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JP2024511954A - ペプチド－オリゴヌクレオチド複合体を用いる筋強直性ジストロフィー１型の治療法 - Google Patents

ペプチド－オリゴヌクレオチド複合体を用いる筋強直性ジストロフィー１型の治療法 Download PDF

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JP2024511954A JP2023555737A JP2023555737A JP2024511954A JP 2024511954 A JP2024511954 A JP 2024511954A JP 2023555737 A JP2023555737 A JP 2023555737A JP 2023555737 A JP2023555737 A JP 2023555737A JP 2024511954 A JP2024511954 A JP 2024511954A
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アシュリング ホランド，
スミタ グンヌー，
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ペプゲン インコーポレイテッド．
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Abstract

筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を有する対象を治療する方法が開示される。前記方法は、少なくとも１ヶ月の時間間隔で複数用量の複合体を含む治療レジメンを実施することを含み、前記複合体は、オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合又はリンカーを介して連結されたペプチドを含み、前記ペプチドは、２つのカチオン性ドメインに挟まれた疎水性ドメインを含み、前記カチオン性ドメインのそれぞれは、RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRR（配列番号３）、RBRRBR（配列番号４）、RRBRBR（配列番号５）、RBRRB（配列番号６）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、HBHBR（配列番号９）、RBRHBHR（配列番号１０）、RBRBBHR（配列番号１１）、RBRRBH（配列番号１２）、HBRRBR（配列番号１３）、HBHBH（配列番号１４）、BHBH（配列番号１５）、BRBSB（配列番号１６）、BRB[Hyp]B（配列番号１７）、R[Hyp]H[Hyp]HB（配列番号１８）、及びR[Hyp]RR[Hyp]R（配列番号１９）のうち１つを含み、前記疎水性ドメインは、YQFLI（配列番号２０）、FQILY（配列番号２１）、ILFQY（配列番号２２）、FQIY（配列番号２３）、WWW、WWPWW（配列番号２４）、WPWW（配列番号２５）、及びWWPW（配列番号２６）のうち１つを含み、及び、前記オリゴヌクレオチドは、合計１２から４０個の連続する核酸塩基を含み、少なくとも９個の連続する核酸塩基は、ＣＵＧ反復配列に相補的である。

Description

本発明はペプチド-オリゴヌクレオチド複合体を用いる筋強直性ジストロフィー１型の治療法に関する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脊髄性筋萎縮症（SMA）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）の両方におけるスプライシングを調節する能力によって例証されており、神経筋疾患の治療への使用が大いに期待されている。トリヌクレオチドリピート伸長あるいはマイクロサテライトリピート伸長としても知られるトリプレットリピートの伸長は、多くの疾患の根底にあり、このような伸長を調節することは治療的意味を有する可能性がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、疾患の発症に関与するタンパク質とRNA種の結合を阻害するために用いることができる。
しかし、これらの有望なアンチセンス治療薬の治療開発は、組織への浸透性や細胞への取り込みの悪さによって妨げられてきた。
筋強直性ジストロフィー1（DM1）は、１９番染色体の長腕に位置する筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（DMPK）の転写産物の3'-非翻訳領域におけるCUGリピートの伸長によって引き起こされる（Mahadevanら、Science 255:1253-1255、1992）。CUGリピートを有するDMPK転写産物と安定なRNA-モルホリノヘテロ二重鎖を形成できるモルホリノASOが開発された。このようにして、ASOはこれらの異常なRNA種と、スプライシング機構の制御に基本的な役割を果たすmuscleblind-like 1（MBNL1）などの他のタンパク質との相互作用を妨害する。しかし、ASOを用いた有害なDMPK転写産物のサイレンシングと異常なpre-mRNAスプライシングに対する正常化効果の誘導はin vitroで実証されているが、in vivoでの効果的なサイレンシングは、ASOの組織透過と細胞内への取り込みが非効率的であるため、まだ達成されていない（Legerら、Nucleic Acid Therapeutics 23(2):109-117、2013）。実際、ヒトにおけるDM1治療のための第1/2a相臨床試験がIonis Pharmaceuticalsによって実施された（ClinicalTrials.gov,Identifier：NCT02312011、clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT02312011）。従って、現在治療法のない疾患に対して有効な治療法を提供するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を改善することが急務である。
送達媒体としてウイルスの使用も提案されているが、ウイルスのコートタンパク質の免疫毒性及び潜在的な発がん性のため、これには限界がある。代わりに、様々な非ウイルス性送達ベクターが開発されており、中でもペプチドは、小さいサイズ、低毒性、標的特異性、及び大きなバイオカーゴを毛細管を介して送達する能力により、最も有望であることが示されている（Farkhaniら、Peptides 57:78-94、2014、Kangら、Curr. Pharm. Biotechnol. 15:220-230、2014、及びPardridge、J. Cereb. Blood Flow Metab. 32:1959-1972、2012）。いくつかのペプチドが、単独で、又はバイオカーゴを運びながら、細胞を透過する能力について報告されている（Farkhaniら及びKangら、前出）。
特に、中央の短い疎水性配列で分離された2つのアルギニンリッチな配列からなるアルギニンリッチなCPPsであるPNA/PMO内部移行ペプチド（Pips）が開発された。これらの「Pip」ペプチドは、当初はペプチド核酸（PNA）カーゴに結合させることにより、高レベルのエクソンスキッピングを維持しながら血清安定性を改善するように設計された。これらのペプチドのさらなる誘導体は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（PMOs）の複合体として設計され、マウスの全身投与後に、全身の骨格筋ジストロフィンの産生を引き起こし、重要なことに心臓での産生も含まれることが示された（Bettsら、Molecular Therapy - Nucleic Acids 1(8)、e38、2012）。
数年にわたり、細胞透過性ペプチド（CPPs）は、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドであるSSOs（特に電荷中性のPMO及びPNA）と複合体化され、そのようなオリゴヌクレオチド類似体を効果的に細胞膜を越えて運び、細胞核内のpre-mRNA標的部位に到達させることにより、細胞送達を増強している。特定のアルギニンリッチなCPPsと複合体化されたPMO治療薬（ペプチドPMO又はP-PMOとして知られている）は、DMDのmdxマウスモデルにおいて全身投与後、骨格筋におけるジストロフィン産生を増強できることが示されている。
R6Glyなどの単一のアルギニンリッチドメインを有する代替細胞透過ペプチドも製造されている。これらのCPPsは、毒性が低減されたペプチド複合体の製造に使用されてきたが、これらの複合体は、Pipペプチドと比較して低い有効性を示した。
従って、現在利用可能なCPPsは、DM1などの疾患のためのヒトでの治療に使用するのに適しているとは、未だ証明されていない。
治療用複合体に使用する担体の配列を変えるための研究者の努力にもかかわらず、これまで、治療効果という点で高い有効性と許容できる毒性レベルの両方を備えた複合体を製造することは非常に困難であることが判明している。
従って、治療効果を維持しながら、患者に全身投与したときに毒性の低減を示すオリゴヌクレオチドを送達する複合体の必要性が残っている。
本発明の1つ以上の態様は、少なくともこの問題を解決することを意図している。
細胞透過ペプチド技術の分野での課題は、有効性と毒性を切り離すことであった。現在、本発明者らは、筋強直性ジストロフィー1型（DM1）などのトリプレットリピート伸長の治療において、少なくともこの問題に対処する、本発明による特定の構造を有する多数の改良されたCPPsを同定し、合成し、試験した。
これらのペプチド複合体は、in vitro及びin vivoでカーゴオリゴヌクレオチドを用いて試験したとき、骨格筋において良好なレベルの有効性を維持する。さらに、これらのペプチド複合体は、同一の治療用カーゴを送達するために使用された場合、従来利用可能であったCPPsを含む複合体と比較して、有効性の向上を示している。同時に、これらのペプチド複合体はin vivoで効果的に作用し、全身注射後に筋強直性ジストロフィー1型（DM1）などのトリプレットリピート伸長障害の動物モデルにおいて臨床症状が軽減され、生化学的マーカーの測定を通して観察される毒性も低減される。重要なことは、本発明のペプチド複合体は、従来のCPPsを含む複合体と比較して、マウスに同様の全身注射を行った後に、驚くほど毒性の低減を示したことである。従って、本発明で使用するペプチド複合体は、従来利用可能であったペプチド複合体よりもヒトに対する治療としての適性が改善されており、ヒト被験者の安全且つ効果的な治療のための治療用複合体として使用することができる。
典型的には、本発明は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を有する対象を治療する方法を提供する。
一つの態様において、上記方法は、少なくとも１ヶ月の時間間隔で複数用量の複合体を含む治療レジメンを実施することを含み、上記複合体は、オリゴヌクレオチドと、上記オリゴヌクレオチドに共有結合又はリンカーを介して連結されたペプチドを含み、上記ペプチドは、２つのカチオン性ドメインに挟まれた疎水性ドメインを含み、前記カチオン性ドメインのそれぞれは、RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRR（配列番号３）、RBRRBR（配列番号４）、RRBRBR（配列番号５）、RBRRB（配列番号６）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、HBHBR（配列番号９）、RBRHBHR（配列番号１０）、RBRBBHR（配列番号１１）、RBRRBH（配列番号１２）、HBRRBR（配列番号１３）、HBHBH（配列番号１４）、BHBH（配列番号１５）、BRBSB（配列番号１６）、BRB[Hyp]B（配列番号１７）、R[Hyp]H[Hyp]HB（配列番号１８）、及 びR[Hyp]RR[Hyp]R（配列番号１９）のうち１つを含み、前記疎水性ドメインは、YQFLI（配列番号２０）、FQILY（配列番号２１）、ILFQY（配列番号２２）、FQIY（配列番号２３）、WWW、WWPWW（配列番号２４）、WPWW（配列番号２５）、及びWWPW（配列番号２６）のうち１つを含み、及び、上記オリゴヌクレオチドは、合計１２から４０個の連続する核酸塩基を含み、少なくとも９個の連続する核酸塩基は、ＣＵＧ反復配列に相補的である。
いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、１から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、２から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、３から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、３から４ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、４から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、５から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月である。
上記治療レジメンは、２週間の開始間隔で複合体を３回又は４回投与することを含む治療開始レジメンをさらに含む
いくつかの実施形態において、投与される複合体の量は、各時点で同じ用量レベルである。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]n-3'であり、ｎは、５から８の整数である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]5-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]6-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]7-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]8-3'である。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]n-3'であり、ｎは、５から８の整数である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]5-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]6-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]7-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]8-3'である。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]n-3'であり、上記ｎは、５から８の整数である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]5-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]6-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]7-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]8-3'である。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、下記のアミノ酸配列RBRRBRFQILYBRBR（配列番号３５）を有する。上記ペプチドは、下記のアミノ酸配列RBRRBRRFQILYRBHBH（配列番号３７）を有する。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、下記のアミノ酸配列RBRRBRFQILYRBHBH（配列番号４４）を有する。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、そのＮ末端を介して上記複合体の残りの部分に結合する。いくつかの実施形態において、上記ペプチドのＣ末端は、-CONH2である。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、そのＣ末端を介して上記複合体の残りの部分に結合する。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、そのＮ末端でアシル化される。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、各リンカーは、独立して下記式（Ｉ）で示される、方法。

（式中、T1は、前記ペプチドに結合するための２価の基であり、-NH-及びカルボニルからなる群から選択され、
T2は、オリゴヌクレオチドに結合するための２価の基であり、-NH-及びカルボニルからなる群から選択され、
ｎは、１、２又は３であり、
各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
ここで、
Y1は、存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して水素、OH、又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、又は-N(RA3)SO2-であり、各RA3は、独立して水素及びメチルから選択され、及び、
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールであり、
ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、及び（１－４Ｃ）アルコキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RA4及びRA5はそれぞれ独立して水素及び（１－４Ｃ）アルキルからなる群より選択され、及び
各R2は、独立して-Y2-X2-Z2であり、ここで、
Y2は、存在しないか、式-[CRB1RB2]m-で示される基であり、ｍは、１、２、３又は４、から選択される整数であり、RB1及びRB2はそれぞれ独立して水素、OH又は（１－２Ｃ）アルキルから選択され、
X2は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S--SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり、それぞれRB3は独立して水素又はメチルから選択され、及び
Z2は、水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル又はヘテロアリールから選択され、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル又はヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、及び（１－４Ｃ）アルコキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RB4及びRB5は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、ただし、ｎ＝１かつ、T1及びT2は互いに異なるとき、R1及びR2は、両方ともHではなく、ｎ=１かつ、T1及びT2は互いに異なり、R1及びR2の一方はHであるとき、R1及びＲ２の他方はメチルではなく、又はｎ＝２かつ、R1及びR2の各存在はHであるときT1及びT2は両方とも-C(O)-、又は両方とも-NH-である。）
いくつかの実施形態において、T2は、-C(O)-である。
いくつかの実施形態において、各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
Y1は、存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは１、２、３又は４であり、ＲＡ１とＲＡ２はそれぞれ水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-又は-S-であり、各RA3は独立して水素又はメチルであり、及び、
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールであり、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、及びヘテロアリールは（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、及び（１－４Ｃ）アルコキシ、からなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RMとRA5は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルである。
いくつかの実施形態において、各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
Y1は存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは１、２、３、又は４であり、RA1とR"は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、
-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、又は-S-であり、各RA3は、独立して水素又はメチルであり、及び、
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、又はヘテロアリールであり、それぞれ（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、及びヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、及びヒドロキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、1、2、3、4、又は5）の置換基によって置換されていてもよい。
いくつかの実施形態において、各R1は独立して-Y1-X1-Z1、であり、
Y1は存在しないか、式-(CRA1RA2)m-で示される基であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RA1とRA2は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は存在しないか、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-であり、各RA3は水素又はメチルであり、及び、
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、又はヘテロアリールであり、それぞれ（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、及びヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、及びヒドロキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよい。
いくつかの実施形態において、各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
Y1は、存在しないか、-(CH2)-、又は-(CH2CH2)-であり、
X1は、存在しないか、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-であり、各RA3は独立して水素又はメチルであり、及び、
Z1は、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである。
いくつかの実施形態において、各R2は、独立して-Y2-Z2であり、
Y2は、存在しないか、-(CRB1RB2)m-であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RB1とRB2はそれぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、及び、
Z2は水素又は（１－６Ｃ）アルキルである。
いくつかの実施形態において、各R2は、水素である。いくつかの実施形態において、ｎは、２又は３である。いくつかの実施形態において、ｎは、１である。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、グルタミン酸、コハク酸、及びγ－アミノ酪酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基である。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、その3'末端でリンカー又はペプチドに結合する。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、モルホリノである。いくつかの実施形態において、上記モルホリノ中のすべてのモルホリノヌクレオシド間結合は、-P(O)(NMe2)O-である。従って、いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'末端として以下の基を含む。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、腹腔内投与される。いくつかの実施形態において、上記複合体は、非経口的に投与される（例えば、点滴静注によって）。
いくつかの実施形態において、上記複数用量中の各用量は、少なくとも5 mg/kg（例えば、5 mg/kgから60 mg/kg、例えば、30 mg/kgから60 mg/kg; 例えば、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、又は60 mg/kg、及び、それらの値の任意の組み合わせの範囲）の上記複合体を含む。
いくつかの実施形態において、上記複数用量中の各用量は、40 mg/kgから60 mg/kg、30 mg/kgから50 mg/kg、30 mg/kgから40 mg/kg、40 mg/kgから50 mg/kg、50 mg/kgから60 mg/kg、35 mg/kgから45 mg/kg、45 mg/kgから55 mg/kg、35 mg/kgから55 mg/kg、30 mg/kgから45 mg/kg、35 mg/kgから50 mg/kg、40 mg/kgから55 mg/kg、45 mg/kgから60 mg/kg、1 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから20 mg/kg、5 mg/kgから25 mg/kg、10 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから15 mg/kg、5 mg/kgから20 mg/kg、10 mg/kgから25 mg/kg、15 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから10 mg/kg、5 mg/kgから15 mg/kg、10 mg/kgから20 mg/kg、15 mg/kgから25 mg/kg、20 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから25 mg/kg、4 mg/kgから20 mg/kg、6 mg/kgから15 mg/kg、又は8 mg/kgから10 mg/kgの上記複合体を含む。
いくつかの実施形態において、上記複数用量中の各用量は、1 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、8 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、又は60 mg/kgの上記複合体を含む。
本発明はまた、本明細書に記載の方法における本明細書に記載の複合体の使用も含む。 従って、本明細書における各治療方法の請求項は、示された方法（例えば、DM1の治療、予防、又は改善）での使用のために、そこに規定されたとおりの組成物の形態における請求を支持するものと考えることができる。
定義
本明細書全体を通して、「X」とは、6-アミノヘキサン酸などのアミノ酸アミノヘキサン酸の任意の形態を示す。
本明細書全体を通して、「B」とは、アミノ酸β‐アラニンを示す。
本明細書全体を通して、「[Hyp]」とは、アミノ酸ヒドロキシプロリンを示す。
本明細書全体を通して、「Ac」とは、アセチル基（CH3-C(O)-）を示す。
本明細書全体を通して、他の大文字は、一般に受け入れられているアルファベットのアミノ酸コードに従って、遺伝子的にコード化された関連するアミノ酸残基を示す。
「アルキル」という用語は、本明細書において、特に指定がない限りは、合計１から２０個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素基（例えば、（１－６Ｃ）アルキル、（１－４Ｃ）アルキル、（１－３Ｃ）アルキル、又は（１－２Ｃ）アルキル）を指す。アルキルの非限定的な例としては、メチル、エチル、1-メチルエチル、プロピル、1-メチルブチル、1-エチルブチルなどが挙げられる。「プロピル」のような個々のアルキル基への言及は、直鎖基のみに特有であり、「イソプロピル」のような個々の分岐鎖アルキル基への言及は、分岐鎖基にのみ特有である。
「アルケニル」という用語は、本明細書において、特に指定がない限りは、１、２、又は３個の炭素―炭素二重結合を持ち、合計２から２０個の炭素原子を含有する脂肪族基を指す（例えば、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－４Ｃ）アルケニル、又は（２－３Ｃ）アルケニル）。アルケニルの非限定的な例としては、ビニル、アリル、ホモアリル、イソプレニルなどが挙げられる。特に指定がない限りは、アルケニルはカルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、オキソ、ハロゲン、及びヒドロキシルからなる群から選択される１、２、３、４又は５個の基によって置換されていてもよい。
「アルキニル」という用語は、本明細書において、特に指定がない限りは、１、２、又は３個の炭素―炭素三重結合を含有し、合計２から２０の炭素原子を含有する脂肪族基（例えば、（２－６Ｃ）アルキニル、（２－４Ｃ）アルキニル、又は（２－３Ｃ）アルキニル）を指す。アルキニルの非限定的な例としては、エチニル、プロパルギル、ホモプロパルギル、ブタ-2-イン-1-イル、2-メチル-プロプ-2-イン-1-イルなどが挙げられる。特に指定がない限りは、アルキニルカルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、オキソ、ハロゲン、及びヒドロキシルからなる群から選択される１、２、３、４、又は５個の基によって置換されていてもよい。
カチオン性ドメインに関して「アルギニンリッチ」とは、カチオン性ドメインの少なくとも40% がアルギニン残基で形成されていることを意味する。
「人工アミノ酸」という用語は、本明細書において、非生体アミノ酸（例えば、非タンパク原性）を指す。例えば、人工アミノ酸は、合成アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば、糖で修飾されたアミノ酸）、非天然アミノ酸、人造アミノ酸、スペーサー、及び非ペプチド結合スペーサーを含んでもよい。合成アミノ酸は、人によって化学的に合成されたものを含んでもよい。疑義を避けるため、アミノヘキサン酸（X）は、本発明の文脈においては人工アミノ酸である。疑義を避けるため、β‐アラニン（B）及びヒドロキシプロリン（Hyp）は、自然界に存在するので、本発明の文脈においては、人工アミノ酸ではなく天然アミノ酸である。人工アミノ酸は、例えば、6‐アミノヘキサン酸（X）、テトラヒドロイソキノリン‐3‐カルボン酸（TIC）、1‐（アミノ）シクロヘキサンカルボン酸（Cy）、3‐アゼチジンカルボン酸（Az）、及び11‐アミノウンデカン酸を含んでもよい。
「アリール」という用語は、本明細書において、１、２、又は３個の環を含有する炭素環式環系を指し、環のうちの少なくとも１個は芳香族である。非置換アリールは、合計6から14個の炭素原子を含む。アリールという用語は、１価の種と２価の種の両方を含む。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、インダニル、などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、置換されていてもよいアリールは、置換されていてもよいフェニルである。
本明細書において、「架橋環系」とは、２個の環が２個以上の原子を共有する環系を意味する、例えば、Advanced Organic Chemistry、Jerry March著、第４版、Wiley Interscience、131-133ページ、1992年を参照されたい。架橋ヘテロシクリル環系の例としては、アザ-ビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、アザ-ビシクロ[2.2.2]オクタン、アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタン、キヌクリジン、などが挙げられる。
本明細書において、「カルボニル」という用語は、以下の構造の基、-C(O)-を指す。カルボニル基の非限定的な例としては、例えば、アセトン、エチルアセテート、タンパク原性アミノ酸、アセトアミド、などに見られるカルボニル基が挙げられる。
本明細書において、「カチオン性」とは、生理的ｐＨにおいて全体として正電荷を有するアミノ酸又はアミノ酸ドメインを示す。
単独又は接頭語として使用される「（m-nC）」又は「（m-nC）基」という用語は、置換されない場合に、合計mからn個の炭素原子を有する基を指す。
「相補的」という用語は、本明細書において核酸塩基配列に関して使用される場合、核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、生理的条件において他のオリゴヌクレオチド又は核酸にハイブリダイズして、二重鎖構造を形成することを可能にする、連続した核酸塩基のパターンを有する核酸塩基配列を指す。相補的配列には、天然及び/又は修飾された核酸塩基から形成されるワトソン‐クリック塩基対が含まれる。相補配列には、また、ウォブル塩基対（グアノシン-ウラシル、ヒポキサンチン-ウラシル、ヒポキサンチン-アデニン、ヒポキサンチン-シトシン）やフーグスティーン塩基対などの非ワトソンクリック塩基対も含まれる場合もある。
「シクロアルキル」という用語は、本明細書において、特に指定がない限りは、１又は２個の環を含有し、合計３から１０個の炭素原子を含有する飽和炭素環式環系を指す。二環式シクロアルキルは縮合環系（２個の橋頭炭素原子は互いに直接結合している）、架橋環系（２個の橋頭炭素原子は、少なくとも１つの炭素原子を含む共有結合性リンカーを介して互いに結合している）、及びスピロ環（２個の環は同一の炭素原子で縮合している）系として配置されていてもよい。シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ[2.2.1]ヘプチル、などが挙げられる。
「シクロアルケニル」という用語は、本明細書において、特に指定がない限りは、非芳香族、非置換、炭素環式環系を指し、１又は２個の環を含有し、１、２、又は３個の環内二重結合を含有し、及び、合計３から１０個の炭素原子を含有する。二環式シクロアルケニルは縮合環系（２個の橋頭炭素原子は互いに直接結合している）、架橋環系（２個の橋頭炭素原子は、少なくとも１つの炭素原子を含有する共有結合性リンカーを介して互いに結合している）、及びスピロ環（２個の環は同一の炭素原子で縮合している）系として配置されていてもよい。シクロアルケニルの非限定的な例としては、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、3-シクロヘキセン-1-イル、シクロオクテニル、などが挙げられる。
「ハロ」又は「ハロゲノ」という用語は、本明細書において、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードを指す。
カチオン性ドメインに関して「ヒスチジンリッチ」とは、カチオン性ドメインの少なくとも40%がヒスチジン残基で形成されることを意味する。
「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族」という用語は、本明細書において互換的に使用される場合、１、２、又は３個の環を含有する環系を指し、環のうち少なくとも１個は芳香族であり、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子を１から４個（例えば、１、２、又は３個）含有する。非置換ヘテロアリール基は、合計１から９個の炭素原子を含有する。ヘテロアリールという用語は、１価の種と２価の種の両方を含む。ヘテロアリール基の例としては、５から１２個の環員、より一般的には５から１０個の環員を含有する、単環式及び二環式基が挙げられる。ヘテロアリール基は、例えば、5-又は6-員の単環式環、又は9-又は10-員の二環式環、例えば、縮合した５及び６員環又は２個の縮合した６員環から形成される二環式構造であってもよい。各環は、典型的には窒素、硫黄及び酸素から選択されるヘテロ原子を約４個まで含有してもよい。典型的には、ヘテロアリール環は、３個までのヘテロ原子、より一般的には２個までの、例えば、単一のヘテロ原子を含む。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール環は、少なくとも１個の環窒素原子を含有する。ヘテロアリール環の窒素原子は、イミダゾール又はピリジンの場合のように、塩基性であっても良く、又はインドール又はピロール窒素の場合のように、本質的に非塩基性であっても良い。典型的には、ヘテロアリール基に存在する塩基性窒素原子の数は、すべての環のアミノ基置換基を含めて、５個未満になる。
ヘテロアリールの例としては、フリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、1、3、5-トリアゼニル、ベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアゾリル、インダゾリル、プリニル、ベンゾフラザニル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、シノリニル、プテリジニル、ナフチリジニル、カルバゾリル、フェナジニル、ベンズイソキノリニル、ピリドピラジニル、チエノ[2,3-b]フラニル、2H-フロ[3,2-b]-ピラニル、5H-ピリド[2,3-d]-オキサジニル、1H-ピラゾロ[4,3-d]-オキサゾリル、4H-イミダゾ[4,5-d]チアゾリル、ピラジノ[2,3-d]ピリダジニル、イミダゾ[2,1-b]チアゾリル、イミダゾ[1,2-b][1,2,4]トリアジニルが挙げられる。「ヘテロアリール」はまた、少なくとも１個の環が芳香族環であり、他の環の１個以上が非芳香族、飽和又は部分飽和環である、部分芳香族の二環式又は多環式環系を含むが、ただし、少なくとも1個の環が窒素、酸素又は硫黄から選択される１個以上のヘテロ原子を含有する。部分芳香族ヘテロアリール基の例としては、例えば、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、2-オキソ-1,2,3,4-テトラヒドロキノリニル、ジヒドロベンズチエニル、ジヒドロベンズフラニル、2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシニル、ベンゾ[1,3]ジオキソイニル、2、2-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-2-ベンゾチエニル、4,5,6,7-テトラヒドロベンゾフラニル、インドリニル、1,2,3,4-テトラヒドロ-1,8-ナフチリジニル、1,2,3,4-テトラヒドロピリド[2,3-b]ピラジニル及び3,4-ジヒドロ-2W-ピリド[3,2-b][1,4]オキサジニルが挙げられる。５員ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、フラザニル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル及びテトラゾリル基が挙げられるが、これらに限定されない。６員ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル及びトリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリール基は、例えば、１、２又は３個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したベンゼン環；１、２又は３環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したピリジン環、１又は２個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したピリミジン環、１、２又は３個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したピロール環、１又は２個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したピラゾール環、１又は２個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したピラジン環、１又は２個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したイミダゾール環、１又は２個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したオキサゾール環、１又は２個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したイソキサゾール環、１又は２個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したチアゾール環、１又は２個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したイソチアゾール環、１、２又は３環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したチオフェン環、１、２又は３環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員環に縮合したフラン環、１、２又は３個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員ヘテロ芳香族環に縮合したシクロヘキシル環、及び１、２又は３個の環ヘテロ原子を含有する5-又は6-員ヘテロ芳香族環に縮合したシクロペンチル環から選択される基であってもよい。５員環に縮合した６員環を含有する二環式ヘテロアリール基の具体例としては、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンズイミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、イソベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、インドリニル、イソインドリニル、プリニル（例えば、アデニニル、グアニニル、インダゾリル、ベンゾジオキソリル及びピラゾロピリジニル基が挙げられるが、これらに限定されない。２個の縮合６員環を含有する二環式ヘテロアリール基の具体例としては、キノリニル、イソキノリニル、クロマニル、チオクロマニル、クロメニル、イソクロメニル、クロマニル、イソクロマニル、ベンゾジオキサニル、キノリジニル、ベンゾオキサジニル、ベンゾジアジニル、ピリドピリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、フタラジニル、ナフチリジニル及びプテリジニル基が挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロシクリル」という用語は、本明細書において、１、２、又は３個の環を含有する環系を指し、環のうち少なくとも１個は芳香族であり、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子を１から４個（例えば、１、２、又は３個）含有し、ただし、環系は、環内ヘテロ原子をさらに含む芳香族環を含有しない。非置換ヘテロシクリル基は、合計２から９個の炭素原子を含有する。ヘテロシクリルという用語は、１価の種と２価の種の両方を含む。ヘテロシクリル基の例としては、５から１２個の環員、より一般的には５から１０個の環員を含有する、単環式及び二環式基が挙げられる。ヘテロシクリル基は、例えば、5-又は6-員の単環式環、又は9-又は10-員の二環式環、例えば、縮合した５及び６員環又は２個の縮合した６員環から形成される二環式構造であってもよい。各環は、典型的には窒素、硫黄及び酸素から選択されるヘテロ原子を約４個まで含有してもよい。ヘテロシクリル基の非限定的な例としては、例えば、ピロリジン、ピペラジン、ピペリジン、アゼパン、1,4-ジアゼパン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、オキセパン、1,4-ジオキセパン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、インドリン、ベンゾピロリジン、2,3-ジヒドロベンゾフラン、フタラン、イソクロマン、及び2,3-ジヒドロベンゾチオフェンが挙げられる。
「ヌクレオシド間結合」という用語は、本明細書において、オリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオシド間に共有結合を形成する基又は結合を表す。ヌクレオシド間結合は非修飾ヌクレオシド間結合又は修飾ヌクレオシド間結合である。「非修飾ヌクレオシド間結合」は、リン酸(-O-P(O)(OH)-O-)ヌクレオシド間結合（「リン酸ホスホジエステル」）である。「修飾ヌクレオシド間結合」はリン酸ホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合である。修飾ヌクレオシド間結合の２つの主要な種類は、リン原子の有無によって定義される。リン含有ヌクレオシド間結合の非限定的な例としては、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスロチオエートジエステル結合、ホスホロチオエートトリエステル結合、モルホリノヌクレオシド間結合、メチルホスホネート、及びホスホルアミデートが挙げられる。非リンヌクレオシド間結合の非限定的な例としては、メチレンメチルイミノ(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、チオジエステル(-O-C(O)-S-)、チオノカルバメート(-O-C(O)(NH)-S-)、シロキサン(-O-Si(H)2-O-)、及びN、N′-ジメチルヒドラジン（-CH2-N(CH3)-N(CH3)-）が挙げられる。ホスホロチオエート結合は、非架橋酸素原子の１つが硫黄原子で置き換えられたホスホジエステル結合及びホスホトリエステル結合である。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド間結合は、以下の構造の基である。
（式中、
ZはO、S、又はSeであり、
Yは-X-L-R1であり、
各Xは独立して-O-、-S-、-N(-L-R1)-、又はLであり、
各Lは独立して共有結合又はリンカー（例えば、置換されていてもよいC1-60脂肪族リンカー又は置換されていてもよいC2-60ヘテロ脂肪族リンカー）であり、
各R1は独立して水素、-S-S-R2、-O-CO-R2、-S-CO-R2、置換されていてもよいC1-9ヘテロシクリル、又は疎水性部位であり、及び、
各R2は独立して置換されていてもよいC1-10アルキル、置換されていてもよいC2-10ヘテロアルキル、置換されていてもよいC6-10アリール、任意に置換されるC6-10アリールC1-6アルキル、置換されていてもよいC1-9ヘテロシクリル、又は置換されていてもよいC1-9ヘテロシクリルC1-6アルキルである。）
Lは共有結合、R1は水素、Zは酸素、及び全てのX基は-O-である場合、ヌクレオシド間基は、リン酸ホスホジエステルとして知られている。Lは共有結合、R1は水素、Zは硫黄、及び全てのX基は-O-である場合、ヌクレオシド間基はホスホロチオエートジエステルとして知られている。Zは酸素、全てのX基は-O-、及び（1）Lはリンカーであるか、又は（2）R1は水素ではない場合、ヌクレオシド間基はホスホトリエステルとして知られている。Zは硫黄、全てのX基は-O-、及び（1）Lはリンカーであるか、又は（2）R1は水素ではない場合、ヌクレオシド間基はホスホロチオエートトリエステルとして知られている。ホスホロチオエートトリエステル結合及びホスホトリエステル結合の非限定的な例は、US2017/0037399に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
「イントロン」は、タンパク質に翻訳されない（遺伝子内の）核酸領域を指す。イントロンは、前駆体mRNA（pre-mRNA）に転写され、その後成熟RNAの形成中にスプライシングにより除去される非コード部分である。
「モルホリノ」という用語は、本明細書においてオリゴヌクレオチドの種類に関して使用される場合、モルホリノヌクレオシド間結合によって相互連結された、少なくとも10個のモルホリノモノマー単位のオリゴマーを表す。モルホリノは5'基及び3'基を含む。例えば、モルホリノは、以下の構造であってもよい。
（式中、
nは、モルホリノサブユニット及び関連基Lの数を示す、少なくとも10（例えば、12から30）の整数であり、
各Bは独立して核酸塩基であり、
R1は、5'基（本明細書では、R1を5'末端と呼ぶ場合がある）であり、
R2は、3'基（本明細書では、R2を3'末端と呼ぶ場合がある）であり、及び、
Lは、（i）モルホリノヌクレオシド間結合、又は、（ii）Lは、R2に結合している場合、共有結合である。）
モルホリノの5'基は、例えば、ヒドロキシル、疎水性部位、リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、トリホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ジホロジチオエート、トリホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホルアミデート、ペプチドへの結合、ペプチド/リンカーの組み合わせへの結合、エンドソーム脱出部位、又は中性有機ポリマーであっても良い。いくつかの実施形態において、5'基は以下の構造である。
好ましい5'基は、ヒドロキシル及び以下の構造の基である。
より好ましい5'基は、以下の構造である。
モルホリノの3'基は、例えば、水素、疎水性部位、リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、トリホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ジホロジチオエート、トリホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホルアミデート、ペプチドへの結合、ペプチド/リンカーの組み合わせへの結合、エンドソーム脱出部位、又は中性有機ポリマーであってもよい。
モルホリノであるオリゴヌクレオチドと、そのオリゴヌクレオチドに共有結合又は連結されたペプチドとの複合体において、好ましい3'基はペプチドへの結合又はペプチド/リンカーの組み合わせへの結合である。
「モルホリノヌクレオシド間結合」という用語は、本明細書において、以下の構造の２価の基を表す。
（式中、
ZはO又はSであり、
X1は結合、-CH2-、又は-O-であり、
X2は結合、-CH2-O-、又は-O-であり、及び、
Yは-NR2であり、ここで、各Rは独立してH又はC1-6アルキル（例えば、メチル）であり、又は両方のRは、共にそれらが結合している窒素原子と結合して、C2-9ヘテロシクリル（例えば、N-ピペラジニル）を形成する。
ただし、X1及びX2の両方は同時に結合ではない。）
「モルホリノサブユニット」という用語は、本明細書において、以下の構造を指す。
（式中、Bは核酸塩基である。）
「核酸塩基」という用語は、本明細書において、ヌクレオシドのリボフラノース/2'-デオキシリボフラノースの1'位に見られる窒素含有ヘテロ環式環を表す。核酸塩基は、非修飾又は修飾されている。本明細書において、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（A）及びグアニン（G）、及びピリミジン塩基であるチミン（T）、シトシン（C）、及びウラシル（U）を含む。修飾核酸塩基は、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、アルキル又はアルキニル置換ピリミジン、アルキル置換プリン、及びN-2、N-6及びO-6置換プリン、並びに、合成及び天然核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-アルキル（例えば、6-メチル）アデニン及びグアニン、2-アルキル（例えば、2-プロピル）アデニン及びグアニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、2-チオシトシン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、5-トリフルオロメチルウラシル、5-トリフルオロメチルシトシン、7-メチルグアニン、7-メチルアデニン、8-アザグアニン、8-アザアデニン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、3-デアザグアニン、3-デアザアデニンを含む。特定の核酸塩基は、核酸の結合親和性を高めるのに特に有用である。例えば、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、N2-、N6-、及び／又はO6-置換プリンである。核酸二重鎖の安定性は、例えば、5-メチルシトシンを使用して増強することができる。核酸塩基の非限定的な例としては、2-アミノプロピルアデニン、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-N-メチルグアニン、6-N-メチルアデニン、2-プロピルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-プロピニル(-C≡C-CH3)ウラシル、5-プロピニルシトシン、6-アゾウラシル、6-アゾシトシン、6-アゾチミン、5-リボシルウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオl、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、8-アザ及び他の8-置換プリン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、5-ハロウラシル、及び5-ハロシトシン、7-メチルグアニン、7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノアデニン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、3-デアザグアニン、3-デアザアデニン、6-N-ベンゾイルアデニン、2-N-イソブチリルグアニン、4-N-ベンゾイルシトシン、4-N-ベンゾイルウラシル、5-メチル4-N-ベンゾイルシトシン、5-メチル4-N-ベンゾイルウラシル、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、プロミスキャス塩基、サイズ拡大塩基、及びフッ素化塩基が挙げられる。さらなる修飾核酸塩基には、1、3-ジアザフェノキサジン-2-オン、1、3-ジアザフェノチアジン-2-オン及び9-(2-アミノエトキシ）-1、3-ジアザフェノキサジン-2-オン（G-クランプ）などの三環式ピリミジンが含まれる。修飾核酸塩基にはまた、プリン又はピリミジン塩基が他のヘテロ環、例えば、7-デアザアデニン、7-デアザグアニン、2-アミノピリジン、又は2-ピリドンで置き換えられたものも含まれうる。さらなる核酸塩基には、Merigan et al.、U.S. Pat. No. 3、687、808に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering、Kroschwitz, J. I., Ed.、John Wiley & Sons、1990、858-859；Englisch et al.、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30、613；Sanghvi、Y. S.、Chapter 15、Antisense Research and Applications、Crooke, S. T.及びLebleu, B., Eds.、CRC Press、1993、273-288；及び、Chapters 6及び15、Antisense Drug Technology、Crooke S. T., Ed.、CRC Press、2008、163-166及び442-443に開示されているものが含まれる。
「ヌクレオシド」という用語は、本明細書において、当該技術分野で知られている糖-核酸塩基化合物及び基、ならびに、当該技術分野で知られている修飾又は非修飾2'-デオキシリボフランポーズ-核酸塩基化合物及び基を表す。糖はリボフラノースであってもよい。糖は修飾されていても非修飾であってもよい。非修飾リボフラノース-核酸塩基は、非修飾核酸塩基へのアノマー炭素結合を有するリボフラノースである。非修飾リボフラノース-核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジンである。非修飾2'-デオキシリボフラノース-核酸塩基化合物は2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシシチジン、2'-デオキシグアノシン、及びチミジンである。修飾化合物及び基は、本明細書に記載の核酸塩基修飾及び糖修飾からなる群から選択される１個以上の修飾を含む。核酸塩基修飾は、非修飾核酸塩基を修飾核酸塩基で置き換えることである。糖修飾は、例えば、2'-置換、ロック、炭素環化、又は非ロックであってもよい。2'-置換はリボフラノースの2'-ヒドロキシルを2'-フルオロ、2'-メトキシ、又は2'-（2-メトキシ）エトキシで置き換えるものであってもよい。あるいは、2'-置換は、2'-（アラ）置換であってもよく、以下の構造に対応する。
（式中、Bは核酸塩基、及びRは2'-（アラ）置換（例えば、フルオロ）である。2'-（アラ）置換基は当該技術分野で知られており、本明細書に記載の他の2'-置換基と同一でもよい。いくつかの実施形態において、2'-（アラ）置換は、2'-（アラ）-F置換（Rはフルオロ）である。ロック修飾は、リボフラノースの4'-炭素原子及び2'-炭素原子の間に架橋を組み込むことである。ロック修飾を有するヌクレオシドは、架橋核酸、例えば、ロック核酸（LNA）、エチレン-架橋核酸（ENA）、及びcEt核酸として当該技術分野で知られている。架橋核酸は、典型的には、親和性を高めるヌクレオシドとして使用される。「ヌクレオシド」はまた、モルホリノサブユニットを指してもよい。
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ヌクレオシド間結合又は以下の構造-X1-P(X2)(R1)2、の１価の基に結合したヌクレオシドを表す。（式中、X1はO、S、又はNHであり、及びX2は存在しないか、=O、又は=Sであり、各R1は独立して-OH、-N(R2)2、又は-O-CH2CH2CNであり、ここで、各R2は独立して置換されていてもよいアルキルであり、又は両方のR2基は、それらが結合する窒素原子と共に、結合して置換されていてもよいヘテロシクリルを形成する。）
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ヌクレオシド間結合によって共有結合した１０個以上の連続するヌクレオシドを含有する構造、１０個以上のモルホリノサブユニットを含有するモルホリノ、又は１０個以上のモルホリノサブユニットを含有するペプチド核酸を表す。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、モルホリノである。
「置換されていてもよい」という用語は、各基について記載されているように、置換又は非置換であっても良い基、構造、又は分子を指す。「式中R1基内の任意のCH、CH2、CH3基又はヘテロ原子（つまり、NH）は置換されていてもよい」という用語は、R1基の水素ラジカルの（任意の）１つが、関連する規定の基によって置換されることを意味する。
本明細書において、「作動可能に連結された」という用語は、選択されたヌクレオチド配列及び調節ヌクレオチド配列が、ヌクレオチドコード配列の発現を調節配列の制御下に置くような方法で共有結合している状況を含んでもよい、然るが故に、調節配列は、選択されたヌクレオチド配列の一部又は全てを形成するヌクレオチドコード配列の転写に影響を与えることが出来る。必要に応じて、得られた転写物は所望のペプチドに翻訳されうる。
本明細書において、「薬学的に許容される」という用語は、個体（例えば、ヒト）組織との接触に適するとともに、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、その他の問題合併症がなく、合理的なベネフィット／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。
本明細書において、「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含有し、薬学的に許容される 賦形剤とともに製剤化され、対象の疾患の治療のための治療レジメンの一部として政府規制当局の承認を得て製造又は販売される組成物を表す。
本明細書において、「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に開示される複合体、オリゴヌクレオチド、及びペプチドの薬学的に許容される塩を意味する。本明細書に記載の任意の化合物の薬学的に許容される塩は、健全な医学的判断の範囲内にあり、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適するとともに、過度の毒性、刺激、アレルギー反応がなく、合理的なベネフィット／リスク比に見合ったものを含んでもよい。薬学的に許容される塩は、当技術分野で周知である。例えば、薬学的に許容される塩は文献Berge et al.、J.Pharmaceutical Sciences 66:1-19、1977及びPharmaceutical Salts:Properties, Selection, and Use（Eds.P.H.Stahl及びC.G.Wermuth）、Wiley-VCH、2008.に記載されている。塩は、本明細書に記載の化合物の最終的な単離及び精製中にその場で、及び遊離塩基を適切な酸と反応させることによって別々に調製することができる。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリ及びアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、及びアミンカチオン（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンが含まれるが、これらに限定されない）などが含まれる。
「低減させる」又は「阻害する」という用語は、一般に、診断技術における日常技術によって測定される本明細書に記載の疾患又は状態の症状のような、関連する生理学的又は細胞応答を「減少させる」本発明の１以上の化合物の能力に関連してもよい。関連する生理学的又は細胞応答（in vivo又はin vitro）は、当業者には明らかであり、筋強直性ジストロフィー１型の症状又は病理の減少、又は筋強直性ジストロフィー１型の個体で発現するDMPK遺伝子の変化形態のような、DMPK遺伝子の欠損型の発現の減少を含んでもよい。応答における「減少」は、アンチセンス化合物を含まない化合物又は対照組成物によって生じる応答と比較して統計的に有意である場合があり、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%の低減を含む場合があり、その間の全ての整数を含んでもよい。
本明細書において、「対象」という用語は、対象からの試料の当該技術分野で知られた臨床検査の有無に関わらず、有資格の専門家（例えば、医師又は看護師）によって、疾患、障害、又は状態に罹患しているか又はその危険性があると判断された、ヒト又はヒトではない動物（例えば、哺乳類）を表す。疾患、障害、及び状態の非限定的な例としては、筋強直性ジストロフィー１型が挙げられる。
「糖」又は「糖部位」は、フラノース環又はヌクレオシドのフラノース環を置換しうる構造を有する天然に存在する糖を含む。本発明のヌクレオシドに含まれる糖は、非フラノース（又は4′置換フラノース）環又は環系又は開放系であってもよい。このような構造は、天然のフラノース環（例えば、6員環）に対する単純な変化を含む。代替糖はまた、フラノース環が、例えばモルホリノ環系やヘキシトール環系などの別の環系で置換された糖代用物も含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれうる有用な糖部位の非限定的な例としては、β-D-リボース、β-D-2′-デオキシリボース、置換糖（例えば、2′、5′及びビス置換糖）、4′-S-糖（例えば、4′-S-リボース、4′-S-2′-デオキシリボース、及び4′-S-2′-置換リボース）、二環式糖部位（例えば2′-O-CH2-4′又は2′-O-（CH2）2-4′架橋リボース由来の二環式糖）及び糖代用物（リボース環がモルホリノ又はヘキシトール環系で置換されている場合）。
本明細書において、「治療」及び「治療している」という用語は、疾患、障害、又は状態（例えば、筋強直性ジストロフィー１型）の改善、寛解、又は安定化を目的とした対象の医学的管理を指す。この用語は、積極的治療（筋強直性ジストロフィー１型の改善のための治療）、緩和治療（筋強直性ジストロフィー１型の症状の緩和のための治療）、及び支持的治療（他の治療を補うための治療）を含む。
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、「含む」及び「含有する」という語ならびにそれらの変形は、「含むが、これらに限定されない」という意味であり、他の部位、添加剤、成分、整数又は手順を除外することを意図しない（また、除外しない）。本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の定めがない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈上他に必要とされない限り、単数形だけでなく複数形も意図していると理解される。
「複合体」とは全て、その薬学的に許容される溶媒和物を含む、その溶媒和物も指す。
「オリゴヌクレオチド」とは全て、その薬学的に許容される塩及び／又は溶媒和物を含む、その塩及び／又は溶媒和物も指す。
特に指定がない限りは、本明細書では全てのペプチドをN末端からC末端方向（左から右）に示す。特に指定がない限りは、本明細書では全てのオリゴヌクレオチドは5'から3'方向（左から右）に示す。
本発明の特定の態様、実施形態又は実施例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、化学部位又は基は、それと両立しない場合を除き、本明細書に記載される他の態様、実施形態又は実施例にも適用可能であると理解される。本明細書（添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示された特徴のすべて、及び／又はそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程のすべては、そのような特徴及び／又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。
図１は、PPMO複合体の構造を示す。 図２は、異なる投与量のPPMO複合体の単回静脈内ボーラス投与による、HSALRDM1マウスモデルにおける機能不全のin vivo修正を示す。複合体投与2週間後の筋電図筋強直測定による対照（WT）及び筋強直（HSALR）マウスの腓腹筋における筋強直の修正（最大筋収縮後の弛緩中の力/時間曲線下面積として測定）。データは最小値から最大値までひげで表し、破線は筋強直無効閾値で筋強直がないところを示す。グラフは平均値±SEMでプロットし、１群あたりn=4-16である。統計は一元配置分散分析Dunnettの多重比較検定を用い、P値は対HSALR生理食塩水群のものであり、**はP<0.01、***はP<0.001を示す。 図３は、HSALRDM1モデルマウスの大腿四頭筋と腓腹筋における分子欠損のin vivo修正を示す。Clcn1転写産物、Mbnl1転写産物、及びAtp2a1転写産物のRT-PCRによる定量化スプライス修正解析は、対照（WT）及び筋強直症（HSALR）マウスの筋肉について、複数用量レベルでPPMO複合体を単回ボーラス投与した2週間後に行った。データは平均値±SEMで表し、１群あたりn=4-16である。統計は一元配置分散分析Dunnettの多重比較検定を用いて行い、P値は対HSALR生理食塩水群の値であり、*はP<0.05、**はP<0.01、***はP<0.001、***はP<0.0001を示す。 図４は、qPCRによって決定された腓腹筋（図4a）及び大腿四頭筋（図4b）におけるCUGexp HSA転写物のレベルに対する、HSALR DM1マウスモデルにおけるPPMOのin vivoスクリーニングを示す。データは平均値±SEMで表し、１群あたりn=4-16である。統計は一元配置分散分析Dunnettの多重比較検定を用いて行い、P値は対HSALR生理食塩水群の値であり、****はP<0.0001を示す。 図５は、PPMOを高濃度でトランスフェクションし、非複合体PMO又はPip複合体化PMO（Pip-PMO）でトランスフェクションした筋芽細胞と比較した、12、24、36、48時間にわたるin vitroでの対照ヒト筋芽細胞生存率の変化を示す。グラフは平均値±SEMでプロットし、１群あたりn≧１である。統計は一元配置分散分析Dunnettの多重比較検定を用いて行い、P値は対PBS（NT）群の値であり、***はP<0.001を示す。 図６は、PMODM1がCUGリピートを標的とし、立体的阻害を介して働くことを示している。PPMO複合体は腓腹筋の核病巣数に影響を与えなかった。パラメーターごとの処置群あたりn≧8である。グラフは平均値±SEMでプロットした。統計は一元配置分散分析Dunnettの多重比較検定を用いて行い、P値は対HSALR生理食塩水群の値である（ns（not significant）はP>0.05を示す）。 図７は、PPMO複合体のオフターゲット評価を示す。オフターゲット解析は天然に存在するCUGリピートに対するリピート配列PMOの影響を評価するために行われた。PPMO複合体はMapkap1又はPcolceに有意な影響を及ぼさなかったが、Txlnb転写物のレベルはベースラインと比較して中程度に上昇した。パラメーターごとの処置群あたりn=8である。グラフは平均値±SEMでプロットした。統計は一元配置分散分析Dunnettの多重比較検定を用いて行い、P値は対HSALR生理食塩水群の値である（ns（not significant）はP>0.05、***はP<0.01、***はP<0.001、***はP<0.0001を示す）。 図８は、血清臨床化学値は生理食塩水の範囲から変化していないことを示す。生理食塩水又はPPMO複合体を指示用量でボーラス静脈内（尾静脈）投与した後、野生型（WT）マウス及びHSALRマウス（8～12週齢）の血清で測定した尿素、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、アルブミン、アルカリホスファターゼ（ALP）、アラニントランスフェラーゼ（ALT）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）のレベルを示す。投与14日後に血清を採取し、解析した。グラフは平均値±SEMでプロットし、１群あたりn=4-8である。統計は一元配置分散分析Dunnettの多重比較検定を用い、P値は対HSALR生理食塩水群の値である（ns（not significant）はP>0.05、*はP<0.05を示す）。 図９は、組織生化学分析により、主要組織におけるPMOの検出が確認されたことを示す。骨格筋で検出されたPMOの用量反応を示した。LLOQは、直線定量下限を示す。n=4-8。グラフは平均値±SEMでプロットした。 図１０は、病原性ミスプライシングのPPMO複合体修正には、骨格筋において不変の持続効果があることを示す。PPMO複合体の単回投与は、DM1マウスモデルにおいて、12週間までミスプライシング分子を修正することができる。NTは無処置（対照は0.9％生理食塩水）を示す。１群あたりn=7-8。グラフは平均値±SEMでプロットした。 図１１は、DM1マウスモデルにおいて、PPMO複合体による病原性ミスプライシングの修正が持続的な効果を有することを示す。PPMO複合体の単回投与は、DM1マウスモデルにおいて、12週間までミスプライシング分子イベントを修正することができる。PPMO複合体の処置は、野生型（WT）マウスのスプライシングレベルに影響を与えない。NTは無処置（対照は0.9％生理食塩水）を示す。1群あたりn=7-8。グラフは平均値±SDでプロットした。 図１２は、複合体は、不死化筋芽細胞において、DM1の特徴である病原性核病巣の数を用量依存的に減少させることを示す。 図１３Aから図１３Eは、PPMO複合体処置とMBNL1の遊離により、下流のミススプライシングが強固に修正されたことを示す。（平均値±SEM、各群n=3-4。）図13Aは、健常細胞、及び非複合体PMO又は複合体PMOで処理したDM1患者細胞におけるMBNL1エクソン5のスプライス含有率レベルを示す。図13Bは、健常細胞、及び非複合体PMO又はPPMO複合体で処理したDM1患者細胞におけるMBNL2エクソン5のスプライス含有率レベルを示す。図13Cは、健常細胞、及び非複合体PMO又はPPMO複合体で処理したDM1患者細胞におけるBIN1エクソン7に対するスプライス含有率レベルを示す。図13Dは、健常細胞、及び非複合体PMO又はPPMOで処理したDM1患者細胞におけるLDB3エクソン11のスプライス含有率レベルを示す。図13Eは、健常細胞、及び非複合体PMO又はPPMO複合体で処理したDM1患者細胞におけるSORBS1エクソン25のスプライス含有率レベルを示す。 図１４A及び図１４Bは、それぞれ、Atp2a1エクソン22の含有レベル及びClcn1エクソン7aの含有レベルを示す。含有レベルは、腓腹筋（図14Aの下部トレース、図14Bの上部トレース）及び大腿四頭筋（図14Aの上部トレース、図14Bの下部トレース）で評価した。グラフは平均値±SEMでプロットした。0週の時点ではn=7、2週と12週の時点ではn=8、24週の時点ではn=5である。この結果は、複合体が、単回投与後少なくとも24週間、ミススプライシングの分子修正を持続したことを示す。
典型的には、本発明は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を有する対象を治療する方法を提供する。上記方法は、少なくとも１ヶ月の時間間隔で複数用量の複合体を含む治療レジメンを実施することを含み、例えば、少なくとも１ヶ月（例えば、１から６ヶ月、２から６ヶ月、３から６ヶ月、３から４ヶ月、４から６ヶ月、５から６ヶ月、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月）、上記複合体は、オリゴヌクレオチドと、上記オリゴヌクレオチドに共有結合又はリンカーを介して連結されたペプチドを含む。上記治療レジメンは、２週間の開始間隔で複合体を３回又は４回投与することを含む治療開始レジメンをさらに含んでもよい。
従って、いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、１から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、２から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、３から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、４から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、５から６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、１から２ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、１から３ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、１から４ヶ月である。いくつかの実施形態において上記時間間隔は、１から５ヶ月である。いくつかの実施形態において上記時間間隔は、２から３ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、２から４ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、２から５ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、３から４ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、３から５ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、４から５ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記時間間隔は、３０日間、４５日間、６０日間、７５日間、９０日間、１０５日間、又は１２０日間である。
いくつかの実施形態において、上記治療レジメンはさらに、１、２、又は３週間の開始間隔で複合体を２、３、４、又は５回投与することを含む治療開始レジメン又は負荷レジメンを投与することを含む。いくつかの実施形態において、この開始又は負荷レジメンの後に、例えば、前段落に挙げたレジメンのいずれか１つから選択できる維持レジメンが続く。
いくつかの実施形態において、上記複合体量は、毎回同じ用量レベルで投与される。
いくつかの実施形態において、用量は、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、55 mg/kg、60 mg/kg、又はこれらの値の任意の組み合わせの選択間の範囲内の量、の間隔あたりの単回用量からなる群から選択される。従って、いくつかの実施形態において、間隔あたりの単回用量は、例えば、5～60 mg/kg、5～50 mg/kg、5～40 mg/kg、5～30 mg/kg、5～20 mg/kg、5～10 mg/kg、10～60 mg/kg、10～50 mg/kg、10～40 mg/kg、10～30 mg/kg、10～20 mg/kg、20～60 mg/kg、20～50 mg/kg、20～40 mg/kg、20～30 mg/kg、30～60 mg/kg、30～50 mg/kg、30～40 mg/kg、40~50 mg/kg、40～60 mg/kg、又は50～60 mg/kgであってもよい。
いくつかの実施形態において、上記投与は、少なくとも0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、又はそれ以上（例えば、患者の生涯にわたって）継続する。
上記ペプチドは、２つのカチオン性ドメインによって挟まれた疎水性ドメインを含み、上記カチオン性ドメインのそれぞれは、RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRR（配列番号３）、RBRRBR（配列番号４）、RRBRBR（配列番号５）、RBRRB（配列番号６）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、HBHBR（配列番号９）、RBRHBHR（配列番号１０）、RBRBBHR（配列番号１１）、RBRRBH（配列番号１２）、HBRRBR（配列番号１３）、HBHBH（配列番号１４）、BHBH（配列番号１５）、BRBSB（配列番号１６）、BRB[Hyp]B（配列番号１７）、R[Hyp]H[Hyp]HB（配列番号１８）、及 びR[Hyp]RR[Hyp]R（配列番号１９）のうち１つを含み、前記疎水性ドメインは、YQFLI（配列番号２０）、FQILY（配列番号２１）、ILFQY（配列番号２２）、FQIY（配列番号２３）、WWW、WWPWW（配列番号２４）、WPWW（配列番号２５）、及びWWPW（配列番号２６）のうち１つを含み、及び、上記オリゴヌクレオチドは、合計１２から４０個の連続する核酸塩基を含み、少なくとも９個の連続する核酸塩基は、ＣＵＧ反復配列に相補的である。
有益なことに、本明細書に記載の方法は、治療の毒物学的影響を低減しながら、本発明の複合体の治療有効量を提供する。さらに、驚くほど長期間持続する効果を提供することで、本発明の方法は、治療に対する患者のコンプライアンス、快適性、及び利便性に関して利点を提供する。従って、本明細書に記載され、特許請求される方法は、DM1の治療のための実質的な進歩を示す。
オリゴヌクレオチド
本明細書で開示される複合体に使用されるオリゴヌクレオチドは、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（DMPK）転写物の3'-非翻訳領域内の伸長CUGリピートに相補的なものであってもよい。理論に束縛されることを望むものではないが、DMPK転写物の3'-非翻訳領域内の伸長CUGリピートにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、DMPK転写物のミススプライシングの発生率を減少させ、それによって筋強直性ジストロフィー1型を寛解すると考えられる。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]n-3'であり、nは5から8の整数である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]5-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]6-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]7-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]8-3'である。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]n-3'であり、nは５から８の整数である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]5-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]6-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]7-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]8-3'である。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]n-3'であり、nは５から８の整数である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]5-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]6-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]7-3'である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは5'-[GCA]8-3'である。
いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるようなホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（PMO）である。
ペプチド
本明細書に記載の複合体に使用されうるペプチドは、WO 2020030927及びWO 2020115494に開示されるものを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複合体に含まれるペプチドは、人工アミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、アミノヘキサン酸残基を含有しない。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、任意の形態のアミノヘキサン酸残基を含有しない。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、6-アミノヘキサン酸残基を含有しない。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、天然アミノ酸残基のみを含有し、従って、天然アミノ酸残基からなる。
いくつかの実施形態において、典型的に細胞透過性ペプチドに使用される6-アミノヘキサン酸のような人工アミノ酸は、天然アミノ酸によって置換される。いくつかの実施形態において、典型的に細胞透過性ペプチドに使用される6-アミノヘキサン酸のような人工アミノ酸は、β‐アラニン、セリン、プロリン、アルギニン、及びヒスチジン又はヒドロキシプロリンから選択されるアミノ酸によって置換される。
いくつかの実施形態において、アミノヘキサン酸は、β‐アラニンによって置換される。いくつかの実施形態において、6-アミノヘキサン酸は、β‐アラニンによって置換される。
いくつかの実施形態において、アミノヘキサン酸は、ヒスチジンによって置換される。いくつかの実施形態において、6-アミノヘキサン酸は、ヒスチジンによって置換される。
いくつかの実施形態において、アミノヘキサン酸は、ヒドロキシプロリンによって置換される。いくつかの実施形態において、6-アミノヘキサン酸は、ヒドロキシプロリンによって置換される。
いくつかの実施形態において、典型的に細胞透過性ペプチドに使用される6-アミノヘキサン酸のような人工アミノ酸は、β‐アラニン、セリン、プロリン、アルギニン、及びヒスチジン又はヒドロキシプロリンの任意の組み合わせ、例えば、β‐アラニン、ヒスチジン、及びヒドロキシプロリンのいずれかの組み合わせによって置換されうる。
いくつかの実施形態において、４０アミノ酸残基以下の全長を有するペプチドが提供され、このペプチドは、各々が少なくとも４アミノ酸残基を含む２個以上のカチオン性ドメイン、及び各々が少なくとも３アミノ酸残基を含む１個以上の疎水性ドメインを含み、ここで少なくとも１個のカチオン性ドメインは、ヒスチジン残基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１個のカチオン性ドメインはヒスチジンリッチである。
いくつかの実施形態において、ヒスチジンリッチが意味するところは、カチオン性ドメインに関連して本明細書において定義される。
カチオン性ドメイン
本発明は、一定の長さを有する少なくとも２個のカチオン性ドメインが存在する特定の構造を有する短鎖細胞透過性ペプチドに関する。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、４個までのカチオン性ドメインを含み、３個までのカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、２個のカチオン性ドメインを含む。
上記で定義したように、上記ペプチドは、それぞれ少なくとも４アミノ酸残基の長さを有するカチオン性ドメインを２個以上含む。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、４から１２アミノ酸残基の間の長さ、例えば、４から７アミノ酸残基の間の長さを有する。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、4、5、6、又は7アミノ酸残基の長さを有する。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、同様の長さであり、例えば、それぞれ各カチオン性ドメインは、同じ長さである。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、カチオン性アミノ酸を含有し、極性及び／又は無極性アミノ酸を含有してもよい。
無極性アミノ酸は、アラニン、β‐アラニン、プロリン、グリシン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニンから選択されてもよい。いくつかの実施形態において、無極性アミノ酸は、電荷を持たない。
極性アミノ酸は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、アルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選択されてもよい。いくつかの実施形態において、選択された極性アミノ酸は負電荷を持たない。
カチオン性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジンから選択されてもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性アミノ酸は生理的pHにおいて正電荷を有する。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、アニオン性又は負に荷電したアミノ酸残基を含まない。いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、β‐アラニン、ヒドロキシプロリン、及び／又はセリン残基を含む。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、β‐アラニン、ヒドロキシプロリン、及び／又はセリン残基からなる。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%のカチオン性アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、カチオン性アミノ酸を過半数含む。いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、少なくとも7.5、少なくとも8.0、少なくとも8.5、少なくとも9.0、少なくとも9.5、少なくとも10.0、少なくとも10.5、少なくとも11.0、少なくとも11.5、少なくとも12.0の等電点（pi）を有する。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、少なくとも10.0の等電点（pi）を有する。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、10.0及び13.0の間の等電点（pi）を有する。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、10.4及び12.5の間の等電点（pi）を有する。
いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインの等電点は、当該技術分野で利用可能な任意の適切な手段により、生理的pHにおいて計算される。いくつかの実施形態において、LukaszKozlowski（Biol.Direct.2016、11:55.DOI:10.1186/s13062-016-0159-9）によって開発されたウェブベースのアルゴリズムであるIPC（www.isoelectric.org）を使用することによって計算される。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、少なくとも１個のカチオン性アミノ酸、例えば、１から５個のカチオン性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、少なくとも２個のカチオン性アミノ酸、例えば、２から５個のカチオン性アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、アルギニンリッチ及び／又はヒスチジンリッチである。いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、ヒスチジン及びアルギニンの両方を含有してもよい。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、アルギニン及び／又はヒスチジン残基を過半数含む。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも60%、少なくとも65%、又は少なくとも70%のアルギニン及び／又はヒスチジン残基を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも60%、少なくとも65%、又は少なくとも70%アルギニン残基を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも60%、少なくとも65%、又は少なくとも70%ヒスチジン残基を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、合計１から５個のヒスチジン及び１から５個のアルギニン残基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、１から５個のアルギニン残基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、１から５個のヒスチジン残基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、合計２から５個のヒスチジン及び３から５個のアルギニン残基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性ドメイン３から５個のアルギニン残基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性ドメイン２から５個のヒスチジン残基を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメイン１つ以上のβ‐アラニン残基を含む。いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、合計２から５個のβ‐アラニン残基、例えば、合計２又は３個のβ‐アラニン残基を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、１個以上のヒドロキシプロリン残基又はセリン残基を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、１から２個のヒドロキシプロリン残基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、１から２個のセリン残基を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、所与のカチオン性ドメインのカチオン性アミノ酸の全てがヒスチジンであってもよく、あるいは、例えば、所与のカチオン性ドメインのカチオン性アミノ酸の全てがアルギニンであってもよい。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、少なくとも１個のヒスチジンリッチカチオン性ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、少なくとも１個のアルギニンリッチカチオン性ドメインを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、少なくとも１個のアルギニンリッチカチオン性ドメインを含んでもよく、少なくとも１個のヒスチジンリッチなカチオン性ドメインを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、２個のアルギニンリッチなカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、２個のヒスチジンリッチなカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、２個のアルギニン及びヒスチジンリッチなカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、１個のアルギニンリッチなカチオン性ドメイン及び１個のヒスチジンリッチなカチオン性ドメインを含む。いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、3個以下の連続するアルギニン残基を、例えば、2個以下の連続するアルギニン残基を含む。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、連続するヒスチジン残基を含まない。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、及び／又はβ‐アラニン残基を含む。いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、及び／又はβ‐アラニン残基を過半数含む。いくつかの実施形態において、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は100%の各カチオン性ドメイン中のアミノ酸残基は、アルギニン、ヒスチジン、及び／又はβ‐アラニン残基。いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、アルギニン、ヒスチジン、及び／又はβ‐アラニン残基からなる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、アルギニン及びβ‐アラニン残基を含む第１カチオン性ドメイン、及び、アルギニン及びβ‐アラニン残基を含む第２カチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、アルギニン及びβ-アラニン残基を含む第1のカチオン性ドメイン、及びヒスチジン、β-アラニン、及び任意にアルギニン残基を含む第2のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、アルギニン及びβ-アラニン残基を含む第1のカチオン性ドメイン、及びヒスチジン及びβ-アラニン残基を含む第２のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、アルギニン残基及びβ-アラニン残基からなる第1のカチオン性ドメインと、アルギニン残基及びβ-アラニン残基からなる第２のカチオン性ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、アルギニン及びβ-アラニン残基からなる第１のカチオン性ドメイン、ならびにアルギニン、ヒスチジン及びβ-アラニン残基からなる第２のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、少なくとも２個のカチオン性ドメインを含み、例えば、これらのカチオン性ドメインは、上記ペプチドのアームを形成する。いくつかの実施形態において、上記カチオン性ドメインは、上記ペプチドのN及びC末端に位置する。従って、いくつかの実施形態において、上記カチオン性ドメインは、カチオン性アームドメインとして知られうる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、２個のカチオン性ドメインを含み、１個は、上記ペプチドのN末端に位置し、１個は、上記ペプチドのC末端に位置する。いくつかの実施形態において、上記ペプチドのいずれかの末端に位置する。いくつかの実施形態において、末端修飾、リンカー及び／又はオリゴヌクレオチドなどの他の基を除いて、さらなるアミノ酸又はドメインは、上記ペプチドのN末端及びC末端には存在しない。疑義を避けるため、このような他の基は、本明細書に記載され請求される「ペプチド」に加えて存在しても良い。従って、いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、上記ペプチドの末端を形成する。いくつかの実施形態において、これは、本明細書に記載されるようなさらなるリンカー基の存在を排除するものではない。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、４個までのカチオン性ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、２個のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、両方ともアルギニンリッチである２個のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、アルギニンリッチである１個のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、両方ともアルギニンリッチかつヒスチジンリッチである２個のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、アルギニンリッチである１個のカチオン性ドメインとヒスチジンリッチである１個のカチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記カチオン性ドメインは、R、H、B、RR、HH、BB、RH、HR、RB、BR、HB、BH、RBR、RBB、BRR、BBR、BRB、RBH、RHB、HRB、BRH、HRR、RRH、HRH、HBB、BBH、RHR、BHB、HBH、又はそれらの任意の組み合わせ、から選択されるアミノ酸単位を含む。
いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインはまた、セリン、プロリン、及び/又はヒドロキシプロリン残基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、上記カチオン性ドメインは、RP、PR、RPR、RRP、PRR、PRP、Hyp、R[Hyp]R、RR[Hyp]、[Hyp]RR、[Hyp]R[Hyp]、[Hyp][Hyp]R、R[Hyp][Hyp]、SB、BS、又はそれらの任意の組み合わせ、又は上記のアミノ酸単位との任意の組み合わせ、から選択されるアミノ酸単位をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、以下の配列のいずれか１つを含む。RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRR（配列番号３）、RBRRBR（配列番号４）、RRBRBR（配列番号５）、RBRRB（配列番号６）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、HBHBR（配列番号９）、RBRHBHR（配列番号１０）、RBRBBHR（配列番号１１）、RBRRBH（配列番号１２）、HBRRBR（配列番号１３）、HBHBH（配列番号１４）、BHBH（配列番号１５）、BRBSB（配列番号１６）、BRB[Hyp]B（配列番号１７）、R[Hyp]H[Hyp]HB（配列番号１８）、R[Hyp]RR[Hyp]R（配列番号１９）、又はそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態において、各カチオン性ドメインは、以下の配列のいずれか１つからなる。RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRR（配列番号３）、RBRRBR（配列番号４）、RRBRBR（配列番号５）、RBRRB（配列番号６）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、HBHBR（配列番号９）、RBRHBHR（配列番号１０）、RBRBBHR（配列番号１１）、RBRRBH（配列番号１２）、HBRRBR（配列番号１３）、HBHBH（配列番号１４）、BHBH（配列番号１５）、BRBSB（配列番号１６）、BRB[Hyp]B、R[Hyp]H[Hyp]HB、R[Hyp]RR[Hyp]R（配列番号１９）、又はそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態において、それぞれのカチオン性ドメインは、以下の配列のうちの１つからなる。RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRRBR（配列番号４）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、又はHBHBR（配列番号９）。
いくつかの実施形態において、上記ペプチド中の各カチオン性ドメインは、同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、上記ペプチド中の各カチオン性ドメインは異なる。
疎水性ドメイン
本発明は、一定の長さを有する少なくとも１個の疎水性ドメインが存在する特定の構造を有する短鎖細胞透過性ペプチドに関する。
本明細書において「疎水性」とは、水をはじく能力を有する、又は水と混合しないアミノ酸又はドメインを示す。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、３個までの疎水性ドメインを含み、２個までの疎水性ドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、１個の疎水性ドメインを含む。
上記で定義したように、上記ペプチドは、それぞれが少なくとも３アミノ酸残基の長さを有する１個以上の疎水性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、３から６アミノ酸残基の長さを有する。いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、５アミノ酸残基の長さを有する。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、無極性、極性、及び疎水性アミノ酸残基であってもよい。
疎水性アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トリプトファンから選択されてもよい。
無極性アミノ酸残基は、プロリン、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、及びメチオニンから選択されてもよい。
極性アミノ酸残基は、セリン、アスパラギン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジンアルギニン、スレオニン、チロシン、グルタミンから選択されてもよい。
いくつかの実施形態において、上記疎水性ドメインは、親水性アミノ酸残基を含まない。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、疎水性アミノ酸残基を過半数含む。いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は100%の疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは疎水性アミノ酸残基からなる。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、少なくとも0.3、少なくとも0.4、少なくとも0.5、少なくとも0.6、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.8、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、又は少なくとも1.3の疎水度を有する。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、少なくとも0.3、少なくとも0.35、少なくとも0.4、又は少なくとも0.45の疎水度を有する。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、少なくとも1.2、少なくとも1.25、少なくとも1.3、又は少なくとも1.35の疎水度を有する。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、0.4及び1.4の間の疎水度を有する。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、0.45及び0.48の間の疎水度を有する。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、1.27及び1.39の間の疎水度を有する。
いくつかの実施形態において、疎水度は、White及びWimley: W.C. Wimley及びS.H. White、「Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces」Nature Struct Biol 3:842（1996）に記載のように測定される。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、少なくとも３又は少なくとも４個の疎水性アミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、プロリン、及び／又はグルタミン残基を含む。いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、プロリン、及び／又はグルタミン残基からなる。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン及び／又はグルタミン残基からなる。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、トリプトファン及び／又はプロリン残基からなる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、１個の疎水性ドメインを含む。いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、上記ペプチドの中心に位置する。従って、いくつかの実施形態において、上記疎水性ドメインは、コア疎水性ドメインとして知られうる。いくつかの実施形態において、各疎水性コアドメインは、アームドメインによって両側に挟まれる。いくつかの実施形態において、上記アームドメインは、１個以上のカチオン性ドメイン及び１個以上のさらなる疎水性ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態において、各アームドメインは、カチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、疎水性コアドメインを挟む２個のアームドメインを含み、ここで、各アームドメインは、カチオン性ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、疎水性コアドメインを挟む２個のカチオン性アームドメインを含む。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、以下の配列のうちの１つを含む。YQFLI（配列番号２０）、FQILY（配列番号２１）、ILFQY（配列番号２２）、FQIY（配列番号２３）、WWW、WWPWW（配列番号２４）、WPWW（配列番号２５）、WWPW（配列番号２６）、又はそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、以下の配列のうちの１つからなる。YQFLI（配列番号２０）、FQILY（配列番号２１）、ILFQY（配列番号２２）、FQIY（配列番号２３）、WWW、WWPWW（配列番号２４）、WPWW（配列番号２５）、WWPW（配列番号２６）、又はそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、以下の配列のうちの１つからなる。FQILY（配列番号２１）、YQFLI（配列番号２０）、又はILFQY（配列番号２２）。
いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、FQILY（配列番号２１）からなる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチド中の各疎水性ドメインは、同一の配列又は異なる配列。
本発明は、病状の治療において治療用カーゴ分子を輸送する際に使用するための短鎖細胞透過性ペプチドに関する。
上記ペプチドは、連続した単一分子である配列を有し、従って、上記ペプチドのドメインは連続する。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、N末端及びC末端との間に線状に配置された、いくつかのドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記ドメインは、上記のカチオン性ドメイン及び疎水性ドメインから選択される。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、上記ドメインが上記で定義された通りであるカチオン性ドメイン及び疎水性ドメインからなる。
各ドメインは、上記の関連するセクションに記載されているように、共通の配列特性を有するが、各ドメインの正確な配列は変化し、変更することが可能である。従って、各ドメインには様々な配列が可能である。各可能なドメイン配列の組み合わせにより、様々なペプチド構造が得られ、それぞれが本発明の一部を形成する。ペプチド構造の特徴を以下に述べる。
いくつかの実施形態において、疎水性ドメインは、任意の２つのカチオン性ドメインを分離する。いくつかの実施形態において、各疎水性ドメインは、その両側にカチオン性ドメインに挟まれる。
いくつかの実施形態において、カチオン性ドメインは、他のカチオン性ドメインと連続しない。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、以下の配置で、２個のカチオン性ドメインによって挟まれた１個の疎水性ドメインを含む。
[カチオン性ドメイン]-[疎水性ドメイン]-[カチオン性ドメイン]
いくつかの実施形態において、疎水性ドメインは、コアドメインとして知られてもよく、カチオン性ドメインの各々は、アームドメインとして知られてもよい。いくつかの実施形態において、疎水性アームドメインは、その両側でカチオン性コアドメインを挟む。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、２個のカチオン性ドメイン及び１個の疎水性ドメインからなる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、２個のカチオン性アームドメインに挟まれた１個の疎水性コアドメインからなる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドはYQFLI（配列番号２０）、FQILY（配列番号２１）、ILFQY（配列番号２２）、FQIY（配列番号２３）、WWW、WWPWW（配列番号24）、WPWW（配列番号２５）、及びWWPW（配列番号２６）、から選択された配列を含む１個の疎水性コアドメインからなり、RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRR（配列番号３）、RBRRBR（配列番号４）、RRBRBR（配列番号５）、RBRRB（配列番号６）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、HBHBR（配列番号９）、RBRHBHR（配列番号１０）、RBRBBHR（配列番号１１）、RBRRBH（配列番号１２）、HBRRBR（配列番号１３）、HBHBH（配列番号１４）、BHBH（配列番号１５）、BRBSB（配列番号１６）、BRB[Hyp]B（配列番号１７）、R[Hyp]H[Hyp]HB（配列番号１８）、及びR[Hyp]RR[Hyp]R（配列番号１９）から選択される配列をそれぞれ含む２個のカチオン性アームドメインによって挟まれる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、FQILY（配列番号２１）、YQFLI（配列番号２０）、及びILFQY（配列番号２２）から選択される配列を含む１個の疎水性コアドメインからなり、RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRRBR（配列番号４）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、及びHBHBR（配列番号９）から選択される２個のカチオン性アームドメインによって挟まれる。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは配列FQILY（配列番号２１）を含む１つの疎水性コアドメインからなり、RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRRBR（配列番号４）、BRBR（配列番号７）、及びRBHBH（配列番号８）から選択される２個のカチオン性アームドメインによって挟まれる。
かかる実施形態のいずれにおいても、リンカー、末端修飾、及び／又はオリゴヌクレオチドなどのさらなる基が存在してもよい。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、N末端修飾される。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、N-アセチル化、N-メチル化、N-トリフルオロアセチル化、N-トリフルオロメチルスルホニル化、又はN-メチルスルホニル化される。いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、N-アセチル化される。
任意で、上記ペプチドのN末端は修飾されていなくてもよい。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、N-アセチル化されている。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、C末端修飾である。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、カルボキシ基、チオ酸基、アミノオキシ基、ヒドラジノ基、チオエステル基、アジド基、ひずみアルキン、ひずみアルケン、アルデヒド基、チオール基、又はハロアセチル基から選択されるＣ末端修飾を含む。
有益なことに、上記Ｃ末端修飾は、上記ペプチドを上記オリゴヌクレオチドに結合するための手段を提供する。
従って、C末端修飾はリンカーを含んでいてもよく、その逆でもよい。いくつかの実施形態において、C末端修飾は、リンカー又はその逆から構成されうる。適切なリンカーは、本明細書の他の箇所に記載されている。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、C末端カルボキシル基を含む。
いくつかの実施形態では、C末端カルボキシル基はグリシン残基又はβ-アラニン残基によって提供される。
いくつかの実施形態において、C末端カルボキシル基は、β-アラニン残基によって提供される。いくつかの実施形態において、C末端β-アラニン残基は、リンカーである。いくつかの実施形態において、C末端グルタミン酸（遊離-COOHが-CONH2で置換されている）は、リンカーである。いくつかの実施形態において、複合体は、以下の構造である。
いくつかの実施形態において、従って、各カチオン性ドメインは、N末端又はC末端の修飾をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、C末端のカチオン性ドメインは、C末端修飾を含む。いくつかの実施形態において、N末端のカチオン性ドメインは、N末端の修飾を含む。いくつかの実施形態において、C末端のカチオン性ドメインは、リンカー基を含む。いくつかの実施形態において、C末端のカチオン性ドメインは、C末端のβ-アラニンを含む。いくつかの実施形態において、N末端のカチオンドメインは、N-アセチル化されている。
本発明のペプチドは、全長４０アミノ酸残基以下と定義される。従って、このペプチドはオリゴペプチドとみなすことができる。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、３～３０アミノ酸残基、例えば、５～２５アミノ酸残基、１０～２５アミノ酸残基、１３～２３アミノ酸残基、又は１５～２０アミノ酸残基の全長を有する。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、又は少なくとも１７アミノ酸残基の全長を有する。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、細胞を透過する事ができる。従って、上記ペプチドは、細胞透過性ペプチドとみなすことができる。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、オリゴヌクレオチドに付着するためのものである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、オリゴヌクレオチドを標的細胞に輸送するためのものである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達するためのものである。従って、このペプチドはキャリアペプチドとみなすことができる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、細胞及び組織内へ、例えば、細胞の核内へ透過することが出来る。いくつかの実施形態において、筋組織内へ透過することができる。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、以下の配列のいずれか１つから選択されてもよい。
RBRRBRRFQILYRBRBR（配列番号２７）
RBRRBRRFQILYRBRR（配列番号２８）
RBRRBRFQILYRRBRBR（配列番号２９）
RBRBRFQILYRBRRBRR（配列番号３０）
RBRRBRRYQFLIRBRBR（配列番号３１）
RBRRBRRILFQYRBRBR（配列番号３２）
RBRRBRFQILYRBRBR（配列番号３３）
RBRRBFQILYRBRRBR（配列番号３４）
RBRRBRFQILYBRBR（配列番号３５）
RBRRBFQILYRBRBR（配列番号３６）
RBRRBRRFQILYRBHBH（配列番号３７）
RBRRBRRFQILYHBHBR（配列番号３８）
RBRRBRRFQILYHBRBH（配列番号３９）
RBRRBRRYQFLIRBHBH（配列番号４０）
RBRRBRRILFQYRBHBH（配列番号４１）
RBRHBHRFQILYRBRBR（配列番号４２）
RBRBBHRFQILYRBHBH（配列番号４３）
RBRRBRFQILYRBHBH（配列番号４４）
RBRRBRFQILYHBHBH（配列番号４５）
RBRRBHFQILYRBHBH（配列番号４６）
HBRRBRFQILYRBHBH（配列番号４７）
RBRRBFQILYRBHBH（配列番号４８）
RBRRBRFQILYBHBH（配列番号４９）
RBRRBRYQFLIHBHBH（配列番号５０）
RBRRBRILFQYHBHBH（配列番号５１）
RBRRBRRFQILYHBHBH（配列番号５２）
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、以下の追加配列のいずれか１つから選択されてもよい。
RBRRBRFQILYBRBS（配列番号５３）
RBRRBRFQILYBRB[Hyp]（配列番号５４）
RBRRBRFQILYBR[Hyp]R（配列番号５５）
RRBRRBRFQILYBRBR（配列番号５６）
BRRBRRFQILYBRBR（配列番号５７）
RBRRBRWWWBRBR（配列番号５８）
RBRRBRWWPWWBRBR（配列番号５９）
RBRRBRWPWWBRBR（配列番号６０）
RBRRBRWWPWBRBR（配列番号６１）
RBRRBRRWWWRBRBR（配列番号６２）
RBRRBRRWWPWWRBRBR（配列番号６３）
RBRRBRRWPWWRBRBR（配列番号６４）
RBRRBRRWWPWRBRBR（配列番号６５）
RBRRBRRFQILYBRBR（配列番号６６）
RBRRBRRFQILYRBR（配列番号６７）
BRBRBWWPWWRBRRBR（配列番号６８）
RBRRBRRFQILYBHBH（配列番号６９）
RBRRBRRFQIYRBHBH（配列番号７０）
RBRRBRFQILYBRBH（配列番号７１）
RBRRBRFQILYR[Hyp]H[Hyp]H（配列番号７２）
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYRBHBH（配列番号７３）
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYR[Hyp]H[Hyp]H（配列番号７４）
RBRRBRWWWRBHBH（配列番号７５）
RBRRBRWWPRBHBH（配列番号７６）
RBRRBRPWWRBHBH（配列番号７７）
RBRRBRWWPWWRBHBH（配列番号７８）
RBRRBRWWPWRBHBH（配列番号７９）
RBRRBRWPWWRBHBH（配列番号８０）
RBRRBRRWWWRBHBH（配列番号８１）
RBRRBRRWWPWWRBHBH（配列番号８２）
RBRRBRRWPWWRBHBH（配列番号８３）
RBRRBRRWWPWRBHBH（配列番号８４）
RRBRRBRFQILYRBHBH（配列番号８５）
BRRBRRFQILYRBHBH（配列番号８６）
RRBRRBRFQILYBHBH（配列番号８７）
BRRBRRFQILYBHBH（配列番号８８）
RBRRBHRFQILYRBHBH（配列番号８９）
RBRRBRFQILY[Hyp]R[Hyp]R（配列番号１０１）
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILYBRBR（配列番号１０２）
R[Hyp]RR[Hyp]RFQILY[Hyp]R[Hyp]R（配列番号１０３）
RBRRBRWWWBRBR（配列番号１０４）
RBRRBRWWPWWBRBR（配列番号１０５）
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、以下の配列のうちの１つから選択されてもよい。
RBRRBRRFQILYRBRBR（配列番号２７）
RBRRBRRYQFLIRBRBR（配列番号３１）
RBRRBRRILFQYRBRBR（配列番号３２）
RBRRBRFQILYBRBR（配列番号３５）
RBRRBRRFQILYRBHBH（配列番号３７）
RBRRBRRFQILYHBHBR（配列番号３８）
RBRRBRFQILYRBHBH（配列番号４４）
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、以下の配列からなる。RBRRBRFQILYBRBR（配列番号３５）。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、以下の配列からなる。RBRRBRRFQILYRBHBH（配列番号３７）。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、以下の配列からなる。RBRRBRFQILYRBHBH（配列番号４４）。
複合体
いくつかの実施形態において、上記複合体は、以下の配列のうちの１つから選択されるペプチドを含む。RBRRBRFQILYBRBR（配列番号３５）、RBRRBRRFQILYRBHBH（配列番号３７）及びRBRRBRFQILYRBHBH（配列番号４４）。
いくつかの実施形態では、いずれの場合でも、ペプチドは、上記のようなN末端修飾をさらに含んでもよい。
好ましくは、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（PMO）である。あるいは、オリゴヌクレオチドは、修飾PMO、又はペプチド核酸（PNA）、γPNAのような化学修飾PNA（Bahal、Nat.Comm.2016）、オリゴヌクレオチドホスホルアミデート（ここで、リン酸の非架橋酸素は、WO2016028187A1に記載されているようなアミン又はアルキルアミンで置換されている）、又は他の部分的もしくは完全に電荷中和されたオリゴヌクレオチドなどである。
適切なリンカーとしては、例えば、ジスルフィド、チオエーテル又はチオール-マレイミド結合の形成を可能にするC末端システイン残基、オキシムを形成するためのC末端アルデヒド、クリック反応又はペプチド上の塩基性アミノ酸とのモルホリノ結合の形成、又はカルボキサミド結合を形成するためにアミノ基と共有結合したペプチド上のカルボン酸部分が挙げられる。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、１～５アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、当該分野で公知の任意のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、以下の配列のいずれかから選択される。G、BC、XC、C、GGC、BBC、BXC、XBC、X、XX、B、BB、BX及びXB。いくつかの実施形態において、Ｘは6-アミノヘキサン酸である。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、Gluリンカーである。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、例えば、PEGなどのポリマーでも良い。
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、β‐アラニンである。
いくつかの実施形態において、上記ペプチドは、カルボキサミド結合を介して上記オリゴヌクレオチドに結合される。
上記複合体のリンカーは、ペプチドを結合させるオリゴヌクレオチドの一部を形成してもよい。あるいは、上記オリゴヌクレオチドの結合は、上記ペプチドのC末端に直接連結されてもよい。いくつかの実施形態において、そのような実施形態において、リンカーは必要ない。
あるいは、上記ペプチドは、上記オリゴヌクレオチに化学的に結合されうる。化学結合は、例えば、ジスルフィド、アルケニル、アルキニル、アリール、エーテル、チオエーテル、トリアゾール、アミド、カルボキサミド、尿素、チオ尿素、セミカルバジド、カルバジド、ヒドラジン、オキシム、ホスフェート、ホスホルアミデート、チオホスフェート、ボランホスフェート、イミノホスフェート、など。又はチオールマレイミド結合を介してもよい。
任意で、ペプチドにジスルフィド結合を形成させるためにペプチドのN末端にシステインを付加してもよく、上記ペプチドにチオエーテルを結合させるためにN末端にブロモアセチル化を施してもよい。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、細胞及び組織内へ、例えば、細胞の核内へ、例えば、筋組織内へ透過することができる。
いくつかの実施形態において、上記複合体のオリゴヌクレオチド成分は、PMOである。
いくつかの実施形態において、上記複合体のオリゴヌクレオチド成分は、上記の「オリゴヌクレオチド」の項又は本明細書の他の箇所に記載されているような、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドである。
リンカー
上記に加えて、本明細書に記載の複合体は、本明細書に記載のペプチドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに共有結合で連結するリンカーを含んでもよい。本発明において有用なリンカーは、WO2020／115494に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
上記リンカーは、独立して下記式（Ｉ）で示されるものであってよい。
T1-(CR1R2)n-T2 （Ｉ）
（式中、T1は、上記ペプチドに結合するための２価の基であり、-NH-及びカルボニルからなる群から選択され、
T2は、オリゴヌクレオチドに結合するための２価の基であり、-NH-及びカルボニルからなる群から選択され、
ｎは、１、２又は３であり、
各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
ここで、
Y1は、存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して水素、OH、又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、又は-N(RA3)SO2-であり、各ＲA3は、独立して水素及びメチルから選択され、及び
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールであり、
ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、及び（１－４Ｃ）アルコキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RA4及びRA5はそれぞれ独立して水素及び（１－４Ｃ）アルキルからなる群より選択され、及び
各R2は、独立して-Y2-X2-Z2であり、ここで、
Y2は、存在しないか、式-[CRB1RB2]m-で示される基であり、ｍは、１、２、３又は４、から選択される整数であり、RB1及びRB2はそれぞれ独立して水素、OH又は（１－２Ｃ）アルキルから選択され、
X2は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S--SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり、それぞれRB3は独立して水素又はメチルから選択され、及び
Z2は、水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル又はヘテロアリールから選択され、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル又はヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、及び（１－４Ｃ）アルコキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RB4及びRB5は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、ただし、ｎ＝１かつ、T1及びT2は互いに異なるとき、R1及びR2は、両方ともHではなく、ｎ=１かつ、T1及びT2は互いに異なり、R1及びR2の一方はHであるとき、R1及びR2の他方はメチルではなく、又はｎ＝２かつ、R1及びR2の各存在はHであるときT1及びT2は両方とも-C(O)-、又は両方とも-NH-である。）
いくつかの実施形態において、上記リンカーは、以下の構造である。
医薬組成物
本発明の複合体、又はその薬学的に許容される塩は、医薬組成物に製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、上記医薬組成物は、本発明の複合体又はその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤、アジュバント又は担体をさらに含んでもよい。
適切な薬学的に許容される希釈剤、アジュバント又は担体は、当該技術分野でよく知られている。
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の疾患、障害、及び状態を緩和、軽減、予防、及び治療するための、追加の公知の治療剤、薬剤、プロドラッグへの化合物の改変物などを、医療用途の下でさらに含んでもよいことが理解されるべきである。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、医薬品として使用するためのものであり、例えば、複合体について本明細書に記載したのと同じ方法で医薬品として使用するためのものである。複合体を使用する医療に関連して本明細書に記載される全ての特徴は、医薬組成物に適用される。
従って、本発明のさらなる態様において、医薬品として使用するための第４の態様による医薬組成物が提供される。さらなる態様において、本明細書に開示される医薬組成物の有効量を投与することを含む、疾患状態の対象を治療する方法が提供される。
医学的用途
本発明のペプチドを含む複合体は、本明細書に記載の投与レジメンを用いて疾患の治療用の医薬品として使用することができる。
医薬品は、上記で定義したような医薬組成物の形態であってもよい。
疾患状態の治療を必要とする患者又は対象の治療方法も提供され、上記方法は、治療有効量の複合体を患者又は対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、医学的治療は、オリゴヌクレオチドの細胞内、例えば細胞の核内への送達を必要とする。
治療すべき疾患には、オリゴヌクレオチドによる細胞膜及び／又は核膜への浸透が改善されることにより、治療効果が改善される可能性のある、あらゆる疾患が含まれうる。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、神経筋系の疾患の治療に使用される。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、スプライシング不全によって引き起こされる疾患の治療における使用のためのものである。そのような実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、スプライシング不全を予防又は修正すること、及び／又は正しくスプライシングされたmRNA分子の産生を増加させることができるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、DM1の治療に使用するための、第２の態様に従う複合体が提供される。
いくつかの実施形態において、そのような実施形態において、上記複合体のオリゴヌクレオチドは、DMPK遺伝子のトリヌクレオチドリピート伸長によって引き起こされるミススプライシング及び／又は筋強直症を低減するように作動可能である。いくつかの実施形態において、上記複合体のオリゴヌクレオチドは、スプライシング及び／又は筋強直症を正常化するように作動可能である。
いくつかの実施形態において、上記複合体のオリゴヌクレオチドは、病的なDMPK遺伝子リピート伸長の結果として生じるスプライシング不全及び筋強直症を逆転させるように作動可能である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、DM1に関連するミスプライシング不全を10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、又は70％減少させる。いくつかの実施形態において、上記複合体は、DM1関連のミスプライシング不全を最大50％減少させる。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、病的なDMPK遺伝子のリピート伸長に起因するスプライシング不全及び筋強直症を最大50％逆転させる。
いくつかの実施形態において、上記複合体のオリゴヌクレオチドは、病的なDMPK遺伝子リピート伸長の結果生じるマルチスプライシング不全及び筋強直症の1つ以上の逆転を引き起こすことによって、そのように作動可能である。
いくつかの実施形態において、上記複合体のオリゴヌクレオチドは、ミスプライシング転写物の1つ以上のエクソンの10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、又は85％のスキッピングを引き起こす。いくつかの実施形態において、上記複合体のオリゴヌクレオチドは、病的なDMPK遺伝子リピート伸長に起因するマルチスプライシング不全及び筋強直症の1つ以上を最大50％逆転させる。
いくつかの実施形態において、上述の治療される患者又は対象は、いかなる動物又はヒトであってもよい。いくつかの実施形態において、患者又は対象は、ヒトではない哺乳動物であってもよい。いくつかの実施形態において、患者又は対象は、男性（オス）又は女性（メス）であってもよい。
いくつかの実施形態において、上述の治療される患者又は対象は、任意の年齢でありうる。いくつかの実施形態では、治療される患者又は対象は、0から70歳、0から60歳、0から50歳、0から40歳、いくつかの実施形態では、0から30歳、いくつかの実施形態では、0から25歳、いくつかの実施形態では、0から20歳の間の年齢である。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、対象に、全身投与、例えば、髄内、髄腔内、脳室内、硝子体内、経腸、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下経口又は経鼻経路によって投与するためのものである。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、対象に静脈内投与するためのものである。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、対象に静脈注射によって投与するためのものである。
いくつかの実施形態において、上記複合体は、対象に点滴静注によって投与するためのものである。
有益なことに、本発明の上記複合体の投与量は、上記オリゴヌクレオチド単独から何らかの効果を見るために必要な投与量よりも低く、例えば、1桁以上低くてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明の上記複合体の投与後、毒性の1つ以上のマーカーは、現在利用可能なペプチド担体を使用する先行する複合体と比較して有意に低減する。
適切な毒性マーカーは、腎毒性のマーカーであってもよい。
適切な毒性マーカーとしては、KIM-1、NGAL、BUN、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、アラニントランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼなどがある。
いくつかの実施形態において、KIM-1、NGAL、及びBUNのうちの少なくとも1つのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を用いた先行する複合体と比較して、本発明の複合体の投与後に低減する。
いくつかの実施形態において、KIM-1、NGAL、及びBUNの各々のレベルは、現在利用可能なペプチド担体を用いた先行する複合体と比較して、本発明の複合体の投与後に低減する。
いくつかの実施形態では、現在利用可能なペプチド担体を用いた先行複合体と比較して、各マーカーのレベルが有意に低減する。
いくつかの実施形態において、各マーカーのレベルは、現在利用可能なペプチド担体を用いた先行する複合体と比較して、本発明の複合体の投与後に最大5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％低減する。
いくつかの実施形態において、投与される上記複数用量中の各用量は、5～60 mg/kgの上記複合体を含む。
いくつかの実施形態において、投与される上記複数用量中の各用量は、40 mg/kgから60 mg/kg、30 mg/kg から50 mg/kg、30 mg/kg から40 mg/kg、40 mg/kg から50 mg/kg、50 mg/kg から60 mg/kg、35 mg/kg から45 mg/kg、45 mg/kg から55 mg/kg、35 mg/kg から55 mg/kg、30 mg/kg から45 mg/kg、35 mg/kg から50 mg/kg、40 mg/kg から55 mg/kg、45 mg/kg から60 mg/kg、1 mg/kg から30 mg/kg、1 mg/kg から20 mg/kg、5 mg/kg から25 mg/kg、10 mg/kg から30 mg/kg、1 mg/kg から15 mg/kg、5 mg/kg から20 mg/kg、10 mg/kg から25 mg/kg、15 mg/kg から30 mg/kg、1 mg/kg から10 mg/kg、5 mg/kg から15 mg/kg、10 mg/kg から20 mg/kg、15 mg/kg から25 mg/kg、20 mg/kg から30 mg/kg、1 mg/kg から25 mg/kg、4 mg/kg から20 mg/kg、6 mg/kg から15 mg/kg、又は8 mg/kg から10 mg/kg の上記複合体、の用量を含む。
いくつかの実施形態において、投与される上記複数用量中の各用量は、1 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、8 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、又は60 mg/kg の上記複合体、の用量を含む。
使用されるレジメンは、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるようなものでありうる（例えば、詳細な説明の冒頭を参照のこと）。従って、いくつかの実施形態において、上記治療レジメンは、少なくとも１ヶ月、例えば約１から６ヶ月、２から６ヶ月、３から６ヶ月、４から６ヶ月、又は５から６ヶ月の時間間隔で間隔を置いた本明細書に記載の複数用量の複合体を含むか、又は上記間隔は約１、２、３、４、５、又は６ヶ月である。いくつかの実施形態において、上記方法は、約２週間の開始間隔で本明細書に記載の複合体を３回又は４回投与することを含む治療開始レジメンをさらに含む。指示された月数について「約」として記載される間隔又は期間は、正確な指示から、例えば、１、２、３、４、５、６、又は７日間変動しうることを理解されたい。同様に、指示された週数について「約」と記述された間隔又は期間は、例えば１、２、又は３日間変動しうることを理解されたい。
ペプチドの調製
本発明のペプチドは、任意の標準的なタンパク質合成法、例えば化学合成、半化学合成、又は発現系の使用により製造されてもよい。従って、本発明はまた、上記ペプチドをコードするDNAを含むか又はそれからなるヌクレオチド配列、発現系、例えば、発現及び発現の制御に必要な配列を伴う配列からなるベクター、ならびに発現系によって形質転換された宿主細胞及び宿主生物に関する。
従って、本発明によるペプチドをコードする核酸も提供される。
いくつかの実施形態において、上記核酸は、単離された形態又は精製された形態で提供されてもよい。
本発明によるペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターもまた提供される。
いくつかの実施形態において、上記ベクターは、プラスミドである。
いくつかの実施形態において、上記ベクターは、本発明によるペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された調節配列、例えば、プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、上記発現ベクターは、適切な細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、又は真菌細胞にトランスフェクトされた場合に、上記ペプチドを発現することができる。
本発明の上記発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。
発現ベクターは、本発明の上記核酸が挿入されうる宿主細胞に応じて選択されてもよい。宿主細胞のこのような形質転換には、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、USA、2001に教示されているような従来の技術を用いる。適切なベクターの選択は、当該分野に詳しい者の技能の範囲内である。適切なベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルスなどがある。
産生された上記ペプチドは、沈殿又はアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離など、任意の適切な方法によって宿主細胞から単離精製することができる。
適切なベクター、宿主、組換え技術は当該技術分野でよく知られている。
以下の実施例は、本発明を説明するためのものである。上記発明を何ら限定するものではない。
本明細書に記載した実施例で検討される複合体は、以下の構造である。
ここで5'基は、
上記複合体中のヌクレオシド間結合は、P(=O)(NMe2)O-である。この複合体は、本明細書に記載の方法のいずれか、例えば、特許請求の範囲に記載の方法で使用することができる。
実施例１．
筋強直性ジストロフィー1型モデルマウスHSALRマウスにおけるPPMO単回静脈内投与後の骨格筋の生理的及び分子的表現型の除去
PPMO複合体のin vivo投与を試験した（図１参照）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DMPK遺伝子に見られる有害なトリヌクレオチドリピート伸長を標的とすることにより、DM1治療に特異的に使用された。HSALRマウスは8から11週齢で、PPMO複合体を10 mg/kg及び30 mg/kgの用量範囲で単回尾静脈内投与して治療した。生理食塩水はHSALRマウスと対照の野生型（WT）FVBマウスの両方で、対照目的で使用した。麻酔条件下で、投与2週間後に骨格筋の筋強直を測定し、その後血清と組織を採取した。
筋生理学に対するPPMO複合体の影響を比較するために、筋強直測定は生理食塩水で治療したWTマウスとHSALRマウス、及びPPMO複合体で治療したHSALRマウスで評価された。10、20、30、50 mg/kgのPPMO複合体をHSALRマウスに単回投与すると、筋強直レベルはわずかに改善したが、30 mg/kgと50 mg/kgのPPMO複合体をHSALRマウスに単回投与すると、統計的に有意な方法で筋強直をWTレベルに正常化することに成功した（図2参照）。このデータから明らかなように、30 mg/kg以上のPPMO複合体の単回投与は筋強直の表現型を修正する能力がある。
PPMO複合体がスプライス修正に及ぼす影響を分子レベルで比較するため、腓腹筋と大腿四頭筋の両方で、HSALRの主要なミススプライスイベント（Clcn1、Mbnl1、Atp2a1）について、抽出したRNAをRT-PCRで解析した。10 mg/kgのPPMO複合体をHSALRマウスに単回投与すると、Clcn1、Mbnl1、Atp2a1転写産物のミススプライス修正がわずかに改善したが、20、30、50 mg/kgのPPMO複合体をHSALRマウスに単回投与すると、同じ転写産物のミススプライス修正が有意に改善し、腓腹筋と大腿四頭筋の骨格筋におけるWTのレベルと比較して、レベルが75％以上修正された（図3）。このデータから明らかなように、20 mg/kg以上のPPMO複合体の単回投与は、筋強直性ジストロフィー1型のHSALRマウスモデルにおいて、主要転写産物のミススプライス修正を有意に向上させる能力を有する。
さらに、qPCRによる分子解析を行い、10、20、30、又は50 mg/kgのPPMO複合体単回投与後の HSALRマウスの腓腹筋（図4a）と大腿四頭筋（図4b）におけるCUGexp HSA転写物レベルを評価した。HSALRマウスにPPMO複合体を投与すると、試験したすべての用量で、腓腹筋（図4a）及び大腿四頭筋骨格筋（図4b）において、P0に標準化したCUGexp HSA転写レベルに有意な変化は認められなかった。従って、PPMO複合体の投与は、HSALRDM1マウスモデルにおけるHSA転写物の発現レベルを変化させることはないと考えられる。
ヒト筋芽細胞のin vitroにおける生存率を、PPMO複合体、Pip複合体PMO（Pip-PMO）、又は非複合体PMOに曝露した後、12、24、36、48時間で測定した（図5）。PPMO複合体を20μMまでの濃度で筋芽細胞に処理しても、筋芽細胞の生存率は測定可能なほど低減しなかった。PPMOは、筋芽細胞に細胞死を起こさせることなく、治療レベルの数倍増加させた濃度で投与できる。
さらに研究を進めると、PMODM1はCUGリピートを標的とし、立体障害を通して働くことがわかった。さらに、PPMO複合体は腓腹筋の核病巣数に影響を与えないことを見出した。これらの研究は、図6に示すように、CAGプローブを用いたFISH解析によって行った。
また、天然に存在するCUGリピートに対するリピート配列PMOの影響を評価するため、オフターゲット解析も行った。図7に示すように、PPMO複合体はMapkap1又はPcolceに有意な影響を及ぼさなかったが、Txlnb転写物のレベルはベースラインと比較して中程度に上昇した。
PPMO複合体の安全性を評価するためのさらなる実験を行った。PPMO複合体を10、20、30、及び50 mg/kg投与したHSALRマウスの血清中の尿素、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、アルブミン、アルカリホスファターゼ（ALP）、アラニントランスフェラーゼ（ALT）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）の濃度を測定した。尿素、クレアチニン、ALP、ALT、AST、アルブミン、及びクレアチンキナーゼの測定値は、PPMO複合体のすべての用量で同等であり、生理食塩水で処置した対照動物と同等であった。
さらに、PPMO複合体は単回投与後3ヶ月間分子修正を持続することがわかった（図10-12）。この発見は、患者の利便性とコンプライアンスを向上させる可能性のある、比較的頻度の低い投与を使用する機会を提供する根拠となる。
材料及び方法
試薬及び一般的方法
9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）保護L-アミノ酸及びFmoc-β-Ala-OHプレロードWang樹脂（0.19mmol g-1）は、Merck（Hohenbrunn、ドイツ）から入手した。HPLCグレードのアセトニトリル、メタノール、及び合成グレードのN-メチル-2-ピロリドン（NMP）は、Fisher Scientific（Loughborough、UK）から購入した。ペプチド合成グレードのN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム（PyBOP）及びジエチルエーテルは、AGTC Bioproducts（Yorkshire、UK）から入手した。ピペリジン及びトリフルオロ酢酸（TFA）はAlfa Aesar（Heysham、England）から入手した。PMOはGene Tools Inc.から購入した。その他の試薬は、特に断りのない限り、Sigma-Aldrich（St. Louis、MO、USA）から入手した。MALDI-TOF質量分析は、Microflex banch top MALDI-ToF（Bruker）を用いて行った。0.1%TFAを含有する水中60%アセトニトリル中のa-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸又はシナピン酸の10 mg mL-1のストック溶液をマトリックスとして使用した。
100μmolスケールでのペプチドの合成
ペプチドは、製造元の推奨に従って、CEM LibertyBlueTM microwave Peptide Synthesizer （Buckingham、UK）とFmocケミストリーを用いて100 μmolスケールで合成した。使用した側鎖保護基は、トリフルオロ酢酸処理に不活性で、ペプチドは、DIPEA又はDIC|Oxymaの存在下でPyBOP（5倍過剰）を用いて活性化した、5倍過剰のFmoc保護アミノ酸（0.25 mmol）を用いて合成した。ピペリジン（DMF中20% v/v）を用いてN-Fmoc保護基を除去した。カップリングは、アルギニン及びグリコシル化アミノ酸残基を除き、75℃で5分間、60ワットのマイクロ波出力で1回ずつ行い、各2回カップリングした。
ヒスチジン及びシステイン残基は、50℃で5分間、60ワットのマイクロ波出力で1回結合させた。各脱保護反応は、75℃で2回行われ、1回は30秒間、次に35ワットのマイクロ波出力で3分間行った。合成が完了したら、樹脂をDMF（3x 50 mL）で洗浄し、固相に結合したペプチドのN末端をDIPEA存在下、無水酢酸でアセチル化した。トリフルオロ酢酸（TFA）からなる切断カクテルで処理することにより、ペプチドを固体支持体から切断した：3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール（DODT）：H2O：トリイソプロピルシラン（TIPS）（94％：2.5％：2.5％：1％、10mL）又はトリフルオロ酢酸（TFA）：H2O：m-クレゾール：トリイソプロピルシラン（TIPS）（94％：2.5％：2.5％：1％、1mL）又はトリフルオロ酢酸（TFA）：H2O：トリイソプロピルシラン（TIPS）（96.5％：2.5％：1％、1mL）を室温で2-3時間添加した。過剰のTFAは、ペプチド溶液にN2を吹き込んで除去した。氷冷ジエチルエーテルを加えて、3000rpmで5分間遠心分離することで切断ペプチドを沈殿させた。ペプチドペレットを氷冷ジエチルエーテルで3回洗浄した。粗ペプチドを水に溶解し、Phenomenex Jupiterカラム（21.2 X 250 mm、C18、10 μm）を用い、流速20 mL/分、以下のグラジエント（A: 0.1% TFA、B: 90% CH3CN、0.1% TFA）0-2分 5% B 2-35 分 5%-60% B 35-40 分 60%-90% Bを用いたRP-HPLCで分析、精製した。目的のペプチドを含有する画分を合わせて凍結乾燥し、生成物を白色固体として得た。
PPMOの定量と再調製
PPMOをRNaseフリーの水に溶解した。この溶液から、一部を0.1 M HClで100倍に希釈し、265 nmのUV-VISで測定した。濃度はBeer-Lambertの法則を用いて決定した：c =（A265）/（ε265l）
使用前に、PPMOを室温まで解凍し（あらかじめ凍結している場合）、短時間ボルテックスした後、37℃で30分間インキュベートした。PPMO溶液をその後、超音波槽で5分間超音波処理した。最後に、PPMOを短時間ボルテックスし、パルススピンした。
注射液は、RNaseフリー水と9％生理食塩水（最終濃度は0.9％生理食塩水）で希釈した目的の治療濃度のP-PMOを合わせて調製した。
動物モデル及びPPMOの全身投与
実験は筋強直性ジストロフィー1型様マウス系統HSALRマウス及びFVB対照マウスを用いて行った。静脈注射は、8～11週齢のマウスに尾静脈から単回投与した。マウスを承認された装置に拘束し、PPMOは麻酔なしで投与した。10、20、30、又は50 mg/kgのPPMOを0.9%生理食塩水で適宜希釈し、HSALRマウスに単回投与した。対照として、FVBマウスとHSALRマウスには0.9%生理食塩水を投与した。最終投与から2週間後に筋強直を評価し、その後組織及び血清を採取した。組織及び血清はドライアイスで凍結し、-80℃で保存するか、中性緩衝ホルマリンで適切に保存した。PPMO処置の持続的効果を示す研究のため、動物を30 mg/kg単回投与後12週間で解剖した。
筋強直と筋弛緩In situ測定
腓腹筋の等尺性収縮特性をin situで評価した。マウスはケタミン（80 mg/kg）/キシラジン（15 mg/kg）で麻酔した。膝と足をクランプとピンで固定し、腓腹筋遠位腱をサーボモーターシステム（305B、Dual-Mode Lever）のレバーアームに取り付けた。すべてのデータはPowerLabシステム（4SP、ADInstruments）を用いて記録し、ADInstrumentsソフトウェアのChart 4を用いて分析した。坐骨神経を近位に破砕し、持続時間0.1msの超極大（10V）矩形波パルスを用いて双極銀電極で刺激した。絶対最大等尺性四頭筋力（P0）は、電気刺激（周波数25から150Hz、刺激トレイン500ms）に対する等尺性収縮中に測定した。筋強直は、P0測定後の弛緩筋の遅延として測定した。
RNA抽出とcDNA合成
製造元のプロトコールに従って、Fastprepシステム及びLysing Matrix D チューブ（MP biomedicals 社製）を使用し、TriReagent（Sigma-Aldrich 社製）で、筋肉組織から全RNAを単離した。抽出されたRNAは、製造元の指示に従って、M-MLV第一鎖合成システム（Life Technologies）を用いて逆転写した。合成したcDNAは、その後、標準プロトコル（ReddyMix、Thermo Scientific）に従って半定量的PCR分析に使用した。
RT-PCR解析
PCR増幅を各遺伝子について25-35サイクル行い、PCR産物を2％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色し、ImageJソフトウェアを用いて定量した。含有率の定量は、アイソフォームシグナルの全強度に対するエクソン含有率の比として決定した。RT-PCRのプライマーは表1に概説する。統計解析はGraphPad Prism 8 for macOS Version 8.2.0（GraphPad Software, Inc.）を用いて行った。
リアルタイムqPCR解析
mRNA発現を定量するために、製造元の指示に従って、Lightcycler 480（Roche）を用いてSYBR Greenキット（Roche）で、リアルタイムqPCRを行った。PCRサイクル条件は、15分間の変性工程、94℃ 15秒間、58℃v20秒間、及び72℃ 20秒間を50サイクルとした。qPCRデータは、Lightcycler 480解析ソフトウェアで解析した。統計解析は、GraphPad Prism8 for macOS Version 8.2.0（GraphPad Software, Inc.）で行った。
In-vitro細胞培養とP-PMO処理
対照個体（Ctrl）又はDMPK遺伝子の3'非転写領域に2600個のCTGリピートを有するDM1患者（DM1）の不死化筋芽細胞を、0.05mL/mL子牛胎児血清（FCS）、フェツイン50 μg/mL、10 ng/mL上皮成長因子、1 ng/mL塩基性線維芽細胞成長因子、10 μg/mLインスリン、0.4 μg/mLデキサメタゾン、及び1％抗生物質抗真菌剤を添加した骨格筋細胞増殖培地（PromoCell）からなる増殖培地で培養した。筋芽細胞は5％CO2中、37℃で培養した。細胞は必要に応じて継代した。細胞のマイコプラズマ検査は、毎月行った。この研究で使用した細胞はすべて、マイコプラズマ陰性であった。
細胞生存率の筋芽細胞処理では、対照筋芽細胞を増殖培地中で細胞培養プレートに播種した。24時間後、筋芽細胞をPBS対照、非複合体PMO又はPPMO複合体で0.5～20 μMの用量範囲で処理（ジムノティック）した。
ミススプライス解析のために、コントロール又はDM1筋芽細胞を増殖培地中で細胞培養プレートに播種した。24時間後に増殖培地を除去し、分化培地（骨格筋細胞増殖培地に10 μg/mLのインスリン及び1％の抗生物質、抗真菌剤を添加）で筋管が発達するまで4日間培養した。その後、筋管をPBS対照、非複合体PMO又はPPMOで1～20 μMの用量範囲で処理（ジムノティック）し、サンプルは処理後48時間で採取した。
細胞生存率試験
全ての処理は2回反復して行った。細胞生存率は、RealTime-Glo MT Cell Viability Assay （Promega）を用いた速度論的細胞生存率解析により、PBS対照、非複合PMO又はPPMO複合体処理後0から48時間まで評価した。簡単には、MT Cell Viability SubstrateとNanoLuc Enzymeを適切な細胞培養液で希釈し、RealTime-Glo試薬とした。この混合液を細胞に添加した。細胞を試験時間中37℃でインキュベートし、1時間毎に発光を測定した。細胞生存率（パーセンテージ）は以下の式で求めた。
［（非複合PMO又はPPMO複合体処理細胞発光）／（PBS処理細胞発光）］×100
PMO定量
WT及びHSALRマウスの腓腹筋及び大腿四頭筋のホモジナイズされた組織溶解物を、PMOオリゴヌクレオチドの濃度を決定し、検量線に対して定量するために開発されたカスタマイズされた陰イオン交換HPLCベースの方法の対象とした。本測定法は、PMOと相補的な配列を持ち、両末端に蛍光色素を複合体化したRNAプローブ（配列番号９７ - 5'-cugcugcugcugcugcugcug-3'）の特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。本測定は、マウス組織において50 ng/gから5,000 ng/gの直線検出範囲を有する。
結果
提供された結果は、動物モデルにおいて、転写物のスプライス修正及びミススプライシングによって引き起こされる筋強直症の表現型の逆転に対するペプチド-PMO複合体の明確な用量反応効果を示している（図2-4）。これらの図はまた、本発明の複合体のすべてが、治療的使用を考慮するのに十分な有効性を示すことを強調している。この結果はさらに、関連する疾患モデルマウスにおけるin vivoでのペプチド-PMO複合体の活性を強調し、このような複合体の活性が大腿四頭筋と腓腹筋で同様に有効であることを示唆している（図2-4）。これらの図は、PPMO複合体がClcn1、Mbnl1、Atp2a1におけるスプライシング不全及び筋強直症を正常化できることを示している。これらの結果は、筋強直とスプライス修正の正常化効果は、10 mg/kg投与と比較して、30 mg/kg投与でより大きくなるという明らかな用量反応を示している。
従って、本発明のペプチド複合体は、ヒトにおける神経筋障害の治療のための治療用複合体の有効性を改善し、毒性を低減するための有望な細胞透過性ペプチドを提供する。
得られた結果は、PPMO複合体の安全性と忍容性プロファイルが明らかに向上していることを示している（図5）。PPMO複合体の投与量を増やしても、投与48時間後まで筋芽細胞に明らかな細胞死がないことが示されたように、非複合体PMOと同レベルの筋芽細胞生存率が得られる。
また、PPMO複合体は、非複合体PMOと比較して劇的に送達を促進し、Pip複合体PMOよりも信頼性の高い用量依存的な分子修正を誘導することが示された。このデータは、PPMO複合体が、Pip複合PMOのような従来の細胞透過性ペプチド複合体よりも広い治療域と安全な毒性プロファイルを持ち、従ってDM1患者にとってより有望で好ましい治療候補となることを示している。
PPMO複合体投与後のPMOの組織送達を、プローブベースの蛍光陰イオン交換HPLCベースの方法で評価し、主要組織群へのPMOの送達を定量化した。10 mg/kgの低投与レベルでさえ、PMOは筋肉組織で約17-24 ng/g検出され、筋肉で検出されたPMOのレベルは用量依存的に増加した。
PPMO複合体の毒性評価は、WT及び/又はHSALRマウスを用いてin vivoで行われた。生理食塩水又はPPMO複合体投与2週間後に血清を採取し、尿素、クレアチニン、ALP、ALT、AST、アルブミン、及びCKレベルを解析した。すべての臨床化学パラメーターは、最高用量レベルの50 mg/kgを含め、生理食塩水対照の範囲内であり（図8）、良好な予備的安全性プロファイルを示した。
図2及び図3a-3cのデータは、RNAミススプライシングと筋強直の下流イベントの修正を通じて、MBNL1と有毒な核CUG伸長との病的相互作用を阻害することにより、PPMO複合体処理がDM1の表現型を標的とする上で大きな影響を与えることを示している。
関連するDM1マウスモデルであるHSALRマウスに存在する筋強直表現型の生理学的修正を、筋強直測定によって評価した（図2）。PPMO複合体の投与により、投与量に関連した明らかな修正が誘導され、20 mg/kgでほぼ完全に修正され、30 mg/kg以上の投与量で統計的に有意な完全修正が達成された（図2）。
DM1マウスモデルで見られた分子異常は、PPMO複合体による処理で修正された（図3a-3c）。PPMO複合体を投与すると、10 mg/kg以上の単回投与で、腓腹筋と大腿四頭筋のClcn1、Mbnl1、及びAtp2a1転写産物の主要なミスプライシングイベントが統計的に有意に修正された。
PPMO複合体による処理は、20 mg/kg以下ではHSA転写レベルに影響を及ぼさず、30 mg/kg及び50 mg/kgの高用量では有意な影響を及ぼさなかった（図4a及び図4b）。
さらに、PPMO複合体は単回投与後、数ヶ月間分子修正が持続することがわかった（図10-12）。この驚くべき発見は、副作用の可能性を最小にするだけでなく、患者のコンプライアンス、快適さ、及び利便性を高める可能性がある、比較的頻度の少ない投与を使用する機会の根拠を提供する。従って、本明細書に記載され特許請求されている方法は、DM1の治療において実質的な進歩を示すものである。
これらの結果を総合すると、PPMO複合体がin vitro及びin vivoにおいて転写産物のスプライス修正に、ならびにHSALRマウス動物モデルにおいてミススプライシングに起因する筋強直性表現型の逆転に明確な用量反応効果を示すことが示された。同時に、PPMO複合体はPip-PMOよりも安全性プロファイルが著しく改善されている。
実施例２．
健常人又は2600個のCTGリピートを有するDM1患者の不死化筋芽細胞を培養し、4日間分化させた。非複合体PMO又はペプチド-PMO複合体を所定の濃度で処理した。処理24時間後に細胞を採取し、解析を行った。可視化はFISHと免疫蛍光で行った。RNAを単離し、RT-PCR及びキャピラリー電気泳動（QIAxcel）解析で分析した。結果を図12及び13A-13Eに示す。
図12の結果は、複合体処理後の核病巣数の劇的な減少を示している。対照的に、非複合体PMOでは核病巣の減少は観察されなかった。
図13A-13Eの結果は、複合体による処理によってMBNL1が遊離し、下流のミスプライシングが強固に修正されたことを示している。
実施例３．
本明細書に記載の複合体を野生型（WT）マウス及びDM1マウスモデル（HSALR）に30 mg/kgで静脈内投与し、投与後2週間（n=8）、12週間（n=8）、又は24週間（n=5）に腓腹筋及び大腿四頭筋を採取した。その後、Atp2a1とClcn1におけるミススプライシングの修正を評価した。結果を図14A及び14Bに示す。複合体処置は、単回投与後少なくとも24週間、分子修正を持続した。
他の実施形態
記載された本発明の様々な修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な変更は、本発明の範囲内にあることが意図されている。
いくつかの実施形態は、以下の番号のパラグラフの範囲内にある。
1． 筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を有する対象を治療する方法であって、上記方法は、少なくとも１ヶ月の時間間隔で複数用量の複合体を含む治療レジメンを実施することを含み、上記複合体は、オリゴヌクレオチドと、上記オリゴヌクレオチドに共有結合又はリンカーを介して連結されたペプチドを含み、
上記ペプチドは、２つのカチオン性ドメインに挟まれた疎水性ドメインを含み、上記カチオン性ドメインのそれぞれは、RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRR（配列番号３）、RBRRBR（配列番号４）、RRBRBR（配列番号５）、RBRRB（配列番号６）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、HBHBR（配列番号９）、RBRHBHR（配列番号１０）、RBRBBHR（配列番号１１）、RBRRBH（配列番号１２）、HBRRBR（配列番号１３）、HBHBH（配列番号１４）、BHBH（配列番号１５）、BRBSB（配列番号１６）、BRB[Hyp]B（配列番号１７）、R[Hyp]H[Hyp]HB（配列番号１８）、及びR[Hyp]RR[Hyp]R（配列番号１９）のうち１つを含み、前記疎水性ドメインは、YQFLI（配列番号２０）、FQILY（配列番号２１）、ILFQY（配列番号２２）、FQIY（配列番号２３）、WWW、WWPWW（配列番号２４）、WPWW（配列番号２５）、及びWWPW（配列番号２６）のうち１つを含み、及び、
上記オリゴヌクレオチドは、合計１２から４０個の連続する核酸塩基を含み、少なくとも９個の連続する核酸塩基は、ＣＵＧ反復配列に相補的である、方法。
2． 上記時間間隔は、１から６ヶ月である、パラグラフ１に記載の方法。
3． 上記時間間隔は、２から６ヶ月である、パラグラフ１に記載の方法。
4． 上記時間間隔は、３から６ヶ月である、パラグラフ１に記載の方法。
5． 上記時間間隔は、４から６ヶ月である、パラグラフ１に記載の方法。
6． 上記時間間隔は、５から６ヶ月である、パラグラフ１に記載の方法。
7． 上記時間間隔は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月又は６ヶ月である、パラグラフ１に記載の方法。
8． 上記治療レジメンは、２週間の開始間隔で複合体を３回又は４回投与することを含む治療開始レジメンをさらに含む、パラグラフ１から７のいずれか１項に記載の方法。
9． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]n-3'であり、ｎは、５から８の整数である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
10． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]5-3'である、パラグラフ９に記載の方法。
11． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]6-3'である、パラグラフ９に記載の方法。
12． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]7-3'である、パラグラフ９に記載の方法。
13． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]8-3'である、パラグラフ９に記載の方法。
14． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]n-3'であり、ｎは５から８の整数である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
15． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]5-3'である、パラグラフ１４に記載の方法。
16． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]6-3'である、パラグラフ１４に記載の方法。
17． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]7-3'である、パラグラフ１４に記載の方法。
18． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]8-3'である、パラグラフ１４に記載の方法。
19． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]n-3'であり、上記ｎは５から８の整数である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
20． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]5-3'である、パラグラフ１９に記載の方法。
21． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]6-3'である、パラグラフ１９に記載の方法。
22． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]7-3'である、パラグラフ１９に記載の方法。
23． 上記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]8-3'である、パラグラフ１９に記載の方法。
24． 上記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRFQILYBRBR（配列番号３５）を有する、パラグラフ１から２３のいずれか１項に記載の方法。
25． 上記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRRFQILYRBHBH（配列番号３７）を有する、パラグラフ１から２３のいずれか１項に記載の方法。
26． 上記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRFQILYRBHBH（配列番号４４）を有する、パラグラフ１から２３のいずれか１項に記載の方法。
27． 上記ペプチドは、そのＮ末端を介して上記複合体の残りの部分に結合する、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
28． 上記ペプチドのＣ末端は、-CONH2である、パラグラフ２７に記載の方法。
29． 上記ペプチドは、そのＣ末端を介して上記複合体の残りの部分に結合する、パラグラフ１から２６のいずれか１項に記載の方法。
30． 上記ペプチドは、そのＮ末端でアシル化された、パラグラフ２９に記載の方法。
31． 上記複合体は、以下の構造である、上記のパラグラフのいずれかに記載の方法。
32． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から３０のいずれか１項に記載の方法。
33． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から３０のいずれか１項に記載の方法。
34． 上記のパラグラフのいずれかに記載の方法であって、各リンカーは、独立して下記式（Ｉ）で示される、方法。


（式中、T1は、前記ペプチドに結合するための２価の基であり、-NH-及びカルボニルからなる群から選択され、
T2は、オリゴヌクレオチドに結合するための２価の基であり、-NH-及びカルボニルからなる群から選択され、
ｎは、１、２又は３であり、
各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
ここで、
Y1は、存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して水素、OH、又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、又は-N(RA3)SO2-であり、各RA3は、独立して水素及びメチルから選択され、及び
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールであり、
ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、及び（１－４Ｃ）アルコキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RA4及びRA5はそれぞれ独立して水素及び（１－４Ｃ）アルキルからなる群より選択され、及び
各R2は、独立して-Y2-X2-Z2であり、ここで、
Y2は、存在しないか、式-[CRB1RB2]m-で示される基であり、ｍは、１、２、３又は４、から選択される整数であり、RB1及びRB2はそれぞれ独立して水素、OH又は（１－２Ｃ）アルキルから選択され、
X2は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S--SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり、それぞれRB3は独立して水素又はメチルから選択され、及び
Z2は、水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル又はヘテロアリールから選択され、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル又はヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、及び（１－４Ｃ）アルコキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RB4及びRB5は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、ただし、ｎ＝１かつ、T1及びT2は互いに異なるとき、R1及びR2は、両方ともHではなく、ｎ=１かつ、T1及びT2は互いに異なり、R1及びR2の一方はHであるとき、R1及びＲ２の他方はメチルではなく、又はｎ＝２かつ、R1及びR2の各存在はHであるときT1及びT2は両方とも-C(O)-、又は両方とも-NH-である。）
35． T2は、-C(O)-である、パラグラフ３４に記載の方法。
36． 各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
Y1は、存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは１、２、３又は４であり、RA1とRA2はそれぞれ水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-又は-S-であり、各RA3は独立して水素又はメチルであり、及び、
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールであり、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、及びヘテロアリールは（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、及び（１－４Ｃ）アルコキシ、からなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RMとRA5は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルである、パラグラフ３４又は３５に記載の方法。
37． 各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
Y1は存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは１、２、３、又は４であり、RA1とR"は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、
-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、又は-S-であり、各RA3は、独立して水素又はメチルであり、及び、
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、又はヘテロアリールであり、それぞれ（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、及びヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、及びヒドロキシからなる群より選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよい、パラグラフ３４又は３５に記載の方法。
38． 各R1は独立して-Y1-X1-Z1であり、
Y1は存在しないか、式-(CRA1RA2)m-で示される基であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RA1とRA2は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
X1は存在しないか、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-であり、各RA3は水素又はメチルであり、及び、
Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、又はヘテロアリールであり、それぞれ（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、及びヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、及びヒドロキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよい、パラグラフ３４又は３５に記載の方法。
39．各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
Y1は、存在しないか、-(CH2)-、又は-(CH2CH2)-であり、
X1は、存在しないか、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-であり、各RA3は独立して水素又はメチルであり、及び、
Z1は、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである、パラグラフ３４又は３５に記載の方法。
40． 各R2は、独立して-Y2-Z2であり、
Y2は、存在しないか、-(CRB1RB2)m-であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RB1とRB2はそれぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、及び、
Z2は水素又は（１－６Ｃ）アルキルである、パラグラフ３４から３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 各R2は、水素である、パラグラフ３４から３９のいずれか１項に記載の方法。
42. ｎは、２又は３である、パラグラフ３４から４１のいずれか１項に記載の方法。
43. ｎは、１である、パラグラフ３４から４１のいずれか１項に記載の方法。
44． 上記リンカーは、グルタミン酸、コハク酸、及びγ－アミノ酪酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
45． 上記リンカーは、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
46． 上記リンカーは、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
47． 上記リンカーは、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
48． 上記リンカーは、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
49． 上記リンカーは、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
50． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
51． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
52． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
53． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
54． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から４３のいずれか１項に記載の方法。
55 上記オリゴヌクレオチドは、その3'末端でリンカー又はペプチドに結合する、パラグラフ１から５４のいずれか１項に記載の方法。
56． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
57． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
58． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
59． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
60． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
61． 上記複合体は、以下の構造である、パラグラフ１から８のいずれか１項に記載の方法。
62． 上記オリゴヌクレオチドは、モルホリノである、パラグラフ１から６１のいずれか１項に記載の方法。
63． 上記モルホリノ中のすべてのモルホリノヌクレオシド間結合は、-P(O)(NMe2)O-である、パラグラフ６２に記載の方法。
64． 上記オリゴヌクレオチドは、5'末端として以下の基を含む、パラグラフ６３に記載の方法。
65． 上記オリゴヌクレオチドは、その5'末端として以下の基を含む、パラグラフ１から６４のいずれか１項に記載の方法。
66． 上記複合体は、腹腔内投与される、上記のパラグラフのいずれか１項に記載の方法。
67． 上記複合体は、非経口的に投与される、パラグラフ６６に記載の方法。
68． 上記複数用量中の各用量は、5-60 mg/kgの上記複合体を含む、パラグラフ１から６７のいずれか１項に記載の方法。
69． 上記複数用量中の各用量は、40 mg/kgから60 mg/kg、30 mg/kgから50 mg/kg、30 mg/kgから40 mg/kg、40 mg/kgから50 mg/kg、50 mg/kgから60 mg/kg、35 mg/kgから45 mg/kg、45 mg/kgから55 mg/kg、35 mg/kgから55 mg/kg、30 mg/kgから45 mg/kg、35 mg/kgから50 mg/kg、40 mg/kgから55 mg/kg、45 mg/kgから60 mg/kg、1 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから20 mg/kg、5 mg/kgから25 mg/kg、10 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから15 mg/kg、5 mg/kgから20 mg/kg、10 mg/kgから25 mg/kg、15 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから10 mg/kg、5 mg/kgから15 mg/kg、10 mg/kgから20 mg/kg、15 mg/kgから25 mg/kg、20 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから25 mg/kg、4 mg/kgから20 mg/kg、6 mg/kgから15 mg/kg、又は8 mg/kgから10 mg/kgの上記複合体を含む、パラグラフ１から６８のいずれか１項に記載の方法。
70． 上記複数用量中の各用量は、1 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、8 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、又は60 mg/kgの上記複合体を含む、パラグラフ６９に記載の方法。
他の実施形態は特許請求の範囲に含まれる。

Claims (70)

  1. 筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を有する対象を治療する方法であって、前記方法は、少なくとも１ヶ月の時間間隔で複数用量の複合体を含む治療レジメンを実施することを含み、前記複合体は、オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合又はリンカーを介して連結されたペプチドを含み、
    前記ペプチドは、２つのカチオン性ドメインに挟まれた疎水性ドメインを含み、前記カチオン性ドメインのそれぞれは、RBRRBRR（配列番号１）、RBRBR（配列番号２）、RBRR（配列番号３）、RBRRBR（配列番号４）、RRBRBR（配列番号５）、RBRRB（配列番号６）、BRBR（配列番号７）、RBHBH（配列番号８）、HBHBR（配列番号９）、RBRHBHR（配列番号１０）、RBRBBHR（配列番号１１）、RBRRBH（配列番号１２）、HBRRBR（配列番号１３）、HBHBH（配列番号１４）、BHBH（配列番号１５）、BRBSB（配列番号１６）、BRB[Hyp]B（配列番号１７）、R[Hyp]H[Hyp]HB（配列番号１８）、及びR[Hyp]RR[Hyp]R（配列番号１９）のうち１つを含み、前記疎水性ドメインは、YQFLI（配列番号２０）、FQILY（配列番号２１）、ILFQY（配列番号２２）、FQIY（配列番号２３）、WWW、WWPWW（配列番号２４）、WPWW（配列番号２５）、及びWWPW（配列番号２６）のうち１つを含み、及び、
    前記オリゴヌクレオチドは、合計１２から４０個の連続する核酸塩基を含み、少なくとも９個の連続する核酸塩基は、ＣＵＧ反復配列に相補的である、方法。
  2. 前記時間間隔は、１から６ヶ月である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記時間間隔は、２から６ヶ月である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記時間間隔は、３から６ヶ月である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記時間間隔は、４から６ヶ月である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記時間間隔は、５から６ヶ月である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記時間間隔は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月又は６ヶ月である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記治療レジメンは、２週間の開始間隔で複合体を３回又は４回投与することを含む治療開始レジメンをさらに含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]n-3'であり、ｎは、５から８の整数である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]5-3'である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]6-3'である、請求項９に記載の方法。
  12. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]7-3'である、請求項９に記載の方法。
  13. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[CAG]8-3'である、請求項９に記載の方法。
  14. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]n-3'であり、ｎは５から８の整数である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]5-3'である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]6-3'である、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]7-3'である、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[AGC]8-3'である、請求項１４に記載の方法。
  19. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]n-3'であり、前記ｎは５から８の整数である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]5-3'である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]6-3'である、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]7-3'である、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記オリゴヌクレオチドは、5'-[GCA]8-3'である、請求項１９に記載の方法。
  24. 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRFQILYBRBR（配列番号３５）を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRRFQILYRBHBH（配列番号３７）を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列RBRRBRFQILYRBHBH（配列番号４４）を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ペプチドは、そのＮ末端を介して前記複合体の残りの部分に結合する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記ペプチドのＣ末端は、-CONH2である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ペプチドは、そのＣ末端を介して前記複合体の残りの部分に結合する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ペプチドは、そのＮ末端でアシル化された、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  34. 請求項１から７のいずれか１項に記載の方法であって、各リンカーは、独立して下記式（Ｉ）で示される、方法。


    （式中、T1は、前記ペプチドに結合するための２価の基であり、-NH-及びカルボニルからなる群から選択され、
    T2は、オリゴヌクレオチドに結合するための２価の基であり、-NH-及びカルボニルからなる群から選択され、
    ｎは、１、２又は３であり、
    各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
    ここで、
    Y1は、存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RA1及びRA2は、それぞれ独立して水素、OH、又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
    X1は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORA3)-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-N(RA3)-C(O)O-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、-SO-、-S-、-SO2-、-S(O)2N(RA3)-、又は-N(RA3)SO2-であり、各RA3は、独立して水素及びメチルから選択され、及び
    Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールであり、
    ここで、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、及び（１－４Ｃ）アルコキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RA4及びRA5はそれぞれ独立して水素及び（１－４Ｃ）アルキルからなる群より選択され、及び
    各R2は、独立して-Y2-X2-Z2であり、ここで、
    Y2は、存在しないか、式-[CRB1RB2]m-で示される基であり、ｍは、１、２、３又は４、から選択される整数であり、RB1及びRB2はそれぞれ独立して水素、OH又は（１－２Ｃ）アルキルから選択され、
    X2は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-CH(ORB3)-、-N(RB3)-、-N(RB3)-C(O)-、-N(RB3)-C(O)O-、-C(O)-N(RB3)-、-N(RB3)C(O)N(RB3)-、-N(RB3)C(NRB3)N(RB3)-、-SO-、-S--SO2-、-S(O)2N(RB3)-、又は-N(RB3)SO2-であり、それぞれRB3は独立して水素又はメチルから選択され、及び
    Z2は、水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル又はヘテロアリールから選択され、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル又はヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRB4RB5、及び（１－４Ｃ）アルコキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RB4及びRB5は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、ただし、ｎ＝１かつ、T1及びT2は互いに異なるとき、R1及びR2は、両方ともHではなく、ｎ=１かつ、T1及びT2は互いに異なり、R1及びR2の一方はHであるとき、R1及びＲ２の他方はメチルではなく、又はｎ＝２かつ、R1及びR2の各存在はHであるときT1及びT2は両方とも-C(O)-、又は両方とも-NH-である。）
  35. T2は、-C(O)-である、請求項３４に記載の方法。
  36. 各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
    Y1は、存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは１、２、３又は４であり、RA1とRA2はそれぞれ水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
    X1は、存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、-N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-又は-S-であり、各RA3は独立して水素又はメチルであり、及び、
    Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、又はヘテロアリールであり、各（１－６Ｃ）アルキル、（２－６Ｃ）アルケニル、（２－６Ｃ）アルキニル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、（３－６Ｃ）シクロアルケニル、及びヘテロアリールは（１－４Ｃ）アルキル、オキソ、ハロ、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、NRA4RA5、及び（１－４Ｃ）アルコキシ、からなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよく、RMとRA5は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルである、請求項３４に記載の方法。
  37. 各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
    Y1は存在しないか、又は-(CRA1RA2)m-であり、ｍは１、２、３、又は４であり、RA1とR"は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
    X1は存在しないか、-O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-、
    -N(RA3)C(O)N(RA3)-、-N(RA3)C(NRA3)N(RA3)-、又は-S-であり、各RA3は、独立して水素又はメチルであり、及び、
    Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、又はヘテロアリールであり、それぞれ（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、及びヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、及びヒドロキシからなる群より選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよい、請求項３４に記載の方法。
  38. 各R1は独立して-Y1-X1-Z1であり、
    Y1は存在しないか、式-(CRA1RA2)m-で示される基であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RA1とRA2は、それぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、
    X1は存在しないか、-C(O)-、-C(O)O-、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-であり、各RA3は水素又はメチルであり、及び、
    Z1は、さらにオリゴヌクレオチドであるか、又は水素、（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、又はヘテロアリールであり、それぞれ（１－６Ｃ）アルキル、アリール、（３－６Ｃ）シクロアルキル、及びヘテロアリールは、（１－４Ｃ）アルキル、ハロ、及びヒドロキシからなる群より選択される１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５）の置換基によって置換されていてもよい、請求項３４に記載の方法。
  39. 各R1は、独立して-Y1-X1-Z1であり、
    Y1は、存在しないか、-(CH2)-、又は-(CH2CH2)-であり、
    X1は、存在しないか、-N(RA3)-C(O)-、-C(O)-N(RA3)-であり、各RA3は独立して水素又はメチルであり、及び、
    Z1は、水素又は（１－２Ｃ）アルキルである、請求項３４に記載の方法。
  40. 各R2は、独立して-Y2-Z2であり、
    Y2は、存在しないか、-(CRB1RB2)m-であり、ｍは、１、２、３又は４であり、RB1とRB2はそれぞれ独立して水素又は（１－２Ｃ）アルキルであり、及び、
    Z2は水素又は（１－６Ｃ）アルキルである、請求項３４に記載の方法。
  41. 各R2は、水素である、請求項３４に記載の方法。
  42. ｎは、２又は３である、請求項３４に記載の方法。
  43. ｎは、１である、請求項３４に記載の方法。
  44. 前記リンカーは、グルタミン酸、コハク酸、及びγ－アミノ酪酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記リンカーは、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記リンカーは、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記リンカーは、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記リンカーは、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記リンカーは、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記オリゴヌクレオチドは、その３'末端でリンカー又はペプチドに結合する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記複合体は、以下の構造である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記オリゴヌクレオチドは、モルホリノである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記モルホリノ中のすべてのモルホリノヌクレオシド間結合は、-P(O)(NMe2)O-である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記オリゴヌクレオチドは、5'末端として以下の基を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記オリゴヌクレオチドは、その5'末端として以下の基を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記複合体は、腹腔内投与される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記複合体は、非経口的に投与される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記複数用量中の各用量は、5-60 mg/kgの前記複合体を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記複数用量中の各用量は、40 mg/kgから60 mg/kg、30 mg/kgから50 mg/kg、30 mg/kgから40 mg/kg、40 mg/kgから50 mg/kg、50 mg/kgから60 mg/kg、35 mg/kgから45 mg/kg、45 mg/kgから55 mg/kg、35 mg/kgから55 mg/kg、30 mg/kgから45 mg/kg、35 mg/kgから50 mg/kg、40 mg/kgから55 mg/kg、45 mg/kgから60 mg/kg、1 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから20 mg/kg、5 mg/kgから25 mg/kg、10 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから15 mg/kg、5 mg/kgから20 mg/kg、10 mg/kgから25 mg/kg、15 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから10 mg/kg、5 mg/kgから15 mg/kg、10 mg/kgから20 mg/kg、15 mg/kgから25 mg/kg、20 mg/kgから30 mg/kg、1 mg/kgから25 mg/kg、4 mg/kgから20 mg/kg、6 mg/kgから15 mg/kg、又は8 mg/kgから10 mg/kgの前記複合体を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記複数用量中の各用量は、1 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、8 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、又は60 mg/kgの前記複合体を含む、請求項６９に記載の方法。
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