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JP2024541312A - 新規末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントおよびその使用 - Google Patents

新規末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントおよびその使用 Download PDF

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JP2024541312A JP2024527290A JP2024527290A JP2024541312A JP 2024541312 A JP2024541312 A JP 2024541312A JP 2024527290 A JP2024527290 A JP 2024527290A JP 2024527290 A JP2024527290 A JP 2024527290A JP 2024541312 A JP2024541312 A JP 2024541312A
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ミカエル ソスキヌ，
エロディ シュヌ，
エリーズ シャンピオン，
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ディーエヌエー スクリプト
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本発明は、ｐｏｌＸファミリーの新規ＤＮＡポリメラーゼ、特に特異的突然変異または置換を含む末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアント、およびそれらの使用について述べる。
【選択図】なし

Description

本発明は、少なくとも１つの特異的突然変異または置換を含むｐｏｌＸファミリーの新規ＤＮＡポリメラーゼ、末端デオキシポリヌクレオチド（ＴｄＴ）バリアント、およびその使用に関する。
現在の合成生物学は、近年急速に成長し続けている研究分野である。また、合成生物学は、生体物質を合成する可能性を提供する。したがって、天然には存在しない生体物質を得ることができ、このことによって療法または診断上の解決策、例えば、ゲノムおよび診断配列決定、多重核酸増幅、治療抗体開発、合成生物学、核酸ベースの療法、ＤＮＡオリガミ、ＤＮＡベースのデータ保存等が、もたらされる。
遺伝子合成は、化学ベースの合成方法によって通常には行われる。しかし、こういった方法にはいくつかの問題がある。一例を挙げると、付加された各ヌクレオチドについて、遺伝的エラーの確率は約０．５％であり、配列が長ければ長いほど、エラーを含有する確率は高い。
近年、化学ベースの合成法を、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）などのテンプレートフリーポリメラーゼを使用する酵素ベースの方法によって補うかまたはこれで置き換えることに関心が集まっているが、なぜなら、このような酵素の効率性が証明され、合成率が高く、エラーのリスクが制限されかつ穏和な非毒性反応条件が有利であるからである、例えば、Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第ＷＯ２０１５／１５９０２３号；Ｈｉａｔｔら、米国特許第５７６３５９４号；Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７：１８２１～１８３２頁（２０１８）等。
酵素ベースの合成を使用するほとんどの方法には、ポリヌクレオチド生成物において所望の配列を得るために、可逆的にブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの使用が必要である。残念ながら、テンプレートフリーポリメラーゼは、修飾されていないヌクレオシドトリホスフェートと比較して効率が低下したそのような修飾されたヌクレオシドトリホスフェートを組み入れる。したがって、修飾されたヌクレオシドトリホスフェートに向けられたより良好な組み込み効率を備えた新規テンプレートフリーポリメラーゼバリアントが、開発されてきた、例えば、Ｃｈａｍｐｉｏｎら、米国特許公開第ＵＳ２０１９／０２１１３１５号の後に国際特許公開第ＷＯ２０２１１１６２７０号；Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第ＷＯ２０１７／２１６４７２号等。
新規テンプレートフリーポリメラーゼバリアントが開発されたが、酵素的ＤＮＡ合成過程でのＤＮＡ品質は、例えば、ＤＮＡ合成過程での置換、欠失、または挿入などの、所望のヌクレオチドの組み込みを欠くリスクを低めることによって改善することができる可能性がある。少なくとも部分的に、これらの欠失は、特にプライマーがヘアピン構造を有する場合に、テンプレートフリーポリメラーゼが所望のヌクレオチドを組み込むことができないことによって生じる。
ゆえに、ＤＮＡ合成過程での置換または欠失の数を制限または防止し、ひいては満足なＤＮＡ品質の合成を達成するための、新規のテンプレートフリーポリメラーゼバリアントが必要である。
こういった必要性に取り組むために、本発明者らは、新規ＴｄＴバリアントを開発し、驚くべきことに、より活性なＴｄＴバリアントが、特にＤＮＡ合成過程で、欠失、挿入または置換などの誤組み込みが少ないＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を産生することを発見した。
したがって、本発明は、一例として配列番号６に記載の配列を有することができるリンカー部分を備えるまたは備えない新規末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントに関する。
新規末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントは、
配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号２と１００％未満同一のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる第１の群から選択される位置に、もしくは前記第１の群の各位置の機能的に等価な位置に置換アミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号８と１００％未満同一のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる第２の群から選択される位置に、もしくは前記第２の群の各位置の機能的に等価な位置に置き換えアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含み、ここで、これらの位置は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、
を含む。
一部の実施形態では、新規ＴｄＴバリアントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に、あるアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。
一部の実施形態では、新規ＴｄＴバリアントは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる群から選択される位置に、あるアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。
別の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置にまたは前記群の各位置の機能的に等価な位置に別のアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。特に、前記置換されたアミノ酸は配列番号１において「Ｘ」により指示される。
別の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる群から選択される位置にまたは各位置の機能的に等価な位置に置き換えアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含み、ここで、これらの位置は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。特に、前記置き換えられたアミノ酸は配列番号７において「Ｘ」により指示される。
特定の実施形態では、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列中に２つ以上のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸置換、より好ましくは少なくとも３つのアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態では、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアントは、配列番号７または配列番号８に記載のアミノ酸配列中に２つ以上のアミノ酸置き換え、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸置き換え、より好ましくは少なくとも３つのアミノ酸置き換えを含む。
一部の実施形態では、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列において置換されるアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）およびグリシン（Ｇ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、配列番号７または配列番号８に記載のアミノ酸配列において置き換えられるアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）およびグリシン（Ｇ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、所定の任意の配列のテンプレートフリーポリヌクレオチド伸長を実施するためのキットにも関し、ここで、キットは、本発明の少なくとも１種のＴｄＴバリアント、少なくとも１種の３’－Ｏ－修飾されたヌクレオシドトリホスフェート、および必要に応じて少なくとも１種のイニシエーターを含む。このようなキットは、ＤＮＡ伸長のためのＡ、Ｃ、ＧおよびＴについてのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、またはＲＮＡ伸長のためのｒＡ、ｒＣ、ｒＧおよびＵについてのリボヌクレオシドトリホスフェート（ｒＮＴＰ）をさらに含むことができる。
したがって、キットは、本発明による少なくとも１種のＴｄＴバリアントを含む。これに関連して、キットは１種のＴｄＴバリアントまたは多種のＴｄＴバリアント、例えば異なる２種のＴｄＴバリアントを含むことができる、ことが理解される。
特定の実施形態では、キットは２種以上のＴｄＴバリアントを含み、特にキットは本発明による２種のＴｄＴバリアントを含み、より好ましくはキットは本発明による３種のＴｄＴバリアントを含む。
一部の実施形態では、キットは、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１種のＴｄＴバリアントを含む。特定の実施形態では、キットは２種のＴｄＴバリアントを含み、第１のＴｄＴバリアントは配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ第２のＴｄＴバリアントは配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択されるアミノ酸配列を含むが、前記第２のＴｄＴバリアントは第１のＴｄＴバリアントとは異なる。別の特定の実施形態では、キットは、本発明による３種のＴｄＴバリアントを含み、より好ましくは、キットは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＴｄＴバリアントと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＴｄＴバリアントと、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントとを含む。
一部の実施形態では、キットは、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む少なくとも１種のＴｄＴバリアントを含む。特定の実施形態では、キットは２種のＴｄＴバリアントを含み、第１のＴｄＴバリアントは、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ第２のＴｄＴバリアントは、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むが、前記第２のＴｄＴバリアントは第１のＴｄＴバリアントとは異なる。
一部の実施形態では、キットは、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む少なくとも１種のＴｄＴバリアントを含む。特定の実施形態では、キットは２種のＴｄＴバリアントを含み、第１のＴｄＴバリアントは、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ第２のＴｄＴバリアントは、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むが、前記第２のＴｄＴバリアントは第１のＴｄＴバリアントとは異なる。
一部の実施形態では、第１のＴｄＴバリアントは配列番号３と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、第２のバリアントは配列番号５と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１のＴｄＴバリアントは配列番号９と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、第２のバリアントは配列番号１１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。
有利には、本発明によるＴｄＴバリアントによれば、従来技術のＴｄＴバリアントの技術的問題が解決され、核酸の酵素的合成過程で欠失、挿入が防止され、他の望ましくないトリホスフェート、例えば化学的に損傷されたｄＮＴＰの組み込みが低下する。
本発明はまた、ポリヌクレオチドを合成する方法にも関し、方法は：
ａ．遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有する少なくとも１種のイニシエーターを用意する工程、
ｂ．伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記少なくとも１種のイニシエーターを、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートおよび本発明によるＴｄＴバリアントと接触させ、その結果、前記少なくとも１種のイニシエーターは、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロックされた伸長断片を形成する工程、ならびに
ｃ．伸長断片を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成する工程、ならびに
ｄ．伸長条件下で工程ｃ．で得られた伸長断片を接触させることによって、ポリヌクレオチドが形成されるまで、工程ｂ．および工程ｃ．を繰り返す工程、
を含む。
さらなる実施形態では、本発明には、上記のＴｄＴバリアントをコードする少なくとも１種の核酸分子が含まれる。換言すれば、本発明は、２種以上の核酸を含むことができ、前記核酸分子それぞれは、記載されている、ＴｄＴバリアントに相当するタンパク質配列をコードする。
本発明にはまた、そのような核酸分子を含む少なくとも１種の発現ベクター、および前述の核酸分子または前述の発現ベクターを含む少なくとも１種の宿主細胞が含まれる。なおさらなる実施形態では、本発明には、本発明の少なくとも１種のＴｄＴバリアントを生成する方法が含まれ、この場合、宿主細胞は前記ＴｄＴバリアントをコードする核酸の発現を可能にする培養条件下で培養され、かつＴｄＴバリアントが必要に応じて回収される。
本発明のＴｄＴバリアントを使用する、テンプレートフリーの酵素的核酸合成の方法の工程を図式的に例示する図である。 ＴｄＴの活性を測定するのに適用されたヘアピン（上）およびデュプレックス（下）のｉＤＮＡを表す、図である。 配列番号３、または配列番号４または配列番号５を有するＴｄＴバリアント、それぞれ突然変異Ｔ２６４Ｒ＋Ｉ２９８Ｖ、またはＣ２３Ａ＋Ｔ２６４Ｒ＋Ｉ２９８Ｖ、またはＶ２６２Ａ＋Ｉ２９８Ｖを有するバリアントの活性および合成性能を表す、図である。パネルＡ：ＴＡＧＣＴ＋Ａデュプレックステストにおける＋Ａ反応の酵素速度。パネルＢ：ＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴ＋Ｇヘアピンによる＋Ｇ反応の酵素速度。 配列番号３、または配列番号４または配列番号５を有するＴｄＴバリアント、それぞれ突然変異Ｔ２６４Ｒ＋Ｉ２９８Ｖ、またはＣ２３Ａ＋Ｔ２６４Ｒ＋Ｉ２９８Ｖ、またはＶ２６２Ａ＋Ｉ２９８Ｖを有するバリアントによる２４の配列の合成過程で加えられた欠失、挿入、置換の平均値を、配列番号２のＴｄＴバリアント（参照と称する）によって行われた合成と比較して、表す図である。
定義
アミノ酸は、本明細書では、以下の命名法に従って１文字コードまたは３文字コードによって表される：Ａ：Ａｌａ（アラニン）。Ｒ：Ａｒｇ（アルギニン）；Ｎ：Ａｓｎ（アスパラギン）；Ｄ：Ａｓｐ（アスパラギン酸）；Ｃ：Ｃｙｓ（システイン）；Ｑ：Ｇｌｎ（グルタミン）；Ｅ：Ｇｌｕ（グルタミン酸）；Ｇ：Ｇｌｙ（グリシン）；Ｈ：Ｈｉｓ（ヒスチジン）；Ｉ：Ｉｌｅ（イソロイシン）；Ｌ：Ｌｅｕ（ロイシン）；Ｋ：Ｌｙｓ（リジン）；Ｍ：Ｍｅｔ（メチオニン）；Ｆ：Ｐｈｅ（フェニルアラニン）；Ｐ：プロ（プロリン）；Ｓ：Ｓｅｒ（セリン）；Ｔ：Ｔｈｒ（スレオニン）；Ｗ：Ｔｒｐ（トリプトファン）；Ｙ：Ｔｙｒ（チロシン）；Ｖ：Ｖａｌ（バリン）およびＸ（未定のアミノ酸）。
本発明の文脈における「末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアント」とは、一連の突然変異または変更を共有する一群のＴｄＴ突然変異体を意味する。変更または突然変異とは、１つ以上の位置における置換、挿入、および／または欠失とすることができ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を保存することを可能にする。例えば、同じアミノ酸残基位置に存在する１種または２種または３種の突然変異、例えばスレオニンは２８位でリジンにより置換されている。特に、配列番号３、配列番号４および配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴは突然変異体であり、前記ＴｄＴは一連の突然変異を共有しかつバリアントを構成する。
本発明によるＴｄＴバリアントは、切断型ＴｄＴバリアントである。ＴｄＴバリアントは、当技術分野で周知されている種々の技法によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変するための技法の例としては、それらに限定されないが、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、および合成ポリヌクレオチドの構築が挙げられる。
「切断型ＴｄＴバリアント」とは、本発明の文脈において、相当する野生型ＴｄＴのＮ末端部分を含まないＴｄＴを意味する。本発明によるＴｄＴバリアントは、相当する野生型親ＮＰ＿００１０３６６９３．１［ハツカネズミ（Mus musculus）］）ＴｄＴ配列のアミノ酸残基１～１３２を欠くＮ末端切断型ＴｄＴである。
「未定のアミノ酸」または「未知のアミノ酸」または「Ｘ」とは、本発明の文脈において、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択される２０個のアミノ酸のうちの１つとすることができるアミノ酸を意味する。
本発明の文脈における「置換されたアミノ酸」または「置き換えられたアミノ酸」とは、特定の位置に、特に、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる第１の群から選択される位置に、または、配列番号８に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる第２の群から選択される位置に、本来のアミノ酸（置換または突然変異の前）の別のアミノ酸による置換を意味する。例えば、配列番号２の２３位または配列番号８の４位にて、本来のアミノ酸はＣであり、置換されたアミノ酸はＡである。
本発明の意味において２つの核酸配列の間または２つのアミノ酸配列の間の「同一性の％」または「同一性のパーセンテージ」または「と少なくとも％同一の」とは、比較される２つの配列の間で同一であるヌクレオチドのまたはアミノ酸残基のパーセンテージを指すものと理解され、このパーセンテージは最良のアライメントの後に得られるものであり、このパーセンテージは純粋に統計学的なものであり、当該２つの配列間の差異はランダムにかつそれらの全長にわたって分布する。比較のための配列の最良のアライメントは、手作業の他に、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）（Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁）の局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁）の局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４頁）の類似性検索方法を用いて、これらのアルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェア（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を用いて、オンラインアライメントソフトウェアＭｕｔａｌｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ；１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６（２２）、１０８８１～１０８９０頁）を用いて、実施することができる。
本発明の意味において「機能的に等価な配列」とは、ｐｏＩＸファミリーのＤＮＡポリメラーゼの配列、特に、配列番号１もしは配列番号２または配列番号７もしは配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９９％の同一性の配列、すなわちアミノ酸配列を有するおよび同一の機能的役割を有するＴｄＴの配列を意味すると、理解される。
「機能的に等価な残基」とは、配列番号２または配列番号８と相同な配列を有し、同一の機能的役割を有する、ｐｏＩＸファミリーのＤＮＡポリメラーゼの配列中の残基を意味すると理解される。したがって、「機能的に等価な位置」とは、相同配列における機能的に等価な残基の位置である。
機能的に等価な残基は、例えばオンラインアラインメントソフトウェアＭｕｔａｌｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ；１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６（２２）、１０８８１～１０８９０頁）を用いて実施される配列アラインメントを使用して特定される。アラインメント後、機能的に等価な残基は、考慮される異なる配列上の相同な位置にある。配列のアラインメントおよび機能的に等価な残基の特定は、ｐｏＩＸファミリーのＤＮＡポリメラーゼと種間バリアントを含めてその天然バリアントの間で行うことができる。
本発明の意味において「少なくとも１つのアミノ酸置換を含む」または「少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む」とは、バリアントは配列番号１または配列番号２の配列に関連して指示されるような１つ以上の置換または突然変異を有するが、バリアントは他の修飾、特に置換、欠失または付加を有することができる、ことを意味すると理解される。
本発明の意味において「少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む」とは、バリアントは配列番号７または配列番号８の配列に関連して指示されるような１つ以上の置換または突然変異を有するが、バリアントは他の修飾、特に置換、欠失または付加を有することができる、ことを意味すると理解される。
本発明は、ｐｏＩＸファミリーのＤＮＡポリメラーゼのバリアント、特に、テンプレート鎖なしでＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドを合成するために使用することができるＴｄＴポリメラーゼの安定化バリアントである、ＴｄＴバリアントに関する。本発明のＴｄＴバリアントによれば、修飾されたヌクレオチド、より具体的には３’Ｏ－可逆的に修飾されたヌクレオシドトリホスフェートを、ポリヌクレオチド合成の酵素ベースの方法において使用することが可能になる。特に、ＴｄＴバリアントは、切断型ＴｄＴバリアント、より具体的には、Ｎ末端切断型ＴｄＴバリアントである。
テンプレートフリー酵素的合成
ポリヌクレオチドのテンプレートフリー酵素的合成は、３’－Ｏ－ブロックされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート（３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰ）の組み込みにおいてより高い温度安定性またはより高い効率性などの改善された特性を有するように操作されたそのバリアントを含めて、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）などのテンプレートフリーポリメラーゼを使用する様々な既知のプロトコールによって行うことができる、例えば、Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第ＷＯ／２０１５／１５９０２３号；Ｙｂｅｒｔら、国際特許公開第ＷＯ／２０１７／２１６４７２号；Ｈｙｍａｎ、米国特許第５４３６１４３号；Ｈｉａｔｔら、米国特許第５７６３５９４号；Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７：１８２１～１８３２頁（２０１８）；Ｍａｔｈｅｗｓら、Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＤＯＩ：０．１０３９／ｃ６ｏｂ０１３７１ｆ（２０１６）；Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．、１（１１）：１７２９～１７３１頁（１９９９）である。
一部の実施形態では、酵素的ＤＮＡ合成の方法は、図１に例示されるように、ヌクレオチドが各サイクルにおいて付加されるような、工程の反復サイクルを含む。イニシエーターポリヌクレオチド（１００）が、例えば、固体支持体（１０２）に付着されて、用意され、これが遊離３’－ヒドロキシル基（１０３）を有する。イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（またはその後のサイクルで伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）に、イニシエーターポリヌクレオチド（１００）（または伸長されたイニシエーターポリヌクレオチド）の３’末端上への３’－Ｏ－保護されたｄＮＴＰの酵素的組み込みにとって効果的な条件下で、３’－Ｏ－保護されたｄＮＴＰとＴｄＴバリアント（１０４）とを添加する。この反応により、その３’－ヒドロキシルが保護された伸長したイニシエーターポリヌクレオチド（１０６）が生成される。
換言すれば、ポリヌクレオチドを合成する方法は、以下の工程を含む：
ａ．遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有する少なくとも１種のイニシエーターを用意する工程、
ｂ．伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記少なくとも１種のイニシエーターを、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートおよび本発明によるＴｄＴバリアントと接触させ、その結果、イニシエーターは、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロックされた伸長断片を形成する工程、
ｃ．伸長断片を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成する工程、ならびに
ｄ．伸長条件下で工程ｃ．で得られた伸長断片を接触させることによって、ポリヌクレオチドが形成されるまで、工程ｂ．および工程ｃ．を繰り返す工程。
伸長したイニシエーターポリヌクレオチドが完成した配列を含有する場合、３’－Ｏ－保護基は除去されるか、または脱保護され、所望の配列が、当初のイニシエーターポリヌクレオチドから切断される。このような切断は、様々な１本鎖切断技法のうちのいずれかを使用して、例えば、切断可能なヌクレオチドまたは切断可能なリンカーを、当初のイニシエーターポリヌクレオチド内の所定の位置に挿入することによって、行うことができる。例示的切断可能なヌクレオチドまたはリンカーとしては、それらに限定されないが、（ｉ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断されるウラシルヌクレオチド；（ｉｉ）米国特許第５，７３９，３８６号に記載の、ニトロベンジルリンカーなどの光開裂性基；またはエンドヌクレアーゼＶによって切断されるイノシン、が挙げられる。
一部の実施形態では、切断されたポリヌクレオチドは、遊離５’－ヒドロキシルを有することができる；他の実施形態では、切断されたポリヌクレオチドは、５’リン酸化末端を有することができる。伸長されたイニシエーターポリヌクレオチドが完成した配列を含有しない場合、３’－Ｏ－保護基が除去されて遊離３’－ヒドロキシル（１０３）を露出し、伸長されたイニシエーターポリヌクレオチドはヌクレオチド付加および脱保護の別のサイクルに供される。
本明細書で使用される場合、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’－ヒドロキシルなどの特定の基に関しての「保護された」および「ブロックされた」という用語は、交換可能に使用され、特定の基に共有結合的に付着する部分であって、化学的または酵素的プロセス過程で当該基への化学変化を防止する、部分を意味するものである。特定の基は、ヌクレオシドトリホスフェートの３’－ヒドロキシルであるまたは３’－保護された（またはブロックされた）－ヌクレオシドトリホスフェートが組み込まれてある延長断片（または「延長中間体」）である場合は常に、防止される化学変化とは、酵素的カップリング反応による当該延長断片（または「延長中間体」）のさらなる、もしくは続いて起こる延長である。
一部の実施形態では、各合成工程において３’－Ｏ－可逆的にブロックされたｄＮＴＰの存在下でＴｄＴを使用して、ヌクレオチドの整列配列をイニシエーター核酸にカップリングする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを合成する方法は、（ａ）遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターを用意する工程；（ｂ）延長条件下で、遊離３’－ヒドロキシルを有するイニシエーターまたは延長中間体をＴｄＴと、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの存在下で反応させて３’－Ｏ－ブロックされた延長中間体を生成する工程；（ｃ）延長中間体を脱ブロッキングして遊離３’－ヒドロキシルを備える延長中間体を生成する工程；および（ｄ）ポリヌクレオチドが合成されるまで工程（ｂ）および工程（ｃ）を繰り返す工程を含む。時折、「延長中間体」は「伸長断片」とも呼ばれることもある。
一部の実施形態では、イニシエーターは、例えば、その５’末端により固体支持体に付着されたオリゴヌクレオチドとして用意される。また、上記の方法は、反応工程または延長工程後、ならびに脱ブロッキング工程後に、洗浄工程を含む場合もある。例えば、反応させる工程は、所定のインキュベーション期間または反応時間後に、例えば洗浄することによって、非組み込みヌクレオシドトリホスフェートを除去するサブ工程を含む場合がある。そのような所定のインキュベーション期間または反応時間は、数秒、例えば３０秒～数分、例えば３０分とすることができる。
上記方法はまた、反応工程または延長工程後、ならびに脱ブロッキング工程後に、キャッピング工程ならびに洗浄工程を含むことができる。上述のように、一部の実施形態では、キャッピング工程を含めることができ、その場合、非延長遊離３’－ヒドロキシルをキャッピングされた鎖のさらなるいかなる延長をも防止する化合物と反応させる。一部の実施形態では、そのような化合物は、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートとすることができる。他の実施形態では、遊離３’－ヒドロキシルを備える非延長鎖は、３’－エキソヌクレアーゼ活性、例えば、Ｅｘｏ Ｉを用いてそれらを処理することによって分解することができる。例えば、Ｈｙｍａｎの米国特許第５４３６１４３号を参照されたい。同様に、一部の実施形態では、脱ブロッキングすることができない鎖は、鎖を除去するようにまたはさらなる延長に対して鎖を不活性となるように処理することができる。
ポリヌクレオチドの連続合成を含む一部の実施形態では、キャッピングが等モル量の複数のポリヌクレオチドの生成を防止する場合があるので、キャッピング工程は望ましくない場合がある。キャッピングがない場合、配列には欠失エラーの均一な分布があることになるが、複数のポリヌクレオチドのそれぞれが等モル量で存在することになる。このことは、非延長断片がキャッピングされる場合にはあてはまらないと思われる。
一部の実施形態では、延長工程または伸長工程向けの反応条件は、以下を含むことができる：２．０μＭ精製ＴｄＴ；１２５～６００μＭ ３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰ（例えば、３’－Ｏ－ＮＨ２－ブロックされたｄＮＴＰ）；約１０～約５００ｍＭカコジル酸カリウムバッファー（６．５と７．５の間のｐＨ）、および約０．０１から約１０ｍＭまでの二価カチオン（例えば、ＣｏＣ１２またはＭｎＣ１２）、この場合、伸長反応は、反応体積５０μＬ中、室温～４５℃の範囲内の温度で３分間実施することができる。３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰが３’－Ｏ－ＮＨ２－ブロックされたｄＮＴＰである実施形態では、脱ブロッキング工程のための反応条件は、以下を含むことができる：７００ｍＭ ＮａＮＯ２；１Ｍ酢酸ナトリウム（酢酸を用いて４．８～６．５の範囲のｐＨに調整）、この場合、脱ブロッキング反応は、体積５０μＬ中、室温～４５℃の範囲内の温度で３０秒間～数分間実施することができる。
特定の適用に応じて、脱ブロッキング工程および／または切断工程は、様々な化学的または物理的条件、例えば、光、熱、ｐＨ、特定の化学結合を切断することができる酵素などの特異的試薬の存在を含むことができる。３’－Ｏ－ブロッキング基および相応する脱ブロッキング条件を選択する上での指針は、参照することにより組む込まれる以下の参考文献に見出すことができる：米国特許第５８０８０４５号；米国特許第８８０８９８８号；国際特許公開第ＷＯ９１／０６６７８号；および下に引用の参考文献。一部の実施形態では、切断剤（ここでも、脱ブロッキング試薬または脱ブロッキング剤とも呼ばれることもある）は、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの化学的切断剤である。代替の実施形態では、切断剤は、３’－ホスフェートブロッキング基を切断することができる、例えば、ホスファターゼなどの酵素的切断剤とすることができる。脱ブロッキング剤の選択が、使用される３’－ヌクレオチドブロッキング基のタイプに、１つまたは複数のブロッキング基が使用されているかどうか、イニシエーターが、穏和な処理を必要とする生細胞もしくは生物体にまたは固体支持体等に付着されるかどうかに左右されることは当業者には理解されるであろう。例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィンを使用して３’Ｏ－アジドメチル基を切断することができる、パラジウム錯体を使用して３’Ｏ－アリル基を切断することができる、または、ナトリウム亜硝酸塩を使用して３’Ｏ－アミノ基を切断することができる。特定の実施形態では、切断反応には、ＴＣＥＰ、パラジウム錯体またはナトリウム亜硝酸塩が関与する。
上述の通り、一部の実施形態では、直交性の脱ブロッキング条件を使用して除去することができる２種以上のブロッキング基を用いることが望ましい。以下のブロッキング基の例示的対を、上記のものなどのパラレル合成実施形態で使用することができる。他のブロッキング基の対または２つ超を含有する基が、本発明のこれらの実施形態での使用に利用可能である場合もある、と理解される。
Figure 2024541312000001
生細胞でオリゴヌクレオチドを合成するには、穏和な脱ブロッキングまたは脱保護の条件、すなわち細胞膜を破壊せず、タンパク質を変性させず、キーとなる細胞機能に干渉しない等の条件が必要である。一部の実施形態では、脱保護条件は、細胞生存と適合性である生理的条件の範囲内である。そのような実施形態では、酵素的脱保護は、生理的条件下で実施することができるので望ましい。一部の実施形態では、酵素的に除去可能な特異的ブロッキング基が、その除去に特異的な酵素と関連付けられる。例えば、エステルベースまたはアシルベースのブロッキング基は、アセチルエステラーゼなどのエステラーゼまたは類似の酵素を用いて除去することができ、ホスフェートブロッキング基は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの３’ホスファターゼを用いて除去することができる。例として、３’－Ｏ－ホスフェートは、１００ｍＭ トリス－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１２、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、および１単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの溶液での処理によって除去することができる。反応は、３７℃の温度で１分間進行する。
「３’－ホスフェートブロックされた」または「３’－ホスフェート保護された」ヌクレオチドとは、３’位にてのヒドロキシル基がホスフェート含有部分の存在によってブロックされているヌクレオチドを指す。本発明による３’－ホスフェートブロックされたヌクレオチドの例は、ヌクレオチジル－３’－ホスフェートモノエステル／ヌクレオチジル－２’，３’－環状ホスフェート、ヌクレオチジル－２’－ホスフェートモノエステルおよびヌクレオチジル－２’または３’－アルキルリン酸ジエステル、ならびにヌクレオチジル－２’または３’－ピロリン酸である。チオホスフェートまたはそのような化合物の他のアナログも使用することができる、ただし、こういった代用が脱リン酸化を妨げず、ホスファターゼによって遊離３’－ＯＨがもたらされることを条件とする。
３’－Ｏ－エステル保護されたｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－ホスフェート保護されたｄＮＴＰの合成および酵素的脱保護のさらなる例は、以下の文献に記載されている：Ｃａｎａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９２：１０８５９～１０８６３頁（１９９５）；Ｃａｎａｒｄら、Ｇｅｎｅ、１４８：１～６頁（１９９４）；Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６（２３）：５１２０～５１２６頁（１９７７）；Ｒａｓｏｌｏｎｊａｔｏｖｏら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１８（４＆５）：１０２１～１０２２頁（１９９９）；Ｆｅｒｒｅｒｏら、Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆｕｒ Ｃｈｅｍｉｅ、１３１：５８５～６１６頁（２０００）；Ｔａｕｎｔｏｎ－Ｒｉｇｂｙら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３８（５）：９７７～９８５頁（１９７３）；Ｕｅｍｕｒａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３０（２９）：３８１９～３８２０頁（１９８９）；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４２（５）：９３６～９５０頁（１９６７）；Ｔｓｉｅｎ、国際特許公開第ＷＯ１９９１／００６６７８号。
本明細書で使用される場合、「イニシエーター」（または「イニシエーティング断片」、「イニシエーター核酸」、「イニシエーターオリゴヌクレオチド」等のような等価な用語）は、ＴｄＴなどのテンプレートフリーポリメラーゼによってさらに伸長させることができる、遊離３’末端を備える短いオリゴヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、イニシエーティング断片はＤＮＡイニシエーティング断片である。代替の実施形態では、イニシエーティング断片はＲＮＡイニシエーティング断片である。一部の実施形態では、イニシエーティング断片は、３から１００個の間のヌクレオチド、特に、３から２０個の間のヌクレオチドを保有する。一部の実施形態では、イニシエーティング断片は一本鎖である。代替の実施形態では、イニシエーティング断片は二本鎖である。特定の実施形態では、５’－一級アミンを用いて合成したイニシエーターオリゴヌクレオチドを、製造業者のプロトコールを使用して磁気ビーズに共有結合的に連結することができる。同様に、３’－一級アミンを用いて合成したイニシエーターオリゴヌクレオチドを、製造業者のプロトコールを使用して磁気ビーズに共有結合的に連結することができる。本発明の実施形態と共に使用に適した様々な他の付着化学は、当技術分野で周知されており、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｂｒｏｃｈｕｒｅ、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｔｔａｃｈｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ」、第６巻（２０１４）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００８）；および類似の文献である。
本発明において用いられる３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰの多くは、商業ベンダーから購入してもよく、または公開された技法、例えば、米国特許第７０５７０２６号；国際特許公開第ＷＯ２００４／００５６６７号、同第ＷＯ９１／０６６７８号；Ｃａｎａｒｄら、Ｇｅｎｅ（上で引用）；Ｍｅｔｚｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４２５９～４２６７頁（１９９４）；Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１４：３２４８～３２５２頁（３００６）；米国特許公開第２００５／０３７９９１号を使用して合成してもよい。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、プリン塩基またはピリミジン塩基と、共有結合的に付着した除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボースまたはデオキシリボースの糖部分とを含む修飾されたヌクレオチド分子またはヌクレオシド分子を含み、したがって、３’炭素原子は構造：
－Ｏ－Ｚ
の基を付着している
［式中、－Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｏ－Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ’’）２、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’および－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆのうちのいずれかであり、ここで、各Ｒ’’は、除去可能な保護基であるかまたはその一部であり；各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換されたアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環式、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミドの各基、または結合基を通して付着された検出可能な標識であり；ただし、一部の実施形態では、そのような置換基は、１０個までの炭素原子および／または５個までの酸素もしくは窒素のヘテロ原子を有することを条件とし；または、（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２の基を表し、ここで、各Ｒ’’’は、同一でも異なっていてもよくかつ水素原子およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択され、ただし、一部の実施形態では、各Ｒ’’’のアルキルは１から３個までの炭素原子を有することを条件とし；ならびに、ここで、分子が反応して、各Ｒ’’がＨと交換されている中間体か、またはＺが－（Ｒ’）２－Ｆである場合は、ＦがＯＨ、ＳＨもしくはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換されている中間体をもたらし、この中間体は水性条件下で解離して遊離３’－ＯＨを備える分子を与える；ただし、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ’’である場合、両方のＲ’基ともＨではないことを条件とする。ある特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換されたアルキルであり、ただし、そのようなアルキルまたは置換されたアルキルは、１から１０個までの炭素原子と０から４個までの酸素または窒素のヘテロ原子を有することを条件とする。ある特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの－Ｚは、式－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ３である。ある特定の実施形態では、Ｚはアジドメチル基である］。
一部の実施形態では、Ｚは、２００以下の分子量を有するヘテロ原子を含むまたは含まない切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、１００以下の分子量を有するヘテロ原子を含むまたは含まない切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、５０以下の分子量を有するヘテロ原子を含むまたは含まない切断可能な有機部分である。一部の実施形態では、Ｚは、２００以下の分子量を有するヘテロ原子を含むまたは含まない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、１００以下の分子量を有するヘテロ原子を含むまたは含まない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、５０以下の分子量を有するヘテロ原子を含むまたは含まない酵素的に切断可能な有機部分である。他の実施形態では、Ｚは、２００以下の分子量を有する酵素的に切断可能なエステル基である。他の実施形態では、Ｚは、３’－ホスファターゼによって除去可能なホスフェート基である。一部の実施形態では、以下の３’－ホスファターゼのうちの１種以上を、製造業者の推奨プロトコールを用いて使用することができる：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、組換えエビアルカリホスファターゼ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡから入手可能）。
さらなる特定の実施形態では、３’－ブロックされたヌクレオチドトリホスフェートは、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ２または３’－Ｏ－アリル基のいずれかによってブロックされている。他の実施形態では、３’－ブロックされたヌクレオチドトリホスフェートは、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ２のいずれかによってブロックされている。
一部の実施形態では、本発明の３’－Ｏ－ブロッキング基には、３’－Ｏ－メチル、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アミン、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブトキシエトキシ、３’－Ｏ－（２－シアノエチル）、および３’－Ｏ－プロパルギルが含まれる。
ＴｄＴバリアント
本発明の第１の態様によれば、本発明によるＴｄＴバリアントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に、あるアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。特に、本発明によるＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－修飾されたヌクレオチドを核酸断片へと組み込むことができる。
特定の実施形態では、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される２つ以上のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも２つまたは３つを含むことができる。前記ＴｄＴバリアントは、ＤＮＡ鎖および／またはＲＮＡ鎖を合成することができる。
別の実施形態では、本発明によるＴｄＴバリアントは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に、あるアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
ここで、これらの位置は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＴｄＴバリアントは、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも１個の未定のアミノ酸を含む。配列中の未定のアミノ酸は、配列番号１において「Ｘ」により指示される。
本発明の第２の態様によれば、本発明によるＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号２と１００％未満同一のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる第１の群から選択される位置にまたは前記第１の群の各位置の機能的に等価な位置に置換アミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。特に、本発明によるＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－修飾されたヌクレオチドを核酸断片へと組み込むことができる。
特定の実施形態では、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される２つ以上のアミノ酸置換、好ましくは少なくとも２つまたは３つを含むことができる。前記ＴｄＴバリアントは、ＤＮＡ鎖および／またはＲＮＡ鎖を合成することができる。
別の実施形態では、本発明によるＴｄＴバリアントは、配列番号１と少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号１と１００％未満同一のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置にまたは前記第１の群の各位置の機能的に等価な位置に置換アミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する前記ＴｄＴバリアントは、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる第１の群から選択される位置にまたは前記第１の群の各位置の機能的に等価な位置に少なくとも１個の未定のアミノ酸を含む。配列中の未定のアミノ酸は、配列番号１において「Ｘ」により指示される。
本発明の第２の態様によれば、本発明によるＴｄＴバリアントは、
配列番号８と少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号８と１００％未満同一のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる第２の群から選択される位置にまたは前記第２の群の各位置の機能的に等価な位置に置き換えアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含み、ここで、これらの位置は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。特に、本発明によるＴｄＴバリアントは、（ｉ）テンプレートなしで核酸断片を合成することができ、（ｉｉ）３’－Ｏ－修飾されたヌクレオチドを核酸断片へと組み込むことができる。
特定の実施形態では、前記アミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる第２の群から選択される２つ以上のアミノ酸置き換え、好ましくは少なくとも２つまたは３つを含むことができる。前記ＴｄＴバリアントは、ＤＮＡ鎖および／またはＲＮＡ鎖を合成することができる。
別の実施形態では、本発明によるＴｄＴバリアントは、配列番号７と少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号７と１００％未満同一のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる群から選択される位置にまたは前記第１の群の各位置の機能的に等価な位置に置き換えアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含み、ここで、これらの位置は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。配列番号７と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する前記ＴｄＴバリアントは、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる第２の群から選択される位置にまたは前記第２の群の各位置の機能的に等価な位置に少なくとも１個の未定のアミノ酸を含む。配列中の未定のアミノ酸は、配列番号７において「Ｘ」により指示される。
別の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、Ｃ２３、Ｖ２６２、Ｔ２６４およびＩ２９８からなる群から選択される一残基に相当する位置に、あるアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。例えば、残基Ｃ２３は置換前の２３位にてのシステインアミノ酸に相当する。
別の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、Ｃ２３、Ｖ２６２、Ｔ２６４およびＩ２９８からなる群から選択される一残基に相当する位置にまたは前記群の各位置の機能的に等価な位置に置換アミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。例えば、残基Ｃ２３は置換前の２３位にてのシステインアミノ酸に相当する。
別の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、Ｃ４、Ｖ２４３、Ｔ２４５およびＩ２７９からなる群から選択される一残基に相当する位置にまたは前記群の各位置の機能的に等価な位置に置き換えアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含み、ここで、これらの位置は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。例えば、残基Ｃ４は置換前の２３位にてのシステインアミノ酸に相当する。先の実施形態のいずれか一つによれば、上記の置換は、柔軟なループＬ１ － ｄＮＴＰとｉＤＮＡの結合に関与するタンパク質領域 － 内に位置するＴｄＴ残基に相当するが、また、触媒ドメインのコア － 反応の化学段階（ヌクレオチジルエキソ転移酵素活性）に関与するタンパク質領域 － 内に位置するＴｄＴ残基にも、および、Ｃ末端ドメイン － ｉＤＮＡ結合とＴｄＴの全体的なフォールディングに関与するタンパク質領域 － に位置するＴｄＴ残基にも、相当する。特定の位置、特に柔軟なループＬ１における前記置換によって、ｉＤＮＡのＴｄＴ ３’ＯＨの間のより良好なアライメントに起因して、ｄＮＴＰのアルファホスフェートに対する反応収率が改善される。
一部の実施形態では、本発明によるＴｄＴバリアントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の機能的に等価な配列を含み、前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に、あるアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、これらの位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている。
本発明の文脈において、ＴｄＴバリアントは任意の種由来であってもよく、キメラタンパク質であってもよい。「キメラタンパク質」とは、バリアントの一部が少なくとも異なる２種由来であることを意味する。前記キメラタンパク質は、ある種のタンパク質の１つ以上の所定の配列と、ｐｏＩＸファミリーのメンバーである、特にＴｄＴである第２の種の少なくとも１つの所定の別の配列との付加によって、特に融合またはコンジュゲーションによって形成される。好ましくは、ＴｄＴバリアントはキメラタンパク質であり、より好ましくは、キメラタンパク質は異なる２種由来の一部、特にマウス由来の所定の配列とウシ由来の所定の配列とを含む。
特定の実施形態では、本発明によるＴｄＴバリアントは、配列番号１にまたは配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％の同一性または相同性、好ましくは、配列番号１によるまたは配列番号２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％未満の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別の特定の実施形態では、本発明によるＴｄＴバリアントは、配列番号３、配列番号４および配列番号５で構成される群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％の同一性または相同性、より好ましくは、配列番号３、配列番号４および配列番号５で構成される群から選択される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％未満の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置にての置換アミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、ＴおよびＧからなる群から選択される。より好ましくは、置換されたアミノ酸は２９８位にあり、指示される位置は配列番号１または配列番号２とのアラインメントによって決定される。
特定の実施形態では、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる群から選択される位置にての置き換えアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置き換えは、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、ＴおよびＧからなる群から選択される。より好ましくは、置き換えられたアミノ酸は２７９位にあり、指示される位置は配列番号７または配列番号８とのアラインメントによって決定される。
一部の実施形態では、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む。好ましくは、第１の置換は２９８位にあり、第２の置換は２３位、２６２位、および２６４位からなる群から選択される位置にある。
一部の実施形態では、配列番号１または配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む。好ましくは、第１の置換は２９８位にあり、第２の置換は２３位、２６２位、および２６４位からなる群から選択される位置にある。Ｉ
一部の実施形態では、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位、および２７９位からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置き換えを含む。好ましくは、第１の置換は２７９位にあり、第２の置換は４位、２４３位、および２４５位からなる群から選択される位置にある。
特定の実施形態では、少なくとも２つの置換は、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、ＴおよびＧからなる群から選択される。
特定の実施形態では、少なくとも２つの置き換えは、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、ＴおよびＧからなる群から選択される。一部の実施形態では、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも３つの置換を含む。好ましくは、第１の置換は２９８位にあり、第２の置換は２３位または２６４位にあり、第３の置換も同様に２３位または２６４位にある。
一部の実施形態では、配列番号１または配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも３つの置換を含む。好ましくは、第１の置換は２９８位にあり、第２の置換は２３位または２６４位にあり、第３の置換も同様に２３位または２６４位にある。
一部の実施形態では、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位、および２７９位からなる群から選択される位置に少なくとも３つの置き換えを含む。好ましくは、第１の置き換えは２７９位にあり、第２の置き換えは４位または２４５位にあり、第３の置き換えも同様に４位または２４５位にある。
特定の実施形態では、３つの置換は、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、ＴおよびＧからなる群から選択される。
特定の実施形態では、３つの置き換えは、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、ＴおよびＧからなる群から選択される。
特定の実施形態では、配列番号２に記載の本発明によるＴｄＴバリアントのアミノ酸配列は、Ｉ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。「Ｉ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌ」とは、これは、イソロイシンがバリン（Ｖ）、スレオニン（Ｔ）およびロイシン（Ｌ）から選択されるアミノ酸によって２９８位で置換されていることを意味する。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸置換はＩ２９８／Ｖである。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｉ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｉ２７９Ｖ／Ｔ／Ｌから選択される少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む。
別の特定の実施形態では、配列番号２に記載のＴｄＴバリアントのアミノ酸配列は、Ｔ２６４Ｒ／Ｋ／Ｑから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。「Ｔ２６４Ｒ／Ｋ／Ｑ」とは、これは、スレオニンがアルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｋ）およびグルタミン（Ｑ）から選択されるアミノ酸によって２６４位で置換されていることを意味する。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸置換はＴ２６４／Ｒである。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｔ２６４Ｒ／Ｋ／Ｑから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｔ２４５Ｒ／Ｋ／Ｑから選択される少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む。
別の特定の実施形態では、配列番号２に記載のＴｄＴバリアントのアミノ酸配列は、Ｖ２６２Ａ／Ｔ／Ｇから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。「Ｖ２６２Ａ／Ｔ／Ｇ」とは、これは、バリンがアラニン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）およびグリシン（Ｇ）から選択されるアミノ酸によって２６２位で置換されていることを意味する。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸置換はＶ２６２Ａである。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｖ２６２Ａ／Ｔ／Ｇから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｖ２４３Ａ／Ｔ／Ｇから選択される少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む。
別の特定の実施形態では、配列番号２に記載のＴｄＴバリアントのアミノ酸配列は、Ｃ２３Ａ／Ｔから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。「Ｃ２３Ａ／Ｔ」とは、これは、システインがアミノ酸アラニン（Ａ）またはスレオニン（Ｔ）によって２３位で置換されていることを意味する。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸置換はＣ２３Ａである。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｃ２３Ａ／Ｔから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｃ４Ａ／Ｔから選択される少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む。
一部の実施形態では、配列番号２に記載のＴｄＴバリアントのアミノ酸配列は、Ｃ２３Ａ／Ｔ、Ｖ２６２Ａ／Ｔ／Ｇ、Ｔ２６４Ｒ／Ｋ／ＱおよびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌから選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、２つのアミノ酸置換は、Ｔ２６４Ｒ／Ｋ／ＱおよびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌ、またはＣ２３Ａ／ＴおよびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌ、またはＶ２６２Ａ／Ｔ／ＧおよびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌである。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｃ２３Ａ／Ｔ、Ｖ２６２Ａ／Ｔ／Ｇ、Ｔ２６４Ｒ／Ｋ／ＱおよびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌから選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、２つのアミノ酸置換は、Ｔ２６４Ｒ／Ｋ／ＱおよびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌ、またはＣ２３Ａ／ＴおよびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌ、またはＶ２６２Ａ／Ｔ／ＧおよびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌである。
一部の実施形態では、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｃ４Ａ／Ｔ、Ｖ２４３Ａ／Ｔ／Ｇ、Ｔ２４５Ｒ／Ｋ／ＱおよびＩ２７９Ｖ／Ｔ／Ｌから選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、好ましくは、２つのアミノ酸置換は、Ｔ２４５Ｒ／Ｋ／ＱおよびＩ２７９Ｖ／Ｔ／Ｌ、またはＣ４Ａ／ＴおよびＩ２７９Ｖ／Ｔ／Ｌ、またはＶ２４３Ａ／Ｔ／ＧおよびＩ２７９Ｖ／Ｔ／Ｌである。
他の好ましい実施形態では、配列番号２に記載のＴｄＴバリアントのアミノ酸配列は、Ｃ２３Ａ／Ｔ、およびＴ２６４Ｒ／Ｋ／Ｑ、およびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌである３つのアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｃ２３Ａ／Ｔ、およびＴ２６４Ｒ／Ｋ／Ｑ、およびＩ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌである３つのアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｃ４Ａ／Ｔ、およびＴ２４５Ｒ／Ｋ／Ｑ、およびＩ２７９Ｖ／Ｔ／Ｌである３つのアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置換は２９８位にある。
一部の実施形態では、前記少なくとも１つのアミノ酸置き換えは２７９位にある。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位、および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む。
一部の実施形態では、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位、および２７９位からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置き換えを含む。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも３つの置換を含む。
一部の実施形態では、配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位、および２７９位からなる群から選択される位置に少なくとも３つの置き換えを含む。
好ましい実施形態では、本発明のＴｄＴバリアントは、キメラバリアントであり、下の表１に列挙されている。
Figure 2024541312000002
一部の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号３、配列番号４、配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくはＴｄＴバリアントは配列番号３または配列番号５に記載のアミノ酸配列を有し、より好ましくはＴｄＴバリアントは配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、ＴｄＴバリアントは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくはＴｄＴバリアントは配列番号９または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、より好ましくはＴｄＴバリアントは配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むＴｄＴバリアントは、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、好ましくはそれらと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり、かつ必要に応じてそれらと１００％未満同一である。
配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むＴｄＴバリアントは、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であり、好ましくはそれらと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり、かつ必要に応じてそれらと１００％未満同一である。
本発明による前記特定のＴｄＴバリアントによって、ＤＮＡ合成の質が改善され、次いで技術的問題が解決される。特に、配列番号３、配列番号４および配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントの欠失率と比較してそれぞれ、工程当たり０．５５％から０．３６％、０．３２％および０．４０％まで、アラニンについて欠失率の減少を有する。同じＴｄＴバリアントによって、全体的な合成エラー率がそれぞれ工程当たり０．０４％、０．０６％および０．０６％だけ減少する。したがって、本発明による前記特定のＴｄＴバリアントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントと比較して、より安定である。
また特に、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントまたは配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントの欠失率と比較してそれぞれ、工程当たり０．５５％から０．３６％、０．３２％および０．４０％まで、アラニンについて欠失率の減少を有する。同じＴｄＴバリアントによって、全体的な合成エラー率がそれぞれ工程当たり０．０４％、０．０６％および０．０６％だけ減少する。したがって、本発明による前記特定のＴｄＴバリアントは、配列番号２に記載のまたは配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントと比較して、より安定である。
別の実施形態では、本発明は、ｐｏＩＸファミリーのＤＮＡポリメラーゼのバリアントを、特に本発明によるテンプレート鎖なしで核酸分子を合成することができるＴｄＴをコードする核酸に関する。本発明はまた、本発明による核酸の発現カセットに関する。本発明は、本発明による核酸または発現カセットを含むベクターにさらに関する。ベクターは、プラスミドから選択しても、ウイルスベクターから選択してもよい。
ＤＮＡポリメラーゼバリアントをコードする核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）であっても、ＲＮＡであっても、この２つの混合物であってもよい。上記核酸は、一本鎖形態であっても、デュプレックス形態であっても、この２つの形態の混合物であってもよい。上記核酸は、例えば、修飾された結合、修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基、または修飾された糖を含む修飾されたヌクレオチドを含むことができる。上記核酸は、化学合成、組換え、突然変異誘発等を含めて、当業者に既知の方法のいずれかによって調製することができる。
発現カセットは、本発明によるＴｄＴバリアントの発現に必要な全てのエレメント、特に、宿主細胞における転写および翻訳に必要なエレメントを含む。宿主細胞は、原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。特に、発現カセットは、プロモーターおよびターミネーターを、必要に応じて増幅因子を含む。プロモーターは、原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。以下は好ましい原核生物プロモーターの例である：Ｌａｃｌ、ＬａｃＺ、ｐＬａｃＴ、ｐｔａｃ、ｐＡＲＡ、ｐＢＡＤ、バクテリオファージＴ３もしくはＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ポリヒドリンプロモーター、ラムダファージのＰＲもしくはＰＬプロモーター。以下は好ましい真核生物プロモーターの例である：ＣＭＶ早期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０早期または後期プロモーター、マウスのメタロチオネイン－Ｌプロモーター、およびある特定のレトロウイルスのＬＴＲ領域。一般に、適正なプロモーターの選択に関して、当業者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）による研究をまたはＦｕｌｌｅｒら（１９９６；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）により記載の技法を有利に参照することができる。
本発明は、本発明によるＴｄＴバリアントをコードする核酸または発現カセットを担持するベクターに関する。ベクターは、発現ベクターであることが好ましい、すなわち、ベクターは、宿主細胞におけるバリアントの発現に必要なエレメントを含む。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌（E.coli）であっても、または真核生物であってもよい。真核生物は、酵母（例えば、Ｐ．パストリス（P.pastoris）またはＫ．ラクチス（K.lactis））もしくは真菌（例えばアスペルギルス（Aspergillus）属のもの）などの下等真核生物であっても、昆虫細胞（例えばＳｆ９またはＳｆ２１）、哺乳動物細胞もしくは植物細胞などの高等真核生物であってもよい。細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ（ミドリザル細胞株）（例えば、ＣＯＳ １（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、ＣＯＳ ７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＣＨＯ（米国特許第４，８８９，８０３号；同第５，０４７，３３５号、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１））、マウスの細胞およびヒト細胞であってもよい。特定の実施形態では、細胞は、非ヒトであり非胚性である。ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、アグロバクテリウム（Agrobacterium）ｐＴｉプラスミド等とすることができる。ベクターは好ましくは、複製起点、多重クローニング部位および選択遺伝子から選択される１つ以上のエレメントを含むことができる。好ましい実施形態では、ベクターはプラスミドである。以下は原核生物ベクターの非網羅的例である：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ－９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）。以下は真核生物ベクターの非網羅的例である：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＰＩＣＺ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＣＩ－ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；およびｐＱＥ－３０（ＱＬＡｅｘｐｒｅｓｓ）。ウイルスベクターは、非網羅的様式でアデノウイルス、ＡＡＶ、ＨＳＶ、レンチウイルス等である。好ましくは、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。
本発明によるＴｄＴバリアントをコードする配列は、シグナルペプチドを含む場合もあれば含まない場合もある。上記配列がシグナルペプチドを含まない場合には、メチオニンを必要に応じてＮ末端に付加することができる。別の代替形態では、異種シグナルペプチドを導入してもよい。この異種シグナルペプチドは、大腸菌などの原核生物に由来しても、真核生物、特に哺乳動物細胞、昆虫細胞、または酵母に由来してもよい。
本発明は、細胞を形質転換するまたはトランスフェクションするための、本発明による、発現カセットのまたはベクターのポリヌクレオチドの使用に関する。本発明は、ＴｄＴバリアントをコードする核酸、発現カセットまたはベクターを含む宿主細胞に、および本発明によるＴｄＴバリアントを生成するためのその使用に関する。「宿主細胞」という用語は、本細胞の培養からまたは増殖から生じる娘細胞を包含する。特定の実施形態では、細胞は、非ヒトであり非胚性である。
本発明はまた、本発明のＴｄＴバリアントを生成するための方法にも関し、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターによる細胞の形質転換またはトランスフェクション；トランスフェクトされた／形質転換された細胞を培養すること；および細胞により産生されたＴｄＴバリアントを回収すること、を含む。代替的な実施形態では、本発明によるＴｄＴバリアントを生成するための方法は、本発明によるポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターを含む細胞を用意すること；トランスフェクトされた／形質転換された細胞を培養すること；および細胞により産生されたＴｄＴバリアントを回収することを含む。特に、細胞は、バリアントをコードする核酸によって一過性のまたは安定な様式で形質転換されても／トランスフェクトされてもよい。この核酸は、エピソームの形態でまたは染色体の形態で細胞に含めることができる。組換えタンパク質を生成するための方法は、当業者には周知されている。
ＴｄＴバリアントは、共有結合または非共有結合；アミノ酸タグ（例えば、ポリ－アミノ酸タグ、ポリ－Ｈｉｓタグ、６Ｈｉｓタグ等）；化学化合物（例えば、ポリエチレングリコール）；タンパク質－タンパク質結合ペア（例えば、ビオチン－アビジン）；アフィニティーカップリング；捕捉プローブ；またはこれらの任意の組み合わせを始めとするリンカー部分に動作可能に連結することができる。リンカー部分は、ＴｄＴバリアントとは別であってもよく、ＴｄＴバリアントの一部であってもよい。本発明の修飾されたＴｄＴバリアントと共に使用するための例示的Ｈｉｓタグは、ＭＡＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＳＥＫＫＩＳ － （配列番号６）である。タグ－リンカー部分は、ＴｄＴバリアントのヌクレオチド結合活性または触媒活性に干渉せず、ＴｄＴバリアントの容易な精製および分離を可能にする。
本発明によるＴｄＴバリアントは、テンプレート鎖なしでの核酸の合成に特に有利である。より具体的には、本発明によるバリアントは、天然ヌクレオチドよりも大きな立体障害を呈する修飾されたヌクレオチドの収容により適切である、より柔軟なループ１を有する。また、配列番号２のＴ２６４Ｒ突然変異または配列番号８のＴ２４５Ｒによって、ＴｄＴとＤＮＡイニシエーターとの間の相互作用が改善される。
したがって、本発明はまた、３’－ＯＨ修飾されたヌクレオチドから、テンプレート鎖なしで核酸分子を合成するための、本発明によるＴｄＴバリアントの、特に出願第ＷＯ２０１６０３４８０７号に記載のものの、使用にも関する。
別の態様では、本発明は、特にテンプレート鎖なしでの核酸分子の酵素的合成のためのキットに関し、前記キットは：
ａ．上記実施形態のいずれか一つによる少なくとも１種のＴｄＴバリアント、
ｂ．少なくとも１種の３’－Ｏ－修飾されたヌクレオシドトリホスフェート、および
ｃ．必要に応じて少なくとも１種のイニシエーター
を含む。
特に、修飾されたヌクレオシドトリホスフェートは保護基である。この保護基によって、３’－ＯＨをブロックして／保護して、その結果、その他のヌクレオシドとの反応を防止することを可能にする。したがって、特に、キットは、少なくとも１種の３’－Ｏ－保護されたヌクレオシドトリホスフェートを含む。
特定の実施形態では、本発明のキットは、少なくとも２種のＴｄＴバリアント、好ましくは少なくとも３種のＴｄＴバリアントを含む。キットが２種以上のＴｄＴバリアントを含む場合、キット中のＴｄＴバリアントは互いに異なる可能性がある。例えば、キットは本発明のＴｄＴバリアントの混合物であってもよい。
一部の実施形態では、キットは、配列番号３と少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号３と１００％未満同一のアミノ酸配列を含む第１のＴｄＴバリアントと、配列番号５と少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号５と１００％未満同一のアミノ酸配列を含む第２のＴｄＴバリアントと、を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のキットは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む第１のＴｄＴバリアントと、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む第２のバリアントとを含む。
一部の実施形態では、本発明のキットは、配列番号９と少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号９と１００％未満同一のアミノ酸配列を含む第１のＴｄＴバリアントと、配列番号１１と少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号１１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の、必要に応じて配列番号１１と１００％未満同一のアミノ酸配列を含む第２のＴｄＴバリアントと、を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のキットは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む第１のＴｄＴバリアントと、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む第２のバリアントと、を含む。
本発明の前記ＴｄＴバリアントおよび前記キットは、テンプレート鎖なしでのポリヌクレオチド、すなわち核酸分子の酵素的合成に特に適切である。
したがって、本発明はまた、テンプレート鎖なしでの核酸分子の酵素的合成のための方法にも関し、本方法によれば、プライマー鎖を、少なくとも１種のヌクレオチドと、好ましくは３’－ＯＨ修飾されたヌクレオチドと、本発明によるＴｄＴバリアントの存在下で接触させる。
したがって、本発明は、必要に応じて所定の配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法に関し、方法は：
ａ．遊離３’－ヒドロキシルを有する３’－末端ヌクレオチドを有する少なくとも１種のイニシエーターを用意する工程、
ｂ．伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する前記少なくとも１種のイニシエーターを、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートおよび上記実施形態のいずれか１つによるＴｄＴバリアントと接触させ、その結果、前記少なくとも１種のイニシエーターは、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロックされた伸長断片を形成する工程、ならびに
ｃ．伸長断片を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成する工程、ならびに
ｄ．伸長条件下で工程ｃ．で得られた伸長断片を接触させることによって、ポリヌクレオチドが形成されるまで、工程ｂ．および工程ｃ．を繰り返す工程、
を含む。
好ましい実施形態では、本発明によるＴｄＴバリアントは、参照により本明細書に組み込まれる出願第ＷＯ２０１５／１５９０２３号に記載されている合成方法を実施するために使用することができる。
本発明の他の特徴および利点は、もちろん非限定的なものである以下の実施例および結果からより明らかになるであろう。
実施例１ － ＴｄＴバリアントの構築、発現およびスクリーニング
ＴｄＴバリアントの構築
本発明のＴｄＴバリアントは、Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋ．ＭＥＧＡＷＨＯＰ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｒｅａｔｉｎｇ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｖｉａ ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１１；４９８：３９９～４０６頁．Ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－３８５１２０－８．０００１７－６．ＰＭＩＤ：２１６０１６８７により開示されたＭＥＧＡＷＨＯＰクローニング法を使用して創出した。
メガプライマーを、通常のＰＣＲ増幅および分子生物学技法に従って、少なくとも１つのプライマーは変異原性（縮重コドンまたは事前設計の突然変異を含有する）である一対のプライマーを用いるＰＣＲによって作製した。精製メガプライマーを、第２のＰＣＲ工程でＴＤＴ環状骨格プラスミド（ｐｅｔ２８ベクター）と組み合わせた。ＤｐｎＩでの消化の後、ＰＣＲ生成物をＥ．Ｃｌｏｎｉ １０Ｇ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）にエレクトロポレーションした。形質転換体を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを補充した２ＹＴ寒天プレート上で選択した。ＴｄＴバリアントをコードするプラスミドを、形質転換プレートのバクテリアカーペットから、または一晩の液体培養物（０．５％グルコースおよび５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを補充した２ＹＴ）からのいずれかから直接に調製した。
発現およびスクリーニング
スクリーニングの場合、ＴｄＴバリアントをコードするプラスミドを市販の大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）で再形質転換した。カナマイシンペトリ皿内で増殖することができたコロニーを分離し、標識した。ＴｄＴの個々のバリアントを、Ｙｂｅｒｔら、米国特許出願第ＵＳ２０２０／０００２６９０号により記載のように、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーを使用して９６ウェルフォーマットで生成し、発現させ、および精製した。タンパク質の量は２８０ｎｍにての吸収度によって決定した。
実施例２ － ＴｄＴバリアントの活性、特にデュプレックスおよびヘアピンの活性の研究。
本発明による様々なＴｄＴバリアントの活性を、以下の試験によって決定した。結果を、バリアントそれぞれが由来する配列番号２のＴｄＴ（参照）を用いて得られた結果と比較した。
本研究では、国際特許出願番号第ＷＯ２０２０／０９９４５１号に記載のように、３’末端ｄＮＴＰの組み込みにおけるＴｄＴ動態をモニタリングする。本発明者らは、単一の塩基（＋Ａ反応についてはＴＧＧＣＣおよび＋Ｇ反応についてはＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴ）の組み込みの際に一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）へと移行する短いイニシエーターＤＮＡ（ｉＤＮＡ）基質を開発した。用途に応じて、２つのタイプのｉＤＮＡ：主に分子内ｄｓＤＮＡを形成するヘアピン－ＤＮＡ、または２つの分子から構成される対称なｄｓＤＮＡを形成するデュプレックス－ＤＮＡ、を適用した（図２を参照のこと）。デュプレックスアッセイでは、単一の組み込まれた塩基のエネルギー効果が２倍であり、このことは、容易に融解するＡ＝Ｔペアを創出する＋Ａまたは＋Ｔの反応をモニタリングするのに極めて重要である。
したがって、このようなシステムでは、ｄｓＤＮＡの形成はＴｄＴの酵素活性を反映し、その形成をｄｓＤＮＡ特異的挿入色素（エチジウムブロマイド、ＧｅｌＲｅｄ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）の蛍光を測定することによってリアルタイムでモニタリングできる。ＴｄＴバリアントの比活性を、５００μＭ ３’ＯＮＨ２ ｄＮＴＰ、１０μＭ ｉＤＮＡおよび３０ｎＭ ＴｄＴの存在下でのＧｅｌＲｅｄ蛍光増加の初速度として決定した。
結果
ＯＰ２とは、キャピラリー電気泳動によって決定した、酵素的に作製したＤＮＡの純度を表す。Ｅ１２とは、固体支持体に付着させたＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣ ＤＮＡの先端に合成したＴＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧ ＤＮＡ配列を表す。Ｑ２１とは、固体支持体に付着させたＧＴＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＧＡＣＴＣＧ ＤＮＡの先端に合成したＣＧＣＡＣＧＣＴＡＣ ＤＮＡ配列を表す。Ｔｍは、純粋なＴｄＴバリアントの融解温度を表し、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素を使用してサーマルシフトアッセイから決定される。欠失率は、平均約５０塩基長である本発明者らの標準２４プライマーセットからの平均値である。
結果を下の表２に詳述する。
Figure 2024541312000003
配列番号３または配列番号４または配列番号５を有するＴｄＴバリアントの、それぞれ突然変異Ｔ２６４Ｒ＋Ｉ２９８Ｖ、またはＣ２３Ａ＋Ｔ２６４Ｒ＋Ｉ２９８Ｖ、またはＶ２６２Ａ＋Ｉ２９８Ｖを有するバリアントの、活性および合成性能を図３に表す。パネルＡのプロットは、ＴＡＧＣＴ＋Ａデュプレックステストにおける＋Ａ反応の酵素速度を示し、パネルＢのプロットは、ＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴ＋Ｇヘアピンによる＋Ｇ反応の酵素速度を指示する。
したがって、配列番号３、配列番号４および配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントによって、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＴｄＴバリアントの欠失率と比較してそれぞれ、工程当たり０．５５％から０．３６％、０．３２％および０．４０％まで、アラニンについて欠失率が減少した。同じＴｄＴバリアントによって、全体的な合成エラー率がそれぞれ工程当たり０．０４％、０．０６％および０．０６％だけ減少する。したがって、本発明による前記特定のＴｄＴバリアントはより良好な品質のＤＮＡ鎖を産生する。
実施例３ － 比較研究
本研究によって、配列番号２のＴｄＴを用いて得られたものと比較して、配列番号３、配列番号４または配列番号５のＴｄＴバリアントによって合成された配列の置換、挿入、欠失の平均値について調査する。
２４の配列を、各ＴｄＴバリアントについて二重で合成する。合成を、０．５Ｍカコジル酸バッファー ｐＨ７．４中で、２０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭ ＮａＣｌにての２０μＭ酵素、２ｍＭ ＣｏＣｌ２、５００μＭ ＯＮＨ２ヌクレオチド、７５０ｐｍｏｌ樹脂（１０μＭ ｉＤＮＡ）を用いて３７℃で行う。各合成は、対照として配列番号２のＴｄＴを含む。パーセンテージとは、参照配列と比較した完全なリードのパーセンテージを指す）。
各ＴｄＴバリアントによって合成された２４の配列を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．製のｉＳｅｑ １００ Ｓｙｓｔｅｍシーケンサーを使用して配列決定した。欠失、挿入、および置換のパーセンテージを、シーケンサーから得られた配列とターゲット配列を比較することによって算出する。
結果を図４に詳述する。
欠失の平均値に関して、配列番号２のＴｄＴと比較して、配列番号３、配列番号４および配列番号５のＴｄＴバリアントは、特に配列番号４および配列番号５のＴｄＴバリアントは、全てより良好である。挿入の平均値も配列番号２のＴｄＴよりも減少している。したがって、本発明によるＴｄＴバリアントは誤組み込みが少ないＤＮＡ鎖を産生し、結果として、技術的問題は本発明のＴｄＴによって十分に解決される。

Claims (14)

  1. 配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列であって、
    前記アミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる第１の群から選択される位置に、もしくは前記第１の群の各位置の機能的に等価な位置に置換アミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
    ここで、これらの位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている、
    配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列、
    または
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列であって、
    前記アミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる第２の群から選択される位置に、もしくは前記第２の群の各位置の機能的に等価な位置に置き換えアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含み、
    ここで、これらの位置は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を参照することによって付番されている、
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列
    を含む、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）バリアント。
  2. 置換アミノ酸または置き換えアミノ酸は、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、ＴおよびＧからなる群から選択される、請求項１に記載のＴｄＴバリアント。
  3. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換は２９８位にある、または前記少なくとも１つのアミノ酸置き換えは２７９位にある、請求項１または２に記載のＴｄＴバリアント。
  4. 配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む、または
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる群から選択される位置に少なくとも２つの置き換えを含む、
    請求項１から３のいずれか一項に記載のＴｄＴバリアント。
  5. 配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、２３位、２６２位、２６４位および２９８位からなる群から選択される位置に少なくとも３つの置換を含む、または
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、４位、２４３位、２４５位および２７９位からなる群から選択される位置に少なくとも３つの置き換えを含む、
    請求項１から４のいずれか一項に記載のＴｄＴバリアント。
  6. 配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｉ２９８Ｖ／Ｔ／Ｌから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、または
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｉ２７９Ｖ／Ｔ／Ｌから選択される少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む、
    請求項１から５のいずれか一項に記載のＴｄＴバリアント。
  7. 配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｔ２６４Ｒ／Ｋ／Ｑから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、または
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｔ２４５Ｒ／Ｋ／Ｑから選択される少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む、
    請求項１から６のいずれか一項に記載のＴｄＴバリアント。
  8. 配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｖ２６２Ａ／Ｔ／Ｇから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、または
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｖ２４３Ａ／Ｔ／Ｇから選択される少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む、
    請求項１から７のいずれか一項に記載のＴｄＴバリアント。
  9. 配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｃ２３Ａ／Ｔから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、または
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、Ｃ４Ａ／Ｔから選択される少なくとも１つのアミノ酸置き換えを含む、
    請求項１から８のいずれか一項に記載のＴｄＴバリアント。
  10. 配列番号２と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一である、または
    配列番号８と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一である、
    請求項１から９のいずれか一項に記載のＴｄＴバリアント。
  11. ａ．請求項１から１０のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＴｄＴバリアント、
    ｂ．少なくとも１種の３’－Ｏ－修飾されたヌクレオシドトリホスフェート、および
    ｃ．必要に応じて少なくとも１種のイニシエーター
    を含む、キット。
  12. キットは２種のＴｄＴバリアントを含む、請求項１１に記載のキット。
  13. 第１のＴｄＴバリアントは配列番号３と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、第２のバリアントは配列番号５と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、または
    第１のＴｄＴバリアントは配列番号９と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、第２のバリアントは配列番号１１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、
    請求項１２に記載のキット。
  14. ポリヌクレオチドを合成する方法であって、方法は：
    ａ．遊離３’－ヒドロキシルを有する３’末端ヌクレオチドを有する少なくとも１種のイニシエーターを用意する工程、
    ｂ．伸長条件下で、遊離３’－Ｏ－ヒドロキシルを有する少なくとも１種のイニシエーターを、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートおよび請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴｄＴバリアントと接触させ、その結果、前記少なくとも１種のイニシエーターは、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオシドトリホスフェートの組み込みによって伸長されて、３’－Ｏ－ブロックされた伸長断片を形成する工程、ならびに
    ｃ．伸長断片を脱ブロッキングして、遊離３’－ヒドロキシルを有する伸長断片を形成する工程、ならびに
    ｄ．伸長条件下で工程ｃ．で得られた前記少なくとも伸長された断片を接触させることによって、ポリヌクレオチドが形成されるまで、工程ｂ．および工程ｃ．を繰り返す工程、
    を含む、ポリヌクレオチドを合成する方法。
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