JP2023504339A - 培養筋肉組織の物理的操作 - Google Patents
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Abstract
本開示は、機械的もしくは手動、またはその両方のいずれかで筋肉組織培養物を物理的に操作するための方法、システム、および組成物に関する。詳細には、本開示は、組織培養物の伸長、圧縮、トルク、および剪断によって、非ランダムな３次元細胞構造を有するバイオプリント組織培養物の弾性容器を、機械的または手動のいずれかで物理的に操作するシステムおよび方法に関する。【選択図】図２Ａ
Description
本開示は、機械的もしくは手動、またはその両方のいずれかで筋肉組織培養物を物理的に操作するための方法、システム、および組成物に向けられる。詳細には、本開示は、４次元にわたる非ランダムな３次元細胞構造を有するバイオプリント組織培養物の弾性容器を物理的に操作するシステムおよび方法に向けられる。
畜産の環境への影響を低減し、人々の栄養を向上するために、および様々な他の誘因のために、３次元（３Ｄ）組織、例えば、筋肉組織に対応する生細胞培養物を含む新規タンパク質源の開発のために、動物の肉の代替物の必要性が存在する。システムおよび方法の使用は、分化に作用し、成長を加速し、栄養効率比を増加させることができる。
加えて、骨組織を操作するための骨格製造に細胞外押出加工を使用する積層造形アプローチが通常使用されているが、製造プロセス中の骨格への厳密な熱処理または化学的処理は、結果として生じる組織成長の有効性に悪影響を与え得る。さらに、停滞した成長条件は、かかる組織培養から生産される肉の品質に悪影響を与え得る。
したがって、制御された様式で物理的に操作される骨格筋などの精密に製造される生体構造のバイオプリンティングで使用するための方法、システム、および組成物の必要性が存在する。
様々な例示的な実装形態では、トーション、伸長、圧縮、剪断、およびそれらの組み合わせ、ならびに浸透および流動応力への曝露の４次元にわたる非ランダムな３次元細胞構造を有するバイオプリント組織培養物の弾性容器を操作するシステムおよび方法が開示される。
例示的な実装形態では、本明細書で提供されるのは、少なくとも１つの弾性容器に対する４つの自由度のうちの少なくとも１つにわたって、応力および歪みの所定のレジメンに作用するようにサイズ設定および構成されるフレームと動作可能に連結される、少なくとも１つの弾性容器と、少なくとも１つのプロセッサ、および実行されると、その後直ちに、少なくとも１つのプロセッサに、センサアレイを使用して、組織培養物に特徴的な物理的データを受信し、データに基づいて、少なくとも１つの弾性容器を物理的に操作することを生じさせるように、構成された一連の実行可能命令を備えたプロセッサ可読媒体を有する少なくとも１つの不揮発性メモリ記憶デバイスと通信する中央処理モジュール（ＣＰＭ）と、を含む、コンピュータ化されたシステムにおいて実行可能である、組織培養物を物理的に操作する方法であって、組織培養物を少なくとも１つの弾性容器にロードすることと、組織培養物に特徴的な物理的データに基づいて、所定の間隔で、少なくとも１つの弾性容器に対する少なくとも１つの応力および歪みに作用することと、を含む、方法である。
別の例示的な実装形態では、本明細書で提供される組織培養物の例示的な実装形態は、弾性容器に移され、プリンタ動作パラメータを格納するためのライブラリを有するプリンタ、ライブラリと通信する少なくとも１つのプロセッサ、少なくとも１つのプロセッサで実行するための一連の操作命令を格納する不揮発性メモリストレージデバイス、マイクロメカニカルインクジェットプリントヘッドまたは少なくとも１つのプロセッサおよびライブラリと通信するヘッド、ならびにライブラリ、メモリ、およびマイクロメカニカルインクジェットプリントヘッドと通信するプリントヘッドまたはヘッドのインターフェース回路を有し、ライブラリが実質的に２Ｄ層または特定の層の一部に固有のプリンタ動作パラメータを提供するように構成される、３Ｄインクジェットプリンタを提供すること、製造されるバイオプリント組織培養物に関連する情報を生成するコンピュータ支援設計／コンピュータ支援製造（ＣＡＤ／ＣＡＭ）が前処理することによって、複数のベクトルデータモデルおよび／またはビットマップ、所定の層またはそれらのインターフェースおよび／または断面および／またはその一部に固有の各ベクトルデータモデルおよび／またはビットマップを取得することと、前処理のステップで処理された複数のビットマップおよび／またはベクトルデータモデルをライブラリにロードすることと、ライブラリを使用して、所定の層、そのインターフェース、および／またはその一部を所定の順序で印刷するようにプロセッサに指示することと、を含む３Ｄインクジェットプリンタを使用するバイオプリンティングの方法を通して形成される。
例示的な実装形態では、システムは、バイオプリンティングモジュールをさらに含み、モジュールは、実行されると、その後直ちに、少なくとも１つのマイクロプロセッサにインクジェットバイオプリンティングの方法を生じさせるように、構成された実行可能命令のセットを備えたマイクロプロセッサ可読媒体を有する不揮発性記憶デバイス、ならびにその中に細胞の所定の３Ｄパターンを有する生体構造内の細胞、骨格、および結合組織のうちの少なくとも１つの２次元（２Ｄ）層に対応する画像ライブラリと通信する少なくとも１つのマイクロプロセッサと、少なくとも１つの開口部、第１のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第１のバイオインクを分配するように構成された第１のディスペンサを有し、第１のバイオインクが、生体適合性分散媒体および／または生体適合性ポリマー、および／またはモノマー、および／またはオリゴマーに懸濁された生細胞を含む組成物である、マイクロプロセッサと通信する第１の分配プリントヘッドと、少なくとも１つの開口部、第２のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第２のバイオインクを分配するように構成された第２のディスペンサを有し、第２のバイオインクが、生体適合性分散媒体および／または生体適合性ポリマー、および／またはモノマー、および／またはオリゴマーに懸濁された組成物生体適合性化合物である、マイクロプロセッサと通信する第２の分配プリントヘッドと、少なくとも１つの開口部、第３のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第３のバイオインクを分配するように構成された第３のディスペンサを有し、第３のバイオインクが、生体適合性ポリマー、モノマー、またはオリゴマーを機能化するための手段を含む、マイクロプロセッサと通信する第３の分配プリントヘッドと、第１、第２、および第３の分配プリントヘッドの各々と動作可能に連結される、マイクロプロセッサと通信するコンベヤと、を有する。
例えば、第１のバイオインクは、組織培養のための骨格を形成するために使用することができる、それにあらゆる細胞が懸濁されていない第１のポリマー、モノマーまたはオリゴマーを有する分散培地（例えば、イーグル培地）を含むことができる。第１のプリントヘッドは、ポリマーを所望の程度まで硬化させるために使用することができる専用の機能化プリントヘッドと関連付けることができる。骨格は、間隔を空けた開口部を備えた内腔を形成するように印刷および構成することができる。第２のバイオインクを備えた第２のプリントヘッドを使用することができ、第２のバイオインクは、特定の分化を受けるように誘発された、またはそうでなければ操作された細胞、および／または代わりに、細胞、および別の機能化プリントヘッドに関連する同じまたは異なる生体適合性ポリマー、モノマーまたはオリゴマーのいずれかを伴う分散媒体を含むことができる。第３のプリントヘッドは、その中に誘発化合物を伴う分散媒体と、同じまたは異なる生体適合性ポリマー、モノマーまたはオリゴマーのいずれかを含む第３のバイオインクを使用することができる。別の（第４の）プリントヘッドは、専用の機能化プリントヘッドに関連する、生細胞を伴う分散媒体を含む第４のバイオインクを使用することができる。様々なプリントヘッドの追加および／または除去は、プリントされる組織培養に基づいて行うことができる。
埋め込み集積回路の接続性を改善するためのシステムおよび方法を、その例示的な実装形態に関してよりよく理解するために、添付の例および図を参照する。
本明細書で提供されるのは、４次元にわたる非ランダムな３次元細胞構造を有するバイオプリント組織培養物の弾性容器を操作するシステムおよび方法の例示的な実装形態である。記載された例示的な実装形態は、組織培養物の分化および成長を改善するように構成され、食物消費のために肉をエミュレートする所定の３次元構造を有する食用生物構造をもたらす。
骨格筋は、食用肉の大部分を構成する。無傷の筋肉組織でも、小さな物理的に誘導された断裂、および裂傷が治癒し、実際に筋肉組織を強化すると報告されている。さらに、筋肉量に外部収縮力を適用すると、例えば、ラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）と呼ばれるプロテインキナーゼの活性化などの特定の要因を上方制御することができる。形成されると、横紋筋の外観は、円筒形の筋原線維をもたらし、これは、Ｚディスク（線、したがって横紋筋の外観）によって分離された筋節ユニットで構成される。本明細書に開示されるシステムおよび方法を使用して、結合組織および筋原線維タンパク質ネットワークへの変化を促進することができる。
したがって、例示的な実装形態では、本明細書で提供されるのは、少なくとも１つの弾性容器に対する４つの自由度のうちの少なくとも１つにわたって、応力および歪みの所定のレジメンに作用するようにサイズ設定および構成されるフレームと動作可能に連結される、少なくとも１つの弾性容器と、少なくとも１つのプロセッサ、および実行されると、その後直ちに、少なくとも１つのプロセッサに、センサアレイを使用して、組織培養物に特徴的な物理的データを受信し、データに基づいて、少なくとも１つの弾性容器を物理的に操作することを生じさせるように、構成された一連の実行可能命令を備えたプロセッサ可読媒体を有する少なくとも１つの不揮発性メモリ記憶デバイスと通信する中央処理モジュール（ＣＰＭ）と、を含む、コンピュータ化されたシステムにおいて実行可能である、組織培養物を物理的に操作する方法であって、組織培養物を少なくとも１つの弾性容器にロードすることと、組織培養物に特徴的な物理的データに基づいて、所定の間隔で、少なくとも１つの弾性容器に対する少なくとも１つの応力および歪みに作用することと、を含む、方法である。
本明細書に記載の組織培養物は、骨軟骨、肝臓、上皮、筋肉、脂肪組織などを含むがこれらに限定されない組織代替物、または組織の一部もしくは全体および／もしくは器官のいずれかの他の代替組織であり得る。組織培養物またはそれに対応するマトリックスは、特定の用途（例えば、魚の断面、Ｔボーンステーキなど）に合わせてカスタマイズできる次元を有し得る。組織培養物は、別々のバイオリアクタで、インビトロで細胞を培養する際に使用することができ、それにより、弾性容器に収容された組織培養物を操作するためのデバイスがそのバイオリアクタの一部を形成する。言い換えれば、組織がバイオプリントされると、培養物はバイオリアクタの一部として弾性容器に移され、そこで栄養素ならびに他の化学的および生物学的薬剤を提供することに加えて、提供されるシステムは組織を物理的に操作して分化を促進し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の物理的特徴を調整する。
弾性容器は、エラストマー材料で形成されるトレイであり得る。かかるエラストマー材料の例は、例えば、ブタジエン、天然ゴム、合成ゴム、シリコン、ウレタン、ネオプレン、ポリエステル、ジシクロペンタジエンモノマー、発泡ポリプロピレン、およびそれらの組み合わせであり得る。さらに、本開示の文脈における「弾性」という用語は、伸長力、圧縮力、トーション、および剪断の適用後に永久に変形することなく、一般に初期の一般的な形状に戻るような柔軟な機能を指す。したがって、別の例示的な実装形態では、弾性容器は、縦軸および横軸を規定し、伸長力、圧縮力、トーション、および剪断は、縦軸（ＸＬ）および横軸（ＸＴ）の少なくとも１つに適用される。
追加的または代替的に、弾性容器は、組織培養物を含むエラストマー材料で作製されるブラダであり得る（開示されるバイオプリンティングモジュールを使用してバイオプリンティングされる）。一般に、開示される弾性容器は、伸長、収縮（圧縮）、トーション、および剪断力を容器から組織培養物に伝達するような方法で組織培養物を含むように構成される。
本開示の文脈において、「伸長」という用語は、弾性容器を操作することにより組織培養物に課せられる歪みおよび応力の両方を指し、容器を、縦軸および横軸のうちの少なくとも１つに沿って、例えば、縦軸および横軸の元の長さに対して１％～２５％伸ばすことによって引き起こされる（例えば、図２Ａを参照されたい）。同様に、圧縮力を適用することは、組織培養物を圧縮するために、弾性的に圧縮可能な容器のいずれかの軸（縦方向および／または横方向、例えば、図２Ｂを参照されたい）に適用される（例えば、組織培養によって）反対の力を意味することを意図する。同様に、本開示の文脈におけるトーションは、圧縮回転、伸長回転、トルク、および／または任意の方向に力を適用した動きを含むがこれらに限定されない、任意の方向に加えられ、反対方向のねじり運動をもたらす任意の力を指す（例えば、図２Ｃを参照されたい）。また、本開示の文脈における「剪断」は、別の層に対する組織培養物の任意の層の変位を指す（例えば、図２Ｄを参照のされたい）。したがって、例示的な実装形態では、本明細書に開示される物理的操作デバイスによって適用される４つの自由度は、少なくとも１つの弾性容器内の組織培養物に圧縮、伸長、剪断、およびトルクを適用するように構成され、それにより組織培養物がそこに含まれる。
本明細書に記載のシステム、デバイス、および方法は、組組織培養物からの物理的特徴データを提供するように構成されたセンサアレイ、アレイをさらに含むことができる。センサアレイは、その物理的特徴に加えて、組織培養物の成長、分化、および発達に関するデータを提供できることに留意されたい。例えば、物理的特徴は、粘度、密度、重量、不透明度、比容積、相対水分活性、ｐＨ、引張強度、および圧縮強度のうちの少なくとも１つであり得る。例示的な実装形態では、実行可能な命令のセットは、実行されると、センサアレイからデータを受信し、弾性容器を物理的に操作するために使用されるレジメンを調整、変更、または制御するように、例えば、弾性容器の内容物の圧縮、伸長、剪断、およびトーションのうちの少なくとも１つの組み合わせを使用して、操作の程度および頻度を変更することによって構成される。
したがって、データを生成するために、システムは、タイマー、粘度計、ロードセル、化学線源、カメラ、および湿度計のうちの少なくとも１つを含むセンサアレイを含むことができる。さらに、本明細書に開示されるシステムおよびデバイスは、浸透応力および流動応力のうちの少なくとも１つに作用するための手段をさらに含む。本開示の文脈において、「浸透応力」という用語は、浸透圧が細胞数の最大増加率に必要な浸透圧よりも十分に高いため、１つ以上の細胞特性（成長率など）および／または細胞外マトリックスに測定可能な差異が生じる培養条件を指す。同様に、流動応力は、例えば、組織を弾性容器の開口部または他の開口部を通って流すことによって、組織培養物の流れによって誘導される応力を指す。例えば、浸透応力に作用するための手段は、少なくとも１つの弾性容器を、任意の所与の時点で組織培養よりも高い化学ポテンシャルを有する薬剤（例えば、様々な塩濃度の塩溶液）を含む膜と接触させることを含み、一方で流動応力に作用するための手段は、２つの弾性容器間の流動通信に作用する管を含む。
さらに、弾性容器は、弾性容器への組織培養物の接着（言い換えれば、湿潤）を促進するように、内部でコートすることができる。コーティングは、例えば、組織培養細胞の接着タンパク質と相互作用することができる、ＰＥＧ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）などのペグ化トリペプチドおよび同様のトリペプチド、例えば、（シクロＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（ｃＲＧＤｆＫ）またはシクロＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ（ｃＲＧＤｆＣ））であり得る。
さらに、開示される方法およびシステムは、生組織培養物の少なくとも一部に所定の形状を課すように構成される、生体適合性ペレットを少なくとも１つの弾性容器に混合することをさらに含み、ペレットは容器の必須な部分であり、弾性容器の操作中に（機械的または手動で）様々な種類の流動応力が課せられるように、様々な経路を作製することができる。同様に、異なる表面コーティングは、組織培養物の湿潤を防ぐことができ、したがって、液滴の形成を課すか、さもなければ組織の球状部分を作製することができる。
示されるように、インクジェットバイオプリンティングモジュールは、組織培養物を提供するように構成される。「バイオプリンティング」という用語は、ドロップオンデマンド機能を備えたインクジェットプリンタを使用して、細胞および他のバイオインクと混合された骨格（マトリックス）材料を沈着させることにより、食用組織類似体を形成するように構成された特定の種類またはいくつかの種類の天然もしくは操作された細胞を作製するプロセスを指す。同様に、「形成する」（および、その変形「形成される」など）という用語は、例示的な実装形態では、任意の好適なインクジェットプリント方法を使用して、流体または材料（例えば、筋肉細胞を含むバイオインク）を別の材料（例えば、骨格、結合組織または別の筋肉細胞層）と接触させて、ポンプ輸送、注入、流入、放出、置換、スポッティング、循環、噴霧、噴霧、インクジェット、噴射、または他の方法で配置することを指す。例示的な実装形態では、「形成する」は、別の例示的な実装形態において様々なラスタ画像（例えば、ｄｃｍ）および／またはベクトルデータモデルから導出される、その下にある２Ｄ層画像からの３Ｄ組織培養自体の組み立てを指す。
さらに、本開示の文脈において、「骨格」または「生体適合性骨格」という用語は、例示的な実装形態では、天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の３Ｄ環境を模倣し、組織培養の短期間の機械的支援を提供し、細胞接着、増殖、遊走、および分化のための表面積の増加を提供し、最終的に組織形成を加速する、所定の３次元構造を有する設計されたプラットフォームを指す。追加的または代替的に、「骨格」は、栄養素、緩衝液、機能化液、および他の同様の機能性液体への成長中の組織培養物内の流動通信を維持するように、サイズ調整されて構成され、印刷されると、導管の製造されたシステムを指す。示されるように、骨格はまた、複合骨格であり得る。「複合骨格」は、「不均一組織」を一緒に含む２つ以上の組織型のコロニー形成および／または増殖を支援するように設計される骨格プラットフォームを指す。本明細書に記載のシステムおよび方法を使用して、直ちに第１の組織型（例えば、軟骨）の形成を支援するための第１の３Ｄ軟骨細胞包埋組織培養物（例えば、組織、器官、組織骨格、結合組織）と、直ちに第２の組織型（例えば、筋肉）の形成を支援するための第２の３Ｄ筋肉細胞包埋組織培養物（例えば、筋肉組織、肉代替物、組織骨格）と、を含む、複合骨格を形成することができる。
本明細書で提供される本開示の文脈では、「ディスペンサ」という用語は、インクジェットインク液滴が分配される分配プリントヘッドを示すために使用される。ディスペンサは、例えば、マイクロバルブ、圧電ディスペンサ、連続ジェットプリントヘッド、沸騰（バブルジェット）ディスペンサ、ポンプ、およびディスペンサを通って流れる流体および／またはバイオインクの温度ならびに特徴に影響を及ぼす他のものを含む、少量の液体を分配するためのデバイスであり得る。
第１のインクジェット組成物を配合することは、必要な場合に、分配プリントヘッドによって課せられる要件および表面の特徴（例えば、親水性または疎水性、および任意に提供される基材の表面エネルギー）を考慮に入れることができる。例えば、導電性分配プリントヘッドを備えたインクジェットを使用して、第１のバイオインクおよび／または第２のバイオインク（プリント温度で測定）のいずれかの粘度は、例えば、約５ｃＰ以上、例えば、約８ｃＰ以上、または約１０ｃＰ以上、および約３０ｃＰ以下、例えば、約２０ｃＰ以下、または約１５ｃＰ以下であり得る。第１のバイオインクは、約２５ｍＮ／ｍ～約３５ｍＮ／ｍの動的表面張力（インクジェットバイオインク液滴が分配プリントヘッド開口部で形成されるときの表面張力を指す）を有するように構成（例えば、配合）され得、例えば、約２９ｍＮ／ｍ～約３１ｍＮ／ｍの動的表面張力が、５０ｍｓの表面寿命および２５℃で最大気泡圧力張力測定によって測定される。動的表面張力は、摂氏約１度～摂氏約１６６度の間、例えば、摂氏約２０度～摂氏約１３０度の間、または摂氏約３５度～摂氏約９０度の間の基板との接触角を提供するように配合することができる。同様に、層間および様々なバイオインク間の接触角は、必要に応じて、湿潤を提供するか、または表面に個別の液滴を形成するように配合することができる。
例示的な実装形態では、細胞の層を形成するために使用される第１のバイオインク組成物、ならびに／または生体適合性および／もしくは操作誘発化合物を含む組成物を含む第２のバイオインク組成物は、生体適合性ポリマー、例えば、ペグ化メタクリレート、ペグ－ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）、カラギーナン、ポリ（乳酸）酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、（ポリ（リジン）、それらのメタクリレート抱合体、コポリマー、相互貫入ネットワーク、または前述の１つ以上を含む組成物を含むことができる。
「生体適合性ポリマー」という用語は、生物の細胞、組織、または体液と接触した際に、免疫反応および／または拒絶などの有害作用を誘発しない任意のポリマーを指す。さらに、本明細書に記載の方法およびシステムで使用される第１および／または第２のバイオインクは、生分解性ポリマーであり得、例示的な実装形態では、プロテアーゼなどの生理学的環境で分解され得る任意のポリマーを指す。生分解性ポリマーの例は、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギネート、キトサン、またはそれらの混合物である。
例示的な実装形態では、カラギーナン親水コロイドは、第１および／または第２のバイオインク、例えばカッパカラギーナン（κ－ＣＡ）で使用することができ、機能化は、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、およびそれらの組み合わせを含む第３のプリントヘッド堆積イオン溶液を加熱および使用することを含む。同様に、第１のバイオインク組成物は、ポリ（エチレンオキシド）－メタクリレート（ＰＥＯＤＭＡ）を含み、機能化は、電磁放射線（ＥＭＲ）への曝露を含む。ＰＥＯは、例えば、ポリ（エチレングリコール）であり得る。第１および／または第２のバイオインクの物理化学的特徴は、物質移動特徴、物理化学的特徴、および生物学的特徴を変更する、例えば、分子量、化学組成、使用される官能化剤の量および種類、ならびに機能化の程度を変えることによって制御することができる。さらに、ポリ（エチレングリコール）－ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）ヒドロゲルは、インビボでブタ膵島細胞と適合性があり、ポリ（エチレングリコール）－ジメタクリレート（ＰＥＧ－ＤＭＡ）ヒドロゲルは、軟骨細胞と適合性があることが示されている。生体適合性または生体模倣ポリマーである、第１および／または第２のバイオインクで使用される懸濁ポリマーを変えることにより、包埋細胞の３Ｄパターンの粘度は、コロニー形成および／もしくは操作を防止するか、または代替的に操作を最適化および加速するいずれかで維持ならびに構成することができる。生体適合性ポリマーはまた、キトサンまたはペグ化キトサンであり得、ペグ化キトサンは、メチルメタクリレートまたはジメチルメタクリレート（例えば、ＣＥＧ－ＭＡおよび／またはＣＥＧ－ＤＭＡ）と抱合される。
特に筋肉細胞に関して、例示的な実装形態では、骨格構造は、筋肉細胞または任意の多能性幹細胞の分化、成長、および生物活性に作用するように構成された生体適合性ポリマーから形成することができる。これらの生体適合性ポリマーは、例えば、ＰＧＡ、ゼラチン、アルギネート、およびコラーゲンのうちの少なくとも１つであり得、これらは、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤペプチド）とさらに抱合または置換される。例えば、組織培養物の骨格は、例えば、本明細書に開示されるシステムを使用してプリントおよび機能化（例えば、架橋）された、架橋された多層の電界紡糸ゼラチンナノファイバーであり得る。さらに、第１のバイオインクは、サテライト細胞および／または他の筋原性前駆細胞（例えば、筋肉前駆細胞（ＭＰＣ））を含むことができ、一方で機能化は、骨格の電気刺激を使用することをさらに含むことができる。
示されるように、第１および／または第２のバイオインクを使用して、水溶液に懸濁し、光開始剤の存在下でラジカル重合によってゲル化するＰＥＧ－ＤＭＡモノマーからの生体適合性組成物を含む３Ｄ細胞包埋組織培養物（例えば、組織、器官、組織骨格、結合組織）を形成することができる。溶液がＵＶ光に曝露されると、重合反応が開始される。各ＰＥＧ－ＤＭＡモノマーは、最大２つの他のメタクリレート基と反応して共有結合を形成できる２つのメタクリレート基を有し、言い換えれば、架橋により、共有結合で架橋された分岐ネットワークが形成される。したがって、ＰＥＧ鎖の長さを変えることにより、光開始剤（例えば、フェニルグリオキシレート、ベンゾフェノン）の濃度およびＥＭＲ曝露の波長、組織培養支持層の最終圧縮弾性率、または所定の細胞の懸濁層を最適化することができる。
例示的な実装形態では、第１、第２、または第３のバイオインク組成物の見かけの粘度は、各々（機能化する前に）、プリント温度で約０．１～約３０ｃＰ・ｓ（ｍＰａ・ｓ）であり得、例えば、最終的なインク配合は、動作温度で８～１２ｃＰ・ｓの粘度を有することができ、これを制御することができる。例えば、細胞の分散液、溶液、乳濁液、懸濁液、ヒドロゲル、もしくは前述のものを含む液体組成物、または懸濁細胞を含む第２のバイオインクは、各々、約５ｃＰ・ｓ～約２５ｃＰ・ｓ、または約７ｃＰ・ｓ～約２０ｃＰ・ｓ、詳細には約８ｃＰ・ｓ～約１５ｃＰ・ｓであり得る。
例示的な実装形態では、第１および／または第２および／または第３のバイオインクの各液滴の体積は、プリンタパラメータおよびインクの特徴に応じて、約５ｐＬ～約４５０ピコリットル（ｐＬ）、例えば、約５０ｐＬ～約１５０ｐＬの範囲であり得る。単一の液滴を放出するための波形は、１０Ｖ～約１７０Ｖのパルス、または約１６Ｖ～約９０Ｖであり得、約１ｋＨｚ～約５００ｋＨｚの周波数で放出され得る。
さらに、ポリマー濃度（例えば、ＰＥＧＤＭＡ、キトサン）は、第１および第２のバイオインクでは同じであるが（他の例示的な実装形態では、懸濁ポリマーは異なり得る）、インク間で濃度が異なり得、したがって、形成されるヒドロゲル構造に異なる物理化学的特徴を提供する。例示的な実装形態では、硬化後（言い換えると、マトリックスを固化および／または機能化する）、形成された骨格支持パターン（言い換えると、ゲルの不可逆的な変形を達成するために必要な荷重および歪みの比率）は、０．５ＭＰａ以上、例えば、０．５～１．５ＭＰａまたは約０．６ＭＰａ～１．０ＭＰａの圧縮弾性率を示すことができる。他の圧縮弾性率は、組織培養自体のために設計することができ、それは約０．０８ＭＰａ～約１．０ＭＰａであり得る。
示されるように、本明細書で提供されるのは、細胞（例えば、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、中皮細胞、周産期細胞、単球細胞、血漿細胞、肥満細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、または特定の細胞型から培養された細胞集団）のうちの１つ以上）の所定の２ｄおよび／または３Ｄパターンをその中に有する複合組織培養物（例えば、組織、器官、組織骨格、結合組織、およびそれらの組み合わせ）を形成するためのコンピュータ化されたバイオプリンティング方法であり、方法は、実行されると、（少なくとも１つだが、それ以上の可能性がある）プロセッサに方法の実行を生じさせるように、構成された実行可能命令のセットを備えたプロセッサ可読媒体を格納する不揮発性記憶デバイスと連結されたマイクロプロセッサと通信する、ならびにプリントされる様々な層の２Ｄ画像のライブラリを有するデータベースと通信するインクジェットプリントシステムを提供することを含み、システムは、少なくとも１つの開口部、第１のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第１のバイオインクを分配するように構成された第１のディスペンサを有し、第１のバイオインクが、生体適合性分散媒体、生体適合性ポリマー、モノマー、またはオリゴマー、および分散媒体に懸濁された、細胞を含む組成物（または本明細書で提供される細胞の１つ以上を含む細胞組成物）である、第１の分配プリントヘッドと、少なくとも１つの開口部、第２のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第２のバイオインクを分配するように構成された第２のディスペンサを有し、第２のバイオインクが、生体適合性分散媒体および／または生体適合性ポリマー、モノマー、またはオリゴマーに懸濁された、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物、例えば、成長促進、成長持続、および成長決定化合物のうちの少なくとも１つを含む組成物である、第２の分配プリントヘッドと、少なくとも１つの開口部、第３のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第３のバイオインクを分配するように構成された第３のディスペンサを有し、第３のバイオインクが、生体適合性ポリマー、モノマー、またはオリゴマーを機能化するための手段を含む、第３の分配プリントヘッドと、第１のプリントヘッド、第２のプリントヘッド、および第３のプリントヘッドと動作可能に連結されるコンベヤと、を含み、第１のインクジェットプリントヘッドを使用して、第１の層またはその一部の２Ｄ画像をアップロードした後、細胞のパターンの第１の層または第１の層の一部を形成し、第３のプリントヘッドを使用して、細胞パターンの第１の層を機能化し、第２のインクジェットプリントヘッドを使用して、第２のバイオインク組成物またはその一部の所定のパターンの第１の層を形成し、第３のプリントヘッドを使用して、第２のバイオインクの所定のパターンの第１の層を機能化し、第１のインクジェットプリントヘッドを使用して、細胞パターンの第１の層および／または第２のバイオインク組成物の所定のパターンの第１の層または第１の層の一部上および／または隣接して細胞パターンの第２の層を形成し、細胞のパターンの第２の層を機能化して、さらに第２のインクジェットプリントヘッドを使用して、細胞パターンの第１の層上および／もしくは隣接する第２のバイオインクの所定のパターンの第２の層、ならびに／または第２のバイオインク組成物の所定のパターンの第１の層を形成し、第２のバイオインクまたはその一部の所定のパターンの第２の層を機能化する。
同様に、本明細書に記載の細胞および組織培養物の層に包埋された、第２のバイオインクの所定の３Ｄパターンは、非ランダムであり得る。言い換えると、細胞を含む組織培養物は、細胞の空間分布および／または密度に実質的な変動があり、細胞の所定の２Ｄ（例えば、ラスタおよび／またはベクトルデータモデルに変換されるＭＲＩおよび／またはＣＴ画像から収集され、インクジェットプリント命令に変換される）および／または３Ｄパターンを形成する。例えば、第２のバイオインクの所定の３次元パターンは、細胞接着を加速し、細胞の本来の成長を保持し、かつ／または器官および／もしくは組織ならびに他の同様の機能を保持するように構成することができる。さらに、３Ｄ骨格支持体および細胞含有骨格は、食用動物組織、例えば、筋肉組織をエミュレートするように構成することができ、例えば、筋細胞、サテライト細胞、および第１のバイオインクに分配される他の筋肉形成細胞を含み、一方で、ＰＣＬおよびコラーゲンのうちの少なくとも１つのナノファイバーは、第２のバイオインクに分配され、第３のバイオインクはＲＧＤペプチドを含むことができる。
さらに、第２のバイオインクは、コロニー形成、増殖、付着に作用し、アポトーシスまたは細胞の他の操作を阻害し、細胞の本来の成長、ならびに／または器官および／もしくは組織および他の同様の機能を保持する他の添加剤をさらに含むことができる。したがって、例示的な実装形態では、複合組織培養物（例えば、組織、器官、組織骨格、結合組織）を直接的なインクジェットバイオプリンティングで使用するための方法、システム、および組成物で使用される第２のバイオインクは、細胞操作誘発化合物（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、グルコースアミノグリカン（ＧＡＧ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、または前述のものを含むシグナル伝達化合物組成物）、および治療有効性化合物、抗菌化合物、免疫抑制化合物などをさらに含むことができる。
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその派生語は、記載された特徴、要素、構成要素、群、整数、および／またはステップの存在を指定するが、他の記載されていない特徴、要素、構成要素、群、整数、および／またはステップの存在を除外しない、制約のない用語であることが意図される。前述のことは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語、およびそれらの派生語などの類似の意味を有する単語にも適用される。
本明細書で開示されるすべての範囲はエンドポイントを含み、エンドポイントは互いに独立して組み合わせることができる。「組み合わせ」には、ブレンド、混合物、合金、反応生成物などが含まれる。本明細書の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、量の制限を示すものではなく、本明細書で特に明記しない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるものとする。本明細書で使用される接尾辞「（ｓ）（複数可）」は、それが修飾する用語の単数形および複数形の両方を含み、それによってその用語の１つ以上を含むことを意図している（例えば、容器（複数可）は、１つ以上の容器を含む）。明細書全体を通して、「１つの例示的な実装形態」、「別の例示的な実装形態」、「例示的な一実装形態」などへの言及は、存在する場合、例示的な実装形態に関連して説明された特定の要素（例えば、特徴、構造、および／または特性）が、本明細書で説明される少なくとも１つの例示的な実装形態に含まれることを意味し、他の例示的な実装形態内に存在する場合または存在しない場合がある。加えて、説明された要素を、様々な例示的な実装形態において、任意の好適な方式で組み合わせてもよいことを理解されたい。
本明細書で開示されるすべての範囲はエンドポイントを含み、エンドポイントは互いに独立して組み合わせることができる。さらに、本明細書の「第１」、「第２」などの用語は、任意の順序、量、または重要性を示すのではなく、１つの要素から別の要素を示すために使用される。
同様に、「約」という用語は、量、サイズ、配合、パラメータを意味し、他の量および特質が正確ではないこと、ならびにその必要がないことを意味するが、所望に応じて、許容範囲、変換係数、四捨五入、測定誤差など、ならびに当業者に既知の他の要因を反映して、近似および／またはより大きいかより小さいことがあり得る。一般に、量、サイズ、配合、パラメータ、または他の量もしくは特質は、明示的にそう述べられているかどうかにかかわらず、「約」または「おおよそ」である。例えば、本明細書で使用される「約」は、最終的な結果が有意に変更されないように、修正される用語の妥当な量の逸脱を意味する。これらの用語の程度は、この逸脱がそれを修正する単語の意味を否定しない場合に、修正された用語の少なくとも±５％または少なくとも±１０％の逸脱を含むと解釈されるべきである。
したがって、例示的な実装形態では、少なくとも１つの弾性容器に対する４つの自由度（ＤＯＦ）のうちの少なくとも１つにわたって、応力および歪みの所定のレジメンに作用するようにサイズ設定および構成されるフレームと動作可能に連結される、少なくとも１つの弾性容器と、少なくとも１つのプロセッサ、および実行されると、その後直ちに、少なくとも１つのプロセッサに、センサアレイを使用して、組織培養物に特徴的な物理的データを受信し、データに基づいて、少なくとも１つの弾性容器を物理的に操作することを生じさせるように、構成された一連の実行可能命令を備えたプロセッサ可読媒体を有する少なくとも１つの不揮発性メモリ記憶デバイスと通信する中央処理モジュール（ＣＰＭ）と、を含む、コンピュータ化されたシステムにおいて実行可能である、組織培養物を物理的に操作する方法であって、組織培養物を少なくとも１つの弾性容器にロードすることと、組織培養物に特徴的な物理的データに基づいて、所定の間隔で、少なくとも１つの弾性容器に対する少なくとも１つの応力および歪みに作用することと、を含む、方法が提供され、（ｉ）システムが、実行されると、その後直ちに、少なくとも１つのマイクロプロセッサにインクジェットバイオプリンティングの方法を生じさせるように、構成された実行可能命令のセットを備えたマイクロプロセッサ可読媒体を有する不揮発性記憶デバイス、ならびにその中に細胞の所定の３Ｄパターンを有する生体構造内の細胞、骨格、および結合組織のうちの少なくとも１つの２次元（２Ｄ）層に対応する画像ライブラリと通信する少なくとも１つのマイクロプロセッサと、少なくとも１つの開口部、第１のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第１のバイオインクを分配するように構成された第１のディスペンサを有し、第１のバイオインクが、生体適合性分散媒体および／または生体適合性ポリマー、および／またはモノマー、および／またはオリゴマーに懸濁された生細胞を含む組成物である、マイクロプロセッサと通信する第１の分配プリントヘッドと、少なくとも１つの開口部、第２のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第２のバイオインクを分配するように構成された第２のディスペンサを有し、第２のバイオインクが、生体適合性分散媒体および／または生体適合性ポリマー、および／またはモノマー、および／またはオリゴマーに懸濁された組成物生体適合性化合物である、マイクロプロセッサと通信する第２の分配プリントヘッドと、少なくとも１つの開口部、第３のバイオインクリザーバ、および開口部を通して第３のバイオインクを分配するように構成された第３のディスペンサを有し、第３のバイオインクが、生体適合性ポリマー、モノマー、またはオリゴマーを機能化するための手段を含む、マイクロプロセッサと通信する第３の分配プリントヘッドと、第１、第２、および第３の分配プリントヘッドの各々と動作可能に連結される、マイクロプロセッサと通信するコンベヤと、を有するインクジェットバイオプリンティングモジュールをさらに含み、（ｉｉ）４つの自由度が、少なくとも１つの弾性容器内の組織培養物に圧縮、伸長、剪断、およびトルクを適用するように構成され、（ｉｉｉ）システムが、組織培養物からの物理的特徴データを提供するように構成されたセンサアレイをさらに含み、（ｉｖ）物理的特徴が、粘度、密度、重量、不透明度、比容積、相対水分活性、ｐＨ、引張強度、および圧縮強度のうちの少なくとも１つであり、（ｖ）センサアレイが、タイマー、粘度計、ロードセル、化学線源、カメラ、および湿度計のうちの少なくとも１つを含み、（ｖｉ）組織培養物が、ウシ筋肉組織、ブタ筋肉組織、トリ筋肉組織、無顎類筋肉組織、軟骨魚類筋肉組織、硬骨魚類筋肉組織、およびヤギ筋肉組織をエミュレートするように構成され、（ｖｉｉ）システムが、浸透応力および流動応力のうちの少なくとも１つに作用するための手段をさらに含み、（ｖｉｉｉ）浸透応力に作用するための手段が、少なくとも１つの弾性容器を、任意の所与の時点で組織培養物よりも高い化学ポテンシャルを有する薬剤を含む膜と接触させることを含み、（ｉｘ）流動応力に作用するための手段が、２つの弾性容器間の流動通信に作用する管を含み、（ｘ）インクジェットバイオプリンティングモジュールが、組織培養物を提供するように構成され、（ｘｉ）組織培養物が、栄養素を組織骨格バルクに送達するように構成される生体適合性骨格をさらに含み、（ｘｉｉ）少なくとも１つの弾性容器が、組織培養物と弾性容器との間の接着を促進するように構成される材料でコートされ、（ｘｉｉｉ）生体適合性骨格が、ペグ化メタクリレート、キトサン、カラギーナン、ポリ（乳酸）酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、それらのメタクリレート抱合体、コポリマー、相互貫入ネットワーク、または前述の１つ以上を含む組成物を含み、（ｘｉｖ）第１のバイオインクが、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、中皮細胞、周皮細胞、単球細胞、血漿細胞、肥満細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、特定の型の細胞から別のものに操作された細胞集団のうちの１つ以上、または前述の細胞のうちの１つ以上を含む細胞組成物、生体適合性ポリマー、および任意の光開始剤を含み、（ｘｖ）第２のバイオインクが、細胞外物質（ＥＣＭ）を含み、（ｘｖｉ）ＥＣＭが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、グルコースアミノグリカン（ＧＡＧ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、または前述のものを含む細胞外マトリックス化合物組成物を含み、方法は、（ｘｖｉｉ）組織培養物の少なくとも一部に所定の形状を課すように構成される、生体適合性ペレットを少なくとも１つの弾性容器に混合することをさらに含み、（ｘｖｉｉｉ）物理的に操作された組織培養物をインキュベータに移し、組織培養物を成長させるステップをさらに含み、（ｘｉｘ）システムが、複数の弾性容器内の組織培養物に特徴的な物理的データに基づいて、所定の間隔で、複数の弾性容器に対する少なくとも１つの同じ応力および歪みに作用する、同時に動作可能な構造に配置される複数の弾性容器を収容するように動作可能なハウジングをさらに含む。
４次元にわたる非ランダムな３次元細胞構造を有するバイオプリント組織培養物の弾性容器を機械的または手動（または両方）で物理的に操作するための前述の開示を、いくつかの例示的な実装形態に関して説明してきたが、他の例示的な実装形態が、本明細書の開示から当業者に明らかになるであろう。さらに、説明された実装形態は、例としてのみ提示されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際、本明細書に説明される新規の方法、プログラム、ライブラリ、およびシステムを、その趣旨から逸脱することなく、他の様々な形態で具体化してもよい。したがって、他の組み合わせ、省略、置換、および修正は、本明細書の開示を考慮することで当業者に明らかになるであろう。
Claims (20)
- 少なくとも１つの弾性容器に対する４つの自由度のうちの少なくとも１つにわたって、応力および歪みの所定のレジメンに作用するようにサイズ設定および構成されるフレームと動作可能に連結される、前記少なくとも１つの弾性容器と、少なくとも１つのプロセッサ、および実行されると、その後直ちに、前記少なくとも１つのプロセッサに、センサアレイを使用して、組織培養物に特徴的な物理的データを受信し、データに基づいて、前記少なくとも１つの弾性容器を物理的に操作することを生じさせるように、構成された一連の実行可能命令を備えたプロセッサ可読媒体を有する少なくとも１つの不揮発性メモリ記憶デバイスと通信する中央処理モジュール（ＣＰＭ）と、を含む、コンピュータ化されたシステムにおいて実行可能である、前記組織培養物を物理的に操作する方法であって、
ａ．前記組織培養物を前記少なくとも１つの弾性容器にロードすることと、
ｂ．前記組織培養物に特徴的な前記物理的データに基づいて、所定の間隔で、前記少なくとも１つの弾性容器に対する少なくとも１つの応力および歪みに作用することと、を含む、方法。 - 前記システムが、
ａ．実行されると、その後直ちに、少なくとも１つのマイクロプロセッサにインクジェットバイオプリンティングの方法を生じさせるように、構成された実行可能命令のセットを備えたマイクロプロセッサ可読媒体を有する不揮発性記憶デバイス、ならびにその中に細胞の所定の３Ｄパターンを有する生体構造内の細胞、骨格、および結合組織のうちの少なくとも１つの２次元（２Ｄ）層に対応する画像ライブラリと通信する少なくとも１つのマイクロプロセッサと、
ｂ．少なくとも１つの開口部、第１のバイオインクリザーバ、および前記開口部を通して前記第１のバイオインクを分配するように構成された第１のディスペンサを有し、前記第１のバイオインクが、生体適合性分散媒体および／または生体適合性ポリマー、および／またはモノマー、および／またはオリゴマーに懸濁された生細胞を含む組成物である、前記マイクロプロセッサと通信する第１の分配プリントヘッドと、
ｃ．少なくとも１つの開口部、第２のバイオインクリザーバ、および前記開口部を通して前記第２のバイオインクを分配するように構成された第２のディスペンサを有し、前記第２のバイオインクが、生体適合性分散媒体および／または生体適合性ポリマー、および／またはモノマー、および／またはオリゴマーに懸濁された組成物生体適合性化合物である、前記マイクロプロセッサと通信する第２の分配プリントヘッドと、
ｄ．少なくとも１つの開口部、第３のバイオインクリザーバ、および前記開口部を通して前記第３のバイオインクを分配するように構成された第３のディスペンサを有し、前記第３のバイオインクが、生体適合性ポリマー、モノマー、またはオリゴマーを機能化するための手段を含む、前記マイクロプロセッサと通信する第３の分配プリントヘッドと、
ｅ．前記第１、前記第２、および前記第３の分配プリントヘッドの各々と動作可能に連結される、前記マイクロプロセッサと通信するコンベヤと、を有するインクジェットバイオプリンティングモジュールをさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 前記４つの自由度が、前記少なくとも１つの弾性容器内の前記組織培養物に圧縮、伸長、剪断、およびトルクを適用するように構成される、請求項１に記載の方法。
- 前記システムが、前記組織培養物からの物理的特徴データを提供するように構成されたセンサアレイをさらに含む、請求項３に記載の方法。
- 前記物理的特徴が、粘度、密度、重量、不透明度、比容積、相対水分活性、ｐＨ、引張強度、および圧縮強度のうちの少なくとも１つである、請求項４に記載の方法。
- 前記センサアレイが、タイマー、粘度計、ロードセル、化学線源、カメラ、および湿度計のうちの少なくとも１つを含む、請求項５に記載の方法。
- 前記組織培養物が、ウシ筋肉組織、ブタ筋肉組織、トリ筋肉組織、無顎類筋肉組織、軟骨魚類筋肉組織、硬骨魚類筋肉組織、およびヤギ筋肉組織をエミュレートするように構成される、請求項６に記載の方法。
- 前記システムが、浸透応力および流動応力のうちの少なくとも１つに作用するための手段をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記浸透応力に作用するための手段が、前記少なくとも１つの弾性容器を、任意の所与の時点で前記組織培養物よりも高い化学ポテンシャルを有する薬剤を含む膜と接触させることを含む、請求項８に記載の方法。
- 前記流動応力に作用するための手段が、２つの弾性容器間の流動通信に作用する管を含む、請求項８に記載の方法。
- 前記インクジェットバイオプリンティングモジュールが、前記組織培養物を提供するように構成される、請求項２に記載の方法。
- 前記組織培養物が、栄養素を組織骨格バルクに送達するように構成される生体適合性骨格をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの弾性容器が、前記組織培養物と前記弾性容器との間の接着を促進するように構成される材料でコートされる、請求項１１に記載の方法。
- 前記生体適合性骨格が、ペグ化メタクリレート、キトサン、カラギーナン、ポリ（乳酸）酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、それらのメタクリレート抱合体、コポリマー、相互貫入ネットワーク、または前述の１つ以上を含む組成物を含む、請求項１２に記載の方法。
- 前記第１のバイオインクが、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、中皮細胞、周皮細胞、単球細胞、血漿細胞、肥満細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、特定の型の細胞から別のものに操作された細胞集団のうちの１つ以上、または前述の細胞のうちの１つ以上を含む細胞組成物、生体適合性ポリマー、および任意の光開始剤を含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記第２のバイオインクが、細胞外物質（ＥＣＭ）を含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記ＥＣＭが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、グルコースアミノグリカン（ＧＡＧ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、または前述のものを含む細胞外マトリックス化合物組成物を含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記組織培養物の少なくとも一部に所定の形状を課すように構成される、生体適合性ペレットを前記少なくとも１つの弾性容器に混合することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記物理的に操作された組織培養物をインキュベータに移し、前記組織培養物を成長させるステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
- 前記システムが、複数の弾性容器内の前記組織培養物に特徴的な物理的データに基づいて、所定の間隔で、前記複数の弾性容器に対する少なくとも１つの同じ応力および歪みに作用する、同時に動作可能な構造に配置される前記複数の弾性容器を収容するように動作可能なハウジングをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
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