一部回復していた。Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ処置は、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスの脾腫に何の変化ももたらさなかった。
血球数パネルも処置動物から収集した。先の実施例に見られるように、血球数パネルは、ＲＥＧＮ７９９９処置がＨｂｂｔｈ３／＋マウスの赤血球数を顕著に増加させることを示している（表３３）。Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ処置は、Ｈｂｂｔｈ３／＋対照と比較してヘモグロビンを顕著に増加させたが、赤血球数を増加させなかった。しかしながら、ＲＥＧＮ７９９９処置は赤血球数の顕著な増加を示した（表３３）。
この知見を確認するためフローサイトメトリーを使用した。脾臓または骨髄から単離された赤血球を、マウスＦｃブロッカー（抗ＣＤ１６／３２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に１０分間インキュベートし、その後、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）抗Ｔｅｒ１１９、フィコエリスリン（ＰＥ）抗ＣＤ７１、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）抗ＣＤ４４及びＡＰＣ－シアニン７（ＡＰＣ－Ｃｙ７）抗ＣＤ４５／ＣＤ１１ｂ／Ｌｙ６Ｇカクテル、とのインキュベーションを３０分間行った（抗体はすべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。分析から死細胞を除外するため、細胞をＳｙｔｏｘ ＡＡＤｖａｎｃｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で３０分間染色した。すべての染色手順を氷上で実施した。補正用対照をＯｎｅＣｏｍｐビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施し、細胞染色時に調製した。標的集団のゲーティングを修正するためのｍｉｎｕｓ－Ｏｎｅコントロールのパネルを作成した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で全試料を測定した。
フローサイトメトリーデータでは、ＲＥＧＮ７９９９処置マウスにおいてのみ脾臓の成熟赤血球増加が示され、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ処置マウスでは示されなかった（図７）。ＲＥＧＮ７９９９処置はまた、網状赤血球の低下を示し、これは、Ａｃｖｒ２ｂ（Ｌ７９Ｄ）－Ｆｃ処置では観察されなかった（図８）。
Figure 2024517931000038
配列
Figure 2024517931000039
Figure 2024517931000040
Figure 2024517931000041
Figure 2024517931000042
Figure 2024517931000043
Figure 2024517931000044
Figure 2024517931000045
Figure 2024517931000046
Figure 2024517931000047
Figure 2024517931000048
Figure 2024517931000049
Figure 2024517931000050
Figure 2024517931000051
Figure 2024517931000052
Figure 2024517931000053
Figure 2024517931000054
Figure 2024517931000055
Figure 2024517931000056

Claims (61)

  1. 膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメインに結合するが、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基には結合しない、前記抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、ＴＭＰＲＳＳ６のＬＤＬＲａドメイン２内部に含まれる部位にてさらに結合する、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合性断片。
  3. ＴＭＰＲＳＳ６に対する前記抗体またはその抗原結合性断片の結合が、ＴＭＰＲＳＳ６の前記触媒三残基を直接的には閉塞しない、請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  4. ＴＭＰＲＳＳ６に対する前記抗体またはその抗原結合性断片の結合が、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック調節を媒介する、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  5. ＴＭＰＲＳＳ６に対する前記抗体またはその抗原結合性断片の結合が、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック阻害を媒介する、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  6. 膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ＴＭＰＲＳＳ６のアロステリック阻害物質である、前記抗体またはその抗原結合性断片。
  7. 前記抗体または抗原結合性断片が、ＴＭＰＲＳＳ６を、ＴＭＰＲＳＳ６基質に結合することはできるがそれを切断することができない不活性型立体構造に維持する、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  8. 前記ＴＭＰＲＳＳ６基質がヘモジュベリン（ＨＪＶ）である、請求項７に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  9. 膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ＴＭＰＲＳＳ６の触媒三残基を立体的に閉塞する部位にてＴＭＰＲＳＳ６の触媒ドメイン内部で結合する、前記抗体または抗原結合性断片。
  10. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、ＴＭＰＲＳＳ６への結合についてヘモジュベリン（ＨＨＶ）と競合する、請求項９に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  11. ヒト膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ｈＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質（配列番号１２６）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、水素／重水素交換により決定されるように、ｈＴＭＰＲＳＳ６の細胞外ドメイン内に含有されている１個以上のアミノ酸と相互作用する、前記抗体またはその抗原結合性断片。
  12. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、水素／重水素交換により決定されるように、（ａ）配列番号１２６のアミノ酸１２５～１３３、（ｂ）配列番号１２６のアミノ酸５８６～５９４、（ｃ）配列番号１２６のアミノ酸６２６～６５０、（ｄ）配列番号１２６のアミノ酸６９３～７０３、（ｅ）配列番号１２６のアミノ酸７０４～７２４、及び／または（ｅ）配列番号１２６のアミノ酸７８０～８０５、から選択されるアミノ酸配列と相互作用する、請求項１１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  13. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、水素／重水素交換により決定されるように、（ａ）配列番号１２６のアミノ酸６９３～７０３、及び／または（ｂ）配列番号１２６のアミノ酸７８０～８０５、から選択されるアミノ酸配列と相互作用する、請求項１２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  14. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、水素／重水素交換により決定されるように、（ａ）配列番号１２６のアミノ酸１２５～１３３、（ｂ）配列番号１２６のアミノ酸５８６～５９４、（ｃ）配列番号１２６のアミノ酸６２６～６５０、及び／または（ｄ）配列番号１２６のアミノ酸７０４～７２４、から選択されるアミノ酸配列と相互作用する、請求項１２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  15. 膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、クライオ電子顕微鏡構造モデリングにより決定されるように、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（配列番号１２６）の残基Ｇ６９９、Ｈ７０１、Ｄ７２４、Ｑ７２６、Ｌ７２７、Ｉ７２８、Ｐ７２９、Ｌ７３２、Ｅ７３５、Ｇ７４９、Ｙ７５０、Ｒ７５１、Ｋ７５２、及びＮ７９１と相互作用する、前記抗体またはその抗原結合性断片。
  16. 前記抗体またはその抗原結合性断片が、クライオ電子顕微鏡構造モデリングにより決定されるように、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（配列番号１２６）の残基Ｖ４９０、Ｓ５０１、Ｔ５０２、Ｃ５０３、Ｉ５０４、Ｓ５０５、及びＫ５０８とさらに相互作用する、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  17. 膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、クライオ電子顕微鏡構造モデリングにより決定されるように、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の残基Ｒ５９７、Ｒ５９９、Ｉ６０１、Ｄ６２２、Ｌ７１０、Ｒ７１１、Ｅ７１２、Ｇ７１３、Ｇ７１４、Ｐ７１５、及びＩ７１６と相互作用する、前記抗体またはその抗原結合性断片。
  18. 膜貫通型セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有されている３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有されている３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ３が、表１に記載のＨＣＤＲ３の配列から選択されるアミノ酸配列を有する、前記抗体またはその抗原結合性断片。
  19. 前記ＬＣＤＲ３配列が、表１に記載のＬＣＤＲ３の配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  20. 表１に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の配列を含む、請求項１８または１９に記載の抗体または抗原結合性断片。
  21. 表１に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列を含む、請求項１８～２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
  22. （ａ）前記ＨＣＤＲ１ドメインが、配列番号４、２４、３４、４４、６４、８４、または１０２から選択されるアミノ酸配列を有し、
    （ｂ）前記ＨＣＤＲ２ドメインが、配列番号６、２６、３６、４６、６６、８６、または１０４から選択されるアミノ酸配列を有し、
    （ｃ）前記ＨＣＤＲ３ドメインが、配列番号８、２８、３８、４８、６８、８８、または１０６から選択されるアミノ酸配列を有し、
    （ｄ）前記ＬＣＤＲ１ドメインが、配列番号１２、５２、７２、９２、または１１０から選択されるアミノ酸配列を有し、
    （ｅ）前記ＬＣＤＲ２ドメインが、配列番号１４、５４、または７４から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ
    （ｆ）前記ＬＣＤＲ３ドメインが、配列番号１６、５６、７６、９４、または１１２から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１８～２１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  23. 前記３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲが、ＣＤＲセットの
    （ａ）配列番号４（ＨＣＤＲ１）、配列番号６（ＨＣＤＲ２）、配列番号８（ＨＣＤＲ３）、配列番号１２（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１６（ＬＣＤＲ３）、
    （ｂ）配列番号２４（ＨＣＤＲ１）、配列番号２６（ＨＣＤＲ２）、配列番号２８（ＨＣＤＲ３）、配列番号１２（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１６（ＬＣＤＲ３）、
    （ｃ）配列番号３４（ＨＣＤＲ１）、配列番号３６（ＨＣＤＲ２）、配列番号３８（ＨＣＤＲ３）、配列番号１２（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１６（ＬＣＤＲ３）、
    （ｄ）配列番号４４（ＨＣＤＲ１）、配列番号４６（ＨＣＤＲ２）、配列番号４８（ＨＣＤＲ３）、配列番号５２（ＬＣＤＲ１）、配列番号５４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号５６（ＬＣＤＲ３）、
    （ｅ）配列番号６４（ＨＣＤＲ１）、配列番号６６（ＨＣＤＲ２）、配列番号６８（ＨＣＤＲ３）、配列番号７２（ＬＣＤＲ１）、配列番号７４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号７６（ＬＣＤＲ３）、
    （ｆ）配列番号８４（ＨＣＤＲ１）、配列番号８６（ＨＣＤＲ２）、配列番号８８（ＨＣＤＲ３）、配列番号９２（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号９４（ＬＣＤＲ３）、または
    （ｇ）配列番号１０２（ＨＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＨＣＤＲ２）、配列番号１０６（ＨＣＤＲ３）、配列番号１１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１１２（ＬＣＤＲ３）、のうちの１つを含む、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  24. 前記３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲが、ＣＤＲセットの
    配列番号４４（ＨＣＤＲ１）、配列番号４６（ＨＣＤＲ２）、配列番号４８（ＨＣＤＲ３）、配列番号５２（ＬＣＤＲ１）、配列番号５４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号５６（ＬＣＤＲ３）、を含む、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  25. 前記３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲが、ＣＤＲセットの
    配列番号１０２（ＨＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＨＣＤＲ２）、配列番号１０６（ＨＣＤＲ３）、配列番号１１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１４（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１１２（ＬＣＤＲ３）、を含む、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  26. ＴＭＰＲＳＳ６に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ＨＣＶＲ内に含有されている３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）ならびにＬＣＶＲ内に含有されている３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＶＲが、
    （ｉ）配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、もしくは１００から選択されるアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、もしくは１００から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、もしくは１００から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
    （ｉｖ）配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、もしくは１００から選択される配列に関して１２以下のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、を含む、前記抗体またはその抗原結合性断片。
  27. 前記ＬＣＶＲが、
    （ａ）配列番号１０、５０、７０、９０、もしくは１０８から選択されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号１０、５０、７０、９０、もしくは１０８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号１０、５０、７０、９０、もしくは１０８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、または
    （ｄ）配列番号１０、５０、７０、９０、もしくは１０８から選択される配列に関して１０以下のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列、を含む、請求項２６に記載の抗体または抗原結合性断片。
  28. 配列番号２、２２、３２、４２、６２、８２、または１００から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項２６または２７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  29. 配列番号１０、５０、７０、９０、または１０８から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項２６～２８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  30. 配列番号２／１０、２２／１０、３２／１０、４２／５０、６２／７０、８２／９０、または１００／１０８から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  31. 配列番号４２／５０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項３０に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  32. 配列番号１００／１０８のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項３０に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  33. ＴＭＰＲＳＳ６に結合する抗体であって、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含み、前記重鎖が、配列番号１８、３０、４０、５８、７８、９６及び１１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記抗体。
  34. 前記軽鎖が、配列番号２０、６０、８０、９８及び１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の抗体。
  35. 配列番号１８／２０、３０／２０、４０／２０、５８／６０、７８／８０、９６／９８または１１４／１１６から選択されるＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む、請求項３３または３４に記載の抗体。
  36. ５８／６０のＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む、請求項３５に記載の抗体。
  37. １１４／１１６のＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む、請求項３５に記載の抗体。
  38. 前記抗体が、
    （ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である、
    （ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、ヒトＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約２１．２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する、
    （ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、サルＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約２５．７ｎＭ未満のＫＤで結合する、
    （ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、マウスＴＭＰＲＳＳ６に、２５℃及び３７℃において約７０３ｎＭ未満のＫＤで結合する、
    （ｅ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約２．７ｎＭ未満である、
    （ｆ）サルＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約３．６ｎＭ未満である、
    （ｇ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を発現している細胞に結合し、ＥＣ５０が約３５ｎＭ未満である、
    （ｈ）約９０％超の阻害パーセントで、ヒトＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害する、
    （ｉ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、約２００ｐＭ未満のＩＣ５０を示す、
    （ｊ）約４２％超の阻害パーセントで、マウスＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害する、
    （ｋ）マウスＴＭＰＲＳＳ６の存在下における細胞表面ヘモジュベリンのプロテアーゼ依存性放出を阻害する、例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６を阻害し、約２７４ｐＭ未満のＩＣ５０を示す、
    （ｌ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約６５％超の阻害パーセントで阻害する、
    （ｍ）ヒトＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、
    （ｎ）サルＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約６６％超の阻害パーセントで阻害する、
    （ｏ）サルＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約５０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、
    （ｐ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において約５８％超の阻害パーセントで阻害する、
    （ｑ）マウスＴＭＰＲＳＳ６を２５℃及び３７℃において阻害し、約３５ｎＭ未満のＩＣ５０を示す、
    （ｒ）それを必要とする対象に投与した場合に、前記対象の血清鉄濃度を減少させる、
    （ｓ）それを必要とする対象に投与した場合に、前記対象の血清ヘプシジン濃度を増加させる、
    （ｔ）それを必要とする対象に投与した場合に、前記対象の成熟赤血球レベルを増加させる、
    （ｕ）それを必要とする対象に投与した場合に、前記対象の脾臓及び／または骨髄における成熟赤血球レベルを増加させる、
    （ｖ）それを必要とする対象に投与した場合に、前記対象のヘモグロビン濃度を増加させる、または
    （ｗ）それを必要とする対象に投与した場合に、前記対象のトランスフェリン飽和レベルを低下させる、から選択される１つ以上の特性を有する、請求項１～３７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  39. 前記抗体が、完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１～３８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  40. ＴＭＰＲＳＳ６への結合について請求項１～３８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
  41. 請求項１～３８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と同じエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合性断片。
  42. 請求項１～４１のいずれか１項に記載の、ＴＭＰＲＳＳ６に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む医薬組成物。
  43. 請求項１～４１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  44. 請求項１～４１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  45. 請求項４３に記載のポリヌクレオチド配列及び／または請求項４４に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
  46. 請求項４３に記載のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、請求項４４に記載のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、を含む、ベクターのセット。
  47. 請求項４５に記載のベクターまたは請求項４６に記載のベクターのセットを含む、宿主細胞。
  48. ＴＭＰＲＳＳ６に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を生産する方法であって、請求項４７に記載の宿主細胞を、前記抗体またはその抗原結合性断片の産生を可能にする条件下で培養すること、及びそのようにして産生された前記抗体またはその抗原結合性断片を回収すること、を含む、前記方法。
  49. 前記抗体またはその抗原結合性断片を、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として製剤化することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 鉄過剰と関連する疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候を治療、予防、または改善する方法であって、治療的有効量の請求項１～４１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
  51. 疾患または障害が、先天性赤血球形成異常性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、アルファサラセミア、ベータサラセミア、輸血依存性溶血性貧血、骨髄異形成症候群、鎌状赤血球症、真性多血症、遺伝性ヘモクロマトーシス、または慢性肝疾患である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記疾患または障害が、ベータサラセミアである、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記疾患または障害が、重症型ベータサラセミアまたは中等症型ベータサラセミアである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記疾患または障害が、骨髄異形成症候群である、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記疾患または障害が、環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記疾患または障害が、輸血依存性溶血性貧血である、請求項５１に記載の方法。
  57. 前記疾患または障害が、ピルビン酸キナーゼ欠乏症による輸血依存性溶血性貧血、または鉄芽球性輸血依存性溶血性貧血である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記疾患または障害が、慢性肝疾患である、請求項５１に記載の方法。
  59. 前記疾患または障害が、アルコール関連慢性肝疾患、Ｃ型肝炎、または自己免疫性肝炎である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記医薬組成物が、それを必要とする前記対象に予防的または治療的に投与される、請求項５０～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記医薬組成物が、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、または筋肉内に投与される、請求項５０～６０のいずれか１項に記載の方法。
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