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JP2023542705A - 核酸塩基編集のためのジンクフィンガー融合タンパク質 - Google Patents

核酸塩基編集のためのジンクフィンガー融合タンパク質 Download PDF

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JP2023542705A JP2023519028A JP2023519028A JP2023542705A JP 2023542705 A JP2023542705 A JP 2023542705A JP 2023519028 A JP2023519028 A JP 2023519028A JP 2023519028 A JP2023519028 A JP 2023519028A JP 2023542705 A JP2023542705 A JP 2023542705A
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Abstract

ジンクフィンガータンパク質およびシチジンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質を含む塩基エディターシステム、ならびに塩基エディターシステムの使用方法が本明細書で提供される。本システムは、標的ＤＮＡ配列中の単一塩基対を特異的に変化させるために使用することができる。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／０８３，６６２号；２０２１年３月２３日に出願された米国特許仮出願第６３／１６４，８９３号；および２０２１年８月６日に出願された米国特許仮出願第６３／２３０，５８０号の優先権を主張する。これらの優先権出願の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年９月２２日に作成された配列表の電子コピーは０２５２９７＿ＷＯ０３４＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、５２９，４４３バイトのサイズである。
一塩基の高精度のＤＮＡ編集は、遺伝性疾患などの障害の治療および理解において様々な用途がある。例えば、１つまたは複数の遺伝子のノックアウトは、通常のコドンを終止コドンに変換することによって、またはスプライス受容部位を突然変異させて、エクソンスキッピングおよび／もしくはフレームシフト突然変異を導入することによって、達成することができる。さらに、ＤＮＡ点突然変異は幅広い障害と関係がある。一塩基編集は、有害な突然変異を修正するため、または有利な遺伝子改変を導入するために使用することができる。
シチジンデアミナーゼは、核酸塩基のシトシンをチミンに（またはヌクレオシドのデオキシシチジンをチミジンに）変換する。この酵素は、ピリミジンサルベージ経路で機能し、主に一本鎖ＤＮＡに作用してシトシンをウラシルに変換し、続いて、ＤＮＡの複製または修復の間にウラシルがチミン塩基に置き換えられる。細菌バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）で同定されたシチジンデアミナーゼ、ＤｄｄＡは、二本鎖ＤＮＡ内のシトシンのウラシルへの脱アミノ化を触媒することができる。ＤｄｄＡは、したがって、ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの巻き戻しの要件を迂回する［Mok et al., Nature (2020) 583:631-7］。Ｍｏｋの研究は転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質に融合しているＤｄｄＡ由来シトシン塩基エディターを用いたヒトＣＣＲ５座位でのＣからＴへの塩基編集を報告するが、どれくらい広くこのアプローチが適用可能であるかは不明である。さらに、二本鎖ＤＮＡに作用する新しいデアミナーゼは、ＤｄｄＡと比較して、塩基編集活性が向上しているかまたは変化している可能性がある。
したがって、多数の疾患の予防および治療のために正確な塩基編集システムを開発する必要が引き続きある。
本開示は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ベースの核酸塩基編集システムおよびその使用を提供する。一態様では、本開示は、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞。真核細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞、または植物細胞であり得る）のゲノムにおいてシトシンをチミンに変えるためのシステムであって、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質、またはそれぞれ第１および第２の融合タンパク質を発現させるための第１および第２の発現コンストラクトを含み、ａ）第１の融合タンパク質が、ｉ）細胞の標的ゲノム領域中の第１の配列に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）シチジンデアミナーゼポリペプチドの第１の部分［例えば、シチジンデアミナーゼは、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む毒素由来デアミナーゼ（ＴＤＤ）である］を含み；ｂ）第２の融合タンパク質が、ｉ）標的ゲノム領域中の第２の配列に結合する第２のＺＦＰドメイン、およびｉｉ）シチジンデアミナーゼポリペプチドの第２の部分を含み；ｃ）標的ゲノム領域への第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質の結合が、第１の部分と第２の部分の二量体化をもたらし、二量体化した部分が、標的ゲノム領域中のシトシンをウラシルに変えることができる活性なシチジンデアミナーゼを形成するシステムを提供する。いくつかの実施形態では、第１の部分および第２の部分は、それら自体でシチジンデアミナーゼ活性を欠く。いくつかの実施形態では、第１の部分および第２の部分は、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む活性なシチジンデアミナーゼを形成する。いくつかの実施形態では、第１の部分および第２の部分は、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む活性なシチジンデアミナーゼを形成する。いくつかの実施形態では、標的ゲノム領域は細胞中の遺伝子の特定のアレルに特異的であり得る。いくつかの実施形態では、標的シトシンは、第１の配列の近位端と標的ゲノム領域中の第２の配列の間にあり得、近位端は１００ｂｐ以下離れていてもよい。
１対より多くの第１および第２の融合タンパク質を含み、融合タンパク質の各対が異なる標的ゲノム領域に結合し、ある対の融合タンパク質の第１および第２のシチジンデアミナーゼ部分が、別の対の融合タンパク質の第１の部分および第２の部分と異なっていてもよい、本塩基エディターシステムのマルチプレックスバージョンも提供される。
いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、非編集鎖または編集鎖で一本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすニッカーゼをさらに含み、ＤＮＡ切断は、編集されるシトシンから約５００ｂｐ以下、適宜２００ｂｐ以下、適宜約１０～５０ｂｐである。ニッカーゼは、例えば、ＺＦＰベースのニッカーゼ、ＴＡＬＥベースのニッカーゼまたはＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、標的ゲノム領域に結合する２つのＺＦＰドメインにそれぞれ融合している第１のニッカーゼドメインと第２のニッカーゼドメインの二量体化によって形成されるＺＦＰベースのニッカーゼであり、第１および第２のニッカーゼドメインは不活性であるか、またはそれ自体で有意もしくは特異的なニッカーゼ活性を欠く。ある特定の実施形態では、ニッカーゼドメインのうちの１つは第１または第２のＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ融合タンパク質に融合しており、もう１つのニッカーゼドメインは標的ゲノム領域中の第３の配列に結合する第３のＺＦＰドメインに融合している。あるいは、２つのニッカーゼドメインは、標的ゲノム領域中の第３の配列に結合する第３のＺＦＰドメインおよび標的ゲノム領域中の第４の配列に結合する第４のＺＦＰドメインにそれぞれ融合している可能性がある。特定の実施形態では、第１および第２のニッカーゼドメインはＦｏｋＩに由来する。
いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、シチジンデアミナーゼの阻害成分、例えば、シチジンデアミナーゼがＴＤＤである毒素由来デアミナーゼ阻害剤（ＴＤＤＩ）をさらに含む。例えば、阻害剤は、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ成分であり得る。ある特定の実施形態では、このシステムは、第３の融合タンパク質または細胞中で第３の融合タンパク質を発現させるための第３の発現コンストラクトを含み、第３の融合タンパク質は、ｉ）標的ゲノム領域中の第３の配列に結合するＺＦＰドメイン、およびｉｉ）シチジンデアミナーゼに対する阻害性ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼがＴＤＤであるＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ）を含み、標的ゲノム領域への第３の融合タンパク質の結合は、阻害性ドメインと二量体化したシチジンデアミナーゼ部分の相互作用、およびそれによる二量体化したシチジンデアミナーゼ部分のシチジンデアミナーゼ活性の阻害をもたらす。
阻害性ドメイン含有塩基エディターシステムのいくつかの実施形態では、システムは、第３の融合タンパク質または細胞中で第３の融合タンパク質を発現させるための第３の発現コンストラクト、および第４の融合タンパク質または細胞中で第４の融合タンパク質を発現させるための第４の発現コンストラクトを含み、第３の融合タンパク質は、ｉ）標的ゲノム領域中の第３の配列に結合するＺＦＰドメイン、およびｉｉ）第１の二量体化ドメインを含み；第４の融合タンパク質は、ｉ）シチジンデアミナーゼに対する阻害性ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼがＴＤＤであるＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ）、およびｉｉ）二量体化誘導剤の存在下で第１の二量体化ドメインとパートナーになることができる第２の二量体化ドメインを含み；標的ゲノム領域への第３の融合タンパク質の結合および第３と第４の融合タンパク質の二量体化は、二量体化したシチジンデアミナーゼ部分への阻害性ドメインの結合、およびそれによる二量体化したシチジンデアミナーゼ部分のシチジンデアミナーゼ活性の阻害をもたらす。
阻害性ドメイン含有塩基エディターシステムのいくつかの実施形態では、システムは、第３の融合タンパク質または細胞中で第３の融合タンパク質を発現させるための第３の発現コンストラクト、および第４の融合タンパク質または細胞中で第４の融合タンパク質を発現させるための第４の発現コンストラクトを含み、第３の融合タンパク質は、ｉ）標的ゲノム領域中の第３の配列に結合するＺＦＰドメイン、およびｉｉ）第１の二量体化ドメインを含み；第４の融合タンパク質は、ｉ）シチジンデアミナーゼに対する阻害性ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼがＴＤＤであるＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ）、およびｉｉ）二量体化阻害剤の非存在下で第１の二量体化ドメインとパートナーになることができる第２の二量体化ドメインを含み；標的ゲノム領域への第３の融合タンパク質の結合、および第３と第４の融合タンパク質の二量体化は、二量体化したシチジンデアミナーゼ部分への阻害性ドメインの結合、およびそれによる二量体化したシチジンデアミナーゼ部分のシチジンデアミナーゼ活性の阻害をもたらす。
特定の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムは、ニッカーゼ成分と本明細書に記載の阻害性ドメイン成分の両方を含む。
本明細書に記載の融合タンパク質で使用されるＺＦＰドメインのうちのいずれも、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーを独立に有することができる。
いくつかの実施形態では、本塩基エディターシステムのタンパク質成分は、発現カセットまたはコンストラクトによって細胞に提供される。そのようなカセットまたはコンストラクトは、ウイルスベクターなどの同じまたは別々の発現ベクターで細胞に提供することができる。ウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。
本明細書に記載の塩基エディターシステムのいくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼはＴＤＤである。ある特定の実施形態では、ＴＤＤは、配列番号７２（ＤｄｄＡ）のアミノ酸配列、または前記配列を含むＴＤＤの毒性ドメイン（例えば、配列番号４９または８１の毒性ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、配列番号４９または８１のアミノ酸配列に少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含むＴＤＤである。ある特定の実施形態では、第１のＤｄｄＡ部分は、配列番号７２のアミノ酸１２６４～１４２７のアミノ酸１２６４～１３３３、１２６４～１３９７、１２６４～１４０４、１２６４～１４０７もしくはそれらの断片を含み；第２のＤｄｄＡ部分は、配列番号７２の前記アミノ酸の残部もしくはそれらの断片を含み；またはその逆を含み；２つの部分は、機能的シチジンデアミナーゼを形成する。ある特定の実施形態では、第１のＤｄｄＡ部分は、配列番号７２のアミノ酸１２９０～１４２７のアミノ酸１２９０～１３３３、１２９０～１３９７、１２９０～１４０４、１２９０～１４０７もしくはそれらの断片を含み；第２のＤｄｄＡ部分は、配列番号７２の前記アミノ酸の残部もしくはそれらの断片を含み；またはその逆を含み；２つの部分は、機能的シチジンデアミナーゼを形成する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＤｄｄＡ部分はそれぞれ、配列番号８２および８３、配列番号８４および８５、配列番号１８および１９、配列番号５１および５２、または配列番号５３および５４を含み、またはその逆を含む。
本明細書に記載の塩基エディターシステムのいくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、配列番号７２のＹ１３０７、Ｔ１３１１、Ｓ１３３１、Ｖ１３４６、Ｈ１３６６、Ｎ１３６７、Ｎ１３６８、Ｐ１３６９、Ｅ１３７０、Ｇ１３７１、Ｔ１３７２、Ｆ１３７５、Ｖ１３９２、Ｐ１３９４、Ｐ１３９５、Ｉ１３９９、Ｐ１４００、Ｖ１４０１、Ｋ１４０２、Ａ１４０およびＴ１４０６から選択される１つまたは複数の残基に突然変異を有するＤｄｄＡである。
本明細書に記載の塩基エディターシステムのいくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、配列番号８６～９１および１１７～１２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＴＤＤである。ある特定の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、配列番号８６～９１および１１７～１２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＴＤＤの毒性ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＴＤＤは、配列番号９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列に少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、配列番号９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含むＴＤＤである。特定の実施形態では、第１および第２のシチジンデアミナーゼ部分はそれぞれ、配列番号９３および９４、配列番号９６および９７、配列番号９９および１００、配列番号１０２および１０３、配列番号１０５および１０６、配列番号１０８および１０９、配列番号１３０および１３１、配列番号１３２および１３３、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４４および１４５、配列番号１４６および１４７、配列番号１４８および１４９、配列番号１５０および１５１、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５８および１５９、配列番号１６０および１６１、配列番号１６３および１６４、配列番号１６５および１６６、配列番号１６８および１６９、配列番号１７０および１７１、配列番号１７３および１７４、配列番号１７５および１７６、配列番号１７８および１７９、配列番号１８０および１８１、配列番号１８２および１８３、配列番号１８５および１８６、配列番号１８７および１８８、配列番号１９０および１９１、配列番号１９２および１９３、配列番号１９５および１９６、配列番号１９７および１９８、配列番号２００および２０１、配列番号２０２および２０３、配列番号２０５および２０６、配列番号２０７および２０８、配列番号２１０および２１１、配列番号２１２および２１３、配列番号２１５および２１６、配列番号２１７および２１８、配列番号２２０および２２１、もしくは配列番号２２２および２２３を含み、またはその逆を含む。
関連した態様では、本開示は、ｉ）遺伝子（これは、真核性、例えば、ヒトの遺伝子であり得る）に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）シチジンデアミナーゼポリペプチドまたはそれらの断片を含む融合タンパク質であって、例えば、シチジンデアミナーゼが、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＴＤＤであり、ＺＦＰドメインおよびシチジンデアミナーゼまたはそれらの断片がペプチドリンカーによって連結していてもよい融合タンパク質も提供する。いくつかの実施形態では、ＴＤＤは、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む。
関連した態様では、本開示は、ｉ）遺伝子（これは、真核性、例えば、ヒトの遺伝子であり得る）に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）シチジンデアミナーゼ阻害性ドメインを含む融合タンパク質であって、例えば、シチジンデアミナーゼが、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＴＤＤであり、ＺＦＰドメインおよび阻害性ドメインがペプチドリンカーによって連結していてもよい融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ阻害性ドメインはＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩである。いくつかの実施形態では、ＴＤＤは、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む。
関連した態様では、本開示は、ｉ）遺伝子（これは、真核性、例えば、ヒトの遺伝子であり得る）に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）ニッカーゼまたはそれらの断片を含む融合タンパク質であって、ＺＦＰドメインおよびニッカーゼまたはそれらの断片がペプチドリンカーによって連結していてもよい融合タンパク質を提供する。
一態様では、本開示は、ａ）ｉ）遺伝子（これは、真核性、例えば、ヒトの遺伝子であり得る）に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）第１の二量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質、ならびにｂ）シチジンデアミナーゼ阻害性ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼは、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＴＤＤである）、ならびにｉｉ）第２の二量体化ドメイン（第１および第２の二量体化ドメインは、二量体化誘導剤の存在下で二量体化することができる）を含む第２の融合タンパク質を含む１対の融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ阻害性ドメインはＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩである。いくつかの実施形態では、ＴＤＤは、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、ａ）ｉ）遺伝子（これは、真核性、例えば、ヒトの遺伝子であり得る）に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）第１の二量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質、ならびにｂ）ｉ）シチジンデアミナーゼ阻害性ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼは、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＴＤＤである）、ならびにｉｉ）第２の二量体化ドメイン（第１および第２の二量体化ドメインは、二量体化阻害剤の非存在下で二量体化することができる）を含む第２の融合タンパク質を含む１対の融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ阻害性ドメインはＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩである。いくつかの実施形態では、ＴＤＤは、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする１種または複数の核酸分子ならびに該核酸分子を含む発現コンストラクトおよび該発現コンストラクトを含むウイルスベクターを提供し、ウイルスベクターは、適宜、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。本明細書に記載の塩基エディターシステム、本明細書に記載の融合タンパク質、本明細書に記載の単離核酸分子、本明細書に記載の発現コンストラクトまたは本明細書に記載のウイルスベクターを含む細胞（真核細胞、例えば、哺乳動物細胞または植物細胞であり得る）も提供される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である。
いくつかの態様では、本開示は、細胞（真核細胞、例えば、哺乳動物細胞または植物細胞であり得る）中の標的ゲノム領域においてシトシンをチミンに変える方法であって、本明細書に記載の塩基エディターシステムを細胞にデリバリーすることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、シトシンのチミンへの変更は標的ゲノム領域中に終止コドンを作出する。マルチプレックス型式のシステムは、１つより多いゲノム領域（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つのゲノム領域）を標的にすることができる。編集は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で実施することができる。
本編集方法によって得られる遺伝子操作細胞（これは、真核細胞、例えば、ヒトｉＰＳＣなどの哺乳動物細胞、または植物細胞であり得る）も提供される。
細胞および医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を含めて、本明細書に記載の操作された細胞（例えば、操作されたヒト細胞）は、それを必要とする患者（例えば、それを必要とするヒト患者）を治療するために使用することができ、またはそれを必要とする患者を治療するための医薬の製造で使用することができる。いくつかの実施形態では、患者は、癌、自己免疫障害、常染色体優性疾患またはミトコンドリア障害を有する。いくつかの実施形態では、患者は、鎌状赤血球症、血友病、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、テイ・サックス病、プリオン病、色盲、リソソーム蓄積症、フリードライヒ失調症または前立腺癌を有する。細胞を含むキットおよび製造品も企図される。
本発明の他の特色、目的および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すが、例示のためのみに与えられ、限定ではないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。
図１は、ＣからＴへの塩基編集のための１対のＺＦＰ－ＴＤＤ融合タンパク質を図示する概略図である。長方形は、融合タンパク質のＺＦＰドメイン中のＤＮＡ結合ジンクフィンガーを表す。下線を引いたＣヌクレオチドの上の矢印の形は、融合タンパク質の二量体化ＴＤＤドメインを表す。ジンクフィンガードメインとＴＤＤドメインの間の黒色の線は、ペプチドリンカーを表す。
図２Ａは、ＣＣＲ５標的化ＺＦＰ－ＴＤＤ融合タンパク質対のためのＺＦＰの設計を示す概略図である。Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１８およびＣ２４は塩基編集のための標的ヌクレオチドである。上の鎖（左から右）：配列番号２２７。下の鎖（右から左）：配列番号２２８。
図２Ｂは、二量体化ＺＦＰ－ＤｄｄＡ対のためのコンストラクトの設計の例を示す概略図である。ＦＬＡＧ：ＦＬＡＧタグ。ＮＬＳ：核局在化配列。ＵＧＩ：ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤。
図３は、一連のＺＦＰ－ＤｄｄＡ融合タンパク質対によるヒトＣＣＲ５座位でのＣからＴへの塩基編集のヒートマップの結果を示す表である。編集活性の程度は、セル内の濃淡の暗さに対応する。Ｌ０、Ｌ７ＡおよびＬ２６は、融合タンパク質においてＤｄｄＡドメインをＺＦＰドメインのＣ末端に融合するために使用されるペプチドリンカーを表す。
図４は、一連のＺＦＰ－ＤｄｄＡ融合タンパク質対によるヒトＣＣＲ５座位でのＣからＴへの塩基編集のヒートマップの結果を示す表であり、ＤｄｄＡの分割は異なる位置で生じる。編集活性の程度は、セル内の濃淡の暗さに対応する。
図５は、ＣＣＲ５標的化ＺＦＰ－ＴＤＤ融合タンパク質のためのＺＦＰの設計を示す概略図である。Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１８およびＣＣ２４は、塩基編集のための標的ヌクレオチドである。上から下：配列番号２２９（左から右）、配列番号２３０（右から左）、配列番号２３１（左から右）、配列番号２３２（右から左）、配列番号２３３（左から右）および配列番号２３４（右から左）。
図６Ａ～６Ｃは、示されるＤｄｄＡ突然変異を有する一連のＺＦＰ－ＤｄｄＡ融合タンパク質対によるヒトＣＣＲ５座位でのＣからＴへの塩基編集のヒートマップの結果を示す表である。突然変異は、配列番号７２について番号付けされている。編集活性の程度は、セル内の濃淡の暗さに対応する。
図７Ａは、塩基編集効率を高めるための、ＺＦＰ－ＴＤＤ塩基編集システムとニッカーゼシステムの併用を図示する概略図である。ここに示すニッカーゼシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのニッカーゼシステムである。例示の遺伝子座位はヒトＣＣＲ５座位である。上の鎖（左から右）：配列番号２３５。下の鎖（右から左）：配列番号２３６。
図７Ｂは、図７Ａのアプローチを使用する、ヒトＣＣＲ５座位でのＤｄｄＡのＣからＴへの塩基編集のヒートマップの結果を示す表である。編集活性の程度は、セル内の濃淡の暗さに対応する。
図８は、ＺＦＰ－ＴＤＤ塩基編集システムとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのニッカーゼシステムの併用を図示する概略図である。
図９は、三量体ＺＦＰ－ＴＤＤ＋ＦｏｋＩニッカーゼ塩基編集システムの例を図示する概略図である。
図１０は、ＣＣＲ５標的化ＺＦＰ－ＴＤＤ融合タンパク質対とＺＦＰ－ニッカーゼの併用のためのＺＦＰの設計を示す概略図である。Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１８およびＣＣ２４は、塩基編集のための標的ヌクレオチドである。上の鎖（左から右）：配列番号２３７。下の鎖（右から左）：配列番号２３８。
図１１は、図１０のアプローチを使用する、ヒトＣＣＲ５座位でのＤｄｄＡのＣからＴへの塩基編集のヒートマップの結果を示す表である。編集活性の程度は、セル内の濃淡の暗さに対応する。
図１２は、一連のＺＦＰ－ＴＤＤ融合タンパク質対によるヒトＣＣＲ５座位でのＣからＴへの塩基編集のヒートマップの結果を示す表である。編集活性の程度は、セル内の濃淡の暗さに対応する。Ｏ１：ＴＤＤ１；Ｏ２：ＴＤＤ２；Ｏ３：ＴＤＤ３；Ｏ４：ＴＤＤ４；Ｏ５：ＴＤＤ５；Ｏ６：ＴＤＤ６。
図１３は、ＴＤＤ１～ＴＤＤ６とのＺＦＰ融合タンパク質対によるＣＣＲ５塩基編集ウィンドウ中の任意のＣについてのＣからＴへの塩基編集の最高頻度のヒートマップの結果を示す表である。Ｏ１：ＴＤＤ１；Ｏ２：ＴＤＤ２；Ｏ３：ＴＤＤ３；Ｏ４：ＴＤＤ４；Ｏ５：ＴＤＤ５；Ｏ６：ＴＤＤ６。
図１４は、ＴＤＤ１～ＴＤＤ６とのＺＦＰ融合タンパク質対によるＣＣＲ５塩基編集ウィンドウ中の任意のＣについてのＣからＴへの塩基編集の最高頻度のヒートマップの結果を示す表である。Ｏ１：ＴＤＤ１；Ｏ２：ＴＤＤ２；Ｏ３：ＴＤＤ３；Ｏ４：ＴＤＤ４；Ｏ５：ＴＤＤ５；Ｏ６：ＴＤＤ６。
図１５は、ＣＩＩＴＡ標的化ＺＦＰ－ＴＤＤ融合タンパク質対のためのＺＦＰの設計を示す概略図である。Ｇ２、Ｇ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｃ１５およびＣ１６は、塩基編集のための標的ヌクレオチドである。上の鎖（左から右）：配列番号２３９。下の鎖（右から左）：配列番号２４０。
図１６は、一連のＺＦＰ－ＴＤＤ融合タンパク質対によるヒトＣＩＩＴＡ座位（「部位２」）でのＣからＴへの塩基編集の最高頻度のヒートマップの結果を示す表である。編集活性の程度は、セル内の濃淡の暗さに対応する。Ｏ１：ＴＤＤ１；Ｏ１４：ＴＤＤ１４；など。
図１７は、ＣＩＩＴＡ塩基編集ウィンドウにおける任意のＣ（下線を引いた）についてのＣからＴへの塩基編集の最高頻度のヒートマップの結果ならびにＤｄｄＡ、ＴＤＤ４、ＴＤＤ６、ＴＤＤ９、ＴＤＤ１０、ＴＤＤ１４、ＴＤＤ１５およびＴＤＤ１８に対するその配列モチーフを示す表である。増幅産物：配列番号２４４。Ｏ４：ＴＤＤ４；Ｏ６：ＴＤＤ６；など。
図１８は、ＴＤＤ６またはＴＤＤ１４とのＺＦＰ融合タンパク質対によるヒトＣＩＩＴＡ座位（「部位２」）でのＣからＴへの塩基編集のヒートマップの結果を示す表である。Ｌ２６、Ｌ２１、Ｌ１８、Ｌ１３、Ｌ１１、Ｌ９、Ｌ６およびＬ４は、融合タンパク質においてＴＤＤ６またはＴＤＤ１４ドメインをＺＦＰドメインのＣ末端に融合するために使用されるペプチドリンカーを表す。編集活性の程度は、セル内の濃淡の暗さに対応する。Ｏ６：ＴＤＤ６；Ｏ１４：ＴＤＤ１４。
図１９は、標的化されるＺＦＰ－ＴＤＤＩを用いたＴＤＤの阻害のための設計を図示する概略図である。
本開示は、例えば、ゲノムＤＮＡなどの細胞のＤＮＡにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への塩基編集のためのシステムおよび方法を提供する。本システムは、ＺＦＰ－毒素由来デアミナーゼ（ＴＤＤ）融合タンパク質（ＺＦＰ－ＴＤＤ）の使用を必然的にともなう。細胞状況において正確な遺伝子編集を提供することによって、多数の疾患の予防および／または治療のために本システムおよび方法を使用することができる。これらのシステムおよび方法は、複数のヒト遺伝子の同時ノックアウトを必要とする細胞ベースの療法に特に有用であることが考えられる。
本システムおよび方法は、標的Ｃ：Ｇ塩基対をＴ：Ａ塩基対に変換することができる。いくつかの実施形態では、塩基編集システムは、変換の安定性を増大させるタンパク質（例えば、ＵＧＩ）および／または編集領域のＤＮＡ修復を刺激するために、ならびに逆鎖のＧヌクレオチドのＡへの修正を促進し、編集されたＴ：Ａ塩基対を形成するために、標的塩基の近くにニックを生成するエンドヌクレアーゼを含むこともできる。
本システムおよび方法は、部分的には融合タンパク質中のＺＦＰドメインのコンパクトなサイズが理由で、有利である。比較すると、より大きな物理的サイズのＴＡＬＥおよび長いＣ末端ＴＡＬＥリンカーは、塩基編集ウィンドウをどれだけ小さくできるかを、および設計密度を制限する可能性がある。操作されたＴＡＬＥのサイズおよび非常に反復性の性質も、一般的なウイルスベクターを使用してＴＡＬＥベースの塩基エディターをヒト細胞にデリバリーするのを困難にする。本ＺＦＰ由来塩基編集システムはこれらの問題を回避する。例えば、ＴＡＬＥ塩基エディターシステム（例えば、ＴＡＬＥ－ＴＤＤ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ塩基エディターシステムと対照的に、これらのＺＦＰ由来システムのコンパクト性によって、単一のＡＡＶベクター内へのパッケージングが可能になる。さらに、本明細書の融合タンパク質が小型であることが理由で、編集される塩基の近くにＤＮＡニックを生成し、それによって、ＤＮＡ修復機構が編集されたＣの反対側の塩基をＧから対応するＡに変更するのを容易にし、正しいＴ：Ａ塩基対を形成することを可能にするように、編集システム中にニッカーゼを含むことが可能である。ニッカーゼの包含は、塩基編集効率を大きく増大させることができる。
Ｉ．ジンクフィンガー融合タンパク質
塩基エディタードメイン（例えば、本明細書に記載のものなどのＴＤＤであり得る、シチジンデアミナーゼドメイン）に融合しているＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、シチジンデアミナーゼ阻害剤（例えば、ＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ）ドメイン、および／またはニッカーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）を含む融合タンパク質が提供される。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」は、異種性機能ドメイン（すなわち、自然界において同じタンパク質中に天然に存在しない機能ドメイン）が共有結合している（例えば、ペプチジル結合による）ポリペプチドを指す。組換えで作製することができるこれらの融合タンパク質は、本塩基エディターシステムの成分である。いくつかの実施形態では、本明細書のＺＦＰ融合タンパク質は、シチジンデアミナーゼドメイン（例えば、本明細書に記載のＴＤＤに由来する）ならびにさらにニッカーゼドメインおよび／またはＵＧＩドメインを含む。
本システムの他の型式も本明細書で企図される。例えば、ペプチジル連結の代わりに、非共有結合によって２つの機能ドメインを結合させることができる。いくつかの実施形態では、２つの機能ドメイン（例えば、ＺＦＰドメインおよびシチジンデアミナーゼ阻害剤ドメイン；またはＺＦＰドメインおよびニッカーゼドメイン）はそれぞれ二量体化パートナー（例えば、ロイシンジッパーおよび本明細書にさらに記載されるもの）に融合しており、その結果、２つの機能ドメインが二量体化パートナーの相互作用を介して結合する。ある特定の実施形態では、これらのドメインの二量体化は、特定の薬剤（例えば、小分子またはペプチド）の有無によって制御され得る。そのような型式は、本発明の任意の態様において融合タンパク質と置き換わることができることが企図される。
本塩基エディターシステムの各成分を以下でさらに詳細に説明する。
Ａ．塩基エディター
本開示のＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ融合タンパク質は、ＺＦＰドメインに加えてシチジンデアミナーゼドメインを含む。本明細書で使用する場合、用語「デアミナーゼ」またはデアミナーゼドメイン」は、脱アミノ化反応を触媒するタンパク質を指す。例えば、シチジンデアミナーゼドメインは、シトシンのウラシルへの脱アミノ化を触媒することができ、ＤＮＡの複製または修復の間にウラシルがチミン塩基に置き換えられる。デアミナーゼドメインは、天然に存在していてもよいし、操作されていてもよい。いくつかの実施形態では、本開示のシチジンデアミナーゼは二本鎖ＤＮＡ上で作用する。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、例えば、原核生物または真核生物由来であり得る毒素に由来する。ある特定の実施形態では、生物は細菌または真菌であり得る。そのようなシチジンデアミナーゼは、毒素由来デアミナーゼ（ＴＤＤ）と本明細書で言及される。ＤｄｄＡおよびＤｄｄＡオルソログはＴＤＤである。本明細書で使用する場合、毒素「に由来する」シチジンデアミナーゼは、天然に存在する毒素と同じであるかまたはデアミナーゼ活性を保持する毒素の改変バージョンであるシチジンデアミナーゼを指すことができる。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼはＤｄｄＡ（配列番号７２）である。ある特定の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＤｄｄＡの毒性ドメイン［例えば、アミノ酸１２９０～１４２７（配列番号４９）または１２６４～１４２７（配列番号８１）］を含み、融合タンパク質はＺＦＰ－ＤｄｄＡと呼ばれる。バークホルデリア・セノセパシアに由来するＤｄｄＡタンパク質の例示的な全配列を以下に示す：
10 20 30 40 50
MYEAARVTDP IDHTSALAGF LVGAVLGIAL IAAVAFATFT CGFGVALLAG
60 70 80 90 100
MMAGIGAQAL LSIGESIGKM FSSQSGNIIT GSPDVYVNSL SAAYATLSGV
110 120 130 140 150
ACSKHNPIPL VAQGSTNIFI NGRPAARKDD KITCGATIGD GSHDTFFHGG
160 170 180 190 200
TQTYLPVDDE VPPWLRTATD WAFTLAGLVG GLGGLLKASG GLSRAVLPCA
210 220 230 240 250
AKFIGGYVLG EAFGRYVAGP AINKAIGGLF GNPIDVTTGR KILLAESETD
260 270 280 290 300
YVIPSPLPVA IKRFYSSGID YAGTLGRGWV LPWEIRLHAR DGRLWYTDAQ
310 320 330 340 350
GRESGFPMLR AGQAAFSEAD QRYLTRTPDG RYILHDLGER YYDFGQYDPE
360 370 380 390 400
SGRIAWVRRV EDQAGQWYQF ERDSRGRVTE ILTCGGLRAV LDYETVFGRL
410 420 430 440 450
GTVTLVHEDE RRLAVTYGYD ENGQLASVTD ANGAGVRQFA YTNGLMTNHM
460 470 480 490 500
NALGFTSSYV WSKIEGEPRV VETHTSEGEN WTFEYDVAGR QTRVRHADGR
510 520 530 540 550
TAHWRFDAQS QIVEYTDLDG AFYRIKYDAV GMPVMLMLPG DRTVMFEYDD
560 570 580 590 600
AGRIIAETDP LGRTTRTRYD GNSLRPVEVV GPDGGAWRVE YDQQGRVVSN
610 620 630 640 650
QDSLGRENRY EYPKALTALP SAHIDALGGR KTLEWNSLGK LVGYTDCSGK
660 670 680 690 700
TTRTSFDAFG RICSRENALG QRITYDVRPT GEPRRVTYPD GSSETFEYDA
710 720 730 740 750
AGTLVRYIGL GGRVQELLRN ARGQLIEAVD PAGRRVQYRY DVEGRLRELQ
760 770 780 790 800
QDHARYTFTY SAGGRLLTET RPDGILRRFE YGEAGELLGL DIVGAPDPHA
810 820 830 840 850
TGNRSVRTIR FERDRMGVLK VQRTPTEVTR YQHDKGDRLV KVERVPTPSG
860 870 880 890 900
IALGIVPDAV EFEYDKGGRL VAEHGSNGSV IYTLDELDNV VSLGLPHDQT
910 920 930 940 950
LQMLRYGSGH VHQIRFGDQV VADFERDDLH REVSRTQGRL TQRSGYDPLG
960 970 980 990 1000
RKVWQSAGID PEMLGRGSGQ LWRNYGYDAA GDLIETSDSL RGSTRFSYDP
1010 1020 1030 1040 1050
AGRLISRANP LDRKFEEFAW DAAGNLLDDA QRKSRGYVEG NRLLMWQDLR
1060 1070 1080 1090 1100
FEYDPFGNLA TKRRGANQTQ RFTYDGQDRL ITVHTQDVRG VVETRFAYDP
1110 1120 1130 1140 1150
LGRRIAKTDT AFDLRGMKLR AETKRFVWEG LRLVQEVRET GVSSYVYSPD
1160 1170 1180 1190 1200
APYSPVARAD TVMAEALAAT VIDSAKRAAR IFHFHTDPVG ALQEVTDEAG
1210 1220 1230 1240 1250
EVAWAGQYAA WGKVEATNRG VTAARTDQPL RFAGQYADDS TGLHYNTFRF
1260 1270 1280 1290 1300
YDPDVGRFIN QDPIGLNGGA NVYHYAPNPV GWVDPWGLAG SYALGPYQIS
1310 1320 1330 1340 1350
APQLPAYNGQ TVGTFYYVND AGGLESKVFS SGGPTPYPNY ANAGHVEGQS
1360 1370 1380 1390 1400
ALFMRDNGIS EGLVFHNNPE GTCGFCVNMT ETLLPENAKM TVVPPEGAIP
1410 1420
VKRGATGETK VFTGNSNSPK SPTKGGC （配列番号７２）
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、用語「ＤｄｄＡ」はＤｄｄＡ毒性ドメインを指す。
ある特定の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＤｄｄＡの「再接続化（ｒｅ－ｗｉｒｅｄ）」バージョン（例えば、配列番号５０）である。
本開示は、ヌクレオチドポケットを形成する残基（例えば、Ｙ１３０７、Ｔ１３１１、Ｓ１３３１、Ｖ１３４６、Ｈ１３６６、Ｎ１３６７、Ｎ１３６８、Ｐ１３６９、Ｅ１３７０、Ｇ１３７１、Ｔ１３７２、Ｆ１３７５、Ｖ１３９２、Ｐ１３９４、Ｐ１３９５、Ｉ１３９９、Ｐ１４００、Ｖ１４０１、Ｋ１４０２、Ａ１４０５、Ｔ１４０６またはこれらの任意の組み合わせ。残基の番号付けは配列番号７２についてである）で突然変異したＤｄｄＡの変異体も提供する。ＤｄｄＡは、例えば、前記残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２で突然変異している可能性がある。いくつかの実施形態では、ＤｄｄＡは、残基Ｅ１３７０、Ｎ１３６８、Ｙ１３０７、Ｔ１３１１、Ｓ１３３１、Ｋ１４０２またはこれらの任意の組み合わせで突然変異している。ある特定の実施形態では、ＤｄｄＡは、残基Ｅ１３７０、Ｎ１３６８、Ｙ１３０７またはこれらの任意の組み合わせで突然変異している。ある特定の実施形態では、突然変異は、ＤｄｄＡの効率を増大させること、ＤｄｄＡ活性を増大させること、ＤｄｄＡ活性ウィンドウを変化させること、またはこれらの任意の組み合わせを行うことができる。そのような変異体は、本発明の任意の態様において野生型ＤｄｄＡと置き換わることができることが企図される。
特定の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメイン（例えば、本明細書に記載のＴＤＤに由来する）は、単独でシチジンデアミナーゼ活性を欠くが、二量体化して活性なシチジンデアミナーゼを形成する、第１および第２の「ハーフドメイン」または「分割体（ｓｐｌｉｔｓ）」から構成される「分割酵素（ｓｐｌｉｔ ｅｎｚｙｍｅ）」である。本明細書で使用する場合、「不活性である」かまたは「シチジンデアミナーゼ活性を欠く」ハーフドメインは、ｉ）いかなるシチジンデアミナーゼ活性も（例えば、いかなる検出可能なシチジンデアミナーゼ活性も）欠く、ｉｉ）特定のシチジンデアミナーゼ活性を欠く、またはｉｉｉ）有意なシチジンデアミナーゼ活性（すなわち、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％またはそれ以上（特定の実施形態では、１０％以上であり得る）の的確な塩基編集活性）を欠く、ハーフドメインであり得る。例えば、活性なシチジンデアミナーゼのアセンブリーは、ハーフドメインが機能的シチジンデアミナーゼのアセンブリーを可能にするように位置するような、互いに近接したＤＮＡ標的へのハーフドメイン結合型ジンクフィンガータンパク質の結合によって、引き起こされ得る。
本明細書に記載の「ハーフドメイン」の対は、シチジンデアミナーゼ活性を別々に欠くが、機能的シチジンデアミナーゼドメインを一緒に形成するシチジンデアミナーゼポリペプチド配列（野生型または本明細書で論じる変異体のいずれか）の任意の対を指すことができることが理解されよう。シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡである場合、ＤｄｄＡ配列中の「分割」は、いくつかの位置のうちのいずれかで、例えば、Ｇ１３２２、Ｇ１３３３、Ａ１３４３、Ｎ１３５７、Ｇ１３７１、Ｎ１３８７、Ｅ１３９６、Ｇ１３９７、Ａ１３９８、Ｉ１３９９、Ｐ１４００、Ｖ１４０１、Ｋ１４０２、Ｒ１４０３、Ｇ１４０４、Ａ１４０５、Ｔ１４０６、Ｇ１４０７またはＥ１４０８などで生じる可能性があり、タンパク質の中央である必要はない。いくつかの実施形態では、「分割」は、Ｇ１３２２、Ｇ１３３３、Ａ１３４３、Ｎ１３５７、Ｇ１３７１、Ｎ１３８７、Ｇ１３９７、Ｇ１４０４またはＧ１４０７で生じる。ある特定の実施形態では、「分割」は、Ｇ１４０４、Ｇ１４０７、Ｇ１３３３またはＧ１３９７で生じる。特定の実施形態では、「分割」はＧ１４０４またはＧ１４０７で生じる。いくつかの実施形態では、ＤｄｄＡハーフドメインの対は、
ａ）配列番号８２および８３、
ｂ）配列番号８４および８５、
ｃ）配列番号１８および１９、
ｄ）配列番号５１および５２、または
ｅ）配列番号５３および５４
のアミノ酸配列を含むことができる。
ある特定の実施形態では、ＴＤＤは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０６９９７７５３２．１（「ＴＤＤ１」、配列番号８６）、ＷＰ＿０２１７９８７４２．１（「ＴＤＤ２，」配列番号８７）、ＱＮＭ０４１１４（「ＴＤＤ３，」配列番号８８）、ＷＰ＿１８１９８１６１２（「ＴＤＤ４，」配列番号８９）、ＡＸＩ７３６６９．１（「ＴＤＤ５，」配列番号９０）、ＷＰ＿１９５４４１５６４（「ＴＤＤ６，」配列番号９１）、ＡＶＴ３２９４０．１（「ＴＤＤ７，」配列番号１１７）、ＷＰ＿１８９５９４２９３．１（「ＴＤＤ８，」配列番号１１８）、ＴＣＰ４２００４．１（「ＴＤＤ９，」配列番号１１９）、ＷＰ＿１７１９０６８５４．１（「ＴＤＤ１０，」配列番号１２０）、ＷＰ＿１７４４２２２６７．１（「ＴＤＤ１１，」配列番号１２１）、ＷＰ＿０５９７２８１８４．１（「ＴＤＤ１２，」配列番号１２２）、ＷＰ＿１３３１８６１４７．１（「ＴＤＤ１３，」配列番号１２３）、ＷＰ＿０８３９４１１４６．１（「ＴＤＤ１４，」配列番号１２４）、ＷＰ＿０８２５０７１５４．１（「ＴＤＤ１５，」配列番号１２５）、ＷＰ＿０４４２３６０２１．１（「ＴＤＤ１６，」配列番号１２６）、ＷＰ＿１６５３７４６０１．１（「ＴＤＤ１７，」配列番号１２７）、ＮＬＩ５９００４．１（「ＴＤＤ１８，」配列番号１２８）、もしくはＫＡＢ８１４０６４８．１（「ＴＤＤ１９」、配列番号１２９）下のアミノ酸配列、またはシチジンデアミナーゼ活性の能力がある、前記アミノ酸配列の一部（例えば、「毒性ドメイン」）を含むことができる。これらのアミノ酸配列を以下に示す：
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０６９９７７５３２．１（ＴＤＤ１）
MSSSDAGRAFGVPENVLARFTRYPGGARRRAGRTARARRLGIVLSAVLSATLLPAEAWAIAPPAPRTGPTLDALQQEEEVDPDPAAMEELDDWDGGPVEPPADYTPTEVTPPTGGTAPVPLDSAGEELVPAGTLPVRIGQASPTEEDPAPPAPSGTWDVTVEPRATTEAAAVDGAIIKLTPPASGSTPVDVELDYGRFEDLFGTEWSSRLKLTQLPECFLTTPELEECGTPITIPTSNDPATGTVRATVDPADGQPQGLAAQSGGGPAVLAATDSASGAGGTYKATSLSATGSWTAGGSGGGFSWSYPLTIPDTPAGPAPKISLSYSSQSVDGRTSVANGQASWIGDGWDYHPGFVERRYRSCNDDRSGTPNNDNSADKEKSDLCWASDNVVMSLGGSTTELVRDDTTGTWVAQNDTGARIEYKDKDGGALAAQTAGYDGEHWVVTTRDGTRYWFGRNTLPGRGAPTNSALTVPVFGNHTGEPCHAATYAASSCTQAWRWNLDYVEDVHGNAMVVDWKKEQNRYAKNEKFKAAVSYDRDAYPTQILYGLRADDLAGPPAGKVVFHAAPRCLESAATCSEAKFESKNYADKQPWWDTPATLHCKAGDENCYVTSPTFWSRVRLSAIETQGQRTPGSTALSTVDRWTLHQSFPKQRTDTHPPLWLESITRVGFGRPDASGNQSSKALPAVTFLPNKVDMPNRVLKSTTDQTPDFDRLRVEVIRTETGGETHVTYSAPCPVGGTRPTPASNGTRCFPVHWSPDPAAFSDENLDKSGYEPPLEWFNKYVVTKVTEMDLVAEQPSVETVYTYEGDAAWAKNTDEYGKPALRTYDQWRGYASVVTRTGTTANTGAADATEQSQTRTRYFRGMSGDAGRAKVHVTLTDVTGTATTVEDLLPYQGMAAETLTYTKAGGDVAARELAFPYSRKTASRARPGLPALEAYRTGTTRTDSIQHISGDRTRAAQNHTTYDDAYGLPTQTYSLTLSPNDSGTLVAGDERCTVTTYVHNTAAHIIGLPDRVRATTGDCAAAPNATTGQIVSDSRTAYDALGAFGTAPVKGLPVQVDTISGGGTSWITSARTEYDALGRATKVTDAAGNSTTTTYSPATGPAFEVTVTNAAGHATTTTLDPGRGSALTVTDQNGRKTTSTYDELGRATGVWTPSRPVNQDASVRFVYQIEDSKVPAVHTRVLRDAGTYEESIELYDGFLRPRQTQREALGGGRIVTETLYNANGSAKEVRDGYLAEGEPARELFVPLSLDQVPSATRTAYDGLGRPVRTTTLHRGVPRHSATTAYGGDWELSRTGMSPDGTTPLSGSRAVKATTDALGRPARIQHFTTQNVSAESVDTTYTYDPRGPLAQVTDAQQNTWTYTYDARGRKTSSTDPDAGAAYFGYNALDQQVWSKDNQGRLQYTTYDVLGRQTELRDDSASGPLVAKWTFDTLPGAKGHPVASTRYNDGAAFTSEVTGYDTEYRPTGNKVTIPSTPMTTGLAGTYTYASTYTPTGKVQSVDLPATPGGLAAEKVITRYDGEDSPTTMSGLAWYTADTFLGPYGEVLRTASGEAPRRVWTTNVYDEDTRRLTRTTAHRETAPHPVSTTTYGYDTVGNITSIADQQPAGTEEQCFSYDPMGRLVHAWTDGNSAVCPRTSTAPGAGPARADVSAGVDGGGYWHSYAFDAIGNRTKLTVHDRTDAALDDTYTYTYGKTLPGNPQPVQPHTLTQVDAVLNEPGSRVEPRSTYAYDTSGNTTQRVIGGDTQTLAWDRRNKLTSVDTNNDGTPDVKYLYDASGNRLVEDDGTTRTLFLGEAEIVVNTAGQAVDARRYYSSPGAPTTIRTTGGKTTGHKLTVMLSDHHSTATTAVELTDTQPVTRRRFDPYGNPRGTEPTTWPDRRTYLGVGIDDPATGLTHIGAREYDASTGRFISVDPVMDLTDPLQMNGYTYANADPINNSDPTGLLLDARGGGTQKCVGTCVKDVTNRKGIPLPPGEEWKHEGEAQTDFNGDGFITVFPTVNVPAKWKKAKKYTEAFYKAVDTACFYGRESCADPEYPSRAHSINNWKGKACKAVGGKCPERLSWGEGPAFAGGFAIAAEEYAGRGGYRGGGARRGSPCKCFLAGTEVLMADGSTKSIEDIKLGDEVVATDPVTGEAGAHPVSALIATENDKRFNELVIITSEGVERLTATHEHPFWSPSEGEWLEAGELRTGMTLRSDSGETLVVAGNRAFTQRARTYNLTVADLHTYYVLAGQTPVLVHNANCGPHLKDLQKDYPRRTVGILDVGTDQLPMISGPGGQSGLLKNLPGRTKANGEHVETHAAAFLRMNPGVRKAVLYIDYPTGTCGTCRSTLPDMLPEGVQLWVISPRRTEKFTGLPD（配列番号８６）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０２１７９８７４２．１（ＴＤＤ２）
MVDLGAYEEPVAFDDGVADALRSAASALSGTLSGQAASRSSWAATASTDFEGHYADVFDANARAACDDCSNIASALDALAADVQTMKDAAASERDRRRQAKEWADRQKDEWAPKSWIDDHLGLDKPPAGPPETPVVDAQAPTVATWSEPAQGQAGGVSSARPDDLRTYSSNVTGANDTVTTQKGTLDGALSDFADRCSWCSIDTSGITTALAAFGANNTNETRWVDTVAAAFEAAGGSGAISAVSDAALDASLQAAGVTQSRQPVDVTAPTIQGDPQTSGYADDPVNTTTGNFIEPETDLAFSGGCASLGFDRVYNSLSAGVGAFGPGWASTADQRLLVTEDGAVWVQPSGRHVVFPRLGNGWDRAHNDTYWLHTTTDTTGPTPGDAPTTGAAGGAGVFVVSDNAGGRWVFDRAGRPVSVSRGPGTRVDHRWDGDRLVGLTHERGRAVTIEWNDHHTRITALTANDGRRVDYGYDPAGRLTEAASAGGTRTYGWNEAGLIATVTDPDGVVEAANTYNEHGQVTSQRSRFGRLSHYTYLPGGVTQVADEDGGRANTWIHDQTGRLVGMVDADGNRQSIGWDQWGNRVQITGRDGRTTVCRYDARGRLITRQEASGARTDYEWDEADRVVQVTVTDTTSSSHGNTSSAGGSGPSVTSYEYEGAGRNPSTVTDPEGGVTRLTWDQNLLTEATDPAGVRVRLGYDGHGDLVSTTNAAGDTARLVRDGAGRVVAAITPLGHRTEYRYDEAGRLASRQDPDGALWRYEHTTGGRLSAVVDPDGGRTVTEYGPGGVEEATTDPLGRRLEQEWDDLGNLAGVRLPDGREWSYVHDGLSRLTETVDPAGGLWRREYDVNGMVAATVDPTGVRRGLAWAADGSVTVSDASGTARVGVDGLGRPVSVSVSSAPAPGEAVPMGMSLEETVGTGAPAPGGAGPDGPDARVVVRDLCGRPVEALDADGGLTRLMRDAAGRLVEEISPAGRSTRYEWDRCGRLSAVIGPDGARTTMAYDAASRLIAQDGPGGRVRVAYDRCGRLSTVTAPGRGKTTWGYDRAGRVRSVRSPAWGLVRFGYDPAGQLTAVTNALGGVTRYDYDECGRLVQVTDPLGHVTRRTYTAADRVETLVDPLGRTTQAGYDAAGRQLWQTDDTGERLAFGWDEAGRLERVATGGEGLPGQTCCALTRPGRRVLRVTGPGGARDELVFDRLGRLARHARGGRTVGEWSWDPDGACTAFTGPDGQRVRYAYDDAGALVRVEGTAFGPVTVRRDTAGRLTGMDGPGLTQRWDRDETGHVIAYRRTKNGVTTSSRVSRDESGRVTAVDGPDGTVRYGYDPAGQLARIEGPDGRRESFTWDKAGHLTRRSVERPGARPETTLYSYDPAGQLASTDGPDGRTLYTWDAAGRRTGQDGPDGHWSYSWAPSGHLTAVTRRTPHDARTWRISRDGLGLPRRIDDTDLAWDLSGPVPALTRFGTHTVTGLPRALAIDGTLTSTGWRPARPTSADDPWAPPPPVVETDGARLGVGGAVGLGGLEILGARVHDPTTFSFLSPDPLDQPPLAPWATNPYSYAANNPLAFTDPTGLRPLTDTDFEAYKHDHGGLGGWIADHKDYLIGGAMVIAGGVLMATGVGGPLGGMLIGAGADTIIQRATTGQVDYGQVAVSGLLGAAGGGAASALLKGGGRLATELGATGLRTAITTGAASGTASGAGGSGYGYLTGPGPHTVSGFLTSTATGAVEGGLLGGASGAAGHGLSTTGKNVLGHFEPTPTTPQGTSSDTIAEMLNSASQPGRTAGVLDIDGELTPLTSGRPSLPNYIASGHVEGQAAMIMRQQQVQSATVYHDNPNGTCGYCYSQLPTLLPEGAALDVVPPAGTVPPSNRWHNGGPSFIGNSSEPKPWPR（配列番号８７）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＱＮＭ０４１１４．１（ＴＤＤ３）
MSLPEYDGTTTHGVLVLDDGTQIGFTSGNGDPRYTNYRNNGHVEQKSALYMRENNISNATVYHNNTNGTCGYCNTMTATFLPEGATLTVVPPENAVANNSRAIDYVKTYTGTSNDPKISPRYKGN（配列番号８８）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１８１９８１６１２（ＴＤＤ４）
MLAIEKIKSGDKVISTDPETMETSPKTVLETYIREVTTLVHLTVNGEEIVTTVDHPFYVKNQGFIKAGELIVGDELLDSNCNVLLVENHSVELTDEPVTVYNFQVEDFHTYHVGKCRLLVHNANCNQEKPVLPKYDGKTTEGVMVTPDGKQISFKSGNSSTPSYPQYKAQSASHVEGKAALYMRENGINEATVFHNNPNGTCGFCDRQVPALLPKGAKLTVVPPSNSVANNVRAIPVPKTYIGNSTVPKIK（配列番号８９）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＸＩ７３６６９．１（ＴＤＤ５）
MSSSVSGRAFRVSGVLTRITKSWTPGSARRSSASVRHRGRAVRARSLGVTLSAVLAATLLPAEAWAIAPPAPRIGPSLVDLQQEEPADPDQAKIDELSTWSGAPVEPPADYTPTATTPPAGGTAPVALDGAGDDLVPVGNLPVRLGKASPTDEEPDPPAPGGTWDVAVEPRTSTEASDVDGALITVTPPSGGATPVDIELDYGKFEDLFGTAWSSRLRLTQLPECFLTTPELDECTTVVDVPSVNDPSNDTVRATIDPAASPQQGLSTQSGGGPVVLAATDSASGAGGTYKATPFTATGTWTAGGSGGGFSWSYPLTAPAPPAGPAPTISLSYSSQSVDGRTSVANGQASWIGDGWDYNPGFIERRYRSCNDDRSGTPNNAGGKDKKKSDLCWASDNLVMSLGGSATALVHDGTTGAWVAQSDTGARIEYRTRTGSPKTAQTGAYDGEYWVVTTRDGTRYWFGRNTIPGRTAATESALTVPVFGNHSGEPCHATAYADSSCAQAWRWNLDYVEDVHGNAMIVDWKKETNRYARNEKFKEAVAYHRGGYPAQILYGLRADDLNGAPAGKVVFKTAPRCVEDAGTTCSPTGYESDNYADKQPWWDTPATLHCKSGAKNCFVTSPTFWSSVRLTEIETHGRRTPGSTALSLVDSWTLKQSFPKQRTDTHPPLWLESITRTGHGAPNASGEQTSRALPPVSFLPNVVDMPNRVSKGATDETPDFDRLRVETVRTETGGEIHVDYSAPCAVGTAHPSPETNTTRCFPVHYSPDPEALSDEVLAKKPAPVEWFNKYVVQKVTEKDRVARQPDVVTTYAYEGGGAWGRSTDEFTKPKLRTYDQWRGYASVLVRKGVTGADPAAADATEQSQTRMRYFRGMSGDAGRPTVTVKDSTGAETLGEDLAPYQGMPAETVAYTRAGGDVASRILAWPTSRETASQARPGLPALKAHRVATARTETVETISGGRTRTARTVTTYDDTYGLPLTAETLTLTPDGSGGTTTGDRSCSTNTYVHNTAKHLIGLVQRARTTVGTCAQAATASGSDVVSDTRVSYDALDAFGAAPVRGLPFRTDTVGADGTGWVTSARTEYDPLGRATEVRDAKGHVSKVGFVPPTGPAFTTTSTDAKGHTTTTALDPARGTALSVTDANGRRTTSAYDELGRTTAVWSPSRTQGTDKASVLFDYQIEDNKVPATRTRVLRDNGTYEDSVTVYDGLLRPRQAQTEALGGGRIVTETLYNANGAPAETRNGYLAEGEPQTELFVPLSLTQVPSASKTAYDGLGRAVRTTVLHAGDPQHSATVRHEGDRTLTRTGMSADGTTPMPGSRSTATWTDALGRTSKIEHFTATDLSAAIDTRYTYDARGNLAKVTDARDNIWTYTYDARGRLTFSTDPDAGSSSFGYDVLDRQIWSKDSRQRSQHTVYDELGRRTELRDDSAEGPLVAKWTYDTLPGAKGLPVASTRYHEGAEFTSEVTGYDQEYRPTGSRTTIPSTPLTTGLAGTYTYKNTYTPTGLPQSVELPATPGGLAAEKVITRYDGEGSPRTTSGLAWYTVDTVLSPLGQVLRTASGEAPNRVWATHFYDESTGRLDRRITDRETLDPSRISETSYAHDTVGNITSITDTQSPARVDRQCFAYDPMGRLAHAWTAKSPGCPRSSTAQGAGPNRTDVSPSIDGAGYWHSYEFDTIGNRTGMVVHDPADPALDDTYVYTHGVPSEGPLQPATLQPHTLTKVDATVRGPGSTVTSSSTYAYDPSGNTTQRVIGGDTQALTWDRRNKLMSADTDDDGTADVTYLYDASGNRLLEADATTRTLYLGESEIVVDTAGRPVEARRYYSHPGAPTTLRTTGGRTSGHTLTVQLTDHHNTPTASVALTGGQPVTRRMFDPYGNPRGTEPTTWPDRRTYLGVGIDDETTGLTHIGAREYDSVTGRFISADPIIDIADPLQMNGYAYANNNPVTNWDPTGLKSDECGSLYRCGGNQVITTKTTKYQDVNTVARHFEKTASWATLAQWKAEGLGKSPAFGKAKKLTKWKNEHYEKNWTINLVPGMARSWVSGVDAAASAIMPFPTVQAAPLYDSLVSSLGVNTKGRAYANGEGLMDGLSMVGGVGAIAPGIKSGLKAAAKGCGPGNSFTPGTEVALADGTTKPIEDIKIGDEVLATDPETGETRAEKVTAEIRGDGTKNLVKVTIDTDGDRGTDTAEITATDGHPFWVPELGRWIDATDLAPGQWLRTSAGTHVQITAIKRWTETATVHNLTVADLHTYYVLAGKTPVLVHNENCGPNLKDLPKDYDRRTVGILDVGTDQLPMISGPGGQSGLLKNLPGRTKANTDHVEAHTAAFLRMNPGIRKAVLYIDYPTGTCGTCGSTLPDMLPEGVQLWVISPRKTEKFAGLPD（配列番号９０）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１９５４４１５６４（ＴＤＤ６）
MKLTYKELEIELELAGLLAVEELVLTQGLNCHAGLTLKILIEEEQRDELVTMSSDAGVTVRELEKTNGQVVFRGKLETVSARRENGLFYLYLEAWSYTMDWDRVKKSRSFQNGALTYMEVVQRVLSGYGQSGVTDHATGGACIPEFLLQYEESDWVFLRRLASHFGTYLLADATDACGKVYFGVPEISYGTVLDRQGYTMEKDMLHYARVLEKEGVLSQEASCWNVTVRFFLRMWETLTFNGIEAVVTAMRLHTEKGELVYSYVLARRAGIRREKEKNPGIFGMSIPATVMERSGNRIRVHFEIDPEYEASEKTKYFTYAIESSSFYCMPEEGSQVHIYFPDHDEQGAVAVHAIRSGEGASGSCSTPENKRFSDPSGSAMDMTPASLQFAPDAGGATVLHLEGGGFLSLTGMDIKLKTQMGMASDKEKPMQDLMICGEQKLTMQIGESSDDCIVMEAGTEVRSALVVQEADSSPAAVPSGDELLSEQEAADAQAREAENNAVKEDMITKKQESKRKIVDGVISLVTVVGLTALTVATGGLAAPFAIAAGVKATFAVADIAEGLDGYSKMNAMDASRPANFLRDTVFGGNQTAYDITSMITDVAFDVVSGKALVGAFSGADKVSKVQKFAGKAMSFWNGICPKTKVANFLFQMGGTMLFGAVNDYLTTGKVDLKNLGLDAFAGLAKGTLGTAGTEKIKRLLNTDNKWVEKAVGILAGTTFGTTVDLGINKLAGRDVDLLQVIKQNLIESGLGQFFGEPIDVVTGAFLITATDFTLPDIREDLRVQRKYNSTSREAGLLGPGWSFSYECRLYCSGNRLHAKLDSGITAVFAWDGSHAVNVTRGCEWLELTGEDDGWRIYDGRNYKCYHYDGQGLLTAAEDRNGQCVRLYYEGERLTRITTPLGYSLDVEIRDGRLVQIRDHMGRTMQYRYENGFLSDVIHMDEGVTHYEYDSNGYLERAVDQAKVTYLENRYDDAGRVVLQTLANGDTYRADYHPEKNRVTIVSSVHDKAVEHWYNEFGEILETSYQDGTKERYEYGENGHRTSRTDRLGRKTTWTYDEAGRLTEEVQPDGLRTVHRYDAAGNEILRTDSAGRETAFEYDGHHNRTAERRTDGLQVRENRSVYDWMGRLTETADAEGNRTQYQYGEAGGKPSVIRFADGETCSFEYDKAGRMMAQEDACGRTEYGYNARNKRALVRDGEGNETRWMYDGMGRLLALYLPKAWKEQHGEYSYSYDFLDRLIHTKNPDGGHERLMRDGEGNVLKRVHPNAYDSCRDDGEGTTYDYDSDGNNIRIHYPDGGCERIFYDSEGNRIRHVMPESYDPQTDDGEGFTYTYDACSRLTGVTGPDGVRQASYTYDPAGNLTEETDAEGRCTYRSYTAFGELKEQLKPALEKDGVMLYERITWQYDRCGNVLLEQRHGGYWDSNGVLVKEDGAGLALRFTYDSRNRRIRVEDGLGAVISCHYDVQGKLVYEEKAVSGEVRQVIHYGYDRAGRLTERKEELDSGLAPLEGEPRYAVTRYRYDGNGNRTGIVTPEGYRILRSYDACDRLVSERVVDDKNGIDRTTSVTYDYAGNITRIVRSGKGLGEWEQGYGYDLKDRIVHVKDCLGPVFSYEYDKNDRRIAETLPQTGMTENGKSGYPKNQNRYRYDVYGRLLTRTDGSGTVQEENRYLPDGRLALSREADGQEIRYAYGAHGREEETGTARSRKAGRAAQKYRYDSRGRITGVVNGNGNETGYDLDAWGRIQNIRQADGGEEGYTYDFAGNVTGTRDANGGVITYRYNSQGKVCEITDQEGNSETFRYDREGRMVLHVDRNGSEVRTTYNVDGNPVLETGTDRNGENRVTRSFEYDASGNVRKAVAGGFCYTYEYRPDGKLLKKSASGRTILSCSYHADGSLESLTDASGKPVFYEYDWRGNLSGVRDENGDMLAAYAHTPGGKLKEICHGNGLCTRYEYDTDGNMIHLHFQRENGETISDLWYEYDLNGNRTLKTGKCILSGDSLTDLAVSYRYDSMDRLTSESRDGEETAYSYDFCGNRLKKLDKSGTEEYHYNRKNQLICRFSEKEKTAYRYDLQGNLLEAAGAEGTEVFSYNAFQQQTAVTMPDGKHLENRYDAEYLRAGTVENGTVTSFSYHNGELLAESSPEGDTISRYIPGYGVAAGWNREKSGYHYYHLDEQNSTAYITGGSCEIENRYEYDAFGVLKNSMEEFHNRILYTGQQYDQTSGQYYLRARFYNPVIGRFVQEDEYRGDGLNLYAYCKNNPVVYYDPSGYDSQYPCKEEMSAGAGESGRKTISLPEYDGTTTHGVLVLDDGTQIGFTSGNGDPRYTNYRNNGHVEQKSALYMRENNISNATVYHNNTNGTCGYCNTMTATFLPEGATLTVVPPENAVANNSRAIDYVKTYTGTSNDPKISPRYKGN（配列番号９１）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＶＴ３２９４０．１（ＴＤＤ７）
MGDRLPAFVDGGDTLGIFSRGGIERDLASGVAGPASSLPKGTPGFNGLVKSHVEGHAAALMRQNGIPNAELYINRVPCGSGNGCAAMLPHMLPEGATLRVYGPNGYDRTFTGLPD（配列番号１１７）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１８９５９４２９３．１（ＴＤＤ８）
MSSRPFRKRLPGAVVRRWLGRGAVVASLSLLPQVVVPSGYDFAAQAQSVAARKKLEDRPEAKINKVGVLRPGTSKAPKDKSAPASRKTRERLQEASWPKSGKATAAVTATSEATVNVGGLGMELTQEPAAPAAKSAKSTTKRKATGPAEKVTLRVHSRATAKKAGVNGVLLTVDPARGESNEKAEDTDKLRISLDYSSFSDVYGGNFGPRLSLVKLPACALTTPEKKSCRTQTPVAGADNEAESQTLTGTVPARNLKAGTPMLLAAAADSSGGGGDFSATPLSPTATWEAGGSTGDFTWDYPLRVPPATAGPSPNLSISYNSASVDGRTAGENNQTSLIGEGFSITESYIERKYASCKDDGQSGKGDLCWKYANATLVLNGKAVELVNACADKSACDTAALSEASGGTWKVKNEDGTRVEHLTGASGNGDNNGEYWKVTDASGIQYYFGKHRMPGWSDKGTTDTADDDPSTYSTWAVPVFGDDSGEPCYKSSGFADSSCNQAWRWNLDYVVDTHDNASTYWYSKETNYYSKNADTTVNGTAYTRGGYLNRIDYGLRSDLIYSKPAAQQVRFTYGQRCIVTNGCSSLTKDTKANWPDVPYDMICAANTKCTTQIGPSFFTRQRLIDITTSVWTGTGTTRRDVDTWHLSHDFPDTGDASSPSLWLKSIQNTGKANTTTAAMPPIVFGGIQMPNHVEGSGQDNLRYIKWRVRTIKSETGSTLTVNYSDPDCIWGSSMPSAVDKNTRRCFPVKWSQSGTTPVTDWFHKYVVTSVLQDDPYGHSDTGETYYDYQGGAGWAYSDDEGLTKPSNRTWSQWRGYGKVVTTSGNSEGPRSKKSTLYMRGLNGEKELDGTARVAKVTDSTGTAIDDSRQYAGFVRETIAYNGSDELSGTINTPWSHKTGSHTYSWGTTEAWIVQAGETESRTKISTGTRTVKQKTTYDTTYGMPITVEDSGDATKFGDESCVRTSYARNTSAWLVNRVSRTETYSVPCATIPAIPADVVSDITTAYDAKAVGAAPTQGDITATYRVASYNAADKTPVYQQVSSSTFDKLGRPLTETNALDRTVKTSYVPDDTGYGPLTSKTTTDPKLYTSTTEVDPAWGAASKTTDANGNVTEWSFDALGRLRSVWKPDRSRTLDDAASIVYAYSVNNDKETWVRTDALKADGKTYNSSYEIFDSLLRPRQKQVPAPNGGRVISEMLYDDRGLAYIANSQVHDNSAPSGTLANTYTGSVPASTETVFDAAGRATDSIFRVYGQEKWRTKTDQQGDRTAVTAAAGGTGTLTIVDARGRVTERREFGGPAPTGTDYTRTLYEYTPGGQIKKMTGPDGAVWTYEYDLRGRKTTSTDPDKGSITTTYNDADQPLTATTTLDNVSRTLINDYDELGRPTGTWDGTKDNAHQLTKFTYDSLAKGQPTASIRYVGGTTGKIYSQSVTGYDALNRPKGTKTVIAATDPLVTAGAPQTFTTSTAYNIDGTVQSTSLPAAAGLPAETVKNTYNSLGMLTGTDGMTDYVQHIGYSPYGEIEETRLGTSTEAKQLQVLNRYEDGTRRLANTHTLDQTNAGYTSDVDYVYDATGNVKSVTDKANGKDTQCFAYDGYRRLTEAWTPSSNDCATARSASALGGPAPYWTSWTYKPGGLRDSQTEHKTSGDTKTVYGYPAVNTSGTGQPHTLTSVTVGSGSAKTYTYDEHGNTTKRYSPTGTAQSLTWNIEGELTRLTEGTKTTDYLYDANGELLIRRSPDKTVLYLGGQELHYDTATEKFTAQRYYPAGDATAVRTETGLSWMVDDHHGTASMTVDATTQAVTRRYTKPFGEARGTAPSVWPDDKGFLGKPADTGTGLTHIGAREYDPTLGRFLSVDPVLAPDDHESLNGYAYANNTPVTLSDPTGLRPDGMCGGSSSSCGGGTETWTLNSKGGWDWSYTKTYTKKFTYRTGNGGTRTGTMTTTVRTEVGHKAVRIVFKKGPEPKPAKKDGQCSSCWAMGTNPGYSPGATDDWIDRPKLETWQKVVLGAISVVAAGVILAPAAIVVGEGCLAAAPVCAAEIAEAATGGASGGSAVVGAGVVATGAKAVTTGKSLSESQATLSVAQRLLATIGEEGKTAGVLELDGELIPLVSGKSSLPNYAASGHVEGQAALIMRDRGATSGRLLIDNPSGICGYCKSQVATLLPENATLQVGTPLGTVTPSSRWSASRTFTGNDRDPKPWPR（配列番号１１８）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＴＣＰ４２００４．１（ＴＤＤ９）
MAFGIGTSRRGSGGGRGWGRRLVTPVAALALLAPLGEAQDAVAQDAGAVRSGPVQPDVPKPRVSKVKEVKGLGAKKARDRVAAGKKAGAAQAARARREQTAVWPGPDTASIELADDRRAKAELGGASVSVVPENGRKTAASGTAQVTILDQKAADKAGVTGVLLSATADTAGTAEVSVDYSGFASAFGGDWAQRLHLVQLPACVLTTPEKAVCRRQTPLKTDNNASEQSVAAQVALAKAEPGAPSAQSVASAEGPSATVLAVTAAAAGSGASPKGTGDYAATELSPSSAWEAGGSSGAFTWNYGFTVPPAAAGPTPPLALSYDSGSIDGRTATTNNQGSAVGEGFSLTESYIERSYGSCDKDGHADVWDHCWKYDNASIVLNGKSNRLIKDDTSGKWRLETDDSTVTRSTGADNGDDNGEYWTVTTGDGTKYVFGENKLDGAADQRTNSTWTVPVFGDDSGEPGYDKGDTFAERAVTQAWRWNLDYVEDTSGNASTYWYAKDSNYYPKNKATTANASYTRGGYLKEIRYGLRKDALFTDDADAKVVFAHAERCTVGSCTTLTKDTAKNWPDVPFDAICSSGDSECNAAGPSFFSRKRLTGISTFSWNAASKAFDPVDTWELTQDYYDAGDIGDTTDHVLVLESIKRTAKAGATAIDVNPVTFTYQLRPNRVDGTDDILPLKRHRIETITSETGSITTVTLSQPECKRSTVLDAPQDSNTRPCYPQFWNINGATKASVDWFHKYRVLAVAVDDPTGHNESIEHAYDYAGAAWHYSDDPFTTKNERTWSEWRGYRDVTTYTGALDTTRSKSVSRYMLGMDGDKNTDGTTKSVSTAPLMDTDVDFAALTDSDPYSGQLLQQVTYSGSQPISTSYTNFTHKNTASQTVPDATDHTARWVRPNSSYASTYLTASKTWRTQVTTSRYDDLGMVTSHDDYGQKGLSGDEICTRTWYARNTEAGINSLVSRTRTVGKECSVDDTALDLPADNKRSGDVLSDTATAYDGATWSDSMKPTKGLVTWTGRAKGYASGTPSWQTLTSAAPADFDVLGRPLKVTNAEGQPTTTAYTPVTAGPVTKIISGNPKGFKTTSFLDPRTGQELRTYDANLKKTERVYDALGRLTQVWLPNRDRGSESATFGPSVKFEYTIDNNDPSWVSTAALKKDGKTYATSYAIYDAMLRPLQSQTETSNGGRLLTDTRYDTRGLPYETYANIFDTTSTPNGTYTRAEYGEAPNQNATVFDGAGRPTKSTLLVFGVEKWSTTTSYTGDSTATTALDGGTASRAITNIRGHTVESREYAGKSPADAQYGDGLGVGFASTRTLYTRGGLQKQITGPDDATWSYTYDLFGRQVEAEDPDKGTSSTEYDVLDRATKSTDSRSKSILTAYDELGRMVGTWAGSKTDTNQRTEYTYDKLLKGQPDKSIRYVGGKAGQAYTDTITEYDSLSRPVAASLELPADDPFAKVGALGSASRTLSFRHAYNLDDTVKTAEEPALGGLPSEIIDYGYNNVGQVTSVGGSTGYLLGATYSPLGQPWEQLLGTANTADHKKVSIRNTFEDGTGRLTRSNVKADSQPYMLQDLNYSFDQVGNVTSITDPTTLGGTSSAETQCFTYDSHRRLTEAWTPSQQKCSDPRSTSSLSGPAPYWTSYTYNTAGQRTTETTRKAAGDTTTTYCYTKTDQPHFLTGTTTKGDCATRERTYTPDTTGNTTKRPGASTTQDLAWSEEGKLTKLTENGKATDYLYDATGELLIRNTTSGERVLYTGTTELHLRTDGTTWAQRYYAAGDQTVAMRSNESGTNKLTYLAGDHHGTSSLAISADSTQTVSKRYMTPFGAERGKPTGTAWPDDKGFLSKTTDKTTGLTHIGAREYDPAIGQFISTDPILDPAQPQSLNGYSYANNTPVTAADPSGLWCDSCNDGKGWTRPDGGTRGDENGGKNPDGSVRGTPGFPSTRPTTVGYGNSPGAGKVITDLGSGTPALPPPDVYQDYQPKLPGVGQMGRNGTYMPELSYELNVELYFRERCSFSWTEECESIRAFYTHGEDSHGLPRYWTDVQDIPTVNTCPICENIGFDIILATLPIGKVGKLRFAPKVESAESMLRSLSQEGKTAGVLDINGELIPLVSGTSSLKNYAASGHVEGQAALIMRERGVASARLIIDNPSGICGYCRSQVPTLLPAGATLEVTTPRGTVPPTARWSNGKTFVGNENDPKPWPR（配列番号１１９）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１７１９０６８５４．１（ＴＤＤ１０）
MRGWVRAVSIPVIVGVLSTALSMPPSFADQEPVARTEATTDGLPTNADEGQRAEPPALIPSENRIPGVGLKSEIESQPTAASVADGPLPSERSDSFFPALAPTPPTIVGYVPTSLAPGCAEWGALRWTHPDSRPNGLVHLYTFELYRDSDDAMVWDQLFDYTLTGAGVVSDVAGDCESILPDPQATPIVELGESYYAKVYAWDGTGWSAPATSSAYPAVALPGLTDEAARGVCVCDTSTGRLYPLNILRADPVNTATGTLTESATDLTIPGVGPAISASRTYNSTDPTVGPLGKGWSFPYFSELESAASSVTYKAEDGQEVEYALQGGAYRLPPGASTRLRSVSGGYQLETKSHQVIGFDQNGRLEYARDSSGQGVSLAYATNGTLDKITDASGREVDVTMDASGKVTAIALSDGRSVSYGYTGDLLTSVTDVRGGVTEYEYDAAGRLAAITDPLGNEVMRSTYDAQGRVISQVDAGGGTWGFEYVDDGAYQTTRTTDPRGGVSRDVYYNNVLVESETAGGAITTYQYDERLRLAATVDPHGRTTRHTYDANDNLLSTTHPNGDREAFTYSSGGDLLTETSPEGRKTTYTYDANHRVATTTDPNGGVTSYTYNTDGQVLTETSPEGNVTEFEYDAQGNRVATISPEGRRTTATFDAYGRLESQTTARGHVAGADPADFTTTFAYDVASNLTSSTDPLGHVTEYEYDLNNRRTTVIDPLDRRTETEFDAAGRVVKIIEPGGAETVHEYDLAGNQVATTDAEGGRTTRTFDLDAHMITMTAARGNEPGAEPADFTWGYEYDGLGNVVEETDSAGGIVSYGYDERYRQTSVTNQANETTTTAYDGDGNTVSVTDPLDRTVSTTYNGLNLPATVTDPAGKVSTVIYDRDGNRTSTTTPLGHKATFTYDGDGMLVQDQTPNGNGRISTYTYDADGNQIRTVDPQGRFTTATFDNAGRVSSRSLWNVTTTYGYDDAGRLTTVTGGDGAVTEYGYNTAGDLVTVTDPNDHVTTHTYDDAHRRTATTDALNRTRTFGYDADGNQTSTVLARGPASGDLARWTVTQSYDELGRRTGVTTGSTASTASYAYDPVGRLTGVTDAGGTTTTVYDDAGQIASVTRGSQAYGYTYDPRGMVKTITQPGGVTVTNTFDDDGRLATTASTNAGTTAFSYDKNNNLTRIDNLAATGLVNRWQQRNYDRADALVSTTTGTGTTTDPTQTVTYSRDGAGRPFVIRRGAGGTQAPGEAHFFDAAGRLAQVCYDASSMFGQNCATADETLAYTYDGAGNRLTETRTGGTTPGTTTYTYDAANQLTQRGNTTYSYDADGNQISDGATSWTYDELNRLVGIDTPTADSQLTYDGLGNRTSVTTGATTRTFSWDINNPLPLLTSVTQGTSTTRYRYGPDAIPVNANINGTNHALLTEDLNSLTTTYNRTTGAKSWTTTYEPFGTPRNTTSTGLTTAQVGLGYTGEYLDPTTGLLNLRARNYNPTLGQFTSTDPVETPQGTPSISPYAYVDNRPTVLTDPSGACFFIDMPWIPGCSEPSWADEVTPATNGVLAGLISAAEDTFYLTGMALGVDWVGYDGDLAQQLFDEAAVEGNYHGETYQQAQLVGGLVALVGGAASTAASLARICTSLVRKIRPPVASGGLATEVPAYAGSRTAGTLVTPDGAEFPLISGWHPPAASMPQGTPGMNIVTKSHVEAHAAAIMRNQGLSEATLWINRAPCGGKPGCAAMLPRMVPSGSTLTINVVPNGSAGSIADTLIIRGIG（配列番号１２０）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１７４４２２２６７．１（ＴＤＤ１１）
MSDSENRLTRASDSPASGKTQSESKVNTACDSLLDTAGSTYDSLKQPFSSKGGALHHVSEAVNALASLQGAPSQLLNTGIAQIPLLDKMPGMPASVISAAHLGTPHAHSHPPSDGFPLPSMGATIGSGCLSVLIGGLPAARVQDIGIAPTCGGLTPYFNIETGSSNTFIGGMRAARMGIDMTRHCNPMGHAGKSGEEAEGAAEKGEQAASEAAEVSSRARWMGRAGKAWKVGNAAVGPASGVAGAASDAKHHEALAAAMMAAQTAADAAMMLLSNLMGKDPGIEPSMGMLMDGNPTVLIGGFPMPDSQMMWHGAKHGLGKKVKARRADRQKEAAPCRDGHPVDVVRGTAENEFVDYETRIAPGFKWERYYCSGWSEQDGELGFGFRHCFQHELRLLRTRAIYVDALNREYPILRNAAGRYEGVFAGYELEQRDGRRFVLRHGRLGDMTFERASEADRTARLVNHVRDGVESTLEYARNGALMRIDQEKGPGRRRQLIDFRYDDCGHIVELYLTDPQGETKRIVHYRYDTAGCLAASTNPLGAVMSHGYDGRRRMVRETDANGYSFSYRYDSQDRCIESMGQDGLWHVSLDYQPGRTVVTRADGGKWTFLYDEARTVTRIVDPYGGTTERVSGDNGRILREIDSGGRVMRWLYDERGGNTGRMDRWGNRWPTKDEAPVLPNPLAHTVPNTPLALQWGDARHEDLADTLLLPPEIAKIAASFFPPQPFSASTEQCDETGRVIARTDGYGQAERLRLDATGNLLQLCDRDGRDYCYSIASWNLRESETDPLGNTVRYRYSPKQEITAIVDANGNESTYTYDYKSRLTSVTRHGTVRETYAYDVGDRLIEKRDGTGNALLRFEVGEDGLQKTRILASGETHTYKYDHRGNFTRASTDKLDVTLTYDAYGRRTGDKRDGRGIDHSFVGGRLESTTYFGRFVVRYEAGQAGDVMIHTPGGGIHRLRRAADGTVLLRLGNRTNVLYGFDADGRCTGRLSWPEGRTAEIHCVQYRYSAVGELRCVIDSTGGTIEYQYDAAHRLVGESRDGWAVRRFEYDQGGNLLSTPTCQWMRYTEGNRLSSASCGAFRYNSRNHLAEQIEENNRRTTYHYNSMDLLVQVKWSDRQESWRSEYDGLCRRIAKAMGQARTQYFWDGDRLAAEAAPDGRLRIYVYVNEASYLPFMFIDYPSCDAEPESGSAYYVFCNQVGLPERIESAMGLDAWRAEEIEPYGSIRVATGNAIDYDLRWPGHWFDVETGLHYNRFRYFQPTLGRYLQSDPAGQSGGVNLYAYSANPLVFVDVLGLECPHNDKSTTECARCEAKEEVDQREKRDKELAREIYHIEDKYSDSHAGIGLDPDEKKRALEDKIDYDDLVRKREKAREDLLEAEKRLREEEIRAKYPTPEEAQLPPYDGDTTYALMYYTDEHGKSHVVELSSGGADDEHSNYAAAGHTEGQAAVIMRQRKITSAVVVHNNTDGTCPFCVAHLPTLLPSGAELRVVPPRSAKAKKPGWIDVSKTFEGNARKPLDNKNKKST（配列番号１２１）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０５９７２８１８４．１（ＴＤＤ１２）
MSEPANRLTRASEPSERHAAQSESKADTACESLLGTVKSTFDPFKQTFSSDGSALHHVSEAVNALASLQSAPSQLLNTGIAQIPLLDKMPGMPAATIGVPHLGTPHAHSHPPSSGFPLPSIGATIGSGCLSVLIGGIPAARVLDIGIAPTCGGLTPYFDIQTGSSNTFFGGMRAARMGIDMTRHCNPMGHVGKSGGKAAGAAEKTEEAASEAAQVTSRAKWMGRAGKAWKVGNAAVGPASGAAGAAADAAHGEELAAAMMAAQTAADAAMMLLGNLMGKDPGIEPSMGTLLAGNPTVLVGGFPLPDSQMMWHGVKHGIGKKVRARIANRRKEVSPCTDGHPVDVVRGTAENEFVDYETKIAPAFKWERYYCSGWSEQDGALGFGFRHCFQHELRLLRTRAIYVDALNREYPILRNAAGRYEGVFAGYELEQRDGRRFLLRHGRHGDMTFERENEADRTARFVSHVRDDVECTLEYARNGALARIAQEDARGLRRQLIDFRYDDRGHIVELCLTDPRGQTRRLAHYRYDAAGCLTVVTDPLGAVTSHGYDDRRRMVRETDANGYSFSYRYDSQGRCIETVGQDGLLHVVLDYQPGRTVVTRADGGKWTFLYDNARTVTRIVDPYGGMTERVIGGDGRILREIDSGGRVMRWLYDERGRNTGRMDRWGNCWPTRDEAPVLPNPLAHTVPVTPLDLQWGEVSPAELTDSVLLSPEIQKVAESLFQQPAFSPSEQHDARGQVVARTDEHGGVERFRRDAAGNIIQVCDKDGRAHHYGIASWSLRESETDSLGNTVRYRYSNKQEITSIVDANGNESAYTYDYKGRITSVMRHGVVRETYTYDAGDRLIEKRDGAGNLLLRFEVGENGLHSKRILASGETHTYEYDRRGNFTKASTDKFDVTRTYDAHGRRTGDKRDGRGIEHVYGDGRLCSTTYFERFTVRYEAEADGEVLIHAPVGGTHRLQRSSDGQILLRLGNGANVLCRFDAHGRCVGRLVWPEGRPKECHRVAYQYSAMGELRRVIANTTGTTEYLYDDAHRLIGESHDGWPVRRFEYDCGGNLLSAPTCQWMRYTEGNRLATASRGAFYYNDRNHLAEQIGENNHRTSYHYNSMDLLVKVTWSDWPEVWTAEYDGLCRRIAKAMGPARTEYYWDGDRLAAEIAPNGQLRIYVYVNETSYLPFMFIDYDGCDAAPESGRGYYVFSNQVGLPEWIEDIAGACVWRAMEIDPYGAIRVAPGNELGYNLRWPGHWLDPETGLHYNRFRSYHSALGRYLQSDPAGQSGGINLYAYTANPLVFVDVLGRECPHLNESSSECSQCENREEAERIRKEMLQSISRRMDIEGDVTGHPGILLTQAELTGKYSHYAEEYKQLLKDIDTKREAEEAALLREAYPSMEGATLPPFDGKTTIGLMFYTDASGQYQVKKLFSGEKVLSNYDATGHVEGKAALIMRNEKITEAVVMHNHPSGTCNYCDKQVETLLPKNATLRVIPPENAKAPTSYWNDQPTTYRGDGKDPKAPSKK（配列番号１２２）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１３３１８６１４７．１（ＴＤＤ１３）
MSTPPGNPASPANEPPPPPAPLISPTGNTSVDALASAVNAGAQPFQQLGNPKANTLDRVTNVVSGAVGSLGALDQLLNTGMAMIPGANLVPGMPAAFIGVPHLGVPHAHAHPPSDGVPMPSCGVTIGSGCLSVLYGGMPAARVLDIGLAPTCGGLAPIFEICTGSSNTFIGGARAARMALDLTRHCNPLGMSGAGHAEQDAEKASALKRAMHIAGMAAPVASGGLTAADQAVDGAGAAAVEMTAAQTAADAIAMAMSNLMGKDPGVEPGVGTLIDGDASVLIGGFPMPDALAMLMLGWGLRKKAHAPEGAGEPKRTEQGECKGGHPVDVVRGTAENQFTDYATLDAPEFKWERYYRSDWSERDGALGFGFRHSFQHELRLLRTRAIYVDGHGRAYAFGRSASGRYEDVFAGYELEQQGENRFVLLQATRGEFTFERASAAQASARLVRHVHEGVESALRYAGDGTLRHIEQTAQREQRHRMIDLLYDARGHVVEMRVTDPRGAVLCAARYRYDATGCLVASTDALGASMTYGYDAWRRMIRETDANGYAFSYRYDSDGRCVESAGQDGLWRVLLDYQPGRTVVTQADGGRWTYLYDAARTVTRIVDPYGGATERVIGDDGRIVEEVDSGGRVMRWLYDERGENTGRQDRWGNRWPTRDEAPVLPNPLAHVVPARPLELLWGDARPEDFTDRLLLPPEIEAVAAAAFAPSAAVPKPAEQRDGAGRVIRRTDESGHAECLHRDAAGNVVQLRDKDGRYYGYAIASWNLRESETDPLGNTVRYRYSSKQNITAVVDANGNESRYTYDYKSRLTRVARHDTIRESYVYDTGDRLIEKRDGAGNTLLRFEVGENGLHSKRILASGETHTYEYDRRGNFTRASTDKFEVTLTYDAFGRRTGDKRDGRGVEHSFVGQRLESTTWFGRFVVRYETGPSGDVMIHTPGGDVHRLQRAADGTVLLRLSNSTNVLYKFDENGRCAGRLTWPDGHTSANRCVQYRYSAVGELRQVIDSKGGTTEYQYDDAHRLVGESREGWAFRRFEYDRGGNLLSTPTCQWMRYTEGNRLSGAACGAFCYNSRNHLAEQIGENNRRTTWHYNSMDLLVRVQWSDRQENWSAEYDGLCRRIAKAMGQARTQYFWDGDRLAAEVAPNGQLRIYAYVNETSYLPFMFIDYDGCDAAPESGRTYYVFCNQVGLPEWIEDISRGCVWGVNEIDPYGAICVAPDNELEYNLRWPGHWFDPETDLHYNRFRSYSPVLGRYLQSDPAGQAGGINLYAHTANPLVFIDVLGRECPHGNESSSECSQCADREEAERINAKILQLISKKMSIEDAVTGHPGELIPLPHFEIDKEYSHYAKEYKQLLADIDALAEAREDALLREQFPSMDAVTLPPFDGKTTIGYMFYTDANGQYHVRKLYSGGKVLSNYDSSGHVEGMAALIMRKGRITEAVVMHNHPSGTCHYCNGQVETLLPKNAKLKVIPPANAKAPTKYWYDQPVDYLGNSNDPKPPS（配列番号１２３）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０８３９４１１４６．１（ＴＤＤ１４）
GSSGKNVRMPRDYASELPEYDGKTTHGVLVTNEGKVIQLRSGGKEEPYTGYKAVSASHVEGKAAIWIRENGSSGGTVYHNNTTGTCGYCNSQVKALLPEGVELKIVPPTNAVAKNAQARAVPTINVGNGTQPGRKQK（配列番号１２４）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０８２５０７１５４．１（ＴＤＤ１５）
MDAETGLVYFQARYYDPQLGRFITQDPYEGDWKTPLSLHHYLYAYANPTTYVDLNGYYARDANEVQRYIIAESNCAKTGSCDAVTALREPSEARQRSAANCKSLDRCREIADDAARSEGDISARIKALQKDLRNGIEANPTTGIKTIWELDKQLEARNISAGAVREAGRHVRWRAFVENRELTDHEKVAPAAEMYGVLSGGRIVIARAVARSSVTRASITQESKTIGVTAEVAPNESLRNTSGDLRASANSARNQPYGNGQSASASPSTNSAGSSGKNVRLPRDYASELPEYDGKTTYGVLVTNEGKVIQLRSGGKEVPYSGYKAVSASHVEGKAAIWIRENASSGGTVYHNNTTGTCGYCNSQVKALLPEGVELKIVPPANAVARNSQAKAIPTINVGNATQPGRKP（配列番号１２５）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０４４２３６０２１．１（ＴＤＤ１６）
MLASTWLDLVIGVDLHFELVPPVMAPVPFPHPFVGLVFDPWGLLGGLVISNVMSVATGGSLQGPVLINLMPATTTGTDAKNWMLLPHFIIPPGVMWAPMVRVPKPSIIPGKPIGLELPIPPPGDAVVITGSKTVHAMGANLCRLGDIALSCSDPIRLPTAAILTIPKGMPVLVGGPPALDLMAAAFALIKCKWVANRLHKLVNRIKNARLRNLLNRVVCFFTGHPVDVATGRVMTQATDFELPGPLPLQFERVYASSWADRASPVGRGWSHSLDQAVWLEPGKVVYRAEDGREIELDTFELPGRMLQPGQESFEPLNRLLFRCLDGHRWEVESAEGLVHEFAPVAGDADPAMARLTRKRSRQGHAITLHYDGKGCLTWVQDSGGRIVRFEHDEAGHLTQVSLPHPTQPGWLPHTRYIYSPEGDLVEVVDPLGHRTRYEYVGHLLVRETDRTGLSFYFGYDGTGPGAYCIRTWGDGGIYDHEIDYDKVNRVTFVTDSLGATTTYEMNVANAVVKVIDPRGGETRYEYNDVLWKTEEVEPAGGATRYEYDARGNCTKSTGPDGATVQVEYDARNVPIRAVNPCGEEWQWVYDAQGQLVERIDPLGETTRYEYDKGMVVTITEASGVTTAEYDDSRNLRRVQGPSEAETSYVYDALGRMVVKRSPARVAERLHYDACGRLVTVEQPDGNVWRLAYDGEGNLTEIQDHHQRVRMRYGGYHQMVSRQEAEDTTLFRYDSEGRLVAIENEAGEIYQYELDSCGRAGLERGFDGGCWKYERDAAGRVIKLRKPSGAEARLIYDAMGRLVEVRRSDSAVERFRYRKDGALIEAENSTIQVKFERDALGRVVREMQGGHWVESSYERGARTWVASSLGVHSAIMRDERRSVVAMTAGRGVDEWRVELSRDAFGLETERKLSSGIVSTWARDALGRPRHRGVAHSNNVLFGVEYQWAPGSRLVALIDTERGTTAFHFDERSRLVGAKLPGGRIDRREPDRIGNIYRAQDQRDRTYSDGGILRGAGETRYTHDLDGNLTQKVLPDGATWSYSYNAAGCLKEVERPDGTRVTFAYDALGRRVSKRWGENEVWWLWDRHVPLHEISTRAEPITWLFEPESFAPIAKIEGDRHYDILCDHLGAPTVVLDEAGVVTWRARLDIHAAVQPEIAETECPWRWPGQYEDQETGLYYNRFRYYDPEADRYISQDPLGPVGGLNLYSYAADPLTWSDPLGLQPDPPPPPTPMGNTLPGWDGGKTQGWFVYPDGTERHLISGYDGPSKFTQGIPGMNGNIKSHVEAHAAALMRQYELSKATLYINRVPCPGVRGCDALLARMLPEGVQLEIIGPNGFKKTYTGLPDPKLKPKGCS（配列番号１２６）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿１６５３７４６０１．１（ＴＤＤ１７）
MTACSDSPRLPPSLLELPDTPCPEPDEAASPFPAELPHSATVEAGAIAGSFGVTSTGEATYTIPLVVPPGRAGMQPELAVQYDSASGEGVLGMGFSVTGLSAVTRCPRNLAQDGEIRAVRYDEGDALCLDGKRLVEVGGGGEVVEYRTVPDTFARVVASYEGGWDRARGPKRLRVFTRAGRVLEYGGEPSGQVLAKGGVIRAWWATRVSDRSGNTIDFHYQNETSASEGYTVEHAPRRIEYTGHPRAAATRAIEFVYAPRRPGTGRVLYSRGMALRSSQQLDRIRMLGPGGALVREYRFSYTSGPATGRRLLNAVRECAADGRCKPATRFRWHHGTGPGFAEVGTRLRVPESERGSLMTMDATGDGRDDLVTTDLDLPVDDDNPITNFFVAPNRMAEGGSSSFGALALAHQEMHHAPPSPVQPELGTPIDYNDDGRMDIFLHDVHGRYPDWHVLLATPEGTFRRKSTGIRRKFGIDAPPPLDLNSRNASAHLADVDGDGIADLLQCEDTGSVFTDWTLHLWRPAASGFEPEPSRIPALRGHPCNAETHLADVDSDGKVDLLVYEATITGNGTLFGTTFEALSFVRPGEWTKRATGLPVLKAGSGGRVIVLDVNGDGLPDAVETGFDDGQLRTFINTGDGFAAGVSSLPSFVFDADAFAKLAAPIDHNSDGRQDLLMPIREPGGPVLWKILQATGSTGDGTFAVIDARLPVSEVLVDREITLAHPWAPRVTDVDGDGNQDVVLAVGKELRVFRSRLREEDLLWTVSDGMSAYDPEEAGHVPKVQIEYSHLSAAEPGVRGEQRTYLPRYDTGEPGDGACDYPVRCALGPRRVVSRYAVNNGADRLRTFQVAYRNGKYHRLGRGFLGFGVRIVRDAASGAGSAEFFDNVTFDPSDRSFPLAGHVVREWRWTPEPQQKGVSRVELSYTERLIHAILTNRGKSYFTLPVYQKQRREQGEHRRDSGKTLEEYVRDTWYAPTQVVSRTERLVSAWDAFGNIREESTSTAGVDLTLKVKRTFRNDEDAWLIGLLETQQECSRALSIEQCRTSSRAYDRHGRVRTESAGSDDDDPETVVRVRYTRDAFGNVIHTRAEDAFGGRRKACVSYDAEGVFPYAQRNPEGHVTYTRYDAGHGALEAVVDPNGLATQWAHDGLGRITEERRPDGTTTRATLSRTRDGGPRGDAWRVLRRTATDGGADETVELDGFGRPIRGWAYKARTDDGPAERVVQEIAFDQSGERVARRSLPAAEGTPRERMQVETYGHDATGRIAWHRAAWGAETRYRYLGRTVEVEGPGGRVTTIENDALGRPVRIVDPEGGVTSYAYGPFGGLWTVTDPGDAKTTTERDAYGRVRRHIDPDRGTAVAHYDGFGQQTSTVDALGREVSWKHDRLGRAVERSDEDGTTTWTWDEAEHGVGKLAEVASPEGHRTTYRYDALGRLREEELAIEGERFATTVDYDGHSRPFRLWYPQAEGERRFGVRRIFDAHGHLVGLRNERSREMFWRLEDTDEAGRIRIEEFGNGVTTERSYHETKGRLRRVATMKDHVVLQDLWYGYDDRLNLSSRRDDRLERTEHFRYDKLDRLTCAARHERFCLFETTYAPNGNIREKPDVGEYTYDPEHPHAVRTAGADVFAYDAVGNQVRRPGVEEIRYTAFDLPASITLAGGTGTVDLDYDGDQRRIRKTTPMEQTVYAGDLYERVTDLATGVVEHRYTVRSSERAVAVVTKRAGGEARTLYIHVDHLGSVDLLTEGRGEDAGREVERRSYDAFGARRDPVTWRRAPKAEAPPALLARGFTGHGSDDELGLVHMKGRLYDPKIGRFTTPDPVVSRPLFGQSWNAYSYVLNNPLAYVDPSGFQEAVPEDRGGSSRAAGAEFTSDELGLPPIEELVVARFPEHEARSDADANAMGAEVGGAVPPVDVGVYGTSAGFVPQPGPSSPEHASAASVVGEGLLGAGEGTGELALRVARSLVLSALTFGGYGTYELGRAMWDGYKENGVVGALNAVNPLYQIGRGAADTALAIDRDDYRAAGAAGVKTVIIGAATVFGAGRGLGALEEATTAAGIARGAPSLPVYTGGKTTGVLRTATGDMPLVSGYKGPSASMPRGTPGMNGRIKSHVEAHAAAVMRERGIKDATLHINQVPCSSATGCGAMLPRMLPEGAQLRVLGPDGYDQVFIGLPD（配列番号１２７）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＬＩ５９００４．１（ＴＤＤ１８）
MVIIGRIDTNESTVSLYQWSLLPATDTNCYKEITVEQYKNNQLVRKVSFSKAFVVNYTESYSNHVGVGTFTLYVRQFCGKDIEVTSQELNSVSNLTPNLPNSVEKDVEVVEIAEKQAVVKSDTSNLKQSNMSITDRLAKQKEKQDNTNIIDNRPKLPDYDGKTTHGILVTPNSEHIPFSSGNPNPNYKNYIPASHVEGKSAIYMRENGITSGTIYYNNTDGTCPYCDKMLSTLLEEGSVLEVIPPINAKAPKPSWVDKPKTYIGNNKVPKPNK（配列番号１２８）
ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＡＢ８１４０６４８．１（ＴＤＤ１９）
MLYAYGPESVVAERTIVGTTVADAGKAAFRVLDDTLAEGVEHSANKADEAGELIEAVVEQCLRNSFSADTLVTTASGLRPISTIAVGELVLAWDATTRSTGYYPVTAVMLHTDAAQVHLSVGGEHVETTPEHPFYTLERGWVAAGDLWDGAHVRRADGSYALTLVLWLDAEPQVMYNLTVATAHTFFVGVERALVHNAGCPGDALPPYGTKGSKTTGILDTGNESILLESGENGPGMMVPRDTPGMSGAMPNRAHVEGHTAAIMRNENIRLADLYINRMPCSGAYGCMVNLPHMLPEGSILRIHVRAKLSDPWTTLPPFVGISDTLWPPSGLNPKIVLP（配列番号１２９）
いくつかの実施形態では、前記配列は、存在する場合、シグナル配列を含まない。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼはＴＤＤの毒性ドメインを含むことができる。ＴＤＤ１～ＴＤＤ１９についての毒性ドメインの例は、以下の通りである：例えば、表９に示すような、ＴＤＤ１（配列番号９２）、ＴＤＤ２（配列番号９５または１３４）、ＴＤＤ３（配列番号９８）、ＴＤＤ４（配列番号１０１または１４３）、ＴＤＤ５（配列番号１０４）、ＴＤＤ６（配列番号１０７または１５２）、ＴＤＤ７（配列番号１５７）、ＴＤＤ８（配列番号１６２）、ＴＤＤ９（配列番号１６７）、ＴＤＤ１０（配列番号１７２）、ＴＤＤ１１（配列番号１７７）、ＴＤＤ１２（配列番号１８４）、ＴＤＤ１３（配列番号１８９）、ＴＤＤ１４（配列番号１９４）、ＴＤＤ１５（配列番号１９９）、ＴＤＤ１６（配列番号２０４）、ＴＤＤ１７（配列番号２０９）、ＴＤＤ１８（配列番号２１４）、およびＴＤＤ１９（配列番号２１９）。ＴＤＤ１～ＴＤＤ１９の毒性ドメインは、例えば、表９に示すようなハーフドメインに分割され得る。いくつかの実施形態では、ＴＤＤ１～ＴＤＤ１９の毒性ドメインは、表９に示される残基でハーフドメインに分割される。ある特定の実施形態では、ＴＤＤハーフドメインの対は、配列番号９３および９４、配列番号９６および９７、配列番号９９および１００、配列番号１０２および１０３、配列番号１０５および１０６、配列番号１０８および１０９、配列番号１３０および１３１、配列番号１３２および１３３、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４４および１４５、配列番号１４６および１４７、配列番号１４８および１４９、配列番号１５０および１５１、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５８および１５９、配列番号１６０および１６１、配列番号１６３および１６４、配列番号１６５および１６６、配列番号１６８および１６９、配列番号１７０および１７１、配列番号１７３および１７４、配列番号１７５および１７６、配列番号１７８および１７９、配列番号１８０および１８１、配列番号１８２および１８３、配列番号１８５および１８６、配列番号１８７および１８８、配列番号１９０および１９１、配列番号１９２および１９３、配列番号１９５および１９６、配列番号１９７および１９８、配列番号２００および２０１、配列番号２０２および２０３、配列番号２０５および２０６、配列番号２０７および２０８、配列番号２１０および２１１、配列番号２１２および２１３、配列番号２１５および２１６、配列番号２１７および２１８、配列番号２２０および２２１、または配列番号２２２および２２３のアミノ酸配列を含むことができる。
本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、用語「ＴＤＤ」はＴＤＤ毒性ドメインを指す。
本開示がシチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のＴＤＤ）に言及する場合、他のシチジンデアミナーゼを本明細書に記載の融合タンパク質および細胞編集システムで使用することができることが企図される。シチジンデアミナーゼは、野生型または進化したドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、例えば、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）ドメインまたは活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）であり得る。
本開示は、他の可能性のあるシチジンデアミナーゼも提供する。そのようなシチジンデアミナーゼは、例えば、本明細書に記載の融合タンパク質および細胞編集システムで使用することができる。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは本明細書に記載のＴＤＤの機能類似体である。ＴＤＤの機能類似体は、前記ＴＤＤ（すなわち、シチジンデアミナーゼの機能）と同じまたは実質的に同じ生物学的機能を有する分子である。例えば、機能類似体は、例えば、さらなるアミノ酸残基ありもしくはなしでＴＤＤの一部を含む、および／またはＴＤＤに対して突然変異を含む、ＴＤＤのアイソフォームまたは変異体であり得る［例えば、ＴＤＤに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する変異体（例えば、配列番号７２、８６～９１および１１７～１２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＴＤＤ）またはその毒性ドメイン（例えば、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む毒性ドメイン）］。ある特定の実施形態では、機能類似体は本明細書に記載のＴＤＤのオルソログである。ある特定の実施形態では、ＴＤＤのオルソログは、前記ＴＤＤのアミノ酸配列に少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含むことができる（例えば、配列番号７２、８６～９１および１１７～１２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＴＤＤ）。ある特定の実施形態では、ＴＤＤのオルソログは、本明細書に記載のＴＤＤの毒性ドメインのアミノ酸配列に少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する毒性ドメイン（例えば配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む毒性ドメイン）を含むことができる。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の文脈での用語「同一パーセント」は、最大一致のために整列させた場合に同じである２つの配列中の残基のパーセントを指す。２つの配列の同一性パーセントは、例えば、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ（登録商標）（米国国立医学図書館の国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで利用可能）によって得ることができる。いくつかの実施形態では、比較目的で整列させる参照配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％（例えば、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０または９０％または１００％）である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のシチジンデアミナーゼは、ＡＣ配列、ＴＣ配列、ＧＣ配列、ＣＣ配列、ＡＡＣ配列、ＴＡＣ配列、ＧＡＣ配列、ＣＡＣ配列、ＡＴＣ配列、ＴＴＣ配列、ＧＴＣ配列、ＣＴＣ配列、ＡＧＣ配列、ＴＧＣ配列、ＧＧＣ配列、ＣＧＣ配列、ＡＣＣ配列、ＴＣＣ配列、ＧＣＣ配列、ＣＣＣ配列またはこれらの任意の組み合わせにおけるシチジンを標的にすることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のシチジンデアミナーゼは、ＤｄｄＡと比較して、効率および／または活性が増大している。いくつかの実施形態では、効率または活性の増大は、例えば、上記の標的配列のいずれか１つまたは組み合わせにおいてであり得る。
Ａ：Ｔ塩基対からＧ：Ｃ塩基対への変換のために本明細書に記載の融合タンパク質および細胞編集システムでアデニンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ）を使用することができることも企図される。ある特定の実施形態では、ＴＤＤは、酵素をアデニンデアミナーゼとして作用させるように、および／または塩基編集ウィンドウ内のＴＣ配列バイアス低減させるように、ヌクレオチドポケットを形成する残基（例えば、ＤｄｄＡに関して上に記載した残基または残基の組み合わせ）で突然変異している可能性がある。
Ｂ．ジンクフィンガータンパク質ドメイン
本明細書に記載の融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、ＺＦＰ－ＴＤＤ）、ＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ阻害剤（例えば、ＺＦＰ－ＴＤＤＩ）、またはＺＦＰ－ニッカーゼ融合タンパク質）は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインを含む。「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、亜鉛によって安定化するＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を指す。ＺＦＰは配列特異的様式でＤＮＡに結合する。個々のＤＮＡ結合ドメインは、「フィンガー」と称される。ＺＦＰは少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは、２～４塩基対のヌクレオチド、典型的には３または４塩基対のＤＮＡ（連続的または非連続的）に結合する。各ジンクフィンガーは、典型的には、およそ３０個のアミノ酸を含み、亜鉛をキレート化する。操作されたＺＦＰは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有することができる。操作方法としては、限定されないが、合理的設計および様々なタイプの選択が挙げられる。合理的設計としては、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列（各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列と結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関係がある）を含むデータベースの使用が挙げられる。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，１４０，０８１号；第６，２００，７５９号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，９７９，５３９号；および第８，５８６，５２６号；ならびに国際特許公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０１６５３６；ＷＯ０２／０９９０８４；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されているＺＦＰの設計方法を参照されたい。
本ＺＦＰ融合タンパク質のＺＦＰドメインは、少なくとも３個（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３個またはそれ以上）のジンクフィンガーを含むことができる。個々のジンクフィンガーは、これらが１つまたは複数の塩基をスキップすることができる操作されたリンカーで接続されていない限り、典型的には、ＤＮＡに結合する場合３塩基対の間隔で配置される［例えば、Paschon et al., Nat Commun. (2019) 10:1133、ならびに米国特許第８，７７２，４５３号；第９，１６３，２４５号；第９，３９４，５３１号；および第９，９８２，２４５号を参照されたい］。３個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的には、９または１２個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。４個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的には、１２～１５個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。５個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、典型的には、１５～１８個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。６個のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、１８～２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。
ＺＦＰドメインの標的特異性は、例えば、米国特許公開第２０１８／００８７０７２号に記載されているように、ＺＦＰ骨格に対する突然変異によって向上させることができる。突然変異としては、ＤＮＡ骨格のリン酸と非特異的に相互作用することができるが、ヌクレオチド標的特異性に関与しないＺＦＰ骨格中の残基に対して行われるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、これらの突然変異は、陽イオン性アミノ酸残基を中性または陰イオンアミノ酸残基に突然変異させることを含む。いくつかの実施形態では、これらの突然変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に突然変異させることを含む。さらなる実施形態では、突然変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して位置（－４）、（－５）、（－９）および／または（－１４）で行われる。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーは、位置（－４）、（－５）、（－９）および／または（－１４）に１つまたは複数の突然変異を含むことができる。さらなる実施形態では、マルチフィンガーＺＦＰドメイン中の１つまたは複数のジンクフィンガーは、位置（－４）、（－５）、（－９）および／または（－１４）に突然変異を含むことができる。いくつかの実施形態では、位置（－４）、（－５）、（－９）および／または（－１４）のアミノ酸［例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）］は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）に突然変異している。いくつかの実施形態では、位置（－４）のＲ残基はＱへ突然変異している。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインはヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。米国特許５，４２０，０３２号および第６，８３３，２５２号；Belfort et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3379-88; Dujon et al., Gene (1989) 82:115-8; Perler et al., Nucleic Acids Res. (1994) 22:1125-7; Jasin, Trends Genet. (1996) 12:224-8; Gimble et al., J Mol Biol. (1996) 263:163-80; Argast et al., J Mol Biol. (1998) 280:345-53；およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalier et al., Mol Cell (2002) 10:895-905; Epinat et al., Nucleic Acids Res. (2003) 31:2952-62; Ashworth et al., Nature (2006) 441:656-59; Paques et al., Current Gene Therapy (2007) 7:49-66；および米国特許公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本ＺＦＰ融合タンパク質は、１つまたは複数のジンクフィンガードメインを含む。ドメインは、例えば、１つのドメインが１つまたは複数（例えば、３、４、５または６個）のジンクフィンガーを含み、別のドメインがさらなる１つまたは複数（例えば、３、４、５または６個）のジンクフィンガーを含むように、伸長可能な可動性リンカーを介して互いに連結することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、フィンガーアレイが８、９、１０、１１または１２個またはそれ以上のフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むような、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態では、リンカーは可動性リンカーなどの非定型リンカーである。例えば、２つのＺＦＰドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＺＦＰ－ＺＦＰ－ドメイン、ドメイン－ＺＦＰ－ＺＦＰ、ＺＦＰ－ドメイン－ＺＦＰ、またはＺＦＰ－ドメイン－ＺＦＰ－ドメイン（２つのＺＦＰ－ドメイン融合タンパク質がリンカーを介して一緒に縮合している）の配置で、シチジンデアミナーゼ、阻害剤またはニッカーゼドメイン（「ドメイン」）、例えば本明細書に記載のものに連結することができる。
いくつかの実施形態では、ＺＦＰ融合タンパク質は「２ハンドル（ｔｗｏ－ｈａｎｄｅｄ）」であり、すなわち、これらは、２つのＺＦＰドメインが２つの非連続的な標的部位に結合するように、介在性アミノ酸によって分離した２つのジンクフィンガークラスター（２つのＺＦＰドメイン）を含む。２ハンドル型のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、４個のジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、３個のフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置する、ＳＩＰ１である［Remacle et al., EMBO J. (1999) 18(18):5073-84を参照されたい］。これらのタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、ユニークな標的配列に結合することができ、２つの標的配列の間の間隔は多くのヌクレオチドを含むことができる。
本明細書に記載のＺＦＰ融合タンパク質のＤＮＡ結合ＺＦＰドメインは、該タンパク質をＤＮＡ標的領域に向ける。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的領域は少なくとも８ｂｐの長さである。例えば、標的領域は、８ｂｐ～４０ｂｐの長さ、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６ｂｐｓの長さであってもよい。
ある特定の実施形態では、ＺＦＰは、標的塩基のいずれかの側の１～１００個（またはそれらの間の任意の数）のヌクレオチドである標的部位に結合する。他の実施形態では、ＺＦＰは、標的塩基のいずれかの側の１～５０個（またはそれらの間の任意の数）のヌクレオチドである標的部位に結合する。
Ｃ．塩基エディター阻害剤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムは、本システムの塩基編集活性を時間的および空間的により良く調節するために、エディターの阻害剤を含むことができる。例えば、シチジンデアミナーゼが本明細書に記載のＴＤＤである場合、阻害剤は前記ＴＤＤを阻害するＴＤＤＩであってもよい。エディターがシチジンデアミナーゼＤｄｄＡである場合、阻害剤は、例えばＤｄｄＩであってもよい。いくつかの実施形態では、ＤｄｄＩは以下に示すアミノ酸配列を有する。
MYADDFDGEI EIDEVDSLVE FLSRRPAFDA NNFVLTFEES GFPQLNIFAK NDIAVVYYMD IGENFVSKGN SASGGTEKFY ENKLGGEVDL SKDCVVSKEQ MIEAAKQFFA TKQRPEQLTW SEL（配列番号７３）
したがって、いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、ＺＦＰ－ＴＤＤ融合タンパク質に加えてＴＤＤＩ成分を含む。ＴＤＤＩ成分は、それに共有結合的に融合しているＤＮＡ結合ドメインを介して、またはそれに共有結合していないＤＮＡ結合ドメインとの二量体化を介して、ＴＤＤ複合体に近接され得る。
いくつかの実施形態では、本塩基編集システムは、ＺＦＰドメインおよび阻害剤ドメインを含むＺＦＰ－阻害剤融合タンパク質を含み、ＺＦＰドメインはＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ融合タンパク質の結合部位に近い（例えば、５０～１００ｎｔ以内）ＤＮＡ標的領域中の配列に結合する。このＺＦＰ－阻害剤融合タンパク質が細胞に導入される場合、阻害剤ドメインはシチジンデアミナーゼ複合体に近接し、該複合体に結合し、それによって、その座位剤でシチジンデアミナーゼの塩基編集活性を阻害する。ＺＦＰ－阻害剤のＺＦＰドメインが結合する配列の存在が、阻害剤の阻害活性を決定する。
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ複合体への阻害剤ドメインの結合は、薬剤（例えば、小分子またはペプチド）によって調節することができる。例えば、阻害剤ドメインは二量体化ドメインに融合していてもよく、その二量体化パートナーは、ＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ融合タンパク質の結合部位に近い（例えば、５０～１００ｎｔ以内）ＤＮＡ標的領域中の配列に結合するＺＦＰドメインに融合していてもよい。阻害剤およびＺＦＰの二量体化ドメインは、二量体化誘導剤（例えば、小分子またはペプチド）の存在下で二量体化することができる。薬剤の存在下で、阻害剤ドメインは、二量体化を介してＤＮＡ標的領域に近接し、シチジンデアミナーゼ複合体の結合および不活性化もたらす。一旦薬剤が取り除かれると、阻害剤ドメインはもはやＤＮＡ標的領域の近くに隔離されず、シチジンデアミナーゼ複合体から引き離され、塩基編集プロセスを進行させる。そのような薬剤および二量体化ドメインの例を以下の表１に示す：
逆に、ＺＦＰに融合しているドメインと阻害剤ドメインの二量体化は、二量体化阻害剤（例えば、小分子またはペプチド）によって、促進されるのではなく、阻害され得、その結果、薬剤の存在によって、シチジンデアミナーゼ複合体の活性が可能になる。薬剤が取り除かれれば、阻害剤ドメインがシチジンデアミナーゼ複合体に結合することができ、塩基編集プロセスを阻害する。
Ｄ．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤
本明細書で使用する場合、用語「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」または「ＵＧＩ」は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。Ｇ：Ｕミスマッチの検出の際に、細胞は、ウラシルＮ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）によるミスマッチのウラシルの除去によって開始される塩基除去修復を介して応答する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムは、編集されたＧ：Ｕ中間をＵＮＧによる除去から保護するために、１種または複数のＵＧＩをさらに含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、ＺＦＰ－ＴＤＤ）融合タンパク質は、例えば、本明細書に記載のリンカーによって結合した、１つまたは複数のＵＧＩドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーはＳＧＧＳリンカー（配列番号２４５）である。ＵＧＩドメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端またはこれらの任意の組み合わせに位置することができる（例えば、Ｃ末端に１つのＵＧＩドメイン、Ｎ末端に１つのＵＧＩドメイン、Ｃ末端に２つのＵＧＩドメイン、Ｎ末端に２つのＵＧＩドメイン、またはこれらの任意の組み合わせ）。さらに、または代わりに、１つまたは複数のＵＧＩドメインは別々のＺＦＰ融合タンパク質（「ＺＦＰ－ＵＧＩ」）にあってもよい。特定の実施形態では、ＵＧＩドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
Ｅ．ニッカーゼ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムは、編集されるＤＮＡ標的領域の近く（例えば、編集される塩基から１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｎｔ以内）に一本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすために、ニッカーゼをさらに含む。ニックが作出されることにより、ＤＮＡ修復機構が誘引され、その結果、ニックの下流の領域が切除され、置き換えられ、完全に編集された二本鎖ＤＮＡ標的領域がもたらされる。ニックは、例えば、同じ鎖または逆鎖の編集される塩基の５’または３’であってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムは、ニッカーゼ機能を含むために、三量体構造を有する。例えば、二量体ニッカーゼの一方のドメインはＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、ＺＦＰ－本明細書に記載のＴＤＤ）に融合していてもよく、他方のドメインは、独立したＺＦＰに融合していてもよく、その結果、両方のＺＦＰドメインのそれらのＤＮＡ標的領域への結合が、一本鎖切断を生じさせることができる活性なニッカーゼをもたらす。例えば、図９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムは、ニッカーゼ機能を含むために、四量体構造を有する。２つのＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のＺＦＰ－ＴＤＤ）融合タンパク質に加えて、そのようなシステムは２つのＺＦＰ－ニッカーゼタンパク質も含み、二量体ニッカーゼの一方のドメインは第１のＺＦＰドメインに融合しており、他方のドメインは第２のＺＦＰドメインに融合しており、その結果、両方のＺＦＰドメインのそれらのＤＮＡ標的領域への結合が、一本鎖切断を生じさせることができる活性なニッカーゼをもたらす。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、例えば、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼでもよい。ある特定の実施形態では、ニッカーゼは、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、ＦｏｋＩニッカーゼは、親ＦｏｋＩニッカーゼと比較して、１つまたは複数の突然変異、例えば、切断ドメインの電荷を変更するための突然変異；分子モデリングに基づいてＤＮＡ骨格に近いと予想され、かつＦｏｋＩ相同体の変動を示す残基に対する突然変異；および／または他の残基での突然変異を含む［例えば、米国特許第８，６２３，６１８号およびGuo et al., J Mol Biol. (2010) 400(1):96-107を参照されたい］。
本明細書に記載のＺＦＰ融合タンパク質では、ニッカーゼドメインは、融合分子のＮ末端側またはＣ末端側（ＺＦＰドメインに対してＮ末端および／またはＣ末端）を含めて、ＤＮＡ結合ＺＦＰドメインのいずれかの側に位置することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のＺＦＰ－ＴＤＤ）融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にシチジンデアミナーゼドメインを含み、ニッカーゼドメインを反対の末端に含む。
Ｆ．ペプチドリンカー
本明細書に記載の融合タンパク質では、ＺＦＰ、シチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のＴＤＤ）、阻害剤（例えば、ＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ）、ニッカーゼおよび／またはＵＧＩドメインは、互いに対して任意の順序で位置することができる。いくつかの実施形態では、ドメインは、直接的ペプチジル結合、ペプチドリンカーまたはこれらの任意の組み合わせによって、互いに結合することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のドメインが、二量体化（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質のＮ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を介する）によって、互いに結合することができる。
いくつかの実施形態では、ＺＦＰドメイン内のＺＦＰ、シチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のＴＤＤ）、阻害剤（例えば、ＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ）、ＵＧＩおよび／またはニッカーゼドメインおよび／またはジンクフィンガーは、約５～２００アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６またはそれ以上のアミノ酸）のペプチドリンカー、例えば、切断不可能なペプチドリンカーを介して連結することができる。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される可動性のアミノ酸部分配列である。例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；第７，１５３，９４９号；第８，７７２，４５３号；および第９，１６３，２４５号；ならびにＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１１／１３９３４９を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、適切なリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは３～３０アミノ酸残の長さであり、Ｇおよび／またはＳに富む。そのようなリンカーの非限定例は、ＳＧＧＳリンカー（配列番号２４５）、およびＧ４Ｓ型リンカー、すなわち、１つもしくは複数（例えば、２つ、３つもしくは４つ）のＧＧＧＧＳ（配列番号７１）モチーフまたは該モチーフの変形（例えば、該モチーフからの１つ、２つもしくは３つのアミノ酸挿入、欠失および置換を有するもの）を含むリンカーである。
特定の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質で使用されるペプチドリンカーは、Ｌ０（ＬＲＧＳＱＬＶＫＳ；配列番号１５）Ｌ７Ａ（LRGSQLVKSKSEAAAR；配列番号１６）、Ｌ２６（LRGSQLVKSKSEAAARGGGGSGGGGS；配列番号１７）、Ｌ２１（LRGSQLVKSKSEAAARGGGGS；配列番号１１０）、Ｌ１８（LRGSQLVKSKSEAAARGS；配列番号１１１）、Ｌ１３（LRGSQLVKSKSGS；配列番号１１２）、Ｌ１１（LRGSQLVKSGS；配列番号１１３）、Ｌ９（LRGSQLVGS；配列番号１１４）、Ｌ６（LRGSGS；配列番号１１５）、またはＬ４（LRGS；配列番号１１６）でもよい。
ＩＩ．塩基エディターシステム
本開示は、本明細書に記載のＺＦＰ融合タンパク質を含む塩基エディターシステムを提供する。塩基エディターシステムは、ＤＮＡ標的領域中のシトシン塩基をウラシル塩基に編集するために使用することができ、この場合、ＤＮＡの複製または修復の間にウラシルがチミン塩基に置き換えられる。ある特定の実施形態では、編集は、標的にされるＣ：Ｇ塩基対のＴ：Ａ塩基対への変更をもたらす。図１は、本開示の塩基編集システムを図示する。
本明細書に記載の塩基エディターシステムは、遺伝子をノックアウトする（例えば、通常のコドンを終止コドンに変えることによる、ならびに／もしくはスプライス受容部位を突然変異させて、エクソンスキッピングおよび／もしくはフレームシフト突然変異を導入することによる）；遺伝子の制御エレメント（例えば、プロモーターもしくはエンハンサー領域）に突然変異を導入して、発現を増加もしくは低減させる；病因性突然）変異（例えば、点突然変異）を修正する；ならびに／または治療的利益をもたらす突然変異を誘導するために使用することができる。標的ＤＮＡは、細胞中の染色体中、または染色体外の配列（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ）中にあり得る。塩基編集は、インビトロ、エキソビボまたはインビボで実施することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムは、１つまたは複数のコドン変換、例えば、ＣＡＡからＴＡＡ；ＣＡＧからＴＡＧ；ＣＧＡからＴＧＡ；またはＴＧＧからＴＡＧ、ＴＧＡもしくはＴＡＡ；またはこれらの任意の組み合わせを実施し、それによって、終止コドンを導入する。
本開示の塩基エディターシステムは、ＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のＺＦＰ－ＴＤＤ）融合タンパク質に加えて、システムの編集活性を調節するかまたは向上させるのに役立ち得る、本明細書に記載されるような阻害剤ドメイン（例えば、ＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ）、ＵＧＩおよびニッカーゼまたはこれらの任意の組み合わせなどの成分を含むことができる。ある特定の実施形態では、単一のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）内にシステムをパッケージングすることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の塩基エディターシステムは、それぞれ、それ自体でシチジンデアミナーゼ活性を欠くシチジンデアミナーゼハーフドメインを含む、１対のＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のＺＦＰ－ＴＤＤ）融合タンパク質を含み、それらのそれぞれのヌクレオチド標的へのＺＦＰの結合が、標的Ｃ塩基をＴに編集する（例えば、ＣをＤＮＡの複製または修復の間にＴに置き換えられるＵと置き換えることによる）ことができる活性なシチジンデアミナーゼ分子をもたらす。
例えば、いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムはａ）ｉ）編集の標的にされる塩基の一方の側の二本鎖ＤＮＡ標的領域のヌクレオチドに結合する第１のＺＦＰドメイン；およびｉｉ）ＴＤＤ Ｎ－ハーフドメインを含む第１の融合タンパク質（ＺＦＰ－ＴＤＤ左）；ならびにｂ）ｉ）編集の標的にされる塩基の他方の側の二本鎖ＤＮＡ標的領域のヌクレオチドに結合する第２のＺＦＰドメイン；およびｉｉ）ＴＤＤ Ｃ－ハーフドメインを含む第２の融合タンパク質（ＺＦＰ－ＴＤＤ右）を含むことができ、ＺＦＰ－ＴＤＤ左およびＺＦＰ－ＴＤＤ右のそれらのそれぞれのヌクレオチドへの結合が、Ｃ塩基をＴに変えることによってＤＮＡ標的領域を編集することができる活性なＴＤＤ分子をもたらす。ＺＦＰ－ＴＤＤおよび／またはＤＮＡ標的領域は、例えば、本明細書に記載の通りであり得る。
いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、ａ）ｉ）第１のＤＮＡ標的領域内のヌクレオチドに結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン；およびｉｉ）ＴＤＤＩドメインを含む、第１のＤＮＡ標的領域内のヌクレオチドに結合する第１の融合タンパク質（ＺＦＰ－ＴＤＤＩ）；ｂ）ｉ）編集の標的にされる塩基の一方の側の第２のＤＮＡ標的領域のヌクレオチドに結合するＺＦＰドメイン；およびｉｉ）ＴＤＤ Ｎ－ハーフドメインを含む、第２の融合タンパク質（ＺＦＰ－ＴＤＤ左）；ならびにｃ）ｉ）編集の標的にされる塩基の他方の側の第２のＤＮＡ標的領域のヌクレオチドに結合するＺＦＰドメイン；およびｉｉ）ＴＤＤ Ｃ－ハーフドメインを含む第３の融合タンパク質（ＺＦＰ－ＴＤＤ右）を含むことができ、ＺＦＰ－ＴＤＤ左およびＺＦＰ－ＴＤＤ右のそれらのそれぞれのヌクレオチド結合が、Ｃ塩基をＴに変えることによって第２のＤＮＡ標的領域を編集することができる活性なＴＤＤ分子をもたらし、かつ第１のＤＮＡ標的領域へのＺＦＰ－ＴＤＤＩの結合が、ＴＤＤによる第２のＤＮＡ標的領域の編集を防止する。ＺＦＰ－ＴＤＤ、ＺＦＰ－ＴＤＤＩおよびＤＮＡ標的領域は、例えば、本明細書に記載の通りであり得る。
いくつかの実施形態では、塩基エディターシステムは、ａ）ｉ）第１のＤＮＡ標的領域内のヌクレオチドに結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）二量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質；ｂ）ｉ）ＴＤＤＩドメイン；およびｉｉ）ａ）の二量体化ドメインとパートナーになる二量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質；ｃ）ｉ）編集の標的にされる塩基の一方の側の第２のＤＮＡ標的領域のヌクレオチドに結合するＺＦＰドメイン、およびｉｉ）ＴＤＤ Ｎ－ハーフドメインを含む第３の融合タンパク質（ＺＦＰ－ＴＤＤ左）；ならびにｄ）ｉ）編集の標的にされる塩基の他方の側の第２のＤＮＡ標的領域のヌクレオチドに結合するＺＦＰドメイン、およびｉｉ）ＴＤＤ Ｃ－ハーフドメインを含む第４の融合タンパク質（ＺＦＰ－ＴＤＤ右）を含むことができ、ＺＦＰ－ＴＤＤ左およびＺＦＰ－ＴＤＤ右のそれらのそれぞれのヌクレオチドへの結合が、Ｃ塩基をＴに変えることによって第２のＤＮＡ標的領域を編集することができる活性なＴＤＤ分子をもたらし、ＺＦＰ－ＴＤＤＩを形成するためのａ）とｂ）の融合タンパク質の二量体化、および第１のＤＮＡ標的領域へのａ）のＺＦＰの結合が、ＴＤＤによる第２のＤＮＡ標的領域の編集を防止する。ＺＦＰ－ＴＤＤ、ＺＦＰ－ＴＤＤＩ、および／またはＤＮＡ標的領域は、例えば、本明細書に記載の通りであり得る。
いくつかの実施形態では、二量体化誘導剤の存在下で、ａ）とｂ）の融合タンパク質の二量体化ドメインがパートナーになってＺＦＰ－ＴＤＤＩを形成し、ＴＤＤ活性を阻害する。
いくつかの実施形態では、ａ）とｂ）の融合タンパク質の二量体化ドメインは、二量体阻害薬剤の存在下で、パートナーになってＺＦＰ－ＴＤＤＩを形成することを阻害され、これにより、ＴＤＤ活性が可能になる。
いくつかの実施形態では、ＺＦＰ－ＴＤＤＩは、ＴＤＤ塩基編集活性から保護される配列に対して特異的である。例えば、ＺＦＰドメインは、その非編集形態で保存されるアレル（例えば、突然変異したアレルなどの別のアレルが編集の標的にされる場合）、またはオフターゲット編集の既知の部位に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＴＤＤ塩基編集は、保護されていないアレルにおいて、通常のコドンを終止コドンに変換することができる。
いくつかの実施形態では、ＺＦＰ－ＴＤＤＩ（またはその成分）の発現は、誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。ある特定の実施形態では、そのようなシステムを「キルスイッチ（ｋｉｌｌ ｓｗｉｔｃｈ）」として使用することができ、この場合、ＺＦＰ－ＴＤＤＩは、細胞中の必須遺伝子が編集されるのを防ぎ、ＺＦＰ－ＴＤＤＩの発現を低減させるかまたは排除することが、細胞死をもたらす。
ＺＦＰ－ＴＤＤＩのアセンブリーが二量体化誘導剤または二量体化阻害剤の制御下にある場合、塩基編集は該薬剤の有無を条件とする可能性がある。そのような状態付きシステムも「キルスイッチ」に使用することもでき、例えば、この場合、ＺＦＰ－ＴＤＤＩは、二量体化誘導剤の存在下でまたは二量体化阻害剤の非存在下で細胞中の必須遺伝子が編集されるのを防ぎ、該薬剤を除去または投与することが、それぞれに細胞死をもたらす。
ある特定の実施形態では、本開示の塩基エディターシステムは、１つより多いＺＦＰ－ＴＤＤ左とＺＦＰ－ＴＤＤ右の対を含むマルチプレックスシステムでもよく、そのようなシステムは、１箇所より多いＤＮＡ標的領域を一度に編集することができる可能性がある。特定の実施形態では、編集の特異性を高めるために、マルチプレックスシステムは、ＴＤＤのＮ－ハーフドメインおよびＣ－ハーフドメインが、各対のために、ＴＤＤ配列中の異なる位置（例えば、本明細書に記載の位置）で分割された、ＺＦＰ－ＴＤＤ対を含む。ある特定の実施形態では、マルチプレックスシステムのＺＦＰ－ＴＤＤ対によって編集されるＤＮＡ標的領域は、異なる遺伝子中にあってもよい。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ標的領域は、同じ遺伝子中にあってもよい。
上記実施形態のうちのいずれかにおいて、ＴＤＤおよびＴＤＤＩは本明細書に記載のいかなるものでもよい。ある特定の実施形態では、ＴＤＤはＤｄｄＡでもよく、ＴＤＤＩはＤｄｄＩでもよい。ＴＤＤおよびＴＤＤＩの代わりに他のシチジンデアミナーゼおよび阻害剤を使用することができることも企図される。特定の実施形態では、本明細書に記載のマルチプレックスシステムは、第１のＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ対および第２のＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ対を含むことができ、第１および第２の対は、異なるシチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のものから選択される）を利用する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムおよび方法は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の細胞で、ＤＮＡ標的領域の標的編集を生じさせる。いくつかの実施形態では、編集された細胞は、オフターゲットインデルをほとんどまたは全く示さない（例えば、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％または０．１％未満のオフターゲットインデル）。いくつかの実施形態では、編集された細胞は、オフターゲット塩基編集をほとんどまたは全く示さない（例えば、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％または０．１％未満のオフターゲット塩基編集）。しかし、オフターゲット部位の塩基編集は、転座または他のゲノムアレンジメントを起こさない傾向があり得るので、より高いパーセンテージも考えられ得る。
本開示は、本明細書に記載のＺＦＰ融合タンパク質をコードする核酸分子も提供し、これは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの一部であり得る。さらに、本開示は、本明細書に記載の塩基エディターシステムを含む細胞または細胞の集団、およびそのような細胞の後代を提供し、該細胞は１つまたは複数の編集された塩基を含む。
ＩＩＩ．ＺＦＰ融合タンパク質のデリバリー
様々な方法［例えば、エレクトロポレーション、受容体リガンド、脂質ナノ粒子、陽イオン性もしくは陰イオン性リポソームまたは核局在化シグナルへのタンパク質の融合（例えば、リポソームと組み合わせる）］を介して、本開示のＺＦＰ融合タンパク質をタンパク質として標的細胞に導入することができる。他の実施形態では、融合タンパク質は、それをコードする核酸分子、例えば、ＤＮＡプラスミドまたはｍＲＮＡを介して標的細胞に導入される。核酸分子は核酸発現ベクターでもよく、これは、ＺＦＰ融合タンパク質のためのコード配列の発現を可能にする発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列および転写終結配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＺＦＰ融合タンパク質の発現を指示するベクター上のプロモーターは、構成的活性型プロモーターまたは誘導性プロモーターである。適切なプロモーターとしては、限定はされないが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター（ＲＳＶエンハンサーを有していてもよい）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶエンハンサーを有していてもよい）、ＣＭＶ最初期プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦｌαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲ、クレアチンキナーゼベース（ＣＫ６）プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）プロモーター、ヒトα１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２因子（Ｅ２Ｆ）プロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター［ＣＡＧプロモーター；Niwa et al., Gene (1991) 108(2):193-9］、およびＲＵ－４８６応答性プロモーターが挙げられる。さらに、プロモーターは、ＺＦＰ融合タンパク質が結合し、予め設定された閾値にそれ自体の発現レベルを抑制することができる、１種または複数の自己制御エレメントを含むことができる。米国特許第９，６２４，４９８号を参照されたい。
限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、陽イオン性もしくは陰イオン性リポソーム、核局在化シグナルと組み合わせたリポソーム、天然に存在するリポソーム（例えば、エキソソーム）またはウイルス性形質導入を含めて、ヌクレオチド配列を細胞に導入する任意の方法を用いることができる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列はｍＲＮＡの形態であり、エレクトロポレーションを介して細胞にデリバリーされる。
発現ベクターのインビボデリバリーのために、ウイルス性形質導入を使用することができる。当技術分野で既知の様々なウイルスベクター、例えば、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポキシウイルス（ｐｏｘｙｖｉｒａｌ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクターおよびハイブリッドウイルスベクターを当業者は本開示で使用するために適合させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるウイルスベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。任意の適切なＡＡＶ血清型を使用することができる。例えば、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ，またはＡＡＶｒｈ１０、または新規な血清型もしくはシュードタイプのもの、例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９またはＡＡＶ２／６／９であり得る。いくつかの実施形態では、発現ベクターはＡＡＶウイルスベクターであり、昆虫細胞／バキュロウイルス産生システムまたは哺乳動物細胞産生システムなどの産生システムにおいてＡＡＶビリオンの産生を可能にするためにＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）配列を両端に有するものを含めて、ゲノムがコンストラクトを含む組換えＡＡＶビリオンによって標的ヒト細胞に導入される。カプシドタンパク質が免疫原性を低減しているか、またはヒトにおける形質導入能力が増強しているように、ＡＡＶを操作することができる。本明細書に記載のウイルスベクターは、当技術分野で既知の方法を使用して生成することができる。ウイルス粒子を産生するために、任意の適切な許容細胞またはパッケージング細胞型を用いることができる。例えば、パッケージング細胞株として、哺乳動物細胞（例えば、２９３）または昆虫（例えば、ｓｆ９）細胞を使用することができる。
本明細書に記載の塩基編集方法のために、任意の種類の細胞を標的にすることができる。例えば、細胞は真核性でも原核性でもよい。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物（例えば、ヒト）細胞または植物細胞である。ヒト細胞としては、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ヒト胚性幹細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）またはリンパ球細胞が分化することができる多能性幹細胞［例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）］を挙げることができる。いくつかの実施形態では、システムは、多能性幹細胞を複数の細胞型への分化より前に改変するために使用することができる。例えば、リンパ球細胞前駆体をリンパ球細胞型、例えば、調節性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、ナチュラルキラー細胞などへの分化より前に改変することができる。本開示のマルチプレックス塩基エディターシステム［１つより多いＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、ＺＦＰ－ＴＤＤ）対を含む］は、特に、多能性細胞を含めて、同時に複数の塩基編集をともなう細胞を調製するために使用することができる。いくつかの実施形態では、マルチプレックスシステムは、例えば、同種異系Ｔ細胞を調製するために使用することができる。システムが、本明細書に記載のように、二量体化調節剤の存在または非存在下でアセンブルするように誘導され得るＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ阻害剤（例えば、ＺＦＰ－ＴＤＤＩ）を含む場合、薬剤の投与の際に活性化される「キルスイッチ」の制御下に編集される細胞を置くことができることが企図される。
農業用途のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介性Ｔ－ＤＮＡデリバリーなどの、植物細胞へのタンパク質または核酸分子の導入のための任意の方法も企図される。
ＩＶ．医薬的用途
本開示は、細胞のＤＮＡにおいてシトシンをチミン塩基に編集する方法であって、本明細書に記載の塩基エディターシステムを細胞に（例えば、患者から）デリバリーし、標的Ｃ塩基のＴ塩基との置き換えをもたらすことを含む方法を提供する。細胞は患者内にあってもよく（インビボ治療）、または、本明細書に記載の方法を患者から取り出された細胞で実施し、次いで編集された細胞を患者にデリバリーすることができる（エキソビボ治療）。いくつかの実施形態では、細胞は、治療として、使用前にエキソビボでさらに操作される。用語「治療する」は、症状の軽減、症状の発症の予防、疾患の進行の緩徐化、生活の質の改善、および生存期間の増加を包含する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって治療される患者は哺乳動物、例えばヒトである。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、疾患と関係がある遺伝子または調節配列を編集するために使用される。例えば、ある特定の実施形態では、塩基編集は、ＤＮＡ配列中の点突然変異を修正して、正常な遺伝子発現または活性を回復させることができる。ある特定の実施形態では、塩基編集は、有害遺伝子（例えば、癌遺伝子）に終止コドンを導入することができる。ある特定の実施形態では、塩基編集は、治療的利益をもたらす突然変異を導入することができる。
いくつかの実施形態では、患者は癌を有する。ある特定の実施形態では、患者からの細胞は、化学療法剤に対する抵抗性を与えるために、塩基編集の前または後にさらに改変される。次いで、化学療法剤で患者を治療することができ、これにより、いくつかの実施形態では、非編集細胞と比べて編集された細胞の生存期間が長くなる。
いくつかの実施形態では、患者は自己免疫障害を有する。
いくつかの実施形態では、患者は、常染色体優性疾患、例えば、常染色体優性多発性嚢胞腎を有する。
いくつかの実施形態では、患者はミトコンドリア障害を有する。
いくつかの実施形態では、患者は、鎌状赤血球症、血友病（例えば、血友病Ａ、ＢもしくはＣ）、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、テイ・サックス病、プリオン病、色盲、リソソーム蓄積症（例えば、ファブリー病）、フリードライヒ失調症または前立腺癌を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、遺伝子の特定のアレル、例えば、野生型または突然変異アレルに塩基編集を標的化することができる。ある特定の実施形態では、アレルは癌と関係がある可能性がある。例えば、方法は、構成的なチロシンリン酸化活性につながり、骨髄増殖性新生物の拡大において重要な役割を果たすＪＡＫ２のＶ６１７Ｆ突然変異アレルを標的にすることができる。例えば終止コドンを導入することによって、Ｖ６１７Ｆ突然変異を有するアレルの発現をノックアウトすることにより、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ障害の治療の成功が容易になる可能性がある。
本開示は、本明細書に記載の塩基エディターシステムの要素、例えば、ＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載のＺＦＰ－ＴＤＤ）対および適宜シチジンデアミナーゼ阻害剤（例えば、ＴＤＤＩ、例えば、シチジンデアミナーゼがＤｄｄＡであるＤｄｄＩ）成分（例えば、ＺＦＰ－シチジンデアミナーゼ阻害剤成分）、または前記要素をコードするヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載のウイルスベクターまたは非ウイルスベクター中にある）を含む医薬組成物をさらに提供する。医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、例えば、水、食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）、デキストロース、グリセロール、ショ糖、ラクトース、ゼラチン、デキストラン、アルブミンまたはペクチンをさらに含むことができる。さらに、組成物は、補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬を含むことができる。医薬組成物は、デリバリー媒体、例えば、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子および小胞を含むことができる。
いくつかの実施形態では、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ａ２ａＲ、ＡＡＶＳ１、ＡＣＴＢ、ＡＩＤ、ＡＬＢ、Ｂ２Ｍ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＢＴＬＡ、ブチロフィリン、ＣＩＩＴＡ、ＣＣＲ５、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ３ゼータＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＣＤ１６０、ＣＤ１６０ （ＢＹ５５）、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤＳ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＩＳＨ、ＣＲＴＡＭ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＤＣＫ、ＤＧＫ、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＧＫＧ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ、ＤＨＦＲ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＥＰ２／４受容体、アデノシン受容体、例えばＡ２ＡＲ、ＦＡＳ、ＦＡＳＬＧ、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、ｇｐ４９Ｂ、ＨＨＬＡ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＩＶ－ＬＴＲ（ロングターミナルリピート）、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＶＥＭ、ＨＶＥＭ、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＦＮ－アルファ／ベータ／ガンマ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ－６、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、免疫グロブリン重鎖座位、免疫グロブリン軽鎖座位、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲファミリー受容体、ＫＬＲＧ１、Ｌａｇ－３、ＬＡＩＲ－１、ＬＡＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＭＮＫ１／２、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＯＸ２Ｒ、ＯＸ４０、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＧＥ２受容体、ＰＩＲ－Ｂ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＰＲＮＰ１、ＰＳＧＬ１、ＰＴＰＮ２、ＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＲＦＸ５、ＲＯＳＡ２６、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＳＬＡＭＦ５、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、テザリン、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＴＭＩＧＤ２、ＴＲＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＴＲＤ、ＴＲＧ、ＴＮＦ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＩＭ５、ＴＵＢＡ１、ＶＩＳＴＡ、ＶＬＡ１、またはＶＬＡ－６から選択されるゲノム座位に標的化するように、本明細書に記載の塩基エディターシステムを操作することができる。
本明細書に記載のＺＦＰ融合タンパク質および塩基エディターシステムは、本明細書に記載の治療の方法で使用することができ、本明細書に記載の治療での使用のためのものでもよく、または本明細書に記載の治療のための医薬の製造で使用することができることが理解されよう。
Ｖ．農業用途
細胞のＤＮＡにおいてシトシンをチミン塩基に編集する記載のシステムおよび方法は、農業用途で使用することもできる。例えば、ある特定の実施形態では、塩基編集は、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数の点突然変異を修正して、正常な遺伝子発現または活性を回復させることができる。ある特定の実施形態では、塩基編集は、１つまたは複数の有害遺伝子に終止コドンを導入することができる。ある特定の実施形態では、塩基編集は、１つまたは複数の有利な突然変異を導入することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のシステムおよび方法は作物植物を編集するために使用される。
本明細書で別段定義しない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載のものと同様または均等の方法および材料も本開示の実施または試験において使用することができる。矛盾がある場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。一般に、本明細書に記載の心臓学、医学、医化学および薬化学ならびに細胞生物学に関連して使用される専門語、ならびにこれらの技法は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。酵素反応および精製技法は、製造者の仕様書に従って、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように実施される。さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書および実施形態全体にわたって、単語「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数の群の排除を意味しないと理解されるであろう。用語「または」は、一般に、文脈において特に明記しない限り、「および／または」を含む意味で用いられることにも留意されたい。本明細書で使用する場合、用語「約」は、特定の使用の文脈内で、記載された数値から１０％、５％または１％プラスまたはマイナスである数値範囲を指す。さらに、本明細書で提供される表題は便宜のためのみであり、主張される実施形態の範囲および意味を説明するものではない。
本明細書で言及されるすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの文献が本明細書で引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれも当技術分野で共通の一般的知識の一部を形成するという承認にはならない。
本発明をより良く理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみを目的とし、いかなる方法によっても、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
［実施例１］ＺＦＰ－ＴＤＤの設計
ＺＦＰ－ＤｄｄＡ融合タンパク質対を調製するために、Mok et al.(上記)に記載されているように、ＤｄｄＡペプチドを残基Ｇ１３３３（「ＤｄｄＡ－Ｇ１３３３」）で、ならびに残基Ｇ１４０４（「ＤｄｄＡ－Ｇ１４０４」）およびＧ１４０７（「ＤｄｄＡ－Ｇ１４０７」）で、２つの分割体（ｈａｌｖｅｓ）に分割した（それぞれ、シチジンデアミナーゼ活性を欠く）。８つの左ＺＦＰおよび５つの右ＺＦＰを、ＤｄｄＡの該分割体をヒトＣＣＲ５座位の部位に標的化し、その結果、該分割体が標的部位で二量体化することができ、ＤｄｄＡの触媒活性を回復するように設計した。左ＺＦＰと右ＺＦＰの対は、２ｂｐ～２４ｂｐまでの幅広い塩基編集ウィンドウをカバーする（図２Ａ）。
各分割ＤｄｄＡ対のＮ末端側の分割体（ｈａｌｆ）を左ＺＦＰのＣ末端に融合し、Ｃ末側の分割体を右ＺＦＰのＣ末端に融合し、逆もまた同様に行った。ＤｄｄＡ－Ｇ１３３３については、３つの異なるリンカー（Ｌ０、Ｌ７ＡおよびＬ２６）のうちの１つを使用したが、ＤｄｄＡ－Ｇ１４０４およびＤｄｄＡ－Ｇ１４０７については、Ｌ２６リンカーを使用した。すべての他の実験については、別段指示がない限り、Ｌ２６リンカーを使用した。ＵＧＩ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤）ドメインもＮ末端側の分割体およびＣ末端側の分割体のぞれぞれのＣ末端に融合した。すべてのＺＦＰ－ＤｄｄＡ融合コンストラクトは、３×ＦＬＡＧタグおよびＳＺＦＰのＮ末端に融合しているＶ４０核局在化シグナルをさらに含んでいた。左ＺＦＰと右ＺＦＰの対の例を図２Ｂに示す。
上記の配列およびいくつかの調製したコンストラクトの配列を以下の表２に示す。左ＺＦＰ＃１～８および右ＺＦＰ＃１～５において、フィンガー配列に下線を引き、太字で示した表２のＺＦＰはＣＣＲ５座位を標的にする。
［実施例２］Ｋ５６２細胞におけるＺＦＰ－ＤｄｄＡ塩基編集
上記の方法に従って調製した同じリンカーＺＦＰ－ＤｄｄＡ対を使用して、細胞で塩基編集をアッセイするために、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４３）細胞をＡＴＣＣから得て、１０％ＦＢＳおよび１×ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（ＰＳＧ）（Ｇｉｂｃｏ、１０３７８－０１６）を含むＲＰＭＩ１６４０において、５％ＣＯ２で３７℃で維持した。製造者の指示書に従ってＳＦ細胞株９６ウェルヌクレオフェクターキット（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＳＣ－２９６０）を使用して、対になったＺＦＰ－ＤｄｄＡをコードする４００ｎｇのｐＤＮＡをＫ５６２細胞にエレクトロポレーションした。手短に述べると、細胞を１×ＰＢＳ（二価陽イオンを含まない）で２回洗浄し、１５μＬの補充したＳＦ細胞株９６ウェルヌクレオフェクター溶液あたり２×１０５細胞で再懸濁した。各トランスフェクションについて、１５μＬの細胞懸濁液を５μＬのｐＤＮＡと混合し、Ｌｏｎｚａヌクレオキュベットプレートに移し、次いで、Ａｍａｘａヌクレオフェクター９６ウェルシャトルシステム（Ｌｏｎｚａ）で、Ｋ５６２細胞用のプロトコール（ヌクレオフェクタープログラム９６－ＦＦ－１２０）を使用して、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を１０分間室温でインキュベートし、次いで、９６ウェル組織培養プレート中の１５０μＬの予め温めた完全培地に移した。細胞を７２時間インキュベートし、次いで、塩基編集の定量化のために回収した。
以下の最適条件を用いてＰｒｉｍｅｒ３を使用して、ＣＣＲ５座位用のＰＣＲプライマーを設計した：２００ヌクレオチドの増幅産物サイズ；６０℃の融解温度；２０ヌクレオチドのプライマー長；および５０％のＧＣ含量。プライマーおよび増幅産物の配列を以下の表３に示す。
第２のＰＣＲ反応のためにアダプターを加えて、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー配列［フォワードプライマー：ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号４７）；リバースプライマー：ＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ（配列番号４８）］を加えた。ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＨｉＦｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して２５μＬで、ＣＣＲ５座位を増幅した。以下のサーモサイクル条件を用いて、０．１μＭの終濃度でプライマーを使用した：９５℃５分の初期融解；９５℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃４０秒の３５サイクル；ならびに６８℃１０分の最終的な伸長。ＰＣＲ産物を水に１：２０希釈した。２０μＬのＰＣＲ反応において２μＬの希釈ＰＣＲ産物を使用して、ＨＦ緩衝液（ＮＥＢ）を含むＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘをともなうＩｌｌｕｍｉｎａライブラリー配列を加えた。以下の条件を用いて、０．５μＭの終濃度でプライマーを使用した：９８℃３０秒の初期融解；９８℃１０秒、６０℃３０秒および７２℃４０秒の１２サイクル；ならびに７２℃１０分間の最終的な伸長。次いで、第２のＰＣＲ反応を実施して、試料特異的な配列バーコードを加えた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＰＣＲライブラリーを精製した。試料をＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量化し、２ｎＭに希釈した。次いで、製造業者の指示に従って、標準的な３００サイクルキットを使用するＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑかまたはｍｉｄ－ｏｕｔｐｕｔ３００サイクルキットを使用するＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００のいずれかで、ライブラリーを試験にかけた。
ＤｄｄＡ－Ｇ１３３３を使用した結果を図３に示す。ＣＣＲ５塩基編集ウィンドウ中の４位置すべて（Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１８およびＣ２４）で＞３％の塩基編集が達成され、注目すべきインデルはなかった。図４は、位置Ｃ１８およびＣ２４におけるＤｄｄＡ－１３９７、ＤｄｄＡ－Ｇ１４０４およびＤｄｄＡ－Ｇ１４０７についての結果を提供する。特に、ＤｄｄＡ－Ｇ１４０４およびＤｄｄＡ－Ｇ１４０７は、特にＣ１８で効率および活性の増大を示した。１７個のＧＦＰ対照のいずれについても塩基編集はみられなかった（データ非表示）。
［実施例３］「再接続化」ＤｄｄＡ設計
以下に示すように、残基１３９８を新しいＮ末端にし、現在のＣ末端を残基１３３４に連結し、残基１３９７を現在のＮ末端に連結し、残基１３３３を新しいＣ末端にすることによって、標準的な環状順列（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を実施することなく、ＤｄｄＡポリペプチド鎖を再び接続した（「再接続化」ＤｄｄＡ完全）：
＞ＤｄｄＡ完全（配列番号７２の残基１２９０～１４２７）（無秩序な残基をイタリックで示した；１３３３および１３９７を太字で示した）：
（配列番号４９）
＞再接続化ＤｄｄＡ完全［１３９８～Ｃ末端：１３３４～１３９７：リンカー（二重下線を引いた）：Ｎ末端～１３３３、一本の下線は、再接続によって作出された近くの接合部を示す］：
次いで、再接続化ＤｄｄＡを２つの分割体に分割して、機能的な無毒の塩基エディター、再接続化＿Ｇ１３０９および再接続化＿Ｎ１３５７を作製するために、２つの異なるストラテジーを確認した：
＞再接続化＿Ｇ１３０９－Ｎ：
＞再接続化＿Ｇ１３０９－Ｃ：
＞再接続化＿Ｎ１３５７－Ｎ：
＞再接続化＿Ｎ１３５７－Ｃ：
次いで、ＣＣＲ５座位に対するそれぞれのＺＦＰ－ＤｄｄＡ塩基エディターを、これらの分割再接続化ＤｄｄＡ構造に基づいて設計した。例えば、表４を参照されたい。上記のプロトコールに従ってＫ５６２細胞で試験する場合に、再接続化ＺＦＰ－ＤｄｄＡ対がＣからＴへの塩基編集を実施することができるであろうことが予期される。そのような再接続化対は、各分割対の左および右アームのみが機能的ＤｄｄＡを形成することができるので、マルチプレックス塩基エディター適用の特異性を高めることができる。
［実施例４］ＺＦＰ－ＤｄｄＡ結合ポケットの再成形
ＤｄｄＡ由来シトシン塩基エディターはＣからＴへの編集に制限されており、塩基編集ウィンドウ内のＴＣジヌクレオチドに対して強い選好性がある。これらの制限を緩めるため、および酵素の効率および／または活性を高めるための飽和突然変異誘発のために、様々な残基が特定され、これらには、Ｙ１３０７、Ｔ１３１１、Ｓ１３３１、Ｖ１３４６、Ｈ１３６６、Ｎ１３６７、Ｎ１３６８、Ｐ１３６９、Ｅ１３７０、Ｇ１３７１、Ｔ１３７２、Ｆ１３７５、Ｖ１３９２、Ｐ１３９４、Ｐ１３９５、Ｉ１３９９、Ｐ１４００、Ｖ１４０１、Ｋ１４０２、Ａ１４０５およびＴ１４０６が含まれる。これらの突然変異は配列番号７２について番号付けされている。ＤｄｄＡと他の塩基エディター、例えばアデニンデアミナーゼの間の構造的アライメントに基づいて、これらの残基はヌクレオチドポケットを形成すると判断した。図５に示す左ＺＦＰと右ＺＦＰの対を使用して、上記のプロトコールに従って、位置Ｅ１３７０、Ｎ１３６８およびＹ１３０７に突然変異を有するＤｄｄＡ変異体をＫ５６２細胞で試験した。
図６Ａ～６Ｃに示すように、ある特定の残基の変更は、効率／活性の増大を起こす。さらに、いくつかの残基の変更は、ＤｄｄＡ酵素の活性ウィンドウを変化させ、そのような変化は、ＤｄｄＡ－ベースの試薬の精度および特異性を高めることができる。Ｙ１３０７とＮ１３６８は両方とも変更に対して感受性であるように思われ、いくつかの突然変異は、Ｙ１３０７の活性プロファイルを変化させる（例えば、ある特定の場合には、Ｃ１８でほとんど２０倍の活性の増加、およびＣ９およびＣ１０に接近する能力）。Ｅ１３７０は変更に対して感受性が低いように思われ、ある特定の突然変異は有益効果を示す（例えば、「左＿ＺＦＰ＃４－Ｇ１３３３－Ｎ：右＿ＺＦＰ＃５－Ｇ１３３３－Ｃ」におけるＥ１３７０Ｈ）。
［実施例５］塩基編集へのＺＦＰ－ＴＤＤ＋ニッカーゼアプローチの組み合わせ
塩基エディターの効率は、未修飾ＤＮＡ鎖にニッカーゼでニックを生成することによって高めることができる。次いで、未修飾ＤＮＡ鎖は、新しく合成されたものとして細胞に認識され、天然のＤＮＡ修復機構が、修飾された鎖を鋳型として使用して、ニックが生成されたＤＮＡ鎖を修復する。ＦｏｋＩ由来ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ由来ニッカーゼを使用して、未修飾鎖にニックを生成することができる。図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ニッカーゼを用いたＺＦＰ－ＴＤＤ塩基編集の設計および結果を示す。しかし、３つのアプローチはすべて、２つのさらなるコンストラクト（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮニッカーゼのための２つのペプチド；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼのための１つのペプチドおよび１つのｓｇＲＮＡ；図８）のデリバリーを必要とする。
この制限を克服し、デリバリーを容易にし、さらに塩基編集およびＤＮＡニック生成が同時に起こる可能性を高くし、編集効率を高めるために、三量体ＺＦＰ－ＴＤＤ塩基エディター構造を開発した。そのような三量体構造では、二量体のＦｏｋＩニッカーゼの分割体の一方を左または右ＺＦＰ－ＴＤＤのＮ末端に融合することができ、独立したＺＦＰ－ＦｏｋＩペプチドを介してＦｏｋＩニッカーゼの対応する他方の分割体を目的の部位に標的化することができる（図９）。ＤｄｄＡを使用するニッカーゼ実験のための配列は以下の表５に見出すことができ、ＺＦＰの設計を図１０に示す（左＿ＺＦＰ＃４＋右＿ＺＦＰ＃１＋ニッカーゼＺＦＰ＃２、または左＿ＺＦＰ＃４＋右＿ＺＦＰ＃５＋ニッカーゼＺＦＰ＃１）。
上記のプロトコールに従って、三量体ＺＦＰ－ＤｄｄＡ－ニッカーゼシステムをＫ５６２細胞で試験した。図１１に示すように、三量体ＺＦＰ－ＤｄｄＡ－ニッカーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼよりも高いレベルの塩基編集活性を示し、場合によっては約７０％の塩基編集、およびバックグラウンドに近いより低レベルのインデルがあった。ＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼシステムより性能が優れていることに加えて、三量体ＺＦＰ－ＴＤＤ－ニッカーゼシステムは、そのコンパクトなサイズにおいて非常に有利である可能性があり、これは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓおよびＴＡＬＥ－ＴＤＤ塩基エディターシステムなどの他のプラットフォームと異なって、ＡＡＶなどの単一のウイルスベクターに適合する可能性がある。
［実施例６］Ｋ５６２細胞におけるＴＤＤの塩基編集活性
他の可能性のある１９種のシチジンデアミナーゼを特定し（表６）、塩基編集活性について試験した。
上記のＴＤＤを上記の実施例に記載されている塩基編集システムにおいてＤｄｄＡの代わりに用い、これを、上記のＣＣＲ５標的化ＺＦＰを使用して、および／またはＣＩＩＴＡ座位（「部位２」）で以下に記載のＣＩＩＴＡ標的化ＺＦＰ（表７を参照されたい）を使用して、ＣＣＲ５座位での塩基編集のための記載されるプロトコールに従って、Ｋ５６２細胞で試験した。ＣＩＩＴＡプライマーおよび増幅産物の配列を以下の表８に示す。
Ｌ２６リンカー（配列番号１７）を使用して、各ＴＤＤ分割体の一方のメンバーを左ＺＦＰのＣ末端に融合し、他方のメンバーを右ＺＦＰのＣ末端に融合した。ＳＧＧＳリンカー（配列番号２４５）を用いて、ＵＧＩ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤）ドメイン（配列番号２０）もＮ末端側の分割体およびＣ末端側の分割体のぞれぞれのＣ末端に融合した。すべてのＺＦＰ融合コンストラクトは、３×ＦＬＡＧタグおよびＺＦＰのＮ末端に融合しているＳＶ４０核局在化シグナル）（配列番号１）をさらに含んでいた。
ＴＤＤのために使用される配列は、以下の表９に含まれる。ある特定のＴＤＤについて、変異型毒性ドメインも試験した（ＴＤＤ指示物の後に「ｂ」で示し、例えば、ＴＤＤ２については「ＴＤＤ２ｂ」である）。
ＣＣＲ５座位でのＴＤＤ塩基編集活性
図１２は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインの２つの異なる対（図１０を参照されたい）を用いた、標的配列ＣＣＲ５のＣ９、Ｃ１０、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０およびＣ２４でのＴＤＤ１～ＴＤＤ６（選択分割）の塩基編集頻度を示す。各分割酵素の２つの方向を試験した（すなわち、各方向についてＺＦＰ対の異なるメンバーに連結しているＮ末端側の分割体およびＣ末端側の分割体を用いた）。塩基編集システムがニッカーゼを含む実験では、ＺＦＰ－ＦｏｋＩニッカーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ニッカーゼを使用した。
図１３は、塩基編集ウィンドウ中の任意のＣに対する各デアミナーゼについて、編集の最高頻度の比較（図１２に示すデータおよびさらなる反復実験に基づく）を示す。ＴＤＤの少なくとも３つ（ＴＤＤ３、ＴＤＤ４およびＴＤＤ６）が、検出可能な塩基編集活性（＞０．２５％の塩基編集）を示し、ＴＤＤ４が、ＤｄｄＡよりも高い最大活性を示した。
図１４は、ＴＤＤ塩基編集活性のより詳細な解析（図１２に示すデータおよびさらなる反復実験に基づく）を提供し、これは、ニッカーゼ活性ありまたはなしで、２つの異なるＺＦＰ対に対する各ＴＤＤの２つの結合方向についての塩基編集ウィンドウ中の任意のＣに対する編集の最高頻度を示す。ある特定のＴＤＤに対する塩基編集は、ＺＦＰ対（例えば、ＴＤＤ４）または結合方向（例えば、ＴＤＤ３）に感受性であるように思われる。ＴＤＤ６は、少なくともＺＦＰ＃４およびＺＦＰ＃５において結合方向依存性があるにもかかわらず、試験したすべての条件について検出可能な活性（＞０．２５％の塩基編集）を有するように見えた。各ＴＤＤについて、場合によっては、ニックを生成することが塩基編集活性を向上させるように思われた（図１２も参照されたい）。
ＣＩＩＴＡ座位でのＴＤＤ塩基編集活性
選択したＴＤＤ分割酵素を、示されるＺＦＰ結合ドメインを有する標的配列ＣＩＩＴＡ（「ＣＩＩＴＡ＿部位＿２＿右＿１」、「ＣＩＩＴＡ＿部位＿２＿右＿５」および「ＣＩＩＴＡ＿部位＿２＿左＿６」）中のＧ２、Ｇ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｇ１０、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｃ１５およびＣ１６と標識されたヌクレオチドでの塩基編集について試験した（図１５）。図１６は、塩基編集ウィンドウ中の任意のＣに対する各融合タンパク質対について、編集の最高頻度の比較を示す。ＣＣＲ５座位で活性であったＴＤＤ３、ＴＤＤ４およびＴＤＤ６は、ＣＩＩＴＡ座位でも検出可能な塩基編集活性（＞０．２５％の塩基編集）を示した。８つのさらなるＴＤＤ（ＴＤＤ８、ＴＤＤ９、ＴＤＤ１０、ＴＤＤ１２、ＴＤＤ１４、ＴＤＤ１５、ＴＤＤ１８およびＴＤＤ１９）も同様に検出可能な編集を示した。塩基編集活性は、ＴＤＤ分割位置に、場合によっては使用した毒性ドメインの変異体（例えば、ＴＤＤ４）に感受性であるように思われた。ＴＤＤ４は、試験したすべての条件で有意な活性を有するように思われた。いくつかのＴＤＤは標的化密度の増大も提供し（図１７）、ＴＣおよびＡＣ部位でのより強い活性（ＤｄｄＡと比較；例えばＴＤＤ６を参照されたい）ならびにＧＣおよびＣＣ部位での活性（例えば、ＴＤＤ６）があった。
ＣＩＩＴＡ座位でのＴＤＤ塩基編集活性に対する異なるリンカーの影響
塩基編集活性がデアミナーゼとＺＦＰドメインの間の異なるリンカーの影響を受けるかどうかを評価するために、リンカーＬ２６、Ｌ２１、Ｌ１８、Ｌ１３、Ｌ１１、Ｌ９、Ｌ６およびＬ４を用いて、ＣＩＩＴＡ座位でのＴＤＤ６の編集頻度を評価した。図１８に示すように、異なるリンカー長は、塩基編集ウィンドウ内の塩基編集プロファイルを変化させることができた。例えば、左ＺＦＰをＮ末端ＴＤＤ分割体またはＣ末端ＴＤＤ分割体のいずれかに接続するリンカーの短縮は、活性ウィンドウを狭くするように思われた。そのような変化は、塩基エディターの精度および特異性を高めることができる。場合によっては、リンカー長の影響は、ＺＦＰ対に対する、またはＴＤＤに対するＴＤＤ分割体の結合方向に感受性であるように思われた（例えば、ＴＤＤ１４でのＬ４のパフォーマンス）。
［実施例７］ＴＤＤに対する標的化阻害剤ＴＤＤＩ
ＴＤＤＩによってＴＤＤ酵素を不活性化することができる。例えば、ＤｄｄＩ阻害剤によって天然のＤｄｄＡ酵素を不活性化することができる。ＺＦＰまたはＴＡＬＥに連結されたＴＤＤＩを潜在的なＴＤＤ由来シトシン塩基エディター部位に標的化し、その部位が編集されるのを防止することができる（図１９）。小分子によって増強される二量体化ドメインを使用してＴＤＤＩ阻害剤をＺＦＰに連結することができ、したがって、編集活性を小分子の制御下に置くことができる。
標的化されるＴＤＤＩコンストラクトをアレル特異的に設計することによって、編集をある特定のアレルに選択的に標的化して、例えば、突然変異が存在する場合のみ終止コドンで編集することによって、有害な突然変異体をノックアウトすることができる。例えば、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆは、Ｖ６１７Ｆ突然変異が存在する場合のみ終止コドンで編集することによって、ノックアウトすることができる。
このＴＤＤＩアプローチは、特に、他の手段によって編集を排除することができない場合に、オフターゲット部位で編集を低減させるために使用することもできる。
ＴＤＤおよびＴＤＤＩの代わりに他のシチジンデアミナーゼおよびそれらの阻害剤を使用することができることも企図される。

Claims (54)

  1. 細胞のゲノムにおいてシトシンをチミンに変えるためのシステムであって、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質、またはそれぞれ第１および第２の融合タンパク質を発現させるための第１および第２の発現コンストラクトを含み、
    ａ）第１の融合タンパク質が、
    ｉ）細胞の標的ゲノム領域中の第１の配列に結合する第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、および
    ｉｉ）配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む毒素由来デアミナーゼ（ＴＤＤ）であるシチジンデアミナーゼポリペプチドの第１の部分
    を含み、
    ｂ）第２の融合タンパク質が、
    ｉ）標的ゲノム領域中の第２の配列に結合する第２のＺＦＰドメイン、および
    ｉｉ）シチジンデアミナーゼポリペプチドの第２の部分
    を含み、
    ｃ）第１の部分および第２の部分が、それら自体でシチジンデアミナーゼ活性を欠き、
    ｄ）標的ゲノム領域への第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質の結合が、第１の部分と第２の部分の二量体化をもたらし、二量体化した部分が、標的ゲノム領域中のシトシンをチミンに変えることができる活性なシチジンデアミナーゼを形成し、
    細胞が真核細胞であってもよく、
    真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞であってもよく、
    さらに、哺乳動物細胞がヒト細胞であってもよい、
    システム。
  2. 標的ゲノム領域が細胞中の遺伝子の特定のアレルに特異的である、請求項１に記載のシステム。
  3. シトシンが第１の配列の近位端と標的ゲノム領域中の第２の配列の間にあり、近位端が１００ｂｐ以下離れていてもよい、請求項１または２に記載のシステム。
  4. １対より多くの第１および第２の融合タンパク質を含み、融合タンパク質の各対が異なる標的ゲノム領域に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
  5. ある対の融合タンパク質の第１および第２のシチジンデアミナーゼ部分が、別の対の融合タンパク質の第１の部分および第２の部分と異なる、請求項４に記載のシステム。
  6. 非編集鎖または編集鎖で一本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすニッカーゼをさらに含み、ＤＮＡ切断が、編集されるシトシンから約５００ｂｐ以下、適宜２００ｂｐ以下、適宜約１０～５０ｂｐである、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
  7. ニッカーゼがＺＦＰベースのニッカーゼ、ＴＡＬＥベースのニッカーゼまたはＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼである、請求項６に記載のシステム。
  8. ニッカーゼが、標的ゲノム領域に結合する２つのＺＦＰドメインにそれぞれ融合している第１のニッカーゼドメインと第２のニッカーゼドメインの二量体化によって形成されるＺＦＰベースのニッカーゼであり、第１および第２のニッカーゼドメインがそれら自体で不活性である、請求項７に記載のシステム。
  9. ニッカーゼドメインのうちの１つが第１または第２の融合タンパク質に融合しており、
    もう１つのニッカーゼドメインが標的ゲノム領域中の第３の配列に結合する第３のＺＦＰドメインに融合している、
    請求項８に記載のシステム。
  10. ２つのニッカーゼドメインが、
    ｉ）標的ゲノム領域中の第３の配列に結合する第３のＺＦＰドメイン、および
    ｉｉ）標的ゲノム領域中の第４の配列に結合する第４のＺＦＰドメイン
    にそれぞれ融合している、請求項８に記載のシステム。
  11. 第１および第２のニッカーゼドメインがＦｏｋＩに由来する、請求項８～１０のいずれか一項に記載のシステム。
  12. さらに第３の融合タンパク質または細胞中で第３の融合タンパク質を発現させるための第３の発現コンストラクトを含み、
    ｅ）第３の融合タンパク質が、
    ｉ）標的ゲノム領域中の第３の配列に結合するＺＦＰドメイン、および
    ｉｉ）シチジンデアミナーゼに対する阻害性ドメイン
    を含み、
    ｆ）標的ゲノム領域への第３の融合タンパク質の結合が、二量体化したシチジンデアミナーゼ部分への阻害性ドメインの結合、およびそれによる二量体化したシチジンデアミナーゼ部分のシチジンデアミナーゼ活性の阻害をもたらす、
    請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
  13. さらに第３の融合タンパク質または細胞中で第３の融合タンパク質を発現させるための第３の発現コンストラクト、および第４の融合タンパク質または細胞中で第４の融合タンパク質を発現させるための第４の発現コンストラクトを含み、
    ｅ）第３の融合タンパク質が、
    ｉ）標的ゲノム領域中の第３の配列に結合するＺＦＰドメイン、および
    ｉｉ）第１の二量体化ドメイン
    を含み、
    ｆ）第４の融合タンパク質が、
    ｉ）シチジンデアミナーゼに対する阻害性ドメイン、および
    ｉｉ）二量体化誘導剤の存在下で第１の二量体化ドメインとパートナーになることができる第２の二量体化ドメイン
    を含み、
    ｇ）標的ゲノム領域への第３の融合タンパク質の結合、および第１と第２の二量体化ドメインの二量体化が、二量体化したシチジンデアミナーゼ部分への阻害性ドメインの結合、およびそれによる二量体化したシチジンデアミナーゼ部分のシチジンデアミナーゼ活性の阻害をもたらす、
    請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
  14. さらに第３の融合タンパク質または細胞中で第３の融合タンパク質を発現させるための第３の発現コンストラクト、および第４の融合タンパク質または細胞中で第４の融合タンパク質を発現させるための第４の発現コンストラクトを含み、
    ｅ）第３の融合タンパク質が、
    ｉ）標的ゲノム領域中の第３の配列に結合するＺＦＰドメイン、および
    ｉｉ）第１の二量体化ドメイン
    を含み、
    ｆ）第４の融合タンパク質が、
    ｉ）シチジンデアミナーゼに対する阻害性ドメイン、および
    ｉｉ）二量体化阻害剤の非存在下で第１の二量体化ドメインとパートナーになることができる第２の二量体化ドメイン
    を含み、
    ｇ）標的ゲノム領域への第３の融合タンパク質の結合、および第１と第２の二量体化ドメインの二量体化が、二量体化したシチジンデアミナーゼ部分への阻害性ドメインの結合、およびそれによる二量体化したシチジンデアミナーゼ部分のシチジンデアミナーゼ活性の阻害をもたらす、
    請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
  15. ＺＦＰドメインが２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーを独立に有する、前記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  16. 発現コンストラクトが同じまたは別々のウイルスベクター上にある、前記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  17. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項１６に記載のシステム。
  18. ＴＤＤが配列番号７２のアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  19. ＴＤＤが配列番号７２のアミノ酸配列を含むＴＤＤの毒性ドメインを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  20. シチジンデアミナーゼが配列番号４９または８１のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＴＤＤである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  21. ＴＤＤが配列番号４９または８１のアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  22. 第１および第２のシチジンデアミナーゼ部分が、
    配列番号７２の
    それぞれ、アミノ酸１２６４～１３３３および１３３４～１４２７、
    それぞれ、アミノ酸１２６４～１３９７および１３９８～１４２７、
    それぞれ、アミノ酸１２６４～１４０４および１４０５～１４２７、
    それぞれ、アミノ酸１２６４～１４０７および１４０８～１４２７、
    それぞれ、アミノ酸１２９０～１３３３および１３３４～１４２７、
    それぞれ、アミノ酸１２９０～１３９７および１３９８～１４２７、
    それぞれ、アミノ酸１２９０～１４０４および１４０５～１４２７、もしくは
    それぞれ、アミノ酸１２９０～１４０７および１４０８～１４２７を含み、
    または
    その逆を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  23. 第１および第２のシチジンデアミナーゼ部分がそれぞれ、
    配列番号８２および８３、
    配列番号８４および８５、
    配列番号１８および１９、
    配列番号５１および５２、もしくは
    配列番号５３および５４を含み、
    または
    その逆を含む、
    請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  24. ＴＤＤが、Ｙ１３０７、Ｔ１３１１、Ｓ１３３１、Ｖ１３４６、Ｈ１３６６、Ｎ１３６７、Ｎ１３６８、Ｐ１３６９、Ｅ１３７０、Ｇ１３７１、Ｔ１３７２、Ｆ１３７５、Ｖ１３９２、Ｐ１３９４、Ｐ１３９５、Ｉ１３９９、Ｐ１４００、Ｖ１４０１、Ｋ１４０２、Ａ１４０５およびＴ１４０６から選択される１つまたは複数の残基に突然変異を有し、残基が配列番号７２について番号付けされている、請求項１８～２３のいずれか一項に記載のシステム。
  25. シチジンデアミナーゼが、配列番号８６～９１および１１７～１２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＴＤＤである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  26. シチジンデアミナーゼが、配列番号８６～９１および１１７～１２９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＴＤＤの毒性ドメインを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  27. ＴＤＤが、配列番号９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  28. シチジンデアミナーゼが、配列番号９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含むＴＤＤである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  29. 第１および第２のシチジンデアミナーゼ部分がそれぞれ、配列番号９３および９４配列番号９６および９７、配列番号９９および１００、配列番号１０２および１０３、配列番号１０５および１０６、配列番号１０８および１０９、配列番号１３０および１３１、配列番号１３２および１３３、配列番号１３５および１３６、配列番号１３７および１３８、配列番号１３９および１４０、配列番号１４１および１４２、配列番号１４４および１４５、配列番号１４６および１４７、配列番号１４８および１４９、配列番号１５０および１５１、配列番号１５３および１５４、配列番号１５５および１５６、配列番号１５８および１５９、配列番号１６０および１６１、配列番号１６３および１６４、配列番号１６５および１６６、配列番号１６８および１６９、配列番号１７０および１７１、配列番号１７３および１７４、配列番号１７５および１７６、配列番号１７８および１７９、配列番号１８０および１８１、配列番号１８２および１８３、配列番号１８５および１８６、配列番号１８７および１８８、配列番号１９０および１９１、配列番号１９２および１９３、配列番号１９５および１９６、配列番号１９７および１９８、配列番号２００および２０１、配列番号２０２および２０３、配列番号２０５および２０６、配列番号２０７および２０８、配列番号２１０および２１１、配列番号２１２および２１３、配列番号２１５および２１６、配列番号２１７および２１８、配列番号２２０および２２１、または配列番号２２２および２２３を含み、
    または
    その逆を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
  30. ｉ）遺伝子に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）シチジンデアミナーゼポリペプチドの断片を含む融合タンパク質であって、シチジンデアミナーゼが、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む毒素由来デアミナーゼ（ＴＤＤ）であり、ＺＦＰドメインおよびシチジンデアミナーゼ断片がペプチドリンカーによって連結していてもよく、遺伝子が真核遺伝子であってもよく、真核遺伝子がヒト遺伝子であってもよい、融合タンパク質。
  31. ｉ）遺伝子に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）シチジンデアミナーゼ阻害性ドメインを含む融合タンパク質であって、シチジンデアミナーゼが、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む毒素由来デアミナーゼ（ＴＤＤ）であり、ＺＦＰドメインおよび阻害性ドメインがペプチドリンカーによって連結していてもよく、遺伝子が真核遺伝子であってもよく、真核遺伝子がヒト遺伝子であってもよい、融合タンパク質。
  32. ＴＤＤが、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む、請求項３０または３１に記載の融合タンパク質。
  33. リンカーが配列番号１５～１７および１１０～１１６のうちのいずれか１つを含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  34. ａ）ｉ）遺伝子に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）第１の二量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質、ならびに
    ｂ）ｉ）配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む毒素由来デアミナーゼ（ＴＤＤ）であるシチジンデアミナーゼ阻害性ドメイン、およびｉｉ）第２の二量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質
    を含む１対の融合タンパク質であって、
    第１および第２の二量体化ドメインが、二量体化誘導剤の存在下で二量体化することができ、
    遺伝子が真核遺伝子であってもよく、真核遺伝子がヒト遺伝子あってもよい、１対の融合タンパク質。
  35. ａ）ｉ）遺伝子に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメイン、およびｉｉ）第１の二量体化ドメインを含む第１の融合タンパク質、ならびに
    ｂ）ｉ）配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む毒素由来デアミナーゼ（ＴＤＤ）であるシチジンデアミナーゼ阻害性ドメイン、およびｉｉ）第２の二量体化ドメインを含む第２の融合タンパク質
    を含む１対の融合タンパク質であって、
    第１および第２の二量体化ドメインが、二量体化阻害剤の非存在下で二量体化することができ、
    遺伝子が真核遺伝子であってもよく、真核遺伝子がヒト遺伝子あってもよい、１対の融合タンパク質。
  36. ＴＤＤが、配列番号４９、８１、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１３４、１４３、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含む、請求項３４または３５に記載の１対の融合タンパク質。
  37. 請求項３０～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、１種または複数の単離核酸分子。
  38. 請求項３７に記載の核酸分子を含む発現コンストラクト。
  39. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってもよい、請求項３８に記載の発現コンストラクトを含むウイルスベクター。
  40. 請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３７に記載の単離核酸分子、請求項３８に記載の発現コンストラクトまたは請求項３９に記載のウイルスベクターを含む細胞であって、真核細胞であってもよい細胞。
  41. 哺乳動物細胞であり、ヒト細胞であってもよく、さらに、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞であってもよい、請求項４０に記載の細胞。
  42. 細胞中の標的ゲノム領域においてシトシンをチミンに変える方法であって、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステムを細胞にデリバリーすることを含み、細胞が真核細胞であってもよい、方法。
  43. シトシンからチミンへの変更が標的ゲノム領域中に終止コドンを作出する、請求項４２に記載の方法。
  44. システムが１つより多いゲノム領域を標的にする、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 請求項１３および１５～２９のいずれか一項に記載のシステムならびに二量体化誘導剤をデリバリーすることを含み、前記薬剤が第１および第２の二量体化ドメインの二量体化を誘導し、それによって、二量体化したシチジンデアミナーゼ部分への阻害性ドメインの結合を活性化する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 請求項１４～２９のいずれか一項に記載のシステムおよび二量体化阻害剤をデリバリーすることを含み、前記薬剤が第１および第２の二量体化ドメインの二量体化を阻害し、それによって、二量体化したシチジンデアミナーゼ部分への阻害性ドメインの結合を防止する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 細胞がインビボのヒト細胞である、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 細胞がエキソビボのヒト細胞である、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。
  49. 請求項４８に記載の方法によって得られる、遺伝子操作細胞、適宜真核細胞、適宜ヒト細胞。
  50. 請求項４９に記載の遺伝子操作細胞を患者にデリバリーすることを含み、細胞および患者がヒトであってもよい、それを必要とする患者を治療する方法。
  51. それを必要とする患者を治療するのに使用するための、請求項４９に記載の遺伝子操作細胞。
  52. それを必要とする患者を治療するための医薬の製造のための、請求項４９に記載の遺伝子操作細胞の使用。
  53. 患者が、癌、自己免疫障害、常染色体優性疾患またはミトコンドリア障害を有する、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法、細胞または使用。
  54. 患者が、鎌状赤血球症、血友病、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、テイ・サックス病、プリオン病、色盲、リソソーム蓄積症、フリードライヒ失調症または前立腺癌を有する、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法、細胞または使用。
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