JP2023508366A - 二重特異性ｆｃｙｒｉｉｉ×ｃｄ３０抗体構築体の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＦｃｙＲＩＩｌａに対する第１の結合ドメインを含む二重特異性ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ抗体構築体を生成する方法であって、溶液から抗体構築体をクロマトグラフィで捕捉する工程と；捕捉マトリックスから抗体構築体を溶出する工程と；溶出した抗体構築体の溶液中のｐＨを、低いｐＨに引き下げる工程と；抗体構築体をこの条件下で少なくとも４０時間インキュベートする工程と；その後中和する工程とを含む方法に関する。

Description

本発明は、二重特異性ＦｃγＲＩＩＩ×ＣＤ３０抗体構築体の製造方法および前記方法によって製造された二重特異性抗体構築体を提供する。

抗体生成の回収精製プロセスは、活性抗体の許容可能な収率を得ながら、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、および他の種等の不純物を除去する必要がある。

クロマトグラフィは、抗体に広く用いられている分離精製技術である。例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ＨＣＩＣ）、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、またはマルチモーダルクロマトグラフィといったいくつかのクロマトグラフィ樹脂が、抗体の回収および精製に用いられている。

ＨＣＩＣは、混合モードクロマトグラフィである。ＨＣＩＣ樹脂は、非特異的疎水性相互作用を介して抗体構築体をカラムに結合させるために、生理学的に中性またはわずかに酸性のｐＨ（例えばｐＨ６～９）にてイオン化可能かつ疎水性であるリガンド、例えば、吸着剤４－メルカプト－エチル－ピリジン（ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標））を含有する。溶出のために、ｐＨを引き下げることによって、疎水性結合を、ｐＨシフトに起因する溶出液に対する静電荷反発によって破壊する。

さらに、ウイルスを除去かつ／または不活化することによるウイルスクリアランス工程が、哺乳動物細胞からの抗体生成のための精製プロセスに組み込まれなければならない。例えば、ウイルスクリアランスを、クロマトグラフィ溶出液の低いｐＨ保持によって達成することができる。例えば、クロマトグラフィ工程後の低いｐＨ保持を、溶出液のｐＨを約３．４～３．６に低下させてから、ｐＨを約７に上げることによって溶出液を中和することによって、達成することができる。ｐＨ＜３．６が、レトロウイルス不活化を達成するのに頑強であると報告されている（Ｑｉ Ｃｈｅｎ，ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ａｎｄ Ｔｅｃｈ，２０１４，６８，１７－２２）。典型的には、低ｐＨ保持を、約３０分間～約６０分間実行する。

ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体の酸性ＭＥＰ溶出液インキュベーションの動態アッセイの図である。

定義
用語「抗体構築体」は、構造および／または機能が、抗体の構造および／または機能に基づく分子または分子のクラスを指す。そのような抗体の例として、例えば、抗体またはその断片の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから得られた完全長の、または完全な免疫グロブリン分子および／または構築体が挙げられる。それゆえに、抗体構築体は、その特異的な標的または抗原に結合することができる。さらに、本発明の文脈において定義される抗体構築体の結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の構造的最小要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）および／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の、好ましくは全６つのＣＤＲ（シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）由来構築体の全３つの重鎖ＣＤＲ）の存在によって定義され得る。抗体の構造的最小要件を定義するための代替アプローチが、特異的標的の構造内の、抗体のエピトープ（エピトープ領域（エピトープクラスタ）を含む標的タンパク質のタンパク質ドメイン）の定義、または定義された抗体のエピトープと競合する特異的抗体の参照による定義である。本発明の文脈において定義される構築体が基づく抗体の例として、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体が挙げられる。

本発明の文脈において定義される抗体構築体の結合ドメインは、例えば、上記のＣＤＲ群を含み得る。好ましくは、当該ＣＤＲは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク内に含まれる。しかしながら、双方を含む必要はない。Ｆｄ断片が、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持している。抗体断片、抗体変異体、または結合ドメインのフォーマットについての更なる例として、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインを有する一価断片であるＦａｂ断片；（２）２つのＦａｂ断片がヒンジ領域にてジスルフィド架橋によって連結されている二価断片であるＦ（ａｂ’）_２断片；（３）２つのＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（６）単離される相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦＶライブラリに由来）。

また、「結合ドメイン」または「に結合するドメイン」の定義の範囲内には、全長抗体の断片、例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または「ｒ ＩｇＧ」（「半抗体」）がある。また、本発明の文脈において定義される抗体構築体は、抗体変異体とも呼ばれる抗体の修飾断片、例えば、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖまたはビｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆａｂ_３、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデム型ダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデム型ジｓｃＦｖ、タンデム型トリｓｃＦｖ、「マルチボディ」、例えばトリアボディまたはテトラボディ、およびシングルドメイン抗体、例えば、ＶＨＨ、ＶＨ、またはＶＬであり得るただ１つの可変ドメインを含むナノボディまたはシングル可変ドメイン抗体を含み得、これらは、他のＶ領域またはドメインと独立して抗原またはエピトープに特異的に結合する。

本明細書中で用いられる用語「単鎖Ｆｖ」、「単鎖抗体」、または「ｓｃＦｖ」は、重鎖および軽鎖の双方由来の可変領域を含むが定常領域を欠く、単ポリペプチド鎖抗体断片を指す。一般に、単鎖抗体はさらに、抗原結合を可能にする所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に含む。単鎖抗体は、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎによって、モノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），ｖｏｌ．１ １３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）において詳細に論じられている。単鎖抗体を生成する種々の方法が知られており、米国特許第４，６９４，７７８号明細書、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；国際公開第８８／０１６４９号パンフレット；Ｂｉｒｄ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４４２；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４；Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１に記載されている方法が挙げられる。特定の実施形態において、単鎖抗体もまた、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体および／もしくはヒト化抗体、ならびに／または合成抗体であり得る。

さらに、用語「抗体構築体」の定義は、一価構築体、二価構築体、および多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ／ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）構築体、ならびに２つの抗原構造にのみ特異的に結合する二重特異性構築体、および異なる結合ドメインを介して３つ以上、例えば、３つ、４つ、またはそれを超える抗原構造に特異的に結合する多特異性／多重特異性構築体を含む。さらに、用語「抗体構築体」の定義は、１つのポリペプチド鎖のみからなる分子、ならびに２つ以上のポリペプチド鎖からなる分子を含み、これらの鎖は、同一であっても（ホモ二量体、ホモ三量体、またはホモオリゴマー）、異なっていてもよい（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロオリゴマー）。先で同定された抗体およびその変異体または誘導体についての例が、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、抗体、ラボマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ），ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）および抗体の使用：ラボマニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ），ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ、抗体工学（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ ｅｄ．２０１０、免疫治療用の小さな組換え抗体（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９、ならびにＮｅｖｏｌｔｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ、抗体工学－方法およびプロトコール（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１８に記載されている。

用語「価」は、抗原結合タンパク質内の決められた数の抗原結合ドメインの存在を示す。天然ＩｇＧは、２つの抗原結合ドメインを有し、二価である。本発明の文脈において定義される抗原結合タンパク質は、少なくとも三価である。四価、五価、そして六価の抗原結合タンパク質の例を、本明細書中に記載する。

本明細書中で用いられる用語「二重特異性」は、「少なくとも二重特異性」である抗体構築体、すなわち、少なくとも第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインが、一方の抗原または標的（ここでは：ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ）に結合し、第２の結合ドメインが、もう一方の抗原または標的（ここでは：標的細胞表面抗原ＣＤ３０）に結合する抗体構築体を指す。したがって、本発明の文脈において定義される抗体構築体は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。例えば、第１のドメインは、好ましくは、ヒト、マカク（Ｍａｃａｃａ）属種、および齧歯類種から選択される種の１つ以上のＮＫ細胞受容体の細胞外エピトープに結合する。

本発明の文脈で用いられる用語「ＮＫ細胞受容体」は、ＮＫ細胞の表面上のタンパク質およびタンパク質複合体を定義する。ゆえに、当該用語は、ＮＫ細胞に特徴的であるが、ＮＫ細胞の表面上に排他的に発現される必要はなく、マクロファージまたはＴ細胞等の他の細胞上にも発現される細胞表面分子を定義する。ＮＫ細胞受容体についての例として、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２Ｄが挙げられるが、これらに限定されない。

「ＣＤ１６ａ」は、ＮＫ細胞の細胞表面上に発現される、ＦｃγＲＩＩＩＡとしても知られている活性化受容体ＣＤ１６ａを指す。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性をトリガーする活性化受容体である。ＣＤ１６ａに対する抗体の親和性は、ＮＫ細胞活性化をトリガーする能力と直接相関するので、ＣＤ１６ａに対する親和性が高いほど、活性化に必要な抗体用量が引き下げられる。抗原結合タンパク質の抗原結合部位は、ＣＤ１６ａに結合するが、ＣＤ１６ｂには結合しない。例えば、ＣＤ１６ａに結合するがＣＤ１６Ｂに結合しない重（ＶＨ）鎖可変ドメインおよび軽（ＶＬ）鎖可変ドメインを含む抗原結合部位が、ＣＤ１６ｂに存在しないＣ末端配列ＳＦＦＰＰＧＹＱ（配列番号１８）のアミノ酸残基、ならびに／またはＣＤ１６ａ（配列番号１９）の残基Ｇ１３０および／もしくはＹ１４１を含む、ＣＤ１６ａのエピトープに特異的に結合する抗原結合部位によって提供され得る。

「ＣＤ１６ｂ」は、好中球および好酸球上に発現される、ＦｃγＲＩＩＩＢとしても知られている受容体ＣＤ１６ｂを指す。受容体は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定されており、ＣＤ１６ｂ陽性免疫細胞のいかなる種類の細胞傷害活性もトリガーしないと理解されている。

用語「標的細胞表面抗原」は、細胞によって発現され、かつ、本明細書中に記載される抗体構築体にアクセス可能であるように細胞表面に存在する抗原構造を指す。本明細書中に記載される二重特異性抗体構築体が結合する「標的細胞表面抗原」は、ＣＤ３０である。ＴＮＦＲＳＦ８としても知られているＣＤ３０は、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの細胞膜タンパク質であり、腫瘍マーカーである。

また、本発明の文脈において定義される用語「二重特異性抗体構築体」は、三重特異性抗体構築体等の多重特異性抗体構築体を包含し、後者は、３つの結合ドメインを含むもの、または３つを超える（例えば、４つ、５つ・・・）特異性を有する構築体である。二重特異性または多重特異性抗体構築体についての例が、例えば、国際公開第２００６／１２５６６８号パンフレット、国際公開第２０１５／１５８６３６号パンフレット、国際公開第２０１７／０６４２２１号パンフレット、国際公開第２０１９／１７５３６８号パンフレット、国際公開第２０１９／１９８０５１号パンフレット、およびＥｌｌｗａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＭＡｂｓ．２０１９ Ｊｕｌ；１１（５）：８９９－９１８）に記載されている。

本発明の文脈において定義される抗体構築体が（少なくとも）二重特異性であることを考えると、当該抗体構築体は、天然には存在せず、天然に存在する産物とは著しく異なる。それゆえに、「二重特異性」抗体構築体または免疫グロブリンは、特異性が異なる少なくとも２つの異なる結合面を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体構築体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結が挙げられる種々の方法によって製造され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）参照。

本発明の抗体構築体の少なくとも２つの結合ドメインおよび可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）は、ペプチドリンカー（スペーサーペプチドまたはコネクタペプチド）を含んでも含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本明細書中で定義される抗体構築体の一方の（可変および／または結合）ドメインおよびもう一方の（可変および／または結合）ドメインのアミノ酸配列を互いに連結するアミノ酸配列を含む。ペプチドリンカーを用いて、第３のドメインを、他のドメインまたは本明細書中で定義される抗体構築体のＦｃ部分に融合することもできる。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、いかなる重合活性も含まないことである。

本発明の文脈において定義される抗体構築体は、好ましくは「インビトロ生成抗体構築体」である。当該用語は、可変領域（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）の全てまたは一部が、非免疫細胞選択、例えばインビトロファージディスプレイ、タンパク質チップ、または候補配列を、抗原に結合する能力について試験することができる他のあらゆる方法で生成される、先の定義に従う抗体構築体を指す。ゆえに、当該用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再配置によってのみ生成される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術または遺伝子工学を用いて作製された抗体である。

本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）またはモノクローナル抗体構築体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る天然に存在する可能性のある突然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化、脱アミノ化、酸化、およびグリコシル化）を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、異なる決定基（またはエピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、抗原上の単一の抗原面または決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるので、他の免疫グロブリンが混入していないという点で、有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、特定の何らかの方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。

モノクローナル抗体の調製に、連続細胞株培養によって生成される抗体を提供するあらゆる技術を用いることができる。例えば、用いられることになるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されるハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）によって作製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体を生成するための更なる技術についての例として、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）、およびＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，モノクローナル抗体および癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７－９６）が挙げられる。

次いで、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析等の標準的な方法を用いてハイブリドーマをスクリーニングして、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。関連抗原のあらゆる形態、例えば組換え抗原、天然に存在する形態、そのあらゆる変異体または断片、ならびにその抗原性ペプチドが、免疫原として用いられ得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで使用される表面プラズモン共鳴を用いて、標的細胞表面抗原のエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ、ヒト抗体ハイブリドーマ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）７（１９９６），９７－１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７－１３）。モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法は、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイまたはリボソームディスプレイライブラリをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている。

ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を用いて、非ヒト動物、例えば齧歯類（例えば、マウス、ハムスター、ウサギ、またはラット）を免疫化することができる。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生欠陥があるマウス株を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きな断片により操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する、遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を生成して選択してもよい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１、米国特許出願公開第２００３－００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、および国際公開第９６／３３７３５号パンフレット参照。

また、モノクローナル抗体を、非ヒト動物から得てから、当該技術において知られている組換えＤＮＡ技術を用いて、修飾、例えば、ヒト化、脱免疫化、キメラ化等を行うことができる。修飾抗体構築体の例として、「親和性成熟」抗体である非ヒト抗体のヒト化変異体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９－８９６（１９９２）およびＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２－１０８３７（１９９１））、および改変エフェクタ機能を有する抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２０１０），ｌｏｃ．ｃｉｔ．、Ｌｉｔｔｌｅ（２００９），ｌｏｃ．ｃｉｔ．、およびＮｅｖｏｌｔｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ（２０１８），ｌｏｃ．ｃｉｔ参照）が挙げられる。

免疫学において、親和性成熟は、Ｂ細胞が、免疫応答の過程で、抗原に対する親和性が増大した抗体を産生するプロセスである。同じ抗原への反復曝露により、宿主は、連続的により高い親和性の抗体を産生することとなる。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、突然変異および選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟を用いて、抗体、抗体構築体、および抗体断片が首尾よく最適化されてきた。ＣＤＲ内のランダム突然変異が、放射線、化学変異原、またはエラープローンＰＣＲを用いて導入される。また、遺伝的多様性は、鎖シャッフリングによって増大させることができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ法を用いた２回または３回の突然変異および選択により、通常、親和性が低ナノモル範囲の抗体断片が生じる。

抗体構築体のアミノ酸置換変異の好ましいタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般に、更なる開発のために選択される、結果として生じる変異体は、当該変異体が生成された親抗体と比較して、生物学的特性が向上している。そのような置換変異体を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。手短に言えば、いくつかの超可変領域面（例えば、６～７面）を変異させて、各面にて可能な全アミノ酸置換を生じさせる。このようにして生成された抗体変異体は、糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、一価で提示される。次いで、ファージディスプレイ変異体を、本明細書中で開示されるように、生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾用の候補超可変領域面を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実行して、抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を同定することができる。これ以外にも、または加えて、結合ドメインと、例えば、ヒト標的細胞表面抗原との接触点を同定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益である場合がある。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書中で詳述する技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルを、本明細書中に記載されるスクリーニングに供して、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。

本発明のモノクローナル抗体および抗体構築体は、具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残りの部分が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書中の注目するキメラ抗体として、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「プリミタイズド」抗体が挙げられる。キメラ抗体を作製するための種々のアプローチが記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書；および英国特許第２１７７０９６号明細書参照。

また、抗体、抗体構築体、抗体断片、または抗体変異体が、例えば国際公開第９８／５２９７６号パンフレットまたは国際公開第００／３４３１７号パンフレットに開示されている方法によって、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫」と呼ばれる方法）によって修飾されてもよい。簡潔には、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができる；当該ペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープを表す（国際公開第９８／５２９７６号パンフレットおよび国際公開第００／３４３１７号パンフレットに定義されている）。潜在的なＴ細胞エピトープの検出に、「ペプチドスレッディング」と称されるコンピュータモデリングアプローチを用いることができ、そしてまた、国際公開第９８／５２９７６号パンフレットおよび国際公開第００／３４３１７号パンフレットに記載されているように、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＶＨ配列およびＶＬ配列に存在するモチーフについて検索することができる。当該モチーフは、１８の主要なＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのいずれかに結合するので、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは、単一アミノ酸置換によって、検出される潜在的なＴ細胞エピトープを排除することができる。典型的には、保存的置換が行われる。限定されないが、多くの場合、ヒト生殖細胞系抗体配列内の位置に共通のアミノ酸が用いられ得る。ヒト生殖細胞系配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ．１６（５）：２３７－２４２；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１４：４６２８－４６３８に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ ａｌ．タンパク質工学に関するＭＲＣセンター（ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによる編集）を提供する。これらの配列は、例えばフレームワーク領域およびＣＤＲのための、ヒト配列の供給源として用いることができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されているような、コンセンサスなヒトフレームワーク領域を用いることもできる。

「ヒト化」抗体、抗体構築体、変異体、またはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または抗体の他の抗原結合部分配列）は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、大部分はヒト配列の抗体または免疫グロブリンである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲでもある）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ハムスター、またはウサギ等の非ヒト（例えば齧歯類）種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、本明細書中で用いられる「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体内にもドナー抗体内にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良かつ最適化するためになされる。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。更なる詳細について、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）参照。

ヒト化抗体またはその断片は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価な配列で置換することによって生成することができる。ヒト化抗体またはその断片を生成する例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；ならびに米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６１号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書；米国特許第５，８５９，２０５号明細書；および米国特許第６，４０７，２１３号明細書によって提供されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つから免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全てまたは一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、かつ発現させることを含む。そのような核酸は、上記のように、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、そして他の供給源から得ることができる。次いで、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクター中にクローニングすることができる。

また、ヒト化抗体は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子を発現するが、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子および内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子を発現することができないマウス等のトランスジェニック動物を用いて生成され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書中に記載されるヒト化抗体を調製するのに用いられ得る例示的なＣＤＲグラフティング法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全てが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置換されていてもよいし、ＣＤＲの一部のみが、非ヒトＣＤＲで置換されていてもよい。ヒト化抗体の、所定の抗原への結合に必要な数のＣＤＲを置換すれば十分である。

ヒト化抗体を、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系置換、および／または復帰突然変異の導入によって最適化することができる。そのような改変された免疫グロブリン分子は、当該技術において知られているいくつかの技術（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８－７３１２，１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３；Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３－１６，１９８２、およびＥＰ ２３９４００号明細書）のいずれによっても作製することができる。

用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体構築体」、および「ヒト結合ドメイン」は、例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって記載されているものが挙げられる当該技術において知られている、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変領域またはドメインおよび定常領域またはドメイン等の抗体領域を有する抗体、抗体構築体、および結合ドメインを含む。本発明の文脈において定義されるヒト抗体、抗体構築体、または結合ドメインは、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３内に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。ヒト抗体、抗体構築体、または結合ドメインは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基で置換された少なくとも１、２、３、４、５つ、またはそれ以上の位置を有し得る。しかしながら、本明細書中で用いられる、ヒト抗体、抗体構築体、および結合ドメインの定義はまた、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ等の技術または系を用いることによって誘導され得るような、抗体の非人工的に、かつ／または遺伝的に改変されたヒト配列のみを含む「完全ヒト抗体」を企図する。好ましくは、「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含まない。

一部の実施形態において、本明細書中で定義される抗体構築体は、「単離された」または「実質的に純粋な」抗体構築体である。「単離された」または「実質的に純粋な」は、本明細書中で開示される抗体構築体を説明するのに用いられる場合、その産生環境の成分から同定、分離、かつ／または回収された抗体構築体を意味する。抗体構築体は、抗体構築体、および１つ以上の他の成分、すなわち不純物を含む溶液から得られる。好ましくは、抗体構築体は、その産生環境からの他の全ての成分と結合していないか、または実質的に結合していない。その産生環境の混入成分、例えば組換え形質移入細胞に由来する成分は、典型的にはポリペプチドについての診断的使用または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含み得る。抗体構築体は、例えば、所与のサンプル中の総タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、状況に応じて、総タンパク質含有量の５重量％～９９．９重量％を構成し得ることが理解される。ポリペプチドは、誘導性プロモータまたは高発現プロモータを用いることによって、高い濃度レベルにて作製されるようにかなり高い濃度にて作製され得る。当該定義は、当該技術において知られている多種多様な生物および／または宿主細胞における抗体構築体の産生を含む。好ましい実施形態において、抗体構築体は、（１）スピニングカップシーケンサーを用いることによってＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる非還元条件下もしくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均質性まで、精製されることとなる。しかしながら、通常、単離された抗体構築体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

抗体構築体は、精製工程としての少なくとも１つのクロマトグラフィ捕捉工程によって、「溶液」から単離される。そのような「溶液」は、抗体構築体、および他の成分としての１つ以上の不純物を含む混合物である。溶液は、抗体構築体を産生する宿主細胞または微生物、例えば細胞培養上清または収穫した細胞培養液から直接得ることができる。溶液は、抗体構築体および他の成分から細胞を物理的に分離することによって、そして場合によっては、バッファおよび／または希釈によってコンディショニングしてからクロマトグラフィ捕捉工程に供することによって得ることができる。

用語「結合ドメイン」は、本発明に関連して、標的分子（抗原）、例えばＮＫ細胞受容体抗原、例えばＣＤ１６、および標的細胞表面抗原ＣＤ３０上の所与の標的エピトープまたは所与の標的面に（特異的に）結合し／これと（特異的に）相互作用し／これを（特異的に）認識するドメインを特徴付ける。第１の結合ドメイン（例えばＣＤ１６を認識する）の構造および機能、そしてまた好ましくは、第２の結合ドメイン（標的細胞表面抗原を認識）の構造および／または機能は、抗体の、例えば、完全長もしくは完全免疫グロブリン分子の構造および／もしくは機能に基づくものであり、かつ／または抗体もしくはその断片の可変重鎖（ＶＨ）および／もしくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから得られる。好ましくは、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）および／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）の存在によって特徴付けられる。また、第２の結合ドメインは好ましくは、標的結合を可能にする抗体の構造的最小要件を含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）および／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含む。第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体からのＣＤＲ配列を足場中にグラフトすることによってではなく、ファージディスプレイ法またはライブラリスクリーニング法によって生成されるか、またはそれによって得ることができることが想定される。

本発明に従えば、結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドの形態である。そのようなポリペプチドは、タンパク質性部分および非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカーまたは化学的架橋剤、例えばグルタルアルデヒド）を含み得る。タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性な断片、およびアミノ酸が通常３０個未満のペプチドを含む）は、共有ペプチド結合を介して互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む（アミノ酸の鎖が生じる）。

本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、通常３０個を超えるアミノ酸からなる一群の分子を表す。ポリペプチドは、二量体、三量体、およびより高次のオリゴマー等の多量体、すなわち２つ以上のポリペプチド分子からなる多量体をさらに形成し得る。そのような二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は、同一であっても同一でなくてもよい。そのような多量体の対応するより高次の構造は、結果として、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体等と呼ばれる。ヘテロ多量体の例として、その天然に存在する形態では、２つの同一の軽ポリペプチド鎖および２つの同一の重ポリペプチド鎖からなる抗体分子がある。また、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、修飾が、例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化等の翻訳後修飾によって影響を受ける、天然に修飾されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質を指す。本明細書中で言及される場合の「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」は、ペグ化等で化学的に修飾されていてもよい。そのような修飾は、当該技術において周知であり、本明細書中で以下に記載されている。

好ましくは、ＮＫ細胞受容体抗原、例えばＣＤ１６に結合する結合ドメイン、および／または標的細胞表面抗原ＣＤ３０に結合する結合ドメインは、ヒト、ヒト化、またはマウス由来キメラ結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体および抗体構築体は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはウサギ）可変領域および／または定常領域等の非ヒト領域を有する抗体または抗体構築体と関連する問題の一部を回避する。そのような齧歯類由来タンパク質の存在は、抗体もしくは抗体構築体の急速なクリアランスをもたらし得るか、または患者による抗体もしくは抗体構築体に対する免疫応答の生成をもたらし得る。齧歯類由来の抗体または抗体構築体の使用を回避するために、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するように、齧歯類にヒト抗体機能を導入することによって、ヒトまたは完全ヒト抗体／抗体構築体を生成することができる。

ＹＡＣにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニングおよび再構築して、マウス生殖細胞系に導入する能力は、非常に大きいか、または大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的構成要素を解明し、かつヒト疾患の有用なモデルを生成するための強力なアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座をそのヒト等価物で置換するためのそのような技術の使用により、発生中のヒト遺伝子産物の発現および調節、他の系とのコミュニケーション、ならびに疾患の誘導および進行への関与に対する独自の洞察を実現することができる。

そのような戦略の重要な実際的応用は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、抗体のプログラムされた発現およびアセンブリの基礎をなす機構、ならびにＢ細胞発生における役割を研究する機会を提供する。さらに、そのような戦略は、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成のための理想的な供給源を提供し得る（ヒト疾患における抗体療法の見込みを成就するための重要なマイルストーンである）。完全ヒト抗体または抗体構築体は、マウスまたはマウス誘導体化ｍＡｂに固有の免疫原性およびアレルギー応答を最小限に抑え、これにより投与された抗体／抗体構築体の有効性および安全性を高めると予想される。完全ヒト抗体または抗体構築体の使用は、反復化合物投与を必要とする慢性のヒト疾患および再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫、および癌の処置において実質的な利点を与えると予想され得る。

この目標に向けた一アプローチとして、そのようなマウスが、マウス抗体の不在下でヒト抗体の大きなレパートリーを産生することを見越して、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片により、マウス抗体産生が欠損したマウス株を操作することがあった。大きなヒトＩｇ断片は、大きな可変遺伝子多様性、ならびに抗体産生および発現の適切な調節を保存するであろう。抗体の多様化および選択、ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如のためにマウス機構を利用することによって、これらのマウス株における再現されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原が挙げられる注目するあらゆる抗原に対する高親和性抗体を生じるはずである。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に生成して選択することができる。この一般的戦略は、第１のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス株の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１（１９９４）参照）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株を、コア可変領域配列および定常領域配列をそれぞれ含有するヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座の２４５ｋｂおよび１９０ｋｂのサイズの生殖細胞系構成断片を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）により操作した。ＹＡＣを含有するヒトＩｇは、抗体の再配置および発現の双方についてマウス系と適合性であることが証明され、かつ不活化マウスＩｇ遺伝子を置換することができた。これは、Ｂ細胞発生を誘導して、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、かつ抗原特異的ヒトｍＡｂを生成する能力によって実証された。また、これらの結果は、より多数のＶ遺伝子、追加の調節エレメント、およびヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座のより大きな部分の導入が、感染および免疫化に対するヒト液性応答に特徴的な完全レパートリーを実質的に再現し得ることを示唆した。Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．の研究は、最近、ヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系構成ＹＡＣ断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーのおおよそ８０％超の導入にまで拡大された。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）および米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書参照。

ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの生成はさらに、米国特許出願第０７／４６６，００８号明細書、米国特許出願第０７／６１０，５１５号明細書、米国特許出願第０７／９１９，２９７号明細書、米国特許出願第０７／９２２，６４９号明細書、米国特許出願第０８／０３１，８０１号明細書、米国特許出願第０８／１１２，８４８号明細書、米国特許出願第０８／２３４，１４５号明細書、米国特許出願第０８／３７６，２７９号明細書、米国特許出願第０８／４３０，９３８号明細書、米国特許出願第０８／４６４，５８４号明細書、米国特許出願第０８／４６４，５８２号明細書、米国特許出願第０８／４６３，１９１号明細書、米国特許出願第０８／４６２，８３７号明細書、米国特許出願第０８／４８６，８５３号明細書、米国特許出願第０８／４８６，８５７号明細書、米国特許出願第０８／４８６，８５９号明細書、米国特許出願第０８／４６２，５１３号明細書、米国特許出願第０８／７２４，７５２号明細書、および米国特許出願第０８／７５９，６２０号明細書；ならびに米国特許第６，１６２，９６３号明細書；米国特許第６，１５０，５８４号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；米国特許第６，０７５，１８１号明細書、および米国特許第５，９３９，５９８号明細書、ならびに日本特許第３０６８１８０号公報、日本特許第３０６８５０６号公報、および日本特許第３０６８５０７号公報において考察かつ正確に概説されている。また、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７）およびＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－４９５（１９９８）、欧州特許第０ ４６３ １５１号明細書、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第００／７６３１０号パンフレット、ならびに国際公開第０３／４７３３６号パンフレット参照。

別のアプローチでは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．が挙げられる他の企業が、「ミニフォーカス」アプローチを利用してきた。ミニフォーカス法では、外因性Ｉｇ遺伝子座は、Ｉｇ遺伝子座由来の片（個々の遺伝子）を含めることによって模倣される。ゆえに、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、および第２の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）が、動物への挿入用の構築体中に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，５４５，８０７号明細書、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋａｙの米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，６２５，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，７７０，４２９号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；および米国特許第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓの米国特許第５，５９１，６６９号明細書および米国特許第６，０２３，０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６１２，２０５号明細書；米国特許第５，７２１，３６７号明細書；および米国特許第５，７８９，２１５号明細書、ならびにＣｈｏｉおよびＤｕｎｎの米国特許第５，６４３，７６３号明細書、ならびにＧｅｎＰｈａｒｍの米国特許出願第０７／５７４，７４８号明細書、米国特許出願第０７／５７５，９６２号明細書、米国特許出願第０７／８１０，２７９号明細書、米国特許出願第０７／８５３，４０８号明細書、米国特許出願第０７／９０４，０６８号明細書、米国特許出願第０７／９９０，８６０号明細書、米国特許出願第０８／０５３，１３１号明細書、米国特許出願第０８／０９６，７６２号明細書、米国特許出願第０８／１５５，３０１号明細書、米国特許出願第０８／１６１，７３９号明細書、米国特許出願第０８／１６５，６９９号明細書、米国特許出願第０８／２０９，７４１号明細書に記載されている。また、欧州特許第０ ５４６ ０７３号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／２２６４７号パンフレット、国際公開第９２／２２６７０号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／００５６９号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９６／１４４３６号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、および国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号明細書参照。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、およびＦｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）参照。

また、Ｋｉｒｉｎは、微小細胞融合によって大きな染色体片または染色体全体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成を実証した。欧州特許出願第７７３ ２８８号明細書および欧州特許出願第８４３ ９６１号明細書参照。Ｘｅｎｅｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ヒト抗体の潜在的な生成のための技術を開発している。この技術では、ＳＣＩＤマウスを、ヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞および／またはＴ細胞で再構成する。次いで、マウスを抗原で免疫化して、抗原に対する免疫応答を生じさせることができる。米国特許第５，４７６，９９６号明細書；米国特許第５，６９８，７６７号明細書；および米国特許第５，９５８，７６５号明細書参照。

ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答により、業界は、キメラ抗体、または別な方法でヒト化抗体を調製するに至った。しかしながら、特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が、特に抗体の慢性的利用またはマルチドーズ型利用において観察されることが予想される。ゆえに、ＨＡＭＡ応答またはＨＡＣＡ応答の懸念および／または影響を打ち消すために、標的細胞表面抗原に対するヒト結合ドメインおよびＣＤ１６に対するヒト結合ドメインを含む抗体構築体を提供することが望ましいであろう。

用語「に（特異的に）結合する」、「を（特異的に）認識する」、「に（特異的に）向けられる」、および「と（特異的に）反応する」は、本発明に従えば、結合ドメインが、標的分子（抗原）、ここではＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原上の所与のエピトープまたは所与の標的面と相互作用または特異的に相互作用することを意味する。

用語「エピトープ」は、抗体もしくは免疫グロブリン等の結合ドメイン、または抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体、断片、もしくは変異体が特異的に結合する、抗原上の面を指す。「エピトープ」は抗原性であるので、用語エピトープは、本明細書中で「抗原構造」または「抗原決定基」とも称されることがある。ゆえに、結合ドメインは、「抗原相互作用面」である。また、前記結合／相互作用は、「特異的認識」を定義すると理解される。

「エピトープ」は、タンパク質の三次折畳みによって並置される連続アミノ酸または不連続アミノ酸の双方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が、認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは典型的に、固有の配列内に少なくとも３つまたは少なくとも４つ、より通常的には少なくとも５つまたは少なくとも６つまたは少なくとも７つ、例えば約８～約１０個のアミノ酸を含む。

線状エピトープとは対照的に、「構造的エピトープ」は、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義成分ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、結合ドメインによって必ずしも認識されないエピトープ）である。典型的には、構造的エピトープは、線状エピトープと比較して、アミノ酸の数が増している。構造的エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはその断片の三次元構造を認識する（本発明の文脈において、結合ドメインの１つについての抗原性構造は、標的細胞表面抗原タンパク質内に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成すると、構造的エピトープを形成する特定のアミノ酸および／またはポリペプチド骨格が並置されて、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの高次構造を決定する方法として、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴（２Ｄ－ＮＭＲ）分光法、ならびに部位特異的スピン標識および電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。

結合ドメインとエピトープまたはエピトープを含む領域との相互作用は、結合ドメインが、特定のタンパク質または抗原（ここで：ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対して認識可能な親和性を示して、一般に、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原ＣＤ３０以外のタンパク質または抗原と著しい反応性を示さない。「認識可能な親和性」は、約１０^６Ｍ（ＫＤ）以上の親和性での結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０^－１２～１０^－８Ｍ、１０^－１２～１０^－９Ｍ、１０^－１２～１０^－１０Ｍ、１０^－１１～１０^－８Ｍ、好ましくは約１０^－１１～１０^－９Ｍである場合、結合は特異的であると考えられる。結合ドメインが特異的に標的と反応するか、または標的に結合するかは、とりわけ、前記結合ドメインの、標的タンパク質または抗原との反応を、前記結合ドメインの、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原以外のタンパク質または抗原との反応と比較することによって、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の文脈において定義される結合ドメインは、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原以外のタンパク質または抗原に本質的または実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインは、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ以外のタンパク質に結合することができず、第２の結合ドメインは、標的細胞表面抗原以外のタンパク質に結合することができない）。

用語「本質的に／実質的に結合しない」または「結合できない」は、本発明の結合ドメインが、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原以外のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原以外のタンパク質または抗原に対して３０％超の反応性を示さない（好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、特に好ましくは９％、８％、７％、６％、または５％以下）ことを意味し、これによって、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原への結合は、１００％に設定される。

特異的結合は、結合ドメインおよび抗原のアミノ酸配列内の特異的モチーフによって影響されると考えられている。ゆえに、結合が、その一次構造、二次構造、および／または三次構造の結果として、かつ前記構造の二次修飾の結果として達成される。抗原相互作用面の、その特異的抗原との特異的相互作用は、前記面の、抗原への単純な結合をもたらし得る。さらに、抗原相互作用面の、その特異的抗原との特異的相互作用は、代替的または追加的に、例えば抗原の高次構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化等に起因する、シグナルの開始をもたらし得る。

用語「可変」は、配列内の可変性を示し、かつ特定の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する抗体または免疫グロブリンドメインの部分（すなわち、「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との対形成は、単一の抗原結合面を一緒に形成する。

可変性は、抗体の可変ドメインの全体を通して均一に分布していない；可変性は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメイン内に集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存されている（すなわち、非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭまたはＦＲ）と呼ばれ、三次元空間において６つのＣＤＲの足場を提供して、抗原結合表面を形成する。天然に存在する重鎖および軽鎖の可変ドメインは、３つの超可変領域によって連結された、主にβシート構成を採用する４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を含み、これらは、βシート構造を連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して一緒に保持されて、他方の鎖由来の超可変領域と共に、抗原結合面の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．参照）。

用語「ＣＤＲ（複数含む）」は、相補性決定領域を指し、その３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３）の結合特性を構成し、３つが重鎖可変領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３）の結合特性を構成する。ＣＤＲは、抗体の、抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含有するので、抗体分子の機能活性に寄与する：ＣＤＲは、抗原特異性の主な決定因子である。

正確な定義上のＣＤＲの境界および長さは、様々な分類系およびナンバリング系に従う。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、コンタクト、または本明細書中に記載されるナンバリング系が挙げられる他のあらゆる境界定義によって参照され得る。異なる境界にも拘らず、これらの系は各々、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいて、ある程度の重なりがある。したがって、これらの系に従うＣＤＲ定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さおよび境界領域が異なり得る。例えばＫａｂａｔ（種間配列可変性に基づくアプローチ）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ）、および／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；およびＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）参照。抗原結合面を特徴付けるためのさらに別の規格として、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられるＡｂＭ定義がある。例えば、抗体可変ドメインのタンパク質配列および構造分析（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ）於：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）参照。２つの残基同定技術が、重複するが同一ではない領域を定義する限りでは、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ系に従うナンバリングが好ましい。

典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類され得るループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループによって採用される主鎖高次構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうち５つが、利用可能な高次構造の限られたレパートリーしか有していないことが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分における高いアミノ酸配列可変性にも拘らず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用されたループ構造と、これを取り囲むアミノ酸配列との間には、関係がある。特定のカノニカルクラスの高次構造は、ループの長さ、およびループ内の、そして保存されたフレームワーク（すなわち、ループの外側）内の重要な位置に存在するアミノ酸残基によって決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。

また、用語「カノニカル構造」は、例えばＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によってカタログ化されているように、抗体の線状配列に関する考慮事項を含み得る。Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（系）は、一貫して抗体可変ドメインのアミノ酸残基をナンバリングするための広く採用されている規格であり、本明細書中の他の箇所でも言及されるように、本発明において適用される好ましいスキームである。抗体のカノニカル構造を決定するための追加的な構造的考慮事項を用いることもできる。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによって完全に反映されていない差異を、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．のナンバリング系によって説明することができ、かつ／または他の技術、例えば結晶学および二次元もしくは三次元計算モデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列が、カノニカルクラスに配置されてよく、これにより、とりわけ、（例えば、ライブラリ内に種々のカノニカル構造を含めたいという要望に基づいて）適切なシャーシ配列を同定することが可能となる。抗体アミノ酸配列のＫａｂａｔナンバリング、およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．によって記載される構造的考慮事項、ならびに抗体構造のカノニカル態様の構築への影響（ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が、文献に記載されている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成が、当該技術において周知である。抗体構造のレビューについては、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８参照。免疫情報学におけるグローバルリファレンスとして、ＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ））の三次元（３Ｄ）構造データベースがある（Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３８，Ｄ３０１－３０７）。ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ構造データが、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ）から抽出されて、内部ツールを用いて、分類のＩＭＧＴ概念に従って注釈付けされる。ゆえに、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢは、３Ｄ構造のアミノ酸配列で発現される最も近い遺伝子および対立遺伝子を、当該配列をＩＭＧＴドメイン参照ディレクトリとアラインメントすることによって提供する。このディレクトリは、抗原受容体について、定常遺伝子によってコードされるドメインのアミノ酸配列、ならびに生殖細胞系可変遺伝子およびジョイニング遺伝子の翻訳を含有する。アミノ酸配列のＣＤＲ領域を、好ましくは、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅデータベースを用いて決定した。

軽鎖のＣＤＲ３、そして特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域内で抗原結合に最も重要な決定因子を構成し得る。一部の抗体構築体では、重鎖ＣＤＲ３は、抗原と抗体との間の主要な接触領域を構成するようである。ＣＤＲ３のみを変異させるインビトロ選択スキームを用いて、抗体の結合特性を変えるか、またはどの残基が抗原の結合に寄与するかを判定することができる。それゆえに、ＣＤＲ３は典型的に、抗体結合面内の最大の分子多様性源である。例えば、Ｈ３は、２アミノ酸残基ほど短くてもよいし、２６アミノ酸を超えてもよい。

古典的な完全長抗体または免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結されている一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。ＶＨに最も近いＣＨドメインは、通常、ＣＨ１と称される。定常（「Ｃ」ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害および補体活性化等の種々のエフェクタ機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれて、例えば、細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。

アセンブリおよび体細胞突然変異後の抗体遺伝子の配列は非常に多様であり、これらの多様な遺伝子は、１０^１０個の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体的または部分的に由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。当該配列は、重鎖のＶ、Ｄ、およびＪセグメント、ならびに軽鎖のＶおよびＪセグメントのインビボでの再配置によって生成され得る。これ以外にも、当該配列は、再配置が起こる、例えばインビトロ刺激に応答して、細胞から生成され得る。これ以外にも、当該配列の一部または全てを、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、突然変異誘発、および他の方法によって得ることができる（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書参照）。レパートリーは、１つの配列のみを含んでもよいし、遺伝的に多様なコレクション内の配列を含む複数の配列を含んでもよい。

また、本発明の文脈において定義される抗体構築体は、例えば分子の単離に有益であるか、または分子の適合された薬物動態学的プロファイルに関連する追加のドメインを含み得る。抗体構築体の単離に有益なドメインは、単離方法、例えば単離カラムにより捕捉することができるペプチドモチーフまたは二次導入部分から選択され得る。そのような追加的なドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃ－タグ、ＨＡＴ－タグ、ＨＡ－タグ、ＴＡＰ－タグ、ＧＳＴ－タグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ－タグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ－タグ）、Ｆｌａｇ－タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグおよびその変異体（例えばＳｔｒｅｐｌｌ－タグ）、ならびにＨｉｓ－タグとして知られているペプチドモチーフを含む。同定されたＣＤＲによって特徴付けられる、本明細書中で開示される全ての抗体構築体は、分子のアミノ酸配列内の連続するＨｉｓ残基、好ましくは５つ、より好ましくは６つのＨｉｓ残基（ヘキサ－ヒスチジン）のリピートとして一般に知られているＨｉｓタグドメインを含み得る。Ｈｉｓタグは、例えば抗体構築体のＮ末端またはＣ末端に位置決めされていてもよく、好ましくはＣ末端に位置決めされている。最も好ましくは、ヘキサ－ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号２０）が、ペプチド結合を介して、本発明に従う抗体構築体のＣ末端に連結されている。加えて、持続的放出用途および薬物動態プロファイル向上のために、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡのコンジュゲート系がポリ－ヒスチジンタグと組み合わされてもよい。

本明細書中に記載される抗体構築体のアミノ酸配列修飾もまた企図される。例えば、抗体構築体の結合親和性および／または他の生物学的特性を向上させることが所望される場合がある。抗体構築体のアミノ酸配列変異体が、抗体構築体核酸中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。以下に記載されるアミノ酸配列修飾の全てが、修飾されていない親分子の所望の生物学的活性（ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ、および標的細胞表面抗原への結合）を依然として保持する抗体構築体をもたらすはずである。

用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、典型的に、当該技術において認識されている定義を有するアミノ酸、例えば：アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｉｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＨｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リジン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）からなる群から選択されるアミノ酸を指すが、修飾アミノ酸、合成アミノ酸、または希アミノ酸を所望通りに用いてもよい。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負荷電側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正荷電側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または非荷電極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｉｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）を有するものとして分類することができる。

アミノ酸修飾の例として、抗体構築体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または残基中への挿入、および／または残基の置換が挙げられる。最終構築体が所望の特性を有する限り、最終構築体に到達するための、欠失、挿入、および置換のあらゆる組合せが行われる。また、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数または位置の変化等の、抗体構築体の翻訳後プロセスが改変し得る。

例えば、ＣＤＲの各々において、１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸が挿入、置換または欠失されていてもよい（勿論、長さによって決まる）一方、ＦＲの各々において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸が挿入、置換、または欠失されていてもよい。好ましくは、抗体構築体中へのアミノ酸配列挿入として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基から、１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さに及ぶアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。また、対応する修飾が、本発明の文脈において定義される抗体構築体の第３のドメイン内で行われてもよい。本発明の文脈において定義される抗体構築体の挿入変異体は、酵素の抗体構築体のＮ末端もしくはＣ末端への融合、またはポリペプチドへの融合を含む。

置換突然変異誘発にとって最も注目する部位として、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられる（これらに限定されない）が、重鎖および／または軽鎖におけるＦＲの改変もまた企図される。置換は好ましくは、本明細書中に記載される保存的置換である。好ましくは、ＣＤＲまたはＦＲの長さに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸がＣＤＲ内で置換されていてもよい一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のアミノ酸が、フレームワーク領域（ＦＲ）内で置換されていてもよい。例えば、ＣＤＲ配列が６つのアミノ酸を包含するならば、これらのアミノ酸の１つ、２つ、または３つが置換されていることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含するならば、これらのアミノ酸の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つが置換されていることが想定される。

突然変異誘発に好ましい位置である抗体構築体の特定の残基または領域を同定するための有用な方法が、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５（１９８９）によって記載される「アラニン走査突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」と呼ばれる。ここで、抗体構築体内の標的残基の残基または群が同定されて（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕ等の荷電残基）、中性アミノ酸または負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）によって置換されて、アミノ酸の、エピトープとの相互作用に影響が及ぶ。

次いで、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置が、置換部位に更なる変異体または他の変異体を導入することによって最適化される。ゆえに、アミノ酸配列変異を導入する部位または領域は予め決定されていても、突然変異自体の性質は予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位における突然変異の性能を分析または最適化するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは標的領域にて行うことができ、そして発現された抗体構築体変異体を、所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングする。知られている配列を有するＤＮＡ内の所定の部位に置換突然変異をもたらす手法が周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発等がある。突然変異体のスクリーニングは、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａ等の抗原結合活性および標的細胞表面抗原結合のアッセイを用いて行われる。

一般に、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲの１つ以上または全てにおいてアミノ酸が置換されているならば、その後得られる「置換」配列は、「元々の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、さらにより好ましくは８０％または８５％、特に好ましくは９０％または９５％同一であることが好ましい。これは、「置換」配列とどの程度同一であるかが、ＣＤＲの長さによって決まることを意味する。例えば、５つのアミノ酸を有するＣＤＲは、好ましくは、その置換配列と８０％同一であり、少なくとも１つのアミノ酸が置換されている。したがって、抗体構築体のＣＤＲは、その置換配列に対して異なる程度の同一性を有し得る、例えば、ＣＤＲＬ１は８０％の同一性を有し得るが、ＣＤＲＬ３は９０％の同一性を有し得る。

好ましい置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎまたはｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、保存的置換である。しかしながら、抗体構築体が、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６ａに第１のドメインを介して、そして標的細胞表面抗原に第２のドメインを介して結合する能力を保持し、かつ／またはそのＣＤＲが、その後置換される配列と同一性を有する（「元々の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％または６５％、より好ましくは７０％または７５％、さらにより好ましくは８０％または８５％、特に好ましくは９０％または９５％同一）限り、あらゆる置換（非保存的置換または以下の表３に列挙される「例示的な置換」由来の１つ以上が挙げられる）が想定される。

保存的置換を、表１に、「好ましい置換」という見出しで示す。そのような置換が、生物学的活性の変化をもたらすならば、表１において「例示的な置換」と呼ばれるか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるような、より実質的な変化を導入して、産物を、所望の特徴についてスクリーニングしてもよい。

本発明の抗体構築体の生物学的特性における実質的な修飾が、（ａ）置換の領域内でのポリペプチド骨格の構造、例えば、シート高次構造もしくはらせん高次構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の大部分の維持に及ぼす効果が大きく異なる置換を選択することによって、達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｈｒ，ａｓｎ，ｇｉｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらのクラスの一方のメンバーを、もう一方のクラスと交換することを伴うこととなる。抗体構築体の適切な高次構造の維持に関与しない任意のシステイン残基が、分子の酸化安定性を向上させ、かつ異常な架橋を防止するために、一般にセリンで置換されてもよい。逆に、システイン結合が、安定性を向上させるために、抗体に付加されてもよい（特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。

アミノ酸配列について、配列同一性および／または類似性が、以下に限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実現（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７－３９５によって記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムが挙げられる、当該技術において知られている標準的な技術を用いて（好ましくはデフォルト設定を用いて、または精査によって）判定される。好ましくは、同一性パーセントは、以下のパラメータに基づくＦａｓｔＤＢによって算出される：ミスマッチペナルティ１；ギャップペナルティ１；ギャップサイズペナルティ０．３３；および連結ペナルティ３０、「配列比較および分析における現在の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．

有用なアルゴリズムの例が、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメントを用いて、関連配列の群から多重配列アラインメントを作成する。また、アラインメントを作成するのに用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０プログレッシブアラインメント方法の簡略化を用いる；当該方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３によって記載されるものと類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとして、デフォルトギャップウェイト３．００、デフォルトギャップ長ウェイト０．１０、および重み付けしたエンドギャップが挙げられる。

有用なアルゴリズムの別の例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；およびＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０－４８０から入手したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、大部分がデフォルト値に設定されているいくつかの検索パラメータを用いる。調整可能なパラメータは、以下の値で設定される：ｏｖｅｒｌａｐ ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝ｌｌ。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的値であり、特定の配列の組成、および注目する配列が検索されることになる特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体によって確立される；しかしながら、感度を上げるために値を調整してもよい。

追加の有用なアルゴリズムが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２によって報告されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコアを用いる；閾値Ｔパラメータを９に設定；非ギャップ拡張をトリガーするためのツーヒット方法、電荷ギャップ長ｋは１０＋ｋのコスト；Ｘｕを１６に設定、Ｘｇを、データベース検索段階については４０に、アルゴリズムの出力段階については６７に設定。ギャップアラインメントを、約２２ビットに対応するスコアによってトリガーする。

一般に、個々の変異体ＣＤＲ間またはＶＨ／ＶＬ配列間のアミノ酸の相同性、類似性、または同一性は、本明細書中に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には、好ましくは、相同性または同一性が、少なくとも６５％または７０％、より好ましくは少なくとも７５％または８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、およびほぼ１００％増大している。同様に、本明細書中で同定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗体構築体のコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージと定義される。具体的な方法は、オーバーラップスパンおよびオーバーラップ割合がそれぞれ１および０．１２５に設定されているデフォルトパラメータに設定したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。

一般に、個々の変異体ＣＤＲまたはＶＨ／ＶＬ配列をコードするヌクレオチド配列と、本明細書中に示されるヌクレオチド配列との核酸配列の相同性、類似性、または同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には、好ましくは、相同性または同一性が、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、およびほぼ１００％増大している。ゆえに、「変異体ＣＤＲ」または「変異体ＶＨ／ＶＬ領域」は、本発明の文脈において定義される親ＣＤＲ／ＶＨ／ＶＬに対して特定の相同性、類似性、または同一性を有するものであり、親ＣＤＲまたはＶＨ／ＶＬの特異性および／または活性の生物学的機能を、以下に限定されないが、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％共有する。

一実施形態において、本発明に従う抗体構築体のヒト生殖細胞系に対する同一性のパーセンテージは、≧７０％または≧７５％、より好ましくは≧８０％または≧８５％、さらにより好ましくは≧９０％、最も好ましくは≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、または≧９６％である。ヒト抗体生殖細胞系遺伝子産物に対する同一性は、治療タンパク質が、処置中の患者において薬物に対する免疫応答を誘発するリスクを引き下げるための重要な特徴であると考えられる。Ｈｗａｎｇ＆Ｆｏｏｔｅ（「操作された抗体の免疫原性（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」；Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）３－１０）は、薬物抗体構築体の非ヒト部分の減少が、処置中の患者において抗薬物抗体を誘導するリスクの低下をもたらすことを実証している。臨床的に評価された抗体薬物と、それぞれの免疫原性データとの網羅的な数を比較することによって、抗体のＶ領域のヒト化が、タンパク質の免疫原性を、改変されていない非ヒトＶ領域を有する抗体（患者の平均２３．５９％）よりも低くする（患者の平均５．１％）という傾向が示される。それゆえに、ヒト配列に対するより高い程度の同一性が、抗体構築体の形態のＶ領域ベースのタンパク質治療薬に所望される。生殖細胞系同一性を判定するこの目的のために、ＶＬのＶ領域を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアを用いたヒト生殖系列ＶセグメントおよびＪセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）のアミノ酸配列、ならびに同一のアミノ酸残基をＶＬのアミノ酸残基の総数（パーセント）で割ることによって算出したアミノ酸配列とアラインすることができる。同じことが、ＶＨセグメント（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）についてあり得るが、ＶＨ ＣＤＲ３が、その高い多様性および既存のヒト生殖細胞系ＶＨ ＣＤＲ３アラインメントパートナーの欠如に起因して除外され得ることを除く。次いで、組換え技術を用いて、ヒト抗体生殖細胞系遺伝子に対する配列同一性を高めることができる。

特定の実施形態は、本発明の文脈において定義される抗体構築体、ならびにこのセクションおよび本明細書中の他の箇所に例示的に記載されているもの等の１つ以上の更なる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。賦形剤は、有効性を向上させるために、かつ／または製剤およびプロセスを、例えば、製造、出荷、貯蔵、使用前調製、投与の間に、そしてその後に生じるストレスに起因する分解および腐敗に対して安定化させるために、本発明の一態様の製剤の物理的、化学的、または生物学的特性を調整すること、例えば粘度および／またはプロセスを調整することといった多種多様な目的に関して、本発明に用いることができる。

特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透を修飾、維持、または保存する目的のための製剤材料を含有してもよい（レミントンの薬学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ），１８’’Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ参照）。そのような実施形態において、適切な製剤材料として、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：
・アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、プロリン、２－フェニルアラニン（荷電アミノ酸を含む）、好ましくは、リジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸、および／またはヒスチジン；
・抗菌剤および抗真菌剤等の抗菌物質；
・アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；
・組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨにて維持するのに用いられるバッファ、バッファ系、および緩衝剤（バッファの例として、ホウ酸塩バッファ、重炭酸塩バッファがある）；
・トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、およびヒスチジン；例えば、約ｐＨ７．０～８．５のトリスバッファ；
・プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の非水性溶媒、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステル；
・水が挙げられる水性キャリア、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられるアルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液；
・ポリエステル等の生分解性ポリマー；
・マンニトールまたはグリシン等の増量剤；
・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤；
・等張化剤および吸収遅延剤；
・カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン等の錯化剤；
・充填剤；
・単糖類；二糖類；および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン等）；（炭水化物は、非還元糖、好ましくは、トレハロース、スクロース、オクタサルファート、ソルビトール、またはキシリトールであり得る）；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質性キャリア、例えば、ヒトもしくはウシ血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン、好ましくはヒト起源のもの；
・着色剤および香味剤；
・グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］－モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤；
・希釈剤；
・乳化剤；
・ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；
・ナトリウム等の塩形成対イオン；
・防腐剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガス等（例として、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素がある）；
・Ｚｎ－タンパク質複合体等の金属複合体；
・溶媒および共溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）；
・糖および糖アルコール、例えば、トレハロース、スクロース、オクタサルファート、マンニトール、ソルビトール、またはキシリトールスタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、マイオイニシトース、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、マイオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えばイノシトール）、ポリエチレングリコール；および多価糖アルコール；
・懸濁化剤；
・プルロニクス、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０等のポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール等の界面活性剤または湿潤剤（界面活性剤は、好ましくは＞１．２ＫＤの分子量を有する洗剤、および／または好ましくは＞３ＫＤの分子量を有するポリエーテルであり得る；好ましい洗剤についての非限定的な例として、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＴｗｅｅｎ ８５がある；好ましいポリエーテルについての非限定的な例として、ＰＥＧ ３０００、ＰＥＧ ３３５０、ＰＥＧ ４０００、およびＰＥＧ ５０００がある）；
・スクロースまたはソルビトール等の安定性増強剤；
・アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール等の張度増強剤；
・塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、ラクトリンゲル液、または固定油が挙げられる非経口送達ビヒクル；
・流体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくもの等）が挙げられる静脈内送達ビヒクル。

医薬組成物の異なる構成成分（例えば、先で列挙したもの）が、異なる効果を有し得、例えば、アミノ酸が、バッファ、安定剤、および／または抗酸化剤として作用し得ることは、当業者には明らかである；マンニトールは、増量剤および／または張度増強剤としての機能を果たし得る；塩化ナトリウムは、送達ビヒクルおよび／または張度増強剤としての機能を果たし得る；その他。

特定の実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達フォーマット、および所望の投薬量に応じて当業者によって決定されることとなる。例えば、前掲のレミントンの薬学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）参照。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってもよく、非経口投与用の組成物に普通にみられる他の材料が補充されていてもよい。血清アルブミンと混合された中性緩衝生理食塩水または生理食塩水が、さらに例示的なビヒクルである。
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本明細書中で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。ゆえに、例えば、「試薬」への言及は、そのような異なる試薬の１つ以上を含み、「方法」への言及は、本明細書中に記載される方法について修正または置換され得る、当業者に知られている同等の工程および方法への言及を含む。

別段の指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の要素の全てに言及すると理解されるべきである。当業者であれば、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはルーチン的な実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。

用語「および／または」は、本明細書中で用いられる場合、「および」、「または」、および「前記用語によって関係する要素の全てまたは他のあらゆる組合せ」の意味を含む。

本明細書中で用いられる用語「約」または「おおよそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。しかしながら、具体的な数も含み、例えば、約２０は２０を含む。

用語「～未満」または「～超」は、具体的な数を含む。例えば、２０未満は、以下を意味する。同様に、～超またはよりも大きいは、以上を意味する。

本明細書および以下の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の要求がない限り、文言「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載された整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含むが、他のいかなる整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群も除外しないことを意味すると理解される。本明細書中で用いられる場合の用語「を含む」は、用語「を含有する」または「が挙げられる」で置き換えることができ、または時には、本明細書中で用いられる場合、用語「を有する」で置き換えることができる。

本明細書中で用いられる場合の「からなる」は、特許請求の範囲の要素で指定されていないあらゆる要素、工程、または成分を除外する。本明細書中で用いられる場合の「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料または工程を排除しない。

本明細書中の各例において、用語「を含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。

本発明は、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、および物質等に限定されず、従って変わり得ることが理解されるべきである。本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することは意図されない。

本明細書の本文の全体を通して引用される全ての刊行物および特許（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書等が挙げられる）は、前掲であろうと下記であろうと、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行発明による開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。参照によって組み込まれる材料が、本明細書と矛盾するか、または首尾一貫しない限りにおいて、本明細書が、そのような材料に取って代わる。

抗体の下流手順の特徴は、以下の精製工程前の、非常に大きな容量を引き下げるための細胞培養物からのタンパク質の捕捉工程である。そのような捕捉工程は、クロマトグラフィ手順であり得る。

本発明は、クロマトグラフィ溶出液の低ｐＨでの長時間処理を達成することによって、過酷な条件にも拘わらず、高収率の活性抗体を回収することができるという予想外の知見に基づいている。

図１は、吸着剤として４－メルカプト－エチル－ピリジン（ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標））を用いる疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ＨＣＩＣ）が、細胞培養物からＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体を捕捉することができたが、ｐＨ３．７にて溶出して、ｐＨ７．０に中和した後（０時間）に、抗体活性の約５０％しか回収されなかったことを示している。驚くべきことに、本発明者らは、ｐＨ３．７での約２日間のインキュベーション後に１００％の抗体活性が回復することを見出した。これは、酸性条件下で予想されるタンパク質劣化とは対照的である。この現象の動態を図１に示す。

さらに、低ｐＨ処理は、例２に記載されるような高分子量形態の減少を明らかにした。これは、ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体の精製の利益を結論付けている。

低ｐＨでのインキュベーションは、ウイルス力価を引き下げるという更なる利点を有する。しかしながら、先行技術の下流プロセシングにおけるそのような酸インキュベーション工程は、タンパク質劣化を回避するために、約１時間に保たれる。

ゆえに、第１の態様において、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩに対する第１の結合ドメインと、ＣＤ３０に対する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築体を生成する方法を提供し、当該方法は、以下の工程を含む：
（ａ）溶液から抗体構築体をクロマトグラフィで捕捉する工程；
（ｂ）捕捉マトリックスから抗体構築体を溶出する工程；
（ｃ）溶出した抗体構築体の溶液中のｐＨを、ｐＨ２．５～ｐＨ３．９の範囲内の低ｐＨに引き下げて、抗体構築体をこの条件下で少なくとも４０時間インキュベートする工程；
（ｄ）ｐＨ４．５～ｐＨ８．０の範囲内のｐＨに中和する工程。

当該技術において知られているように、クロマトグラフィは、混合物を分離するためのラボ技術である。混合物が、移動相と呼ばれる流体中に溶解されて、これが、固定相と呼ばれる別の材料を保持する構造を通って運ばれる。クロマトグラフィ法は、抗体技術の分野において広く用いられている；Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（編者）、抗体のプロセススケール精製（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｃａｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）２００９参照。

本明細書中で以下に詳細に記載されるように、本発明の方法の工程（ｃ）について記載されるような溶液中のｐＨの引下げは、酸性溶液を添加することによって達成される。本発明の方法に沿って、工程（ｃ）に従うインキュベーションは、≦１２℃、好ましくは≦１０℃の温度にて実行されることが好ましい。より好ましくは、工程（ｃ）に従うインキュベーションは、２℃～１０℃の範囲内、最も好ましくは２℃～８℃の範囲内の温度にて実行される。

本発明の方法の工程（ｃ）に示されるような低ｐＨ溶液中での抗体構築体のインキュベーションは、少なくとも４０時間示されて、本発明の方法の工程（ｄ）に従う溶液の中和によって停止される。中和される溶液は、塩基性（アルカリ性）溶液の添加によってｐＨ４．５～ｐＨ８．０の範囲内のｐＨに適合される。中和される溶液は、ｐＨ６．５～ｐＨ７．５の範囲内のｐＨに適合されることが好ましい。より好ましくは、中和される溶液は、ｐＨ６．８～ｐＨ７．２の範囲内のｐＨに適合される。

先に記載されるように、タンパク質である抗体構築体の、低ｐＨ（酸）条件下でのインキュベーションは、あらゆるタンパク質についてストレスが多い。それにも拘わらず、短期間（一般的に５分～１２０分の範囲内；Ｃｈｅｎ ２０１５，ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ａｎｄ Ｔｅｃｈ，６８，１７，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（編者）、抗体のプロセススケール精製（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｃａｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）２００９ Ｗｉｌｅｙ ｃｈａｐｔｅｒ ４．５．２参照）の間、そのような低ｐＨ工程は、可能性があるウイルス混入を不活化するための生物製剤の下流プロセシングにおける標準的な手順の一部である。

本発明の方法に沿って、ＦｃγＲＩＩＩに対する抗体構築体の第１の結合ドメインは、ＣＤ１６Ａに結合する。

本発明の方法について、抗体構築体は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ＿ＣＤ１６Ａ）；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ１６Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＿ＣＤ１６Ａ）；
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ３０に特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ＿ＣＤ３０Ａ）；
（ｄ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ３０Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＿ＣＤ３０Ａ）
からなる群からの少なくとも４つの可変ドメインを含むことが好ましい。

また、本発明の方法について、抗体構築体の可変ドメインは、１２個以下のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ３によって次々に連結されて、Ｎ末端からＣ末端までの２つのポリペプチド鎖の各々の内部に、ＶＨ＿ＣＤ３０－Ｌ１－ＶＬ＿ＣＤ１６Ａ－Ｌ２－ＶＨ＿ＣＤ１６Ａ－Ｌ３－ＶＬ＿ＣＤ３０の順序で配置されていることが好ましい。

本発明の方法の好ましい実施形態において、抗体構築体のリンカーＬ２は、３～９個のアミノ酸残基からなる。

さらに、本発明の方法について、抗体構築体は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。

本発明の方法の好ましい実施形態において、工程（ｃ）におけるｐＨは、ｐＨ３．０～ｐＨ３．８の範囲内、好ましくはｐＨ３．５～ｐＨ３．７５の範囲内、より好ましくはｐＨ３．６５～ｐＨ３．７の範囲内である。

また、本発明の方法について、抗体構築体は、工程（ｃ）において、低ｐＨで少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも９６時間インキュベートされることが好ましい。先で本明細書中に記載されるように、工程（ｃ）に従うインキュベーションは、≦１２℃、好ましくは≦１０℃の温度にて実行される。より好ましくは、工程（ｃ）に従うインキュベーションは、２℃～１０℃の範囲内、最も好ましくは２℃～８℃の範囲内の温度にて実行される。

更なる実施形態において、抗体構築体は、工程（ｃ）において、医薬品（例えば、米国薬局方または欧州薬局方によって定義される）の貯蔵に用いられる室温（ＲＴ）、例えば１５～３０℃、特に１５～２５℃、とりわけ２０～２５℃にてインキュベートされる。

特定の実施形態において、工程（ｃ）は、工程（ｄ）が実行される前に、低ｐＨでの少なくとも１週、少なくとも３週、３～５週、または最大５週を含む。

更なる態様において、抗体は、工程（ｃ）において、室温にて、低ｐＨで少なくとも１週間、少なくとも３週間、３～５週間、または最大５週間インキュベートされる。

本発明の方法の好ましい実施形態において、工程（ａ）のクロマトグラフィ捕捉方法は、プロテインＬクロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、または混合モードクロマトグラフィ（ＭＭＣ）からなる群から選択される。

混合モードクロマトグラフィ（ＭＭＣ）またはマルチモーダルクロマトグラフィは、固定相と分析物との間の複数の形態の相互作用を利用して、これらの分離を達成するクロマトグラフィ法を指す。したがって、このタイプのクロマトグラフィ法は、生物製剤、例えば抗体および抗体構築体の調製および単離に一般的に用いられる。ＭＭＣは、物理的なＭＭＣと化学的なＭＭＣとに分類することができる。前者の方法では、固定相は、２種類以上の充填物で構成されている。化学的方法では、２つ以上の官能基を含有する１種類の充填物のみが用いられる。化学的方法の例として、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）＋疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、ＩＣＥ＋逆相液体クロマトグラフィ（ＲＰＬＣ）、親水性相互作用クロマトグラフィまたは親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）＋ＲＰＬＣ、ＨＩＬＩＣ＋ＩＥＣ、およびサイジング排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）＋ＩＥＣが挙げられる。

本発明の方法について、工程（ａ）におけるクロマトグラフィ捕捉は、好ましくはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆを用いる、プロテインＬクロマトグラフィ、またはＧＥのＣａｐｔｏ Ｌ、または疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ＨＣＩＣ）のいずれかであることが好ましい。

本発明の方法の好ましい実施形態において、疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ＨＣＩＣ）は、混合モードクロマトグラフィ吸着剤（例えばＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標））である。また、ＨＣＩＣの後に陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）および／または陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）が続くことが好ましい。

本発明の方法について、当該方法は、以下の追加の工程をさらに含むことが好ましい：
（ｅ）陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、または混合モードクロマトグラフィ（ＭＭＣ）からなる群から選択される少なくとも１つのクロマトグラフィ法によって、溶液から抗体構築体を捕捉する工程。

本発明の方法について、工程（ｅ）におけるクロマトグラフィ捕捉は、好ましくはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆを用いる、プロテインＬクロマトグラフィ、または疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ＨＣＩＣ）のいずれかであることが好ましい。本発明の方法の好ましい実施形態において、疎水性電荷誘導クロマトグラフィ（ＨＣＩＣ）は、混合モードクロマトグラフィ吸着剤（例えばＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標））である。また、ＨＣＩＣの後に陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）および／または陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）が続くことが好ましい。

更なる実施形態において、本発明の方法は、工程（ａ）の前に追加のクロマトグラフィ捕捉工程を含む。そのような追加のクロマトグラフィ捕捉工程は、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィであってもよい。特定の実施形態において、本発明の方法は、下流に上記の工程（ａ）および工程（ｅ）のクロマトグラフィ法が続く、クロマトグラフィ捕捉工程、例えば陰イオン交換クロマトグラフィを含む。

更なる実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つの追加の濾過工程を含む。そのような濾過工程は、工程（ｄ）の後であってもよい。例えば、濾過工程は、工程（ｄ）と工程（ｅ）との間にあってもよい。特定の実施形態において、本発明の方法は、工程（ｅ）の後かつ／または工程（ａ）の前に、更なる追加の濾過工程を含んでもよい。例えば、本発明の方法は、工程（ａ）の前、工程（ｄ）と工程（ｅ）との間、そして工程（ｅ）の後に、濾過工程を含んでもよい。好ましくは、そのような濾過工程は、限外濾過である。

さらに、本発明の方法について、工程（ｂ）における抗体構築体の溶出は、酢酸ナトリウム／酢酸、ギ酸ナトリウム／ギ酸、クエン酸ナトリウム／クエン酸、およびコハク酸ナトリウム／コハク酸を含むバッファからなる群から選択されるバッファを用いて実行されることが好ましい。各バッファは、適用されるパラメータに応じて、約１０ｍＭ～最大約１００ｍＭ、稀に最大２００ｍＭの濃度範囲で用いられる。

本発明の方法の工程（ｄ）に従う中和について、そのような中和は、より高いｐＨのバッファまたは溶液を添加することによって達成されることが好ましい。適切なバッファまたは溶液の例として、例えばＡＥＸバッファ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ；ｐＨ７．０のようなＴｒｉｓ緩衝液が挙げられるが、これに限定されない。勿論、当業者であれば、工程（ｄ）に従う中和に適した代替のバッファ液を知っている。

本発明の方法について、抗体構築体は、工程（ｆ）において医薬組成物として製剤化されることがさらに好ましい。

また、本発明は、本発明の方法によって生成される抗体構築体を提供する。

本発明の一態様に従う医薬組成物の一実施形態において、組成物は、患者に静脈内投与される。

本明細書中に記載される医薬組成物の静脈内（ｉｖ）投与のための方法およびプロトコールは、当該技術において周知である。

本発明の一態様において、ＣＤ３０^＋増殖性疾患または腫瘍性疾患の予防、処置、または改善に使用される医薬組成物が提供される。好ましくは、前記腫瘍性疾患は、悪性疾患、好ましくは癌である。

本発明の医薬組成物の一実施形態において、同定された悪性疾患は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、および固形腫瘍からなる群から選択される。

また、一実施形態において、本発明は、ＣＤ３０^＋増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための方法であって、本発明の方法に従って生成される抗体構築体を、処置または改善を必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。

前記腫瘍性疾患は、悪性疾患、好ましくは癌であることが好ましい。

疾患を処置または改善するための前記方法の一実施形態において、前記悪性疾患は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、および固形腫瘍からなる群から選択される。

以下の例はさらに、本発明を実証しており、限定することは意図されない。

例１
クロマトグラフィ
本例は、本発明に従うＨＣＩＣクロマトグラフィを用いたＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体（配列番号１３）の精製を説明する。

配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性タンデムダイアボディを、以前に記載されるように（Ｒｅｕｓｃｈ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ６：３，７２７－７３８，２０１４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生させた。細胞培養液上清中のタンパク質濃度は、１３ｍｇ／Ｌであった。

捕捉にＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌｌ（商標）樹脂を用いて、ＨＣＩＣクロマトグラフィを実行した。カラムのロードを、表１に示すように算出した。ロードの濃度の変動は、以下の通りであった：
０：ＭＥＰ溶出液 ０．４ｍｇ／ｍＬ
＋：濃縮ＭＥＰ溶出液 ０．８ｍｇ／ｍＬ
－：希釈ＭＥＰ溶出液 ０．２ｍｇ／ｍＬ

ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ画分を、表２に示すようにｐＨ３．７～４．０にて希釈した。

動態
酸性溶出液のｐＨを、０時間（Ｔ０）、４時間（Ｔ１）、１８時間（Ｔ２）、２４時間（Ｔ３）、そして４８時間（Ｔ４）目に、Ｔｒｉｓ＿０５４＿０．５Ｍ＿ｐＨ１０．５により、ｐＨ７．０に上げた。

タンパク質の濃度を、０．５ｍＬのサンプルにより、アポトーシス阻害剤（ＡＰＩ）ＥＬＩＳＡによって測定した。

サンプルＡ１、Ａ２、およびＡ３は、４８時間後に１５０％を超える収率を示す。ｐＨ７．０、－７０℃（プローブＡ４、図示せず）でのサンプルの貯蔵は、ＡＰＩ－ＥＬＩＳＡによる濃度の測定に大きく影響しなかった。

ｐＨおよび濃度の変動は、濃度の測定に影響を及ぼさない。ｐＨが高い（Ｂ、Ｄ）ほど、低い反応動態を示し、この動態は、濃度が低いほど低い。低い収率は、サンプルの断片化によって引き起こされない。ｐＨが低い（Ｃ、Ｅ）と、断片化によって引き起こされる収率はより低い結果となる。濃度が高いほど、この効果は増すようである。しかしながら、４時間後の値から、ｐＨ値が低いほど再活性化が増すと仮定され得る。

温度は、タンパク質分解活性による断片化が、高温であるほど強く増すという効果を示している。１５℃にて（Ｆ）１８時間保存すると、５℃（Ａ１、Ａ２、Ａ３）と比較して、断片化による収率の低下が示される。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
中和した溶出液は、経時的に大きく変化していない。２～８℃にて貯蔵した酸性溶出液のみが断片化を示し、これは、－７０℃にて貯蔵したプローブでは観察されなかった。

ｐＨが低いと、５０ｋＤａおよび更なるバンドにて、無傷のモノマーが減る結果となる。

２５℃に温度が上昇すると、４８時間後に、４つのドメインの無傷の分子を伴わないバンドパターンが生じる。

等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析
ＩＥＦ分析は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のバンドパターンと相関した。また、断片化を有するサンプルは、異なるパターンのアイソフォームを示した。

サイズ排除（ＳＥ）－ＨＰＬＣ分析
モノマーの量は、インキュベーション中に、７５％から９１％まで増大し、それぞれの収率と相関した。サンプルは、サンプルの貯蔵とは無関係に、４８時間後に９１％のモノマーを示す。Ａ１の酸性溶出液（－７０℃）は、ＵＶシグナルが検出されなかったため、評価することができなかった。

４８時間後のモノマーの値は、収率と相関した。ｐＨおよび濃度が様々なサンプルは、より低い収率（Ｆ、Ｇ）および多量のモノマーを示した（表３）。

カラム内にロードされるタンパク質の理論量に関する面積の計算は、差異を実証した。サンプルの値に基づいて、４．５未満の値は、沈殿によるタンパク質の損失を示す。これは、低ｐＨまたは温度上昇による断片化を示す全てのＭＥＰ溶出液で観察される。

考察
ＭＥＰクロマトグラフィは、ＡＰＩ－ＥＬＩＳＡで測定した酸性溶出液に基づいて、１００％の収率を示した。標準化された条件での３つのサンプルは、４８時間後に１５０％の収率を示した。活性の増大は、最終的に９０％に増大するモノマーの量と相関した。また、大きな断片化は観察されなかった。中和された溶出液については、－７０℃での貯蔵が可能であるようである。

温度を２５℃に上昇させると、断片化による活性の低下が生じた。

ｐＨおよび濃度の変動は、収率および断片化に影響を及ぼす。ｐＨが低いと、モノマーの断片化が生じた。しかしながら、バンドパターンは、温度研究のサンプルと比較して、異なっていた。バンドパターンは、３５、２５、および１２ｋＤａにて更なるより強いバンドを示したが、かなりスラリー化したサンプルも示した。対照的に、ｐＨが高いほど断片化が生じなかったが、経時的な収率の増大は、４８時間後の収率と同様に、減速した（１１０％および１２６％）。

より高いｐＨでの濃度が高いほど、より低いｐＨでのより速い動態の再活性化、および断片化の増大が引き起こされる。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分析は、断片化による収率の損失の相関を示したが、再活性化の動態を示していない。ＳＥ－ＨＰＬＣでは、断片化が開始されなくなるまで、収率の損失が相関した。断片化が開始した後に、タンパク質が、沈殿に起因して失われ、これは、ＳＥ－ＨＰＬＣの結果を偽陽性に曲解させる。

結果は、酸性インキュベーション中に、活性を打ち消す２つの異なる関連プロセスが進行していることを示している。第１に、凝集に関連する分子が再活性化かつ安定化する。第２に、ｐＨおよび濃度に敏感なタンパク質分解プロセスが、酸性ｐＨにて進行する。

例２
プロテインＬクロマトグラフィ
本例は、本発明に従うプロテインＬクロマトグラフィを用いたＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体（配列番号１３）の精製を説明する。

ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体（配列番号１３）を、以前に記載されるように（Ｒｅｕｓｃｈ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ６：３，７２７－７３８，２０１４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生させた。プロテインＬカラム上にアプライする前に、無細胞収穫物（ＺＡ）を０．２μｍのクリアフィルターを用いて濾過する。

プロテインＬクロマトグラフィを、捕捉のために東ソー株式会社製Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ－６５０Ｆ樹脂を用いて実行した。これ以外にも、ＧＥのＣａｐｔｏ Ｌ材料を、捕捉工程用の樹脂として用いてもよい。ローディングを、４分の滞留時間で実行して、ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体は、樹脂に特異的に結合した。その後の洗浄工程によって、非特異的に結合した物質を除去してから、酸性バッファ（５０ｍＭ酢酸（ＨＯＡｃ／ＮａＯＡｃ）、ｐＨ３．３）でＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体を溶出した。次いで、溶出液の酸性ｐＨ値が、低ｐＨでのインキュベーション工程の役目を果たした。溶出液のｐＨはｐＨ３．４～３．６であり、プロテインＬ溶出液を、室温にて４８～９６時間インキュベートする。潜在的なウイルスの不活化に加えて、低ｐＨでの、好ましくは室温でのインキュベーションは、活性ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体回収の増大（「生成物活性化」）をもたらすことが観察された。高分子量（ＨＭＷ）形態のさらなる減少が観察された。その後、溶出液を、中和せずに２℃～８℃にて、例えば５週の保持時間、貯蔵してもよい。

ｐＨ３．６での生成物活性化
低ｐＨでの溶出液の保持時間が、生成物活性化をもたらし、これは、結合ＥＬＩＳＡによって検出することができた。ＵＶ分析とは対照的に、活性生成物分子のみを検出することができる。生成物活性化の判定のために、保持時間の前後の生成物の量を、結合ＥＬＩＳＡによって測定した。

以下の式を用いた：
生成物活性化［％］＝（保持時間後の溶出液中の生成物の量［ｍｇ］／保持時間前の溶出液中の生成物の量［ｍｇ］）×１００％
最初の試験ランでは、インキュベーションを室温、２～８℃、および－７０℃にて３９時間研究した（表５）。１７４％の最も高い生成物活性化が室温にて観察された。これを、以下の実験でさらに試験した。様々な温度での様々な持続時間を調査した（表６）。－７０℃での保持時間は既に、４８時間後に顕著な低い生成物濃度をもたらした。最良の結果が、室温（ＲＴ）にて４８時間で得られた。

要約すると、室温にて４８時間以内の１１６％～１７４％の生成物活性化が観察された。

更なる精製の過程で、これらの活性化レベルもまた調査した。ＲＴでの保持時間は、２５時間または４９時間のいずれかであった。２５時間の保持時間は、１０９％および１２６％の収率を示し、４９時間の保持時間は１６０％（捕捉ＣＯ_２）を示した。生成物活性化後の分析を、ｐＨ３．６にて２～８℃でのさらに３日間の保持時間の後に、またはさらには２～８℃にて１０日間のより長い保持時間の後に実行した。更なるプロセシング前の生成物活性化は、２～８℃での保持時間に起因して、１３０～２０９％であった。その結果、無細胞収穫物中の生成物の量に対する収率は、１６３％～２２７％であった。

ｐＨ３．６での保持時間は、生成物濃度に及ぶプラスの効果を示したので、室温にて４８～９６時間の期間を決定した。ここで、生成物活性化の平均値は１３１％であった。ｐＨ３．６のプロテインＬ溶出液を２～８℃にて貯蔵すると、結合ＥＬＩＳＡによって測定される生成物濃度の更なる増大が部分的に示された。

ｐＨ３．６でのＨＭＷ形態の減少
生成物活性化に加えて、高分子量（ＨＭＷ）形態の形成を、保持時間について、様々な温度にて調査した（表８）。ＨＭＷ形態の含有量は、－７０℃にて増大することを観察することができた。これは、凍結融解サイクルに起因する可能性が最も高い。室温は、プロテインＬ溶出液の貯蔵に最適な温度であることが証明された。ｐＨ３．６での保持時間なしのサンプルと比較した、ＨＭＷ形態の減少を観察することができた。これは、結合ＥＬＩＳＡによって測定される生成物濃度と相関した。このことは、ＨＭＷ形態の減少が、生成物活性の増大をもたらすことを意味する。低いｐＨ値は、ＨＭＷ形態を不安定化すると仮定される。

ＨＭＷ減少の動態を調べるために、更なる様々な保持時間を試験した（表９）。保持時間なしのサンプルは、１５％のＨＭＷ形態および３．２％の低分子量（ＬＭＷ）形態を明らかにした。ＲＴにて２～８℃での貯蔵は、ＨＭＷ形態およびＬＭＷ形態の減少をもたらした。結合ＥＬＩＳＡによる生成物濃度とＨＭＷ形態のレベルとの関係を観察することができた。サンプルは、ＨＭＷ形態のレベルが低いほど、結合ＥＬＩＳＡによって測定される生成物濃度が高い傾向があり、このことは、より高いレベルの活性生成物が存在することを意味する。

また、ＲＴでの４８時間の最適保持時間後の２～８℃での貯蔵を調べた（表１０および表１１）。ＨＭＷ形態およびＬＭＷ形態の更なる減少を観察することができた。

ｐＨ３．６での保持時間もまた、ＨＭＷ形態の減少に有益であることが示された。また、ＨＭＷ形態の減少は、結合ＥＬＩＳＡによって測定される生成物濃度に関連しているようであった。ＨＭＷ形態が減少した場合に、生成物濃度の増大が認められた。

２～８℃での低ｐＨインキュベーション工程の保持時間
２～８℃での低ｐＨインキュベーション工程の保持時間を調査するために、プロテインＬ溶出液の、ｐＨ５．０、そしてｐＨ７．０へのｐＨ調整を行った。プロテインＬ溶出液を最初にｐＨ３．６で室温にて４８時間インキュベートするか、またはｐＨ値５．０もしくは７．０に直接調整した。２～８℃にて１週間、そして２週間貯蔵した後に、再測定を行った。結果を表１２に要約する。

サンプル１とサンプル２との比較により、ｐＨ３．６での保持時間が、生成物活性化およびＨＭＷ形態の減少をもたらすことが確認された。室温でｐＨ３．６にて４８時間インキュベートし、次いでｐＨ５．０に中和したサンプルは、より低いレベルのＨＭＷ形態に向かう明らかな傾向を示した。

ＵＶおよび結合ＥＬＩＳＡによって測定した生成物濃度は、２～８℃での保持時間にわたってほぼ一定のままであった。しかし、ＨＭＷ形態のレベルは、１１％から３３％まで増大した。ｐＨ７．０について、ＨＭＷ形態の含有量は、最初は１７％とさらに高かったが、貯蔵時間と共に低下した。同時に、生成物濃度は、２週後に０．６ｇ／Ｌに低下した。これは、結合ＥＬＩＳＡによって依然として測定可能であり得る沈殿物の形成に起因し得る。

結論として、中和されたプロテインＬ溶出液の保持時間が、ＨＭＷ形態の更なる形成をもたらす。以下のポリッシング工程について、より高いｐＨでの保持時間を最小にまで引き下げるために、使用直前にｐＨを調整する必要がある。混濁が出現する虞があるため、ポリッシング工程の前に濾過が必要な場合がある。

結論
生成物は、無細胞収穫物において、活性高次構造および非活性高次構造の双方で存在すると仮定される。プロテインＬアフィニティクロマトグラフィを介して、生成物の両変異体が、樹脂に特異的に結合する。次の洗浄工程の間に、非特異的に結合した混入物が除去される。続いて、酸性バッファを用いて、ｐＨの低下により生成物を溶出させる。プロテインＬ溶出液中の生成物濃度とＨＭＷ形態の形成との間には、相関関係がある。生成物濃度が高いほど、ＨＭＷ形態のレベルは高くなる結果となった。以下の３．６の低ｐＨ処理により、ＨＭＷ形態の減少、および結合ＥＬＩＳＡによって測定される生成物濃度の増大に至ることが観察された。サンプル中の生成物の総量を測定するＵＶ分析とは対照的に、結合ＥＬＩＳＡ測定は、その活性な高次構造の、または少なくとも抗原への結合を可能にする高次構造の生成物しか検出しない。低ｐＨでのインキュベーションは、最初は非活性な形態の、活性な高次構造への高次構造変化を促進すると仮定される。おそらく、ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ抗体の三次構造および／または四次構造は、低ｐＨにて不安定化されるので、当該条件下でそのサブユニットを再配置することができる。その結果、結合ＥＬＩＳＡによって測定される濃度は、低ｐＨ保持工程中に増す一方、ＵＶによって測定される濃度は変化しないままである。

例３
更なる精製およびポリッシング工程
捕捉のためのクロマトグラフィ、および抗体構築体の低ｐＨでのインキュベーションの後に、精製プロセスのための更なる工程を選択することができる。ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体の精製プロセスの一例を以下に記載する：
低ｐＨでのインキュベーション工程の後に、ポリッシングに適したバッファ中への濃縮および第１のダイアフィルトレーション工程が続く。混入物を枯渇させるためのポリッシングは、フロースルーモードで行われる陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）および結合溶出モードで行われるヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ（ＨＡＣ）からなる。その後、ウイルス濾過を行う。最後に、製剤化に適したバッファ中への濃縮および第２のダイアフィルトレーション工程が実行される。

配列表１８ ＜２２３＞Ｃ末端ＣＤ１６Ａ
配列表２０ ＜２２３＞Ｈｉｓタグ
配列表２１ ＜２２３＞リンカー

Claims (15)

1. ＦｃγＲＩＩＩに対する第１の結合ドメインと、ＣＤ３０に対する第２の結合ドメインとを含む二重特異性抗体構築体を生成する方法であって：
   （ａ）溶液から前記抗体構築体をクロマトグラフィで捕捉する工程と；
   （ｂ）捕捉マトリックスから前記抗体構築体を溶出する工程と；
   （ｃ）溶出した前記抗体構築体の溶液中のｐＨを、ｐＨ２．５～ｐＨ３．９の範囲内の低ｐＨに引き下げて、前記抗体構築体をこの条件下で少なくとも４０時間インキュベートする工程と；
   （ｄ）ｐＨ４．５～ｐＨ８．０の範囲内のｐＨに中和する工程と
   を含む方法。
2. ＦｃγＲＩＩＩに対する前記抗体構築体の前記第１の結合ドメインが、ＣＤ１６Ａに結合する、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗体構築体が、
   （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ＿ＣＤ１６Ａ）；
   （ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ１６Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＿ＣＤ１６Ａ）；
   （ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ３０に特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ＿ＣＤ３０Ａ）；
   （ｄ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ３０Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＿ＣＤ３０Ａ）
   からなる群からの少なくとも４つの可変ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記抗体構築体の可変ドメインが、１２個以下のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ３によって次々に連結されて、Ｎ末端からＣ末端までの２つのポリペプチド鎖の各々の内部に、ＶＨ＿ＣＤ３０－Ｌ１－ＶＬ＿ＣＤ１６Ａ－Ｌ２－ＶＨ＿ＣＤ１６Ａ－Ｌ３－ＶＬ＿ＣＤ３０の順序で配置されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記抗体構築体のリンカーＬ２が、３～９個のアミノ酸残基からなる、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記抗体構築体が、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 工程（ｃ）におけるｐＨが、ｐＨ３．０～ｐＨ３．７５の範囲内である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記抗体構築体を、工程（ｃ）において、少なくとも４８時間インキュベートする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程（ａ）のクロマトグラフィ捕捉方法が、プロテインＬクロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、または混合モードクロマトグラフィ（ＭＭＣ）からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記方法がさらに：
    （ｅ）陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、または混合モードクロマトグラフィ（ＭＭＣ）からなる群から選択される少なくとも１つのクロマトグラフィ法によって、溶液から前記抗体構築体を捕捉する、追加の工程を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程（ｂ）における前記抗体構築体の前記溶出が、酢酸ナトリウム／酢酸、ギ酸ナトリウム／ギ酸、クエン酸ナトリウム／クエン酸、およびコハク酸ナトリウム／コハク酸を含むバッファからなる群から選択されるバッファを用いて実行される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記抗体構築体が、工程（ｆ）において医薬組成物として製剤化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって生成される抗体構築体。
14. ＣＤ３０^＋増殖性疾患または腫瘍性疾患を処置または改善するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって生成される抗体構築体を含む医薬組成物。
15. ＣＤ３０^＋増殖性疾患または腫瘍性疾患に罹患している対象に、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって生成される抗体構築体を投与することを含む、患者を処置または改善する方法。
    

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