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JP2024516168A - がんを治療するための組成物および方法 - Google Patents

がんを治療するための組成物および方法 Download PDF

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JP2024516168A JP2023564570A JP2023564570A JP2024516168A JP 2024516168 A JP2024516168 A JP 2024516168A JP 2023564570 A JP2023564570 A JP 2023564570A JP 2023564570 A JP2023564570 A JP 2023564570A JP 2024516168 A JP2024516168 A JP 2024516168A
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seq
kras
splicing
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エー． ヤンネ，パシ
祥久 小林
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デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド
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Abstract

本発明は、がんを治療するための組成物および方法を含む。例えば、本発明は、スプライシングをモジュレートすることによる、がんを治療するための組成物および方法を含む。

Description

本出願は、その内容全体が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、２０２１年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１７８，１５０号、および２０２１年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２９２，８４２号からの優先権の利益を主張する国際出願である。
本明細書において引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体として本明細書によって組み込まれる。これらの刊行物のそれらの全体としての開示は、本明細書に記載されかつ主張される本発明の日の時点で、その中に当業者に公知の最先端をより十分に記載するために、本出願へ参照により本明細書によって組み込まれる。
本特許開示は、著作権保護の対象になる材料を含有する。著作権所有者は、それが米国特許商標庁の特許ファイルまたは記録に現れることから、特許文書または特許開示についての任意の者による複写に異論はないが、その他の点ではありとあらゆる著作権権利を保有する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、参照によりその全体として本明細書によって組み込まれる配列表を含有する。［］に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、［］と名付けられ、サイズが［］バイトである。
発明の分野
本発明は、がんを治療するための組成物および方法を対象とする。例えば、本発明は、スプライシングをモジュレートすることによる、がんを治療するための組成物および方法を対象とする。
ＲＡＳファミリーは、相同タンパク質ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＫＲＡＳを含む（Parikh ら, Blood 108:1, 2006）。ＲＡＳファミリーメンバーは、細胞膜から核への生理学的シグナルの伝達を調節する分子スイッチとして作動する２１－ｋＤのグアニンヌクレオチド結合タンパク質をコードする（MacKenzie ら, Blood 93:6, 1999）。ＲＡＳファミリーメンバーは、がんに関わっている。
本発明の態様は、標的にハイブリダイズする配列を含む核酸であって、標的は、ＲＡＳファミリー遺伝子の前駆体－ｍＲＮＡ（プレ－ｍＲＮＡ）を含み、前駆体－ｍＲＮＡは、少なくとも１個の変異を含むエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフを含む、核酸に向けたものである。例えば、ＲＡＳファミリー遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳを含む。
実施形態において、核酸は、プレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートする。例えば、核酸は、プレ－ｍＲＮＡのスプライシングを促進するまたはスプライシングを阻害する。
実施形態において、標的は、プレ－ｍＲＮＡのエクソン３またはその一部分を含む。例えば、核酸は、エクソン３またはその一部分を除外する選択的スプライシングを促進する。
実施形態において、核酸の配列は、標的に少なくとも部分的に相補的であるか、部分的に相補的であるか、または完全に相補的である。
実施形態において、標的は、野生型プレ－ｍＲＮＡと比較して少なくとも１個の変異を含む。
実施形態において、配列は、野生型プレ－ｍＲＮＡに相補的ではない。
実施形態において、標的は、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフまたはそれに近接した配列を含む。
例えば、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、プレ－ｍＲＮＡのコドン５２～７０またはその一部分を含む。
例えば、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＫＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５５～６５またはその一部分を含む。
例えば、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＮＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５５～６６を含む。
例えば、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＨＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５８～６７を含む。
実施形態において、標的は、
［配列番号［］］
を含む、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。例えば、
Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
Ｘ２は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
Ｘ３は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
Ｘ４は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、標的は、
［配列番号［］］、
［配列番号［］］、
［配列番号［］］、および
［配列番号［］］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。
実施形態において、標的は、
［配列番号［］］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。例えば、
Ｘ１は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；
Ｘ２は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、標的は、
［配列番号［］］、
［配列番号［］］、
［配列番号［］］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。
実施形態において、標的は、
［配列番号［］］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。例えば、
Ｘ１は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；
Ｘ２は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、標的は、
［配列番号［］］、
［配列番号［］］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。
実施形態において、標的核酸は、コドン６１内の変異等、少なくとも１個の変異を含む。例えば、少なくとも１個の変異は、Ｇ６０Ｘ、Ｑ６１Ｘ、またはその組み合わせを含む。例えば、少なくとも１個の変異は、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、またはＱ６１Ｋを含む。例えば、少なくとも１個の変異はＧＱ６０ＧＫを含む。
実施形態において、核酸は、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］
に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。例えば、
Ｘ１は、ＧもしくはＴである；
Ｘ２は、ＡもしくはＴである；
Ｘ３は、ＧもしくはＴである；
Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、核酸は、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、核酸は、５’－ＣＴＴＸ１Ｘ２ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号［］］に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。例えば、
Ｘ１は、ＧもしくはＴである；
Ｘ２は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、核酸は、
５’－ＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号［］］、
５’－ＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
５’－ＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’［配列番号［］］、
５’－ＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴ－３’［配列番号［］］、
５’－ＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴ－３’［配列番号［］］、または
５’－ＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧ－３’［配列番号［］］
の配列を含む。
実施形態において、核酸は、５’－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４－３’［式中、Ｘ１は、ＧもしくはＴである；Ｘ２は、ＡもしくはＴである；Ｘ３は、ＧもしくはＴである；Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；またはその任意の組み合わせである］に従った配列を含む。実施形態において、核酸は、５’隣接ヌクレオチド、３’隣接ヌクレオチド、または５’隣接ヌクレオチドおよび３’隣接ヌクレオチドの両方をさらに含む。
実施形態において、核酸は、
５’－ＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣ－３’（配列番号［］）、
５’－ＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡ－３’（配列番号［］）、
５’－ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’（配列番号［］）、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号［］）、
５’－ＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’（配列番号［］）、
５’－ＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴ－３’（配列番号［］）、または
５’－ＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡ－３’（配列番号［］）
の配列を含む。
実施形態において、核酸は、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＸ１Ｘ２ＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号［］］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。例えば、
Ｘ１は、Ｃ、Ｔ、もしくはＡである；
Ｘ２は、ＴもしくはＧである；
またはその任意の組み合わせである。
実施形態において、核酸は、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号［］］、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号［］］、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号［］］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、核酸は、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２ＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号［］］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。例えば、
Ｘ１は、ＡもしくはＣである；
Ｘ２は、ＴもしくはＡである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、核酸は、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号［］］、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号［］］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、核酸は、修飾された核酸を含む。例えば、修飾された核酸は、糖修飾、骨格修飾、塩基修飾、非天然塩基対、細胞透過性ペプチドへのコンジュゲーション、またはその任意の組み合わせを含む。例えば、修飾は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）＋２’－Ｏ－メトキシエチル（Methyoxyethyl）（２’ＭＯＥ）を含む。
実施形態において、修飾された核酸は、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、細胞透過性ペプチドコンジュゲートモルホリノ、アミド架橋核酸（ＡｍＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
本発明の態様は、さらに、本明細書に記載される核酸を含む組成物等の組成物に向けたものである。
実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
実施形態において、組成物は、少なくとも１種の付加的な活性剤をさらに含む。例えば、少なくとも１種の付加的な活性剤は抗がん剤を含む。
なおさらに、本発明の態様は、それを必要とする対象においてがんを治療するための方法に向けたものである。例えば、方法は、本明細書に記載される核酸または本明細書に記載される組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。
実施形態において、がんはＲＡＳ関連がんを含む。例えば、ＲＡＳは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳである。
実施形態において、ＲＡＳ関連がんは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳにおける少なくとも１個の変異を含む。例えば、少なくとも１個の変異は、Ｇ６０Ｘ、Ｑ６１Ｘ、またはその組み合わせを含む。例えば、少なくとも１個の変異は、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、またはＱ６１Ｋを含む。例えば、少なくとも１個の変異はＧＱ６０ＧＫを含む。
また、本発明の態様は、対象においてスプライシングを誘導するための方法に向けたものである。例えば、方法は、本明細書に記載される核酸または本明細書に記載される組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。
なおさらに、本発明の態様は、腫瘍細胞においてＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするための方法に向けたものである。例えば、方法は、本明細書に記載される核酸または本明細書に記載される組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。例えば、方法は、腫瘍細胞と、腫瘍細胞においてＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするのに有効な量等の、本明細書に記載される核酸とを接触させるステップを含む。
実施形態において、スプライシングをモジュレートすることは、スプライシングを増強することまたは誘導することを含む。例えば、スプライシングをモジュレートすることは、エクソン３のスプライシングをモジュレートすることを含む。
実施形態において、スプライシングは、正常細胞においてではなく、腫瘍細胞においてモジュレートされる。
さらに、本発明の態様は、腫瘍細胞においてエクソンのスキッピングを誘導するための方法に向けたものである。例えば、実施形態は、腫瘍細胞と、腫瘍細胞においてエクソンのスキッピングを誘導するのに有効な量等の、本明細書に記載される核酸とを接触させるステップを含む。
実施形態において、エクソンは、ＲＡＳのエクソン、例えばエクソン３を含む。例えば、ＲＡＳは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳを含む。
本発明の態様は、本明細書に記載される核酸および／または本明細書に記載される組成物、ならびにその使用のための使用説明書を含むキットに向けたものでもある。
本発明の他の目的および利点は、後に続く説明から容易に明らかになるであろう。
ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋは、同時ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異の存在下でのみ、オシメルチニブに対する抵抗性を与えることを示す図である。パネルａ．１または３週間のオシメルチニブを用いた処理後の、親ＰＣ９細胞株、または変異体ＫＲＡＳもしくはＢＲＡＦを発現するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９細胞株を使用した、コロニー形成アッセイ。パネルｂ．オシメルチニブ選択圧の下で、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異のアレル頻度（ＡＦ）は、Ｇ６０でのサイレント変異（ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＣＡまたはＡＡ）の存在下でのみ増加する。パネルｃ．表示される変異を有する単一クローンに由来するＫＲＡＳ ＤＮＡについての代表的なシーケンシングクロマトグラム。パネルｄ．７２時間のオシメルチニブ処理後の、種々のＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ変異体の非存在または存在下におけるＰＣ９細胞の細胞生存率アッセイ。Ｐ値を、ＡＮＯＶＡ、それに続くダネットの事後検定によって算出した、＊＊ｐは０．０１未満。パネルｅ．ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇではなく、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ（ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＧＡ）およびＱ６１ＨのＡＦは、オシメルチニブ選択の間に増加する。パネルｆ．７２時間のオシメルチニブ処理後の、改変ＰＣ９細胞の細胞生存率アッセイ。ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＡＡおよびＱ６１Ｋはホモ接合性であり、一方でＱ６１Ｈはヘテロ接合性であった。パネルｇ．オシメルチニブ処理後のウェスタンブロット分析は、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＡＡを発現するＰＣ９細胞において持続的ＥＲＫ活性化を実証するが、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ単独を発現する細胞においては持続的ＥＲＫ活性化を実証しない。パネルｈ．ＫＲＡＳ発現ＰＣ９細胞株におけるＲＡＳ－ＧＴＰアッセイを、１μＭオシメルチニブの有無での２４時間の処理後に実施した。パネルｉ．ｓｉＲＮＡによるＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ遺伝子のノックダウンは、オシメルチニブに対して種々のＰＣ９細胞株モデルを再感作する。ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＡＡはホモ接合性であり、他はヘテロ接合性である。Ｐ値をスチューデントｔ検定によって算出した、＊ｐは０．０５未満、＊＊ｐは０．０１未満。 上記と同じ。 上記と同じ。 上記と同じ。 ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋは、３つの独立した汎がんコホートにおいてＧ６０Ｇサイレント変異と同時発生することを示す図である。パネルａ．がんゲノムアトラス（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）（ＴＣＧＡ）汎がんコホートから獲得された、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳ遺伝子における非同義およびサイレント変異。円グラフは、各遺伝子におけるすべての非同義およびサイレント変異を含む。Ｑ６１における非同義変異、およびサイレント変異は、棒グラフに示されている。活性化非同義Ｑ６１ＸおよびＧ６０Ｇサイレント変異の同時発生の頻度を、フィッシャーの正確検定によって評価した、＊＊ｐは０．０１未満。サイレント変異と共存するバックグラウンド活性化変異は、図１５に示されている。がんタイプ、およびｃ．１８０におけるＧ６０Ｇサイレント変異の存在に関するデータが、ＲＡＳ Ｇ６０Ｇを有する腫瘍において示されている。パネルｂ．標的次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって評価された汎がんコホート（ｎ＝２５，２５２）。ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを有する２３件の事例は、同時発生するＧ６０Ｇサイレント変異を有した。Ｑ６１ＫおよびＧ６０Ｇのアレル頻度（ＡＦ）間の相関を、ピアソンの相関係数によって分析した。パネルｃ．セルフリーＤＮＡを使用した標的ＮＧＳによって検出された、Ｇｕａｒｄａｎｔ ＨｅａｌｔｈコホートにおけるＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、Ｇ６０Ｇ、およびＱ６１Ｈ変異の分布を示すベン図。活性化非同義およびＧ６０Ｇサイレント変異の同時発生を、フィッシャーの正確検定によって評価した。パネルｄ．オシメルチニブ処理を受け、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって編集されたＰＣ９モデルにおいて次世代シーケンシングによって評価された、Ｑ６１Ｋを有するまたは有しないＫＲＡＳ Ａ５９Ａサイレント変異のＡＦ。パネルｅ．コホートにおけるＫＲＡＳ Ｑ６１ＫおよびＧ６０Ｇ／Ａ５９ＡのＡＦ間の相関。 上記と同じ。 上記と同じ。 ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇにおけるサイレント変異は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋのスプライシングに必要であり得ることを示す図である。パネルａ．種々のＫＲＡＳ変異を発現するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９クローンから作出された、ｃＤＮＡのＫＲＡＳ特異的ＰＣＲアンプリコンの画像。ＫＲＡＳ変異体のヘテロ接合性またはホモ接合性が、各クローンに対して示されている。Ｍ：１００ｂｐマーカー、ｍ：変異体、ｗｔ：野生型、ｆｓ：フレームシフト、パネルｂ．パネルａに示された種々のＫＲＡＳアイソフォームのスキーマ。ＡＡ：アミノ酸。パネルｃ．後続のフレームシフトおよび早期終止コドンをもたらす、エクソン３の１１２ｂｐまたは全エクソン３を欠如するアイソフォームに由来するＫＲＡＳ ｃＤＮＡについての代表的なシーケンシングクロマトグラム。パネルｄ．スプライシングドナー部位の保存されたモチーフ２３およびＱ６１周辺のＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳのＤＮＡ配列の比較。推定の隠れたスプライスドナー部位としての役割を果たす、ｃ．１８０およびｃ．１８１におけるヌクレオチドは、青色で網掛けされている。欠失を含めたヌクレオチド変化は、赤色の縦棒として示されている。スプライス部位のコンセンサス値を、Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒ２４によって推測した。隠れたスプライスドナー部位を有するＫＲＡＳ変異体、およびそれらのコンセンサス値は、青色で示されている。ＡＳ：選択的スプライシング、＊報告されていない。パネルｅ．ＫＲＡＳ発現ＰＣ９細胞株におけるウェスタンブロット分析を、ＫＲＡＳのＮ末端またはＣ末端エピトープを標的にする抗体とともに、１μＭオシメルチニブの後に実施した。パネルｆ．ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ Ｑ６１周辺のエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）およびサイレンサー（ＥＳＳ）を、Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒを使用してシミュレーションした。閾値は、各モチーフの強度を示す。ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＲｐ４０、ＳＣ３５、およびＳＲｐ５５を含めたＳＲタンパク質に対するマトリックスを、ＥＳＥ Ｆｉｎｄｅｒツール３８、３９から獲得した。ＲＥＳＣＵＥ－ＥＳＥ６量体４０および推定８量体ＥＳＥ４１も示されている。ＥＳＥ／ＥＳＳ８量体の相対強度は、黄色の曲線によって表されている。 上記と同じ。 上記と同じ。 アンチセンスオリゴは、ＲＡＳ Ｑ６１Ｘがんにおいて異常なスプライシングを誘導し、インビトロおよびインビボにおける治療効果につながることを示す図である。パネルａ．治療ストラテジーのスキーマ：アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの野生型対応物ではなく、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ Ｑ６１がんのプレ－ｍＲＮＡにおけるエクソンスプライシングエンハンサーモチーフにハイブリダイズし、エクソン３のスキッピングを誘導し、未成熟終結をもたらす。パネルｂ．増加する濃度のＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ選択的または対照モルホリノオリゴで４８時間処理されたＣａｌｕ６のｃＤＮＡから作出されたＫＲＡＳ特異的ＰＣＲアンプリコンの画像。エクソン３スキッピングの割合は、ＩｍａｇｅＪによって定量される、「スキップされた／（スキップされた＋全長）」転写産物のバンド強度として規定される。Ｍ：１００ｂｐマーカー。Ｐ値を、標的モルホリノで処理された細胞とｍｏｒ－ＣＴＲＬを用いたものとの間で、スチューデントｔ検定を使用して算出した、＊ｐは０．０５未満、＊＊ｐは０．０１未満。パネルｃ．１０μＭモルホリノで４８時間処理されたＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ Ｑ６１変異体細胞株のｃＤＮＡから作出されたＰＣＲアンプリコンの画像。ＣＴＲＬ：対照、ｍｏｒ－１、４、６、９：それぞれＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、およびＨＲＡＳ Ｑ６１Ｈを標的にするモルホリノ。Ｐ値を、パネルｂにおいてと同じ方法を使用して算出した。パネルｄ．モルホリノで処理されたＳＷ９４８細胞のｍＲＮＡに由来する無傷の全長ＫＲＡＳアンプリコンにおける、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ対野生型の転写産物頻度。パネルｅ．変異体ＲＡＳ細胞株のパネルにおける相対的ＲＡＳ依存性、およびアンチセンスオリゴを用いた処理に対するそれらの感受性についての概要。ＲＮＡｉおよびＣＲＩＳＰＲノックアウトによって評価された、依存性に関する遺伝子効果スコアを、Ｄｅｐｍａｐ（depmap.org/portal/）から獲得し、０のスコアは、必須ではない遺伝子と等価であり、一方で－１のスコアは、すべての共通の必須遺伝子の中央値に相当する。スコアはヒートマップで示されている：青色で－１以下、赤色で０より多い、および黄色でその他。８日間のｓｉＲＮＡ（上）および１０μＭモルホリノ（下）処理後に、浮遊細胞における細胞生存率アッセイを実施した。モルホリノ処理の棒グラフにおいて、色は、各変異体選択的モルホリノを示す。パネルｆ．１７種のＲＡＳ Ｑ６１Ｘ細胞株におけるＲＡＳ ｓｉＲＮＡおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによる成長阻害の相関。パネルｇ．ＫＲＡＳ変異体細胞株におけるシグナル伝達についてのウェスタンブロット分析を、１０ｎＭトラメチニブ、１０μＭモルホリノ、またはそれぞれの対照を用いた７２時間の処理後に実施した。パネルｈ．ルシフェラーゼ発現Ｈ６５０異種移植片腫瘍のインビボイメージング。Ｈ６５０細胞を、ヌードマウスへの注射前の１または２日間、インビトロで１０μＭ ｖｉｖｏＭｏｒ－ＣＴＲＬまたはｖｉｖｏＭｏｒ－４で前処理した。インビボイメージングを、週に２回実施した（処理群あたりｎ＝１０）。パネルｉ．前処理されたＨ６５０異種移植片腫瘍の代表的な画像。パネルｊ．モルホリノの毎日の腫瘍内注射で処理されたＨ６５０異種移植片腫瘍のインビボ効力（処理群あたりｎ＝１０）。 上記と同じ。 上記と同じ。 上記と同じ。 上記と同じ。 上記と同じ。 ＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ変異の発がん性を評価するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＥＧＦＲ変異体ＰＣ９細胞を示す図である。パネルａ．ＥＧＦＲ阻害剤オシメルチニブを用いた選択のスキーマ。親ＥＧＦＲ変異体ＰＣ９細胞の大多数はオシメルチニブに感受性であり、ほんの一部が内在性の抵抗性を呈する。バルクＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９細胞において、オシメルチニブ処理は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ等の抵抗性変異を持つ細胞の割合の増加につながり得る。パネルｂ．７２時間のオシメルチニブ処理後の、親およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９細胞の細胞生存率アッセイ。各クローンは、ヘテロ接合性ＫＲＡＳ変異を有する：ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＣＡ＋Ｑ６１Ｋ、ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＧＡ＋フレームシフト、およびＱ６１Ｋ＋フレームシフト。パネルｃ．４８時間のＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ特異的ｓｉＲＮＡ処理後の、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９クローンにおけるＫＲＡＳまたはＢＲＡＦのノックダウンが、ウェスタンブロット分析によって示されている。 上記と同じ。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９細胞におけるＫＲＡＳの選択的スプライシングを示す図である。パネルａ．上流のＥＧＦＲシグナルの影響を考慮した、オシメルチニブの存在または非存在下における、種々のＫＲＡＳ変異を発現するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９クローンから作出された、ｃＤＮＡのＫＲＡＳ特異的ＰＣＲアンプリコンの画像。ＫＲＡＳ変異体のヘテロ接合性またはホモ接合性が、各クローンに対して示されている。Ｍ：１００ｂｐマーカー、ｍ：変異体、ｗｔ：野生型、ｆｓ：フレームシフト。パネルｂ．種々のＫＲＡＳ変異を発現する付加的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９クローンから作出された、ｃＤＮＡのＫＲＡＳ特異的ＰＣＲアンプリコンの画像。パネルｃ．は、種々のＫＲＡＳ変異を発現するＫＲＡＳ変異体細胞株およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９改変ＰＣ９クローンから作出された、ｃＤＮＡのＫＲＡＳ特異的ＰＣＲアンプリコンの画像を示している。 上記と同じ。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してサイレント変異を編集することによって、元のＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫを非機能的Ｑ６１Ｋに転換するストラテジーを示す図である。パネルａ．ｃ．１８０サイレント変異を隠れたスプライスドナーヌクレオチドで置換する変異体特異的ｓｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集を使用して、未成熟終止コドンにつながるエクソンスキッピングを促進する、提唱される代替的治療ストラテジーのスキーマ。パネルｂ．表示されるドナー鋳型を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集の４８時間後の、バルクＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ変異体ＣＡＬＵ６およびＳＮＵ６６８細胞株に由来するＤＮＡを使用した次世代シーケンシングによって評価された、変異のアレル頻度。元のＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫのＡＦは、ＧＱ６０ＧＫ特異的ｓｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ編集によって減少し、非機能的Ｑ６１ＫのＡＦは、Ｑ６１Ｋに対して設計されたドナー鋳型の存在下でのみ増加した。パネルｃ．表示されるドナー鋳型を用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集の４８時間後の、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ変異体ＣＡＬＵ６およびＳＮＵ６６８細胞株におけるｑＰＣＲによって評価された、表示されるＫＲＡＳアイソフォームの相対発現。発現データは、Ｑ６１Ｋ鋳型を使用した細胞株と比べて示されている。成長することができないそれらの能力に起因して、非機能的Ｑ６１Ｋへの転換に成功したクローンを捕捉することは困難であり得るが、１１２ｂｐをスキップしたＫＲＡＳアイソフォームの発現レベルの増加を、ＣＲＩＳＰＲ編集の２日後に、残りの細胞において確認した。 上記と同じ。 変異体選択的アンチセンスオリゴを設計するスキームを示す図である。パネルａ．ＤＮＡ、ホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）＋２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびモルホリノの構造。ＰＳ＋２’ＭＯＥにおいて、非架橋酸素は、ホスフェート（phosphate）骨格における硫黄原子によって置き換えられ、糖部分の２’位は修飾される。モルホリノにおいて、糖部分は、メチレンモルホリン環で置き換えられ、アニオン性ホスフェート（phosphate）は非イオン性ホスホロジアミデート（phosphorodiamidate）連結で置き換えられる。パネルｂ．ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＣＡ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、およびＨＲＡＳ Ｑ６１Ｌ選択的アンチセンスオリゴの設計を描写するスキーマ。Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒ（上）およびＥＳＥ ｆｉｎｄｅｒ（下）を使用してシミュレーションされた、エクソンスプライシングエンハンサーに結合するためのモチーフが示されている。ＳＲＳＦ１（ＳＦ２／ＡＳＦおよびＩｇＭ－ＢＲＣＡ１）、ＳＲＳＦ２（ＳＣ３５）、ＳＲＳＦ５（ＳＲｐ４０）、およびＳＲＳＦ６（ＳＲｐ５５）を含めたＳＲタンパク質に対するマトリックスが示されている。 上記と同じ。 モルホリノを使用した、ＲＡＳの変異体選択的阻害を示す図である。ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ転写産物を示す生のＮＧＳリードを、ＩＧＶソフトウェアを使用して可視化した。 ＲＡＳ変異体細胞におけるＭＥＫ阻害剤およびモルホリノオリゴに対するインビトロ感受性を示す図である。パネルａ．８日間の１０ｕＭモルホリノ処理後の浮遊細胞における細胞生存率アッセイを、超低接着プレートで実施した。Ｐ値を、ＤＭＳＯで処理された細胞と比較して、ＡＮＯＶＡ、それに続くダネットの事後検定によって算出した、＊＊ｐは０．０１未満。パネルｂ．２Ｄ付着または３Ｄ浮遊培養における７２時間のトラメチニブ処理後の、変異体ＲＡＳ細胞株のパネルの細胞生存率アッセイ。パネルｃ．２Ｄまたは３Ｄ培養における１０ｎＭトラメチニブによる成長阻害、および１７種のＲＡＳ Ｑ６１Ｘ細胞株におけるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの相関。パネルｄ、ＫＲＡＳ野生型細胞株におけるシグナル伝達についてのウェスタンブロット分析を、１０ｎＭトラメチニブ、１０μＭモルホリノ、またはそれぞれの対照を用いた７２時間の処理後に実施した。パネルｅ．変異体選択的モルホリノで４８時間処理されたＣＡＬＵ６およびＨ６５０細胞株におけるｑＰＣＲによって評価された、ＥＲＫシグネチャー遺伝子の相対発現。発現データは、対照モルホリノ処理のリードアウトに対して正規化されている。ＧＵＳＢを内部対照として使用した。Ｐ値をスチューデントｔ検定によって算出した、＊＊ｐは０．０１未満。パネルｆ．パネルａと同じ方法を用いた、８日間の５０ｎＭアファチニブ、１０μｇ／ｍｌセツキシマブ（cetuximub）、および１０μＭモルホリノ処理後の、浮遊細胞における細胞生存率アッセイ。パネルｇ．ＮＲＡＳおよびＨＲＡＳ変異体細胞株におけるシグナル伝達についてのウェスタンブロット分析を、１０ｎＭトラメチニブ、１０μＭモルホリノ、またはＤＭＳＯを用いた７２時間の処理後に実施した。 上記と同じ。 上記と同じ。 上記と同じ。 上記と同じ。 インビトロおよびインビボＨ６５０モデルにおける、ビボ－モルホリノを使用した前処理ストラテジーを示す図である。パネルａ、モルホリノオリゴ前処理ストラテジー。Ｈ６５０細胞を、３Ｄ浮遊細胞として、１０μＭ対照ビボ－モルホリノおよび標的ビボ－モルホリノで１～４日間前処理した。薬物洗い出しの後、細胞を成長培地中で培養し、細胞生存率をインビトロで８日目に評価した。ルシフェラーゼ発現Ｈ６５０細胞をインビボ実験に使用した。３Ｄ浮遊細胞としての、１０μＭ ｖｉｖｏＭｏｒ－ＣＴＲＬおよび標的ビボ－モルホリノを用いた１～２日間の前処理の後、薬物を洗い出し、細胞をマウスに皮下移植した。インビボイメージングを、週に２回実施した。パネルｂ、１０μＭ ｖｉｖｏＭｏｒ－ＣＴＲＬまたはｖｉｖｏＭｏｒ－４で１～４日間前処理されたＨ６５０細胞のインビトロ細胞生存率アッセイ。Ｐ値をスチューデントｔ検定によって算出した、＊＊ｐは０．０１未満。パネルｃ、前処理されたＨ６５０異種移植片腫瘍の体積変化。Ｈ６５０細胞を、ヌードマウスへの注射前の１または２日間、インビトロでｖｉｖｏＭｏｒ－ＣＴＲＬまたはｖｉｖｏＭｏｒ－４で前処理した。データは平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝１０）である。 上記と同じ。 Ｈ６５０異種移植片モデルにおけるビボ－モルホリノの腫瘍内注射を示す図である。パネルａ．モルホリノの毎日の腫瘍内注射で７日間処理されたＨ６５０異種移植片腫瘍のｃＤＮＡから作出された、ＫＲＡＳ特異的ＰＣＲアンプリコンの画像。エクソン３スキッピングの割合は、ＩｍａｇｅＪによって測定される、「スキップされた／（スキップされた＋全長）」のバンド強度として規定される。Ｍ：１００ｂｐマーカー。パネルｂ．パネル（ａ）に示されるサンプルにおけるエクソン３スキッピングの割合を、スチューデントｔ検定によって統計的に比較した、＊＊ｐは０．０１未満。パネルｃ．（ａ）に相当する腫瘍サンプルにおけるｑＰＣＲによって評価された、ＫＲＡＳエクソン３スキッピングの相対発現。パネルｄ．モルホリノで経時的に処理されたＨ６５０異種移植片腫瘍を有するマウスの体重変化。 上記と同じ。 Ｃａｌｕ６モデルにおけるビボ－モルホリノの前処理ストラテジーおよび腫瘍内注射を示す図である。パネルａ、１０μＭ ｖｉｖｏＭｏｒ－ＣＴＲＬまたはｖｉｖｏＭｏｒ－１で１～４日間前処理されたＣａｌｕ６細胞のインビトロ細胞生存率アッセイ。Ｐ値をスチューデントｔ検定によって算出した、＊＊ｐは０．０１未満。パネルｂ．前処理されたＣａｌｕ６異種移植片腫瘍の体積変化。Ｃａｌｕ６細胞を、ヌードマウスへの注射前の２４時間、インビトロでｖｉｖｏＭｏｒ－ＣＴＲＬまたはｖｉｖｏＭｏｒ－１で前処理した（ｎ＝１０）。パネルｃ．モルホリノの毎日の腫瘍内注射で処理されたＣａｌｕ６異種移植片腫瘍のインビボ効力（ｎ＝１０）。パネルｄ．モルホリノで経時的に処理されたＣａｌｕ６異種移植片腫瘍を有するマウスの体重変化。 上記と同じ。 ＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴを使用したＫＲＡＳの変異体選択的阻害を示したデータを示す図である。パネルａ．スクリーニングによる、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＣＡ選択的アンチセンスオリゴの設計を描写するスキーマ。パネルｂ．６種類のＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴで４８時間処理された細胞のｃＤＮＡから作出された、ＫＲＡＳ特異的ＰＣＲアンプリコンの画像。エクソン３スキッピングの割合は、ＩｍａｇｅＪによって定量される、「スキップされた／（スキップされた＋全長）」転写産物のバンド強度として規定される。Ｍ：１００ｂｐマーカー。パネルｃ．パネルｂと同じ方法を用いた、表示される細胞株におけるＫＲＡＳ特異的ＰＣＲアンプリコンの画像。パネルｄ．ＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴで処理されたＣａｌｕ６およびＳＷ９４８細胞のｍＲＮＡに由来する無傷の全長ＫＲＡＳアンプリコンにおける、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫまたはＱ６１Ｌ対野生型の転写産物リード。パネルｅ．ＫＲＡＳ変異体および野生型細胞株におけるシグナル伝達についてのウェスタンブロット分析を、６日間の０．５ｕＭ ＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴの後に実施した。パネルｆ．８日間の０．５ｕＭ ＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴ処理後に、浮遊細胞における細胞生存率アッセイを実施した。 上記と同じ。 上記と同じ。 上記と同じ。 ＴＣＧＡコホートにおけるサイレント変異、およびバックグラウンド活性化変異を示す図である。 ＤＦＣＩ内部コホートにおけるＫＲＡＳ Ｑ６１ＫおよびＧ６０Ｇのアレル頻度の詳細を示す図である。 Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈコホートにおける、Ｑ６１Ｋを有しない４件のＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇ事例の共変異を示す図である。 ＴＣＧＡコホートにおける、ベースライン時のエクソン３スキッピングを示す図である。 標的モルホリノおよび対照モルホリノの配列を示す図である。 変異体または野生型配列とのモルホリノの結合アフィニティーを示す図である。 潜在的オフターゲット結合部位のゲノムワイドスクリーニングを示す図である。 変異体または野生型配列との、スクリーニングされたＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴの結合アフィニティーを示す図である。 スクリーニングされたＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴの潜在的オフターゲット結合部位のゲノムワイドスクリーニングを示す図である。 本明細書に記載される材料および方法を示す図である。 上記と同じ。 上記と同じ。 上記と同じ。 （パネルａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ）モルホリノを使用したインビトロ処理を示す図である。 上記と同じ。 ＫＲＡＳエクソン３を示す図である。 ＮＲＡＳエクソン３を示す図である。 ＨＲＡＳエクソン３を示す図である。 ＲＡＳ Ｑ６１がんに対する標的療法への需要を示す図である。 ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異体がんにおけるスプライシング脆弱性を示す図である。Ｇ６０Ｇサイレント変異は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋが発がん性であるのに必須である。Ｇ６０Ｇサイレント変異がないと、ＫＲＡＳは選択的スプライシングを受け、非機能的タンパク質をもたらす。 ＲＡＳ Ｑ６１変異体がんにおけるスプライシング脆弱性を示す図である。エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）のホットスポットは、ＲＡＳ Ｑ６１周辺にある。 スプライシングを改変するための、現在ＦＤＡに承認されているアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＡＳ Ｑ６１がんの治療のための変異体特異的アンチセンスオリゴを使用する新たなストラテジーを示す図である。 Ｑ６１汎がんにおける、変異体特異的アンチセンスオリゴの効力を示す図である。 ３つの独立したコホートからの、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ Ｑ６１Ｘ（Ｑ６１Ｋ／Ｌ／Ｈ／Ｒ等、任意の種類のＱ６１変異）におけるがんタイプの例を示す図である。 アンチセンスオリゴをスクリーニングすることについてのデータを示す図である。パネルａ：ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ特異的アンチセンスオリゴの設計を描写するスキーマ。モルホリノを、３ｎｔの差を有して設計した。パネルｂ：ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ変異体肺Ｈ６５０細胞株におけるスキッピング全エクソン３。具体的には、９種類のモルホリノで処理されたＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ変異体肺Ｈ６５０細胞株におけるＫＲＡＳエクソン３スキッピングを示すＰＣＲバンド。パネルｃ：ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ変異体肺Ｈ６５０細胞株におけるｑＰＣＲによって定量されたスキッピング全エクソン３。具体的には、Ｈ６５０細胞株における、ＫＲＡＳエクソン３スキッピングおよび全長ＫＲＡＳの発現レベルを示すｑＰＣＲデータ（プローブを、エクソン３およびエクソン４の接合部において設計した）。パネルｄ：アガロースゲル電気泳動後のＰＣＲ産物の画像を示す図である。 スクリーニングにおいて使用された、ＫＲＡＳにおける標的変種に対するモルホリノおよびモルホリノの配列の表を示す図である。
発明の詳細な説明
１つまたは複数の実施形態についての詳細な説明が本明細書において提供される。しかしながら、本発明は多様な形態で具現化され得ることが理解されるべきである。それゆえ、本明細書に開示される具体的な詳細は、限定的ではなくむしろ特許請求の範囲の根拠として、および任意の適当な様式で本発明を採用するように当業者に教示するための代表的な根拠として解釈されるべきである。
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上別様にはっきりと指示されない限り、複数の指示対象（reference）を含む。「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用される場合、「１つ」を意味し得るが、それは、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つを上回る」という意味とも合致する。
「例えば」、「等」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語句および同種のもののいずれかが本明細書において使用される場合はどこでも、別様に明示的に述べられない限り、「限定することなく」という語句が後に続くと理解される。同様に、「例」、「例示的な」、および同種のものは、非限定的であると理解される。
「実質的に」という用語は、意図される目的に負の影響を与えない、記述子からの逸脱を可能にする。記述的用語は、たとえ「実質的に」という単語が明示的に記述されないとしても、「実質的に」という用語によって修飾されると理解される。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」という用語（ならびに、同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、および「伴う（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」）、ならびに同種のものは、互換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、該用語のそれぞれは、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」についての共通の米国特許法定義と合致して定義され、それゆえ、「少なくとも以下のもの」を意味する開かれた用語であると解釈され、付加的な特質、限定、態様等を除外しないとも解釈される。ゆえに、例えば、「ステップａ、ｂ、およびｃを伴う過程」とは、過程が、少なくともステップａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。「ａ」または「ａｎ」という用語が使用される場合はどこでも、そのような解釈が文脈において非合理的でない限り、「１つまたは複数」が理解される。
本明細書において使用するとき、「約」という用語は、およそ、大体、前後、またはその領域における、を意味するために本明細書において使用される。「約」という用語が、数域と併せて使用される場合、それは、明記された数値よりも上および下に境界線を広げることによってその域を修飾する。一般的に、「約」という用語は、述べられた値よりも上および下の数値を、２０パーセント上または下の（より高いまたはより低い）変動分修飾するために本明細書において使用される。
核酸
本発明の態様は、標的にハイブリダイズする配列を含む核酸を対象とする。実施形態において、標的は、ＲＡＳファミリー遺伝子の前駆体ｍＲＮＡを含む。
ＲＡＳファミリーは、相同タンパク質ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＫＲＡＳを含む（Parikh ら, Blood 108:1, 2006）。ＲＡＳファミリーメンバーは、細胞膜から核への生理学的シグナルの伝達を調節する分子スイッチとして作動する２１－ｋＤのグアニンヌクレオチド結合タンパク質をコードする（MacKenzieら, Blood 93:6, 1999）。
ＲＡＳファミリーメンバーは、数種類のがんに見出されている。ＨＲＡＳ変異は、色々ながんと関連している（Youngら, Oncogene 24:40, 2005；Perkinsら, MoI. Brain Res. Ill, 2003；Garrettら, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2, 1993；Theodorescuら, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87, 1990；Westonら, Environ Health Perspect. 105:4, 1997；Fujitaら, Cancer Research 48, 1988）。ＫＲＡＳおよびＨＲＡＳ変異は、色々ながんと関連している（Braunら, Proc. Natl Acad. Sci. USA 101:2, 2004；Jiら, J. Biol. Chem. 282: 19, 2007；Paoら, PLoS Medicine 2: 1, 2005；Rosellら, Clin. Cancer Res. 2, 1996；Ryanら, Gut 52, 2003）。ヒト腫瘍において、ＮＲＡＳ遺伝子の活性化は、ＮＲＡＳ遺伝子の１２、１３、または６１位におけるアミノ酸置換の結果である（Carneyら, Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 1986；Janssenら, Proc. Natl Acad. Sci. USA 84, 1987；Ugurelら, PLoS ONE 2:2, 2007；MacKenzieら, Blood 93:6, 1999）。ＮＲＡＳの構成的活性化をもたらす変異は、骨髄性悪性腫瘍（Parikhら, 2006；Janssenら, 1987）および癌腫（Reynoldsら, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 1991）において生じることが示されている。
本発明の「オリゴヌクレオチド化合物」（「核酸」と互換可能に使用され得る）は、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等、ならびにそれに組み込まれる本明細書において論じられる修飾されたヌクレオチドを含み得る。ＡＳＯは、標的核酸配列に相補的である一本鎖ヌクレオチド分子である。ゆえに、本明細書における実施形態は、標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド化合物（核酸等）を含む。
「標的」という用語は、本文書を通じて色々な異なる形態で使用され、それが使用される文脈によって規定される。例えば、「標的ｍＲＮＡ」とは、所与のオリゴヌクレオチドが向けられ得るメッセンジャーＲＮＡを指し得る。例えば、「標的配列」および「標的部位」とは、オリゴヌクレオチドのセンス鎖が様々な程度の相同性を示し、アンチセンス鎖が様々な程度の相補性を呈する、ｍＲＮＡ内の配列を指し得る。「オリゴヌクレオチド標的」という語句は、オリゴヌクレオチドが向けられる遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質を指し得る。実施形態において、標的核酸は、ＲＡＳファミリー遺伝子を含むＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレ－ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、およびまたそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、ならびにノンコーディング配列をさらに包含する本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を包含する。一実施形態において、標的配列は、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ）をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、ＭＭＲシステムのサブユニットをコードする核酸配列と関連したセンスおよび／またはアンチセンスノンコーディングおよび／またはコーディング配列を含むが、それらに限定されるわけではない。
ヒトＫＲＡＳに対するゲノム配列は、公的データベースにおいてアクセス可能であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号［ＮＧ＿００７５２４．２］（核酸）および［ＮＰ＿２０３５２４．１およびＮＰ＿００４９７６．２］（タンパク質）を有する。ＫＲＡＳタンパク質は、２種のアイソフォーム、具体的にはエクソン５を有するアイソフォーム４Ａ、およびエクソン５を有しないアイソフォーム４Ｂを有する。
ヒトＮＲＡＳに対するゲノム配列は、公的データベースにおいてアクセス可能であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号［ＮＧ＿００７５７２．１］（核酸）および［ＮＰ＿００２５１５．１］（タンパク質）を有する。
ヒトＨＲＡＳに対するゲノム配列は、公的データベースにおいてアクセス可能であり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号［ＮＧ＿００７６６６．１］（核酸）および［ＮＰ＿００５３３４．１およびＮＰ＿７８９７６５．１］（タンパク質）を有する。
実施形態において、標的核酸は、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフまたは推定エクソンスプライシングエンハンサー結合モチーフを含む前駆体－ｍＲＮＡを包含する。エクソンスプライシングエンハンサーとは、その遺伝子から転写されるプレ－ｍＲＮＡのスプライシングに寄与する、エクソンに見出される縮重６量体配列である。エクソンスプライシングエンハンサーの存在または非存在は、スプライシングに影響を及ぼす。ゆえに、本明細書における実施形態は、細胞における遺伝子の標的エクソンの発現をスキップするための組成物および方法を提供し、例えば、標的エクソンは、推定エクソンスプライシングエンハンサー配列を含む、または推定エクソンスプライシングエンハンサー配列に近接している。例えば、図４、パネルａを参照すると、エクソンスプライシングエンハンサーモチーフは、ＲＡＳのエクソン３の内にまたはすぐ近接して位置し得る。
ＫＲＡＳエクソン３ 配列番号［］
ＮＲＡＳエクソン３ 配列番号［］
ＨＲＡＳエクソン３ 配列番号［］
実施形態において、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、プレ－ｍＲＮＡのコドン５２～７０またはその一部分を含む。例えば、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＫＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５５～６５またはその一部分を含む。例えば、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＮＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５５～６６またはその一部分を含む。例えば、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＨＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５８～６７またはその一部分を含む。
ＫＲＡＳエクソン３のプレ－ｍＲＮＡ 配列番号［］
ＮＲＡＳエクソン３のプレ－ｍＲＮＡ 配列番号［］
ＨＲＡＳエクソン３のプレ－ｍＲＮＡ 配列番号［］
実施形態において、標的は、ＲＡＳファミリー遺伝子の前駆体－ｍＲＮＡ（プレ－ｍＲＮＡ）を含み、前駆体－ｍＲＮＡは、少なくとも１個の変異を含むエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフを含む。本明細書に記載されるように、Ｑ６１変異体ＲＡＳがんにおけるサイレント変異およびスプライシング脆弱性の重大性が発見されている。Ｑ６１Ｘ変異は、ＲＡＳのエクソン３内に位置し、エクソンスプライシングエンハンサーモチーフの内におよび／またはすぐ近接してある。ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを有するモデルは、スプライシングドナー部位の保存されたモチーフとの類似性に起因して選択的スプライシングを受け、原因となる早期終止コドン（そのため、非機能的タンパク質）をもたらし、一方でＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ＋サイレント変異（Ｇ６０Ｇ＋Ｑ６１Ｋ）は、選択的スプライシングを阻止され、機能的タンパク質をもたらした。ゆえに、本明細書に記載される標的核酸は、野生型配列と比較して少なくとも１個の変異、少なくとも２個の変異、少なくとも３個の変異、または４個以上の変異を含むＥＳＥ結合モチーフであり得る。例えば、変異はＱ６１Ｋであり得る。別の例において、変異はＧ６０Ｇ＋Ｑ６１Ｋであり得る。
実施形態において、標的核酸は、コドン６１内に少なくとも１個の変異を含み得る。例えば、少なくとも１個の変異は、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、またはＱ６１Ｋを含む。実施形態において、標的核酸は、コドン６０内に少なくとも１個の変異を含み得る。実施形態において、標的核酸は、コドン６０内の変異およびコドン６１内の変異を含み得る。実施形態において、変異は、Ｇ６０Ｘ、Ｑ６１Ｘ、またはその組み合わせを含む。例えば、変異はＧＱ６０ＧＫを含む。
ゆえに、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド組成物および／または核酸は、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡ等のプレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートし得る。核酸は、プレ－ｍＲＮＡのスプライシングを促進し得る、または核酸は、プレ－ｍＲＮＡのスプライシングを阻害し得る。実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物および／または核酸は、エクソン３またはその一部分を除外する選択的スプライシングを促進する。
ハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の、水素結合を伴い得、それは、ワトソン・クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対合する相補的ヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは様々な状況下で生じ得る。相補的とは、当業者によって理解されるように、２種のヌクレオチド間の精確な対合のための能力を指し得る。例えば、各分子における十分な数の相当する位置が、互いと水素結合し得るヌクレオチドによって占有される場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは互いに相補的である。オリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸のものに１００％相補的である必要はない。例えば、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズし得、それにより、介在するまたは近接するセグメントは、ハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造等）。ゆえに、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、十分な程度の相補性、または安定でかつ特異的な結合が、オリゴヌクレオチドとその標的核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的）との間で生じる精確な対合を示すために使用される。
一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物とその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。一実施形態において、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの結合が、ＤＮＡの正常な機能、ＲＮＡの正常な機能、または標的核酸によってコードされる産物の正常な機能および／もしくは発現を妨害する場合、オリゴヌクレオチド化合物は特異的にハイブリダイズ可能であり、機能および／または活性のモジュレーションを引き起こす。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、エクソン３等、エクソンをＲＡＳプレ－ｍＲＮＡからスプライスさせ得る。例えば、図４、パネルａを参照されたい。エクソン３が、変異体ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡ等からスプライスされる場合、例えば、非機能的タンパク質が産生される。
妨害される対象となるＤＮＡ機能は、例えば複製および転写を含む。妨害される対象となるＲＮＡ機能は、例えばタンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移行、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１種もしくは複数のｍＲＮＡ種を産出するＲＮＡのスプライシング、および／またはＲＮＡに従事し得るもしくはＲＮＡによって促され得る触媒活性を含む。標的核酸機能のそのような妨害の全体的効果は、コードされる産物またはオリゴヌクレオチドの発現のモジュレーションである。一実施形態において、モジュレーションは、コードされる産物の活性の減少または喪失である。一実施形態において、モジュレーションは、コードされる産物の発現の減少または喪失である。一実施形態において、モジュレーションは、コードされるｍＲＮＡの選択的スプライシングである。
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物は、オリゴヌクレオチド化合物を標的とする標的核酸配列内の標的領域との、約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列相補性を含む。例えば、オリゴヌクレオチド化合物の２０個のうちの１８個のヌクレオチドが、標的領域に相補的であり、それゆえ特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、９０パーセントの相補性を表し得る。
一実施形態において、オリゴヌクレオチドとその標的核酸配列との間の相同性は、約５０％～約６０％である。一部の実施形態において、相同性は約６０％～約７０％である。一部の実施形態において、相同性は約７０％～約８０％である。一部の実施形態において、相同性は約８０％～約８５％である。一部の実施形態において、相同性は約８５％～約９０％である。一部の実施形態において、相同性は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％である。
一実施形態において、オリゴヌクレオチドとその標的核酸配列との間の配列同一性は、約５０％～約６０％である。さらなる実施形態において、相同性は約６０％～約７０％である。さらなる実施形態において、相同性は約７０％～約８０％である。さらなる実施形態において、相同性は約８０％～約８５％である。さらなる実施形態において、相同性は約８５％～約９０％である。さらなる実施形態において、相同性は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％である。
実施形態において、配列は、標的に少なくとも部分的に相補的であるか、部分的に相補的であるか、または完全に相補的である。例えば、一実施形態において、オリゴヌクレオチドとその標的核酸配列との間の相補性は、約５０％～約６０％である。別の実施形態において、相同性は約６０％～約７０％である。別の実施形態において、相同性は約７０％～約８０％である。別の実施形態において、相同性は約８０％～約８５％である。別の実施形態において、相同性は約８５％～約９０％である。別の実施形態において、相同性は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％である。
「完璧に」または「完全に」相補的な核酸分子とは、第１の核酸分子のある特定の数のヌクレオチドが、第２の核酸分子における同じ数の残基と水素結合して（アニールして）、連続的な二本鎖領域を形成するものを意味する。例えば、２種以上の完全に相補的な核酸分子鎖は、同じ数のヌクレオチドを有し得る（すなわち、同じ長さを有し、突出の有無にかかわらず１つの二本鎖領域を形成する）、または異なる数のヌクレオチドを有し得る（例えば、一方の鎖は、もう一方の鎖より短くあり得るがその内に完全に含有され得る、または一方の鎖は、他方の鎖に覆いかぶさり得る）。
「部分的に相補的な」とは、もう一方の核酸に実質的に相補的な配列を有するが、他方の核酸と少なくとも１個または複数のヌクレオチドで異なる、そうした核酸分子を意味する。ある特定の実施形態において、部分的に相補的な核酸は、正確に相補的である配列、つまり１００％の相補性を有する相補的配列を含有する核酸を具体的に除外する。
実施形態において、核酸分子は、変異体ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡに相補的であるか、または部分的に相補的であるが、野生型ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡには相補的でない。例えば、図４、パネルａを参照されたい。
実施形態において、標的核酸は、
（配列番号［］）
の配列を含み得る。
Ｘ１～Ｘ４は、野生型ＫＲＡＳと比べた１個または複数の変異に相当する。例えば、Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；Ｘ２は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；Ｘ３は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；Ｘ４は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；またはその任意の組み合わせである。例えば、標的核酸は、
（配列番号［］）、
（配列番号［］）、
（配列番号［］）、および
（配列番号［］）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み得る。
実施形態において、標的核酸は、
（配列番号［］）
の配列を含み得る。
Ｘ１～Ｘ２は、野生型ＮＲＡＳと比べた１個または複数の変異に相当する。例えば、Ｘ１は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；Ｘ２は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；またはその任意の組み合わせである。例えば、標的核酸は、
（配列番号［］）、
（配列番号［］）、
（配列番号［］）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み得る。
実施形態において、標的核酸は、
（配列番号［］）
の配列を含み得る。
Ｘ１～Ｘ２は、野生型ＨＲＡＳと比べた１個または複数の変異に相当する。例えば、Ｘ１は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；Ｘ２は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；またはその任意の組み合わせである。例えば、標的核酸は、
（配列番号［］）
（配列番号［］）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み得る。
一実施形態において、オリゴヌクレオチド（すなわち、核酸分子）は、限定されることなくコーディングおよびノンコーディング領域を含む、ＲＡＳファミリー遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ）のプレ－ｍＲＮＡに特異的であり得る（すなわち、ハイブリダイズする）。一実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスＲＮＡ分子である。一実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスＤＮＡ分子である。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＡＳファミリー遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ）の天然アンチセンス配列（コーディングおよびノンコーディング領域に対する天然アンチセンス）を標的にする。一実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスＲＮＡ分子である。一実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスＤＮＡ分子である。
本明細書において論じられるオリゴヌクレオチド化合物は、異なる塩基が、オリゴヌクレオチド化合物におけるヌクレオチド位置の１つまたは複数に存在する変種も含み得る。例えば、第１のヌクレオチドがアデニンである場合、その位置にチミジン、グアノシン、シチジン、または他の天然もしくは非天然ヌクレオチドを含有する変種が産生され得る。塩基置換は、オリゴヌクレオチドの位置のいずれかにおいて行われ得る。次いで、オリゴヌクレオチド化合物を、本明細書に記載される方法を使用して試験して、ＲＡＳのメンバー（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）等の標的核酸の発現および／または機能を阻害するオリゴヌクレオチド化合物の能力を判定し得る。
一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、単離されたオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において使用するとき、「単離された」という用語は、天然環境（例えば、天然環境は細胞であり得る）における共存する材料の一部またはすべてから分離されている等、その元の環境から取り出されている参照材料（例えば、本明細書における開示の核酸分子）を指し得る。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号［］）
に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
例えば、Ｘ１は、ＧもしくはＴである；Ｘ２は、ＡもしくはＴである；Ｘ３は、ＧもしくはＴである；Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；またはその任意の組み合わせである。例えば、オリゴヌクレオチドは、
Ｍ１ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号［］）、
Ｍ２ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号［］）、
Ｍ３ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号［］）、
Ｍ４ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号［］）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＣＴＴＸ１Ｘ２ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号［］］
に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
例えば、Ｘ１は、ＧもしくはＴである；Ｘ２は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；またはその任意の組み合わせである。
例えば、オリゴヌクレオチドは、
１－１ ５’－ＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号［］］、
１－２ ５’－ＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
１－３ ５’－ＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’［配列番号［］］、
１－４ ５’－ＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴ－３’［配列番号［］］、
１－５ ５’－ＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴ－３’［配列番号［］］、または
１－６ ５’－ＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧ－３’［配列番号［］］
の配列を含む。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４－３’
の配列を含み、配列は、５’隣接ヌクレオチド、３’隣接ヌクレオチド、または５’隣接ヌクレオチドおよび３’隣接ヌクレオチドの両方をさらに含む。この文脈において、「隣接ヌクレオチド」という用語は、５’－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４－３’配列に近接したヌクレオチドを指し得る。ある特定の実施形態において、隣接ヌクレオチドは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチドを含む。実施形態において、配列は、その５’末端、３’末端、またはその両方に隣接ヌクレオチドを含む。実施形態において、隣接配列は、標的核酸へのハイブリダイゼーションに適切な長さである。
実施形態において、隣接ヌクレオチドは、０～１０個のヌクレオチド等、０～２０個のヌクレオチド等、０～３０個のヌクレオチド等、０～４０個のヌクレオチド等、０～５０個のヌクレオチドを含み得る。実施形態において、隣接ヌクレオチドは、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡに相補的であるか、または部分的に相補的である配列を含み得る。
例えば、Ｘ１は、ＧもしくはＴである；Ｘ２は、ＡもしくはＴである；Ｘ３は、ＧもしくはＴである；Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；またはその任意の組み合わせである。例えば、オリゴヌクレオチドは、
ｍｏｒ－４－１ ５’－ＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣ－３’（配列番号［］）
ｍｏｒ－４－２ ５’－ＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡ－３’（配列番号［］）
ｍｏｒ－４－３ ５’－ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’（配列番号［］）
ｍｏｒ－４－４ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号［］）
ｍｏｒ－４－５ ５’－ＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’（配列番号［］）
ｍｏｒ－４－７ ５’－ＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴ－３’（配列番号［］）
ｍｏｒ－４－８ ５’－ＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡ－３’（配列番号［］）
の配列を含む。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＸ１Ｘ２ＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’（配列番号［］）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
例えば、Ｘ１は、Ｃ、Ｔ、もしくはＡである；Ｘ２は、ＴもしくはＧである；またはその任意の組み合わせである。例えば、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’（配列番号［］）、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’（配列番号［］）、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’（配列番号［］）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２ＧＧＣＣＧＧ－３’（配列番号［］）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
例えば、Ｘ１は、ＡもしくはＣである；Ｘ２は、ＴもしくはＡである；またはその任意の組み合わせである。例えば、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧ－３’（配列番号［］）、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧ－３’（配列番号［］）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
本発明によれば、オリゴヌクレオチド化合物は、オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載される１種または複数の特性を呈するように修飾される少なくとも１つの領域を含み得る。オリゴヌクレオチドの特性は、例えば、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合アフィニティーの増加を含むが、それらに限定されるわけではない。修飾されたオリゴヌクレオチドは、例えば、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチド（例えば、Schcit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980；Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443、Toulme, J. J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18；Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139；Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443、Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213、Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310によって記載されるものを参照されたい）；または２’－Ｏ，３’－Ｃ連結［３．２．０］ビシクロアラビノヌクレオシドを含み得る。そのような修飾されたヌクレオチドは、結合特性、例えば二重鎖または三重鎖安定性、特異性等を増強するように設計された合成ヌクレオチドを含む。
修飾されたヌクレオチドを有するＤＮＡまたはＲＮＡ、置換されたヌクレオチドを有するＤＮＡまたはＲＮＡ等かどうかにかかわらず、オリゴヌクレオチド化合物は、標的核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）へのオリゴヌクレオチド化合物の結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害する場合、特異的にハイブリダイズし得る。さらなる修飾は、オリゴヌクレオチド化合物の末端の一方にもしくはオリゴヌクレオチド化合物の選択されたヌクレオチド位置に接着したコンジュゲート基、糖環の多様な位置に付加したコンジュゲート基、またはヌクレオチド間連結の一方に付加したコンジュゲート基を含み得る。一実施形態において、妨害は、標的核酸の実用性の喪失を引き起こし得、特異的結合が必要とされる条件下では、非標的核酸配列へのオリゴヌクレオチド化合物の非特異的結合を回避する十分な程度の相補性がある。特異的結合が必要とされる条件は、インビボアッセイにおけるもしくは治療的処置における生理学的条件、またはインビトロアッセイが実施される条件を含むが、それらに限定されるわけではない。
ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、および標的核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズしかつその機能をモジュレートする他のオリゴヌクレオチドを含むがそれらに限定されない、アンチセンス化合物のグループを含む。アンチセンス化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンであり得、ミスマッチまたはループ等の構造要素を含み得る。アンチセンス化合物は、ルーチン的に線状に調製されるが、当業者であれば、アンチセンス化合物が、環状および／または分岐状であるように接合されるまたは別様に調製されるように調製し得る。
一実施形態において、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡの核酸配列に向けられたオリゴヌクレオチド化合物は、１個または複数の修飾されたヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、より短いまたはより長いフラグメント長（例えば、１５－、１６－、１７－、１８－、１９－、２０－、２１－、２２－、２３－、２４－、２５－、２６－、２７－、２８－、２９－、３０－、３１－、３２－、３３－、３４－、３５－、３６－、３７－、３８－、３９－、４０－、４１－、４２－、４３－、４４－、４５－、４６－、４７－、４８－、４９－、または５０－ｍｅｒ）を含み得る。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、修飾された結合またはヌクレオチド間連結を含み得る。修飾された結合またはヌクレオチド間連結の非限定的な例は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）等を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物はリン誘導体を含み得る。一実施形態において、リン誘導体（または修飾されたリン酸基）は、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドにおける糖または糖類似体部分に接着され得る。リン誘導体（または修飾されたリン酸基）の非限定的な例は、モノホスフェート（monophosphate）、ジホスフェート（diphosphate）、トリホスフェート（triphosphate）、アルキルホスフェート（alkylphosphate）、アルカンホスフェート（alkanephosphate）、ホスホロチオエート（phosphorothioate）等を含む。例示的なリン誘導体（または修飾されたリン酸基）の調製、およびヌクレオチドへのそれらの組み込み（例えば、本発明のオリゴヌクレオチド化合物を含むもの）は、当技術分野において周知である。実施形態において、修飾された核酸は、糖修飾、骨格修飾、塩基修飾、非天然塩基対、細胞透過性ペプチドへのコンジュゲーション、またはその任意の組み合わせを含む。実施形態において、修飾は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）＋２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）を含む。実施形態において、修飾された核酸は、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アミド架橋核酸（ＡｍＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
いくつかのヌクレオチド修飾は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、天然オリゴデオキシヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより抵抗性にすることが示されている。それらのヌクレアーゼ抵抗性を増強するように修飾されているオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも長い時間無傷で生き残る。本明細書において論じられるように、本発明の実施形態は、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡに向けられた修飾されたＡＳＯ等、修飾されたオリゴヌクレオチドを包含する。修飾されたオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをＲＮａｓｅ Ｈ分解に対して抵抗性にする２’－Ｏ－メチル修飾オリゴリボヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（phosphorothioate）骨格を含む。例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate）骨格は、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチド化合物の安定性を増加させ、細胞取り込みを増強する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、全長ホスホロジアミデート（phosphorodiamidate）ＤＮＡを含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、２’Ｏ－メチル修飾を有する１個または複数のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、本明細書において論じられる１種または複数の修飾を含む。修飾された骨格の非限定的な例は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスフィネート（phosphinate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、ホスホロアミデート（phosphoramidate）、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（alkyl phosphonate）（例えば、３’アルキレンホスホネート（alkylene phosphonate）を含むホスホネート（phosphonate）、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間連結を含む。一実施形態において、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡの核酸配列に向けられたオリゴヌクレオチド化合物は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）骨格を含む。
一実施形態において、修飾されたオリゴヌクレオチド化合物は、糖の２’位で修飾された少なくとも１個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、糖の２’位に修飾を有するヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、または２’－フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース上での２’－フルオロ、２’－アミノ、および２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
本明細書において論じられるように、オリゴヌクレオチド化合物は、モルホリノホスホロジアミデート（phosphorodiamidate）ＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびエチレン架橋核酸等の付加的な修飾を含み得る。これらの修飾は、オリゴヌクレオチド化合物をＲＮａｓｅ Ｈおよびヌクレアーゼ抵抗性にし得、ならびに標的ＲＮＡに対するアフィニティーを増加させ得る。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、モルホリノ骨格構造を有する（例えば、参照によりその全体として本明細書によって組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号明細書においてＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒによって開示される）。モルホリノは、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣ、Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ Ｏｒｅｇ．；http://www.gene-tools.com/を通じて市販されている。
例えば、オリゴヌクレオチド類似体のモルホリノ骨格は、それらをヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対して抵抗性にし得、それにより、それらは細胞において長寿命である。
例えば、モルホリノは、ペプチドコンジュゲートモルホリノであり得る（例えば、参照によりそれらの全体として本明細書によって組み込まれる、BoisguerinらAdvanced Drug Delivery Review 87 (2015) 52-67およびKleinら The Journal of Clinical Investigation, 2019, 129(11):4739-4744に記載される）。例えば、ペプチドコンジュゲートモルホリノは、「細胞透過性ペプチドコンジュゲートモルホリノ」であり得る。実施形態において、細胞透過性ペプチドコンジュゲートモルホリノは、体内における送達の増加を有し得る。細胞透過性ペプチドコンジュゲートモルホリノは当業者に公知であろう。例えば、Klein, Arnaud F.,ら "Peptide-conjugated oligonucleotides evoke long-lasting myotonic dystrophy correction in patient-derived cells and mice." The Journal of clinical investigation 129.11 (2019): 4739-4744、およびBoisguerin, Prisca,ら"Delivery of therapeutic oligonucleotides with cell penetrating peptides." Advanced drug delivery reviews 87 (2015): 52-67を参照されたい。
オリゴヌクレオチドに組み込まれるいくつかのヌクレオチド修飾（例えば、オリゴヌクレオチド類似体をもたらす）は、オリゴヌクレオチドを立体ブロッキング（steric blocking）適用に有用にする。例えば、Jarverら(2014) Nuc. Acid Therap., 24(1):37-47（参照によりその全体として組み込まれる）に開示される、オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエート（oligodeoxynucleotide phosphorothioate）（ＤＮＡ－ＰＳ）、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート（methylphosphorothioate）（ＯＭｅ－ＰＳ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド（２’－Ｆ）、ロックド核酸（ＬＮＡ；架橋核酸（ＢＮＡ）とも称される）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、トリシクロＤＮＡ類似体（ＴｃＤＮＡ）、および２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］ウリジン（ＭＣＥ）等の負に帯電したオリゴヌクレオチド類似体を使用して、エクソンスキッピングを誘導し得る：
［式中、Ｒは、負に帯電したオリゴヌクレオチド類似体においてＯまたはＳであり得る］。
一実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド化合物は、１種または複数の置換または修飾を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個のロックド核酸（ＬＮＡ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個のホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート（methylphosphorothioate）（ＯＭｅ－ＰＳ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個の２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個の２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド（２’－Ｆ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個のエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個のトリシクロＤＮＡ類似体（ＴｃＤＮＡ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個の２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］ウリジン（ＭＣＥ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個のオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエート（oligodeoxynucleotide phosphorothioate）（ＤＮＡ－ＰＳ）、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート（methylphosphorothioate）（ＯＭｅ－ＰＳ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド（２’－Ｆ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、トリシクロＤＮＡ類似体（ＴｃＤＮＡ）、２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］ウリジン（ＭＣＥ）、またはその組み合わせで置換される。
電荷中性のペプチド核酸（ＰＮＡ）およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide）（ＰＭＯ）は、エクソンスキッピングを誘導するために使用され得る、Jarverら(2014) Nuc. Acid Therap., 24(1):37-47（参照によりその全体として組み込まれる）に開示されるオリゴヌクレオチド類似体のさらなる例である：
一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個のペプチド核酸（ＰＮＡ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個のホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）で置換される。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１個のペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）、またはその組み合わせで置換される。
モルホリノサブユニットの非荷電骨格に起因して、これらのオリゴヌクレオチド類似体は、それらの相補的な標的ＲＮＡにしっかりと結合し得る。モルホリノは、それらの相補的配列に結合し、タンパク質または核酸による結合を除外することによって働く。一実施形態において、エクソンスプライシングエンハンサー結合モチーフへの結合は、スプライシング機構によるそれらの配列の認識を妨害し得る。モルホリノは、タンパク質ノックダウン実験に最もよく使用されている。ｍＲＮＡにおける開始ＡＵＧに結合するように設計されたモルホリノは、リボソームによる翻訳開始を遮断するであろう。モルホリノの利点は、それらが、活性を、ＲＩＳＣ、ダイサー、またはＲＮａｓｅＨ等のアクセサリータンパク質発現に依存していないことから、種々の種および種々の組織において働く予測可能な方策である。
一実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド化合物は、選択された標的核酸配列に結合してスプライシングをモジュレートし得る。一部の実施形態において、エクソンスプライシングエンハンサー結合ドメインをマスキングすることは、スプライシングをモジュレートし得る。一実施形態において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド化合物は、エクソンを保持させ得；ゆえに、エクソンが保持された場合、例えばｍＲＮＡは機能的タンパク質をコードし得る。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡの標的核酸配列に向けられた修飾されたオリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡの標的核酸配列に向けられた修飾されたオリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１つのモルホリノサブユニットを含む。
一部の実施形態において、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡの核酸配列に向けられたオリゴヌクレオチド化合物は、修飾されたオリゴヌクレオチドである。本発明によれば、選択された標的核酸に結合してスプライシングをモジュレートし得る、２種以上のオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせまたは「カクテル」が提供され得る。
本発明の実践において有用な標的部位は、ｍＲＮＡスプライシングに関与するものである（スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、またはエクソンスプライシングエンハンサーエレメント等）。スプライシング分岐点およびエクソン認識配列またはスプライスエンハンサーは、ｍＲＮＡスプライシングのモジュレーションのための潜在的標的部位でもある。一実施形態において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド化合物は、選択された標的核酸配列に結合してエクソンスキッピングを誘導し得る。一部の実施形態において、ドナースプライス部位をマスキングすることは、エクソンスキッピングを誘導し得る。一部の実施形態において、アクセプタースプライス部位をマスキングすることは、エクソンスキッピングを誘導し得る。例えば、モルホリノオリゴマーの性質のおかげで、当業者であれば、スプライス接合部に確実に結合するであろう配列を特定し得る。本明細書における実施例に記載されるように、標的モルホリノＳＳＯの効力は、組織培養において迅速に突き止められ得る。
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド化合物の別の修飾は、オリゴヌクレオチドに１種または複数の部分またはコンジュゲートを化学的に連結することを伴い、それは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する。これらの部分またはコンジュゲートは、第１級または第２級ヒドロキシル基等の官能基に共有結合したコンジュゲート基を含み得る。部分およびコンジュゲートの非限定的な例は、脂質部分（コレステロール部分、コレステリル部分、チオコレステロール部分等）、インターカレーター、レポーター分子、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分、リン脂質、脂肪族鎖（ドデカンジオールまたはウンデシル残基等）、ポリアミン鎖、ポリアミド鎖、ポリエチレングリコール鎖、ポリエーテル鎖、コール酸、およびアダマンタン酢酸を含む。コンジュゲート基の例は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含むが、それらに限定されるわけではない。
親油性部分を含むオリゴヌクレオチド化合物、およびそのようなものを調製するための方法は、例えば、そのそれぞれが参照によりその全体として組み込まれる、米国特許第５，１３８，０４５号明細書、第５，２１８，１０５号明細書、および第５，４５９，２５５号明細書に記載されるように、当技術分野において公知である。
オリゴヌクレオチド化合物コンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、そのそれぞれが参照によりその全体として本明細書によって組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；第４，９４８，８８２号明細書；第５，２１８，１０５号明細書；第５，５２５，４６５号明細書；第５，５４１，３１３号明細書；第５，５４５，７３０号明細書；第５，５５２，５３８号明細書；第５，５７８，７１７号明細書；第５，５８０，７３１号明細書；第５，５８０，７３１号明細書；第５，５９１，５８４号明細書；第５，１０９，１２４号明細書；第５，１１８，８０２号明細書；第５，１３８，０４５号明細書；第５，４１４，０７７号明細書；第５，４８６，６０３号明細書；第５，５１２，４３９号明細書；第５，５７８，７１８号明細書；第５，６０８，０４６号明細書；第４，５８７，０４４号明細書；第４，６０５，７３５号明細書；第４，６６７，０２５号明細書；第４，７６２，７７９号明細書；第４，７８９，７３７号明細書；第４，８２４，９４１号明細書；第４，８３５，２６３号明細書；第４，８７６，３３５号明細書；第４，９０４，５８２号明細書；第４，９５８，０１３号明細書；第５，０８２，８３０号明細書；第５，１１２，９６３号明細書；第５，２１４，１３６号明細書；第５，０８２，８３０号明細書；第５，１１２，９６３号明細書；第５，２１４，１３６号明細書；第５，２４５，０２２号明細書；第５，２５４，４６９号明細書；第５，２５８，５０６号明細書；第５，２６２，５３６号明細書；第５，２７２，２５０号明細書；第５，２９２，８７３号明細書；第５，３１７，０９８号明細書；第５，３７１，２４１号明細書；第５，３９１，７２３号明細書；第５，４１６，２０３号明細書；第５，４５１，４６３号明細書；第５，５１０，４７５号明細書；第５，５１２，６６７号明細書；第５，５１４，７８５号明細書；第５，５６５，５５２号明細書；第５，５６７，８１０号明細書；第５，５７４，１４２号明細書；第５，５８５，４８１号明細書；第５，５８７，３７１号明細書；第５，５９５，７２６号明細書；第５，５９７，６９６号明細書；第５，５９９，９２３号明細書；第５，５９９，９２８号明細書；および第５，６８８，９４１号明細書を含むが、それらに限定されるわけではない。代表的なコンジュゲート基は、そのそれぞれが参照によりその全体として組み込まれる、米国特許第５，５７８，７１８号明細書；第６，１５３，７３７号明細書；第６，２８７，８６０号明細書；および第６，７８３，９３１号明細書に開示される。
オリゴヌクレオチド化合物は、固相合成の確立された技法により好都合にかつルーチン的に作製され得る。そのような合成に有用な設備は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含めた、いくつかの商業的供給業者を通じて獲得され得る。オリゴヌクレオチド化合物の合成は、当業者によってよく理解されている。同様の技法を使用して、ホスホロチオエート（phosphorothioate）およびアルキル化誘導体等の他のオリゴヌクレオチドを調製することも、当技術分野において周知である。同様の技法、ならびにビオチン、フルオレセイン、アクリジン、またはソラレン修飾アミダイトおよび／または制御性多孔質ガラス（ＣＰＧ）等、市販の修飾されたアミダイトおよびＣＰＧ製品（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｖａ．から入手可能）を使用して、コレステロール修飾オリゴヌクレオチド等、蛍光標識された、ビオチン化された、または他の修飾されたオリゴヌクレオチドを合成することも周知である。モルホリノは、例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、ＬＬＣ、Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ Ｏｒｅｇ．；http://www.gene-tools.com/を通じて市販されている。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド化合物（ＡＳＯおよびＳＳＯ等）はインビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物、またはオリゴヌクレオチド化合物のインビボ合成を指揮するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、修飾されたオリゴヌクレオチド化合物）は、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡの標的核酸配列のコーディングおよび／またはノンコーディング領域に結合し、標的分子の発現および／または機能をモジュレートする。
一続きの少なくとも五（５）個の連続を含む、長さが約５～１００個のヌクレオチドの標的核酸配列が、標的化に適切である。標的核酸配列は、ＲＡＳタンパク質をコードする遺伝子の５’末端からの少なくとも５個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含み得る。標的核酸配列は、ＲＡＳタンパク質をコードする遺伝子の３’末端からの少なくとも５個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含み得る。
一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、標的核酸配列のセンスまたはアンチセンス鎖に結合する。標的核酸配列は、コーディングならびにノンコーディング領域を含む。オリゴヌクレオチド化合物は、長さが約１０個のヌクレオチドから長さが最高約５０個のヌクレオチドであり得る。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、長さが１０～５０個のヌクレオチドである。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、長さが少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１５個のヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが２０個のヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが２５個のヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが２０個のヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが３０個のヌクレオチドである。
疾患に対する治療および療法
本明細書において提供されるように、本明細書に開示される態様および実施形態のいずれかは、１種または複数の過剰増殖性疾患または障害、例えば白血病、皮膚黒色腫、腺癌、扁平上皮癌、フィラデルフィア染色体陰性骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、移行上皮癌、卵巣がん、脳腫瘍、乳がん、膀胱がん、肺がん、腎臓腫瘍、尿路腫瘍、膵臓がん、および結腸直腸腺腫；ならびに、１種または複数の血管新生疾患または障害等、それを必要とする対象におけるＲＡＳ関連疾患または障害を治療することにおいて有用であり得る。例えば、方法は、本明細書に記載される核酸分子またはそれを含む組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含み得る。
実施形態において、ＲＡＳ関連疾患または障害は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳにおける少なくとも１個の変異を含むがん等のがんである。例えば、がんは、ＲＡＳのコドン６１内に少なくとも１個の変異を含み得る。例えば、少なくとも１個の変異は、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、またはＱ６１Ｋを含む。実施形態において、がんは、コドン６０内に少なくとも１個の変異を含み得る。実施形態において、がんは、コドン６０内の変異およびコドン６１内の変異を含み得る。実施形態において、変異は、Ｇ６０Ｘ、Ｑ６１Ｘ、またはその組み合わせを含む。例えば、変異はＧＱ６０ＧＫを含む。
「動物」、「対象」、および「患者」という用語は、互換可能に使用され得、哺乳類、動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ等）、およびヒトを含むがそれらに限定されない、動物界のメンバーを指し得る。
本明細書において使用されるようにかつ当技術分野においてよく理解されているように、「治療」とは、臨床結果を含めた有益な結果を獲得するための手法である。有益な臨床結果は、検出可能か検出不能かどうかにかかわらず、１種または複数の症状または病状の緩和または改善、疾患の程度の縮小、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の広がりを阻止すること、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分的または全体的かどうかに関わらない）を含み得るが、それらに限定されるわけではない。「治療」とは、治療を受けない場合の予想生存期間と比較して延びた生存期間も指し得る。
「それを必要とする」という用語は、がん等、例えばＲＡＳ関連疾患または病状等の病状からの症候的または無症候的救済の必要性を指し得る。それを必要とする対象は、例えばがんと関係した病状に対する治療を受けている可能性がある。
本発明の態様は、対象においてＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするための方法に向けたものでもある。例えば、方法は、本明細書に記載される核酸分子またはそれを含む組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。
本発明の態様は、にさら、腫瘍細胞においてＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするための方法に向けたものである。例えば、方法は、腫瘍細胞と、腫瘍細胞においてＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするのに有効な量の、本明細書に記載される核酸分子とを接触させるステップを含む。実施形態において、スプライシングは、正常細胞においてではなく、変異したＲＡＳを含むもの等の腫瘍細胞においてモジュレートされる。
本明細書において使用するとき、「スプライシングをモジュレートすること」とは、ｍＲＮＡのスプライシングパターンを変化させることを指し得、エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、イントロンインクルージョン、近隣の隠れたスプライス部位の利用、または新たなスプライス部位の作出を促進することまたは阻害することを含む。スプライシングパターンの変更は１００％である必要はなく、すなわち、促進することおよび阻害することは、元のプレ－ｍＲＮＡ（変異なしまたは化合物処理なし）における頻度と比べて、スプライシング事象が生じる（または生じない）頻度を増加させることおよび減少させることを指す。
本明細書に記載されるように、スプライシングをモジュレートすることは、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのエクソン３のスプライシングをモジュレートすることを指し得る。
本開示は、がん等のＲＡＳ関連疾患または病状の治療に有用な小分子治療法（例えば、裸のまたは修飾された、オリゴヌクレオチド化合物）も含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を対象に投与して、ＲＡＳと関連した疾患または障害を阻止するまたは治療する。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡの標的核酸配列に向けられている。一実施形態において、有効量のオリゴヌクレオチド化合物が対象に投与される。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、ヌクレアーゼ抵抗性である修飾されたオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、薬学的に許容される担体中に、対象に投与される医薬組成物を含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはスプライシングをモジュレートする）は、多様なＲＡＳ関連疾患または病状の治療のための治療方法としての役割を果たし得る。
治療法に関して、ＲＡＳの核酸配列の発現をモジュレートすることによって治療され得る、疾患または障害（ＲＡＳ関連疾患または病状等）を有する疑いがある対象、例えばヒトは、本発明に従ってオリゴヌクレオチド化合物（ＡＳＯ等）を投与することによって治療される。一実施形態において、ＲＡＳタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子産物の相補的核酸配列に標的化される、長さが１５～３０個のヌクレオチド塩基のヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチド等、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド化合物を含む医薬組成物が対象に投与される。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡとハイブリダイズし、正常対照と比較して、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングを約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％モジュレートする。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、少なくとも１種の修飾を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１７～２８個のヌクレオチド塩基である。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１８～２５個のヌクレオチド塩基である。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１９～２３個のヌクレオチド塩基である。
一実施形態において、オリゴヌクレオチド複合体を含むオリゴヌクレオチド化合物である医薬組成物が投与され得る。
本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、適切な薬学的に許容される希釈剤または担体に有効量の化合物を添加することによって、医薬組成物において利用され得る。本発明のオリゴヌクレオチド化合物および方法の使用は、予防的にも有用であり得る。
本明細書において使用される「有効量」、「十分量」、または「治療有効量」とは、臨床結果を含めた有益な結果を生じさせるのに十分である、組成物の量である。そのため、有効量は、例えば、苦痛もしくは病状の重症度および／もしくは継続期間、またはその１つもしくは複数の症状を低下させるまたは改善するのに、苦痛または病状と関係した病状の前進を阻止するのに、苦痛または病状と関連した１つまたは複数の症状の再発、発症、または発生を阻止するのに、あるいは別の療法の予防的または治療的効果を増強するまたは別様に向上させるのに十分であり得る。有効量は、望ましくない副作用を回避するまたは実質的に弱める、組成物（例えば、本明細書において論じられるオリゴヌクレオチド化合物）の量も含む。
「担体」という用語は、それとともに化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し得る。そのような薬学的担体の非限定的な例は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等、石油、動物、植物、または合成起源のものを含めた、水および油等の液体を含む。薬学的担体は、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素等でもあり得る。加えて、助剤、安定化剤、増粘剤、平滑剤、および着色剤が使用され得る。適切な薬学的担体の他の例は、それぞれが参照によりその全体として本明細書によって組み込まれる、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition (University of the Sciences in Philadelphia, 編, Lippincott Williams & Wilkins 2005)；およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 第7版(Raymond Rowe ら, 編, Pharmaceutical Press 2012)に記載される。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的にかつ薬学的に許容される塩：すなわち、親化合物の要される生物学的活性を保持しかつそれに望ましくない毒物学的効果を与えない塩を指し得る。薬学的に許容される担体は、薬学的投与と適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含み得る。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。活性化合物と適合する任意の好都合な媒体または作用物質が使用され得る。補足的な活性化合物も組成物に組み込まれ得る。オリゴヌクレオチド化合物に関して、薬学的に許容される塩およびそれらの使用の例は、参照によりその全体として本明細書によって組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載される。
一実施形態において、ＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングのモジュレーションは、１種または複数のオリゴヌクレオチド化合物（例えば、裸のまたは修飾された、ＡＳＯまたはＳＳＯ）をそれを必要とする対象に投与することによってもたらされ得る。一実施形態において、正常対照と比較して、ＲＡＳタンパク質のサブユニットの異常な発現、機能、活性と関係するＲＡＳ関連疾患または病状の阻止、改善、または治療も、１種または複数のオリゴヌクレオチド化合物（例えば、裸のまたは修飾された、ＡＳＯまたはＳＳＯ）をそれを必要とする対象に投与することによってもたらされ得る。
本発明の実施形態は単独で投与され得る、または治療用カクテルにおいてもしくは医薬組成物として投与され得る。例えば、医薬組成物は、本発明の実施形態、およびリン酸塩緩衝液を含む生理食塩溶液を含み得る。本発明の実施形態は、本明細書に記載される手段および用量を使用して投与され得る。本発明の実施形態は、適切な担体との組み合わせで投与され得る。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物（例えば、ＡＳＯおよびＳＳＯ）は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または対象に投与されると、生物学的に活性なその代謝産物もしくは残基を（直接的にまたは間接的に）提供する任意の他の化合物を包含する。
本開示の付加的な態様の内で、本明細書に記載されるＲＡＳ関連疾患または病状を制御するために、本開示のオリゴヌクレオチドと一緒に製剤化されるまたはそれと協調的に投与される１種または複数の二次的または補助的な活性剤との組み合わせで、本開示の１種または複数のオリゴヌクレオチドの有効量を含む組み合わせ製剤および方法が提供される。これらのコンビナトリアル製剤および協調的治療方法における有用な補助的治療剤は、例えば、酵素的核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、またはアプタマー核酸分子、モノクローナル抗体等の抗体、小分子、ならびに金属、塩、およびイオンを含めた他の有機または無機化合物、ならびにがんを治療するために使用される化学療法剤を含めた、ＲＡＳ関連疾患または病状を治療するために適応される他の薬物および活性剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、チロシンキナーゼ阻害剤等を含む。例示的な化学療法剤は、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ブスルファン、ニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、ウラムスチン、テモゾロミド）、代謝拮抗物質（例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、メルカプトプリン、フルオロウラシル、シタラビン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン（idaruicin）、ミトキサントロン、バルルビシン）、ブレオマイシン、マイトマイシン（mytomycin）、アクチノマイシン、ヒドロキシウレア、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド）、モノクローナル抗体（例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ロイコボリン、オキサリプラチンを含む。
一部の補助的療法は、ＲＡＳと相互作用するもしくは結び付く、または特異的なＲＡＳ生物学的活性に影響を及ぼす標的に向けられ得る。小分子および抗体またはそのフラグメントを含むがそれらに限定されない、補助的療法として適切に採用され得る、ＲＡＳの色々な阻害剤が記載されている。
小分子ＮＲＡＳ阻害剤は、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＥＫ１／２阻害剤、および阻害性ＲＡＳアイソフォームを含む。ＦＴＩ－２７７およびＲｌ １５７７７等のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、細胞膜へのＮＲＡＳの移行を妨害する（Ugurelら, PLoS ONE 2:2, 2007；Lernerら, Oncogene 15: 11, 1997；Ochiaiら, Blood 102:9, 2003）。最近の研究は、ＭＥＫ１／２阻害剤ＰＤ９８０５９およびＵ０１２６が、ヒツジ肺腺癌と関連したＮＲＡＳ－ＭＥＫ－分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ４４／４２経路を不活性化することを示した（Maedaら, J. Virol 79:1, 2005）。セリン１７をアスパラギンで置換する、３種のＲＡＳアイソフォームのそれぞれに対するドミナント阻害性変異体が創出されている（Matallanasら, J. Biol. Chem. 278:1, 2003）。３種のうちの２種のＲＡＳアイソフォームＮＲＡＳ Ｎ１７およびＨＲＡＳ Ｎ１７は、野生型ＮＲＡＳを阻害することが示された（Matallanasら, J. Biol Chem. 278:1, 2003）。
小分子ＨＲＡＳ阻害剤は、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、Ｓ－トランス、トランス－ファルネシルチオサリチル酸、およびジアリルジスルフィド（ＤＡＤＳ）を含む。一部の公知のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、ＦＴＩ－２７７およびＲｌ １５１１１を含む。ＦＴＩ－２７７およびＲｌ １５７７７等のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、細胞膜へのＨＲＡＳの移行を妨害する（Lernerら, Oncogene 15: 11, 1997；Ochiaiら, Blood 102:9, 2003；Zhuら, Blood 105: 12, 2005）。新たな合成のファルネシル化された剛直なカルボン酸誘導体であるＳ－トランス、トランス－ファルネシルチオサリチル酸は、その膜係留ドメインからＨＲＡＳを取り外し、ＨＲＡＳ分解を加速させることが示されている（Gana-Weiszら, Clinical Cancer Research 8, 2002）。ニンニクにおける天然に存在する有機硫黄化合物ＤＡＤＳは、ラットモデルにおける実験的脳Ｃ６神経膠腫の治療において有効であることが示されている（Perkinsら, MoI Brain Res. Ill, 2003）。付加的に、セリン１７をアスパラギンで置換する、３種のＲＡＳアイソフォームのそれぞれに対するドミナント阻害性変異体が創出されている（Matallanasら, J. Biol. Chem. 278:1, 2003）。
ＫＲＡＳの少なくとも１種の公知の阻害剤が、補助的療法として適切に採用され得る。新たな合成のファルネシル化された剛直なカルボン酸誘導体であるＳ－トランス、トランス－ファルネシルチオサリチル酸は、その膜係留ドメインからＫＲＡＳを取り外し、ＫＲＡＳ分解を加速させることが示されている（Jiら, J. Biol. Chem. 282: 19, 2007）。本開示の協調的投与法を実践するために、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される二次的または補助的治療剤の１種または複数を用いた協調的治療プロトコールにおいて同時にまたは逐次的に投与される。協調的投与は任意の順序で行われ得、一方のみまたは両方の活性治療剤が個々にまたは集合的にそれらの生物学的活性を発揮する間に期間があり得る。そのような協調的治療方法の際立った態様は、組成物に存在するオリゴヌクレオチドが、何らかの望ましい臨床応答を引き出し、それが、二次的治療剤によって提供される二次的臨床応答と連動し得ることである。例えば、本明細書に開示される二次的治療剤とのオリゴヌクレオチドの協調的投与は、精製されたｄｓＲＮＡまたは二次的治療剤単独によって引き出される治療応答を超える、増強した（相乗的な）治療応答を生み出し得る。
本発明の医薬組成物は、その意図される投与の経路と適合するように製剤化される。投与の経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素：注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化物質；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝液；および、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張度の調整のための作用物質を含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作製されたアンプル、使い捨て注射器、または複数回用量バイアルに封入され得る。
注射用の使用に適切な医薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散体、および無菌の注射用溶液または分散体の即時調製のための無菌の粉末を含む。静脈内投与に関して、適切な担体は、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＭ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は無菌でなければならず、易注射性が存在する程度に流動性であり得る。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微小生物の夾雑作用から守られなければならない。担体は、例えば水、エタノール、薬学的に許容されるポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散体の場合には要される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微小生物の作用の阻止は、多様な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールによって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることは有用であり得る。注射用組成物の長期吸入は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
無菌の注射用溶液は、必要に応じて、本明細書に挙げられる成分の１種または組み合わせとともに、適当な溶媒中に要される量の化合物を組み込み、その後に濾過滅菌が続くことによって調製され得る。分散体は、基本的な分散媒、および本明細書に挙げられるものからの要される他の成分を含有する無菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射用溶液の調製のための無菌の粉末の場合、有用な調製法の例は、活性成分＋あらかじめ濾過滅菌されたその溶液からの任意の付加的な成分の粉末を産出する、真空乾燥およびフリーズドライである。
経口組成物は、不活性希釈剤または食用担体を含み得る。それらは、ゼラチンカプセルに封入され得る、または錠剤に圧縮され得る。経口の治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物は、洗口液としての使用のための流体担体を使用しても調製され得、流体担体における化合物は、経口適用され、グチュグチュされ、吐き出されるまたは飲み込まれる。
薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチン等のバインダー；デンプンもしくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、プリモジェル（Primogel）、もしくはトウモロコシデンプン等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート（sterote）等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロースもしくはサッカリン等の甘味剤；または、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味料等の香味剤。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものでもあり得る。経粘膜または経皮投与に関して、浸透されるべき壁に適当な透過剤が、製剤において使用される。そのような透過剤は当技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与に関しては、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは座薬の使用により遂行され得る。経皮投与に関して、活性化合物は、当技術分野において公知の軟膏、軟膏剤、ゲル、またはクリームに製剤化される。
本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、また、取り込み、分布、および／または吸収を助けるための、他の分子、分子構造、または化合物の混合物、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、または他の製剤とともに混和され得る、カプセル化され得る、コンジュゲートされ得る、または別様に結び付けられ得る。そのような取り込み、分布、および／または吸収を助ける製剤の調製を教示する米国特許の非限定的な例は、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１０８，９２１号明細書；第５，３５４，８４４号明細書；第５，４１６，０１６号明細書；第５，４５９，１２７号明細書；第５，５２１，２９１号明細書；第５，５４３，１６５号明細書；第５，５４７，９３２号明細書；第５，５８３，０２０号明細書；第５，５９１，７２１号明細書；第４，４２６，３３０号明細書；第４，５３４，８９９号明細書；第５，０１３，５５６号明細書；第５，１０８，９２１号明細書；第５，２１３，８０４号明細書；第５，２２７，１７０号明細書；第５，２６４，２２１号明細書；第５，３５６，６３３号明細書；第５，３９５，６１９号明細書；第５，４１６，０１６号明細書；第５，４１７，９７８号明細書；第５，４６２，８５４号明細書；第５，４６９，８５４号明細書；第５，５１２，２９５号明細書；第５，５２７，５２８号明細書；第５，５３４，２５９号明細書；第５，５４３，１５２号明細書；第５，５５６，９４８号明細書；第５，５８０，５７５号明細書；および第５，５９５，７５６号明細書を含む。
中枢神経系における組織を治療することに関して、投与は、例えば脳脊髄液への注射または注入によって行われ得る。脳脊髄液へのアンチセンスＲＮＡの投与は、例えば、参照によりその全体として組み込まれる米国特許第７，６２２，４５５号明細書に記載される。オリゴヌクレオチド化合物（例えば、ＡＳＯまたはＳＳＯ）が、中枢神経系の細胞に投与されるであろうことが意図される場合、投与は、血液脳関門を横断したオリゴヌクレオチド化合物の透過を促進し得る１種または複数の作用物質を用いたものであり得る。注射は、例えば内嗅皮質または海馬において行われ得る。脳への直接送達に関する付加的な開示に関しては、そのそれぞれの特許が参照によりその全体として組み込まれる、米国特許第６，６３２，４２７号明細書および第６，７５６，５２３号明細書も参照されたい。心臓組織を治療することに関して、投与は、例えば血流への注射または注入によって行われ得る。注射は、以下の経路：腹腔内注射、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射、またはその組み合わせによって投与され得る。一実施形態において、血流への投与は有用である。
局所投与に有用な製剤は、本発明のオリゴヌクレオチド化合物が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混和されているものを含む。例示的な脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイル（diolcoyl）－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（distearolyphosphatidyl choline））、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチル（diolcoyltetramethyl）－アミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）、およびジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））を含む。局所または他の投与に関して、本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、カチオン性リポソーム等、リポソーム内にカプセル化され得るまたはそれと複合体を形成し得る。代替的に、オリゴヌクレオチド化合物は、カチオン性脂質等の脂質に複合され得る。例示的な脂肪酸およびエステル、その薬学的に許容される塩、ならびにそれらの使用は、参照によりその全体として本明細書によって組み込まれる米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載される。
治療用組成物の製剤化およびそれらの後続の投与（投薬）は、当業者の技能の範囲内にある。投薬は、治療されるべき疾患状態の重症度および応答性に依存しており、治療のコースは、数日間～数ヶ月間、または治癒がもたらされるもしくは疾患状態の縮小が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定から算出され得る。当業者であれば、最適な投薬量、投薬方法論、および反復率を容易に判定し得る。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効能に応じて変動し得、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて推測され得る。一部の実施形態において、治療有効量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．７５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４００ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４５０ｍｇ／ｋｇ体重、または少なくとも約５００ｍｇ／ｋｇ体重である。
一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、１回（例えば、単回の注射または堆積として）対象に投与され得る。代替的に、投与は、約２～約２８日間、または約７～約１０日間、または約７～約１５日間の期間のそれを必要とする対象への１日１回または２回であり得る。それは、年あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回、またはその組み合わせの期間、対象に１日１回または２回でも投与され得る。例えば、投薬量は、毎日、毎週、毎月、毎年１回もしくは複数回、またはさらに２～２０年ごとに１回与えられ得る。一実施形態において、２種以上の組み合わせられたオリゴヌクレオチド化合物、治療薬等は、組み合わせでまたは逐次的に一緒に使用され得る。投薬量は、活性成分の薬力学的特徴ならびにその投与の様態および経路；活性成分の投与の時間；レシピエントの年齢、性別、健康状態、および重量；症状の性質および程度；併用治療の種類、治療の頻度、および本明細書に記載される使用に要される効果；ならびに排出の速度等、公知の因子に応じて変動し得る。当業者であれば、体液または組織における薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投薬の反復率を容易に推測し得る。治療の成功の後、オリゴヌクレオチド化合物が、１日１回または複数回から２～２０年ごとに１回、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重に及ぶ維持用量で投与される、維持療法を患者に受けさせて疾患状態の再発を阻止することが望ましくあり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドのある特定の注射投薬量が、例えば、参照によりその全体として本明細書によって組み込まれる米国特許第７，５６３，８８４号明細書に記載される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、組み換えウイルスベクターを使用した送達のために製造され得る。「組み換えウイルスベクター」とは、１種または複数の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組み換えポリヌクレオチドベクターを指し得る。
「組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」とは、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される１種または複数の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指し得る。そのようなｒＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウイルスに感染しており（または、適切なヘルパー機能を発現している）かつＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞に存在する場合、複製され得かつ感染性ウイルス粒子内にパッケージされ得る。ｒＡＡＶベクターが、より大きなポリヌクレオチドに（例えば、染色体に、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミド等の別のベクターに）組み込まれた場合には、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング機能および適切なヘルパー機能の存在下で複製およびカプシド化によって「レスキュー」され得る「プロ－ベクター」と称され得る。ｒＡＡＶベクターは、脂質と複合し、リポソーム内にカプセル化され、ウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子内にカプシド化された、プラスミド、線状人工染色体を含むがそれらに限定されない、いくつかの形態のいずれかにあり得る。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルスカプシド内にパッケージして、「組み換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を作出し得る。
「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１種のＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド化されたｒＡＡＶベクターゲノムから構成されるウイルス粒子を指し得る。
「組み換えアデノウイルスベクター」とは、少なくとも１つのアデノウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される１種または複数の異種配列（すなわち、アデノウイルス起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指し得る。一部の実施形態において、組み換え核酸は、２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される。そのような組み換えウイルスベクターは、組み換えウイルスゲノムから欠失された必須のアデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅ１遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子等）を発現している宿主細胞に存在する場合、複製され得かつ感染性ウイルス粒子内にパッケージされ得る。組み換えウイルスベクターが、より大きなポリヌクレオチドに（例えば、染色体に、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミド等の別のベクターに）組み込まれた場合には、組み換えウイルスベクターは、アデノウイルスパッケージング機能の存在下で複製およびカプシド化によって「レスキュー」され得る「プロ－ベクター」と称され得る。組み換えウイルスベクターは、脂質と複合し、リポソーム内にカプセル化され、ウイルス粒子、例えばアデノウイルス粒子内にカプシド化された、プラスミド、線状人工染色体を含むがそれらに限定されない、いくつかの形態のいずれかにあり得る。組み換えウイルスベクターをアデノウイルスウイルスカプシド内にパッケージして、「組み換えアデノウイルス粒子」を作出し得る。
「組み換えレンチウイルスベクター」とは、少なくとも１つのレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）によって隣接される１種または複数の異種配列（すなわち、レンチウイルス起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指し得る。一部の実施形態において、組み換え核酸は、２つのレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）によって隣接される。そのような組み換えウイルスベクターは、適切なヘルパー機能に感染している宿主細胞に存在する場合、複製され得かつ感染性ウイルス粒子内にパッケージされ得る。組み換えレンチウイルスベクターをレンチウイルスカプシド内にパッケージして、「組み換えレンチウイルス粒子」を作出し得る。
「組み換え単純ヘルペスベクター（組み換えＨＳＶベクター）」とは、ＨＳＶ末端反復配列によって隣接される１種または複数の異種配列（すなわち、ＨＳＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指し得る。そのような組み換えウイルスベクターは、適切なヘルパー機能に感染している宿主細胞に存在する場合、複製され得かつ感染性ウイルス粒子内にパッケージされ得る。組み換えウイルスベクターが、より大きなポリヌクレオチドに（例えば、染色体に、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミド等の別のベクターに）組み込まれた場合には、組み換えウイルスベクターは、ＨＳＶパッケージング機能の存在下で複製およびカプシド化によって「レスキュー」され得る「プロ－ベクター」と称され得る。組み換えウイルスベクターは、脂質と複合し、リポソーム内にカプセル化され、ウイルス粒子、例えばＨＳＶ粒子内にカプシド化された、プラスミド、線状人工染色体を含むがそれらに限定されない、いくつかの形態のいずれかにあり得る。組み換えウイルスベクターをＨＳＶカプシド内にパッケージして、「組み換え単純ヘルペスウイルス粒子」を作出し得る。
「異種」とは、それが比較される、またはそれが導入されるもしくは組み込まれる実体の残りのものとは遺伝子型的に区別される実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技法によって異なる細胞タイプに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（発現した場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれている細胞配列（例えば、遺伝子またはその一部分）は、ベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。
「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写され得、任意で、翻訳され得かつ／または適当な条件下で発現され得るポリヌクレオチドを指し得る。態様において、それは、それが導入された細胞に特性を付与する、またはそうでなければ治療的もしくは診断的成果につながる。別の態様において、それは、本明細書に記載されるＡＳＯまたはオリゴヌクレオチド等、スプライシングをモジュレートする分子に転写され得る。
実施形態は、ＫＲＡＳ変異体特異的ｓｇＲＮＡを用いた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して等、ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異を直接補正して、元のＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫを非機能的Ｑ６１Ｋに転換する組成物および方法も含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的間隔の短い回文型リピート）とは、塩基配列の複数の短い直接反復を含有するＤＮＡ座の頭字語である。原核生物ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核生物における使用のための遺伝子編集（特異的遺伝子をサイレンシングする、増強する、または変化させる）としての使用のために適応されている（例えば、Cong, Science, 15:339(6121):819-823 (2013)、およびJinek,ら, Science, 337(6096):816-21 (2012)を参照されたい）。細胞に、Ｃａｓ遺伝子および特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲを含む要される要素をトランスフェクトすることによって、生物のゲノムは、事実上任意の場所で切られ得かつ改変され得る。一方または両方の誘導性発現を含めた、ガイド鎖またはＣａｓタンパク質を発現させるためのいくつかの方法が存在する。ウイルス性形質導入、インジェクションもしくはマイクロインジェクション、ナノ粒子、または他の送達、タンパク質の取り込み、ＲＮＡもしくはＤＮＡの取り込み、タンパク質およびＲＮＡもしくはＤＮＡの組み合わせの取り込みを含めた、細胞にガイド鎖およびＣａｓタンパク質を導入するためのいくつかの方法が存在する。方法の組み合わせも、同時にまたは順番に使用され得る。ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質の複数ラウンドの送達が、さらなるタンパク質発現の有無にかかわらず生じ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用したゲノム編集における使用のための組成物を調製する方法は、参照によりそれらの全体として本明細書に具体的に組み込まれる、国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレットおよび国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレットに詳細に記載される。
「ＣＲＩＳＰＲ活性」という用語は、ＣＲＩＳＰＲシステムと関連した活性を指し得る。そのような活性の例は、二本鎖ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、転写活性化、転写抑制、核酸メチル化、核酸脱メチル化、およびリコンビナーゼである。
「ＣＲＩＳＰＲシステム」という用語は、組み合わせられた場合に、少なくともＣＲＩＳＰＲ関連活性（例えば、標的遺伝子座特異的な、二本鎖ＤＮＡの二本鎖切断）をもたらす、ＣＲＩＳＰＲタンパク質および核酸の集合体を指し得る。
「ＣＲＩＳＰＲ複合体」という用語は、互いと結び付いて、機能的活性を有する凝集体を形成する、ＣＲＩＳＰＲタンパク質および核酸（例えば、ＲＮＡ）を指し得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体の例は、標的遺伝子座に特異的なガイドＲＮＡに結合している野生型Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１と称されることもある）タンパク質である。
「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」という用語は、核酸（例えば、ＲＮＡ）結合ドメイン核酸およびエフェクタードメイン（例えば、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９等のＣａｓ９）を含むタンパク質を指し得る。核酸結合ドメインは、標的核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）にハイブリダイズし得る領域を有する第１の核酸分子と相互作用する、または標的核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ）にハイブリダイズし得る領域を有する第２の核酸との結び付きを可能にする。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、付加的なＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、ならびに他のドメインも含み得る。
ＣＲＩＳＰＲタンパク質とは、本明細書で言及される第１の核酸分子に結合する複合体を形成するタンパク質も指し得る。ゆえに、一方のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、例えばガイドＲＮＡに結合し得、もう一方のタンパク質はエンドヌクレアーゼ活性を有し得る。それらは、Ｃａｓ９等の単一タンパク質と同じ機能を果たす複合体の一部として機能するため、これらはＣＲＩＳＰＲタンパク質であると見なされる。
実施形態において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、それらが核に輸送されるのを可能にする核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有し得る。
キット
本発明は、ＲＡＳ関連疾患または病状を有する対象の治療のためのキットも提供する。実施形態において、キットは、その使用のための使用説明書とともに、適切な容器にパッケージされた少なくともオリゴヌクレオチド化合物を含む。一実施形態において、本発明は、ＲＡＳ関連疾患または病状の治療のためのキットであって、本明細書において論じられるオリゴヌクレオチド化合物を含むキットを提供する。一実施形態において、本発明は、ＲＡＳ関連疾患または病状の治療のためのキットであって、本明細書において論じられる少なくとも２種のオリゴヌクレオチド化合物を含むキットを提供する。一実施形態において、ＲＡＳ関連疾患または病状はがんである。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、本明細書に記載される配列のオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチド化合物は、本明細書に記載される少なくとも１種の修飾を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に示されるもの等、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド化合物（例えば、ＡＳＯまたはＳＳＯ）、または本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの組み合わせを含むアンチセンス分子のカクテルを含有するであろう。
本発明の実施形態は、多様な実行および活用に関して記載されるものの、これらの実施形態は例示であること、および本発明の範囲はそれらに限定されないことが理解されるであろう。多くの変形、改変、付加、および向上が可能である。なおさらに、本明細書に記載される任意のステップは任意の順序で行われ得、任意のステップが付加され得るまたは欠失され得る。本発明および本発明の付加的な実施形態への支持が、それへの参照によりそれらの全体として本明細書に明示的に組み込まれる付属の文書に見出され得る。また、本明細書において使用される言い回しおよび術語は、説明の目的のためのものであり、限定的として見なされ得ない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびその変形の使用は、その後に列挙される項目およびその均等物、ならびに付加的な項目を包含することを意図される。
別様に定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。例示的な方法および材料が本明細書に記載されるが、とはいえ、本明細書に記載されるものと同様のまたは均等の方法および材料も、本発明の実践または試験において使用され得る。
本開示を読むことにより当業者に明らかであろうように、本開示の実施形態は、本明細書に具体的に開示されるもの以外の形態で具現化され得る。それゆえ、本明細書に記載される実施形態は、例示と見なされるべきであり、制限的ではない。当業者であれば、単なるルーチン的実験だけを使用して、本明細書に記載される具体的な実施形態に対する数多くの均等物を認識するであろうまたは突き止め得るであろう。本発明の範囲は、前述の説明に含有される例に限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲およびその均等物に明記されるとおりである。
本明細書において触れられる刊行物および他の参考文献は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または参考文献が、参照により組み込まれることを具体的にかつ個々に示されているかのように、参照によりそれらの全体として組み込まれる。本明細書において引用される刊行物および参考文献は、先行技術であると認められるわけではない。
実施例は、本発明のより完全な理解を促すために本明細書において提供される。以下の実施例は、本発明を行いかつ実践する例示的な様態を示す。しかしながら、代替的な方法を利用して同様の結果を獲得し得ることから、本発明の範囲は、単に例示の目的のためのものである、これらの実施例に開示される具体的な実施形態に限定されるわけではない。
[実施例１]
ＫＲＡＳは、がんにおける変異がん遺伝子である。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ特異的阻害剤は、肺がんを有する患者において奏功を示すものの、他の変種、例えばＱ６１Ｋ変異は標的不能である。
ＫＲＡＳ変異は、ＥＧＦＲ－チロシンキナーゼ阻害剤に対する後天的抵抗性メカニズムとしても見出されることを考えて、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集によって、ＥＧＦＲ変異体肺がん細胞株ＰＣ９において内在性ＫＲＡＳ変異を創出した。これらのモデルを通じて、本発明者らは、Ｑ６１変異体ＲＡＳがんにおいてサイレント変異およびスプライシング脆弱性の重大性を予想外に発見した。ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを有するモデルは、スプライシングドナー部位の保存されたモチーフとの類似性に起因して選択的スプライシングを受け、それは原因となる早期終止コドン（そのため、非機能的タンパク質）をもたらし、一方でＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ＋サイレント変異（Ｇ６０Ｇ＋Ｑ６１Ｋ、ＧＱ６０ＧＫとも称される）は、選択的スプライシングを阻止された。３つの独立した汎がんコホートにおいて、本発明者らは、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋが、ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異と常に共存することを確認した。付加的に、本発明者らは、ＲＡＳ Ｑ６１周辺の配列が、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に対するモチーフのホットスポットであり、これらのエリア周辺のゲノム編集は、これらのモチーフを中断することによって、全エクソン３スキッピングおよび後続の早期終止コドンを誘導し得ることを見出した。
本発明者らは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ Ｑ６１がんのプレ－ｍＲＮＡにおけるＥＳＥのホットスポットを標的にする変異体特異的アンチセンスオリゴを設計した。全エクソン３をスキップすることを、ＲＡＳ Ｑ６１変異体汎がん細胞株において誘導し、未成熟終結をもたらした。インビトロデータは、成長阻害、ならびにｐＥＲＫおよびｐＡＫＴを含めた下流シグナルの減少を実証した。
本明細書に記載されるように、変異体特異的モルホリノアンチセンスオリゴは、ＲＡＳ Ｑ６１変異体汎がんを標的にする新たな療法として使用され得る。
現在、ＫＲＡＳタンパク質をその不活性ＧＤＰ結合状態に閉じ込めるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ特異的阻害剤のみが、臨床試験において見込みのあるデータを示したが、ＫＲＡＳ Ｑ６１、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳがんに対する直接的な阻害剤はない。スプライシング脆弱性を標的にする本発明者らの手法は新たな概念であり、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳのコドン６１における変異を有する任意のがんに適用可能である。注目すべきことには、変異体特異的モルホリノアンチセンスオリゴの使用は、変異体プレ－ｍＲＮＡのみを阻害し、無傷の野生型プレ－ＲＮＡに影響を及ぼさない。そのため、これらのストラテジーは、Ｑ６１ ＲＡＳ変異体特異的であり、野生型ＫＲＡＳに影響を与えない。ゆえに、この手法は、ＭＥＫ阻害剤よりも広い治療指数を有し得る。ＭＥＫ阻害剤はＫＲＡＳ変異体がんにおいて使用されるが、変異体選択性（selectively）を有せず、有毒である（正常組織においてＭＥＫを阻害することに起因して）。脊髄性筋萎縮症に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対するモルホリノアンチセンスオリゴを用いた治療が、ＦＤＡによってすでに承認されていることを考えると、本発明者らのストラテジーも治療的に実行可能であり得る。
ＲＡＳ（ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、またはＮＲＡＳ）Ｑ６１変異体がんの治療のための、変異体特異的モルホリノアンチセンスオリゴおよびそれらの使用が本明細書に記載される。
[実施例２]
ＫＲＡＳサイレント変異は、ＲＡＳ Ｑ６１がんに対する治療手法を見つける
要約
非同義体細胞変異を有するがんにおける標的療法、限局性増幅、および転座は、生存期間を向上させ得る１。ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳを含めたＲＡＳファミリーメンバーは、ヒトがんにおいて最も頻繁に変異するがん遺伝子である。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ特異的阻害剤は、肺がんを有する患者において臨床活性を示すものの２～４、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ、または非Ｇ１２Ｃ ＫＲＡＳ変種の直接的阻害剤はない。本明細書で本発明者らは、機能的ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋに対するＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇにおけるサイレント変異を見つける。ＫＲＡＳ Ｑ６１ＫにおけるＧ６０でのサイレント変異の非存在下において、隠れたスプライスドナー部位が形成され、選択的スプライシングおよびトランケーションされた非機能的タンパク質につながる。Ｇ６０Ｇサイレント変異の存在は、スプライスドナー部位を排除し、機能的ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変種を産出する。ＫＲＡＳ Ｑ６１ＫおよびＧ６０Ｇ／Ａ５９Ａサイレント変異の顕著な一致が、３つの独立した汎がんコホートにおいて検出された。本発明者らは、ＲＡＳ Ｑ６１周辺の領域が、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）モチーフに富むことをさらに明らかにし、ＥＳＥ媒介性スプライシングを妨害する変異体特異的オリゴを設計し、変異体選択的様式でＲＡＳ Ｑ６１タンパク質を非機能的にする。変異体選択的アンチセンスオリゴによる異常スプライシングの導入は、インビトロおよびインビボにおける治療効果を実証した。機能的ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋに必要なスプライシングを研究することによって、本発明者らは、変異体選択的ＲＡＳ Ｑ６１がん治療ストラテジーを見つけ、ならびに理論によって拘束されることを望むことなく、他の遺伝学的文脈において治療的に活用され得る変異体特異的脆弱性を明るみに出す。
序論
タンパク質のアミノ酸配列を変更する非同義変異の効果は、正常なヒト生物学を混乱させかつ／またはがんを引き起こすそれらの潜在性について調べられている。がん遺伝子非同義体細胞変異または転座の脆弱性は、それ以来、特異的薬物を用いて標的にされている１、５、６。対照的に、サイレント変異は、スプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡフォールディング、翻訳、または共翻訳タンパク質フォールディングに関与するという一部の証拠にもかかわらず７、８、同義（サイレント）変異の臨床的意義は、捉えどころのないままである。がん病因における同義変異の役割は体系的に研究されておらず、そのため、サイレント変異は、大部分が、臨床的変異分析においてノイズとして無視されている。
ＲＡＳファミリー遺伝子における変異は、がんの最高２０％に見出される：非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、膵臓がんにおけるＫＲＡＳ；黒色腫、結腸がん、および白血病におけるＮＲＡＳ；ならびに、膀胱がん、乳がん、および甲状腺がんにおけるＨＲＡＳ。９ＲＡＳタンパク質は、不活性（ＧＤＰ結合型）および活性（ＧＴＰ結合型）状態の間を循環するバイナリスイッチとして作用するグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰａｓｅ）である。活性化ＲＡＳタンパク質は、ＭＥＫおよびＥＲＫを含めた下流の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を刺激する。ＲＡＳにおける体細胞変異は、ＧＴＰ結合型ＲＡＳを増加させ、ＭＡＰＫシグナル伝達を異常に活性化する。
ＲＡＳ変異体がんに対する標的療法の開発は複雑である。ＫＲＡＳ変異体ＮＳＣＬＣにおける化学療法と組み合わされたＭＥＫ阻害剤は、限定された効力を有する１０。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路のＲＴＫ媒介性フィードバック活性化を考慮して、ＭＥＫ阻害剤と受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤との併用も提唱されているが、変異体選択性の欠如に起因したＭＥＫ阻害剤の毒性およびより低い効力は課題である１１～１３。ＲＴＫからのシグナルを伝達してＲＡＳの活性化を促進する、非受容体タンパク質チロシンホスファターゼであるＳＨＰ２を標的にするアロステリック阻害剤が、臨床開発中である１４。ＲＡＳ標的療法の最初の成功は、該タンパク質をその不活性なＧＤＰ結合状態に閉じ込めるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ特異的共有結合性阻害剤の使用を伴う２。これまでに、第Ｉ相臨床試験は、ＮＳＣＬＣを有する患者においてこれらの化合物の有望な臨床活性を実証している３、４、１５。別の手法は、ＫＲＡＳに対するグアニン交換因子であるＳＯＳ１を標的にすることであり、それは、ＧＤＰ結合型ＲＡＳタンパク質にその触媒的結合部位で結合しかつ活性化し、このようにしてＧＴＰへのＧＤＰの交換を促進する。しかしながら、内在性ＧＴＰ加水分解活性を欠如するＫＲＡＳ Ｑ６１変異体は１６、１７、ＳＯＳ１阻害剤に応答性ではなく、代替的Ｑ６１Ｘ選択的治療ストラテジーの開発を必要とする。
結果
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｑ６１Ｋ、Ａ１４６Ｔ、およびＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅにおける後天的体細胞変異は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）変異体肺がんにおけるＥＧＦＲ－チロシンキナーゼ阻害剤オシメルチニブに対する抵抗性を駆動する１８、１９。これらの事象をインビトロでモデル化するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９相同指向性修復（ＨＤＲ）を使用して、ＥＧＦＲ変異体肺がん細胞株ＰＣ９においてＫＲＡＳまたはＢＲＡＦに変異を導入し、抵抗性を与えるクローンを選択した。予想どおり、オシメルチニブ処理は、種々のＫＲＡＳ変異またはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅを持つ細胞の選択的増加につながり、親細胞ではそうではなかった（図１パネルａ、および図５パネルａ）。本発明者らは、標的次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、薬物選択の経過にわたって変異体アレル頻度（ＡＦ）をモニターし、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、およびＡ１４６ＴのＡＦが、オシメルチニブ選択圧の下で経時的に増加する一方で、ＫＲＡＳ Ｑ６１ＫのＡＦはそれどころか減少することに気付いた（図１パネルｂ）。予想外にも、本発明者らは、両方ともＧ６０における同時サイレント変異ＧＱ６０ＧＫ（ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＣＡまたはＡＡ）を含有する他の２種のＫＲＡＳ Ｑ６１ＫアレルのＡＦが、薬物処理に応答して急激に増加することに気付いた（図１パネルｂ、ｃ）。ＧＱ６０ＧＫ二重変異体は、Ｑ６１Ｋ（ｃ．１８１Ｃ＞Ａ）単一変異体に対して設計された同じドナー鋳型を使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集事象から生まれ、エラープローン非相同末端接合修復の結果であり得る。オシメルチニブ感受性について試験した場合、このサイレント変異なしでＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを持つＰＣ９細胞の単細胞クローンは、抵抗性を与えることができず、親ＰＣ９細胞のものに匹敵する成長阻害を呈した。このことは、１μＭオシメルチニブ処理によって大きく影響を受けなかったＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ａ１４６Ｔ、またはＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅクローンとは著しく対照的であった（図１パネルｄ）。３種の考え得るＧ６０変異体変種（ｃ．１８０ＴはＡ、Ｃ、またはＧより大きい）を考えて、本発明者らは、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ（ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＧＡ）、ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇ単独（ｃ．１８０ＴはＡ、Ｃ、またはＧより大きい）、およびコドン６１における別の非同義変異ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈに対するドナー鋳型を使用して、ＰＣ９細胞を編集した。オシメルチニブ圧の下で、ＧＱ６０ＧＫ（ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＧＡ）およびＱ６１ＨのＡＦは増加したが、Ｇ６０Ｇサイレント変異単独のＡＦは変わらないままであった（図１パネルｅ）。ヘテロ接合性ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫまたはＱ６１Ｈ変異単独は、ＰＣ９モデルにおいてオシメルチニブに対する抵抗性を引き起こすのに十分であった（図１パネルｆおよび図５パネルｂ）。
ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ変異の機能効果の増大を検討するために、本発明者らは、そのタンパク質産物および下流シグナル伝達に対する影響を評価した。オシメルチニブ処理の後、持続的ＥＲＫ１／２活性化は、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＡＡを発現するＰＣ９細胞に存在したが、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ単独を発現する細胞においてはそうではなく（図１パネルｇ）、二重変異体のみにおいてＥＲＫ１／２のものからのＥＧＦＲ阻害の脱離を裏付けた。加えて、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫは、ベースライン時にＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄのものと同様のＲＡＳ－ＧＴＰレベルを呈し、それは、オシメルチニブ処理によって最小限に影響を受けた（図１パネルｈ）。対照的に、オシメルチニブ処理は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ単一変異体においてまたはＫＲＡＳ野生型親ＰＣ９細胞においてＲＡＳ－ＧＴＰの減少につながった。逆に、ｓｉＲＮＡによってＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ遺伝子をノックダウンすることは、オシメルチニブに対して抵抗性ＰＣ９モデルを再感作し、ＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ変異とオシメルチニブ抵抗性との間の因果関係を補強した（図１パネルｉおよび図５パネルｃ）。合わせると、本発明者らの知見は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの生物学的機能にとっての、ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇにおけるサイレント変異の要件を示す。
ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫは３つの汎がんコホートに存在する
本発明者らは、サイレント共変異の頻度について、ＫＲＡＳおよび他のＲＡＳファミリーメンバー変異体に関するがんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データを調べた。Ｑ６１は、ＮＲＡＳおよびＨＲＡＳおいて最も頻繁に変異するコドンであり、ＫＲＡＳでは３番目によく見られる変異であった（図２パネルａ、および図１５）。サイレント変異は、すべてのＲＡＳファミリー変異体がんの２～４％に見出された：１８件のＫＲＡＳ事例、１０件のＮＲＡＳ事例、および７件のＨＲＡＳ事例。しかしながら、とりわけ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを有する７件すべてのがんは、ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇ（ｃ．１８０ＴはＡ、Ｃ、またはＧより大きい）サイレント変異も含有した。この同時発生は、ＫＲＡＳ変異の中でＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋに固有であり、Ｇ６０Ｇは、８１件のＮＲＡＳまたはＨＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異体がんの中で一度見出されただけであった（図２パネルａ）。この知見から広げるために、本発明者らは、ダナ・ファーバー癌研究所（Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において標的ＮＧＳによってシーケンシングされた汎がんコホート（ｎ＝２５，２５２）を検討した。これらの中で、本発明者らは、２３件のＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを特定し、インビトロ抵抗性をモデル化するために使用された（図１）、肺腺癌がオシメルチニブ処理後にＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ変異を取得した患者の事例を含めて１８、それらのすべては、Ｇ６０Ｇにサイレント変異を含有した（図２パネルｂ）。ＫＲＡＳ Ｑ６１ＫおよびＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇにつながる、変異のアレル頻度の間に高い程度の一致があった（図２パネルｂおよび図１６）。
ゲノムドライバー、および循環腫瘍ＤＮＡにおける抵抗性のメカニズムを検出するために、ならびに処理の効果をモニタリングするために、血漿を使用した液体生検の幅広い使用を考慮して２０、２１、本発明者らは、Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ臨床コホートにおいてＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、Ｇ６０Ｇ、およびＱ６１Ｈがんを研究し、標的ＮＧＳによって分析した（Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０）。ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異の同時発生は、ＫＲＡＳ Ｑ６１ＨがんにおいてよりもＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋにおいて有意に高かった（図２パネルｃ）。ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈがんの２／１１４８件（０．１７％）のみと比較して、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを有する５４件のがんのうち、５０件（９３％）がＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異を有した（ｐは０．０００１未満）。注目すべきことには、ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異を持つＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈがんの両方とも、随伴するＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異も含有した（図２パネルＣ）。このコホートにおいて、ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇ変異を有しない４件のうち３件のＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋがんは、異なるサイレント変異ＫＲＡＳ Ａ５９Ａ（ｃ．１７７ＡはＡまたはＧより大きい）を含有した。ＣＲＩＳＰＲ改変ＰＣ９のオシメルチニブ選択アッセイを使用して変異の機能を調べて、本発明者らは、Ａ５９Ａ単独のＡＦが薬物選択の下で増加しないことに気付いた（図２パネルｄ）。しかしながら、Ｑ６１ＫとともにシスでＡ５９Ａにおけるサイレント変異を有する細胞において、アレルの割合（allelic fraction）増加は、ＧＱ６０ＧＫを用いて見られるものを映し出した（図１パネルｅおよび２パネルｄ）。ＫＲＡＳ Ｇ６０ＧおよびＡ５９ＡのＡＦに関するデータを、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを有する４５件の事例において獲得し；４５件の事例において、ＫＲＡＳ Ｑ６１ＫのＡＦは、ＫＲＡＳ Ｇ６０ＧまたはＡ５９Ａサイレント変異と相関した（図２パネルｅ）。入手可能なＡＦを有しない残りの９件の事例において、Ｇ６０ＧおよびＡ５９Ａにおけるサイレント変異は、分析精度に対する手動の点検によってＱ６１Ｋとシスにあることが確認された。４件の事例は、ＫＲＡＳ Ｑ６１ＫなしのＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異のみを有した；ＥＧＦＲ ｄｅｌ７４６＿７５０＋Ｔ７９０Ｍを有するＮＳＣＬＣ、ＢＲＣＡ１ Ｓ１１４７Ｆを有する乳がん、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｒを有する結腸がん、ならびに低い腫瘍倉庫（shed）（ＡＦは１％未満）を有しかつ明らかなドライバー変異を有しない腎細胞癌（図１７）。
ＫＲＡＳ Ｇ６０ＧはＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋにおける適正なスプライシングに要される
ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇにおけるサイレント変異への機能的ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの依拠を規定するメカニズムを検証するために、本発明者らは、オシメルチニブまたは対照処理の後に、本発明者らのスクリーニングに現れたＣＲＩＳＰＲ改変ＰＣ９クローンからＫＲＡＳのｃＤＮＡを増幅した（図３パネルａ）。親ＰＣ９細胞、ならびにＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ａ１４６Ｔ、Ｇ６０Ｇ、およびＱ６１Ｈ変異を発現するクローンにおいて観察された２種の以前に立証されたアイソフォーム４Ａ（全長ＫＲＡＳ）および４Ｂ（エクソン５を欠如する）２２に加えて、２種の転写産物アイソフォームを、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫまたはＱ６１Ｋを持つクローンにおいて特定した。これらのアイソフォームは、エクソン３内の１１２ｂｐの非存在、またはエクソン３全体のスキッピングによって特徴付けられる（図３パネルａ～ｃ）。理論によって拘束されることを望むことなく、いずれのアイソフォームも、早期終止コドンを導入するフレームシフトに起因して、機能的ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋに翻訳されないであろう。
Ｑ６１周辺の野生型ＫＲＡＳの配列は、スプライスドナー部位の保存されたモチーフとの高いコンセンサスを示し２３、ｃ．１８１においてのみ逸脱する（図３パネルｄ）。ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋをもたらす変異（ｃ．１８１ＣはＡより大きい）は、エクソン３とイントロン３との間の標準スプライスドナー部位（８９）と等価であるコンセンサス値（８６）を有して、その場所で推定の隠れたドナー部位を同時に導入し、そのため、本発明者らのスクリーニングにおいて観察されるタンパク質なしまたは非機能的Ｑ６１Ｋ変種のいずれかを産生する異常なスプライシング事象をもたらし得る。このことを検証するために、本発明者らは、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋのタンパク質産物を、Ｎ末端（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳに共通）またはＣ末端（ＫＲＡＳ ４Ｂに固有）のいずれかに結合する抗体を使用して、オシメルチニブチャレンジの後に、ウェスタンブロッティングによって分析した。Ｎ末端抗体は、ＫＲＡＳ Ｑ６１ＫおよびＧＱ６０ＧＫ細胞の両方においてＲＡＳを検出する一方で、Ｃ末端抗体は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ細胞において無の／最小のＲＡＳ、およびＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ細胞においてより堅牢な発現を検出した（図３パネルｅ）。合わせると、これらのデータは、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ単独では、オシメルチニブ抵抗性を与える能力がある全長ＫＲＡＳタンパク質を産生し得ないことを示す（図３パネルｅおよび１パネルｈ）。
本発明者らのＣＲＩＳＰＲ編集ＰＣ９クローンの別の１種は、Ｑ６１Ｈとともにｃ．１８１のヘテロ接合性欠失を持つ（図３パネルａ）。この単一塩基対欠失は、高いコンセンサス値（９８）を有して隠れたスプライス部位を同様に導入し、本発明者らが、この部位における異常なスプライシングが、フレームシフトを創出する、このアイソフォームにおけるエクソン３の１１２ｂｐを欠失させることに関わると結論付けることにつながる（図３パネルａ、ｄ）。ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇにおけるサイレント変異（ｃ．１８０ＴはＡ、Ｃ、またはＧより大きい）は、保存されたスプライス部位と比べてその低いコンセンサス値によって証明されるように、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異によって導入される隠れたスプライスドナー部位を破壊する（図３パネルｄ）。Ｑ６１Ｈ／Ｌ／Ｒ等の他のＫＲＡＳ Ｑ６１Ｘ変種は、これらの変異はｃ．１８２または１８３に生じるため、隠れたスプライスドナー部位を作出しない（図３パネルｄ）。ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異のようなＫＲＡＳ Ａ５９Ａ（ｃ．１７７ＡはＡまたはＧより大きい）サイレント変異（図２パネルｃ）は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋにおけるスプライス部位コンセンサス値を減少させ、そのため機能的ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを産生する（図２パネルｄおよび３パネルｄ）。ＮＲＡＳまたはＨＲＡＳにおいて、野生型配列におけるｃ．１８０はＡまたはＣであり、その結果としてＮＲＡＳまたはＨＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異は、隠れたスプライスドナー部位を導入しない。これらの知見は、Ｇ６０Ｇサイレント変異がＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋバックグラウンドにおいて固有に生じることを示す臨床データと合致する（図２パネルａ）。理論によって拘束されることを望むことなく、ＮＲＡＳ Ｑ６１ＫまたはＨＲＡＳ Ｑ６１Ｋにサイレント変異を外因的に導入することも、これらのタンパク質を非機能的にし得る。例えば、ＮＲＡＳまたはＨＲＡＳ Ｑ６１ＫにおけるＧ６０Ｇでのサイレント変異（ＡはＴより大きい、またはＣはＴより大きい）は、異常なスプライシングを誘導するであろう隠れたスプライスドナー部位を創出し得る（図３パネルｄ）。
本発明者らは、次に、未成熟終結につながるエクソン３全体のスキッピングの背後にあるメカニズムを検証した（図２パネルａパネルｃ）。Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒ予測ソフトウェア２４を使用して、本発明者らは、推定エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）およびエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）モチーフについてＫＲＡＳエクソン３を調べ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ周辺の領域がＥＳＥモチーフに富むと判定した（図３パネルｆ）。ＥＳＥは、特異的セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質に対する結合シグナルとしての、およびエクソンに隣接する弱いスプライス部位にスプライシング機構を導き、エクソンインクルージョンを増強する他のスプライシング調節因子としての役割を果たす２３。単一のヌクレオチド変化でさえ、ＥＳＥまたはＥＳＳシグナルを妨げ得または導入し得、エクソン全体を欠失させるものを含めて、異常なスプライシングを促進し得る２５。好例のＫＲＡＳ ｃ．１８２＿１８３における２ヌクレオチド欠失は、推定ＥＳＥモチーフを劇的に変更し（図３パネルｆ）、ｃ．１８２＿１８３ｄｅｌを持つクローンは、エクソン３全体のスキッピングを示す（図３パネルａ）。エクソン３全体のスキッピングは、ＫＲＡＳ Ｑ６１における変異を有する他のクローンにおいても観察された（図６パネルａ、ｂ）。少数のがんは、ベースライン時にエクソン３全体をスプライス除去する天然の傾向も有するが（図６パネルｃおよび図１８）、とはいえ、これは低い（１０％）頻度で生じる。注目すべきことには、ＥＳＥモチーフは、ＮＲＡＳ Ｑ６１およびＨＲＡＳ Ｑ６１にも見出される（図３パネルｆ）。
まとめると、本発明者らは、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ背景でのＧ６０Ｇにおけるサイレント変異が、異常なスプライシングを阻止し、このＫＲＡＳ変異体の適正な翻訳を保証するために要され得る新たなメカニズムを見つける。本発明者らのスクリーニングは、異常なスプライシングにつながる内因性ＥＳＥモチーフの破滅的変更を含めた、ＫＲＡＳ Ｑ６１の近辺における変異と関連した他の脆弱性をさらに明るみに出す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる異常なスプライシングの誘導
本発明者らは、スプライシングに影響を与える種々のＫＲＡＳ変異体を研究することから得られた洞察を治療ストラテジーに適用した。理論によって拘束されることを望むことなく、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡにおけるＥＳＥモチーフに対して設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの部位への結合をＳＲタンパク質と競合し得、全エクソン３の有害な除外につながり、早期終結を引き起こす。代替的ストラテジーは、ＫＲＡＳ変異体特異的ｓｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異を補正して、元のＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫを非機能的Ｑ６１Ｋに転換することである（図７パネルａ～ｃ）。
本明細書で、本発明者らは、モルホリノ、およびホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）＋２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）修飾を有するＤＮＡを使用して、アンチセンスオリゴを作出した（図８パネルａ）。両タイプのアンチセンスオリゴは、相補的標的部位に強くかつ特異的に結合するように天然核酸から修飾され、ＤＮＡ２６よりもヌクレアーゼの存在下で安定である。本発明者らは、推定ＥＳＥ部位および自己二量体化するオリゴの潜在性を考慮に入れて、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳ Ｑ６１Ｘに対する変異体選択的モルホリノ、ならびにこれらの配列に対して３個のミスマッチを有する対照モルホリノを設計した（図８パネルｂおよび図１９）。ＨＲＡＳ Ｑ６１Ｘに対するモルホリノオリゴは、コドン５７および５８周辺のＥＳＥを網羅し得なかった、というのも、該オリゴは自己二量体化し得、そのためこの領域に結合し得ないためである。変異体または野生型アレルに対するモルホリノの間の予測アフィニティー（Ｔｍ）の平均差は、４．８（１．８～９．３）度であった（図２０）。ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫを標的にするモルホリノは、野生型対応物と比較して最高９．３度の差を明らかにした。
設計されたモルホリノのオフターゲット部位のゲノムワイドスクリーニングは、９種のモルホリノのいずれに対しても、１００％の相同性を有するアンチセンスオフターゲット遺伝子を示さなかった。最高３個のミスマッチを許した場合、ｍｏｒ－６（３個のミスマッチ）のみが、オフターゲット相同配列を有するが、その標的は、センス鎖に（ゆえに、結合し得ない）またはノンコーディング領域に位置する（図２１パネルａ）。付加的に、両末端で１個のヌクレオチド削られた配列を評価して、末端分解したモルホリノの結合をシミュレーションした２７。３個のミスマッチを有する遺伝子は、オンターゲットおよびオフターゲット部位の間で予測結合アフィニティーの平均１０．５（４．１～１５．６）度の差を示し、そのため、オフターゲット結合をもたらす可能性は低い（図２１パネルｂ）。
変異体選択的アンチセンスオリゴを使用して、腫瘍細胞においてのみ異常なスプライシングを誘導し得るが、Ｑ６１変異を欠如する正常細胞においてはそうではなく、これにより、オフターゲット毒性が最小限に抑えされる（図４パネルａ）。この手法を使用して、本発明者らは、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ肺がんＣＡＬＵ６細胞株において全エクソン３のスキッピングを用量依存的様式で誘導した（図４パネルｂ）。対照オリゴを用いて、エクソン３のスキッピングは観察されなかった。この観察結果を、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳ Ｑ６１Ｘ変異体を持つ付加的ながん細胞株に広げ、オリゴ媒介性変異体選択的エクソン３スキッピングを実証した（図４パネルｃ）。野生型転写産物と比した、ＫＲＡＳ変異体に対するモルホリノの選択性を査定するために、モルホリノ処理後にエクソン３をスプライスされたｍＲＮＡに寄与する全長プレ－ｍＲＮＡの正体が判定される必要があった。エクソン３を持するＱ６１がスプライス除去される、エクソン３をスキップされたｃＤＮＡ配列自体から、この情報は引き出され得ないことから、本発明者らは、その代わりに全長ＫＲＡＳ ｃＤＮＡアンプリコンの組成に本発明者らの分析の焦点を合わせた。本発明者らは、モルホリノ処理されたＳＷ９４８細胞から作出されたＫＲＡＳ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、それをゲル電気泳動によって分離し、残りの全長転写産物をＮＧＳによって分析して、モルホリノによって標的にされる変異体対野生型ＫＲＡＳプレ－ｍＲＮＡの比を獲得した。標準的ＡＦ定量に類似したＮＧＳ分析は、ｍｏｒ－４が、変異体ＫＲＡＳプレ－ｍＲＮＡを優先的に標的にし、全長転写産物種の内でのその割合を用量依存的様式で４４％から２２％に減少させることを明らかにし、それは、モルホリノ処理が変異体選択的スプライシングを誘導することを示す（図４パネルｄおよび図９）。本発明者らは、次に、細胞成長に対するこれらオリゴの効果を評価した。すべてのＲＡＳ変異体細胞株が、それらの成長をＲＡＳシグナル伝達に依存しているわけではないことから２８、本発明者らは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ特異的ｓｉＲＮＡを使用してＱ６１変異体細胞株のそれぞれについてのＲＡＳ依存性を判定し、本発明者らの知見を、Ｄｅｐｍａｐ（depmap.org）から獲得された、ＲＮＡｉおよびＣＲＩＳＰＲノックアウトによる依存性に関する公開された遺伝子効果スコアと比較した（図４パネルｅ）。ｓｉＲＮＡによって判定される、それらの成長に対してＲＡＳ依存性である細胞株は、選択的モルホリノオリゴ処理後にも成長阻害された（図４パネルｅおよび図１０パネルａ）。概して、ｓｉＲＮＡによる成長阻害とモルホリノオリゴ処理との間に有意な一致があった（図４パネルｆ）。本発明者らは、トラメチニブを使用して、これらの細胞株のパネルにおけるＭＥＫ阻害剤感受性も評価した（図１０パネルｂ）。注目すべきことには、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ Ｈ６５０肺細胞株は、トラメチニブに非常に抵抗性であるが、アンチセンスオリゴに感受性である（図１０パネルｂ、ｃ）。Ｈ６５０におけるトラメチニブに対する抵抗性は、ｐＥＧＦＲ再活性化および継続的ｐＡＫＴシグナルの結果であり、一方で、アンチセンスオリゴ処理は、このフィードバックなしでｐＥＲＫおよびｐＡＫＴの両方を阻害した（図４パネルｇ、および図１０パネルｄ）。本発明者らは、ＫＲＡＳ変異体細胞におけるＥＲＫシグネチャー遺伝子２９の発現が、アンチセンスオリゴを用いた処理後に低下することをさらに確認した（図１０パネルｅ）。単剤モルホリノオリゴ処理に感受性ではないモデルにおいて、一部は、ＥＧＦＲ阻害剤単独療法に、またはＥＧＦＲ阻害剤およびモルホリノの組み合わせに感受性であった（図１０パネルｆ、ｇ）。本発明者らは、次に、インビボにおいてモルホリノ処理ストラテジーを研究した。本発明者らは、前処理ストラテジーを採用した（図１１パネルａ）。インビトロで試験運用した場合、１～４日間のモルホリノオリゴ前処理、それに続く洗い出しは、細胞成長を強力に阻害した（図１１パネルｂ）。本発明者らは、その後、インビボにおける各処理条件からの同数の生存細胞を注射する前に、変異体選択的または対照ビボ－モルホリノのいずれかを用いて、Ｈ６５０肺がん細胞を１または２日間前処理した。対照ビボ－モルホリノで処理された細胞は、未処理細胞に匹敵する速度で成長した（図４パネルｈ、ｉ）。しかしながら、変異体選択的モルホリノで処理された細胞におけるルシフェラーゼまたは腫瘍体積のいずれかによって測定される、インビボにおける成長の有意な減少があった（図４パネルｈ、ｉ、および図１１パネルｃ）。さらに、ビボ－モルホリノの腫瘍内注射は、ＫＲＡＳエクソン３スキッピングの誘導（図１２パネルａ～ｄ）、およびＣＴＲＬまたは未処理腫瘍と比較した腫瘍サイズの有意な低下（図４パネルｊ）を実証した。第２のＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ変異体異種移植片モデル（Ｃａｌｕ６）において、処理は、前処理手法を使用した場合にも有効であり（図１３パネルａ、ｂ）、腫瘍内注射手法を通じたプラスの効力傾向につながった（図１３パネルｃ、ｄ）。本発明者らは、第２のタイプのアンチセンスオリゴ技術ＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴの効力をさらに評価し、それらが、モルホリノオリゴと比較してはるかに低い濃度で、インビトロにおける変異体選択的エクソンスキッピングおよび成長阻害を達成することを観察した（図１４パネルａ～ｆ、ならびに図２２および２３）。
考察
本発明者らは、スプライシングおよび機能的がん遺伝子の産生におけるサイレント変異の役割を見つける。本発明者らのＲＡＳ指向性ＣＲＩＳＰＲ編集および薬物圧スクリーニングは、機能的ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋのスプライシングおよび翻訳に対するサイレント変異、つまりＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇの効果に光を投じる。コーディング配列のみの従来的な外在性過剰発現を使用した先行研究は、すでにスプライスされた転写産物のｃＤＮＡをそのようなモデルにおいて採用しているため、サイレント変異の生物学的必要性を特定していないであろう。スプライシング事象の評価、ならびに臨床サンプルにおけるＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異の手動の点検を可能にするＣＲＩＳＰＲモデルは、知られていなかったＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇの新たな生物学を見つけた。機能的ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋは、ジヌクレオチド変化を要し、そのため、単一塩基対置換に起因して発がん性であるＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ（すべてのＮＲＡＳ変異の２０％）またはＨＲＡＳ Ｑ６１Ｋ（すべてのＨＲＡＳの７％）変異とは対照的に、患者におけるこの変異の珍しさ（すべてのＫＲＡＳ変異の０．７％）を説明し得る。ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異の機能的意義は知られていない３０。本発明者らは、治療的に活用され得る２種の異なるスプライシング脆弱性：ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫがんにおける隠れたスプライスドナー部位、ならびにＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳ Ｑ６１Ｘ変異体がんにおけるＥＳＥモチーフを特定した。結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチド手法を使用した、変異体選択的様式での異常なエクソン３除外の誘導が、非機能的ＲＡＳ変異体タンパク質を産生し、インビトロおよびインビボにおける腫瘍細胞成長阻害につながることを示す。本発明者らの知見は、ＲＡＳ Ｑ６１Ｘがんの直接阻害の治療的実用性を示す。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対するスプライスモジュレートモルホリノ、および脊髄性筋萎縮症に対するＰＳ＋２’ＭＯＥを有するアンチセンスオリゴを使用した治療は、ＦＤＡ承認療法であり、本発明者らのＲＡＳ Ｑ６１Ｘ指向性アンチセンスオリゴ手法の臨床的実現可能性を示す。ＳＴＡＴ３またはＫＲＡＳを標的にする先行のアンチセンスストラテジーとは異なり、ＲＡＳ Ｑ６１Ｘを標的にするための本発明者らのストラテジーは、変異体選択的であり、より広い治療指数および正常組織におけるより低い毒性をもたらし得る３１、３２。すべてのＫＲＡＳ変異体腫瘍がＲＡＳに依存しているわけではなく、ＥＧＦＲ３３を含めた他のシグナル、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的にすることも、サブセットのみにおいて応答を達成したことから１５、発明者らのモルホリノの効力とＲＡＳ依存性との間の相関は、本発明者らのストラテジーのオンターゲット効果をさらに支持する。アンチセンスオリゴのインビボ送達についての実施形態は、細胞透過性短ペプチドへのコンジュゲーション３４、３５、カプセル化、およびウイルス送達３６を含めた、化学修飾を含み得る。
本発明者らの知見は、がん遺伝子におけるサイレント変異の生物学的役割、および新たな療法に翻訳されるそれらの能力への新たな洞察を提供する。このストラテジーの適用可能性は、サイレント変異の包括的分析に基づいて他の遺伝子に広がり得る３７。ＤＮＡ編集技術のさらなる開発は、ＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇサイレント変異の直接編集を可能にして、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋがんにおける異常なスプライシングを誘導し得、それらの発がん能を無効にする。
本実施例において引用された参考文献
方法
細胞株および薬物
細胞株に関する情報は、補足の表１０に列挙される。研究を通じて、すべての細胞株を、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｐｌｕｓ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）について定期的に試験した。オシメルチニブ、トラメチニブ、およびアファチニブを、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。セツキシマブをダナ・ファーバー癌研究所薬局から購入した。
動物
７週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｈ６５０異種移植片モデルに関して）およびＮＣｒヌードマウス（Ｃａｌｕ－６異種移植片モデルに関して）を、ジャクソン研究所（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入した。研究の開始前少なくとも５日間、動物を順応させた。すべてのインビボ研究は、ＡＡＡＬＡＣ公認動物施設において動物実験委員会の承認を有して、ダナ・ファーバー癌研究所で行われた。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したゲノム編集
ＰＣ９細胞株においてＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ変異を創出するために、ＨＤＲのためのｓｇＲＮＡおよびドナー鋳型を、Ｄｅｓｋｇｅｎ（deskgen.com）を使用して設計した。ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）をｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせて、１５０ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡを作製し、次いでリボヌクレオタンパク質複合体を、１２０ｐｍｏｌ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＩＤＴ）を用いてインビトロで形成した。反応混合物および１２０ｐｍｏｌドナー鋳型を、プリセットのＰＣ９モードを用いたＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２０μｌのＳＥ溶液（ＩＤＴ）に懸濁されたＰＣ９細胞（１×１０５個細胞）にヌクレオフェクト（nucleofect）した。細胞を、３０μＭ Ａｌｔ－Ｒ ＨＤＲエンハンサー（ＩＤＴ）を有する成長培地中で１２時間培養した。ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単一クローンから抽出し、変異を、マサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（ＭＧＨ）ＤＮＡシーケンシングコアにおいて、サンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）またはＣＲＩＳＰＲシーケンシングによって確認した。すべてのｓｇＲＮＡ、ドナー鋳型、およびプライマーは、図２４に列挙される。
レンチウイルストランスフェクション
ホタルルシフェラーゼレンチウイルス（１．５×１０６ＣＦＵ、Ｋａｒａｆａｓｔ）を使用して、ポリブレン（５μｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下でＨ６５０細胞株（１．５×１０５個細胞）に形質導入し、その後に３２℃で９０分間の１，２００×ｇでの遠心分離が続き、次いで３７℃で１２時間培養した。ルシフェラーゼ発現細胞を、５日間の１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）において選択した。
コロニー形成アッセイおよびアレル頻度評価
ＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ変異を含有するように編集されたバルクＰＣ９細胞（１×１０５個細胞）を、１２ウェルプレートに播種し、３０ｎＭオシメルチニブの有無で培養した。２５％メタノール中０．５％クリスタルバイオレットで３０分間染色した後、画像を撮った。特異的変異体のアレル頻度を経時的に評価するために、ＤＮＡをバルク編集細胞から抽出し、ＣＲＩＳＰＲシーケンシング（ＭＧＨ ＤＮＡコア）に提出した。
ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン
対照ｓｉＲＮＡまたは標的特異的ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭの最終濃度、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（０．３％の最終濃度、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で混合した。１０分後、混合物を、成長培地とともにＣＲＩＳＰＲ改変ＰＣ９細胞株に添加した。成長阻害アッセイに関しては、細胞を、トランスフェクションの２４時間後にトリプシン処理し、３８４ウェルプレートにおいて２４時間培養し、次いでオシメルチニブで処理した（図１パネルｈ）。ウェスタンブロット分析に関しては、サンプルを、トランスフェクションの４８時間後に回収した（図５パネルｃ）。ＲＡＳ変異体細胞株を使用した実験において、対照ｓｉＲＮＡまたは表示されるＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ（２５ｎＭの最終濃度、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）とＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１またはＤｈａｒｍａＦＥＣＴ２（０．３％の最終濃度、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）とを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中で５分間混合し、次いで反応混合物を、成長培地中にて細胞に添加した（図４パネルｄ）。
細胞成長阻害アッセイ
親またはＣＲＩＳＰＲ改変ＰＣ９細胞株（１×１０３個細胞）を３８４ウェルプレートに播いた。２４時間後、細胞を、表示される濃度の薬物で７２時間処理した。終点細胞生存率アッセイを、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。ＲＡＳ変異体細胞株（２×１０３個細胞）を、３８４超低接着プレートに浮遊細胞として播種し、３Ｄ－Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。ＲＡＳ変異体細胞を、トラメチニブで３日間、およびアンチセンスオリゴまたはｓｉＲＮＡで８日間処理した。
ＲＡＳアイソフォーム
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、ｃＤＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して合成した。アイソフォームを、遺伝子特異的プライマーを使用して増幅し（図２４）、アンプリコンを２％アガロースゲルで分解した。アイソフォームをサンガーシーケンシングによって特徴付けした。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ｑＰＣＲ反応を、１μｇ ＲＮＡから合成された１：５希釈されたｃＤＮＡの１μｌを含むＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して２０μｌで準備した。反応を、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実行した。標的遺伝子の発現レベルを、各サンプルにおいてＧＵＳＢハウスキーピング遺伝子のものに対して正規化した。プライマーおよびプローブを、正常ＫＲＡＳアイソフォームおよびエクソン３の１１２ｂｐのスキッピングを有するアイソフォームのエクソン１～２を標的にするように設計した（図２４）。
抗体およびウェスタンブロット分析
細胞を、ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）およびＰｈｏＳＴＯＰ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を補給されたＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて溶解した。総細胞溶解物（２０μｇ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、イモビロン－Ｐポリフッ化ビニリデン膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に転写した。抗体は、補足の表１０に列挙される。ＲＡＳ－ＧＴＰを、Ａｃｔｉｖｅ Ｒａｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃８８２１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して評価した。細胞を、１μＭオシメルチニブの有無で０．１％ ＦＢＳを含有する培地を用いて２４時間培養し、８０μｇのＧＳＴ－Ｒａｆ１－ＲＢＤおよび５００μｇのタンパク質溶解物を、メーカーの使用説明書に従って使用した。
スプライス部位のコンセンサス値をシミュレーションする
スプライス部位のコンセンサス値をＨｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒ２４によって推測した。ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ Ｑ６１周辺のエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）およびサイレンサー（ＥＳＳ）部位の分布を評価するために、野生型および変異体配列を、同じＨｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒを使用してシミュレーションした。アンチセンスオリゴを設計する目的のために、ＥＳＥの場所を、ＥＳＥ ｆｉｎｄｅｒ３８、３９も使用してシミュレーションして、独立したアルゴリズムによって検証した。
アンチセンスオリゴを設計する
変異体選択的２５ｎｔモルホリノ、ビボ－モルホリノ（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ）、および完全なＰＳ＋２’ＭＯＥ修飾を有するＤＮＡ（ＩＤＴ）を、Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ＦｉｎｄｅｒおよびＥＳＥ ｆｉｎｄｅｒによってシミュレーションされたＥＳＥモチーフの領域に対して設計し、自己二量体化潜在性を、Ｏｌｉｇｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（https://www.idtdna.com/calc/analyzer/）を使用して推測した。普遍的対照２０ｎｔアンチセンスオリゴを、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳ Ｑ６１周辺の野生型配列と比べて３個のミスマッチを有して設計した（図１９）。
変異体または野生型配列とのモルホリノの結合アフィニティー
変異体または野生型配列に対して設計されたモルホリノの予測結合アフィニティーを、Ｎａ ５０ｍＭ、Ｍｇ １．２ｍＭ、およびオリゴ０．２５μＭの設定を有するＵＮＡＦｏｌｄ Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒを使用して算出した（unafold.org/Dinamelt/applications/hybridization-of-two-different-strands-of-dna-or-rna.php）。
インビトロにおける、ＰＳ＋２’ＭＯＥを有するモルホリノまたはアンチセンスオリゴを用いた処理
培養培地中のＲＡＳ変異体細胞株を、表示される濃度のモルホリノおよび３～６μＭ ｅｎｄｏ－ｐｏｒｔｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ）を用いて浮遊状態で処理した。処理の継続期間は、ＲＡＳ変異体細胞に対するＫＲＡＳ選択的阻害剤を用いた以前に公開された処理プロトコールに基づいて４、ＲＮＡ実験に関しては２日間、ウェスタンブロットに関しては３日間、および成長阻害アッセイに関しては８日間であった。完全ＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴを使用したすべての実験において、培地をＣａ２＋で富化した。培地のＣａ２＋富化は、複数のタイプのオリゴヌクレオチドのインビトロ活性を強化し、従来のトランスフェクション法よりもインビボ条件を反映している４２。処理の継続期間は、ＲＮＡ実験に関しては２日間、ウェスタンブロットに関しては６日間、および成長阻害アッセイに関しては８日間であった。
インビトロにおける、ビボ－モルホリノを使用した前処理ストラテジーのパイロット研究
浮遊状態の細胞を、１％ＦＢＳを含有する培養培地中にてｅｎｄｏ－ｐｏｒｔｅｒなしでビボ－モルホリノで処理し、その後にモルホリノオリゴ洗い出しが続いた。次いで、細胞を超低接着プレートに播種し、３Ｄ－Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイまで完全培地を用いて８日間培養した。
インビボ効力研究
ルシフェラーゼ発現Ｈ６５０およびＣａｌｕ６細胞株を、１％ＦＢＳを含有する培養培地中にてｅｎｄｏ－ｐｏｒｔｅｒなしで、対照ビボ－モルホリノまたは標的化ビボ－モルホリノで１または２日間前処理した。モルホリノオリゴ洗い出しの後、５０％マトリゲル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに、同数の生存細胞（５×１０６個細胞）をＮＳＧマウスの右脇腹に皮下移植した。腫瘍量を、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、２日目から始まる生物発光イメージングによって少なくとも週２回査定した。腫瘍体積も、キャリパー測定を使用して少なくとも週２回測定した。総生物発光を光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして測定し、腫瘍体積を、腫瘍体積＝（長さ×幅２）／２という式を使用することによって判定した。体重を週２回測定した。腫瘍内注射実験に関しては、ＰＢＳ中で復元された０．５ｍＭビボ－モルホリノを毎日注射した。腫瘍サンプルを回収して、薬物投与の７日目の後４時間の時点で薬力学を評価した。
臨床データ
ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳ遺伝子における非同義およびサイレント変異を、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）汎がんコホートから獲得した。ダナ・ファーバー癌研究所で標的次世代シーケンシングＯｎｃｏｐａｎｅｌ４３によって評価された汎がんコホート（ｎ＝２５，２５２）をクエリーし、匿名化されたＫＲＡＳ Ｑ６１ＫおよびＫＲＡＳ Ｇ６０Ｇデータを抽出した。本発明者らは、Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ匿名化データベースの回顧的点検を実施して、２０１４年３月と２０１９年１１月の間に標準的臨床ケアの一部としてセルフリーＤＮＡシーケンシングを有した、進行期固形腫瘍を有するＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、およびＧ６０Ｇ変異陽性患者を特定した。試験は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ（ＣＬＩＡ）認定の、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＣＡＰ）公認の、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ承認の、Ｇｕａｒｄａｎｔ Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．における臨床検査室において実施された。分析を、匿名化されかつ限定されたデータセットに対して、Ａｄｖａｒｒａ Ｒｅｖｉｅｗ施設内倫理委員会プロトコールの下で完了し、具体的な患者同意を要しなかった。血漿を、以前に記載される方法４４により分析した。本発明者らは、このコホートからのすべての報告されたゲノム変更を分析し、特定されたサンプルのサブセットに対して手動のシーケンシング点検を実施した。
統計分析
平均値を、対応のない両側スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡ、それに続くダネットの事後検定を使用して査定した。相関をピアソンの相関係数によって分析した。活性化非同義Ｑ６１ＸおよびＧ６０Ｇサイレント変異の同時発生の頻度を、フィッシャーの正確検定によって評価した。柱は平均±標準偏差を表す。スチューデントｔ検定を使用して、最後の実験時点での腫瘍体積／相対生物発光を比較し、ランダム勾配を有する線形混合モデルを適用して、処理群の間の成長速度を比較した。有意性を示すために使用される星印は、＊ｐは０．０５より大きい、＊＊ｐは０．０１より大きい、に相当する。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９およびＳＡＳ９．４をすべての統計分析に使用した。
方法参考文献
[実施例３]
図４、パネルｄは、未処理のＳＷ９８４細胞株において検出された変異体対野生型ＫＲＡＳ転写産物頻度のベースライン比を強調する点線を示している。野生型アレルと比して変異体に対するｍｏｒ－４のいかなる選択性も存在しない場合、各アレルの転写産物リードの絶対数は、同じ大きさ減少すると考えられ、それゆえ、処理なしに関して観察されるであろうように、変異体対野生型転写産物頻度の相対比を維持した（点線によって示される）。しかしながら、任意の程度の選択性が変異体アレルに対して観察される場合、変異体の転写産物リードの絶対カウントは、野生型のものよりも大きな程度減少すると考えられ、変異体対野生型頻度比を有効に減少させた。これは、点線を下回る変異体頻度に示され得る。
重要なことには、本発明者らは、第２のタイプのアンチセンスオリゴＰＳ＋２’ＭＯＥを使用した。有効用量を減少させるために、本発明者らは、元の２５ｎｔのＰＳ＋２’ＭＯＥを２０ｎｔに短くすることによって、細胞へのオリゴの送達を向上させた。本発明者らは、それぞれが３個のヌクレオチド違う６種の異なる２０ｎｔ ＰＳ＋２’ＭＯＥをスクリーニングして、エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）のホットスポットを効率的にかつ選択的に網羅し得るものを特定した。設計されたＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴ（ＰＳ＋ＭＯＥ１～３；図１４において赤色で強調される）は、以前に使用された２５ｎｔモルホリノと比較してはるかに低い濃度で変異体選択的スキッピングを達成した（図１４パネルａ～ｆ）。新たに設計されたＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴの結合アフィニティーおよびオフターゲットも、図２２および図２３に示される。
本発明者らは、理論によって拘束されることを望むことなく、それらのインビボ活性プロファイルの向上をもたらすであろう、向上した効力を有する選択的アンチセンスオリゴ（ＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴ）を示している（図１４パネルａ～ｆ）。
ＫＲＡＳ野生型ＰＣ９細胞（ＥＧＦＲ変異体）でも正常ＢＥＡＳ２Ｂ細胞（ヒト気管支細胞）でもなく、ＫＲＡＳ変異体細胞においてモルホリノの効力を示すデータ（図１０パネルａ）。
本発明者らは、細胞送達および変異体選択性を向上させるために、より短い２０ｎｔ ＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴの新たなセットを設計した。新たに設計されたオリゴの選択されたセットは、元のモルホリノ（１０μＭ）と比較してはるかに低い濃度（０．０３または０．１μＭ）でエクソンスキッピングを誘導し、エクソンスキッピングが野生型細胞においてではなくＱ６１変異体細胞においてのみ誘導される治療ウィンドウを達成した（図１４パネルａ～ｆ、図２２および２３）。ＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴの効力を、ＫＲＡＳ変異体および野生型ＰＣ９細胞の両方において評価した（図１４パネルｆ）。
変異体および野生型配列の間の１または２ｎｔだけの差にもかかわらず、変異体または野生型アレルに対するモルホリノ間の予測アフィニティー（Ｔｍ）の平均差は、４．８（１．８～９．３）度であった（図）。付加的に、設計された短い２０ｎｔ ＰＳ＋２’ＭＯＥアンチセンスオリゴは、１２．２および４．１度のＴｍ差を呈し（図２２）、ゆえに、さらに小さな差でさえ、ＷＴアレルと比して選択的変異体をもたらす差につながり得ることを示す。このことは、ＫＲＡＳ変異体およびＷＴ細胞における付加的な成長阻害データによってさらに支持される（図１０、パネルａ、および図１４）。
さらに、変異体選択的エクソンスキッピングが、モルホリノオリゴに関してよりも低い濃度で達成された。理論によって拘束されることを望むことなく、これらの知見は、変異体選択的エクソンスキッピング、および結果として、２０ｎｔ ＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴを使用した治療ウィンドウの正当性を立証する。
本発明者らは、モルホリノオリゴと比較してはるかに低い濃度でエクソンスキッピングを誘導するより短いＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴを開発しかつ評価した（図１０、パネルａ、および図１４）。本発明者らのデータは、アンチセンスオリゴの最適化が、効力および選択性を向上させ得、高用量の元のモルホリノを用いて見られる毒性効果を減じることを示す。
本発明者らは、ＴＣＧＡ ＳｐｌｉｃｅＳｅｑツール（https://bioinformatics.mdanderson.org/public-software/tcgaspliceseq/）を使用してＴＣＧＡコホートから導き出されたＲＮＡシーケンシングデータを使用して、スプライシングパターンを分析した。
エクソン３スキッピングは、図１８に示されるように、ＫＲＡＳ ＧＱ６０ＧＫ汎がんコホートに関して７件のうち１件の事例に見出された。この事例は結腸腺癌であったことから、本発明者らは、その後、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体結腸がんコホート（ｎ＝４９）、および対照としてのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異体肺腺がんコホート（ｎ＝５８）におけるエクソン３スキッピングの頻度を調べた。全体として、エクソン３スキッピングは、低い割合（３～７％域）のエクソン３スキッピングを有して、各コホートのおよそ１０％において検出された。全体として、本発明者らの知見は、少数のがんが、ベースライン時にエクソン３をスプライス除去する天然の傾向を有することを示す。
本発明者らは、２０ｎｔ ＰＳ＋２’ＭＯＥオリゴを評価しており、モルホリノオリゴを用いて可能であるよりも低い濃度での変異体選択性の増強を実証する（図１４）。さらにモルホリノオリゴに関して、成長阻害における細胞変異体選択性があり（図１０、パネルａ）、ＥＧＦＲ変異体（ＰＣ９細胞）または正常細胞（ＢＥＡＳ２Ｂ；正常気管支上皮細胞）の成長において効果は観察されない。合わせると、これらの知見は、本明細書に記載される手法を使用して、エクソン３スキッピングにおけるおよび成長阻害における変異体選択性を達成することが可能であることを示す。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤オシメルチニブに対する抵抗性をモデル化するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性相同指向性修復により、ＥＧＦＲ変異体ＰＣ９ ＮＳＣＬＣ細胞に特異的発がん性ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異を導入した。実施形態において、本発明者らは、薬物選択圧の下で、結果として生じたクローンのアレル頻度（ＡＦ）をモニターし、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、およびＡ１４６Ｔ変異体のＡＦは増加し、一方でＱ６１Ｋはそうではないことを観察した。実施形態において、Ｑ６１Ｋ ＡＦは、Ｇ６０における同時サイレント変異（例えば、ＧＱ６０ＧＫ ｃ．１８０＿１８１ｄｅｌｉｎｓＡＡ、ＣＡ、またはＧＡ）が付随する場合にのみ増加し、それは、非相同末端接合修復におけるエラーに起因し得る。さらに、Ｑ６１Ｋを発現するが付随のサイレントＧ６０Ｇ変異を欠如するクローンは、Ｑ６１Ｋが発現されかつ機能的である場合にあり得るように、オシメルチニブ発現を誘導し得なかった。これらの観察結果は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異体が、フレームシフトおよびエクソン３の一部またはすべての喪失につながる、これまで認められていないスプライスドナー部位を固有に有し、トランケーションされた機能不全のタンパク質の翻訳をもたらすという驚くべき知見につながった。Ｇ６０における近接した非同義変異の存在は、ＧＵモチーフをＧＡまたはＧＣに、それゆえ非機能的スプライス部位に転換し、それは、Ｑ６１Ｋの正しいスプライシング、および全長の機能的タンパク質の発現を可能にする。
汎がん腫瘍ゲノムについての３種の別個の大きなデータベースについての検討は、Ｑ６１Ｋ変異の存在とサイレントＧ６０Ｇ変異の存在との間の実に顕著な相関を示した。
実施形態において、本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方において、エクソンスキッピングおよび成長阻害を選択的に引き起こし得、それによって、Ｑ６１変異体がんに対する治療ストラテジーを提供する、２種のタイプのアンチセンスオリゴを特定することができた。
サイレント変異に対するこの要件が、そのすべてが、隠れたスプライスを欠如する個別の配列を有する他のＱ６１変異体（例えば、Ｑ６１Ｈ）およびＮＲＡＳまたはＨＲＡＳアイソフォームではなく、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋに固有であることは、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの適正な発現が、付随するサイレントＧ６０Ｇ変異の同時存在を、具体的にはこれがＱ６１Ｋの正しいスプライシングを可能にするので、必要とするという考えへのさらなる支持である。
この知見は、複数の理由で重要である：
１）それは、すでにスプライスされた転写産物のものであるｃＤＮＡの異所性発現に依存する発現および機能の評価によって全く見逃されるであろう配列特異的発がん活性の調節を明らかにし、それはＲＡＳに対してだけでなく多くの分野にわたって標準的である。（Sharmaら, Nat Commun 2019［ｒｅｆ ３７］ですら、ＫＲＡＳにおける患者由来同義変異が、ｍＲＮＡ構造およびタンパク質発現を変更し得ることを示すその研究において、コーディング配列のみを含有するプラスミドへの特異的単一変異の導入によって彼らの知見を裏付け、エクソンスキッピングの結果である本明細書で示される顕著なトランケーションを観察しなかった）；
２）それは、一般的に仮定されるが必ずしも実証されない、疾患病因、またはタンパク質の構造、生化学的もしくは生物学的機能における説明的な差とは異なる、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異の相対的希少性に対する説明を提供する；
３）理論によって拘束されることを望むことなく、スプライスが妨げられない場合、すなわちＱ６１ＫがサイレントＧ６０Ｇ変異を付随しない場合に作出される短いＣ末端でトランケーションされたＱ６１Ｋタンパク質は、十分に機能的でないだけでなく、ドミナントネガティブでもある。このことは、ラボで作出されたＣ末端に欠陥があるまたはトランケーションされたＨＲＡＳ Ｑ６１Ｌ変異体およびその他についての公知のドミナントネガティブ活性への類似性によって、ならびにこの原稿の図１パネルｇにおけるデータ（同義Ｇ６０ＧなしでＱ６１Ｋを発現する細胞における薬物処理後の、ｐＥＲＫの減少および回復の失敗）によって支持される；
４）それは、大多数の既存の抗ＲＡＳ療法よりも変異体選択的でかつそれゆえより毒性の低い様式で、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの発現を遮断する手段を提供する；ならびに
５）それは、種々のＲＡＳアイソフォームにおけるＱ６１配列のエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に富む環境に焦点を合わせることによって、他の変異体選択的Ｑ６１Ｘオリゴの検索の成功につながり、それによって、そのような手法の治療到達点を伸ばす。
均等物
当業者であれば、単なるルーチン的実験だけを使用して、本明細書に記載される具体的な物質および手順に対する数多くの均等物を認識するであろうまたは突き止め得るであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあると見なされ、以下の特許請求の範囲によって網羅される。
［配列番号１］
を含む、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。例えば、
Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
Ｘ２は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
Ｘ３は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
Ｘ４は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
その任意の組み合わせである。
［配列番号２］、
［配列番号３］、
［配列番号４］、および
［配列番号５］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。
［配列番号６］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。例えば、
Ｘ１は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；
Ｘ２は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
その任意の組み合わせである。
［配列番号７］、
［配列番号８］、
［配列番号９］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。
［配列番号１０］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。例えば、
Ｘ１は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；
Ｘ２は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
その任意の組み合わせである。
［配列番号１１］、
［配列番号１２］
を含む核酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む。
実施形態において、核酸は、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号１３］
に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。例えば、
Ｘ１は、ＧもしくはＴである；
Ｘ２は、ＡもしくはＴである；
Ｘ３は、ＧもしくはＴである；
Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、核酸は、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号１４］、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号１５］、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号１６］、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号１７］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、核酸は、５’－ＣＴＴＸ１Ｘ２ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号１８］に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。例えば、
Ｘ１は、ＧもしくはＴである；
Ｘ２は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、核酸は、
５’－ＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号１９］、
５’－ＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号２０］、
５’－ＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’［配列番号２１］、
５’－ＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴ－３’［配列番号２２］、
５’－ＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴ－３’［配列番号２３］、または
５’－ＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧ－３’［配列番号２４］
の配列を含む。
実施形態において、核酸は、
５’－ＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣ－３’（配列番号２５）、
５’－ＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡ－３’（配列番号２６）、
５’－ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’（配列番号２７）、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号１７）、
５’－ＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’（配列番号２８）、
５’－ＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴ－３’（配列番号２９）、
または
５’－ＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡ－３’（配列番号３０）
の配列を含む。
実施形態において、核酸は、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＸ１Ｘ２ＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号３１］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。例えば、
Ｘ１は、Ｃ、Ｔ、もしくはＡである；
Ｘ２は、ＴもしくはＧである；
またはその任意の組み合わせである。
実施形態において、核酸は、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号３２］、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号３３］、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号３４］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、核酸は、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２ＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号３５］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。例えば、
Ｘ１は、ＡもしくはＣである；
Ｘ２は、ＴもしくはＡである；または
その任意の組み合わせである。
実施形態において、核酸は、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号３６］、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号３７］
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
（配列番号１）
の配列を含み得る。
（配列番号２）、
（配列番号３）、
（配列番号４）、および
（配列番号５）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み得る。
（配列番号６）
の配列を含み得る。
（配列番号７）、
（配列番号８）、
（配列番号９）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み得る。
（配列番号１０）
の配列を含み得る。
（配列番号１１）
（配列番号１２）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含み得る。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号１３）
に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
例えば、Ｘ１は、ＧもしくはＴである；Ｘ２は、ＡもしくはＴである；Ｘ３は、ＧもしくはＴである；Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；またはその任意の組み合わせである。例えば、オリゴヌクレオチドは、
Ｍ１ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号１４）、
Ｍ２ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号１５）、
Ｍ３ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号１６）、
Ｍ４ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号１７）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＣＴＴＸ１Ｘ２ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号１８］
に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
例えば、オリゴヌクレオチドは、
１－１ ５’－ＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号１９］、
１－２ ５’－ＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号２０］、
１－３ ５’－ＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’［配列番号２１］、
１－４ ５’－ＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴ－３’［配列番号２２］、
１－５ ５’－ＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴ－３’［配列番号２３］、または
１－６ ５’－ＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧ－３’［配列番号２４］
の配列を含む。
例えば、Ｘ１は、ＧもしくはＴである；Ｘ２は、ＡもしくはＴである；Ｘ３は、ＧもしくはＴである；Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；またはその任意の組み合わせである。例えば、オリゴヌクレオチドは、
ｍｏｒ－４－１ ５’－ＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣ－３’（配列番号２５）
ｍｏｒ－４－２ ５’－ＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡ－３’（配列番号２６）
ｍｏｒ－４－３ ５’－ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’（配列番号２７）
ｍｏｒ－４－４ ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号１７）
ｍｏｒ－４－５ ５’－ＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’（配列番号２８）
ｍｏｒ－４－７ ５’－ＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴ－３’（配列番号２９）
ｍｏｒ－４－８ ５’－ＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡ－３’（配列番号３０）
の配列を含む。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＸ１Ｘ２ＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’（配列番号３１）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
例えば、Ｘ１は、Ｃ、Ｔ、もしくはＡである；Ｘ２は、ＴもしくはＧである；またはその任意の組み合わせである。例えば、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’（配列番号３２）、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’（配列番号３３）、
５’－ＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’（配列番号３４）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２ＧＧＣＣＧＧ－３’（配列番号３５）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。
例えば、Ｘ１は、ＡもしくはＣである；Ｘ２は、ＴもしくはＡである；またはその任意の組み合わせである。例えば、オリゴヌクレオチドは、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧ－３’（配列番号３６）、
５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧ－３’（配列番号３７）
の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む。

Claims (69)

  1. 標的にハイブリダイズする配列を含む核酸であって、前記標的は、ＲＡＳファミリー遺伝子の前駆体－ｍＲＮＡ（プレ－ｍＲＮＡ）を含み、前記前駆体－ｍＲＮＡは、少なくとも１個の変異を含むエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフを含む、核酸。
  2. 前記プレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートする、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記プレ－ｍＲＮＡのスプライシングを促進するまたはスプライシングを阻害する、請求項２に記載の核酸。
  4. 前記標的は、前記プレ－ｍＲＮＡのエクソン３またはその一部分を含む、請求項１に記載の核酸。
  5. エクソン３またはその一部分を除外する選択的スプライシングを促進する、請求項４に記載の核酸。
  6. 前記配列は、前記標的に少なくとも部分的に相補的であるか、部分的に相補的であるか、または完全に相補的である、請求項１に記載の核酸。
  7. 前記標的は、野生型プレ－ｍＲＮＡと比較して少なくとも１個の変異を含む、請求項１に記載の核酸。
  8. 前記標的は、前記エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフまたはそれに近接した配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  9. 前記配列は、野生型プレ－ｍＲＮＡに相補的ではない、請求項１に記載の核酸。
  10. 前記ＲＡＳファミリー遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳを含む、請求項１に記載の核酸。
  11. 前記エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、前記プレ－ｍＲＮＡのコドン５２～７０またはその一部分を含む、請求項１に記載の核酸。
  12. 前記エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＫＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５５～６５またはその一部分を含む、請求項１１に記載の核酸。
  13. 前記エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＮＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５５～６６を含む、請求項１１に記載の核酸。
  14. 前記エクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）結合モチーフは、ＨＲＡＳのプレ－ｍＲＮＡのコドン５８～６７を含む、請求項１１に記載の核酸。
  15. 前記標的は、
    ［配列番号［］］、そのフラグメント、
    またはそれと少なくとも９０％同一である配列
    を含む配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  16. Ｘ１は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
    Ｘ２は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
    Ｘ３は、Ｇ、Ａ、Ｕ、もしくはＣである；
    Ｘ４は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
    その任意の組み合わせである、請求項１５に記載の核酸。
  17. 前記配列は、
    ［配列番号［］］、
    ［配列番号［］］、
    ［配列番号［］］、および
    ［配列番号［］］、
    またはそれと少なくとも９０％同一の配列
    を含む、請求項１５に記載の核酸。
  18. 標的は、
    ［配列番号［］］、そのフラグメント、
    またはそれと少なくとも９０％同一である配列
    を含む配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  19. Ｘ１は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；
    Ｘ２は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
    その任意の組み合わせである、請求項１８に記載の核酸。
  20. 前記配列は、
    ［配列番号［］］、
    ［配列番号［］］、
    ［配列番号［］］、
    またはそれと少なくとも９０％同一の配列
    を含む、請求項１８に記載の核酸。
  21. 前記標的は、
    ［配列番号［］］、そのフラグメント、
    またはそれと少なくとも９０％同一の配列
    を含む配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  22. Ｘ１は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；
    Ｘ２は、Ｇ、Ｕ、Ａ、もしくはＣである；または
    その任意の組み合わせである、請求項２１に記載の核酸。
  23. 前記配列は、
    ［配列番号［］］、
    ［配列番号［］］、
    またはそれと少なくとも９０％同一の配列
    を含む、請求項２１に記載の核酸。
  24. 前記少なくとも１個の変異は、コドン６１内の変異を含む、請求項１に記載の核酸。
  25. 前記少なくとも１個の変異は、Ｇ６０Ｘ、Ｑ６１Ｘ、またはその組み合わせを含む、請求項１に記載の核酸。
  26. 前記少なくとも１個の変異は、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、またはＱ６１Ｋを含む、請求項２５に記載の核酸。
  27. 前記少なくとも１個の変異はＧＱ６０ＧＫを含む、請求項２５に記載の核酸。
  28. ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］
    に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  29. Ｘ１は、ＧもしくはＴである；
    Ｘ２は、ＡもしくはＴである；
    Ｘ３は、ＧもしくはＴである；
    Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；または
    その任意の組み合わせである、請求項２８に記載の核酸。
  30. ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］
    の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
  31. ５’－ＣＴＴＸ１Ｘ２ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号［］］
    に従った配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  32. Ｘ１は、ＧもしくはＴである；
    Ｘ２は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；または
    その任意の組み合わせである、請求項３１に記載の核酸。
  33. ５’－ＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴ－３’［配列番号［］］、または
    ５’－ＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧ－３’［配列番号［］］
    の配列を含む、請求項３１に記載の核酸。
  34. ５’－Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４－３’［式中、Ｘ１は、ＧもしくはＴである；Ｘ２は、ＡもしくはＴである；Ｘ３は、ＧもしくはＴである；Ｘ４は、Ｇ、Ｃ、もしくはＡである；またはその任意の組み合わせである］に従った配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  35. ５’隣接ヌクレオチド、３’隣接ヌクレオチド、または５’隣接ヌクレオチドおよび３’隣接ヌクレオチドの両方をさらに含む、請求項３４に記載の核酸。
  36. ５’－ＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣ－３’（配列番号［］）、
    ５’－ＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡ－３’（配列番号［］）、
    ５’－ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡ－３’（配列番号［］）、
    ５’－ＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＧ－３’（配列番号［］）、
    ５’－ＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－３’（配列番号［］）、
    ５’－ＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴ－３’（配列番号［］）、または
    ５’－ＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡ－３’（配列番号［］）
    の配列を含む、請求項３５に記載の核酸。
  37. ５’－ＣＴＣＴＴＣＴＸ１Ｘ２ＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号［］］
    の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  38. Ｘ１は、Ｃ、Ｔ、もしくはＡである；
    Ｘ２は、ＴもしくはＧである；
    またはその任意の組み合わせである、請求項３７に記載の核酸。
  39. ５’－ＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴ－３’［配列番号［］］
    の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３７に記載の核酸。
  40. ５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＸ１Ｘ２ＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号［］］
    の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載の核酸。
  41. Ｘ１は、ＡもしくはＣである；
    Ｘ２は、ＴもしくはＡである；または
    またはその任意の組み合わせである、請求項４０に記載の核酸。
  42. ５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号［］］、
    ５’－ＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＧ－３’［配列番号［］］
    の配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項４０に記載の核酸。
  43. 修飾された核酸を含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載の核酸。
  44. 前記修飾された核酸は、糖修飾、骨格修飾、塩基修飾、非天然塩基対、細胞透過性ペプチドへのコンジュゲーション、またはその任意の組み合わせを含む、請求項４３に記載の核酸。
  45. 前記修飾は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）＋２’－Ｏ－メトキシエチル（Methyoxyethyl）（２’ＭＯＥ）を含む、請求項４３に記載の核酸。
  46. 前記修飾された核酸は、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アミド架橋核酸（ＡｍＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項４３に記載の核酸。
  47. 前記モルホリノは細胞透過性ペプチドコンジュゲートモルホリノである、請求項４６に記載の核酸。
  48. 請求項１から４７のいずれか一項に記載の核酸を含む組成物。
  49. 薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
  50. 少なくとも１種の付加的な活性剤をさらに含む、請求項４８に記載の組成物。
  51. 前記少なくとも１種の付加的な活性剤は抗がん剤を含む、請求項５０に記載の組成物。
  52. それを必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、請求項１から４７のいずれか一項に記載の核酸または請求項４８から５１のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
  53. 前記がんはＲＡＳ関連がんを含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ＲＡＳは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳである、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ＲＡＳ関連がんは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳにおける少なくとも１個の変異を含む、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記少なくとも１個の変異は、Ｇ６０Ｘ、Ｑ６１Ｘ、またはその組み合わせを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記少なくとも１個の変異は、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、またはＱ６１Ｋを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記少なくとも１個の変異はＧＱ６０ＧＫを含む、請求項５６に記載の方法。
  59. 対象においてスプライシングを誘導するための方法であって、請求項１から４７のいずれか一項に記載の核酸または請求項４８から５１のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
  60. 腫瘍細胞においてＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするための方法であって、腫瘍細胞と、前記腫瘍細胞においてＲＡＳプレ－ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートするのに有効な量の、請求項１から４７のいずれか一項に記載の核酸とを接触させるステップを含む方法。
  61. モジュレートすることは、スプライシングを増強することまたは誘導することを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. スプライシングをモジュレートすることは、エクソン３のスプライシングをモジュレートすることを含む、請求項６０に記載の方法。
  63. スプライシングは、正常細胞においてではなく、腫瘍細胞においてモジュレートされる、請求項６０に記載の方法。
  64. 腫瘍細胞においてエクソンのスキッピングを誘導するための方法であって、腫瘍細胞と、前記腫瘍細胞においてエクソンのスキッピングを誘導するのに有効な量の、請求項１から４７のいずれか一項に記載の核酸とを接触させるステップを含む方法。
  65. 前記エクソンはＲＡＳのエクソンを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記エクソンはエクソン３を含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ＲＡＳは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳを含む、請求項６５に記載の方法。
  68. 請求項１から４７のいずれか一項に記載の核酸、およびその使用のための使用説明書を含むキット。
  69. 請求項４８から５１のいずれか一項に記載の組成物、およびその使用のための使用説明書を含むキット。
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