JP2023528445A - 変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物および製品を作製するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ＥＲＦ遺伝子のグループに遺伝子改変を有するタバコを提供する。変化したレベルの総アルカロイドおよびニコチンと商業的に許容される葉のグレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介したその開発、ならびにこれらのタバコ植物からのタバコ製品の作製もまた提供される。ニコチンレベルを低減するために新規の突然変異またはアレルを有するタバコ植物を産生するための組成物および方法がさらに提供される。タバコ葉のグレードおよびタバコ製品の品質を維持しながら、低減したニコチンまたはアルカロイドを有するタバコを育種するための、配列多型および分子マーカーがさらに提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月３日に出願された米国仮出願第６３／０３４，０６１号の恩典を主張し、この仮出願は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年６月３日に出願された米国仮出願第６３／０３４，０６１号の恩典を主張し、この仮出願は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の組込み
２，７８０，４３５バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）の２０２１年６月２日に作成された「Ｐ３４８１３ＷＯ００＿ＳＬ．ＴＸＴ」という名称のファイルに含有される配列表が本明細書と共に電子的に提出され、参照することによりその全体が組み込まれる。
２，７８０，４３５バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）の２０２１年６月２日に作成された「Ｐ３４８１３ＷＯ００＿ＳＬ．ＴＸＴ」という名称のファイルに含有される配列表が本明細書と共に電子的に提出され、参照することによりその全体が組み込まれる。
分野
本開示は、低アルカロイド関連染色体欠失領域（ＬＡ関連領域）、タバコＮｉｃ１ｂ遺伝子座、およびその領域または遺伝子座の中または周囲にある遺伝子を提供する。変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルならびに商業的に許容される葉のグレードを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介したその開発、ならびにこれらのタバコ植物からのタバコ製品の作製もまた提供される。
本開示は、低アルカロイド関連染色体欠失領域（ＬＡ関連領域）、タバコＮｉｃ１ｂ遺伝子座、およびその領域または遺伝子座の中または周囲にある遺伝子を提供する。変化した総アルカロイドおよびニコチンレベルならびに商業的に許容される葉のグレードを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介したその開発、ならびにこれらのタバコ植物からのタバコ製品の作製もまた提供される。
背景
ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンの４つの主要なアルカロイドがタバコ中に見出される。ニコチンは最も多数を占めるアルカロイドであり、通常、商用のタバコ栽培品種において総アルカロイドの９０％より多くを占める。ニコチン生合成は主にタバコの根において起こる。次に、タバコ植物は維管束を通じてニコチンを葉に輸送し、次に、ニコチンは葉の液胞中に貯蔵される。
ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンの４つの主要なアルカロイドがタバコ中に見出される。ニコチンは最も多数を占めるアルカロイドであり、通常、商用のタバコ栽培品種において総アルカロイドの９０％より多くを占める。ニコチン生合成は主にタバコの根において起こる。次に、タバコ植物は維管束を通じてニコチンを葉に輸送し、次に、ニコチンは葉の液胞中に貯蔵される。
遺伝子型、環境、受精、および耕種学的実施を含む様々な要因がタバコアルカロイドレベルに影響する（例えば、ニコチン産生は、摘心、傷付け、および草食動物による損傷により刺激される）。キューバシガータバコ品種の株において最初に見出された低アルカロイド形質は一連の戻し交雑を通じてシガレット品種に導入された。その後に、低アルカロイドのタバコ生殖質は栽培品種Ｂｕｒｌｅｙ ２１の遺伝的背景に登録された（Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０：２１２（１９７０）（非特許文献１））。低アルカロイドＢｕｒｌｅｙ ２１（ＬＡ ＢＵ２１）株を使用した遺伝学的研究から、２つの非連鎖の遺伝子座がタバコ葉におけるニコチンレベルに寄与することが分かった。これらの２つの遺伝子座はＮｉｃ１およびＮｉｃ２と称される。ＬＡ ＢＵ２１においてｎｉｃ１およびｎｉｃ２（それぞれｎｉｃｏｔｉｎｅ１およびｎｉｃｏｔｉｎｅ２と同じ）突然変異はセミドミナントである。これらはニコチンレベルに対して用量依存的な効果を示し、ｎｉｃ１の効果はｎｉｃ２の効果より約２．４倍強い。Ｎｉｃ２遺伝子座の分子的特徴付けが報告されている。ｎｉｃ２突然変異は、エチレン応答性因子（ＥＲＦ）ファミリーからの転写因子遺伝子、例えば、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８のクラスターの欠失を含有することが示された（Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０）（非特許文献２））。
タバコ中の総アルカロイド含有量の低減は多くの利益を有し得る。総アルカロイド含有量の低減はバイオマス資源としてのタバコの価値を増加させ得る。タバコ植物中のニコチンアルカロイドの増加は昆虫および草食動物からの植物の保護において重要な役割を果たし得る。
昆虫からの防御におけるアルカロイドの役割と合致して、ＬＡ ＢＵ２１は昆虫による損傷に対して極めて高い感受性をもつことが報告された（Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０：２１２（１９７０）（非特許文献１））。総アルカロイドパーセント（約０．２０％）が低い熱風乾燥タバコの同質遺伝子株をその「正常」な反復親（総アルカロイド１．８５～２．７０％）と比較したさらなる研究では、低アルカロイド株における収率、グレード指数、総Ｎ、および還元糖含有量は正常な熱風乾燥栽培品種より低いことが報告された（Ｃｈａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｅｅｋｓ，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６（３）：４１６－１８（１９７６）（非特許文献３））。
タバコニコチンレベルを調節する遺伝子を同定すること、ならびにタバコ葉の品質を（優れたものとしないにしても）維持しながら、変化したニコチンレベル（例えば、低減したニコチン）を含有するタバコ植物および製品を開発することが必要とされている。
Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０：２１２（１９７０）
Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０）
Ｃｈａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｅｅｋｓ，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６（３）：４１６－１８（１９７６）
概要
一局面では、本開示は、遺伝子中にあり、かつ前記遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む改変タバコ植物またはその一部であって、前記遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列をコードする、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
一局面では、本開示は、遺伝子中にあり、かつ前記遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む改変タバコ植物またはその一部であって、前記遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列をコードする、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
一局面では、本開示は、遺伝子を標的とし、前記遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む改変タバコ植物またはその一部であって、前記遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列をコードする、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
別の局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド中に非自然突然変異を含む、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
一局面では、本開示は、非コードＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸構築物を含む改変タバコ植物またはその一部であって、非コードＲＮＡ分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、および ２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するｍＲＮＡに結合することができる、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
別の局面では、本開示は、遺伝子中にあり、かつ前記遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む改変タバコ植物またはその一部であって、前記遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
一局面では、本開示は、遺伝子を標的とし、前記遺伝子の発現または活性を下方制御する遺伝子改変を含む改変タバコ植物またはその一部であって、前記遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中に非自然突然変異を含む、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
別の局面では、本開示は、非コードＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターを含む組換え核酸構築物を含む改変タバコ植物またはその一部であって、非コードＲＮＡ分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができ、非コードＲＮＡ分子が前記ポリペプチドの発現を抑制する、改変タバコ植物またはその一部を提供する。
一局面では、本開示は、本明細書に記載のタバコ植物の集団、本明細書に記載のタバコ植物からの乾燥タバコ材料、ならびに乾燥タバコ材料から作製された再構成タバコ、タバコブレンド物、およびタバコ製品を提供する。
別の局面では、本開示は、低アルカロイドタバコ植物を産生するための方法であって、（ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および ２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列、または（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現または活性を下方制御する工程と、（ｂ）タバコ植物から葉または種子を収穫する工程を含む、方法を提供する。
配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、ＴＮ９０×ＬＡ ＢＵ２１交雑から同定されたＬＡ関連領域の配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、ＴＮ９０×ＬＡ ＢＵ２１交雑から同定されたＬＡ関連領域の配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はＮｉｃ１ｂ領域（ＬＡ関連領域を含む）の配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７は、Ｎｉｃ１ｂ領域中の３５の注釈付き遺伝子（ＮＣＧ）のゲノムコード配列（典型的にはＡＴＧから開始して終止コドンで終了するが、一部の事例では非翻訳領域（ＵＴＲ）配列も含有するｇＤＮＡ）を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８～７２は、Ｎｉｃ１ｂ領域中の３５の注釈付き遺伝子（ＮＣＧ）のｃＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～１０７は、Ｎｉｃ１ｂ領域中の３５の注釈付き遺伝子（ＮＣＧ）によりコードされるアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８～１１９は、選択されたＮＣＧ遺伝子を抑制するための例示的な成熟人工ｍｉＲＮＡ配列（センスまたはアンチセンス）を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０～１２４は、選択されたＮＣＧ遺伝子を編集するための例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５は、Ｎｉｃ１ｂ領域にまたがるか、またはこれに隣接する２１のＳＮＰマーカー配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６～１４８は、それぞれ、遺伝子座ｇ３１４３２のゲノムコード配列、ｃＤＮＡ配列、およびアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９～１５１は、それぞれ、遺伝子座ｇ３１４４６のゲノムコード配列、ｃＤＮＡ配列、およびアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２～１５６は、Ｎｉｃ１ｂ領域からの複数のタンパク質コード遺伝子のゲノムコード配列および非非コードＲＮＡを示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７～１６１は、対応するｃＤＮＡ配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２～１８３は、対応するタンパク質または非コードＲＮＡ分子配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４～１８６は、正常アルカロイドタバコ株と低減アルカロイドタバコ株との間で発現差異を示す複数の転写因子遺伝子のゲノムコード配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７～１８９は、対応するｃＤＮＡ配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０～１９２は、対応するタンパク質または非コードＲＮＡ分子配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３～２０１は、複数のＥＲＦ遺伝子のすぐ隣にあるか、またはＮｉｃ１ｂ領域からの非コードＲＮＡをコードする遺伝子内にあるＳＮＰマーカー配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２および２０３は、Ｎｉｃ１ｂ領域と関連付けられる２つのＥＲＦ遺伝子のゲノムコード配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４および２０５は、対応するｃＤＮＡ配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６および２０７は、対応するタンパク質配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８～２１４は、７つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子のゲノムコード配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５～２２１は、対応するｃＤＮＡ配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２～２２８は、対応するタンパク質配列を示す。
様々な配列が、ヌクレオチド配列中に「Ｎ」またはアミノ酸配列中に「Ｘ」を含む。「Ｎ」は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃでもよく、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入でもよい。場合によっては、一列に並んだ「Ｎ」が示される。「Ｎ」の数は、その位置における未決定のヌクレオチドの実際の数と必ず相関するとは限らない。実際のヌクレオチド配列は「Ｎ」の示されるセグメントより長くなるか、または短くなる場合がある。同様に、「Ｘ」は任意のアミノ酸残基でもよく、１つもしくはそれ以上のアミノ酸の欠失もしくは挿入でもよい。この場合も、「Ｘ」の数は、その位置における未決定のアミノ酸の実際の数と必ず相関するとは限らない。実際のアミノ酸配列は、「Ｘ」の示されるセグメントよりより長くなるか、または短くなる場合がある。
詳細な説明
特に定義のない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識する。実際、本開示は、記載される方法および材料に何ら限定されない。本開示の目的のために、以下の用語を以下において定義する。
特に定義のない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識する。実際、本開示は、記載される方法および材料に何ら限定されない。本開示の目的のために、以下の用語を以下において定義する。
例えば、全ての特許および刊行物を含めて、本明細書において引用されるあらゆる参考文献が、参照することによりその全体が組み込まれる。
本明細書において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しなければ、複数への言及を含む。例えば、「１つの化合物」（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含めて、複数の化合物を含んでもよい。
「約」という用語は、おおよそ、大まかに、その領域の周囲、またはその領域の中にあることを意味するために本明細書において使用される。「約」という用語が数値範囲と一緒に使用される場合、示される数値の上および下に境界を広げることによりその範囲を修飾する。
本明細書において使用される場合、「Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座」は、Ｎｉｃ１ｂ領域内にあるか、またはＮｉｃ１ｂ領域に密接に関連する任意の染色体の位置または場所を指す。「Ｎｉｃ１ｂ領域」は、ＴＮ９０ゲノムに由来するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に対応し、かつ低アルカロイド形質と関連付けられるアレルを有する約１５０万ｂｐ長の染色体セグメントを指す。「ｎｉｃ１ｂ突然変異」はＮｉｃ１ｂ遺伝子座中の突然変異を指す。
本明細書において使用される場合、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ（または複数形Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ）は、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座にあるか、またはその近くにあるＥＲＦ遺伝子または遺伝子座のいずれか１つを指し、例えば、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２を含む。表１１およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。「ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異」はＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子中の突然変異を指す。本明細書において使用される場合、突然変異または突然変異アレルは全て小文字およびイタリック体で示される。遺伝子、遺伝子座、またはタンパク質の名称は全て大文字で、または大文字から開始して示され、イタリック体でもよく、イタリック体でなくてもよい。
本明細書において使用される場合、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ（または複数形Ｎｉｃ２＿ＥＲＦｓ）は、Ｎｉｃ２遺伝子座にあるか、またはその近くにあるＥＲＦ遺伝子または遺伝子座のいずれか１つを指し、例えば、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ１６８、ＥＲＦ１７、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１８９を含む。表１２；Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０）；および Ｋａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。
本明細書において使用される場合、突然変異は、遺伝子によりコードされる産物の発現または活性を変化させるために遺伝子に導入される遺伝性の遺伝子改変を指す。このような改変は、遺伝子の任意の配列領域中、例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、３’ＵＴＲ、またはターミネーター領域中にあってもよい。一局面では、突然変異は遺伝子産物の発現または活性を低減、阻害、または排除する。別の局面では、突然変異は遺伝子産物の発現または活性を増加、上昇、強化、または増大させる。一局面では、突然変異は、特定のタバコ品種または栽培品種中に存在する天然の多型ではない。本明細書において使用される場合、「突然変異アレル」は、遺伝子座からのアレルであって、アレルが突然変異を含むものを指す。本明細書において使用される場合、「突然変異誘発性」は、導入遺伝子を伴うことなく、または突然変異関連の導入遺伝子が最終的な突然変異体中に残留することなく、突然変異を生じることを指す。一局面では、突然変異誘発性はシスジェニックである。別の局面では、突然変異誘発性は遺伝子またはゲノム編集を介する。さらなる局面では、突然変異誘発性は、ランダム突然変異誘発、例えば、化学的（例えば、ＥＭＳ）または物理的（ｒ照射）突然変異誘発を介する。
一局面では、突然変異は「非自然」または「非天然」突然変異である。本明細書において使用される場合、「非自然」または「非天然」突然変異は、ヒトの介入を介して生じた非自然発生突然変異を指し、ヒトの介入なしに生じた自然発生突然変異に対応しない。ヒトの介入の非限定的な例には、突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発、電離放射線突然変異誘発）および標的とされた遺伝子改変（例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの方法、ＴＡＬＥＮベースの方法、ジンクフィンガーベースの方法）が含まれる。非自然突然変異および非天然突然変異は、天然に生じた（例えば、植物の生殖細胞系列内で異常なＤＮＡ複製を介して生じた）自然発生突然変異を含まない。
突然変異を同定する時に、参照ＤＮＡ配列は同じタバコ品種に由来しなければならないと理解される。例えば、突然変異を含む改変タバコ植物が品種ＴＮ９０に由来するのであれば、内因性参照配列は内因性ＴＮ９０配列でなければならず、異なるタバコ品種（例えば、Ｋ３２６）に由来する相同配列であってはならない。同様に、突然変異を含む改変タバコ細胞がＴＮ９０細胞であれば、内因性参照配列は内因性ＴＮ９０配列でなければならず、異なるタバコ品種（例えば、Ｋ３２６）に由来するタバコ細胞に由来する相同配列であってはならない。
一局面では、本明細書において提供される突然変異によって変異遺伝子座のドミナントアレルが作り出される。ドミナントアレルは、同じ遺伝子座にある第２のアレルの寄与を隠すアレルである。ドミナントアレルは「ドミナントネガティブアレル」でもよく、「ドミナントポジティブアレル」でもよい。ドミナントネガティブアレル、すなわちアンチモルフは正常アレル機能とは対立するように働くアレルである。ドミナントネガティブアレルは典型的には正常に機能せず、野生型タンパク質の活性を（例えば、二量体化によって）直接阻害するか、または野生型タンパク質の正常機能に必要な第２のタンパク質（例えば、アクチベーターもしくは経路の下流成分）の活性を阻害する。例えば、ドミナントネガティブアレルは、ヘテロ接合状態またはホモ接合状態でアレルの正常機能を抑制または低減する。ドミナントポジティブアレルは正常な遺伝子機能を増大することができる（例えば、ハイパーモルフ）、または遺伝子に新たな機能を提供することができる（例えば、ネオモルフ）。セミドミナントアレルは、アレルがヘテロ接合性の個体における連鎖性表現型の浸透度が、アレルがホモ接合性の個体において観察されるものより小さい時に生じる。
一局面では、本明細書において提供される突然変異によって変異遺伝子座のドミナントネガティブアレルが作り出される。別の局面では、本明細書において提供される突然変異によって変異遺伝子座のドミナントポジティブアレルが作り出される。
本明細書において使用される場合、突然変異を「誘導する工程」とは、ヒトの介入によってポリヌクレオチド配列中に突然変異を生じさせる工程を指す。タバコに突然変異を誘導するための多くの適切な方法が当技術分野において公知である。このような方法の非限定的な例には、化学変異原の使用、放射線の使用、およびヌクレアーゼの使用が含まれる。一局面では、突然変異を誘導する工程は、化学変異原、照射、トランスポゾン、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびヌクレアーゼからなる群より選択される作用物質の使用を含む。
一局面では、突然変異を誘導する工程は化学変異原の使用を含む。一局面では、化学変異原はメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を含む。
別の局面では、突然変異を誘導する工程は照射の使用を含む。一局面では、照射はγ線、Ｘ線、または電離放射線を含む。別の局面では、照射は高速中性子の使用を含む。
一局面では、突然変異を誘導する工程はトランスポゾンの使用を含む。別の局面では、突然変異を誘導する工程はアグロバクテリウムの使用を含む。
さらなる局面では、突然変異を誘導する工程はヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹヌクレアーゼ、およびＣｓｍ１ヌクレアーゼからなる群より選択される。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣｓｍ１ヌクレアーゼの使用を含む。
さらなる局面では、突然変異を誘導する工程はヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹヌクレアーゼ、およびＣｓｍ１ヌクレアーゼからなる群より選択される。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹヌクレアーゼの使用を含む。一局面では、突然変異を誘導する工程はＣｓｍ１ヌクレアーゼの使用を含む。
遺伝子のコード領域に突然変異（例えば、エクソン突然変異）があると、変異したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がタンパク質またはポリペプチドに翻訳された時に切断型タンパク質またはポリペプチドが生じることがある。一局面では、本開示は、タンパク質またはポリペプチドを切断する突然変異を提供する。本明細書において使用される場合、「切断型」タンパク質またはポリペプチドは、内因性対照タンパク質またはポリペプチドと比較して少なくとも１つ少ないアミノ酸を含む。例えば、内因性のタンパク質Ａが１００個のアミノ酸を含む場合、タンパク質Ａの切断型バージョンは１～９９個のアミノ酸を含んでもよい。
一局面では、本明細書において提供される突然変異はヌル突然変異を含む。本明細書において使用される場合、「ヌル突然変異」は、突然変異を含む遺伝子によってコードされるタンパク質の完全機能喪失を付与する突然変異、または代わりに、ゲノム遺伝子座によってコードされる小型ＲＮＡの完全機能喪失を付与する突然変異を指す。ヌル突然変異があると、ｍＲＮＡ転写物産生の欠如、小型ＲＮＡ転写物産生の欠如、タンパク質機能の欠如、またはその組合せが引き起こされることがある。
一局面では、内因性遺伝子に突然変異があると、突然変異が無い内因性遺伝子と比較して発現レベルが低減する。別の局面では、内因性遺伝子に突然変異があると、突然変異が無い内因性遺伝子と比較して発現レベルが増加する。
一局面では、非自然突然変異があると、対照タバコ植物中での遺伝子の発現と比較して発現レベルが低減する。一局面では、非自然突然変異があると、対照タバコ植物中での遺伝子の発現と比較して発現レベルが増加する。
さらなる局面では、内因性遺伝子に突然変異があると、突然変異が無い内因性遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、突然変異を有する内因性遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルが低減する。さらなる局面では、内因性遺伝子に突然変異があると、突然変異が無い内因性遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、突然変異を有する内因性遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルが増加する。
一局面では、非自然突然変異があると、非自然突然変異が無いポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、非自然突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルが低減する。別の局面では、非自然突然変異があると、非自然突然変異が無いポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、非自然突然変異を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルが増加する。
一局面では、ゲノム遺伝子座に突然変異があると、突然変異が無いゲノム遺伝子座と比較して発現レベルが低減する。別の局面では、ゲノム遺伝子座に突然変異があると、突然変異が無いゲノム遺伝子座と比較して発現レベルが増加する。さらなる局面では、ゲノム遺伝子座に突然変異があると、突然変異が無いゲノム遺伝子座によってコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、突然変異を有するゲノム遺伝子座によってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルが低減する。さらなる局面では、ゲノム遺伝子座に突然変異があると、突然変異が無いゲノム遺伝子座によってコードされるタンパク質またはポリペプチドと比較して、突然変異を有するゲノム遺伝子座によってコードされるタンパク質またはポリペプチドによる活性レベルが増加する。
遺伝子発現レベルは当技術分野において日常的に調べられる。非限定的な例として、遺伝子発現は、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮＡシークエンシング、またはノザンブロットを用いて測定することができる。一局面では、遺伝子発現はｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定される。別の局面では、遺伝子発現はノザンブロットを用いて測定される。別の局面では、遺伝子発現はＲＮＡシークエンシングを用いて測定される。
本明細書において使用される場合、タバコ植物はニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属からの任意の植物でよく、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属からの任意の植物には、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・アンプレキシカウリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ）ＰＩ ２７１９８９、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）ＰＩ ５５５４７８、ニコチアナ・ビゲロビー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ）ＰＩ ５５５４８５、ニコチアナ・デブネイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｄｅｂｎｅｙｉ）、ニコチアナ・エクセルシオル（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ）ＰＩ ２２４０６３、ニコチアナ・グルチノーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）ＰＩ ５５５５０７、ニコチアナ・グッドスピーデイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ）ＰＩ ２４１０１２、ニコチアナ・ゴセイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｏｓｓｅｉ）ＰＩ ２３０９５３、ニコチアナ・ヘスペリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｈｅｓｐｅｒｉｓ）ＰＩ ２７１９９１、ニコチアナ・ナイティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ）ＰＩ ５５５５２７、ニコチアナ・マリティマ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＰＩ ５５５５３５、ニコチアナ・メガロシフォン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）ＰＩ ５５５５３６、ニコチアナ・ヌディカウリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ）ＰＩ ５５５５４０、ニコチアナ・パニクラータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）ＰＩ ５５５５４５、ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）ＰＩ ５５５５４８、ニコチアナ・レパンダ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｅｐａｎｄａ）ＰＩ ５５５５５２、ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・スアベオレンス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）ＰＩ ２３０９６０、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）ＰＩ ５５５５６９、ニコチアナ・トメントーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）ＰＩ ２６６３７９、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、およびニコチアナ・トリゴノフィラ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ）ＰＩ ５５５５７２が含まれるが、それに限定されない。一局面では、本明細書に記載のタバコ植物はニコチアナ・タバカム植物である。
一局面では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中に突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物またはその一部を提供する。一局面では、タバコ植物はＮｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中の突然変異をさらに含む。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む。一局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群より選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物は、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、類似の条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物は、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。一局面では、タバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含み、対照植物は、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。別の局面では、タバコ植物は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択される総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、タバコ植物は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、タバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む。
一局面では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中に突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物またはその一部を提供する。一局面では、タバコ植物はＮｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む。別の局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群より選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５０～９５、５５～９５、６０～９５、６５～９５、７０～９５、７５～９５、８０～９５、８５～９５、９０～９５、５５～９０、６０～８５、６５～８０、７０～７５、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、および９０～９５からなる群より選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンまたは総アルカロイドを含む。別の局面では、タバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む。
一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択される１つまたはそれ以上の配列を含む。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または９０００ヌクレオチド未満の配列または染色体セグメントを含む。別の局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または９０００ヌクレオチドの配列または染色体セグメントを含む。さらなる局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１００～１５００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、１００～５０００、１００～６０００、１００～７０００、１００～８０００、または１００～９０００ヌクレオチドの配列または染色体セグメントを含む。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、または８０００～９０００ヌクレオチドの配列または染色体セグメントを含む。
一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーの５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、または７００００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。別の局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーの１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１００～１５００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、１００～５０００、１００～６０００、１００～７０００、１００～８０００、または１００～９０００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。さらなる局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーの５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、または８０００～９０００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。
一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列を含む。別の局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択される配列の５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、または７００００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。さらなる局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択される配列の１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１００～１５００、１００～２０００、１００～３０００、１００～４０００、１００～５０００、１００～６０００、１００～７０００、１００～８０００、または１００～９０００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択される配列の５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、４０００～５０００、５０００～６０００、６０００～７０００、７０００～８０００、または８０００～９０００ヌクレオチド以内の配列または染色体セグメントを含む。
一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列のいずれか２つに隣接しており、かつ前記２つの配列を含まない配列または染色体セグメントを含む。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接しており、かつ前記２つの配列を含まない配列または染色体セグメントを含む。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択される配列のいずれか２つに隣接しており、かつ前記２つの配列を含まない配列または染色体セグメントを含む。
一局面では、本開示はまた、ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異、ｎｉｃ２突然変異、およびその組合せからなる群より選択される突然変異を含むタバコ品種、栽培品種、または株であって、タバコ品種、栽培品種、または株が、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ品種、栽培品種、または株の葉のグレードと同等の葉のグレードを有し、対照タバコ品種が、前記突然変異を除いて前記タバコ品種、栽培品種、または株と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ品種、栽培品種、または株を提供する。
一局面では、本開示は、非トランスジェニックタバコ植物またはその一部であって、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含み、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の値、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、非トランスジェニックタバコ植物またはその一部をさらに提供する。別の局面では、このような非トランスジェニックタバコ植物は２．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、このような非トランスジェニックタバコ植物は１．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
一局面では、本開示はまた、非トランスジェニック突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、非トランスジェニック突然変異が、タバコ植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満まで低減し、タバコ植物が、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、対照植物が、非トランスジェニック突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物またはその一部を提供する。
一局面では、本開示は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中に突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記突然変異がＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１には存在しない、タバコ植物またはその一部を提供する。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座においてＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１と比較して短い染色体移入を含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中に完全な遺伝子または完全な遺伝子コード配列の欠失を含まない。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物はＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座においてホモ接合である。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物はＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座においてヘテロ接合である。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、点突然変異、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群より選択されるＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ突然変異を含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物中のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ突然変異は、ランダム突然変異誘発および標的指向性突然変異誘発からなる群より選択されるアプローチにより導入される。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物中のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ突然変異は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲからなる群より選択される標的指向性突然変異誘発アプローチにより導入される。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、１５３、１５４、２０２、２０３、および２０８～２１４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内に１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一局面では、１つまたはそれ以上の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、１５３、１５４、２０２、２０３、および２０８～２１４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、２０５、および２１５～２２１、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコード配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内に１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一局面では、１つまたはそれ以上の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８、４８、４９、５２～５４、１５８、１５９、２０４、２０５、および２１５～２２１、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコード配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、および２２２～２２８、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子内に１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一局面では、１つまたはそれ以上の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、および２２２～２２８、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内に１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一局面では、１つまたはそれ以上の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコード配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内に１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一局面では、１つまたはそれ以上の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコード配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８７、８８、および８９、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子内に１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一局面では、１つまたはそれ以上の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８７、８８、および８９、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１（ＬＡ ＢＵ２１としても参照される）は、キューバシガー品種に由来する低アルカロイド遺伝子を数回の戻し交雑によってＢｕｒｌｅｙ ２１に組み込むことで生じた総アルカロイドが少ないタバコ株である（Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．１９７０）。ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１は、その親であるＢｕｒｌｅｙ ２１の約３．５ ％（乾燥重量）と比較して約０．２ ％の総アルカロイド（乾燥重量）を有する。ＬＡ ＢＵ２１は商業的に許容される基準よりかなり低い葉のグレードを有する。ＬＡ ＢＵ２１はまた、親よりも低い収率、遅い成熟および老化、昆虫の食害に対する高い感受性、ならびに乾燥後の不十分な最終製品品質を特徴とする他の不都合な葉表現型も示す（Ｃｈａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｅｅｋｓ，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．１６：４１６－４１８（１９７６）；Ｌｅｇｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｐ．Ｓｃｉ．１０：２１２（１９７０）；Ｃｈａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｂｕｒｋ，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．７５：１３３－１３６（１９８３））。ＬＡ ＢＵ２１の葉はさらに、親よりも高いポリアミン含有率、高いクロロフィル含有率、および多数の、葉単位面積当たりの葉肉細胞などの形質を示す。
特に定めのない限り、タバコ植物、品種、栽培品種、または株についての本明細書に記載のアルカロイド、ポリアミン、もしくはニコチンレベル（もしくは別の葉の化学もしくは特性の特徴）の測定値または葉グレード指数値は、例えば、単一の代表的植物の複数の葉の平均または単一の品種、栽培品種、もしくは株からのタバコ植物の代表的集団からの平均測定値を含む、平均測定値を指す。特に定めのない限り、本明細書に記載のタバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心後に葉番号３、４、および５から収集されたプールされた葉試料において摘心の２週間後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、ニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミン（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）の最も高いレベルを有する葉において摘心後に測定される。一局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベルは、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群より選択される連続する葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群より選択される葉番号を有する葉において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群より選択される葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、および２６～３０からなる群より選択される葉番号を有する３つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。
本明細書において使用される場合、葉の番号付けは、タバコの茎上の葉の位置に基づき、葉番号１は摘心後の最も若い葉（最上部）であり、最も大きい葉番号は最も古い葉（最下部）に割り当てられる。
平均測定値（例えば、アルカロイドもしくはニコチンレベルまたは葉のグレード付け）を決定するためのタバコ植物の集団またはタバコ葉の集合物は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０といった任意のサイズであり得る。産業上承認される標準的なプロトコールに従って平均測定値またはグレード（ｇｒａｄ）指数値が決定される。
本明細書において使用される場合、「摘心」は、タバコ植物が栄養成熟に近くかつ生殖生長の開始時期にある時の、ＳＡＭ、花、および数枚までの隣接する葉を含む、茎の頂部の除去を指す。典型的には、タバコ植物は、つぼみステージ（花が現れ始めた直後）において摘心される。例えば、温室または野外生育のタバコ植物は、５０％の植物が少なくとも１つの開いた花を有する時に摘心され得る。タバコ植物の摘心は、頂芽優勢の喪失を結果としてもたらし、かつアルカロイド産生の増大も誘導する。
典型的には、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約２週間後に測定される。他の時点もまた使用され得る。一局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約１、約２、約３、約４、または約５週間後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約３、約５、約７、約１０、約１２、約１４、約１７、約１９、または約２１日後に測定される。
本明細書において使用される場合、「類似の生育条件」または「同等の生育条件」は、生育のためおよび２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間の意味のある比較を行うための類似の環境条件および／または耕種学的実施であって、環境条件および耕種学的実施のいずれも、２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間に観察される任意の差異に寄与せず、かつ該差異の説明とならないような、類似の環境条件および／または耕種学的実施を指す。環境条件としては、例えば、光、温度、水（湿度）、ならびに栄養物（例えば、窒素およびリン）が挙げられる。耕種学的実施としては、例えば、種まき、切取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）、切落し（ｕｎｄｅｒｃｕｔｔｉｎｇ）、移植、摘心、および吸枝が挙げられる。Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９９）、ｐｐ ７０－１０３のＣｈａｐｔｅｒ ４Ｂおよび４Ｃを参照。
「アルカロイド」は、植物中に天然に存在する複雑な窒素含有化合物であり、ヒトおよび動物において薬理学的効果を有する。「ニコチン」は、市販のシガレットタバコ中の主要な天然アルカロイドであり、ニコチアナ・タバカム中のアルカロイド含有量の約９０パーセントを占める。タバコ中の他の主要なアルカロイドとしては、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンが挙げられる。微量のタバコアルカロイドとしては、ニコチン－ｎ－オキシド、Ｎ－メチルアナタビン、Ｎ－メチルアナバシン、シュードオキシニコチン、２，３ジピリジル、およびその他が挙げられる。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ変異もＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ指向導入遺伝子も有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルの総アルカロイドまたは個々のアルカロイドを含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ植物と比較して、より低いレベルの、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンからなる群より選択される１種またはそれ以上のアルカロイドを含む。一局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。別の局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの約０．５％～１％、約１％～２％、約２％～３％、約３％～４％、約４％～５％、約５％～６％、約６％～７％、約７％～８％、約８％～９％、約９％～１０％、約１１％～１２％、約１２％～１３％、約１３％～１４％、約１４％～１５％、約１５％～１６％、約１６％～１７％、約１７％～１８％、約１８％～１９％、約１９％～２０％、約２１％～２２％、約２２％～２３％、約２３％～２４％、約２４％～２５％、約２５％～２６％、約２６％～２７％、約２７％～２８％、約２８％～２９％、または約２９％～３０％のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。さらなる局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの約０．５％～５％、約５％～１０％、約１０％～２０％、約２０％～３０％のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。
アルカロイドレベルは、当技術分野において公知の方法により、例えば、気体－液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイに基づく定量化により、アッセイされ得る。例えば、ニコチンアルカロイドレベルは、キャピラリーカラムおよびＦＩＤ検出器を備えた気体－液体クロマトグラフィーを使用する方法のためのＣＯＲＥＳＴＡ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ．７、１９８７およびＩＳＯ規格（ＩＳＯ ＴＣ １２６Ｎ ３９４ Ｅ．；Ｈｉｂｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １００：８２６－３５（１９９２）も参照）に基づくＧＣ－ＦＩＤ法により測定され得る。特に定めのない限り、本明細書に記載の全てのアルカロイドレベルは、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｍｅｔｈｏｄ Ｎｏ ６２、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５による方法、ならびにＦｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｖｏｌ．６４、Ｎｏ．５５ Ｍａｒｃｈ ２３、１９９９において刊行（およびＶｏｌ．７４、Ｎｏ．４、Ｊａｎｕａｒｙ ７、２００９において補正）されたＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ’ｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ，Ｔｏｔａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｉｎ Ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓにおいて定義される方法を使用して測定される。
代替的に、タバコの総アルカロイドは、Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３：７９－８１（１９６９）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。簡潔に述べれば、タバコの試料を乾燥し、粉砕し、抽出した後に総アルカロイドおよび還元糖の分析を行う。方法では次に、脱色のために酢酸／メタノール／水抽出および木炭が用いられる。総アルカロイドの決定は、有色複合体を形成するための芳香族アミンの存在下でのニコチンアルカロイドとの塩化シアノゲンの反応に基づき、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。特に定めのない限り、本明細書に示される総アルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）に基づく。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ変異もＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ指向導入遺伝子も有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルのニコチンを含む。一局面では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満の平均ニコチンレベルを指す。別の局面では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの約０．５％～１％、約１％～２％、約２％～３％、約３％～４％、約４％～５％、約５％～６％、約６％～７％、約７％～８％、約８％～９％、約９％～１０％、約１１％～１２％、約１２％～１３％、約１３％～１４％、約１４％～１５％、約１５％～１６％、約１６％～１７％、約１７％～１８％、約１８％～１９％、約１９％～２０％、約２１％～２２％、約２２％～２３％、約２３％～２４％、約２４％～２５％、約２５％～２６％、約２６％～２７％、約２７％～２８％、約２８％～２９％、または約２９％～３０％の平均ニコチンレベルを指す。さらなる局面では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの約０．５％～５％、約５％～１０％、約１０％～２０％、約２０％～３０％の平均ニコチンレベルを指す。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、約０．０２％、約０．０５％、約０．７５％、約０．１％、約０．１５％、約０．２％、約０．３％、約０．３５％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、約３％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、および約９％からなる群より選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．０２％、約０．０２％～０．０５％、約０．０５％～０．７５％、約０．７５％～０．１％、約０．１％～０．１５％、約０．１５％～０．２％、約０．２％～０．３％、約０．３％～０．３５％、約０．３５％～０．４％、約０．４％～０．５％、約０．５％～０．６％、約０．６％～０．７％、約０．７％～０．８％、約０．８％～０．９％、約０．９％～１％、約１％～１．１％、約１．１％～１．２％、約１．２％～１．３％、約１．３％～１．４％、約１．４％～１．５％、約１．５％～１．６％、約１．６％～１．７％、約１．７％～１．８％、約１．８％～１．９％、約１．９％～２％、約２％～２．１％、約２．１％～２．２％、約２．２％～２．３％、約２．３％～２．４％、約２．４％～２．５％、約２．５％～２．６％、約２．６％～２．７％、約２．７％～２．８％、約２．８％～２．９％、約２．９％～３％、約３％～３．１％、約３．１％～３．２％、約３．２％～３．３％、約３．３％～３．４％、約３．４％～３．５％、および約３．５％～３．６％からなる群より選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．１％、約０．０２％～０．２％、約０．０３％～０．３％、約０．０４％～０．４％、約０．０５％～０．５％、約０．７５％～１％、約０．１％～１．５％、約０．１５％～２％、約０．２％～３％、および約０．３％～３．５％からなる群より選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
本開示はまた、他のタバコ形質、例えば、葉グレード指数値に対して負の影響を有さずに変化したニコチンレベルを有するタバコ植物を提供する。一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、商業的に許容されるグレードの乾燥タバコを提供する。タバコグレードは、葉の茎上の位置、葉のサイズ、葉の色、葉の均一性および完全性、熟度、感触、弾性、光沢（葉の呈色の強度および深さの他に輝きと関連する）、吸湿性（周囲の水分を吸収および保持するタバコ葉の能力）、ならびに緑色の特徴または色合いが挙げられるがそれに限定されない要因に基づいて評価される。葉グレードは、例えば、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅにより刊行されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅ（７ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§５１１）を使用して決定され得る。例えば、１９９０年１１月５日（５５ Ｆ．Ｒ．４０６４５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｂｕｒｌｅｙ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ３１ ａｎｄ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｔｙｐｅ ９３）；１９８９年３月２７日（５４ Ｆ．Ｒ．７９２５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｅ－Ｃｕｒｅｄ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ １１，１２，１３，１４ ａｎｄ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｔｙｐｅ ９２）；１９６５年１月８日（２９ Ｆ．Ｒ．１６８５４）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｅｅｄｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ４１）；１９６３年１２月８日（２８ Ｆ．Ｒ．１１７１９および２８ Ｆ．Ｒ．１１９２６）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｏｈｉｏ Ｃｉｇａｒ－Ｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ４２，４３，ａｎｄ ４４）；１９６９年１１月２０日（３４ Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｉｇａｒ－Ｂｉｎｄｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ５４ ａｎｄ ５５）；１９６９年１１月２０日（３４ Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｉｇａｒ－Ｂｉｎｄｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ ５４ ａｎｄ ５５）；１９７１年４月に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｇｒａｄｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｏｒｇｉａ ａｎｄ Ｆｌｏｒｉｄａ Ｓｈａｄｅ－Ｇｒｏｗｎ Ｃｉｇａｒ－Ｗｒａｐｐｅｒ Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ ６２）を参照。ＵＳＤＡグレード指数値は、産業上承認されたグレード指数にしたがって決定され得る。例えば、Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２：３９－４０（１９８８）；Ｌｅｇａｃｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｂａｔｅｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃５２３２６７８２６－５２３２６７８３３、Ｊｕｌｙ １、１９８８、Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｏｓｅｄ Ｂｕｒｌｅｙ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ）；およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｉｎｔｅｒｎ．、１９２：５５－５７（全ての以上の参考文献は参照することにより全体が組み込まれる）を参照。特に定めのない限り、本明細書に記載の任意の植物に関するＵＳＤＡグレード指数は、受領された連邦政府のグレードの０～１００の数値表現であり、全ての茎上の位置の加重平均である。より高いグレード指数はより高い品質を指し示す。代替的に、葉グレードは、ハイパースペクトルイメージングを介して決定され得る。例えば、ＷＯ２０１１／０２７３１５（公開日２０１１年３月１０日；参照することにより全体が組み込まれる）を参照。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ植物と比較して、類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群より選択される１つまたはそれ以上のタバコ芳香化合物を含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群より選択される１つまたはそれ以上のタバコ芳香化合物のレベルに対して影響を有しないｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ 変異、ｎｉｃ２変異、またはその組合せを含む。
本明細書において使用される場合、タバコ芳香化合物は、タバコの煙の風味および芳香と関連付けられる化合物である。これらの化合物としては、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、センブラノイドおよびラブダノイドジテルペン、ならびに糖エステルが挙げられるがそれに限定されない。タバコ芳香化合物の濃度は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴分光法、液体クロマトグラフィー連結質量分析が挙げられるがそれに限定されない当技術分野における任意の公知の代謝物プロファイリング方法により測定され得る。Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ、ＷｅｃｋｗｅｒｔｈおよびＫａｈｌ編、（Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）（Ｍａｙ ２８、２０１３）を参照。
本明細書において使用される場合、「還元糖」は、遊離のまたは潜在的に遊離のアルデヒドまたはケトン基を有する任意の糖（単糖または多糖）である。グルコースおよびフルクトースは、煙のｐＨを低減することおよび「遊離」の非プロトン化ニコチンの量を効果的に低減することによりシガレットの煙中のニコチン緩衝剤として作用する。還元糖は、例えば、ニコチンおよび他のタバコアルカロイドの知覚的影響を改変することにより、煙の風味の均衡を取る。糖含有量とアルカロイド含有量との逆の関係性が、タバコ品種にわたり、同じ品種内において、および栽培条件により引き起こされる同じ植物株内において報告されている。還元糖レベルは、Ｓｋａｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｄａｖｉｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：１３９－１４４（１９７６）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。例えば、試料は、炭酸ナトリウム溶液に対して透析される。銅ネオクプロインが試料に添加され、溶液が加熱される。銅ネオクプロインキレートは糖の存在下で還元されて有色複合体を結果としてもたらし、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはｎｉｃ２遺伝子座から１つまたはそれ以上の遺伝子活性を低減または除去するＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはｎｉｃ２遺伝子座における１つまたはそれ以上の天然に存在しない変異体アレルを含む。一局面では、これらの変異体アレルは、より低いニコチンレベルを結果としてもたらす。変異体Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはｎｉｃ２アレルは、ランダムまたは標的指向性変異誘発アプローチを含む当技術分野において公知の任意の方法により導入され得る。
そのような変異誘発方法としては、エチルメチルスルフェート（ＥＭＳ）（ＨｉｌｄｅｒｉｎｇおよびＶｅｒｋｅｒｋ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ ｐｒｅｓｓ、ｐｐ ３１７－３２０、１９６５）またはＵＶ照射、Ｘ線、および高速中性子照射（例えば、Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．１９：１９７－２０３、１９７１；およびＰｏｅｈｌｍａｎ、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ、Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ）、１９８７を参照）、トランスポゾンタグ付加（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９８４；米国特許第４，７３２，８５６号および米国特許第５，０１３，６５８号）を用いる種子の処理の他に、Ｔ－ＤＮＡ挿入方法論（Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８３；米国特許第５，１４９，６４５号）が挙げられるがそれに限定されない。ＥＭＳ誘導変異誘発は、ゲノムの長さにわたりランダムな点変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子変異誘発は、種子を中性子衝撃に曝露することからなり、中性子衝撃は二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす。トランスポゾンタグ付加は、内因性遺伝子内にトランスポゾンを挿入して遺伝子の発現を低減または除去することを含む。タバコ遺伝子中に存在し得る変異の種類としては、例えば、点変異、欠失、挿入、重複、および逆位が挙げられる。そのような変異は、望ましくは、タバコ遺伝子のコード領域中に存在するが、タバコ遺伝子のプロモーター領域、およびイントロン、または非翻訳領域中の変異もまた望ましいことがある。
加えて、変性ＨＰＬＣまたは選択されるＰＣＲ産物の選択的なエンドヌクレアーゼ消化を使用する、化学的に誘導される変異のためのスクリーニングの迅速かつ自動化可能な方法、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）もまた本開示に応用可能である。ＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５－４５７を参照。遺伝子発現に影響するまたは遺伝子の機能に干渉する変異は、当技術分野において周知の方法を使用して決定され得る。遺伝子エクソン中の挿入変異は、通常、ヌル変異体を結果としてもたらす。保存された残基中の変異は、タンパク質の機能の阻害において特に効果的であり得る。一局面では、タバコ植物は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子中のナンセンス（例えば、終止コドン）変異を含む。
一局面では、本開示はまた、商業的に許容される葉品質を維持しながら変化したニコチンレベルを有するタバコ株を提供する。これらの株は、精密なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ－ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１システム、およびその組合せを介してＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ またはｎｉｃ２遺伝子座における１つまたはそれ以上の遺伝子中に変異を導入することにより産生され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２３３７５６号を参照）。例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１（７）：３９７－４０５（２０１３）を参照。
変異誘発されたタバコ植物のスクリーニングおよび選択は、当業者に公知の任意の方法論を介してもよい。スクリーニングおよび選択の方法論の例としては、サザン解析、ポリヌクレオチドの検出のためのＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護、プライマー伸長、ＲＮＡ転写物の検出のためのＲＴ－ＰＣＲ増幅、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＰａｃＢｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４）、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性の検出のための酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合イムノアッセイが挙げられるがそれに限定されない。インサイチューハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの他の技術もまた、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために使用され得る。参照される全ての技術を行うための方法は公知である。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１ヌクレアーゼからなる群より選択されるヌクレアーゼにより変異誘発または編集される。
本明細書において使用される場合、「編集」または「ゲノム編集」は、内因性の植物ゲノム核酸配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０ヌクレオチドの標的指向性変異誘発、または内因性の植物ゲノム核酸配列の除去もしくは置換を指す。一局面では、提供される編集された核酸配列は、内因性核酸配列と少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。一局面では、提供される編集された核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２～２０５、および２０８～２２１，ならびにその断片からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。
別の局面では、提供される編集された核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２～２０５、および２０８～２２１からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。
別の局面では、提供される編集された核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２～２０５、および２０８～２２１からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。
メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、ゲノム配列の標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、それは次に、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然のプロセスにより修復される。次に、切断された部位において配列改変が行われ、それは、ＮＨＥＪの場合に遺伝子破壊を結果としてもたらす欠失もしくは挿入、またはＨＲによるドナー核酸配列の組込みを含み得る。一局面では、提供される方法は、提供されるヌクレアーゼを用いて植物ゲノムを編集して、ドナーポリヌクレオチドを用いるＨＲを介して植物ゲノム中の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド超を変異させる工程を含む。一局面では、提供される変異は、ヌクレアーゼを使用するゲノム編集により引き起こされる。別の局面では、提供される変異は、非相同末端結合または相同組換えにより引き起こされる。
一局面では、本明細書において提供される変異は、１つまたはそれ以上の酸化防止剤について、関心対象の遺伝子、例えば、生合成酵素、調節性転写因子、トランスポーター、異化酵素、またはその組合せからなる群より選択される遺伝子の発現または活性を活性化させる優性変異体を提供する。
一般的に微生物において同定されるメガヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの部位特異的な消化を結果としてもたらす高い活性および長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有する特有の酵素である。天然に存在するメガヌクレアーゼの操作型は、典型的には、伸長されたＤＮＡ認識配列（例えば、１４～４０ｂｐ）を有する。メガヌクレアーゼの操作は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの操作より困難であり得、その理由は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識と切断機能が単一ドメインにおいて絡み合っているからである。特有の配列を認識しかつ向上したヌクレアーゼ活性を有する新規のメガヌクレアーゼバリアントを作製するために変異誘発およびハイスループットスクリーニングの特別の方法が使用されている。
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合した操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる合成タンパク質である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの改変のために二本鎖ＤＮＡの任意の長さと言ってよい長さのストレッチを切断するように設計され得る。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列に結合するように操作されたジンクフィンガーアレイに融合したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的なＤＮＡ切断ドメインから構成される単量体から二量体を形成する。
ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３～４個のジンクフィンガーアレイから構成される。標的ＤＮＡへの部位特異的な結合に寄与するジンクフィンガー∞－ヘリックスの開始に対して－１、＋２、＋３、および＋６の位置のアミノ酸を変更およびカスタマイズして、特定の標的配列に適合させることができる。他のアミノ酸はコンセンサス骨格を形成して、異なる配列特異性を有するＺＦＮを産生する。ＺＦＮ用の標的配列を選択するための規則は当技術分野において公知である。
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するために二量体化を必要とし、したがって、Ｃ末端領域を有する２つのＺＦＮは切断部位の対向するＤＮＡ鎖（５～７ｂｐだけ分離されている）に結合することが必要とされる。２－ＺＦ－結合部位がパリンドロームの場合、ＺＦＮ単量体は標的部位を切断することができる。ＺＦＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＺＦＮからの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＺＦＮを含む。ＺＦＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働くように操作された一対のＺＦＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
いかなる科学理論によっても限定されないが、ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は様々な方法の１つを使用して原理的に再操作され得るので、カスタマイズされたＺＦＮは理論的に、ほぼすべての遺伝子配列を標的指向するように構築され得る。ジンクフィンガードメインを操作するための公開されている方法としては、Ｃｏｎｔｅｘｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ Ｐｏｏｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）、およびＭｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙが挙げられる。
ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合させることにより産生される人工的な制限酵素である。ＴＡＬＥＮペアの各メンバーが標的部位に隣接するＤＮＡ部位に結合する場合、ＦｏｋＩ単量体は二量体化して標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＴＡＬＥＮの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働く一対のＴＡＬＥＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際的に任意のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。ＴＡＬＥタンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の様々な植物細菌性病原体に由来するＤＮＡ結合ドメインである。キサントモナス病原体は、感染の間に宿主植物細胞中にＴＡＬＥを分泌する。ＴＡＬＥは核に移動し、そこで宿主ゲノム中の特定の遺伝子のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列を認識してそれに結合する。ＴＡＬＥは、３３～３４アミノ酸の１３～２８個のリピートモノマーから構成される中心のＤＮＡ結合ドメインを有する。各単量体のアミノ酸は、位置１２および１３における超可変アミノ酸残基を除いて高度に保存されている。２つの可変アミノ酸は反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＲＶＤのアミノ酸ペアＮＩ、ＮＧ、ＨＤ、およびＮＮはそれぞれ、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニン／アデニンを優先的に認識し、ＲＶＤのモジュレーションは、連続するＤＮＡ塩基を認識することができる。アミノ酸配列とＤＮＡ認識とのこの単純な関係性は、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組合せを選択することによる特定のＤＮＡ結合ドメインの操作を可能とした。
野生型ＦｏｋＩ切断ドメインの他に、変異を有するＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントが、切断特異性および切断活性を向上させるために設計されている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向および空間的配置を有する標的ゲノム中の部位のための特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方は、高レベルの活性を達成するためのパラメータである。
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との関係性は、設計可能なタンパク質を可能とする。ＤＮＡ Ｗｏｒｋｓなどのソフトウェアプログラムを使用してＴＡＬＥ構築物を設計することができる。ＴＡＬＥ構築物を設計する他の方法は当業者に公知である。Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）４０：Ｗ１１７－１２２．；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）．３９：ｅ８２；およびｔａｌｅ－ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＦｏｋＩベースの方法のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの代替である。ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位におけるＤＮＡ配列を認識するために相補的塩基対形成を使用するＲＮＡガイド操作型ヌクレアーゼに基づく。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細菌および古細菌の適応免疫系の部分であり、配列依存的な方式で外来ＤＮＡを切断することによりウイルスなどの侵入性核酸からそれらを保護する。免疫は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位末端における２つの隣接リピートの間のスペーサーとして公知の侵入性ＤＮＡの短い断片の組込みにより獲得される。スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイは、侵入性ＤＮＡとのその後の遭遇の間に転写され、約４０ｎｔの長さの低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされ、ｃｒＲＮＡはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と合わさってＣａｓ９ヌクレアーゼを活性化およびガイドする。これは侵入性ＤＮＡ中のプロトスペーサーとして公知の相同的二本鎖ＤＮＡ配列を切断する。切断のための必要条件は、標的ＤＮＡの下流の保存されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在であり、これは通常、配列５－ＮＧＧ－３、より低い頻度でＮＡＧを有する。特異性は、ＰＡＭの約１２塩基上流のいわゆる「シード配列」により提供され、これはＲＮＡと標的ＤＮＡとの間でマッチしなければならない。Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はＣａｓ９と類似の方式で作用するが、Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする。
さらに別の局面では、提供されるタバコ植物は、ニコチンデメチラーゼをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子座中の１つまたはそれ以上の変異を欠いた対照植物と比較して、低減した量のノルニコチンを付与するニコチンデメチラーゼをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子座中の１つまたはそれ以上の変異（例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、ＣＹＰ８２Ｅ１０）をさらに含む（米国特許第８，３１９，０１１号、同第８，１２４，８５１号、同第９，１８７，７５９号、同第９，２２８，１９４号、同第９，２２８，１９５号、同第９，２４７，７０６号を参照）。一局面では、記載される改変タバコ植物は、同等の条件下で生育および乾燥された場合の対照植物と比較して低減したニコチンデメチラーゼ活性をさらに含む。
本開示はまた、植物、特に、様々な商用の品種のタバコ植物を含むニコチアナ属の植物においてＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からの１つまたはそれ以上のポリペプチドの発現または機能を阻害するための組成物および方法も提供する。
一局面では、本開示は、タバコ植物またはその一部であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列を含む異種発現カセットを含み、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物またはその一部を提供する。別の局面では、本開示は、タバコ植物またはその一部であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列を含む異種発現カセットを含み、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物またはその一部を提供する。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、およびその組合せからなる群より選択される阻害性ポリヌクレオチドとして転写することができる。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １０８～１１９からなる群より選択される配列を含む。
本明細書において使用される場合、「阻害する」、「阻害」、および「阻害すること」という用語は、関心対象の遺伝子産物（例えば、標的遺伝子産物）の発現または機能を減少させる当技術分野において公知のまたは本明細書に記載の任意の方法として定義される。「阻害」は、２つの植物、例えば、遺伝学的に変化した植物と野生型植物との比較の文脈におけるものであり得る。代替的に、標的遺伝子産物の発現または機能の阻害は、同じ植物内のまたは異なる植物間の植物細胞、細胞小器官、器官、組織、もしくは植物部分の間での比較の文脈におけるものであり得、同じ植物内もしくは植物部分内のまたは植物間もしくは植物部分間の発達ステージもしくは時間的ステージの間での比較が挙げられる。「阻害」は、関心対象の遺伝子産物の機能または産生の完全な除去を含めて該完全な除去までの、その遺伝子産物の機能または産生の任意の相対的な減少を含む。「阻害」という用語は、標的遺伝子産物の翻訳および／もしくは転写または標的遺伝子産物の機能的活性を下方調節する任意の方法または組成物を包含する。一局面では、改変植物中のＮｉｃ１ｂ遺伝子座からの１つまたはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、変異体ではない植物中またはその遺伝子の発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物中の同じ遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満である。
「阻害配列」という用語は、植物中のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からのニコチン生合成調節に関与する遺伝子の発現または機能を阻害することができる任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を包含し、例えば、全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、切断型ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の断片、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のバリアント、センス方向のヌクレオチド配列、アンチセンス方向のヌクレオチド配列、センスまたはアンチセンス方向のヌクレオチド配列の相補体、ヌクレオチド配列の逆位領域、ヌクレオチド配列のヘアピン、二本鎖ヌクレオチド配列、一本鎖ヌクレオチド配列、およびその組合せなどである。「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学修飾核酸、核酸アナログ、およびその組合せなどの配列を含む。
阻害配列は、標的遺伝子産物の名称により指し示される。したがって、「Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列」は、例えば、転写および／もしくは翻訳のレベルにおいて、植物中のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からのニコチン生合成調節に関与する遺伝子の発現を阻害することができる、または遺伝子産物の機能を阻害することができる阻害配列を指す。「阻害することができる」という語句がポリヌクレオチド阻害配列の文脈において使用される場合、それは、阻害配列自体が阻害効果を発揮すること；または、阻害配列が阻害性ヌクレオチド分子（例えば、ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド）をコードするか、もしくは阻害性ポリペプチド（例えば、標的遺伝子産物の発現もしくは機能を阻害するポリペプチド）をコードする場合、その転写（例えば、ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする阻害配列の場合）もしくはその転写および翻訳（阻害性ポリペプチドをコードする阻害配列の場合）後に、それぞれ転写もしくは翻訳された産物が標的遺伝子産物に対する阻害効果を発揮する（例えば、標的遺伝子産物の発現もしくは機能を阻害する）ことを意味するように意図される。
開示されるＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、センス抑制／共抑制、アンチセンス抑制、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ干渉およびイントロン含有ヘアピンＲＮＡ干渉、アンプリコン媒介性干渉、リボザイム、小干渉性ＲＮＡ、人工または合成マイクロＲＮＡ、および人工トランス作用性ｓｉＲＮＡが挙げられるがそれに限定されない当技術分野において公知の任意のサイレンシング経路または機構を介して遺伝子サイレンシングを誘発する配列であり得る。Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、所望のアウトカムに依存して、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約４００ヌクレオチドから本開示のタンパク質をコードする全長ポリヌクレオチドまでの範囲内であってもよい。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、約５０～約４００ヌクレオチド、約７０～約３５０ヌクレオチド、約９０～約３２５ヌクレオチド、約９０～約３００ヌクレオチド、約９０～約２７５ヌクレオチド、約１００～約４００ヌクレオチド、約１００～約３５０ヌクレオチド、約１００～約３２５ヌクレオチド、約１００～約３００ヌクレオチド、約１２５～約３００ヌクレオチド、または約１２５～約２７５ヌクレオチドの長さの断片であり得る。一部の態様では、シトクロムＰ４５０ポリヌクレオチドの断片は、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約４００ヌクレオチドの長さ、および約７０～約４００ヌクレオチドの他のこのような値である。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ阻害配列は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドを含んでもよい。
「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、ＤＮＡを構成するポリヌクレオチドに本開示を限定することを意図しない。当業者は、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオシドとの組合せを含み得ることを認識する。そのようなデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオチドとしては、天然に存在する分子および合成アナログの両方が挙げられる。本開示のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、およびステム－アンド－ループ構造などが挙げられるがそれに限定されない全ての形態の配列を包含する。
一局面では、本開示は、タバコ細胞中で機能し、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、および２２２～２２８ならびにその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された、プロモーターを含み、かつ、ＲＮＡ分子がポリペプチドの発現を抑制する、組換えＤＮＡ構築物を提供する。一局面では、ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびトランス作用性ｓｉＲＮＡからなる群より選択される。別の局面では、組換えＤＮＡ構築物は二本鎖ＲＮＡをコードする。これらの組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニックタバコ植物もしくはその部分、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品もまた提供される。一局面では、これらのトランスジェニック植物、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品は、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルのニコチンを含む。タバコ植物のニコチンレベルを低減する方法であって、これらの組換えＤＮＡ構築物のいずれかを用いてタバコ植物を形質転換する工程を含む、方法がさらに提供される。
本明細書において使用される場合、「機能的に連結された」は、２つまたはそれ以上の要素の間の機能しうる連結を指す。例えば、関心対象のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との機能的な連結は、関心対象のポリヌクレオチドの発現を可能とする機能しうる連結である。機能的に連結された要素は、連続または非連続であってもよい。
本明細書において使用され、かつ配列に関して使用される場合、「異種」は、外来種を起源とするか、または、同じ種からの場合、意図的なヒトの介入により組成物および／もしくはゲノム遺伝子座においてその天然の形態から実質的に改変されている配列を指す。この用語はまた、本明細書において「ポリヌクレオチド構築物」または「ヌクレオチド構築物」と称されることもある核酸構築物にあてはまる。このようにして、「異種」核酸構築物は、外来種を起源とするか、または、同じ種からの場合、意図的なヒトの介入により組成物および／もしくはゲノム遺伝子座においてその天然の形態から実質的に改変されている構築物を意味することが意図される。異種核酸構築物としては、例えば、形質転換方法、または関心対象の別の植物を用いるトランスジェニック植物のその後の育種を介して、植物またはその植物部分に導入された組換えヌクレオチド構築物が挙げられるがそれに限定されない。一局面では、使用されるプロモーターは、プロモーターによりドライブされる配列にとって異種である。別の局面では、使用されるプロモーターは、タバコにとって異種である。さらなる局面では、使用されるプロモーターは、タバコにとって天然である。
一局面では、記載される改変タバコ植物はシスジェニック植物である。本明細書において使用される場合、「シスジェネシス」または「シスジェニック」は、全ての成分（例えば、プロモーター、ドナー核酸、選択遺伝子）が植物のみを起源とする（すなわち、非植物起源の成分は使用されない）植物、植物細胞、または植物ゲノムの遺伝子改変を指す。一局面では、提供される改変植物、植物細胞、または植物ゲノムはシスジェニックである。提供されるシスジェニック植物、植物細胞、および植物ゲノムは、使用準備済みのタバコ株に繋がり得る。別の局面では、提供される改変タバコ植物は、非タバコの遺伝材料および配列のいずれも含まない。
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」は、遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む、遺伝子産物の生合成または産生を指す。
植物、特に、様々な商用の品種のタバコ植物を含むニコチアナ属の植物においてＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座から１つまたはそれ以上のポリペプチドを過剰発現させるための組成物および方法もまた本明細書において提供される。
一局面では、本開示は、タバコ細胞中で機能的であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、および２２２～２２８、ならびにその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。これらの組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニックタバコ植物もしくはその一部、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品もまた提供される。一局面では、これらのトランスジェニック植物、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品は、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較して増加したレベルのニコチンを含む。タバコ植物のニコチンレベルを増加させる方法であって、これらの組換えＤＮＡ構築物のいずれかを用いてタバコ植物を形質転換する工程を含む、方法がさらに提供される。
一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ関連の導入遺伝子または突然変異を有する各トランスジェニックまたは突然変異株について、このようなトランスジェニックまたは突然変異株と、Ｎｉｃ２遺伝子座の１つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に向けられる突然変異または導入遺伝子事象との組合せもまた提供される。このような１つまたはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子には、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８が含まれるが、それに限定されない（Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０））。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０）と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制の組合せを有する植物は特に関心が高く、本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制の組合せを有する植物はさらに特に関心が高く、本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、ＥＲＦ１８９の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制の組合せを有する植物が本明細書においてさらに提供される。別の局面では、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、ＥＲＦ１１５の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制の組合せを有する植物が本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（ＮＣＧ１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７）と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制の組合せを有する植物は特に関心が高く、本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制の組合せを有する植物はさらに特に関心が高く、本明細書において提供される。１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、ＥＲＦ１８９の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制の組合せを有する植物が本明細書においてさらに提供される。別の局面では、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または４つ全てのＮｉｃ１ｂ ＥＲＦ様遺伝子（ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、ＥＲＦ１１５の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制の組合せを有する植物が本明細書において提供される。
さらなる局面では、ＮＣＧ１２の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。別の局面では、ＮＣＧ１５の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。別の局面では、ＮＣＧ１６の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。別の局面では、ＮＣＧ１７の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。別の局面では、ＥＲＦ１０１の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。別の局面では、ＥＲＦ１１０の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。別の局面では、ＥＲＦ１６の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。別の局面では、ＥＲＦ１３０の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２ ＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、６つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、６つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照動物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、２つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、３つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、４つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、５つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、６つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、６つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照動物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。一局面では、６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、６つより少ない、または７つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。
一局面では、１つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、３つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、４つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、上記の植物のいずれも、同等の条件下の、このようなＮｉｃ２＿ＥＲＦまたはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有さない対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入もしくは突然変異誘発性の抑制と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、または６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、３つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、４つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、上記の植物のいずれも、同等の条件下の、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦまたはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有さない対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、１つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、３つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、４つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の、このようなＮｉｃ２＿ＥＲＦまたはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有さない対照植物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２つより少ないＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、２つより少ない、３つより少ない、４つより少ない、５つより少ない、または６つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、３つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、４つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、５つもしくはそれ以上のＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現と、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有する、タバコ植物が提供される。一局面では、このような植物は、同等の条件下の、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦまたはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有さない対照植物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む２つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする２つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む２つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする２つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む３つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする３つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む３つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする３つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする２つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする３つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする４つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含む５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一の配列を含むポリペプチドをコードする５つより少ないＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の抑制を欠く対照植物と比較して低いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の突然変異誘発性抑制は全Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子または全Ｎｉｃ２＿ＥＲＦコード領域の欠失を含有しない。一局面では、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の突然変異誘発性抑制は全Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子または全Ｎｉｃ２＿ＥＲＦコード領域の欠失を含有する。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の突然変異誘発性抑制は全Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子または全Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦコード領域の欠失を含有しない。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の突然変異誘発性抑制は全Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子または全Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦコード領域の欠失を含有する。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照植物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、２０８、２１２、２１５、および２１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、および５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含む１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、２２２および２２６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つまたは２つのＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、および８７～８９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むポリペプチドをコードする１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子の遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現をさらに有する、タバコ植物が提供される。一局面では、本段落に記載の植物は、同等の条件下の、このような遺伝子導入または突然変異誘発性の過剰発現を欠く対照植物と比較して高いニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
一局面では、低いニコチンまたは総アルカロイドレベルは、同等の条件下の対照植物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、または９９％低減していることを指す。
一局面では、高いニコチンまたは総アルカロイドレベルは、同等の条件下の対照植物と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、または８００％増加していることを指す。
一局面では、組換えＤＮＡ構築物または発現カセットはまた、トランスジェニック細胞の選択のための選択マーカー遺伝子を含み得る。選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子の他に、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４－ジクロロフェノキシアセテート（２，４－Ｄ）などの除草性化合物に対して抵抗性を付与する遺伝子が挙げられるがそれに限定されない。追加の選択マーカーとしては、β－ガラクトシダーゼなどの表現型マーカーおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質が挙げられる。
一局面では、組換えＤＮＡ構築物または発現カセットは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性プロモーター（例えば、葉特異的または根特異的プロモーター）からなる群より選択されるプロモーターを含む。例示的な構成的プロモーターとしては、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよび米国特許第６，０７２，０５０号に開示される他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０－８１２）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９－６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５－６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１－５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７２３－２７３０）；ならびにＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが挙げられる。例示的な化学物質誘導性プロモーターとしては、サリチル酸により活性化されるタバコＰＲ－１ａプロモーターが挙げられる。他の関心対象の化学物質誘導性プロモーターとしては、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１－１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１４（２）：２４７－２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照）ならびにテトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９－２３７、および米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号を参照）が挙げられる。使用され得る追加の例示的なプロモーターは、熱調節性遺伝子発現、光調節性遺伝子発現（例えば、エンドウマメｒｂｃＳ－３Ａ；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター；エンドウマメにおいて見出されるクロロフィルａｌｂ結合性タンパク質遺伝子；またはＡｒａｂｓｓｕプロモーター）、ホルモン調節性遺伝子発現（例えば、コムギのＥｍ遺伝子からのアブシジン酸（ＡＢＡ）応答性配列；オオムギおよびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＢＡ誘導性のＨＶＡ１およびＨＶＡ２２、およびｒｄ２９Ａプロモーター；ならびに創傷誘導性遺伝子発現（例えば、ｗｕｎｌ）、器官特異的遺伝子発現（例えば、塊茎特異的貯蔵タンパク質遺伝子；により記載されるトウモロコシからの２３ｋＤａのゼイン遺伝子；またはインゲンマメ（β－ファセオリン遺伝子）、または病原体誘導性プロモーター（例えば、ＰＲ－１、ｐｒｐ－１、または（β－１，３グルカナーゼプロモーター、コムギの真菌誘導性のｗｉｒｌａプロモーター、および線虫誘導性プロモーター、それぞれタバコ乾燥パセリのＴｏｂＲＢ７－５ＡおよびＨｍｇ－１）に関与するものである。
一局面では、提供されるタバコ植物は、ニコチン生合成または輸送に関与する遺伝子の活性の発現の増大または低減をさらに含む。ニコチン生合成に関与する遺伝子としては、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ－アデノシル－メチオニンシンセターゼ（ＳＡＭＳ）が挙げられるがそれに限定されない。ニコチン酸誘導体とメチルピロリニウム陽イオンとの縮合段階を触媒するニコチンシンターゼは解明されていないが、２つの候補遺伝子（Ａ６２２およびＮＢＢ１）が提唱されている。ＵＳ２００７／０２４０７２８Ａ１およびＵＳ２００８／０１２０７３７Ａ１を参照。Ａ６２２はイソフラボンレダクターゼ様タンパク質をコードする。加えて、いくつかのトランスポーターがニコチンの移行に関与し得る。ＭＡＴＥと命名されたトランスポーター遺伝子がクローニングおよび特徴決定されている（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ １０６：２４４７－５２（２００９））。
一局面では、提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比較して、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の増大または低減したレベルのｍＲＮＡ、タンパク質、または両方をさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を直接的に抑制する導入遺伝子をさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を抑制する導入遺伝子または変異をさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子を過剰発現する導入遺伝子をさらに含む。
当技術分野において公知の任意の好適な形質転換方法を使用する記載される組換え構築物または発現カセットを用いるタバコ植物の形質転換もまた開示される。ポリヌクレオチド配列をタバコ植物に導入するための方法は当技術分野において公知であり、安定な形質転換方法、一過性形質転換方法、およびウイルス媒介性の方法が挙げられるがそれに限定されない。「安定な形質転換」は、植物に導入された関心対象のヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれ、その子孫に遺伝することができる形質転換を指す。「一過性形質転換」は、配列が植物に導入され、かつ、一時的にのみ発現されるかまたは一過性にのみ植物中に存在することを意味することが意図される。
ポリヌクレオチドを本開示の植物細胞に導入する好適な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０－３３４）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３１３－３３６；Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２－５６０６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性の形質転換（米国特許第５，１０４，３１０号、同第５，１４９，６４５号、同第５，１７７，０１０号、同第５，２３１，０１９号、同第５，４６３，１７４号、同第５，４６４，７６３号、同第５，４６９，９７６号、同第４，７６２，７８５号、同第５，００４，８６３号、同第５，１５９，１３５号、同第５，５６３，０５５号、および同第５，９８１，８４０号）、直接的な遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７－２７２２）、および衝撃粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１４１，１３１号、同第５，８８６，２４４号、同第５，８７９，９１８号、および同第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－９２６を参照）が挙げられる。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１－４７７；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１－６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－９２６（ダイズ）；ＦｉｎｅｒおよびＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５－１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９－３２４（ダイズ）；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８５）、Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．編（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎ．Ｙ．）、ｐｐ．１９７－２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５－４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０－５６６（ウィスカー媒介性形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５－１５０５（エレクトロポレーション）も参照。
別の局面では、組換え構築物または発現カセットは、植物をウイルスまたはウイルス核酸と接触させることにより植物に導入されてもよい。概しては、そのような方法は、本開示の発現カセットをウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に組み込む工程を含む。発現カセットにおいて使用するためのプロモーターはまた、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写のために用いられるプロモーターを包含することが認識される。ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を伴う、ポリヌクレオチドを植物に導入し、かつ、それにコードされるタンパク質を発現させるための方法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、同第５，８８９，１９０号、同第５，８６６，７８５号、同第５，５８９，３６７号、同第５，３１６，９３１号、およびＰｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２０９－２２１を参照。
器官発生によるものであれ胚発生によるものであれ、クローン法を使用してその後に繁殖され得る任意の植物組織は、組換え構築物または発現カセットを用いて形質転換されてもよい。「器官発生」により、シュートおよび根が成長点の中心から逐次的に発達するプロセスが意図される。「胚発生」により、シュートおよび根が、体細胞からであれ配偶子からであれ、協調した様式（逐次的ではない）において一緒に発達するプロセスが意図される。記載される様々な形質転換プロトコールのために好適な例示的な組織としては、カルス組織、既存の分裂性組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根端分裂組織）ならびに誘導性分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）、胚軸、子葉、葉盤、花粉、ならびに胚などが挙げられるがそれに限定されない。
一局面では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、ガルパオ（Ｇａｌｐａｏ）タバコ、およびオリエンタル（Ｏｒｉｅｎｔａｌ）タバコからなる群より選択されるタバコ種からのものである。別の局面では、提供されるタバコ植物は、バーレイタバコ、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）タバコ、およびダークタバコからなる群より選択されるタバコ種からのものである。
一局面では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコのバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の熱風乾燥タバコの特徴を呈する。熱風乾燥タバコ（バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）またはブライトタバコとも呼ばれる）は、世界のタバコ産生の約４０％の量を占める。熱風乾燥タバコは、乾燥の間に達するゴールデンイエローからディープオレンジの色のため、多くの場合に「ブライトタバコ」とも称される。熱風乾燥タバコは、軽い、鮮烈な芳香および味を有する。熱風乾燥タバコは、概して、糖分が高くかつ油分が低い。主要な熱風乾燥タバコ生育国は、アルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニアおよび米国である。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、ＣＣ １３、ＣＣ ２７、ＣＣ ３３、ＣＣ ３７、ＣＣ ６５、ＣＣ ６７、ＣＣ ７００、ＧＦ ３１８、ＧＬ ３３８、ＧＬ ３６８、ＧＬ ９３９、Ｋ ３４６、Ｋ ３９９、Ｋ３２６、ＮＣ １０２、ＮＣ １９６、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ４７１、ＮＣ ５５、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ９２、ＰＶＨ １１１８、ＰＶＨ １４５２、ＰＶＨ ２１１０、スペイト（ＳＰＥＩＧＨＴ）１６８、スペイト ２２０、スペイト ２２５、スペイト ２２７、スペイト ２３６、および以上の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択される熱風乾燥タバコのバックグラウンドである。別の局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、コッカー（Ｃｏｋｅｒ）４８、コッカー １７６、コッカー３７１ゴールド（Ｃｏｋｅｒ ３７１－Ｇｏｌｄ）、コッカー ３１９、コッカー ３４７、ＧＬ ９３９、Ｋ １４９、Ｋ３２６、Ｋ ３４０、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＮＣ ２７ＮＦ、ＮＣ ３７ＮＦ、ＮＣ ５５、ＮＣ ６０、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８２、ＮＣ ９５、ＮＣ ２９７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７２９、ＮＣ ２３２６、マクネア（ＭｃＮａｉｒ）３７３、マクネア９４４、Ｏｘ ２０７、Ｏｘ ４１４ ＮＦ、レームズ（Ｒｅａｍｓ）１２６、レームズ７１３、レームズ７４４、ＲＧ ８、ＲＧ １１、ＲＧ １３、ＲＧ １７、ＲＧ ２２、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ４、ＲＧ Ｈ５１、スペイトＨ－２０、スペイトＧ－２８、スペイトＧ－５８、スペイトＧ－７０、スペイトＧ－１０８、スペイトＧ－ｌ１１、スペイトＧ－ｌ１７、スペイト１６８、スペイト１７９、スペイトＮＦ－３、Ｖａ １１６、Ｖａ １８２、および以上の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択される熱風乾燥タバコのバックグラウンドである。ＷＯ２００４／０４１００６Ａ１を参照。さらなる局面では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、Ｋ３２６、Ｋ３４６、およびＮＣ１９６からなる群より選択される任意の熱風乾燥のバックグラウンドである。一局面において、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表１５に列挙した品種、および上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択される熱風乾燥タバコ品種のタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子である。ＷＯ２００４／０４１００６Ａ１を参照されたい。
一局面では、提供されるタバコ植物は空気乾燥タバコのバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の空気乾燥タバコ特徴を示す。空気乾燥タバコには、バーレイ（Ｂｕｒｌｅｙ）、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）、およびダーク（ｄａｒｋ）タバコが含まれる。共通の因子は、乾燥が主に熱および湿気の人工的な発生源なくなされることである。バーレイタバコはライトブラウンからダークブラウンの色であり、油が多く、かつ糖が少ない。バーレイタバコは小屋の中で空気乾燥される。主要なバーレイ栽培国は、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイ、および米国である。メリーランドタバコは非常にふっくらしており、良好な燃焼特性、低ニコチン、および中立的な芳香を有する。主要なメリーランド栽培国には米国およびイタリアが含まれる。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｃｌａｙ ４０２、Ｃｌａｙ ４０３、Ｃｌａｙ ５０２、Ｋｙ １４、Ｋｙ ９０７、Ｋｙ ９１０、Ｋｙ ８９５９、ＮＣ ２、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ２０００、ＴＮ ８６、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７１１、Ｒ ７１２、ＮＣＢＨ １２９、Ｂｕ ２１×Ｋｙ １０、ＨＢ０４Ｐ、Ｋｙ １４×Ｌ ８、Ｋｔ ２００、Ｎｅｗｔｏｎ ９８、Ｐｅｄｉｇｏ ５６１、Ｐｆ５６１、およびＶａ ５０９からなる群より選択されるバーレイタバコのバックグラウンドである。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表１６に列挙したタバコ品種、および上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択されるバーレイタバコ品種のものである。さらなる局面では、低アルカロイドまたは低ニコチンタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、ＴＮ ９０、ＫＴ ２０９、ＫＴ ２０６、ＫＴ２１２、および ＨＢ ４４８８からなる群より選択される任意のバーレイのバックグラウンドである。別の局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｍｄ １０、Ｍｄ ４０、Ｍｄ ２０１、Ｍｄ ６０９、Ｍｄ ８７２、およびＭｄ ３４１からなる群より選択されるメリーランドタバコのバックグラウンドである。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表１７に列挙したタバコ品種、および上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択されるメリーランドタバコ品種のものである。
一局面では、提供されるタバコ植物は暗色空気乾燥タバコ（ｄａｒｋ ａｉｒ－ｃｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ）のバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の暗色空気乾燥タバコの特徴を示す。暗色空気乾燥タバコは主に、暗色空気乾燥タバコにミディアムブラウンからダークブラウンの色と独特の芳香を与えるその乾燥プロセスにより他の種類から区別される。暗色空気乾燥タバコは主に噛みタバコおよび嗅ぎタバコの産生において使用される。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、スマトラ（Ｓｕｍａｔｒａ）、ジャティム（Ｊａｔｉｍ）、ドミニカンキュバーノ（Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ Ｃｕｂａｎｏ）、ベスキ（Ｂｅｓｕｋｉ）、ワンサッカー（Ｏｎｅ ｓｕｃｋｅｒ）、グリーンリバー（Ｇｒｅｅｎ Ｒｉｖｅｒ）、バージニアサンキュアード（Ｖｉｒｇｉｎｉａ ｓｕｎ－ｃｕｒｅｄ）、およびパラグアンパサド（Ｐａｒａｇｕａｎ Ｐａｓｓａｄｏ）、ならびに上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択される暗色空気乾燥タバコのバックグラウンドである。
一局面では、提供されるタバコ植物は暗色火力乾燥タバコ（ｄａｒｋ ｆｉｒｅ－ｃｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ）のバックグラウンドであるか、または１つもしくはそれ以上の本明細書に記載の暗色火力乾燥タバコの特徴を示す。暗色火力乾燥タバコは、通常、密閉した乾燥小屋の床上で火力の弱い薪の火を用いて乾燥される。暗色火力乾燥タバコの葉の糖含有量は低いが、ニコチン含有量は高い。暗色火力乾燥タバコは、パイプブレンド物、シガレット、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、および風味の強いシガーを作製するために使用される。暗色火力乾燥タバコの主要な栽培地域は、米国のテネシー、ケンタッキー、およびバージニアである。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、ナローリーフマドール（Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ）、インプルーブドマドール（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍａｄｏｌｅ）、トムロソンマドール（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ Ｍａｄｏｌｅ）、ニュートンＶＨマドール（Ｎｅｗｔｏｎ’ｓ ＶＨ Ｍａｄｏｌｅ）、リトルクリテンデン（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ）、グリーンウッド（Ｇｒｅｅｎ Ｗｏｏｄ）、リトルウッド（Ｌｉｔｔｌｅ Ｗｏｏｄ）、スモールスタークブラックマモス（Ｓｍａｌｌ Ｓｔａｌｋ Ｂｌａｃｋ Ｍａｍｍｏｔｈ）、ＤＴ ５０８、ＤＴ ５１８、ＤＴ ５９２、ＫＹ １７１、ＤＦ ９１１、ＤＦ ４８５、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＶＡ ３０９、およびＶＡ ３５９からなる群より選択される暗色火力乾燥タバコのバックグラウンドである。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表１８に列挙したタバコ品種、および上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択される暗色火力乾燥タバコ品種のものである。
一局面では、提供されるタバコ植物はオリエンタルタバコのバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上のオリエンタルタバコの特徴を示す。オリエンタルタバコは、典型的には、トルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリア、およびルーマニアなどの東地中海地域において栽培されるという事実に起因してギリシャ、アロマ（ａｒｏｍａ）、およびトルコタバコとも称される。今日のオリエンタル品種に特徴的な小さな植物と葉のサイズや、その特有の芳香性は、過去何世紀にもわたり生育してきた、やせた土壌とストレスの多い気候条件に植物が適応した結果である。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、イズミル（Ｉｚｍｉｒ）、カテリニ（Ｋａｔｅｒｉｎｉ）、サムスン（Ｓａｍｓｕｎ）、バスマ（Ｂａｓｍａ）およびクルモブグラド（Ｋｒｕｍｏｖｇｒａｄ）、トラブゾン（Ｔｒａｂｚｏｎ）、テサリアン（Ｔｈｅｓａｌｉａｎ）、タソバ（Ｔａｓｏｖａ）、シノプ（Ｓｉｎｏｐ）、イズミット（Ｉｚｍｉｔ）、ヘンデク（Ｈｅｎｄｅｋ）、エジルン（Ｅｄｉｒｎｅ）、セムジンリ（Ｓｅｍｄｉｎｌｉ）、アディヤンマン（Ａｄｉｙａｎｍａｎ）、ヤイラダグ（Ｙａｙｌａｄａｇ）、イスケンデラン（Ｉｓｋｅｎｄｅｒｕｎ）、ダズセ（Ｄｕｚｃｅ）、マセドニアン（Ｍａｃｅｄｏｎｉａｎ）、マブラ（Ｍａｖｒａ）、プリレプ（Ｐｒｉｌｅｐ）、バフラ（Ｂａｆｒａ）、ブルサ（Ｂｕｒｓａ）、ブカク（Ｂｕｃａｋ）、ビトリス（Ｂｉｔｌｉｓ）、バリケシル（Ｂａｌｉｋｅｓｉｒ）、ならびに上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択されるオリエンタルタバコのバックグラウンドである。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表１９に列挙したタバコ品種、および上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択されるオリエンタルタバコ品種のものである。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表２０に列挙したタバコ品種、および上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択されるシガータバコ品種のものである。
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物もしくは種子または改変タバコ植物もしくは種子は、表２１に列挙したタバコ品種、および上記の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択されるタバコ品種のものである。
一局面では、本明細書に記載の改変タバコ植物、種子、または細胞は、表１５、表１６、表１７、表１８、表１９、表２０、および表２１に列挙したタバコ品種からなる群より選択される品種に由来する。
一局面では、本明細書に記載のタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株（これらは低アルカロイド、低ニコチン、高アルカロイド、または高ニコチンであり得る）は、ＢＵ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、コッカー１７６、コッカー３１９、コッカー３７１ゴールド、コッカー４８、ＣＵ ２６３、ＤＦ９１１、ガルパオタバコ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ １０、ＫＹ １４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８ ＬＣ、リトル・クリテンデン（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ）、マクネア３７３、マクネア（９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、ナロー・リーフ・マドーレ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、ニール・スミス・マドール（Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ）、ＯＸＦＯＲＤ ２０７、「ペリック」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１１、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、スペイト１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ－２８、スペイトＧ－７０、スペイトＨ－６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ １４０６、ＴＩ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（トム・ロッソン）マドーレ、ＶＡ ３０９、またはＶＡ３５９、メリーランド６０９、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ＨＢ４４８８ＰＬＣ、ＫＴ２０６ＬＣ、ＫＴ２０９ＬＣ、ＫＴ２１０ＬＣ、ＫＴ２１２ＬＣ、Ｒ６１０ＬＣ、ＰＶＨ２３１０、ＮＣ１９６、ＫＴＤ１４ＬＣ、ＫＴＤ６ＬＣ、ＫＴＤ８ＬＣ、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０５ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１８ＬＣ、ＰＤ７３１９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ、シャーレイ（Ｓｈｉｒｅｙ）ＬＣ、または当技術分野において公知の標準的なタバコ育種技術による任意の商用のタバコ品種に本質的に由来するか、またはその遺伝的背景である。
暗色空気乾燥、バーレイ、メリーランド、暗色火力乾燥、またはオリエンタル種の全ての上記の特定の品種は、例示的な目的のためにのみ列記されている。任意の追加の暗色空気乾燥、バーレイ、メリーランド、暗色火力乾燥、オリエンタル品種もまた本出願において想定される。
記載されるタバコ植物の集団もまた提供される。一局面では、タバコ植物の集団は、１エーカー当たり約５，０００～約８０００、約５，０００～約７，６００、約５，０００～約７，２００、約５，０００～約６，８００、約５，０００～約６，４００、約５，０００～約６，０００、約５，０００～約５，６００、約５，０００～約５，２００、約５，２００～約８，０００、約５，６００～約８，０００、約６，０００～約８，０００、約６，４００～約８，０００、約６，８００～約８，０００、約７，２００～約８，０００、または約７，６００～約８，０００個の植物の栽植密度を有する。別の局面では、タバコ植物の集団は、低い～中程度の肥沃度を有する土壌型中に存在する。
記載されるタバコ植物からの種子の容器もまた提供される。本開示のタバコ種子の容器は、任意の数、重量、または体積の種子を含有してもよい。例えば、容器は、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００、少なくとも約２５００、少なくとも約３０００、少なくとも約３５００、少なくとも約４０００、もしくはそれ以上、または約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００個、もしくはそれ以上より多い種子を含有し得る。代替的に、容器は、少なくとも約１オンス、少なくとも約５オンス、少なくとも約１０オンス、少なくとも約１ポンド、少なくとも約２ポンド、少なくとも約３ポンド、少なくとも約４ポンド、少なくとも約５ポンド、もしくはそれ以上、または約１オンス、約５オンス、約１０オンス、約１ポンド、約２ポンド、約３ポンド、約４ポンド、約５ポンド、もしくはそれ以上より多い種子を含有し得る。タバコ種子の容器は、当技術分野において利用可能な任意の容器であってもよい。非限定的な例として、容器は、箱、バッグ、小包、ポーチ、テープロール、チューブ、またはボトルであってもよい。
記載される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料もまた提供される。より高いレベルの総アルカロイドまたはニコチンを有する記載されるタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料がさらに提供される。
「乾燥」は、水分を低減し、かつ、タバコ葉に黄金色を与えかつそれによりデンプンが糖に変換されるクロロフィルの分解をもたらす熟成プロセスである。乾燥タバコは、したがって、収穫された緑色の葉と比較してより高い還元糖含有量およびより低いデンプン含有量を有する。一局面では、提供される緑色の葉のタバコは、従来の手段、例えば、熱風乾燥、納屋乾燥、火力乾燥、空気乾燥、または太陽乾燥を使用して乾燥され得る。例えば、異なる種類の乾燥方法の説明のためにＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥タバコは、通常、１０％～約２５％の範囲内の水分含有量において数年（例えば、２～５年）にわたり圧縮条件において木製ドラム（例えば、大だる）または段ボール箱中で熟成される。米国特許第４，５１６，５９０号および同第５，３７２，１４９号を参照。乾燥および熟成されたタバコは次にさらに加工され得る。さらなる加工としては、様々な温度での蒸気の導入ありまたはなしでの真空下でのタバコのコンディショニング、低温殺菌、および発酵が挙げられる。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０～２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、同第５，３７２，１４９号；米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号；およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥、熟成、および発酵されたタバコはさらに加工（例えば、切断、細断、膨化、またはブレンド）され得る。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、および同第４，９８７，９０７号を参照。一局面では、本開示の乾燥タバコ材料は太陽乾燥されている。別の局面では、本開示の乾燥タバコ材料は、熱風乾燥、空気乾燥、または火力乾燥されている。
本開示のタバコ株、品種またはハイブリッドから得られるタバコ材料は、タバコ製品を作製するために使用され得る。本明細書において使用される場合、「タバコ製品」は、ヒトでの使用または消費が意図されるタバコから作製または派生された任意の製品として定義される。
提供されるタバコ製品としては、シガレット製品（例えば、シガレットおよびビディシガレット）、シガー製品（例えば、葉巻タバコ（ｃｉｇａｒ ｗｒａｐｐｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ）およびシガリロ）、パイプタバコ製品、タバコに由来する製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙タバコ製品（例えば、湿潤嗅ぎタバコ、乾燥嗅ぎタバコ、および噛みタバコ）、フィルム、チュワブル、タブ、成形部分、ゲル、消費可能単位、不溶性マトリックス、中空形状、再構成タバコ、ならびに膨化タバコなどが挙げられるがそれに限定されない。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０１９１５４８号を参照。
本明細書において使用される場合、「シガレット」は、「ロッド」および「フィラー」を有するタバコ製品を指す。シガレット「ロッド」は、シガレットペーパー、フィルター、プラグラップ（フィルター材料を含有するために使用される）、シガレットペーパー（フィラーを含む）をフィルターに保持するティッピングペーパー（ｔｉｐｐｉｎｇ ｐａｐｅｒ）、およびこれらの成分を一緒に保持する全ての接着剤を含む。「フィラー」としては、（１）再構成タバコおよび膨化タバコが挙げられるがそれに限定されない全てのタバコ、（２）非タバコ代用品（シガレットペーパー内に巻かれたタバコを伴ってもよいハーブ、非タバコ植物材料および他のスパイスが挙げられるがそれに限定されない）、（３）ケーシング、（４）風味物質、ならびに（５）全ての他の添加物（タバコおよび代用品に混合され、シガレット中に巻かれる）が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「再構成タバコ」は、シート形態に加工され、かつタバコに似せるように細片に切断された、タバコ塵および他のタバコ屑材料から作製されたタバコフィラーの部分を指す。コストの節約に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖との反応を使用する風味発生の加工からシガレットの味に対するその寄与のために非常に重要である。
本明細書において使用される場合、「膨化タバコ」は、タバコが「膨らむ」ように好適な気体の膨張を通じて加工されて、低減された密度およびより大きい充填能力を結果としてもたらすタバコフィラーの部分を指す。それは、シガレットにおいて使用されるタバコの重量を低減する。
本開示の植物に由来するタバコ製品としてはまた、シガレットと、特にフィルター要素を含む、他の喫煙物品とが挙げられ、喫煙可能材料のロッドがタバコブレンド物内に乾燥タバコを含む。一局面では、本開示のタバコ製品は、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される。別の局面では、本開示のタバコ製品は無煙タバコ製品である。無煙タバコ製品は燃焼されず、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、スヌース、および乾燥嗅ぎタバコが挙げられるがそれに限定されない。噛みタバコは、典型的には大きいパウチ様パッケージ中に包装されてプラグまたはツイストにおいて使用される粗く分割されたタバコ葉である。湿潤無煙タバコは、ルース（ｌｏｏｓｅ）形態またはパウチ形態において提供される湿潤の、より微細に分割されたタバコであり、典型的には、丸缶中に包装され、成人タバコ消費者の頬と歯肉との間に置かれるピンチとしてまたはパウチ中で使用される。スヌースは、熱処理される無煙タバコである。乾燥嗅ぎタバコは、口の中に置かれるまたは経鼻的に使用される微細に粉砕されたタバコである。さらなる局面では、本開示のタバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される。さらに別の局面では、本開示のタバコ製品は、電子加熱シガレット、ｅ－シガレット、電子的気化デバイスからなる群より選択される。
一局面では、本開示のタバコ製品はブレンドタバコ製品であり得る。別の局面では、本開示のタバコ製品は低ニコチンタバコ製品であり得る。さらなる局面では、本開示のタバコ製品は、約３ｍｇ／ｇ未満のレベルのノルニコチンを含んでもよい。例えば、そのような製品中のノルニコチン含有量は、３．０ｍｇ／ｇ、２．５ｍｇ／ｇ、２．０ｍｇ／ｇ、１．５ｍｇ／ｇ、１．０ｍｇ／ｇ、７５０μｇ／ｇ、５００ｐｇ／ｇ、２５０ｐｇ／ｇ、１００ｐｇ／ｇ、７５ｐｇ／ｇ、５０ｐｇ／ｇ、２５ｐｇ／ｇ、１０ｐｇ／ｇ、７．０ｐｇ／ｇ、５．０ｐｇ／ｇ、４．０ｐｇ／ｇ、２．０ｐｇ／ｇ、１．０ｐｇ／ｇ、０．５ｐｇ／ｇ、０．４ｐｇ／ｇ、０．２ｐｇ／ｇ、０．１ｐｇ／ｇ、０．０５ｐｇ／ｇ、０．０１ｐｇ／ｇ、または検出不可能であり得る。
一局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、約０．０２％、約０．０５％、約０．７５％、約０．１％、約０．１５％、約０．２％、約０．３％、約０．３５％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、約３％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、および約９％からなる群より選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．０２％、約０．０２％～０．０５％、約０．０５％～０．７５％、約０．７５％～０．１％、約０．１％～０．１５％、約０．１５％～０．２％、約０．２％～０．３％、約０．３％～０．３５％、約０．３５％～０．４％、約０．４％～０．５％、約０．５％～０．６％、約０．６％～０．７％、約０．７％～０．８％、約０．８％～０．９％、約０．９％～１％、約１％～１．１％、約１．１％～１．２％、約１．２％～１．３％、約１．３％～１．４％、約１．４％～１．５％、約１．５％～１．６％、約１．６％～１．７％、約１．７％～１．８％、約１．８％～１．９％、約１．９％～２％、約２％～２．１％、約２．１％～２．２％、約２．２％～２．３％、約２．３％～２．４％、約２．４％～２．５％、約２．５％～２．６％、約２．６％～２．７％、約２．７％～２．８％、約２．８％～２．９％、約２．９％～３％、約３％～３．１％、約３．１％～３．２％、約３．２％～３．３％、約３．３％～３．４％、約３．４％～３．５％、および約３．５％～３．６％からなる群より選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％～０．１％、約０．０２％～０．２％、約０．０３％～０．３％、約０．０４％～０．４％、約０．０５％～０．５％、約０．７５％～１％、約０．１％～１．５％、約０．１５％～２％、約０．２％～３％、および約０．３％～３．５％からなる群より選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
本開示はまた、望ましいレベルの総アルカロイドまたはニコチン、例えば、低ニコチンまたはニコチン非含有を含むタバコ株、栽培品種、または品種を育種するための方法を提供する。育種は、任意の公知の手法を介して実行され得る。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰマッピング、ハプロタイプマッピング、または類似の技術は、望ましい形質またはアレルをタバコ植物に移入または育種するためにマーカー補助選択（ＭＡＳ）育種プログラムにおいて使用されてもよい。例えば、育種家は、Ｆ１ハイブリッド植物を使用してまたはＦ１ハイブリッド植物を耕種学的に望ましい遺伝子型を有する他のドナー植物とさらに交雑してＦ２または戻し交雑世代において分離集団を作製することができる。Ｆ２または戻し交雑世代における植物は、当技術分野において公知のまたは本明細書において列記される技術の１つを使用して所望の耕種学的形質または望ましい化学的プロファイルについてスクリーニングされ得る。期待される遺伝パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に依存して、所望の個々の植物の同定を補助するために戻し交雑の各サイクルの前に選択された植物の自家受粉が行われ得る。戻し交雑または他の育種手法は、反復親（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｐａｒｅｎｔ）の所望の表現型が回収されるまで反復され得る。本開示における反復親は、熱風乾燥品種、バーレイ品種、暗色空気乾燥品種、暗色火力乾燥品種、またはオリエンタル品種であり得る。他の育種技術は、例えば、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
記載されるタバコ植物を使用する植物育種プログラムの結果としては、本開示の有用な株、栽培品種、品種、子孫、近交系、およびハイブリッドが挙げられる。本明細書において使用される場合、「品種」という用語は、同じ種の他の植物からそれらを分離する一定の特徴を共有する植物の集団を指す。品種は、常にではないが多くの場合に、商業的に販売される。１つまたはそれ以上の特徴的な形質を有するが、品種は、その品種内の個体間の非常に小さい全体的なバリエーションによりさらに特徴付けられる。「純粋株」品種は、組織または細胞培養技術を使用して単一の親からの自家受粉および選択、または栄養繁殖のいくつかの世代により作製されてもよい。品種は、別の株または品種に本質的に由来し得る。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ（１９６１年１２月２日；１９７２年１１月１０日、１９７８年１０月２３日、および１９９１年３月１９日にＧｅｎｅｖａにおいて改訂）により定義されるように、品種は、ａ）主に初期品種、または初期品種の遺伝子型もしくは遺伝子型の組合せの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現を保持しながら主に初期品種に由来する品種に由来し、ｂ）初期品種から明確に区別可能であり、かつｃ）誘導という行為の結果としてもたらされる差異を除いて、初期品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現において初期品種と合致する場合に、初期品種に「本質的に由来する」。本質的に由来する品種は、例えば、天然のもしくは誘導された変異体、体細胞繁殖系バリアント、初期品種の植物からのバリアント個体の選択、戻し交雑、または形質転換により得られ得る。第１のタバコ品種および第１の品種が本質的に由来する第２のタバコ品種は、本質的に同一の遺伝的背景を有すると考えられる。品種から区別されるような「株」は、最も多くの場合に、非商業的に、例えば植物研究において使用される植物の群を表す。株は、典型的には、１つまたはそれ以上の関心対象の形質について個体間の全体的なバリエーションをほとんど示さないが、他の形質について個体間で何らかのバリエーションがあってもよい。
一局面では、本開示は、低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つもしくはそれ以上の子孫タバコ植物を産生する工程、（ｂ）低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つもしくはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定する工程であって、多型マーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接する染色体間隔内にある、工程、ならびに（ｃ）低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択する工程を含む、方法を提供する。別の局面では、これらの方法は、選択された子孫タバコ植物を第２のタバコ品種と戻し交雑する工程をさらに含む。さらなる局面では、これらの方法は、（ｄ）選択された子孫植物をそれ自体と、または第２のタバコ品種と交雑して、１つもしくはそれ以上のさらなる子孫タバコ植物を産生する工程、および（ｅ）低ニコチン形質を含むさらなる子孫タバコ植物を選択する工程をさらに含む。一局面では、選択する工程（ｅ）はマーカー補助選択を含む。一局面では、これらの方法は、低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を生じさせる。一局面では、これらの方法は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ移入を含む単一遺伝子変換を生じさせる。一局面では、第２のタバコ品種はエリート品種である。別の局面では、これらの方法の遺伝子型判定する工程は１またはそれ以上の分子マーカーアッセイを伴う。別の局面では、この方法で使用される多型マーカーは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純反復配列（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群より選択される多型を含む。別の局面では、選択された子孫タバコ植物は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座においてＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１と比較して短い染色体移入を含む。
別の局面では、本開示は、低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生する工程、（ｂ）低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定する工程であって、多型マーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカー、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群より選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の範囲内にある、工程、ならびに（ｃ）低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択する工程を含む、方法を提供する。一態様では、この方法は、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座と関連付けられる、または密接に関連する１つまたはそれ以上の分子マーカーの他に、Ｎｉｃ２遺伝子座と関連付けられる、または密接に関連する１つまたはそれ以上の分子マーカーについて同時にまたは並行して選択する工程を含む。
一局面では、本開示は、低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する方法であって、（ａ）タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程、（ｂ）Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座と密接に関連した１つまたはそれ以上のマーカーについて核酸をアッセイする工程、および（ｃ）マーカーアッセイに基づいて低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する工程を含む、方法を提供する。一局面では、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座と密接に関連したアッセイされる１つまたはそれ以上のマーカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカー、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、１５３、１５４、１５８、１５９、および２０２～２０５からなる群より選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の範囲内にある。別の局面では、この方法は、Ｎｉｃ２遺伝子座と密接に関連した１つまたはそれ以上のマーカーについてアッセイする工程をさらに含む。一局面では、Ｎｉｃ２遺伝子座と密接に関連したアッセイされる１つまたはそれ以上のマーカーは、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８の１つに位置する多型遺伝子座のいずれか１つの約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の範囲内にある。一局面では、この方法は、選択された植物のニコチンレベルを決定して低ニコチン形質を確認する工程をさらに含む。
低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つもしくはそれ以上の子孫タバコ植物を産生する工程、（ｂ）低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つもしくはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定する工程であって、多型マーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接する染色体間隔内にある、工程、ならびに（ｃ）低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択する工程を含む、方法もまた開示される。一局面では、これらの方法は、低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を生じさせる。一局面では、これらの方法は、Ｎｉｃ２移入を含む単一遺伝子変換を生じさせる。一局面では、第２のタバコ品種はエリート品種である。別の局面では、これらの方法の遺伝子型判定する工程は１つもしくはそれ以上の分子マーカーアッセイを伴う。別の局面では、この方法で使用される多型マーカーは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純反復配列（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群より選択される多型を含む。別の局面では、選択された子孫タバコ植物は、Ｎｉｃ２遺伝子座においてＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１と比較して短い染色体欠失を含む。
本明細書において使用される場合、「遺伝子座」は、多型核酸、形質決定因子、遺伝子、またはマーカーが位置する染色体領域である。本開示の遺伝子座は集団中に１つもしくはそれ以上の多型を含み、例えば、代替的なアレルが一部の個体中に存在する。本明細書において使用される場合、「アレル」は、特定の遺伝子座における代替的な核酸配列を指す。アレルの長さは１ヌクレオチド塩基と短い場合があるが、典型的にはもっと長い。例えば、ヘテロ接合個体の異なる染色体について、または集団中の異なるホモ接合個体もしくはヘテロ接合個体の間で起こるように、例えば、第１のアレルが、ある１つの染色体上で起こり得るのに対して、第２のアレルが第２の相同染色体上で起こる。本明細書において使用される場合、「染色体間隔」という用語は、１本の染色体上にあるゲノムＤＮＡの連続した直線的な範囲を示す。
本明細書において使用される場合、センチモルガン（「ｃＭ」）は組換え頻度の尺度の単位である。１ｃＭとは、一世代での交叉に起因して、ある１つの遺伝子座にあるマーカーが第２の遺伝子座にあるマーカーから分離する可能性が１％に等しいことである。本明細書において参照される遺伝子距離はコーサンビー（Ｋｏｓａｍｂｉ）関数（Ｋｏｓａｍｂｉ，Ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｐ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｅｕｇｅｎｉｃｓ，１２：１７２－７５（１９４４））を使用して組換え値から算出することができる。
本明細書において使用される場合、「密接に関連する」または「関連付けられる」は、マーカーまたは遺伝子座が、別のマーカーまたは遺伝子座の約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の範囲内にあることを意味する。例えば、２０ｃＭは、約２０％に等しいか、または約２０％未満の頻度でマーカーと遺伝子座との間で組換えが起こることを意味する。
本明細書において使用される場合、「移入」または「移入する」は、１つの遺伝的背景から別の遺伝的背景への遺伝子座の所望のアレルの伝達を指す。
本明細書において使用される場合、「交雑される」または「交雑」は、受精（例えば、細胞、種子、または植物）を介して子孫を産生することを意味し、植物の間の交雑（有性）および自家受精（自殖）を含む。
本明細書において使用される場合、「戻し交雑」および「戻し交雑する」は、子孫植物がその親の１つに戻して繰り返して交雑される方法を指す。戻し交雑スキームにおいて、「ドナー」親は、移入される所望の遺伝子または遺伝子座を有する親植物を指す。「レシピエント」親（１回もしくは複数回使用される）または「反復」親（２回もしくはそれ以上の回数使用される）は、遺伝子または遺伝子座が移入されている親植物を指す。初期交雑はＦ１世代を生じさせる。「ＢＣ１」という用語は反復親の２回目の使用を指し、「ＢＣ２」は反復親の３回目の使用を指す、などである。一局面では、戻し交雑は繰り返して行われ、連続する戻し交雑世代それぞれの子孫個体は、それ自体が同じ親遺伝子型に対して戻し交雑される。
本明細書において使用される場合、「単一遺伝子変換される」または「単一遺伝子変換」は、戻し交雑として公知の植物育種技術を使用して、または遺伝子操作を介して開発される植物を指し、ここで、戻し交雑技術を介してまたは遺伝子操作を介して品種に移入される単一遺伝子に加えて、品種の所望の形態学的および生理学的特徴の本質的に全てが元通りとされる。
本明細書において使用される場合、「エリート品種」は、優れた耕種学的性能のための育種および選択の結果としてもたらされた任意の品種を意味する。
本明細書において使用される場合、マーカー補助選択または育種の文脈における「選択する」または「選択」は、ある特定の予め決定された基準に基づく、通常は集団からの所望の個体の採集または選出の行為を指す。
本明細書において使用される場合、「形質」という用語は、遺伝子型により影響され得る細胞または生物の１つまたはそれ以上の検出可能な特徴を指す。表現型は、肉眼で、または当技術分野において公知の評価の任意の他の手段により観察可能であり得、該手段は、例えば、顕微鏡法、生化学的分析、ゲノム解析、特定の耐病性についてのアッセイなどである。一部の場合には、表現型は、単一の遺伝子または遺伝子座、例えば、「単一の遺伝子形質」により直接的に制御される。他の場合には、表現型はいくつかの遺伝子の結果である。
本明細書において使用される場合、「マーカーアッセイ」は、特定の方法、例えば、少なくとも１つの表現型（例えば、種子の色、花の色、または他の視覚的に検出可能な形質）の測定、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、単一塩基伸長、電気泳動、配列アライメント、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、マイクロアレイベースの技術、および核酸シークエンシング技術などを使用して特定の遺伝子座における多型を検出する方法を意味する。
本明細書において使用される場合、「マーカー支援選抜」（ＭＡＳ）は、表現型がマーカー遺伝子型に基づいて選択されるプロセスである。「マーカー支援選抜育種」は、所望の形質に関連した１つまたはそれ以上の核酸を植物から検出し、次に、それらの１つまたはそれ以上の核酸を有する植物または生殖質を選択することにより１つまたはそれ以上の植物中の所望の１つまたはそれ以上の形質を選択するプロセスを指す。
本明細書において使用される場合、「多型」は、集団中の１つまたはそれ以上のバリエーションの存在を意味する。多型は、核酸のヌクレオチド配列におけるバリエーションとして現れてもよく、タンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションとして現れてもよい。多型には、１つまたはそれ以上の個体の集団における１つまたはそれ以上の遺伝子座における核酸配列または核酸の特徴の１つまたはそれ以上のバリエーションの存在が含まれる。バリエーションは、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの塩基の変化、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入、または１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含んでもよいが、それに限定されない。多型は、核酸複製におけるランダムなプロセスから、突然変異誘発を通じて、可動性ゲノム要素の結果として、コピー数の変化から、ならびに減数分裂、例えば、不等交叉、ゲノム重複、ならびに染色体の切断および融合のプロセスの間に生じることがある。バリエーションは共通して見出されてもよく、集団内に低い頻度で存在してもよい。前者は一般的な植物育種において大きな有用性があり、後者は、まれだが重要な表現型バリエーションと関連付けられることがある。有用な多型としては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純反復配列（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰを挙げることができる。遺伝子マーカー、遺伝子、ＤＮＡ由来配列、ＲＮＡ由来配列、プロモーター、遺伝子の５’非翻訳領域、遺伝子の３’非翻訳領域、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、耐性遺伝子座、サテライトマーカー、導入遺伝子、ｍＲＮＡ、ｄｓ ｍＲＮＡ、転写プロファイル、およびメチル化パターンも多型を含むことがある。加えて、前述のものの存在、非存在、またはコピー数の変化は多型を含むことがある。
本明細書において使用される場合、「ＳＮＰ」または「単一ヌクレオチド多型」は、ゲノム配列中の１個のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）が変更されるか、または可変である時に起こる配列バリエーションを意味する。「ＳＮＰマーカー」は、ＳＮＰがゲノム上の部位にマッピングされた時に存在する。
本明細書において使用される場合、「マーカー」または「分子マーカー」または「マーカー遺伝子座」は、ゲノム上の特定の遺伝子座を特徴付けるほど十分にユニークな核酸配列またはアミノ酸配列を表すために使用される用語である。異なって遺伝し、かつ関心対象の表現型形質と連鎖不平衡を示す限り、任意の検出可能な多型形質をマーカーとして使用することができる。従って、各マーカーは、ユニークなヌクレオチド配列を有する、特定のＤＮＡセグメントの指標である。地図上の位置は、互いに対する特定のマーカーの相対位置の尺度を提供する。ある形質がある特定のマーカーに関連していると記載される場合、その形質に影響を及ぼす配列をもつ実際のＤＮＡセグメントは通常、マーカーと同時分離すると理解される。形質の両側にマーカーが同定されたら、形質の場所をもっと正確かつ確実に突き止めることができる。交雑種の子孫におけるマーカー出現を測定することにより、形質そのものの出現を実際に評価することなく比較的簡単な分子試験によって形質の存在を検出することができる。形質を実際に評価するには、形質が発現する段階まで、および／または環境条件下で植物を生育させることが必要になるので、形質そのものの出現を実際に評価することは困難であり、かつ時間がかかることがある。一局面では、使用されるマーカーは、Ｑｇｅｎｅバージョン２．２３（１９９６）およびデフォルトパラメーターなどの当技術分野において公知の方法を使用して測定して、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦまたはＮｉｃ２＿ＥＲＦ遺伝子座と２もしくはそれ以上、３もしくはそれ以上、４もしくはそれ以上、５もしくはそれ以上、６もしくはそれ以上、７もしくはそれ以上、８もしくはそれ以上、または９もしくはそれ以上のＬＯＤスコアを示す。
本開示の任意のタバコ植物は、例えば、当技術分野において公知の技術を使用する遺伝子構築物または導入遺伝子を用いる形質転換により、追加の耕種学的に望ましい形質をさらに含み得ることが理解される。非限定的に、所望の形質の例は、除草剤抵抗性、有害生物抵抗性、耐病性；高い収率；高いグレード指数値；治癒可能性；乾燥品質；機械的収穫可能性；保持能力；葉品質；高さ、植物成熟度（例えば、早期成熟、早期成熟から中程度成熟、中程度成熟、中程度成熟から後期成熟、もしくは後期成熟）；茎サイズ（例えば、小さい、中程度、もしくは大きい茎）；または植物１つ当たりの葉数（例えば、少ない（例えば、５～１０枚の葉）、中程度（例えば、１１～１５枚の葉）、または多数（例えば、１６～２１枚）の葉）、または任意の組合せである。一局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物または種子は、１つまたはそれ以上の殺虫タンパク質、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶タンパク質またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）からの栄養殺虫タンパク質、例えば、ＶＩＰ３などを発現する１つまたはそれ以上の導入遺伝子を含む（例えば、Ｅｓｔｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１３７を参照）。別の局面では、タバコ植物は、落葉病への抵抗性（米国特許第５，６８９，０３５号）またはシスト線虫への抵抗性（米国特許第５，４９１，０８１号）を付与する移入された形質をさらに含む。
本開示はまた、変化したニコチンまたは総アルカロイドレベルを含むがそのようなニコチンレベルの変化を有しない対応する初期タバコ植物の収率と同等の収率を有するタバコ植物を提供する。一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、約１２００～３５００、約１３００～３４００、約１４００～３３００、約１５００～３２００、約１６００～３１００、約１７００～３０００、約１８００～２９００、約１９００～２８００、約２０００～２７００、約２１００～２６００、約２２００～２５００、および約２３００～２４００ｌｂ／エーカーからなる群より選択される収率を提供する。別の局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、約１２００～３５００、約１３００～３５００、約１４００～３５００、約１５００～３５００、約１６００～３５００、約１７００～３５００、約１８００～３５００、約１９００～３５００、約２０００～３５００、約２１００～３５００、約２２００～３５００、約２３００～３５００、約２４００～３５００、約２５００～３５００、約２６００～３５００、約２７００～３５００、約２８００～３５００、約２９００～３５００、約３０００～３５００、および約３１００～３５００ｌｂ／エーカーからなる群より選択される収率を提供する。さらなる局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物は、ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ変異、ｎｉｃ２変異、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ導入遺伝子、Ｎｉｃ２導入遺伝子、またはその組合せを除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の６５％～１３０％、７０％～１３０％、７５％～１３０％、８０％～１３０％、８５％～１３０％、９０％～１３０％、９５％～１３０％、１００％～１３０％、１０５％～１３０％、１１０％～１３０％、１１５％～１３０％、または１２０％～１３０％の収率を提供する。さらなる局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物は、ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ変異、ｎｉｃ２変異、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ導入遺伝子、Ｎｉｃ２導入遺伝子、またはその組合せを除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の７０％～１２５％、７５％～１２０％、８０％～１１５％、８５％～１１０％、または９０％～１００％の収率を提供する。
一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群より選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群より選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の２つまたはそれ以上を呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群より選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の３つまたはそれ以上を呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群より選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群より選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の２つまたはそれ以上を呈する。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群より選択されるＬＡ ＢＵ２１形質の３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。
一局面では、開示される改変タバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群より選択される形質に実質的に影響することなく所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含む。
一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物と実質的に同等の形質をさらに含み、該形質は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群より選択される。
一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い収率をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％の収率をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％の収率をさらに含む。
一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％の摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％の摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。
一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高いクロロフィルレベルをさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％のクロロフィルレベルをさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％のクロロフィルレベルをさらに含む。
一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の単位葉面積当たりの葉肉細胞数と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い単位葉面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の単位葉面積当たりの葉肉細胞数と比べて７０％～１４０％、７５％～１３５％、８０％～１３０％、８５％～１２５％、９０％～１２０％、９５％～１１５％、または１００％～１１０％の単位葉面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の単位葉面積当たりの葉肉細胞数と比べて７０％～８０％、７５％～８５％、８０％～９０％、８５％～９５％、９０％～１００％、９５％～１０５％、１０５％～１１５％、１１０％～１２０％、１１５％～１２５％、１２０％～１３０％、１２５～１３５％、または１３０％～１４０％の単位葉面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。
一局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、機械収穫のために適合されている。別の局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、機械で収穫される。
一局面では、提供されるタバコ植物はハイブリッド植物である。ハイブリッドは、第１の品種の雌性親植物（例えば、種子親）の自家受粉を予防して、第２の品種の雄性親植物からの花粉が雌性親植物に授精することを可能とし、Ｆ１ハイブリッド種子が雌性植物において形成されることを可能とすることにより産生され得る。雌性植物の自家受粉は、早期の花発達ステージにおいて花を除雄することにより予防され得る。代替的に、花粉形成は、雄性不稔性の形態を使用して雌性親植物において予防され得る。例えば、雄性不稔性は、導入遺伝子が小胞子形成および／もしくは花粉形成を阻害する雄性不稔性（ＭＳ）、もしくはトランスジェニック雄性不稔性、または自家不和合性により生じ得る。ＭＳを含有する雌性親植物は特に有用である。雌性親植物がＭＳである局面では、花粉が雄性稔性植物から収穫され、ＭＳ雌性親植物の柱頭に手動で適用されてもよく、結果として生じたＦ１種子が収穫される。
植物は、単交雑タバコＦ１ハイブリッドを形成するために使用され得る。雄性親植物からの花粉は、Ｆ１種子を形成するために、除雄された雌性親植物または雄性不稔性の雌性親植物に手動で移動される。代替的に、単交雑Ｆ１ハイブリッドが雌性親として使用されて異なる雄性親と交雑される三系交雑が実行され得る。別の代替として、２つの異なる単交雑のＦ１子孫がそれら自体で交雑される二重交雑ハイブリッドが作製され得る。二重交雑ハイブリッドを形成する場合の雌性親の自家受粉を予防するための特定の利点のために自家不和合性が使用され得る。
一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は雄性不稔性である。別の局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は細胞質雄性不稔性である。雄性不稔性のタバコ植物は、当技術分野において公知の任意の方法により産生されてもよい。雄性不稔性のタバコを産生する方法は、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ ６６９－６９８ Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．７６１ ｐｐに記載されている。
さらなる局面では、提供されるタバコ部分としては、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、さや、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養物、シュート、細胞、およびプロトプラストが挙げられるがそれに限定されない。一局面では、提供されるタバコ部分は種子を含まない。一局面では、本開示は、生殖材料ではなく、かつ植物の天然の生殖を媒介しないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示はまた、生殖材料であり、かつ植物の天然の生殖を媒介するタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示は、光合成を介して維持され得ないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示は、体細胞性タバコ植物細胞を提供する。体細胞は、生殖細胞系列細胞とは異なり、植物生殖を媒介しない。
提供される細胞、組織、および器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、内乳、根、シュート、茎、さや、花、花序、茎、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、がく、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、師部、管束組織からのものであってもよい。別の局面では、本開示は、タバコ植物葉緑体を提供する。さらなる局面では、本開示は、表皮細胞、気孔細胞、葉毛もしくは根毛、貯蔵根、または塊茎を提供する。別の局面では、本開示は、タバコプロトプラストを提供する。
タバコ植物は、無性生殖または栄養繁殖を介してではなく、種子を介して天然に生殖することを当業者は理解する。一局面では、本開示は、タバコ内乳を提供する。別の局面では、本開示は、タバコ内乳細胞を提供する。さらなる局面では、本開示は、ヒトの介入なしでは生殖できない雄性または雌性不稔性タバコ植物を提供する。
一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７２、１４７、１５０、１５７～１６１、１８７～１８９、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の同一性を含む核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の同一性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。別の局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列類似性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。別の局面では、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性バリアントを提供する。本開示のタンパク質の生物学的活性バリアントは、わずか１～１５アミノ酸残基、わずか１０、わずか９、わずか８、わずか７、わずか６、わずか５、わずか４、わずか３、わずか２、またはわずか１アミノ酸残基だけそのタンパク質から異なるものであってもよい。Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座からの遺伝子またはタンパク質のオルソログ遺伝子またはタンパク質もまた提供される。「オルソログ」は、共通の祖先遺伝子に由来し、かつ種分化の結果として異なる種において見出される遺伝子である。オルソログは、ヌクレオチド配列および／またはタンパク質配列のレベルにおいて少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性または類似性を共有してもよい。オルソログの機能は、多くの場合に種間で高度に保存されている。
本明細書において使用される場合、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定される比較ウインドウにわたる最大の一致のためにアライメントされた場合に同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は多くの場合に保存的アミノ酸置換により異なり、その場合、アミノ酸残基は類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって分子の機能的特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために上方に調整されてもよい。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するとみなされる。
提供される核酸分子、ポリペプチド、またはタンパク質は、単離または実質的に精製され得る。「単離された」または「精製された」核酸分子、ポリペプチド、タンパク質、またはその生物活性部分は、その天然に存在する環境において見出されるようなそのポリヌクレオチドまたはタンパク質と通常一緒にあるまたは相互作用する成分を実質的または本質的に含まない。例えば、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により産生される場合に他の細胞材料、もしくは培養培地を実質的に含まず、かつ、化学合成される場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
本開示は、開示されるタバコ植物からのタバコ材料を含むタバコ製品を産生する方法をさらに提供する。一局面では、方法は、タバコ植物から作製された熟成されたタバコ材料をコンディショニングして約１２．５％～約１３．５％から約２１％までその水分含有量を増加させ、コンディショニングされたタバコ材料をブレンドして望ましいブレンド物を産生する工程を含む。一局面では、タバコ製品を産生する方法は、ブレンド物をケーシングまたは風味付けする工程をさらに含む。概して、ケーシングプロセスの間に、ケーシングまたはソース材料をブレンド物に加えて、化学組成の均衡を取ることによりそれらの品質を増強し、かつある特定の所望の風味の特徴を発生させる。ケーシング加工についてのさらなる詳細は、Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌ．ＤａｖｉｓおよびＭ．Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９において見出され得る。
提供されるタバコ材料はまた、熱処理（例えば、クッキング、トースティング）、風味付け、酵素処理、膨張、および／または乾燥が挙げられるがそれに限定されない方法を使用して加工され得る。発酵タバコおよび非発酵タバコの両方がこれらの技術を使用して加工され得る。好適な加工タバコの例としては、暗色空気乾燥、暗色火力乾燥、バーレイ、熱風乾燥、およびシガーフィラーまたはラッパーの他に、葉全体から茎を取り除く操作（ｗｈｏｌｅ ｌｅａｆ ｓｔｅｍｍｉｎｇ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）からの製品が挙げられる。一局面では、タバコ繊維は、新鮮重を基準にして最大７０％のダークタバコを含む。例えば、タバコは、米国特許出願公開第２００４／０１１８４２２号または同第２００５／０１７８３９８号に記載されるような加熱、蒸しおよび／または低温殺菌段階によりコンディショニングされ得る。
提供されるタバコ材料は、発酵に供され得る。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０～２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、および同第５，３７２，１４９号を参照。葉の芳香の改良に加えて、発酵は、葉の色および感触のいずれかまたは両方を変化させ得る。また、発酵プロセスの間に、発生ガスが産生され得、酸素が取り込まれ得、ｐＨが変更され得、かつ保持される水の量が変更され得る。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥、または乾燥および発酵タバコは、口腔製品への組込みの前にさらに加工（例えば、切断、膨化、ブレンド、ミーリング加工、または粉砕）され得る。タバコは、一部の場合には、コポリマーとの混合ならびに任意選択的に香料および他の添加物の前に４８～５０重量パーセントのオーブン揮発分含有量（ｏｖｅｎ ｖｏｌａｔｉｌｅｓ ｃｏｎｔｅｎｔ）を有するロングカットの発酵乾燥湿潤タバコである。
一局面では、提供されるタバコ材料は、所望のサイズに加工され得る。一局面では、タバコ繊維は、２００マイクロメートル未満の平均繊維サイズを有するように加工され得る。一局面では、タバコ繊維は７５～１２５マイクロメートルである。別の局面では、タバコ繊維は、７５マイクロメートルまたはそれ未満のサイズを有するように加工される。一局面では、タバコ繊維は、ロングカットのタバコを含み、該タバコは、約１０カット／インチから約１１０カット／インチまでの幅および約０．１インチから約１インチまでの長さにカットまたは細断され得る。ダブルカットタバコ繊維は、ダブルカットタバコ繊維の約７０％が－２０メッシュ～８０メッシュの間のメッシュサイズを落ちるような粒子サイズの範囲を有し得る。
提供されるタバコ材料は、約１０重量％もしくはそれ以上、約２０重量％もしくはそれ以上、約４０重量％もしくはそれ以上、約１５重量％～約２５重量％、約２０重量％～約３０重量％、約３０重量％～約５０重量％、約４５重量％～約６５重量％、または約５０重量％～約６０重量％の総オーブン揮発分含有量を有するように加工され得る。「湿潤」タバコは、典型的には、約４０重量％～約６０重量％（例えば、約４５重量％～約５５重量％、または約５０重量％）のオーブン揮発分含有量を有するタバコを指すことを当業者は理解する。本明細書において使用される場合、「オーブン揮発分」は、１１０℃に予め温めた強制送風オーブン中で３．２５時間にわたり試料を乾燥した後の試料の重量損失のパーセンテージを算出することにより決定される。口腔製品は、口腔製品を作製するために使用されるタバコ繊維のオーブン揮発分含有量とは異なる全体的なオーブン揮発分含有量を有し得る。記載される加工段階は、オーブン揮発分含有量を低減または増加させ得る。
以下のリストは、例示的な態様の第１のセットを提供する。
１．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中に突然変異を含み、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２．タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
３．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５．タバコ植物が、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群より選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６．タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
７．タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含み、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９．タバコ植物が、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択されるニコチンレベルを含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１０．タバコ植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１１．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中に突然変異を含み、タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２．タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１４．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１５．タバコ植物が、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群より選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１６．タバコ植物が、乾燥された場合に、対照植物のグレーディング指数の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１７．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１８．タバコ植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１９．ｎｉｃ１ｂ突然変異を含むタバコ品種の植物またはタバコ遺伝子型であって、タバコ品種が、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ品種の葉のグレーディング指数と同等の葉のグレーディング指数を有し、対照タバコ品種が、突然変異を除いてタバコ品種と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、植物またはタバコ遺伝子型。
２０．タバコ品種が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１９に記載の植物またはタバコ遺伝子型。
２１．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１９に記載の植物またはタバコ遺伝子型。
２２．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１９に記載の植物またはタバコ遺伝子型。
２３．非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択されるニコチンレベルを含み、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の値、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２４．非トランスジェニックタバコ植物が、２．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様２３に記載の非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２５．非トランスジェニックタバコ植物が、１．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様２３に記載の非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２６．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中に非トランスジェニック突然変異を含み、非トランスジェニック突然変異が、タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満まで低減し、タバコ植物が、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、対照植物が、非トランスジェニック突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２７．態様１～２６のいずれか１つに記載のタバコ植物の集団。
２８．態様１～２６のいずれか１つのタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
２９．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様２８に記載の乾燥タバコ材料。
３０．態様２８の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
３１．乾燥タバコ材料が、重量によりタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様３０に記載のタバコブレンド物。
３２．乾燥タバコ材料が、体積によりタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様３０に記載のタバコブレンド物。
３３．態様２８に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
３４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様３３に記載のタバコ製品。
３５．無煙タバコ製品である、態様３３に記載のタバコ製品。
３６．無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様３５のタバコ製品。
３７．態様２８の乾燥タバコ材料を含む、再構成タバコ。
３８．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中に突然変異を含み、突然変異がＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１品種には存在しない、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
３９．タバコ植物が、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座においてＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１品種と比較して短い染色体移入を含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４０．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して低いレベルのニコチンを含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４１．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物中のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４２．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して低いレベルの総アルカロイドを含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４３．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して低いレベルの、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンからなる群より選択される１種またはそれ以上のアルカロイドを含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４４．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブデノイド、センブレノイド、糖エステル、および還元糖からなる群より選択される１種類またはそれ以上の化合物を含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４５．突然変異がホモ接合である、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４６．突然変異がヘテロ接合である、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４７．突然変異が、点突然変異、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群より選択される、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４８．突然変異が、ランダム突然変異誘発および標的指向性突然変異誘発からなる群より選択されるアプローチにより導入される、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４９．標的指向性突然変異誘発が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲにより媒介される、態様４８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５０．タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５１．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５２．突然変異が遺伝子の発現または活性を低減する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５３．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５４．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５５．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、２０２～２０５、５４、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５６．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５７．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するコード配列を含む遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５８．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５９．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８７、８８、および８９、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６０．植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しないタバコ植物と比較して低減したレベルの、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、およびＡ６２２からなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡ、タンパク質、または両方をさらに含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６１．植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６２．タバコ植物がハイブリッドである、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６３．部分が、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、さや、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養物、シュート、細胞、およびプロトプラストからなる群より選択される、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６４．タバコ植物が、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、およびガルパオタバコ、およびオリエンタルタバコからなる群より選択される品種からのものである、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６５．タバコ植物が、バーレイタバコ、メリーランドタバコ、および暗色空気乾燥タバコからなる群より選択される品種からのものである、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６６．態様３８に記載のタバコ植物の集団。
６７．態様３８に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
６８．突然変異を有しない対照タバコ植物からの乾燥タバコ材料と比較して低いレベルのニコチンを含む、態様６７に記載の乾燥タバコ材料。
６９．タバコ植物が０．２％～０．６％のレベルのニコチンを含む、態様６７に記載の乾燥タバコ材料。
７０．タバコ植物が１．０％～３．０％のレベルのニコチンを含む、態様６７に記載の乾燥タバコ材料。
７１．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様６７に記載の乾燥タバコ材料。
７２．態様６７に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
７３．態様６７に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
７４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様７３に記載のタバコ製品。
７５．無煙タバコ製品である、態様７３に記載のタバコ製品。
７６．無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様７５に記載のタバコ製品。
７７．態様６７に記載の乾燥タバコ材料を含む、再構成タバコ。
７８．タバコ細胞中で機能的であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２、ならびにその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物。
７９．態様７８に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８０．タバコ植物が、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較して高いレベルのニコチンを含む、態様７９に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８１．態様７９に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
８２．態様８１に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
８３．タバコ植物のニコチンレベルを増加させる方法であって、態様７８に記載の組換えＤＮＡ構築物を用いてタバコ植物を形質転換する工程を含む、方法。
８４．タバコ細胞中で機能的であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２、ならびにその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物であって、ＲＮＡ分子がポリペプチドの発現を抑制する、組換えＤＮＡ構築物。
８５．態様８４に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８６．ＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびトランス作用性ｓｉＲＮＡからなる群より選択される、態様８５に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８７．ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡをコードする、態様８５に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８８．タバコ植物が、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較して低いレベルのニコチンを含む、態様８５に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８９．態様８５に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
９０．態様８９に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
９１．タバコ植物のニコチンレベルを低減する方法であって、態様８４に記載の組換えＤＮＡ構築物を用いてタバコ植物を形質転換する工程を含む、方法。
９２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の同一性を有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９３．Ｎｉｃ１ｂ阻害配列が、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、およびその組合せからなる群より選択される阻害性ポリヌクレオチドとして転写することができる、態様９２に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９４．プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性（ｔｉｓｓｕｅ－ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターからなる群より選択される、態様９２に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９５．プロモーターが根特異的プロモーターである、態様９２に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９６．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９７．低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、
ａ．低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生する工程、
ｂ．低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定する工程であって、多型マーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接する染色体間隔内にある、工程、ならびに
ｃ．低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択する工程
を含む、方法。
９８．選択された子孫タバコ植物を第２のタバコ品種と戻し交雑する工程をさらに含む、態様９７に記載の方法。
９９．ｄ．選択された子孫植物をそれ自体と、または第２のタバコ品種と交雑して、１つまたはそれ以上のさらなる子孫タバコ植物を産生する工程、および
ｅ．低ニコチン形質を含むさらなる子孫タバコ植物を選択する工程
をさらに含む、態様９７の方法。
１００．選択する工程（ｅ）がマーカー支援選抜を含む、態様９９に記載の方法。
１０１．低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を生じさせる、態様９７に記載の方法。
１０２．第２のタバコ品種がエリート品種である、態様９７に記載の方法。
１０３．遺伝子型判定する工程が１またはそれ以上の分子マーカーアッセイを伴う、態様９７に記載の方法。
１０４．多型マーカーが、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純反復配列（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群より選択される多型を含む、態様９７に記載の方法。
１０５．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様９７に記載の方法。
１０６．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様９７に記載の方法。
１０７．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様９７に記載の方法。
１０８．第１のタバコ品種が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１からなる群より選択される、態様９７に記載の方法。
１０９．選択された子孫タバコ植物が、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座において、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１と比較して短い染色体移入を含む、態様９７に記載の方法。
１１０．低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、
ａ．低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生する工程、
ｂ．低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定する工程であって、多型マーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカー、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群より選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの２０ｃＭ以内にある、工程、ならびに
ｃ．低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択する工程
を含む、方法。
１１１．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１０に記載の方法。
１１２．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１０に記載の方法。
１１３．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１０に記載の方法。
１１４．低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する方法であって、
ａ．タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程、
ｂ．Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座に密接に関連した１つまたはそれ以上のマーカーについて核酸をアッセイする工程、および
ｃ．マーカーアッセイに基づいて低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する工程
を含む、方法。
１１５．１つまたはそれ以上のマーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカー、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群より選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の範囲内にある、態様１１４に記載の方法。
１１６．アッセイする工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１４に記載の方法。
１１７．アッセイする工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１４に記載の方法。
１１８．アッセイする工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１４に記載の方法。
１１９．選択された植物のニコチンレベルを決定して低ニコチン形質を確認する工程をさらに含む、態様１１４に記載の方法。
１２０．タバコ生殖質の収集物が半数体育種集団である、態様１１４に記載の方法。
１２１．ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１のいずれか１つから得られ得る染色体移入を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、染色体移入が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接しており、かつこれらを含まないか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群より選択される配列を有するいずれか２つの遺伝子座に隣接しており、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の、５５もしくはそれ以上、６０もしくはそれ以上、６５もしくはそれ以上、７０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、８０もしくはそれ以上、８５もしくはそれ以上、９０もしくはそれ以上、または９５もしくはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２２．タバコ植物が、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択されるニコチンレベルを含む、態様１２１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２３．染色体移入が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６～１３５からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接しており、かつこれらを含まない、態様１２１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２４．染色体移入が、ＳＮＰマーカーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９～１３２に隣接しており、かつこれらを含まない、態様１２１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２５．ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１のいずれか１つから得られ得る第１の染色体移入を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、第１の染色体移入が、Ｎｉｃ１ｂマーカー番号１～２０７のいずれか２つに隣接しており、かつこれらを含まず、タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２６．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、態様１２５に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２７．態様１２１～１２６および１３６～１４１のいずれか１つに記載のタバコ植物の集団。
１２８．態様１２１～１２６のいずれか１つのタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
１２９．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様１２８に記載の乾燥タバコ材料。
１３０．態様１２８の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
１３１．乾燥タバコ材料が、重量によりタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様１３０に記載のタバコブレンド物。
１３２．乾燥タバコ材料が、体積によりタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様１３０に記載のタバコブレンド物。
１３３．態様１２８に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
１３４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様１３３に記載のタバコ製品。
１３５．ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様１３３に記載のタバコ製品。
１３６．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１４６、１５３、１５４、１７、１８、１９、２０２、および２０３、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３７．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１５３、１５４、１７、１８、１９、２０２、および２０３、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３８．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１５３、１５４、１７、１８、１９、および２０３、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３９．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１７、１８、および１９、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１４０．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１８、および１９、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物またはその一部。
１４１．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７、８８、８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中に突然変異を含み、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２．タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
３．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５．タバコ植物が、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群より選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６．タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
７．タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含み、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９．タバコ植物が、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択されるニコチンレベルを含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１０．タバコ植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、態様１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１１．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中に突然変異を含み、タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２．タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１４．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１５．タバコ植物が、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群より選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１６．タバコ植物が、乾燥された場合に、対照植物のグレーディング指数の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１７．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１８．タバコ植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を直接的に抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、態様１１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１９．ｎｉｃ１ｂ突然変異を含むタバコ品種の植物またはタバコ遺伝子型であって、タバコ品種が、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ品種の葉のグレーディング指数と同等の葉のグレーディング指数を有し、対照タバコ品種が、突然変異を除いてタバコ品種と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、植物またはタバコ遺伝子型。
２０．タバコ品種が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１９に記載の植物またはタバコ遺伝子型。
２１．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１９に記載の植物またはタバコ遺伝子型。
２２．タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、または両方における１つまたはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様１９に記載の植物またはタバコ遺伝子型。
２３．非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択されるニコチンレベルを含み、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の値、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２４．非トランスジェニックタバコ植物が、２．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様２３に記載の非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２５．非トランスジェニックタバコ植物が、１．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様２３に記載の非トランスジェニックタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２６．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中に非トランスジェニック突然変異を含み、非トランスジェニック突然変異が、タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満まで低減し、タバコ植物が、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、対照植物が、非トランスジェニック突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
２７．態様１～２６のいずれか１つに記載のタバコ植物の集団。
２８．態様１～２６のいずれか１つのタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
２９．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様２８に記載の乾燥タバコ材料。
３０．態様２８の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
３１．乾燥タバコ材料が、重量によりタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様３０に記載のタバコブレンド物。
３２．乾燥タバコ材料が、体積によりタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様３０に記載のタバコブレンド物。
３３．態様２８に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
３４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様３３に記載のタバコ製品。
３５．無煙タバコ製品である、態様３３に記載のタバコ製品。
３６．無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様３５のタバコ製品。
３７．態様２８の乾燥タバコ材料を含む、再構成タバコ。
３８．タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座中に突然変異を含み、突然変異がＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１品種には存在しない、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
３９．タバコ植物が、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座においてＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１品種と比較して短い染色体移入を含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４０．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して低いレベルのニコチンを含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４１．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物中のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４２．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して低いレベルの総アルカロイドを含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４３．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して低いレベルの、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンからなる群より選択される１種またはそれ以上のアルカロイドを含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４４．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しない対照タバコ植物と比較して類似のレベルの、３－メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブデノイド、センブレノイド、糖エステル、および還元糖からなる群より選択される１種類またはそれ以上の化合物を含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４５．突然変異がホモ接合である、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４６．突然変異がヘテロ接合である、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４７．突然変異が、点突然変異、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群より選択される、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４８．突然変異が、ランダム突然変異誘発および標的指向性突然変異誘発からなる群より選択されるアプローチにより導入される、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
４９．標的指向性突然変異誘発が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲにより媒介される、態様４８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５０．タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５１．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５２．突然変異が遺伝子の発現または活性を低減する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５３．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５４．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５５．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、２０２～２０５、５４、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５６．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５７．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するコード配列を含む遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５８．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５２、５３、２０４、２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
５９．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８７、８８、および８９、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６０．植物が、類似の生育条件において生育された場合の突然変異を有しないタバコ植物と比較して低減したレベルの、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、およびＡ６２２からなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡ、タンパク質、または両方をさらに含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６１．植物が、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥトランスポーターからなる群より選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を抑制する導入遺伝子または突然変異をさらに含む、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６２．タバコ植物がハイブリッドである、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６３．部分が、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、さや、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養物、シュート、細胞、およびプロトプラストからなる群より選択される、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６４．タバコ植物が、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、およびガルパオタバコ、およびオリエンタルタバコからなる群より選択される品種からのものである、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６５．タバコ植物が、バーレイタバコ、メリーランドタバコ、および暗色空気乾燥タバコからなる群より選択される品種からのものである、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
６６．態様３８に記載のタバコ植物の集団。
６７．態様３８に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
６８．突然変異を有しない対照タバコ植物からの乾燥タバコ材料と比較して低いレベルのニコチンを含む、態様６７に記載の乾燥タバコ材料。
６９．タバコ植物が０．２％～０．６％のレベルのニコチンを含む、態様６７に記載の乾燥タバコ材料。
７０．タバコ植物が１．０％～３．０％のレベルのニコチンを含む、態様６７に記載の乾燥タバコ材料。
７１．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様６７に記載の乾燥タバコ材料。
７２．態様６７に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
７３．態様６７に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
７４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様７３に記載のタバコ製品。
７５．無煙タバコ製品である、態様７３に記載のタバコ製品。
７６．無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様７５に記載のタバコ製品。
７７．態様６７に記載の乾燥タバコ材料を含む、再構成タバコ。
７８．タバコ細胞中で機能的であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２、ならびにその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物。
７９．態様７８に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８０．タバコ植物が、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較して高いレベルのニコチンを含む、態様７９に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８１．態様７９に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
８２．態様８１に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
８３．タバコ植物のニコチンレベルを増加させる方法であって、態様７８に記載の組換えＤＮＡ構築物を用いてタバコ植物を形質転換する工程を含む、方法。
８４．タバコ細胞中で機能的であり、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３～１０７、１４８、１５１、１８０～１８３、２０６、２０７、および１９０～１９２、ならびにその断片からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換えＤＮＡ構築物であって、ＲＮＡ分子がポリペプチドの発現を抑制する、組換えＤＮＡ構築物。
８５．態様８４に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８６．ＲＮＡ分子が、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびトランス作用性ｓｉＲＮＡからなる群より選択される、態様８５に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８７．ポリヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡをコードする、態様８５に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８８．タバコ植物が、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較して低いレベルのニコチンを含む、態様８５に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
８９．態様８５に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
９０．態様８９に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
９１．タバコ植物のニコチンレベルを低減する方法であって、態様８４に記載の組換えＤＮＡ構築物を用いてタバコ植物を形質転換する工程を含む、方法。
９２．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の同一性を有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９３．Ｎｉｃ１ｂ阻害配列が、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、およびその組合せからなる群より選択される阻害性ポリヌクレオチドとして転写することができる、態様９２に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９４．プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性（ｔｉｓｓｕｅ－ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーターからなる群より選択される、態様９２に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９５．プロモーターが根特異的プロモーターである、態様９２に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９６．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列を含む遺伝子のＮｉｃ１ｂ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、阻害配列が、植物細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、阻害配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列の少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
９７．低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、
ａ．低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生する工程、
ｂ．低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定する工程であって、多型マーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接する染色体間隔内にある、工程、ならびに
ｃ．低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択する工程
を含む、方法。
９８．選択された子孫タバコ植物を第２のタバコ品種と戻し交雑する工程をさらに含む、態様９７に記載の方法。
９９．ｄ．選択された子孫植物をそれ自体と、または第２のタバコ品種と交雑して、１つまたはそれ以上のさらなる子孫タバコ植物を産生する工程、および
ｅ．低ニコチン形質を含むさらなる子孫タバコ植物を選択する工程
をさらに含む、態様９７の方法。
１００．選択する工程（ｅ）がマーカー支援選抜を含む、態様９９に記載の方法。
１０１．低ニコチン形質を含む単一遺伝子変換を生じさせる、態様９７に記載の方法。
１０２．第２のタバコ品種がエリート品種である、態様９７に記載の方法。
１０３．遺伝子型判定する工程が１またはそれ以上の分子マーカーアッセイを伴う、態様９７に記載の方法。
１０４．多型マーカーが、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列中の挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純反復配列（ＳＳＲ）、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群より選択される多型を含む、態様９７に記載の方法。
１０５．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様９７に記載の方法。
１０６．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様９７に記載の方法。
１０７．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様９７に記載の方法。
１０８．第１のタバコ品種が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１からなる群より選択される、態様９７に記載の方法。
１０９．選択された子孫タバコ植物が、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座において、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１と比較して短い染色体移入を含む、態様９７に記載の方法。
１１０．低ニコチン形質をタバコ品種に移入する方法であって、
ａ．低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交雑して、１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を産生する工程、
ｂ．低ニコチン形質に関連した多型マーカーについて１つまたはそれ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型判定する工程であって、多型マーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカー、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群より選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの２０ｃＭ以内にある、工程、ならびに
ｃ．低ニコチン形質を含む子孫タバコ植物を選択する工程
を含む、方法。
１１１．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１０に記載の方法。
１１２．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１０に記載の方法。
１１３．遺伝子型判定する工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１０に記載の方法。
１１４．低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する方法であって、
ａ．タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程、
ｂ．Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座に密接に関連した１つまたはそれ以上のマーカーについて核酸をアッセイする工程、および
ｃ．マーカーアッセイに基づいて低ニコチン形質を有するタバコ植物を選択する工程
を含む、方法。
１１５．１つまたはそれ以上のマーカーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカー、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群より選択される配列を有する任意の遺伝子座のいずれか１つの約２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．５ｃＭ、または０．５ｃＭ未満の範囲内にある、態様１１４に記載の方法。
１１６．アッセイする工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１４に記載の方法。
１１７．アッセイする工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、１５、１７、１８、１９、３７、３９、４９、５０、５２、５３、５４、２０２～２０５、および７２、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１４に記載の方法。
１１８．アッセイする工程が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１７、１８、１９、４９、５２、５３、２０２～２０５、および５４、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する核酸配列についてアッセイする工程を含む、態様１１４に記載の方法。
１１９．選択された植物のニコチンレベルを決定して低ニコチン形質を確認する工程をさらに含む、態様１１４に記載の方法。
１２０．タバコ生殖質の収集物が半数体育種集団である、態様１１４に記載の方法。
１２１．ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１のいずれか１つから得られ得る染色体移入を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、染色体移入が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５～１４５および１９３～２０１からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接しており、かつこれらを含まないか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３～３７、１４６、１４９、１５２～１５６、２０２、２０３、および１８４～１８６からなる群より選択される配列を有するいずれか２つの遺伝子座に隣接しており、タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の、５５もしくはそれ以上、６０もしくはそれ以上、６５もしくはそれ以上、７０もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、８０もしくはそれ以上、８５もしくはそれ以上、９０もしくはそれ以上、または９５もしくはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２２．タバコ植物が、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群より選択されるニコチンレベルを含む、態様１２１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２３．染色体移入が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６～１３５からなる群より選択されるＳＮＰマーカーのいずれか２つに隣接しており、かつこれらを含まない、態様１２１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２４．染色体移入が、ＳＮＰマーカーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９～１３２に隣接しており、かつこれらを含まない、態様１２１に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２５．ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、およびＬＮ ＫＹ１７１のいずれか１つから得られ得る第１の染色体移入を含む、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分であって、第１の染色体移入が、Ｎｉｃ１ｂマーカー番号１～２０７のいずれか２つに隣接しており、かつこれらを含まず、タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物が、突然変異を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２６．タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルのニコチンを含む、態様１２５に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１２７．態様１２１～１２６および１３６～１４１のいずれか１つに記載のタバコ植物の集団。
１２８．態様１２１～１２６のいずれか１つのタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
１２９．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様１２８に記載の乾燥タバコ材料。
１３０．態様１２８の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
１３１．乾燥タバコ材料が、重量によりタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様１３０に記載のタバコブレンド物。
１３２．乾燥タバコ材料が、体積によりタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様１３０に記載のタバコブレンド物。
１３３．態様１２８に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
１３４．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様１３３に記載のタバコ製品。
１３５．ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様１３３に記載のタバコ製品。
１３６．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１４６、１５３、１５４、１７、１８、１９、２０２、および２０３、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３７．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１５３、１５４、１７、１８、１９、２０２、および２０３、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３８．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１５３、１５４、１７、１８、１９、および２０３、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１３９．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１７、１８、および１９、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
１４０．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１８、および１９、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物またはその一部。
１４１．突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７、８８、８９、１８０、１８１、２０６、および２０７、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、態様３８に記載のタバコ植物、またはそのタバコ遺伝子型もしくはタバコ部分。
以下のリストは、例示的な態様の第２のセットを提供する。
１．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含む、タバコ植物またはその一部であって、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物またはその一部。
２．前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、態様１に記載のタバコ植物またはその一部。
３．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様２のタバコ植物またはその一部。
４．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つもしくはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
５．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
６．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
７．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの４０％未満のレベルのニコチンを含み、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
８．前記タバコ植物が２．０％未満のニコチンレベルを含む、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
９．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の非トランスジェニック突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記非トランスジェニック突然変異が、前記タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの６０％未満まで低減し、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、前記対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ前記対照植物が、前記非トランスジェニック突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有し、前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、タバコ植物またはその一部。
１０．態様２に記載のタバコ植物の集団。
１１．態様２に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
１２．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、請求項１１に記載の乾燥タバコ材料。
１３．態様１１に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
１４．態様１１に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
１５．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様１４に記載のタバコ製品。
１６．無煙タバコ製品である、態様１４に記載のタバコ製品。
１７．前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様１６に記載のタバコ製品。
１８．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中に突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記突然変異が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、および ＬＮ ＫＹ１７１には存在しない、タバコ植物またはその一部。
１９．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２０．前記突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２１．前記突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７、８８、８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２２．前記タバコ植物が、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、およびガルパオ（Ｇａｌｐａｏ）タバコ、およびオリエンタルタバコからなる群より選択される品種からのものである、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２３．前記タバコ植物が、バーレイタバコ、メリーランドタバコ、および暗色空気乾燥タバコからなる群より選択される品種からのものである、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２４．態様１８に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
２５．前記タバコ植物が、０．２％～０．６％のレベルのニコチンを含む、態様２４に記載の乾燥タバコ材料。
２６．前記タバコ植物が１．０％～３．０％のレベルのニコチンを含む、態様２４に記載の乾燥タバコ材料。
２７．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様２４に記載の乾燥タバコ材料。
２８．態様２４に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
２９．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様２４に記載のタバコ製品。
３０．無煙タバコ製品である、態様２４に記載のタバコ製品。
１．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含む、タバコ植物またはその一部であって、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物またはその一部。
２．前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、態様１に記載のタバコ植物またはその一部。
３．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様２のタバコ植物またはその一部。
４．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つもしくはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
５．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
６．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
７．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの４０％未満のレベルのニコチンを含み、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
８．前記タバコ植物が２．０％未満のニコチンレベルを含む、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
９．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の非トランスジェニック突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記非トランスジェニック突然変異が、前記タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの６０％未満まで低減し、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、前記対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ前記対照植物が、前記非トランスジェニック突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有し、前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、タバコ植物またはその一部。
１０．態様２に記載のタバコ植物の集団。
１１．態様２に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
１２．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、請求項１１に記載の乾燥タバコ材料。
１３．態様１１に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
１４．態様１１に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
１５．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様１４に記載のタバコ製品。
１６．無煙タバコ製品である、態様１４に記載のタバコ製品。
１７．前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様１６に記載のタバコ製品。
１８．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中に突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記突然変異が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、および ＬＮ ＫＹ１７１には存在しない、タバコ植物またはその一部。
１９．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２０．前記突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２１．前記突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７、８８、８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２２．前記タバコ植物が、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、およびガルパオ（Ｇａｌｐａｏ）タバコ、およびオリエンタルタバコからなる群より選択される品種からのものである、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２３．前記タバコ植物が、バーレイタバコ、メリーランドタバコ、および暗色空気乾燥タバコからなる群より選択される品種からのものである、態様１８に記載のタバコ植物またはその一部。
２４．態様１８に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
２５．前記タバコ植物が、０．２％～０．６％のレベルのニコチンを含む、態様２４に記載の乾燥タバコ材料。
２６．前記タバコ植物が１．０％～３．０％のレベルのニコチンを含む、態様２４に記載の乾燥タバコ材料。
２７．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様２４に記載の乾燥タバコ材料。
２８．態様２４に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
２９．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様２４に記載のタバコ製品。
３０．無煙タバコ製品である、態様２４に記載のタバコ製品。
以下は、例示的な態様の第３のセットを提供する。
１．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含む、タバコ植物またはその一部であって、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物またはその一部。
２．前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、態様１に記載のタバコ植物またはその一部。
３．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１または２のタバコ植物またはその一部。
４．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
５．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＥＲＦ１６である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
６．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１５である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
７．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１７である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
８．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＥＲＦ１３０である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
９．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つもしくはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１０．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１１．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１２．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの４０％未満のレベルのニコチンを含み、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１３．前記タバコ植物が２．０％未満のニコチンレベルを含む、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１４．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の非トランスジェニック突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記非トランスジェニック突然変異が、前記タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの６０％未満まで低減し、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、前記対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ前記対照植物が、前記非トランスジェニック突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有し、前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、タバコ植物またはその一部。
１５．態様２または１４に記載のタバコ植物の集団。
１６．態様２または１４に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
１７．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、請求項１６に記載の乾燥タバコ材料。
１８．態様１６に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
１９．態様１６に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
２０．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様１９に記載のタバコ製品。
２１．無煙タバコ製品である、態様１９に記載のタバコ製品。
２２．前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様２１に記載のタバコ製品。
２３．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中に突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記突然変異が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、および ＬＮ ＫＹ１７１には存在しない、タバコ植物またはその一部。
２４．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様２３に記載のタバコ植物またはその一部。
２５．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１である、態様２３または２４に記載のタバコ植物またはその一部。
２６．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＥＲＦ１６である、態様２３～２５のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
２７．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１５である、態様２３～２６のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
２８．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１７である、態様２３～２７のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
２９．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＥＲＦ１３０である、態様２３～２８のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３０．前記突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様２３～２９のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３１．前記突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７、８８、８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、態様２３～３０のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３２．前記タバコ植物が、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、およびガルパオ（Ｇａｌｐａｏ）タバコ、およびオリエンタルタバコからなる群より選択される品種からのものである、態様２３～３１のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３３．前記タバコ植物が、バーレイタバコ、メリーランドタバコ、および暗色空気乾燥タバコからなる群より選択される品種からのものである、態様２３～３２のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３４．態様２３～３３のいずれか１つに記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
３５．前記タバコ植物が、０．２％～０．６％のレベルのニコチンを含む、態様３４に記載の乾燥タバコ材料。
３６．前記タバコ植物が１．０％～３．０％のレベルのニコチンを含む、態様３４に記載の乾燥タバコ材料。
３７．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様３４に記載の乾燥タバコ材料。
３８．態様３４に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
３９．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様３４に記載のタバコ製品。
４０．無煙タバコ製品である、態様３４に記載のタバコ製品。
４１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中に非自然突然変異を含む、改変タバコ植物またはその一部。
４２．前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、態様４１に記載の改変タバコ植物またはその一部。
４３．前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する、態様４１または４２に記載の改変タバコ植物またはその一部。
４４．少なくとも１つの前記改変タバコ植物が、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、態様４１～４３のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
４５．前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、態様４１～４４のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
４６．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中に非自然突然変異を含む、改変タバコ植物またはその一部。
４７．前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する、態様４６に記載の改変タバコ植物またはその一部。
４８．前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する、態様４６または４７に記載の改変タバコ植物またはその一部。
４９．前記改変タバコ植物が、遺伝子改変または突然変異または組換え核酸構築物を有さない対照植物と比べて、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減したレベルの少なくとも１種類のアルカロイドを含む、態様４６～４８のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
５０．より高いＵＳＤＡグレード指数値が、対照植物の同等の葉のＵＳＤＡグレード指数値より少なくとも５％高い、態様４６～４９のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
５１．前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
５２．前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
５３．態様５２に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
５４．タバコ製品が、シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコ、再構成タバコ、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、スヌース、および鼻嗅ぎタバコ、または無煙タバコ製品からなる群より選択される、態様５３に記載のタバコ製品。
５５．以下の工程を含む、改変タバコ植物を作製する方法：
（ａ）少なくとも１つのタバコ細胞中で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるまたは類似しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする内因性核酸配列において、非自然突然変異を誘導する工程；
（ｂ）工程（ａ）からの非自然突然変異を含む少なくとも１つのタバコ細胞を選択する工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）において選択された少なくとも１つのタバコ細胞から少なくとも１つの改変タバコ植物を再生させる工程であって、該少なくとも１つの改変タバコ植物が、該突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、工程。
５６．前記少なくとも１つの改変タバコ植物が、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、態様５５に記載の方法。
５７．前記内因性核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％同一である、態様５５または５６に記載の方法。
５８．前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、態様５５～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．（ｄ）工程（ｃ）において再生させた改変タバコ植物を生育させる工程
をさらに含む、態様５５～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．（ｅ）工程（ｄ）において生育させた改変タバコ植物を第２のタバコ植物と交雑する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）の交雑から少なくとも１つの種子を得る工程
をさらに含む、態様５５～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記少なくとも１つの改変タバコ植物が、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、態様１～６０のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
６２．前記少なくとも１種類のアルカロイドがアナバシンである、態様６１に記載の改変タバコ植物またはその一部。
６３．前記少なくとも１種類のアルカロイドがアナタビンである、態様６１または６２に記載の改変タバコ植物またはその一部。
６４．前記少なくとも１種類のアルカロイドがニコチンである、態様６１、６２、または６３に記載の改変タバコ植物またはその一部。
６５．前記少なくとも１種類のアルカロイドがノルニコチンである、態様６１、６２、６３、または６４に記載の改変タバコ植物またはその一部。
１．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の突然変異を含む、タバコ植物またはその一部であって、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、タバコ植物またはその一部。
２．前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、態様１に記載のタバコ植物またはその一部。
３．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様１または２のタバコ植物またはその一部。
４．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
５．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＥＲＦ１６である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
６．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１５である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
７．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１７である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
８．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＥＲＦ１３０である、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
９．前記タバコ植物が、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群より選択される２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、５つもしくはそれ以上、６つもしくはそれ以上、または７つ全ての遺伝子において１つもしくはそれ以上の突然変異をさらに含む、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１０．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１１．前記タバコ植物が、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１２．前記タバコ植物が、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの４０％未満のレベルのニコチンを含み、前記対照植物が、前記突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１３．前記タバコ植物が２．０％未満のニコチンレベルを含む、態様２に記載のタバコ植物またはその一部。
１４．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中の非トランスジェニック突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記非トランスジェニック突然変異が、前記タバコ植物のニコチンレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの６０％未満まで低減し、前記タバコ植物が、乾燥された場合に、前記対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ前記対照植物が、前記非トランスジェニック突然変異を除いて前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有し、前記タバコ植物がニコチアナ・タバカム植物である、タバコ植物またはその一部。
１５．態様２または１４に記載のタバコ植物の集団。
１６．態様２または１４に記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
１７．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、請求項１６に記載の乾燥タバコ材料。
１８．態様１６に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
１９．態様１６に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
２０．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様１９に記載のタバコ製品。
２１．無煙タバコ製品である、態様１９に記載のタバコ製品。
２２．前記無煙タバコ製品が、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群より選択される、態様２１に記載のタバコ製品。
２３．Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子座中に突然変異を含むタバコ植物またはその一部であって、前記突然変異が、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＬＡＦＣ５３、および ＬＮ ＫＹ１７１には存在しない、タバコ植物またはその一部。
２４．前記タバコ植物が、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子中に突然変異をさらに含む、態様２３に記載のタバコ植物またはその一部。
２５．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１である、態様２３または２４に記載のタバコ植物またはその一部。
２６．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＥＲＦ１６である、態様２３～２５のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
２７．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１５である、態様２３～２６のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
２８．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＮＣＧ１７である、態様２３～２７のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
２９．Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子がＥＲＦ１３０である、態様２３～２８のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３０．前記突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７、１８、１９、３８、４８、４９、５２、５３、５４、および２０２～２０５、ならびにその断片からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する配列内に位置する、態様２３～２９のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３１．前記突然変異が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７、８８、８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する、態様２３～３０のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３２．前記タバコ植物が、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、およびガルパオ（Ｇａｌｐａｏ）タバコ、およびオリエンタルタバコからなる群より選択される品種からのものである、態様２３～３１のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３３．前記タバコ植物が、バーレイタバコ、メリーランドタバコ、および暗色空気乾燥タバコからなる群より選択される品種からのものである、態様２３～３２のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
３４．態様２３～３３のいずれか１つに記載のタバコ植物からの、乾燥タバコ材料。
３５．前記タバコ植物が、０．２％～０．６％のレベルのニコチンを含む、態様３４に記載の乾燥タバコ材料。
３６．前記タバコ植物が１．０％～３．０％のレベルのニコチンを含む、態様３４に記載の乾燥タバコ材料。
３７．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群より選択される乾燥プロセスにより作られる、態様３４に記載の乾燥タバコ材料。
３８．態様３４に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
３９．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群より選択される、態様３４に記載のタバコ製品。
４０．無煙タバコ製品である、態様３４に記載のタバコ製品。
４１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中に非自然突然変異を含む、改変タバコ植物またはその一部。
４２．前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、態様４１に記載の改変タバコ植物またはその一部。
４３．前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する、態様４１または４２に記載の改変タバコ植物またはその一部。
４４．少なくとも１つの前記改変タバコ植物が、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、態様４１～４３のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
４５．前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、態様４１～４４のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
４６．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中に非自然突然変異を含む、改変タバコ植物またはその一部。
４７．前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する、態様４６に記載の改変タバコ植物またはその一部。
４８．前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する、態様４６または４７に記載の改変タバコ植物またはその一部。
４９．前記改変タバコ植物が、遺伝子改変または突然変異または組換え核酸構築物を有さない対照植物と比べて、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減したレベルの少なくとも１種類のアルカロイドを含む、態様４６～４８のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
５０．より高いＵＳＤＡグレード指数値が、対照植物の同等の葉のＵＳＤＡグレード指数値より少なくとも５％高い、態様４６～４９のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
５１．前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物またはその一部。
５２．前記態様のいずれか１つに記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
５３．態様５２に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
５４．タバコ製品が、シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコ、再構成タバコ、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、スヌース、および鼻嗅ぎタバコ、または無煙タバコ製品からなる群より選択される、態様５３に記載のタバコ製品。
５５．以下の工程を含む、改変タバコ植物を作製する方法：
（ａ）少なくとも１つのタバコ細胞中で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるまたは類似しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする内因性核酸配列において、非自然突然変異を誘導する工程；
（ｂ）工程（ａ）からの非自然突然変異を含む少なくとも１つのタバコ細胞を選択する工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）において選択された少なくとも１つのタバコ細胞から少なくとも１つの改変タバコ植物を再生させる工程であって、該少なくとも１つの改変タバコ植物が、該突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、工程。
５６．前記少なくとも１つの改変タバコ植物が、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、態様５５に記載の方法。
５７．前記内因性核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％同一である、態様５５または５６に記載の方法。
５８．前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、態様５５～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．（ｄ）工程（ｃ）において再生させた改変タバコ植物を生育させる工程
をさらに含む、態様５５～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．（ｅ）工程（ｄ）において生育させた改変タバコ植物を第２のタバコ植物と交雑する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）の交雑から少なくとも１つの種子を得る工程
をさらに含む、態様５５～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記少なくとも１つの改変タバコ植物が、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、態様１～６０のいずれか１つに記載の改変タバコ植物またはその一部。
６２．前記少なくとも１種類のアルカロイドがアナバシンである、態様６１に記載の改変タバコ植物またはその一部。
６３．前記少なくとも１種類のアルカロイドがアナタビンである、態様６１または６２に記載の改変タバコ植物またはその一部。
６４．前記少なくとも１種類のアルカロイドがニコチンである、態様６１、６２、または６３に記載の改変タバコ植物またはその一部。
６５．前記少なくとも１種類のアルカロイドがノルニコチンである、態様６１、６２、６３、または６４に記載の改変タバコ植物またはその一部。
今や本開示が大まかに説明されたが、以下の実施例を参照することでもっと容易に理解される。以下の実施例は例示として示され、特に定めのない限り、本開示の限定であると意図されない。
実施例１： 低アルカロイド形質を有するＴＮ９０株ならびにｎｉｃ１およびｎｉｃ２欠失マーカーアレルを有する高中間アルカロイド形質を有する植物の開発
ＬＡ ＢＵ２１（ｎｉｃ１突然変異とｎｉｃ２突然変異を有するＬｏｗ Ａｌｋａｌｏｉｄ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ドナー親）とエリート栽培品種ＴＮ９０（レシピエント親）との交雑から育種集団を開発する。目標は、劣った葉の特徴を有する親ＬＡ ＢＵ２１株と比較した場合に向上した葉の品質も有する低アルカロイド植物を得ることである。所望の特徴（低アルカロイドレベル、向上した葉の品質）を有するＦ２植物をさらに自家受粉してＦ３世代、その後にＦ５世代を得る。図１は、低アルカロイド形質を有する自家受粉ＴＮ９０株の開発のためにたどる育種プロセスを示す。
ＬＡ ＢＵ２１（ｎｉｃ１突然変異とｎｉｃ２突然変異を有するＬｏｗ Ａｌｋａｌｏｉｄ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ドナー親）とエリート栽培品種ＴＮ９０（レシピエント親）との交雑から育種集団を開発する。目標は、劣った葉の特徴を有する親ＬＡ ＢＵ２１株と比較した場合に向上した葉の品質も有する低アルカロイド植物を得ることである。所望の特徴（低アルカロイドレベル、向上した葉の品質）を有するＦ２植物をさらに自家受粉してＦ３世代、その後にＦ５世代を得る。図１は、低アルカロイド形質を有する自家受粉ＴＮ９０株の開発のためにたどる育種プロセスを示す。
図１に示したように、ＴＮ９０タバコゲノム配列データベースに対して、様々なタバコ種（熱風、ダーク、オリエンタル、およびバーレイ）に属するいくつかの再シークエンシング済み株において観察された約１７０，０００の多型ＳＮＰに基づいて開発されたＡｘｉｏｍｅ（登録商標）アレイにおいて２２のＦ３植物をスクリーニングする。植物２２－６は約４０．６％のレシピエント親ゲノム回収率を示し、さらなる進展のために選択する。Ｆ３世代は低アルカロイドレベルも示し、これはＬＡ ＢＵ２１において観察されたものと合致する。Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２ ＫＡＳＰアッセイを使用してＦ４世代をスクリーニングする（それぞれＮｉｃ１ＫＡＳＰマーカーおよびＮｉｃ２ＫＡＳＰマーカーに対応する、ＵＳ２０１６／０３７４３８７のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５および１３７を参照されたい）。１９２のスクリーニングされたＦ４植物の全てが２つの欠失を有し、３つの植物（ｄｓ１０５９－１３８、ｄｓ１０５９－１４３、およびｄｓ１０５９－１９２）をさらなる進展のために選択する。これらの３つの植物からの自家受粉種子をさらに集め、Ｆ５世代を評価する。２２０全てのＦ５植物がｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルの両方についてホモ接合である。摘心の２週間後に植物の先端から３つ目、４つ目、および５つ目の葉から採取したプールした葉試料を測定することによってＦ５植物のアルカロイドレベルを決定する。全ての植物が低アルカロイド形質を示すわけではなく、葉表現型の際立った差異も観察され、いくつかの株は、商用のバーレイタバコにおいて観察されるものと合致する良好な葉の品質を示す（表１）。
（表１）選択されたＦ５植物および対照植物のアルカロイドレベルおよび葉の表現型。全てのＦ５植物はｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルの両方についてホモ接合である。
実施例２： 低アルカロイド形質と関連付けられる追加のゲノム領域の同定
ホモ接合のｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルを有するにもかかわらず高いアルカロイドレベルを有する実施例１からのＦ５植物は、ｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失マーカーおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失マーカーが低アルカロイド形質と１００％の連鎖を示さないことを示唆する。この観察について調べるために、ＬＡＦＣ５３（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有する熱風乾燥型）、ＬＮ ＫＹ１７１（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有するダーク型）、およびＫＹ１７１（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有しないダーク品種）の他に、ｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルについてホモ接合であるが高いアルカロイドレベルを示す２つのＦ５株（Ｇ６１－３６およびＧ６１－３９）、ならびにｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルについてホモ接合であり、かつ低アルカロイドレベルを示す２つのＦ５株（Ｇ６１－３１およびＧ６１－３７）に対してさらなる再シークエンシングを実行する。以前に再シークエンシングされた株であるＢＵ２１、ＨＩ ＢＵ２１、ＬＩ ＢＵ２１、およびＬＡ ＢＵ２１に加えて、これらの７つの株をＴＮ９０ゲノムデータベースを使用してマッピングした。
ホモ接合のｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルを有するにもかかわらず高いアルカロイドレベルを有する実施例１からのＦ５植物は、ｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失マーカーおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失マーカーが低アルカロイド形質と１００％の連鎖を示さないことを示唆する。この観察について調べるために、ＬＡＦＣ５３（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有する熱風乾燥型）、ＬＮ ＫＹ１７１（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有するダーク型）、およびＫＹ１７１（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２移入を有しないダーク品種）の他に、ｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルについてホモ接合であるが高いアルカロイドレベルを示す２つのＦ５株（Ｇ６１－３６およびＧ６１－３９）、ならびにｎｉｃ１ＫＡＳＰ欠失アレルおよびｎｉｃ２ＫＡＳＰ欠失アレルについてホモ接合であり、かつ低アルカロイドレベルを示す２つのＦ５株（Ｇ６１－３１およびＧ６１－３７）に対してさらなる再シークエンシングを実行する。以前に再シークエンシングされた株であるＢＵ２１、ＨＩ ＢＵ２１、ＬＩ ＢＵ２１、およびＬＡ ＢＵ２１に加えて、これらの７つの株をＴＮ９０ゲノムデータベースを使用してマッピングした。
マッピングしたリードのカバレッジ解析から、ＵＳ２０１６／０３７４３８７において以前に記載されたｎｉｃ１欠失セグメントＮＴ１．０－Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００２５０４の約２００万ｂｐ下流にある２０００～３０００ｂｐの領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、以下「ＬＡ関連領域」）が同定される。ＬＡ関連領域は、ＬＡ ＢＵ２１、ＬＩ ＢＵ２１、ＬＮ ＫＹ１７１、ＬＡＦＣ５３の他に、低アルカロイドのホモ接合ｎｉｃ１ＫＡＳＰｎｉｃ２ＫＡＳＰＦ５株Ｇ６１－３１およびＧ６１－３７において欠失している。対照的に、ＬＡ関連領域は、野生型（例えば、ＴＮ９０、ＢＵ２１、Ｋ３２６、ＮＬＭ、カテリニ）の他に、高アルカロイドのホモ接合ｎｉｃ１ＫＡＳＰｎｉｃ２ＫＡＳＰＦ５株Ｇ６１－３６およびＧ６１－３９において欠失していない（すなわち、存在する）。ＬＡ関連領域には既知の遺伝子がない。セリンスレオニンプロテインホスファターゼ遺伝子がこの領域の４８７７ｂｐ上流において見出され、ＥＲＦ（ＥＲＦ１８９のホモログ）がこの領域の５９，９４５ｂｐ下流において見出される。
さらに、Ｆ３植物（２２－６）のＳＮＰ遺伝子型判定から、ｎｉｃ１欠失セグメントＮＴ１．０－Ｓｃａｆｆｏｌｄ０００２５０４の１，２５６，０６３ｂｐ下流から始まり２，７６６，１１８ｂｐ下流において終了するゲノム領域（約１，５１０，０５５ｂｐの長さ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、本明細書において「Ｎｉｃ１ｂ領域」と称される）はＦ３植物（ＬＡ関連領域を含む）においてヘテロ接合であることが明らかになる。このことから、Ｎｉｃ１ｂ領域の低アルカロイドアレルはシガーを起源としている可能性が高く（ＬＡ ＢＵ２１はＢＵ２１と低アルカロイドキューバシガー品種との交雑から開発された）、結果として生じたＦ４と後の世代で分離すると示唆される。
また、約１７０，０００のＳＮＰを含有するＡｘｉｏｍｅアレイを使用して４７のＦ４植物と４８のＦ５植物を遺伝子型判定して、アルカロイドレベルとＬＡ関連領域の他にＮｉｃ１ｂ領域との相関をさらに検証する。３つの祖先Ｆ４世代植物（ｄｓ１０５９－１３８、ｄｓ１０５９－１４３、およびｄｓ１０５９－１９２）の解析から、ＬＡ関連領域およびＮｉｃ１ｂ領域はヘテロ接合であるか、またはＬＡ ＢＵ２１様（Ｂ）アレルを有することが分かる。同様に、４８のＦ５世代植物はＬＡ関連領域およびＮｉｃ１ｂ領域において分離を示し、Ｂアレル（ＬＡ ＢＵ２１様）を有する個体は低アルカロイドレベル（０．１３７％～０．４１７％、乾燥重量）を示し、ヘテロ接合状態（Ｈ）または野生型アレル（Ａ）を有する個体は中等度から高いアルカロイドレベル（１．７９３％～５．４１９％、乾燥重量）を示す。
実施例３： Ｎｉｃ１ｂ領域中の遺伝子およびマーカーの同定
Ｎｉｃ１ｂ領域の配列解析によって、前記領域から少なくとも３５の注釈付き遺伝子が明らかになる（表２）。これらの遺伝子をＮｉｃ１ｂ Ｃｉｇａｒ Ｇｅｎｅ（「ＮＣＧ」）１～３５と称する。これらのＮＣＧ遺伝子の中で、６つのエチレン応答性転写因子様（ＥＲＦ様）遺伝子が同定される。ＲＮＡ－ｓｅｑデータによって、ＢＵ２１と類縁のＬＡ ＢＵ２１植物において摘心の７２時間後に採取した根試料から１０のＮＣＧは低減した発現を示すことが分かる。ＢＵ２１と比較してＬＡ ＢＵ２１において、６つのＥＲＦ様遺伝子のうちの４つを含む７つのＮＣＧは下方調節される一方、他の３つのＮＣＧは上方調節される。
Ｎｉｃ１ｂ領域の配列解析によって、前記領域から少なくとも３５の注釈付き遺伝子が明らかになる（表２）。これらの遺伝子をＮｉｃ１ｂ Ｃｉｇａｒ Ｇｅｎｅ（「ＮＣＧ」）１～３５と称する。これらのＮＣＧ遺伝子の中で、６つのエチレン応答性転写因子様（ＥＲＦ様）遺伝子が同定される。ＲＮＡ－ｓｅｑデータによって、ＢＵ２１と類縁のＬＡ ＢＵ２１植物において摘心の７２時間後に採取した根試料から１０のＮＣＧは低減した発現を示すことが分かる。ＢＵ２１と比較してＬＡ ＢＵ２１において、６つのＥＲＦ様遺伝子のうちの４つを含む７つのＮＣＧは下方調節される一方、他の３つのＮＣＧは上方調節される。
ＬＡ ＢＵ２１、ＴＮ９０、および選択されたＦ５植物における３５のＮＣＧのそれぞれを再シークエンシングして、ＬＡ ＢＵ２１に存在し、かつ遺伝子機能の喪失を引き起こし得る特定の自然突然変異を同定する。遺伝子発現の調節異常を引き起こし得る非コード配列（例えば、プロモーター）における突然変異を同定するために追加の再シークエンシング解析も行う。
加えて、ＳＮＰマーカーを開発するために、Ｎｉｃ１ｂ領域内にある、およびＮｉｃ１ｂ領域に隣接する多型も同定する。Ｎｉｃ１ｂ領域の遺伝子型判定のために２１のＳＮＰマーカーを開発する（表３）。さらなるＳＮＰマーカーを表４に示す。これらのマーカーはＮｉｃ１ｂ領域内にあり、かつ様々なＥＲＦ遺伝子のすぐ隣にある。これらは、正常アルカロイド株を低アルカロイド株と区別するために使用することができるアレルを有する。
（表２）Ｎｉｃ１ｂ領域の注釈付き遺伝子。ａｇ３１４３１およびｇ３１４３２は選択的スプライシングを示すと思われる（図２を参照されたい）。ｂｇ３１４４６は別の選択的スプライシングを示し得る。
（表３）Ｎｉｃ１ｂ領域の中および周囲にあるマーカー。（＊）ゲノム位置はＴＮ９０ゲノムに基づき、ＴＮ９０ゲノムはＮＣＧ遺伝子位置を表すためにも使用される。
（表４）Ｎｉｃ１ｂ領域からの複数のＥＲＦ遺伝子の至近距離にあるＳＮＰマーカー。（＊）ゲノム位置は参照ＴＮ９０ゲノムに基づく。
実施例４： 望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発するためのトランスジェニックアプローチ
過剰発現と抑制の両方のアプローチを採用して、ＮＣＧの機能を調べ、かつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２組のトランスジェニック植物を作製する。一方は完全長コード配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。３５個全てのＮＣＧ（ＮＣＧ１～ＮＣＧ３５）を、ＴＮ９０とＬＡ ＢＵ２１との間で発現差異を示した全てのＮＣＧ、特に、ＥＲＦ様タンパク質をコードするＮＣＧに焦点を当てて試験する。同定された遺伝子（個々に、または組合せで）が低アルカロイド突然変異表現型を補完するか、または突然変異ｎｉｃ１アレルから救出する能力を試験するために、過剰発現研究の一部をｎｉｃ１ ｎｉｃ２二重突然変異体背景（例えば、ＬＡ ＢＵ２１）で行う。
過剰発現と抑制の両方のアプローチを採用して、ＮＣＧの機能を調べ、かつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２組のトランスジェニック植物を作製する。一方は完全長コード配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。３５個全てのＮＣＧ（ＮＣＧ１～ＮＣＧ３５）を、ＴＮ９０とＬＡ ＢＵ２１との間で発現差異を示した全てのＮＣＧ、特に、ＥＲＦ様タンパク質をコードするＮＣＧに焦点を当てて試験する。同定された遺伝子（個々に、または組合せで）が低アルカロイド突然変異表現型を補完するか、または突然変異ｎｉｃ１アレルから救出する能力を試験するために、過剰発現研究の一部をｎｉｃ１ ｎｉｃ２二重突然変異体背景（例えば、ＬＡ ＢＵ２１）で行う。
完全長コード配列または人工マイクロＲＮＡ配列を発現させるために、ＣｓＶＭＶプロモーターおよびＮＯＳターミネーターの他に、アクチン２プロモーターの指示下でカナマイシン選択マーカー（ＮＰＴ ＩＩ）を有し、かつＮＯＳターミネーターを有するカセットを有するように発現ベクターを構築する。例示的な人工マイクロＲＮＡ配列は表２において見出され得る。抑制性構築物の構築または遺伝子サイレンシングのための他のトランスジェニックアプローチ（例えば、ＲＮＡｉ、トランス作用性ｓｉＲＮＡなど）において他の標的配列が使用できることを当業者は理解する。
ＤＮＡボンバードメントまたは微粒子銃アプローチを使用して、関心対象の導入遺伝子を有する核酸構築物をタバコ葉ディスクに導入する。例えば、Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７：４８３－５１０、およびＯｋｕｚａｋｉ ａｎｄ Ｔａｂｅｉ，２０１２，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９：３０７－３１０を参照されたい。簡潔に述べれば、形質転換カセットを含有するプラスミドＤＮＡを以下のように１μｍの金粒子（ＤＮＡ／金）上にコーティングする。１μｍの金粒子を１８０℃で１２時間焼き、ストック溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）を調製する。１０ショット用の混合物を作製するために、１００μｌのストック溶液を、１．５ｍｌチューブの中で４０μｌの発現ベクターＤＮＡ（１μｇ／μｌ）、１００μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２、および４０μｌの０．１Ｍスペルミジンと混合する。混合物を１３，０００×ｇで３０秒間遠心分離し、５００μｌの１００％エタノールを用いてペレットを洗浄する。ＤＮＡ／金混合物を１００μｌの水に懸濁し、１０μｌをマクロキャリアに適用し、乾燥させ、次に砲撃（ｂｏｍｂａｒｄ）する。ＰＤＳ－１０００／Ｈｅシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）において部分真空（７１１ｍｍＨｇ）下で１，１００ｐｓｉラプチャーディスクを使用してプレート当たり２ショットを砲撃する。ナローリーフマドール（ＮＬＭ）およびテネシー（Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）９０（ＴＮ９０）タバコ葉ディスクを、ＲＮＡｉ構築物を用いた形質転換および全長遺伝子構築物を用いた形質転換のために使用する。タバコ葉全体（約４５×３０ｍｍ長）をＭＳ培地上に一晩置き、２日目に葉ディスクに構築物を砲撃する。次に葉を小片（約５×５ｍｍ）に切断し、ＴＯＭ培地（２０ｇスクロース／Ｌ；１ｍｇ／Ｌ ＩＡＡおよび２．５ｍｇ／Ｌ ＢＡＰを含むＭＳ培地）に移して２７℃で３～５日間生育させ、次に、３００ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＴＯＭ培地（ＴＯＭ－Ｋａｎ）に移して生育させる。組織を４～６週間にわたり２～３週間毎に新たなＴＯＭ－Ｋａｎプレートに移す（２７℃，１６時間の光）。ボンバードメントの４～６週間後にカナマイシン耐性初代シュートが再生する。シュートをＭＳ－カナマイシンプレートに移して根を生育させる。次に、１種またはそれ以上のアルカロイドの量を求めるために、Ｔ１植物（とその後の世代）からの葉および／または根を評価する。
実施例５： 低アルカロイド形質を付与するＮｉｃ１ｂ領域の中または周囲にある新規の突然変異を開発するためのランダム突然変異誘発
メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）突然変異誘発または高速中性子ボンバードメントを使用してタバコ植物のランダム突然変異誘発を行う。ＥＭＳ突然変異誘発はゲノムの長さにわたってランダムな点突然変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子突然変異誘発は、二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす中性子ボンバードメントに種子を曝露することからなる。
メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）突然変異誘発または高速中性子ボンバードメントを使用してタバコ植物のランダム突然変異誘発を行う。ＥＭＳ突然変異誘発はゲノムの長さにわたってランダムな点突然変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子突然変異誘発は、二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす中性子ボンバードメントに種子を曝露することからなる。
ＥＭＳ突然変異誘発のために、１グラム（約１０，０００の種子）のテネシー９０タバコ（ＴＮ９０）種子を０．１％Ｔｗｅｅｎで１５分間洗浄し、次に、３０ｍｌのｄｄＨ２Ｏ中に２時間浸す。次に、１５０μｌの０．５％ＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｍ－０８８０）を種子／ｄｄＨ２Ｏ溶液に混合し、フード下において室温（ＲＴ；約２０℃）で８～１２時間（３０ｒｐｍで回転）インキュベートする。次に液体を種子から除去し、汚染除去および廃棄のために１Ｍ ＮａＯＨに一晩混合する。次に種子を１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏを用いて２回、２～４時間洗浄する。次に、洗浄した種子を０．１％寒天溶液に懸濁した。
寒天溶液中のＥＭＳ処理済み種子を、平箱中の水に浸したＣａｒｏｌｉｎａ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｍｉｘ（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｏｉｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋｉｎｓｔｏｎ，ＮＣ）に約２０００種子／平箱で均等に広げる。次に平箱をプラスチックラップで覆い、生育室に入れる。実生が土壌から現れたら、プラスチックラップに穴を開けて湿度を徐々に低下させる。プラスチックラップを２週間後に完全に除去する。平箱を温室に移動し、ＮＰＫ肥料を施す。実生をフロートトレイに詰め、移植サイズまで生育させる。その後に植物を圃場に移植する。生育の間に植物は自家受粉してＭ１種子を形成する。成熟段階において各植物から５つのさく果を収穫し、個々の呼称を各植物からの一組の種子に与える。これはＭ１集団を形成する。各Ｍ０植物からのＭ１種子の混成品種を生育させ、Ｍ１植物からの葉をＤＮＡ抽出のために収集する。突然変異の同定のために、Ｎｉｃ１ｂ領域内にあるか、その周囲にあるか、またはそれに隣接する標的遺伝子を増幅および配列決定する。ＴＮ９０とＬＡ ＢＵ２１との間で発現差異を示す全てのＮＣＧ、特に、ＥＲＦ様タンパク質をコードするＮＣＧに焦点を当てて、３５個全てのＮＣＧ（ＮＣＧ１～ＮＣＧ３５）において突然変異を同定する。
実施例６： 低アルカロイド形質を付与するＮｉｃ１ｂ領域の中または周囲にある新規の突然変異を開発するための標的指向性突然変異誘発
精密なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９システム、Ｃｐｆ１システム、またはＣｓｍ１システム）を介してＮｉｃ１ｂ遺伝子座（例えば、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０、およびＮＣＧ）中に、およびその周囲に突然変異を導入することにより、高い葉の品質を維持しながらニコチンが少ないタバコ株を産生する。ＴＮ９０、Ｋ３２６、およびナローリーフマドールなどの商用のタバコ品種においてゲノム改変を行う。ＴＮ９０とＬＡ ＢＵ２１との間で発現差異を示す全てのＮＣＧ、特に、ＥＲＦ様タンパク質をコードするＮＣＧに焦点を当てて、３５個全てのＮＣＧ（ＮＣＧ１～ＮＣＧ３５）を編集する。
精密なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９システム、Ｃｐｆ１システム、またはＣｓｍ１システム）を介してＮｉｃ１ｂ遺伝子座（例えば、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０、およびＮＣＧ）中に、およびその周囲に突然変異を導入することにより、高い葉の品質を維持しながらニコチンが少ないタバコ株を産生する。ＴＮ９０、Ｋ３２６、およびナローリーフマドールなどの商用のタバコ品種においてゲノム改変を行う。ＴＮ９０とＬＡ ＢＵ２１との間で発現差異を示す全てのＮＣＧ、特に、ＥＲＦ様タンパク質をコードするＮＣＧに焦点を当てて、３５個全てのＮＣＧ（ＮＣＧ１～ＮＣＧ３５）を編集する。
例えば、ＮＣＧ遺伝子からの特定の標的配列を認識するようにＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを設計および合成する。例示的なガイドＲＮＡ配列を表２に示す。次に、ガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣｓｍ１タンパク質をコードする付随する核酸（ＤＮＡプラスミド形態またはｍＲＮＡ形態のいずれかとして）を使用してタバコプロトプラストを形質転換する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１／Ｃｓｍ１リボ核タンパク質複合体は特定のＮＣＧ標的配列を認識して二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。内因性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復システムはＤＳＢを修復する。ＤＳＢはヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を導入し、潜在的な機能欠失型突然変異をもたらし得る。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ標的部位に、またはその周囲に所望の配列を導入するための鋳型分子として働くように、所望の配列を有するドナー核酸分子をプロトプラスト形質転換に含める。
生育室のマゼンタ（Ｍａｇｅｎｔａ）ボックスの中で育っているＴＮ９０タバコ葉からタバコプロトプラストを単離する。３～４週齢の植物から、大きく広がった葉（５ｃｍ）を葉の中央部分から０．５～１ｍｍの葉細片に切断する。葉細片の両側を浸漬することにより、調製された酵素溶液（１％のセルラーゼＲ１０、０．２５％マセロザイムＲ１０、０．４Ｍマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ）中に葉細片を移す。デシケーターを使用して葉細片を暗所で３０分間真空浸潤し、撹拌なしで４時間から一晩、室温において暗所で消化を続ける。プロトプラストを１００μｍのナイロンフィルターで濾過し、３ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いて精製する。プロトプラストを遠心分離し、Ｗ５ｎ溶液（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭＥＳ、９９１ｍｇ／ｌグルコース、ｐＨ５．７）を用いて洗浄し、５×１０５／ｍｌの濃度でＷ５ｎ溶液に懸濁する。プロトプラストを氷上に３０分間保って、重力によりチューブの底に沈殿させる。Ｗ５ｎ溶液を動かし、プロトプラストを室温でＰ２溶液に再懸濁する。５０μｌのＤＮＡ（１０～２０μｇのプラスミド）、５００μｌのプロトプラスト（２×１０５のプロトプラスト）、および５５０μｌのＰＥＧ溶液（４０％ｖ／ｖ、１０ｍｌの４ｇ ＰＥＧ４０００、０．２Ｍマンニトール、０．１Ｍ ＣａＣｌ２）を１５ｍｌの微量遠心分離チューブ中で穏やかに混合し、混合物を室温で５分間インキュベートする。
プロトプラストをペレット化し、１ｍｌの２Ｘ ８ＥＮ１（８ＥＮ１：ＮＨ４ＮＯ３を含まないＭＳ塩、ＭＳビタミン、０．２％ミオイノシトール、４ｍＭ ＭＥＳ、１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、１ｍｇ／ｌ ＩＡＡ、０．５Ｍマンニトール、０．５ｍｇ／ｌ ＢＡＰ、１．５％スクロース）を用いて再懸濁する。形質転換されたプロトプラストを等量の低融点アガロース（ＬＭＡ）を用いてゼリー状にし、０．２ｍｌのプロトプラスト－ＬＡＭを滴下してビーズを形成する。１０ｍｌの８ＥＮ１をビーズに加え、７日目に５ｍｌの８ＥＮ１を取り出し、５ｍｌの８ＥＮ２（０．２５Ｍマンニトールを含む８ＥＮ１）を加え、さらに７日後（１４日）に、１０ｍｌの８ＥＮ２を取り出し、１０ｍｌの８ＥＮ２を加え、さらに７日後（２１日）に、５ｍｌの８ＥＮ２を取り出し、５ｍｌの８ＥＮ３（３％のスクロースを含み、かつマンニトールを含まない８ＥＮ１）を加え、さらに７日後（２８日）に、１０ｍｌの８ＥＮ３を取り出し、１０ｍｌの８ＥＮ３を加える。微小カルスが生育するまでプロトプラストを２週間保つ。カルスが約５ｍｍに達するまで（通常、約２週）、カルスをＮＣＭ固体培地に移す。カルスをＴＯＭ－Ｋａｎ固体培地に移してシュートを生育させ、形質転換されたタバコ植物を本明細書に記載の方法を使用して再生させた。カルスまたは再生植物を、ＮＣＧ遺伝子に所望の突然変異がある遺伝子編集事象について試験および選択する。機能欠失型ＮＣＧアレル（例えば、早期終止コドンもしくはフレームシフト）または他の種類の突然変異（例えば、機能獲得もしくはネオモルフ）の両方が産生される。
同様に、ゲノム編集法（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣｓｍ１媒介性のＣＲＩＳＰＲ編集システム）を使用してＮｉｃ２遺伝子座からのＥＲＦ遺伝子（ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８）も編集する。機能欠失型ＥＲＦ突然変異（例えば、早期終止コドン）または他の種類の突然変異（例えば、機能獲得もしくはネオモルフ）の両方が産生される。
実施例７： Ｎｉｃ１ｂ領域中のＥＲＦ様遺伝子を抑制し、かつ低アルカロイドのタバコを産生するためのドミナントリプレッサーの使用
Ｃ末端にＥＲＦ関連両親媒性抑制（ＥＲＦ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＥＡＲ）モチーフを取り付けることによって、Ｎｉｃ１ｂ領域に由来する１つまたはそれ以上のＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０、およびＮＣＧ１７）のドミナントリプレッサーを開発する。ＥＡＲモチーフは転写因子に取り付けられると転写因子の標的遺伝子の発現を活発に抑制することが示されている（Ｈｉｒａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．３４：７３３－７３９（２００３））。
Ｃ末端にＥＲＦ関連両親媒性抑制（ＥＲＦ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＥＡＲ）モチーフを取り付けることによって、Ｎｉｃ１ｂ領域に由来する１つまたはそれ以上のＥＲＦ様遺伝子（例えば、ＮＣＧ１、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ１３０、およびＮＣＧ１７）のドミナントリプレッサーを開発する。ＥＡＲモチーフは転写因子に取り付けられると転写因子の標的遺伝子の発現を活発に抑制することが示されている（Ｈｉｒａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．３４：７３３－７３９（２００３））。
簡潔に述べれば、ＥＲＦ－ＥＡＲ構築物を構成的プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター）の制御下に置き、それを使用してプロトプラスト形質転換またはアグロバクテリウムにより野生型タバコを形質転換し、それにより、各構築物のトランスジェニック株と、空ベクター（ＶＣ）を用いて形質転換された対照株を産生する。導入遺伝子の発現を検証する。ニコチンレベルと、ニコチン生合成関連酵素（プトレシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、Ｎ－メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、アスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）、キノリン酸シンターゼ（ＱＳ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＰＩＰファミリーオキシドレダクターゼＡ６２２）、ならびにトノプラスト局在化ＭＡＴＥファミリートランスポーターＭＡＴＥ１およびＭＡＴＥ２（ＭＡＴＥ１／２）の発現を両方とも、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、スペルミジンシンターゼ（ＳＰＤＳ）、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＳＡＭＤＣ）、およびＳ－アデノシルメチオニンシンターゼ（ＳＡＭＳ）遺伝子の発現レベルと共に試験する。
実施例８： 低ニコチンを含有するタバコ品種の育種
同定されたＮｉｃ１ｂ領域、Ｎｉｃ１ｂ領域の中の遺伝子、およびＮｉｃ１ｂ領域と関連付けられた分子マーカーの助けを借りて、商業的に許容される葉の品質を有する、ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異（例えば、Ｎｉｃ１ｂ領域の完全または部分的な欠失）を含む低アルカロイドのタバコハイブリッド、品種、および株を育種および産生する。ＮＣＧ遺伝子およびマーカーはまた、様々なニコチアナ属の生殖質、例えば、様々なニコチアナ属の種またはニコチアナ・タバカム株に由来する追加のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆアレルをスクリーニングするのにも用いられる。スクリーニングすることができる、４３種類のニコチアナ属の種、４９種類のニコチアナ・ルスティカ株、および約６００種類のニコチアナ・タバカム株のコレクションが米国特許第７，７００，８３４号の表８に示される。
同定されたＮｉｃ１ｂ領域、Ｎｉｃ１ｂ領域の中の遺伝子、およびＮｉｃ１ｂ領域と関連付けられた分子マーカーの助けを借りて、商業的に許容される葉の品質を有する、ｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異（例えば、Ｎｉｃ１ｂ領域の完全または部分的な欠失）を含む低アルカロイドのタバコハイブリッド、品種、および株を育種および産生する。ＮＣＧ遺伝子およびマーカーはまた、様々なニコチアナ属の生殖質、例えば、様々なニコチアナ属の種またはニコチアナ・タバカム株に由来する追加のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆアレルをスクリーニングするのにも用いられる。スクリーニングすることができる、４３種類のニコチアナ属の種、４９種類のニコチアナ・ルスティカ株、および約６００種類のニコチアナ・タバカム株のコレクションが米国特許第７，７００，８３４号の表８に示される。
新規のｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆアレルを有すると突き止められた生殖質は、栽培タバコを用いて育種するための供給源材料として使用される。ドナー供給源からの望ましいｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆまたはｎｉｃ２突然変異アレルを栽培タバコに移入するために、戻し交雑または系統法などの標準的な育種方法と組み合わせた種間または種内ハイブリダイゼーション法が使用され得る。例えば、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、または両方の突然変異アレルを含む低ニコチン品種（例えば、ＬＡ Ｂｕｒｌｅｙ ２１などのドナー親）が、望ましい遺伝的背景および耕種学的にエリートの形質を有するエリート高ニコチン品種と交雑される。任意で、この交雑からのＦ１子孫植物を、表３に例示した１つまたはそれ以上の分子マーカーがあるかどうかアッセイする。次に、Ｆ１子孫植物を親エリート高ニコチン品種（反復親）と戻し交雑する。本明細書中で説明および開示される分子マーカーを使用してＢＣ１世代からの植物を遺伝子型判定して、より小さなｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ欠失セグメントまたはｎｉｃ２欠失セグメントを有するタバコ植物を選択する。複数回の戻し交雑（例えば、５～７世代）後に、低アルカロイド形質と、反復親エリート株からの他の望ましい形質を両方とも含む新たなエリートタバコ品種が得られる。この新たなエリートタバコ品種はまた、Ｎｉｃ１ｂ遺伝子座およびＮｉｃ２遺伝子座の周囲の遺伝子組換え事象に起因する低アルカロイド形質と関連付けられた、あらゆるジェネティックドラグ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒａｇ）を含まない。これらの組換え事象は、あらゆる関連付けられた有害な突然変異からｎｉｃ１ｂ＿ｅｒｆ突然変異およびｎｉｃ２突然変異を連鎖させないようにし、従って、ジェネティックドラグを低減または回避する。上記の育種およびマーカー支援選抜戦略を使用して、低ニコチン形質と、アルカロイドまたはＴＳＮＡレベルを低減する他の導入遺伝子または天然のアレルとの上乗せまたは積重ねを達成することもできる。
低アルカロイドのタバコハイブリッド、品種、または株は、バーレイ種、ダーク種、熱風乾燥種、メリーランド種、またはオリエンタル種のタバコとして作製されてもよく、ＢＵ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、コカー（Ｃｏｋｅｒ）１７６、コカー３１９、コカー３７１ゴールド（Ｇｏｌｄ）、コカー４８、ＣＵ ２６３、ＤＦ９１１、ガルパオタバコ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ １０、ＫＹ １４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４ ｘ Ｌ８ ＬＣ、リトルクリテンデン、マクネア（ＭｃＮａｉｒ）３７３、マクネア９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、ナローリーフマドール、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、ニールスミスマドール（Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ）、オックスフォード（ＯＸＦＯＲＤ）２０７、「ペリーク」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１１、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、スペイト（Ｓｐｅｉｇｈｔ）１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ－２８、スペイトＧ－７０、スペイトＨ－６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ １４０６、ＴＩ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（トムロソン）マドール、ＶＡ ３０９、もしくはＶＡ３５９、メリーランド６０９、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ＨＢ４４８８ＰＬＣ、ＫＴ２０６ＬＣ、ＫＴ２０９ＬＣ、ＫＴ２１０ＬＣ、ＫＴ２１２ＬＣ、Ｒ６１０ＬＣ、ＰＶＨ２３１０、ＮＣ１９６、ＫＴＤ１４ＬＣ、ＫＴＤ６ＬＣ、ＫＴＤ８ＬＣ、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０５ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１８ＬＣ、ＰＤ７３１９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ、シレイＬＣ（ＳｈｉｒｅｙＬＣ）、または当技術分野において公知の標準的なタバコ育種技術による任意の商用のタバコ品種に本質的に由来してもよい。
実施例９： Ｎｉｃ１ｂ領域に由来する追加の遺伝子
非コードＲＮＡを含む、いくつかの遺伝子をＮｉｃ１ｂ領域から同定する。これらを表５に列挙した。ＥＲＦ１６を除いて、これらの遺伝子は全て、ＴＮ９０および高アルカロイドＦ５同胞植物においてＬＡ ＢＵ２１および低アルカロイドＦ５同胞植物と比較して高い発現レベルを示す。ＥＲＦ１６は高アルカロイド植物および低アルカロイド植物において比較的類似したレベルで発現するように見える。実施例４～７で概説したように、これらの追加の遺伝子をさらに研究する。例えば、過剰発現と抑制の両方のアプローチを採用して、これらの遺伝子の機能を調べ、かつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２組のトランスジェニック植物を作製する。一方は完全長コード配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。さらに、これらの遺伝子の突然変異アレルを産生するために、突然変異アプローチ（ランダム突然変異誘発または標的指向性編集のいずれか）も採用する。
非コードＲＮＡを含む、いくつかの遺伝子をＮｉｃ１ｂ領域から同定する。これらを表５に列挙した。ＥＲＦ１６を除いて、これらの遺伝子は全て、ＴＮ９０および高アルカロイドＦ５同胞植物においてＬＡ ＢＵ２１および低アルカロイドＦ５同胞植物と比較して高い発現レベルを示す。ＥＲＦ１６は高アルカロイド植物および低アルカロイド植物において比較的類似したレベルで発現するように見える。実施例４～７で概説したように、これらの追加の遺伝子をさらに研究する。例えば、過剰発現と抑制の両方のアプローチを採用して、これらの遺伝子の機能を調べ、かつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２組のトランスジェニック植物を作製する。一方は完全長コード配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。さらに、これらの遺伝子の突然変異アレルを産生するために、突然変異アプローチ（ランダム突然変異誘発または標的指向性編集のいずれか）も採用する。
Ｎｉｃ１ｂ領域に由来する、またはその周囲に由来する選択された遺伝子または配列セグメントの過剰発現からの結果を表１３および図３に示す。３５Ｓプロモーターを使用して過剰発現を推進する。ＬＡ ＢＵ２１における個々のＴ０形質転換体を同日に鉢植えする。これらは、ＥＲＦ１３０、ＬＡ ＢＵ２１において欠失しているＬＡ関連領域（すなわち、注釈付き遺伝子を含有しない「Ｎｉｃ１ｂΔ」として参照されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１。実施例２を参照されたい）、ｇ３２０８１（ベータ－グルコシダーゼ１８様遺伝子）、およびＥＲＦ１６を対象にした対照構築物および過剰発現構築物を含む。鉢植えの１２週間後に植物を摘心する。摘心の２週間後に植物の先端から３つ目、４つ目、５つ目、および６つ目の葉から採取したプールした葉身試料を測定することによってアルカロイドレベルを決定する。４つまたは５つの独立したＴ０植物を各構築物について試験し、総アルカロイドまたは個々のアルカロイドの平均レベルを決定する。図３に示したように、このアルカロイドデータセットはＥＲＦ１６の過剰発現がニコチン産生を促進することを示す（対照と比べて７６％の増加）。他の微量アルカロイド（ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンを含む）もまたＥＲＦ１６過剰発現植物において増加するようであり、これらは全て、対照と比べて７６％の総アルカロイドの増加に寄与する。ニコチンまたはアルカロイドレベルの明らかな変化はＥＲＦ１３０、Ｎｉｃ１ｂΔ配列、またはｇ３２０８１の過剰発現から観察されない。
実施例１０： 第７染色体に由来する複数の転写因子が正常アルカロイドタバコ株と低減アルカロイドタバコ株との間で異なって発現する
表６に列挙したように、ＢＵ２１とＬＡ ＢＵ２１との間で異なった発現レベルを示す、いくつかの追加の転写因子が第７染色体から同定される。実施例４～７で概説したように、これらの追加の遺伝子をさらに研究する。例えば、過剰発現と抑制の両方のアプローチを採用して、これらの遺伝子の機能を調べ、かつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２組のトランスジェニック植物を作製する。一方は完全長コード配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。さらに、これらの遺伝子の突然変異アレルを産生するために、突然変異アプローチ（ランダム突然変異誘発または標的指向させた編集のいずれか）も採用する。
表６に列挙したように、ＢＵ２１とＬＡ ＢＵ２１との間で異なった発現レベルを示す、いくつかの追加の転写因子が第７染色体から同定される。実施例４～７で概説したように、これらの追加の遺伝子をさらに研究する。例えば、過剰発現と抑制の両方のアプローチを採用して、これらの遺伝子の機能を調べ、かつ望ましいニコチンレベルを有するタバコ品種を開発する。２組のトランスジェニック植物を作製する。一方は完全長コード配列を使用する過剰発現アプローチであり、他方は人工マイクロＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列を使用する抑制アプローチである。さらに、これらの遺伝子の突然変異アレルを産生するために、突然変異アプローチ（ランダム突然変異誘発または標的指向させた編集のいずれか）も採用する。
実施例１１： Ｎｉｃ１ｂ領域に由来する様々なＥＲＦ遺伝子がニコチン生合成に関与する
実施例４で概説したように、Ｎｉｃ１ｂ領域に由来する、またはその近くにある様々なＥＲＦ遺伝子（集団としては「Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ」と称する）を抑制するために、ＭＩＲ６１４７骨格を使用して人工マイクロＲＮＡ（「ａｍｉＲＮＡ」）構築物を設計する。一部の人工マイクロＲＮＡは、個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓを特異的に抑制するように設計される。他のマイクロＲＮＡは、複数のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓを同時に標的とするように設計される。一部の例示的な成熟人工マイクロＲＮＡ配列を表２に示す。
実施例４で概説したように、Ｎｉｃ１ｂ領域に由来する、またはその近くにある様々なＥＲＦ遺伝子（集団としては「Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ」と称する）を抑制するために、ＭＩＲ６１４７骨格を使用して人工マイクロＲＮＡ（「ａｍｉＲＮＡ」）構築物を設計する。一部の人工マイクロＲＮＡは、個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓを特異的に抑制するように設計される。他のマイクロＲＮＡは、複数のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓを同時に標的とするように設計される。一部の例示的な成熟人工マイクロＲＮＡ配列を表２に示す。
Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ特異的ａｍｉＲＮＡ構築物を用いて形質転換したＴ０植物を、ａｍｉＲＮＡ－ＧＵＳ構築物を有する対応する対照植物と同日に鉢植えする。遺伝子発現研究のための根組織を、もっと大きな鉢に植え替えしながら植物から採取する。摘心の２週間後に植物の先端から３つ目、４つ目、５つ目、および６つ目の葉から採取したプールした葉身試料を測定することによってアルカロイドレベルを決定する。簡潔に述べれば、内部標準を含有する有機溶媒への液体／液体抽出を使用して約０．５ｇのタバコを抽出し、水素炎イオン化（ＦＩＤ）を用いてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により分析する。結果は、そのまま、または乾燥重量を基準として重量パーセント（Ｗｔ％）として報告されることがある。乾燥重量に基づくデータの報告はオーブン揮発分（ＯＶ）の決定を必要とする。特に定めのない限り、本明細書中で示される総アルカロイドレベルもしくは個々のアルカロイドレベルまたはニコチンレベルは乾燥重量に基づく（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５またはＱＳ１２Ｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてアクチンを対照として用いるマルチプレックスｑＰＣＲ法を使用して事前の遺伝子発現スクリーニングを行う。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＱＳ １２Ｋ機器によって、アクチン対照遺伝子を含む１８の遺伝子を３回繰り返して用いて、特注のＯｐｅｎＡｒｒａｙ上で植物の選ばれたサブセットもスクリーニングする。
表７は、人工マイクロＲＮＡを介して、選択された個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓを抑制した一組の独立したＴ０形質転換体からのアルカロイドデータをまとめたものである。いくつかの例外（例えば、１８ＧＨ２０８３）はあるが、人工マイクロＲＮＡを介して個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓを抑制すると、ＨＩ ＢＵ２１背景（すなわち、ｎｉｃ２単一突然変異体）ではニコチンが低減するが、野生型背景（例えば、ｔ－ＮＬ Ｍａｄｏｌｅ（ＰｈＰｈ）ＳＲＣ）ではニコチンは低減しない（表７～９）。これはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ間の冗長性を示唆している可能性があり、ニコチン調節における個々の各Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの役割を評価するために、ｎｉｃ２単一突然変異体が高感度化した背景を提供することも示している。ＨＩ ＢＵ２１植物において個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓを抑制すると、ニコチンレベルは対照植物の約５０％～９０％まで低減する（表７および図４）。ａｍｉＲＮＡ植物において観察されたニコチンの低減は複数のニコチン生合成遺伝子の遺伝子発現の低減と合致する（表１０）。
Ｔ１植物を産生し、カナマイシン耐性分離比、アルカロイドレベル、およびニコチン生合成遺伝子発現についてさらに分析する。交雑を行って複数のａｍｉＲＮＡを単一の植物に導入して、複数のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓを同時に抑制する。
実施例１２： Ｎｉｃ１ｂおよび／またはＮｉｃ２遺伝子座と関連付けられたＥＲＦ遺伝子の操作によるニコチンレベルの調整
タバコにおいて望ましいニコチンレベルを実現するために、過剰発現または下方調節を介して、およびトランスジェニックまたは突然変異誘発のいずれかのアプローチを通じて２つのＥＲＦ遺伝子グループを操作する。それぞれのＥＲＦグループはＮｉｃ１ｂ領域またはＮｉｃ２領域の周囲でクラスター化している。第１のＥＲＦグループは、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２を含み、これらは、Ｎｉｃ１ｂ領域の周囲でクラスター化することが本明細書において見出される（個別ではＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ、集団としてはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ）。表１１およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。この第１のＥＲＦグループのコアメンバーは、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２を含む。この第１のグループはまたＪＲＥ５Ｌ２を含むことがある。第２のＥＲＦグループは、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８（個別ではＮｉｃ２＿ＥＲＦ、集団としてはＮｉｃ２＿ＥＲＦｓ）を含み、これらはＨＩ ＢＵ２１（すなわち、ｎｉｃ２単一突然変異体）において欠失しているようである。Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０）を参照されたい。第２のグループのコアメンバーはＥＲＦ１８９およびＥＲＦ１１５を含む。この第２のグループはまた、ＥＲＦ１６３、ＥＲＦ９１Ｌ１、ＥＲＦ１０４ΔＣ、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ１６８、ＥＲＦ１７、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７Ｌ１、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１７Ｌ２ΔＣ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＥＲＦ１０４Ｌ１ΔＣ、およびＥＲＦ１６８Ｌ１ΔＣを含む、さらに大きなグループに拡大されることがある。表１２およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。
タバコにおいて望ましいニコチンレベルを実現するために、過剰発現または下方調節を介して、およびトランスジェニックまたは突然変異誘発のいずれかのアプローチを通じて２つのＥＲＦ遺伝子グループを操作する。それぞれのＥＲＦグループはＮｉｃ１ｂ領域またはＮｉｃ２領域の周囲でクラスター化している。第１のＥＲＦグループは、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２を含み、これらは、Ｎｉｃ１ｂ領域の周囲でクラスター化することが本明細書において見出される（個別ではＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ、集団としてはＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓ）。表１１およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。この第１のＥＲＦグループのコアメンバーは、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２を含む。この第１のグループはまたＪＲＥ５Ｌ２を含むことがある。第２のＥＲＦグループは、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８（個別ではＮｉｃ２＿ＥＲＦ、集団としてはＮｉｃ２＿ＥＲＦｓ）を含み、これらはＨＩ ＢＵ２１（すなわち、ｎｉｃ２単一突然変異体）において欠失しているようである。Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０）を参照されたい。第２のグループのコアメンバーはＥＲＦ１８９およびＥＲＦ１１５を含む。この第２のグループはまた、ＥＲＦ１６３、ＥＲＦ９１Ｌ１、ＥＲＦ１０４ΔＣ、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ１６８、ＥＲＦ１７、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７Ｌ１、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１７Ｌ２ΔＣ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＥＲＦ１０４Ｌ１ΔＣ、およびＥＲＦ１６８Ｌ１ΔＣを含む、さらに大きなグループに拡大されることがある。表１２およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１を参照されたい。
トランスジェニックアプローチには、ＲＮＡ干渉ベースの遺伝子抑制（例えば、アンチセンス、共抑制、ヘアピンまたは逆方向反復ベースのＲＮＡｉ、人工マイクロＲＮＡ、人工トランス作用性低分子干渉（ｔａ－ｓｉ）ＲＮＡ）およびドミナントネガティブサプレッサー（例えば、ＥＲＦ関連両親媒性抑制（ＥＡＲ）モチーフ）が含まれる。導入遺伝子ベースまたはシス遺伝子ベースの抑制は単一のＥＲＦ遺伝子に特異的に、またはＥＲＦ遺伝子のサブセットに同時に方向付けることができる。ドミナントネガティブサプレッサーは、例えば、内因性ＥＲＦコード配列とインフレームのＥＡＲモチーフコード配列におけるノックインにより、シスジェニックにすることができる。
突然変異誘発アプローチには、化学的（例えば、ＥＭＳベースのＴＩＬＬＩＮＧ）または物理的（例えば、照射）のいずれかのランダム突然変異誘発およびゲノム編集が含まれる。本明細書に記載の任意のゲノム編集法を使用することができる。ゲノム編集法には、例えば、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９システム、Ｃｐｆ１システム、またはＣｓｍ１システムが含まれる。
コアメンバーに焦点を当てて、第１および第２のＥＲＦグループの突然変異アレルを作製するためにトランスジェニックまたは突然変異誘発アプローチを使用する。機能欠失型（すなわち、ヌル）アレルと弱い突然変異アレルが両方とも産生される。Ｎｉｃ２＿ＥＲＦｓのレベルまたは活性を、潜在的にはＨＩ ＢＵ２１またはＬＡ ＦＣ５３において見出されるｎｉｃ２突然変異アレルと類似のレベルまたは活性まで抑制するように、Ｎｉｃ２＿ＥＲＦ突然変異アレルの様々な組み合わせを生じさせる。Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦｓのレベルまたは活性を、潜在的にはＬＩ ＢＵ２１またはＬＡ ＦＣ５３において見出されるｎｉｃ１突然変異アレルと類似のレベルまたは活性まで抑制するように、Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ突然変異アレルの様々な組み合わせを生じさせる。ＬＡ ＢＵ２１、ＬＡ ＦＣ５３、またはＬＮ ＫＹ１７１において見出されるものと同様のニコチンおよび総アルカロイドレベルを有する低アルカロイドのタバコ株を産生するために、様々なＮｉｃ２＿ＥＲＦおよびＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子にある突然変異アレルのさらなる組合せを生じさせるか、または単一のタバコ植物に移入する。
実施例１３： 毛状根における過剰発現またはドミナントＥＡＲリプレッサー融合を介してＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子を操作することによるニコチンレベルの調整
実施例１２で述べたように、様々なＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ配列をドミナントＥＡＲリプレッサードメインと融合させ、タバコ毛状根において過剰発現させる。毛状根をジャスモン酸メチルで誘導しない。１本の根を導入遺伝子発現レベルについて試験し、導入遺伝子発現レベルをグループ（＋、＋＋、＋＋＋）に分類する。少なくとも１つの液体培養物／構築物を根に接種する。根は同様の発現を示す（５本の根／培養物）。下流遺伝子発現（ＰＭＴ、ＱＰＴ、およびスペルミジン合成酵素（対照遺伝子）の定量ＲＴ－ＰＣＲ）とアルカロイドレベルを求める。結果を表１４にまとめた。
実施例１２で述べたように、様々なＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ配列をドミナントＥＡＲリプレッサードメインと融合させ、タバコ毛状根において過剰発現させる。毛状根をジャスモン酸メチルで誘導しない。１本の根を導入遺伝子発現レベルについて試験し、導入遺伝子発現レベルをグループ（＋、＋＋、＋＋＋）に分類する。少なくとも１つの液体培養物／構築物を根に接種する。根は同様の発現を示す（５本の根／培養物）。下流遺伝子発現（ＰＭＴ、ＱＰＴ、およびスペルミジン合成酵素（対照遺伝子）の定量ＲＴ－ＰＣＲ）とアルカロイドレベルを求める。結果を表１４にまとめた。
ＥＲＦ１９９－ＥＡＲドミナントサプレッサーを発現させると（過剰発現レベル：＋＋／＋＋＋）、ＰＭＴおよびＱＰＴ遺伝子の発現が低減し（図５Ａ）、ニコチンおよびノルニコチンが低減する（が、アナバシンおよびアナタビンは低減しない）（図５Ｂ）。３つのＥＲＦ１９９－ＥＡＲバイオロジカルレプリケートとベクター対照（ｖｃ、３つのバイオロジカルレプリケートの１つのプール）を試験する。これらのドミナントサプレッションデータから、ＥＲＦ１９９はＰＭＴ発現を誘導し、それにより、ニコチンおよびノルニコチン産生を誘導することが示唆される。さらに、ＥＲＦ１９９はＱＰＴ発現に強力に影響を及ぼすようには見えず、従って、アナバシンおよびアナタビン産生はＥＲＦ１９９－ＥＡＲサプレッサー株ではわずかにしか変化しない。
ＥＲＦ２９－ＥＡＲドミナントサプレッサーを発現させると（過剰発現レベル：（＋）／＋）、ＰＭＴおよびＱＰＴ遺伝子の発現が低減し（図６Ａ）、ニコチン、ノルニコチン、およびアナタビンが低減する（が、アナバシンは低減しない）（図６Ｂ）。３つのＥＲＦ２９－ＥＡＲバイオロジカルレプリケートとベクター対照試料（ｖｃ、２つのバイオロジカルレプリケートの１つのプール）を試験する。これらのドミナントサプレッションデータから、ＥＲＦ２９はＰＭＴ発現を誘導し、それにより、ニコチンおよびノルニコチン産生を誘導することが示唆される。さらに、ＥＲＦ２９はまたＱＰＴ発現にも影響を及ぼし、従って、アナタビン産生にも影響を及ぼすように見える。
ＥＲＦ２１０－ＥＡＲドミナントサプレッサーを発現させると（過剰発現レベル：＋＋＋）、ＰＭＴおよびＱＰＴ遺伝子の発現が中程度に低減し（図７Ａ）、ニコチン、ノルニコチン、およびアナタビンがわずかに低減する（が、アナバシンは低減しない）（図７Ｂ）。これらの結果は、図４の人工マイクロＲＮＡベースの抑制データと一致する。１つのＥＲＦ２１０－ＥＡＲバイオロジカルレプリケートとベクター対照試料（ｖｃ、１つのバイオロジカルレプリケートの１つのプール）を試験する。これらのドミナントサプレッションデータから、ＥＲＦ２１０はＰＭＴおよびＱＰＴ発現にわずかに影響を及ぼし、それにより、ニコチンおよびノルニコチン産生にわずかな影響を与えることが示唆される。
ＥＲＦ１６－ＥＡＲドミナントサプレッサーを発現させると（過剰発現レベル：（＋）／＋）、ＰＭＴ発現が低減し（図８Ａ）、ニコチン、ノルニコチン、およびアナタビンが低減する（が、アナバシンは低減しない）（図８Ｂ）。２つのＥＲＦ１６－ＥＡＲバイオロジカルレプリケートとベクター対照（ｖｃ、１つのバイオロジカルレプリケートの１つのプール）を試験する。これらのドミナントサプレッションデータから、ＥＲＦ１６はＰＭＴ発現を誘導し、それにより、ニコチンおよびノルニコチン産生を誘導することが示唆される。この観察は、図３に示したトランスジェニックデータと一致する。さらに、ＥＲＦ１６はＱＰＴ発現に強力に影響を及ぼすようには見えず、従って、ＥＲＦ１６－ＥＡＲサプレッサー株ではアナバシン産生は変化しない。
ＥＲＦ１３０－ＥＡＲドミナントサプレッサーを発現させると（過剰発現レベル：＋＋）、ＰＭＴ発現が低減し（図９Ａ）、ニコチン、ノルニコチン、およびアナタビンが低減する（が、アナバシンは低減しない）（図９Ｂ）。３つのＥＲＦ１３０－ＥＡＲバイオロジカルレプリケートとベクター対照（ｖｃ、２つバイオロジカルレプリケートの１つのプール）を試験する。これらのドミナントサプレッションデータから、ＥＲＦ１３０はＰＭＴ発現を誘導し、それにより、ニコチンおよびノルニコチン産生を誘導することが示唆される。さらに、ＥＲＦ１３０はＱＰＴ発現にわずかにしか影響を及ぼさないように見え、従って、ＥＲＦ１３０－ＥＡＲサプレッサー株ではアナタビン産生もわずかにしか変化しない。
ＥＲＦ９１過剰発現とＥＲＦ９１－ＥＡＲドミナントサプレッサー発現を両方とも試験する。ＥＲＦ９１を過剰発現させるとＰＭＴおよびＱＰＴの発現が強化され、従って、ニコチン、ノルニコチン、およびアナタビンレベルが増加する（図１０Ａおよび１０Ｂ、「ＥＲＦ９１Ｉ」として列挙する）。ＥＲＦ９１－ＥＡＲドミナントサプレッサーを発現させても（過剰発現レベル：＋＋）、ＰＭＴ発現は低減しないように見え（図１０Ａ、「ＥＲＦ９１ＩＩ」として列挙した）、従って、ニコチン、ノルニコチン、およびアナタビンの目に見えて分かる低減は無い（図１０Ｂ、「ＥＲＦ９１ＩＩ」として列挙した）。
ＥＲＦ１０１とＥＲＦｎｅｗ両方の過剰発現も別々に試験する。ＥＲＦ１０１を過剰発現させるとＰＭＴおよびＱＰＴの発現が強化され、従って、ニコチンおよびアナタビンレベルが増加する（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＥＲＦｎｅｗを過剰発現させると同様にＰＭＴおよびＱＰＴの発現が強化され、従って、ニコチン、ノルニコチン、およびアナタビンレベルが増加する（図１２Ａおよび１２Ｂ、ＥＲＦｎｅｗをＥＲＦ１７ｄｅｌＮと表記した）。この観察はニコチン産生におけるＥＲＦｎｅｗの役割を裏付けており、図４で観察された人工マイクロＲＮＡベースの抑制データと一致する。
実施例１４： ＥＭＳによって生じたＮＩＣ１ｂ－ＥＲＦ突然変異植物の作製および評価
ＴＮ９０バーレイのバックグラウンドで以前に作製されたタバコ種子のＥＭＳ集団を、Ｎｉｃ１ｂ領域内にある遺伝子に突然変異があるかどうかスクリーニングする。ＥＭＳ集団は標準的な技法を用いて作り出した。サンガーシークエンシングを使用して、１試料当たり８つの植物からプールしたＤＮＡを分析することで、Ｍ２世代の関心対象の遺伝子にある点突然変異を同定することにより候補植物を同定する。例示的な突然変異を表２２にまとめた。Ｍ２世代の候補植物において上記の方法を用いて植物形態およびアルカロイドレベルを分析する。摘心の２週間後に植物から葉をサンプリングし、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンの量を乾燥重量に対するパーセントとして測定することによって候補植物のアルカロイドレベルを分析する。２０１８年および２０１９年の栽培シーズン（それぞれ、２０１９年および２０２０年にサンプリングした）を表す測定値を図１３～２０に示した。ＮＣＧ１およびＥＲＦ１６にある例示的な突然変異のサンプリング統計値を表２３に示した。表２３から、同じ時期に栽培した野生型ＴＮ９０と比較してアルカロイドレベルが統計的に有意に低減したことが証明される。ＮＣＧ１５にある２つ例示的な突然変異のサンプリング統計値を表２４に示した。表２４から、ＭＳ１３６５７株の突然変異によって、同じ時期に栽培した野生型ＴＮ９０と比較してアルカロイドレベルが有意に低減したことが証明される。望ましいアルカロイドレベルおよび野生型形態を示した候補植物の種子をさらなる育種のために選択する。
ＴＮ９０バーレイのバックグラウンドで以前に作製されたタバコ種子のＥＭＳ集団を、Ｎｉｃ１ｂ領域内にある遺伝子に突然変異があるかどうかスクリーニングする。ＥＭＳ集団は標準的な技法を用いて作り出した。サンガーシークエンシングを使用して、１試料当たり８つの植物からプールしたＤＮＡを分析することで、Ｍ２世代の関心対象の遺伝子にある点突然変異を同定することにより候補植物を同定する。例示的な突然変異を表２２にまとめた。Ｍ２世代の候補植物において上記の方法を用いて植物形態およびアルカロイドレベルを分析する。摘心の２週間後に植物から葉をサンプリングし、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンの量を乾燥重量に対するパーセントとして測定することによって候補植物のアルカロイドレベルを分析する。２０１８年および２０１９年の栽培シーズン（それぞれ、２０１９年および２０２０年にサンプリングした）を表す測定値を図１３～２０に示した。ＮＣＧ１およびＥＲＦ１６にある例示的な突然変異のサンプリング統計値を表２３に示した。表２３から、同じ時期に栽培した野生型ＴＮ９０と比較してアルカロイドレベルが統計的に有意に低減したことが証明される。ＮＣＧ１５にある２つ例示的な突然変異のサンプリング統計値を表２４に示した。表２４から、ＭＳ１３６５７株の突然変異によって、同じ時期に栽培した野生型ＴＮ９０と比較してアルカロイドレベルが有意に低減したことが証明される。望ましいアルカロイドレベルおよび野生型形態を示した候補植物の種子をさらなる育種のために選択する。
（表５）第７染色体上のＮｉｃ１ｂ領域またはその近傍に由来する追加の遺伝子。開始および停止ゲノム位置を参照ＴＮ９０ゲノムに基づいて提供する。配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）を各遺伝子のゲノムコードＤＮＡ配列（該当する場合はイントロンを含む）、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質または他のコードされるＲＮＡ配列について提供する。
（表６）正常アルカロイドタバコ株と低減アルカロイドタバコ株との間で発現差異を示す第７染色体からの転写因子。開始および停止ゲノム位置を参照ＴＮ９０ゲノムに基づいて提供する。配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）を各遺伝子のゲノムコードＤＮＡ配列（該当する場合はイントロンを含む）、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質または他のコードされるＲＮＡ配列について提供する。
（表７）ある一組のＴ０形質転換体から、人工マイクロＲＮＡを介して個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを抑制すると、ＨＩ ＢＵ２１背景（すなわち、ｔ－ＨＩ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ｎｉｃ２単一突然変異体）ではニコチンが低減することが証明される。人工マイクロＲＮＡのためにＭＩＲ６１４７骨格を使用する（「ａＭＩＲ６１４７」）。縦列「％変換」はニコチンからノルニコチンへの変換のパーセントを表す。複数のＴ０ ＧＵＳ対照形質転換体からの平均ニコチンレベルを使用して、個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ ａｍｉＲＮＡ Ｔ０形質転換体のそれぞれにおける相対ニコチンレベルを決定する。最初に鉢植えして１６週間後に植物を摘心し、アルカロイド分析のために葉試料を２週間後に収集する。
（表８）ＨＩ ＢＵ２１背景（すなわち、ｔ－ＨＩ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ｎｉｃ２単一突然変異体）において、個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを標的とする人工マイクロＲＮＡを用いて形質転換された別の一組のＴ０植物。最初に鉢植えして１５週間後に、この一組のＴ０植物を摘心し、アルカロイド分析のために葉試料を２週間後に収集する。表７の植物と比較して、これらの植物を１週間早く摘心する。これにより対照植物では一貫性が欠如することがあり（ニコチンレベルは１．５２％および２．７８％に及ぶ）、従って、ａｍｉＲＮＡ植物は一貫したニコチン低減を示さない。表７と同じ一組のａｍｉＲＮＡ構築物を使用する。縦列「％変換」はニコチンからノルニコチンへの変換のパーセントを表す。複数のＴ０ ＧＵＳ対照形質転換体からの平均ニコチンレベルを使用して、個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ ａｍｉＲＮＡ Ｔ０形質転換体のそれぞれにおける相対ニコチンレベルを決定する。
（表９）ｔ－ＮＬ Ｍａｄｏｌｅ（ＰｈＰｈ）ＳＲＣ背景（すなわち、タバコ疫病抵抗性と、ノルニコチンの低減のための３つのニコチンデメチラーゼ遺伝子の突然変異を有するナローリーフマドール）において、個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦを標的とする人工マイクロＲＮＡを用いて形質転換された一組のＴ０植物。最初に鉢植えして１８週間後に、この一組のＴ０植物を摘心し、アルカロイド分析のために葉試料を２週間後に収集する。表７の植物と比較して、これらの植物を２週間遅く摘心する。この一組の植物では一貫したニコチン低減は認められない。このことから、ニコチン調節における個々の各Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦの役割を評価するために、ｎｉｃ２単一突然変異体は、野生型背景（例えば、ｔ－ＮＬ Ｍａｄｏｌｅ（ＰｈＰｈ）ＳＲＣ）と比較して高感度化した背景を提供することが分かる。表７と同じ一組のａｍｉＲＮＡ構築物を使用する。縦列「％変換」はニコチンからノルニコチンへの変換のパーセントを表す。複数のＴ０ ＧＵＳ対照形質転換体からの平均ニコチンレベルを使用して、個々のＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ ａｍｉＲＮＡ Ｔ０形質転換体のそれぞれにおける相対ニコチンレベルを決定する。
（表１０）選択されたＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ人工マイクロＲＮＡ Ｔ０形質転換体における遺伝子発現。「％Ｅｘｐ」は、複数の対照Ｔ０形質転換体に基づく平均発現レベルと比べた発現レベルのパーセントを指す。ニコチン低減は、対象とするＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ標的の抑制と複数のニコチン生合成遺伝子（ＰＭＴ１ａ、ＢＢＬａ、Ａ６２２、ＯＤＣ、ＭＡＴＥ２、ＱＰＴ２＿２）の発現の低減と相関する。全ての形質転換体はｔ－ＨＩ Ｂｕｒｌｅｙ ２１の背景にある。ＮＤは、決定されなかったことを意味する。
（表１１）Ｎｉｃ１ｂ領域にあるか、またはその近くにある選択されたＥＲＦ遺伝子。各ＥＲＦ遺伝子のゲノム座標を第７染色体上の開始および停止として示す。ＥＲＦの命名法は、Ｒｕｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＴＯＢＦＡＣ：ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００８，９：５３に基づく。各Ｎｉｃ１ｂ＿ＥＲＦのＤＮＡ配列をＴｏｂＦａｃデータセットから入手し、タバコゲノムデータベースをプローブして注釈付き遺伝子モデル、転写物、および染色体座標の両方を同定するために使用する。配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）を、各遺伝子のゲノムコードＤＮＡ配列（該当する場合はイントロンを含む）、ｃＤＮＡ配列、およびポリペプチド配列について提供する。
（表１２）Ｎｉｃ２領域にあるか、またはその近くにある選択されたＥＲＦ遺伝子。各ＥＲＦ遺伝子のゲノム座標を第１９染色体上の開始および停止として示す。ＥＲＦの命名法は、Ｒｕｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＴＯＢＦＡＣ：ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００８，９：５３；Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０－４０９（２０１０）、およびＫａｊｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，，Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９－１０１１に基づく。各Ｎｉｃ２＿ＥＲＦのＤＮＡ配列をＴｏｂＦａｃデータセットまたはＮＣＢＩデータベースから入手し、タバコゲノムデータベースをプローブして注釈付き遺伝子モデル、転写物、および染色体座標の両方を同定するために使用する。配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）を各遺伝子のゲノムコードＤＮＡ配列（該当する場合はイントロンを含む）、ｃＤＮＡ配列、およびポリペプチド配列について提供する。
（表１３）ＬＡ ＢＵ２１におけるニコチンおよび総アルカロイドはＥＲＦ１６を過剰発現させると増加するが、ＥＲＦ１３０も、ＬＡ ＢＵ２１において欠失しているＬＡ関連領域（すなわち、注釈付き遺伝子を含有しない「Ｎｉｃ１ｂΔ」として参照されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；実施例２を参照されたい）も、ｇ３２０８１（ベータ－グルコシダーゼ１８様遺伝子）も過剰発現させても増加しない。対照構築物をａｇ－４５ＥＶとして列挙する。
（表１４）様々なＮｉｃ１ｂ＿ＥＲＦ遺伝子（ドミナントＥＡＲリプレッサードメインあり、またはなし）の毛状根発現と、下流遺伝子発現（ＰＭＴおよびＱＰＴ）ならびにアルカロイドレベルに及ぼすその影響の概要
（表１５）熱風乾燥タバコ品種
（表１６）バーレイタバコ品種
（表１７）メリーランドタバコ品種
（表１８）暗色火力乾燥タバコ品種
（表１９）オリエンタルタバコ品種
（表２０）シガータバコ品種
（表２１）他のタバコ品種
（表２２）ＮＩＣ１ｂ－ＥＲＦ遺伝子において同定された、ＥＭＳによって生じた突然変異
（表２３）ＮＩＣ１ｂ－ＥＲＦ遺伝子ＮＣＧ１およびＥＲＦ１６における選択された突然変異を対象にしたアルカロイドサンプリング統計値
（表２４）ＮＩＣ１ｂ－ＥＲＦ遺伝子ＮＣＧ１７における２つ選択された突然変異を対象にしたアルカロイドサンプリング統計値
Claims (20)
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド中に非自然突然変異を含む、改変タバコ植物またはその一部。
- 前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の改変タバコ植物またはその一部。
- 前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に対して１００％の同一性を有する、請求項１に記載の改変タバコ植物またはその一部。
- 少なくとも１つの前記改変タバコ植物が、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、請求項１に記載の改変タバコ植物またはその一部。
- 前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、請求項４に記載の改変タバコ植物またはその一部。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド中に非自然突然変異を含む、改変タバコ植物またはその一部。
- 前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する、請求項６に記載の改変タバコ植物またはその一部。
- 前記ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して１００％の同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する、請求項６に記載の改変タバコ植物またはその一部。
- 前記改変タバコ植物が、遺伝子改変または突然変異または組換え核酸構築物を有さない対照植物と比べて、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減したレベルの少なくとも１種類のアルカロイドを含む、請求項６に記載の改変タバコ植物またはその一部。
- より高いＵＳＤＡグレード指数値が、対照植物の同等の葉のＵＳＤＡグレード指数値より少なくとも５％高い、請求項６に記載の改変タバコ植物またはその一部。
- 前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、請求項９に記載のタバコ植物またはその一部。
- 請求項６に記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
- 請求項１２に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
- タバコ製品が、シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコ、再構成タバコ、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、スヌース、および鼻嗅ぎタバコ、または無煙タバコ製品からなる群より選択される、請求項１３に記載のタバコ製品。
- 以下の工程を含む、改変タバコ植物を産生する方法：
（ａ）少なくとも１つのタバコ細胞中で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、８３、８４、８７～８９、１８０、１８１、２０６、および２０７からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるまたは類似しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする内因性核酸配列において、非自然突然変異を誘導する工程；
（ｂ）工程（ａ）からの非自然突然変異を含む少なくとも１つのタバコ細胞を選択する工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）において選択された少なくとも１つのタバコ細胞から少なくとも１つの改変タバコ植物を再生させる工程であって、該少なくとも１つの改変タバコ植物が、該突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、工程。 - 前記少なくとも１つの改変タバコ植物が、前記突然変異を欠く対照タバコ植物と比較して低減した量の少なくとも１種類のアルカロイドを含む、請求項１５に記載の方法。
- 前記内因性核酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、１４、１７～１９、３８、４８、４９、５２～５４、１５３、１５４、１５８、１５９、２０２、２０３、２０４、および２０５からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％同一である、請求項１５に記載の方法。
- 前記少なくとも１種類のアルカロイドが、アナバシン、アナタビン、ニコチン、およびノルニコチンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
- （ｄ）工程（ｃ）において再生させた改変タバコ植物を生育させる工程
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。 - （ｅ）工程（ｄ）において生育させた改変タバコ植物を第２のタバコ植物と交雑する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）の交雑から少なくとも１つの種子を得る工程
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
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