JP2024508658A

JP2024508658A - 抗ｐｄ－１抗体及びその用途

Info

Publication number: JP2024508658A
Application number: JP2023547439A
Authority: JP
Inventors: ヒョンロクパク，; ドンゴペ，; スンホハン，; チェギュパク，; ミョンジンユン，; ヘミキム，; ウンジチョ，; キョンジンキム，; ジャヨンキム，
Original assignee: ジェヌーヴインク．
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2022-02-03
Publication date: 2024-02-28
Also published as: IL304807A; BR112023015652A2; WO2022169274A2; TW202241509A; US20240034796A1; WO2022169274A3; KR20230133871A; EP4289866A2; KR102661163B1; AU2022217058A1; CA3206253A1; MX2023009112A

Abstract

プログラムされた細胞死滅１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｄｅａｔｈ－１；ＰＤ－１）タンパク質に結合するタンパク質結合剤、抗体、その抗原結合断片に係り、さらには、該タンパク質結合剤、該抗体、その抗原結合断片を暗号化するポリヌクレオチド配列、それを含むベクター、宿主細胞を提供し、該タンパク質結合剤、該抗体、その抗原結合断片を含む薬学的組成物、キットを提供する。【選択図】図６

Description

本発明は、プログラムされた細胞死滅１（ＰＤ－１：programmed cell death-1）タンパク質に結合する抗体、その抗原結合断片、及びその用途に関する。

本項目の説明は、本開示内容に係わる背景技術情報を提供するのみ、先行技術を本質的に構成するものではない。

プログラムされた細胞死滅１（ＰＤ－１：programmed cell death-1；programmed death-1）（ＣＤ２７９でも命名される）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核細胞、自然殺害（ＮＫ）細胞及び樹枝状細胞のような免疫細胞で頻繁に確認される細胞表面タンパク質であり、免疫体系を下向き調節し、免疫体系の反応を調節し、Ｔ細胞炎症活性を抑制することにより、自己耐性（self-tolerance）を促進させる。それは、自己免疫疾患を予防することはするが、免疫体系が癌細胞を殺すことを妨害しうる（Syn et al., 2017 Lancet Oncol 18 (12): e731-e741）。

最近、免疫体系をターゲットにし、免疫力を回復、促進させる免疫抗癌剤の開発が活発に進められている。免疫チェックポイントタンパク質の一つであるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路は、臨床的に癌免疫療法の標的にもなることが確認された（Patsoukis et al., 2020 Sci. Adv. 6: eabd2712）。従って、ＰＤ－１を遮断し、免疫体系を活性化させ、腫瘍を攻撃し、特定類型の癌を治療するためのＰＤ－１阻害剤が開発されている。

また、ＰＤ－１信号伝逹の上向き調節は、ヒトのウイルス感染及びウイルス拡張にもつながる。流行性の肝臓感染ウイルスであるＨＢＶ及びＨＣＶは、肝細胞において、ＰＤ－１リガンドの過発現を誘導し、エフェクターＴ細胞において、ＰＤ－１信号伝逹を活性化させ、ウイルス感染に対するＴ細胞の枯渇及び寛容を引き起こす（Golden-Mason et al., 2008 J Immunol 180: 3637-3641）。同様に、ＨＩＶ感染は、類似したメカニズムにより、ヒト免疫システムを頻繁に回避する。拮抗分子により、ＰＤ－１信号伝逹を治療的に調節し、寛容から免疫細胞を回復させることができ、再活性化させ、癌及び慢性ウイルスの感染を除去することができると報告されている（Okazaki et al., 2007 Int Immunol 19: 813-824）。

一方、抗ＰＤ－１アゴニスト抗体を、リウマチ関節炎のような自己免疫障害の治療、移植された細胞／組織の拒否を低減させるための用途の開発も進行中である（Grebinoski and Vignali, 2020 Curr Opin Immunol 67: 1-9）。

また、ＩＦＮ γ依存的全身性免疫反応（systemic immune response）がアルツハイマー病及び神経炎症性要素（neuroinflammatory component）を共有する他の中枢神経系病理の治療に有益であるということが提案され、国際公開特許ＷＯ２０１５／１３６５４１において、抗ＰＤ－１抗体を使用したアルツハイマー病治療用途が開示された。国際公開特許ＷＯ２０１７／２２０９９０には、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抑制性免疫チェックポイント経路の遮断は、ＩＦＮ γ生産細胞によるＩＦＮ γの分泌を高め、増大されたＩＦＮ γ活性は、脳の脈絡膜網（choroid plexus）が、選択的な白血球輸送、Ｔ細胞及び単核球の損傷された中枢神経系への浸透、免疫細胞の神経退行性病理及び神経炎症の部位への帰巣（homing）を許容させ、環境を有害にさせず、毒性物質の除去、神経細胞の救済・再生及び修復がさらに良好になされるようにするということが記載されている。

抗ＰＤ－１抗体製剤の開発が活発であるが、依然としてさらに多様な適応症や特性を有する多様な抗ＰＤ－１抗体の開発が切実である。また、抗ＰＤ－１抗体製剤や、それを含む複合剤を効率的に開発するためには、ヒトＰＤ－１だけではなく、マウスＰＤ－１にも結合することができ、前臨床段階において、抗体の効能、薬物動力学的特性、毒性などをマウスで確認することができる抗体の大切さが大きいが、商用化された抗体のほとんどは、ヒトＰＤ－１にだけ結合するものであるので、交差反応性（cross-reactivity）がある新たな抗ＰＤ－１抗体の開発が必要である。

本開示内容の一目的は、ＰＤ－１に結合する新規のＰＤ－１タンパク質結合剤を提供するものである。

本開示内容の一目的は、ＰＤ－１に結合する新規の抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合断片を提供するものである。

本開示内容の他の一目的は、ヒトＰＤ－１及びマウスＰＤ－１にいずれも結合する新規の交差反応性（cross－reactive）のタンパク質結合剤、抗体、及びその抗原結合断片を提供するものである。

本開示内容のさらに他の一目的は、新規のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体、及びその抗原結合断片を生産する方法を提供するものである。

本開示内容のさらに他の一目的は、新規のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体、及びその抗原結合断片の用途を提供するものである。

しかしながら、本開示内容が解決すべき課題は、以上で言及された課題に制限されるものではなく、言及されていない他の課題は、以下の記載から、当業者に明確に理解されうるであろう。

前述のような課題を解決するために、本出願の発明者らは、多数の実験後、新たなＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体、及びその抗原結合断片を開発した。

本開示内容は、一側面において、ＰＤ－１タンパク質に結合する抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合断片を開示し、前記抗体及び前記抗原結合断片は、重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域を含み、
該重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３，６３，６４，６５，６６または６７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、並びに配列番号５、及び配列番号６８ないし８２によってなる群のうちから選択されたアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＨＣＤＲ変異体を含み、
該軽鎖可変領域は、配列番号７，６０，８３または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＬＣＤＲ変異体を含む。

本開示内容は、一側面において、ＰＤ－１タンパク質に結合する抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合断片を開示し、該抗体は、重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域を含み、
該重鎖可変領域は、配列番号１３，５４，５６または５８で表されているような配列を含むか、あるいはそれら配列と比較し、１ないし１０個以下のアミノ酸突然変異を有する変異体を含み、
該軽鎖可変領域は、配列番号１５，５５，５７または５９で表されているような配列を含むか、あるいはそれら配列と比較し、１ないし１０個以下のアミノ酸突然変異を有する変異体を含む。

本開示内容は、一側面において、ヒトＰＤ－１タンパク質（配列番号６２）のＰ１３０、Ｌ１２８及びＩ１２６を含むＰＤ－１のエピトープ（epitope）に特異的に結合する、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を提供する。前述の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６２のＮ６６、Ｙ６８、Ｋ７８、Ａ１２９及びＡ１３２によってなる群のうちから選択された１以上を含むさらなるエピトープに特異的に結合しうる。

本開示内容は、一側面において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３，６３，６４，６５，６６または６７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、並びに配列番号５、及び配列番号６８ないし８２によってなる群のうちから選択されたアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＨＣＤＲ変異体を含む、単離された免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、軽鎖可変領域は、配列番号７，６０，８３または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＬＣＤＲ変異体を含む、単離された免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８で表されているような配列を含むか、あるいはそれら配列と比較し、１ないし１０個以下のアミノ酸突然変異を有する変異体を含む、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９で表されているような配列を含むか、あるいはそれら配列と比較し、１ないし１０個以下のアミノ酸突然変異を有する変異体を含む、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列に対し、１ないし１０個のアミノ酸の追加・欠失、保存的アミノ酸置換、またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列に対し、１ないし１０個のアミノ酸の追加・欠失、保存的アミノ酸置換、またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３，６３，６４，６５，６６または６７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、並びに配列番号５、及び配列番号６８ないし８２によってなる群のうちから選択されたアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＨＣＤＲ変異体を含み、フレームワーク領域（framework region）及び不変領域（constant region）を含む、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、軽鎖可変領域は、配列番号７，６０，８３または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＬＣＤＲ変異体を含み、フレームワーク領域及び不変領域を含む、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８で表されているような配列を含むか、あるいはそれら配列と比較し、１ないし１０個以下のアミノ酸突然変異を有する変異体を含む、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９で表されているような配列を含むか、あるいはそれら配列と比較し、１ないし１０個以下のアミノ酸突然変異を有する変異体を含む、単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるアミノ酸配列を有する、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるアミノ酸配列を有する、単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列に対し、１ないし１０個のアミノ酸の追加・欠失、保存的アミノ酸置換、またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列に対し、１ないし１０個のアミノ酸の追加・欠失、保存的アミノ酸置換、またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、抗体接合体、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド及び／または免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチドを含む、ＰＤ－１タンパク質結合剤（binding agent）を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容によるＰＤ－１タンパク質結合剤が、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ（diabody）、Ｆ（ａｂ’）_２，Ｆａｂ’，Ｆａｂ，Ｆｖ，ｓｃＦｖ，ｓｃＦＶダイマー（dimer）、ＢｓＦｖ，ｄｓＦｖ，（ｄｓＦｖ）_２，ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’，Ｆｖ断片、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ミニボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、ｄＡｂ、及び一本鎖結合ポリペプチドから選択された抗体またはその抗原結合断片であるＰＤ－１タンパク質結合剤を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を含む単離または精製されたポリヌクレオチド分子を提供する。

本開示内容は、他の一側面において、本開示内容による、免疫グロブリン重鎖可変領域のポリペプチドを暗号化する配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含む単離または精製されたポリヌクレオチド分子を提供する。

本開示内容は、一側面において、本開示内容による、免疫グロブリン軽鎖可変領域のポリペプチドを暗号化する配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む単離または精製されたポリヌクレオチド分子を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターを提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを発現するように操作された遺伝子導入動物を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを暗号化する単離されたポリヌクレオチドが発現される条件下において、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を培養することを含む、前記任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを発現させる方法を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドと、試験対象物質とを反応させる段階、及び結合可否を測定する段階を含む、ＰＤ－１類似物質をスクリーニングする方法を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドと、試験対象物質とを反応させる段階、及び結合可否を測定する段階を含む、ＰＤ－１類似物質をスクリーニングする方法によってスクリーニングされたＰＤ－１類似物質を提供する。

本開示内容は、一側面において、ＰＤ－１ノックアウトマウスをＰＤ－１抗原で免疫化させた後、脾臓を取り出してＢリンパ球を分離させた後、骨髄腫（myeloma）細胞と融合させて得られたハイブリドーマ（hybridoma）細胞において、ＰＤ－１抗原と反応する抗体を生産するハイブリドーマを選別することを含む、抗ＰＤ－１抗体の生産方法を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による抗体生産方法によって選別されたＰＤ－１抗原と反応する抗体を生産するハイブリドーマを提供する。

本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスを提供する。

本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上、及び薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含む薬学的組成物を提供する。

前記薬学的組成物は、腫瘍、癌、転移性腫瘍、転移性癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患（neurodegenerative disease）または感染性疾患の予防、改善または治療のための薬学的組成物でもある。

本開示内容は、一側面において、前記薬学的組成物に、第２治療剤をさらに含む薬学的組成物を提供する。

本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を含む、治療用、診断用または検出用のキットを提供する。

本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を個体に投与する段階を含む、腫瘍、癌、転移性腫瘍、転移性癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患または感染性疾患を予防または治療する方法を提供する。

本開示内容は、また一側面において、個体に、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を投与することを含む、個体で免疫反応を調節する方法を提供する。

本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、またはそれを含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスを、腫瘍、癌、転移性腫瘍、転移性癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患または感染性疾患の予防剤、改善剤または治療剤を製造するのに使用する用途を提供する。

本開示内容は、また一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を、腫瘍細胞の成長を抑制するために、治療学的に有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の成長を抑制する方法を提供する。

他の態様は、本願の詳細な説明、及び当業界の技術常識から明らかであろう。

本開示内容による、ＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、またはそれを含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスは、ヒトＰＤ－１タンパク質に結合し、免疫反応調節のために使用されうる。それらは、例えば、ＰＤ－１を発現するＴ細胞を標的化し、ＰＤ－１活性を調節するのに有用である。例えば、腫瘍、癌、転移性腫瘍、転移性癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患（neurodegenerative disease）または感染性疾患の予防または治療のために使用されうる。

また本開示内容による、前記ＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドは、ヒトＰＤ－１だけではなく、マウスＰＤ－１にも結合することができ、前臨床段階において、抗体の効能、薬物動力学的特性、毒性などをマウスで確認することができ、抗体製剤や、それを含む複合製剤の効率的な開発に重要な役割を行うことができる。

本開示内容の効果は、そのような文言的記載だけに限定されるものではなく、通常の技術者が本開示内容を介して類推することができるものまでいずれも含む。

酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）を使用し、本開示内容による、ハイブリドーマ１Ｇ１抗体の細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する結合テストを実施した結果のグラフである。流細胞分析（flow cytometry）を使用し、本開示内容による、ハイブリドーマ１Ｇ１抗体の細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する結合テストを実施した結果のグラフである。細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する、それぞれヒトＰＤ－Ｌ１結合またはマウスＰＤ－Ｌ１結合につき、ＥＬＩＳＡを使用し、本開示内容のハイブリドーマ１Ｇ１抗体の遮断（blocking）テストを実施した結果を示したグラフである。細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する、それぞれヒトＰＤ－Ｌ１結合またはマウスＰＤ－Ｌ１結合につき、流細胞分析（flow cytometry）を使用し、本開示内容のハイブリドーマ１Ｇ１抗体の遮断テストを実施した結果を示したグラフである。精製されたハイブリドーマ１Ｇ１抗体及びキメリック１Ｇ１抗体（キメリック１Ｇ１）を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。ＥＬＩＳＡを使用し、精製されたハイブリドーマ１Ｇ１抗体の細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する結合テストを実施した結果のグラフである。本開示内容の、単一クローン細胞（ハイブリドーマ）１Ｇ１抗体のヒトＴ細胞表面免疫チェックポイントに対する選択的結合いかんをＥＬＩＳＡで試験した結果である。ヒト化１Ｇ１抗体３種（ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６１，１Ｇ１－ｈ６８，１Ｇ１－ｈ７０）それぞれの重鎖アミノ酸配列を示した図である。前記配列は、リーダー配列（leader sequence）－ＶＨ／ＶＬ（太字及び下線による表示）－ｈＩｇＧ４ＣＨ／ｈＩｇｋａｐｐａＣＬの形態で示されている。ヒト化１Ｇ１抗体３種（ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６１，１Ｇ１－ｈ６８，１Ｇ１－ｈ７０）それぞれの軽鎖アミノ酸配列を示した図である。前記配列は、リーダー配列（leader sequence）－ＶＨ／ＶＬ（太字及び下線による表示）－ｈＩｇＧ４ＣＨ／ｈＩｇｋａｐｐａＣＬの形態で示されている。ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６１の重鎖核酸配列を示した図である。前記配列は、リーダー配列（leader sequence）－ＶＨ／ＶＬ（太字及び下線による表示）－ｈＩｇＧ４ＣＨ／ｈＩｇｋａｐｐａＣＬ－終結コドン（イタリック体）の形態で示されている。ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６８の重鎖核酸配列を示した図である。前記配列は、リーダー配列（leader sequence）－ＶＨ／ＶＬ（太字及び下線による表示）－ｈＩｇＧ４ＣＨ／ｈＩｇｋａｐｐａＣＬ－終結コドン（イタリック体）の形態で示されている。ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ７０の重鎖核酸配列を示した図である。前記配列は、リーダー配列（leader sequence）－ＶＨ／ＶＬ（太字及び下線による表示）－ｈＩｇＧ４ＣＨ／ｈＩｇｋａｐｐａＣＬ－終結コドン（イタリック体）の形態で示されている。ヒト化１Ｇ１抗体３種（ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６１，１Ｇ１－ｈ６８，１Ｇ１－ｈ７０）それぞれの軽鎖核酸配列を示した図である。前記配列は、リーダー配列（leader sequence）－ＶＨ／ＶＬ（太字及び下線による表示）－ｈＩｇＧ４ＣＨ／ｈＩｇｋａｐｐａＣＬ－終結コドン（イタリック体）の形態で示されている。本開示内容による、ヒト化１Ｇ１抗体のヒトＰＤ－１に対する結合動力学を示した図である。本開示内容による、ヒト化１Ｇ１抗体のヒトＰＤ－１に係わる親和度を、ｋａ値（Ｋｏｎ）、ｋｄ値（Ｋｏｆｆ）、ＫＤ値を介して示したグラフである。ＥＬＩＳＡを使用し、ヒト、マウス、ウサギ、シノモルグス（cynomolgus）サル及びラットそれぞれの細胞外ドメインＰＤ－１抗原に対する本開示内容による１Ｇ１抗体（キメリック１Ｇ１抗体、ヒト化１Ｇ１抗体）の選択的結合いかん（交差反応性（cross－reactivity））を試験した結果のグラフである。１Ｇ１抗体の抗癌効果確認のための動物実験スケジュールを図示した図である。マウス黒色腫モデルにおいて、１Ｇ１抗体投与による経時的な腫瘍サイズ変化を示したグラフである。マウス黒色腫モデルにおいて、１Ｇ１抗体投与による経時的な生存率を示したグラフである。ＭＣ３８大腸癌シンジェニック（syngeneic）マウスモデルにおいて、１Ｇ１抗体投与による経時的な相対的腫瘍サイズ変化と腫瘍成長抑制率とを示した図である。ヒト化１Ｇ１抗体、キイトルーダ及びオプジーボのヒトＰＤ－１への結合領域を図示した図である。本開示内容による、ヒト化１Ｇ１抗体のｐＨ６．０におけるヒトＰＤ－１に対する結合動力学を示した図である。本開示内容による、ヒト化１Ｇ１抗体のｐＨ６．０におけるヒトＰＤ－１に係わる親和度を、ｋａ値（Ｋｏｎ）、ｋｄ値（Ｋｏｆｆ）、ＫＤ値を介して示したグラフである。

本開示内容の記載前、本開示内容は、特定方法、及び記載された実験条件が、可変的なものでもあるので、そのような方法及び条件に制限されるものではないと理解されなければならない。本願に使用されている用語は、本開示内容の範囲が、ただ添付された特許請求の範囲によってのみ制限されるものであるために、単に特定態様を記載するためのものであり、特許請求の範囲を制限すると意図されるものではない。

取り立てて定義されない限り、本願に使用された全ての技術用語及び科学用語は、本開示内容が属する分野の通常の技術者により、一般的に理解されるところと同一の意味を有する。本願に記載されたところと類似しているか、あるいは同等な任意の方法及び物質が、本開示内容の実行または試験に使用されうる。本願に言及された全ての文献は、その全文が本願に参照として含まれる。

本開示内容の用語「プログラムされた細胞死滅１」、「ＰＤ－１」、「ＰＤ－１タンパク質」は、相互交換的に使用され、変異体、同型、ヒトＰＤ－１の種相同体、及び少なくとも一つのＰＤ－１との共通したエピトープを有する類似体を含む。ＰＤ－１は、ＣＤ２７９でも公知されたＴ細胞共阻害剤である。

本開示内容の用語「結合分子」または「結合剤」は、抗体、その抗原結合断片、それらの他の分子との接合体であるものを含む。

本開示内容の用語「抗体」は、全体抗体、及び任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分（portion）」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、二硫化結合（disulfide bond）によって相互連結された少なくとも２つの重鎖、及び２つの軽鎖を含む、タンパク質またはその抗原結合部分を称する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖不変領域によって構成される。該重鎖不変領域は、３つのドメイン；ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３によって構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖不変領域によって構成される。該軽鎖不変領域は、１つのドメイン；ＣＬによって構成される。該重鎖可変領域（ＶＨ）及び該軽鎖可変領域（ＶＬ）は、さらには、相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）と呼ばれる過変異性（hypervariability）領域に細分化され、それは、より保存的なフレームワーク領域（ＦＲ：framework region）と呼ばれる領域間に配されている。それぞれのＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ、及び４つのＦＲによってなり、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４．重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

本開示内容において「抗体」は、免疫グロブリン、あるいはその断片または誘導体を称し、それが試験管内で生産されても、生体内で生産されてもよく、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。前記用語は、多クローン性抗体、単一クローン性抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメリック（chimeric）抗体、合成抗体、組み換え抗体、雑種（hybrid）抗体、突然変異抗体及びグラフト（grafted）抗体を含むが、それらに制限されるものではない。前記用語「抗体」は、また抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）_２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｄ、ｄＡｂ、及び抗原結合機能、すなわち、ＰＤ－１に特異的に結合する能力を維持する他の抗体断片を含む。典型的には、そのような断片は、抗原結合断片を含むものである。

本開示内容の用語「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」及び「結合断片」は、抗体と抗原との特異的結合の原因であるアミノ酸を含む抗体分子の一部を称する。例えば、抗原が大きい場合、該抗原結合断片は、ただ抗原の一部にだけ結合しうる。該抗原分子の抗原結合断片との特異的相互作用の原因になる部分を「エピトープ」または「抗原決定因子（antigenic determinant）」と称する。

抗原結合断片は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むものでもあるが、必須的に二つとも含まなければならないものではない。例えば、いわゆる、Ｆｄ抗体断片は、ただＶＨドメインだけによって構成されるが、依然として完全な抗体の抗原結合機能の一部を維持する。

用語「エピトープ」は、抗原決定因子を定義し、それは、前述のところで定義されたように、結合断片により、特異的に結合／同定される。該結合断片は、標的構造、例えば、ヒトＰＤ－１及び齧歯類ＰＤ－１につき、固有な構造的なエピトープ、または連続したエピトープと特異的に結合／相互作用しうる。構造的または非連続的なエピトープは、一次配列で分離されるが、ポリペプチドが天然タンパク質（native protein）／抗原に折り畳まれるとき、分子の表面上に合わされる２個以上の不連続アミノ酸残基の存在により、ポリペプチド抗原と特徴づけられる。エピトープに寄与する２以上の不連続アミノ酸残基は、１以上のポリペプチド鎖の単離された区画上に存在する。この残基は、ポリペプチド鎖が三次元構造に折り畳まれてエピトープを構成するとき、分子の表面上に合わされる。対照的に、連続的エピトープまたは線形エピトープは、ポリペプチド鎖の単一線形セグメント（segment）内に存在する、２個以上の連続のアミノ酸残基によって構成される。

用語「ＰＤ－１のエピトープに結合する」は、抗体がＰＤ－１の特定エピトープに対して特異的結合を有するということを称し、該エピトープは、線形アミノ酸配列、またはＰＤ－１ポリペプチドの一部上の三元、すなわち、三次元の構造によって定義されうる。該特異的結合は、ＰＤ－１部分に対する抗体親和性が、他の関連ポリペプチドに対するそれらの親和性より実質的にさらに大きいということを意味する。

用語「高い親和性」は、他の関連ポリペプチドに対する親和性と比較し、ＰＤ－１の部分に対する親和性において、測定可能な増大があることを意味する。望ましくは、前記親和性は、他のタンパク質に対し、さらに、ＰＤ－１の特定部分につき、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０^２倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍以上である。結合親和性は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）によったり、蛍光活性化細胞分類分析法（ＦＡＣＳ）または表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によったりして決定されうる。

本開示内容の用語「交差反応性（cross-reactivity）」は、本願に記載された抗原断片の、ヒト及び齧歯類（マウスまたはラット）における同一標的分子への結合を称する。従って、「交差反応性（cross-reactivity）」は、異なる種で発現される同一分子×に係わるものであるが、しかしながら、×以外の他の分子に係わるものではない、種間反応性（interspecies reactivity）として理解されなければならない。例えば、ヒトＰＤ－１を認識する単一クローン性抗体の齧歯類（マウスまたはラット）ＰＤ－１における交差種特異性は、例えば、ＦＡＣＳ分析によっても決定される。

本開示内容の「個体」、「対象」は、疾患の治療を必要とする対象を意味し、さらに具体的には、ヒト、または非ヒトである霊長類、ラット、マウス、犬、猫、馬及び牛のような哺乳類を意味する。

本開示内容の「治療」は、本開示内容による、薬学的組成物の投与により、疾患に対する症状が好転したり、好ましく変更される全ての行為を意味する。治療には、予防も含まれる。治療が必要なのは、すでに特定の医学的障害を有している個体だけではなく、結局、障害を得ることになる個体を含む。

本開示内容の「改善」とは、治療される状態と係わるパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも低減させる全ての行為を意味する。

以下においては、本開示内容を実施するための内容について、具体的実施例について、添付図面を参照し、詳細に説明する。従来技術と異ならない部分であり、本開示内容の技術的思想の理解に必要ではない事項は、説明から除く。

例示的な抗ＰＤ－１抗体及びＰＤ－１結合剤など
本開示内容は、一側面において、ＰＤ－１タンパク質に結合する抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を開示し、該抗体または該抗原結合断片は、重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域を含み、
該重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３，６３，６４，６５，６６または６７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、並びに配列番号５、及び配列番号６８ないし８２によってなる群のうちから選択されたアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＨＣＤＲ変異体を含み、
該軽鎖可変領域は、配列番号７，６０，８３または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＬＣＤＲ変異体を含む。

一部具現例において、前述の「３個以下のアミノ酸突然変異」は、３個、２個、１個または０個のアミノ酸突然変異を意味する。

一部具現例において、本開示内容の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＰＤ－１とマウスＰＤ－１とに同等なレベルの結合力を有する抗体またはその抗原結合断片でもある。

一部具現例において、本開示内容の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＫＤ値１０^－７Ｍ以下でＰＤ－１に結合し、一部具現例において、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍまたは１０^－１１Ｍ以下のＫＤ値でもってＰＤ－１に結合する。

一部具現例において、本開示内容の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、低いｐＨ環境においても、ＫＤ値１０^－９Ｍ以下、望ましくは、ＫＤ値１０^－１０Ｍ以下、さらに望ましくは、ＫＤ値１０^－１１Ｍ以下でＰＤ－１に結合する。一部具現例において、本開示内容の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ６．０において、９ｘ１０^－１０Ｍ以下のＫＤでもってＰＤ－１に結合する。

本開示内容は、一側面において、配列番号７，６０，８３または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＬＣＤＲ変異体を含む、単離された免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容において「単離された」は、天然環境の成分から分離されたものを言う。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であるアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であるアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。

ポリペプチドに係わる配列類似性は、一般的に、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、多様な置換、欠失及び他の変形に割り当てられた類似性尺度を使用し、類似した配列をマッチングする。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の有機体起源の同族ポリペプチドのような密接に係わるポリペプチド間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質（mutein）との配列相同性または配列同一性を決定するためのデフォルトパラメータ（default parameter）と共に使用されうるＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照する。ポリペプチド配列を、さらにデフォルト、または勧められたパラメータを有するＦＡＳＴＡを使用して比較することができ、ＧＣＧバージョン６．１．ＦＡＳＴＡ（例：ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）のプログラムは、クエリー（query）と検索配列との最適重畳領域の整列、及びパーセント配列同一性を提供する。本開示内容の配列を、異なる有機体起源の多数配列を含むデータベースと比較する場合、他の望ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれが本願に参照として含まれた文献（参照：Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410；及びAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）を参照する。

同一ではない残基位置は、例えば、保存的アミノ酸置換によっても異なる。

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した化学的特性（例：電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒグループ）を有する他のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般的に、該保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないのである。２個以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、類似率または類似度は、置換の保存的性質に対して補正されるように上向きに調整されうる。そのような調整のための手段は、当業者に十分に公知されている。例えば、本願に参照として含まれている文献（参照：Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331）を参照する。類似した化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸グループの例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸；及び７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンを含む。望ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン・ロイシン・イソロイシン、フェニルアラニン・チロシン、リシン・アルギニン、アラニン・バリン、グルタミン酸・アスパラギン酸及びアスパラギン・グルタミンである。代案としては、保存的代替は、本願に参照として含まれた文献（参照：Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45）に開示されたＰＡＭ２５０ログ可能性マトリックス（log-likelihood matrix）において、正値を有する任意の変化である。「中程度（moderately）保存的」代替は、ＰＡＭ２５０ログ可能性マトリックスにおいて、非負（nonnegative）値を有する任意の変化である。

本開示内容は、一側面において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３，６３，６４，６５，６６または６７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、並びに配列番号５、及び配列番号６８ないし８２によってなる群のうちから選択されたアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＨＣＤＲ変異体を含み、フレームワーク領域（framework region）及び不変領域（constant region）を含む、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号７，６０，８３または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含むか、あるいはそれら配列と比較し、保存的アミノ酸置換、または３個以下のアミノ酸突然変異を有するＬＣＤＲ変異体を含み、フレームワーク領域及び不変領域を含む、ＰＤ－１に結合する単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であるアミノ酸配列を有する、単離された免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上であるアミノ酸配列を有する、単離された免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列に対し、１個ないし１０個のアミノ酸の追加・欠失、保存的アミノ酸置換、またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを提供する。

本開示内容は、一側面において、配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列に対し、１個ないし１０個のアミノ酸の追加・欠失、保存的アミノ酸置換、またはそれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を有する、ＰＤ－１に結合する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを提供する。

一部具現例において、本開示内容の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、組み換え抗体、望ましくは、ミュリン（murine）抗体、キメリック（chimeric）抗体またはヒト化（humanized）抗体でもある。

一部具現例において、本開示内容のキメリック抗ＰＤ－１抗体またはヒト化抗ＰＤ－１抗体の重鎖不変領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３またはヒトＩｇＧ４、あるいはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の突然変異体配列に由来し、軽鎖不変領域は、ヒトカッパ鎖、ヒトラムダ鎖、またはその突然変異体配列に由来しうる。

本開示内容の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の一部具現例において、抗体は、キメラ抗体であり、抗体の不変領域（constant region）は、ヒト抗体の不変領域またはその突然変異体に由来しうる。

本開示内容の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の一部具現例において、抗体は、ヒト化抗体であり、抗体の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ：framework region）及び重鎖フレームワーク領域は、それぞれヒト生殖腺（germline）の軽鎖及び重鎖、またはその突然変異体配列に由来する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、抗体接合体、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び／または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド及び／または免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチドを含むＰＤ－１タンパク質結合剤（binding agent）を提供する。

前記ＰＤ－１タンパク質結合剤は、例えば、抗体、抗体接合体またはその抗原結合断片でもあるが、それらに限定されるものではない。

一部具現例において、本開示内容は、ＰＤ－１への結合のために、前述の任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドと競争するか、あるいはＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片と同一のＰＤ－１エピトープに結合する、単離されたＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を提供する。

抗原結合断片
本開示内容は、一側面において、前記本開示内容によるＰＤ－１タンパク質結合剤は、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、Ｆ（ａｂ’）_２，Ｆａｂ’，Ｆａｂ，Ｆｖ，ｓｃＦｖ，ｓｃＦＶダイマー、ＢｓＦｖ，ｄｓＦｖ，（ｄｓＦｖ）_２，ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’，Ｆｖ断片、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ミニボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、ｄＡｂ、及び一本鎖結合ポリペプチドのうちから選択された抗体またはその抗原結合断片でもあるが、それらに制限されるものではない。

取り立てて具体的に指示されない限り、本願に使用された用語「抗体」は、２個の免疫グロブリン重鎖、及び２個の免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）だけではなく、その抗原結合断片を含む。本願に使用された用語、抗体の「抗原結合部位」、抗体の「抗原結合断片」などは、抗原と特異的に結合し、複合体を形成する任意の天然発生の、酵素でもって得ることができる、合成の、または遺伝的に操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本願に使用された用語、抗体の「抗原結合断片」または「抗体断片」は、ＰＤ－１に特異的に結合する能力を保有する抗体の１以上の断片を示す。該抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含む断片、または単離されたＣＤＲを含むものでもある。特定態様において、用語「抗原結合断片」は、多重特異的抗原結合分子のポリペプチド断片を示す。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメイン及び（任意に）抗体不変ドメインをコーディングするＤＮＡの操作及び発現を伴うタンパク質分解消化技術または組み換え遺伝的操作技術のような任意の適する標準技術を使用し、完全抗体分子から誘導されうる。そのようなＤＮＡは、公知され、かつ／あるいは、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に利用可能であったり合成されたりしうる。該ＤＮＡは、例えば、１以上の可変ドメイン及び／または不変ドメインを適する立体配置に配するか、あるいはコドンを取り入れたり、システイン残基を生成したり、アミノ酸を変形・添加または欠失させるようなことのために配列分析され、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって操作されうる。

抗原結合断片の非制限的な例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）_２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｄ、ｄＡｂ、及び抗体の超可変（hypervariable）領域を模倣するアミノ酸残基によってなる最小認識単位（例：単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＣＤＲ３ペプチド）、または束縛されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを含む。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失された抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ－グラフティングされた抗体、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、ミニボディ（minibody）、ナノボディ（nanobody）（例：一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰｓ：small modular immunopharmaceuticals）及びシャーク可変（shark variable）ＩｇＮＡＲドメインも、また本願に使用された表現「抗原結合断片」内に含まれる。

抗体の抗原結合断片は、一般的に、少なくとも１つの可変ドメインを含むものである。該可変ドメインは、任意の大きさ、または任意のアミノ酸組成を有することができ、一般的に、１以上のフレームワーク配列に隣接するか、あるいは１以上のフレームワーク配列と共に、フレーム（frame）内にある少なくとも１つのＣＤＲを含むものである。ＶＬドメインと結合されたＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、互いに対し、任意の適する配列に位置されうる。例えば、可変領域は、二量体でもあり、ＶＨ－ＶＨ，ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含む。代案としては、抗体の抗原結合断片は、単量体ＶＨドメインまたは単量体ＶＬドメインを含むものでもある。

特定態様において、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの不変ドメインに共有連結された少なくとも１つの可変ドメインを含むものでもある。本開示内容の、抗体の抗原結合断片内で発見されうる可変ドメイン及び不変ドメインの非制限的であり、例示的な立体配置は、（i）ＶＨ－ＣＨ１、（ii）ＶＨ－ＣＨ２、（iii）ＶＨ－ＣＨ３、（iv）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（v）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（vi）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（vii）ＶＨ－ＣＬ、（viii）ＶＬ－ＣＨ１、（ix）ＶＬ－ＣＨ２、（x）ＶＬ－ＣＨ３、（xi）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（xii）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（xiii）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３及び（xiv）ＶＬ－ＣＬを含む。前述の列挙された例示的な立体配置のうちいずれかを含む、可変ドメイン及び不変ドメインの任意の立体配置において、可変ドメイン及び不変ドメインは、互いに直接連結されうるか、あるいは完全ヒンジまたは部分的ヒンジ、あるいはリンカ領域によって連結されうる。該ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子において、隣接した可変ドメイン及び／または不変ドメインの間の可撓性連結または半可撓性連結をもたらす少なくとも２個（例：５，１０，１５，２０，４０，６０個以上）のアミノ酸によってもなる。さらに、本開示内容の抗体の抗原結合断片は、互い、及び／または１以上の単量体ＶＨドメインまたは単量体ＶＬドメインと、非共有結合または共有結合により（例えば、二硫化結合により）、前述の列挙された可変ドメイン及び不変ドメインの立体配置のうちいずれのホモダイマーまたはヘテロダイマー（または、他の多量体）を含むものでもある。完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異的または多重特異的（例：二重特異的）でもある。抗体の多重特異的抗原結合断片は、一般的に、少なくとも２個の異なる可変ドメインを含むものであり、ここで、それぞれの可変ドメインは、別個の抗原上、または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合しうる。本願に開示された例示的な二重特異的抗体フォーマットを含む、任意の多重特異的抗体フォーマットは、当該分野で使用可能な日常的な技術を使用し、本開示内容の抗体の抗原結合断片の脈絡における使用にも合わせられる。

例示的な抗ＰＤ－１抗体及び結合剤などを暗号化する核酸
本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を含む単離または精製されたポリヌクレオチド分子を提供する。

例示的な抗ＰＤ－１抗体及び結合剤などの製造
本開示内容の一側面において、ＰＤ－１ノックアウトマウスをＰＤ－１抗原で免疫化させた後、脾臓を取り出してＢリンパ球を分離させた後、骨髄腫（myeloma）細胞と融合させて得られたハイブリドーマ細胞において、ヒトＰＤ－１抗原と反応する抗体を生産するハイブリドーマを選別することを含む抗体の生産方法を提供する。

また、本開示内容の一側面において、前記抗体生産方法によって製造されたハイブリドーマを提供する。

一実施態様において、宿主細胞は、（１）本開示内容による、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、または（２）本開示内容による、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドを含む第１ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドを含む第２ベクターを含む（例えば、それらベクターでもって形質転換されている）。

一実施態様において、前述のところで提供されているような、ＰＤ－１に結合する抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、抗体発現に適する条件下で培養し、選択的に、抗体を宿主細胞（または、宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗ＰＤ１抗体の製造方法が提供される。

抗体暗号化ベクターのクローニングまたは発現に適する宿主細胞としては、原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃ作動因子機能が必要ではない場合、細菌で生成されうる。細菌において、抗体断片、及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照することができる。また、Ｅ．coliにおいて、抗体断片の発現を記述している文献［Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254］を参照することができる。該抗体は、発現後、可溶性分画において、細菌細胞ペーストから単離され、さらに精製されうる。原核細胞以外に、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的または完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の生成を引き起こす真菌及び酵母菌株を含み、糸状菌または酵母のような真核微生物も、抗体暗号化ベクターに適するクローニングまたは発現の宿主である（文献［Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215］参照）。

グリコシル化抗体の発現に適する宿主細胞は、また多細胞有機体（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。特に、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞の形質感染のために、昆虫細胞と共に使用されうる多くのバキュロウイルス菌株が同定された。植物細胞培養物も、また宿主として使用されうる（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号及び米国特許第６，４１７，４２９号（遺伝子移植植物において、抗体を生成するためのプランティボディ（PLANTIBODIES）^TM技術について説明している）参照）。

脊椎動物細胞も、また宿主として使用されうる。例えば、懸濁液で成長するのに適する哺乳動物細胞株が有用でもある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓細胞株（例えば、文献［Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74］に記述されているような２９３細胞または２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（sertoli）細胞（例えば、文献［Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252］に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）、犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、文献［Mather, J. P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68］に記述されているようなＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞［Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220］を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が含まれる。抗体生成に適する特定哺乳動物宿主細胞株の検討のためには、例えば、文献［Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268］を参照することができる。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを発現するように操作された遺伝子導入動物を提供する。前記動物は、例えば、マウス、ラットのような齧歯類でもある。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドと、試験対象物質とを反応させる段階、及び結合いかんを測定する段階を含む、ＰＤ－１類似物質をスクリーニングする方法を提供する。

本開示内容は、一側面において、前記本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドと、試験対象物質とを反応させる段階、及び結合いかんを測定する段階を含む、ＰＤ－１類似物質をスクリーニングする方法によってスクリーニングされたＰＤ－１類似物質を提供する。

多重特異的抗原結合分子、免疫接合体
本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスを提供する。

抗体の多重特異的（例えば、二重特異的）抗原結合分子は、一般的に、少なくとも２個の異なる可変ドメインを含むものであり、ここで、それぞれの可変ドメインは、別個の抗原、または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合しうる。二重特異的抗体フォーマットを含む、任意の多重特異的抗体フォーマットは、当該分野において使用可能な日常的な技術を使用し、本開示内容の抗体の抗原結合断片の脈絡における使用に合わせられうる。

一側面において、本開示内容は、多重特異的抗原結合分子またはその抗原結合断片を含み、ここで、免疫グロブリンの１つの特異性は、ＰＤ－１の細胞外ドメインまたはその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他の特異性は、ＰＤ－１の細胞外ドメイン以外のドメインの結合、または第２治療標的に特異的であるか、あるいは治療的モイエティに接合される。免疫グロブリンの他の特異性は、第２標的抗原に特異的でもある。前記第２標的抗原は、ＰＤ－１と同一の細胞上、または異なる細胞上に存在しうる。一態様において、該第２標的細胞は、Ｂ細胞、抗原伝達細胞、単核球、大食細胞または樹枝状細胞のようなＴ細胞以外の免疫細胞上にある。一部態様において、該第２標的抗原は、腫瘍細胞上、自己免疫組織細胞上、またはウイルス感染された細胞上に存在しうる。

他の側面において、本開示内容は、ＰＤ－１に結合する第１抗原結合特異性、及びＴ細胞受容体、Ｂ細胞受容体またはＦｃ受容体に結合する第２抗原結合特異性を含む多重特異的抗原結合分子またはその抗原結合断片を提供する。関連側面において、本開示内容は、ＰＤ－１に結合する第１抗原結合特異性、及びＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＣＤ－２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ及びＣＤ１６０のような異なるＴ細胞共阻害剤に結合する第２抗原結合特異性を含む多重特異的抗原結合分子またはその抗原結合断片を提供する。

さらに他の側面において、本開示内容は、ＰＤ－１に結合する第１抗原結合特異性、及び自己免疫組織特異的抗原に結合する第２抗原結合特異性を含む多重特異的抗原結合分子またはその抗原結合断片を提供する。特定態様において、前記抗体は、活性化または作用剤の抗体でもある。

本開示内容の多重特異的抗原結合分子のうちいずれか、またはその変異体は、当業者に公知されているような標準分子生物学的技術（例：組み換えＤＮＡ技術及びタンパク質発現技術）を使用して作製されうる。

一部態様において、ＰＤ－１特異的抗体は、ＰＤ－１の異なるドメインに結合する可変領域が共に連結され、単一結合分子内において、二重ドメイン特異性を提供する二重特異的フォーマット（「二重特異的」）に生成される。適切にデザインされた二重特異的抗体は、特異性及び結合活性（binding avidity）のいずれも増大させることにより、全般的なＰＤ－１抑制効能を増進させることができる。１つのドメイン内の異なる領域に結合しうるか、あるいは個々のドメイン（例：Ｎ末端ドメインの分節）に対する特異性を有する可変領域は、それぞれの領域を、別個のエピトープ、または１つのドメイン内の異なる領域に同時に結合させる構造的フレームワークで対をなす。

二重特異的抗体に係わる１つの例として、重鎖可変領域（ＶＨ）に係わる最初の特異性を破壊せずに、最初のＶＨと対をなすことができる非同族（non-cognate）ＶＬパートナーを識別するように、１つのドメインに係わる特異性を有する結合剤からのＶＨは、第２ドメインに係わる特異性を有する一連の結合剤からの軽鎖可変領域（ＶＬ）と組み換えられる。そのような方式により、単一ＶＬ分節（例：ＶＬ１）は、２個の異なるＶＨドメイン（例：ＶＨ１及びＶＨ２）と組み合わさり、２個の結合「アーム（arm）」（ＶＨ１－ＶＬ１及びＶＨ２－ＶＬ１）によって構成された二重特異的抗体を生成することができる。単一ＶＬ分節の使用は、前記システムの複雑性を低減させるので、二重特異的抗体を生成するのに使用されるクローニング、発現及び精製の工程において効率を上昇させる（例えば、米国特許第１３／０２２７５９号及び米国特許第２０１０／０３３１５２７号参照）。

代案としては、１個以上のドメイン、及び第２標的と結合する抗体、例えば、非制限的に、第２の異なる抗ＰＤ－１抗体は、本願に記載された技術、または当業者に公知された他の技術を使用し、二重特異的フォーマットに製造されうる。異なる領域に結合する抗体可変領域を、例えば、ＰＤ－１の細胞外ドメイン上の関連部位に結合する可変領域と共に連結し、単一結合分子内に、二重抗原特異性を提供することができる。そのような特性の適切にデザインされた二重特異的抗体は、二重機能を行う。細胞外ドメインに係わる特異性を有する可変領域は、細胞外ドメイン以外のドメインに係わる特異性を有する可変領域と組み合わされ、それぞれの可変領域を別個の抗原に結合させる構造的フレームワークにおいて対をなす。

本開示内容の脈絡で使用されうる例示的な二重特異的抗体フォーマットは、第１免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２ＩｇＣＨ３ドメインの使用を伴い、ここで、前記第１ＩｇＣＨ３ドメイン及び前記第２ＩｇＣＨ３ドメインは、互いに少なくとも１つのアミノ酸によって異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差は、アミノ酸差がない二重特異的抗体と比較し、タンパク質Ａに対する二重特異的抗体の結合を低減させる。

一態様において、前記第１ＩｇＣＨ３ドメインは、タンパク質Ａと結合し、前記第２ＩｇＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ変形（ＩＭＧＴエクソンナンバリング（numbering）によるが、ＥＵナンバリングによっては、Ｈ４３５Ｒ）のように、タンパク質Ａ結合を低減させたり、廃止させたりする突然変異を含む。前記第２ＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ変形（ＩＭＧＴナンバリングによるが、ＥＵナンバリングによっては、Ｙ４３６Ｆ）をさらに含むものでもある。第２ＣＨ３内で発見されうるさらなる変形は、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴナンバリングによるが、ＥＵナンバリングによっては、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ及びＶ４２２Ｉ）を含み、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴナンバリングによるが、ＥＵナンバリングによっては、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ及びＶ４２２Ｉ）を含み、ＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴナンバリングによるが、ＥＵナンバリングによっては、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ及びＶ４２２Ｉ）を含む。前述の二重特異的抗体フォーマットに係わる変形も、本開示内容の範囲内で考慮される。

本開示内容の脈絡で使用されうる他の例示的な二重特異的フォーマットは、例えば、ｓｃＦｖ基盤またはダイアボディの二重特異的フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合物、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Quadroma）、ＫＩＨ（knobs-into-holes）、一般的な軽鎖（例：ＫＩＨを有する一般的な軽鎖など）、CrossMab、CrossFab、（ＳＥＥＤ）body、ロイシンジッパー（zipper）、デュオボディ（Duobody）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、及びＭａｂ２二重特異的フォーマット（前記フォーマット検討のために、例えば、Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11、及び本願に引用された参照文献を参照する）を制限なしに含む。二重特異的抗体は、またペプチド／核酸接合を使用しても作製され、例えば、ここで、直交化学的反応性（orthogonal chemical reactivity）を有する非天然アミノ酸は、部位特異的抗体・オリゴヌクレオチド接合体を生成し、続けて、定義された組成、原子価（valency）及び幾何学を有する多量体複合体に自己組織化するのに使用される（参照：例えば、Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012])］）。

本開示内容は、癌を治療する化学療法剤または細胞毒素のような治療的モイエティに接合されたヒト抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（「免疫接合体」）を含む。本願に使用されているように、用語「免疫接合体」は、細胞毒素、放射能剤、サイトカイン、インターフェロン、標的モイエティまたはレポーターモイエティ、酵素、毒素、ペプチドまたはタンパク質、あるいは治療剤に化学的または生物学的に連結された抗体を示す。前記抗体は、その標的と結合しうる一分子により、いかなる位置においても、細胞毒素、放射能剤、サイトカイン、インターフェロン、標的モイエティまたはレポーターモイエティ、酵素、毒素、ペプチド、あるいは治療剤に連結されうる。該免疫接合体の例は、抗体薬物接合体及び抗体毒素融合タンパク質を含む。

抗ＰＤ－１抗体に接合されうる治療的モイエティの類型は、治療される病態、及び達成される目的とする治療効果を考慮するものである。免疫接合体を形成するのに適する物質の例は、当該分野に公知されており、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照する。

治療的投与及びその剤形
本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上、及び薬学的に許容可能な賦形剤、担体を含む薬学的組成物を提供する。

本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を個体に投与する段階を含む、腫瘍、癌、転移性腫瘍、転移性癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患または感染性疾患を予防、改善及び／または治療する方法を提供する。

本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、またはそれを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスは、特に、ＰＤ－１発現、シグナリングまたは活性と係わるか、それによって媒介されるか、ＰＤ－１とＰＤ１リガンド（例：ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）との相互作用を遮断するか、あるいはそれ以外に、ＰＤ－１活性及び／またはシグナリングを抑制することによって治療可能な任意の疾患または障害、病態の治療、予防及び／または改善に有用である。

前記本開示内容による薬学的組成物は、ＰＤ－１と関連する状態を予防、治療または改善するためのものでもある。

前記ＰＤ－１と関連する状態は、腫瘍、癌、転移性腫瘍、転移性癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患または感染性疾患でもあるが、それらに制限されるものではない。

前記ＰＤ－１と関連する状態は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腎臓癌、肝臓癌、骨癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌腫、膀胱癌、食道癌、中皮腫、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、膠芽細胞腫、子宮頸部癌、胸腺癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞癌、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔巨大Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富Ｂ細胞リンパ腫、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）陽性及びＥＢＶ陰性の移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ＥＢＶ関連彌満性巨大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽細胞リンパ腫、外部ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、非咽頭癌腫、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）関連原発性滲出リンパ腫、ホジキンリンパ腫を含む他の血液癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、脊椎腫瘍、または脳幹神経膠腫を含む中枢神経系の新生物でもあるが、それらに制限されるものではない。

本開示内容による薬学的組成物は、癌の早期段階症状または後期段階症状を治療するのに使用されうる。一態様において、本開示内容の抗体またはその断片は、転移癌を治療するのに使用されうる。本開示内容による薬学的組成物は、固体腫瘍及び血液癌（blood cancer）のいずれの腫瘍成長を低減させたり抑制させたり収縮させたりするのに有用である。特定態様において、本開示内容による薬学的組成物の処理は、被験者において、腫瘍の５０％以上の低減、６０％以上の低減、７０％以上の低減、８０％以上の低減、９０％以上の低減を引き起こす。特定態様において、前記薬学的組成物は、腫瘍の再発を予防するのに使用されうる。特定態様において、前記薬学的組成物は、癌を有する被験者において、全体生存を延長させるのに有用である。一部態様において、前記薬学的組成物は、癌を患っている患者において、長期間生存を維持させながら、化学療法または放射線療法による毒性を低減させるのに有用である。

前記ＰＤ－１と関連する状態である自己免疫疾患は、例えば、ループス、全身性紅斑性ループス、シェーグレン症侯群（Sjogren’s syndrome）、関節炎、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病（Alzheimer’s disease）、炎症性腸疾患、クローン病（Crohn’s disease）、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病（Peyronie’s disease）、セリアック病（coeliac disease）、胆嚢疾患、毛巣病（pilonidal disease）、腹膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、血管炎、手術後癒着（surgical adhesions）、脳卒中、第１型糖尿病、ライム病（lyme disease）、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症侯群（Guillain-Barre syndrome）、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病（Grave’s disease）、ＩｇＡ腎臓病、特発性血小板減少性紫班病、メニエール病（Meniere’s disease）、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症（Wegener’s granulomatosis）、他の自己免疫疾患、膵臓炎、トラウマ（手術）、移植片対宿主疾患、移植拒否反応、心筋梗塞及びアテローム性動脈硬化症のような虚血性疾患を含む心臓病、血管内凝固、骨吸収、骨多孔症、骨関節炎、歯周炎及び低塩酸症、胎児・母体間寛容の欠如と係わる不妊症（infertility related to lack of fetal-maternal tolerance）、白斑症、重度筋無力症、または全身性硬化症でもあるが、それらに制限されるものではない。

ＩＦＮ γ依存的全身性免疫反応（systemic immune response）がアルツハイマー病及び神経炎症性要素（neuroinflammatory component）を共有する他の中枢神経系病理の治療に有益であるということが提案され、国際公開特許ＷＯ２０１５／１３６５４１において、抗ＰＤ－１抗体を使用したアルツハイマー病治療用途が開示された。国際公開特許ＷＯ２０１７／２２０９９０には、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抑制性免疫チェックポイント経路の遮断は、ＩＦＮ γ－生産細胞によるＩＦＮ γの分泌を高め、増大されたＩＦＮ γ活性は、脳の脈絡膜網（choroid plexus）が、選択的な白血球輸送、Ｔ細胞及び単核球の損傷された中枢神経系への浸透、免疫細胞の神経退行性病理及び神経炎症部位への帰巣（homing）を許容するようにし、環境をあまり有害にさせず、毒性物質の除去、神経細胞の救済、再生及び修復がさらに良好になされるということが記載されている。

ＰＤ－１は、中枢神経系において、認知機能（cognitive function）、学習・記憶だけではなく、脳腫瘍、アルツハイマー病、脳卒中（stroke）、脊髄損傷（spinal cord injury）、多発性硬化症（multiple sclerosis）、膠芽腫（glioblastoma）、黒色腫（melanoma）、痛症（pain）のような中枢神経系障害と関連があると公知されている（Zunli Zaoら, "Emerging role of PD-1 in the central nervous system and brain diseases", Neurosci. Bull. 2021. 04. 20, online published）。また、ＰＤ－１は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ：amyotrophic lateral sclerosis）のような神経退行性疾患において、減退（degeneration）されると知られた網膜節細胞（retinal ganglion cell）と関連性があるということが報告された（Ling Chenら, Role of the Immune Modulator Programmed Cell Death-1 during Development and Apoptosis of Mouse Retinal Ganglion Cells, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2009, Vol. 50, No. 10, 4941-4948）。抗ＰＤ－１抗体は、アルツハイマー病モデルマウス５×ＦＡＤ及び痴呆モデルマウスにおいて、認知障害及び病理学的特徴を改善させ、神経退行性疾患に使用されうるということが公知され（Michal Schwartzら, "Potential immunotherapy for Alzheimer disease and age-related dementia", Dialogues in clinical neuroscience, 21 (1), 21, 2019）、抗ＰＤ－１抗体ニボルマブは、学習及び記憶を向上させたと報告されている（Ru-Rong Jiら, "Anti-PD-1 treatment as a neurotherapy to enhance neuronal excitability, synaptic plasticity and memory," BioRxiv, 2019. 12. 10. Htps://doi.org/10.1101.870600）。

本開示内容の一側面において、本開示内容による薬学的組成物は、ＰＤ－１と関連する状態である神経系疾患及び神経退行性疾患、例えば、認知障害、脳腫瘍、アルツハイマー病、痴呆、脳卒中（stroke）、脊髄損傷（spinal cord injury）、筋委縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症（multiple sclerosis）、膠芽腫（glioblastoma）、黒色腫（melanoma）、痛症（pain）、記憶減退の予防・改善・治療に使用されうるが、それらに制限されるものではない。

本開示内容の一側面において、本開示内容による薬学的組成物は、慢性ウイルス感染を患っている被験者を治療するのに有用である。一部態様において、本開示内容により、宿主において、ウイルス力価（viral titer）を低減させ、かつ／あるいは枯渇されたＴ細胞を取り戻すのに有用である。

前記ＰＤ－１と関連する状態の感染性疾患は、Ｂ型肝炎・Ｃ型肝炎のウイルス感染、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス類型Ｉ、単純ヘルペスウイルス類型ＩＩ、ヒト乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス伝染と関連するカポシウェスト肉腫、薄リングウイルス（トルクテノウイルス）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ＪＣウイルス感染またはＢＫウイルス感染を含む慢性ウイルス感染でもある。

一態様において、本開示内容の薬学的組成物は、シノモルグスのようなサル被験体において、サル免疫欠乏ウイルス（ＳＩＶ）による感染を治療するのに使用されうる。

一態様において、本開示内容による薬学的組成物は、疾患または障害の１以上の症状または状態を緩和するか、予防するか、あるいはその重症度を低減させるように投与されうる。癌、自己免疫疾患及び慢性ウイルス感染のような疾患または障害の発病危険にある患者において、本開示内容による薬学的組成物を予防的に使用することが本願においてさらに考慮される。

本開示内容のさらに他の態様において、本開示内容による薬学的組成物は、癌、自己免疫疾患またはウイルス感染の治療に有用な、当業者に公知された任意の他の製剤、または任意の他の療法と共に補助療法において使用されうる。

本開示内容による薬学的組成物は、適する担体、賦形剤、及び向上された運搬・伝達・耐性などを提供するように剤形内に含まれる他の製剤と共に投与されうる。多数の適切な剤形は、全ての薬剤化学者（pharmaceutical chemist）に公知された処方集（参照：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA）で確認されうる。それら剤形は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、液体、液体（陽イオンまたは陰イオン）含有小胞（vesicle）（例：リポフェクチン（Lipofectin^TM））、ＤＮＡ接合体、無水吸収ペースト、水中油エマルジョン及び油中水エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（多様な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカルボワックスを含む半固体混合物を含む（参照：Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311）。

抗体の用量は、投与される被験者の年齢及び大きさ、標的疾患、病態、投与経路などによって可変的でもある。本開示内容の抗体が、成人患者において、疾患または障害の治療、またはそのような疾患の予防に使用される場合、本開示内容の抗体を、一般的に、体重１ｋｇ当たり、約０．１ないし約６０ｍｇ、さらに望ましくは、約５ないし約６０ｍｇ、約１０ないし約５０ｍｇ、または約２０ないし約５０ｍｇの単一用量で投与することが有利である。病態の重症度により、治療頻度及び治療持続時間を調節することができる。特定態様において、本開示内容の抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも、約０．１ｍｇないし約８００ｍｇ、約１ないし約５００ｍｇ、約５ないし約３００ｍｇ、または約１０ないし約２００ｍｇ、あるいは約１０ないし約１００ｍｇ、または約１０ないし約５０ｍｇの初期用量で投与されうる。特定態様において、前記初期用量は、初期用量とほぼ同一であるか、あるいはそれよりも少量である第２用量、または多数のその後の用量の抗体またはその抗原結合断片の投与にもつながり、ここで、前述のその後の用量は、少なくとも１日ないし３日、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも５週、少なくとも６週、少なくとも７週、少なくとも８週、少なくとも９週、少なくとも１０週、少なくとも１２週、あるいは少なくとも１４週ほど離れる。

本開示内容の薬学的組成物は、多様な伝達システム、例えば、リポソーム内カプセル化、微細粒子、マイクロカプセル、突然変異ウイルスを発現させることができる組み換え細胞、受容体媒介されたエンドサイトーシス（endocytosis）に投与されうる（参照：例えば、Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432）。導入方法は、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路を含むが、それらに制限されるものではない。前記組成物は、任意の一般的な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（lining）（例：経口粘膜、直腸及び腸の粘膜など）を介する吸収によっても投与され、他の生物学的活性剤と共に投与されうる。該投与は、全身投与または局所投与でもある。

本開示内容の薬学的組成物は、また小胞、特に、リポソームに伝達することができる（参照：例えば、Langer (1990) Science 249: 1527-1533）。本開示内容の抗体を伝達するナノ粒子の使用も考慮されうる。抗体接合されたナノ粒子は、治療用途及び診断用のいずれのためにも使用される。抗体接合されたナノ粒子、その製造方法、及びその用途は、本願に参照として含まれた文献（参照：Arruebo, M., et al. 2009, "Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Volume 2009, Article ID 439389, 24 pages, doi: 10.1155/2009/439389）に詳細に記載されている。ナノ粒子を開発し、薬学的組成物に含有された抗体に接合させ、腫瘍細胞、自己免疫組織細胞、またはウイルス感染された細胞を標的化することができる。薬物伝達のためのナノ粒子は、また、例えば、それぞれ全文が本願に含まれた、米国特許第８２５７７４０号または米国特許第８２４６９９５号に記載されている。

特定状況において、本開示内容の薬学的組成物は、制御された放出システムでもって伝達されうる。一態様において、ポンプが使用されうる。他の態様において、重合体性物質が使用されうる。さらに他の態様において、制御された放出システムは、組成物の標的隣近に配され、全身用量の一部のみを必要とさせるうる。注射可能な製剤は、静脈内・皮下・皮内・頭蓋内・腹腔内及び筋肉内の注射、点滴注入（drip infusion）などのための投与型を含むものでもある。それら注射可能な製剤は、公式的に公知された方法によって製造されうる。注射可能な製剤は、例えば、前述の抗体またはその塩を、滅菌水性培地内、または注射のために一般的に使用される油性培地内に溶解させたり懸濁させたり乳化させたりすることによって製造されうる。注射用水性培地として、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、多価アルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例：ポリソルベート８０、水素化されたひまし油のＨＣＯ－５０（ポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）添加物）］などと共に使用されうる、例えば、生理食塩水、グルコースを含む等張性溶液、及び他の補助剤などでもある。油性培地として、可溶化剤、例えば、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどと共に使用されうる、例えば、胡麻油(sesame oil)、大豆油などが利用されうる。それによって製造された注射液は、望ましくは、適切なアンプルに充填される。

本開示内容の薬学的組成物は、標準ニードル（standard needle）及びシリンジにより、皮下または静脈内に伝達されうる。また、皮下伝達につき、ペン伝達装置（pen delivery device）が、本開示内容の薬学的組成物を伝達するのに手軽に使用される。そのようなペン伝達装置は、再使用可能でもあり、単回使用でもある。再使用可能なペン伝達装置は、一般的に、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての薬学的組成物が投与され、カートリッジが空になれば、空のカートリッジは、手軽に廃棄され、薬学的組成物を含む新たなカートリッジに交換されうる。該ペン伝達装置は、その後再使用されうる。単回使用ペン伝達装置においては、交換可能なカートリッジがない。その代わり、単回使用ペン伝達装置は、前記装置内の保存所に収容された薬学的組成物に事前に充填される。前記保存所に薬学的組成物が枯渇すれば、全体装置を廃棄する。多数の再使用可能なペン、及び自動注入装置（autoinjector）の伝達装置は、本開示内容の薬学的組成物の皮下伝達に使用される。例えば、オートペン（AUTOPEN^TM, Owen Mumford, Inc., Woodstock, イギリス）、ジセトロニック（DISETRONIC^TM）ペン（Disetronic Medical Systems, Burghdorf, スイス）、ヒューマログミックス（HUMALOG MIX）７５／２５^TMペン、ヒューマログ（HUMALOG^TM）ペン、ヒューマリン（HUMALIN）７０／３０^TMペン（Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN）、ノボペン（NOVOPEN^TM）Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩ（Novo Nordisk, Copenhagen, デンマーク）、ノボペンジュニア（NOVOPEN JUNIOR^TM）（Novo Nordisk, Copenhagen, デンマーク）、ＢＤ^TMペン（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、オプチペン（OPTIPEN^TM）、オプチペンプロ（OPTIPEN PRO^TM）、オプチペンスターレット（OPTIPEN STARLET^TM）及びオプチクリック（OPTICLIK^TM）（Sanofi-Aventis, Frankfurt, ドイツ）を含むが、必ずしもそれらに制限されるものではない。本開示内容の薬学的組成物の皮下伝達に使用される単回使用ペン伝達装置は、例えば、ソロスター（SOLOSTAR^TM）ペン（Sanofi-Aventis）、フレックスペン（FLEXPEN^TM）（Novo Nordisk）、クイックペン（KWIKPEN^TM）（Eli Lilly）、スレクリック（SURECLICK^TM）自動注入装置（Amgen, Thousand Oaks, CA）、ペンレット（PENLET^TM）（Haselmeier, Stuttgart, Germany）、エピペン（EPIPEN）（Dey, L. P.）及びヒュミラ（ＨＵＭＩＲＡ^TM）ペン（Abbott Labs, Abbott Park, IL）を含むが、必ずしもそれらに制限されるものではない。

好都合であるように、前述の経口使用または非経口使用のための薬学的組成物は、活性成分の用量を合わせるのに適する単位用量の投与型に製造される。そのような単位用量の投与型は、例えば、錠剤、丸藥、カプセル、注射液（アンプル）、坐剤などを含む。含有された抗体の量は、一般的に、単位用量、特に、注射形態の投与型当たり、約５ないし約５００ｍｇであり、抗体が、約５ないし約１００ｍｇ含有され、かつ他の投与型につき、約１０ないし約２５０ｍｇに含有されることが望ましい。

本開示内容は、また一側面において、個体に、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を投与することを含む、個体において免疫反応を調節する方法を提供する。

本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、またはそれを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスを、腫瘍、癌、転移性腫瘍、転移性癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患または感染性疾患の予防剤、改善剤または治療剤を製造するのに使用する用途を提供する。

本開示内容は、また一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を、腫瘍細胞の成長を抑制するために、治療学的に有効量を個体に投与することを含む、個体における腫瘍細胞の成長を抑制する方法を提供する。

併用投与
本開示内容の一側面において、本開示内容による薬学的組成物は、第２治療剤をさらに含む薬学的組成物を提供する。

多様な態様において、該第２治療剤としては、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体、ＰＤ－１に対する第２抗体（例：ニボルマブ）、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例：イプリムマブ）、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、他のＴ細胞共阻害剤またはリガンドの拮抗剤（例：ＣＤ－２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０またはＶＩＳＴＡに対する抗体）、インドールアミン－２，３－デ－オキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）拮抗剤［例：「ＶＥＧＦ－Trap」、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号に記載されたアフリベルセプト、または他のＶＥＧＦ－抑制融合タンパク質、抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合断片（例：ベバシズマブまたはラニビズマブ）、またはＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例：スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ）］、Ａｎｇ２阻害剤（例：ネスバクマブ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例：エルロチニブ、セツキシマブ）、共刺激受容体に対する作用剤（例：グルココルチコイド誘導されたＴＮＦＲ関連タンパク質に対する作用剤）、腫瘍特異的抗原に対する抗体（例：ＣＡ９、ＣＡ１２５、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍－Ｍ２－ＰＫ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ムチン－１、ＭＡＲＴ－１及びＣＡ１９－９）、ワクチン（例：ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin）、癌ワクチン）、抗原伝達を増大させるアジュバント（例：顆粒球・大食細胞コロニー刺激因子）、二重特異的抗体（例：ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異的抗体、ＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異的抗体）、細胞毒素、化学療法剤（例：ダカルバジン、テモゾロマイド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル及びビンクリスチン）、シクロホスファミド、放射線療法、ＩＬ－６Ｒ阻害剤（例：サリルマブ）、ＩＬ－４Ｒ阻害剤（例：デュピルマブ）、ＩＬ－１０阻害剤、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１及びＩＬ－１５）、抗体薬物接合体（ＡＤＣ）（例：抗ＣＤ１９－ＤＭ４ＡＤＣ及び抗ＤＳ６－ＤＭ４ＡＤＣ）、抗炎症薬物（例：コルチコステロイド及び非ステロイド抗炎症薬物）、食餌補充剤（例えば、抗酸化剤、または癌治療のための任意の緩和治療（palliative care））と共に使用されうる。

特定態様において、前記第２治療剤は、抗腫瘍反応を増大させるための樹枝状細胞ワクチン、腫瘍溶解（oncolytic）ウイルス、腫瘍細胞ワクチンなどを含む癌ワクチンでもある。該癌ワクチンの例は、黒色腫及び膀胱癌のためのＭＡＧＥ３ワクチン、乳癌のためのＭＵＣ１ワクチン、脳癌（多形成膠芽細胞腫を含む）のためのＥＧＦＲｖ３（例：リンドペピムト）または（ＣＥＡ＋癌のための）ＡＬＶＡＣ－ＣＥＡを含むものでもある。

診断及び検出のための方法、キット
本開示内容は、一側面において、本開示内容による、任意のＰＤ－１タンパク質結合剤、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、及びそれらを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を含む、疾病の治療用、診断用または検出用のキットを提供する。

本開示内容の抗ＰＤ－１抗体は、例えば、診断目的のために、サンプルからＰＤ－１を検出し、かつ／あるいは測定するのに使用されうる。一部態様は、癌、自己免疫疾患または慢性ウイルス感染のような疾患または障害を検出する検定において、本開示内容の１以上の抗体の使用を考慮する。ＰＤ－１に対する例示的な診断検定は、例えば、患者から得られたサンプルを、本開示内容の抗ＰＤ－１抗体と接触させることを含み、ここで、前記抗ＰＤ－１抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子でもって標識されるか、あるいは患者サンプルから、ＰＤ－１を選択的に単離する捕獲リガンドとして使用される。

代案としては、標識されていない抗ＰＤ－１抗体は、それ自体で検出可能に標識される二次抗体と共に診断用途に使用されうる。検出可能な標識またはレポーター分子は、ラジオアイソトープ、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ；フルオレセインイソチオシアネートまたはロダミンのような蛍光性モイエティまたは化学発光性モイエティ；またはアルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼのような酵素でもある。

サンプルからＰＤ－１を検出するか、あるいは測定するのに使用されうる具体的な例示的なアッセイとして、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ：fluorescence-activated cell sorting）を含む。

本開示内容による、ＰＤ－１診断アッセイに使用されうるサンプルは、患者から得ることができる任意の組織または流体サンプルを含み、それらは、正常状態下または病的状態下で検出可能な量のＰＤ－１タンパク質またはその断片を含む。一般的に、健康な患者（例：癌または自己免疫疾患にかかっていない患者）から得られた特定サンプルにおけるＰＤ－１レベルを測定し、ＰＤ－１の基底線または標準レベルを初期に確立する。その後、そのようなＰＤ－１の基底線レベルを、癌関連病態、またはそのような病態と係わる症状を有すると疑われる個体から得られたサンプルから測定されたＰＤ－１のレベルと比較することができる。

ＰＤ－１に特異的な本開示内容による、ポリペプチド、ＰＤ－１結合剤、抗体などは、さらなる標識またはモイエティを含まないか、あるいはＮ末端またはＣ末端の標識またはモイエティを含むものでもある。一態様において、前記標識またはモイエティは、ビオチンである。結合検定において、標識（存在する場合）の位置は、ペプチドが結合される表面に対するペプチドの配向を決定することができる。例えば、表面がアビジンによってコーティングされる場合、Ｎ末端ビオチンを含むペプチドは、前記ペプチドのＣ末端部分が表面から遠い側に位置されるように配向されるのである。

本開示内容の一側面は、患者において、癌または自己免疫障害の予後を予測するためのマーカーとしての、開示された抗体の用途に係わるものである。本開示内容による、ポリペプチド、ＰＤ－１結合剤、抗体などは、患者において癌の予後を評価し、生存を予測するための診断検定に使用されうる。

以下においては、発明の具体的な具現例による抗体の生産方法について、さらに詳細に説明する。ただし、それらは、発明の１つの例示として提示されるものであり、それらにより、発明の権利範囲が限定されるものではなく、発明の権利範囲内において、具現例についての多様な変形が可能であるということは、当業者に自明であろう。

実施例
実施例１．免疫院の準備及び細胞株の確立
タンパク質抗原
ヒトＰＤ－１のｃＤＮＡが含まれたｐＣＭＶ３－Ｃ－ＦＬＡＧベクター（Sino）から、細胞外ドメイン（ＥＣＤ：extracellular domain）をＰＣＲ（polymerase chain reaction）で合成し、ｐＥＭ．ＣＭＶ－ＳＦ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰベクターに挿入した。作製されたベクターをＣＨＯＳ細胞株に形質感染させ、ヒトＰＤ－１タンパク質細胞外ドメインを生成する細胞を、ＥＧＦＰ発現を基準に、流細胞分析（flow cytometry）を介して選別した。細胞培養液において、ＦＬＡＧタッグアフィニティークロマトグラフィ方法を使用し、ヒトＰＤ－１タンパク質を精製して定量化した。

細胞株抗原
ヒトＰＤ－１のｃＤＮＡが含まれたｐＣＭＶ３－Ｃ－ＦＬＡＧベクター（Sino）を、ＢＡＬＢ／ｃマウス結腸癌（colon cancer）由来ＣＴ２６細胞株に形質感染させた。ＡＰＣ－ｃｙ７抗ヒトＰＤ－１抗体を利用し、ヒトＰＤ－１を発現する細胞を、流細胞分析（flow cytometry）を介して選別した。９６－ウェルプレートで限界希釈（limiting dilution）し、単一クローンを確保した。

対照群（キイトルーダ、オプジーボ）の入手
対照群抗体であるキイトルーダ（Keytruda）（ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）アイソタイプ、ｃａｔ．Ｎｏ．ｈｐｄ１ｐｅ－ｍａｂ１４）は、インビボジェン（InvivoGen）で製造された製品、またはＭＳＤの臨床用製品を購入して使用した。オプジーボ（Opdivo）は、ＢＭＳの臨床用製品を購入して使用した。

細胞株の確立
ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１のｃＤＮＡが含まれたｐＣＭＶ３－Ｃ－ＦＬＡＧベクター（Sino）をＣＨＯＳ細胞株に形質感染させた。ＡＰＣ－ｃｙ７抗ヒトＰＤ－１抗体またはＡＰＣ－ｃｙ７抗マウスＰＤ－１抗体を利用し、ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１を発現する細胞を、流細胞分析（flow cytometry）を介して選別した。９６ウェルプレートで限界希釈（limiting dilution）し、単一クローンを確保した。

実施例２．ＰＤ－１ノックアウトマウスの作製
ＰＤ－１ノックアウトマウスは、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）から、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムを利用して作製した。マウスＰＤ－１遺伝子配列に特異的なガイドＲＮＡを作製し、インビトロ（in vitro）でマウスＰＤ－１ＤＮＡを分解することができるか否かということを確認した後、ガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを、受精卵（zygote）にマイクロインジェクションした。ガイドＲＮＡが注入された受精卵の中で生存したものを選別し、代理母卵管に移植し、移植後に生まれて２週ほどになるマウスの尾を切り、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ方法でマウスＰＤ－１遺伝子欠損いかんを確認した。

実施例３．抗体ハイブリドーマの生成
マウスの免疫化
８週齢雌ＰＤ－１ノックアウトマウスに、ヒトＰＤ－１抗原を免疫化させ、抗体生成を誘導した。免疫化用抗原としては、精製されたヒトＰＤ－１タンパク質抗原とＣＴ２６由来ヒトＰＤ－１細胞株抗原とを利用した。

タンパク質抗原免疫化は、マウス当たり５０μｇの抗原タンパク質をTiterMax Goldアジュバント５０μｇと混合し、マウスの左右側背部位に皮下（ｓ．ｃ．：subcutaneous）注射した。細胞株抗原免疫化は、免疫化１日前の細胞株抗原に、×線照射（Irradiation）を実施し、細胞成長（cell growth）を抑制させ、マウス当たり１ｘ１０^６細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．：intraperitoneal）に投与した。免疫化は、３週間隔で実施し、免疫化１０日後、それぞれのマウス個体から、顎下出血（submandibular bleeding）によって血液を採取した。血液から分離された血清（serum）を利用して生成された抗体の力価をＥＬＩＳＡで測定した。

細胞融合及び単一クローン細胞（ハイブリドーマ）の生成
ヒトＰＤ－１免疫化マウスから脾臓を取り出し、Ｂリンパ球を分離させた後、培養された骨髄腫（myeloma）細胞（ｓｐ２／０）と融合させた。融合された細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンが添加されている培地（ＨＡＴ medium）で培養し、骨髄腫（myeloma）とＢリンパ球とだけが融合された細胞（hybridoma）を選択的に選別して培養した。

得られたハイブリドーマ細胞において、ヒトＰＤ－１抗原と反応する抗体を生産するハイブリドーマを、タンパク質ベースのＥＬＩＳＡ分析を遂行して確認した。ヒトＰＤ－１抗原と反応するハイブリドーマを、限界希釈法（limiting dilution method）を利用し、クローニングを繰り返し、ヒトＰＤ－１抗原に反応する抗体を生産する単一クローン細胞（ハイブリドーマ）（１Ｇ１）を生産した。

実施例４．ハイブリドーマ１Ｇ１のＰＤ－１に対する結合（binding）テスト
実施例３で製造された単一クローン細胞（ハイブリドーマ）（１Ｇ１）と、細胞表面に発現される構造的ＰＤ－１タンパク質との結合確認のために、セルベース（cell-based）ＥＬＩＳＡと流細胞分析（flow cytometry）とを遂行した。抗ｈＰＤ－１抗体対照群は、キイトルーダ（Invivogen）を使用した。

ＥＬＩＳＡ分析について要約すれば、コラーゲンコーティングされた９６ウェルプレート（Thermo Fisher）に、ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｓ細胞１０，０００個を、３７℃で一晩中コーティングした。コーティングされた細胞は、８％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）で常温で１５分間固定させた。遮断及び洗浄の後、キイトルーダ培養上澄み液またはハイブリドーマ培養上澄み液を、コーティングされたプレートに添加し、常温で２時間インキュベーションした。洗浄後、二次抗体を添加し、４℃で一晩中インキュベーションした。二次抗体としては、キイトルーダ添加ウェルには、マウス抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ（GenScript）を使用し、ハイブリドーマ上澄み液添加ウェルには、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃＨＲＰ（Thermo Fisher）を使用した。洗浄後、ＴＭＢ基質（Abcam）を添加し、ＳＴＯＰ溶液（Abcam）で発色反応を中止させた。マイクロプレートリーダ（Thermo Fisher）を利用し、４５０／６５０ｎｍにおける吸光度を確認した。

流細胞分析（flow cytometry）について要約すれば、ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｓ細胞を、１×１０^６細胞／ウェルの密度で、９６ウェルＶ底プレート（Corning）にローディングし、キイトルーダ培養上澄み液またはハイブリドーマ培養上澄み液を添加し、４℃で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体を添加し、４℃で１時間、細胞と共にインキュベーションした。該二次抗体は、キイトルーダ添加ウェルには、ＰＥ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Biolegend）を使用し、ハイブリドーマ培養上澄み液添加ウェルには、ＡＦ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Thermo Fisher）を使用した。その後、細胞を洗浄した後、１× ＰＢＳ／２％ＢＳＡに再懸濁し、流細胞分析（ＢＤ）及びFlowJoソフトウェアで分析した。

図１は、ＥＬＩＳＡを使用し、実施例３で製造されたハイブリドーマ抗体１Ｇ１の細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する結合テストを実施した結果のグラフである。図２は、流細胞分析（flow cytometry）を使用し、実施例３で製造されたハイブリドーマ抗体の細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する結合テストを実施した結果のグラフである。１Ｇ１抗体は、ヒトＰＤ－１及びマウスＰＤ－１に高い親和度で結合した。

なお、対照群として使用されたキイトルーダは、細胞表面ヒトＰＤ－１にだけ結合する一方、実施例３で製造された１Ｇ１ハイブリドーマ抗体は、細胞表面ヒトＰＤ－１及びマウスＰＤ－１のいずれにも結合し、交差反応性（cross-reactivity）を示した。

実施例５．ハイブリドーマ１Ｇ１抗体のリガンド遮断（blocking）テスト
実施例３で製造された単一クローン細胞（ハイブリドーマ）１Ｇ１が、細胞表面ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１の結合を遮断するか否かということを確認するために、セルベースＥＬＩＳＡと流細胞分析（flow cytometry）とを遂行した。抗ｈＰＤ－１抗体対照群は、キイトルーダ（Invivogen）を使用した。

ＥＬＩＳＡ分析について要約すれば、コラーゲンコーティングされた９６ウェルプレートに、ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｓ細胞１０，０００個を、３７℃で一晩中コーティングした。コーティングされた細胞は、８％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）で常温で１５分間固定させた。遮断及び洗浄の後、ヒトＰＤ－１ＣＨＯ－Ｓ細胞コーティングウェルには、ヒトＰＤ－Ｌ１ラマＦｃタンパク質を添加し、マウスＰＤ－１ＣＨＯ－Ｓ細胞コーティングウェルには、マウスＰＤ－Ｌ１ヒトＦｃタンパク質を添加し、常温で２０分インキュベーションした。キイトルーダ培養上澄み液またはハイブリドーマ培養上澄み液を添加し、常温で１時間２０分インキュベーションした。

洗浄後、二次抗体を添加し、４℃で一晩中インキュベーションした。該二次抗体としては、ヒトＰＤ－Ｌ１ラマＦｃタンパク質添加ウェルには、マウス抗ラマＩｇＧ２／ＩｇＧ３ＨＲＰ（Antibody onlines）を使用し、マウスＰＤ－Ｌ１ヒトＦｃタンパク質添加ウェルには、マウス抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ（Genscript）を使用した。洗浄後、ＴＭＢ基質（Abcam）を添加し、ＳＴＯＰ溶液（Abcam）で発色反応を中止させた。マイクロプレートリーダ（Thermo Fisher）を利用し、４５０／６５０ｎｍにおける吸光度を確認した。

流細胞分析（flow cytometry）について要約すれば、ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｓ細胞を、１ｘ１０^６細胞／ウェルの密度で、９６ウェルＶ底プレート（Corning）にローディングし、ＰＤ－Ｌ１タンパク質と、キイトルーダ培養上澄み液またはハイブリドーマ培養上澄み液との混合液を添加し、４℃で１時間インキュベーションした。ヒトＰＤ－１ＣＨＯ－Ｓ細胞ローディングウェルには、ヒトＰＤ－Ｌ１ラマＦｃタンパク質と抗体混合液とを添加し、マウスＰＤ－１ＣＨＯ－Ｓ細胞ローディングウェルには、マウスＰＤ－Ｌ１ヒトＦｃタンパク質と抗体混合液とを添加した。１× ＰＢＳ／２％ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体を添加し、４℃で１時間インキュベーションした。

二次抗体としては、ヒトＰＤ－Ｌ１ラマＦｃタンパク質と抗体混合液との添加ウェルには、ＦＩＴＣヤギ抗ラマＩｇＧ（Abcam）を使用し、マウスＰＤ－Ｌ１ヒトＦｃタンパク質と抗体混合液との添加ウェルには、ＰＥ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Biolegend）を使用した。細胞を洗浄した後、１× ＰＢＳ／２％ＢＳＡに再懸濁し、流細胞分析（ＢＤ）及びFlowJoソフトウェアで分析した。

図３は、細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する、それぞれヒトＰＤ－Ｌ１結合またはマウスＰＤ－Ｌ１結合につき、実施例３で製造された単一クローン細胞（ハイブリドーマ）１Ｇ１抗体の遮断テストを、ＥＬＩＳＡを使用して実施した結果をグラフで示したものである。

図４は、細胞表面の、ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する、それぞれヒトＰＤ－Ｌ１結合またはマウスＰＤ－Ｌ１結合につき、実施例３で製造された単一クローン細胞（ハイブリドーマ）１Ｇ１抗体の遮断テスト流細胞分析（flow cytometry）を使用して実施した結果をグラフで示したものである。

対照群であるキイトルーダは、細胞表面ヒトＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合のみを遮断する一方、１Ｇ１ハイブリドーマ抗体は、ヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及びマウスＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合いずれをも遮断した。

実施例６．精製されたハイブリドーマ１Ｇ１抗体のＰＤ－１に対する結合テスト（ＥＬＩＳＡ）
ハイブリドーマにおいて抗体を生産するために、ハイブリドーマを３％ low－ＩｇＧＦＢＳ（Gibco）が含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco Modified Eagle Medium）（HyClone）（Cytiva）培地で１週間培養し、遠心分離した後、０．２２μｍフィルタ（Millipore）を利用して濾過した後、細胞培養液を回収した。

ハイブリドーマ細胞培養液において、アフィニティークロマトグラフィ方法を利用し、抗体タンパク質を分離させた。該ハイブリドーマ細胞培養液を、Protein Ｇ bead（Cytiva）が含まれたクロマトグラフィカラム（Bio Rad）にローディングし、ＩｇＧ Elution Buffer（Thermo Scientific）で溶出（elution）した。低いｐＨのＩｇＧ Elution Buffer（ｐＨ２．５～３．０）により、タンパク質が損傷されることを最小化させるために、１Ｍ Tris－ＨＣＬ溶液（ｐＨ８．０）が入っているチューブに抗体を溶出（elution）させ、ｐＨインジケータストリップを利用し、中和されたタンパク質のｐＨを測定した。

精製された抗体は、Amicon １００Ｋ遠心式フィルター（Merck）を利用して濃縮し、クマシーブルー染色（Coomassie blue staining）及びＢＣＡアッセイ（Thermo Scientific）を介し、タンパク質の確認及び定量を行った（図５）。

精製された抗体１Ｇ１と、細胞表面に発現される正常な構造のＰＤ－１タンパク質との結合親和度確認のために、セルベースＥＬＩＳＡを遂行した。抗ｈＰＤ－１抗体対照群は、キイトルーダ（Keytruda）（ＭＳＤ）とオプジーボ（Opdivo）（ＢＭＳ）を使用した。

ＥＬＩＳＡ分析について要約すれば、コラーゲンコーティングされた９６ウェルプレート（Thermo Scientific）に、ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｓ細胞１０，０００個を、３７℃インキュベータで一晩中コーティングした。コーティングされた細胞は、８％のパラホルムアルデヒドで常温で１５分間固定させた。遮断させて洗浄した後、キイトルーダ、オプジーボ、精製されたハイブリドーマ抗ＰＤ－１抗体を、コーティングされたプレートに添加し、常温で２時間インキュベーションした。

洗浄後、二次抗体を添加し、４℃で一晩中インキュベーションした。該二次抗体としては、キイトルーダまたはオプジーボの添加ウェルには、マウス抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ（GenScript）を使用し、精製されたハイブリドーマ抗ＰＤ－１抗体添加ウェルには、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃＨＲＰ（Thermo Fisher）を使用した。洗浄後、ＴＭＢ基質（Abcam）を添加し、ＳＴＯＰ溶液（Abcam）で発色反応を中止させた。マイクロプレートリーダ（Thermo Fisher）を利用し、４５０／６５０ｎｍにおける吸光度を確認した。

図６は、ＥＬＩＳＡを使用し、精製されたハイブリドーマ１Ｇ１抗体の細胞表面のヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１に対する結合テストを実施した結果のグラフである。その実験結果から、精製されたマウス１Ｇ１抗体及び対照群（キイトルーダ、オプジーボ）の抗原に対するＥＣ_５０を算出した。

精製されたハイブリドーマ抗ＰＤ－１抗体（１Ｇ１）は、キイトルーダ（１５３．５２ｐＭ）とオプジーボ（１５７．２７ｐＭ）対比で、ヒトＰＤ－１抗原に約５倍向上された結合力（２８．１３ｐＭ）を示した。また、精製されたハイブリドーマ抗ＰＤ－１抗体（１Ｇ１）は、マウスＰＤ－１抗原に対しても、ヒトＰＤ－１抗原と類似した結合力（３１．７２ｐＭ）を示すということを確認した。

ND: 検出されず（not detected）

実施例７．ヒト免疫チェックポイントに対する交差反応性（cross-reactivity）
実施例３で製造された単一クローン細胞（ハイブリドーマ）１Ｇ１が、ヒトＴ細胞表面に存在するＰＤ－１に特異的に結合するか否かということを確認するために、タンパク質ベースのＥＬＩＳＡ分析でもって、他の免疫チェックポイントに対する交差反応性（cross-reactivity）試験を行った。抗ｈＰＤ－１抗体対照群は、キイトルーダ（Invivogen）を使用した。

ヒトＰＤ－１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳまたはＢＴＬＡタンパク質を、９６ウェルプレート（Nunc）に、４℃で一晩中コーティングした。遮断させて洗浄した後、キイトルーダ培養上澄み液またはハイブリドーマ培養上澄み液を、コーティングされたプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。洗浄後、二次抗体を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。該二次抗体は、キイトルーダ添加ウェルには、マウス抗ヒトＩｇＧＦｃＨＲＰ（Genscript）を使用し、ハイブリドーマ培養上澄み液添加ウェルには、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃＨＲＰ（Thermo Fisher）を使用した。洗浄後、ＴＭＢ基質（Abcam）を添加し、ＳＴＯＰ溶液（Abcam）で発色反応を中止させた。マイクロプレートリーダ（Thermo Fisher）を利用し、４５０／６５０ｎｍにおける吸光度を確認した。

図７は、ヒトＴ細胞表面免疫チェックポイントに対する結合いかんを、ＥＬＩＳＡで試験した結果である。１Ｇ１ハイブリドーマ抗体は、対照群と同様に、ヒトＰＤ－１にだけ特異的に結合した。

実施例８．抗体ハイブリドーマ細胞シークエンシング
実施例３で製造された１Ｇ１ハイブリドーマ細胞から、ＲＮＡをトリゾール試薬で抽出した。ＲＮＡから、逆転写酵素を利用してｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡから、抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列を次のように増幅した。

配列増幅のためのプライマーは、次の通りである。

ＰＣＲ反応は、次のようになされた。

得られるＰＣＲ生産物（１０μＬ）を、ｐＣＭＶ３ベクターで結紮させ、Ｔ７（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）プライマー及びｐＣＭＶ３＿Ｆ（5’-CGAGGAGGATTTGATATTCAC-3’）プライマーを利用した配列分析でもって、ハイブリドーマ抗体のＶＨ配列とＶＬ配列を確認した。

確認されたＶＨ配列とＶＬ配列は、次の通りであり、ＶＨとＶＬのいずれにおいても、カバット（Kabat）システムにより、ＦＲ１－４配列及びＣＤＲ１－３配列を確認した。

実施例９．キメリック抗体の作製、発現及び精製
ハイブリドーマで生産されたマウス抗ＰＤ－１抗体の不変領域（constant region）を、ヒト抗体の不変領域で交替させるキメリック抗体を作製した。シグナルペプチド（signal peptide）と、抗体のＶＨ配列またはＶＬ配列とをoverlapping ＰＣＲで連結し、ヒトＩｇＧ４不変領域（Ｓ２２８Ｐ）（配列番号３８～４１）を発現するｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４ベクター（Invivogen）で結紮させた。

抗体のＶＨ配列とＶＬ配列とが含まれたｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４ベクターを、ExpiCHO^TMexpressionsystem（Thermo Scientific）に導入し、抗体を発現させた。ｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４ベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に形質感染（transfection）させた後、ＦＢＳが含まれていないExpiCHO^TM Expression Mediumにおいて培養し、細胞生存能（cell viability）を観察し、形質感染後７～１０日の間、生存能７０％以上になる細胞を遠心分離した後、０．２２μｍフィルター（Millipore）で濾過し、細胞培養液を回収した。細胞培養液を、Protein Ａ bead（Thermo Scientific）が含まれたクロマトグラフィカラム（Bio Rad）にローディングし、ＩｇＧ Elution Buffer（Thermo Scientific）で溶出（elution）した。低いｐＨのＩｇＧ Elution Buffer（ｐＨ２．５～３．０）により、タンパク質が損傷されることを最小化させるために、１Ｍ Tris－ＨＣＬ溶液（ｐＨ８．０）が入っているチューブに抗体を溶出（elution）させ、ｐＨインジケータストリップを利用し、中和されたタンパク質のｐＨを測定した。精製された抗体は、Amicon ５０Ｋ遠心式フィルター（Merck）を利用して濃縮し、クマシーブルー染色（Coomassie blue staining）及びＢＣＡアッセイ（Thermo Scientific）を介し、タンパク質の確認及び定量を行った。図５は、精製されたマウス１Ｇ１抗体（１Ｇ１ parental）及びキメリック１Ｇ１抗体（Chimeric １Ｇ１）を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。

実施例１０．キメリック１Ｇ１抗体のＰＤ－１に対する結合テスト（ＳＰＲ）
実施例９で製造されたキメリック１Ｇ１抗体のヒトＰＤ－１に対する結合動力学を、Biacore ８Ｋ（Cytiva）を利用したＳＰＲ（surface plasma resonance）分析を介して測定した。抗ヒトＩｇＧ抗体を、ＣＭ５チップ（Cytiva）に、アミン連結（coupling）を介して固定させた。精製された抗体（キイトルーダ、オプジーボ、キメリック１Ｇ１抗体）をセンサーチップの上に流し、抗ヒトＩｇＧ抗体によってキャプチャーした。ヒトＰＤ－１、及び０～１００ｎＭ（０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎＭ）濃度のランニングバッファーを、流速３０μｌ／分で、結合（association）段階の１２０ｓの間、センサーチップに流し、９００ｓの解離（dissociation）に続いた。チップは、それぞれの実験後、ｐＨ１．５のグリシン（glycine）で再生成された。Cytiva evaluationソフトウェアを利用し、結合曲線及び解離曲線を描いて、動力学及び親和度値を決定した。

以下の表は、ＳＰＲ分析によって試験された、ヒトＰＤ－１に対するキメリック１Ｇ１抗体の結合親和性の結果を示す。

キメリック抗ＰＤ－１抗体（１Ｇ１）は、ヒトＰＤ－１に対し、キイトルーダ（６．３３ｅ^－９）及びオプジーボ（１．０５ｅ^－８）対比で、約２～３倍すぐれたな結合力（ＫＤ）（３．３５ｅ^－９）を有することを確認した。それは、１Ｇ１キメリック抗ＰＤ－１抗体が、結合（Ｋｏｎ）（２．２３ｅ^＋５）面においては、キイトルーダ（４．９６ｅ^＋５）及びオプジーボ（２．０４ｅ^＋５）と類似しているが（０．９～２．２倍）、解離（Ｋｏｆｆ）（７．４９ｅ^－４）面においては、キイトルーダ（３．１４ｅ^－３）及びオプジーボ（２．１４ｅ^－３）対比で、２．９～４．２倍解離されていない向上された結合特性を有しているためである。

実施例１１．１Ｇ１抗体のエピトープマッピング
１Ｇ１－chimeric（ｈＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ））抗体のヒトＰＤ－１抗原（配列番号６２）に係わるエピトープマッピング（アラニンスキャニング）を施し、前記抗体が認知するヒトＰＤ－１抗原エピトープを確認した。ＰＣＲ突然変異誘発を利用し、ＰＤ－１のアミノ酸残基をアラニンで突然変異させた。突然変異されたタンパク質を発現させ、１Ｇ１キメリック抗体との結合につき、高スループット流細胞分析（flow cytometry）で分析した。

その結果、アミノ酸の突然変異抗原に対する結合力が、野生型抗原に対する結合力に比べ、５０％以下に低下されるエピトープ３個（Ｐ１３０、Ｌ１２８及びＩ１２６）を決定した。それらアミノ酸は、いずれもマウスＰＤ－１においても保存されるアミノ酸であり、それらは、１Ｇ１抗体が、ヒトＰＤ－１とマウスＰＤ－１とに交差反応性（cross-reactivity）を有する現象を裏付ける。

実施例１２．１Ｇ１抗体のヒト化（humanization）
マウス由来１Ｇ１抗体の免疫原性を除去し、ヒト体内において、安定した抗体効能を確保するために、復帰突然変異ライブラリー（back mutation library）法を利用し、１Ｇ１抗体のヒト化を進めた。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を除いたフレームワーク（ＦＲ）配列を、ヒト抗体配列で置換した１Ｇ１ヒト化抗体３種（ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６１，１Ｇ１－ｈ６８，１Ｇ１－ｈ７０）を作製し、タンパク質Ａ親和度クロマトグラフィで精製した。

得られた３種の１Ｇ１ヒト化抗体（ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６１，１Ｇ１－ｈ６８，１Ｇ１－ｈ７０）のヒトＰＤ－１抗原に対する結合親和性を、Biacore ８Ｋ（Cytiva）を利用したＳＰＲ（surface plasma resonance）分析を介して実施した。得られた３種のヒト化１Ｇ１抗体は、いずれもキメリック１Ｇ１抗体と類似レベルの抗原結合力を示していると確認された。

得られた３種のヒト化１Ｇ１抗体それぞれの配列を分析し、図８ないし１１に図示した。具体的には、ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６１の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ配列番号５４及び５５のアミノ酸配列を有する。ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６８の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ配列番号５６及び５７のアミノ酸配列を有する。ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ７０の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、それぞれ配列番号５８及び５９のアミノ酸配列を有する。

実施例１３．ヒト化１Ｇ１抗体のＰＤ－１抗原に対する結合動力学（kinetics）比較の評価
Biacore ８Ｋ（Cytiva）を利用したＳＰＲ（surface plasma resonance）分析を介し、各抗体のヒトＰＤ－１への結合動力学を測定し、抗体間の抗原に対する結合力を比較した。

抗ヒトＰＤ－１抗体対照群であるキイトルーダ（Keytruda）（ＭＳＤ（Lot #T020031））とオプジーボ（Opdivo）（ＢＭＳ（Lot #043FB））は、人体用医薬品として、シンウォン薬品（Shinwon Pharmacy Co., Ltd.）から購入した。

対照群抗体（キイトルーダ、オプジーボ）と１Ｇ１抗体（キメリック抗体１Ｇ１－chimeric、ヒト化抗体１Ｇ１－ｈ６１，１Ｇ１－ｈ６８，１Ｇ１－ｈ７０）をProtein Ａチップ（Cytiva）上に流してキャプチャーした。７個の濃度（０～１００Ｍ）のヒトＰＤ－１を流速３０μＬ／分で、結合（association）段階の１２０ｓの間、センサーチップに流し、１，８００ｓの解離（dissociation）に続いた。チップは、それぞれの実験後、ｐＨ１．５のグリシンによって再生成された。Cytiva evaluationソフトウェアを利用し、結合曲線及び解離曲線を描いて、動力学及び親和度値を測定した。GraphPad Prismプログラムのone-way ANOVA with Tukey testを利用し、抗体間動力学と親和度値との有意性を判断した（＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

図１２Ａ及び図１２Ｂは、ヒトＰＤ－１に係わる結合動力学及び親和度を、Ｋｏｎ（ｋａ値）、Ｋｏｆｆ（ｋｄ値）、ＫＤ値を介して示している。結論として、ヒト化抗ＰＤ－１抗体（１Ｇ１）は、平均して、ヒトＰＤ－１につき、キイトルーダ（７．０６ｅ^－９）及びオプジーボ（７．５４ｅ^－９）と類似レベルの結合力（ＫＤ）（７．２６ｅ^－９）を有するということを確認した。それは、１Ｇ１ヒト化抗ＰＤ－１抗体が、結合（Ｋｏｎ）（５．４５ｅ^＋４）面においては、キイトルーダ（４．１８ｅ^＋５）及びオプジーボ（１．４１ｅ^＋５）対比で、２．６～７．７倍徐々に結合するが、解離（Ｋｏｆｆ）（３．８７ｅ^－４）面においては、キイトルーダ（２．９５ｅ^－３）及びオプジーボ（１．０６^－３）対比で、２．７～７．６倍解離されていない向上された結合特性を有しているためである。抗ＰＤ－１抗体の作用メカニズムを考慮するとき、１Ｇ１ヒト化抗ＰＤ－１抗体は、解離されていない結合特性により、向上された抗癌活性を示す。

実施例１４．ＰＤ－１抗原に対する交差反応性（cross－reactivity）比較の評価
ＰＤ－１抗原に対する抗体の交差反応性（cross－reactivity）確認のために、タンパク質ベースのＥＬＩＳＡを遂行した。ＥＬＩＳＡ分析について要約すれば、９６ウェルプレート（Thermo Scientific）に、ヒト、マウス、ウサギ、シノモルグス、ラットの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＰＤ－１タンパク質１０ｎｇを、４℃で一晩中コーティングした。遮断させて洗浄した後、対照群抗体（キイトルーダ、オプジーボ）と１Ｇ１抗体（キメリック抗体、ヒト化抗体）１μｇ／ｍｌとを、コーティングされたプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。洗浄後、二次抗体（抗ヒトＩｇＧ抗体）を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。洗浄後、ＴＭＢ基質（Abcam）を添加し、ＳＴＯＰ溶液（Abcam）で発色反応を中止させた。マイクロプレートリーダ（Thermo Fisher）を利用し、４５０／６５０ｎｍにおける吸光度を確認した。

図１３は、ＰＤ－１抗原に対する抗体の交差反応性（cross－reactivity）測定結果を示している。キイトルーダ、オプジーボ、１Ｇ１抗体のいずれも、ヒトＰＤ－１及びシノモルグスＰＤ－１抗原に交差反応性（cross－reactivity）を有する。１Ｇ１抗体は、マウスＰＤ－１抗原にさらに交差反応性（cross－reactivity）を示すということを確認した。

実施例１５．インビボ（in vivo）抗癌効能の評価
マウス黒色腫モデルを利用した１Ｇ１抗体の抗癌効能評価実験を、図１４のように進めた。マウス黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１１／ＯＴ．ＥＧＦＰ）を培養し、３ｘ１０^６個の細胞を、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス右側背皮下に移植した。腫瘍細胞移植６日後、癌結節の大きさを測定し、５グループで分けた後、移植７日目から３日間隔で、１Ｇ１－親抗体（parental antibody）を５回腹腔投与し、３日間隔で腫瘍サイズを測定した。腫瘍サイズは、次の数式を利用して計算した。
ＬｘＷ^２／２
ここで、Ｌは、長軸長であり、Ｗは、短軸長である。

生存率は、腫瘍の体積が１，０００ｍｍ^３を超えるか、あるいは腫瘍潰瘍、マウス斃死が生じた日として記録した。GraphPad PrismプログラムのTwo-way ANOVA with Bonferroni testを利用し、腫瘍成長抑制率間の有意性を判断し、ログランク検定（Log-rank test）（Mantel-Cox test）を利用し、生存率値間の有意性を判断した（＊：Ｐ＜０．０５，＊＊＊：Ｐ＜０．００１，生存率分析終点（endpoint）：７００ｍｍ^３）。

図１５は、経時的な腫瘍成長、及び１Ｇ１－親抗体（parental antibody）投与濃度による腫瘍成長抑制を示している。１Ｇ１１ｍｇ／ｋｇ投与群は、アイソタイプ対照群と類似した腫瘍成長を示したが、１Ｇ１２．５～１０ｍｇ／ｋｇ投与群においては、１９日目に、約９０～１００％、２２日目に、９４～１１２％、２５日目に、８６～９４％の腫瘍成長抑制率を示し、（図１５の２２日目）、約２０％の生存率増加が観察された（図１６）。この結果を基に、１Ｇ１－親抗体（parental antibody）がすぐれた抗癌効果を示すということを確認した。

実施例１６．大腸癌実験モデルにおけるインビボ（in vivo）抗癌効能の評価
ＭＣ３８大腸癌シンジェニック（syngeneic）モデルにおいて、１Ｇ１抗体の抗癌効能を評価した。７～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの左側脇腹に、５×１０^５個のＭＣ３８マウス大腸癌細胞を皮下注入した。注入後、平均腫瘍サイズが、５０ないし１５０ｍｍ^３に逹したとき、腫瘍体積により、４グループ（それぞれｎ＝１３）に分け、ヒトｈＩｇＧ４、ラットｒＩｇＧ２ａ、１Ｇ１－ｈ７０抗体及びＲＭＰ１－１４（マウスＰＤ－１）抗体をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇずつ３日間隔で、総５回投与した。各グループにつき、動物の体重と、腫瘍の大きさとを毎週３回測定して評価した。最終体重と、最終腫瘍の大きさは、該研究が終点に逹した日に測定した。該終点は、対照グループの平均腫瘍サイズが、１，５００ｍｍ^３に逹するときに決定した。腫瘍成長抑制率（％ＴＧＩ）は、初期（i）腫瘍測定値及び最終（f）腫瘍測定値を使用し、処理グループ（Ｔ）対（ｖｓ）対照グループ（Ｃ）につき、以下の方程式を使用して測定した。
％ＴＧＩ＝１－（Ｔｆ－Ｔｉ）／（Ｃｆ－Ｃｉ）＊１００

各グループの経時的な相対的腫瘍サイズ変化と腫瘍成長抑制率とを図１７に示した。１Ｇ１－ｈ７０抗体は、マウスＰＤ－１抗体であるＲＭＰ１－１４抗体に比べ、顕著にすぐれた腫瘍成長抑制を示した。ＭＣ３８大腸癌シンジェニック（syngeneic）モデルは、抗ＰＤ－１療法に良好に反応しないと知られている。従って、１Ｇ１－ｈ７０抗体によるすぐれた腫瘍成長抑制効果は、予想できないのである。なお、各グループの処理によるマウスの体重には、統計的に有味な変化がなかった（データ図示せず）。

実施例１７．結晶構造解析（crystallography）を利用した１Ｇ１抗体のエピトープマッピング
１Ｇ１－ｈ７０ヒト化抗体のヒトＰＤ－１抗原（配列番号６２）に係わるエピトープマッピング（Ｘ線結晶学的方法）を実施し、前記抗体が認知するヒトＰＤ－１抗原のエピトープを確認した。１Ｇ１－ｈ７０抗体のＦａｂと、ＰＤ－１の結合複合体とを、２０℃で結晶化溶液を利用し、ハンギングドロップ蒸気拡散法（hanging drop vapor diffusion method）（drop volume＝タンパク質０．８μｌ＋リザーバー（reservoir）０．８μｌ、リザーバー体積４００μｌ）で結晶化させた。生成された単結晶につき、×線回折実験を行い、２．３０Å解像度のデータを獲得した。下記表４は、Ｘ線回折データコレクション（data collection）及び構造精密化（structure refinement）に係わる情報を整理したものである。

１Ｇ１－ｈ７０ＦａｂとＰＤ－１との相互作用で、１Ｇ１－ｈ７０抗体は、ＰＤ－１タンパク質抗原（配列６２）上のＮ６６，Ｙ６８，Ｋ７８，Ａ１２９，Ｐ１３０及びＡ１３２残基と水素結合を形成すると確認された。それらのうち、Ｙ６８、Ｋ７８、Ｎ６６は、側鎖が水素結合に関与する。

また、１Ｇ１－ｈ７０ＦａｂとＰＤ－１との相互作用により、１Ｇ１－ｈ７０抗体は、ＰＤ－１タンパク質抗原（配列６２）上のＩ１２６，Ｌ１２８，Ａ１２９，Ｐ１３０及びＡ１３２残基と疎水性結合を形成すると観察された。前記実施例１１のＡｌａスキャニング実験を介して確認されたように、１Ｇ１抗体との結合に最も重要な役割を行うと明らかにされた３種アミノ酸残基（Ｐ１３０、Ｌ１２８、Ｉ１２６）は、ＰＤ－１のＦＧループ領域（loop region）に位置し、それらによる疎水性相互作用が相乗効果（synergy）を発揮し、結合親和度に大きく寄与すると見られる。

実際、ＰＤ－１分子は、ループ領域が非常にフレキシブルであり、結合するパートナーにより、結合に適切な構造（conformation）を取ると知られている。図１８は、ＰＤ－１内において、１Ｇ１抗体との結合に重要な役割を行うＦＧループ、キイトルーダとの結合に重要なＣ’Ｄループ、オプジーボとの結合に重要なＮ末端領域（terminal region）の構造的差を示している。そのような構造変化の差は、ＰＤ－１インタラクトーム（interactome）との結合様相に違いを与えるものであり、各抗体による抗癌免疫様相が異なりうる。

実施例１８．１Ｇ１抗体のｐＨによる結合力
血液（ｐＨ７．４）と腫瘍微細環境（tumor microenvironment）（ｐＨ５．０～７．０）は、ｐＨ差があると知られている。従って、抗体結合力のｐＨ依存性（dependent）いかんにより、免疫抗癌抗体の治療的効能に影響を受けるのである。一般的に、ｐＨ差による結合力に最も敏感な残基がヒスチジン（histidine）であるが、従来、ＰＤ－１抗体であるキイトルーダとオプジーボとの場合、結合に関与する残基内にヒスチジンが存在しない。それに比べ、１Ｇ１抗体は、ＣＤＲ領域（カバット（Kabat）システム）において、重鎖ＣＤＲ２のＨ５２残基のように、ＰＤ－１タンパク質抗原と、水素結合または疎水性結合に関与するヒスチジン残基を有しているので、低いｐＨを有する腫瘍微細環境においても、ＰＤ－１との結合に寄与すると予想される。そのために、１Ｇ１－ｈ７０抗体のＰＤ－１結合力がｐＨに依存的であるか否かということを、キイトルーダ、オプジーボと共に調査した。

Biacore ８Ｋ（Cytiva）を利用したＳＰＲ（surface plasma resonance）分析を介し、各抗体のヒトＰＤ－１への結合動力学を測定し、抗体間抗原に対する結合力を比較した。抗ヒトＰＤ－１抗体対照群であるキイトルーダ（Keytruda）（ＭＳＤ（Ｌｏｔ＃Ｔ０２００３１））とオプジーボ（Opdivo）（ＢＭＳ（Ｌｏｔ＃０４３ＦＢ））は、人体用医薬品として、シンウォン薬品から購入した。また、CStone PharmaceuticalsのＷＯ２０１８／０５３７０９からの２Ｅ５クローンにより、２Ｅ５抗体を作製した。該２Ｅ５抗体は、ヒトＰＤ－１及びマウスＰＤ－１にいずれも結合し、そのエピトープ分析結果は、ＰＤ－１のＦＧ環上に位置していると開示されている。

対照群抗体（キイトルーダ、オプジーボ）、２Ｅ５抗体及び１Ｇ１抗体（１Ｇ１－ｈ７０）をProtein Ａチップ（Cytiva）上に流してキャプチャーした。７個の濃度（０～１００Ｍ）のヒトＰＤ－１を、流速３０μＬ／分で、結合（association）段階の１２０ｓの間、センサーチップに流し、１，８００ｓの解離（dissociation）に続いた。キャプチャー、結合（association）、解離（dissociation）は、ｐＨ６．０のＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーによってなる。チップは、それぞれの実験後、ｐＨ１．５のグリシンによって再生成された。Cytiva evaluationソフトウェアを利用し、結合曲線及び解離曲線を描いて、動力学及び親和度値を測定した。GraphPad Prismプログラムのone-way ANOVA with Tukey testを利用し、抗体間動態学と親和度値との有意性を判断した（＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。

図１９Ａ及び図１９Ｂは、ヒトＰＤ－１に係わる結合動力学及び親和度を、Ｋｏｎ（ｋａ値）、Ｋｏｆｆ（ｋｄ値）、ＫＤ値を介して示している。ｐＨ７．４（血液）において、１Ｇ１－ｈ７０抗体（ＫＤ＝５．４ｎＭ）は、ヒトＰＤ－１につき、キイトルーダ（ＫＤ＝６．６ｎＭ）、オプジーボ（ＫＤ＝７．１ｎＭ）及び２Ｅ５抗体（ＫＤ＝１２．６ｎＭ）に匹敵する類似したレベルの結合力を示している。しかしながら、ｐＨ６．０（腫瘍微細環境）においては、１Ｇ１－ｈ７０抗体（ＫＤ＝０．９ｎＭ）が、キイトルーダ（ＫＤ＝４．２ｎＭ）、オプジーボ（ＫＤ＝３．１ｎＭ）及び２Ｅ５抗体（ＫＤ＝４．５ｎＭ）に比べ、ヒトＰＤ－１につき、はるかに強い結合親和度を示すと確認された。それは、１Ｇ１－ｈ７０抗体が、ｐＨ６．０においても、解離（Ｋｏｆｆ）側面において、キイトルーダ、オプジーボ及び２Ｅ５抗体に比べ、解離されていない向上された結合特性を有しているためである。免疫抗癌抗体を含めた抗癌薬物の腫瘍に対する抗癌効能は、腫瘍微細環境の低いｐＨによって影響を受けるという点において、腫瘍微細環境の低いｐＨにおいても、強いヒトＰＤ－１結合力を示す１Ｇ１－ｈ７０抗体は、生体内腫瘍微細環境において、顕著にすぐれた抗癌活性を示す根拠になる。

実施例１９．親和度成熟（affinity maturation）
１Ｇ１－ｈ７０抗体のヒトＰＤ－１に係わる親和度を増大させるために、親和度成熟化を進めた。１Ｇ１－ｈ７０抗体のＣＤＲ領域の各アミノ酸残基を、Ｅ．coliに係わる最適コドンを使用し、他の１９個のアミノ酸に突然変異させた。マイクロアレイ上において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーを合成し、クローンを選択し、Ｅ．coliにおいて発現させた。

培地に分泌された粗タンパク質を、ＢＳＡ及びヒトＰＤ－１タンパク質に対し、ＥＬＩＳＡで分析し、発現及び結合親和度を分析した。向上された値を有するクローンを選択し、配列を分析した。ＳＰＲによる親和度順位により、「良好な突然変異（beneficial mutant）」を確認した。Biacore Ｔ２００上において、解離速度（off-rate）スクリーニングを行った。ランニングバッファーは、ＨＢＳ－ＥＰ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、５００ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ Tween２０）（ｐＨ７．４）であった。培養培地に分泌された選択されたクローンのＦａｂ－ＳＡＳＡは、ＳＡＳＡ捕獲バイオセンサーに捕獲された。平衡後、抗原を１２０秒（association phase）間注入した後、４２０秒（dissociation phase）間、ランニングバッファーを注入した。他の選択されたクローンを注入する前、表面を再生し、この工程を全てのサンプルを分析するまで繰り返した。Ｆａｂ－ＳＡＳＡクローンの解離速度は、Biacore Ｔ２００評価ソフトウェアを使用し、実験データをローカルに、１：１相互作用モデルに整合させて得た。選択された突然変異を、それらの解離定数（off-rates）（ｋｄ）によって順位を付けた。

「良好な突然変異」が確認されれば、それら突然変異のランダム組み合わせによってなる組み合わせライブラリー（combinational library）をＰＣＲによって構成した。組み合わせクローンをＥＬＩＳＡによって分析し、ＤＮＡ配列分析と親和度順位指定との作業を遂行した。発現が低下されずに、最も高い親和度増大を起こす「良好な突然変異」の上位組み合わせを最終選定し、抗体親和度を測定した。

親和度成熟後、総１３個のヒト化ＰＤ－１抗体（ＡＨＦ１６５５６、ＡＨＦ１６５５７、ＡＨＦ１６５５８、ＡＨＦ１６５５９、ＡＨＦ１６５６０、ＡＨＦ１６５６１、ＡＨＦ１６５６３、ＡＨＦ１６５６４、ＡＨＦ１６５６５、ＡＨＦ１６５６６、ＡＨＦ１６５６８、ＡＨＦ１６５６９及びＡＨＦ１６５７０）を得た。それら抗体は、１Ｇ１－ｈ７０親抗体（ＷＴ）に比べ、３つのＣＤＲ領域（ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１）において、下記表５のようなアミノ酸置換を有している。

それら抗体のヒトＰＤ－１に係わる結合動力学データを下記表６に示した。

配列リスト

以上においては、本開示内容について説明したが、本開示内容は、開示された実施例、及び添付図面によって限定されるものではなく、本開示内容の技術的思想を外れない範囲以内において、通常の技術者により、多様に変形されうる。また、本開示内容の実施例において説明された技術的思想は、それぞれ独立して実施されもし、２以上が互いに組み合わせされても実施される。

Claims

配列番号６２のＰ１３０、Ｌ１２８及びＩ１２６アミノ酸を含むプログラムされた細胞死滅１（ＰＤ－１）タンパク質のエピトープ（epitope）に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６２のＮ６６、Ｙ６８、Ｋ７８、Ａ１２９及びＡ１３２によってなる群のうちから選択された１以上を含むさらなるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＰＤ－１及びマウスＰＤ－１に同等なレベルの結合力を有する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ６．０において、９Ｅ－１０Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
ＰＤ－１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）と、
配列番号３，６３，６４，６５，６６または６７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２と、
配列番号５、及び配列番号６８ないし８２によってなる群のうちから選択されたアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３と、
配列番号７，６０，８３または８４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）と、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、
配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む、抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、ミュリン（murine）抗体、キメリック抗体、またはヒト化（humanized）抗体である、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
ＰＤ－１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合断片。
ＰＤ－１タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合断片であり、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号１３，５４，５６または５８のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号１５，５５，５７または５９のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合断片。
請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を暗号化する、核酸分子。
請求項９に記載の核酸分子を含む、クローニングベクターまたは発現ベクター。
請求項１０に記載のクローニングベクターまたは発現ベクターを含む、宿主細胞。
請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を暗号化する核酸分子を含むクローニングベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞を培養する段階を含む、請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を生産する方法。
前記抗体または抗原結合断片は、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、Ｆ（ａｂ’）_２，Ｆａｂ’，Ｆａｂ，Ｆｖ，ｓｃＦｖ，ｓｃＦＶダイマー、ＢｓＦｖ，ｄｓＦｖ，（ｄｓＦｖ）２，ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’，Ｆｖ断片、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ミニボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、ｄＡｂ、及び一本鎖結合ポリペプチドのうちから選択される、請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現するように操作された、遺伝子導入動物。
前記動物は、齧歯類である、請求項１４に記載の遺伝子導入動物。
請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルス。
請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいはそれを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスを含む、ＰＤ－１と関連する状態を予防または治療するための薬学的組成物。
ＰＤ－１と関連する状態が、腫瘍、癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患または感染性疾患である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
ＰＤ－１と関連する状態である腫瘍または癌が、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、腎臓癌、肝臓癌、骨癌、皮膚癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌腫、膀胱癌、食道癌、中皮腫、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、膠芽細胞腫、子宮頸部癌、胸腺癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞癌、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔巨大Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富Ｂ細胞リンパ腫、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）陽性及びＥＢＶ陰性の移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ＥＢＶ関連彌満性巨大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽細胞リンパ腫、外部ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、非咽頭癌腫、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）関連原発性滲出リンパ腫、ホジキンリンパ腫を含む他の血液癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫を含む中枢神経系の新生物のうちから選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
ＰＤ－１と関連する状態である自己免疫疾患が、ループス、全身性紅斑性ループス、シェーグレン症侯群（Sjogren’s syndrome）、関節炎、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病（Alzheimer’s disease）、炎症性腸疾患、クローン病（Crohn’s disease）、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病（Peyronie’s disease）、セリアック病（coeliac disease）、胆嚢疾患、毛巣病（pilonidal disease）、腹膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、血管炎、手術後癒着（surgical adhesions）、脳卒中、第１型糖尿病、ライム病（lyme disease）、髄膜脳炎、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症侯群（Guillain-Barre syndrome）、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病（Grave’s disease）、ＩｇＡ腎臓病、特発性血小板減少性紫班病、メニエール病（Meniere’s disease）、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症（Wegener’s granulomatosis）、他の自己免疫疾患、膵臓炎、トラウマ（手術）、移植片対宿主疾患、移植拒否反応、心筋梗塞及びアテローム性動脈硬化症のような虚血性疾患を含む心臓病、血管内凝固、骨吸収、骨多孔症、骨関節炎、歯周炎及び低塩酸症、胎児・母体間寛容の欠如と係わる不妊症（infertility related to lack of fetal-maternal tolerance）、白斑症、重度筋無力症及び全身性硬化症のうちから選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
ＰＤ－１と関連する状態である神経系疾患または神経退行性疾患が、認知障害、脳腫瘍、アルツハイマー病、痴呆、脳卒中（stroke）、脊髄損傷（spinal cord injury）、筋委縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症（multiple sclerosis）、膠芽腫（glioblastoma）、黒色腫（melanoma）、痛症（pain）、及び記憶減退のうちから選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
ＰＤ－１と関連する状態である感染性疾患が、Ｂ型肝炎・Ｃ型肝炎のウイルス感染、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス類型Ｉ、単純ヘルペスウイルス類型ＩＩ、ヒト乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス伝染と関連するカポシウェスト肉腫、薄リングウイルス（トルクテノウイルス）、ＪＣウイルスまたはＢＫウイルス感染を含む慢性ウイルス感染のうちから選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、及びそれらを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体及び腫瘍死滅ウイルスによって構成された群のうちから選択された１以上を個体に投与する段階を含む、腫瘍、癌、自己免疫疾患、神経系疾患、神経退行性疾患または感染性疾患を予防または治療する方法。
請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、あるいはそれを含む多重特異的抗原結合分子、免疫接合体、キメラ抗原受容体、作製されたＴ細胞受容体または腫瘍死滅ウイルスを含む、癌を有する大上体で免疫反応を増加させるための薬学的組成物。
ＰＤ－１ノックアウトマウスをＰＤ－１抗原で免疫化させた後、脾臓を取り出してＢリンパ球を分離させた後、骨髄腫（myeloma）細胞と融合させて得られたハイブリドーマ細胞において、ヒトＰＤ－１抗原と反応する抗体を生産するハイブリドーマを選別することを含む、請求項１，２、及び請求項５ないし８のうち、いずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を生産する方法。
請求項２５に記載の方法によって製造された、ハイブリドーマ。