Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

JP2024079633A - Medical drug that consists of antisense nucleic acid - Google Patents

Medical drug that consists of antisense nucleic acid Download PDF

Info

Publication number
JP2024079633A
JP2024079633A JP2023201238A JP2023201238A JP2024079633A JP 2024079633 A JP2024079633 A JP 2024079633A JP 2023201238 A JP2023201238 A JP 2023201238A JP 2023201238 A JP2023201238 A JP 2023201238A JP 2024079633 A JP2024079633 A JP 2024079633A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
pharma
acceptable salt
base sequence
bond
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023201238A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
智秋 満
Tomoaki Man
成宏 浅野
Naruhiro Asano
恭介 日野
Kyosuke HINO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd filed Critical Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Publication of JP2024079633A publication Critical patent/JP2024079633A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

To provide a novel therapeutic agent to Werner syndrome.SOLUTION: A medical drug consists of an oligonucleotide that expresses a functional human WRN protein to a skipping mutation of 26th or 28th exon of a human WRN gene, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. A base length of the oligonucleotide is 10 to 30 mer, and a base sequence of the oligonucleotide is a base sequence having 90% or more and 100% or less of sequence identity based on a base sequence complementary to at least one target region constituted of the same base length as the oligonucleotide, in a specific base sequence, a base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases in the target region are deleted, substituted, inserted or added, or a base sequence that hybridizes an oligonucleotide having the target region in a stringent condition.SELECTED DRAWING: Figure 3

Description

本発明は、ウェルナー症候群の原因遺伝子のWRN遺伝子の第27番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴヌクレオチド(アンチセンス核酸)からなる医薬及び該オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。 The present invention relates to a pharmaceutical comprising an antisense oligonucleotide (antisense nucleic acid) that enables skipping of the 27th exon of the WRN gene, which is the causative gene for Werner syndrome, and a pharmaceutical composition containing the oligonucleotide.

ウェルナー症候群は、早期老化をきたす希少疾患であり、若年期に、一般的な老人に見られる特徴、例えば白髪化、禿、糖尿病、心疾患、ガン、皮膚の退縮、皮膚の強皮症様変化、若年性白内障、早老、性腺機能低下などを示すことが知られている。より具体的には、20~30歳代から皮膚の萎縮・硬化、白髪や禿頭等の毛髪の変化、白内障等の老化徴候が出現する。さらに、糖尿病、動脈硬化ならびに悪性腫瘍等を高率に合併し、多くは50歳代で死に至る。また、肘、膝、踵等に好発する難治性皮膚潰瘍の悪化により四肢切断に至り、生活の質が損なわれるケースも多い(非特許文献1)。 Werner syndrome is a rare disease that causes premature aging, and is known to show typical elderly characteristics in early life, such as graying of hair, baldness, diabetes, heart disease, cancer, skin atrophy, scleroderma-like changes in the skin, early cataracts, premature aging, and hypogonadism. More specifically, signs of aging such as atrophy and hardening of the skin, changes in hair such as gray hair and baldness, and cataracts appear from the age of 20 to 30. Furthermore, there is a high incidence of complications such as diabetes, arteriosclerosis, and malignant tumors, and many die in their 50s. In addition, in many cases, the worsening of intractable skin ulcers that commonly occur on the elbows, knees, heels, etc. leads to limb amputation, impairing the quality of life (Non-Patent Document 1).

ウェルナー症候群は常染色体劣性の遺伝性希少疾患であり、第8染色体短腕(8p12)上に存在するRecQ型DNA/RNAヘリカーゼ(WRNヘリカーゼ)をコードするWRN遺伝子が原因遺伝子として同定されている(非特許文献2,非特許文献3)。
WRNタンパク質は1432アミノ酸からなり、ATP依存性のDNA/RNAヘリカーゼ活性、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。生理機能としては、DNA複製、塩基除去修復、DNA二重鎖切断修復、転写、テロメアの維持と多様な機能を持ち、遺伝子修復と染色体の安定性の維持に働く。そのためウェルナー症候群では顕著なゲノムの不安定化が認められる。ウェルナー症候群患者由来線維芽細胞は、健常者由来の正常細胞と比べ分裂寿命が短く、増殖速度が顕著に低下する(非特許文献4)。線維芽細胞分裂能の低下は、ウェルナー症候群の皮膚潰瘍の創傷治癒の遅延の一つの要因と考えられる(非特許文献5)。
Werner syndrome is a rare autosomal recessive genetic disease, and the WRN gene encoding the RecQ-type DNA/RNA helicase (WRN helicase) located on the short arm of chromosome 8 (8p12) has been identified as the causative gene (Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3).
The WRN protein consists of 1,432 amino acids and has ATP-dependent DNA/RNA helicase activity and 3'→5' exonuclease activity. It has a variety of physiological functions, including DNA replication, base excision repair, DNA double-strand break repair, transcription, and telomere maintenance, and works to repair genes and maintain chromosome stability. Therefore, significant genomic instability is observed in Werner syndrome. Fibroblasts derived from Werner syndrome patients have a shorter division life span and a significantly reduced proliferation rate compared to normal cells derived from healthy individuals (Non-Patent Document 4). The reduced ability of fibroblasts to divide is thought to be one of the factors that delays wound healing in skin ulcers in Werner syndrome (Non-Patent Document 5).

WRNタンパク質のC末端付近には核移行シグナル(NLS:Neuclear Localization Signal)が存在し、核移行を誘導することで正常な生理機能を果たす(図1)。しかしながら、スプライシング、ナンセンス、フレームシフトなどの変異に基づく中途ストップコドン(終止コドン)の出現によって核移行シグナルが欠失した不完全なWRNタンパク質が作られた場合、本来核内で機能するべきWRNヘリカーゼが核内へ移行できないため、その機能を果たすことができなくなり、ウェルナー症候群が発症する(図1及び図2)(非特許文献3)。
ウェルナー症候群の日本人患者の約7割において、ヒトWRN遺伝子の26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>Cによりアミノ酸の読み枠にズレが生じ(Out-of-Frame)、第27番エクソン(以下、「エクソン27」と称することがある。)にストップコドン(終止コドン)が出現する。このためにヒトWRN遺伝子の第27番エクソン以降のC末端に存在する核移行シグナルを欠失しているWRNタンパク質が作られ、本来の機能を喪失する(図2)(非特許文献3)。
The WRN protein has a nuclear localization signal (NLS) near its C-terminus, which induces nuclear localization and enables it to perform its normal physiological functions (Figure 1). However, when an incomplete WRN protein is produced in which the nuclear localization signal is deleted due to the appearance of a premature stop codon caused by splicing, nonsense, frameshift, or other mutations, the WRN helicase, which should function in the nucleus, is unable to migrate into the nucleus and is therefore unable to perform its function, resulting in the development of Werner syndrome (Figures 1 and 2) (Non-Patent Document 3).
In approximately 70% of Japanese patients with Werner syndrome, a skip mutation c.3139-1G>C in exon 26 of the human WRN gene causes a shift in the amino acid reading frame (out-of-frame), resulting in the appearance of a stop codon in exon 27 (hereinafter sometimes referred to as "exon 27"). As a result, a WRN protein is produced that lacks the nuclear localization signal present at the C-terminus after exon 27 of the human WRN gene, causing it to lose its original function (Figure 2) (Non-Patent Document 3).

国際公開第2011/052436号International Publication No. 2011/052436 国際公開第2014/046212号International Publication No. 2014/046212 国際公開第2015/125783号International Publication No. 2015/125783 国際公開第1991/009033号International Publication No. WO 1991/009033 国際公開第2009/064471号International Publication No. 2009/064471

Geriatr Gerontol Int(2013)13:475-481Geriatr Gerontol Int (2013) 13:475-481 Nature(1992)355:735-738Nature (1992) 355: 735-738 Am. J. Hum. Genet.(1997)60:330-341Am. J. Hum. Genet. (1997) 60:330-341 Human Genetics(1981)58:310-316Human Genetics (1981) 58: 310-316 皮膚臨床(2000)40:1512-1513Skin Clinical (2000) 40: 1512-1513 Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.(2010)50:259-293Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (2010) 50: 259-293 J.Med.Chem.(2016)59:9645-9667J. Med. Chem. (2016) 59:9645-9667 J.Am.Chem.Soc(2016)138:15663-15672J. Am. Chem. Soc (2016) 138:15663-15672

ウェルナー症候群は、患者の生命と生活の質を脅かす難病であるが、現在のところウェルナー症候群に対する有効な治療法がなく、新たな治療薬の創製が切望されている。 Werner syndrome is an incurable disease that threatens the lives and quality of life of patients, but there is currently no effective treatment for Werner syndrome, and there is a strong need to develop new therapeutic drugs.

近年、新たな治療薬として核酸医薬品が実用化されている。核酸医薬品は、核酸あるいは修飾核酸が十数から数十塩基連結したオリゴ核酸で構成され、タンパク質翻訳に関わるメッセンジャーRNA又は非翻訳RNAなどに直接作用するものや、抗体医薬のように標的タンパク質に作用するものが知られており、化学合成により製造される医薬品である。核酸医薬品の一種であるスプライシング制御型アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシング因子のmRNA前駆体(以下、「pre-mRNA」と称することがある。)への結合を阻害することで、近傍に存在するエクソンのスプライシングをスイッチし(スプライスアウト)、フレームシフトを起こした異常RNAの読み枠を正常化することができる。この結果、ある遺伝子のエクソンをスプライスアウトさせることにより、機能発現に重要なN末端とC末端を保持した当該タンパク質を発現させる。このように、スプライシング制御型アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的となるエクソンをスキップすることでC末端までが翻訳された機能的なタンパク質を新たに発現させることが可能となり、これによりある疾患の病態を改善する可能性がある。これは、エクソンスキップ療法と呼ばれ、この治療で発現されるタンパク質は正常のものより短くはなるが、変異により欠損していた機能を回復することができる(非特許文献6)。 In recent years, nucleic acid drugs have been put to practical use as new therapeutic drugs. Nucleic acid drugs are composed of oligonucleic acids in which tens to tens of bases of nucleic acid or modified nucleic acid are linked together. Some are known to act directly on messenger RNA or non-translated RNA involved in protein translation, while others act on target proteins like antibody drugs, and are drugs manufactured by chemical synthesis. Splicing control antisense oligonucleotides, a type of nucleic acid drug, can switch the splicing of nearby exons (splice out) by inhibiting the binding of splicing factors to mRNA precursors (hereinafter sometimes referred to as "pre-mRNA"), and normalize the reading frame of abnormal RNA that has undergone frameshift. As a result, by splicing out the exons of a certain gene, the protein is expressed with the N-terminus and C-terminus that are important for functional expression. In this way, by skipping the targeted exon with splicing control antisense oligonucleotides, it is possible to newly express a functional protein that has been translated up to the C-terminus, which may improve the pathology of a certain disease. This is called exon skipping therapy, and although the protein expressed by this treatment is shorter than normal, it can restore the function lost due to the mutation (Non-Patent Document 6).

上記のように、ウェルナー症候群において最も高頻度の変異として報告されているのは、ヒトWRN遺伝子の第26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>Cである。上記スキップ変異c.3139-1G>Cにより第27番エクソン内に終止コドンが出現し、C末端に存在する核移行シグナルを含んだ終止コドン以降のアミノ酸配列を欠失したWRNタンパク質が作られ、本来の生理機能を喪失する。この状態を改善するため、本発明者らは、スプライシング制御型アンチセンスオリゴヌクレオチドに着目し、ヒトWRN遺伝子のエクソン27のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドの創生の検討を行った。 As mentioned above, the most frequent mutation reported in Werner syndrome is the skipping mutation c.3139-1G>C in exon 26 of the human WRN gene. The skipping mutation c.3139-1G>C causes a stop codon to appear in exon 27, resulting in the production of a WRN protein lacking the amino acid sequence following the stop codon, including the nuclear localization signal present at the C-terminus, and thus losing its original physiological function. To improve this condition, the present inventors focused on splicing-control antisense oligonucleotides and investigated the creation of antisense oligonucleotides that induce the skipping of exon 27 of the human WRN gene.

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、ヒトWRN遺伝子の第27番エクソンのスキッピングを可能にするオリゴヌクレオチドからなる医薬、及びこれを含むヒトWRN遺伝子の第27番エクソンを高効率にスキッピングさせる薬剤を提供することを目的とする。 The present invention has been made in consideration of the above circumstances, and the problem that the present invention aims to solve is to provide a pharmaceutical comprising an oligonucleotide that enables skipping of exon 27 of the human WRN gene, and a drug that contains the same and efficiently skips exon 27 of the human WRN gene.

本発明者らは、ヒトWRN遺伝子のmRNA前駆体のうちエクソン27及び周辺のヌクレオチドからなる配列をアンチセンスオリゴヌクレオチドでターゲッティングすることにより、高効率にエクソン27のスキッピングを誘導できることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。 The present inventors have found that by targeting a sequence consisting of exon 27 and surrounding nucleotides in the pre-mRNA of the human WRN gene with an antisense oligonucleotide, it is possible to induce skipping of exon 27 with high efficiency. Based on this finding, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.

[1]本発明に係るオリゴヌクレオチドからなる医薬は、ヒトWRN遺伝子の第26番又は第28番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトWRNタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び/又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、10~30merであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
[1] A pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide according to the present invention is a pharmaceutical composition comprising an oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, which expresses a functional human WRN protein in response to a skipping mutation in exon 26 or 28 of the human WRN gene,
The oligonucleotide has each nucleotide linked to a phosphate group and/or a modified phosphate group;
the oligonucleotide comprises a modified nucleic acid having at least one modified sugar;
The oligonucleotide has a base length of 10 to 30 mer,
The base sequence of the oligonucleotide is
A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the oligonucleotide in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6;
A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or
The pharmaceutical comprises an oligonucleotide having a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the above-mentioned target region, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof.

上記構成を備えるオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬は、ヒトWRN遺伝子の第27番エクソンのスキッピングを可能にする。 A pharmaceutical comprising an oligonucleotide having the above-mentioned configuration or a pharma- ceutical acceptable salt thereof enables skipping of exon 27 of the human WRN gene.

[2]上記[1]において、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、95%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
[2] In the above [1], the base sequence of the oligonucleotide is
It is preferable that the base sequence has a sequence identity of 95% or more and 100% or less based on a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the above-mentioned oligonucleotide in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6.

[3]上記[1]において、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列であることが好ましい。
[3] In the above [1], the base sequence of the oligonucleotide is
It is preferable that the base sequence is complementary to at least one target region in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6, and is composed of the same base length as the above oligonucleotide.

[4]上記[1]~[3]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、15~25merであることが好ましい。 [4] In any of [1] to [3] above, the base length of the oligonucleotide is preferably 15 to 25 mer.

[5]上記[1]~[4]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’位の水酸基の糖修飾であることが好ましい。 [5] In any of the above [1] to [4], it is preferable that the sugar constituting the oligonucleotide is D-ribofuranose, and the sugar modification is a sugar modification of the hydroxyl group at the 2' position of D-ribofuranose.

[6]上記[1]~[5]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式(A1)で表される基であることが好ましい。

Figure 2024079633000002

(式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Xはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Yは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Zは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素-酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数1~5のアルキル基であるか、又は上記アルキル基の一部の炭素原子とYとが一緒になって環を形成する。) [6] In any one of the above [1] to [5], it is preferable that the sugar modification constituting the oligonucleotide is a group represented by the following formula (A1):
Figure 2024079633000002

(In the formula, Bx is a nucleic acid base, each independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil; X is a phosphate bond, each independently a phosphodiester bond, phosphorothioate bond, phosphorodithioate bond, phosphoamidate bond, boranophosphate bond, or alkylphosphonate bond; Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted, or an amino group which may be substituted; Z is each independently a hydrogen atom, a carbon-oxygen double bond, or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which may have a cyclic structure, or a carbon atom of the alkyl group and Y together form a ring.)

[7]上記[1]~[6]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式(A2)又は式(A3)で表される基であることが好ましい。

Figure 2024079633000003

(式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Xはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Rは、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルキル基であり、Y’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、R及びRは、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルキル基、又は、R及びRが一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、nは、0又は1である。) [7] In any of the above [1] to [6], it is preferable that the sugar modification constituting the oligonucleotide is a group represented by the following formula (A2) or formula (A3).
Figure 2024079633000003

(In the formula, Bx is a nucleic acid base, each independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil; X is a phosphate bond, each independently a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoamidate bond, a boranophosphate bond, or an alkylphosphonate bond; R 4 is each independently a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; Y' is an oxygen atom or an optionally substituted nitrogen atom; R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or R 5 and R 6 together form a carbonyl group or a ring; and n is 0 or 1.)

[8]上記[7]において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が上記式(A2)で表される基であり、上記Rは、それぞれ、独立して、メチル基、メトキシエチル基、又はN-メチルプロパンアミド基であることが好ましい。 [8] In the above [7], it is preferable that the sugar modification constituting the above oligonucleotide is a group represented by the above formula (A2), and each of the above R4s is independently a methyl group, a methoxyethyl group, or an N-methylpropanamide group.

[9]上記[7]において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が上記式(A3)で表される基であり、上記Y’は、酸素原子、又は水素原子、メチル基、メトキシエチル基、若しくはN-メチルプロパンアミド基で置換されていてもよい窒素原子であり、上記R及びRは、それぞれ、独立して、水素原子、炭素数1~2のアルキル基、又は上記R及びRが一緒になってカルボニル基又は炭素数3~6の環を形成しており、nは、0又は1であることが好ましい。 [9] In the above [7], it is preferable that the sugar modification constituting the above oligonucleotide is a group represented by the above formula (A3), the above Y' is an oxygen atom, or a nitrogen atom which may be substituted with a hydrogen atom, a methyl group, a methoxyethyl group, or an N-methylpropanamide group, the above R5 and R6 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, or the above R5 and R6 together form a carbonyl group or a ring having 3 to 6 carbon atoms, and n is 0 or 1.

[10]上記[1]~[9]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合であることが好ましい。 [10] In any of [1] to [9] above, it is preferable that at least one internucleotide bond of the oligonucleotide is a phosphorothioate bond.

[11]上記[1]~[10]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合であることが好ましい。 [11] In any of [1] to [10] above, it is preferable that at least one internucleotide bond in the oligonucleotide is a phosphodiester bond.

[12]上記[1]~[9]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合であることが好ましい。 [12] In any of the above [1] to [9], it is preferable that the internucleotide bond of the oligonucleotide is a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.

[13]上記[1]~[4]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
上記オリゴヌクレオチドが下記の式(A4)で表されるモルフォリノ核酸で構成され、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を持つモルフォリノオリゴ核酸であることが好ましい。

Figure 2024079633000004

(式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、X’はリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。) [13] In any one of the above [1] to [4], the base sequence of the oligonucleotide is
It is preferable that the oligonucleotide is composed of a morpholino nucleic acid represented by the following formula (A4), and is a morpholino oligonucleic acid having a base sequence complementary to at least one target region composed of the same base length as the oligonucleotide in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6.
Figure 2024079633000004

(In the formula, Bx is a nucleic acid base, each of which is independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil, and X' is a phosphate bond, each of which is independently a phosphorodiamidate bond, a phosphorodiamidethioate bond, or a phosphorodiamidedithioate bond.)

[14]上記[1]~[13]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~40番、46番、51番、56番、若しくは62番~63番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108873番、108878番~108917番、108923番、108928番、108933番、若しくは108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であることが好ましい。
[14] In any one of the above [1] to [13], the base sequence of the oligonucleotide is
A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 15-25 mer consisting of bases located at positions 1 to 40, 46, 51, 56, or 62 to 63 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a continuous 15-25 mer consisting of bases located at positions 108873, 108878 to 108917, 108923, 108928, 108933, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or
It is preferable that the base sequence hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the above-mentioned target region.

[15]上記[1]~[14]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~32番、34番~40番、46番、51番、若しくは62番~63番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108878番~108909番、108911番~108917番、108923番、108928番、若しくは108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。 [15] In any of the above [1] to [14], the base sequence of the oligonucleotide is preferably a base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a 15-25mer contiguous bases located at positions 1 to 32, 34 to 40, 46, 51, or 62 to 63 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a 15-25mer contiguous bases located at positions 108878 to 108909, 108911 to 108917, 108923, 108928, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2.

[16]上記[1]~[15]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番、3番、5番~12番、14番~19番、21番、25番、29番、30番、31番、34番、46番、若しくは51番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108878番、108880番、108882番~108889番、108891番~108896番、108898番、108902番、108906番~108908番、108911番、108923番、若しくは108928番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。 [16] In any of [1] to [15] above, the base sequence of the oligonucleotide is a target region consisting of a continuous 15-25mer consisting of bases located at positions 1, 3, 5 to 12, 14 to 19, 21, 25, 29, 30, 31, 34, 46, or 51 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a continuous 15-25mer consisting of bases located at positions 1, 3, 5 to 12, 14 to 19, 21, 25, 29, 30, 31, 34, 46, or 51 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 ... It is preferable that the base sequence has a sequence identity of 90% or more and 100% or less based on a base sequence complementary to a target region composed of a continuous 15 to 25 mer from bases located at positions 878, 108880, 108882 to 108889, 108891 to 108896, 108898, 108902, 108906 to 108908, 108911, 108923, or 108928.

[17]上記[1]~[16]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号9~14、16~26、28~39、41~42、44~50、52、55~56、69、73、80~105、107~108、110、112、114、116、118~131、133、及び135の塩基配列からなる群より選ばれる1つの塩基配列であることが好ましい。 [17] In any of [1] to [16] above, the base sequence of the oligonucleotide is preferably one selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 9 to 14, 16 to 26, 28 to 39, 41 to 42, 44 to 50, 52, 55 to 56, 69, 73, 80 to 105, 107 to 108, 110, 112, 114, 116, 118 to 131, 133, and 135.

[18]上記[1]~[17]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドは、表2-1から表2-7に示す配列名6-20-A、8-20-A、8-20-B、8-20-C、9-20-A、10-20-A、12-20-A、14-20-A、16-20-A、17-20-A、18-20-A、19-20-A、15-25-A、10-17-A、10-20-B、12-20-B、14-20-B、15-20-B、16-20-B、19-20-B、31-20-B、34-20-B、6-20-B、7-20-B、8-20-D、及び9-20-Bからなる群より選ばれる1つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。 [18] In any of the above [1] to [17], the oligonucleotide is preferably one selected from the group consisting of sequence names 6-20-A, 8-20-A, 8-20-B, 8-20-C, 9-20-A, 10-20-A, 12-20-A, 14-20-A, 16-20-A, 17-20-A, 18-20-A, 19-20-A, 15-25-A, 10-17-A, 10-20-B, 12-20-B, 14-20-B, 15-20-B, 16-20-B, 19-20-B, 31-20-B, 34-20-B, 6-20-B, 7-20-B, 8-20-D, and 9-20-B shown in Tables 2-1 to 2-7.

[19]上記[1]~[18]のいずれかにおいて、上記オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。 [19] In any of [1] to [18] above, the oligonucleotide is preferably a single-stranded antisense oligonucleotide.

[20]本発明に係る二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドからなる医薬は、上記[19]に記載のオリゴヌクレオチドと、
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である、二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
[20] A medicine comprising a double-stranded antisense oligonucleotide according to the present invention, comprising the oligonucleotide according to [19] above and
and a second strand oligonucleotide hybridized to the single strand antisense oligonucleotide,
The base sequence of the second strand oligonucleotide has a sequence identity of 90% or more and 100% or less based on a base sequence complementary to the base sequence of the single strand antisense oligonucleotide, and is a medicine consisting of a double strand antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof.

[21]本発明に係るオリゴヌクレオチド複合体からなる医薬は、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬と、
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
上記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬である。
[21] A medicine comprising the oligonucleotide complex according to the present invention comprises a medicine comprising the oligonucleotide according to any one of [1] to [19] above or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a medicine comprising the double-stranded antisense oligonucleotide according to [20] above or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
and an additional substance bound directly or via a linker bond to the oligonucleotide or the second strand oligonucleotide,
the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, a peptide, an alkyl chain, a ligand compound, an antibody, a protein, and a sugar chain;
The above linker bonds are each independently a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoamidate bond, a boranophosphate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphorodiamidate bond, a phosphorodiamidethioate bond, or a phosphorodiamidedithioate bond, and the pharmaceutical comprises an oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof.

[22]本発明に係る医薬品は、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[21]に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、医薬品である。 [22] The pharmaceutical product according to the present invention is a pharmaceutical product comprising, as an active ingredient, a pharmaceutical product consisting of the oligonucleotide described in any one of [1] to [19] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical product consisting of the double-stranded antisense oligonucleotide described in [20] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical product consisting of the oligonucleotide complex described in [21] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.

[23]本発明に係るヒトWRN遺伝子の第27番目エクソンのスキッピング剤は、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[21]に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ヒトWRN遺伝子の第27番目エクソンのスキッピング剤である。 [23] The agent for skipping the 27th exon of the human WRN gene according to the present invention is an agent for skipping the 27th exon of the human WRN gene, which comprises, as an active ingredient, a pharmaceutical comprising the oligonucleotide described in any one of [1] to [19] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide described in [20] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex described in [21] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.

[24]本発明に係る機能的WRN回復剤は、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[21]に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンのスキッピングによる核移行シグナルを保有する機能的WRN回復剤である。 [24] The functional WRN restorer of the present invention is a functional WRN restorer that contains, as an active ingredient, a pharmaceutical comprising the oligonucleotide described in any one of [1] to [19] above or a pharmaceutical acceptable salt thereof, the double-stranded antisense oligonucleotide described in [20] above or a pharmaceutical acceptable salt thereof, or the oligonucleotide complex described in [21] above or a pharmaceutical acceptable salt thereof, and that possesses a nuclear localization signal resulting from skipping of the 27th exon of the human WRN gene.

[25]本発明に係るウェルナー症候群に対する治療剤は、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[21]に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ウェルナー症候群に対する治療剤である。 [25] The therapeutic agent for Werner's syndrome according to the present invention is a therapeutic agent for Werner's syndrome that contains, as an active ingredient, a pharmaceutical agent comprising the oligonucleotide described in any one of [1] to [19] above or a pharma- ceutical agent comprising a double-stranded antisense oligonucleotide described in [20] above or a pharma-ceutical agent comprising a pharma-ceutical agent comprising an oligonucleotide complex described in [21] above or a pharma-ceutical agent comprising ...

[26]本発明に係るウェルナー症候群に対する予防剤は、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[21]に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ウェルナー症候群に対する予防剤である。 [26] The preventive agent for Werner's syndrome according to the present invention is a preventive agent for Werner's syndrome that contains, as an active ingredient, a medicine consisting of the oligonucleotide described in any one of [1] to [19] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a medicine consisting of the double-stranded antisense oligonucleotide described in [20] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a medicine consisting of the oligonucleotide complex described in [21] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.

[27]本発明に係るウェルナー症候群の治療方法又は予防方法は、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[21]に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を個体に投与することを含む、ウェルナー症候群の治療方法又は予防方法である。 [27] The method for treating or preventing Werner syndrome according to the present invention is a method for treating or preventing Werner syndrome, which comprises administering to an individual a medicine comprising the oligonucleotide described in any one of [1] to [19] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a medicine comprising the double-stranded antisense oligonucleotide described in [20] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a medicine comprising the oligonucleotide complex described in [21] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.

[28]本発明は、ウェルナー症候群の治療又は予防に使用するための、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[21]に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。 [28] The present invention provides a medicine for use in treating or preventing Werner's syndrome, comprising the oligonucleotide according to any one of [1] to [19] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, the double-stranded antisense oligonucleotide according to [20] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or the oligonucleotide complex according to [21] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.

[29]本発明は、ウェルナー症候群の治療剤又は予防剤を製造するために使用する、上記[1]~[19]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記[20]に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記[21]に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。 [29] The present invention provides a medicine for use in producing a therapeutic or prophylactic agent for Werner's syndrome, comprising the oligonucleotide according to any one of [1] to [19] above or a pharma- ceutical agent comprising the double-stranded antisense oligonucleotide according to [20] above or a pharma-ceutical agent comprising the oligonucleotide complex according to [21] above or a pharma-ceutical agent comprising the oligonucleotide complex according to [21] above or a pharma-ceutical agent comprising the oligonucleotide complex.

本発明によれば、ヒトWRN遺伝子の第27番エクソンのスキッピングを可能にするオリゴヌクレオチドからなる医薬、及びこれを含むヒトWRN遺伝子の第27番エクソンを高効率にスキッピングさせる薬剤を提供することが可能になる。 According to the present invention, it is possible to provide a pharmaceutical comprising an oligonucleotide that enables skipping of exon 27 of the human WRN gene, and a drug that contains the same and efficiently skips exon 27 of the human WRN gene.

図1は、ヒトWRN遺伝子産物の構造を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the human WRN gene product. 図2は、26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>Cを持つウェルナー症候群の発症メカニズムを説明する模式図である。Figure 2 is a schematic diagram explaining the mechanism of onset of Werner syndrome with exon 26 skipping mutation c.3139-1G>C. 図3は、本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたエクソン27のスキッピングメカニズムを説明する模式図である。FIG. 3 is a schematic diagram illustrating the mechanism of exon 27 skipping using the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment. 図4は、WRNエクソン27のスキップを誘導するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソン27での相対的位置を示す模式図である。FIG. 4 is a schematic diagram showing the relative positions in exon 27 of antisense oligonucleotides designed to induce WRN exon 27 skipping. 図5は、HEK293TにおけるWRN遺伝子のエクソン27のスキッピング効率を示す電気泳動の写真である。FIG. 5 is an electrophoretic photograph showing the efficiency of exon 27 skipping of the WRN gene in HEK293T. 図6は、26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>Cを持つウェルナー症候群患者線維芽細胞におけるWRN遺伝子のエクソン27のスキッピング活性を示す電気泳動の写真である。FIG. 6 is a photograph of electrophoresis showing the exon 27 skipping activity of the WRN gene in fibroblasts from a Werner syndrome patient carrying the exon 26 skipping mutation c.3139-1G>C. 図7は、26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>Cを持つウェルナー症候群患者線維芽細胞におけるWRN遺伝子のエクソン27のスキッピング活性を示す蛍光顕微鏡の観察画像である。FIG. 7 is a fluorescence microscopic image showing the exon 27 skipping activity of the WRN gene in fibroblasts from a Werner syndrome patient carrying the exon 26 skipping mutation c.3139-1G>C.

以下、本発明の一実施形態(以下「本実施形態」と記すことがある。)について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本願明細書において「オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬」とは、「オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬」と同義である。「オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬」とは、「オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬」と同義である。同様に、「○○に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬」とは、「○○に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬」と同義である。「○○に記載のオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬」とは、「○○に記載のオリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩を含有する医薬」と同義である。同様に、「~からなる医薬」は、「~を含有する医薬」と書き換えることもできる。 One embodiment of the present invention (hereinafter, sometimes referred to as "the present embodiment") will be described below. However, the present embodiment is not limited thereto. In the present specification, "a medicine consisting of an oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof" is synonymous with "a medicine containing an oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof". "A medicine consisting of an oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof" is synonymous with "a medicine containing an oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof". Similarly, "a medicine consisting of an oligonucleotide according to XX or a pharma- ceutically acceptable salt thereof" is synonymous with "a medicine containing an oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof". "A medicine consisting of an oligonucleotide complex according to XX or a pharma- ceutically acceptable salt thereof" is synonymous with "a medicine containing an oligonucleotide complex according to XX ... Similarly, "a medicine consisting of" can be rewritten as "a medicine containing".

≪ヒトWRN遺伝子の第27番エクソンをスキッピングさせるオリゴヌクレオチド≫
本実施形態のオリゴヌクレオチドは、
ヒトWRN遺伝子の第26番又は第28番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトWRNタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び/又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、10~30merであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩、である。また、本実施形態は、上記オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。上記オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。本実施形態において、用語「修飾糖を有する修飾核酸」には、後述するモルフォリノ核酸が含まれるものとする。
<<Oligonucleotide that skips exon 27 of the human WRN gene>>
The oligonucleotide of this embodiment is
An oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that expresses a functional human WRN protein in response to a skipping mutation of exon 26 or 28 of the human WRN gene,
The oligonucleotide has each nucleotide linked to a phosphate group and/or a modified phosphate group;
the oligonucleotide comprises a modified nucleic acid having at least one modified sugar;
The oligonucleotide has a base length of 10 to 30 mer,
The base sequence of the oligonucleotide is
A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the oligonucleotide in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6;
A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or
The oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof is a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the target region. The present embodiment also provides a medicine comprising the oligonucleotide or a pharma-ceutically acceptable salt thereof. The oligonucleotide is preferably a single-stranded antisense oligonucleotide. In the present embodiment, the term "modified nucleic acid having a modified sugar" includes morpholino nucleic acid, which will be described later.

上記構成を備えるオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩は、ヒトWRN遺伝子の第27番エクソンのスキッピングを可能にする。本実施形態の一側面において、上記オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩は、「ヒトWRN遺伝子の第27番エクソンをスキッピングするオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩」と把握することもできる。本発明は、ヒトWRN遺伝子の第26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>Cにより生じたスプライシング異常に起因する、アミノ酸読み枠のずれたmRNA前駆体に対して、第27番エクソンのスキッピングを誘導して読み枠のずれを解消することで、難治性皮膚潰瘍をはじめとするウェルナー症候群の症状を改善することができる。また、第26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>C以外として、例えば、第26番エクソンのスキップ変異c.3233+1G>T、第26番エクソンのスキップ変異c.3233+1G>C、及び第28番エクソンのスキップ変異c.IVS28+2T>Cを持つウェルナー症候群患者の治療にも応用可能である。以下詳細に説明する。なお、本実施形態に係るオリゴヌクレオチドを便宜上「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」等で表現している場合があるが、これらに限定することを意図するものではない。 The oligonucleotide or pharma- ceutically acceptable salt thereof having the above-mentioned configuration enables skipping of exon 27 of the human WRN gene. In one aspect of this embodiment, the oligonucleotide or pharma- ceutically acceptable salt thereof can also be understood as "an oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof that skips exon 27 of the human WRN gene." The present invention can improve the symptoms of Werner's syndrome, including intractable skin ulcers, by inducing skipping of exon 27 in a pre-mRNA having a shifted amino acid reading frame caused by a splicing abnormality caused by a skip mutation c.3139-1G>C in exon 26 of the human WRN gene, thereby eliminating the shift in reading frame. In addition, the present invention can also be applied to the treatment of patients with Werner's syndrome who have, for example, a skipping mutation in exon 26, c.3233+1G>T, a skipping mutation in exon 26, c.3233+1G>C, and a skipping mutation in exon 28, c.IVS28+2T>C, in addition to the skipping mutation in exon 26, c.3139-1G>C. This will be described in detail below. For the sake of convenience, the oligonucleotide according to this embodiment may be expressed as an "antisense oligonucleotide", "single-stranded antisense oligonucleotide", etc., but this is not intended to be limiting.

<用語の定義等>
まず、本明細書において用いられる用語の定義等について以下に説明する。
<Definitions of terms>
First, the definitions of terms used in this specification will be explained below.

(WRN遺伝子)
本実施形態において「WRN遺伝子」は、Nature(1992)355:735-738(非特許文献2)、Am. J. Hum. Genet.(1997)60:330-341(非特許文献3)により定義することができる。
(WRN gene)
In this embodiment, the "WRN gene" can be defined according to Nature (1992) 355:735-738 (Non-Patent Document 2) and Am. J. Hum. Genet. (1997) 60:330-341 (Non-Patent Document 3).

(一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド)
本実施形態において「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(以下、「ASO」と称することがある。)とは、標的遺伝子のmRNA、mRNA前駆体、又はncRNA(ノンコ-ディングRNA)(以下、これら三者をまとめて「標的RNA」と称することがある。)に対して相補的なオリゴヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA及び/又はそれらの類似体から構成される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とするmRNA、mRNA前駆体、又はncRNAと二本鎖を形成することにより、標的とするmRNA、mRNA前駆体又はncRNAの働きを抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるmRNA、mRNA前駆体、又はncRNAの塩基配列に対して、完全に相補的な塩基配列を有するもの、当該相補的な塩基配列において1個又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有するもの、及びゆらぎ塩基対を形成する塩基をその塩基配列中に含むものが含まれる。
また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する「糖部が修飾糖である修飾核酸」(糖修飾されている修飾ヌクレオチド)以外の、当該分野で公知の修飾ヌクレオチドを更に含んでいてもよい。当該分野で公知の修飾ヌクレオチドとしては、糖修飾されている修飾ヌクレオチドに加えて、例えば、後述するリン酸基修飾されている修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾されている修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
なお、本実施形態におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その両末端の構造は特に制限されず、例えば、-OHであってもよいし、-OR(ただし、Rはアルキル鎖、リン酸エステル体、又は後述する付加物質を示す。)であってもよい。
また、本実施形態における一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であってもよいし、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態をとってもよい。上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドとからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを、「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と称することがある。
(single-stranded antisense oligonucleotide)
In this embodiment, the term "single-stranded antisense oligonucleotide" or "antisense oligonucleotide" (hereinafter, sometimes referred to as "ASO") means an oligonucleotide complementary to the mRNA, pre-mRNA, or ncRNA (non-coding RNA) of a target gene (hereinafter, these three may be collectively referred to as "target RNA"), or a pharmacologically acceptable salt thereof. Antisense oligonucleotides are composed of DNA, RNA, and/or analogs thereof. Antisense oligonucleotides form a double strand with the target mRNA, pre-mRNA, or ncRNA, thereby suppressing the action of the target mRNA, pre-mRNA, or ncRNA. Antisense oligonucleotides include those having a completely complementary base sequence to the base sequence of the target mRNA, pre-mRNA, or ncRNA, those having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted, or added in the complementary base sequence, and those containing bases that form wobble base pairs in their base sequence.
Furthermore, the antisense oligonucleotide of the present invention may further contain modified nucleotides known in the art other than the "modified nucleic acid whose sugar moiety is a modified sugar" (sugar-modified modified nucleotides) described below. In addition to sugar-modified modified nucleotides, examples of modified nucleotides known in the art include phosphate-modified modified nucleotides and nucleic acid base-modified modified nucleotides described below.
In addition, the structure of both ends of the antisense oligonucleotide in this embodiment is not particularly limited, and may be, for example, -OH or -OR (wherein R represents an alkyl chain, a phosphate ester, or an additional substance described later).
In addition, the single-stranded antisense oligonucleotide in this embodiment may be in the form of a single strand, or may hybridize with a second strand oligonucleotide described later to form a double strand. The double-stranded oligonucleotide consisting of the single-stranded antisense oligonucleotide and the second strand oligonucleotide hybridized to the single-stranded antisense oligonucleotide may be referred to as a "double-stranded antisense oligonucleotide".

(オリゴヌクレオチド)
本実施形態において「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合又はその他の結合で2~30個連結されたヌクレオチドのポリマーを意味する。上記オリゴヌクレオチドは、以下の構造式で示すように核酸塩基部、リン酸部、及び、糖部又はモルフォリノ環部から構成されていると把握することもできる。
(Oligonucleotides)
In this embodiment, the term "oligonucleotide" refers to a polymer of nucleotides in which 2 to 30 identical or different nucleotides are linked together by phosphodiester bonds or other bonds. The oligonucleotide can also be understood to be composed of a nucleic acid base portion, a phosphate portion, and a sugar portion or a morpholino ring portion, as shown in the following structural formula:

Figure 2024079633000005
Figure 2024079633000005

Figure 2024079633000006
Figure 2024079633000006

上記オリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドと非天然型のオリゴヌクレオチドとに大別される。「天然のオリゴヌクレオチド」とは天然に存在しているヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然のオリゴヌクレオチド」とは、後述する修飾ヌクレオチドを構成単位として少なくとも1つ含むオリゴヌクレオチドを意味する。「非天然型のオリゴヌクレオチド」としては、好ましくは、糖部が修飾された修飾糖誘導体;リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で1つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体;リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で2つ置き換えられたホスホロジチオエート誘導体;リン酸ジエステル結合がトリエステル化されたエステル誘導体;リン酸ジエステル結合がアミド化されたホスホアミド誘導体;リン酸ジエステル結合がボロン酸エステル化されたボラノホスフェート誘導体;リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート(例えば、メチルホスホネート、メトキシプロピルホスホネート等)誘導体;リン酸ジエステル結合がアミド結合に置換されたアミド誘導体:核酸塩基が修飾された修飾塩基誘導体が挙げられる。更に好ましくは、上記非天然のオリゴヌクレオチドは、糖部が修飾された架橋型修飾糖誘導体;リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で1つ置き換えられたホスホロチオエート誘導体;リン酸ジエステル結合がエステル化されたエステル誘導体;及び、糖部が後述する修飾糖(例えば、架橋型糖)で修飾され、かつリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で1つ置き換えられているか、又はリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子がアルキル基に置換されたアルキルホスホネート化されている誘導体等が挙げられる。 The oligonucleotides are broadly classified into natural oligonucleotides and non-natural oligonucleotides. "Natural oligonucleotides" refers to oligonucleotides made of naturally occurring nucleotides. "Non-natural oligonucleotides" refers to oligonucleotides containing at least one modified nucleotide as a constituent unit, as described below. "Non-natural oligonucleotides" preferably include modified sugar derivatives in which the sugar portion is modified; phosphorothioate derivatives in which one non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom; phosphorodithioate derivatives in which two non-bridging oxygen atoms of the phosphodiester bond are replaced with sulfur atoms; ester derivatives in which the phosphodiester bond is tri-esterified; phosphoamide derivatives in which the phosphodiester bond is amidated; boranophosphate derivatives in which the phosphodiester bond is boronated; alkylphosphonate (e.g., methylphosphonate, methoxypropylphosphonate, etc.) derivatives in which the non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with an alkyl group; amide derivatives in which the phosphodiester bond is replaced with an amide bond; and modified base derivatives in which the nucleic acid base is modified. More preferably, the above-mentioned non-natural oligonucleotide includes a cross-linked modified sugar derivative in which the sugar portion is modified; a phosphorothioate derivative in which one non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom; an ester derivative in which the phosphodiester bond is esterified; and an alkylphosphonate derivative in which the sugar portion is modified with a modified sugar (e.g., a cross-linked sugar) described below and one non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom or the non-bridging oxygen atom of the phosphodiester bond is replaced with an alkyl group.

(ヌクレオシド)
本実施形態において「ヌクレオシド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基と糖とが結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」という場合がある。特に糖部分が修飾された修飾ヌクレオシドを「修飾糖ヌクレオシド」という場合がある。
(Nucleoside)
In this embodiment, "nucleoside" refers to a compound in which a purine base or a pyrimidine base is bound to a sugar. A naturally occurring nucleoside may be referred to as a "natural nucleoside". A modified nucleoside that does not exist in nature may be referred to as a "modified nucleoside". A modified nucleoside in which the sugar moiety is modified may be referred to as a "modified sugar nucleoside".

(ヌクレオチド)
本実施形態において「ヌクレオチド」とは、上記ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。天然に存在しているヌクレオチドを「天然ヌクレオチド」という場合がある。天然に存在していない修飾されたヌクレオチドを「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」という場合がある。「修飾ヌクレオチド」又は「修飾核酸」としては、上記修飾ヌクレオシドの糖部にリン酸基が結合した化合物、及び、天然ヌクレオシドの糖部に後述する修飾リン酸基が結合した化合物等が挙げられる。
(nucleotide)
In this embodiment, "nucleotide" refers to a compound in which a phosphate group is bound to the sugar of the above-mentioned nucleoside. A naturally occurring nucleotide may be referred to as a "natural nucleotide". A modified nucleotide that does not exist in nature may be referred to as a "modified nucleotide" or "modified nucleic acid". Examples of the "modified nucleotide" or "modified nucleic acid" include a compound in which a phosphate group is bound to the sugar moiety of the above-mentioned modified nucleoside, and a compound in which a modified phosphate group described below is bound to the sugar moiety of a natural nucleoside.

(糖修飾、修飾糖)
本実施形態において「糖修飾」とは、上記ヌクレオチドの糖部が修飾されていることを意味する。修飾された糖部を特に「修飾糖」という場合がある。糖修飾が施されている修飾ヌクレオチドは修飾核酸として利用可能であり、例えば、2’-O-アルキル化核酸、2’-F化核酸、5’-メチル化核酸、2’,4’-BNA(Bridged Nucleic Acid、以下「LNA」と称することがある。)、AmNA(アミド架橋型人工核酸、Amido-bridged nucleic acid)、GuNA(グアニジン架橋型人工核酸、Guanidino-bridged nucleic acid)、scpBNA(2’-O,4’-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid)、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-Bridged Nucleic Acid)、S-cEt(2’,4’-constrained Ethyl Nucleic Acid)等が挙げられる。
2’-O-アルキル化核酸としては、例えば、後述する記号「A(M)」、「A(m)」、「C(M)」、「5(m)」、「G(M)」、「G(m)」、「U(M)」、「T(m)」で示される構造を含むものが挙げられる。LNAとしては、例えば、後述する記号「A(L)」、「5(L)」、「G(L)」、「T(L)」で示される構造を含むものが挙げられる。AmNAとしては、例えば、後述する記号「A(Y)」、「5(Y)」、「G(Y)」、「T(Y)」で示される構造を含むものが挙げられる。GuNAとしては、例えば、後述する記号「A(Gx)」、「5(Gx)」、「G(Gx)」、「T(Gx)」で示される構造を含むものが挙げられる。scpBNAとしては、例えば、後述する記号「A(S)」、「5(S)」、「G(S)」、「T(S)」で示される構造を含むものが挙げられる。
(Sugar modification, modified sugar)
In this embodiment, "sugar modification" means that the sugar moiety of the nucleotide is modified. The modified sugar moiety may be specifically referred to as a "modified sugar". Modified nucleotides that have been sugar-modified can be used as modified nucleic acids, and examples of such modified nucleic acids include 2'-O-alkylated nucleic acids, 2'-fluorinated nucleic acids, 5'-methylated nucleic acids, 2',4'-BNA (bridged nucleic acid, hereinafter sometimes referred to as "LNA"), AmNA (amide-bridged artificial nucleic acid), GuNA (guanidine-bridged artificial nucleic acid), scpBNA (2'-O,4'-C-spirocyclopropylene bridged nucleic acid), ENA (2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid), and 2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid. Examples of such nucleic acids include S-cEt (2',4'-constrained Ethyl Nucleic Acid) and S-cEt (2',4'-constrained Ethyl Nucleic Acid).
Examples of 2'-O-alkylated nucleic acids include those containing structures represented by the symbols "A(M)", "A(m)", "C(M)", "5(m)", "G(M)", "G(m)", "U(M)", and "T(m)" as described below. Examples of LNA include those containing structures represented by the symbols "A(L)", "5(L)", "G(L)", and "T(L)" as described below. Examples of AmNA include those containing structures represented by the symbols "A(Y)", "5(Y)", "G(Y)", and "T(Y)" as described below. Examples of GuNA include those containing structures represented by the symbols "A(Gx)", "5(Gx)", "G(Gx)", and "T(Gx)" as described below. Examples of scpBNA include those containing structures represented by the symbols "A(S)", "5(S)", "G(S)", and "T(S)" as described below.

本実施形態の一側面において上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式(A1)で表される基であることが好ましい。本実施形態の他の側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する修飾糖が下記の式(A1)で表される、と把握することもできる。 In one aspect of this embodiment, the modification of the sugar constituting the oligonucleotide is preferably a group represented by the following formula (A1). In another aspect of this embodiment, it can also be understood that the modified sugar constituting the oligonucleotide is represented by the following formula (A1).

Figure 2024079633000007
Figure 2024079633000007

上記式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Xはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Yは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Zは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素-酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数1~5のアルキル基であるか、又は、上記アルキル基の一部の炭素原子とYとが一緒になって環を形成する。ここで、「炭素数1~5のアルキル基」は、炭素数1~5のアルキレン基の一部の炭素原子と水素原子とが一緒になって形成される一価の基と把握することもできる。 In the above formula, Bx is a nucleic acid base, each independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil; X is a phosphate bond, each independently a phosphodiester bond, phosphorothioate bond, phosphorodithioate bond, phosphoamidate bond, boranophosphate bond, or alkylphosphonate bond; Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted, or an amino group which may be substituted; Z is each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which may have a carbon-oxygen double bond or a cyclic structure, or a ring formed by a part of the carbon atom of the alkyl group and Y together. Here, the "alkyl group having 1 to 5 carbon atoms" can also be understood as a monovalent group formed by a part of the carbon atom of an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms together with a hydrogen atom.

「置換されていてもよい炭素数1~6のアルコキシ基」としては、例えば、置換されていない炭素数1~6のアルコキシ基、並びに、水酸基、フッ素原子、炭素数1~6の直鎖状又は分枝状アルコキシ基、炭素数3~8の環状アルコキシ基、カルバモイル基、及び炭素数1~8のアルキルアミド基(-(CO)-NRで表される基)からなる群より選ばれる置換基で置換されている炭素数1~6のアルコキシ基が挙げられる。ここで、R及びRは、それぞれ、独立して、水素原子、又は炭素数1~8の直鎖状若しくは分枝状アルキル基を示す。 Examples of "optionally substituted alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms" include unsubstituted alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, and alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms substituted with a substituent selected from the group consisting of a hydroxyl group, a fluorine atom, a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a cyclic alkoxy group having 3 to 8 carbon atoms, a carbamoyl group, and an alkylamide group having 1 to 8 carbon atoms (a group represented by -(CO)-NR 7 R 8 ). Here, R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.

「置換されていてもよいアミノ基」としては、例えば、置換されていないアミノ基、並びに、炭素数1~6の直鎖状又は分枝状アルキル基(当該アルキル基は、炭素数1~6の直鎖若しくは分枝状アルコキシ基、又は-(CO)-NR10で表される基で置換されていてもよい)、炭素数3~8の環状アルキル基、炭素数1~6のアシル基、及び炭素数1~6の直鎖状又は分枝状アルキル基で1~3箇所置換されているアミジン基からなる群より選ばれる置換基で置換されているアミノ基が挙げられる。ここで、R及びR10は、それぞれ、独立して、水素原子、又は炭素数1~6の直鎖状若しくは分枝状アルキル基を示す。 Examples of the "optionally substituted amino group" include an unsubstituted amino group, and an amino group substituted with a substituent selected from the group consisting of a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (the alkyl group may be substituted with a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a group represented by -(CO) -NR9R10 ), a cyclic alkyl group having 3 to 8 carbon atoms, an acyl group having 1 to 6 carbon atoms, and an amidine group substituted at 1 to 3 positions with a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Here, R9 and R10 each independently represent a hydrogen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.

「炭素-酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数1~5のアルキル基」としては、例えば、置換されていない炭素数1~5のアルキル基、炭素-酸素二重結合を有している炭素数1~5のアルキル基、及び炭素数3~5のシクロアルキル基(シクロプロピル基等)が挙げられる。ここで、「炭素-酸素二重結合を有している炭素数1~5のアルキル基」における炭素数は、炭素-酸素二重結合を構成している炭素が含まれていてもよい。そのため、本実施形態において「炭素-酸素二重結合を有している炭素数1~5のアルキル基」には、アルデヒド基が含まれうる。Zがアルデヒド基であり、Yが置換されていてもよいアミノ基である場合、YとZとで一緒に形成される環は、アミド結合を含む構造であってもよい。 Examples of "an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, which may have a carbon-oxygen double bond or a cyclic structure" include an unsubstituted alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, which has a carbon-oxygen double bond, and a cycloalkyl group having 3 to 5 carbon atoms (such as a cyclopropyl group). Here, the number of carbon atoms in the "alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, which has a carbon-oxygen double bond" may include the carbon that constitutes the carbon-oxygen double bond. Therefore, in this embodiment, the "alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, which has a carbon-oxygen double bond" may include an aldehyde group. When Z is an aldehyde group and Y is an amino group which may be substituted, the ring formed by Y and Z together may have a structure including an amide bond.

本実施形態の一側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式(A2)又は式(A3)で表される基であることが好ましい。本実施形態の他の側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する修飾糖が下記の式(A2)又は式(A3)で表される、と把握することもできる。 In one aspect of this embodiment, the modification of the sugar constituting the oligonucleotide is preferably a group represented by the following formula (A2) or formula (A3). In another aspect of this embodiment, it can also be understood that the modified sugar constituting the oligonucleotide is represented by the following formula (A2) or formula (A3).

Figure 2024079633000008
Figure 2024079633000008

式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Xはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Rは、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルキル基であり、Y’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、R及びRは、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルキル基、又は、R及びRが一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、nは、0又は1である。 In the formula, Bx is a nucleic acid base, each of which is independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil; X is a phosphate bond, each of which is independently a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoamidate bond, a boranophosphate bond, or an alkylphosphonate bond; R4 is each independently a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; Y' is an oxygen atom or an optionally substituted nitrogen atom; R5 and R6 are each independently a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or R5 and R6 together form a carbonyl group or a ring; and n is 0 or 1.

本実施形態の他の側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が上記式(A2)で表される基であり、上記Rは、それぞれ、独立して、メチル基、メトキシエチル基、又はN-メチルプロパンアミド基(-CHCH-CONH-CH、メチルイミノカルボニルエチル基)であることが好ましい。 In another aspect of this embodiment, it is preferred that the sugar modification constituting the oligonucleotide is a group represented by formula (A2) above, and each of the R 4s is independently a methyl group, a methoxyethyl group, or an N-methylpropanamide group (-CH 2 CH 2 -CONH-CH 3 , a methyliminocarbonylethyl group).

本実施形態の他の側面において、上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が上記式(A3)で表される基であり、上記Y’は、酸素原子、又は水素原子、メチル基、メトキシエチル基、若しくはN-メチルプロパンアミド基で置換されていてもよい窒素原子であり、上記R及びRは、それぞれ、独立して、水素原子、炭素数1~2のアルキル基、又は上記R及びRが一緒になってカルボニル基又は炭素数3~6の環を形成しており、nは、0又は1であることが好ましい。 In another aspect of this embodiment, it is preferable that the sugar modification constituting the oligonucleotide is a group represented by formula (A3), Y' is an oxygen atom, or a nitrogen atom which may be substituted with a hydrogen atom, a methyl group, a methoxyethyl group, or an N-methylpropanamide group, R5 and R6 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, or R5 and R6 together form a carbonyl group or a ring having 3 to 6 carbon atoms, and n is 0 or 1.

(糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾)
上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するための修飾核酸として利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、後述するリン酸基修飾、核酸塩基修飾が知られている。このようなヌクレオチドの修飾は、例えば、J.Med.Chem.(2016)59:9645-9667.(非特許文献5)等に記載されているヌクレオチドの修飾が挙げられる。これらのヌクレオチドの修飾は、上記文献で引用されている文献において述べられている当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
(Nucleotide modifications known in the art other than sugar modifications)
Nucleotide modifications known in the art other than the sugar modifications can be used as modified nucleic acids for producing the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention. As nucleotide modifications, phosphate group modifications and nucleic acid base modifications described below are known. Examples of such nucleotide modifications include nucleotide modifications described in J. Med. Chem. (2016) 59:9645-9667. (Non-Patent Document 5) and the like. These nucleotide modifications can be carried out based on methods known in the art described in the documents cited in the above documents.

(リン酸基)
本実施形態において「リン酸基」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部の結合様式が天然に存在するホスホジエステル結合(後述する記号「-」で示される結合)であるものを意味する。
(phosphate group)
In this embodiment, the term "phosphate group" refers to a nucleotide in which the bond at the phosphate moiety is a naturally occurring phosphodiester bond (a bond indicated by the symbol "-" as described below).

(リン酸基修飾、修飾リン酸基)
本実施形態において「リン酸基修飾」とは、上記ヌクレオチドのリン酸部が修飾されていることを意味する。修飾されたリン酸部を特に「修飾リン酸基」という場合がある。上記修飾リン酸基を含む結合様式としては、例えば、ホスホロチオアート結合(後述する記号「∧」で示される結合)、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、又はボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合(後述する記号「*」で示される結合)、ホスホロジアミドチオアート結合、及びホスホロジアミドジチオアート結合等が挙げられる。
(Phosphate group modification, modified phosphate group)
In this embodiment, "phosphate group modification" means that the phosphate moiety of the nucleotide is modified. The modified phosphate moiety may be specifically referred to as a "modified phosphate group." Examples of the bond containing the modified phosphate group include phosphorothioate bond (bond indicated by the symbol "∧" described below), phosphorodithioate bond, phosphoramidate bond, or boranophosphate bond, alkylphosphonate bond, phosphorodiamidate bond (bond indicated by the symbol "*" described below), phosphorodiamidethioate bond, and phosphorodiamidedithioate bond.

(核酸塩基修飾、修飾核酸塩基)
本実施形態において「核酸塩基修飾」とは、上記ヌクレオチドの核酸塩基部が修飾されていることを意味する。修飾された核酸塩基部を特に「修飾核酸塩基」という場合がある。修飾核酸塩基としては、例えば、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-プロピニルシトシン等が挙げられる。
(Nucleobase modification, modified nucleobase)
In this embodiment, "nucleobase modification" means that the nucleobase portion of the nucleotide is modified. The modified nucleobase portion may be specifically referred to as a "modified nucleobase." Examples of modified nucleobases include 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine, and 5-propynylcytosine.

(DNA又はRNAの類似体)
上記DNA又はRNAの類似体とは、DNA又はRNAに類似の構造を持つ分子を意味する。例えば、ペプチド核酸(pNA)、モルフォリノ核酸等が挙げられる。
なお、本発明で用いる核酸は、核酸糖部の修飾に限られず、モルフォリノ核酸やペプチド核酸を用いてもよい。
すなわち、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、下記<一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列>の欄に記載される配列において、オリゴヌクレオチドは、DNA又はRNAの類似体で構成されてもよい。このDNA又はRNAの類似体は、ペプチド核酸やモルフォリノ核酸を少なくとも含む。ペプチド核酸やモルフォリノ核酸を含む本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成は一般的な定法に従って行う。モルフォリノオリゴ核酸は、例えば、国際公開第1991/009033号(特許文献4)、国際公開第2009/064471号(特許文献5)、J.Am.Chem.Soc(2016)138:15663-15672(非特許文献8)に従って製造することができる。モルフォリノ核酸としては、例えば、後述する記号「A(N)」、「C(N)」、「G(N)」、「T(N)」で示される構造を含むものが挙げられる。
(DNA or RNA analogues)
The above-mentioned DNA or RNA analogue means a molecule having a structure similar to that of DNA or RNA, such as peptide nucleic acid (pNA) and morpholino nucleic acid.
The nucleic acid used in the present invention is not limited to modifications at the sugar portion of the nucleic acid, and morpholino nucleic acid or peptide nucleic acid may also be used.
That is, in another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, in the sequence described in the column below under <Base sequence of single-stranded antisense oligonucleotide>, the oligonucleotide may be composed of a DNA or RNA analog. This DNA or RNA analog includes at least a peptide nucleic acid or a morpholino nucleic acid. The synthesis of the antisense oligonucleotide of the present invention containing a peptide nucleic acid or a morpholino nucleic acid is performed according to a general standard method. Morpholino oligonucleotides can be produced, for example, according to International Publication No. 1991/009033 (Patent Document 4), International Publication No. 2009/064471 (Patent Document 5), and J. Am. Chem. Soc (2016) 138: 15663-15672 (Non-Patent Document 8). Examples of morpholino nucleic acids include those containing structures represented by the symbols "A(N)", "C(N)", "G(N)", and "T(N)" described below.

本実施形態の一側面において、上記オリゴヌクレオチドは、下記の式(A4)で表されるモルフォリノ核酸で構成されるモルフォリノオリゴ核酸であることが好ましい。 In one aspect of this embodiment, the oligonucleotide is preferably a morpholino oligonucleotide composed of a morpholino nucleic acid represented by the following formula (A4):

Figure 2024079633000009
Figure 2024079633000009

式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、X’はリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。 In the formula, Bx is a nucleic acid base, each independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil, and X' is a phosphate bond, each independently a phosphorodiamidate bond, phosphorodiamidioate bond, or phosphorodiamidiodithioate bond.

(ncRNA)
本実施形態において「ncRNA」とは、タンパク質の翻訳には関わらないRNAの総称を意味する。上記ncRNAとしては、例えば、リボソ-ムRNA、転移RNA、miRNA、Natural Antisense Transcript(NAT)等が挙げられる。
(ncRNA)
In this embodiment, "ncRNA" refers to a general term for RNA that is not involved in protein translation. Examples of the ncRNA include ribosomal RNA, transfer RNA, miRNA, and Natural Antisense Transcript (NAT).

(オリゴヌクレオチドの核酸塩基部)
上記オリゴヌクレオチドの核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、5-メチルシトシニル基、ウラシリル基、2-オキソ-4-ヒドロキシ-5-メチル-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-アミノ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、4-アミノ-5-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、及び2-オキソ-4-ヒドロキシ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基等が挙げられる。好ましくは、上記核酸塩基部としては、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、5-メチルシトシニル基、及びウラシリル基等が挙げられる。当該核酸塩基のうち、ウラシル(U)とチミン(T)は、互換性がある。ウラシル(U)とチミン(T)のどちらも、相補鎖のアデニン(A)との塩基対を形成することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基部においても同様である。
(Nucleobase portion of oligonucleotide)
Examples of the nucleic acid base moiety of the oligonucleotide include thyminyl group, cytosinyl group, adeninyl group, guaninyl group, 5-methylcytosinyl group, uracilyl group, 2-oxo-4-hydroxy-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, 4-amino-5-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, and 2-oxo-4-hydroxy-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group. Preferably, examples of the nucleic acid base moiety include thyminyl group, cytosinyl group, adeninyl group, guaninyl group, 5-methylcytosinyl group, and uracilyl group. Among the nucleic acid bases, uracil (U) and thymine (T) are interchangeable. Both uracil (U) and thymine (T) can form base pairs with adenine (A) in a complementary strand, as well as in the nucleobase portion of an antisense oligonucleotide.

(標的RNA)
本実施形態において「標的RNA」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが結合するRNAを指す。言い換えると、本実施形態において標的RNAとは、WRN遺伝子のmRNA前駆体を意味する。上記標的RNAとしては、例えば、配列番号2に記載の塩基配列を有するヒトWRN遺伝子のmRNA前駆体、配列番号3~5のいずれかに記載の塩基配列を有するヒトWRN遺伝子のエクソン26スキップ変異を有するmRNA前駆体、配列番号6に記載の塩基配列を有するヒトWRN遺伝子のエクソン28スキップ変異を有するmRNA前駆体が挙げられる。
(Target RNA)
In this embodiment, the "target RNA" refers to the RNA to which the single-stranded antisense oligonucleotide binds. In other words, in this embodiment, the target RNA refers to a pre-mRNA of the WRN gene. Examples of the target RNA include a pre-mRNA of the human WRN gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, a pre-mRNA of the human WRN gene having a base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 3 to 5 and having an exon 26 skipping mutation, and a pre-mRNA of the human WRN gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and having an exon 28 skipping mutation.

(標的RNAとの結合)
本実施形態において「標的RNAとの結合」とは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基が、標的RNAとの相補性によって、当該標的RNAの核酸塩基と共に二本鎖核酸を形成することを意味する。上記二本鎖核酸は、上記標的RNAの少なくとも一部において形成されていればよい。なお、上記標的RNAとの結合の強さは、例えば、熱安定性の指標により測定することができる。上記熱安定性の指標としては、例えば、上記二本鎖核酸の融解温度(Tm値)等が挙げられる。上記Tm値としては、好ましくは40~90℃であり、より好ましくは50~70℃である。
(Binding to target RNA)
In this embodiment, "binding to the target RNA" means that the nucleic acid base of the single-stranded antisense oligonucleotide forms a double-stranded nucleic acid together with the nucleic acid base of the target RNA due to complementarity with the target RNA. The double-stranded nucleic acid may be formed in at least a part of the target RNA. The strength of the binding to the target RNA can be measured, for example, by an index of thermal stability. An example of the index of thermal stability is the melting temperature (Tm value) of the double-stranded nucleic acid. The Tm value is preferably 40 to 90°C, more preferably 50 to 70°C.

(標的領域)
上記標的領域とは、WRN遺伝子のmRNA前駆体における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと結合する領域を意味する。上記標的領域には、示された塩基配列からなる標的領域、及びWRNのmRNA前駆体上の領域を含む。
(Target Area)
The target region refers to a region in the pre-mRNA of the WRN gene that is bound to the single-stranded antisense oligonucleotide, including the target region consisting of the indicated base sequence and a region on the pre-mRNA of WRN.

(mRNA前駆体)
上記mRNA前駆体とは、DNAから転写されたRNAの一次転写物を意味する。すなわち、上記mRNA前駆体は、エクソン領域、イントロン領域及び非翻訳領域(Untranslated region:UTR)を含むRNAである。上記mRNA前駆体は、転写後スプライシングが行われる前のRNAと把握することもできる。上記mRNA前駆体がスプライシングされるとmRNAとなる。
(Pre-mRNA)
The pre-mRNA refers to a primary transcript of RNA transcribed from DNA. That is, the pre-mRNA is an RNA including an exon region, an intron region, and an untranslated region (UTR). The pre-mRNA can also be understood as an RNA before splicing after transcription. When the pre-mRNA is spliced, it becomes an mRNA.

(標的領域との結合)
上記標的領域との結合とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的領域と二本鎖を形成することを意味する。ただし、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、必ずしも標的領域全体と二本鎖を形成する必要はなく、標的領域の一部の領域と二本鎖形成するものであればよい。すなわち、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的領域と完全な相補性を有しているものであることが好ましいが、WRNの標的領域と結合する限りにおいて、標的領域の少なくとも一部の領域と相補的であればよい。
(Binding to target region)
The binding with the above-mentioned target region means that the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention forms a double strand with the target region.However, the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention does not necessarily need to form a double strand with the whole target region, but can form a double strand with a part of the target region.That is, the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is preferably one that has complete complementarity with the target region, but can be complementary to at least a part of the target region as long as it binds to the target region of WRN.

(標的領域の一部)
上記標的領域の一部とは、標的領域のうち10~15ヌクレオチド塩基長の領域を意味する。
(Part of the target area)
The part of the target region means a region of the target region having a length of 10 to 15 nucleotide bases.

(標的領域の少なくとも一部と相補的)
上記標的領域の少なくとも一部と相補的とは、標的RNA上の標的領域の少なくとも一部の領域の塩基と相補的であることを意味する。ここにおいて、少なくとも一部の領域に対応するmRNA前駆体上の領域の塩基と相補的であることも含む。
(Complementary to at least a portion of the target region)
"Complementary to at least a portion of the target region" means complementary to the bases of at least a portion of the target region on the target RNA, including complementary to the bases of a region on a pre-mRNA corresponding to at least a portion of the region.

本発明者らは、スプライシング制御型アンチセンスオリゴヌクレオチドに着目し、ヒトWRN遺伝子のエクソン27のスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドの創生の検討を行った。 The present inventors focused on splicing-control antisense oligonucleotides and investigated the creation of antisense oligonucleotides that induce skipping of exon 27 of the human WRN gene.

<一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計>
フレームシフト等による異常RNAに対し、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは異常となった読み枠を元に戻すことを可能とし、かつ標的領域であるエクソンをスキッピングさせるための化合物である。そのため、アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造としては、標的RNAの標的領域に結合できるよう設計されており、加えて、RNaseH等のヌクレアーゼに認識されないよう糖部修飾核酸が配置されている。
<Design of single-stranded antisense oligonucleotide>
For abnormal RNA caused by frameshift, etc., single-stranded antisense oligonucleotides are compounds that can restore the abnormal reading frame and skip the target region, that is, exon. Therefore, the structure of the antisense oligonucleotide is designed so that it can bind to the target region of the target RNA, and in addition, sugar-modified nucleic acids are arranged so that it cannot be recognized by nucleases such as RNase H.

<一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列>
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
(A)配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~40番、46番、51番、56番、若しくは62番~63番に位置する塩基から連続した10~30mer(好ましくは15~25mer)で構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108873番、108878番~108917番、108923番、108928番、108933番、若しくは108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
(B)上記標的領域において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
(C)上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、であることが好ましい。また、本実施形態において、配列表に示されている各塩基配列は核酸塩基部の配列情報のみを示すために用いるものとする。上記核酸塩基部に加えて糖部及びリン酸部を含めたオリゴヌクレオチドの構造情報は、後述する表2-1~表2-8に示される記載形式で示すものとする。
<Single-stranded antisense oligonucleotide sequence>
The base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment is:
(A) a base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 10-30 mer (preferably a 15-25 mer) consisting of bases located at positions 1 to 40, 46, 51, 56, or 62-63 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a continuous 15-25 mer consisting of bases located at positions 108873, 108878 to 108917, 108923, 108928, 108933, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
(B) a base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or
(C) A base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the target region is preferable. In this embodiment, each base sequence shown in the sequence listing is used to indicate only the sequence information of the nucleic acid base portion. The structural information of the oligonucleotide including the sugar portion and the phosphate portion in addition to the nucleic acid base portion is shown in the description format shown in Tables 2-1 to 2-8 below.

本実施形態において「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つの塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメント(好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方又は両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。)における、オーバーラップする全塩基配列に対する同一塩基の割合(%)を意味する。塩基配列の「配列同一性」は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用いることができる。 In this embodiment, "sequence identity" refers to the percentage of identical bases in the total overlapping base sequence in the optimal alignment when two base sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm can take into account the introduction of gaps into one or both of the sequences for optimal alignment). The "sequence identity" of base sequences can be easily confirmed by those skilled in the art. For example, NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) can be used.

本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列における上述の所定の標的領域に対して相補的な塩基配列と95%以上100%以下の配列同一性を有することが好ましく、98%以上100%以下の配列同一性を有することがより好ましく、100%の配列同一性を有することが更に好ましい。 The base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment preferably has a sequence identity of 95% to 100% with the base sequence complementary to the above-mentioned predetermined target region in the base sequence set forth in SEQ ID NO:1, more preferably has a sequence identity of 98% to 100%, and even more preferably has a sequence identity of 100%.

本実施形態において、「1又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列」としては、例えば、欠失、置換、挿入又は付加によって、欠失、置換、挿入又は付加される前の塩基配列に対して80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上の配列同一性を有する塩基配列を挙げることができる。「1又は数個の塩基」の具体的な数としては、上述の欠失、置換、挿入又は付加が、それぞれ独立して、1カ所、2カ所、3カ所、4カ所、又は5カ所に存在してもよいし、複数が組み合わさっておこっていてもよい。 In this embodiment, the "base sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, inserted or added" may be, for example, a base sequence that has 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity to the base sequence before the deletion, substitution, insertion or addition due to the deletion, substitution, insertion or addition. The specific number of "one or several bases" may be one, two, three, four or five of the above-mentioned deletions, substitutions, insertions or additions, each independently, or a combination of multiple bases.

本実施形態において「ストリンジェントな条件」とは、6×SSC(1×SSCの組成:0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7.0)と0.5%SDSと5×デンハルトと100μg/mLの変性サケ精子DNAと50%(v/v)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて12時間インキュベートし、更に0.5×SSCで50℃以上の温度で洗浄する条件をいう。更に、よりストリンジェントな条件、例えば、45℃又は60℃にて12時間インキュベートすること、0.2×SSC又は0.1×SSCで洗浄すること、洗浄に際し60℃又は65℃以上の温度条件で洗浄すること等の、より厳しい条件も含む。 In this embodiment, "stringent conditions" refers to conditions in which the sample is incubated for 12 hours at room temperature in a solution containing 6xSSC (1xSSC composition: 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5x Denhardt's solution, 100 μg/mL denatured salmon sperm DNA, and 50% (v/v) formamide, and then washed with 0.5xSSC at a temperature of 50°C or higher. Furthermore, more stringent conditions, such as incubation for 12 hours at 45°C or 60°C, washing with 0.2xSSC or 0.1xSSC, and washing at a temperature of 60°C or 65°C or higher, are also included.

本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~40番、46番、51番、56番、若しくは62番~63番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108873番、108878番~108917番、108923番、108928番、108933番、若しくは108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列であることが好ましい。 In one aspect of this embodiment, the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is preferably a base sequence complementary to a target region consisting of a contiguous 15-25mer from bases located at positions 1 to 40, 46, 51, 56, or 62 to 63 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a contiguous 15-25mer from bases located at positions 108873, 108878 to 108917, 108923, 108928, 108933, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2.

本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~32番、34番~40番、46番、51番、若しくは62番~63番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108878番~108909番、108911番~108917番、108923番、108928番、若しくは108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列であることがより好ましい。 In one aspect of this embodiment, the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is more preferably a base sequence complementary to a target region consisting of a contiguous 15-25mer from bases located at positions 1 to 32, 34 to 40, 46, 51, or 62 to 63 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a contiguous 15-25mer from bases located at positions 108878 to 108909, 108911 to 108917, 108923, 108928, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2.

本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番、3番、5番~12番、14番~19番、21番、25番、29番、30番、31番、34番、46番、若しくは51番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108878番、108880番、108882番~108889番、108891番~108896番、108898番、108902番、108906番~108908番、108911番、108923番、若しくは108928番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列であることが更に好ましい。 In one aspect of this embodiment, the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is more preferably a base sequence complementary to a target region consisting of a contiguous 15-25mer from the bases located at positions 1, 3, 5 to 12, 14 to 19, 21, 25, 29, 30, 31, 34, 46, or 51 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a contiguous 15-25mer from the bases located at positions 108878, 108880, 108882 to 108889, 108891 to 108896, 108898, 108902, 108906 to 108908, 108911, 108923, or 108928 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2.

上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、WRN遺伝子の標的領域と結合することができる。本明細書において、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの「WRN遺伝子の標的領域との結合」とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのWRNのmRNA前駆体への直接結合を包含する。 The single-stranded antisense oligonucleotide can bind to a target region of the WRN gene. In this specification, the "binding to a target region of the WRN gene" of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention includes direct binding of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention to the WRN pre-mRNA.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、WRN遺伝子のエクソン27をスキッピングできる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、表1-1~表1-5に記載されているいずれかの塩基配列を持ち、当該一本鎖オリゴヌクレオチドは、ヒトWRN遺伝子のmRNA前駆体における標的領域と相補的である。
なお、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1-1~表1-5に記載されている塩基配列を含んでいれば3’側及び/又は5’側にそれぞれ1~5塩基延びていてもよい。上記標的領域は、ヒトWRNのmRNA前駆体において、特に、ヒトWRN遺伝子の発現調節に関連する領域(例えば、アンチセンスヌクレオチドが結合しやすいmRNAの二次構造をもつ領域)と言える。例えば、表1-1において配列番号1の5’末端位置が「5」であり3’末端位置が「24」である場合、配列番号1(配列番号2のエクソン27に該当)に記載の塩基配列における5’末端から数えて5番目から24番目までの連続する20merの塩基配列が、対応する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列名「5-20」)が標的とするヒトWRNのエクソン27における標的領域となる。また、表1-1において配列番号1の5’末端位置が「(-)5」であり3’末端位置が「15」である場合、配列番号1(配列番号2のエクソン27に該当)に記載の塩基配列における5’末端に結合するイントロン領域に対してエクソン27に結合する位置から数えて5番目の塩基からエクソン27の15番目までの20merの塩基配列が、対応する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列名「(-)5-20」)が標的とするヒトWRNのエクソン27における標的領域となる。
One embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is a single-stranded antisense oligonucleotide capable of skipping exon 27 of the WRN gene, which has any of the base sequences listed in Tables 1-1 to 1-5, and which is complementary to a target region in the pre-mRNA of the human WRN gene.
In addition, the single-stranded antisense oligonucleotide may extend by 1 to 5 bases on the 3' side and/or 5' side, respectively, so long as it contains the base sequence described in Tables 1-1 to 1-5. The target region can be said to be a region in the pre-mRNA of human WRN that is particularly related to the regulation of expression of the human WRN gene (e.g., a region having a secondary structure of mRNA to which an antisense nucleotide is easily bound). For example, when the 5'-end position of SEQ ID NO: 1 in Table 1-1 is "5" and the 3'-end position is "24", the consecutive 20-mer base sequence from the 5th to the 24th bases counting from the 5'-end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 (corresponding to exon 27 of SEQ ID NO: 2) is the target region in exon 27 of human WRN targeted by the corresponding single-stranded antisense oligonucleotide (sequence name "5-20"). In addition, in Table 1-1, when the 5'-terminal position of SEQ ID NO: 1 is "(-)5" and the 3'-terminal position is "15," a 20-mer base sequence from the 5th base from the position binding to exon 27 to the 15th base of exon 27 in the intron region binding to the 5'-terminal of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 (corresponding to exon 27 of SEQ ID NO: 2) is the target region in exon 27 of human WRN targeted by the corresponding single-stranded antisense oligonucleotide (sequence name "(-)5-20").

Figure 2024079633000010
Figure 2024079633000010

Figure 2024079633000011
Figure 2024079633000011

Figure 2024079633000012
Figure 2024079633000012

Figure 2024079633000013
Figure 2024079633000013

Figure 2024079633000014
Figure 2024079633000014

上記表1-1~表1-5において、記号「A’」、記号「C’」、記号「G’」及び記号「T’」は、それぞれ天然ヌクレオシド(後述する、a、c、g、及びt)又は修飾ヌクレオシド(修飾糖ヌクレオシドを含む)から選択される。なお、修飾糖ヌクレオシドのうち2’-O-アルキル化核酸としては、記号「A’」は、後述するA(M)、又はA(m)から選択され、記号「C’」は、後述するC(M)、又は5(m)から選択され、記号「G’」は、後述するG(M)、又はG(m)から選択され、記号「T’」は、後述するU(M)、又はT(m)から選択される。架橋型修飾ヌクレオシドとしては、記号「A’」は、後述するA(L)、A(Y)、A(Gx)、又はA(S)から選択され、記号「C’」は、後述する5(x)、5(L)、5(Y)、5(Gx)、又は5(S)から選択され、記号「G’」は、後述するG(L)、G(Y)、G(Gx)、又はG(S)から選択され、記号「T’」は、後述するT(L)、T(Y)、T(Gx)、又はT(S)から選択される。モルフォリノ核酸としては、記号「A’」は、後述するA(N)であり、記号「C’」は、後述するC(N)であり、記号「G’」は、後述するG(N)であり、記号「T’」は、後述するT(N)である。 In the above Tables 1-1 to 1-5, the symbols "A'", "C'", "G'" and "T'" are each selected from natural nucleosides (a, c, g, and t, described below) or modified nucleosides (including modified sugar nucleosides). Note that, as for the 2'-O-alkylated nucleic acid among the modified sugar nucleosides, the symbol "A'" is selected from A(M) or A(m), described below; the symbol "C'" is selected from C(M) or 5(m), described below; the symbol "G'" is selected from G(M) or G(m), described below; and the symbol "T'" is selected from U(M) or T(m), described below. As for the bridged modified nucleoside, the symbol "A'" is selected from A(L), A(Y), A(Gx), or A(S) as described below, the symbol "C'" is selected from 5(x), 5(L), 5(Y), 5(Gx), or 5(S) as described below, the symbol "G'" is selected from G(L), G(Y), G(Gx), or G(S) as described below, and the symbol "T'" is selected from T(L), T(Y), T(Gx), or T(S) as described below. As for the morpholino nucleic acid, the symbol "A'" is A(N) as described below, the symbol "C'" is C(N) as described below, the symbol "G'" is G(N) as described below, and the symbol "T'" is T(N) as described below.

<薬理学上許容される塩>
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬理学上許容される塩の形態であってもよい。ここで、「薬理学上許容される塩」とは、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩であって、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの生理学的に許容される塩、すなわち、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、かつ望まれない毒物学的効果を保持しない塩を意味する。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
<Pharmacologically acceptable salts>
The single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment may be in the form of a pharmacologically acceptable salt.Here, "pharmacologically acceptable salt" refers to the salt of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, which is a physiologically acceptable salt of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, that is, the salt that retains the desired biological activity of the single-stranded antisense oligonucleotide and does not retain undesired toxicological effects.The same applies to the double-stranded antisense oligonucleotide and antisense oligonucleotide complex described below.

<製薬学的に許容される塩>
本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、製薬学的に許容される塩の形態であってもよい。ここで「製薬学的に許容される塩」とは、上述の薬理学上許容される塩であってかつ酸付加塩又は塩基付加塩であるものを意味する。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩、並びに、クエン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、para-トルエンスルホン酸塩及びカンファースルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩及びアルミニウム塩等の無機塩基塩、並びに、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン]、tert-ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン及びN,N-ジベンジルエチルアミン等の有機塩基塩等が挙げられる。更には、アルギニン、リジン、オルニチン、アスパラギン酸又はグルタミン酸等の塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸との塩(アミノ酸塩)が挙げられる。なお、後述する二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体についても同様である。
Pharmaceutically acceptable salts
In one aspect of this embodiment, the single-stranded antisense oligonucleotide may be in the form of a pharma- ceutically acceptable salt. Here, the term "pharma-ceutically acceptable salt" refers to a salt that is the pharmacologically acceptable salt described above and is an acid addition salt or a base addition salt. Examples of acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate, and phosphate, and organic acid salts such as citrate, oxalate, phthalate, fumarate, maleate, succinate, malate, acetate, formate, propionate, benzoate, trifluoroacetate, methanesulfonate, benzenesulfonate, para-toluenesulfonate, and camphorsulfonate. Examples of base addition salts include inorganic base salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, magnesium salts, barium salts, and aluminum salts, as well as organic base salts such as trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, tromethamine [tris(hydroxymethyl)methylamine], tert-butylamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, and N,N-dibenzylethylamine. Further examples include salts with basic or acidic amino acids such as arginine, lysine, ornithine, aspartic acid, or glutamic acid (amino acid salts). The same applies to the double-stranded antisense oligonucleotide and antisense oligonucleotide complex described below.

<一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造>
本実施形態に係る一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド及び/又は非天然のオリゴヌクレオチドで構成されている。
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖の形態であることが好ましい。本実施形態の一側面において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、後述する第二鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖の形態(二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド)をとってもよい。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
<Structure of single-stranded antisense oligonucleotide>
The single-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment is composed of a natural oligonucleotide and/or a non-natural oligonucleotide.
The single-stranded antisense oligonucleotide is preferably in the form of a single strand. In one aspect of this embodiment, the single-stranded antisense oligonucleotide may hybridize with the second strand oligonucleotide described below to take a double-stranded form (double-stranded antisense oligonucleotide). The base sequence of the second strand oligonucleotide is preferably a base sequence having 90% or more and 100% or less sequence identity based on the base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide.

<一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによるエクソンスキッピング機構>
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のメカニズムで、異常スプライスされた標的RNAの読み枠を元の読み枠に戻し、機能的なWRNタンパク質の発現を誘導する。
エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみmRNAに包含されるが、スプライス部位をアンチセンスオリゴヌクレオチドでターゲッティングすることにより、スプライシングが阻害され、エクソンスキッピングを誘導することができる。エクソンスキッピングは、エクソンの5’スプライス部位及び3’スプライス部位のいずれか一方若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが当該エクソンに結合することにより誘導することができる。すなわち、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的RNAの標的領域に結合し、当該エクソンのスプライスを阻害することによって、対象となるエクソンをスキップさせることが可能となり、発現されたmRNAを基に機能的なタンパク質の翻訳を誘導する。
<Exon skipping mechanism by single-stranded antisense oligonucleotide>
The single-stranded antisense oligonucleotide restores the reading frame of the aberrantly spliced target RNA to the original reading frame and induces the expression of a functional WRN protein through the following mechanism.
An exon is included in an mRNA only when both splice sites are recognized by the spliceosome complex, but by targeting the splice sites with an antisense oligonucleotide, splicing is inhibited and exon skipping can be induced. Exon skipping can be induced by binding a single-stranded antisense oligonucleotide that targets either or both of the 5' splice site and 3' splice site of an exon, or the inside of an exon, to the exon. That is, the single-stranded antisense oligonucleotide binds to the target region of the target RNA and inhibits the splicing of the exon, making it possible to skip the target exon and inducing the translation of a functional protein based on the expressed mRNA.

また、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本実施形態においては、上述のようなメカニズムでヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンを高効率にスキッピングする(WRNのmRNA前駆体の成熟を調節することを介して作用する場合も含む。)ために好適に用いることが可能である。より具体的には、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的RNA(WRN遺伝子のmRNA前駆体)の標的領域であるエクソン27に結合し(図3上段)、当該エクソン27のスプライスを阻害する。よって、ウェルナー症候群患者で見られるエクソン26のスキップ変異で出現したエクソン27内の終止コドンがスキップされ、エクソン25とエクソン28が連結したWRN mRNA(健常者WRN遺伝子の読み枠に修正:イン・フレーム)が生成し(図3中段)、当該mRNAを基にエクソン34に含まれる核移行シグナルを持つ機能的なWRNタンパク質が翻訳される。更に本実施形態によれば、臨床応用時に通常用いられる投与経路である経皮投与、静脈内投与や皮内投与においても、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによる機能的なWRN遺伝子の発現を調節する効果が発揮され得る。ここで、「ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンを高効率にスキッピング」とは、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンを高効率にスキッピングすることを少なくとも意味し、結果として、機能的なWRNタンパク質の発現を回復することを少なくとも意味する。 In addition, in this embodiment, the single-stranded antisense oligonucleotide can be suitably used to skip the 27th exon of the human WRN gene with high efficiency (including the case where it acts through regulating the maturation of WRN pre-mRNA) by the mechanism described above. More specifically, the single-stranded antisense oligonucleotide binds to exon 27, which is the target region of the target RNA (pre-mRNA of the WRN gene) (upper part of FIG. 3), and inhibits the splicing of exon 27. Thus, the stop codon in exon 27 that appears due to the skip mutation of exon 26 seen in Werner's syndrome patients is skipped, and WRN mRNA (corrected to the reading frame of the WRN gene of healthy individuals: in-frame) in which exons 25 and 28 are linked is generated (middle part of FIG. 3), and functional WRN protein having a nuclear localization signal contained in exon 34 is translated based on the mRNA. Furthermore, according to this embodiment, the single-stranded antisense oligonucleotide can exert its effect of regulating the expression of a functional WRN gene even through percutaneous administration, intravenous administration, or intradermal administration, which are administration routes commonly used in clinical applications. Here, "highly efficient skipping of the 27th exon of the human WRN gene" at least means highly efficient skipping of the 27th exon of the human WRN gene, and as a result, at least means restoring the expression of a functional WRN protein.

糖部がデオキシリボースである天然ヌクレオチドとしては、例えば、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、チミジン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシ-5-メチルシチジン一リン酸等が挙げられる。言い換えると、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する天然ヌクレオチドとしては、後述する記号a、g、t、c及び5(x)それぞれに対応する構造式を含むものが挙げられる。 Examples of natural nucleotides in which the sugar moiety is deoxyribose include deoxyadenosine monophosphate, deoxyguanosine monophosphate, thymidine monophosphate, deoxycytidine monophosphate, and deoxy-5-methylcytidine monophosphate. In other words, examples of natural nucleotides that make up the above single-stranded antisense oligonucleotide include those that contain structural formulas corresponding to the symbols a, g, t, c, and 5(x) described below.

糖部がデオキシリボースである非天然ヌクレオチドとしては、例えば、2-チオ-チミジン-リン酸、2-アミノアデノシン-リン酸、7-デアザグアノシン-リン酸等が挙げられる。 Examples of non-natural nucleotides in which the sugar moiety is deoxyribose include 2-thio-thymidine phosphate, 2-aminoadenosine phosphate, and 7-deazaguanosine phosphate.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長は、10~30merであり、好ましくは15~25merであり、より好ましくは18~22merであり、更に好ましくは16~20merであり、特に好ましくは18~20merである。本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長が、15~25mer、18~22mer、16~20mer、18~20merである場合、特に、WRNのmRNA前駆体への結合が強く、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンにおける高効率なスキッピングをより効果的に調節できる。 The base length of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is 10-30 mer, preferably 15-25 mer, more preferably 18-22 mer, even more preferably 16-20 mer, and particularly preferably 18-20 mer. When the base length of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is 15-25 mer, 18-22 mer, 16-20 mer, or 18-20 mer, binding to WRN pre-mRNA is particularly strong, and highly efficient skipping in the 27th exon of the human WRN gene can be more effectively regulated.

本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び/又は修飾リン酸基で結合されており、ホスホジエステル結合又はホスホロチオアート結合で結合されていることが好ましい。 In this embodiment, the single-stranded antisense oligonucleotide has each nucleotide linked via a phosphate group and/or a modified phosphate group, and is preferably linked via a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.

<二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド>
本実施形態に係る二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩である。また、本実施形態は、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。上記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列であることが好ましい。
<Double-stranded antisense oligonucleotide>
The double-stranded antisense oligonucleotide according to this embodiment comprises the above single-stranded antisense oligonucleotide and
and a second strand oligonucleotide hybridized to the single-stranded antisense oligonucleotide, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof. The present embodiment also provides a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof. The base sequence of the second strand oligonucleotide is preferably a base sequence having a sequence identity of 90% or more and 100% or less with respect to a base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide.

上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、溶液中で解離して、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとに分離することができる。分離した上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述した標的RNAに結合することができる。なお、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記第二鎖オリゴヌクレオチドとの関係において、「第一鎖オリゴヌクレオチド」と把握することもできる。なお、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドのうち上記第一鎖オリゴヌクレオチドが上述した標的RNAに対するアンチセンス鎖を有しているが、上記第一鎖オリゴヌクレオチドと上記第二鎖オリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチドを便宜上「二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ぶことにする。 The double-stranded antisense oligonucleotide can be dissociated in a solution and separated into the single-stranded antisense oligonucleotide and the second-stranded oligonucleotide. The separated single-stranded antisense oligonucleotide can bind to the target RNA. The single-stranded antisense oligonucleotide can also be understood as a "first-stranded oligonucleotide" in relation to the second-stranded oligonucleotide. Of the oligonucleotides constituting the double-stranded antisense oligonucleotide, the first-stranded oligonucleotide has an antisense strand against the target RNA, but for convenience, the double-stranded oligonucleotide consisting of the first-stranded oligonucleotide and the second-stranded oligonucleotide will be referred to as a "double-stranded antisense oligonucleotide".

≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法による固相合成により製造することができる。例えば、市販の核酸自動合成機を使用して固相担体上で所定の塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをまず合成する。次に、塩基性物質等を用いて固相担体から合成した一本鎖オリゴヌクレオチドを切出し、脱保護を行ない、粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを得る。その後、得られた粗体の一本鎖オリゴヌクレオチドを、HPLC等を用いて精製する。上述の製造法に限らず、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法に準じて、核酸の塩基配列、修飾部位等を適宜変更することにより製造できる。また、AmNA、GuNA、及びscpBNAについては、それぞれ国際公開第2011/052436号(特許文献1)、国際公開第2014/046212号(特許文献2)、及び国際公開第2015/125783号(特許文献3)に記載の方法により製造することができる。また、モルフォリノオリゴ核酸(PMO)は、国際公開第1991/009033号(特許文献4)、国際公開公報第2009/064471号(特許文献5)又は非特許文献8に記載の方法に従って製造することが可能である。
<Method for producing single-stranded antisense oligonucleotide>
The single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be produced by solid-phase synthesis using the phosphoramidite method. For example, a single-stranded oligonucleotide having a predetermined base sequence is first synthesized on a solid-phase support using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer. Next, the synthesized single-stranded oligonucleotide is cut out from the solid-phase support using a basic substance or the like, and deprotected to obtain a crude single-stranded oligonucleotide. The crude single-stranded oligonucleotide obtained is then purified using HPLC or the like. Not limited to the above-mentioned production method, the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be produced by appropriately changing the base sequence, modification site, etc. of the nucleic acid according to a method known to those skilled in the art. In addition, AmNA, GuNA, and scpBNA can be produced by the methods described in WO 2011/052436 (Patent Document 1), WO 2014/046212 (Patent Document 2), and WO 2015/125783 (Patent Document 3), respectively. In addition, morpholino oligonucleotides (PMOs) can be produced according to the methods described in International Publication No. WO 1991/009033 (Patent Document 4), International Publication No. WO 2009/064471 (Patent Document 5), or Non-Patent Document 8.

≪二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法≫
本発明の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、まず、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の製造方法を用いて、該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を基準として所定の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド(第二鎖オリゴヌクレオチド)を製造する。その後、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび上記第二鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより製造することができる。
<Method for producing double-stranded antisense oligonucleotide>
The double-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be produced by first producing an oligonucleotide (second strand oligonucleotide) having a predetermined sequence identity based on the base sequence complementary to the single-stranded antisense oligonucleotide using the same production method as the single-stranded antisense oligonucleotide, and then hybridizing the single-stranded antisense oligonucleotide and the second strand oligonucleotide.

≪アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体≫
本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
上記オリゴヌクレオチド(好ましくは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド)若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、
を有する。上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖(例えば、飽和脂肪族炭化水素等)、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖(例えば、炭水化物、多糖等)からなる群より選ばれる。
<Antisense oligonucleotide complex>
The antisense oligonucleotide complex according to this embodiment comprises:
The above-mentioned oligonucleotide (preferably, a single-stranded antisense oligonucleotide) or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or the above-mentioned double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof;
an additional substance attached to the oligonucleotide or the second strand oligonucleotide;
The additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains (e.g., saturated aliphatic hydrocarbons, etc.), ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains (e.g., carbohydrates, polysaccharides, etc.).

本実施形態の一側面において、上記オリゴヌクレオチド複合体は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩と、
上記オリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
上記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。また、本実施形態は、上記オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬を提供する。
In one aspect of this embodiment, the oligonucleotide complex comprises the oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma-ceutically acceptable salt thereof,
and an additional substance bound to the oligonucleotide or the second strand oligonucleotide directly or via a linker bond, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof,
the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, a peptide, an alkyl chain, a ligand compound, an antibody, a protein, and a sugar chain;
The linker bonds are each independently a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoramidate bond, a boranophosphate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphorodiamidate bond, a phosphorodiamidethioate bond, or a phosphorodiamidedithioate bond. The present embodiment also provides a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex or a pharma- ceutical acceptable salt thereof.

本実施形態の一側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
上記オリゴヌクレオチド(好ましくは一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド)又はその製薬学的に許容される塩と、
上記オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれる。
In one aspect of this embodiment, the antisense oligonucleotide conjugate comprises:
the oligonucleotide (preferably a single-stranded antisense oligonucleotide) or a pharma- ceutical acceptable salt thereof;
and an additional substance bound to the oligonucleotide, the additional substance being selected from the group consisting of polyethylene glycol, a peptide, an alkyl chain, a ligand compound, an antibody, a protein, and a sugar chain.

本実施形態の他の側面において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体は、
上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩と、
上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している付加物質と、を有し、上記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖(例えば、飽和脂肪族炭化水素等)、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖(例えば、炭水化物、多糖等)からなる群より選ばれる。
In another aspect of this embodiment, the antisense oligonucleotide conjugate comprises:
The double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof;
and an additional substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second strand oligonucleotide, the additional substance being selected from the group consisting of polyethylene glycol, peptides, alkyl chains (e.g., saturated aliphatic hydrocarbons, etc.), ligand compounds, antibodies, proteins, and sugar chains (e.g., carbohydrates, polysaccharides, etc.).

本実施形態において「付加物質」とは、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドに結合している物質であって、所定の作用を付与するために用いられる物質を意味する。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端に結合していてもよいし、3’末端に結合していてもよいし、5’末端及び3’末端の両方に結合していてもよい。また、上記付加物質は、上記第二鎖オリゴヌクレオチドの5’末端に結合していてもよいし、3’末端に結合していてもよいし、5’末端及び3’末端の両方に結合していてもよい。本実施形態の一側面において、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドの5’末端又は3’末端のいずれか一方に結合していることが好ましい。また、上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと直接、共有結合で結合していてもよい。上記付加物質は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記第二鎖オリゴヌクレオチドと、リンカー物質を介して結合していてもよい。上記リンカー物質としては例えば、アルキル、ポリエチレングリコール、ペプチド、ジスルフィド、リン酸結合等及び/又はこれらの組み合わせで構成されたリンカーが挙げられる。上記リンカー物質は、リンカー結合と把握することもできる。 In this embodiment, the term "additive substance" refers to a substance bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide, and used to impart a predetermined action. The additive substance may be bound to the 5' end, the 3' end, or both the 5' end and the 3' end of the single-stranded antisense oligonucleotide. The additive substance may be bound to the 5' end, the 3' end, or both the 5' end and the 3' end of the second-stranded oligonucleotide. In one aspect of this embodiment, the additive substance is preferably bound to either the 5' end or the 3' end of the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide. The additive substance may be directly bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide by a covalent bond. The additive substance may be bound to the single-stranded antisense oligonucleotide or the second-stranded oligonucleotide via a linker substance. Examples of the linker substance include linkers composed of alkyl, polyethylene glycol, peptide, disulfide, phosphate bond, etc., and/or combinations thereof. The above linker substance can also be understood as a linker bond.

上記付加物質として用いられるペプチドとしては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。CPPs(Cell Penetrating Peptides:細胞膜透過性ペプチド)、核移行性ペプチド、TAT(Trans-Activator of Transcription protein)、ポリアルギニン、グルカゴン様ペプチド-1 類縁ペプチド、合成環状RGDペプチド、皮膚透過性ペプチド。 Examples of peptides that can be used as the additional substance include, but are not limited to, the following: CPPs (Cell Penetrating Peptides), nuclear transport peptides, TAT (Trans-Activator of Transcription protein), polyarginine, glucagon-like peptide-1 analogue peptides, synthetic cyclic RGD peptides, and skin-permeable peptides.

上記付加物質として用いられるリガンド化合物としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、糖類(グルコース、マンノース等)、脂質類(コレステロール等)、ビタミン類(葉酸、ビタミンA、ビタミンE等)、アミノ酸。 Examples of ligand compounds used as the above-mentioned additional substances include, but are not limited to, the following: N-acetylgalactosamine (GalNAc), sugars (glucose, mannose, etc.), lipids (cholesterol, etc.), vitamins (folic acid, vitamin A, vitamin E, etc.), and amino acids.

上記付加物質として用いられる抗体としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これらに限らない。抗インスリン受容体抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、抗LDL受容体関連タンパク質抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗HER2抗体。 Examples of antibodies that can be used as the additional substance include, but are not limited to, the following: anti-insulin receptor antibody, anti-transferrin receptor antibody, anti-LDL receptor-related protein antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD30 antibody, and anti-HER2 antibody.

上記付加物質として用いられるタンパク質としては、例えば、以下のようなものが挙げられるが、これに限らない。アルブミン。 Examples of proteins that can be used as the additional substance include, but are not limited to, the following: Albumin.

モルフォリノオリゴ核酸において、上記付加物質と上記リンカー物質の組み合わせとしては、例えば、以下の構造式で示されるものが挙げられるが、これに限らない。

Figure 2024079633000015
In the morpholino oligonucleic acid, examples of the combination of the additional substance and the linker substance include, but are not limited to, those represented by the following structural formulas.
Figure 2024079633000015

≪ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンのスキッピング剤≫
本実施形態に係るヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンのスキッピング剤は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体を有効成分として含む。
本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、WRNのmRNA前駆体に結合することで、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンをスキッピングすることができる。上記スキッピング剤の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。
本実施形態の一側面において、上記ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンのスキッピング剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
<<Skipping agent for the 27th exon of the human WRN gene>>
The agent for skipping exon 27 of the human WRN gene according to this embodiment contains the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, the double-stranded antisense oligonucleotide, or the antisense oligonucleotide complex as an active ingredient.
The single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can bind to WRN pre-mRNA and thereby skip exon 27 of the human WRN gene. Any administration method and formulation of the skipping agent can be used as long as it is known in the art.
In one aspect of this embodiment, the agent for skipping the 27th exon of the human WRN gene comprises, as an active ingredient, a pharmaceutical comprising the oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex or a pharma- ceutical acceptable salt thereof.

≪機能的WRN回復剤≫
本実施形態に係る機能的WRN回復剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンのスキッピングによる核移行シグナルを保有する機能的WRN回復剤である。本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、WRNのmRNA前駆体に結合することで、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンをスキッピングすることができる。特に、上記ヒトWRN遺伝子がウェルナー症候群患者で見られるエクソン26のスキップ変異を有する場合、当該ヒトWRN遺伝子で出現したエクソン27内の終止コドンがスキップされ、エクソン25とエクソン28が連結したWRN mRNAが生成し、当該mRNAを基にエクソン34に含まれる核移行シグナルを持つ機能的なWRNタンパク質が翻訳される。
本実施形態の一側面において、上記機能的WRN回復剤は、上記オリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記オリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
<Functional WRN recovery agent>
The functional WRN restorer according to the present embodiment is a functional WRN restorer that contains the above-mentioned oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, the above-mentioned double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned oligonucleotide complex or a pharma- ceutical acceptable salt thereof as an active ingredient, and has a nuclear localization signal resulting from skipping of the 27th exon of the human WRN gene. The single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can skip the 27th exon of the human WRN gene by binding to a WRN pre-mRNA. In particular, when the human WRN gene has a skip mutation of exon 26 seen in patients with Werner's syndrome, the stop codon in exon 27 that appears in the human WRN gene is skipped, and WRN mRNA in which exon 25 and exon 28 are linked is generated, and a functional WRN protein having a nuclear localization signal contained in exon 34 is translated based on the mRNA.
In one aspect of this embodiment, the functional WRN restoration agent comprises as an active ingredient a pharmaceutical comprising the above-mentioned oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the above-mentioned double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the above-mentioned oligonucleotide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.

≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を有効成分として含有する医薬組成物≫
本実施形態に係る医薬組成物は、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。本実施形態の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。以下、上記医薬組成物を、「アンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物」と表記することがある。
<Pharmaceutical composition containing single-stranded antisense oligonucleotide or the like as an active ingredient>
The pharmaceutical composition according to this embodiment contains as an active ingredient a pharmaceutical comprising the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the above-mentioned double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutical acceptable salt thereof. Any administration method and formulation known in the art can be used for the pharmaceutical composition according to this embodiment. Hereinafter, the pharmaceutical composition may be referred to as a "pharmaceutical composition of antisense oligonucleotides, etc."

上記医薬組成物は、ウェルナー症候群の治療又は予防に用いられる。言い方を変えると、上記医薬組成物は、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンを高効率にスキッピングすることによってウェルナー症候群の症状の改善が期待できる治療又は予防に用いることができる。 The pharmaceutical composition is used for the treatment or prevention of Werner syndrome. In other words, the pharmaceutical composition can be used for the treatment or prevention of Werner syndrome, which is expected to improve the symptoms of Werner syndrome by skipping the 27th exon of the human WRN gene with high efficiency.

≪ウェルナー症候群に対する治療剤及び予防剤≫
本実施形態に係るウェルナー症候群に対する治療剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。本実施形態に係るウェルナー症候群に対する予防剤は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む。
<Treatment and prevention agents for Werner's syndrome>
The therapeutic agent for Werner's syndrome according to this embodiment contains as an active ingredient a medicine consisting of the above single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, a medicine consisting of the above double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or a medicine consisting of the above antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof. The prophylactic agent for Werner's syndrome according to this embodiment contains as an active ingredient a medicine consisting of the above single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, a medicine consisting of the above double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, or a medicine consisting of the above antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof.

<個体>
本発明における個体とは、哺乳動物を意味する。好ましくは、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスである。より好ましくはヒトである。
<Individual>
In the present invention, an individual refers to a mammal, preferably a human, monkey, marmoset, dog, pig, rabbit, guinea pig, rat, or mouse, more preferably a human.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその医薬組成物(ウェルナー症候群に対する治療剤及び予防剤を含む)を投与するに当たっては、その投与方法及び剤型は特に限定されない。すなわち、当該分野における公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の投与方法及び製剤として用いることができる。投与方法としては、例えば、経口投与、非経口投与等が挙げられる。非経口投与としては、点眼投与、腟内投与、直腸内投与、鼻腔内投与、経皮投与、静脈内注射、点滴、皮下投与、腹腔内投与若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。 When administering the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention or a pharmaceutical composition thereof (including a therapeutic agent and a prophylactic agent for Werner's syndrome), the administration method and dosage form are not particularly limited. In other words, any administration method and formulation known in the art can be used as the administration method and formulation of the antisense oligonucleotide of the present invention. Examples of administration methods include oral administration and parenteral administration. Examples of parenteral administration include eye drops, intravaginal administration, intrarectal administration, intranasal administration, transdermal administration, intravenous injection, drip infusion, subcutaneous administration, intraperitoneal administration or intramuscular injection, pulmonary administration by aspiration or inhalation, intrathecal administration, and intraventricular administration.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の製剤には、賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、嬌味剤、芳香剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、張剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合することができる。 The formulations of the antisense oligonucleotides of the present invention may contain various pharmaceutical additives, such as excipients, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, diluents, flavoring agents, fragrances, solubilizing agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and tonicity agents, as necessary.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を局所投与する場合、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。 When administering pharmaceutical compositions such as the antisense oligonucleotides of the present invention locally, formulations such as transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids, powders, etc. can be used.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を経口投与する場合、例えば、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等の製剤を用いることができる。 When the pharmaceutical composition of the present invention, such as the antisense oligonucleotide, is orally administered, it may be in the form of, for example, a powder, granules, a suspension or solution dissolved in water or a non-aqueous medium, capsules, powders, tablets, or other formulations.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド等の医薬組成物を非経口、静脈内投与、皮下投与、又は皮内投与する場合、例えば、無菌水溶液等の製剤を用いることができる。 When administering pharmaceutical compositions such as antisense oligonucleotides of the present invention parenterally, intravenously, subcutaneously, or intradermally, formulations such as sterile aqueous solutions can be used.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効投与量は、投与される個体の性別、年齢、体重、症状等により、任意に定めることができる。更に、投与の方法、経路、頻度等に応じても任意に定めることができる。例えば、投与量として0.01~100mg/kg等が挙げられる。好ましくは0.1~50mg/kgであり、更に好ましくは0.1~10mg/kgである。 The effective dose of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention can be determined arbitrarily depending on the sex, age, weight, symptoms, etc. of the individual to be administered. Furthermore, it can also be determined arbitrarily depending on the method, route, frequency, etc. of administration. For example, the dose can be 0.01 to 100 mg/kg, etc., preferably 0.1 to 50 mg/kg, and more preferably 0.1 to 10 mg/kg.

≪ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンを高効率にスキッピングする方法≫
本実施形態におけるヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンをスキッピングする方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として、上記WRN遺伝子を発現している細胞、組織又は個体に投与する工程を含む。
<Method for highly efficient skipping of the 27th exon of the human WRN gene>
In this embodiment, the method for skipping the 27th exon of the human WRN gene includes a step of administering, as an active ingredient, a pharmaceutical comprising the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, the above-mentioned double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or the above-mentioned antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutical acceptable salt thereof to a cell, tissue, or individual expressing the above-mentioned WRN gene.

本実施形態において、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等を細胞、組織又は個体に投与する方法は、in vitroで行ってもよいし、in vivoで行ってもよい。in vivoで投与する場合、その投与経路は、上述した投与経路が用いられる。 In this embodiment, the method of administering the single-stranded antisense oligonucleotide or the like to a cell, tissue, or individual may be performed in vitro or in vivo. When administering in vivo, the administration route is the administration route described above.

本実施形態において、「WRN遺伝子を発現している細胞」としては、線維芽細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、ケラチノサイト、筋細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞などが挙げられる。 In this embodiment, examples of "cells expressing the WRN gene" include fibroblasts, adipocytes, mesenchymal stem cells, keratinocytes, muscle cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, etc.

本実施形態におけるウェルナー症候群の治療方法又は予防方法は、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、上記二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は上記アンチセンスオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として、上記ウェルナー症候群に罹患している個体に投与する工程を含む。 The method for treating or preventing Werner's syndrome in this embodiment includes a step of administering, as an active ingredient, a medicine consisting of the single-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a medicine consisting of the double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or a medicine consisting of the antisense oligonucleotide complex or a pharma- ceutical acceptable salt thereof to an individual suffering from Werner's syndrome.

以上、本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドについて説明した。上述の構成を備える上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンを高効率にスキッピングすることが可能になる。 The above describes the antisense oligonucleotide according to this embodiment. The single-stranded antisense oligonucleotide having the above-mentioned configuration enables highly efficient skipping of the 27th exon of the human WRN gene.

≪ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンをスキッピングに対する活性の評価方法≫
<細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入>
「WRN遺伝子を発現している細胞」にリポフェクション法、エレクトロポレーション法又は直接添加による導入等の方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを6時間から1ヶ月間処置することで観察できる。なお処置時間は、48時間から7日間が好ましい。使用する細胞はWRN遺伝子が発現している細胞であればよく、例えばHEK293T細胞、又はウェルナー症候群患者由来の線維芽細胞(以下、「ウェルナー症候群患者線維芽細胞」という。)が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを処置した細胞は、処置後すぐに回収してもよいし、アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去して継続培養してもよい。
<Method for evaluating activity in skipping the 27th exon of the human WRN gene>
<Introduction of antisense oligonucleotides into cells>
The "cells expressing the WRN gene" can be treated with antisense oligonucleotides for 6 hours to 1 month using methods such as lipofection, electroporation, or direct addition. The treatment time is preferably 48 hours to 7 days. The cells used may be any cells expressing the WRN gene, such as HEK293T cells or fibroblasts derived from Werner syndrome patients (hereinafter referred to as "Werner syndrome patient fibroblasts"). The cells treated with the antisense oligonucleotides may be harvested immediately after treatment, or the antisense oligonucleotides may be removed and the cells may be continuously cultured.

<ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンスキッピング評価>
回収した細胞から抽出した全RNAに対して逆転写反応を実施し、得られたcDNAに対してWRN遺伝子のエクソン27の周辺領域をPCRにて増幅する。該PCR増幅産物に対して、ポリヌクレオチド量の定量またはシークエンス解析を行うことにより、WRN遺伝子の第27番目のエクソンスキッピングが確認できる。スキッピング効率は、エクソン27がスキップしたPCR産物のポリヌクレオチド量「A」及びエクソン27がスキップしなかったPCR産物のポリヌクレオチド量「B」を定量し、これら「A」と「B」の測定値を以下の計算式に従って、スキッピング効率(%)を計算することができる。
スキッピング効率(%)=100×A/(A+B)
<Evaluation of exon skipping of the 27th exon of the human WRN gene>
A reverse transcription reaction is carried out on the total RNA extracted from the collected cells, and the region surrounding exon 27 of the WRN gene is amplified by PCR using the obtained cDNA. The PCR amplified product is subjected to quantification of the polynucleotide amount or sequence analysis to confirm skipping of the 27th exon of the WRN gene. The skipping efficiency can be calculated by quantifying the polynucleotide amount "A" of the PCR product in which exon 27 was skipped and the polynucleotide amount "B" of the PCR product in which exon 27 was not skipped, and calculating the skipping efficiency (%) from the measured values of "A" and "B" according to the following formula:
Skipping efficiency (%) = 100 x A/(A+B)

なお、本発明は、上述の実施形態に限定されない。例えば、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の実施態様を含む。 The present invention is not limited to the above-mentioned embodiments. For example, the above-mentioned single-stranded antisense oligonucleotide includes the following embodiments.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの一態様としては、
ヒトWRN遺伝子の第26番又は第28番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトWRNタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩であって、
上記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び/又は修飾リン酸基で結合されており、
上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、10~30merであり、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1に記載の塩基配列における、上記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩、である。
One embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
An oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof that expresses a functional human WRN protein in response to a skipping mutation of exon 26 or 28 of the human WRN gene,
The oligonucleotide has each nucleotide linked to a phosphate group and/or a modified phosphate group;
the oligonucleotide comprises a modified nucleic acid having at least one modified sugar;
The oligonucleotide has a base length of 10 to 30 mer,
The base sequence of the oligonucleotide is
A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the oligonucleotide in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or
The oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof has a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the above-mentioned target region.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、95%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である。
In another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is
This is a base sequence that has a sequence identity of 95% to 100% based on a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the single-stranded antisense oligonucleotide in the base sequence set forth in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, or SEQ ID NO:6.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列である。 In another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention, the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide is a base sequence complementary to at least one target region in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6, the target region having the same base length as the single-stranded antisense oligonucleotide.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾がD-リボフラノースの2’位の水酸基の糖修飾である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The sugar constituting the above oligonucleotide is D-ribofuranose, and the sugar modification is a sugar modification of the hydroxyl group at the 2'-position of D-ribofuranose.

上記オリゴヌクレオチドの塩基長は、15~25merである。 The base length of the above oligonucleotide is 15-25mer.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式(A1)で表される基である。

Figure 2024079633000016

(式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Xはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Yは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Zは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素-酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数1~5のアルキル基であるか、又は上記アルキル基の一部の炭素原子とYとが一緒になって環を形成する。)上記炭素数1~5のアルキル基が有する「炭素-酸素二重結合」としては、例えばカルボニル基が挙げられる。上記炭素数1~5のアルキル基が有する「環状構造」としては、例えばシクロプロパン構造が挙げられる。 Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The sugar modification constituting the above oligonucleotide is a group represented by the following formula (A1).
Figure 2024079633000016

(In the formula, Bx is a nucleic acid base, each independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine or uracil; X is a phosphate bond, each independently a phosphodiester bond, phosphorothioate bond, phosphorodithioate bond, phosphoamidate bond, boranophosphate bond or alkylphosphonate bond; Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted, or an amino group which may be substituted; and Z is each independently a hydrogen atom, a carbon-oxygen double bond or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which may have a cyclic structure, or a part of the carbon atom of the alkyl group and Y form a ring together.) An example of the "carbon-oxygen double bond" possessed by the alkyl group having 1 to 5 carbon atoms is a carbonyl group. An example of the "cyclic structure" possessed by the alkyl group having 1 to 5 carbon atoms is a cyclopropane structure.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
At least one internucleotide bond of the oligonucleotide is a phosphorothioate bond.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
At least one internucleotide bond of the oligonucleotide is a phosphodiester bond.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~12番、14番~21番、24番、25番、29番~31番、34番、36番、41番、46番、51番、若しくは62番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide is
A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 15-25mer from bases located at positions 1 to 12, 14 to 21, 24, 25, 29 to 31, 34, 36, 41, 46, 51, or 62 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or
It is a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the above-mentioned target region.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~40番、46番、51番、56番、又は62番~63番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108873番、108878番~108917番、108923番、108928番、108933番、又は108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
上記標的領域において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
上記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide is
A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 15-25 mer consisting of bases located at positions 1 to 40, 46, 51, 56, or 62 to 63 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a continuous 15-25 mer consisting of bases located at positions 108873, 108878 to 108917, 108923, 108928, 108933, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region; or
It is a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the above-mentioned target region.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番、3番~12番、14番~19番、21番、25番、29番、30番、31番、34番、46番、若しくは51番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide has a sequence identity of 90% or more and 100% or less based on a base sequence complementary to a target region consisting of a consecutive 15-25mer starting from the base located at positions 1, 3 to 12, 14 to 19, 21, 25, 29, 30, 31, 34, 46, or 51 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~32番、34番~40番、46番、51番、又は62番~63番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108878番~108909番、108911番~108917番、108923番、108928番、又は108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide has a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 15-25 mer from bases located at positions 1 to 32, 34 to 40, 46, 51, or 62 to 63 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a continuous 15-25 mer from bases located at positions 108878 to 108909, 108911 to 108917, 108923, 108928, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番、3番、6番~12番、14番~19番、21番、25番、29番、30番、31番、34番、46番、若しくは51番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide has a sequence identity of 90% or more and 100% or less based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 15-25mer starting from the base at positions 1, 3, 6 to 12, 14 to 19, 21, 25, 29, 30, 31, 34, 46, or 51 in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, counting from the 5' end.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番、3番、5番~12番、14番~19番、21番、25番、29番、30番、31番、34番、46番、又は51番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108878番、108880番、108882番~108889番、108891番~108896番、108898番、108902番、108906番~108908番、108911番、108923番、又は108928番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide is a base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 15-25mer from bases located at positions 1, 3, 5 to 12, 14 to 19, 21, 25, 29, 30, 31, 34, 46, or 51 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a continuous 15-25mer from bases located at positions 108878, 108880, 108882 to 108889, 108891 to 108896, 108898, 108902, 108906 to 108908, 108911, 108923, or 108928 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式(A2)又は式(A3)で表される基である。

Figure 2024079633000017

(式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Xはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Rは、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルキル基であり、Y’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、R及びRは、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルキル基、又は、R及びRが一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、nは、0~1である。) Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The sugar modification constituting the above oligonucleotide is a group represented by the following formula (A2) or formula (A3).
Figure 2024079633000017

(In the formula, Bx is a nucleic acid base, each independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil; X is a phosphate bond, each independently a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoamidate bond, a boranophosphate bond, or an alkylphosphonate bond; R 4 is each independently a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; Y' is an oxygen atom or an optionally substituted nitrogen atom; R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or R 5 and R 6 together form a carbonyl group or a ring; and n is 0 to 1.)

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号9、11、14~22、24~29、31、35、39~41、44、52、及び53の塩基配列からなる群より選ばれる1つの塩基配列である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide is one selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 14 to 22, 24 to 29, 31, 35, 39 to 41, 44, 52, and 53.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号9~14、16~26、28~39、41~42、44~50、52、55~56、69、73、80~105、107~108、110、112、114、116、118~131、133、及び135の塩基配列からなる群より選ばれる1つの塩基配列である。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide is one selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 9 to 14, 16 to 26, 28 to 39, 41 to 42, 44 to 50, 52, 55 to 56, 69, 73, 80 to 105, 107 to 108, 110, 112, 114, 116, 118 to 131, 133, and 135.

本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の一態様としては、
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
Another embodiment of the single-stranded antisense oligonucleotide of the present invention is
The base sequence of the oligonucleotide is a single-stranded antisense oligonucleotide.

以下、本発明に係る実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The following describes examples of the present invention, but the present invention is not limited to these.

≪WRN遺伝子に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの作製≫
以下の手順でWRN遺伝子に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。
<<Preparation of single-stranded antisense oligonucleotide against WRN gene>>
A single-stranded antisense oligonucleotide against the WRN gene was prepared by the following procedure.

2’-OMe(O-メチル)、2’-MOE(O-メトキシエチル)、AmNA、scpBNA、及びGuNAを含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機(nS-8型、株式会社ジーンデザイン製)を用いて、0.2μmolスケールで合成した。鎖長の伸長は、標準的なホスホロアミダイトプロトコールにて実施した。このとき固相担体は、CPGレジンを使用した。また、ホスホロチオエート化(PS)骨格形成のための硫化はDDTT(((Dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3-thione)等を使用した。AmNA及びscpBNAを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、末端の5’位の水酸基がDMTr(4,4’-ジメトキシトリチル)基で保護されておらず、かつ3’位が固相に担持されたものとして得た。続いてアルカリ処理することにより、上記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを固相担体から切り出し、溶液の状態で回収した。その後、回収した溶液から溶媒を留去することで粗生成物を得た。得られた粗生成物を逆相HPLCにて精製することにより精製された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを得た。得られた各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの純度及び構造をLC-MS(Waters社製)により確認した。モルフォリノ核酸を含むモルフォリノオリゴ核酸は、国際公開第2009/064471号(特許文献5)又は、J.Am.Chem.Soc(2016)138:15663-15672(非特許文献8)に従って合成した。 Single-stranded antisense oligonucleotides containing 2'-OMe (O-methyl), 2'-MOE (O-methoxyethyl), AmNA, scpBNA, and GuNA were synthesized on a 0.2 μmol scale using an automatic nucleic acid synthesizer (nS-8 model, manufactured by Gene Design Co., Ltd.). Chain length was extended using a standard phosphoramidite protocol. CPG resin was used as the solid support. DDTT (((Dimethylamino-methylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazaoline-3-thione) or the like was used for sulfurization to form the phosphorothioate (PS) backbone. The antisense oligonucleotides containing AmNA and scpBNA were obtained such that the hydroxyl group at the 5' position at the terminal was not protected with a DMTr (4,4'-dimethoxytrityl) group and the 3' position was supported on a solid phase. The single-stranded antisense oligonucleotide was then cut out from the solid phase support by alkali treatment and recovered in a solution state. The solvent was then distilled off from the recovered solution to obtain a crude product. The crude product obtained was purified by reverse phase HPLC to obtain a purified single-stranded antisense oligonucleotide. The purity and structure of each single-stranded antisense oligonucleotide obtained were confirmed by LC-MS (Waters). Morpholino oligonucleotides containing morpholino nucleic acids were synthesized according to International Publication No. 2009/064471 (Patent Document 5) or J. Am. Chem. Soc (2016) 138: 15663-15672 (Non-Patent Document 8).

下記表2-1~表2-7に、上述の方法で製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを列挙する。また、下記表2-8に列挙された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを、上述の方法で製造した。 Tables 2-1 to 2-7 below list the single-stranded antisense oligonucleotides produced by the method described above. The single-stranded antisense oligonucleotides listed in Table 2-8 below were also produced by the method described above.

Figure 2024079633000018
Figure 2024079633000018

Figure 2024079633000019
Figure 2024079633000019

Figure 2024079633000020
Figure 2024079633000020

Figure 2024079633000021
Figure 2024079633000021

Figure 2024079633000022
Figure 2024079633000022

Figure 2024079633000023
Figure 2024079633000023

Figure 2024079633000024
Figure 2024079633000024

Figure 2024079633000025
Figure 2024079633000025

本明細書において、下記記号又は表記を用いて、対応する構造を表すことがある。 In this specification, the following symbols or notations may be used to represent corresponding structures.

Figure 2024079633000026
Figure 2024079633000026

Figure 2024079633000027
Figure 2024079633000027

Figure 2024079633000028
Figure 2024079633000028

Figure 2024079633000029
Figure 2024079633000029

上に示す構造式において、R、R、及びRは、それぞれ独立して、水素原子、又は、直鎖若しくは分岐の炭素数1から6のアルキル基、又は炭素数3から7のシクロアルキル基を示す。ここにおいて、上述の「Gx」で示されるGuNAにおけるR及びRが共に水素原子で、かつ、Rがメチル基の場合は、「Gm」と示し、Rが水素原子で、かつ、R及びRが共にメチル基の場合は、「Gdm」と示し、R及びRが水素原子で、かつ、Rがtert-ブチル基の場合は、「GtB」と示す。 In the structural formula shown above, R 1 , R 2 , and R 3 each independently represent a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 3 to 7 carbon atoms. In this regard, when R 1 and R 3 in the GuNA represented by "Gx" above are both hydrogen atoms and R 2 is a methyl group, it is represented as "Gm", when R 1 is a hydrogen atom and R 2 and R 3 are both methyl groups, it is represented as "Gdm", and when R 1 and R 3 are hydrogen atoms and R 2 is a tert-butyl group, it is represented as "GtB".

≪ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンスキッピング評価≫
ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンスキッピング評価は、HEK293T細胞やエクソン26を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞におけるエクソン27スキッピングの誘導を確認することにより行った。
本実施例における遺伝子発現評価とは、逆転写反応によって得られた相補的DNA(cDNA)に対してWRN遺伝子のエクソン26(正常WRN遺伝子を持つHEK293T)或いは25(エクソン26を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞)から29にわたる領域を、PCR法を用いて増幅した量を測定することでWRN遺伝子の第27番目のエクソンの配列構造を評価することを意味する。以下、各発現評価の具体的手順について説明する。
<Evaluation of exon skipping of the 27th exon of the human WRN gene>
The skipping of the 27th exon of the human WRN gene was evaluated by confirming the induction of exon 27 skipping in HEK293T cells and in fibroblasts from a Werner syndrome patient in which exon 26 is deleted.
In this embodiment, gene expression evaluation refers to evaluating the sequence structure of the 27th exon of the WRN gene by measuring the amount of amplification, by PCR, of the region from exon 26 (HEK293T having a normal WRN gene) or 25 (fibroblasts of a patient with Werner's syndrome lacking exon 26) to 29 of the WRN gene in complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription. Specific procedures for each expression evaluation are described below.

(細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入)
「ヒトWRN遺伝子を発現している細胞」にリポフェクション法或いは直接添加による導入等の方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを2日間処置した。使用する細胞はWRN遺伝子が発現している細胞(例えばHEK293T細胞又はエクソン26を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞)を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを処置した細胞は、処置後すぐに回収するか、又は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去して継続培養してから回収した。
(Introduction of antisense oligonucleotides into cells)
"Cells expressing the human WRN gene" were treated with antisense oligonucleotides for two days using lipofection or direct addition. The cells used were cells expressing the WRN gene (e.g., HEK293T cells or fibroblasts from a Werner's syndrome patient lacking exon 26). The cells treated with the antisense oligonucleotides were either harvested immediately after treatment or harvested after continued culture with the antisense oligonucleotides removed.

(WRN cDNAの解析)
回収した細胞から抽出した全RNAに対して逆転写反応を実施し、得られたcDNAに対してWRN遺伝子のエクソン26からエクソン29にわたる領域(正常WRN遺伝子を持つHEK293T細胞を用いた場合)、或いはWRN遺伝子のエクソン25からエクソン29にわたる領域(エクソン26欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いた場合)を、PCR法を用いて増幅した。これらの増幅は、アニーリング温度60℃を設定した。
(Analysis of WRN cDNA)
Reverse transcription was performed on the total RNA extracted from the collected cells, and the region of the WRN gene spanning from exon 26 to exon 29 (when HEK293T cells with normal WRN gene were used) or the region of the WRN gene spanning from exon 25 to exon 29 (when fibroblasts from a Werner's syndrome patient with exon 26 deletion were used) was amplified by PCR. The annealing temperature for these amplifications was set at 60°C.

(エクソン27のスキッピングの確認)
こうして、正常WRN遺伝子を持つHEK293Tにおいて、WRN cDNAのエクソン26から29の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの無添加では290塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソン26、エクソン27、エクソン28、エクソン29からなることが示された。
(Confirmation of exon 27 skipping)
When the region from exons 26 to 29 of the WRN cDNA was amplified in HEK293T cells carrying a normal WRN gene, a band of 290 base pairs was obtained without the addition of antisense oligonucleotides. The base sequence of this amplified product was determined by a conventional method and was shown to consist of exons 26, 27, 28, and 29.

同様に、エクソン26を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞においては、WRN cDNAのエクソン25からエクソン29の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの無添加では290塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソン25、エクソン27、エクソン28、エクソン29からなることが示された。この結果は患者の遺伝子解析結果とよく一致していた。 Similarly, when the region from exon 25 to exon 29 of WRN cDNA was amplified in fibroblasts from a patient with Werner's syndrome, which lacked exon 26, a band of 290 base pairs was obtained without the addition of antisense oligonucleotide. The base sequence of this amplified product was determined by standard methods and was shown to consist of exons 25, 27, 28, and 29. This result was in good agreement with the results of the patient's genetic analysis.

一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入したHEK293T細胞のcDNAでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた増幅産物と同じサイズの増幅産物が得られたのみならず、培養48時間後、小さなサイズの増幅産物が得られた。この増幅産物の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソン26、エクソン28、エクソン29からなることが示された。この条件で小さなサイズの転写物、すなわちエクソン27のスキッピングを有するもののみが得られた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した上述のウェルナー症候群患者線維芽細胞のcDNAでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた増幅産物より小さなサイズの増幅産物が得られた。この小さなサイズの増幅産物の塩基配列を決定したところ、エクソン25の配列が直接エクソン28の配列につながっており、エクソン26とエクソン27の欠失が判明した。このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によりエクソン27がスキッピングしたことを示している。
On the other hand, in the case of cDNA from HEK293T cells transfected with antisense oligonucleotides, not only was an amplified product of the same size as that obtained from cells not transfected with antisense oligonucleotides obtained, but after 48 hours of culture, an amplified product of a smaller size was also obtained. The base sequence of this amplified product was determined by a conventional method, and it was shown to consist of exons 26, 28, and 29. Under these conditions, only transcripts of a smaller size, i.e., those with skipping of exon 27, were obtained.
The cDNA of the Werner syndrome fibroblasts transfected with antisense oligonucleotides gave a smaller amplification product than that obtained from cells not transfected with antisense oligonucleotides. The sequence of this smaller amplification product was determined to reveal that the sequence of exon 25 was directly connected to the sequence of exon 28, and that exons 26 and 27 were deleted. This indicates that exon 27 was skipped by the antisense oligonucleotide treatment.

正常のヒトWRN遺伝子構造を持つ遺伝子から転写されたmRNA前駆体もスプライシング反応において、本発明者らはデザインしたアンチセンスオリゴヌクレオチドがエクソン27のスキッピングを有効に誘導することを確認した。また、第26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>Cを持つウェルナー症候群患者線維芽細胞(エクソン26を欠失したウェルナー症候群患者線維芽細胞)でも、本発明者らはデザインしたアンチセンスオリゴヌクレオチドがエクソン27のスキッピングを有効に誘導することを確認した。以下、各種の試験に基づいて本発明を更に詳細に説明する。 The inventors have confirmed that the designed antisense oligonucleotide effectively induces exon 27 skipping in the splicing reaction of pre-mRNA transcribed from a gene with a normal human WRN gene structure. The inventors have also confirmed that the designed antisense oligonucleotide effectively induces exon 27 skipping in Werner syndrome patient fibroblasts carrying the exon 26 skipping mutation c.3139-1G>C (Werner syndrome patient fibroblasts lacking exon 26). The present invention will be described in more detail below based on various tests.

≪WRN遺伝子のエクソン27スキッピングの誘導評価≫
WRN遺伝子のエクソン27スキッピングの誘導評価は、製造した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに応じて、ヒト胎児腎細胞HEK293T細胞を用いた評価と、26番エクソンのスキップ変異c.3139-1G>Cを持つウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いた評価に分けて行った。以下、具体的手順について説明する。
<Evaluation of induction of exon 27 skipping of the WRN gene>
The evaluation of the induction of exon 27 skipping of the WRN gene was carried out using human fetal kidney cells HEK293T cells and fibroblasts from a Werner syndrome patient carrying the skipping mutation c.3139-1G>C in exon 26, depending on the single-stranded antisense oligonucleotide produced. Specific procedures are described below.

<ヒト胎児腎細胞HEK293T細胞を用いたエクソン27スキッピングの誘導評価>
ヒト胎児腎細胞HEK293T細胞(ATCC(登録商標)CRL-3216 (商標))を、培養培地中、37℃、5%COの条件で培養した。HEK293T細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
<Evaluation of exon 27 skipping induction using human fetal kidney cells HEK293T cells>
Human embryonic kidney cells HEK293T cells (ATCC® CRL-3216™) were cultured in a culture medium at 37° C. and 5% CO 2. The culture medium for HEK293T cells had the following composition.

HEK293T細胞の培養培地組成
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM):Thermo Fisher Scientific社製、Cat#11995
10% ウシ胎児血清(FBS):Thermo Fisher Scientific社製、Cat#10437028
Culture medium composition for HEK293T cells Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM): Thermo Fisher Scientific, Cat#11995
10% fetal bovine serum (FBS): Thermo Fisher Scientific, Cat#10437028

まず、トランスフェクションの前日に、96穴プレートにHEK293T細胞(12000 cells/well)を播種し、37℃、5%COの条件で一晩培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(50nM)をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないPBSをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を培養培地中で37℃、5%COの条件で48時間培養した。その後、上記培養培地を除去し、Taqman Fast Cells-to-CT Kit(Thermo Fisher Scientific社製、Cat#4399003)を用いて、抽出した全RNAに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的DNA(cDNA)を利用して、予め設計された特異的プライマー(下記参照)を用いてWRN遺伝子のエクソン25からエクソン29にわたるPCRを実施した。 First, the day before transfection, HEK293T cells (12000 cells/well) were seeded in a 96-well plate and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2. Then, each single-stranded antisense oligonucleotide (50 nM) diluted with phosphate-buffered saline (PBS) was transfected into the above-mentioned cells by lipofection. As a negative control group, cells transfected with PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide was not dissolved were used. The transfected cells were cultured in culture medium at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours. Then, the culture medium was removed, and the extracted total RNA was subjected to reverse transcription reaction using Taqman Fast Cells-to-CT Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat # 4399003). The complementary DNA (cDNA) obtained from this reverse transcription reaction was used to perform PCR spanning exon 25 to exon 29 of the WRN gene using predesigned specific primers (see below).

用いたPCRのプログラムは、以下の通りである。
94℃、1分間:熱変性
[98℃、10秒間;60℃、5秒間;68℃、40秒間]×35サイクル:PCR増幅
The PCR program used was as follows:
94°C, 1 minute: heat denaturation [98°C, 10 seconds; 60°C, 5 seconds; 68°C, 40 seconds] x 35 cycles: PCR amplification

遺伝子特異的プライマーはWRN_Exon26_Fw及びWRN_Exon29_Rvを使用した。
WRN_Exon26_Fw: 5’-CTCAGAGCCTCATCCTTCAAGCTAATG-3’
WRN_Exon29_Rv: 5’-CAATCTGAGTCTCCTGCTCTTGTGC-3’
The gene-specific primers used were WRN_Exon26_Fw and WRN_Exon29_Rv.
WRN_Exon26_Fw: 5'-CTCAGAGCCTCATCCTTCAAGCTAATG-3'
WRN_Exon29_Rv: 5'-CAATCTGAGTCTCCTGCTCTGTGC-3'

上記PCR反応の反応物を3%アガロースゲール電気泳動によって分離し、LEDトランスイルミネーターゲルみえーる(Wako社)とiPhone8(Apple社)とを組み合わせた撮影システムにより、ゲル写真を撮影した。 The products of the above PCR reaction were separated by 3% agarose gel electrophoresis, and gel photographs were taken using a photography system that combined an LED transilluminator Gel Mieru (Wako) and an iPhone 8 (Apple).

上述の方法で求められた、ヒトWRN mRNA前駆体に対する各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(図4)によるヒトWRN遺伝子のエクソン27のスキッピング活性測定の実験結果を図5に示す。 Figure 5 shows the experimental results of measuring the skipping activity of exon 27 of the human WRN gene by each single-stranded antisense oligonucleotide against human WRN pre-mRNA (Figure 4), determined by the method described above.

正常WRN遺伝子を持つHEK293T細胞において、WRNcDNAのエクソン26からエクソン29の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しなかったサンプル(図5中、「無添加」と表記)では291塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列をDNAシークエンシングにより決定したところ、このバンドがエクソン26、エクソン27、エクソン28、エクソン29からなることが示された。 When the region from exon 26 to exon 29 of WRN cDNA was amplified in HEK293T cells carrying a normal WRN gene, a band of 291 base pairs was obtained in the sample to which no antisense oligonucleotide was introduced (labeled "No addition" in Figure 5). The base sequence of this amplified product was determined by DNA sequencing, and it was shown that this band consisted of exons 26, 27, 28, and 29.

一方、各アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加したHEK293T細胞のcDNAでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた増幅産物と同じサイズの増幅産物が得られたのみならず、培養48時間後、小さなサイズの増幅産物(215塩基対)が得られた。この増幅産物の塩基配列をシークエンスにより決定したところ、当該増幅産物はエクソン26、エクソン28、エクソン29からなることが示された。またこの条件で小さなサイズの増幅産物のみが認められる、すなわち高効率なエクソン27のスキッピング活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドも得られた。 On the other hand, in the cDNA of HEK293T cells to which each antisense oligonucleotide was added, not only was an amplified product of the same size as that obtained from cells not transfected with antisense oligonucleotides obtained, but after 48 hours of culture, a smaller sized amplified product (215 base pairs) was also obtained. When the base sequence of this amplified product was determined by sequencing, it was shown to consist of exons 26, 28, and 29. Furthermore, under these conditions, only a small sized amplified product was observed, i.e., an antisense oligonucleotide with highly efficient exon 27 skipping activity was also obtained.

ImageJ(米国NIH)により、エクソン27がスキップしたPCR産物「215bp、A」と、及びエクソン27がスキップしなかったPCR産物「291bp、B」を定量した。これら「A」と「B」の測定値を以下の計算式に従って、以下の式を用いてスキッピング効率(%)を求めた。その結果を表3-1~表3-3に示す。
スキッピング効率(%)=100×A/(A+B)
Using ImageJ (NIH, USA), the PCR product "215 bp, A" in which exon 27 was skipped and the PCR product "291 bp, B" in which exon 27 was not skipped were quantified. The measured values of "A" and "B" were used according to the following calculation formula to calculate the skipping efficiency (%). The results are shown in Tables 3-1 to 3-3.
Skipping efficiency (%) = 100 x A/(A+B)

Figure 2024079633000030
Figure 2024079633000030

Figure 2024079633000031
Figure 2024079633000031

Figure 2024079633000032
Figure 2024079633000032

<ウェルナー症候群患者線維芽細胞のWRN遺伝子の変異型の確認>
ウェルナー症候群患者線維芽細胞(Coriell Cell Repositories、Cat#AG12795)を、培養培地中、37℃、5%COの条件で培養した。ウェルナー症候群患者線維芽細胞の培養培地としては、以下の組成のものを用いた。
<Confirmation of the mutation type of the WRN gene in fibroblasts from Werner syndrome patients>
Werner syndrome patient fibroblasts (Coriell Cell Repositories, Cat#AG12795) were cultured in a culture medium at 37° C. and 5% CO 2. The culture medium for Werner syndrome patient fibroblasts had the following composition:

ウェルナー症候群患者線維芽細胞の培養培地組成
イーグル最少必須培地(MEM):Sigma社製、Cat#M5650
15% FBS:Thermo Fisher Scientific社製、Cat#10437028
Culture medium composition for Werner syndrome patient fibroblasts Eagle's minimum essential medium (MEM): Sigma, Cat# M5650
15% FBS: Thermo Fisher Scientific, Cat#10437028

上記のウェルナー症候群患者線維芽細胞におけるWRN遺伝子の変異型について遺伝子変異の解析を行った。96穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞(10000 cells/well)を播種し、37℃、5%COの条件で一晩培養した。その後、細胞
のゲノムDNAを抽出し、予め設計された特異的プライマー(下記参照)を用いてWRN遺伝子のエクソン25からエクソン29にわたるPCRを実施した。
Gene mutation analysis was performed on the mutant type of the WRN gene in the Werner syndrome patient fibroblasts. Werner syndrome patient fibroblasts (10,000 cells/well) were seeded in a 96-well plate and cultured overnight at 37°C and 5% CO2 . Then, the genomic DNA of the cells was extracted, and PCR spanning exon 25 to exon 29 of the WRN gene was performed using pre-designed specific primers (see below).

用いたPCRのプログラムは、以下の通りである。
94℃、1分間:熱変性
[98℃、10秒間;60℃、5秒間;68℃、40秒間]×35サイクル:PCR増幅
The PCR program used was as follows:
94°C, 1 minute: heat denaturation [98°C, 10 seconds; 60°C, 5 seconds; 68°C, 40 seconds] x 35 cycles: PCR amplification

遺伝子特異的プライマーはWRN_Exon25_Fw及びWRN_Exon29_Rvを使用した。
WRN_Exon25_Fw:5’-CTGGCAAGGATCAAACAGAGAGTTG-3’
WRN_Exon29_Rv:5’-CAATCTGAGTCTCCTGCTCTTGTGC-3’
The gene-specific primers used were WRN_Exon25_Fw and WRN_Exon29_Rv.
WRN_Exon25_Fw: 5'-CTGGCAAGGATCAAACAGAGAGTTG-3'
WRN_Exon29_Rv: 5'-CAATCTGAGTCTCCTGCTCTTGTGTC-3'

上記PCR反応の反応物を3%アガロースゲール電気泳動として分離し、LEDトランスイルミネーターゲルみえーる(Wako社)により、増幅したPCR断片を検出し、PCR断片を含むゲルを切り出した。増幅したPCR断片を精製しシークエンスによる解析を実施したところ、当該ウェルナー症候群患者線維芽細胞はWRN遺伝子のc.3139-1G>Cのホモ接合体であることが確認された。 The products of the PCR reaction were separated by 3% agarose gel electrophoresis, the amplified PCR fragment was detected using an LED transilluminator Gel Mieru (Wako), and the gel containing the PCR fragment was excised. The amplified PCR fragment was purified and analyzed by sequencing, confirming that the Werner syndrome patient fibroblasts were homozygous for c.3139-1G>C in the WRN gene.

<ウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いたエクソン27スキッピングの誘導評価>
次に、WRN遺伝子のc.3139-1G>Cのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、WRN遺伝子のエクソン27スキッピングの誘導評価を行った。トランスフェクションの前日に、96穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞(10000 cells/well)を播種し、37℃、5%COの条件で一晩培養した。
その後、リポフェクション法による導入方法を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを48時間から10日間処置した。PBSで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(終濃度1~50nM)をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないPBSをトランスフェクションした細胞を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞を培養培地中で37℃、5%COの条件で48時間または240時間培養した。その後、上記培養培地を除去し、Taqman Fast Cells-to-CT Kit(Thermo Fisher Scientific社製、Cat#4399003)を用いて、抽出した全RNAに対して逆転写反応を実施した。この逆転写反応から得られた相補的DNA(cDNA)を利用して、予め設計された特異的プライマー(下記参照)を用いてWRN遺伝子のエクソン25からエクソン29にわたるPCRを実施した。用いたPCRのプログラムは、以下の通りである。
<Evaluation of exon 27 skipping induction using Werner syndrome patient fibroblasts>
Next, induction of exon 27 skipping of the WRN gene was evaluated using fibroblasts from a Werner syndrome patient who is homozygous for c.3139-1G>C in the WRN gene. On the day before transfection, fibroblasts from a Werner syndrome patient (10,000 cells/well) were seeded onto a 96-well plate and cultured overnight at 37°C in 5% CO2 .
Thereafter, the cells were treated with antisense oligonucleotides for 48 hours to 10 days using the introduction method by the lipofection method. Each single-stranded antisense oligonucleotide (final concentration 1 to 50 nM) diluted with PBS was transfected into the above cells by the lipofection method. As a negative control group, cells transfected with PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide was not dissolved were used. The cells treated with the antisense oligonucleotides were cultured in culture medium at 37°C and 5% CO2 for 48 hours or 240 hours. Then, the culture medium was removed, and the extracted total RNA was subjected to reverse transcription reaction using Taqman Fast Cells-to-CT Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat#4399003). Using the complementary DNA (cDNA) obtained from this reverse transcription reaction, PCR was performed spanning exon 25 to exon 29 of the WRN gene using previously designed specific primers (see below). The PCR program used was as follows:

94℃、1分間:熱変性
[98℃、10秒間;60℃、5秒間;68℃、40秒間]×35サイクル:PCR増幅
94°C, 1 minute: heat denaturation [98°C, 10 seconds; 60°C, 5 seconds; 68°C, 40 seconds] x 35 cycles: PCR amplification

遺伝子特異的プライマーはWRN_Exon25_Fw及びWRN_Exon29_Rvを使用した。
WRN_Exon25_Fw:5’-CTGGCAAGGATCAAACAGAGAGTTG-3’
WRN_Exon29_Rv:5’-CAATCTGAGTCTCCTGCTCTTGTGC-3’
The gene-specific primers used were WRN_Exon25_Fw and WRN_Exon29_Rv.
WRN_Exon25_Fw: 5'-CTGGCAAGGATCAAACAGAGAGTTG-3'
WRN_Exon29_Rv: 5'-CAATCTGAGTCTCCTGCTCTTGTGTC-3'

上記PCR反応の反応物を3%アガロースゲール電気泳動として分離し、LEDトランスイルミネーターゲルみえーる(Wako社)とiPhone8(Apple社)を組み合わせた撮影システムにより、ゲル写真を撮影した。 The products of the PCR reaction were separated by 3% agarose gel electrophoresis, and gel photographs were taken using a photography system that combined an LED transilluminator Gel Mieru (Wako) and an iPhone 8 (Apple).

上述の方法で求められた、ヒトWRN mRNA前駆体に対する各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトWRN遺伝子のエクソン27のスキッピング活性測定の実験結果を図6に示す。ウェルナー症候群患者線維芽細胞においては、WRNcDNAのエクソン25からエクソン29の領域を増幅したところ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しなかったサンプル(図6中、「無添加」と表記)では352塩基対のバンドが得られた。この増幅産物の塩基配列をシークエンスにより決定したところ、このバンドがエクソン25、エクソン27、エクソン28、エクソン29からなることが示された。この結果は患者の遺伝子解析結果とよく一致していた。 Figure 6 shows the experimental results of measuring the skipping activity of exon 27 of the human WRN gene by each single-stranded antisense oligonucleotide against human WRN pre-mRNA, obtained by the method described above. When the region from exon 25 to exon 29 of WRN cDNA was amplified in fibroblasts from a patient with Werner's syndrome, a band of 352 base pairs was obtained in the sample to which no antisense oligonucleotide was introduced (indicated as "no addition" in Figure 6). The base sequence of this amplified product was determined by sequencing, and it was shown that this band consisted of exons 25, 27, 28, and 29. This result was in good agreement with the results of the patient's genetic analysis.

一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加したウェルナー症候群患者線維芽細胞のcDNAでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しない細胞から得られた産物より小さなサイズの産物(276塩基対)が得られた。この小さなサイズの増幅産物の塩基配列をシークエンスにより決定したところ、エクソン25の配列が直接エクソン28の配列につながっており、エクソン26とエクソン27の欠失が判明した。このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によりエクソン27がスキッピングしたことを示している。 On the other hand, in the cDNA of fibroblasts from Werner's syndrome patients to which antisense oligonucleotides had been added, a smaller product (276 base pairs) was obtained than that obtained from cells to which antisense oligonucleotides had not been introduced. When the base sequence of this small amplified product was determined by sequencing, it was found that the sequence of exon 25 was directly connected to the sequence of exon 28, and that exons 26 and 27 were deleted. This indicates that exon 27 was skipped by treatment with the antisense oligonucleotide.

ImageJ(米国NIH)により、エクソン27がスキップしたPCR産物「276bp、A」と、及びエクソン27がスキップしなかったPCR産物「352bp、B」を定量した。これら「A」と「B」の測定値を以下の計算式に従って、以下の式を用いてスキッピング効率(%)を求めた。その結果を表4-1A~4-1F、表4-2A~4-2D、表4-3A~4-3D、表4-4A~4-4D及び表4-5に示す。
スキッピング効率(%)=100×A/(A+B)
Using ImageJ (NIH, USA), the PCR product "276 bp, A" in which exon 27 was skipped and the PCR product "352 bp, B" in which exon 27 was not skipped were quantified. The measured values of "A" and "B" were used to calculate the skipping efficiency (%) according to the following formula. The results are shown in Tables 4-1A to 4-1F, Tables 4-2A to 4-2D, Tables 4-3A to 4-3D, Tables 4-4A to 4-4D, and Table 4-5.
Skipping efficiency (%) = 100 x A/(A+B)

Figure 2024079633000033
Figure 2024079633000033

Figure 2024079633000034
Figure 2024079633000034

Figure 2024079633000035
Figure 2024079633000035

Figure 2024079633000036
Figure 2024079633000036

Figure 2024079633000037
Figure 2024079633000037

Figure 2024079633000038
Figure 2024079633000038

Figure 2024079633000039
Figure 2024079633000039

Figure 2024079633000040
Figure 2024079633000040

Figure 2024079633000041
Figure 2024079633000041

Figure 2024079633000042
Figure 2024079633000042

Figure 2024079633000043
Figure 2024079633000043

Figure 2024079633000044
Figure 2024079633000044

Figure 2024079633000045
Figure 2024079633000045

Figure 2024079633000046
Figure 2024079633000046

Figure 2024079633000047
Figure 2024079633000047

Figure 2024079633000048
Figure 2024079633000048

Figure 2024079633000049
Figure 2024079633000049

Figure 2024079633000050
Figure 2024079633000050

Figure 2024079633000051
Figure 2024079633000051

<ウェルナー症候群患者線維芽細胞でのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる機能的なWRNタンパク質発現の誘導>
WRN遺伝子のc.3139-1G>Cのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、WRN遺伝子のエクソン27スキッピングによる機能的なWRNタンパク質発現の誘導評価を行った。評価の前日に、96穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞(10000 cells/well)を播種し、37℃、5%COの条件で一晩培養した。その後、PBSで希釈した配列番号28の塩基配列からなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(終濃度50nM)をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないPBSをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を培養培地中で37℃、5%COの条件で48時間培養した。その後、細胞を4%paraformaldehyde(富士フイルム和光純薬社製、Cat#163-20145)にて15分間で固定し、0.5%Triton-X(ナカライテスク社製、Cat#12967-45)で10分間インキュベートした。続いて、インキュベートした上記細胞を5%ヤギ血清を含有するPBSで1時間ブロッキングし、抗WRN抗体(Cell Signaling社製、Cat#4666)溶液中で一晩インキュベートした。さらに抗マウスIgG抗体(Thermo Fisher Scientific社製、A32766)溶液中で、上記細胞を1時間インキュベートした。最後にHoechst(登録商標)33342核酸染色(Thermo Fisher Scientific社製、Cat#H3570)溶液中で15分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。
Induction of functional WRN protein expression in Werner syndrome patient fibroblasts by antisense oligonucleotides
Using fibroblasts from Werner syndrome patients who are homozygous for c.3139-1G>C in the WRN gene, the induction of functional WRN protein expression by exon 27 skipping of the WRN gene was evaluated. On the day before the evaluation, fibroblasts from Werner syndrome patients (10,000 cells/well) were seeded in a 96-well plate and cultured overnight at 37°C and 5% CO2 . Then, single-stranded antisense oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO:28 diluted with PBS (final concentration 50 nM) was transfected into the above cells by lipofection. As a negative control group, cells transfected with PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide was not dissolved were used. The transfected cells were cultured in a culture medium at 37°C and 5% CO2 for 48 hours. The cells were then fixed with 4% paraformaldehyde (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Cat#163-20145) for 15 minutes and incubated with 0.5% Triton-X (Nacalai Tesque, Cat#12967-45) for 10 minutes. The incubated cells were then blocked with PBS containing 5% goat serum for 1 hour and incubated overnight in an anti-WRN antibody (Cell Signaling, Cat#4666). The cells were then further incubated in an anti-mouse IgG antibody (Thermo Fisher Scientific, A32766) solution for 1 hour. Finally, the sections were incubated in Hoechst (registered trademark) 33342 nucleic acid staining solution (Thermo Fisher Scientific, Cat#H3570) for 15 minutes and observed under a fluorescent microscope.

上述の方法で求められた、ヒトWRN mRNA前駆体に対する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによるWRN遺伝子のエクソン27のスキッピング活性による機能的なWRNタンパク質発現の誘導結果を図7に示す。図7より、配列番号28の塩基配列からなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞(図7における「ASO:No.28」)では上記機能的なWRNタンパク質が核内移行していることが分かった。 Figure 7 shows the results of induction of functional WRN protein expression by the skipping activity of exon 27 of the WRN gene using a single-stranded antisense oligonucleotide against human WRN pre-mRNA, as determined by the above-mentioned method. Figure 7 shows that the functional WRN protein was translocated into the nucleus in cells transfected with a single-stranded antisense oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO:28 ("ASO: No. 28" in Figure 7).

<ウェルナー症候群患者線維芽細胞でのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の促進>
ヒトWRN遺伝子のc.3139-1G>Cのホモ接合体であるウェルナー症候群患者線維芽細胞を用いて、WRN遺伝子のエクソン27スキッピングによる細胞増殖能の評価を行った。評価の前日に、96穴プレートにウェルナー症候群患者線維芽細胞(12000 cells/well)を播種し、37℃、5%COの条件で一晩培養した。その後、PBSで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(終濃度10nM)をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないPBSをトランスフェクションした細胞を用いた。トランスフェクションした細胞を培養培地中で37℃、5%COの条件で288時間培養した。その後、上記増殖培地にCelltiter-Glo 2.0 Assay(Promega社製、Cat#G9242)を添加して細胞数を測定した。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞の細胞数「A」と陰性対照群の細胞数「B」の測定値を以下の計算式に従って、以下の式を用いて細胞増殖率(%)を求めた。その結果を表5に示す。
細胞増殖率(%)=100×(A)/B
<Stimulation of cell proliferation by antisense oligonucleotides in fibroblasts from Werner syndrome patients>
We evaluated the cell proliferation ability by exon 27 skipping of the WRN gene using fibroblasts from Werner syndrome patients, which are homozygotes of c.3139-1G>C of the human WRN gene. On the day before the evaluation, fibroblasts from Werner syndrome patients (12,000 cells/well) were seeded on a 96-well plate and cultured overnight at 37°C and 5% CO2 . Then, each single-stranded antisense oligonucleotide (final concentration 10 nM) diluted with PBS was transfected into the above cells by lipofection. As a negative control group, cells transfected with PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide was not dissolved were used. The transfected cells were cultured in culture medium at 37°C and 5% CO2 for 288 hours. Then, Celltiter-Glo 2.0 Assay (Promega, Cat#G9242) was added to the above growth medium, and the cell count was measured. The cell proliferation rate (%) was calculated using the following formula from the measured cell counts "A" of the cells transfected with the single-stranded antisense oligonucleotide and "B" of the negative control group. The results are shown in Table 5.
Cell proliferation rate (%) = 100 x (A)/B

Figure 2024079633000052
Figure 2024079633000052

≪一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞毒性評価≫
ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2細胞を、増殖培地中、37℃、5%CO条件で培養した。増殖培地としては、以下の組成のものを用いた。
<Cytotoxicity evaluation of single-stranded antisense oligonucleotides>
HepG2 cells, a cell line derived from human hepatoma, were cultured in a growth medium at 37° C. and 5% CO 2. The growth medium used had the following composition.

細胞毒性評価に用いた増殖培地の組成
10% FBS:GIBCO社製、CAT#10270-106
Minimum Essential Medium (L-グルタミン、フェノールレッド含有) (GIBCO社製、CAT#11095-080)
Composition of growth medium used for cytotoxicity evaluation 10% FBS: GIBCO, CAT#10270-106
Minimum Essential Medium (containing L-glutamine and phenol red) (GIBCO, CAT#11095-080)

実験前日に96穴プレートに上記細胞(1.5×10 cells/well)を播種した。播種した細胞を37℃、5%COの条件で一晩培養した後、その後、PBSで希釈した各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド(終濃度3~30nM)をリポフェクション法にて、上述の細胞にトランスフェクションした。添加後、37℃、5%COの条件で24時間上記細胞を培養した。陰性対照群としては、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが溶解していないPBSをトランスフェクションした細胞を用いた。その後、上記増殖培地に、Caspase-Glo 3/7 Assay System(Promega社製、Cat#G8093)を添加してカスパーゼ活性を評価した。上述の方法で求められた、各一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるカスパーゼ活性を表6に示す。 The above cells (1.5×10 4 cells/well) were seeded on a 96-well plate the day before the experiment. The seeded cells were cultured overnight at 37° C. and 5% CO 2 , and then each single-stranded antisense oligonucleotide (final concentration 3-30 nM) diluted with PBS was transfected into the above cells by lipofection. After addition, the above cells were cultured for 24 hours at 37° C. and 5% CO 2. As a negative control group, cells transfected with PBS in which the single-stranded antisense oligonucleotide was not dissolved were used. Then, Caspase-Glo 3/7 Assay System (Promega, Cat# G8093) was added to the above growth medium to evaluate caspase activity. Table 6 shows the caspase activity in each single-stranded antisense oligonucleotide determined by the above method.

Figure 2024079633000053
Figure 2024079633000053

以上のように本発明の実施形態及び実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態及び各実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。 Although the embodiments and examples of the present invention have been described above, it is also planned from the beginning to combine the configurations of the above-mentioned embodiments and examples as appropriate.

今回開示された実施の形態及び実施例はすべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した実施の形態及び実施例ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味、及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。 The embodiments and examples disclosed herein are illustrative in all respects and should not be considered limiting. The scope of the present invention is indicated by the claims rather than the embodiments and examples described above, and is intended to include all modifications within the scope of the claims and meanings equivalent thereto.

Claims (29)

ヒトWRN遺伝子の第26番又は第28番エクソンのスキップ変異に対して、機能的なヒトWRNタンパク質を発現するオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
前記オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドがリン酸基及び/又は修飾リン酸基で結合されており、
前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾糖を有する修飾核酸、を含み、
前記オリゴヌクレオチドの塩基長は、10~30merであり、
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
前記標的領域において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して、相補的な塩基配列、又は、
前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、である、オリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
A pharmaceutical composition comprising an oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, which expresses a functional human WRN protein in response to a skipping mutation in exon 26 or 28 of the human WRN gene,
the oligonucleotide has each nucleotide linked by a phosphate group and/or a modified phosphate group;
the oligonucleotide comprises a modified nucleic acid having at least one modified sugar;
The oligonucleotide has a base length of 10 to 30 mer,
The base sequence of the oligonucleotide is
A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the oligonucleotide in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6;
A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region, or
A pharmaceutical comprising an oligonucleotide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, the oligonucleotide having a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the target region.
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、95%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
The base sequence of the oligonucleotide is
A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to claim 1 or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, the oligonucleotide having a sequence identity of 95% or more and 100% or less based on a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the oligonucleotide in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6.
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
The base sequence of the oligonucleotide is
A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to claim 1 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, which is a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the oligonucleotide in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6.
前記オリゴヌクレオチドの塩基長は、15~25merである、請求項1~請求項3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 A pharmaceutical comprising the oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 3, wherein the oligonucleotide has a base length of 15 to 25 mer. 前記オリゴヌクレオチドを構成する糖がD-リボフラノースであり、糖の修飾が前記D-リボフラノースの2’位の水酸基の糖修飾である、請求項1~請求項4のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 4, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, wherein the sugar constituting the oligonucleotide is D-ribofuranose, and the sugar modification is a sugar modification of the hydroxyl group at the 2' position of the D-ribofuranose. 前記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式(A1)で表される基である、請求項1~請求項5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
Figure 2024079633000054

(式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Xはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Yは、それぞれ、独立して、水素原子、水酸基、フッ素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルコキシ基、又は置換されていてもよいアミノ基であり、Zは、それぞれ、独立して、水素原子であるか、炭素-酸素二重結合若しくは環状構造を有していてもよい炭素数1~5のアルキル基であるか、又は前記アルキル基の一部の炭素原子とYとが一緒になって環を形成する。)
A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 5, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, wherein a sugar modification constituting the oligonucleotide is a group represented by the following formula (A1):
Figure 2024079633000054

(In the formula, Bx is a nucleic acid base, each independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil; X is a phosphate bond, each independently a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoamidate bond, a boranophosphate bond, or an alkylphosphonate bond; Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a fluorine atom, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted, or an amino group which may be substituted; Z is each independently a hydrogen atom, a carbon-oxygen double bond, or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which may have a cyclic structure, or a carbon atom of the alkyl group and Y together form a ring.)
前記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が下記の式(A2)又は式(A3)で表される基である、請求項1~請求項6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
Figure 2024079633000055

(式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、Xはリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合又はアルキルホスホナート結合であり、Rは、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルキル基であり、Y’は、酸素原子又は置換されていてもよい窒素原子であり、R及びRは、それぞれ、独立して、水素原子、置換されていてもよい炭素数1~6のアルキル基、又は、R及びRが一緒になってカルボニル基又は環を形成しており、nは、0又は1である。)
A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 6, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, wherein a sugar modification constituting the oligonucleotide is a group represented by the following formula (A2) or formula (A3):
Figure 2024079633000055

(In the formula, Bx is a nucleic acid base, each independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil; X is a phosphate bond, each independently a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoamidate bond, a boranophosphate bond, or an alkylphosphonate bond; R 4 is each independently a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; Y' is an oxygen atom or an optionally substituted nitrogen atom; R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or R 5 and R 6 together form a carbonyl group or a ring; and n is 0 or 1.)
前記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が前記式(A2)で表される基であり、前記Rは、それぞれ、独立して、メチル基、メトキシエチル基、又はN-メチルプロパンアミド基である、請求項7に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 The oligonucleotide according to claim 7, wherein the sugar modification constituting the oligonucleotide is a group represented by formula (A2), and each of the R4s is independently a methyl group, a methoxyethyl group, or an N-methylpropanamide group. 前記オリゴヌクレオチドを構成する糖の修飾が前記式(A3)で表される基であり、前記Y’は、酸素原子、又は水素原子、メチル基、メトキシエチル基、若しくはN-メチルプロパンアミド基で置換されていてもよい窒素原子であり、前記R及びRは、それぞれ、独立して、水素原子、炭素数1~2のアルキル基、又は前記R及びRが一緒になってカルボニル基又は炭素数3~6の環を形成しており、nは、0又は1である、請求項7に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 8. The pharmaceutical composition according to claim 7, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, wherein the sugar modification constituting the oligonucleotide is a group represented by formula (A3), Y' is an oxygen atom, or a nitrogen atom which may be substituted with a hydrogen atom, a methyl group, a methoxyethyl group, or an N-methylpropanamide group, R5 and R6 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, or R5 and R6 together form a carbonyl group or a ring having 3 to 6 carbon atoms, and n is 0 or 1. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項1~請求項9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 9 or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, wherein at least one internucleotide bond of the oligonucleotide is a phosphorothioate bond. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合である、請求項1~請求項10のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 10 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, wherein at least one internucleotide bond of the oligonucleotide is a phosphodiester bond. 前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合である、請求項1~請求項9のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 9 or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, wherein the internucleotide bond of the oligonucleotide is a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond. 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
前記オリゴヌクレオチドが下記の式(A4)で表されるモルフォリノ核酸で構成され、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に記載の塩基配列における、前記オリゴヌクレオチドと同じ塩基長で構成された少なくとも1つの標的領域に対して相補的な塩基配列を持つモルフォリノオリゴ核酸である、請求項1~4のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
Figure 2024079633000056

(式中、Bxは核酸塩基であり、それぞれ、独立して、アデニン、グアニン、シトシン、5-メチルシトシン、チミン又はウラシルで表される基であり、X’はリン酸結合であり、それぞれ、独立して、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である。)
The base sequence of the oligonucleotide is
The oligonucleotide is a morpholino oligonucleotide having a base sequence complementary to at least one target region having the same base length as the oligonucleotide in a base sequence shown in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, or SEQ ID NO:6. A medicine comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 4, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof.
Figure 2024079633000056

(In the formula, Bx is a nucleic acid base, each of which is independently a group represented by adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, or uracil, and X' is a phosphate bond, each of which is independently a phosphorodiamidate bond, a phosphorodiamidethioate bond, or a phosphorodiamidedithioate bond.)
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、
配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~40番、46番、51番、56番、若しくは62番~63番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108873番、108878番~108917番、108923番、108928番、108933番、若しくは108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列、
前記標的領域において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は、
前記標的領域を有するオリゴヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である、請求項1~請求項13のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
The base sequence of the oligonucleotide is
A base sequence having a sequence identity of 90% to 100% based on a base sequence complementary to a target region consisting of a continuous 15-25 mer consisting of bases located at positions 1 to 40, 46, 51, 56, or 62 to 63 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of a continuous 15-25 mer consisting of bases located at positions 108873, 108878 to 108917, 108923, 108928, 108933, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
A base sequence complementary to a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the target region, or
A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 13, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, which has a base sequence that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide having the target region.
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番~32番、34番~40番、46番、51番、若しくは62番~63番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108878番~108909番、108911番~108917番、108923番、108928番、若しくは108939番~108940番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項1~請求項14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 The oligonucleotide has a base sequence having 90% to 100% sequence identity based on a base sequence complementary to a target region consisting of 15 to 25 mers consisting of consecutive bases located at positions 1 to 32, 34 to 40, 46, 51, or 62 to 63 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or a target region consisting of 15 to 25 mers consisting of consecutive bases located at positions 108878 to 108909, 108911 to 108917, 108923, 108928, or 108939 to 108940 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2. The pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 14 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof. 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端から数えて1番、3番、5番~12番、14番~19番、21番、25番、29番、30番、31番、34番、46番、若しくは51番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域、又は配列番号2に記載の塩基配列において、5’末端から数えて108878番、108880番、108882番~108889番、108891番~108896番、108898番、108902番、108906番~108908番、108911番、108923番、若しくは108928番に位置する塩基から連続した15~25merで構成された標的領域に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である、請求項1~請求項15のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 The base sequence of the oligonucleotide is a target region consisting of a continuous 15-25mer consisting of bases located at positions 1, 3, 5 to 12, 14 to 19, 21, 25, 29, 30, 31, 34, 46, or 51 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 1, or 108878, 108880, 108882 to 108889, 108891, or 108892 from the 5' end in the base sequence described in SEQ ID NO: 2. A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 15, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, which is a base sequence having 90% to 100% sequence identity based on a base sequence complementary to a target region composed of a continuous 15-25 mer from bases located at positions 108896 to 108898, 108902, 108906 to 108908, 108911, 108923, or 108928. 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号9~14、16~26、28~39、41~42、44~50、52、55~56、69、73、80~105、107~108、110、112、114、116、118~131、133、及び135の塩基配列からなる群より選ばれる1つの塩基配列である、請求項1~請求項16のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 The oligonucleotide has a base sequence selected from the group consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 9-14, 16-26, 28-39, 41-42, 44-50, 52, 55-56, 69, 73, 80-105, 107-108, 110, 112, 114, 116, 118-131, 133, and 135. The oligonucleotide or its pharma- ceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 16, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof. 前記オリゴヌクレオチドは、表2-1から表2-7に示す配列名6-20-A、8-20-A、8-20-B、8-20-C、9-20-A、10-20-A、12-20-A、14-20-A、16-20-A、17-20-A、18-20-A、19-20-A、15-25-A、10-17-A、10-20-B、12-20-B、14-20-B、15-20-B、16-20-B、19-20-B、31-20-B、34-20-B、6-20-B、7-20-B、8-20-D、及び9-20-Bからなる群より選ばれる1つのオリゴヌクレオチドである、請求項1~請求項17のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 The oligonucleotide is an oligonucleotide selected from the group consisting of sequence names 6-20-A, 8-20-A, 8-20-B, 8-20-C, 9-20-A, 10-20-A, 12-20-A, 14-20-A, 16-20-A, 17-20-A, 18-20-A, 19-20-A, 15-25-A, 10-17-A, 10-20-B, 12-20-B, 14-20-B, 15-20-B, 16-20-B, 19-20-B, 31-20-B, 34-20-B, 6-20-B, 7-20-B, 8-20-D, and 9-20-B shown in Tables 2-1 to 2-7. The pharmaceutical composition comprises the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 17, or a pharma- ceutical acceptable salt thereof. 前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1~請求項18のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 The oligonucleotide is a single-stranded antisense oligonucleotide, comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 18 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof. 請求項19に記載のオリゴヌクレオチドと、
前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしている第二鎖オリゴヌクレオチドと、を含む二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
前記第二鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列は、前記一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を基準として、90%以上100%以下の配列同一性を有する塩基配列である、二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
An oligonucleotide according to claim 19;
and a second strand oligonucleotide hybridized to the single strand antisense oligonucleotide,
A pharmaceutical comprising a double-stranded antisense oligonucleotide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, wherein the base sequence of the second strand oligonucleotide has a sequence identity of 90% or more and 100% or less based on a base sequence complementary to the base sequence of the single-stranded antisense oligonucleotide.
請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬と、
前記オリゴヌクレオチド又は前記第二鎖オリゴヌクレオチドに、直接又はリンカー結合を介して結合している付加物質と、を有する、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬であって、
前記付加物質は、ポリエチレングリコール、ペプチド、アルキル鎖、リガンド化合物、抗体、タンパク質、及び糖鎖からなる群より選ばれ、
前記リンカー結合は、それぞれ、独立してホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホアミダート結合、ボラノホスフェート結合、アルキルホスホナート結合、ホスホロジアミダート結合、ホスホロジアミドチオアート結合、又はホスホロジアミドジチオアート結合である、オリゴヌクレオチド複合体又はその製薬学的に許容される塩からなる医薬。
A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof;
and an additional substance bound to the oligonucleotide or the second strand oligonucleotide directly or via a linker bond,
the additional substance is selected from the group consisting of polyethylene glycol, a peptide, an alkyl chain, a ligand compound, an antibody, a protein, and a sugar chain;
A pharmaceutical comprising an oligonucleotide conjugate or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, wherein each of the linker bonds is independently a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, a phosphoamidate bond, a boranophosphate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphorodiamidate bond, a phosphorodiamidethioate bond, or a phosphorodiamidedithioate bond.
請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項21に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む医薬品。 A pharmaceutical comprising, as an active ingredient, a pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex according to claim 21 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof. 請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項21に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ヒトWRN遺伝子の第27番目エクソンのスキッピング剤。 A skipping agent for the 27th exon of the human WRN gene, comprising as an active ingredient a pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex according to claim 21 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof. 請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項21に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ヒトWRN遺伝子の第27番目のエクソンのスキッピングによる核移行シグナルを保有する機能的WRN回復剤。 A functional WRN restorer that possesses a nuclear localization signal resulting from skipping of the 27th exon of the human WRN gene, comprising as an active ingredient a pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex according to claim 21 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof. 請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項21に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ウェルナー症候群に対する治療剤。 A therapeutic agent for Werner's syndrome, comprising as an active ingredient a pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex according to claim 21 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof. 請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項21に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を有効成分として含む、ウェルナー症候群に対する予防剤。 A preventive agent for Werner's syndrome, comprising as an active ingredient a pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a pharmaceutical comprising the double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex according to claim 21 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof. 請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項21に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬を個体に投与することを含む、ウェルナー症候群の治療方法又は予防方法。 A method for treating or preventing Werner's syndrome, comprising administering to an individual a pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical comprising a double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a pharmaceutical comprising the oligonucleotide complex according to claim 21 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof. ウェルナー症候群の治療又は予防に使用するための、請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項21に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 A medicine comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, the double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or the oligonucleotide complex according to claim 21 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, for use in the treatment or prevention of Werner's syndrome. ウェルナー症候群の治療剤又は予防剤を製造するために使用する、請求項1~19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、請求項20に記載の二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬、又は請求項21に記載のオリゴヌクレオチド複合体若しくはその製薬学的に許容される塩からなる医薬。 A pharmaceutical comprising the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 19 or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, the double-stranded antisense oligonucleotide according to claim 20 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or the oligonucleotide complex according to claim 21 or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, for use in producing a therapeutic or prophylactic agent for Werner's syndrome.
JP2023201238A 2022-11-30 2023-11-29 Medical drug that consists of antisense nucleic acid Pending JP2024079633A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022191137 2022-11-30
JP2022191137 2022-11-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024079633A true JP2024079633A (en) 2024-06-11

Family

ID=91391113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023201238A Pending JP2024079633A (en) 2022-11-30 2023-11-29 Medical drug that consists of antisense nucleic acid

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2024079633A (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6867621B1 (en) Antisense nucleic acid
JP7416852B2 (en) Antisense oligonucleotides for regulating HTRA1 expression
JP6208349B2 (en) Antisense nucleic acid
KR102473431B1 (en) Antisense nucleic acids
JP2006507809A (en) Antisense modulation of VEGF co-regulated chemokine-1 expression
US20220042022A1 (en) Antisense oligonucleotides for modulating htra1 expression
CN115397436A (en) RNAi agents for inhibiting PNPLA3 expression, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
JP2024059839A (en) Compound and method for modulating smn2
EP4112083A1 (en) Antisense nucleic acid inducing skipping of exon 51
EP4083208A1 (en) Antisense nucleic acid that induces skipping of exon 50
JP2024079633A (en) Medical drug that consists of antisense nucleic acid
WO2019177061A1 (en) Nucleic acid complex
EP3947677A1 (en) Oligonucleotides for modulating atxn2 expression
EP4252846A1 (en) Regulator for expression and/or function of rps25 gene
WO2022250155A1 (en) Antisense nucleic acid
WO2021187540A1 (en) Regulator of expression and/or function of scn1a gene
EP4067489A1 (en) Method for reducing toxicity of antisense nucleic acids
TW202405171A (en) Angiotensinogen-modulating compositions and methods of use thereof
WO2019038228A1 (en) Oligonucleotides for modulating tom1 expression
NZ749395A (en) Antisense oligonucleotides for modulating htra1 expression