JP2024505987A - 抗ｔｎｆｒ２抗体およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗体ＴＮＦＲ２抗体、その調製方法、組成物および使用に関する。本発明は、がんなどのＴＮＦＲ２関連疾患および／または病症を治療するための方法をさらに提供する。

Description

本発明は、抗体ＴＮＦＲ２抗体、その調製方法、組成物および使用に関する。本発明は、がんなどのＴＮＦＲ２関連疾患および／または病症を治療するための方法をさらに提供する。

ＩＩ型腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ２、ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５またはＴＮＦＲＳＦ１Ｂともいう）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーメンバーである。ＴＮＦＲ２は、サイトカインＴＮＦαの受容体として、様々なタイプのがん細胞、および腫瘍に浸潤して免疫系活性を阻害可能な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表面に高く発現している。ＴＮＦαは、ＴＮＦＲ２と結合することにより、下流のＮＦｋＢシグナル伝達を活性化し、強化されたＴｒｅｇ細胞の増殖をもたらすことができる。腫瘍微小環境において存在度の高いＴＮＦＲ２－陽性Ｔｒｅｇ細胞があることは、既に様々なヒトおよびネズミがんにおいて発見された。従って、腫瘍微小環境のＴｒｅｇ細胞および腫瘍細胞上のＴＮＦＲ２を標的にすることによるがんの治療は、有望な治療方法である。例えば、ＷＯ２０１７／０８３５２５には、いくつかの拮抗性ＴＮＦＲ２抗体が開示されており、かつがん治療におけるその使用が提案されている。

腫瘍免疫反応におけるＴＮＦＲ２の潜在的な標的作用に鑑み、当該分野においては、疾患の治療、特にがんの治療のために、新たなＴＮＦＲ２抗体、特に強い遮断作用および直接的な腫瘍殺傷活性を有する抗ＴＮＦＲ２抗体を開発する必要がある。

本発明者は、深く研究することで、新たな抗ＴＮＦＲ２抗体を提供する。本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体は、強いＴＮＦＲ２遮断活性を有し、かつ一部の分子が新しい遮断メカニズムを有し、ＴＮＦαと受容体ＴＮＦＲ２の結合を遮断せずにＴＮＦＲ２の重合を直接阻害することで、ＴＮＦα／ＴＮＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を阻害することができる。本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体は、動物実験において良好な抗腫瘍薬効結果を示している。

従って、一態様において、本発明は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９と６４に示される重鎖可変領域のうちの１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、かつ／または配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３１と６５に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、あるいは上記ＣＤＲ配列の組み合わせの変異体を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、
（ｉ）高親和性でヒトＴＮＦＲ－２と結合するが、ヒトＴＮＦＲ－１と結合しないこと、
（ｉｉ）サルＴＮＦＲ－２との交差免疫反応性を有すること、
（ｉｉｉ）特にリンパ腫細胞などの腫瘍細胞およびＴｒｅｇ細胞である細胞の表面上のＴＮＦＲ－２と効果的に結合すること、
（ｉｖ）ＴＮＦＲ－２とリガンドＴＮＦαの結合を遮断すること、
（ｖ）ＴＮＦαのＴＮＦＲ－２との結合により媒介されるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を阻害すること、
（ｖｉ）ＡＤＣＣシグナル伝達経路を活性化すること、および
（ｖｉｉ）腫瘍の成長への阻害などの抗腫瘍活性を有すること、
という１つまたは複数の特性を有する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の例示的な抗体（例えば、下記の表Ｂに示される抗体ＶＨおよびＶＬ配列の組み合わせを有する抗体）と同じまたは重複するエピトープと結合する、かつ／またはＴＮＦＲ２と競合的に結合する、かつ／または本発明の例示的な抗体を阻害する（例えば、競合的に阻害する）、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、上記核酸を含むベクター、上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を調製する方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体を含む免疫複合体、医薬組成物および組み合わせ製品を提供する。

別の態様において、本発明は、例えば、インビボとインビトロで、ＴＮＦＲ－２とそのリガンドＴＮＦαの結合を遮断および／または拮抗すること、かつ／または上記結合による生物学活性、例えば、ＴＮＦＲ２受容体の活性化および／またはＴｒｅｇ細胞の増殖ＴＮＦＲ２受容体の活性化および／またはＴｒｅｇ細胞の増殖を遮断および／または拮抗することに用いられること、かつ／またはインビボとインビトロで表面にＴＮＦＲ２を発現した腫瘍細胞を殺傷することに用いられることを含むが、これらに限定されない、本発明のＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を適用するインビボとインビトロ方法および使用を提供する。

別の態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を適用してＴＮＦＲ２関連疾患を予防または治療する方法および使用をさらに提供し、上記疾患は、結腸がんまたは慢性骨髄性白血病などの腫瘍を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、唯一の活性剤としてもよく、または、他の治療法もしくは治療剤と併用投与してもよい。

別の態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を適用して試料においてＴＮＦＲ２を検出する方法および試薬キットをさらに提供する。

下記の図面および具体的な実施形態で本発明をさらに説明する。しかし、これらの図面および具体的な実施形態は、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではなく、当業者が容易に想到できる変更は、本発明の精神および添付される特許請求の範囲に含まれる。

フローサイトメトリーによってハイブリドーマ抗体とヒトＴＮＦＲ２過剰発現安定形質転換細胞株ｈＴＮＦＲ２ ＣＨＯ－Ｓとの結合能力への測定を示す。 フローサイトメトリーによってハイブリドーマ抗体とカニクイザルＴＮＦＲ２安定形質転換細胞株ｃＴＮＦＲ２ ＣＨＯ－Ｓとの結合能力への測定を示す。 ＥＬＩＳＡ法によってＴＮＦα／ＴＮＦＲ２に対するハイブリドーマ抗体の遮断作用の検出を示す。 フローサイトメトリーによってキメラ抗体とヒトＴＮＦＲ２過剰発現安定形質転換細胞株ｈＴＮＦＲ２ ＣＨＯ－Ｓとの結合能力への測定を示す。 フローサイトメトリーによってキメラ抗体とカニクイザルＴＮＦＲ２過剰発現安定形質転換細胞株ｃＴＮＦＲ２ ＣＨＯ－Ｓとの結合能力への測定を示す。 ＥＬＩＳＡ法によってＴＮＦα／ＴＮＦＲ２に対するキメラ抗体の遮断作用の検出を示す。 Ｊｕｒｋａｔ ＴＮＦＲ２ ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子検出法によって、ＴＮＦＲ２シグナル伝達経路のＴＮＦαによる活性化に対するキメラ抗体の阻害作用の検出を示す。 フローサイトメトリーによってヒト化抗体とヒトｈＴＮＦＲ２ ＣＨＯ－Ｓ安定形質転換細胞株との結合能力への測定を示す。 ＥＬＩＳＡ法によってＴＮＦα／ＴＮＦＲ２に対するヒト化抗体の遮断作用の検出を示す。 Ｊｕｒｋａｔ ＴＮＦＲ２ ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子検出法によって、ＴＮＦＲ２シグナル伝達経路のＴＮＦαによる活性化に対するヒト化抗体の阻害作用の検出を示す。 フローサイトメトリーによってヒト化抗体とヒトＫ５６２ ＣＭＬ細胞株（Ａ）および初代Ｔｒｅｇ細胞（Ｂ）との結合能力への測定を示す。 Ｊｕｒｋａｔ ＡＤＣＣルシフェラーゼレポーター遺伝子検出法によって、ＡＤＣＣシグナル伝達経路に対するヒト化抗体の活性化作用の検出を示す。 Ｋ５６２ ｍａｔｒｉｇｅｌ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ動物モデルによってＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果の検出を示す。 ＭＣ３８－ＴＮＦＲ２皮下接種Ｃ５７動物モデルによってＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果の検出を示す。 本発明の例示的なキメラ抗体およびヒト化抗体のＣＤＲ配列を示す。 本発明の例示的なキメラ抗体およびヒト化抗体のＶＨとＶＬ配列を示す。

発明の詳細な説明
定義
別に定義しない限り、本明細書に使用されるすべての技術と科学用語はいずれも、当業者に通常に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下、下記の用語を定義する。

「約」という用語は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

「かつ／または」という用語は、選択可能オプションのうちのいずれか１項または選択可能オプションのいずれか２項もしくは複数項の組み合わせを指すと理解すべきである。

本明細書に使用されるように、「包含する」または「含む」という用語は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、「包含する」または「含む」という用語を用いる場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある具体的な配列を「含む」抗体可変領域が言及される場合、この具体的な配列からなる抗体可変領域を含むことも意図する。

本明細書において、「抗体」という用語は、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを指し、上記免疫グロブリン可変領域は、抗原を特異的に認識して結合する。当該用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体または複数鎖抗体、単特異性または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体、全長抗体と抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を含むが、所望の抗原結合活性を表現すればよい。

当業者は、「全抗体」（本明細書では、「全長抗体」、「完全抗体」、「完全な抗体」と切り替えて使用可能）が少なくとも２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ）を包含することが分かる。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインで構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。可変領域は、抗体の重鎖または軽鎖における、抗体とその抗原の結合に関与するドメインである。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示している。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つのタイプ（ｋａｐｐａ（κ）とｌａｍｂｄａ（λ）と称される）の一方に分類することができる。抗体の重鎖は、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて主にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧとＩｇＭという５つの異なるタイプに分けることができ、かつこれらのタイプのうちのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４、ＩｇＡ１とＩｇＡ２などのサブクラスにさらに分けることができる。異なる抗体のタイプに対応する重鎖定常領域はそれぞれ、α、δ、ε、γおよびμと称される。「アイソタイプ」という用語は、抗体の重鎖定常領域によって決定される抗体のタイプを指す。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐａｕｌ，Ｗ．，２ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（すべての目的のために、その全体が参照によりここに組み込まれる）を参照する。

抗体の「抗原結合部分」（本明細書では、「抗体断片」および「抗原結合断片」と切り替えて使用可能）という用語は、完全な抗体ではない分子を指し、完全な抗体における当該完全な抗体が結合する抗原と結合するための部分を包含する。当業者に理解されるように、抗体の抗原結合部分は、通常、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を包含する。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、または酵素的もしくは化学的に完全な抗体を切断することにより調製することができる。抗原結合断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、二本鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三本鎖抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四本鎖抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むが、これらに限定されない。抗体断片のより詳細な説明については、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ）邵栄光ら、抗体薬物の研究および応用、人民衛生出版社（２０１３）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４ー６４４８（１９９３）、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９ー１３４（２００３）を参照することができる。

「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの生物種に由来して、定常領域配列が別の生物種に由来する抗体を指し、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体である。

「ヒト化抗体」という用語用語は、他の哺乳動物種、例えばマウス生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に接続する抗体を指す。例えば、抗体の親和性成熟を行うために、ヒトフレームワーク配列において追加のフレームワーク領域修飾を行い、かつ／またはＣＤＲ配列において追加のアミノ酸修飾を行うことができる。

「単離した」抗体は、既にその天然環境における成分と単離した抗体である。いくつかの実施形態において、抗体を９５％もしくは９９％より高い純度に精製し、上記純度は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって定められる。抗体の純度を評価する方法についての概説は、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９ー８７を参照する。

「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原領域を指す。エピトープは、連続的なアミノ酸から形成され、またはタンパク質の３次フォールディングにより並置された非連続的なアミノ酸から形成される。

本明細書において、ＴＮＦＲ２は、「腫瘍壊死因子受容体２」を指し、ＴＮＦＲＳＦ１ＢおよびＣＤ１２０ｂとも呼ばれる。当該受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、細胞表面結合受容体として、がん細胞および腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞において発現可能である。ＮＦ－ＫＢシグナル伝達経路を調節することにより、ＴＮＦＲ２は、細胞の生存と増殖を促進する遺伝子の転写を調節することができる。本明細書において、当該表現は、ＴＮＦＲ２およびその変異体、アイソタイプ、ホモログと種ホモログをカバーしている。本発明による一実施形態において、ＴＮＦＲ２は、ヒト由来のＴＮＦＲ２であり、例えば、配列番号６０に示されるヒトＴＮＦＲ２、または配列番号６０と少なくとも９５％、さらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するヒトＴＮＦＲ２である。本発明による別の実施形態において、ＴＮＦＲ２は、サル由来のＴＮＦＲ２であり、例えば、配列番号６１に示されるヒトＴＮＦＲ２、または配列番号６１と少なくとも９５％、さらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するヒトＴＮＦＲ２である。本明細書において、ＴＮＦＲ２は、ＴＮＦＲ２の断片、例えば、細胞外ドメインを含む断片、例えば、本発明のいずれかの抗体との結合能力を保持する断片を含んでもよい。本明細書において、ＴＮＦαは、ＴＮＦＲ２の天然のアゴニストリガンドである「腫瘍壊死因子α」を指す。本明細書において、ＴＮＦＲ１は「腫瘍壊死因子受容体１」を指し、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ登録番号Ｐ１９４３８でのヒトＴＮＦＲ１である。

「特異的に結合する」という用語は、抗体が抗原と選択的にまたは優先的に結合することを示す。光干渉による生体測定において、抗体が約５ｘ１０^－７Ｍまたはそれ以下、約１ｘ１０^－７Ｍまたはそれ以下、約５ｘ１０^－８Ｍまたはそれ以下、約１ｘ１０^－８Ｍまたはそれ以下、約５ｘ１０^－９Ｍまたはそれ以下のＫ_Ｄで、ヒトＴＮＦＲ２と結合すると、当該抗体は「ヒトＴＮＦＲ２と特異的に結合する」抗体である。しかし、ヒトＴＮＦＲ２と特異的に結合する抗体は、他の種由来のＴＮＦＲ２タンパク質と交差反応性を有し得る。例えば、ヒトＴＮＦＲ２に特異的な抗体は、いくつかの実施形態において、非ヒト種のＴＮＦＲ２タンパク質と交差反応することができる。他のいくつかの実施形態において、ヒトＴＮＦＲ２に特異的な抗体は、種もしくは他のタイプの交差反応性を示さずにヒトＴＮＦＲ２に完全に特異的であり、またはある種のＴＮＦＲ２に対する交差反応性のみを示してもよい。

本明細書にに使用されるように、「交差反応」という用語は、抗体が異なる種由来のＴＮＦＲ２と結合する能力を指す。例えば、本明細書に記載のヒトＴＮＦＲ２と結合する抗体は、他の種由来のＴＮＦＲ２（例えば、カニクイザルＴＮＦＲ２）と結合してもよい。交差反応性を測定する方法は、実施例に記載される方法、および本分野で既知の標準的な測定法、例えば、光干渉による生体測定法、またはフローサイトメトリー技術を含む。

「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー同士間の相互作用を反映する固有結合親和性を指す。その配偶子Ｙに対する分子Ｘの親和性は、通常、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって示され、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋ_ｄｉｓとｋ_ｏｎである）との比である。親和性は、本分野で既知の通常の方法により測定することができる。親和性を測定するための具体的な方法の１つは、本明細書におけるＦｏｒｔｅＢｉｏ動態結合測定法である。

「高親和性」という用語は、ＩｇＧ抗体に対して、当該抗体が１ｘ１０^－７Ｍまたはそれ以下、好ましくは５ｘ１０^－８Ｍまたはそれ以下、より好ましくは約１ｘ１０^－８Ｍまたはそれ以下、さらにより好ましくは約５ｘ１０^－９Ｍまたはそれ以下のＫ_Ｄで、標的抗原と結合することを指す。しかし、「高親和性」結合は、抗体アイソタイプによって変化することができる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対して、「高親和性」は、抗体が１ｘ１０^－６Ｍまたはそれ以下、好ましくは１ｘ１０^－７Ｍまたはそれ以下、より好ましくは約１ｘ１０^－８Ｍまたはそれ以下のＫ_Ｄを有することを指す。

ＴＮＦＲ２などの抗原と結合する参照抗体「競合的に結合する抗体」は、競合検定において、参照抗体と抗原（例えば、ＴＮＦＲ２）との結合の５０％またはそれ以上を遮断し、逆に、参照抗体が競合検定において当該抗体と抗原（例えば、ＴＮＦＲ２）との結合の５０％またはそれ以上を遮断する抗体を指す。例示的な競合検定は、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されている。競合的に結合する抗体は、参照抗体と同じエピトープ領域、例えば、同じエピトープ、隣接するエピトープまたは重複するエピトープと結合することができる。

参照抗体とその抗原との結合を阻害（例えば、競合的阻害）する抗体とは、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上の上記参照抗体とその抗原との結合を阻害する抗体である。逆に言えば、参照抗体は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上の当該抗体とその抗原との結合を阻害する。抗体とその抗原との結合は、親和性（例えば、平衡解離定数）で測定することができる。親和性の測定方法は、この分野で既知の内容である。

参照抗体と同様もしくは類似の結合親和性および／または特異性を示す抗体は、参照抗体の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％以上の結合親和性および／または特異性があり得る抗体を指す。これは、当該分野での既知の結合親和性および／または特異性の任意の測定方法により測定することができる。

本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、少なくとも一部の定常領域を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域を定義するために用いられる。当該用語は、天然配列Ｆｃ－領域および変異体Ｆｃ－領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ－領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からまたはＰｒｏ２３０からカルボキシル末端に延伸する。しかし、Ｆｃ－領域のＣ－末端リシン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、または存在しなくてもよい。本明細書に特に断りのない限り、Ｆｃ－領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムによるものであり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載されている。

「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ－領域による生物活性を指し、抗体の種類によって変化する。主な抗体クラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧとＩｇＭという５つがあると知られており、かつこれらの一部は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１とＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けることができる。ＩｇＧＦｃ領域は、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、貪食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体と抗原－抗体複合体の半減期／クリアランス速度などのいくつかの重要なエフェクター機能を媒介することができる。治療の目的によっては、これらのエフェクター機能は、治療用抗体に望まれるものである場合があるが、他の場合に、不要または有害なものである可能性がある。従って、一実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域においてアミノ酸残基変化を有することで抗体エフェクター機能を変化させる変異体Ｆｃ領域およびそのスクリーニング方法を提供する。例えば、抗体のＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基を置換することにより、抗体のエフェクター機能を変えることができる。

「ＡＤＣＣ」は、抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害を指す。ＡＤＣＣは、人体において主にナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）により媒介される。ＡＤＣＣにおいて、抗体は、標的細胞表面にディスプレイされた抗原と結合し、ＮＫ細胞表面のＦｃγＲＩＩＩＡにより抗体のＦｃ領域を認識することで、ＮＫ細胞を活性化し、パーフォリンとグランザイムを放出し、標的細胞の溶解とアポトーシスを引き起こす。標的分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロ測定試験の非限定的な実例は、ＵＳ５，５００，３６２（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ、Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６）７０５９－７０６３、およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（１９８５）１４９９－１５０２を参照してもよい）、ＵＳ ５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１－１３６１を参照してもよい）に記載されている。または、非放射性測定方法（例えば、フローサイトメトリーに用いられるＡＣＴＩＴＭ非放射性の細胞傷害測定（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）およびＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性の細胞傷害測定（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を採用することができる。これらの測定に適用されるエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいはまたはさらに、インビボで標的分子のＡＤＣＣ活性を評価することができ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１９９８）６５２－６５６に開示された動物モデルにおいて評価する。

「ＣＤＣ」は、補体依存性細胞傷害を指す。ＣＤＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、補体分子Ｃ１ｑと結合し、それにより膜攻撃複合体を形成し、標的細胞のクリアランスを引き起こす。例えば、ＬｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＡｔｋｉｎｓｏｎ，ｃｈ．２６，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄｉｔｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３，ｐｐ９１７－９４０を参照する。

「ＡＤＣＰ」は、抗体依存性細胞媒介性の貪食作用を指す。Ｆｃ受容体により媒介されるこのプロセスにおいて、抗体と結合する標的細胞は、マクロファージ、単核細胞、好中球と樹状細胞などの貪食細胞により貪食される。複数種のＦｃ受容体は、当該プロセスに関与することができる。Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７－２５２７（２００８）には、ＡＤＣＰのためのインビトロ試験が記載されている。

抗体に関連する「変異体」という用語は、本明細書において、参照抗体と比べて、既に少なくとも１個、例えば、１個～３０個、１個～２０個または１個～１０個、例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失および／または挿入によってアミノ酸変化を有する標的抗体領域を含む抗体を指し、ここで、変異体は、基本的に変化前の抗体分子の少なくとも１つの生物学的特性（例えば、抗原結合能力）を保持する。標的抗体領域は、抗体全長、あるいは重鎖可変領域、軽鎖可変領域またはそれらの組み合わせ、あるいは（１つもしくは複数の）重鎖ＣＤＲ領域、（１つもしくは複数の）軽鎖ＣＤＲ領域またはそれらの組み合わせであってもよい。本明細書において、参照抗体領域に対してアミノ酸変化を有する抗体領域は、当該抗体領域の「変異体」とも呼ばれる。

本明細書において、「配列同一性」は、比較ウィンドウにおいて１つずつのヌクレオチドまたは１つずつのアミノ酸に基づく配列が同一である程度を指す。「配列同一性百分率」は、次の方法により算出することができる：最適にアラインメントされた２つの配列を比較ウィンドウで比較し、２つの配列において同じ核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同じアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が存在する位置の数を決定することでマッチングした位置の数を取得し、マッチングした位置の数を比較ウィンドウにおける総位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、その結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得る。配列同一性百分率を決定するために行われる最適なアラインメントは、本分野で既知の種々の方法により、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアで実現することができる。当業者は、比較されている全長配列範囲内または標的配列領域内での最大アラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。

本発明において、抗体配列について、アミノ酸配列同一性百分率は、候補抗体配列を参照抗体配列と最適にアラインメントした後、好ましい一形態でＫａｂａｔ番号付け規則に従って最適なアラインメントを行った後に決定される。本明細書において、比較ウィンドウ（すなわち、比較すべき標的抗体領域）を指定しない場合、参照抗体配列の全長でアラインメントすることに適用される。いくつかの実施形態において、抗体について、配列同一性は重鎖可変領域全体および／または軽鎖可変領域全体に分布することができ、あるいは配列百分率同一性はフレームワーク領域のみに限定され、ＣＤＲ領域に対応する配列は１００％同じに保持する。

同様に、抗体配列について、アラインメントに基づき、参照抗体に対して標的抗体領域においてアミノ酸変化アミノ酸変化を有する候補抗体を決定することができる。

本発明において、「保存的置換」は、あるアミノ酸の化学的に類似なアミノ酸への置換を引き起こすアミノ酸変化を指す。部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性の変異誘発のような本分野で既知の標準的な方法によって、置換などのアミノ酸修飾を本発明の抗体に導入することができる。

機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、本分野でよく知られているものである。好ましい一態様において、保存的置換残基は、以下の保存的置換表Ａに由来し、好ましくは表Ａに示される好ましい保存的置換残基である。

本発明の各態様は、以下の各セクションにおいてさらに詳細に説明される。

Ｉ．本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体
本発明の一態様は、ＴＮＦＲ２、好ましくはヒトＴＮＦＲ２タンパク質（例えば、配列番号６０、ＮＭ＿００１０６６．２のヒトＴＮＦＲ２配列）と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、特にヒト化抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体、（Ｆａｂ’）_２断片、シングルドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）または線状抗体から選ばれる抗体断片である。

抗体の有利な生物学的特性
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、高親和性でヒトＴＮＦＲ２と結合し、例えば、解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）は約５０ｘ１０^－９Ｍ以下、より好ましくは約１ｘ１０^－９Ｍ～３０ｘ１０^－９Ｍ、さらにより好ましくは約５ｘ１０^－９Ｍ以下であり、例えば約２ｎＭ、１．５ｎＭ、１．０ｎＭ、０．５ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭである。好ましくは、Ｋ_Ｄは、光干渉による生体測定法（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定法）により測定される。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片とヒトＴＮＦＲ２との結合の解離定数は、例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定法により決定され、約１ｘ１０^－４ｓ^－１～２０ｘ１０^－４ｓ^－１であり、例えば、約２ｘ１０^－４ｓ^－１、約５ｘ１０^－４ｓ^－１、約１０ｘ１０^－４ｓ^－１、約１５ｘ１０^－４ｓ^－１、約２０ｘ１０^－４ｓ^－１である。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、サルＴＮＦＲ２と交差反応する。いくつかの実施形態において、抗体は、高親和性でカニクイザルＴＮＦＲ２と結合し、ここで、Ｋ_Ｄ値（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定法による）は、約５０ｘ１０^－９Ｍ以下、より好ましくは約１ｘ１０^－９Ｍ～３０ｘ１０^－９Ｍ、さらにより好ましくは約５ｘ１０^－９Ｍ以下である。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、高親和性で細胞表面に発現したＴＮＦＲ２と結合する。一実施形態において、上記表面にヒトＴＮＦＲ２を発現した細胞は、腫瘍細胞（例えば、リンパ腫細胞、例えば、Ｋ５６２細胞）、Ｔｒｅｇ細胞（例えば、ヒト末梢血天然ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^ＬＯＷ 制御性Ｔ細胞）、またはＴＮＦＲ２を組換え発現した哺乳動物細胞である。好ましくは、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）により、抗体とヒトＴＮＦＲ２を発現した細胞との結合のＥＣ５０値を測定する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体と細胞表面ＴＮＦＲ２との結合のＥＣ５０値は１０ｎＭ未満、例えば０．１ｎＭ～５ｎＭであり、例えば、ＴＮＦＲ２を組換え発現したＣＨＯ細胞においてフローサイトメトリーにより測定される。別の実施形態において、本発明の抗体と細胞表面ＴＮＦＲ２との結合のＥＣ５０値は１００ｐＭ未満、例えば２０ｐＭ～６０ｐＭであり、例えば、Ｋ５６２細胞またはヒト末梢血Ｔｒｅｇ細胞においてフローサイトメトリーにより測定される。当業者は、細胞表面ＴＮＦＲ２の密度が抗体と細胞の結合ＥＣ５０の測定値に影響を及ぼす場合があることが分かる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＴＮＦＲ２とそのリガンドＴＮＦαとの結合を遮断する。フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）により、ヒトＴＮＦＲ２（細胞に発現したＴＮＦＲ２）とヒトＴＮＦαの結合を遮断する抗体の能力（例えば、ＩＣ５０値と最大遮断活性）を測定することができる。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＴＮＦＲ２（細胞に発現したＴＮＦＲ２）とヒトＴＮＦαの結合を完全に遮断することができる。いくつかの実施形態において、ＦＡＣＳにより測定し、本発明の抗体のＩＣ５０値は約１０ｎＭ未満、例えば、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭまたは６ｎＭである。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合によるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を低減する。いくつかの実施形態において、蛍光レポーター遺伝子試験（例えば、実施例のＪｕｒｋａｔ ＮＦ－κＢ蛍光レポーター試験）により、ＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合によるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を低減する抗体の能力（例えば、最大阻害およびＩＣ５０値）を検出する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合によるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を遮断し、抗体を加えない場合に比べて、３倍以上の阻害に達することができる。いくつかの実施形態において、抗体のＩＣ５０値は、約０．１ｎＭ～１０ｎＭ未満である。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片と細胞ＴＮＦＲ２の結合は、ＮＫおよび／またはエフェクターＴ細胞の存在下でＡＤＣＣシグナル伝達経路を活性化する。好ましくは、本発明の抗体は、ＡＤＣＣ活性によりＴＮＦＲ２陽性腫瘍細胞を殺傷することができる。いくつかの実施形態において、蛍光レポーター遺伝子試験（例えば、実施例のＪｕｒｋａｔ ＡＤＣＣルシフェラーゼレポーター遺伝子検出試験）により、抗体とＴＮＦＲ２の結合によるＡＤＣＣ蛍光シグナルの能力（例えば、最大活性化作用およびＥＣ５０値）を検出する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴＮＦＲ２を発現した腫瘍の成長を阻害する。一実施形態において、腫瘍細胞は、ヒトＴＮＦＲ２を発現したリンパ腫細胞、例えば慢性骨髄性白血病細胞であり、またはヒトＴＮＦＲ２を発現した固形腫瘍細胞、例えば結腸がん細胞である。さらなる一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＡＤＣＣ依存性腫瘍細胞殺傷活性を引き起こす。別のいくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、（例えば、腫瘍微小環境において）ＴＮＦＲ２を発現した免疫抑制性制御性Ｔｒｅｇ細胞の機能を阻害する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、
－免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞に作用し、その増殖を阻害することで、宿主の免疫機能の回復に有益であること、および
－表面にＴＮＦＲ２を発現したがん細胞に直接作用し、ＡＤＣＣ依存性腫瘍細胞殺傷活性を引き起こすこと、
のうちの少なくとも１つまたは好ましくは２つの作用を有する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、レシピエント（例えば、実施例の担腫瘍マウスなどの担腫瘍動物モデル）において少なくとも１０％の腫瘍阻害率、例えば、少なくとも２０％～５０％もしくはそれ以上の腫瘍阻害率に達する。

好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、上記の特性の少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つ、４つ、または５つ、さらにより好ましくは上記のすべての特性を示す。

抗体のＣＤＲ領域
「相補性決定領域」、「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」（本明細書において、超可変領域「ＨＶＲ」と入れ替えて使用可能である）は、抗体可変領域において主に抗原エピトープとの結合を担当するアミノ酸領域にわたってある。重鎖および軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号付けられる。抗体の重鎖可変ドメインにあるＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメインにあるＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３と呼ばれる。

下記の表Ｂには、本発明のいくつかの例示的な抗体のＶＨおよびＶＬ配列の組み合わせを示す。

本分野では、所定のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列にそのＣＤＲ配列を決定するための方案が複数既知されている。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列変異性によって決定され、かつ最もよく用いられるものである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、構造リングの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造リングとの間のトレードオフであり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触性」（Ｃｏｎｔａｃｔ）ＨＶＲは、入手可能な複雑な結晶構造への解析に基づくものである。異なるＣＤＲ決定方法に従って、これらのＨＶＲにおける各ＨＶＲ／ＣＤＲの残基は以下の通りである。

ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基づいて、以下のようなＫａｂａｔ残基位置に位置付けるＨＶＲ配列であってもよい：
ＶＬにおける位置２４～３６または２４～３４（ＬＣＤＲ１）、位置４６～５６または５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および位置８９～９７または８９～９６位置（ＬＣＤＲ３）、ならびにＶＨにおける位置２６～３５または２７～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１）、位置５０～６５または４９～６５（ＨＣＤＲ２）、または位置９３～１０２、９４～１０２または９５～１０２（ＨＣＤＲ３）である。

ＨＶＲは、参照ＣＤＲ配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか１つ）と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することによって決定することができる。

特に断りのない限り、本発明において、「ＣＤＲ」、「ＣＤＲ配列」、「ＨＶＲ」または「ＨＶＲ配列」という用語は、上記のいずれか１つの方法で定められるＨＶＲまたはＣＤＲ配列を含む。

特に断りのない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）に言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に基づく番号付け位置を指す。

好ましい一実施形態において、本発明のＣＤＲ配列は、図１５に示す通りである。

下記の表Ｃには、本発明のいくつかの例示的なＣＤＲ配列の組み合わせを示す。

異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかし、ＣＤＲが抗体間で異なるにもかかわらず、ＣＤＲにおいては、抗原との結合に直接関与するアミノ酸位置の数が限られている。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびＣｏｎｔａｃｔ方法のうちの少なくとも２つを使用することにより、最小の重複領域を決定することができ、それによって抗原と結合するための「最小結合単位」を提供する。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であってもよい。当業者に知られているように、抗体の構造とタンパク質のフォールディングによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基を決定することができる。従って、本発明は、本明細書に提供されるいずれのＣＤＲの変異体についても考慮する。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基は変わらないように保持するが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａに基づいて定義された残りのＣＤＲ残基は、保存的なアミノ酸残基で置換されてもよい。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つのＣＤＲが、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の可変領域配列における対応するＣＤＲまたはその変異体と同じである。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも１つ、２つまたは３つのＨＣＤＲが、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の可変領域配列における対応する重鎖ＣＤＲまたはその変異体と同じである。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも１つ、２つもしくは３つのＬＣＤＲが、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の可変領域配列における対応する軽鎖ＣＤＲまたはその変異体と同じである。本明細書において、「対応するＣＤＲ」は、最適にアラインメントした後、候補抗体の可変領域アミノ酸配列において、参照抗体のＣＤＲと最も類似した位置にあるＣＤＲを指す。本明細書において、ＣＤＲ変異体は、既に少なくとも１個、例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸置換、欠失および／または挿入によって修飾されるＣＤＲであり、ここで、ＣＤＲ変異体を含む抗原結合分子は、基本的に非修飾ＣＤＲを含む抗原結合分子の生物学的特性を保持し、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％の生物学的活性（例えば、抗原結合能力）を保持する。各ＣＤＲは、単独で修飾されても、組み合わせて修飾されてもよいことが理解されるべきである。好ましくは、アミノ酸修飾はアミノ酸置換であり、特に保存的アミノ酸置換であり、例えば、表Ａに示される好ましい保存的アミノ酸置換である。

また、本分野で既知のように、ＣＤＲ３領域は、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域とは独立しており、関連抗原に対する抗体の結合特異性を単独で決定することができる。かつ、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有する複数種の他の抗体を産生することができる。

従って、一実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域配列からのＣＤＲ３配列を含み、ここで、上記抗体は、ヒトＴＮＦＲ２と特異的に結合することができる。さらなる一実施形態において、上記抗体は、同一の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域からのＣＤＲ２、あるいは異なるＴＮＦＲ２抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域からのＣＤＲ２を含んでもよい。さらなる一実施形態において、上記抗体は、同一の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、あるいは異なるＴＮＦＲ２抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域からのＣＤＲ１を含んでもよい。本明細書に記載の測定方法により、ヒトＴＮＦＲ２との結合活性、ＴＮＦＲ２とＴＮＦα分子の結合への遮断活性、かつ／または腫瘍成長への阻害活性を含む、これらの抗体の活性を特徴付けることができる。

さらなる一態様において、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２と３領域から提供されることを考慮すると、いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１、２と３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２と３配列を「混合とマッチングする」（すなわち、同一のＴＮＦＲ２抗原と結合する異なる抗体に由来するＣＤＲを混合とマッチングすることができるが、各抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、２と３およびＶＬ ＣＤＲ１、２と３を含むことが好ましい）ことにより、ＴＮＦＲ２と結合する本発明の他の分子を産生することができる。このような「混合とマッチングする」抗体とＴＮＦＲ２の結合は、本分野で既知の結合測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒｅ）および実施例に記載されるような測定法により測定することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合とマッチングする時に、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置換することが好ましい。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合とマッチングする時に、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置換することが好ましい。本発明の表Ｂに示される抗体間でＣＤＲの「混合とマッチング」を行うことができる。また、他の異なる抗体に由来する１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列で、本明細書に示される抗体の構造的に類似したＣＤＲ配列を置換することにより、本発明の他の抗体を産生することもできることは、当業者には明らかである。

従って、いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域を含み、上記重鎖可変領域は重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、上記ＨＣＤＲ３は、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖可変領域のＨＣＤＲ３と同じであり、または
（ｉｉ）表Ｃに示されるいずれか１つのＨＣＤＲ３配列と同じであり、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のＨＣＤＲ３に対して、少なくとも１個（好ましくは１個～２個、もしくはより好ましくは１個）のアミノ酸変化（好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）
を含む。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、かつ上記抗体の重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）は、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖と軽鎖可変領域配列のＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３と同じであり、または
（ｉｉ）表Ｃに示されるいずれか１つの組み合わせにおけるＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３配列と同じであり、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３に対して、合計で少なくとも１個（好ましくは１個～２個、もしくはより好ましくは１個）のアミノ酸変化（好ましくは置換、より好ましくは保存的置換）
を含む。

一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここで、上記ＶＨは、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体のＶＨ配列に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３配列、または
（ｉｉ）表Ｃに示されるいずれか１つの組み合わせにおけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して、上記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個、かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個を超えないアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれた配列
を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、上記ＶＬは、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体のＶＬ配列に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３配列、または
（ｉｉ）表Ｃに示されるいずれか１つの組み合わせにおけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して、上記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個、かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個を超えないアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれた配列
を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、上記抗体は、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体のＶＨとＶＬ配列に含まれる６つのＣＤＲ配列、または
（ｉｉ）表Ｃに示されるいずれか１つの組み合わせにおける６つのＣＤＲ配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の配列に対して、６つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個かつ１０個もしくは５個、４個、３個、２個、１個を超えないアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれる配列
を含む。

一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号１９に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２０に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
（ｉｉ）配列番号２１に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２２に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２３に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、および配列番号２４に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２と３配列、または
（ｉｖ）配列番号２５に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２６に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
（ｖ）配列番号２７に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２８に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
（ｖｉ）配列番号２９に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号３０もしくは３１に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２と３配列、または
（ｖｉｉ）配列番号６４に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、ならびに配列番号６５に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列
を含む。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ、および軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲを含み、ここで、
（ｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、かつＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、または
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は配列番号８のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は配列番号９のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、かつＬＣＤＲ３は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、または
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は配列番号１６のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、かつＬＣＤＲ３は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成される。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表Ｃに示される組み合わせのうちの１つの６つのＣＤＲ配列を含む。

抗体の可変領域
「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖における、抗体とその抗原の結合に関与するドメインである。重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）は、比較的保存的な領域（すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ））が介在する超可変領域（ＨＶＲ、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる）にさらに分けることができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成され、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。場合によっては、単一のＶＨまたはＶＬドメインだけで、抗原－結合特異性を付与することができる。また、特定の抗原と結合する抗体は、上記抗原と結合する抗体に由来するＶＨまたはＶＬドメインにより相補性ＶＬまたはＶＨドメインライブラリーを選別することで単離することができる（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０ー８８７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４ー６２８参照）。

本分野で既知のように、２つの可変領域の一方または両方（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）における１つもしくは複数の残基を修飾し、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域に対して残基修飾、特に保存的残基置換を行うことができるが、修飾された抗体は、依然として、変化前の抗体分子の少なくとも１つの生物学的特性（例えば、抗原結合能力）を基本的に保持する。例えば、ＣＤＲ領域の残基を変異させて、抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することができる。インビトロまたはインビボ測定試験において、変異後の抗体の抗原結合特性または他の機能特性を評価することができる。好ましくは、保存的置換が導入される。好ましくは、ＣＤＲ領域に導入される残基変化は、１個、２個、３個、４個または５個を超えない。また、例えば、抗体の特性を改善するために、フレームワーク領域残基を変異させることができる。例えば、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列残基に「復帰変異」してもよい。

ＣＤＲ移植は、本分野で既知のもう１つの抗体可変領域修飾方法である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体－抗原相互作用を担当するため、既知の抗体の特性をシミュレーションする組換え抗体変異体を構築することができる。当該抗体変異体において、既知の抗体からのＣＤＲ配列は、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク領域に移植される。従って、一実施形態において、本発明は、表Ｂの抗体のうちの１つからの重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク領域配列を有する、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関する。置換のためのフレームワーク領域配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースから、または公開文献に報告されたＴＮＦＲ２抗体配列から得ることができる。例えば、ヒト重鎖と軽鎖可変領域遺伝子をコードする生殖細胞系列ＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得ることができる。抗体タンパク質配列とデータベースにおけるタンパク質配列は、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴなどの配列類似性検索ツールにより比較することができる。好ましくは、置換のためのフレームワーク配列は、変化のために選択された本発明の抗体のフレームワーク配列と構造的類似性を有し、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するフレームワーク配列を有する。いくつかの実施形態において、実施例９の方法のように抗体のヒト化を行うことができる。

さらなる一実施形態において、本発明の例示的な抗体（表Ｂに示される抗体のうちの１つ）と他の異なる抗ＴＮＦＲ２抗体（好ましくは、表Ｂに示される別の抗体）に由来するＶＨとＶＬ配列を「混合とマッチングする」ことにより、ＴＮＦＲ２と結合する本発明の他の抗体を産生することができる。これらの鎖を混合とマッチングする時に、好ましくは、具体的なＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列を構造的に類似したＶＨ配列に置換する。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置換することが好ましい。このような「混合とマッチングする」抗体とＴＮＦＲ２の結合は、本分野で既知の結合測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ、および実施例部分に記載された他の測定法）により測定することができる。

従って、一実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖可変領域ＶＨ配列を含み、または上記アミノ酸配列によって構成される。さらなる一実施形態において、本発明の抗体は、上記ＶＨ配列の変異体を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の軽鎖可変領域ＶＬ配列を含み、または上記アミノ酸配列によって構成される。さらなる一実施形態において、本発明の抗体は、上記ＶＬ配列の変異体を含む。

さらなる一実施形態において、本発明の抗体は、
（ｉ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列もしくはその変異体、または
（ｉｉ）配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列もしくはその変異体、または
（ｉｉｉ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列もしくはその変異体、または
（ｉｖ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列もしくはその変異体、または
（ｖ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列またはその変異体、
（ｖｉ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号３０もしくは２１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列もしくはその変異体、あるいは
（ｖｉｉ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列またはその変異体、
を含む。

一実施形態において、ＶＨ配列の変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＨ配列と比べて、（好ましくは、全長にわたって、またはＣＤＲ１、２と３の３つの領域にわたって）、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する。一実施形態において、ＶＨ配列の変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＨ配列と比べて、（好ましくは、全長にわたって、またはＣＤＲ１、２と３の３つの領域にわたって）、少なくとも１個、かつ３０個、１０個、または５個、４個、３個、２個、１個、０個を超えないアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含む。好ましくは、配列の相違は、ＣＤＲ領域に生じない。

好ましい一実施形態において、ＶＬ配列の変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＬ配列と比べて、（好ましくは、全長にわたって、またはＣＤＲ１、２および３の３つの領域にわたって）、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する。好ましい一実施形態において、ＶＬ配列の変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＬ配列と比べて、（好ましくは、全長にわたって、またはＣＤＲ１、２と３の３つの領域にわたって）、少なくとも１個、かつ３０個、１０個、または５個、４個、３個、２個、１個、０個を超えないアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含む。好ましくは、配列の相違は、ＣＤＲ領域に生じない。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域ＶＨ／ＶＬ配列対を含み、または上記アミノ酸配列対によって構成される。本発明は、当該抗体の変異体、例えば、ＶＨ、ＶＬまたはＶＨとＶＬに少なくとも９５％～９９％の同一性を有し、または１０個を超えないアミノ酸変化を含む変異体も提供する。

上記のいずれか１つの実施形態において、好ましくは、参照抗体に対して、抗体変異体の重鎖可変領域は、１つまたは複数のＣＤＲ（好ましくはすべての３つのＣＤＲ）領域に１０個を超えず、好ましくは５個を超えない（例えば、３個、２個、１個もしくは０個）アミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含む。

上記のいずれか１つの実施形態において、好ましくは、参照抗体に対して、抗体変異体の軽鎖可変領域ＶＬは、１つまたは複数のＣＤＲ（好ましくはすべての３つのＣＤＲ）領域に１０個を超えず、好ましくは５個を超えない（例えば、３個、２個、１個もしくは０個）アミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含む。

抗体の重鎖と軽鎖
一実施形態において、本発明の抗体は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、重鎖Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域を含む。別のいくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１－Ｆｃ領域、特にヒトＩｇＧ１－Ｆｃ領域を含む。さらなるいくつかの実施形態において、本発明の抗体は、κ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域を含む。

抗体の所望の応用によって、抗体は、天然Ｆｃ領域に対して同じまたは変化されたエフェクター機能を有する重鎖定常領域を含むことができる。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞により媒介される貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃγＲにより媒介されるエフェクター機能を含む。一般的に、抗体の可変領域が細胞（例えば、腫瘍細胞）表面抗原と結合し、かつ抗体のＦｃ領域がエフェクター細胞（例えば、Ｔエフェクター細胞）上のＦｃ受容体と結合する場合、エフェクター機能が引き起こされる。哺乳動物において、液性免疫のほとんどは、抗体Ｆｃ領域とＣ１ｑの相互作用および補体カスケードにより媒介される。一方、細胞免疫反応のほとんどは、抗体Ｆｃ領域とＦｃγ受容体（すなわち、ＦｃγＲ）の相互作用により媒介される。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢは、活性化ＦｃγＲである。一方、ＦｃγＲＩＩＢは抑制性ＦｃγＲである。活性化受容体の細胞内シグナル伝達は、受容体の細胞内ＩＴＡＭモチーフのリン酸化により媒介され、これは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰなどのエフェクター機能、およびサイトカインの放出を誘導することによる炎症反応をもたらす。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢの細胞シグナル伝達は、受容体細胞内のＩＴＩＭモチーフのリン酸化により媒介され、活性化シグナル伝達経路を平衡する作用を果たす。抗体とＦｃγＲおよびＣ１ｑとの相互作用は、主に、ヒンジとＣＨ２アミノ酸配列およびＣＨ２領域のグリコシル化に依存する。

いくつかの実施形態において、従って、本発明の抗体は、活性化ＦｃγＲと結合する重鎖定常領域を含む。一具体的な実施形態において、抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）Ｆ１５８変異体、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）Ｖ１５８変異体から選ばれるＦｃＲと結合する重鎖定常領域を含む。別の具体的な実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラスの定常領域を含む。好ましくは、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体は、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞が存在する時にＡＤＣＣを誘導する。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６２のヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列、または配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも１つ、２つもしくは３つであるが、２０個、１０個もしくは５個を超えないアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、または配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％～９９％の同一性を有する配列を含む。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖定常領域を含む。好ましい一実施形態において、軽鎖定常領域は、ヒトκ軽鎖定常領域である。さらに好ましい一実施形態において、軽鎖定常領域は、配列番号６３のアミノ酸配列、または配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも１個、２個もしくは３個であるが、２０個、１０個もしくは５個を超えないアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、または配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％～９９％の同一性を有する配列を含む。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖を含み、かつ上記重鎖は、配列番号３２～３７と６６から選ばれるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも１個、２個もしくは３個であるが、２０個、１０個もしくは５個を超えないアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸変化は、ＣＤＲ領域に発生せず、より好ましくは、可変領域に発生しない。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖を含み、かつ上記軽鎖は、配列番号３８～４４と６７から選ばれるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも１個、２個もしくは３個であるが、２０個、１０個もしくは５個を超えないアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸変化は、ＣＤＲ領域に発生せず、より好ましくは、可変領域に発生しない。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、
（ａ）配列番号３２から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖配列もしくはその変異体、
（ｂ）配列番号３３から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号３９または１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖配列もしくはその変異体、
（ｃ）配列番号３４から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖配列もしくはその変異体、
（ｄ）配列番号３５から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖配列もしくはその変異体、
（ｅ）配列番号３６から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列もしくはその変異体、
（ｆ）配列番号３７から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号４３もしくは４４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列もしくはその変異体、および
（ｇ）配列番号６６から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖配列もしくはその変異体、かつ／または配列番号６７もしくは４４のアミノ酸配列を含む軽鎖配列もしくはその変異体、
から選ばれる重鎖配列および／または軽鎖配列を含む。

ここで、上記変異体は、対応する参照配列と比べて、少なくとも１個、２個もしくは３個であるが、２０個、１０個もしくは５個を超えないアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、または少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸変化はＣＤＲ領域に発生せず、より好ましくは、可変領域に発生しない。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその断片の重鎖および／または軽鎖は、シグナルペプチド配列をさらに含む。

例示的な抗体配列
本発明は、実施例のように単離して特徴付けられる、ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）と特異的に結合する抗体、例えば、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を提供する。図１６は、本発明のこれらの例示的な抗体の抗体可変領域ＶＨおよびＶＬ配列を示す。図１５は、抗体の例示的なＣＤＲ配列を示す。

抗体の変異体
一態様において、本発明は、本明細書に言及される任意の抗体、特に表Ｂに示される例示的な抗体の変異体を提供する。一実施形態において、抗体の変異体は、変化前の抗体の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の生物学的活性（例えば、抗原結合能力）を保持する。いくつかの実施形態において、上記変化により、抗体の変異体が抗原への結合を失うことにはならないが、場合により、向上した抗原親和性および異なるエフェクター機能などのような特性を付与することができる。

なお、抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域、または各ＣＤＲ領域は、単独でまたは組み合わせて変化することができる。いくつかの実施形態において、抗体の変異体と参照抗体は、標的抗体の配列領域において少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する。例えば、一実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表Ｂに示される抗体の１つ）と比べて、３つの重鎖ＣＤＲ領域に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する。一実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表Ｂに示される抗体の１つ）と比べて、３つの軽鎖ＣＤＲ領域に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する。別の実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表Ｂに示される抗体の１つ）と比べて、６つのＣＤＲ領域に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する。さらなる一実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表Ｂに示される抗体の１つ）と比べて、重鎖可変領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。さらなる一実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表Ｂに示される抗体の１つ）と比べて、軽鎖可変領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表Ｂに示される抗体の１つ）と比べて、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。

また、抗体のＦｃ領域を変化させることができる。Ｆｃ領域の変化は、単独で、あるいはフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域の上記変化と組み合わせて行われてもよい。例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合などの抗体の１つもしくは複数の機能、かつ／または抗原依存性細胞傷害を変化させるために、Ｆｃ領域を変化させることができる。また、本発明の抗体を化学的に修飾（例えば、ＰＥＧと連結）したり、そのグリコシル化パターンを変化させたりしてもよい。

別のいくつかの実施形態において、所望の抗体の応用目的によっては、抗体は、修飾されたＦｃ領域変異体を含んでもよく、上記修飾されたＦｃ領域変異体は、非修飾の親Ｆｃ領域と比べて変化されたエフェクター機能を有する。通常、本明細書に記載の可変領域を、１つもしくは複数の修飾（例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入）を含むＦｃ領域に連結することにより、１種もしくは複数種の変化（例えば、強化、低減または除去）されたエフェクター機能を有する本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体、例えば、非修飾の親Ｆｃ領域に対して、増加したＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、かつ／または血清半減期という増加した機能を有する抗ＴＮＦＲ２抗体を得ることができる。また、本発明の抗体を化学的に修飾し、例えば、抗体のグリコシル化パターンを変化させることにより、その機能を変化させることができる。

一部の実施形態において、抗体Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ活性を高める１つもしくは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ－領域の位置２９８、３３３および／または３３４の置換（残基のＥＵ番号）を有するＦｃ－領域を含んでもよい。いくつかの実施形態において、Ｆｃ－領域を変化させることで、変化（すなわち、向上もしくは低減）されたＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こしてもよい（例えば、ＵＳ６，１９４，５５１、ＷＯ９９／５１６４２およびＩｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４参照）。

いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆｃ領域変異体を含み、上記変異体は、天然の非修飾の親Ｆｃ領域と比べて、増加したのＡＤＣＣ活性を有する。このようなＦｃ領域変異体のいくつかの実例は、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９（アミノ酸残基は、ＥＵインデックスによって番号付けられる）という位置から選ばれる１つまたは複数のアミノ酸修飾に含まれる。例示的な置換は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄ、および３３２Ｅを含む。例示的な組み合わせ置換は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、および２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含む。

ヒトＩｇＧ１におけるＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎとの結合部位が描かれており、かつ改善された結合を有する変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の変異は、ＦｃγＲＩＩＩとの結合を改善可能なことを示している。Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異という組み合わせ変異体は、ＦｃγＲＩＩＩとの結合およびＡＤＣＣ活性を改善可能なことを示している。

別のいくつかの実施形態において、抗体Ｆｃを変化させることで、そのグリコシル化程度を増加もしくは低減し、かつ／またはそのグリコシル化パターンを変えることができる。Ｆｃのグリコシル化部位の追加または欠失は、１つまたは複数のグリコシル化部位を生成または除去するためにアミノ酸配列を変えることにより容易に実現することができる。例えば、１つまたは複数のグリコシル化部位を除去するために１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことにより、当該部位でのグリコシル化を除去することができる。タイプが変化されたグリコシル化抗体、例えば、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体もしくは無フコシル化抗体、またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体を調製することができる。このような変化されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を向上可能なことを示している。本発明は、Ｆｃ領域に連結されたオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も考慮する。これらの抗体変異体は、向上したＣＤＣ機能を有することができる。

さらにまたは代替的に、例えば、変化されたグリコシル化メカニズムを有する宿主細胞に抗体を発現することにより、抗体グリコシル化の程度および／またはパターンの変化を実現することができる。変化されたグリコシル化メカニズムを有する細胞は、本分野で既に記載されたものであり、かつ組換え抗体を発現することで変化されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用可能である。

別のいくつかの実施形態において、本発明は、抗体のインビボ半減期は重要であるが、いくつかのエフェクター機能（例えば、補体とＡＤＣＣ）は不要または有害である特定の応用のための望ましい候補物となる、全部ではないく一部のエフェクター機能を有する抗体変異体も考慮する。例えば、Ｆｃ領域は、変異Ｐ３２９Ｇおよび／またはＬ２３４ＡとＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、あるいは変異Ｐ３２９Ｇおよび／またはＳ２２８ＰとＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域などの、エフェクター機能を除去するかまたは減弱させる変異を含むことができる。

一部の実施形態において、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された「チオＭＡｂ」などの、システイン操作抗体を産生する必要があり得る。例えば、抗体ヒンジ領域におけるシステイン残基の数を変更することによって、軽鎖および重鎖の組み立てを促進し、または抗体の安定性を向上もしくは低減させることができる。残基は、例えば、米国特許番号５，６７７，４２５である。

一部の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、非タンパク質部分が含まれるようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導に適する部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な実例は、例えば、抗体（例えば、血清）の半減期を増加させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これに限定されない。タンパク質のＰＥＧ化のための方法は、本分野で既知するものであり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ ０１５４ ３１６およびＥＰ ０４０１３８４を参照する。

ＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主
本発明は、上記の任意の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその断片をコードする核酸を提供する。上記核酸を含むベクターをさらに提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターである。上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）から選ばれる。別の実施形態において、宿主細胞は原核のものである。

一態様において、本発明は、上記の任意の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその断片をコードする核酸を提供する。上記核酸は、抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸、あるいは抗体の軽鎖および／または重鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含むことができる。抗体の重鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列は、配列番号４５、４７、４９、５１、５３、５５と６８から選ばれる核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み、または配列番号４５、４７、４９、５１、５３、５５と６８から選ばれる核酸配列を含む。抗体の軽鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列は、配列番号４６、４８、５０、５２、５４、５６、５７と６９から選ばれる核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含み、または配列番号４６、４８、５０、５２、５４、５６、５７と６９から選ばれる核酸配列を含む。これらのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、適切な発現ベクターから発現される場合、ＴＮＦＲ２抗原結合能力を示すことができる。

本発明は、ＴＮＦＲ２と結合する上記抗体からの重鎖ＶＨまたは軽鎖ＶＬ配列の少なくとも１つのＣＤＲ領域および通常はすべての３つのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかのさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、上記のＴＮＦＲ２と結合する上記抗体の重鎖および／または軽鎖の完全もしくは基本的に完全な可変領域配列をコードする。

当業者に明らかなように、遺伝暗号の退化性のため、それぞれの抗体またはポリペプチドアミノ酸配列は、複数種の核酸配列によってコードすることができる。

好ましい一実施形態において、抗体をコードする本発明の核酸は、配列番号６２に示される定常領域配列またはそれと基本的に同じ配列などの、重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

好ましい一実施形態において、抗体をコードする本発明の核酸は、配列番号６３に示される配列またはそれと基本的に同じ配列などの、軽鎖定常領域配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

本分野でよく知られている方法を用い、デノボ固相ＤＮＡ合成により、またはＰＣＲ変異誘発により、ＴＮＦＲ２と結合する抗体もしくはその抗原結合断片の上記抗体核酸配列をコードすることができる。

一実施形態において、本発明の核酸を含む１つまたは複数のベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクター、例えば、真核発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。

一実施形態において、上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。抗体をコードするベクターをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、本明細書に記載される原核または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特に、グリコシル化とＦｃエフェクター機能が不要な場合に、細菌において産生することができる。細菌における抗体断片とポリペプチドの発現に関しては、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、第５，８４０，５２３号、およびＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４８（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐ２４５～２５４，大腸菌における抗体断片の発現が参照される。発現した後、抗体は、可溶性画分における細菌細胞ペーストから単離することができるとともに、さらに精製することができる。

一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞または抗体もしくはその抗原結合断片の調製に適用される他の細胞から選ばれる。例えば、糸状菌または酵母のような真核微生物は、抗体をコードするベクターに適したクローニングまたは発現宿主である。例えば、グリコシル化経路が既に「ヒト化」された真菌と酵母菌株により、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）が参照される。グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも由来する。脊椎動物の細胞を宿主として用いてもよい。例えば、懸濁成長に適するように改変された哺乳動物細胞株を使用することができる。使用可能な哺乳動物宿主細胞株の他の実例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓系（２９３ＨＥＫもしくは２９３細胞、例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されたもの）などに示される。他の使用可能な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１６（１９８０））などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＹ０、ＮＳ０とＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体の産生に適するような哺乳動物宿主細胞株は、例えば、Ｙａｚａｋｉ＆Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ． ２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ２５５ー２６８（２００３）で概略的に説明されている。

ＩＩＩ．抗体の調製
一実施形態において、抗体の発現に適する条件で、上述したように、上記抗体をコードする核酸を含む上記の宿主細胞を培養することと、場合により上記宿主細胞（または宿主細胞培地）から上記抗体を回収することとを含む、抗ＴＮＦＲ２抗体を調製する方法を提供する。組換えにより抗ＴＮＦＲ２抗体を産生するために、抗体（例えば、上記の抗体）をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために、それを１つまたは複数のベクターに挿入する。このような核酸は、通常のプロセスにより単離してシークエンシングすることが容易である（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって行われる）。

ＩＶ．測定法
本分野で既知の種々の測定法により、本明細書に提供される抗ＴＮＦＲ２抗体を同定し、スクリーニングし、またはその物理的／化学的特性および／または生物学的活性を特徴付けることができる。

例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットのような本分野で既知の方法、または本明細書の実施例に開示された例示的な方法により、抗体とヒトＴＮＦＲ２との結合を測定することができる。例えば、フローサイトメトリーにより測定することができ、ここで、抗体は、ヒトＴＮＦＲ２を発現した細胞株、例えば、トランスフェクトにより細胞表面にヒトＴＮＦＲ２を発現したＣＨＯ細胞と反応する。ヒトＴＮＦＲ２を発現した腫瘍細胞または初代Ｔｒｅｇ細胞を含む他の細胞も、フローサイトメトリーに適用される。場合により、結合ダイナミクス（例えば、Ｋ_Ｄ値）を含む抗体の結合は、組換えＴＮＦＲ２タンパク質を使用して光干渉による生体測定法で測定することができる。いくつかの実施形態において、光干渉による生体測定法（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定）により、抗体とヒトおよび他の種に由来するＴＮＦＲ２の結合平衡解離定数を測定する。

ＴＮＦＲ２に対する本発明の阻害性／拮抗性抗体は、細胞膜ＴＮＦＲ２との結合により、リガンドＴＮＦαによるＴＮＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を遮断することができる。いくつかの実施形態において、当該遮断活性は、実施例の抗体３Ｃ４と６９Ｂ１およびそのヒト化形態、またはそれと同様もしくは類似のＶＨとＶＬ配列を有する抗体などの抗体によるＴＮＦＲ２とその天然リガンドＴＮＦαとの結合への遮断によるものである。別のいくつかの実施形態において、当該遮断活性は、実施例の抗体７２Ｇ８およびそのヒト化形態、またはそれと同様もしくは類似のＶＨとＶＬ配列を有する抗体などの抗体によるＴＮＦＲ２とその天然リガンドＴＮＦαとの結合への遮断によらないものであり、これらの抗体は、細胞表面ＴＮＦＲ２の重合を直接阻害することで、ＴＮＦＲ２受容体の活性化を阻害することができる。Ｊｕｒｋａｔ ＴＮＦＲ２ ＮＦ－κＢ ルシフェラーゼレポーター検出システムにより、ＴＮＦＲ２を過剰発現したＪｕｒｋａｔ細胞において、本発明の抗体によるＴＮＦαにより活性化されたＴＮＦＲ２シグナル伝達経路への阻害作用を検出することができる。いくつかの実施形態において、実施例８に記載の方法により、本発明の抗体によるＴＮＦαにより活性化されたＴＮＦＲ２シグナル伝達経路への阻害作用を検出する。

ＡＤＣＣレポーター遺伝子の生物学的活性検出により、本発明の抗体によるＴＮＦＲ２を発現した標的細胞へのＡＤＣＣ殺傷作用を検出することができる。ＡＤＣＣレポーター遺伝子の生物学的活性検出法は、ＡＤＣＣ作用メカニズム経路の活性化過程における初期事象、すなわち、エフェクター細胞におけるＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核因子）経路により媒介される遺伝子転写の活性化を検出の読み出し指標として選択する。また、ＡＤＣＣレポーター遺伝子検出法は、操作されたＴ細胞をエフェクター細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）として使用し、ここで、上記細胞は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（例えば、Ｖ１５８高親和性変異体）およびＮＦＡＴ応答要素により発現駆動されるホタルルシフェラーゼを安定的に発現する。上記検出において、ＡＤＣＣ作用メカニズムにおける抗体の生物活性は、ＮＦＡＴ経路の活性化により産生されたルシフェラーゼによって定量されるが、エフェクター細胞におけるルシフェラーゼ活性は、生物発光の読取値によって定量される。ＡＤＣＣレポーター遺伝子の生物学的活性検出により、正確な表面抗原を有する標的細胞、正確な特異性抗体、およびＦｃγＲＩＩＩａを発現したエフェクター細胞を同時に備える場合にのみ、良好な検出応答を得ることができる。好ましい一実施形態において、本発明の抗体のＡＤＣＣ活性は、実施例１４に記載のＡＤＣＣレポーター遺伝子検出方法により検出される。

本発明は、生物学的活性を有する抗ＴＮＦＲ２抗体を同定するための測定法をさらに提供する。生物学的活性は、例えば、ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）との結合、ＴＮＦＲ２（例えば、ヒトＴＮＦＲ２）とＴＮＦα分子の結合への遮断、ＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合により媒介されるシグナル伝達への阻害、ＡＤＣＣ活性の誘発、かつ／または腫瘍成長の阻害を含んでもよい。例えば、インビボ腫瘍阻害モデル（例えば、実施例１５と１６参照）において、抗体の腫瘍成長への阻害能力を測定する。本発明は、インビボおよび／またはインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体も提供する。

なお、本発明の免疫複合体または多重特異性抗体で抗ＴＮＦＲ２抗体を置換または補充することで、任意の上記測定を実現することができる。

Ｖ．多重特異性抗体
さらなる一態様において、本発明は、ＴＮＦＲ２（好ましくはヒトＴＮＦＲ２）と特異的に結合する多重特異性（二重特異性を含む）抗体分子を提供する。一実施形態において、多重特異性抗体において、本発明の抗体（またはその抗原結合断片）は、ＴＮＦＲ２に対する第１の結合特異性を形成する。さらなる一実施形態において、上記多重特異性抗体は、さらに、以下の１つに対する第２の特異性、またはさらに、以下の２つの分子に対する第２と第３の結合特異性を含む。上記の第２、第３の結合特異性は、例えば、腫瘍細胞表面に発現した別の抗原に対してもよい。

一実施形態において、結合特異性は、抗体の「結合部位」または「抗原結合部位」（抗体分子において抗原と実際に結合する領域）によって提供される。好ましい一実施形態において、抗原結合部位は、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなるＶＨ／ＶＬ対で構成される。従って、一実施形態において、「多重特異性」抗体は、少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体であり、上記少なくとも２つの抗原結合部位のそれぞれは、同じ抗原の異なるエピトープまたは異なる抗原の異なるエピトープと結合することができる。多重特異性抗体およびその調製については、例えば、ＷＯ ２００９／０８０２５１、ＷＯ ２００９／０８０２５２、ＷＯ ２００９／０８０２５３およびＷＯ ２０１０／１４５７９３に記載されたことを参照することができる。

ＶＩ．免疫複合体
さらなる一態様において、本発明は、本発明の抗体を異種分子に複合することにより産生される免疫複合体を提供する。一実施形態において、免疫複合体において、本発明の抗体（またはその抗原結合断片）は、治療剤または診断剤と結合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体または抗体断片の形態で異種分子と複合することができる。例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖ｓｃＦａｂ抗体、単鎖ｓｃＦｖなどの断片の形態で複合することができる。

リンカーにより、複合体の様々な実体を共有結合することができる。好適なリンカーは、化学リンカーまたはペプチドリンカーを含む。有利なことに、リンカーは、標的部位への送達後にポリペプチドの放出を容易にする「切断可能なリンカー」である。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感度リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたは二硫化物を含むリンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２（１９９２）１２７～１３１；ＵＳ５，２０８，０２０）を使用することができる。

複合体に適用される治療剤は、細胞毒素（例えば、細胞成長阻害剤もしくは細胞殺傷剤）、薬物または放射性同位体を含むが、これらに限定されない。免疫複合体の形成に適する細胞傷害剤（例えば、化学療法剤）としては、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１が参照され、本分野で既知のものである。例えば、細胞傷害剤は、放射性同位体、成長阻害剤、ヌクレアーゼなどの酵素およびその断片、抗生物質、その断片および／または変異体を含む小分子毒素、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒素などの毒素、および既知の種々の抗腫瘍または抗がん剤を含むが、これらに限定されない。

さらなる一態様において、本発明の抗体は、診断剤または検出可能な試薬と複合することができる。このような複合体は、臨床検査方法の一部（例えば、特定療法の効能を確認する）として、疾患または病症の発作、形成、進行および／または重篤性を監視または予測することができる。抗体を検出可能な試薬にカップリングすることにより、このような診断および検出を実現することができ、上記検出可能な試薬は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどに限定されないさまざまな酵素、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどに限定されない補欠分子族、蛍光物質、発光物質、放射性物質、ならびにさまざまな陽電子放出イメージングで使用される陽電子放出金属および非放射性常磁性金属イオンを含むが、これらに限定されない。

ＶＩＩ．医薬組成物および医薬製剤
本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその免疫複合体または多重特異性抗体を含む組成物（医薬組成物または医薬製剤を含む）、抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその免疫複合体または多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物をさらに含む。これらの組成物はまた、場合により、本分野で既知の薬学的に許容可能なベクター、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの、適切な薬用補助材料を含んでもよい。

本発明に適用される薬学的に許容可能なベクターは、水および油などの滅菌液体であってもよく、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油などの石油、動物、植物または合成に由来するようなものを含む。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水はベクターとして好ましい。さらに、生理食塩水溶液および水性デキストロースとグリセリン溶液を液体ベクターとして、特に注射可能な溶液に用いてもよい。適切な薬用賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用およびその用途については、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ、Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ、Ｐ．Ｊ．ＳｅｓｋｅｙおよびＳ．Ｃ．Ｏｗｅｎ、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｃｈｉｃａｇｏも参照される。必要に応じて、上記組成物は、少量の湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続性放出製剤などの形態を採用することができる。経口製剤は、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの標準的なベクターを含んでもよい。

所望の純度を有する本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体、免疫複合体または多重特異性抗体を、１つまたは複数の任意の薬用補助材料（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｓｏｌ，Ａ．（１９８０））と混合することにより、好ましくは凍結乾燥製剤または水溶液の形態で本発明を含む医薬製剤を調製することができる。

本発明の医薬組成物および医薬製剤において、本発明の抗体は、唯一の活性剤であってもよく、または他の治療剤と併用してもよい。本発明の抗体と併用可能な治療剤は、治療すべき疾患および／または病症に有益な治療効果を有する治療剤を含むが、これらに限定されない。例えば、上記活性成分は、治療される特定の適応症に必要なものであってもよく、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的な活性を有するような活性成分である。例えば、抗がん活性を付与可能な他の薬物成分である。本発明の抗体および活性成分は、目的とする使用に有効な量で医薬組成物および医薬製剤に適切に組み合わせて存在する。

持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適切な実例は、抗体を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスを含み、上記マトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル形態のような成形品である。

医薬製剤の他の成分については、ＷＯ２０１５／１５３５１３に開示されているものを参照してもよい。

ＶＩＩＩ．組み合わせ製品
さらなる一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片、二重特異性抗体または免疫複合体、および１種もしくは複数種の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、抗腫瘍薬など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法に使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、組み合わせ製品を提供し、ここで、上記他の治療剤は、例えば、免疫反応を刺激して対象の免疫反応をさらに増強、刺激またはアップレギュレートするのに有効な治療剤、例えば抗体である。

いくつかの実施形態において、上記組み合わせ製品は、腫瘍の予防または治療に用いられる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、結腸がん、慢性骨髄性白血病などのがんである。

ＩＸ．方法および使用
一態様において、本発明は、本発明のＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を適用する方法および使用を提供する。例えば、インビボとインビトロで、
（１）ＴＮＦＲ－２とそのリガンドＴＮＦαの結合を遮断すること、
（２）ＴＮＦＲ－２とそのリガンドＴＮＦαの結合を遮断せずに、ＴＮＦＲ２の重合を直接阻害すること、
（３）依存的または非依存的にＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合を遮断することにより、ＴＮＦＲ２受容体の活性化を阻害すること、
（４）ＴＮＦαとＴＮＦＲ２との結合により媒介されるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を阻害すること、
（５）ＴＮＦＲ２の天然アゴニストＴＮＦαのＴｒｅｇ細胞増殖促進作用を拮抗すること、および
（６）抗体のＦｃ領域により誘発されるＡＤＣＣ活性に応じて、表面にＴＮＦＲ２を発現した腫瘍細胞を殺傷すること、
に用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の方法および使用は、対象個体における疾患の治療に関する。別のいくつかの実施形態において、本発明の方法および使用は、例えば対象からの試料におけるＴＮＦＲ２の存在の検出に関する。さらなるいくつかの実施形態において、本発明は、上記使用に用いられる製品（例えば、医薬組成物、医薬製品または検出製品）の調製における、本発明のＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片の使用も提供する。

治療応用
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を利用して個体または対象においてＴＮＦＲ２関連疾患を予防または治療する方法および使用をさらに提供し、上記疾患は、結腸がんまたは慢性骨髄性白血病などの腫瘍を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、唯一の活性剤としてもよく、または、他の治療法もしくは治療剤と併用して投与してもよい。上記他の治療法および治療剤は、例えば、腫瘍細胞表面の抗原を標的にして、これらの分子を結合および／または遮断することで腫瘍を消滅させる薬剤、対象の免疫系を活性化し、腫瘍を自発的に消滅させることを促進する薬剤を含む。

本明細書において、「個体」または「対象」という用語は、入れ替えて使用可能であり、哺乳動物を指す。哺乳動物は、馴化動物（例えば、乳牛、ヒツジ、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトである。

本明細書において、「治療」は、１）診断された病理学的状態もしくは疾患の症状を治癒・緩和・軽減し、かつ／またはこの診断された病理学的状態もしくは疾患の進行を停止する治療的手段と、２）病理学的状態もしくは疾患の進行を予防および／または緩和する予防的または事前防止手段と、を含む。従って、治療が必要な対象は、疾患に罹患した個体、疾患に罹患しやすい個体、および疾患を予防しようとする個体を含む。上記個体は、上記の治療的手段または予防的手段から利益を受け、上記処理を受けていない個体と比べて、疾患、病症、病状、および／または症状の発生、再発もしくは進行の軽減もしくは改善を示している。いくつかの実施形態において、本発明は疾患または病症の治療に関し、別のいくつかの実施形態において、本発明は疾患または病症の予防に関する。

本発明によるいくつかの実施形態において、疾患または病症の「治療」は、疾患または病症の改善（すなわち、疾患の進行もしくはその少なくとも１つ臨床症状の緩和、阻止もしくは減少）を指す。別のいくつかの実施形態において、「治療」は、患者に識別できない可能性のある生理的パラメータを含め、少なくとも１つの身体パラメータを緩和または改善することを指す。別のいくつかの実施形態において、「治療」は、身体的に（例えば、安定的で識別可能な症状）、生理的に（例えば、安定的な身体パラメータ）またはこの両方において疾患または病症を調節することを指す。本明細書に明記のない限り、疾患または病症の治療および／または予防効果を評価する方法は、本分野で一般的に知られているものである。

本発明によるさらなるいくつかの実施形態において、疾患または病症の「治療」は、疾患、病症、または特定の疾患もしくは病症の症状の発生または進行に対する阻害を含め、疾患または病症の「予防」を指す。いくつかの実施形態において、対象は、予防的計画の候補者である。一般に、「予防」という用語は、疾患または病症の症候もしくは症状が生じる前（特に、疾患のリスクがある対象で）の薬剤投与を指す。

本明細書における「治療有効量」、「予防有効量」または「有効量」という用語は、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片が単独で、または他の治療薬と組み合わせて細胞、組織または対象に投与される場合、１種もしくは複数種の疾患もしくは症候の症状、または当該疾患もしくは病症の進行を効果的に予防または改善する量を指す。治療有効量は、症状の改善に十分な抗体またはその抗原結合断片の量、例えば、関連の医学的病態を治療、治癒、予防もしくは改善するか、またはこのような病態を治療、治癒、予防もしくは改善する速度を高める量をさらに指す。ある活性成分を個体に単独投与する場合、治療有効量は、当該成分の量のみを指す。１種以上の活性成分を併用して投与する場合、治療有効量は、並行投与にしても、順次投与にしても、同時投与にしても、治療効果をもたらす活性成分の総合量を指す。治療剤の有効量により、診断基準またはパラメータは、少なくとも１０％、一般的に少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％向上する。

従って、いくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその断片、または上記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物を上記対象に投与することを含む、対象において腫瘍を阻害する方法に関する。別のいくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその断片、または上記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物を上記対象に投与することを含む、対象において体の抗腫瘍免疫応答を強化する方法にも関する。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合部分を、ＴＮＦＲ２を伴う腫瘍を殺傷するため、腫瘍を伴う対象に投与する。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合部分を、抗腫瘍免疫応答を刺激するため、腫瘍を伴う対象に投与する。

別のいくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその断片、または上記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物を上記対象に投与することを含む、対象の腫瘍、例えばがんを治療する方法を提供する。がんは、早期、中期または末期にあるがんまたは転移性がんであってもよい。

本発明の方法により治療することができる腫瘍は、例えば、結腸がんおよび慢性骨髄性白血病を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体は、細胞表面にＴＮＦＲ２を発現する腫瘍細胞および／またはＴｒｅｇ細胞を標的にすることにより、腫瘍の成長を阻害することができる。

本発明の抗体（およびそれを含む医薬組成物または免疫複合体、ならびに任意の他の治療剤）は、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、かつ、局所治療に必要な場合、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。投与が短期であるか長期であるかによってある程度決まり、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射により投与することができる。本明細書において、様々な投与スケジュールが含まれ、単回投与または複数の時点での複数回投与、ボーラス投与およびパルス注入を含むが、これらに限定されない。

疾患を予防または治療するために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、または１種もしくは複数種の他の治療剤と併用される場合）は、治療対象疾患の種類、抗体のタイプ、疾患の重症度およびその進行、上記抗体が予防目的で投与されるかまたは治療目的で投与されるか、過去の治療、患者の臨床病歴および上記抗体に対する応答、ならびに主治医の判断力によって決定される。上記抗体は、単回の治療で、または一連の治療を経て患者に適当に投与される。

上記本発明の方法において、本発明の抗体または抗原結合部分の代わりに、本発明の組成物、多重特異性抗体または免疫複合体を投与することができる。あるいは、これらの方法において、本発明の抗体または抗原結合部分の投与に加えて、本発明の組成物、多重特異性抗体または免疫複合体をさらに投与することができる。

いくつかの実施形態において、本発明はまた、上記方法（例えば、治療のため）に用いられる薬剤の調製における本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体、組成物、免疫複合体、多重特異性抗体の使用を提供する。

検出応用
本発明はまた、試料におけるＴＮＦＲ２を検出する方法および試薬キットを提供する。ここで、上記方法は、（ａ）上記試料を本発明の抗体またはその抗原結合断片もしくは免疫複合体と接触することと、（ｂ）上記抗体またはその抗原結合断片もしくは免疫複合体とＴＮＦＲ２タンパク質との間の複合物の形成を検出することを含む。いくつかの実施形態において、試料は、皮膚がん患者などのがん患者に由来する。上記検出は、インビトロでもインビボでもよい。

「検出」という用語は本明細書に使用される場合、定量的または定性的検出を含み、例示的な検出方法としては、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、抗体分子複合磁気ビーズ、ＥＬＩＳＡ測定法、ＰＣＲ－技術（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）が挙げられる。一部の実施形態において、生体試料は、血、血清または生物に由来する他の液体試料である。一部の実施形態において、生体試料は、細胞または組織を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、過剰増殖性またはがん性病巣に由来する。一部の実施形態において、検出待ちのＴＮＦＲ２はヒトＴＮＦＲ２である。

一実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体は、抗ＴＮＦＲ２抗体による治療に適する対象の選択に用いられ、例えば、ＴＮＦＲ２は、上記対象を選択するためのバイオマーカーである。一実施形態において、本発明の抗体を利用してがんまたは腫瘍を診断し、例えば、対象における本明細書に記載の疾患（例えば、過剰増殖性疾患またはがん性疾患）の治療または進行、その診断および／または病期を評価（例えば、モニター）することができる。

一部の実施形態において、標識された抗ＴＮＦＲ２抗体を提供する。標識は、直接検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識および放射性標識）、および例えば、酵素触媒反応または分子間の相互作用により間接的に検出される部分、例えば、酵素もしくはリガンドを含むが、これらに限定されない。標識の非限定的な例は、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉといった放射性同位体、希土類キレートもしくはフルオレセインおよびその誘導体などのフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル（ｄａｎｓｙｌ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）などのルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、フルオレセイン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼなどの炭水化物オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ならびにＨＲ、ラクトペルオキシダーゼ、もしくはマイクロペルオキシダーゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）といった過酸化水素染料前駆体による酵素などの複素環オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、ファージ標識、安定的なフリーラジカルなどを含むが、これらに限定されない。

本発明の理解を助けるために、以下の実施例を説明する。いかなる方法によって、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図もなく、そうすべきでもない。

実施例
実施例１．ハイブリドーマ細胞の調製
本実験は、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質でマウスに免疫し、さらにマウスの脾細胞を取って骨髄腫細胞と融合し、陽性抗体を発現可能なハイブリドーマ細胞が得られた。
ハイブリドーマ融合

細胞の融合：
免疫した動物から脾臓を採取し、脾細胞懸濁液とした。ろ過および赤血球溶解後、脾細胞を２０ｍＬの基本培地に懸濁して計数した。

２０ｍＬの基本培地でマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５８１）を再懸濁して計数した。ＳＰ２／０と脾細胞を１：２～１：１の割合で混合し、１０００ｒｐｍで６ｍｉｎ遠心分離した。上清を除去した後、混合した細胞を１０ｍＬの融合緩衝液（ＢＴＸｐｒｅｓｓ、４７－０００１）に再懸濁した。さらに、１５ｍＬの融合緩衝液を加え、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。上記ステップを１回繰り返した後、適量の融合緩衝液で細胞を再懸濁し、混合細胞の密度を１×１０^７細胞／ｍＬに調整した。電気融合装置のパラメータ設定は、以下の通りである。各電気融合皿に２ｍＬの細胞懸濁液を加えて電気融合を行った。

電気融合後のスクリーニング：
細胞を電気融合皿において室温で５ｍｉｎ静置した。細胞を遠心管に移し、スクリーニング培地（下記の表の通り）で細胞を１ｘ１０^４細胞／ｍＬ～２ｘ１０^４細胞／ｍＬに希釈した。９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬの細胞懸濁液を加えた。融合後の７日目にスクリーニング培地を交換した。１０日間（またはそれ以上、細胞生長状態によって）培養した後、スクリーニングした。Ｅｌｉｓａ検出により特異的抗ｈＴＮＦＲ２抗体を発現したハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。

スクリーニングされたハイブリドーマ細胞に発現した抗体に対してＰＣＲシークエンシングを行い、抗体の可変領域遺伝子を決定し、キメラ抗体のスクリーニング、ヒト化、および親和性成熟を行い、異なる段階の候補配列が得られた。

本発明の例示的な３つの抗体（３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８）およびそのヒト化形態のＣＤＲ領域、軽鎖可変領域と重鎖可変領域、軽鎖と重鎖のアミノ酸配列、ならびに対応するヌクレオチド配列は、下記の表に挙げられている。

注：ＨＣは、ＶＨ配列を配列番号６２のＩｇＧ１部分に融合することにより形成され、ＬＣは、ＶＬ配列を配列番号６３のＣκ鎖に融合することにより形成される。

実施例２．キメラ抗体の生産および精製
（１）ＧＳ－ＣＨＯ細胞における発現および精製：
メーカーの取扱説明書に従い、ＧＳ Ｘｃｅｅｄ（商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ試薬キット（Ｌｏｎｚａ）を使用して抗体を発現するＣＨＯ－Ｓ細胞株を産生した。まず、抗体分子の重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列を、同一のｐＣＨＯ１．０プラスミドに挿入し、ここで、重鎖は軽鎖の上流にあった。その後、化学トランスフェクション法およびエレクトロトランスフェクション法により、構築したｐＣＨＯ１．０プラスミドをＣＨＯ細胞株に導入し、４８時間トランスフェクションした後、ＦｏｒｔｅＢｉｏで抗体の収率を検出し、トランスフェクション効率を判定した。トランスフェクション後の細胞を２回加圧スクリーニングして抗体を高発現した細胞プール（ｐｏｏｌ）が得られた。その後、細胞プールを増幅し、抗体を大量に発現させ、細胞上清を集め、抗体の純度＞９５％になるようにＰｒｏｔｅｉｎ Ａで上清液を精製した。

（２）ＨＥＫ２９３細胞における発現および精製：
ＨＥＫ２９３細胞における抗体の一過性発現に対して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１を使用した。まず、抗体をコードする重鎖および軽鎖のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。化学トランスフェクション法により、抗体分子の重鎖および軽鎖を有するベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。使用された化学トランスフェクション試薬はＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）であり、メーカーから提供された方法に従って、培養した２９３ＨＥＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を一過性トランスフェクションした。トランスフェクションした後、培地を捨て、新鮮なＥＸＰＩ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を４ｘ１０^６／ｍＬに希釈した。３７℃、５％のＣＯ２の条件において細胞を７日間培養し、４８時間ごとに新鮮な培地を流加した。７日間後、１３００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離した。上清液を取り、抗体の純度＞９５％になるように、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで上清液を精製した。

実施例３ バイオレイヤー干渉技術による本発明のキメラ抗体と抗原の結合動力学の測定
本発明は、光干渉による生体測定（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）という測定方法を用いて、本発明の上記３つの例示的な抗体とヒトＴＮＦＲ２（ｈＴＮＦＲ２）、カニクイザルＴＮＦＲ２（ｃＴＮＦＲ２）、マウスＴＮＦＲ２（ｍＴＮＦＲ２）、ヒトＴＮＦＲ１（ｈＴＮＦＲ１）との結合の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。比較として、陽性対照抗体ＯＰＩ（ＷＯ２０１７０８３５２５におけるヒト化抗体ＳＢＴ－００２ｅ、ＶＨ配列配列番号５８、およびＶＬ配列配列番号５９）の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。

ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ．２７０ー８）に従って行われた。簡単に言えば、センサを分析緩衝液においてオフラインで３０分間平衡化し、次にオンラインで６０秒間検出して基線を確立し、上述したように得られた精製された抗体をＡＨＱセンサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にオンラインでロードしてＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行った。さらに、ロードされた抗体を有するセンサを、１００ｎＭのｈＴＮＦＲ２、ｃＴＮＦＲ２、ｍＴＮＦＲ２、ｈＴＮＦＲ１抗原に暴露して５分間作用させた後、解離速度の測定のために、センサを分析緩衝液に移して５分間解離した。１：１結合モデルを利用して動態解析を行った。

上記測定法のように行われた実験において、３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８、および対照抗体ＯＰＩの親和性は、表２に示す通りである。

以上のグラフの結果から見られるように、上記４つの抗体は、いずれも極めて高親和性を示しており、ここで、３Ｃ４、６９Ｂ１および７２Ｇ８は、対照抗体ＯＰＩに相当するかまたはそれ以上の高親和性を有する。

実施例４ ハイブリドーマ抗体とヒトＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２）またはカニクイザルＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｃＴＮＦＲ２）との結合実験
本研究は、フローサイトメーターにより、勾配希釈した本発明のハイブリドーマ抗体（３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８）と表面にヒトＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ安定細胞株との結合状況を検出した。

ヒトＴＮＦＲ２（配列番号６０、ＮＭ＿００１０６６．２）とカニクイザルＴＮＦＲ２（配列番号６１、ＸＰ＿００５５４４８１７．１）をコードするｃＤＮＡをそれぞれｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションし、ヒトＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２）およびカニクイザルＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｃＴＮＦＲ２）を産生した。

ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２細胞またはＣＨＯＳ－ｃＴＮＦＲ２細胞を計数するとともに、２ｘ１０^６個の細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでＵ型底９６ウェルプレートに加えた。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞培地を除去した。試料（それぞれハイブリドーマ抗体３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８および陽性対照抗体ＯＰＩである）の希釈物（抗体の希釈方法は、最高抗体濃度が３００ｎＭで、ＰＢＳに２倍段階希釈した）をＵ型プレートに加えて細胞を再懸濁し、１００μＬ／ウェルで、氷上で３０ｍｉｎ静置した。４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してＰＢＳを除去し、各ウェルに抗マウスＩｇＧのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８で標識した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５－５４５－０７２）（１：１００でＰＢＳに希釈した）を１００μＬ加え、氷上で暗所で３０ｍｉｎインキュベートした。４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。２００μＬの１×ＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳにより検出した。

上記測定法に記載された実験において、検出結果として、図１と図２に示すように、抗体３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８は、いずれもＣＨＯ－Ｓ細胞に過剰発現したヒトＴＮＦＲ２分子（図１参照）およびカニクイザルのＴＮＦＲ２と結合している（図２参照）。

実施例５ ハイブリドーマ抗体によるＴＮＦＲ２のＴＮＦαとの結合への遮断実験
ＥＬＩＳＡにより、ハイブリドーマ抗体３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８および対照抗体ＯＰＩによるヒトＴＮＦαとｈＴＮＦＲ２との結合への遮断能力を検出した。

ｈＴＮＦＲ２タンパク質をＰＢＳで再懸濁して２μｇ／ｍＬの濃度に溶解し、マイクロプレートに一晩被覆した。５％のＢＳＡで１ｈブロッキングし、ビオチン抗原Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＴＮＦαタンパク質（ＡＣＲＯ）を３μｇ／ｍＬに希釈し、２０μＬ／ウェルであった。上述したように調製された抗体（３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８）を最高濃度３００ｎＭから勾配希釈し、合計で８個または１２個の希釈勾配であり、２００μＬ／ウェルで、ＰＢＳにおいて氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。抗原抗体混合液をマイクロプレートにて９０ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、上清を捨て、各ウェルに１：５０００で希釈したＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μＬ加え、常温で３０ｍｉｎ行い、ＰＢＳを加えて６回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ発色液（ｓｏｌａｒｂｉｏ）により１ｍｉｎ発色し、１００μＬ／ウェルの停止液（ｓｏｌａｒｂｉｏ）により停止させた。プレートリーダーによりＯＤ_４５０およびＯＤ_６２０の値を読み取った。

実験の結果から明らかなように、７２Ｇ８は、ＴＮＦαリガンドと受容体の結合に対して遮断作用がないが、３Ｃ４、６９Ｂ１と対照抗体ＯＰＩによる遮断効果が完全であり、ＩＣ５０値において、３Ｃ４および６９Ｂ１はＯＰＩよりも優れている。（図３参照）

実施例６ キメラ抗体とヒトＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２）またはカニクイザルＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｃＴＮＦＲ２）との結合実験
本研究は、フローサイトメーターにより、勾配希釈した本発明のキメラ抗体と表面にヒトＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ安定細胞株との結合状況を検出した。

ヒトＴＮＦＲ２（配列番号６０）とカニクイザルＴＮＦＲ２（配列番号６１）をコードするｃＤＮＡをそれぞれｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションし、ヒトＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２）およびカニクイザルＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｃＴＮＦＲ２）を産生した。

ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２細胞またはＣＨＯＳ－ｃＴＮＦＲ２細胞を計数するとともに、２ｘ１０^６個の細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでＵ型底９６ウェルプレートに加えた。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞培地を除去した。試料（それぞれキメラ抗体３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８および陽性対照抗体ＯＰＩである）の希釈物（抗体の希釈方法は、最高抗体濃度が３００ｎＭで、ＰＢＳに３倍段階希釈した）をＵ型プレートに加えて細胞を再懸濁し、１００μＬ／ウェルで、氷上で３０ｍｉｎ静置した。４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してＰＢＳを除去し、各ウェルに抗ヒトＦｃのＰＥで標識した二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０９）（１：１００でＰＢＳに希釈した）を１００μＬ加え、氷上で暗所で３０ｍｉｎインキュベートした。４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。２００μＬの１×ＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳにより検出した。

上記測定法に記載された実験において、検出の結果として、図面に示すように、キメラ抗体３Ｃ４、６９Ｂ１と７２Ｇ８は、いずれもＣＨＯ－Ｓ細胞に過剰発現したヒトＴＮＦＲ２分子と結合し（図４参照）、かつ抗体３Ｃ４、６９Ｂ１と７２Ｇ８は、いずれもカニクイザルのＴＮＦＲ２と結合している（図５参照）。キメラ抗体３Ｃ４と６９Ｂ１の結合ＥＣ５０値は陽性対照抗体ＯＰＩに相当するが、７２Ｇ８の結合は明らかに低い。

実施例７ キメラ抗体によるＴＮＦＲ２とＴＮＦαとの結合への遮断実験
ＥＬＩＳＡにより、キメラ抗体３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８および対照抗体ＯＰＩによるヒトＴＮＦαとｈＴＮＦＲ２との結合への遮断能力を検出した。

ｈＴＮＦＲ２タンパク質をＰＢＳで再懸濁して２μｇ／ｍＬの濃度に溶解し、マイクロプレートに一晩被覆した。５％のＢＳＡで１ｈブロッキングし、ビオチン抗原Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＴＮＦαタンパク質（ＡＣＲＯ）を２μｇ／ｍＬに希釈し、１０μＬ／ウェルであった。上述したように調製された抗体（３Ｃ４、６９Ｂ１、７２Ｇ８）を最高濃度３００ｎＭから勾配希釈し、合計で８個または１２個の希釈勾配であり、１００μＬ／ウェルで、ＰＢＳにおいて氷上で３０ｍｉｎインキュベートした。抗原抗体混合液をマイクロプレートにて９０ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、上清を捨て、各ウェルに１：５０００で希釈したＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μＬ加え、常温で３０ｍｉｎ行い、ＰＢＳを加えて６回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ発色液（ｓｏｌａｒｂｉｏ）により１ｍｉｎ発色し、１００μＬ／ウェルの停止液（ｓｏｌａｒｂｉｏ）により停止させた。プレートリーダーによりＯＤ_４５０およびＯＤ_６２０の値を読み取った。

実験の結果から明らかなように、３Ｃ４、６９Ｂ１および対照抗体ＯＰＩによる遮断効果が完全であり、７２Ｇ８は遮断効果がない。ＩＣ５０値において、３Ｃ４、６９Ｂ１抗体は、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＯＰＩよりも優れている。（図６参照）

実施例８ キメラ抗体によるＴＮＦＲ２媒介性のＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化への阻害実験
ＴＮＦＲ２に対する阻害抗体は、細胞膜ＴＮＦＲ２との結合により、リガンドＴＮＦαによるＴＮＦＲ２シグナル伝達経路の活性化を遮断することができる。本研究は、Ｊｕｒｋａｔ ＴＮＦＲ２ ＮＦ－κＢ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒシステムにより、ＴＮＦＲ２を過剰発現したＪｕｒｋａｔ細胞において、本発明の抗体によるＴＮＦαにより活性化されたＴＮＦＲ２シグナル伝達経路への阻害作用を検定した。

検出ステップ：
１０％の１６４０培地を希釈ｂｕｆｆｅｒとして、５ｘ１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでＪｕｒｋａｔ ＴＮＦＲ２ ＮＦ－κＢ ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞を各ウェルに加え、細胞を最終濃度５０ｎｇのＴＮＦαおよび異なる濃度の抗体の条件（最高濃度が２０ｎＭで、順に１：２で等比希釈した）でインキュベートし、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで６ｈインキュベートし、各ウェルに１００μＬのｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質液を加えて２ｍｉｎ振とうした。多機能プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ｉ３）により値を読み取った。下記の式に従って、抗体蛍光値の倍率変化を算出した：
倍率変化＝抗体が加えられた各ウェルの蛍光値／対照群（ＴＮＦα処理無し群）の蛍光値。
実験の結果（図７）から明らかなように、ＴＮＦＲ２とＴＮＦαとの結合を遮断したキメラ抗体３Ｃ４と６９Ｂ１は、いずれもＴＮＦαにより誘導されるＴＮＦＲ２ ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を阻害することができ、かつ３Ｃ４と６９Ｂ１抗体の阻害活性は陽性対照抗体ＯＰＩよりも優れている。また、驚くべきことに、７２Ｇ８抗体は、新たなＴＮＦＲ２機能活性阻害メカニズムを示しており、当該抗体は、ＴＮＦＲ２とＴＮＦαとの結合を遮断せずに、ＴＮＦＲ２の重合を直接阻害することで、ＴＮＦαにより誘導されるＴＮＦＲ２ ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を阻害することができる。

実施例９ キメラ抗体のヒト化
得られた抗体である３Ｃ４と６９Ｂ１キメラ抗体をヒト化した。ステップは以下の通りである：
１．ＣＤＲループ構造を決定する。
２．ヒト生殖系列配列データベースに重鎖と軽鎖の各Ｖ／Ｊ領域に最も近い相同配列を見つける。
３．重鎖軽鎖と最もマッチングするヒト生殖細胞系列および最低量の復帰変異をスクリーニングする。
４．キメラ抗体のＣＤＲ領域をヒトの骨格領域に構築する。
５．配列と構造特徴を使用して、骨格領域においてＣＤＲを維持する機能を果たすアミノ酸位置を決定する。
６．重要であると決定された配列位置で復帰変異を行う（入力アミノ酸タイプに戻す）。
７．リスク部位のアミノ酸を最適化する。

得られたヒト化抗体ｈｚ３Ｃ４．７、ｈｚ６９Ｂ１．５、ｈｚ６９Ｂ１．６、ｈｚ６９Ｂ１．１１、ｈｚ６９Ｂ１．２０のＣＤＲ、軽鎖可変領域と重鎖可変領域、軽鎖と重鎖のアミノ酸配列は、添付された配列表を参照してください。

実施例１０ ヒト化抗体とヒトＴＮＦＲ２を発現した細胞の結合実験
本研究は、フローサイトメーターにより、勾配希釈した抗体と表面にヒトＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ安定細胞株との結合状況を検出した。

ヒトＴＮＦＲ２をコードするｃＤＮＡをｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションし、ヒトＴＮＦＲ２を過剰発現したＣＨＯ－Ｓ細胞（ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２）を産生した。

ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２細胞を計数するとともに、２ｘ１０^６細胞／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでＵ型底９６ウェルプレートに加えた。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞培地を除去した。試料（それぞれヒト化抗体ｈｚ３Ｃ４．７、ｈｚ６９Ｂ１．５、ｈｚ６９Ｂ１．６、ｈｚ６９Ｂ１．１１、ｈｚ６９Ｂ１．２０、キメラ抗体６９Ｂ１および陽性対照抗体ＯＰＩである）（抗体の希釈方法は、最高抗体濃度が３００ｎＭで、ＰＢＳにおいて３倍希釈した）をＵ型プレートに加えて細胞を再懸濁し、１００μＬ／ウェルで、氷上で３０ｍｉｎ静置した。４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してＰＢＳを除去し、各ウェルに抗ヒトＦｃのＰＥで標識した二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０９）（１：１００でＰＢＳに希釈した）を１００μＬ加え、氷上で暗所で３０ｍｉｎインキュベートした。４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。２００μＬの１×ＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳにより検出した。

上記測定法に記載された実験において、抗体とＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２細胞の結合状況は、図８に示す通りである。ヒト化抗体ｈｚ３Ｃ４．７、ｈｚ６９Ｂ１．５、ｈｚ６９Ｂ１．６、ｈｚ６９Ｂ１．１１、ｈｚ６９Ｂ１．２０は、いずれもＣＨＯ－Ｓ細胞に過剰発現したヒトＴＮＦＲ２分子と結合している（図８参照）。

実施例１１ ヒト化抗体によるＴＮＦＲ２とＴＮＦαとの結合への遮断実験
実施例７と同様に、ＥＬＩＳＡにより、ヒト化抗体ｈｚ３Ｃ４．７、ｈｚ６９Ｂ１．５、ｈｚ６９Ｂ１．６、ｈｚ６９Ｂ１．１１、ｈｚ６９Ｂ１．２０および対照抗体ＯＰＩによるヒトＴＮＦαとｈＴＮＦＲ２との結合への遮断能力を検出した。

その結果は、図９Ａと図９Ｂに示されている。図面に示すように、３Ｃ４と６９Ｂ１のヒト化形態は、完全な遮断効果を示している。

実施例１２ ヒト化抗体によるＴＮＦＲ２媒介性のＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化阻害実験
実施例８と同様に、Ｊｕｒｋａｔ ＴＮＦＲ２ ＮＦ－κＢ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒシステムにより、ＴＮＦＲ２を過剰発現したＪｕｒｋａｔ細胞において、３Ｃ４と６９Ｂ１のヒト化形態抗体による、ＴＮＦαにより活性化されたＴＮＦＲ２シグナル伝達経路への阻害作用を検査した。その結果は、図１０Ａと１０Ｂに示されている。

実施例１３ ヒト化抗体とＫ５６２、Ｔｒｅｇ細胞との結合実験
本研究は、フローサイトメーターにより、勾配希釈した本発明のヒト化抗体とＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ、慢性骨髄性白血病細胞）およびＴｒｅｇ細胞との結合状況を検出した。

Ｔｒｅｇの調製は以下の通りである：ヒトのＰＢＭＣ細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ、ＰＢ００５Ｆ）を蘇生させ、フローサイトメトリーによりＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ細胞を選別し、Ｔｒｅｇ細胞を単離した。ＣＤ４＋：ａｎｔｉ－ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｂｅａｄｓ＝１：１に従って、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ、１１１３１Ｄ）を加え、１０ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ２を加え、７日間刺激した。

検出ステップ：４００ｇで、５ｍｉｎ遠心分離し、細胞培地を除去し、ＰＢＳでＫ５６２またはＴｒｅｇ細胞を再懸濁し、計数した後、細胞密度を２ｘ１０^６個／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＵ型底９６ウェルプレートに加えた。測定待ちの抗体を加え、３倍勾配希釈し、氷上で３０ｍｉｎ静置した。３００ｇ、５ｍｉｎで上清を除去し、ＰＢＳにより細胞を１回洗浄した。３００ｇ、５ｍｉｎでＰＢＳを除去し、各ウェルに１：２００で希釈したＰＥ－抗ヒトＦｃ抗体（ＳＯＵＴＨＥＲＮ ＢＩＯＴＥＣＨ、２０４０－０９）を１００μＬ加えた。氷上で暗所で３０ｍｉｎインキュベートした。４００ｇで上清を５ｍｉｎ除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。１００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ、ＡＣＣＵＲＩＣ６ ｐｌｕｓ）により検出した。

上記の試験において、その結果として、図１１に示すように、ヒト化抗体ｈｚ３Ｃ４．７、ｈｚ６９Ｂ１．５、ｈｚ６９Ｂ１．１１、ｈｚ６９Ｂ１．２０結合Ｋ５６２とＴｒｅｇ細胞は、対照抗体ＯＰＩと比べて、より優れた結合能力を有する。

実施例１４ ヒト化抗体のＡＤＣＣ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験
本研究は、Ｊｕｒｋａｔ ＡＤＣＣ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７１０２）により、ＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２細胞に対する勾配希釈した本発明のヒト化抗体のＡＤＣＣ殺傷作用を検出した。

検出ステップ：供給業者から提供された実験計画に従って、抗体を勾配希釈し、初期濃度が５０ｎＭで、１：２で等比希釈した。その後、各ウェルに２．５ｘ１０^４のＣＨＯＳ－ｈＴＮＦＲ２ ｃｅｌｌｓ、および１．７５ｘ１０^５のＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を加えた。３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで２０ｈインキュベートし、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質を加えた。２ｍｉｎ後、多機能プレートリーダーにより値を読み取って（ＭＤ、Ｉ３多機能プレートリーダー）検出した。

上記の試験において、その結果として、図１２に示すように、ヒト化抗体ｈｚ３Ｃ４．７、ｈｚ６９Ｂ１．５、ｈｚ６９Ｂ１．１１、ｈｚ６９Ｂ１．２０は、対照抗体ＯＰＩと比べて、ｈＴＮＦＲ２を発現したＣＨＯ－Ｓ細胞に対して、より良いＡＤＣＣ殺傷効果を有する。

実施例１５．抗Ｋ５６２腫瘍薬効試験
本実験は、Ｋ５６２細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに接種して本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍作用を測定した。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス：
雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入され、等級がＳＰＦグレード、品質検査機関が北京維通利華実験動物技術有限公司で、合格証明書番号がＮＯ．１１４００７００３８０３８４である。マウスを受け入れた後、実験開始前に７日間飼育して順応させる。

細胞：
Ｋ５６２細胞は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞であり、ＡＴＣＣ（ＣＡＴ＃：ＣＣＬ－２４３）から購入され、かつ取扱説明書に厳格に遵守して後続のインビボ実験に通常の継代培養を行った。遠心分離して細胞を収集し、Ｍａｔｒｉｇｅｌにおいて細胞を再懸濁して細胞密度を５ｘ１０^６個／ｍＬに調整した。０．２ｍＬの細胞懸濁液を取ってＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右腹部領域に皮下接種し、Ｋ５６２担腫瘍マウスモデルを確立した。

投与：
腫瘍細胞を６日間接種した後、各マウスの腫瘍体積を検出し、腫瘍体積が２５ｍｍ^３～１１８ｍｍ^３の範囲にあるマウスを選別して腫瘍体積によってランダムに群分けし（１群あたりマウス８匹）、各群の腫瘍体積は、平均で６５ｍｍ^３程度である投与量および方法は、表３に示す通りである。ｈ－ＩｇＧ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ－ＢＩＯから購入）は、陰性対照とした。それぞれ接種後の６、１０、１３、１７日目に投与し、１週２回で、合計４回投与し、マウス腫瘍体積および体重をモニターした。毎回投与する前に体重および腫瘍体積を測定し、接種後の２７日目に相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）である。腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積を下記の式：Ｖ＝Ｌ××Ｗ^２／２により算出した。電子天びんにより体重を測定した。

腫瘍阻害率の結果として、図１３および表４に示すように、接種後の２７日目に、キメラ抗体３Ｃ４と６９Ｂ１の単剤は、いずれも腫瘍阻害効果を示すことができる。３Ｃ４の腫瘍阻害率は３７％、６９Ｂ１の腫瘍阻害率はそれぞれ３３％である。従って、本発明のＴＮＦＲ２分子に対する抗体は、腫瘍に対して阻害効果がある。

実施例１６．抗ＭＣ３８－ＴＮＦＲ２腫瘍薬効試験
本実験は、ＭＣ３８－ＴＮＦＲ２細胞（ヒトＴＮＦＲ２を発現したマウス結腸がん細胞）をＣ５７ＢＬ／６マウスに接種して本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍作用を測定した。

Ｃ５７マウス：
雌のＣ５７ＢＬ／６背景のマウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入され、等級がＳＰＦグレード、品質検査機関が北京維通利華実験動物技術有限公司、合格証明書番号がＮＯ．１１００１１１９１１０５５７９６である。マウスを受け入れた後、実験開始前に７日間飼育して順応させる。

細胞：
マウスＭＣ３８－ＴＮＦＲ２細胞を自己構築し、取扱説明書を厳格に遵守して後続のインビボ実験のために通常の継代培養を行った。遠心分離して細胞を収集し、ＰＢＳにおいて細胞を再懸濁して細胞密度を２ｘ１０^６個／ｍＬに調整した。０日目に０．２ｍＬの細胞懸濁液を取ってヒトＣ５７ＢＬ／６マウスの右腹部領域に皮下接種してＭＣ３８－ＴＮＦＲ２担腫瘍マウスモデルを確立した。

投与：
腫瘍細胞を７日間接種した後、各マウスの腫瘍体積を検出し、腫瘍体積によってランダムに群分けし（１群あたりマウス７匹）、各群の腫瘍体積は、平均で６３ｍｍ^３程度である投与量と方式は表５に示す通りであり、ｈ－ＩｇＧ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ－ＢＩＯから購入）は陰性対照とされ、１週２回で、合計４回投与し、マウス腫瘍体積と体重をモニターした。接種後の２１日目に、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）である。腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積を下記の式：Ｖ＝Ｌ××Ｗ^２／２により算出した。電子天びんにより体重を測定した。

腫瘍阻害率の結果として、図１４および表６に示すように、接種後の２１日目に、ｈｚ３Ｃ４．７とｈｚ６９Ｂ１．２０の単剤は、いずれも腫瘍阻害効果を示すことができる。Ｈｚ３Ｃ４．７の単剤の腫瘍阻害率は２８％、ｈｚ６９Ｂ１．２０の腫瘍阻害率は４１％である。従って、本発明のＴＮＦＲ２分子に対する抗体は、腫瘍に対して阻害効果がある。

Claims (18)

1. ＴＮＦＲ２と結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
   （ｉ）配列番号１９に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２０に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
   （ｉｉ）配列番号２１に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２２に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
   （ｉｉｉ）配列番号２３に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２４に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
   （ｉｖ）配列番号２５に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２６に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
   （ｖ）配列番号２７に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２８に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、または
   （ｖｉ）配列番号２９に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列、ならびに配列番号３０もしくは３１に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２と３配列、または
   （ｖｉｉ）配列番号６４に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列、ならびに配列番号６５に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列
   を含む、ＴＮＦＲ２と結合する抗体またはその抗原結合断片。
2. 重鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＨＣＤＲと、軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域ＬＣＤＲとを含むＴＮＦＲ２と結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ここで、
   （ｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、かつＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、または
   （ｉｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号７のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は配列番号８のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は配列番号９のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、かつＬＣＤＲ３は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、または
   （ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は配列番号１５のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は配列番号１６のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、かつＬＣＤＲ３は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、もしくはそれによって構成され、
   または、前記抗体は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のＣＤＲ配列の組み合わせのうちの１つの変異体を含み、ここで、該変異体は、６個のＣＤＲ領域において合計で少なくとも１個かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含み、好ましくは、重鎖ＣＤＲ３は変わらないように維持する、
   抗体またはその抗原結合断片。
3. 重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、
   前記重鎖可変領域は、
   （ｉ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｉｉ）配列番号２１に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｉｉｉ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｉｖ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｖ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｖｉ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｖｉｉ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
   を含む、抗体またはその抗原結合断片。
4. 重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、
   前記軽鎖可変領域は、
   （ｉ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｉｉ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｉｉｉ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｉｖ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｖ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｖｉ）配列番号３０もしくは２１に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
   （ｖｉｉ）配列番号６５に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
   を含む、抗体またはその抗原結合断片。
5. （ｉ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
   （ｉｉ）配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２２に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、または
   （ｉｉｉ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
   （ｉｖ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
   （ｖ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
   （ｖｉ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号３０もしくは３１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
   （ｖｉｉ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
   から選ばれる重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４形態の抗体またはその抗原結合断片で、好ましくはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、好ましくは、前記抗体は、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞がある場合にＡＤＣＣ活性を誘導する、
   前記請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
7. 前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体であり、または前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’）_２断片、シングルドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）もしくは線状抗体から選ばれる、
   前記請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
8. 抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体は、
   （ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体とヒトＴＮＦＲ２の結合を阻害する（例えば、競合的に阻害する）こと、
   （ｉｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体と同じまたは重複するエピトープと結合すること、および
   （ｉｉｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体と競合的にヒトＴＮＦＲ２と結合すること、
   のうちの１つまたは複数の特性を有する、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
9. 前記請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片をコードする、
   単離した核酸。
10. 請求項９に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは発現ベクターである、
    ベクター。
11. 請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である、
    宿主細胞。
12. 抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を調製する方法であって、前記請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む宿主細胞を、核酸の発現に適する条件で培養し、場合により、前記抗体またはその抗原結合断片を単離することを含み、場合により、前記宿主細胞から前記抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を回収することをさらに含む、
    方法。
13. 治療剤または診断剤と結合する前記請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、
    免疫複合体。
14. 前記請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、
    多重特異性抗体。
15. 前記請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の免疫複合体あるいは請求項１４に記載の多重特異性抗体と、場合により、薬用補助材料とを含む、
    医薬組成物。
16. 前記請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用であって、インビボでまたはインビトロで、
    （１）ＴＮＦＲ－２とそのリガンドＴＮＦαの結合を遮断すること、
    （２）ＴＮＦＲ－２とそのリガンドＴＮＦαの結合を遮断せずに、ＴＮＦＲ２の重合を直接阻害すること、
    （３）依存的または非依存的にＴＮＦαとＴＮＦＲ２の結合を遮断することにより、ＴＮＦＲ２受容体の活性化を阻害すること、
    （４）ＴＮＦαとＴＮＦＲ２との結合により媒介されるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を阻害すること、
    （５）ＴＮＦαのＴｒｅｇ細胞増殖促進作用を拮抗すること、および／または
    （６）抗体のＦｃ領域により誘発されるＡＤＣＣ活性に応じて、表面にＴＮＦＲ２を発現した腫瘍細胞を殺傷すること、
    から選ばれる目的のための、使用。
17. 前記対象に有効量の前記請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項１３に記載の免疫複合体、あるいは請求項１４に記載の多重特異性抗体、あるいは請求項１５に記載の医薬組成物を投与することを含み、好ましくは、前記腫瘍は結腸がん、または慢性骨髄性白血病である、
    対象において腫瘍を予防または治療する方法。
18. 試料中のＴＮＦＲ２を検出する方法であって、
    （ａ）試料を前記請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触すること、および
    （ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片とＴＮＦＲ２の間の複合体の形成を検出すること、を含み、場合により、抗体が検出可能に標識されることを含む、
    試料中のＴＮＦＲ２を検出する方法。

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