JP2023518420A

JP2023518420A - コロナウイルス遺伝子を標的とするための遺伝子サイレンシング剤およびその使用

Info

Publication number: JP2023518420A
Application number: JP2022556044A
Authority: JP
Inventors: チャンジェイ．リー，; シャンガオスン，; チャールズリー，; ピンピンピータークアン，
Original assignee: １グローブヘルスインスティテュートエルエルシー
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2023-05-01
Also published as: EP4121119A4; WO2021188841A2; EP4121119A2; CN115884796A; WO2021188841A9; US20230138103A1

Abstract

本発明は、コロナウイルス遺伝子（複数可）、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の発現をインビトロおよびインビボの両方でサイレンシングすることができる遺伝子サイレンシング剤を提供する。本発明はさらに、例えばＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス感染症に関連する症状を管理または処置するための、研究または治療目的のため、対象、例えばヒトなどの哺乳動物における特定のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質レベルまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価を低下させるために使用することができる、一般的および特定の組成物ならびにそのような組成物を使用する方法を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年３月１８日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６２／９９１，５８０号および２０２０年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０９２，８０１号に基づく優先権および利益を主張し、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。

技術分野
本発明は一般には、コロナウイルス（ＣｏＶ）遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を標的とする際に使用するための遺伝子サイレンシング剤、ならびにそのような遺伝子サイレンシング剤を使用して、インビトロおよびインビボの両方でコロナウイルスタンパク質レベルまたはウイルス力価を低下させる方法、ならびにコロナウイルス感染症（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を有する対象を処置する方法、またはコロナウイルス感染症を予防する方法の分野に関する。

発明の背景
近年世界を支配しているＣＯＶＩＤ－１９は、２０１２年に中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こし、２００３年に重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こした無数の一本鎖ＲＮＡに属しており、これらはいずれも動物起源からヒトに伝染したものであるが、この重症呼吸器感染症（Ｚｈｕ，Ｎ．，２０１９）には緊急の医療的解決が必要である。

ＣＯＶＩＤ－１９は患者の８１％にとって軽度であり、症例全体の致死率は２～３％である。疾患の重症度は年齢と関連しているようであり、高齢者は主にリスクがある。８０歳以上の者の致死率（ＣＦＲ）は１５％である。ＣＦＲはまた、心血管、糖尿病、慢性呼吸器疾患、高血圧および癌を含む併存症を有する者においても増加する。死因は、呼吸不全、ショックまたは多臓器不全宿主（ＦｉｓｈｅｒおよびＨｅｙｍａｎｎ、２０２０）である。

現時点で大部分の患者においてＣｏＶ複製を阻害できる特異的治療法は証明されていない。遺伝子サイレンシング技術は、ＡＳＯ（一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）およびＲＮＡｉ（二本鎖干渉ＲＮＡ）を含む、最も有望な薬物開発技術の１つであると考えられている。遺伝子を標的とする合理的に設計されたａｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯまたは他の遺伝子サイレンシング剤は、ＣｏＶ感染症の処置に有用であり得る。

非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、二本鎖ＲＮＡ分子の一種であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で作動する。それは、転写後にｍＲＮＡを分解し、翻訳を阻むことによって、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨げる（Ｓｕｎ，Ｘら２００８）。ここで強調されるのは、ＲＮＡｉが現在のＣＯＶＩＤ－１９のアウトブレイクの管理における有望なアプローチであり得るということである。現在のところ、進行型ＣＯＶＩＤ－１９に利用可能な特定の処置選択肢はない。新興ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの伝播を制限し、最終的にはＣＯＶＩＤ－１９疾患の集団伝播を制御すべきであるが、死亡を予防し、罹患率を緩和するために、既にＣＯＶＩＤ－１９疾患を発症した人のための治療薬に対する緊急の満たされていない医学的必要性がある。ウイルス標的小分子の設計には、標的部位に到達する能力を有する許容され得るレベルの生物学的機能を有するリード分子を最適化するのに数年かかるという欠点がある（Ｋｕｎｉｓａｋｉ，Ｋ．Ｍ．，２００９およびＨｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．，２０２０）。また、プロテアーゼ阻害剤／ヌクレオシド類似体およびワクチンなどの有効な小分子治療薬を開発するために、研究者はウイルスの構造的および機能的側面を知る必要がある（Ｌｕ，Ｈ．，２０２０）。上記の選択肢によってもたらされる制約は、薬になり得ない標的（Ｌｅｖａｎｏｖａ，Ａ．，２０１８およびＬａｍ，Ｊ．Ｋ．，２０１５）を標的とすることができるａｉＲＮＡを使用することによって克服することができ、高度な生物情報学ツールを使用してａｉＲＮＡベースの治療薬を迅速かつ正確に設計する本発明者らの能力の点でさらなる利点がある。したがって、ＣｏＶ感染症、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対するａｉＲＮＡなどの有効な遺伝子サイレンシング剤が緊急に必要とされている。

要旨
本発明は、ＣｏＶ遺伝子をインビトロおよびインビボでサイレンシングすることが示されている遺伝子サイレンシング剤を提供する。

一態様では、本発明は、具体的には、ＣｏＶの遺伝子の１つ、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＬ１、３ＣＬ、ＲｄＲｐ（以下、ＰＯＬまたはＰとも呼ばれる）およびヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子に実質的に相補的な少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含む遺伝子サイレンシング剤、より具体的には、図１～図３に提供される標的配列（配列番号１～２１０）のうちの１つに実質的に相補的な１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを含む薬剤を提供する。遺伝子サイレンシング剤は、好ましくは、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、鎖あたり３０ヌクレオチド未満、例えば９～２３ヌクレオチドを有する。

別の態様では、本発明は、図１～図３に提供されるアンチセンス鎖配列（配列番号２１１～４２０）の１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含む遺伝子サイレンシング剤を具体的に提供する。

いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシング剤は好ましくは、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、一本鎖あたり３０ヌクレオチド未満、例えば、９～２３ヌクレオチド、例えば、図１～図３に提供されるもの（ＧＨＩ＿Ｎ１～ＧＨＩ＿Ｎ９６、ＧＨＩ＿Ｐ９７～ＧＨＩ＿Ｐ１６２、ａｉＲＮＡ３ＣＬ＿１～２８およびａｉＲＮＡＰＬＰＲＯ＿１～２０）を有する。二本鎖ＲＮＡｉ剤は、その薬剤のアンチセンス鎖の３’および／または５’末端に平滑末端を有するか、または１～５ヌクレオチドのオーバーハングを有することができる。

一態様では、本発明は二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む二本鎖遺伝子サイレンシング剤を提供し、上記アンチセンス鎖は５’－ＡＡＣＧＡＵＵＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＵＡＧＣ－３’（配列番号２５３）を含み、上記センス鎖は５’－ＡＡＣＡＡＵＧＣＵＧＣＡＡＵＣ－３’（配列番号４６３）を含む。本発明はまた、前述のセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。

一態様では、本発明は遺伝子サイレンシング剤を提供し、遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、上記アンチセンス鎖は５’－ＡＡＣＵＵＵＡＵＣＡＵＵＧＵＡＧＡＵＧＵＣ－３’（配列番号３６５）を含み、上記センス鎖は５’－ＡＵＣＵＡＣＡＡＵＧＡＵＡＡＡ－３’（配列番号５７５）を含む。本発明はまた、前述のセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。

一態様では、本発明は遺伝子サイレンシング剤を提供し、遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、上記アンチセンス鎖は５’－ＡＡＧＣＡＵＵＧＵＵＡＧＣＡＧＧＡＵＵＧＣ－３’（配列番号２２４）を含み、上記センス鎖は５’－ＡＵＣＣＵＧＣＵＡＡＣＡＡＵＧ－３’（配列番号４３４）を含む。本発明はまた、前述のセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。

一態様では、本発明は遺伝子サイレンシング剤を提供し、遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、上記アンチセンス鎖は５’－ＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＧＧＣＣＡＡＵＧＵＵＵ－３’（配列番号２４０）を含み、上記センス鎖は５’－ＣＡＵＵＧＧＣＣＧＣＡＡＡＵＵ－３’（配列番号４５０）を含む。本発明はまた、前述のセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。

一態様では、本発明は遺伝子サイレンシング剤を提供し、遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、上記アンチセンス鎖は５’－ＡＡＵＵＧＵＵＵＧＧＡＧＡＡＡＵＣＡＵＣＣ－３’（配列番号２４５）を含み、上記センス鎖は５’－ＵＧＡＵＵＵＣＵＣＣＡＡＡＣＡ－３’（配列番号４５５）を含む。本発明はまた、前述のセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。

一態様では、本発明は遺伝子サイレンシング剤を提供し、遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、上記アンチセンス鎖は５’－ＡＡＡＣＣＡＧＣＵＡＣＵＵＵＡＵＣＡＵＵＧ－３’（配列番号３６６）を含み、上記センス鎖は５’－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＣＵＧＧ－３’（配列番号５７６）を含む。本発明はまた、前述のセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。

一態様では、本発明は遺伝子サイレンシング剤を提供し、遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、上記アンチセンス鎖は５’－ＡＡＡＵＧＵＧＵＣＡＣＡＡＵＵＡＣＣＵＵＣ－３’（配列番号３５４）を含み、上記センス鎖は５’－ＧＧＵＡＡＵＵＧＵＧＡＣＡＣＡ－３’（配列番号５６４）を含む。本発明はまた、前述のセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。

一態様では、本発明は遺伝子サイレンシング剤を提供し、遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、上記アンチセンス鎖は５’－ＡＡＣＡＧＣＵＧＧＡＣＡＡＵＣＣＵＵＡＡＧ－３’（配列番号３５７）を含み、上記センス鎖は５’－ＡＡＧＧＡＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号５６７）を含む。本発明はまた、前述のセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるセンスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。

上記の任意の態様で提供される遺伝子サイレンシング剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置もしくは予防する、細胞内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の発現を阻害する、細胞内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子をサイレンシングする、細胞内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害する、またはインビトロもしくはインビボでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価を低下させるために使用することができる。

別の態様では、本発明は、本発明によって提供される任意の態様の遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体と、を含む、ＣｏＶ感染症に関連する症状、例えばＣＯＶＩＤ－１９を処置するための医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシング剤は、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤であり、アンチセンス鎖は、図１、図２および図３のヌクレオチド配列（配列番号２１１－４２０）のいずれか１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシング剤は、図１～３に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤（ＧＨＩ＿Ｎ１～ＧＨＩ＿Ｎ９６、ＧＨＩ＿Ｐ９７～ＧＨＩ＿Ｐ１６２、ａｉＲＮＡ３ＣＬ＿１～２８およびａｉＲＮＡＰＬＰＲＯ＿１～２０）である。特定の実施形態では、遺伝子サイレンシング剤は、ＧＨＩ＿Ｎ４３、ＧＨＩ＿Ｐ１５５、ＧＨＩ＿Ｎ１４、ＧＨＩ＿Ｎ３０、ＧＨＩ＿Ｎ３５、ＧＨＩ＿Ｐ１５６、ＧＨＩ＿Ｐ１４４、ＧＨＩ＿Ｐ１４７、ＧＨＩ＿Ｎ３１、ＧＨＩ＿Ｎ１２、ＧＨＩ＿Ｎ３、ＧＨＩ＿Ｎ９３、ＧＨＩ＿Ｎ１３、ＧＨＩ＿Ｎ３２、ＧＨＩ＿Ｎ２９、ＧＨＩ＿Ｎ７８、ＧＨＩ＿Ｎ３３、ＧＨＩ＿Ｎ３６、ＧＨＩ＿Ｎ９１、ＧＨＩ＿Ｎ３４、ＧＨＩ＿Ｎ２０、ＧＨＩ＿Ｎ７５、ＧＨＩ＿Ｎ９５、ＧＨＩ＿Ｎ４６、ＧＨＩ＿Ｎ１５、ＧＨＩ＿Ｎ４４、ＧＨＩ＿Ｎ９６、ＧＨＩ＿Ｎ８１、ＧＨＩ＿Ｎ５８、ＧＨＩ＿Ｎ８４、ＧＨＩ＿Ｎ８６、ＧＨＩ＿Ｎ６２、ＧＨＩ＿Ｐ１５７、ＧＨＩ＿Ｐ１５８、ＧＨＩ＿Ｐ１５１、ＧＨＩ＿Ｐ１４８、ＧＨＩ＿Ｐ１４５、ＧＨＩ＿Ｐ１５３、ＧＨＩ＿Ｐ１５０、ＧＨＩ＿Ｐ１５９、ＧＨＩ＿Ｐ１４６、ＧＨＩ＿Ｐ１４９、ＧＨＩ＿Ｐ１５４、ＧＨＩ＿Ｐ１５２、ＧＨＩ＿Ｐ１６０、ＧＨＩ＿Ｐ１６１、およびＧＨＩ＿Ｐ１６２から選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤である。

別の態様では、本発明は、ＣｏＶ感染症に関連する症状、例えばＣＯＶＩＤ－１９を処置するための医薬組成物を提供し、医薬組成物は、本発明によって提供される任意の態様の２またはそれを超える遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体と、を含み、各遺伝子サイレンシング剤は、ＣｏＶ遺伝子の異なるセグメントまたは異なるＣｏＶ遺伝子を対象とする。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２つの遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体と、を含み、第１の遺伝子サイレンシング剤はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド遺伝子を標的とし、第２の遺伝子サイレンシング剤はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲｄＲｐ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子サイレンシング剤は、図１に提供されるアンチセンス鎖配列（配列番号２１１～３０６）のうちの１つから３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子サイレンシング剤は、図２に提供されるアンチセンス鎖配列（配列番号３０７～３７２）のうちの１つから３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子サイレンシング剤は、ＧＨＩ＿Ｎ１～ＧＨＩ＿Ｎ９６のいずれか１つから選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤である。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子サイレンシング剤は、ＧＨＩ＿Ｐ９７～ＧＨＩ＿Ｐ１６２のいずれか１つから選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤である。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２つの遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体と、を含み、第１の遺伝子サイレンシング剤は、配列番号２５３、２２４、２４０および２４５からなる群より選択されるアンチセンス鎖配列の１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド遺伝子を標的とし、第２の遺伝子サイレンシング剤は、配列番号３６５、３６６、３５４および３５７からなる群より選択されるアンチセンス鎖配列の１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲｄＲｐ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子サイレンシング剤は、配列番号２５３のアンチセンス鎖配列から３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含み、第２の遺伝子サイレンシング剤は、配列番号３６５のアンチセンス鎖配列から３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含む。

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子サイレンシング剤は、ＧＨＩ＿Ｎ４３、ＧＨＩ＿Ｎ１４、ＧＨＩ＿Ｎ３０、ＧＨＩ＿Ｎ３５、ＧＨＩ＿Ｎ３１、ＧＨＩ＿Ｎ１２、ＧＨＩ＿Ｎ３、ＧＨＩ＿Ｎ９３、ＧＨＩ＿Ｎ１３、ＧＨＩ＿Ｎ３２、ＧＨＩ＿Ｎ２９、ＧＨＩ＿Ｎ７８、ＧＨＩ＿Ｎ３３、ＧＨＩ＿Ｎ３６、ＧＨＩ＿Ｎ９１、ＧＨＩ＿Ｎ３４、ＧＨＩ＿Ｎ２０、ＧＨＩ＿Ｎ７５、ＧＨＩ＿Ｎ９５、ＧＨＩ＿Ｎ４６、ＧＨＩ＿Ｎ１５、ＧＨＩ＿Ｎ４４、ＧＨＩ＿Ｎ９６、ＧＨＩ＿Ｎ８１、ＧＨＩ＿Ｎ５８、ＧＨＩ＿Ｎ８４、ＧＨＩ＿Ｎ８６およびＧＨＩ＿Ｎ６２からなる群のいずれか１つから選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤である。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子サイレンシング剤は、ＧＨＩ＿Ｐ１５５、ＧＨＩ＿Ｐ１５６、ＧＨＩ＿Ｐ１４４、ＧＨＩ＿Ｐ１４７、ＧＨＩ＿Ｐ１５７、ＧＨＩ＿Ｐ１５８、ＧＨＩ＿Ｐ１５１、ＧＨＩ＿Ｐ１４８、ＧＨＩ＿Ｐ１４５、ＧＨＩ＿Ｐ１５３、ＧＨＩ＿Ｐ１５０、ＧＨＩ＿Ｐ１５９、ＧＨＩ＿Ｐ１４６、ＧＨＩ＿Ｐ１４９、ＧＨＩ＿Ｐ１５４、ＧＨＩ＿Ｐ１５２、ＧＨＩ＿Ｐ１６０、ＧＨＩ＿Ｐ１６１およびＧＨＩ＿Ｐ１６２からなる群のいずれか１つから選択される二本鎖ＲＮＡｉ剤である。

一実施形態では、医薬組成物は、２つの遺伝子サイレンシング剤を含み、第１の遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含むａｉＲＮＡ分子であり、上記アンチセンス鎖は、配列番号２５３のアンチセンス鎖配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを含み、上記センス鎖は、配列番号４６３のセンス鎖配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１２個またはそれを超える連続するヌクレオチドを含み、第２の遺伝子サイレンシング剤は、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖と、センス鎖と、を含むａｉＲＮＡ分子であり、上記アンチセンス鎖は、配列番号３６５のアンチセンス鎖配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを含み、上記センス鎖は、配列番号５７５のセンス鎖と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１２個またはそれを超える連続するヌクレオチドを含む。

さらに、本発明によって提供される任意の態様の遺伝子サイレンシング剤は、天然に存在するリボヌクレオチドサブユニットのみを含有することができるか、または薬剤に含まれるリボヌクレオチドサブユニットの１またはそれを超える糖もしくは塩基に対する１またはそれを超える修飾を含有するように合成することができる。一実施形態では、上記の任意の態様で提供される遺伝子サイレンシング剤のアンチセンス鎖および／またはセンス鎖のうちの少なくとも１つのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、上記の任意の態様で提供される遺伝子サイレンシング剤のアンチセンス鎖および／またはセンス鎖のヌクレオチドの実質的にすべてが、修飾ヌクレオチドである。遺伝子サイレンシング剤は、薬剤の安定性、分布または細胞取り込みを改善するように選択される１またはそれを超えるリガンド、部分またはコンジュゲートに結合するようにさらに修飾され得る。遺伝子サイレンシング剤はさらに、単離された形態であってもよく、または本明細書中に記載される方法のために使用される医薬組成物の一部であってもよく、特に、肺もしくは鼻腔への送達のために製剤化されるか、または非経口投与のために製剤化される医薬組成物としてであってもよい。医薬組成物は、１またはそれを超える遺伝子サイレンシング剤を含有することができ、いくつかの実施形態では、それぞれがＣｏＶ遺伝子の異なるセグメントまたは２つの異なるＣｏＶ遺伝子を対象とする２またはそれを超える遺伝子サイレンシング剤を含有する。

本発明はさらに、細胞内のＣｏＶタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のレベルを低下させる方法を提供する。本発明はさらに、対象のＣｏＶ感染症、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法を提供する。そのような方法は、本発明の少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、またはそれを超える）遺伝子サイレンシング剤を対象に投与する工程を含む。本方法は、ＲＮＡ干渉に関与する細胞機構を利用して細胞内のＣｏＶタンパク質レベルを選択的に低下させ、細胞を本発明の少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、またはそれを超える）抗ウイルス遺伝子サイレンシング剤と接触させる工程からなる。そのような方法は、細胞上で直接行われ得るか、または本発明の少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、またはそれを超える）遺伝子サイレンシング剤／医薬組成物を対象に投与することによって哺乳動物対象に対して行われ得る。

本発明の１またはそれを超える実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。本出願は、あらゆる目的のために、引用されたすべての参考文献、特許、および特許出願を参照によりその全体が組み込まれる。

図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のヌクレオカプシド（Ｎ）領域の合理的に設計および選択された標的配列の例示的な配列を、各標的配列の開始ヌクレオチド位置、遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖と共に、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のヌクレオカプシド（Ｎ）領域の合理的に設計および選択された標的配列の例示的な配列を、各標的配列の開始ヌクレオチド位置、遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖と共に、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のヌクレオカプシド（Ｎ）領域の合理的に設計および選択された標的配列の例示的な配列を、各標的配列の開始ヌクレオチド位置、遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖と共に、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のヌクレオカプシド（Ｎ）領域の合理的に設計および選択された標的配列の例示的な配列を、各標的配列の開始ヌクレオチド位置、遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖と共に、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。

図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のＲｄＲｐ領域の合理的に設計および選択された標的配列の例示的な配列を、各標的配列の開始ヌクレオチド位置、遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖と共に、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のＲｄＲｐ領域の合理的に設計および選択された標的配列の例示的な配列を、各標的配列の開始ヌクレオチド位置、遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖と共に、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子のＲｄＲｐ領域の合理的に設計および選択された標的配列の例示的な配列を、各標的配列の開始ヌクレオチド位置、遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖と共に、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。

図３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの３ＣＬおよびＰＬ１遺伝子の合理的に設計および選択された標的配列、ならびに遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖の例示的な配列を、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。図３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの３ＣＬおよびＰＬ１遺伝子の合理的に設計および選択された標的配列、ならびに遺伝子サイレンシング剤の合理的に設計されたアンチセンス鎖、および設計されたアンチセンス鎖に対応する非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）の合理的に設計されたセンス鎖の例示的な配列を、相対発現のインビトロアッセイ結果と共に、示す。

図４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の標的遺伝子領域を示し、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＮ９０８９４７．３の領域５１２３～５９２９、１００５２～１０９８８、１３４６８～１６２３７、２８３７４～２９５３０を、遺伝子サイレンシング剤ターゲティングのために選択した。

図５は、遺伝子サイレンシング剤をスクリーニングするための例示的な全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの標的ＲｄＲｐおよびヌクレオカプシド領域を示す。

図６は、アンチセンス鎖の３’および５’末端に３ヌクレオチドのオーバーハングを有する、１５ｍｅｒのセンス鎖および２１ｍｅｒのアンチセンス鎖を有する１５ｍｅｒの二重鎖ａｉＲＮＡの例示的な一般構造を示す。

図７は、１ｎＭのＨｅＬａ細胞における、ａｉＲＮＡ（ＧＨＩ＿Ｎ１～ＧＨＩ＿Ｎ４８）を標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２候補Ｎからの有効なａｉＲＮＡについての９６ウェルスクリーニングから得られた結果を示す。模擬トランスフェクト対照に対してＬｕｃ／Ｒｌｕｃの比を計算した。

図８は、１ｎＭのＨｅＬａ細胞における、ａｉＲＮＡ（ＧＨＩ＿Ｎ４９～ＧＨＩ＿Ｎ９６）を標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２候補Ｎからの有効なａｉＲＮＡについての９６ウェルスクリーニングから得られた結果を示す。模擬トランスフェクト対照に対してＬｕｃ／Ｒｌｕｃの比を計算した。

図９は、１００ｐＭのＨｅＬａ細胞における、スーパーａｉＲＮＡを標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ由来の有効なａｉＲＮＡについての９６ウェルスクリーニングから得られた結果を示す。模擬トランスフェクト対照に対してＬｕｃ／Ｒｌｕｃの比を計算した。

図１０は、１ｎＭのＨｅＬａ細胞における、ａｉＲＮＡ（ＧＨＩ＿Ｐ９７～ＧＨＩ＿Ｐ１４４）を標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２候補ＲｄＲｐからの有効なａｉＲＮＡについての９６ウェルスクリーニングから得られた結果を示す。模擬トランスフェクト対照に対してＬｕｃ／Ｒｌｕｃの比を計算した。

図１１は、１００ｐＭおよび１０ｐＭのＨｅＬａ細胞において、ａｉＲＮＡ（ＧＨＩ＿Ｐ１４４～ＧＨＩ＿Ｐ１６２）を標的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲｄＲｐからの有効なａｉＲＮＡについて、９６ウェルスクリーニングから得られたさらなるスクリーニング結果を示す。模擬トランスフェクト対照に対してＬｕｃ／Ｒｌｕｃの比を計算した。

図１２は、各試験化合物およびそれらの組み合わせについての用量応答曲線およびＩＣ_５０によるＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス感染症アッセイの結果を示す。トランスフェクションを使用せずに、ａｉＲＮＡを細胞ベースのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２感染症系に添加した。

発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞（ａｃｅｌｌ）」という用語は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。

「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、数値範囲と共に使用される場合、それらの数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、本明細書では、記載された値の上下の数値を２０％、１０％、５％、または１％の分散で修飾するために使用される。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、記載された値の上および下の数値を１０％の分散で修飾するために使用される。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、記載された値の上および下の数値を５％の分散で修飾するために使用される。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、記載された値の上および下の数値を１％の分散で修飾するために使用される。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基部分および糖部分を含む化合物を意味する。ヌクレオシドには、天然に存在するヌクレオシド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシド）および修飾ヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオシドは、例えばヌクレオチドになるようにリン酸部分に連結され得る。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、リン酸連結基をさらに含むヌクレオシドを意味する。

本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ剤またはＡＳＯ剤を含む「遺伝子サイレンシング剤」という用語は、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代用物であり、これらはすべて本明細書に記載されているか、またはＲＮＡ合成技術分野で周知である。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代用物が記載されているが、好ましい例としては、非修飾ＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解に対する耐性が高いものが挙げられる。好ましい例としては、２’糖修飾、１またはそれを超えるリン酸基またはリン酸基の１またはそれを超える類似体を含む５’修飾を有するものが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ剤」という用語は、標的遺伝子、例えばＣｏＶの発現を下方制御することができるＲＮＡ剤である。理論に拘束されることを望むものではないが、ＲＮＡｉ剤は、当技術分野でＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後切断、または転写前もしくは翻訳前機構を含む、１またはそれを超えるいくつかの機構によって作用し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡｉ剤である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡｉ剤」という用語は、鎖間ハイブリダイゼーションが二重鎖構造の領域を形成することができる２本以上、好ましくは２本の鎖を含む、ＲＮＡｉ剤である。本明細書における「鎖」は、ヌクレオチドの連続した配列（天然に生じないヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含む）を指す。２またはそれを超える鎖は、別々の分子であってもよく、もしくはその一部をそれぞれ形成してもよく、またはそれらは、例えばリンカー、例えばポリエチレングリコールリンカーによって共有結合的に相互接続されて、ただ１つの分子を形成してもよい。少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡに十分に相補的な領域を含むことができる。このような鎖は、「アンチセンス鎖」と呼ばれる。アンチセンス鎖に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡｉ剤に含まれる第２の鎖は、「センス鎖」と呼ばれる。しかしながら、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡｉ剤はまた、少なくとも部分的に、自己相補的な、例えば、二重鎖領域を含むヘアピンまたはパンハンドル構造などを、形成する。そのような場合、「鎖」という用語は、同じＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮＡ分子の領域の１つを指す。本明細書で使用される「ａｉＲＮＡ剤」または「ａｉＲＮＡ」および「ｓｉＲＮＡ剤」または「ｓｉＲＮＡ」は、ヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘導しない、例えば３０ヌクレオチド対未満の二重鎖領域を有するほど十分に短いｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡｉ剤を指す。「ａｉＲＮＡ剤」または「ａｉＲＮＡ」は、非対称である２本の鎖を有し、すなわち、薬剤のアンチセンス鎖の３’および／または５’末端の両方に１～５ヌクレオチドのオーバーハングを有するか、またはアンチセンス鎖の５’末端に１つの平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端に１～１０ヌクレオチドの１つのオーバーハングを有する。「ｓｉＲＮＡ剤」または「ｓｉＲＮＡ」は、実質的に対称である２本の鎖を有し、すなわち、薬剤の両３’末端に１～５ヌクレオチドの２つのオーバーハングを有する。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、ａｉＲＮＡ（非対称干渉ＲＮＡ）分子である。

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、複数の連結されたヌクレオシドを含む化合物を指す。特定の実施形態では、１またはそれを超える複数のヌクレオシドが修飾される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１またはそれを超えるリボヌクレオシド（ＲＮＡの場合）および／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡの場合）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの二本鎖干渉ＲＮＡである。

本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」という用語は、少なくとも１つの修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド間結合、および／または修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。

本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオシド」という用語は、少なくとも１つの修飾糖部分および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを意味する。

本明細書で使用される場合、「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。

本明細書で使用される場合、「天然に存在するヌクレオシド間結合」という用語は、３’から５’ホスホジエステル結合を意味する。

本明細書で使用される場合、「修飾されたヌクレオシド間結合」という用語は、天然に存在するヌクレオシド間結合からの置換または任意の変化を指す。例えば、ホスホロチオエート結合は、修飾されたヌクレオシド間結合である。

本明細書で使用される場合、「天然糖部分」という用語は、ＤＮＡ（２－Ｈ）またはＲＮＡ（２－ＯＨ）に見られる糖を意味する。

本明細書で使用される場合、「修飾糖」という用語は、天然糖からの置換または変化を指す。例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。

本明細書で使用される場合、「二環式糖」という用語は、２つの非ジェミナル環原子の架橋によって修飾フロシル環を意味する。二環式糖は、修飾糖である。

本明細書で使用される場合、「修飾核酸塩基」という用語は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、またはウラシル以外の任意の核酸塩基を指す。例えば、５－メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。「非修飾核酸塩基」とは、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。

本明細書で使用される場合、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」、「制御する（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）」およびその文法上の均等物は、（例えば、サイレンシング）増加または減少のいずれか、換言すれば、上方制御または下方制御のいずれかを指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子発現の減少を指し、標的遺伝子の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の遺伝子発現の減少を指し得る。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、特定の処置のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関して本明細書では交換可能に使用される。

本明細書で使用される「処置する」または「処置」または「処置すること」または「緩和する」または「緩和すること」などの用語は、（１）診断された病的症状または障害を治癒する、減速する、その徴候を軽減する、および／またはその進行を停止させる治療的手段と、（２）標的とする病的症状または障害の発症を予防または遅延させる予防的または予防的手段の両方を指す。したがって、処置を必要とする者には、既に障害を有する者、障害を有する傾向がある者、および障害が予防されるべき者が含まれる。患者が以下のうちの１またはそれを超えるものを示す場合、対象は、本発明の方法に従って首尾よく「処置」される。癌細胞の数の減少または癌細胞の完全な非存在；腫瘍サイズの縮小；軟部組織や骨への癌の進展を含む末梢臓器への癌細胞浸潤の阻害または非存在；腫瘍転移の阻害または非存在；腫瘍成長の阻害または非存在；特定の癌に関連する１またはそれを超える徴候の軽減；罹患率および死亡率の低下；および生活の質の改善。

本明細書で使用される場合、「阻害する」、「阻害すること」という用語およびそれらの文法上の均等物は、生物活性の文脈で使用される場合、ウイルスタンパク質またはウイルスｍＲＮＡの産生などの標的機能を低減または排除し得る生物活性の下方制御を指す。特定の実施形態では、阻害は、標的発現の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の減少を指し得る。

本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」または「相補的」という用語は、２つの核酸間の塩基対の二本鎖領域における相補性を指し、末端オーバーハングまたは２つの二本鎖領域間のギャップ領域などのいかなる一本鎖領域でもない。相補性は、完全である必要はなく、例えば、２つの核酸間に任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得る。しかしながら、ミスマッチの数が非常に多く、最もストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件下でさえもハイブリダイゼーションが起こり得ない場合、その配列は実質的に相補的な配列ではない。２つの配列が、本明細書において「実質的に相補的」と称される場合、それは、選択された反応条件下でハイブリダイズするために配列が互いに十分に相補的であることを意味する。特異性を達成するのに十分なハイブリダイゼーションの核酸相補性およびストリンジェンシーの関係は、当技術分野で周知である。２つの実質的に相補的な鎖は、ハイブリダイゼーション条件が、例えば、対合配列と非対合配列との区別を可能にするのに十分である限り、例えば、完全に相補的であり得るか、または１～多くのミスマッチを含み得る。したがって、実質的に相補的な配列は、二本鎖領域において、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％、またはその間の任意の数の塩基対相補性を有する配列を指すことができる。

本明細書で使用される場合、「完全に相補的」または「１００％相補的」は、第１の核酸の核酸塩基配列の各核酸塩基が、第２の核酸の第２の核酸塩基配列に相補的核酸塩基を有することを意味する。ある特定の実施形態では、第１の核酸はアンチセンス鎖であり、第２の核酸は標的核酸である。ある特定の実施形態では、第１の核酸はセンス鎖であり、第２の核酸はアンチセンス鎖である。

本明細書で使用される場合、第２のヌクレオチド配列と比較して第１のヌクレオチド配列を指す場合の「本質的に同一」は、最大１、２または３個のヌクレオチド置換（例えば、ウラシルで置き換えられたアデノシン）を除いて、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列と同一であることを意味する。

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。特定の実施形態では、相補的核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、相補的核酸分子は、アンチセンス鎖および標的核酸を含む。

本明細書で使用される場合、「Ｎ遺伝子」は、標的遺伝子としてのＣｏＶゲノムのヌクレオカプシド領域を意味し、好ましい例は、ＳＡＲＳＣｏＶ－２ゲノムのヌクレオカプシド領域、すなわちＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＮ９０８９４７．３の領域２８３７４－２９５３０である。ヌクレオカプシドは、ＣｏＶ集合において重要な役割を果たす。

本明細書で使用される場合、「ＲｄＲｐ遺伝子」、「ＰＯＬ遺伝子」または「Ｐ遺伝子」は、標的遺伝子としてのＣｏＶゲノムのＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）領域を意味し、好ましい例は、ＳＡＲＳＣｏＶ－２ゲノムの非構造タンパク質１２（Ｎｓｐ１２）、すなわちＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＮ９０８９４７．３の領域１３４６８～１６２３７として知られているＳＡＲＳＣｏＶ－２ゲノムのＲｄＲｐ領域である。ＲｄＲｐは、ＣｏＶ複製において重要な役割を果たす。

本明細書中で使用される場合、「３ＣＬ遺伝子」は、標的遺伝子としてのＣｏＶゲノムの３Ｃ様プロテアーゼ領域を意味し、好ましい例は、ＳＡＲＳＣｏＶ－２ゲノムの３ＣＬ領域、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＮ９０８９４７．３の領域１００５２～１０９８８である。

本明細書中で使用される場合、「ＰＬ１遺伝子」は、標的遺伝子としてのＣｏＶゲノムのパパイン様１プロテアーゼ領域を意味し、好ましい例は、ＳＡＲＳＣｏＶ－２ゲノムのＰＬ１領域、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＮ９０８９４７．３の領域５１２３～５９２９である。

「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「投与」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用される。これらの用語は、本明細書に記載の化合物または医薬組成物を、対象に導入する任意の方法を指し、例えば、化合物を対象に全身的、局所的またはインサイツで導入することを含み得る。したがって、組成物（化合物を含むか否かにかかわらず）から対象において産生される本開示の化合物は、これらの用語に包含される。これらの用語が「全身」または「全身的に」という用語に関連して使用される場合、それらは一般に、血流中の化合物または組成物のインビボでの全身吸収または蓄積、続いて全身への分布を指す。

「有効量」および「治療有効量」という用語は、以下に示すように、疾患処置を含むがこれに限定されない意図された結果に影響を及ぼすのに十分な、本明細書に記載の化合物または医薬組成物の量を指す。いくつかの実施形態では、「治療有効量」は、癌細胞の成長もしくは広がり、腫瘍のサイズもしくは数、ならびに／または癌のレベル、ステージ、進行および／もしくは重症度の他の尺度の検出可能な死滅または阻害に有効な量である。いくつかの実施形態では、「治療有効量」は、全身的、局所的、またはインサイツ（例えば、対象においてインサイツで生成される化合物の量）で投与される量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロまたはインビボ）、または処置される対象および疾患症状、例えば、対象の体重および年齢、疾患症状の重症度、投与様式などに応じて、異なってよく、これらは、当業者によって容易に決定することができる。この用語はまた、標的細胞における特定の応答、例えば、細胞遊走の低下を誘導する用量にも適用される。具体的な用量は、例えば、特定の医薬組成物、対象およびそれらの年齢ならびに既存の健康状態または健康状態に対するリスク、従うべき投薬レジメン、疾患の重症度、他の薬剤と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、投与される組織、およびそれが担持される物理的送達システムに応じて異なり得る。

「医薬組成物」という用語は、対象への投与に適した形態の開示された遺伝子サイレンシング剤を含有する製剤である。一実施形態では、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器上の単一ポンプ、またはバイアルを含む様々な形態のいずれかである。組成物の単位用量中の活性成分の量は、量の効果であり、関与する特定の処置に従って変化する。当業者は、患者の年齢および症状に応じて投与量を日常的に変更させることが必要な場合があることを理解するであろう。投与量はまた、投与経路に依存する。経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内などを含む、様々な経路が企図される。本発明のサイレンシング剤の局所投与または経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が含まれる。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびそのゲノム
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ様コロナウイルスである。これまでに同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に最も近いウイルスは、９６％を超える配列相同性を示す、Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓｂａｔに由来するウイルスである（ＦｉｓｈｅｒおよびＨｅｙｍａｎｎ、２０２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶとわずか７９％相同である（Ｚｈｏｕら、２０２０）。

ＳＡＲＳコロナウイルスのゲノムは、長さ約３０ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡ分子からなる（Ｍａｒｒａら、２００３）。大きなＳＡＲＳ－ＣｏＶＲＮＡゲノムは、構造タンパク質およびアクセサリータンパク質の効率的な翻訳のための８つの３’共末端ネステッドサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ－ｍＲＮＡ）を産生する（Ｍａｓｔｅｒｓ、２００６）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶゲノムの５’２／３は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａおよび１ｂによって発現される２つの大きなレプリカーゼポリタンパク質をコードする。他のコロナウイルスの場合と同様に、ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ｂはわずかに重複しており、ＯＲＦ１ｂはそれ自体の翻訳開始部位を欠いているため、ＯＲＦ１ｂによってコードされるタンパク質は、プログラムされた－１リボソームフレームシフト（－１ＰＲＦ；Ｂａｒａｎｏｖら、２００５）によってＯＲＦ１ａと共に融合タンパク質としてのみ翻訳される。ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ａ／１ｂ融合タンパク質は、ウイルスゲノム複製中に複数の重要な役割を果たす１６個の成熟非構造タンパク質（ｎｓｐ）にタンパク質分解的に切断される（Ｍａｓｔｅｒｓ，２００６）。コロナウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）は、ウイルスゲノム複製に必要なレプリカーゼの重要な構成要素であり（Ｘｕら、２００３）、フレームシフト後に合成されるＯＲＦ１ａ／１ｂタンパク質の最初の部分であるので、－１ＰＲＦは、ＣｏＶゲノム複製に必須であると考えられている。

ＣｏＶは、エンドソーム経路および／または細胞表面非エンドソーム経路を使用して宿主細胞に入る。ＣｏＶは、宿主細胞内でばらばらになり、ヌクレオカプシドおよびウイルスＲＮＡを細胞質に放出し、その後、ＯＲＦ１ａ／ｂがポリタンパク質１ａ（ｐｐ１ａ）および１ａｂ（ｐｐ１ａｂ）に翻訳され、ゲノムＲＮＡが複製される（Ｃｈａｎら、２０１５）。次いで、サブゲノムｍＲＮＡを合成し、翻訳して、構造タンパク質およびアクセサリータンパク質を産生する（ｖａｎＢｏｈｅｅｍｅｎ、２０１２）。ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）とゲノムＲＮＡの集合によって形成されたらせん状ヌクレオカプシドは、次いで表面タンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、および膜タンパク質（Ｍ）と相互作用して、集合したビリオンを形成する（Ｃｈａｎら、２０１５）。ビリオンは、エキソサイトーシスによって最終的に細胞外区画に放出され、ウイルス複製サイクルが繰り返される（Ｃｈａｎら、２０１５）。

遺伝子サイレンシング剤の設計および選択
本発明は、インビトロでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子の標的遺伝子サイレンシングの実証に基づいている。これらの結果に基づいて、本発明は、ウイルス感染症、特にＣｏＶおよび特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の処置に使用することができる遺伝子サイレンシング剤を単離された形態で医薬組成物として具体的に提供する。

本発明の遺伝子サイレンシング剤は、ＣｏＶゲノム、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム中の最も保存されたドメインである領域を標的とし、標的部位で起こる可能性のある変異を可能な限り回避するように設計されている。さらに、本発明の遺伝子サイレンシング剤は、ＣｏＶの生活環の重要な工程、例えばアセンブルおよび複製を阻害するように設計されている。最近のＣｏｖｉｄ１９ウイルス調査は、ヌクレオカプシド（Ｎ）領域およびＲｄＲｐ（Ｐ）領域がＳタンパク質などの他よりも変異率が低いことを示している。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子サイレンシング剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド（Ｎ）領域およびＲｄＲｐ領域を標的とするように設計されている。

そのような薬剤は、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子配列、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＬ１、３ＣＬ、ＲｄＲｐおよびＮ遺伝子配列、より具体的には図１～図３に提供される標的配列（配列番号１～２１０）に実質的に相補的な少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡｉ剤であり得る。

本発明は、上記で定義したように、ＣｏＶ由来の遺伝子、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＬ１、３ＣＬ、ＲｄＲｐおよびＮ遺伝子の少なくとも一部に実質的に相補的な、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドの配列を含むアンチセンス鎖を含む遺伝子サイレンシング剤を提供する。ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡおよびａｉＲＮＡを含む遺伝子サイレンシング剤の例示的なアンチセンス鎖は、図１～図３に提供される設計アンチセンス鎖（配列番号２１１－４２０）のうちの１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを含む。

遺伝子サイレンシング剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子配列に実質的に相補的な少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖配列に実質的に相補的な少なくとも１２個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡｉ剤である。特に有用な薬剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＬ１、３ＣＬ、ＲｄＲｐおよびＮ遺伝子由来の配列、より具体的には、図１～３に提供される標的配列からなるか、本質的になるか、またはそれらに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡｉ剤である。

本発明のｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、図１～図３で活性であることが示されているｄｓＲＮＡｉ剤のうちの１つに由来する少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドに基づいており、それらを含む。そのような薬剤では、薬剤のアンチセンス鎖は、図１～３に提供されるアンチセンス鎖配列全体からなるか、本質的になるか、もしくはそれらを含むことができるか、または標的遺伝子の連続領域と相補的な追加のヌクレオチドと共に図１～３に提供される１５個またはそれを超える連続残基を含むことができる。ｄｓＲＮＡｉ剤は、配列情報および所望の特性ならびに図１～図３において提供される情報に基づいて合理的に設計することができる。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤は、図１～図３に提供される薬剤の配列に従って、ならびに標的遺伝子のコード配列全体を考慮して、設計することができる。

したがって、本発明は、ＣｏＶ由来の遺伝子、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰＬ１、３ＣＬ、ＲｄＲｐおよびＮ遺伝子を標的とする少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの配列をそれぞれ含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡｉ剤を提供する。例示的なｄｓＲＮＡｉ剤には、図１～図３に提供される薬剤のうちの１つから１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを含むものが含まれる。

特定の実施形態では、遺伝子サイレンシング剤のアンチセンス鎖は、１０～３０ヌクレオチド長である。換言すれば、アンチセンス鎖は、１０個～３０個の連結された核酸塩基である。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、８個～１００個、１０個～８０個、１０個～５０個、１０個～３０個、１２個～５０個、１２個～３０個、１４個～３０個、１４個～２７個、１５個～２３個、１６個～２３個、１９個～２３個または２１個の連結された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定のこのような実施形態では、アンチセンス鎖は、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個、または上記の値のいずれか２つによって定義される範囲の連結された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。

ある特定の実施形態では、遺伝子サイレンシング剤のセンス鎖は、９ヌクレオチド～３０ヌクレオチド長である。言い換えれば、センス鎖は、９から３０個の連結された核酸塩基である。他の実施形態では、センス鎖は、８～１００個、１０～８０個、１０～５０個、１０～３０個、１２～５０個、１２～３０個、１２～２０個、１２～１７個、１４～３０個、１４～２０個、１４～１７個、１５～２３個、１５～１６個または１５個の連結された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定のこのような実施形態では、センス鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の連結された核酸塩基長からなる修飾オリゴヌクレオチド、または上記の値のいずれか２つによって定義される範囲を含む。

一定の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤がａｉＲＮＡ分子である。典型的には、ａｉＲＮＡ剤は、より短いセンス鎖およびより長いアンチセンス鎖を有する短いＲＮＡ二重鎖を含み、二重鎖はアンチセンス鎖の３’および／または５’末端にオーバーハングを含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドからの３’オーバーハングおよび１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドからの５’オーバーハングを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドからの３’オーバーハングおよび５’平滑末端を有する。さらに別の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドからの５’オーバーハングおよび３’平滑末端を有する。

特定の構成では、ａｉＲＮＡは修飾ヌクレオチドを含む。修飾されたａｉＲＮＡは、標的遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を保持しながら、対応する非修飾ａｉＲＮＡ配列と比較して、分解に対してより耐性であり、免疫応答を誘発する可能性が低い。さらに、そのような修飾は、非修飾ａｉＲＮＡの使用に関連する非常に低いサイトカイン誘導、毒性、およびオフターゲット効果を伴う治療的に実行可能なａｉＲＮＡ用量での遺伝子サイレンシングを可能にする。いくつかの構成では、修飾ａｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ－ウリジン、２’ＯＭｅ－アデノシン、２’ＯＭｅ－グアノシンおよび／または２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドなどの少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）プリンまたはピリミジンヌクレオチドを含有する。いくつかの構成では、修飾ａｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドを含有する。修飾ヌクレオチドは、ａｉＲＮＡの一方の鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス）または両方の鎖に存在し得る。

特定の構成では、アンチセンス鎖の３’および／または５’末端にオーバーハングを有する様々な長さ（例えば、９～２３、１４～２１、１５～１９、１５～２１、１４～１９または１４～２０塩基対、より典型的には、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３塩基対）のａｉＲＮＡ二重鎖が設計され得る。ある特定の場合において、ａｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、約９～２３、１４～２１、１５～１９、１５～２１、１４～１９または１４～２０ヌクレオチド長であり、より典型的には、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド長である。特定の他の例では、ａｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、約１５～５０、１５～４０、または１５～３０ヌクレオチド長、より典型的には約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５、または１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド長、好ましくは約１９～２３ヌクレオチド長である。

特定の構成では、本発明は、ヌクレオカプシド領域（２８３７４－２９５３０）、ＲｄＲｐ（Ｐ）領域（１３４６８－１６２３７）、３ＣＬ領域（１００５２－１０９８８）およびＰＬ１領域（５１２３－５９２９）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの４つの領域を標的とし、特にヌクレオカプシド（Ｎ）領域およびＲｄＲｐ領域を標的とする、１５ｍｅｒのセンス鎖（ｓｓ）および２１ｍｅｒのアンチセンス鎖（ａｓ）を含む設計されたａｉＲＮＡ二重鎖を提供する。

いくつかの構成では、５’アンチセンスオーバーハングは、１個、２個、３個またはそれを超える非標的ヌクレオチド（例えば、ＡＡ、ＵＵ、ｄＴｄＴなど）を含む。他の構成では、３’アンチセンスオーバーハングは、１個、２個、３個またはそれを超える非標的ヌクレオチド（例えば、ＡＡ、ｄＴｄＴなど）を含む。特定の構成では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドに隣接する第１のヌクレオチドは、「ＡＡ」モチーフ、「ＵＵ」モチーフ、「ＣＣ」モチーフ、「ＡＵ」モチーフ、「ＡＣ」モチーフ、「ＵＡ」モチーフ、「ＵＣ」モチーフ、または「ＣＡ」モチーフ、または「ｄＴｄＴ」モチーフである。好ましい構成では、５’末端ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに隣接する第１のヌクレオチドは、「ＡＡ」モチーフを含む。いくつかの構成では、３’末端のアンチセンス鎖の最後のヌクレオチドは、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣリボヌクレオチドからなる。

いくつかの構成では、遺伝子サイレンシング剤分子は、例えば二本鎖領域および／または一本鎖領域に１またはそれを超える修飾ヌクレオチドを含み得る。典型的には、これらの修飾には、デオキシリボヌクレオシド、２’ＯＭｅヌクレオチド（例えば、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－アデノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドまたは２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチドなど）、２’－フッ素ヌクレオチド（２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド）、２；－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡ、ｃＥｔモルホリンおよび／またはホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）またはチオホスホルアミダートヌクレオシド間結合、および／または５’－ＭｅＣヌクレオチドが含まれる。

いくつかの構成において、遺伝子サイレンシング剤は、薬剤の安定性、分布または細胞取り込みを改善するように選択される１またはそれを超えるリガンド、部分またはコンジュゲートに結合するようにさらに修飾され得る。そのような部分には、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれる遺伝子サイレンシング剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばそのようなリガンドを欠く種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞型、区画、例えば細胞または器官区画、組織、器官または身体の領域に対する増強された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸における二重鎖対形成に関与しないであろう。リガンドは、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）、糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミンまたはヒアルロン酸）、または脂質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸などの組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸が、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、疑ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリカルペプチドが挙げられる。いくつかの構成では、リガンド、部分またはコンジュゲートは、当業者に公知の任意のリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートすることができる。いくつかの構成では、リガンド、部分またはコンジュゲートは、当業者に公知の任意のリンカーを介してセンス鎖の５’末端にコンジュゲートすることができる。いくつかの構成では、リガンド、部分またはコンジュゲートは、任意のそのようなリンカーを介してアンチセンス鎖の３’末端にコンジュゲートすることができる。いくつかの構成では、リガンド、部分またはコンジュゲートは、任意のそのようなリンカーを介してアンチセンス鎖の５’末端にコンジュゲートすることができる。

いくつかの構成では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、２０～７０％の全ＧＣ含有量を含む。さらなる実施形態では、ＧＣ含有量は５０％未満、または好ましくは３０～５０％である。

適切なａｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ／ＡＳＯ配列は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して設計、選択、合成、および修飾することができる。

ａ）ａｉＲＮＡ配列の設計および選択
リードａｉＲＮＡ配列を生成し、カスタム生物情報ベースの手法によってランク付けした。すべての可能なａｉＲＮＡ標的配列のリストは、ＮＣＢＩに見出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡ転写物配列をすべての可能な１９塩基対の標的配列に分割することによって生成した。次いで、多型配列の標的化を回避するために、配列の相違の領域を除去した。配列中のＧＣ含有量が過度に高いと、熱力学的安定性が高いために巻き戻しが困難になる可能性があり、一方、ＧＣ含有量が過度に低いと、標的配列への結合が減少する可能性がある。そのようなものとして、それぞれ７０％超または２５％未満によって定義されるような、過度に高いまたは低いＧＣ含有量を有する配列を除去した。（ＧＣ含有量は、標的配列中のグアニン塩基およびシトシン塩基のパーセンテージとして計算される）。４またはそれを超える連続する同一の塩基（例えば、ＡＡＡＡ、ＴＴＴＴ、ＣＣＣＣ、ＧＧＧＧ）を有する配列も、これらが適切にアニールする可能性が低いため、除去した。残りの配列を、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現をサイレンシングする能力についてスクリーニングし、以前に見出された高い有効性配列に関連するパターンの存在によって決定される有効性の可能性が最も高い配列から始めた。

特定の実施形態では、遺伝子サイレンシング剤は、配列番号２１１～４２０の配列のうちの１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有する配列からなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２１１～４２０の配列のうちの１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを有する配列からなる、それらから本質的になる、またはそれらを含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号２１１～４２０から選択される配列からなる、それらから本質的になる、またはそれらを含む。

ｂ）ａｉＲＮＡ分子の生成
ａｉＲＮＡは、典型的には、ホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１）を用いた固相化学合成によって生成される。しかし、ａｉＲＮＡ分子を構成する個々のオリゴヌクレオチドは、液相または固相ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスファイトトリエステル、またはＨ－ホスホネート化学（Ｒｅｅｓｅら、２００５）を含む、オリゴヌクレオチド合成のための文献に記載される任意の様々な技術によって合成することができる。標準的なオリゴヌクレオチド合成は、５’末端のジメトキシトリチルおよび複素環塩基上のベンゾイル、イソブチリルまたはアセチルなどの一般的な核酸保護基を利用する。さらに、インビボでの適用のためのａｉＲＮＡ合成は、血清安定性を改善し、オフターゲット効果を減少させる化学修飾、例えば糖骨格への２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ修飾を組み込むことが多い（Ｂｅｈｌｋｅ２００９）。Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）のＭｅｒｍａｄｅシリーズなどのコンピュータ制御自動オリゴヌクレオチド合成機は、ａｉＲＮＡ分子（Ｒａｙｎｅｒら、１９９８）のハイスループット生産に使用することができる。ａｉＲＮＡは、０．２μｍｏｌまたは１．０μｍｏｌスケールでこれらおよび類似の装置で合成することができるが、より大規模および小規模の合成も可能である。ＲＮＡ合成、脱保護および精製に適した試薬は、様々な製造業者から市販されている。これらのプロセスの標準的なプロトコルは、文献で容易に入手可能であり、および／または製造業者から直接入手可能である。

候補ＲＮＡｉ剤の評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ａｉＲＮＡのスクリーニング
特定のメッセンジャーＲＮＡ内のすべての配列が、ＲＮＡ干渉の適切な標的であるとは限らない。例えば、メッセンジャーＲＮＡ分子の二次構造が、ＲＮＡ干渉の必須の工程であるアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションを妨げることができることは周知である。ａｉＲＮＡの選択をガイドするために独自のアルゴリズムが採用された（「ａｉＲＮＡ配列の設計および選択」の章を参照）。その後、ａｉＲＮＡの有効性をインビトロアッセイで検証した。

インビトロでａｉＲＮＡの有効性を試験するために、ａｉＲＮＡを、ＧＯＩを発現する細胞に送達することができる。次いで細胞によって取り込まれるリポソームへのａｉＲＮＡの封入などの当技術分野で周知の方法を使用して、ａｉＲＮＡを送達することができる。続いて、空のリポソームまたは非特異的なａｉＲＮＡ（例えば、ＧＯＩを標的としないａｉＲＮＡ）を受けた細胞におけるＧＯＩの発現レベルを、特異的なａｉＲＮＡを受けた細胞におけるＧＯＩの発現と比較することによって、特異的なａｉＲＮＡがＧＯＩを抑制する有効性を評価することができる。ＧＯＩの発現は、ＲＮＡの定量的ＰＣＲ、およびタンパク質の免疫ブロットまたはＥＬＩＳＡなどの当技術分野で周知の技術を使用して、ＲＮＡおよびタンパク質レベルで研究することができる。

二重鎖ａｉＲＮＡの合成

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の予測ｍＲＮＡ配列からのａｉＲＮＡの選択をガイドする独自のアルゴリズムを採用する。選択された候補ａｉＲＮＡを示す（図１～図３参照）。候補ａｉＲＮＡ（１５ｍｅｒＳＳおよび２１ｍｅｒＡＳ）は、ノーウッドの１ＧｌｏｂｅＨｅａｌｔｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅのバイオオートメーション合成機によってホスホラミダイト化学を使用して合成した。標準的なアニールプロトコルに従って、ａｉＲＮＡ二重鎖を調製した。ａｉＲＮＡアニーリングをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。

ＳＡＲＳＣｏＶ－２遺伝子の発現を効率的に抑制するａｉＲＮＡを同定するために、本発明者らは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現する標準的なレポーターベクターに関連ウイルス配列（公知のＳＡＲＳＣｏＶ－２ゲノムに基づく、図４および図５）をサブクローニングした。次いで、本発明者らは、関連する組換えベクターおよび各ａｉＲＮＡの両方を哺乳動物細胞に送達し、次いで、特異的なａｉＲＮＡを受けた細胞におけるレポーター（ルシフェラーゼ）の発現を対照細胞（模擬トランスフェクト細胞）におけるレポーター発現と比較することによって、数百のａｉＲＮＡをスクリーニングした。様々な濃度でａｉＲＮＡをスクリーニングし、ＩＣ_５０濃度を決定するために最も有効なものを選択した。スクリーニングされたａｉＲＮＡおよびスクリーニング結果のリストを図１～図３および図７～図１１に示す。

実施例１：哺乳動物細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子発現をサイレンシングするすべての候補ａｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲｌｕｃ）遺伝子の合成バージョンおよび合成ホタルルシフェラーゼ（ｈｌｕｃ）を含むＤｕａｌ－ルシフェラーゼＣＯＶＩＤ－１９レポーター（ＤＬＲ）プラスミドｐｓｉＣＨＥＣＫ２／ＰＬ１、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２／３ＣＬ、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２／ＲｄＲｐ（Ｐ）およびｐｓｉＣＨＥＣＫ２／ヌクレオカプシド（Ｎ）を構築して、ＣＯＶＩＤ－１９ａｉＲＮＡの活性を試験した。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＭＮ９０８９４７．３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列領域ＰＬ１（５１２３－５９２９）３ＣＬ（１００５２－１０９８８）、ＲｄＲｐ（１３４６８－１６２３７）およびＮ（２８３７４－２９５３０）（図４参照）を連結し、両端に制限部位を付加した後、この配列を化学合成し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２Ｄｕａｌ－ルシフェラーゼベクターにサブクローニングした。

ＨｅＬａ細胞を、ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。センスおよびアンチセンスａｉＲＮＡ鎖をＭｅｒｍａｄｅ１９２オリゴヌクレオチド合成機で化学合成した。ＨｅＬａ細胞を１００００細胞／ウェルで９６ウェル培養プレートにプレーティングした。２４時間後、これらの細胞にレポータープラスミドＤＮＡおよび様々な濃度のＣＯＶＩＤ－１９ａｉＲＮＡ（１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ）、非特異的ｓｉＲＮＡ（陰性対照）を同時トランスフェクトするか、またはリポフェクタミン２０００試薬を使用して模擬トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、Ｄｕａｌ－ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍによって、ＣＯＶＩＤ－１９遺伝子発現に対する各ａｉＲＮＡの効果を決定した。スクリーニング結果を図１～図３に示す。

実施例２：哺乳動物細胞におけるａｉＲＮＡを標的とするＮ（ＧＨＩ＿Ｎ１～ＧＨＩ＿Ｎ９６）およびａｉＲＮＡを標的とするＲｄＲｐ（ＧＨＩ＿Ｐ９７～ＧＨＩ＿Ｐ１６２）のインビトロスクリーニング
Ｄｕａｌ－ルシフェラーゼレポーター（ＤＬＲ）システムの構築

ｐｓｉＣｈｅｃｋ－２／ヌクレオカプシド（Ｎ）およびｐｓｉＣｈｅｃｋ－２／ＲｄＲｐ（Ｐ）を含む２つのＤＬＲレポータープラスミドを構築した。簡単に記載すると、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＭＮ９０８９４７．３（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離体Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）から、標的領域ＲｄＲｐ（１３４６８－１６２３７）およびＮ（２８３７４－２９５３０）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって化学合成し、ＰＣＲによって増幅した。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩの制限部位をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーに加えた。ＰＣＲ増幅したＰおよびＮ断片を、別個のプロモーターによって駆動される２つのルシフェラーゼ遺伝子（ホタルおよびウミシイタケ）が存在するｐｓｉＣｈｅｃｋ－２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。標的断片インサートを、レポーターとして働くウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の直後の領域にクローニングしたが、ホタルルシフェラーゼ遺伝子は内部対照である。

細胞培養およびトランスフェクション

ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａにおいて、ａｉＲＮＡの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を試験した。細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地－１Ｘ（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下で培養した。

９６ウェルについて、ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクション時に７０％～８０％コンフルエンスに達するように、抗生物質を含まない１００ｕＬのＤＭＥＭ培地に播種した。レポータープラスミドｐｓｉＣｈｅｃｋ－２／ＮまたはｐｓｉＣｈｅｃｋ－２／ＰおよびａｉＲＮＡ－コレステロールコンジュゲートを、ＯｐｔｉＭＥＭ－Ｉ還元血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、標準的なＤｕａｌ－ルシフェラーゼレポーター・キット・プロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ標準的ＤＬＲ（登録商標）アッセイシステム）を用いて、各ウェル中のホタル－ルシフェラーゼおよびウミシイタケ－ルシフェラーゼの発光活性を検出した。未処理ａｉＲＮＡの対照に対して、ウミシイタケルシフェラーゼ／ホタルシフェラーゼの発光比を計算した。

トランスフェクション混合物の調製

トランスフェクション混合物ＡおよびＢを別々に調製した。２５ｕＬの二成分混合物－Ａは、０．２ｕＬのリポフェクタミン－２０００試薬を含有し、残りの体積のＯｐｔｉＭＥＭ培地を含有した。２５ｕＬの三成分混合物－Ｂは、２００ｎｇのレポータープラスミドＤＮＡ（ＮまたはＰ）、２．５ｕＬのＰＢＳ緩衝液中の対応するａｉＲＮＡ－コレステロールコンジュゲートの単回用量試験濃度プラス残りの体積のＯｐｔｉＭＥＭ培地を含有した。Ａ溶液とＢ溶液の両方を１：１の比で混合した後、室温で５分間インキュベートした各ウェルに５０ｕＬの得られたトランスフェクション混合物を添加する。

スクリーニング結果

１ｎＭの濃度のａｉＲＮＡを標的とするすべての設計候補Ｎ（ＧＨＩ＿Ｎ１～ＧＨＩ＿Ｎ９６）の結果を図７および図８に示す。模擬トランスフェクト対照に対してＬｕｃ／Ｒｌｕｃの比を計算した。スクリーニングされたａｉＲＮＡを標的とするスーパーＮを１００ｐＭの濃度でさらにスクリーニングする。結果を図９に示す。さらに、ＩＣ_５０濃度の決定のために最も有効なものを選択し、結果を以下の表１に示す。

１ｎＭの濃度のａｉＲＮＡ（ＧＨＩ＿Ｐ９７～ＧＨＩ＿Ｐ１４４）を標的とする設計候補ＲｄＲｐの結果を図１０に示し、１００ｐＭおよび１０ｐＭの濃度のａｉＲＮＡ（ＧＨＩ＿Ｐ１４４～ＧＨＩ＿Ｐ１６２）を標的とする設計候補ＲｄＲｐのさらなるスクリーニング結果を図１１に示す。模擬トランスフェクト対照に対してＬｕｃ／Ｒｌｕｃの比を計算した。さらに、ＩＣ_５０濃度の決定のために最も有効なものを選択し、結果を以下の表２に示す。

実施例３：ＶｅｒｏＥ６細胞におけるａｉＲＮＡを標的とするＮ（ＧＨＩ＿Ｎ３５、ＧＨＩ＿Ｎ４３およびＧＨＩ＿Ｎ８１）およびａｉＲＮＡを標的とするＲｄＲｐ（ＧＨＩ＿Ｐ１４４、ＧＨＩ＿Ｐ１４７、ＧＨＩ＿Ｐ１５５およびＧＨＩ＿Ｐ１５６）のアッセイでのインビトロＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス感染症
材料

ＶｅｒｏＥ６細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気下、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧｉｂｃｏＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ；ＧｉｂｃｏＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。

臨床分離株２０１９－ｎＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）をＶｅｒｏＥ６細胞で増殖させ、免疫蛍光アッセイを使用して５０％組織培養感染症用量（ＴＣＩＤ_５０）を測定することによってウイルス力価を決定した。すべての感染症実験は、ＢｉｏｓａｆｅｔｙＬｅｖｅｌ３（ＢＬＳ－３）実験室で行った。

試験する各ａｉＲＮＡ化合物または１：１比のａｉＲＮＡＮ４３およびａｉＲＮＡＰ１５５の組み合わせを、ストック溶液として１ｍＭの濃度で生理食塩水に溶解した。ストック溶液から、１００μＭ、３３μＭ、１０μＭ、３．３μＭ、１μＭの濃度を有する５つの段階希釈液を調製した。

評価方法

ＥＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中で培養したＶｅｒｏＥ６（１０，０００細胞／ウェル）細胞を、９６ウェルプレートに接種し、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。１０μＬの上記１～１００μＭ希釈物のサンプルを各濃度点で採取し、１００μＬウェルプレートに添加して細胞を少なくとも４８時間前処理した。１Ｘ緩衝液を陰性対照として設定した。添加後の試験化合物の濃度は、以下の通りであった：１０μＭ、３．３μＭ、１μＭ、３３３ｎＭ、１００ｎＭおよび０。

アリコートのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＭＯＩ０．０５）を添加して、処理細胞集団を２時間感染させた。次いで、ウイルス－ａｉＲＮＡ化合物混合物を除去し、細胞を、ａｉＲＮＡ化合物を含有する新鮮な培地（前処理と同じ濃度）でさらに培養した。４８時間のインキュベーション後、細胞上清を回収し、定量分析のために溶解緩衝液（Ｔａｋａｒａ、９７６６に溶解した。

各細胞集団から１００μＬの細胞培養上清のサンプルを採取した後、ＭｉｎｉＢＥＳＴＵｎｉｖｅｒｓａｌＲＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＴａＫａＲａ、９７６６）を用いてウイルスＲＮＡを単離した。ウイルスＲＮＡを３０μＬのリボヌクレアーゼ非含有水に溶出した。ｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ（ＴａｋａｒａＲＲ０４７Ａ）を含むＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔを用いて逆転写を行った。ｑＲＴ－ＰＣＲを、ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（ＴａｋａｒａＲＲ８２０Ａ）を備えたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）で行った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（登録商標）を使用して、ウイルスＲＮＡコピー対薬物濃度から用量応答曲線をプロットした。結果を図１２に示す。

実施例４：ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルス感染症の阻害およびａｉＲＮＡによるインビトロでの複製
設計された試験組み合わせ（ＧＨ５４３）は、１：１の比率のａｉＲＮＡＮ４３化合物とａｉＲＮＡＰ１５５化合物との組み合わせであった。試験は、化合物がＶｅｒＥ６細胞培養物中のウイルス産生を阻害する能力を評価した。このアッセイは二段階プロセスであり、ウイルスは最初に様々な希釈で抗ウイルス物質を含有する培養物中で産生され、その後、９６ウェルマイクロプレート中のエンドポイント希釈によってウイルス力価についてサンプルを滴定した。試験化合物の８つの希釈物をアッセイし、有効抗ウイルス濃度を回帰分析によって決定した。試験化合物の毒性を並行して決定した。

材料および方法

２％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５０ｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した改変イーグル培地（ＭＥＭ）の試験培地を使用して、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞株（Ｖｅｒｏ７６）中でウイルスを継代することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ストックを調製した。ａｉＲＮＡ－１（１００μＭ）およびａｉＲＮＡ－２（１００μＭ）の両方を１：１の比で混合して、５０μＭのＧＨ５４３を調製した。次いで、２９．１μＭ溶液を１×ＲＮＡｉ緩衝液中で調製した。１×ＲＮＡｉ緩衝液中で８回の連続半対数希釈を実施し、次いで、１０μＬの調製した各濃度を４０μＬの還元血清ＭＥＭ（ＯｐｔｉＭＥＭ）に添加した。この溶液を、調製したＧＨ５４３溶液と１：１の比（５０μＬ＋５０μＬ）で混合した。化合物を室温で２０分間インキュベートした。次いで、調製した各希釈液を、８０～１００％コンフルエントなＶｅｒｏＥ６細胞を含む１８６．２５μＬの試験培地を含有する９６ウェルプレートの５ウェルに対して１３．７５μＬで添加した。プレート上の最終的な最高濃度は２００ｎＭであった。

試験組み合わせ（ＧＨ５４３）を上記のように調製した。化合物希釈液を細胞と共に２４時間インキュベートした後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で感染させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、５日以内に８０％超の細胞変性効果（ＣＰＥ）をもたらし得る最小の可能な感染多重度（ＭＯＩ０．００１）を達成するように調製した。プロテアーゼ阻害剤（Ｍ１２８５３３）を、陽性対照として並行して、試験化合物前処理アッセイと同様の方法で、すなわち、開始用量から８の半対数連続希釈を１００ｕｇ／ｍＬとして試験した。プレートを３７℃および５％ＣＯ_２でインキュベートした。

感染後３日目に、各化合物濃度から上清液を回収し、標準エンドポイント希釈ＣＣＩＤ_５０アッセイを用いてウイルス力価について試験し、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ（１９４８）式（Ｒｅｅｄ、Ｌ．Ｊ．、１９３８）を用いて力価を計算した。

ＧＨ５４３および陽性対照Ｍ１２８５３３によるインビトロＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス力価の低下を表３に要約した。ウイルス収量を１ｌｏｇ１０減少させるのに必要な化合物の濃度（ＥＣ_９０）を回帰分析によって計算し、ウイルスの非存在下で５０％の細胞死を引き起こす試験化合物の濃度（ＣＣ_５０）を表４に計算した。ＳＩ_９０の選択指数は、ＣＣ_５０をＥＣ_９０で割って計算した。

^ａ０．１ｍＬあたりのＣＣＩＤ_５０としてのＧＨ５４３ＶＹＲについてのウイルス力価、平均ウイルス対照力価は、処置前アッセイについては６．３であり、処置後アッセイについては４．７であった。
^ｂ０．１ｍＬあたりのＣＣＩＤ_５０としてのＭ１２８５３３ＶＹＲについてのウイルス力価、平均ウイルス対照力価は６．０であった。

試験化合物ＧＨ５４３は、非毒性（ＣＣ_５０、＞２００ｎＭ）であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して活性であり、有意なウイルス力価の低下を示した（ＥＣ_９０、０．２２ｎＭ）が、用量反応は典型的ではなく、より低濃度ではＣＰＥを完全に阻害しなかった（表４、ＥＣ_９０計算のために無視）。選択指数比は高く（ＳＩ_９０＞９２０）、所与のウイルス感染症に対するインビボ処置中のより有効でより安全な薬物の良好な指標である。陽性対照化合物Ｍ１２８５３３は、予想通りに機能した。

ＧＨ５４３は、陽性対照（ＥＣ_９０＝０．２２ｎＭ）と比較してウイルス感染症および複製を有意に減少させ（ＥＣ_９０＝１４ｎＭ）、試験化合物は細胞に対して非毒性である。研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の阻害のためのツールであり得る証拠を提供した。
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ＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄＥ．，ＰｕｅｒｎｅｒＪ．Ａ．（１９８４）Ａｓｉｍｐｌｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｕｓｉｎｇｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｆｏｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｓｓａｙｓ（ＨＴＤ／ＮＲ９０）．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ９（１）：７－９．

Claims

ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、配列番号１～２１０からなる群より選択される少なくとも１つの標的遺伝子に実質的に相補的な少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、配列番号２１１～４２０からなる群より選択されるヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、低分子干渉ＲＮＡ二重鎖であり、配列番号２１１～４２０からなる群より選択される少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に実質的に相補的なセンス鎖と、を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と二本鎖領域を形成する、遺伝子サイレンシング剤。
前記アンチセンス鎖が１５～３０ヌクレオチドの長さを有し、前記センス鎖が９～２９ヌクレオチドの長さを有し、両端が含まれる、請求項３に記載の剤。
前記アンチセンス鎖が２３ヌクレオチドの長さを有し、前記センス鎖が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドの長さを有する、請求項３に記載の剤。
前記アンチセンス鎖が２１ヌクレオチドの長さを有し、前記センス鎖が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドの長さを有する、請求項３に記載の剤。
前記アンチセンス鎖が１９ヌクレオチドの長さを有し、前記センス鎖が１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９ヌクレオチドの長さを有する、請求項３に記載の剤。
前記アンチセンス鎖が、３’末端および／または５’末端にオーバーハングを有し、前記３’末端および／または５’末端の前記オーバーハングが、１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの長さを有する、請求項３～７に記載の剤。
前記アンチセンス鎖が、３’末端にオーバーハングを有し、かつ５’平滑末端を有し、３’末端の前記オーバーハングが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチドの長さを有する、請求項３～７のいずれか一項に記載の剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、低分子干渉ＲＮＡ二重鎖であり、配列番号２１１～４２０からなる群より選択される配列と本質的に同一のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖と、配列番号４２１～６３０からなる群に列挙される対応する配列と本質的に同一のヌクレオチドを有するセンス鎖と、を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と二本鎖領域を形成する、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、５’－ＡＡＣＧＡＵＵＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＵＡＧＣ－３’（配列番号２５３）を含み、前記センス鎖が、５’－ＡＡＣＡＡＵＧＣＵＧＣＡＡＵＣ－３’（配列番号４６３）を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、５’－ＡＡＣＵＵＵＡＵＣＡＵＵＧＵＡＧＡＵＧＵＣ－３’（配列番号３６５）を含み、前記センス鎖が、５’－ＡＵＣＵＡＣＡＡＵＧＡＵＡＡＡ－３’（配列番号５７５）を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、５’－ＡＡＧＣＡＵＵＧＵＵＡＧＣＡＧＧＡＵＵＧＣ－３’（配列番号２２４）を含み、前記センス鎖が、５’－ＡＵＣＣＵＧＣＵＡＡＣＡＡＵＧ－３’（配列番号４３４）を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、５’－ＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＧＧＣＣＡＡＵＧＵＵＵ－３’（配列番号２４０）を含み、前記センス鎖が、５’－ＣＡＵＵＧＧＣＣＧＣＡＡＡＵＵ－３’（配列番号４５０）を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、５’－ＡＡＵＵＧＵＵＵＧＧＡＧＡＡＡＵＣＡＵＣＣ－３’（配列番号２４５）を含み、前記センス鎖が、５’－ＵＧＡＵＵＵＣＵＣＣＡＡＡＣＡ－３’（配列番号４５５）を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、５’－ＡＡＡＣＣＡＧＣＵＡＣＵＵＵＡＵＣＡＵＵＧ－３’（配列番号３６６）を含み、前記センス鎖が、５’－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＡＧＣＵＧＧ－３’（配列番号５７６）を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、５’－ＡＡＡＵＧＵＧＵＣＡＣＡＡＵＵＡＣＣＵＵＣ－３’（配列番号３５４）を含み、前記センス鎖が、５’－ＧＧＵＡＡＵＵＧＵＧＡＣＡＣＡ－３’（配列番号５６４）を含む、遺伝子サイレンシング剤。
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための遺伝子サイレンシング剤であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖が、５’－ＡＡＣＡＧＣＵＧＧＡＣＡＡＵＣＣＵＵＡＡＧ－３’（配列番号３５７）を含み、前記センス鎖が、５’－ＡＡＧＧＡＵＵＧＵＣＣＡＧＣＵ－３’（配列番号５６７）を含む、遺伝子サイレンシング剤。
前記アンチセンス鎖および／またはセンス鎖のうちの少なくとも１つのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の剤。
前記アンチセンス鎖およびセンス鎖のうちの少なくとも１つが、コレステロール部分などの脂質部分を含むリガンドにコンジュゲートされている、請求項１～１８のいずれか一項に記載の剤。
前記剤が、対象の細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｍＲＮＡまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価のレベルを低下させることができる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の剤。
請求項１～２１のいずれか一項に記載の遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する症状を処置するための医薬組成物。
請求項１～２１のいずれか一項に記載の２またはそれを超える遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体とを含む、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する症状を処置するための医薬組成物であって、前記遺伝子サイレンシング剤が、ＣｏＶ遺伝子の複数の異なるセグメントまたは複数の異なるＣｏＶ遺伝子に向けられる、医薬組成物。
２つの遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体と、を含むＣＯＶＩＤ－１９に関連する症状を処置するための医薬組成物であって、第１の遺伝子サイレンシング剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド遺伝子を標的とし、図１に提供されるアンチセンス鎖配列（配列番号２１１～３０６）の１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含む、アンチセンス鎖を含み、
第２の遺伝子サイレンシング剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲｄＲｐ遺伝子を標的とし、図２に提供されるアンチセンス鎖配列（配列番号３０７～３７２）の１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドからなる、それらから本質的になる、またはそれらを含むアンチセンス鎖を含む、医薬組成物。
２つの遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体と、を含む、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する症状を処置するための医薬組成物であって、第１の遺伝子サイレンシング剤が、ＧＨＩ＿Ｎ１～ＧＨＩ＿Ｎ９６のうちのいずれか１つから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシド遺伝子を標的とし、第２の遺伝子サイレンシング剤が、ＧＨＩ＿Ｐ９７～ＧＨＩ＿Ｐ１６２のいずれか１つから選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲｄＲｐ遺伝子を標的とする、医薬組成物。
前記第１のサイレンシング剤が、ＧＨＩ＿Ｎ４３、ＧＨＩ＿Ｎ１４、ＧＨＩ＿Ｎ３０およびＧＨＩ＿Ｎ３５からなる群より選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
前記第２のサイレンシング剤が、ＧＨＩ＿Ｐ１５５、ＧＨＩ＿Ｐ１５６、ＧＨＩ＿Ｐ１４４およびＧＨＩ＿Ｐ１４７からなる群より選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
二つの遺伝子サイレンシング剤と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤または担体と、を含む、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する症状を処置するための医薬組成物であって、第１の遺伝子サイレンシング剤が請求項１１に記載の剤であり、第２の遺伝子サイレンシング剤が請求項１２に記載の剤である、医薬組成物。
対象の細胞内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のレベルを低下させる方法であって、遺伝子サイレンシング剤を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子サイレンシング剤が、配列番号１～２１０からなる群より選択される標的遺伝子に実質的に相補的な少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、方法。
対象の細胞内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のレベルを低下させる方法であって、遺伝子サイレンシング剤を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子サイレンシング剤が、配列番号２１１～４２０からなる群より選択されるヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、方法。
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法であって、遺伝子サイレンシング剤を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子サイレンシング剤が、配列番号１～２１０からなる群より選択される標的遺伝子に実質的に相補的な少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、方法。
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法であって、遺伝子サイレンシング剤を前記対象に投与することを含み、前記遺伝子サイレンシング剤が、配列番号２１１～４２０からなる群より選択されるヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５個またはそれを超える連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む、方法。
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法であって、請求項１～２１のいずれか一項に記載の遺伝子サイレンシング剤および請求項２３～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
前記剤を対象の鼻腔内に投与する、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記剤を、吸入または噴霧によって対象に投与する、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。