JP2023525898A - 非経口タンパク質溶液における可視粒子の形成を防止するためのキレート剤の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、水性タンパク質製剤中の可視粒子の形成を防止するための方法、特に、ある特定のキレート剤の使用、ならびに前記方法で得られる組成物および医薬製品を提供する。TIFF2023525898000021.tif96161

Description

本発明は、可視粒子の形成に対して安定化された水性タンパク質組成物、特に非経口適用のための医薬抗体製剤の分野に関する。

発明の背景
貯蔵寿命中の可視粒子の形成は、非経口使用のためのバイオ医薬品に関連する主要な懸念の１つである。臨床結果の程度はまだ完全には不明であるが、粒子の存在は一般に患者に対する潜在的な安全性リスクと考えられており、したがって、非経口製品のリコール事象の最も一般的な理由の１つである（Ｄｏｅｓｓｅｇｇｅｒら、２０１２）。

生物医薬製剤における粒子形成の最も一般的な根本原因の１つは、ポリソルベート（ＰＳ）、例えばＰＳ２０の分解であり、これは、界面応力に対してタンパク質を保護するために製剤に一般的に添加されている。ポリソルベートは、脂肪酸とエトキシル化ソルビトールまたはイソソルビトールとの部分エステルの不均一な混合物として記載され得る（Ｈｅｗｉｔｔら、２００８；Ｌｉｐｐｏｌｄら、２０１７；Ｋｉｓｈｏｒｅら、２０１１ｂ）。

酸化によるポリソルベートの分解、および化学的または酵素的加水分解は周知であり、十分に研究されている。後者の機序は、目的のタンパク質と共精製され、ポリソルベート中のエステル結合の切断を触媒することができる、リソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）などの宿主細胞タンパク質によって、主に駆動されることが報告されている（Ｌａｂｒｅｎｚ、２０１４；Ｄｉｘｉｔら、２０１６）。

これらの酵素は、ポリソルベートのモノエステルまたは高次種に対して異なる特異性を有し、異なるＰＳ分解パターンをもたらすことが最近報告された（Ｇｒａｆら、２０２０；Ｈａｌｌら、２０１６）。ＰＳ２０の加水分解は、界面活性剤の機能性の喪失をもたらす（Ｋｉｓｈｏｒｅら、２０１１ａ）だけでなく、さらに、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、例えばラウリン酸またはミリスチン酸の放出をもたらし、これらは水溶液に難溶性であり、ＦＦＡ濃度が溶解限界を超えると可視粒子またはサブビジブル粒子を形成し得る。溶液中のＦＦＡの溶解度は、温度、ｐＨまたは残留するインタクトなポリソルベートの濃度を含む様々な異なる因子に依存する（Ｄｏｓｈｉら、２０１５）。微量レベルのＡｌ^３＋のような金属イオンは、加水分解性ＰＳ分解から生じるＦＦＡと相互作用し、最終的に水性製剤から析出し、可視粒子の核生成種として作用するＦＦＡ－金属錯体をもたらすことが以前に示されている（Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒら、２０２１）。

しかしながら、バイオ医薬品におけるＦＦＡ粒子形成の発生は予測できないことが多く、他の核生成因子が粒子形成に関与する可能性があるという仮定につながる。したがって、例えば抗体の水性調製物（または組成物）などの非経口水性タンパク質製剤における可視粒子の形成に対抗する溶液を提供する必要性が依然として存在する。

本発明は、この問題に対する解決策を提供する。より詳細には、本発明は、賦形剤（キレート剤）の添加によって溶解限界未満でのＦＦＡ粒子形成の軽減オプションを提供し、これは、多価カチオンを錯化し、ポリソルベート分解に起因する脂肪酸との相互作用を防止することができる。

ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡなどのキレート剤は、タンパク質またはポリソルベートの酸化的分解を防止するために生物医薬製剤に一般的に使用されてきた（Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、２０１９；Ｄｏｙｌｅ Ｄｒｂｏｈｌａｖら、２０１９；Ｋｒａｎｚら、２０１９；Ｄｏｓｈｉら、２０２１；Ｇｏｐａｌｒａｔｈｎａｍら、２０１８）。酸化は、ステンレス鋼製造装置に由来（Ｚｈｏｕら、２０１１）し得るか、または原料、例えばヒスチジンを通して導入（欧州医薬品品質理事会）され得る、遷移金属の存在によって促進される可能性がある。

一実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば緩衝剤、抗酸化剤を含む安定剤と一緒に、タンパク質を含み、かつ少なくとも１種類のキレート剤をさらに含む、安定な水性組成物を提供する。

一実施形態では、本発明は、水性タンパク質製剤における可視粒子の形成を防止するためのキレート剤の使用を提供する。

一実施形態では、本発明は、溶解度レベル未満の濃度の遊離脂肪酸を含む可視粒子の形成を防止するための水性タンパク質製剤におけるキレート剤の使用を提供する。

別の実施形態では、本発明は、容器またはバイアル中に、本明細書で定義される調製物、例えば水性抗体組成物を含む医薬剤形を提供する。

Ａｌ濃度の関数としてのラウリン酸塩粒子の経時的な流体力学的半径（ｒＨ）。 Ａｌ濃度の関数としてのラウリン酸塩粒子の経時的な（Ａ）ＤＬＳ強度および（Ｂ）シグモイドフィットの変曲点。 金属カチオンの種類および濃度の関数としてのラウリン酸塩粒子の経時的な（Ａ）流体力学的粒径および（Ｂ）散乱強度。 キレート剤対アルミニウム比の関数としての、（Ａ）ＥＤＴＡおよび（Ｂ）ＤＴＰＡ（Ｃ）ＧＬＤＡおよび（Ｄ）ＰＤＴＡの存在下でのラウリン酸塩粒子の経時的な流体力学的粒子半径。 キレート剤対アルミニウム比の関数としての、（Ａ）ＥＤＴＡおよび（Ｂ）ＤＴＰＡ（Ｃ）ＧＬＤＡおよび（Ｄ）ＰＤＴＡの存在下でのラウリン酸塩粒子の経時的な散乱強度。 ＤＴＰＡ対Ｆｅ比の関数としてのラウリン酸塩粒子の経時的な（Ａ）散乱強度および（Ｂ）流体力学的粒子半径。 ＤＴＰＡ対Ａｌ比の関数としてのラウリン酸塩粒子の経時的な（Ａ）散乱強度および（Ｂ）流体力学的粒子半径。

発明の詳細な説明
界面活性剤の分解、特にポリソルベート（ＰＳ２０および／またはＰＳ８０）の分解の結果としての遊離脂肪酸（ＦＦＡ）からなる可視粒子の形成は、例えば治療用抗体の非経口調製物などの非経口タンパク質製剤中の界面活性剤の選択肢が限られているため、バイオ医薬品産業において大きな課題である。ＦＦＡが析出して可視粒子を形成する可能性があり、これは次に非経口医薬品の品質に影響を及ぼし得るので、様々な手段によってポリソルベート分解、そしてＦＦＡの放出を低減またはさらには排除することが重要である。

市販のポリソルベート（ＰＳ２０および８０）は、主にソルビタンＰＯＥ脂肪酸エステルを含む化学的に多様な混合物である。ＰＳ８０の主な種は、ソルビタンのヘッドグループから延びる４本のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）鎖を有するソルビタンのヘッドグループを含む。理論的には、各ヘッドグループに結合したＰＯＥユニットは合計２０個あるが、実際には多かったり少なかったりして存在する場合がある。典型的には、ＰＯＥユニットの数にはガウス様分布があり、不均一な混合物になる。ソルビタンのヘッドグループに結合した４つのＰＯＥ基のうち、それらの１～３つは、それらの末端（第一級アルコールで終結することができる）で脂肪酸（ＦＡ）にエステル化される。ＰＳ８０に見られるＦＡは、１４～１８個の炭素長であり、鎖に沿って最大３つの二重結合を有し得る。最も豊富なＦＡはオレイン酸（≧５８％、１８個の炭素、１つの二重結合）であり、リノール酸（１８％、１８個の炭素、２つの二重結合）が続く。個々のソルビタンのヘッドグループ上のＦＡ置換の数は、０～４つの範囲であり得る。ＰＳ８０はまた、０～２つのＦＡ置換を有するイソソルビドのヘッドグループを有する。ヘッドグループに結合していないＰＯＥ－ＦＡもかなりの量存在する。これらの構成要素はすべて、製造業者間で広範囲に変動する可能性がある多様に不均一な混合物をもたらす。（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９（２０２０）６３３－６３９）。例えばＰＳ２０中に存在する他の脂肪酸には、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸が含まれる。

ＰＳ２０および８０は、様々なグレードで入手可能である。本発明に従って、以下のグレードを試験した：
－高純度（ＨＰ）ＰＳ２０
－超精製（ＳＲ）ＰＳ２０
－高純度（ＨＰ）ＰＳ８０
－超精製（ＳＲ）ＰＳ８０
－純粋オレイン酸（ＰＯＡ）ＰＳ８０

すべてのグレードは、英国Ｓｎａｉｔｈに本社を置く特殊化学薬品会社Ｃｒｏｄａ（本明細書では「Ｃｒｏｄａ」）から購入した。ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ８０の合成プロセスと比較して、ＳＲグレードは、ＰＳ原料からアルデヒドおよび過酸化物などのさらなる極性および酸化不純物を除去することができる独自のフラッシュクロマトグラフィープロセスによってさらに精製される（Ｄｏｓｈｉら、２０２０ａ）。純粋オレイン酸のグレードは、最近、中国薬局方（ＣｈＰ）委員会によって導入され、注射可能な製品についてオレイン酸エステルの含有量が≧９８．０％であることが規定された。この高オレイン酸グレードはもはや非経口製品の使用に必須ではないが、ＨＰ／ＳＲ ＰＳ２０およびＨＰ／ＳＲ ＰＳ８０と比較して、加水分解時にサブビジブルおよび可視粒子を形成する傾向が低いため（Ｄｏｓｈｉら、２０２１）、最近より高い評判（ｐｏｌｕｌａｒｉｔｙ）を集めている。

（表１ａ）ＰＳ２０およびＰＳ８０に対する米国／欧州／中国（Ｃｈ）薬局方の仕様

本発明に従って、可視粒子の形成のための核生成因子としての多価カチオンの役割を調査し、遊離脂肪酸溶液および異なる酵素で酵素的に加水分解された部分的に分解されたポリソルベートを用いたスパイク研究にて実証した。金属不純物、すなわちアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛は、製造プロセス（プロセス浸出物）（Ｚｈｏｕら、２０１１）または一次包装容器（ガラス浸出物）（Ｄｉｔｔｅｒら、２０１８）を通して生物医薬製剤に導入される可能性がある。これらの金属不純物のいくつか、例えば鉄は、ポリソルベートの酸化的分解を促進することが公知である（Ｋｒａｎｚら、２０１９；Ｄｏｙｌｅ Ｄｒｂｏｈｌａｖら、２０１９）。

したがって、一実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば緩衝剤、抗酸化剤を含む安定剤と一緒に、タンパク質を含み、かつ少なくとも１種類のキレート剤をさらに含む、安定な水性組成物を提供する。一実施形態では、前記安定な水性組成物（または調製物）は、非経口使用のためのものである。

別の実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば緩衝剤、抗酸化剤を含む安定剤と一緒に、タンパク質を含み、かつ遊離脂肪酸、無機金属イオン、および少なくとも１種類のキレート剤をさらに含む、安定な水性組成物を提供する。一実施形態では、前記安定な水性組成物（または調製物）は、非経口使用のためのものである。別の実施形態では、遊離脂肪酸は、本明細書で定義されるとおりである。さらに別の実施形態では、前記遊離脂肪酸は、ＰＳ２０またはＰＳ８０の加水分解に起因する。さらに別の実施形態では、前記遊離脂肪酸は、前記安定な水性組成物中にそれらの溶解濃度未満の濃度で存在し、キレート剤の濃度は、無機金属イオンの濃度と少なくとも同じ（すなわち、等モル）である。この実施形態では、無機金属イオンは、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄および／または亜鉛の多価イオン、好ましくはアルミニウムまたは鉄から選択される１種類または数種類のイオンであり得る。

一実施形態では、前記「キレート剤」は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡまたはペンテト酸）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ’－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ’－エチレンジグリシン（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ジヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、１，３－ジアミノプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＰＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－グルタミン酸四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、シトレート、マロネート、タルトレート、アスコルベート、サリチル酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸の群から選択される。別の実施形態では、前記キレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。別の実施形態では、前記キレート剤はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡまたはペンテト酸）である。さらに別の実施形態では、ただ１種類のキレート剤が使用される。

一実施形態では、前記キレート剤は、０．０００５～２．０％（ｗ／ｖ）、または０．００１～０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。別の実施形態では、キレート剤がＥＤＴＡである場合、それは０．００５％（ｗ／ｖ）の相対量で存在する。別の実施形態では、キレート剤がＤＴＰＡである場合、それは０．０５ｍＭの量で存在する。さらに別の実施形態では、キレート剤は、本発明による組成物中の金属不純物または無機金属イオンと少なくとも同じ（すなわち、等モル）量で存在する。

別の実施形態では、前記組成物のｐＨが５～７の範囲である、上記で定義される組成物が提供される。一態様では、ｐＨは約５．５または約６である。

別の実施形態では、本発明は、タンパク質が抗体である、本明細書で前に定義される組成物を提供する。一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様では、抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル、単一または二重特異性抗体である。

さらに別の実施形態では、本発明に従う抗体は、ＩＮＮペルツズマブを伴う抗体である。ペルツズマブは、例えば、商標名ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）で市販されている。ペルツズマブは、例えば、ＥＰ２２３８１７２Ｂ１にも開示されている。したがって、別の実施形態では、「ペルツズマブ（または「ｒｈｕＭａｂ ２Ｃ４」）は、ＥＰ２２３８１７２Ｂ１に開示されているように、それぞれ配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。ペルツズマブがインタクトな抗体である場合、ペルツズマブは、ＥＰ２２３８１７２Ｂ１に開示されているように、それぞれ配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む。

別の実施形態では、本発明は、以下の構成要素からなる、本明細書で前に定義される組成物を提供する：製剤Ａ：１０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ５．０、１０ｍＭメチオニン、２４０ｍＭスクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０中１０ｍｇ／ｍＬ ＡＰＩ；製剤Ｂ：２０ｍＭ Ｈｉｓ、ｐＨ６、２４０ｍＭトレハロース、０．０２％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０中２５ｍｇ／ｍＬ ＡＰＩ；製剤Ｃ：２０ｍＭ Ｌ－Ｈｉｓ／Ｈｉｓアセテート緩衝液ｐＨ５．５、２２０ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｌ－メチオニン、０．０４％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０中５０ｍｇ／ｍＬ ＡＰＩ；製剤Ｄ：２０ｍＭ Ｌ－Ｈｉｓ／Ｈｉｓアセテート緩衝液ｐＨ５．５、１３０ｍＭアルギニン塩酸塩、１０ｍＭ Ｌ－メチオニン、０．０４％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０中１８０ｍｇ／ｍＬ ＡＰＩ；製剤Ｅ：２０ｍＭ Ｈｉｓ／Ａｓｐ ｐＨ６．０、１５０ｍＭアルギニン、４０ｍＭ Ｍｅｔ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０中１７５ｍｇ／ｍＬ ＡＰＩ。本明細書で使用される「ＡＰＩ」という用語は、活性医薬成分を意味し、医薬調製物の当業者に周知である。一実施形態では、ＡＰＩは、本明細書で定義される、タンパク質または抗体である。

別の実施形態では、本発明は、実施例５（表７）で指定される製剤０１、０２、０３、０４または０５と命名された組成物のいずれかを提供する。

別の実施形態では、本発明は、２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液（ｐＨ６．０）、１２０ｍＭスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬ ＨＰ ＰＳ２０、１０ｍＭメチオニンおよび０．０５ｍＭ ＤＴＰＡ中３０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ６．０、１２０ｍＭスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬ ＨＰ ＰＳ２０、１０ｍＭメチオニンおよび０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ中３０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ６．０、１２０ｍＭスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬ純粋オレイン酸（ＰＯＡ）ＰＳ８０、１０ｍＭメチオニンおよび０．０５ｍＭ ＤＴＰＡ中３０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ６．０、１２０ｍＭスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬ純粋オレイン酸（ＰＯＡ）ＰＳ８０、１０ｍＭメチオニンおよび０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ中３０ｍｇ／ｍＬのペルツズマブを含む組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、医薬の製造、特に、安定な非経口タンパク質調製物、より具体的には非経口抗体調製物の製造のための、本明細書で定義されるキレート剤の使用を提供する。一実施形態では、非経口調製物は水性調製物である。別の実施形態では、非経口調製物は皮下（ｓｃ）適用のためのものである。別の実施形態では、非経口調製物は静脈内（ｉｖ）適用のためのものである。

別の実施形態では、本発明は、非経口タンパク質調製物、特に抗体調製物における可視粒子の形成を防止するための、本明細書で定義されるキレート剤の使用を提供する。一態様では、非経口調製物は水性調製物である。別の態様では、非経口調製物は皮下（ｓｃ）適用のためのものである。別の態様では、非経口調製物は静脈内（ｉｖ）適用のためのものである。別の態様では、本発明は、非経口タンパク質調製物において、溶解度レベル未満の濃度の遊離脂肪酸を含む可視粒子の形成を防止するための、本明細書で定義されるキレート剤の使用を提供する。

「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、その通常の意味を有する。一態様では、非経口は、皮下（ｓｃ）注射および／または静脈内注射用を意味する。

本非経口タンパク質調製物は、本明細書で定義されるキレート剤の存在により「安定」である。「安定」という用語は、前記調製物が、その認可された貯蔵寿命の終わりまで、可視粒子を含まないままか；または本質的に含まないままか；または実質的に含まないままであることを意味する。一態様では、本調製物は３０ヶ月間まで；または２４ヶ月間まで；または１８ヶ月間まで；または１２ヶ月間まで安定である。非経口タンパク質調製物の安定性は、例えば、光（ＵＶ照射）、温度および／または振盪などの当業者に周知のパラメータによって影響され得る。したがって、一態様では、「安定」という用語は、例えば欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって発行された製品特性の概要（ＳｍＰＣ）またはその所与の製品の添付文書に記載されているように、本非経口タンパク質調製物または抗体調製物を含む製品の貯蔵に通常推奨される条件を含む。一実施形態では、「安定」という用語は、２℃～８℃の間の温度で３０ヶ月の期間を含み、実質的に光から保護される。

可視粒子の存在は、一般に、欧州薬局方または米国薬局方に記載されている方法を使用して検出することができる（Ｐｈ．Ｅｕｒ１０．０；第２．９．２０章；およびＵＳＰ ３７－ＮＦ ３２＜７９０＞の第１追補を参照）。本発明の一実施形態では、可視粒子を「含まない」という用語は、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｖ９０－Ｔ装置（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｋｔ Ｓｃｈｗａｂｅｎ、ＤＥ）を利用し、添付の作業実施例に記載される方法を使用して、非経口タンパク質調製物中に可視粒子を検出できないことを意味する。可視粒子を「本質的に含まない」という用語は、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｖ９０－Ｔ装置（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｋｔ Ｓｃｈｗａｂｅｎ、ＤＥ）を利用し、添付の作業実施例に記載される方法および条件を使用して、１～５個の可視粒子を非経口タンパク質調製物中に検出できることを意味する。可視粒子を「実質的に含まない」という用語は、欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ １０．０；第２．９．２０章を参照）に記載される黒および白パネル（本明細書では「Ｅ／Ｐボックス」または「Ｅ／Ｐ」）を使用して、０～４個の可視粒子を検出できることを意味する。

「可視粒子」という用語は、１種類もしくは数種類の遊離脂肪酸、または凝集したタンパク質と遊離脂肪酸の混合物を含む粒子を意味する。一態様では、可視粒子は、少なくとも８０μｍまたは少なくとも１００μｍの粒径を有し、例えば、非経口タンパク質調製物中の濁度または析出物として見ることができる。一実施形態では、可視粒子は、少なくとも１種類の多価カチオンと、非経口タンパク質調製物中に存在する界面活性剤（例えばＰＳ２０およびＰＳ８０など）から切断された遊離脂肪酸とによって形成する。「多価カチオン」という用語は、本明細書で使用される場合、製造プロセスまたは一次包装容器を通して非経口タンパク質調製物に導入される１種類または数種類の金属不純物を意味する。一実施形態では、そのような多価カチオンは、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛から選択されるカチオンである。「脂肪酸」という用語は、本明細書で使用される場合、有機化学の当業者に公知のその通常の意味を有する。一実施形態では、脂肪酸という用語は、ＰＳ２０またはＰＳ８０中に存在する、またはＰＳ２０またはＰＳ８０から切断された任意の脂肪酸（複数可）を意味する。別の実施形態では、「脂肪酸」という用語は、ラウリン酸、またはミリスチン酸、またはパルミチン酸、またはステアリン酸、またはオレイン酸を意味する。本発明に従って、前記脂肪酸は、その溶解濃度（または「溶解度レベル」）未満の濃度で水性タンパク質調製物中に存在し得、核生成因子として本明細書で定義される多価カチオンと一緒に可視粒子を形成することができる。本明細書で定義される脂肪酸の溶解濃度は当業者に周知であり、例えば（Ｄｏｓｈｉら、２０１５；Ｄｏｓｈｉら、２０２０ｂ；Ｇｌｕｃｋｌｉｃｈら、２０２０）に見出すことができる。一実施形態では、「その溶解濃度未満」という用語は、０℃と３０℃との間の任意の温度での、本明細書で定義される脂肪酸の水溶液または緩衝液中の溶解濃度未満を意味する。別の実施形態では、「その溶解濃度未満」という用語は、２～８℃の温度での、本明細書で定義される脂肪酸の水溶液または緩衝液中の溶解濃度未満を意味する。さらに別の実施形態では、「その溶解濃度未満」という用語は、約５℃の温度での、本明細書で定義される脂肪酸の水溶液または緩衝液中の溶解濃度未満を意味する。

したがって、さらに別の実施形態では、本発明は、医薬の製造のための、特に、水性非経口タンパク質調製物、より具体的には非経口抗体調製物の製造のための、本明細書で定義されるキレート剤の使用を提供し、認可された貯蔵寿命の全期間にわたって、しかし少なくとも３０ヶ月まで、または２４ヶ月まで；または１８ヶ月まで；または１２ヶ月間までの間、およびそのような調製物の貯蔵に推奨される条件下で、ＰＳ２０またはＰＳ８０の分解に起因する遊離脂肪酸、および任意に、１種類または数種類の多価カチオンを含む可視粒子を含まないか、または実質的に含まないか、または本質的に含まないことを特徴とする。

別の実施形態では、本発明は、例えば、バイアルまたはシリンジなどの容器中に、本明細書で定義されるタンパク質調製物、例えば、水性抗体調製物を含む医薬剤形を提供する。

別の実施形態では、本発明は、例えばバイアルまたはシリンジなどの容器中に、本明細書で定義されるキレート剤の使用から得られるタンパク質調製物を含む医薬剤形を提供する。

「賦形剤」という用語は、対象に対して非毒性である、医薬組成物または調製物中の活性成分以外の成分を指す。賦形剤には、緩衝剤、抗酸化剤を含む安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。

「緩衝剤」という用語は、例えば医薬調製物の開発などの有機化学または薬学の当業者に周知である。本明細書で使用される緩衝剤は、アセテート、スクシネート、シトレート、アルギニン、ヒスチジン、ホスフェート、トリス、グリシン、アスパルテート、およびグルタメート緩衝系を意味する。さらに、この実施形態においては、前記緩衝剤のヒスチジン濃度は５～５０ｍＭである。好ましい緩衝剤は、遊離ヒスチジン塩基およびヒスチジン－ＨＣｌまたはアセテートまたはスクシネートおよび／またはアスペルテートである。さらに、この実施形態においては、前記緩衝剤のヒスチジン濃度は５～５０ｍＭである。

「安定剤」という用語は、例えば医薬調製物の開発などの有機化学または薬学の当業者に周知である。本発明に従う安定剤は、糖、糖アルコール、糖誘導体、またはアミノ酸からなる群から選択される。一態様では、安定剤は、（１）スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、ソルビトール、マンニトール、グリシン、または／および（２）メチオニン、および／または（３）アルギニン、もしくはリジンである。さらに別の態様では、前記安定剤の濃度は、それぞれ（１）最大５００ｍＭ、または（２）５～２５ｍＭ、または／および（３）最大３５０ｍＭである。

本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、任意の治療上重要なポリペプチドを意味する。一実施形態では、タンパク質という用語は抗体を意味する。別の実施形態では、タンパク質という用語はイムノコンジュゲートを意味する。

本明細書での「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体クラスまたは構造を包含する。一実施形態では、これらの抗体のいずれかは、ヒトまたはヒト化されている。一態様では、抗体は、アレムツズマブ（ＬＥＭＴＲＡＤＡ（登録商標））、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ／ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）、２Ｃ４）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））、バビツキシマブ、ベリムマブ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標））、ブリアキヌマブ（ｂｒｉａｎｋｉｎｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ＩＬＡＲＩＳ（登録商標））、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、シドフシツズマブ、シドツズマブ、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレネズマブ、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））、ダロツズマブ、デノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標）、ＸＧＥＶＡ（登録商標））、エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、エミシズマブ（ＨＥＭＬＩＢＲＡ（登録商標））、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））、イピリムマブ、イムガツズマブ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルリズマブペゴル、ルムレツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モガムリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ムロノマブ、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））、ネシツムマブ（ＰＯＲＴＲＡＺＺＡ（登録商標））、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ（登録商標））、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オロキズマブ、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、オナルツズマブ（ＭｅｔＭＡｂとしても公知）、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、ペキセリズマブ、プリリキシマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロバツムマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、セリバンツマブ、シファリムマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、シプリズマブ、ソンツズマブ、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））、トラリズマブ、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標））、ベドリズマブ（ＥＮＴＹＶＩＯ（登録商標））、ビシリズマブ、ザノリムマブ、ザルツムマブから選択される。

「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説については、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。

抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。ある特定の態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。ある特定の態様では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の態様では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプのものである。ある特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を向上するために、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのものである。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、ａ、ｄ、ｅ、ｇ、およびｍと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられ得る。

「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト起源由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ＣＤＲのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列において超可変性であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを指す。一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨ中にあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬ中にある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；ならびに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。

特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記がまた、上記のＣｈｏｔｈｉａ、上記のＭｃＣａｌｌｕｍ、または任意の他の科学的に許容され得る命名システムに従い決定され得ることを理解するであろう。

「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性薬剤を含むがこれに限定されない、１種または複数種の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。

「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様では、個体または対象は、ヒトである。

「単離された」抗体とは、その自然環境の構成要素から分離されているものである。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）法によって決定される場合、純度が９５％または９９％より高くなるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。

「医薬組成物」または「医薬調製物」という用語は、それに含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態をしており、かつ、医薬組成物が投与されるであろう対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない調製物を指す。

「薬学的に許容され得る担体」とは、対象に対して非毒性である、医薬組成物または調製物中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、本明細書で定義される賦形剤が含まれるが、これに限定されない。

Ａ．キメラおよびヒト化抗体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

ある特定の態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するようにヒト化される一方、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持する。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその一部分）が非ヒト抗体に由来する１つまたは複数の可変ドメインを含み、ＦＲ（またはその一部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含み得る。いくつかの態様では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。

ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、 Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトを記載）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングの「ガイドセレクション」アプローチを記載）にさらに記載されている。

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、以下が含まれるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；およびＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）。

Ｂ．ヒト抗体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋおよびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）ならびにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。

ヒト抗体は、免疫原を、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって調製されてもよい。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物によって生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変されてもよい。

ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１－６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７－９３７（２００５）ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。

ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージ・ディスプレイ・ライブラリから選択される可変ドメイン配列を単離することによって生成することができる。次いで、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する技法は以下に記載されている。

Ｃ．抗体誘導体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに改変されてもよい。抗体の誘導体化に適した部位には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）、ポリプロピレンオキシド（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であり得、複数のポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であり得るか、または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または種類は、限定されるものではないが、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義される条件下で治療に使用されるかどうかなどを含む考慮事項に基づいて決定することができる。

Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素；細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体などの１種または複数種の治療剤にコンジュゲート（化学的に結合）された本明細書の抗体を含む、イムノコンジュゲートを提供する。

一態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、前述の治療剤の１種または複数種にコンジュゲートされている、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、治療剤の１種または複数種に接続される。治療剤および薬物およびリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概観は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。

別の態様では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンシンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含むがこれらに限定されない、酵素活性毒素またはその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。

別の態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされ、放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。放射性コンジュゲートの生産には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。検出のために使用される場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、あるいは核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても公知）のためのスピン標識（ここでもヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄など）を含み得る。

抗体と細胞傷害性薬剤とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる：例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート化剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内において細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用されてもよい。

本明細書におけるイムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、限定されないが、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、ＵＳＡから）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋リンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明確に意図している。

Ｅ．多重特異性抗体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」とは、少なくとも２つの異なる部位、すなわち異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。

多重特異性抗体を作製するための技法には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照）および「ノブ－イン－ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号およびＡｔｗｅｌｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照）が含まれる。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロダイマー分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照）；２つ以上の抗体または断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）を参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）および国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）；および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）を参照）；および例えばＴｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製することができる。

例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、またはＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号および国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、および国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。二重特異性抗体またはその抗原結合断片はまた、２つの異なる抗原または同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号および国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。

多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つまたは複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称形態で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号および国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）または完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒら、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１８７－１１９１、およびＫｌｅｉｎら、ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）を交換することによってももたらされ得る。一態様では、多重特異性抗体はクロス－Ｆａｂ断片を含む。「クロスＦａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域１（ＣＨ１）で構成されるポリペプチド鎖、ならびに重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電または非荷電アミノ酸変異をドメイン界面に導入して正しいＦａｂペアリングを指向することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照されたい。

多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照）。

Ｆ．組換え方法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法および組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つまたは複数の単離された核酸が提供される。

２つの核酸が必要とされるネイティブ抗体またはネイティブ抗体断片の場合、１つは軽鎖またはその断片のため、および１つは重鎖またはその断片のためのものである。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖（複数可））をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上、または異なる発現ベクター上にあり得る。

４つの核酸が必要とされるヘテロダイマーの重鎖を有する二重特異性抗体の場合、１つは第１の軽鎖のため、１つは第１のヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第１の重鎖のため、１つは第２の軽鎖のため、および１つは第２のヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第２の重鎖のためのものである。４つの核酸は、１つまたは複数の核酸分子または発現ベクターに含まれ得る。そのような核酸は、抗体の、第１のＶＬを含むアミノ酸配列および／または第１のヘテロモノマーＦｃ領域を含む第１のＶＨを含むアミノ酸配列および／または第２のＶＬを含むアミノ酸配列および／または第２のヘテロモノマーＦｃ領域を含む第２のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の第１および／もしくは第２の軽鎖ならびに／または第１および／もしくは第２の重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上、または異なる発現ベクター上にあり得、通常、これらの核酸は、２つまたは３つの発現ベクター上に位置しており、すなわち、１つのベクターは、これらの核酸のうち２つ以上を含むことができる。これらの二重特異性抗体の例は、クロス（Ｃｒｏｓｓ）Ｍａｂである（例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１を参照）。例えば、ＥＵインデックス付番に従い、ヘテロモノマー重鎖の一方は、いわゆる「ノブ変異」（Ｔ３６６Ｗと、任意に、Ｓ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのうち１つ）を含み、他方は、いわゆる「ホール変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖと、任意に、Ｙ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照）。

抗体の組換え産生に関しては、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞内での発現のために、例えば、上記の抗体をコードする核酸が単離され、１つまたは複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、容易に単離することができ、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定されるか、または組換え方法によって産生されるか、または化学合成によって得られ得る。

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされていない場合には、細菌中で産生されてもよい。細菌中の抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、および米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい。（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現を記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００３）、２４５－２５４頁も参照されたい）発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製され得る。

原核生物に加えて、糸状菌や酵母などの真核生物は、抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現宿主として適しており、その中には、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌および酵母株が含まれ、部分的または完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９－１４１４；およびＬｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０－２１５を参照されたい。

また、（グリコシル化）抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。

植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号および米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい。

脊椎動物細胞も、宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４に記載されているような、２９３または２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２に記載されているようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載されるような）；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）；ならびに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が含まれる。抗体産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．およびＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）、２５５－２６８頁を参照されたい。

ここで、本発明を、以下の非限定的な作業実施例によってさらに説明する。

材料および方法
緩衝水溶液中の遊離脂肪酸の溶解度
遊離脂肪酸ストック溶液は、わずかな修正を加えてＤｏｓｈｉら（Ｄｏｓｈｉら、２０１５）によって以前に記載されたように調製した。簡単に記載すると、ラウリン酸（「ＬＡ」、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＤＥ）およびミリスチン酸（「ＭＡ」、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ／Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＤＥ）をＰＳ２０ ＨＰ（Ｃｒｏｄａ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）に懸濁し、両方のＦＦＡが完全に溶解するまで６０℃で３０分間撹拌（１５０ｒｐｍ）した。溶液を予熱した（６０℃）注射用水（ＷＦＩ）で１：５に希釈し、直ちに０．２２μｍのＰＶＤＦ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルタ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＤＥ）に通してフィルタにかけた。Ｈｏｎｅｍａｎｎら（Ｈｏｎｅｍａｎｎら、２０１９）によって記載されているように、ＦＦＡストック溶液中のＬＡおよびＭＡの濃度をＬＣ－ＭＳによって検証した。

ＬＡ／ＭＡ／ＰＳ２０ストック溶液を２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５にスパイク（１：５００希釈、ｎ＝３）し、ＭａｘＱ（商標）４０００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で２５℃にて１時間ホモジナイズした。試料を５℃で貯蔵し、０、１、７および２８日後に、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．９．２０（欧州医薬品品質理事会）に準拠した黒／白パネル、およびＳｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｖ９０－Ｔ装置（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｋｔ Ｓｃｈｗａｂｅｎ、ＤＥ）を使用して可視粒子について分析した。すべての試料を周囲温度に平衡化（１時間）した後、視覚検査した。容器あたりの可視粒子の数は、Ｅ／Ｐボックスでは、「多数の粒子（＞７）」、「少数の粒子（５～７）」、または「実質的に粒子を含まない（０～４）」として定義し、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒによって、「多数の粒子（＞１０）」、「少数の粒子（６～１０）」、「本質的に粒子を含まない（１～５）」、または「粒子を含まない（０）」として定義した。

ＦＦＡストック溶液および試料の組成を、表１に概説する。

（表１）ＬＡ／ＭＡ／ＰＳ２０ストック溶液および試料の組成

遊離脂肪酸およびアルミニウムを用いたスパイク研究
２０ｍＭヒスチジンアセテートｐＨ５．５中の塩化アルミニウム六水和物から、１００ｐｐｍのアルミニウムストック溶液を調製した。アルミニウムの実際の濃度は、誘導－結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によって決定した。次いで、このストック溶液を１０ｐｐｍのＡｌ^３＋に希釈し、０．２２μｍの多孔性フィルタカートリッジ（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ－ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して－滅菌濾過した。さらなる希釈物（１０～２５０ｐｐｂ Ａｌ^３＋）を層状空気流下で無菌的に調製し、２０ｍＬのＩ型ホウケイ酸ガラスバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ、Ｍａｉｎｚ、ＤＥ）に分注した。

異なる量のアルミニウム（０～２５０ｐｐｂ）を含む試料に、異なるＦＦＡストック溶液（ＬＡＭＡ－２、ＬＡＭＡ－６、ＬＡＭＡ－７、ＬＡＭＡ－８およびＬＡＭＡ－１０）でスパイクした。２５０ｐｐｂのアルミニウムを含む試料に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）でさらにスパイクして、０．００５％（ｗ／ｖ）の標的濃度を得た。すべてのバイアルを２０ｍｍテフロン加工の注射ストッパー（Ｄ７７７－１、Ｄａｉｋｙｏ）およびアルミニウムクリンプキャップで密封し、ＭａｘＱ（商標）４０００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で２５℃にて１時間ホモジナイズした。

ＬＡＭＡ－６、ＬＡＭＡ－７およびＬＡＭＡ－８でスパイクした希釈物は、それらの溶解限界未満のＬＡおよびＭＡ濃度をもたらしたが、ＬＡＭＡ－２でのスパイクは、溶解限界を超えるＦＦＡ濃度をもたらし、陽性対照として用いた。ＬＡＭＡ－１０はポリソルベート２０のみを含み、陰性対照の調製に使用した。すべての試料を三連で調製した。

試料を５℃で貯蔵し、可視粒子の形成を、上記のように黒／白およびＳｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｖ９０－Ｔ装置（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｋｔ Ｓｃｈｗａｂｅｎ、ＤＥ）を使用して２８日間まで評価した。

部分的に分解されたＰＳ２０の溶解度
ＰＳ２０を、モノエステルおよび高次エステルに対して異なる特異性を有する固定化した酵素（Ｇｒａｆら、２０２０）（ムコール・ミエヘイ（ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（ＭＭＬ）およびカンジダ・アンタークティカ（ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（ＣＡＬ））で酵素的に加水分解した。６つの異なる分解レベル（１０％、１５％、２０％、３０％、４０％および６０％の分解）を有するポリソルベートのセットを各酵素に対して調製した（表２）。

ＰＳ２０ストック溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５にスパイク（１：１２５希釈、ｎ＝３）し、ＭａｘＱ（商標）４０００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で２５℃にて１時間ホモジナイズした。試料を５℃で貯蔵し、０、１、７および２８日後に、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．９．２０（欧州医薬品品質理事会）に準拠した黒／白パネルを使用して可視粒子について分析した。すべての試料を周囲温度に平衡化（１時間）した後、視覚検査した。容器あたりの可視粒子の数は、「多数の粒子（＞７）」、「少数の粒子（５～７）」、または「実質的に粒子を含まない（０～４）」として定義した。

（表２）酵素的に分解されたポリソルベート

部分的に分解されたポリソルベート２０およびアルミニウムを用いたスパイク研究
２０ｍＭヒスチジンアセテートｐＨ５．５に含む、希釈されたアルミニウム溶液を上記のように調製し、２０ｍＬのＩ型ホウケイ酸ガラスバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ、Ｍａｉｎｚ、ＤＥ）に充填した。異なる量のアルミニウム（０～２５０ｐｐｂ）を含む試料に、異なるＰＳ２０ストック溶液（ＰＳ２０－Ｓｔｄ、ＭＭＬ－１０、ＭＭＬ－１５、ＭＭＬ－４０、ＣＡＬ－１０、ＣＡＬ－１５）でスパイクした。さらに、２５０ｐｐｂのアルミニウムを含む試料に、０．００５％（ｗ／ｖ）のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）または０．０５ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を補充した後に、部分的に分解されたＰＳ２０でスパイクした。バイアルを２０ｍｍテフロン加工の注射ストッパー（Ｄ７７７－１、Ｄａｉｋｙｏ）およびアルミニウムクリンプキャップで密封し、ＭａｘＱ（商標）４０００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で２５℃にて１時間ホモジナイズした。

ＭＭＬ－１０／－１５およびＣＡＬ－１０／－１５を用いて調製された試料は、それらの溶解限界未満のＦＦＡ濃度をもたらしたが、ＭＭＬ－４０（陽性対照）でのスパイクは、溶解限界を超えるＦＦＡ濃度をもたらした。ＰＳ２０－Ｓｔｄは、未分解ポリソルベート２０のみを含み、陰性対照の調製に使用した。すべての試料を三連で調製した。

試料を５℃で貯蔵し、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．９．２０に準拠した黒／白パネルを使用した視覚検査によって２８日間まで粒子形成を評価した（欧州医薬品品質理事会）。

実施例１：ヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５中の遊離脂肪酸の溶解度
ラウリン酸（ＬＡ）およびミリスチン酸（ＭＡ）の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）ストック溶液を、２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５にスパイクした（ｎ＝３）。試料を、２～８℃で０、１日間、７日間および２８日間インキュベーションした後、（Ａ）Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒおよび（Ｂ）Ｅ／Ｐボックスを使用して可視粒子の存在について分析した。容器あたりの粒子の数は、Ｅ／Ｐボックスでは、「多数の粒子（＞７、ｘｘｘ）」、「少数の粒子（５～７、ｘｘ）」、または「実質的に粒子を含まない（０～４、／）」、およびＳｅｉｄｅｎａｄｅｒによって、「多数の粒子（＞１０、ｘｘｘ）」、「少数の粒子（６～１０、ｘｘ）」、「本質的に粒子を含まない（１～５、ｘ）」、または「粒子を含まない（０、／）」として分類した。ｄ＝検査の日、ｄ０＝スパイク後。結果を表３に要約する。

（表３）ヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５中の遊離脂肪酸の溶解度

実施例２：可視粒子の形成
０～２５０ｐｐｂの範囲の異なる量のアルミニウムを含む緩衝水溶液（２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５）にＦＦＡストック溶液をスパイクした後（ｎ＝３）。最も多い量のアルミニウム（２５０ｐｐｂ）を含む試料を、キレート剤（ＥＤＴＡ）を用いてさらに配合した。試料を、２～８℃で０、１日間、７日間および２８日間貯蔵した後、（Ａ）Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒおよび（Ｂ）Ｅ／Ｐボックスを使用して可視粒子の存在について分析した。容器あたりの粒子の累積含有量は、Ｅ／Ｐボックスでは、「多数の粒子（＞７、ｘｘｘ）」、「少数の粒子（５～７、ｘｘ）」、または「実質的に粒子を含まない（０～４、／）」、およびＳｅｉｄｅｎａｄｅｒによって、「多数の粒子（＞１０、ｘｘｘ）」、「少数の粒子（６～１０、ｘｘ）」、「本質的に粒子を含まない（１～５、ｘ）」、または「粒子を含まない（０、／）」として分類した。ＦＦＡを含まないか塩を含まない試料を陰性対照として使用した一方、溶解限界（＊）を超えるＦＦＡを含む試料を陽性対照として使用した。ｄ＝検査の日。ｄ０＝スパイク後。ｎｄ＝未決定。結果を表４に要約する。

（表４）可視粒子の形成

実施例３：ヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５中の部分的に分解されたポリソルベート２０の溶解度
ＭＭＬまたはＣＡＬによって事前に分解されたポリソルベート２０（ＰＳ２０）（分解レベル０～６０％）を、２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５にスパイク（ｎ＝３）して、０．０４％（ｗ／ｖ）の最終ＰＳ２０濃度にした。試料を、２～８℃で０、１日間、７日間および２８日間貯蔵した後、可視粒子の存在について視覚的に検査（Ｅ／Ｐボックス）した。容器あたりの粒子の累積含有量は、Ｅ／Ｐボックスでは、「多数の粒子（＞７、ｘｘｘ）」、「少数の粒子（５～７、ｘｘ）」、または「実質的に粒子を含まない（０～４、／）」として分類した。ｄ＝検査の日。ｄ０＝スパイク後、ＭＭＬ＝ムコール・ミエヘイリパーゼ、ＣＡＬ＝カンジダ・アンタークティカリパーゼ。結果を表５に要約する。

（表５）ヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５中の部分的に分解されたポリソルベート２０の溶解度

実施例４：可視粒子の形成
０～２５０ｐｐｂの範囲の異なる量のアルミニウムを含む緩衝水溶液（２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５）に部分的に分解されたポリソルベート２０をスパイクした後（ｎ＝３）。最も多い量のアルミニウム（２５０ｐｐｂ）を含む試料を、キレート剤（ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡ）を用いてさらに配合した。試料を、２～８℃で０、１日間、７日間および２８日間インキュベーションした後、可視粒子の存在について視覚的に検査（Ｅ／Ｐボックス）した。容器あたりの粒子の累積含有量は、「多数の粒子（＞７、ｘｘｘ）」、「少数の粒子（５～７、ｘｘ）」、または「実質的に粒子を含まない（０～４、／）」として分類した。１００％インタクトなＰＳ２０を含むかまたは塩を含まない試料を陰性対照として使用した一方、溶解限界（＊）を超える６０％分解されたＰＳ（ＭＭＬ）を含む試料を陽性対照として使用した。ｄ＝検査の日。ｄ０＝スパイク後、ｎｄ＝未決定、ＭＭＬ＝ムコール・ミエヘイリパーゼ、ＣＡＬ＝カンジダ・アンタークティカリパーゼ。結果を表６に要約する。

（表６）可視粒子の形成

結果
ラウリン酸およびミリスチン酸の溶解限界を、ＦＦＡストック溶液をヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５にスパイクして、ラウリン酸について０～３０μｇ／ｍＬおよびミリスチン酸について０～１２μｇ／ｍＬの標的濃度を得ることによって評価した（実施例１を参照）。試料を２～８℃でインキュベートし、０、７、１４および２８日後にＳｅｉｄｅｎａｄｅｒ（表３Ａ）およびＥ／Ｐボックス（表３Ｂ）を使用して可視粒子について検査した。多数の可視粒子（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒでは＞１０、Ｅ／Ｐボックスでは＞７）の形成が、少なくとも２０／８μｇ／ｍＬのラウリン／ミリスチン酸を含む試料において１日後に既に観察された一方、ＦＦＡのより低い濃度は、全体的により少ない粒子の数、および粒子の発生の遅延をもたらした。Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ機による視覚検査は１．５倍の倍率で行われるため、容器あたりの粒子の総数はＥ／Ｐボックス分析と比較して多かった。溶解限界は、ラウリン酸およびミリスチン酸の濃度として定義され、それを超えると、三連セットの３つすべてのバイアルについて２８日後に多くの可視粒子（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒでは＞１０、およびＥ／Ｐボックスでは＞７）が観察された。表３に示すように、少なくとも１２．５μｇ／ｍＬのラウリン酸および５μｇ／ｍＬのミリスチン酸を含む試料では、遊離脂肪酸の濃度が溶解限界を超え、ＦＦＡが可視粒子としてクラッシュアウトした。結論として、より低いラウリンおよびミリスチン酸の濃度を有するすべての試料は、溶解限界未満であると考えられた。

続いて、ＦＦＡストック溶液を、０～２５０ｐｐｂの範囲の異なる量のアルミニウムを含む緩衝水溶液（２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５）にスパイクした（実施例２）。それにより、試料中の脂肪酸の最終濃度は、陽性対照として使用した２５／１０μｇ／ｍＬのラウリン／ミリスチン酸を含む１つの試料を除いて、以前に決定された溶解限界（１０／４、７．５／３、５／２、０／０μｇ／ｍＬのラウリン／ミリスチン酸）未満であった。最も多い含有量のアルミニウム（２５０ｐｐｂ）を含む試料に、０．００５％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡでさらにスパイクした。すべての試料を２～８℃で２８日間までインキュベートし、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ（表４Ａ）およびＥ／Ｐボックス（表４Ｂ）を使用して可視粒子について検査した。表４に示すように、アルミニウムの存在は、ＦＦＡの溶解限界未満であってもＦＦＡ粒子の形成をもたらした。可視粒子の形成の程度および発生は、アルミニウム濃度に依存し、驚くべきことにＦＦＡ濃度にも逆依存した。最も高い濃度のアルミニウムを含む試料は、最も早い粒子発生および最も多い粒子数を示した。この効果は、減少したＦＦＡの量を含む試料でさらに顕著であった。Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒの結果によって実証されるように、１０ｐｐｂの微量のアルミニウムでさえ、遊離脂肪酸を錯化し、可視粒子を形成するのに十分であった。脂肪酸のみ（溶解限界未満）を含むが、アルミニウムを含まない、またはその逆の試料は、２～８℃で２８日間までのインキュベーションで、有意な数の可視粒子（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒでは≦１０、およびＥ／Ｐボックスでは≦７）を形成しなかった。

可視ＦＦＡ粒子の形成は、最も高いアルミニウム濃度（２５０ｐｐｂ）および溶解限界未満のＦＦＡレベルを含む試料に、０．００５％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡを添加することによって抑制することができた。

水性（非経口）タンパク質製剤または抗体製剤中のポリソルベートからのＦＦＡ放出のより具体的な問題に目を向けると、ポリソルベートの加水分解は、活性医薬成分（ＡＰＩ）と共精製され、ポリソルベート中のエステル結合の加水分解を触媒することができる宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の存在によって主に駆動されることが以前に開示されている（Ｌａｂｒｅｎｚ、２０１４；Ｄｉｘｉｔら、２０１６）。異なる酵素がポリソルベートのモノエステルまたはポリエステル構成要素に対して異なる特異性を有し、異なるポリソルベート分解パターンをもたらすことは既に公知である（ＭｃＳｈａｎら、２０１６）。

実施例３では、ポリソルベートを、ビーズ上に予め固定化した２つの異なる酵素によって人為的に分解して、分解レベルの正確な制御を可能にした。ＭＭＬは高次エステルを優先的に分解するのに対して、ＣＡＬはモノエステルおよび高次エステルを均一に分解する（Ｇｒａｆら、２０２０）。

ＭＭＬまたはＣＡＬのいずれかで分解された部分加水分解のポリソルベートの溶解限界は、ＰＳ２０ストック溶液をヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５にスパイクして０．４ｍｇ／ｍＬの総濃度にすることによって決定した。試料を２～８℃でインキュベートし、２８日間まで可視粒子の存在について視覚的に検査（Ｅ／Ｐボックス）した。ＭＭＬによって４０％および６０％分解されたポリソルベートをスパイクした直後に、多数の可視粒子（Ｅ／Ｐボックスでは＞７）の形成が観察された。対照的に、初期時点（ｄ０）では、最も高い分解レベル（６０％）であっても、ＣＡＬ試料については可視粒子は観察されなかった。２～８℃でのインキュベーション後、可視粒子は、ＭＭＬおよびＣＡＬ試料について、それぞれ２０％または３０％のポリソルベート分解で既に観察された。

各ポリソルベートの分解シリーズの溶解限界は、それを超えると、三連セットの３つすべてのバイアルについて２８日後に多くの可視粒子（Ｅ／Ｐボックスについて＞７）が観察された臨界分解度として定義した。

より低いポリソルベート分解度（ＭＭＬについては＜２０％、およびＣＡＬについては＜３０％）を有する試料を、溶解限界未満であると定義した。

次のステップでは、部分的に分解されたＰＳ２０溶液を、０～２５０ｐｐｂの範囲の異なる量のアルミニウムを含む緩衝水溶液（２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５）にスパイクした（実施例４）。それにより、ポリソルベート分解物の最終濃度は、陽性対照として使用したＭＭＬで４０％分解されたポリソルベートを含む１つの試料を除いて、以前に決定された溶解限界（１０％および１５％）未満であった。最も多い含有量のアルミニウム（２５０ｐｐｂ）を含む試料に、０．０５ｍＭのＤＴＰＡまたは０．００５％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡのいずれかでさらにスパイクした。すべての試料を２～８℃で２８日間までインキュベートし、視覚的に検査（Ｅ／Ｐボックス）した。表６に示すように、アルミニウムの存在は、臨界ポリソルベート分解レベル未満であっても、ＦＦＡ粒子の形成をもたらした。ここでも、可視粒子の形成の程度および粒子の発生の両方は、アルミニウム濃度に依存し、驚くべきことにＰＳ２０の分解度および分解パターンにも逆依存した。最も高い濃度のアルミニウムを含む試料は、最も早い粒子発生および最も多い粒子数を示した。この効果は、より低いポリソルベート分解度（１０％）でわずかにより顕著であった。興味深いことに、アルミニウムが存在する場合、ＣＡＬ試料は、非常に低レベルのアルミニウム（１０ｐｐｂ）であっても可視粒子の形成を示し、対応するＭＭＬ試料と比較して有意に早かった（７日後）。

２～８℃で２８日間までインキュベートした場合、未分解ポリソルベートでスパイクしたか、またはアルミニウムを含まない試料中に可視粒子は形成されなかった。

したがって、可視ＦＦＡ粒子の形成は、最も高いアルミニウム濃度（２５０ｐｐｂ）および溶解限界未満で部分的に分解されたポリソルベート含む試料に、０．０５ｍＭのＤＴＰＡまたは０．００５％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡを添加することによって首尾よく防止された。

実施例５：キレート剤を含むおよび含まないペルツズマブ製剤中の粒子形成
ペルツズマブ（ｍＡｂ１）を、表７に要約したように、０．２ｍｇ／ｍＬのＨＰ ＰＳ２０または純粋オレイン酸（ＰＯＡ）ＰＳ８０、０または１０ｍＭのメチオニンおよび０または０．０５ｍＭのキレート剤（ＤＴＰＡまたはＥＤＴＡ）を補充した、２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ６．０、１２０ｍＭスクロース中に３０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。製剤化された薬物製品を２０ｃｃのホウケイ酸バイアル（１４．０ｍＬ）に充填し、２～８℃で貯蔵した。各製剤３０バイアルを調製した。

（表７）異なるｍＡｂ１製剤の試料組成

視覚検査（ＳｅｉｄｅｎａｄｅｒまたはＥ／Ｐ）を、２～８℃で６ヶ月のインキュベーション後に製剤あたり３０バイアルで行った。バイアルを、２～８℃の貯蔵（低温試料溶液）から取り出した後１時間以内、または周囲温度に４時間平衡化した後に検査した。

結果：
表８および表９は、２～８℃で６ヶ月貯蔵した後のＥ／Ｐ法またはＳｉｄｅｎａｄｅｒを使用した視覚検査結果をそれぞれ要約している。低温試料溶液の全体的な粒子数は、周囲温度に平衡化した後の試料と比較して全体的に高く、これは、粒子が主に、より低い温度でより低い溶解度を有する遊離脂肪酸または脂肪酸塩からなることを示している。平衡化後の異なる製剤中の粒子を比較すると、粒子を含む容器の数は、５つの製剤すべてについて非常に類似していた（３０個のうち１～３個の容器）。粒子の総数および

（表８）６ヶ月後（２～８℃）の視覚検査（ＥＰ）

（表９）６ヶ月後（２～８℃）の強化された視覚検査（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ）

実施例６：異なるＰＳ２０およびＰＳ８０グレードならびにＤＴＰＡを用いたスパイク研究
方法
酵素的に分解されたＰＳ２０およびＰＳ８０の調製
超精製（ＳＲ）ＰＳ２０およびＰＳ８０、高純度（ＨＰ）ＰＳ２０およびＰＳ８０、ならびに純粋オレイン酸（ＰＯＡ）ＰＳ８０を、固定化した酵素（Ｇｒａｆら、２０２０）（ムコール・ミエヘイリパーゼ（ＭＭＬ）、カンジダ・アンタークティカリパーゼ（ＣＡＬ）およびカンジダ・アンタークティカリパーゼＢ（ＣＡＬＢ））を使用して１０％酵素的に加水分解した。これらの酵素は、モノ－エステルおよび高次エステルに対して異なる特異性を有するが、ＭＭＬはＰＳ中の高次エステル種を主に分解し、ＣＡＬはモノエステルおよび高次エステルを標的とし、ＣＡＬＢはモノエステルを優先的に分解する。

部分的に分解されたポリソルベート（ＰＳ２０およびＰＳ８０）およびアルミニウムを用いたスパイク研究
２０ｍＭヒスチジンアセテートｐＨ５．５に含む、希釈されたアルミニウム溶液を上記のように調製し、２０ｍＬのＩ型ホウケイ酸ガラスバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ、Ｍａｉｎｚ、ＤＥ）に充填した。０または２５０ｐｐｂのアルミニウム（Ａｌ^３＋）を含む試料に、異なるＰＳストック溶液（ＨＰ ＰＳ２０、ＳＲ ＰＳ２０、ＨＰ ＰＳ８０、ＳＲ ＰＳ８０、ＰＯＡ ＰＳ８０；０または１０％の分解レベル）でスパイクした。さらに、２５０ｐｐｂのアルミニウムを含む試料に、０．０５ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を補充した後に、部分的に分解されたＰＳでスパイクした。バイアルを２０ｍｍテフロン加工の注射ストッパー（Ｄ７７７－１、Ｄａｉｋｙｏ）およびアルミニウムクリンプキャップで密封し、ＭａｘＱ（商標）４０００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で２５℃にて１時間ホモジナイズした。

部分的に分解されたＰＳ２０またはＰＳ８０を用いて調製された試料は、溶解限界未満のＦＦＡ濃度をもたらした。異なるグレードの未分解ポリソルベート２０および８０を、陰性対照として用いた。すべての試料を三連で調製した。

試料を５℃で貯蔵し、上記のようにＰｈ．Ｅｕｒ．２．９．２０．に準拠した黒／白パネルを使用した視覚検査、および強化された視覚検査（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｖ９０－Ｔ装置）によって２２日間まで粒子形成を評価した。

結果
異なるグレードのＰＳ２０（ＳＲ、ＨＰ）およびＰＳ８０（ＳＲ、ＨＰ、ＰＯＡ）を、異なる基質特異性を有する異なる酵素を使用して１０％部分的に分解した。ＰＳストック溶液（０または１０％分解）を、含まない（０ｐｐｂ）または２５０ｐｐｂのアルミニウム、または２５０ｐｐｂのアルミニウムおよび５０μＭのＤＴＰＡをさらに含む緩衝水溶液にスパイクした。バイアルを２～８℃でインキュベートし、可視粒子の形成を視覚検査（Ｅ／Ｐ）および強化された視覚検査（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ）によってモニターした。表１０（Ｅ／Ｐによる可視粒子）に示すように、１０％分解されたＰＳ２０またはＰＳ８０を含むがアルミニウムを含まない試料では、研究の過程で可視粒子は観察されなかった。分解に使用される酵素とは無関係に、部分的に分解されたＰＳ２０およびアルミニウムを含む試料で多くの可視粒子が形成したが、部分的に分解されたＰＳ８０およびアルミニウムを含む試料については、可視粒子が有意に少なかったかまたは観察されなかった。すべてのグレードのＰＳについて、キレート剤（ＤＴＰＡ）の存在下では粒子は観察されなかった。興味深いことに、２５０ｐｐｂのアルミニウムを含む未分解ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ８０対照は可視粒子を形成したが、他のすべての対照は粒子を含まなかった。この観察は、ＨＰグレードのＰＳが対応するＳＲグレードと比較して、有意に高いレベルの遊離脂肪酸を原料中に含むという事実によって説明されるであろう（Ｄｏｓｈｉら、２０２０ａ）。これらのレベルはＦＦＡ溶解度レベルをはるかに下回るが、ＦＦＡ金属核生成に対して十分に高い可能性がある。

（表１０）アルミニウムを含まないかまたは２５０ｐｐｂのアルミニウムを含む緩衝水溶液（２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５）に、ＰＳストック溶液（０または１０％の分解レベル）をスパイクした後の可視粒子の形成（Ｅ／Ｐ）（ｎ＝３）
２５０ｐｐｂのアルミニウムを含む試料を、キレート剤（ＤＴＰＡ）を用いてさらに製剤化した。試料を、２～８℃で０～２２日間貯蔵した後、Ｅ／Ｐボックスを使用して可視粒子の存在について分析した。容器（２０ｍＬ）あたりの粒子の累積含有量は、「多数の粒子（＞７、ｘｘｘ）」、「少数の粒子（５～７、ｘｘ）」、または「実質的に粒子を含まない（０～４、／）」として分類した。未分解ＰＳ無塩をいずれか含む試料を、陰性対照として使用した。結果は、３つの容器中の粒子数の平均として報告する。ｄ＝検査の日、ＣＡＬＢ＝カンジダ・アンタークティカリパーゼＢ、ＭＭＬ＝ムコール・ミエヘイリパーゼ、ＣＡＬ＝カンジダ・アンタークティカリパーゼ、ＤＴＰＡ＝ジエチレントリアミン五酢酸。

表１１は、ＨＰ ＰＳ２０、ＳＲ ＰＳ２０、ＨＰ ＰＳ８０、ＳＲ ＰＳ８０およびＰＯＡ ＰＳ８０について、対応する強化された視覚検査の結果を示す。アルミニウムの非存在下で部分的に分解されたＰＳを含む対照は、粒子を含まないかまたは本質的に含まないままであったが、部分的に分解されたＰＳおよびアルミニウムを含むすべての試料は、多くの可視粒子を瞬時に形成した。粒子形成は、ＰＳのグレードまたは分解に使用される酵素とは無関係に、ＤＴＰＡの存在下で有意に軽減された。ここでも、未分解ＨＰ ＰＳ２０およびＨＰ ＰＳ８０ならびにアルミニウムを含む試料では、多くの粒子が形成されたが、他の非分解対照（アルミニウムを含む）では、粒子はほとんど観察されなかったかまたは観察されなかった。

（表１１）アルミニウムを含まないかまたは２５０ｐｐｂのアルミニウムを含む緩衝水溶液（２０ｍＭヒスチジンアセテート緩衝液ｐＨ５．５）に、ＰＳストック溶液（０または１０％の分解レベル）をスパイクした後の可視粒子の形成（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ）（ｎ＝３）
２５０ｐｐｂのアルミニウムを含む試料を、キレート剤（ＤＴＰＡ）を用いてさらに製剤化した。試料を、２～８℃で０～２２日間貯蔵した後、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ装置を使用して可視粒子の存在について分析した。容器あたりの粒子の累積含有量は、「多数の粒子（＞１０、ｘｘｘ）」、「少数の粒子（６～１０、ｘｘ）」、「本質的に粒子を含まない（１～５、ｘ）」、または「粒子を含まない（０、／）として分類した。未分解ＰＳを含むかまたは塩を含まない試料を、陰性対照として使用した。ｄ＝検査の日、ＣＡＬＢ＝カンジダ・アンタークティカリパーゼＢ、ＭＭＬ＝ムコール・ミエヘイリパーゼ、ＣＡＬ＝カンジダ・アンタークティカリパーゼ、ＤＴＰＡ＝ジエチレントリアミン五酢酸。

実施例７：金属塩およびキレート剤のスクリーニング
方法
動的光散乱（ＤＬＳ）によるＦＦＡ粒子核生成
ＤＬＳ実験をＤｙｎａＰｒｏ（Ｒ）プレートリーダー（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）で行った。測定を開始する５時間前にＤＬＳプレートリーダーを窒素でフラッシュし、測定の全期間中５℃に冷却する。６％ｖ／ｖのＤＭＳＯを補充したｐＨ６．０の２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン緩衝液中２０μｇのラウリン酸（ＬＡ）および様々な量の金属イオン（Ａｌ^３＋、Ｆｅ^３＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｎｉ^２＋）を含む２００μＬの試料溶液を、黒色ガラス底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のキュベット中で混合した。ＦＦＡ核生成および粒子成長を、６３３ｎｍレーザーおよび後方散乱検出システムを１５８°で使用して、４０～７０時間にわたって測定した。流体力学的粒子半径（ｒＨ）は、得られた自己相関関数にキュムラントフィットをフィッティングさせることによって決定した。キュムラントフィットの下限および上限は、それぞれ１０μｓおよび１０００μｓの遅延時間τに設定した。レーザー出力は、各測定シーケンスの前に調整し、測定全体にわたって一定に保った。最大量の散乱光を収集するために、すべての測定に対して減衰レベルを０に設定した。

粒子キネティクスに対するアルミニウム（Ａｌ）濃度の影響
２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０中のＡｌ試料溶液（１００×）を滅菌５０ｐｐｍ Ａｌストック溶液（２０ｍＭグリシンｐＨ２．５）から調製し、０、２０、４０、６０および１００ｐｐｂのＡｌの標的濃度でＤＬＳアッセイ緩衝液にスパイクした。粒子核生成および成長を、上記のように４０時間の期間にわたって測定した。

シグモイド型ボルツマン関数を成長曲線にフィッティングすることにより、ＦＦＡ粒子の散乱レーザー光の強度を経時的に分析することによって、定量分析を行った。

式中、Ａは初期値を表し、Ｂは最終値を表し、ｘ_０はシグモイド曲線の中心または変曲点であり、ｄｘは時定数である。

二価および三価カチオンとラウリン酸との相互作用
アルミニウム（Ａｌ）、鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）およびニッケル（Ｎｉ）ストック溶液を、それらそれぞれの塩からＭｉｌｌｉ－Ｑ水ｐＨ２．５中４ｍＭで調製し、使用するまで２～８℃で貯蔵した。希釈した試料溶液（１００×）をＭｉｌｌｉ－Ｑ水ｐＨ２．５中で新たに調製した。ＤＬＳアッセイ緩衝液を塩試料溶液に添加して、０、１、３、１０および３０μＭの金属イオン標的濃度を得た。粒径（ｒＨ）および強度を、上記のように７０時間の期間にわたって測定した。

キレート剤の存在下でのＦＦＡ金属核生成
ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，３－ジアミノプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＰＤＴＡ）およびＮ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－グルタミン酸四ナトリウム（ＧＬＤＡ）ストック溶液を、２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５中で調製し、ＤＬＳアッセイ緩衝液中で所望の濃度に希釈した。Ａｌ核生成研究のために、２μＭの金属イオン標的濃度を使用した。ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＧＬＤＡおよびＰＤＴＡの最終濃度は、０、０．５、１．０、１．５、２および２０μＭのいずれかであり、それぞれキレート剤対Ａｌのモル比０、０．２５、０．５、０．７５、１．０および１０をもたらした。Ｆｅ核生成研究のために、Ｆｅの標的濃度は４μＭであった。ＤＴＰＡの最終濃度は、０、０．０４、０．４、２．０、４．０または４０μＭのいずれかであり、それぞれ０、０．０１、０．１、０．５、１．０および１０のモル比（ＤＴＰＡ：Ｆｅ）をもたらした。ＤＬＳ測定は、上記のように５℃で５０時間にわたって行った。

ＤＴＰＡは、実際のガラス浸出物の存在下でのＦＦＡ金属核生成を防止する
代表的なガラス浸出物をＡｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒら（Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒら、２０２１）に開示されている手順に従って調製した。簡単に記載すると、６ｍＬのｐＨ１０のグリシン溶液を、６ｍＬのＦｉｏｌａｘ（登録商標）バイアル（Ｓｃｈｏｔｔ ＡＧ、Ｍｕｌｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、およびＳｃｈｏｔｔ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ）に充填し、Ｄ７７７－１セラムストッパー（ＤＡＩＫＹＯ Ｓｅｉｋｏ Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で栓をし、１回のオートクレーブ処理サイクル（１２１℃、２０分）に供した。希釈後の試料中のガラス浸出物の含有量は、３７ｐｐｂのＡｌ、４３ｐｐｂのＢ、４３０ｐｐｂのＳｉ、および０ｐｐｂのＮａ、Ｋ、Ｃａであり、１．４μＭのＡｌ、４．０μＭのＢおよび１５．３μＭのＳｉに対応した。ＤＴＰＡ濃度は、０、０．０４、０．４、２．０、４．０または４０μＭのいずれかであり、それぞれ、０、０．０３、０．３、１．５、２．９および２９のモル比（ＤＴＰＡ：Ａｌ）、または０、０．００２、０．０２、０．１、０．２および１．９（ＤＴＰＡ対ガラス浸出物）をもたらした。ＤＬＳ測定は、上記のように５℃で５０時間にわたって行った。

結果
金属カチオンとラウリン酸との相互作用
ＤＰ製造または貯蔵中に潜在的に導入される可能性がある他の二価および三価金属不純物のリスクを評価するために、ＤＬＳに基づく代用アッセイを確立した。ＤＬＳは、０．３ｎｍ～１０μｍのサイズ範囲で粒子形成および成長を捕捉するために使用することができ（Ｐａｎｃｈａｌら、２０１４）、したがって、初期の核生成事象（ＦＦＡ－金属相互作用）を検出するのに適していた。タンパク質およびポリソルベートのミセルはアッセイを妨げ得るため、加水分解ＰＳ２０からの主な分解産物であるラウリン酸（溶解限界未満）、およびＬＡ溶解度を増加させるＤＭＳＯ（６％ｖ／ｖ）を含む水溶液中で測定を行った。第１の実験では、異なるＡｌ濃度を使用してＦＦＡ錯化およびその後の粒子形成を誘発した。図１に示すように、Ａｌを含むすべての製剤でナノ粒子が形成されたが、ＡｌまたはＦＦＡのいずれかを含まない対照では粒子は観察されなかった（データは示さず）。Ａｌ含有試料の粒径は経時的に増加し、それによりサイズの増加はより高いＡｌ濃度で上昇した。

図２Ｂに示すように、Ａｌを含む試料の散乱強度は、Ａｌを含まない対照試料（５０００ｋＣｎｔ／ｓ）と比較して最初は高かった。４０ｐｐｂのＡｌを含む試料では、経時的に強度のわずかな増加が観察されたが、６０～１００ｐｐｂのＡｌを含む試料は強度の急激な増加を示し、これをシグモイド曲線でフィッティングして変曲点を決定することができた（図２Ｂ）。強度範囲、したがってシグモイドフィットの勾配は、高Ａｌレベルを含む試料では著しく増加するため、粒子成長キネティクスを評価するためにｔ_{ｏｎｓｅｔ}を使用することはできなかった（データは示さず）。代わりに、シグモイド曲線の変曲点は、強度範囲とは無関係であるため使用した。

図２Ｂに示すように、シグモイド曲線フィットの変曲点は、Ａｌ濃度の増加につれて指数関数的に減衰し、これは、錯化および粒子成長の事象が微量レベルのＡｌ（４０～６０ｐｐｂ）で有意に加速され得ることを示すが、Ａｌのさらなる増加（８０ｐｐｂを超える）は変曲点のさらなるシフトをもたらさなかった。これらの結果は、より高いＡｌ濃度の存在下では、より大きな粒子が形成されるが、粒子成長キネティクスは８０ｐｐｂの濃度を超えて影響を受けないことを示唆している。非常に低い濃度（２０ｐｐｂ）に対しては、変曲点はおよそ６５時間であると算出され、したがってこの実験では捕捉されなかった。

第２の研究では、異なる二価（Ｃａ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｎｉ）および三価（Ａｌ、Ｆｅ）カチオンを、ラウリン酸と相互作用させてＦＦＡ塩粒子を形成する傾向についてスクリーニングした。より良い比較のために、０～３０μＭの範囲の等モル量の金属イオンを使用した。それぞれのｐｐｂ濃度への変換を表１２に示す。

（表１２）金属イオン濃度の変換

金属カチオンの種類および濃度の関数としての粒径（ｒ_Ｈ）および強度の変化を７０時間の期間にわたって評価した。図３に示すように、粒子形成および成長は、三価金属イオン（Ｆｅ、Ａｌ）についてのみ観察された一方、二価カチオン（Ｃａ、Ｍｇ、Ｎｉ、Ｚｎ）の存在は、ＦＦＡ塩粒子の形成または成長をもたらさなかった。興味深いことに、ＡｌとＦｅは全く異なる挙動であった。Ａｌ濃度の増加（０～１０μＭ）は、より大きな粒子の形成およびより速い粒子成長をもたらしたが、等量のＦｅの添加は、瞬時の粒子形成（５０～６０ｎｍのｒ_Ｈ）をもたらしたが、経時的な粒径のさらなる増加はもたらさなかった。しかしながら、散乱強度は、ＡｌおよびＦｅのレベルが増加するにつれて増加し、ＦＦＡ－Ｆｅ粒子は経時的に成長しないが、粒子の数は依然として増加していることを示唆している。

両方の三価カチオンについて、最高濃度（３０μＭ）は非常に大きな粒子の形成をもたらした。粒径はＤＬＳの検出上限に近いため、さらなるサイズの増加は観察できなかった。さらに、これらの大きな粒子は、散乱強度の漸減によって示されるように、経時的に沈降するようであった（図３Ｂ）。

これらの結果に基づいて、二価カチオンの存在は、調査された濃度範囲でＦＦＡ塩粒子形成のリスクが低い一方、Ａｌ^３＋およびＦｅ^３＋などの三価カチオンは、非常に低い濃度であっても負に帯電したＦＦＡと相互作用することができると結論付けることができる。

ＦＦＡ金属核生成に対するキレート剤の保護効果
キレート剤の保護効果を評価するために、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＧＬＤＡおよびＰＤＴＡを、０～１０のモル比（キレート剤対Ａｌ）に対応する０～４０μＭの範囲の異なる濃度で、ラウリン酸および４ｕＭのＡｌを含む溶液にスパイクした。

図４および図５に示すように、キレート剤濃度の増加は、散乱強度および粒径の全体的な減少、ならびに経時的なより遅い粒子成長をもたらした。少なくとも１：１（キレート剤対Ａｌ）のモル比では、粒子形成および成長は、すべてのキレート剤について効率的に抑制された。キレート剤間のわずかな効率の差は、化学構造に起因し得る。ＥＤＴＡ、ＧＬＤＡおよびＰＤＴＡは、六座のキレート化剤として多価イオンを錯化することができる四酢酸であるが、ＤＴＰＡは、８つの配位結合形成部位（５つのカルボキシレートの酸素原子および３つの窒素原子）を有するペンテト酸である。カルボキシレートのドナー基は、ｐＨを低下させるとますますプロトン化され（Ｅｉｖａｚｉｈｏｌｌａｇｈら、２０１７）、より電荷の少ないキレート剤種をもたらし、よって金属錯化がより弱くなる。ＤＴＰＡは、ＥＤＴＡ、ＧＬＤＡおよびＰＤＴＡよりも多くのドナー原子を有するので、わずかに酸性のｐＨで多価カチオンを効率的に錯化することができる。

ＤＴＰＡの保護効果も、ラウリン酸および４μＭ Ｆｅの存在下で評価した（図６）。Ａｌとは対照的に、Ｆｅを用いたＦＦＡ金属核生成は、ＤＬＳアッセイにおいて瞬時のナノ粒子形成をもたらすが、経時的な著しい粒子成長はもたらさない。等モル量のＤＴＰＡの添加は、Ａｌの場合と同様に、粒子形成および成長の完全な抑制をもたらした。０．５のＤＴＰＡ対Ｆｅ比では、散乱強度は有意に減少したが、粒子半径はわずかに変化しただけであり、主に粒子の数が減少したことを示唆している。

Ｅｘｐ５１ホウケイ酸ガラスバイアルから抽出されるラウリン酸および実際のガラス浸出物を含む試料へのＤＴＰＡの添加も、少なくとも１．５のキレート剤対Ａｌのモル比で粒子形成を軽減するのに有効であった（図７）。

参考文献
Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒ，Ａｎｄｒｅａ；Ｌｅｂｏｃ，Ｖａｎｅｓｓａ；Ｂｏｎａｔｉ，Ｌｕｃｉａ；Ｗｏｅｈｒ，Ａｎｎｅ；Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｒａｖｕｒｉ Ｓ．Ｋ．；Ａｂｓｔｉｅｎｓ，Ｋａｔｈｒｉｎ（２０２１）：Ｇｌａｓｓ Ｌｅａｃｈａｂｌｅｓ ａｓ ａ Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１０（２）、Ｓ．７８５－７９５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０２０．０９．０５０．
Ｄｉｔｔｅｒ，Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ；Ｍａｈｌｅｒ，Ｈａｎｎｓ－Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ；Ｇｏｈｌｋｅ，Ｌｉｎｕｓ；Ｎｉｅｔｏ，Ａｌｅｊａｎｄｒａ；Ｒｏｅｈｌ，Ｈｏｌｇｅｒ；Ｈｕｗｙｌｅｒ，Ｊｏｅｒｇら（２０１８）：Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｖｉａｌ Ｗａｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｄｅｌａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｇｌａｓｓ Ｖｉａｌｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３５（７）、Ｓ．１４６．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１０９５－０１８－２４２１－６．
Ｄｉｘｉｔ，Ｎｉｔｉｎ；Ｓａｌａｍａｔ－Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｚｉｌａ；Ｓａｌｉｎａｓ，Ｐａｕｌ Ａ．；Ｔａｙｌｏｒ，Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｄ．；Ｂａｓｕ，Ｓｕｊｉｔ Ｋ．（２０１６）：Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｕｌｆａｔａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０５（５）、Ｓ．１６５７－１６６６．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０１６．０２．０２９．
Ｄｏｅｓｓｅｇｇｅｒ，Ｌｕｃｅｔｔｅ；Ｍａｈｌｅｒ，Ｈａｎｎｓ－Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ；Ｓｚｃｚｅｓｎｙ，Ｐｉｏｔｒ；Ｒｏｃｋｓｔｒｏｈ，Ｈｅｌｍｕｔ；Ｋａｌｌｍｅｙｅｒ，Ｇｅｏｒｇ；Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ，Ａｎｊａら（２０１２）：Ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｄｒｕｇｓ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０１（８）、Ｓ．２６３５－２６４４．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｐｓ．２３２１７．
Ｄｏｓｈｉ，Ｎｉｄｈｉ；Ｄｅｍｅｕｌｅ，Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ；Ｙａｄａｖ，Ｓａｎｄｅｅｐ（２０１５）：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ａｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｂｙｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １２（１１）、Ｓ．３７９２－３８０４．ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｍｏｌｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．５ｂ００３１０．
Ｄｏｓｈｉ，Ｎｉｄｈｉ；Ｆｉｓｈ，Ｒａｐｈａｅｌ；Ｐａｄｉｌｌａ，Ｋａｒｉｎａ；Ｙａｄａｖ，Ｓａｎｄｅｅｐ（２０２０ａ）：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｐｅｒ Ｒｅｆｉｎｅｄ（商標） Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｗｉｔｈ Ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９（１０）、Ｓ．２９８６－２９９５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０２０．０６．０３０．
Ｄｏｓｈｉ，Ｎｉｄｈｉ；Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｊａｍｉｅ；Ｌｕｉｓ，Ｌｉｎ；Ｗｕ，Ａｒｔｈｕｒ；Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｋｙｌｅ；Ｌｉｕ，Ｗｅｎｑｉａｎｇら（２０２１）：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ａｌｌ－Ｏｌｅａｔｅ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０：Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８（３）、Ｓ．５３１－５４８．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１０９５－０２１－０３０２１－ｚ．
Ｄｏｓｈｉ，Ｎｉｄｈｉ；Ｍａｒｔｉｎ，Ｊｏｅｌｌｅ；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ａｎｔｈｏｎｙ（２０２０ｂ）：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ Ｅｓｔｅｒ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １７（１１）、Ｓ．４３５４－４３６３．ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｍｏｌｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．０ｃ００７９４．
Ｄｏｙｌｅ Ｄｒｂｏｈｌａｖ，Ｌａｕｒａ Ｍ．；Ｓｈａｒｍａ，Ａｎａｎｔ Ｎａｖａｎｉｔｈａｎ；Ｇｏｐａｌｒａｔｈｎａｍ，Ｇａｎａｐａｔｈｙ；Ｈｕａｎｇ，Ｌｉｈｕａ；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｓｃｏｔｔ（２０１９）：Ａ Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｐａｒｔ ２．Ｉｎ：ＰＤＡ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７３（４）、Ｓ．３２０－３３０．ＤＯＩ：１０．５７３１／ｐｄａｊｐｓｔ．２０１８．００９６３９．
Ｅｉｖａｚｉｈｏｌｌａｇｈ，Ａｌｉｒｅｚａ；Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ，Ｊｏａｋｉｍ；Ｎｏｒｇｒｅｎ，Ｍａｇｎｕｓ；Ｅｄｌｕｎｄ，Ｈａｋａｎ（２０１７）：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｅｌａｔｅｄ Ｃｕ（ＩＩ）ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｅｌｌ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）９２（６）、Ｓ．１４３６－１４４５．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｃｔｂ．５１４１．
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ：Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ ０１／２０１７：０９１１．Ｉｎ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ １０．３ ２０２１．
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ：Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ［２．９．２０］．Ｉｎ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ １０．０ ２０２０．
Ｇｌｕｃｋｌｉｃｈ，Ｎｉｌｓ；Ｄｗｉｖｅｄｉ，Ｍｒｉｄｕｌａ；Ｃａｒｌｅ，Ｓｔｅｆａｎ；Ｂｕｓｋｅ，Ｊｕｌｉａ；Ｍａｄｅｒ，Ｋａｒｓｔｅｎ；Ｇａｒｉｄｅｌ，Ｐａｔｒｉｃｋ（２０２０）：Ａｎ ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｌｉｍｉｔｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ａｎｄ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ５９１、Ｓ．１１９９３４．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｉｊｐｈａｒｍ．２０２０．１１９９３４．
Ｇｏｐａｌｒａｔｈｎａｍ，Ｇａｎａｐａｔｈｙ；Ｓｈａｒｍａ，Ａｎａｎｔ Ｎａｖａｎｉｔｈａｎ；Ｄｏｄｄ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｗｉｔｔ；Ｈｕａｎｇ，Ｌｉｈｕａ（２０１８）：Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ Ｓｔｅｅｌ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ｉｎ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｐｌａｃｅｂｏ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：ＰＤＡ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７２（２）、Ｓ．１６３－１７５．ＤＯＩ：１０．５７３１／ｐｄａｊｐｓｔ．２０１７．００８２８４．
Ｇｒａｆ，Ｔｏｂｉａｓ；Ａｂｓｔｉｅｎｓ，Ｋａｔｈｒｉｎ；Ｗｅｄｅｋｉｎｄ，Ｆｒａｎｋ；Ｅｌｇｅｒ，Ｃａｒｓｔｅｎ；Ｈａｉｎｄｌ，Ｍａｒｋｕｓ；Ｗｕｒｔｈ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ；Ｌｅｉｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ（２０２０）：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ－Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｎ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ｔｉｍｅ．Ｉｎ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １５２、Ｓ．３１８－３２６．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｂ．２０２０．０５．０１７．
Ｈａｌｌ，Ｔｒｏｉｉ；Ｓａｎｄｅｆｕｒ，Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ Ｌ．；Ｆｒｙｅ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｃ．；Ｔｕｌｅｙ，Ｔａｍｍｙ Ｌ．；Ｈｕａｎｇ，Ｌｉｈｕａ（２０１６）：Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｒｏｕｐ ＸＶ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ Ｉｓｏｍｅｒ Ｘ１ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０５（５）、Ｓ．１６３３－１６４２．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０１６．０２．０２２．
Ｈｅｗｉｔｔ，Ｄａｎｉｅｌ；Ｚｈａｎｇ，Ｔａｙｌｏｒ；Ｋａｏ，Ｙｕｎｇ－Ｈｓｉａｎｇ（２００８）：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ａ １２１５（１－２）、Ｓ．１５６－１６０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｒｏｍａ．２００８．１１．０１７．
Ｈｏｎｅｍａｎｎ，Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎ Ｎ．；Ｗｅｎｄｌｅｒ，Ｊａｎ；Ｇｒａｆ，Ｔｏｂｉａｓ；Ｂａｔｈｋｅ，Ａｎｊａ；Ｂｅｌｌ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈ．（２０１９）：Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ＱＣ－ｒｅａｄｙ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｂ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１１６，Ｓ．１－８．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｈｒｏｍｂ．２０１９．０３．０３０．
Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｒａｖｕｒｉ Ｓ．Ｋ．；Ｋｉｅｓｅ，Ｓｙｌｖｉａ；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓｔｅｆａｎ；Ｐａｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ａｓｔｒｉｄ；Ｇｒａｕｓｃｈｏｐｆ，Ｕｌｌａ；Ｍａｈｌｅｒ，Ｈａｎｎｓ－Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ（２０１１ａ）：Ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（５）、Ｓ．１１９４－１２１０．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１０９５－０１１－０３８５－ｘ．
Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｒａｖｕｒｉ Ｓ．Ｋ．；Ｐａｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ａｓｔｒｉｄ；Ｄａｕｐｈｉｎ，Ｉｓａｂｅｌｌｅ Ｂａｕｅｒ；Ｒｏｓｓ，Ａｌｆｒｅｄ；Ｂｕｅｒｇｉ，Ｂｅａｔｒｉｃｅ；Ｓｔａｅｍｐｆｌｉ，Ａｎｄｒｅａｓ；Ｍａｈｌｅｒ，Ｈａｎｎｓ－Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ（２０１１ｂ）：Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０：ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅｒｍａｌ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １００（２）、Ｓ．７２１－７３１．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｐｓ．２２２９０．
Ｋｒａｎｚ，Ｗｅｎｄｅｌｉｎ；Ｗｕｃｈｎｅｒ，Ｋｌａｕｓ；Ｃｏｒｒａｄｉｎｉ，Ｅｌｅｏｎｏｒａ；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍｉｃｈｅｌｌｅ；Ｈａｗｅ，Ａｎｄｒｅａ（２０１９）：Ｆａｃｔｏｒｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ’ｓ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０８（６）、Ｓ．２０２２－２０３２．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０１９．０１．００６．
Ｌａｂｒｅｎｚ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｒ．（２０１４）：Ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ｉｎ ｍＡｂ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｚｅｄ ｒｉｓｋ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｉｎ ｍＡｂ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０３（８）、Ｓ．２２６８－２２７７．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｐｓ．２４０５４．
Ｌｉｐｐｏｌｄ，Ｓｔｅｆｆｅｎ；Ｋｏｓｈａｒｉ，Ｓｔｉｊｎ Ｈ．Ｓ．；Ｋｏｐｆ，Ｒｏｂｅｒｔ；Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，Ｒｕｄｏｌｆ；Ｂｕｃｋｅｌ，Ｔｈｏｍａｓ；Ｚａｒｒａｇａ，Ｉｓｉｄｒｏ Ｅ．；Ｋｏｅｈｎ，Ｈｅｎｎｉｎｇ（２０１７）：Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｍｏｎｏ－ａｎｄ ｐｏｌｙ－ｅｓｔｅｒ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ ＨＰＬＣ－ＣＡＤ／ＥＬＳＤ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｅｌｌｅ ａｓｓａｙ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ １３２、Ｓ．２４－３４．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｂａ．２０１６．０９．０３３．
ＭｃＳｈａｎ，Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．；Ｋｅｉ，Ｐｅｒｖｉｎａ；Ｊｉ，Ｊｕｎｙａｎ Ａ．；Ｋｉｍ，Ｄａｎｉｅｌ Ｃ．；Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｊｏｈｎ（２０１６）：Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ａｎｄ ８０ ｂｙ ａ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｉｎ：ＰＤＡ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７０（４）、Ｓ．３３２－３４５．ＤＯＩ：１０．５７３１／ｐｄａｊｐｓｔ．２０１５．００５９４２．
Ｐａｎｃｈａｌ，Ｊａｉｎｉｋ；Ｋｏｔａｒｅｋ，Ｊｏｓｅｐｈ；Ｍａｒｓｚａｌ，Ｅｗａ；Ｔｏｐｐ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｍ．（２０１４）：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）ａｎｄ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｍａｓｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ＲＭＭ）．Ｉｎ：Ｔｈｅ ＡＡＰＳ ｊｏｕｒｎａｌ １６（３）、Ｓ．４４０－４５１．ＤＯＩ：１０．１２０８／ｓ１２２４８－０１４－９５７９－６．
Ｙａｒｂｒｏｕｇｈ，Ｍｅｌｉｓｓａ；Ｈｏｄｇｅ，Ｔａｍａｒａ；Ｍｅｎａｒｄ，Ｄａｎｉｅｌｅ；Ｊｅｒｏｍｅ，Ｒｉｃｈａｒｄ；Ｒｙｃｚｅｋ，Ｊｅｆｆ；Ｍｏｏｒｅ，Ｄａｖｉｄら（２０１９）：Ｅｄｅｔａｔｅ Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ａｓ ａ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０８（４）、Ｓ．１６３１－１６３５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｘｐｈｓ．２０１８．１１．０３１．
Ｚｈｏｕ，Ｓｈｕｘｉａ；Ｓｃｈｏｎｅｉｃｈ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ；Ｓｉｎｇｈ，Ｓａｔｉｓｈ Ｋ．（２０１１）：Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｌｅａｃｈａｂｌｅｓ ｆｒｏｍ ｓｔａｉｎｌｅｓｓ ｓｔｅｅｌ．Ｉｎ：ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ １２（１）、Ｓ．４１１－４２１．ＤＯＩ：１０．１２０８／ｓ１２２４９－０１１－９５９２－３．

Claims (13)

1. 薬学的に許容され得る賦形剤、例えば緩衝剤、抗酸化剤を含む安定剤と一緒に、タンパク質を含み、かつ少なくとも１種類のキレート剤をさらに含む、安定な水性組成物。
2. 前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ’－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ’－エチレンジグリシン（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ジヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、１，３－ジアミノプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＰＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－グルタミン酸四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、シトレート、マロネート、タルトレート、アスコルベート、サリチル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸の群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）である、請求項２に記載の組成物。
4. 前記キレート剤が０．０００５～２．０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記タンパク質が抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 医薬の製造、特に、安定な非経口タンパク質調製物または安定な非経口抗体調製物の製造のためのキレート剤の使用。
7. 非経口タンパク質調製物または抗体調製物の製造のためのキレート剤の使用であって、前記非経口タンパク質調製物または抗体調製物が、それらの認可された貯蔵寿命の全期間にわたって可視粒子を含まないままであることを特徴とする、キレート剤の使用。
8. 非経口タンパク質調製物または抗体調製物における可視粒子の形成を防止するためのキレート剤の使用。
9. 前記キレート剤が、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ’－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ’－エチレンジグリシン（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ジヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＨＡ）、１，３－ジアミノプロパン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’－四酢酸（ＰＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）－Ｌ－グルタミン酸四ナトリウム（ＧＬＤＡ）、シトレート、マロネート、タルトレート、アスコルベート、サリチル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡまたはペンテト酸）から選択され、かつ０．０００５～２．０％の範囲の濃度で存在する、請求項６～８のいずれか一項に記載のキレート剤の使用。
10. 前記キレート剤がＥＤＴＡまたはＤＴＰＡである、請求項９に記載のキレート剤の使用。
11. 前記可視粒子が、少なくとも１種類の多価カチオンと、前記非経口タンパク質調製物中に存在する界面活性剤、例えばＰＳ２０およびＰＳ８０から切断された遊離脂肪酸とを含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載のキレート剤の使用。
12. 請求項１～５のいずれか一項に記載の調製物を、または請求項６～１１のいずれか一項に記載のキレート剤を使用して得られる調製物を容器中に含む、医薬剤形。
13. 本明細書に実質的に記載のとおりの新規な組成物、方法、および使用。

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