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JP2023541876A - 外膜小胞 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ナイセリアワクチン組成物（特に淋菌ワクチン組成物）及びかかる組成物の医薬における使用の分野に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子改変された淋菌FA1090株及びそこから得られる外膜小胞に関する。本発明はまた、本発明の遺伝子改変淋菌を作製する方法、並びに本発明の外膜小胞を含む免疫原性組成物及びワクチンを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子改変された淋菌(Neisseria gonorrhoeae)細菌及びそこから得られる外膜小胞に関する。外膜小胞は、免疫原性組成物及びワクチン、例えば、医薬に使用するためのワクチンにおいて特に有用である。
グラム陰性双球菌である淋菌は、性感染症(STI)である淋病を引き起こす偏性ヒト病原体である。淋菌疾患は、典型的には生殖管、直腸、咽頭又は眼の粘膜感染として現れる。
淋菌感染は、世界的に重大な健康問題であり、推定罹患率は世界中で年間1億600万例を超える(WHO、2018年)。淋病は米国で報告された2番目に多い伝染性疾患(CDC 2019)であり、その有病率は世界的に増加している。例えば、オーストラリアでの有病率は過去5年間で63%増加し(Kirby Institute. オーストラリアにおけるHIV、ウイルス性肝炎及び性感染症: 年次監視報告書 2017)、米国では2014年から2018年の間に63%増加した(CDC.性感染症監視 2018)。しかしながら、無症候性感染が一般的である(感染した女性の最大80%、感染した男性の40%)ため、淋菌の真の有病率は十分には解明されていない。
未処置のままであるか又は診断されていない淋菌感染は重篤な結果をもたらすことがある。このような結果には、子宮内膜炎、骨盤内炎症性疾患、泌尿生殖器膿瘍、有害な妊娠転帰、新生児合併症(失明を含む)及び不妊症が含まれる。さらに、淋菌による感染はヒト免疫不全ウイルス(HIV)の獲得と伝播のリスクを増加させる(Hayes R, Watson-Jones D, Celum C, van de Wijgert J, Wasserheit J. Treatment of sexually transmitted infections for HIV prevention: end of the road or new beginning? AIDS 2010年; 24巻: S15-26)。
淋菌の制御は主に抗生物質処置に基づいている。しかしながら、このアプローチは、抗菌薬耐性(AMR)の急速かつ継続的な出現によって損なわれる。淋菌は、以前は感染症の処置に成功していた多くの抗生物質に対して耐性を獲得している。これにより、セファロスポリン系は淋病処置の最後の防御ラインとして残された。しかしながら、拡大スペクトルセファロスポリン(すなわち、セフトリアキソン及びセフィキシム)に対する高レベルの耐性を有する菌株は、現在、世界中から単離されている(Unemo M, Jensen JS. Antimicrobial-resistant sexually transmitted infections: gonorrhoea and Mycoplasma genitalium. Nat Rev Urol 2017年; 14巻:139～152頁)。
主要な公衆衛生上の懸念としてのSTIの流行を終結させるための取り組みとして、WHOは最近、2030年までに淋菌の発生率を90%削減するという世界的な目標を掲げた世界的な健康戦略の草案を発表した(WHO, Global Health Sector Strategy on sexually transmitted infections, 2016-2021, 2017年12月20日)。淋菌(gonococcus)がAMRを発生させる能力があることを考えると、淋菌ワクチンが淋病の長期管理の鍵となる(Edwards JL, Jennings MP, Seib KL Neisseria gonorrhoeae vaccine development: hope on the horizon? Current Opinion in Infectious Diseases: 2018年6月 - 31巻 - 3号 - 246～-250頁)、(Gottlieb SL, Jerse AEら. Advancing vaccine development for gonorrhoea and the Global STI Vaccine Roadmap. Sex Health. 2019年;16巻(5号):426～432頁. doi:10.1071/SH19060)。
しかしながら、今日まで淋菌ワクチン開発は、臨床的防御を示す淋菌特異的ワクチン候補が存在しないことから困難であった。しかしながら、最近のレトロスペクティブ症例対照研究では、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)血清群Bに対する、外膜小胞(OMV)ワクチンMeNZBによるワクチン接種(すなわち交差防御)後、性健康クリニック患者(15～30歳)で淋病の発生率が減少したことが見出された。しかしながら、淋菌に対するMeNZBの有効性は比較的低かった(推定31%)(Petousis-Harris H, Paynter J, Morgan J,ら、Effectiveness of a Group B OMV meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand - a case control study. Lancet 2017年; 390巻:1603～1610頁)。
OMVは、グラム陰性菌、例えば髄膜炎菌及び淋菌から自然に放出される外膜成分の複雑な混合物である(Van Der Pol L, Stork M, Van Der Ley P. Outer membrane vesicles as platform vaccine technology. Biotechnol J 2015年; 10巻:1689～1706頁)。MeNZB OMVベースのワクチンの交差防御の観察は、OMVベースのワクチンアプローチが淋病から対象を防御するのに有効であり得るという証拠を初めて提供した。この点に関して、Liuらは、マイクロカプセル化インターロイキン-12+淋菌OMVを膣内接種することにより、淋菌感染に対する防御をマウスに付与することができる(Liu Y, Hammer LA, Liu Wら、Experimental vaccine induces Th1-driven immune responses and resistance to Neisseria gonorrhoeae infection in a murine model. Mucosal Immunol 2017年; 10巻:1594～1608頁)。しかしながら、淋菌OMVをワクチン候補として使用する他の試みは、決定的な結果をもたらさなかった。例えば、淋菌OMVベースのワクチン候補は、血清及び粘膜抗体の誘導に関して免疫原性であったが、マウスチャレンジ試験では失敗した(Freixeiroら、A genetically modified native outer membrane vesicle vaccine administered by a subcutaneous/intranasal route failed to accelerate clearance of gonococcus in a heterologous mouse challenge study. 21st International Pathogenic Neisseria Conference 9月23～28日, 2018年, Oral Poster Presentation Abstract OP174)。
効果的な淋病ワクチンの必要性は依然として残っている。本出願の発明者らは、驚くことに、特にバックグラウンド菌株であるFA1090において産生された遺伝子改変された淋菌が、ワクチン株としてのその有用性に関して改良された特性を有する淋菌を生じさせることを発見した。特に、遺伝子改変された淋菌は、a)液体培養中で増殖可能であり、b)同じ遺伝子改変を有する他の淋菌株と比較して、生産的なレベルのOMVを産生した。さらに、上記遺伝子改変されたFA1090淋菌は、OMVをブレブ形成し、免疫原性、例えば顕著な交差殺菌抗体価を誘導する能力が改善された。これ自体、驚くべきことであった。ゲノム分析を考慮して、FA1090株の淋菌は、4000以上の比較対照淋菌のゲノムと比較してゲノム学的に多様(すなわち末梢)であることが示唆されたことは、特に驚くべきことであった。
本出願の発明者らは、遺伝子改変された淋菌を生成することによって、特にバックグラウンド菌株であるFA1090において、それらが驚くべき特性を有するワクチン菌株を作製することができることを発見した。特に、本発明者らは、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌が、液体培養物中に移入することができ、同じ遺伝子改変を有する他の淋菌株と比較して生産的なレベルのOMVを産生することができることを見出した。さらに、上記遺伝子改変されたFA1090淋菌からブレブ形成されたOMVは高度に免疫原性であり、有意な交差殺菌抗体力価を誘導した。この前臨床データを考慮すると、本明細書に開示される外膜小胞に基づくワクチンは、ヒトにおける淋菌感染及び疾患の予防における臨床的有効性を示すことができる。
したがって、第1の一態様では、以下の遺伝子改変:
a) リピドA生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼ(lpxl1)遺伝子、mRNA、及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b) 還元改変可能タンパク質(rmp)遺伝子、mRNA、及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌が提供される。
さらなる一態様では、淋菌細菌を作製する方法が提供され、該方法は、
a) 淋菌FA1090細菌中のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌由来のrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製することか、あるいは
b) 第1の淋菌FA1090細菌由来のrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌由来のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製すること、
のいずれかを含む。
さらなる一態様では、外膜小胞の産生における淋菌細菌の使用が提供される。
さらなる一態様では、FA1090株淋菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供され、上記外膜小胞は、lpxl1とrmpポリペプチドの両方の減少したレベル又は検出不可能なレベルのいずれかを含む。
さらなる一態様では、遺伝子改変されたFA1090株淋菌由来の外膜小胞(OMV)が提供され、上記遺伝子改変されたFA1090株淋菌は、a)lpxl1遺伝子、lpxl1 mRNA、及び/又はLpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子、rmp mRNA、及び/又はRmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含み、上記OMVは、i)上記遺伝子改変を欠く淋菌FA1090株由来の比較対照OMV中のRmpポリペプチドのレベルと比較して減少したレベルのRmpポリペプチドを含み、及びii)比較対照OMVからのヘキサアシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサアシル化リピドAを含む。
さらなる一態様では、本発明の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供される。
さらなる一態様では、本発明の外膜小胞を含む免疫原性組成物が提供される。
さらなる一態様では、本発明の外膜小胞又は本発明の免疫原性組成物のいずれか、及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチンが提供される。
さらなる一態様では、医薬に使用するための本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンが提供される。
さらなる一態様では、ナイセリア(Neisseria)感染、例えば淋菌感染に対する対象の免疫化に使用するための、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンが提供される。
さらなる一態様では、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンは、ナイセリア、例えば淋菌により引き起こされる疾患の処置又は予防に使用するために提供される。
さらなる一態様では、それを必要とする対象におけるナイセリア(例えば、淋菌)によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための方法が提供され、上記方法は、上記対象に治療有効量の本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンを投与することを含む。
さらなる一態様では、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンを対象に投与することを含む、それを必要とする対象をナイセリア(例えば、淋菌)に対して免疫化する方法が提供される。
さらなる一態様では、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンを対象に投与することを含む、対象における免疫応答を上昇させる方法が提供される。
さらなる一態様では、ナイセリアによって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンの使用が提供される。
さらなる一態様では、淋菌によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンの使用が提供される。
さらなる一態様では、少なくとも2用量の組成物が対象に投与される、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供される。
さらなる一態様では、対象が青年及び/又は成人である、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供される。
さらなる一態様では、対象が、一般集団における平均リスクと比較して、淋菌による感染のリスクが増加している、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供される。
さらなる一態様では、対象が1種以上のさらなる感染性因子に対して同時免疫される、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供される。
さらなる一態様では、上記免疫原性組成物又はワクチンが、筋肉内又は腹腔内の投与経路を介して投与される、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供される。
ゲノム分析(実施例1に記載)のために考慮される淋菌分離株の原産国別の頻度(*=頻度<0.5%)を示す図である。4058個の淋菌全ゲノムが分析に利用可能であった。 淋菌ゲノムのコア及びノンコア一塩基多型(SNPs)系統発生を示す図であり、内部コレクション(四角記号でマークされた)に存在する菌株のゲノムが含まれる。枝の長さは遺伝的距離に比例する。6つのコンパクトなクラスターが同定され、黒い矢印で強調されている。 4058個の淋菌ゲノム系統発生的再構成及び集団構造を示す図であり、内部コレクション(NM_cgMLST_v1.0スキーマ)の菌株を含む。4058個の菌株について、全ゲノムのタイピングによって規定されたプロファイルをクラスター形成する。 シルエットパラメータ最適化を用いて淋菌集団のパーティション（隔て）の最適数を決定した図である。全ゲノム変動性から、分離群は24の異なるクラスターに分類されることが示される。 全ゲノム分析に基づいて、各菌株の他の菌株に対する平均距離として定義される中心性を示す図である。NM_cgMLST_v1.0の1605個の遺伝子座の対立遺伝子変異に基づく各菌株の他の全ての株からの系統発生平均距離(「中心性」)。 図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃは、突然変異体生成のための対照の概略図を示す図である。二重相同組換えの発生及び突然変異クローンの生成を確認するために、欠失領域の外側にある一対のプライマーを図示されるように設計した(図6A)。全突然変異体集団中に混合された野生型細胞の存在(図6C)を、野生型ゲノムに特異的に対合するが突然変異体には対合しないプライマーを用いて調べた(図6B)。 FA1090Δlpxl1クローンのPCR外部チェックのアガロースゲルを示す図である。PCRは組換え事象の外部のプライマーを用いて行い、PCR産物を1%アガロースゲル中で電気泳動により分離した。PCR反応の陰性対照として水を用いた。マーカーとして1kb+ラダーを用いた。矢印はノックアウト(KO)突然変異体及び野生型(WT)株の予想バンドを示す。 FA1090ΔlpxL1クローンのPCR内部チェックのアガロースゲルを示す図である。PCRは野生型集団に特異的なプライマーを用いて行い、PCR産物を1%アガロースゲル中で電気泳動により分離した。バンドの存在は、集団中の残存野生型細胞の存在と相関する。PCR反応の陰性対照として水を用いた。マーカーとして1kb+ラダーを用いた。 MALDI-TOFを用いて参照バッチFA1090から精製されたリピドAの構造及びその質量分析スペクトルを示す図である。記録されたスペクトルは非改変のヘキサアシル化リピドAを示す:MPLA型に対応する最高ピーク、BPLA型に対応する第2ピーク。リピドのMALDI-TOFプロファイル。 図９Ａ－１の続き。 遺伝子改変されたFA1090Δlpxl1から精製されたペンタ-アシル化形態に対応するリピドAの構造、及びMALDI-TOFを用いたそれらの質量分析スペクトルを示す図である。図9Aからのスペクトルと比較した場合、対応するピーク(MPLA及びBPLA)の各々の間の質量差は、ラウリン酸鎖の質量である182Daである。未同定の脂質に対応するm/z 1572のシグナルが両方のスペクトルに存在する。 図９Ｂ－１の続き。 FA1090Δlpxl1,ΔrmpクローンのPCR外部チェックのアガロースゲルを示す図である。PCRは組換え事象の外部のプライマーを用いて行い、PCR産物を1%アガロースゲル中で電気泳動により分離した。PCR反応の陽性対照として、及び突然変異体クローンとの比較として、野生型株のDNA溶解物とゲノムDNA(gDNA)の両方を用いた。PCR反応の陰性対照として水を用いた。マーカーとして1kb+ラダーを用いた。矢印はノックアウト(KO)突然変異体及び野生型(WT)株の予想バンドを示す。 FA1090ΔlpxL1ΔrmpクローンのPCR内部チェックのアガロースゲルを示す図である。PCRは、元の集団に特異的なプライマー(この場合、2KO突然変異体が生成された細胞、FA1090ΔlpxL1)を用いて行い、PCR産物を1%アガロースゲルにおける電気泳動によって分離した。バンドの存在は、集団中の残存する元の細胞の存在と相関する。マーカーとして1kb+ラダーを用いた。 非改変FA1090分離株から抽出したlpxL1の遺伝子座を示す図である。 FA1090Δlpxl1,Δrmp株から抽出したlpxL1の遺伝子座を示す図である。 図１３－１の続き。 非改変FA1090分離株から抽出したrmpの遺伝子座を示す図である。 FA1090Δlpxl1,Δrmp株から抽出したrmpの遺伝子座を示す図である。 野生型FA1090、Δlpxl1 FA1090(1KO)及びΔLpxl1,Δrmp(2KO)FA1090からブレブ形成されたOMVのSDS-PAGEパターンを示す図である。約28kDaの見かけの分子量で移動したバンドのタンパク質含量を同定した。 互いに対する各菌株の平均距離として定義される中心性を示す図である。59個のタンパク質座位のスキーマ対立遺伝子変異に基づく、各菌株の他の全ての菌株からの系統発生学的平均距離(「中心性」)。 WT及び突然変異体FA1090由来のOMVによるTLR4の活性化を示す図である。HEK293-NF-kBluc/hTLR4細胞を、FA1090Δlpxl1(又は1KO)突然変異体(#GMMA2)及びFA1090Δlpxl1,Δrmp(又は2KO)突然変異体(#GMMA3)から調製した野生型(WT)FA1090又はOMVからのOMVの異なる濃度(ベースのタンパク質)にてインビトロで刺激した。次に、細胞を溶解し、TLR4媒介NF-kB活性化を、ルシフェラーゼ誘導をルミネセンスで測定することにより定量化した。細胞活性化は、培地処理細胞上での誘導倍数として表される。 2つの試験した培地調製物における6つの二重突然変異淋菌(Δlpxl1,Δrmp)の増殖プロファイルを示す図である。増殖を16時間にわたってモニターし、600nmで測定した光学濃度(OD)に基づいて測定した。 図１９－１の続き。 図１９－１の続き。 OMV体積生産性は、2つの増殖培地中の6つの2KO淋菌(Δlpxl1,Δrmp)について示されている。各試料について、色素添加有り及び無しで蛍光を記録し、色素無しの上清のバックグラウンド蛍光を色素処理試料値から差し引いた。培地のみのブランクも減算した。培養上清中のOMV濃度(mg/L)を標準曲線からの値外挿により評価した。データは、各菌株及び増殖条件について、2つの生物学的複製の平均として報告される。 図20Aからの結果は、600nm波長(OD600nm)で異なる光学密度に標準化され、各条件において各菌株によって到達し、特定の生産性を比較した図である。 二重突然変異体FA1090(Δlpxl1,Δrmp)と二重突然変異体F62(Δlpxl1,Δrmp)の両方からブレブ形成されたOMV(その中ではGMMAと呼ばれる)の免疫原性を示す図である。7週齢のCD1雌マウスに、FA1090 2KO又はF62 2KOからAlum中で製剤化したOMV又はAlum単独を4週間の間隔で2回IP免疫化した。機能的抗体は、補体源としてヒト血清を用いて、2回目の免疫化の2週間後に採取した血清中の指示株に対するhSBAにより測定した。 図２１－１の続き。 図２１－１の続き。 FA1090(図22A)、SK920679(図22B)及びWHO-M(図22C)株についての細菌付着阻害(BAI)の結果は、2つの別々の実験において、FA1090二重突然変異体(図中「dd」と標識されたΔlpxl1,Δrmp)から得られたOMV(その中でGMMAと称する)で4週間の間隔で2回IP免疫化された7週齢CD1雌マウス由来の血清の希釈物について示されている図である。OMVをAlum中で製剤化し、Alumのみの対照も陰性対照として試験した。機能的抗体は、指示された菌株(FA1090(図22A)、SK92-679(図22B)及びWHO-M(図22C))を用いてBAIにより測定した。「dd」=デルタ、すなわちFA1090ΔΔ(二重突然変異体Δlpxl1,Δrmpを参照する)。 FA1090(図22A)、SK920679(図22B)及びWHO-M(図22C)株についての細菌付着阻害(BAI)の結果は、2つの別々の実験において、FA1090二重突然変異体(図中「dd」と標識されたΔlpxl1,Δrmp)から得られたOMV(その中でGMMAと称する)で4週間の間隔で2回IP免疫化された7週齢CD1雌マウス由来の血清の希釈物について示されている図である。OMVをAlum中で製剤化し、Alumのみの対照も陰性対照として試験した。機能的抗体は、指示された菌株(FA1090(図22A)、SK92-679(図22B)及びWHO-M(図22C))を用いてBAIにより測定した。「dd」=デルタ、すなわちFA1090ΔΔ(二重突然変異体Δlpxl1,Δrmpを参照する)。 FA1090(図22A)、SK920679(図22B)及びWHO-M(図22C)株についての細菌付着阻害(BAI)の結果は、2つの別々の実験において、FA1090二重突然変異体(図中「dd」と標識されたΔlpxl1,Δrmp)から得られたOMV(その中でGMMAと称する)で4週間の間隔で2回IP免疫化された7週齢CD1雌マウス由来の血清の希釈物について示されている図である。OMVをAlum中で製剤化し、Alumのみの対照も陰性対照として試験した。機能的抗体は、指示された菌株(FA1090(図22A)、SK92-679(図22B)及びWHO-M(図22C))を用いてBAIにより測定した。「dd」=デルタ、すなわちFA1090ΔΔ(二重突然変異体Δlpxl1,Δrmpを参照する)。 FA1090Δlpxl1,Δrmp(2KO)由来のOMV(その中ではGMMAと呼ばれる)は、抗rmp抗体を誘導しないことを示す図である。7週齢のCD1雌マウスを、Alum中に製剤化したFA1090Δlpxl1(単一突然変異体)又はFA1090Δlpxl1,Δrmp(二重突然変異体)由来のOMVで4週間の間隔で2回IP免疫化し、2回目の免疫化抗rmp IgGの2週間後に、Luminexベースの免疫アッセイでプール血清において測定した。 Alum、Bexsero、又は7 FA1090 2KO OMVワクチンロット(TRD4-TRD10)で免疫化したCD1マウス由来のプールされた4wp2及び2wp3血清におけるFA1090相同株に対して測定されたhSBA力価を示す図である。バーは2つの独立した実験の平均力価を表す。ドットは1滴定量を表す。 個々のhSBA力価を、Alum、Bexsero、又はFA1090 2KO OMVワクチンロットTRD4、TRD 5、及びTRD9で免疫化したCD1マウス由来の個々の血清上の指示淋菌株に対して測定した図を示す。データをGMT(95%CI)とともに報告する。 図２５Ａ－１の続き。 図２５Ａ－１の続き。 95%CIであるhSBA GMRは、FA1090 2KO OMVワクチンロットTRD4、TRD 5及びTRD9について、Alum(図25B)及びBexsero(図25C)と比較して、試験した11菌株のうち少なくとも菌9株について力価の優越性を明らかにした図である。 図２５Ｂ－１の続き。 図２５Ｂ－１の続き。 95%CIであるhSBA GMRは、FA1090 2KO OMVワクチンロットTRD4、TRD 5及びTRD9について、Alum(図25B)及びBexsero(図25C)と比較して、試験した11菌株のうち少なくとも菌9株について力価の優越性を明らかにした図である。 図２５Ｃ－１の続き。 図２５Ｃ－１の続き。 抗OMV IgGを、示されるように免疫化されたマウスのプールされた群からの血清中のLuminexにより測定した。全7つのFA109 2KO OMVワクチンロットのIgG力価及びBexsero力価を報告する。点線は定量下限値のLLOQ=329を示す。 抗OMV IgGを、示されるように免疫化された個々のマウス由来の血清中のLuminexにより測定された。個々の力価及び95%CIのGMTを報告する。 抗OMV IgGは、示されるように免疫化された個々のマウス由来の血清中のLuminexによって測定された。異なるFA1090 2KO OMVロットの力価及びBexsero力価の上限及び下限95% CIのGMRを報告する。 抗OMV IgGは、示されるように免疫化された個々のマウス由来の膣洗浄物中でLuminexによって測定された。個々の力価及び95%CIのGMTを報告する。 抗OMV IgGは、示されるように免疫化された個々のマウス由来の膣洗浄液中でLuminexによって測定された。異なるFA1090 2KO OMVワクチンロットの力価及びBexsero力価又はAlum力価の上限及び下限95% CIのGMRを報告する。 抗OMV IgAは、示されるように免疫化された個々のマウス由来の膣洗浄物中でLuminexによって測定された。個々の力価及び95%CIのGMTを報告する。 抗OMV IgAは、示されるように免疫化された個々のマウス由来の膣洗浄液中でLuminexによって測定された。異なるFA1090 2KO OMVワクチンロットの力価及びBexsero力価又はAlum力価の上限及び下限95%CIのGMRを報告する。 淋菌における包括的PorB系統発生を示す図である。 細胞外ループ(1～8)同定及び多様性を伴うFA1090 2KO及びGC_0817560 PorBアラインメントを示す図である。 図３１－１の続き。 異なる菌株において相変数ON opaB遺伝子配列を提示する細菌の割合を示す図である。1つの(FA1090 WT及びGC_0817560株)又は複数の(FA1090 2KO及び他の菌株)試料において、相ONであることが予測される細菌のパーセンテージを報告する。
用語
本開示の様々な実施形態のレビューを容易にするために、用語の以下の説明を提供する。追加の用語及び説明は、本開示の文脈において提供される。
本明細書に別段の説明又は定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、分子生物学における共通用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrewら(eds.), The Encyclopaedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994年 (ISBN 0-632-02182-9)、及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995年 (ISBN 1-56081-569-8)に記載される。
本特許明細書内に引用される特許及び/又は特許出願の公開を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、イタリック体でフォーマットされた遺伝子識別子は、その遺伝子又はmRNAを指す(例えば、lpxl1はlpxl1遺伝子を指す)。本明細書で使用される場合、イタリック化されていない遺伝子識別子は、タンパク質又はポリペプチドを指す(例えば、lpxl1はlpxl1タンパク質を指す)。本明細書で使用される「lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチド」とは、「lpxl1遺伝子mRNA及び/又はlpxl1ポリペプチド」を指す。本明細書で使用される場合、「rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチド」は、「lpxl1遺伝子mRNA及び/又はrmpポリペプチド」を指す。WTという略語は「野生型」に対応する。
「リポオリゴ糖」(又はLOS)への言及は、「リポ多糖」(又はLPS)とも呼ばれ得る。
アミノ酸は、アラニン(ala、A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リシン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、スレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、バリン(val、V)からなる群から選択されるアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類及び非霊長類哺乳動物、例えばげっ歯類属(限定されないが、マウス及びラットを含む)、テンジクネズミ(Cavia)属(限定されないが、モルモットを含む)、並びにラゴモルファ目のメンバー(限定されないが、ウサギを含む)である。本明細書で使用される場合、対象は、最も好ましくはヒトである。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」とは、抗原に応答して、分子レベル、細胞レベル又は組織レベル(すなわち、生物学的組織の任意のレベルの)で生じる一連の事象を意味する。本開示の文脈において、「免疫応答」は、抗原(例えば、細菌、ウイルス、真菌などの表面上の抗原)に応答して、又はOMVの表面上に存在する抗原若しくは免疫原性断片、免疫原性組成物若しくはワクチンの形態の抗原に応答して生じる、一連の細胞性(細胞媒介性)及び/又は体液性(抗体媒介性)事象であり得る。本明細書で使用される場合、「免疫原性」とは、免疫応答を誘発する抗原の能力を意味する。
本明細書で使用される場合、「アジュバント」とは、抗原又は複数の抗原とともに、例えば免疫原性組成物又はワクチンの一部として対象に投与された場合、(アジュバントの不存在下で得られる免疫応答と比較して)投与された抗原又は複数の抗原に対する対象の免疫応答を増加又は増強する化合物又は物質(又は化合物と物質の組み合わせ)を意味する。本開示に関して、外膜小胞とともに対象に投与されるアジュバントは、OMVの表面に存在する抗原又は複数の抗原に対する対象の免疫応答を増加又は増強する。
本明細書で使用される場合、ナイセリア(特に淋菌)によって引き起こされる感染、疾患又は状態の文脈において「防御する」という用語は、予防を介して防御することを意味する。防御は、例えば、ナイセリアによって引き起こされる感染症、疾患又は状態(症候性及び無症候性の状態)の発生率の減少を指し、ナイセリアによって引き起こされる疾患の制御、及び/又はそれによって引き起こされる関連するリプロダクティブ・ヘルスの有害転帰の制御をもたらす。防御は、来院回数の減少をもたらすことができる。本明細書において、用語「防御する」(又は防御)は、急性疾患(子宮頸管炎及び尿道炎)の予防、抗菌薬耐性の影響の減少、淋菌関連HIV獲得、及び上記感染の結果として生じる長期間の生殖合併症に関して、ナイセリアによる一次感染に対する防御について使用することができる。様々な解剖学的部位(泌尿生殖器、肛門直腸、口腔咽頭)で淋菌感染症を引き起こす疾患に対して防御が達成されることがある。本明細書で使用される場合、「予防する」(又は予防)という用語は、防御の増加の結果として、淋菌によって引き起こされる疾患又は状態が実質的に回避され、結果として、集団の健康転帰が改善されることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」(又は処置)とは、ナイセリア(特に淋菌)によって引き起こされる感染、疾患又は状態の文脈において、感染後、症状、作用又は表現型を引き起こす任意の淋菌を投与を介して処置することを意味する。処置とは、対象における状態若しくは疾患の症状の重症度又は頻度を低下させ、状態の進行を遅延又は排除し、及び/又は対象における疾患若しくは状態の症状を全体的又は部分的に排除することを意味し得る。淋菌によって引き起こされる感染症、疾患又は状態の処置には、ヒトにおいて淋菌によって引き起こされる症状、作用又は表現型の改善、安定化、減少又は排除が含まれる。また、淋菌によって引き起こされる感染症、疾患又は状態の処置には、細菌を除去し、又は死滅させることが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子改変(複数可)」とは、特定の効果(例えば、発現の低下又は消失)を提供するための、細胞における遺伝物質の構成、構造又は操作に対する任意の変更を意味する。当業者は、改変されていない(例えば、天然に存在する細菌)又は目的の野生型遺伝子を含む細菌のものと比較して、遺伝子及び/又はタンパク質の発現を低下又は消失させるための多数の手段を知っている。細胞内の遺伝物質は、DNA又はRNAのいずれかに関する。したがって、本明細書で使用される遺伝子改変という用語は、特定の遺伝子の発現及び/又は機能を低下及び/又は消失させるような淋菌DNA又はRNAのいずれかの構成、構造又は作用に対する任意の人為的変更を意味する。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変された」とは、淋菌細菌に関して、その遺伝物質を人為的に変更した淋菌を指す。遺伝子改変された淋菌には野生型淋菌は含まれない。遺伝子改変された淋菌細菌は、例えば、外因性ポリヌクレオチドが導入された淋菌細菌を含む。遺伝子改変された淋菌細菌はまた、内因性ヌクレオチドが、突然変異、例えば、欠失、挿入、置換又はそれらの組み合わせを含むように変更されているように遺伝子操作された細菌を指す。例えば、内因性コード領域及び/又は非コード領域は、欠失又は置換され得る。このような遺伝子改変は、ポリペプチドの枯渇及び/若しくは消失発現をもたらすか、及び/又は内因性ポリヌクレオチドによりコードされたものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを生じ得る。遺伝子改変された淋菌細菌の別の例は、作動可能に連結された内因性コード領域の発現の増加又は低下をもたらす変更された調節配列、例えばプロモーターを有するものである。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子欠失」又は「遺伝子ノックアウト」とは、特定の遺伝子を作動不能又は不活性にする可能性を有する遺伝子技術の組み合わせを指す。一部の実施態様では、遺伝子欠失は、遺伝子からのポリペプチドの発現を低下させるか又は消失させる。一部の実施形態では、mRNAとタンパク質の両方が低減又は除去される。ある実施形態では、遺伝子の発現は、実質的に低下又は消失される。実質的に低下するとは、遺伝子の発現の内因性レベルと比較した場合、遺伝子の発現が少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも98%減少することを意味する。ある実施形態では、遺伝子の発現は消失される。消失とは、遺伝子から転写されたmRNAの発現、又は特定のmRNAから翻訳されたタンパク質の発現をモニタリングする技術を使用して、検出のレベルが観察されないことを意味する。遺伝子の発現は、適切な技術によって(例えば、RT/Q-PCRにより転写物レベル、又は免疫アッセイ、例えばウエスタンブロットにより発現されたタンパク質レベルを測定することによって)決定することができる。このような技術は当業者に公知である。遺伝子欠失又は遺伝子ノックアウトは、遺伝的要素の欠失のみならず、遺伝子が作動不能又は不活性であるような付加、置換又は改変を含み得、すなわち、遺伝子配列の挿入が、例えば、早期終止コドンを組み込むことにより、又はミスセンス翻訳を引き起こすことにより、遺伝子の誤翻訳を引き起こすことがある。例えば、遺伝子は、例えば相同組換えによって、異なる異種遺伝子(例えば抗生物質耐性遺伝子)で、遺伝子又は上記遺伝子の断片を置換することによって欠失させることができる。
本明細書で使用される場合、「Δ」なる記号は、本明細書では、「遺伝子欠失」又は「遺伝子ノックアウト」の定義に沿って、Δ記号の後に列挙された遺伝子の配列が欠失/ノックアウトされた細菌株を指すために使用される。
本明細書で使用される場合、用語「外膜小胞」又は「OMV」は、グラム陰性菌の外膜の破壊又はブレブ形成によって得られ、外膜から抗原を保持する小胞を形成するプロテオリポソーム小胞に関する。グラム陰性菌は自然にOMVを排出し、増殖培地に放出される。異種抗原は、グラム陰性菌で発現され、その結果、膜に集合し、次に培養上清に放出される。このような細菌由来のOMVは、外膜及びペリプラズムの細菌コンパートメントを代表し、その天然の組成及び構造における膜タンパク質の提示を可能にする。最も広い意味で、OMVは、任意のこのようなプロテオリポソーム小胞に関連する。しかしながら、用語OMVには、「天然OMV」(nOMV)、マイクロベシクル(MV)、界面活性剤抽出されたOMV(DOMV)、及びMVとして放出される前に細菌に付着したままである外膜突起であるブレブが含まれる。これらの全ては本発明の一部を構成し、特に明記しない限り、本明細書ではOMVと総称される。本発明の好ましい一実施形態では、OMVはnOMVである。本明細書で使用される場合、用語外膜小胞又はOMVは、GMMAとも呼ばれることがある。
本明細書で使用される場合、用語「同質遺伝子性（isogenic）」は、実質的に同一であるゲノムを有する2つの個々の生物を指す。一実施形態では、同質遺伝子は、同一のゲノムを有する2つの個々の生物を意味する。本開示の文脈において、2つの生物は、特定の遺伝子改変を除き、同質遺伝子性であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「異種遺伝子配列」とは、参照生物に関して天然に存在しないヌクレオチド配列(例えば、遺伝子配列又は遺伝子配列の一部)を指す。本発明の文脈において、異種遺伝子配列は、淋菌FA1090株のゲノム内に天然に存在しない配列を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ゲノム組換え」とは、2つのポリヌクレオチド間の遺伝情報を交換するプロセスを指す。遺伝子欠失/ノックアウトの目的では、相同組換えは、所望のノックアウト遺伝子の代わりに抗生物質耐性マーカーを含有するDNA構築物を作製することを伴う。構築物はまた、標的配列と相同性を有する遺伝子配列を含む。このアプローチは、DNA構築物を既存のDNAに組み換えるための細胞修復機構に依存する。これは、内因性遺伝子の配列の変更をもたらす。
本明細書で使用される場合、用語「免疫原性組成物」は、特異的免疫応答、例えば病原体、例えばナイセリアに対する特異的免疫応答を誘導することができる、ヒト又は動物対象への投与(例えば、実験的又は臨床的状況で)に適した物質の組成物に関する。このように、免疫原性組成物は、1種以上の抗原(例えば、ポリペプチド抗原)又は抗原性エピトープを含む。免疫原性組成物はまた、免疫応答を誘発又は増強することができる1種以上のさらなる成分、例えば賦形剤、担体及び/又はアジュバントを含むことができる。ある場合には、免疫原性組成物を投与して、病原体によって誘導される症状又は状態から対象を完全に又は部分的に防御する免疫応答を誘発する。本開示の文脈において、用語「免疫原性組成物」は、ナイセリアに対する曝露前の防御免疫応答又はナイセリアに対する曝露後の緩和免疫応答を誘導する目的で、対象又は対象の集団に投与することを意図した組成物を包含することが理解される。
「免疫学的に有効な量」とは、その量の個体への投与が、単回用量又は一連の一部として、処置、防御又は予防に有効であることを意味する。免疫学的に有効な量の投与は、防御免疫応答を含む免疫応答を誘発する。この量は、処置される個体の健康状態及び身体状態、年齢、処置される個体の分類学的グループ(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、個体の免疫系による抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの製剤化、処置医による医学的状況の評価、及び他の関連する因子に依存して変化し得る。量は比較的広い範囲になることが予想される。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」とは、参照物質が対象(例えば、ヒト又は動物対象)への投与に適していることを意味する。Remington's Pharmaceutical Science, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition 25 (1975)は、免疫原性組成物を含む治療用及び/又は予防用組成物の医薬送達に適した組成物及び製剤(希釈剤を含む)を記載する。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、免疫グロブリン様ドメイン(例えば、IgG、IgM、IgA、IgD又はIgE)を有する分子を指し、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト、ヒト化、多特異的抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体、単一可変ドメイン(例えば、VH、VHH、VL、ドメイン抗体(dAb(商標)))、抗原結合抗体断片、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合したFv、一本鎖Fv、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ、TANDABS(商標)など、並びに上記のいずれかの改変されたバージョンが含まれる(代替の「抗体」フォーマットの概要については、[Holliger P, Hudson PJ. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol. 2005;23(9):1126-36]を参照されたい)。代替の抗体フォーマットは、抗原結合タンパク質の1種以上のCDRが、適切な非免疫グロブリンタンパク質足場又は骨格上に整列され得る代替の足場を含み、例えば、アフィボディ、SpA足場、LDL受容体クラスAドメイン、アビマー又はEGFドメインが含まれる。
「配列同一性」は、MPSRCHプログラム(Oxford Molecular)に実装されるSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定され、パラメータであるギャップオープンペナルティ=12及びギャップ伸長ペナルティ=1を用いたアフィンギャップ検索パラメータを使用するが、好ましくは、デフォルトパラメータ(例えば、ギャップオープンペナルティ=10.0、ギャップ伸長ペナルティ=0.5であり、EBLOSUM62スコアリングマトリックスを用いる)を用いるNeedleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム(例えば、Rubin (2000) Pediatric. Clin. North Am. 47:269-285を参照されたい)によって決定される。このアルゴリズムは、EMBOSSパッケージ内のニードルツール内で便利に行われる。本出願が特定の配列番号と配列同一性について言及する場合、その同一性は、その配列番号の全長にわたって計算されることが意図される。
淋菌
第1の態様では、本発明は、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌を提供し、
a)リピドA生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼ(lpxl1)遺伝子、mRNA、及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b)還元改変可能タンパク質(rmp)遺伝子、mRNA、及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、次に、遺伝子改変(複数可)が導入される出発生物は、FA1090株の実質的に又は完全に改変されていない淋菌細菌である。したがって、本発明は、遺伝子改変された淋菌細菌を提供し、
a) lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b) rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含み、非改変淋菌細菌はFA1090株淋菌細菌である。
一実施形態では、次に、本発明の遺伝子改変(複数可)が導入される出発生物は、そのlpxl1及び/又はrmp遺伝子に対する遺伝子改変(複数可)を含まないFA1090株の淋菌細菌である。したがって、本発明は、遺伝子改変された淋菌細菌を提供し、
a) lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b) rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含み、改変されていない淋菌細菌は、野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含むFA1090株淋菌細菌である。
一実施形態では、少なくとも:上記改変を欠く淋菌FA1090株における機能的Lpxl1及び機能的Rmpと比較して、リピドA生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼ(Lpxl1)の総活性を低下させ、機能的還元改変可能タンパク質(Rmp)を低下させる改変を含む淋菌FA1090株が提供される。
FA1090株の淋菌は当該技術分野において公知である。淋菌のFA1090株(ポリン血清型PIB-3株)は、元々、播種性淋菌感染が疑われる患者の子宮頸部から単離された[Nachamkin I, Cannon JG, Mittler RS. Infect Immun. 1981 May; 32(2):641-8]。FA1090淋菌は、American Type Culture Collection (ATCC、例えば、寄託番号#700825, 1081 University Blvd、Manassas、Virginia 20110、US)から市販されており、FA1090ゲノム配列は、GenBank (アクセッションID: AE004969.1)から公に利用可能である。
当該技術分野において、FA1090株は、自然変異のために、わずかに(例えば、異なる実験室間で)異なる場合があることは理解されるが、当業者は、与えられた淋菌がFA1090株であるかどうかを決定する方法を知っている。例えば、当業者は、淋菌ゲノムを配列決定し(例えば、実施例9に記載される方法を使用する)、ゲノムを公知のFA1090株のゲノム、例えば、GenBankアクセッションID:AE004969.1に示されるFA1090のゲノムとアラインメントさせる方法を知っている。上記のアラインメントは、当業者に、GenBankアクセッションID:AE004969.1に示されるゲノムと比較した配列同一性のレベルを提供する。配列同一性の上記レベルが95%超、97%超又は99%超である場合、当業者は、上記淋菌がFA1090株淋菌であると推定することができる。
一実施形態では、遺伝子改変(複数可)が導入されるFA1090淋菌は、GenBankアクセッション:AE004969.1(2015年7月1日付け)に示されるように、FA1090淋菌ゲノムと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%同一である淋菌である。一実施形態では、[Lee I, Ouk Kim Y, Park SC, Chun J. OrthoANI: An improved algorithm and software for calculating average nucleotide identity. Int J Syst Evol Microbiol. 2016;66(2):1100-1103]に記載されるOrthoANIアルゴリズムを用いて計算した場合、GenBankアクセッション: AE004969.1 (2015年7月1日付け)に示されるように、遺伝子改変(複数可)が導入されるFA1090淋菌は、FA1090淋菌ゲノムと99.97%同一である淋菌である。一実施形態では、非改変淋菌細菌は、GenBank アクセッション: AE004969.1 (2015年7月1日付け)に記載されるように、FA1090淋菌ゲノムと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるFA1090淋菌細菌である。一実施形態では、非改変淋菌細菌は、[Lee I, Ouk Kim Y, Park SC, Chun J. OrthoANI: An improved algorithm and software for calculating average nucleotide identity. Int J Syst Evol Microbiol. 2016;66(2):1100-1103]に記載されるOrthoANIアルゴリズムを用いて計算した場合、GenBank アクセッション: AE004969.1 (2015年7月1日付け)に示されるように、FA1090淋菌ゲノムと99.97%同一であるFA1090株淋菌細菌である。
一実施形態では、遺伝子改変(複数可)が導入されるFA1090淋菌(すなわち、非改変淋菌細菌)は、配列番号1及び配列番号3と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%の同一性を有する配列を含むFA1090株淋菌である。上記実施形態では、配列番号1及び配列番号3と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%の同一性を有する配列を含むFA1090淋菌は、機能的Lpxl1及びRmpタンパク質を保持する。一実施形態では、遺伝子改変(複数可)が導入されるFA1090淋菌(すなわち、非改変淋菌細菌)は、配列番号1及び配列番号3を含むFA1090株淋菌である。
一実施形態では、本発明は、さらに、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌を提供し、
a) lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b) rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変を(複数可)含み、発現及び/又は機能の低下又は消失は、野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含むFA1090株の淋菌細菌との比較においてである。
一実施形態では、野生型lpxl1及びrmpを含むFA1090株の淋菌細菌は、非改変FA1090株淋菌である。このような菌株の例は、ATCC(#700825)から入手可能なFA1090株淋菌であり得る。
一実施形態では、lpxl1遺伝子は、配列番号3に示される配列と少なくとも80%同一である配列を含み、rmp遺伝子は、配列番号1に示される配列と少なくとも80%同一である配列を含む。
一実施形態では、lpxl1遺伝子は、配列番号3に示される配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である配列を含む。Lpxl1遺伝子(msbBとも呼ばれる)は、ポリペプチドであるリピドA生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼ(Lpxl1)をコードする。Lpxl1はリピドA生合成において役割を果たす。減少したか又は検出することができない機能的lpxl1をコードするタンパク質を提供するように遺伝子改変されたナイセリア生物は、エンドトキシンが減少したOMVを産生する。これは、リピドAアシル化の量及びアシル化の性質が、LOS毒性に影響する主要因子であるためである[Makda Fissehaら. Infection and Immunity Jun 2005, 73 (7) 4070-4080]。Lpxl1(ポリペプチド)は、Lpxl1酵素とも呼ばれ得る。
一実施形態では、rmp遺伝子は、配列番号1に示される配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である配列を含む。Rmp遺伝子は、ポリペプチド還元改変可能タンパク質(Rmp)をコードする。
一実施形態では、lpxl1遺伝子は、配列番号3に示される配列と少なくとも90%同一の配列を含み、rmp遺伝子は、配列番号1に示される配列と少なくとも90%同一の配列を含む。一実施形態では、lpxl1遺伝子は配列番号3を含み、rmp遺伝子は配列番号1を含む。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変された淋菌細菌は、
a) lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させ、
b) rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変された淋菌細菌は、
a) Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、及び
b) Rmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変された淋菌細菌は、
a) Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、及び
b) Rmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変された淋菌細菌は、
a) Lpxl1ポリペプチドの発現を消失させ、及び
b) Rmpポリペプチドの発現を消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドは配列番号4と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、Rmpポリペプチドは配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドは、配列番号4に示される配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Rmpポリペプチドは、配列番号2に示される配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドは、配列番号4と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、Rmpポリペプチドは、配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドは配列番号4のアミノ酸配列を含み、Rmpポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、非改変(例えば、野生型)淋菌FA1090株におけるLpxl1ポリペプチドの発現と比較して、10%未満、5%未満又は1%未満のLpxl1ポリペプチドを発現し、非改変(例えば、野生型)淋菌FA1090株におけるRmpポリペプチドの発現と比較して、10%未満、5%未満又は1%未満のRmpポリペプチドを発現する。一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、野生型lpxl1遺伝子を含む淋菌FA1090株におけるLpxl1ポリペプチドの発現と比較して、Lpxl1ポリペプチドの10%未満、5%未満又は1%未満を発現し、野生型rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株におけるRmpポリペプチドの発現と比較して、Rmpポリペプチドの10%未満、5%未満又は1%未満を発現する。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、非改変(野生型)淋菌FA1090株におけるLpxl1ポリペプチドのレベルと比較して、最小レベルのLpxl1ポリペプチドを発現し、及び非改変(野生型)淋菌FA1090株におけるRmpポリペプチドのレベルと比較して、最小レベルのRmpポリペプチドを発現する。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、Lpxl1ポリペプチド又はRmpポリペプチドを発現しない。一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、例えばイムノアッセイによって測定した場合、Lpxl1及び/又はRmpポリペプチドを検出可能なレベルで発現しない。一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、ウエスタンブロット又はELISAによって測定した場合、Lpxl1及び/又はRmpポリペプチドを検出可能なレベルで発現しない。
本開示の文脈において、「発現の低下」とは、本発明の淋菌が、非改変(野生型)淋菌FA1090株又は野生型lpxl1/rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株と比較して、より少ないlpxl1及びrmp mRNA及び/又はLpxl1及びRmpタンパク質を発現することを意味する。mRNA及び/又はタンパク質発現のいずれかの減少が、非改変(野生型)淋菌FA1090株又は野生型lpxl1/rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株と比較して観察される場合、発現は低下したものとして考えることができる。非改変(野生型)淋菌FA1090株又は野生型lpxl1/rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株において、mRNA及び/又はタンパク質発現のそれぞれ5%超、10%超、25%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、若しくは95%超のmRNA及び/又はタンパク質発現の減少が観察された場合、発現は低下したものとして考えることができる。本開示の文脈において、「消失された発現」とは、Lpxl1 mRNA及び/又はタンパク質、及びRmp mRNA及び/又はタンパク質が、発現を測定するために当業者によって使用される技術を使用して、本発明の淋菌細菌において検出され得ないことを意味する。
lpxl1及びrmp遺伝子の発現レベルは、当業者に周知である技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく技術を用いて(例えば、Q/RT-PCRを用いて)測定することができる。Lpxl1及びRmpポリペプチドの発現レベルは、当業者に周知である技術を用いて測定することができる。例えば、Lpxl1とRmpポリペプチドの両方の発現レベルは、ウエスタンブロッティング又はELISAを用いて測定することができる。Rmpポリペプチドの発現レベルは、SDS-PAGE及びLC/MS-MSを用いて、例えば、実施例11に本質的に記載される技術を用いて測定することができる。
遺伝子改変(複数可)は、lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ得る。したがって、上記遺伝子改変(複数可)は、Lpxl1ポリペプチドの発現を保持することができるが、ポリペプチドは機能的ではない。Lpxl1の機能は、例えば、外膜小胞リポオリゴ糖のリピドA成分が、ヘキサ-アシル化されるのではなく、ペンタ-アシル化される程度を調べることによって決定することができる(例えば、実施例6に記載の方法を使用する)。遺伝子改変された淋菌細菌がLpxl1タンパク質の機能を低下又は消失させる遺伝子改変を含む場合、lpxl1 mRNA及び/又はタンパク質の存在を示唆する証拠にもかかわらず、リピドAは、ペンタ-アシル化される(例えば、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるか、又は100%のペンタ-アシル化される)。
一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、ペンタ-アシル化リピドAとヘキサ-アシル化リピドAとの比を50:50～99:1(総リピドAと比較してペンタ-アシル化されたリピドAのパーセンテージは50%～100%である)で含むFA1090株の淋菌をもたらす。
一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、リピドAのペンタ-アシル化をもたらし、場合により、リピドAのアシル化は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間(MALDI-TOF)分光分析によって決定される。一実施形態では、本発明の遺伝子改変された淋菌細菌は、ペンタ-アシル化リピドAを有するリポオリゴ糖(LOS)を含む。リピドAのアシル化は、例えば、リピドAを抽出し、続いて、例えば、実施例6に本質的に記載されるように、MADI-TOF分光分析により分析することによって決定することができる。具体的には、Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、LpxL1が機能的に発現されていれば添加されたであろうラウリン酸を欠くリピドAを含むリポオリゴ糖(LOS)をもたらす。Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、リピドAのGlcN二糖の非還元末端から二次ラウロイル鎖を欠くリピドAを含むLOSをもたらす。Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、C12アシルオキシアシル鎖を(非還元末端から)欠くリピドAを含むLOSが生じる。Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、β-(1-->6)D-グルコサミン二量体の遠位非還元末端グルコサミンの第二級2'-O-位にラウリン酸を欠くリピドAを含むLOSをもたらす(その結果、リピドAの遠位グルコサミン上のアミド結合に孤立した3-ヒドロキシミリスチル部分が存在する)。
一実施形態では、lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、50%を超えるリピドAのペンタ-アシル化、例えば、60%を超える、70%を超える、80%を超える、90%を超える、95%を超える、又は99%を超えてもたらす。一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、リピドAの100%ペンタ-アシル化をもたらす。一実施形態では、本発明の遺伝子改変された淋菌細菌は、野生型lpxl1遺伝子を含むFA1090株の淋菌と比較して、Toll様受容体4(TLR4)を活性化する能力が減少している。
同様に、遺伝子改変(複数可)は、rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ得る。したがって、上記遺伝子改変(複数可)は、Rmpポリペプチドの発現の保持をもたらし得るが、ポリペプチドは機能的ではない。Rmpの機能は、例えば、淋菌がブレブ形成する程度を調べることによって決定することができる。遺伝子改変された淋菌細菌が、Rmpタンパク質の機能を低下又は消失させる遺伝子改変を含む場合、rmp mRNA及び/又はRmpタンパク質の存在を示唆する証拠にもかかわらず、野生型rmp遺伝子を含む淋菌細菌と比較して淋菌は「過剰ブレブ形成性」である可能性がある。したがって、一部の実施形態では、遺伝子改変されたFA1090は、野生型rmp遺伝子を含む淋菌細菌からの同じ測定値と比較して、より多くのOMVを産生するかどうか(例えば、菌株が過剰ブレブ形成性であるかどうか)について、すなわち、ある菌株から得られたOMV収量を別の菌株から得られたOMV収量と比較することによって(同じOMVブレビングプロトコルを使用して)試験され得る。このような方法は、例えば、[Maharjanら (2016年). Dissection of the function of the RmpM periplasmic protein from Neisseria meningtidis. Microbiology, 162巻(), 364～375号]に開示されている。このような実験の例は、実施例18に見ることができる。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変されたFA1090淋菌(FA1090二重突然変異体ΔLpxl1、Δrmp)は、比較株、例えばGC_0817560と比較して、(OMV生産性の増加対単一突然変異体ΔLpxl1の増加に関して)改善されたOMV生産性を示す。
一実施形態では、Rmpポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、野生型rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株のブレブ形成と比較して、過剰ブレブ形成性である淋菌をもたらす。したがって、本開示の淋菌は、それらの対応する野生型株(又は野生型rmp遺伝子を含む菌株)と比較して、過剰ブレブ形成性であり、すなわち、野生型株又は野生型rmp遺伝子を含む菌株よりも大量のブレブをそれらの培養培地中に放出する。一実施形態では、Rmpポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、野生型rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株と比較して、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%以上のOMVをブレブ形成する淋菌をもたらす。一実施形態では、Rmpポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、野生型rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株と比較して、80%～120%以上のOMVをブレブ形成する淋菌をもたらす。一実施形態では、野生型rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株は、配列番号1と少なくとも90%、95%又は100%同一である配列を含む。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、遺伝子改変(複数可)を含み、遺伝子改変(複数可)は、
a) 内因性lpxl1及びrmp遺伝子の破壊若しくは欠失、又は
b) 野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む菌株におけるlpxl1及びrmpポリペプチド発現の抑制
からなるか又はそれを含む。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変された淋菌細菌は、a)内因性lpxl1及びrmp遺伝子の破壊若しくは欠失、又はb)野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む菌株におけるLpxl1及びRmpポリペプチド発現の抑制のいずれかによって作製される。
一実施形態では、遺伝子改変(複数可)(すなわち、lpxl1及びrmpの発現及び/又は機能を低下又は消失させる)は、野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む菌株におけるLpxl1及びRmpポリペプチド発現の抑制によって達成される。上記実施形態では、FA1090淋菌株は、野生型(すなわち、改変されていない)lpxl1及びrmp遺伝子配列を含み、細菌に対してなされた上記遺伝子改変(複数可)は、Lpxl1及びRmpタンパク質の発現の低下又は消失をもたらす。野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む菌株におけるLpxl1及びRmpタンパク質発現を抑制する技術には、例えば、アンチセンス阻害及び阻害性RNA(すなわち、低分子干渉RNA[siRNA]、マイクロRNA[miRNA]、短鎖ヘアピンRNA[shRNA]など)が含まれるが、これらの技術は、真核生物宿主においてより一般的に使用される。結果として生じる細菌において、抑制されたタンパク質をコードするmRNAは実質的に存在せず、及び/又はその翻訳は実質的に阻害される(例えば、抑制の不存在下で見られる発現レベルの90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、25%未満、15%未満、10%未満、5%未満又は1%未満である)。野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む菌株におけるLpxl1及びRmpタンパク質発現の上記抑制は、Lpxl1及びRmpタンパク質の発現が抑制されるように改変されていない菌株と比較して測定される。
しかしながら、内因性lpxl1及びrmp遺伝子を破壊又は欠失させることが好ましい。したがって、一実施形態では、遺伝子改変(複数可)は、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の破壊及び/若しくは欠失からなるか、又はそれらを含む。
遺伝子改変(複数可)が内因性lpxl1及びrmp遺伝子の破壊を伴う場合、これは、例えば、上記破壊がプロモーター領域に対するものである場合に、Lpxl1及び/又はRmpタンパク質の発現の低下又は消失をもたらす可能性がある。しかしながら、内因性lpxl1及び/又はrmp遺伝子の破壊は、突然変異体Lpxl1及び/又はRmpタンパク質、例えば、異なるアミノ酸配列を有するLpxl1及び/又はRmpタンパク質の、野生型Lpxl1及び/又はRmpタンパク質への発現をもたらし得る。一実施形態では、内因性lpxl1及び/又はrmpの破壊は、非機能的Lpxl1及び/又はRmpポリペプチドの発現をもたらす。
一実施形態では、内因性lpxl1及び/又はrmp遺伝子の破壊は、内因性lpxl1及び/又はrmp遺伝子配列への付加、欠失又は置換を含む。「付加」とは、1種以上の非天然ヌクレオチドの遺伝子配列への挿入を指す。付加は、上流プロモーター領域を含むコード領域又は非コード領域に対してなし得、末端及び/又は非末端残基においてなし得る。一部の実施形態では、付加は、コード領域の転写が全くないか若しくは減少したプロモーター領域へのものであり、又は付加は、コドンシフト又は早期終止コドンが存在するようなコード領域へのものである。「置換」とは、1種のヌクレオチド塩基が別のヌクレオチド塩基と交換されることを指す。置換は、コドンを異なるアミノ酸をコードするものに変化させる能力を有し、したがって、産生されるタンパク質にわずかな(さらに機能的な)変化をもたらす。あるいは、置換は、アミノ酸コードを「終止」コドンに変化させる能力を有し、したがって不完全な(機能しない)タンパク質を生じる。内因性遺伝子の破壊の文脈における「欠失」とは、ポリヌクレオチド遺伝子配列から1種以上のヌクレオチドを除去することを指す。一部の実施形態では、欠失は、コード領域の転写が全くないか若しくは減少するように、プロモーター領域(又はその一部)の欠失を含むか、又は欠失は、コドンシフト又は早期終止コドンが存在するように、コード領域内にある。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は遺伝子改変(複数可)を含み、遺伝子改変(複数可)は、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含む。一実施形態では、本発明の淋菌細菌は遺伝子改変(複数可)を含み、遺伝子改変(複数可)は、二重突然変異体FA1090淋菌(Δlpxl1、Δrmp)をもたらす内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含む。一実施形態では、本発明の遺伝子改変された淋菌細菌は、二重突然変異体FA1090淋菌(Δlpxl1、Δrmp)である。
したがって、本発明は、
a. lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b. rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌を提供し、遺伝子改変(複数可)は、二重突然変異体FA1090淋菌(Δlpxl1、Δrmp)をもたらす内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含む。
一実施形態では、lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させ、rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌が提供され、遺伝子改変(複数可)は、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含み、その結果、二重突然変異体FA1090淋菌(Δlpxl1、Δrmp)が生じる。
一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、rmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌が提供され、遺伝子改変(複数可)は、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含み、その結果、二重突然変異体FA1090淋菌(Δlpxl1、Δrmp)が生じる。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、遺伝子改変(複数可)が遺伝子欠失である遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、lpxl1遺伝子、mRNA及び/若しくはLpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、rmp遺伝子、mRNA及び/若しくはRmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌が提供され、遺伝子改変(複数可)は遺伝子欠失である。一実施形態では、遺伝子欠失は、lpxl1及びrmp遺伝子座内の配列付加、置換又は欠失改変の結果である。遺伝子欠失は、上記改変の結果であり得るか又は上記改変によって達成され得る。
一実施形態では、lpxl1遺伝子、mRNA及び/若しくはLpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、rmp遺伝子、mRNA及び/若しくはRmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌が提供され、遺伝子改変(複数可)は遺伝子欠失であり、遺伝子欠失は、lpxl1及びrmp遺伝子の一部(又は複数の一部)を異種配列で置換した結果であり、場合により、上記異種配列は抗生物質耐性遺伝子をコードする。一実施形態では、lpxl1遺伝子、mRNA及び/若しくはLpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、rmp遺伝子、mRNA及び/若しくはRmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌が提供され、遺伝子改変(複数可)は遺伝子欠失であり、遺伝子欠失は、異種遺伝子配列をlpxl1及びrmpコード領域に加えた結果であり、場合により、上記異種配列は抗生物質耐性遺伝子をコードする。
一実施形態では、Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、rmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌が提供され、遺伝子改変(複数可)は遺伝子欠失であり、その結果、二重突然変異体FA1090淋菌(Δlpxl1、Δrmp)が生じる。
内因性lpxl1及びrmp遺伝子を欠失させる(すなわち、遺伝子ノックアウトを生じさせる)ために、任意の適切な技術を使用することができる。淋菌における遺伝子ノックアウトは、例えば、トランスポゾン突然変異誘発、プラスミド又は細菌人工染色体(BAC)に含有される遺伝子を改変するためのインビトロ遺伝子工学、及び改変された構築物の目的の生物への移動、並びにインビボ相同組換えによって作製することができる。一実施形態では、遺伝子は、遺伝子の転写又は翻訳に不可欠である内因性プロモーター、オペロン又は調節エレメントを無力化することによってノックアウトされる。一実施形態では、CRISPR-Cas9技術を用いて遺伝子を欠失させる。
一実施形態では、内因性lpxl1及びrmp遺伝子は、相同組換えによって欠失される。相同組換えは、例えば、国際公開第01/09350A2号に記載されているように、又は[Dillard J. P. (2011年). Genetic Manipulation of Neisseria gonorrhoeae. Current protocols in microbiology, Chapter 4, Unit4A.2]に記載されている技術を用いて行うことができる。相同組換えのプロセスにおいて、内因性lpxl1及びrmp遺伝子は、lpxl1及びrmp遺伝子のコード配列に異なる遺伝子を加えるか、又は組換えによって遺伝子若しくはその断片を異なる遺伝子(例えば、異種遺伝子又は非機能的遺伝子)と置換することによって欠失される。一実施形態では、異種遺伝子は抗生物質耐性遺伝子である。
一実施形態では、遺伝子改変(複数可)は、コード領域及び/又は非コード領域であり得る。コード領域は、タンパク質をコードする遺伝子のDNA配列の一部である。非コード領域(例えば、イントロンDNA)は、タンパク質配列をコードしない生物(すなわち、淋菌)DNAの成分である。一実施形態では、遺伝子改変(複数可)は、lpxl1遺伝子のコード領域、非コード領域、又はその組み合わせ、及びrmp遺伝子のコード領域、非コード領域、又はその組み合わせに対するものである。所定のDNA配列中のコード領域及び非コード領域を同定することは、当業者の範囲内である。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、
a) lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b) rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を除き、野生型淋菌FA1090株と同質遺伝子性（isogenic）である。
本明細書で使用される場合、用語「同質遺伝子（isogenic）」は、実質的に同一のゲノムを指す。したがって、一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、特定の遺伝子改変(複数可)を除き、野生型(すなわち、実質的に改変されていない)淋菌FA1090株と同質遺伝子性である。一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、特定の遺伝子改変(複数可)を除き、野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む淋菌FA1090株と同質遺伝子性である。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、
a) lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b) rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を除き、野生型淋菌FA1090株と同一である。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、特定の遺伝子改変(複数可)を除き、野生型(すなわち、実質的に改変されていない)淋菌FA1090株と同一である。一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、特定の遺伝子改変(複数可)を除き、野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む淋菌FA1090株と同質遺伝子性である。
野生型淋菌FA1090株(又は野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む淋菌FA1090株)の例は、ATCC(#700825)から得ることができる淋菌FA1090株である。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、最大3個、最大5個、最大10個、又は最大20個のナイセリア抗原の過剰発現及び/又は低下若しくは消失した発現をもたらすさらなる遺伝子改変(複数可)をさらに含む。「さらなる」ナイセリア抗原とは、Lpxl1及びRmpに対する改変(すなわち、含んでいない)に「追加」することを意味する。一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個のさらなるナイセリア抗原の過剰発現及び/又は発現の低下若しくは消失を、すなわち、a)lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)に加えてもたらすさらなる遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、上記さらなる遺伝子改変は、さらなるナイセリア抗原の過剰発現及び/又は低下した発現をもたらし、上記過剰発現及び/若しくは低下した発現は、遺伝的に改変されていないFA1090株淋菌又は対応する野生型遺伝子を含むFA1090株淋菌と比較される。追加の遺伝子改変(複数可)がさらなるナイセリア抗原の過剰発現をもたらす場合、上記抗原は、好ましくは、それらが、遺伝子改変された淋菌から得られたか又は得ることができるOMV上で表面露出されるように、細菌外膜中に存在する。このような実施形態では、さらなるナイセリア抗原は、別々のポリペプチドの形態であり得るか、又は融合タンパク質と同じポリペプチド中に存在し得る。
当業者は、抗原を過剰発現するための技術、特にOMVの表面に増加したレベルが存在するように抗原(複数可)を過剰発現するための技術(例えば国際公開2012/0324982A2号に要約される方法を参照されたい)を知っている。OMVは、特定の抗原(複数可)を過剰発現するように遺伝的に改変された細菌から得ることができる。細菌は既に抗原(複数可)を発現することができるが、上記改変を受けていない細菌と比較して、抗原の発現を増加させる遺伝子改変を含み得る。この改変は、通常、組換え技術、例えば部位特異的突然変異誘発又は標的相同組換えを用いて導入される。過剰発現の結果として、改変された細菌から調製された外膜小胞は、より高いレベルの過剰発現抗原(複数可)を含有する。
上記ナイセリア抗原は、ナイセリア属の任意のメンバー、例えば、N.アニマリス(N. animalis)、N.アニマロリス(N. animaloris)、N.バシリホルミス(N. bacilliformis)、N.カニス(N. canis)、N.シネレア(N. cinerea)、N.デンチアエ(N. dentiae)、N.エロンガタ(N. elongata)、N.フラバ(N. flava)、N.フラベセンス(N. flavescens)、淋菌(N. gonorrhoeae)、N.イグアナエ(N. iguanae)、N.ラクタミカ(N. lactamica)、N.マカカエ(N. macacae)、髄膜炎菌(N. meningitidis)、N.ムコサ(N. mucosa)、N.オラリス(N. oralis)、N.ペルフラバ(N. perflava)、N.ファリンギス(N. pharyngis)、N.ポリサッカレア(N. polysaccharea)、N.シャエガニイ(N. shayeganii)、N.シッカ(N. sicca)、N.スブフラバ(N. subflava)、N.ワズワーシイ(N. wadsworthii)、N.ウエアベリ(N. weaveri)又はN.ズーデグマチス(N. zoodegmatis)由来の抗原であり得る。一実施形態では、上記ナイセリア抗原は、髄膜炎菌由来の抗原である。一実施形態では、上記ナイセリア抗原は、淋菌由来の抗原である。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌は、最大3個、最大5個、最大10個、又は最大20個のさらなるナイセリア抗原の過剰発現をもたらすさらなる遺伝子改変(複数可)を含む。
遺伝子改変された細菌の作製方法
さらなる一態様では、本発明は、
a) 淋菌FA1090細菌中のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌由来のrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製すること、あるいは
b) 第1の淋菌FA1090細菌由来のrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌由来のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製すること
のいずれかを含む、本発明の淋菌細菌を作製する方法が提供される。
a)に記載される方法では、第1の淋菌FA1090細菌は単一突然変異体(Δlpxl1)であり、第2の淋菌FA1090細菌は二重突然変異体(Δlpxl1、Δrmp)である。b)に記載される方法では、第1の淋菌FA1090細菌は単一突然変異体(Δrmp)であり、第2の淋菌FA1090細菌は二重突然変異体(Δlpxl1、Δrmp)である。
好ましい一実施形態では、本発明の方法は、淋菌FA1090細菌中のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて、第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌からのrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて、第2の淋菌FA1090細菌を作製することを含む。上記好ましい一実施形態では、第1の淋菌FA1090細菌は、単一突然変異体(Δlpxl1)である。単一突然変異体(Δlpxl1)は、そのlpxl1遺伝子が欠失されているように遺伝的に改変されたFA1090株淋菌である。一実施形態では、第2の淋菌FA1090細菌は、二重突然変異体(ΔlpxL1、Δrmp)である。
一実施形態では、本発明の方法は、淋菌FA1090細菌中のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させて、第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌からのrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させて、第2の淋菌FA1090細菌を作製するステップを含む。一実施形態では、本発明の方法は、淋菌FA1090細菌中のLpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させて、第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌からのRmpポリペプチドの発現を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製するステップを含む。
一実施形態では、lpxl1及びrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる上記遺伝子改変(複数可)は、
a) 内因性lpxl1及びrmp遺伝子の破壊若しくは欠失、又は
b) 野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む菌株におけるlpxl1及びrmp発現の低下又は消失
からなるか又はそれを含むことができる。
しかしながら、遺伝子改変(複数可)は、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の破壊又は欠失を伴うことが好ましい。内因性lpxl1及びrmp遺伝子を欠失させることが特に好ましい。好ましい一実施形態では、遺伝子改変は遺伝子欠失である。
当業者は、「第2の淋菌FA1090細菌」(すなわち、二重突然変異体ΔlpxL1、Δrmp株)を生成するための従来の遺伝子ノックアウト技術を知っている。遺伝子ノックアウトの技術は周知であり、ナイセリアノックアウト突然変異体は以前に報告されている[例えば、Makda Fissehaら. Infection and Immunity Jun 2005, 73 (7) 4070-4080を参照されたい]。例えば、ノックアウトは、コード領域の少なくとも一部の欠失によって達成することができるが、任意の他の適切な技術、例えばプロモーターの欠失又は突然変異、開始コドンの欠失又は突然変異などを使用することができる。この細菌は、ノックアウトされた遺伝子の代わりにマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性マーカーを含有し得る。どちらの技術(又は技術の組み合わせ)を選択しても、得られた細菌は、実質的にLpxl1及びRmpを含まない。
好ましい一実施形態では、lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失は、ゲノム組換えによって行われる。一実施形態では、ゲノム組換えは、lpxl1及びrmp遺伝子又はその一部が置換される相同組換えである。一実施形態では、lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失は、lpxl1及びrmpコード配列又はその一部を異種遺伝子配列で置換することによって行われる。しかしながら、好ましい一実施形態では、lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失は、lpxl1及びrmpコード配列又はその一部を抗生物質耐性カセット又は抗生物質耐性遺伝子で置換することによって行われる。
一実施形態では、lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失は遺伝子欠失であり、場合により、上記遺伝子欠失は、lpxl1及びrmp遺伝子座内の配列付加、置換又は欠失改変の結果である。一実施形態では、lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失は、lpxl1及びrmpコード配列内の異種遺伝子配列(又は異種配列)の付加若しくは挿入、並びに/又はlpxl1及びrmp遺伝子配列若しくはその一部を異種遺伝子配列で置換することによって行われる。一実施形態では、異種遺伝子配列は、カセット内に担持される抗生物質耐性遺伝子であり、上記カセットは組換え部位もまた含む。
一実施形態では、lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失は、lpxl1及びrmpコード配列内の抗生物質耐性カセットの付加、並びに/又はlpxl1及びrmpコード配列若しくはその一部を抗生物質耐性カセットで置換することによって行われる。抗生物質耐性カセットは、組換え部位と抗生物質耐性遺伝子、例えば細菌にカナマイシン耐性を付与するKanMXを担持する遺伝子カセットである。
lpxl1及び/若しくはrmp遺伝子への抗生物質耐性を付与する遺伝子の付加、又はlpxl1及び/若しくはrmp遺伝子配列(例えば、コード領域)若しくはその一部の、抗生物質耐性を付与する遺伝子による置換は、(欠失される遺伝子とは対照的に)挿入される抗生物質耐性遺伝子を担持する形質転換体の選択を可能にする。したがって、成功した形質転換体(すなわち、成功して作製された突然変異体)は、上記の抗生物質の存在下でプレート上に画線塗布した場合に又はその存在下で増殖させた場合に感受性である。形質転換に成功していない細菌はいずれも生存できない。しかしながら、形質転換体は、その後、a)上記遺伝子の発現及び/又は機能の低下又は消失が達成されたことを確実にするため、b)残存する野生型(すなわち、形質転換されていない)細菌が存在しないことを確実にするために、試験されるべきである。
必要に応じて、マークされていない突然変異体構築物を用いたその後の形質転換を使用して、抗生物質カセットを置換することができる。したがって、一実施形態では、抗生物質耐性カセットは、その後置き換えられる。
外膜小胞
本発明のさらなる一態様では、OMVの産生における本発明の淋菌細菌(すなわち、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌であって、遺伝子改変(複数可)は、a)lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、(b)rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させるFA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌)の使用が提供される。
Lpxl1が外膜小胞において発現される範囲で:
本発明のさらなる一態様では、FA1090株淋菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供され、上記外膜小胞は、Lpxl1とRmpポリペプチドの両方の減少したレベル又は検出不可能なレベルのいずれかを含む。一実施形態では、FA1090株淋菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供され、上記外膜小胞は、減少又は消失したレベルのLpxl1及びRmpを含む。一実施形態では、Lpxl1とRmpポリペプチドの両方の減少したレベル又は検出不可能なレベルは、野生型FA1090細菌由来のOMVと比較して測定される。一実施形態では、Lpxl1とRmpポリペプチドの両方の減少したレベル又は検出不可能なレベルは、FA1090株の淋菌細菌由来のOMVと比較して測定され、上記株は、野生型(すなわち、改変されていない)lpxl1及びrmp遺伝子を含む。一実施形態では、Lpxl1及びRmpポリペプチドの減少したレベル又は検出不可能なレベルは、免疫アッセイ(例えば、ウエスタンブロット又はELISAアッセイ)によって測定される。
本発明のさらなる一態様では、本発明の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供される。したがって、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供され、遺伝子改変(複数可)は、a)lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる。一実施形態では、本発明の外膜小胞は、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができ、遺伝子改変(複数可)は、a)lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させる。淋菌ゲノムに対してなされた遺伝子改変(複数可)は、比較対照OMV中のLpxl1及びRmpポリペプチドの発現及び/又は機能のレベルと比較して、Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失、並びにRmpポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失を有するFA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌由来のOMVをもたらし、上記比較対照OMVは、上記遺伝子改変を欠く(又は野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む)淋菌FA1090株由来である。
一実施形態では、本発明の外膜小胞は、Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失、並びにRmpポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失を含む。一実施形態では、本発明の外膜小胞は、Lpxl1ポリペプチドの発現の低下又は消失、及びRmpポリペプチドの発現の低下又は消失を含む。一実施形態では、本発明の外膜小胞は、Lpxl1ポリペプチドの発現の低下又は消失、及びRmpポリペプチドの発現の低下又は消失をOMVの表面上に含む。上記の発現及び/又は機能の低下又は消失は、野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含むFA1090株淋菌細菌由来のOMVと比較される。
一実施形態では、本発明の外膜小胞はLpxl1及びRmpを発現しない。一実施形態では、本発明の外膜小胞は、OMVの表面にLpxl1及びRmpを発現しない。
一実施形態では、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供され、遺伝子改変(複数可)は、Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、及びrmpポリペプチドの発現を低下又は消失させ、遺伝子改変(複数可)は、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含む。一実施形態では、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供され、遺伝子改変(複数可)は、Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、及びrmpポリペプチドの発現を低下又は消失させ、遺伝子改変(複数可)は、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含み、その結果、二重変異体FA1090淋菌(ΔlpxL1、Δrmp)が生じる。
一実施形態では、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供され、遺伝子改変(複数可)は、Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、及びRmpポリペプチドの発現を低下又は消失させ、遺伝子改変(複数可)は遺伝子欠失であり、上記遺伝子欠失は、lpxl1及びrmp遺伝子座内の配列付加、置換又は欠失改変の結果であり、場合により、上記遺伝子欠失は、lpxl1及びrmp遺伝子の一部又は複数の一部を異種配列で置換した結果であり、場合により、上記異種配列は抗生物質耐性遺伝子をコードする。
Lpxl1が外膜小胞において発現しない範囲で:
本発明のさらなる一態様では、遺伝子改変されたFA1090株淋菌由来の外膜小胞(OMV)が提供され、上記遺伝子改変されたFA1090株淋菌は、a)lpxl1遺伝子、lpxl1 mRNA、及び/又はLpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子、rmp mRNA、及び/又はRmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含み、
上記OMVは、
I. 比較対照OMVにおけるRmpポリペプチドのレベルと比較して、減少したレベルのRmpポリペプチドを含み、上記比較対照OMVは、上記遺伝子改変を欠く淋菌FA1090株由来であり、及び
II. 比較対照OMVからのヘキサ-アシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドAを含む。
一実施形態では、OMVは、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドAを有するリポオリゴ糖(LOS)を含む。一実施形態では、OMVは、リピドA成分を有するリポオリゴ糖(LOS)を含み、上記リピドA成分は、比較対照OMVからのヘキサ-アシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドAを有する(淋菌FA1090株由来の比較対照OMVは、a)lpxl1遺伝子、lpxl1 mRNA、及び/又はLpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b) rmp遺伝子、rmp mRNA、及び/又はRmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を欠く)。
一実施形態では、上記OMVは、
iii. 比較対照OMVからのラウリン酸を欠くペンタ-アシル化リピドAのレベルと比較して、ラウリン酸を欠く増加したレベルのペンタ-アシル化リピドA
をさらに含む。
一実施形態では、OMVは、ラウリン酸を欠く増加したレベルのペンタ-アシル化リピドAを有するリポオリゴ糖(LOS)をさらに含む。一実施形態では、OMVは、さらに、リピドA成分を有するリポオリゴ糖(LOS)を含み、上記リピドA成分は、比較対照OMVからのラウリン酸を欠くペンタ-アシル化リピドAのレベルと比較して、ラウリン酸を欠く増加したレベルのペンタ-アシル化リピドAを有する。一実施形態では、ラウリン酸を欠く上記ペンタ-アシル化リピドAは、GlcN二糖の非還元末端からの第2のラウロイル鎖を欠く。
さらに、遺伝子改変された淋菌FA1090株からの外膜小胞(OMV)が提供され、OMVは、
I. 上記遺伝子改変を欠く淋菌FA1090株由来の比較対照OMVにおけるRmpポリペプチドのレベルと比較して、減少したレベルのRmpポリペプチド、及び
II. 比較対照OMVからのヘキサ-アシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドA、
III. 比較対照OMVからのラウリン酸を欠くペンタ-アシル化リピドAのレベルと比較して、ラウリン酸を欠く増加したレベルのペンタ-アシル化リピドA
を含む。
ヘキサ/ペンタ-アシル化リピドAのレベルは、前述のように決定することができ、このような方法の例は実施例6において提供される。
本発明の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞は、PorBを含み、上記PorBタンパク質は、8つのループドメイン(ループドメイン1～8)を含む。上記ループドメインは、本明細書において、配列番号26、27、28、29、30、31、32及び33(すなわち、FA1090 2KO Δlpxl1、Δrmp株由来のPorBループドメイン)として提供される。一実施形態では、本発明の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞はPorBタンパク質を含み、上記PorBタンパク質は、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32及び配列番号33を含む。一実施形態では、本発明の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞はPorBタンパク質を含み、上記PorBタンパク質は、8つのループドメインを含み、各ループドメインは、それぞれ配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32及び配列番号33と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の同一性を有する。換言すると、ループ1ドメインは、配列番号26と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の同一性を有する配列を含むことができ、ループ2ドメインは、配列番号27と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の同一性を有する配列を含むことができるなどである。
一実施形態では、本発明の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞は、配列番号25と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有するPorBタンパク質配列を含む。一実施形態では、本発明の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞は、配列番号25のPorBタンパク質配列を含む。
一実施形態では、本発明の外膜小胞は、遺伝子改変(複数可)を欠く淋菌FA1090株由来の比較対照OMVを用いた活性化と比較して、減少したToll様受容体4(TLR4)活性化を示す。TLR4活性化を決定するために使用される方法は、実施例13に開示される通りである。
本発明のさらなる一態様では、本発明の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供される。したがって、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞が提供され、遺伝子改変(複数可)は、a)lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる。一実施形態では、本発明の外膜小胞は、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができ、遺伝子改変は、a)lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させる。淋菌ゲノムに対してなされた遺伝子改変(複数可)は、上記のFA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌由来のOMVをもたらし、上記遺伝子改変(複数可)を欠く淋菌FA1090株由来の比較対照OMVにおけるRmpポリペプチドのレベルと比較して、減少したレベルのRmpポリペプチド、及び比較対照OMVからのヘキサ-アシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドAを含む。
したがって、本発明は淋菌外膜小胞を提供する。外膜小胞には、淋菌外膜の破壊又は淋菌外膜からのブレブ形成によって得られ、外膜から抗原を保持する小胞を形成する任意のプロテオリポソーム小胞が含まれる。OMVは、当業者に公知である種々の方法によって調製することができる。例えば、OMVは、細菌から人工的に調製することができ、界面活性剤処理(例えば、デオキシコール酸塩を用いる)を使用して調製することができ、又は非界面活性剤手段によって調製することができる。OMV調製のための好ましい方法は、例えば、遠心分離、続く培養上清の濾過、及び接線流濾過(TFF)を用いたその濃縮である(例えば、実施例10に記載される)。
好ましい一実施形態では、本発明の外膜小胞は天然の外膜小胞である、すなわち、界面活性剤で抽出されていない外膜小胞である。好ましい一実施形態では、本発明の外膜小胞は、非界面活性剤抽出によって得られる。本発明の外膜小胞は、ブレブ形成から得られるか、又は外膜の破壊から得られ、上記破壊は、外膜からのOMVの界面活性剤抽出を実質的に含まない。したがって、本発明の外膜小胞を得るための好ましい方法は、技術、例えば、超音波処理、均質化、微小流動化、キャビテーション、浸透ショック、粉砕、フレンチプレス、ブレンドなどを用いて、界面活性剤の不存在下で実質的に行われる。界面活性剤を使用しないか又は低界面活性剤を使用する方法は、[国際公開第2004/019977号]に記載されるように、有用な抗原を保持することができる。
一実施形態では、本発明の外膜小胞は、対象に投与した場合、交差殺菌性である。一実施形態では、本発明の外膜小胞は、対象に投与した場合、交差殺菌抗体力価を誘導することができる。一実施形態では、本発明の外膜小胞は、対象に投与した場合、淋菌の異種及び相同株(複数可)に対して交差殺菌性であり、相同株はFA1090株淋菌であり、異種株(複数可)は、淋菌の非FA1090株、例えば、WHO-M、F62、MS11、WHO-N、BG27、BG8、WHO-F、WHO-G、及びGC14である。
本発明の外膜小胞は、電子顕微鏡により40nm～120nm(例えば、電子顕微鏡により60nm～80nm)の直径を有する。さらに、本発明のOMVは、細胞質汚染を実質的に含まない。
OMVは細菌増殖中に自然に放出され、培養培地から精製することができる。精製は、理想的には、例えば、懸濁液中にブレブを残す一方で、ペレット細胞に低速遠心分離を用いることによって、及び/又はフィルター、例えば、ブレブを通過させるが無傷の細菌を通過させない0.22μmフィルターを用いるサイズベースの濾過によって、生きている及び/又は無傷の淋菌細菌からOMVを分離することを伴う。したがって、培養培地とは異なり、本開示の組成物を含有するOMVは、一般に、生きているか死んでいるかにかかわらず、全細菌を実質的に含まない。ブレブのサイズは、例えば、典型的にはフィルター滅菌に使用されるように、濾過によって、それらが全細菌から容易に分離され得ることを意味する。ブレブは、標準的な0.22μmフィルターを通過するが、これらは、他の材料によって急速に詰まる可能性があり、そのため、0.22μmフィルターを使用する前に、孔サイズを低下させる一連のフィルターを通して、フィルター滅菌の連続ステップを行うことが有用であり得る。先行するフィルターの例は、孔サイズが0.8μm、0.45μmなどのものである。一実施形態では、本発明の外膜小胞は、孔サイズが0.5μm、0.4μm又は0.3μm未満の滅菌フィルターを通して濾過することによって精製される。
OMV調製のための有用なプロセスは、[国際公開第2005/004908号]に記載され、高速遠心分離よりも粗OMV上での限外濾過を伴う。このプロセスは、限外濾過が行われた後、限外遠心分離のステップを伴うことができる。
得られた小胞は、完全にLOSを欠くことができるか、又はヘキサアシル化LOSを欠くことができ、例えば、小胞内のLOSは、LOS分子あたりの減少した数の二次アシル鎖を有することができる。例えば、本発明の遺伝子改変された淋菌(すなわち、lpxl1欠失又は突然変異を有する菌株)から得られるOMVは、ペンタ-アシル化LOSの産生をもたらす[Koeberlingら (2008年) J Infect Dis 198:262-70 and Zollingerら (2010年) Vaccine 28巻:5057～67頁]。得られるOMVは、リピドAのGlcN二糖の非還元末端から二次ラウロイル鎖を欠くリピドAを含むLOSを含み得る。得られたOMVは、エンドトキシン活性の低下を含む。
一実施形態では、本発明の外膜小胞は、二重突然変異体FA1090(ΔlpxL1、Δrmp)タンパク質プロファイルを含み、上記二重突然変異体FA1090(ΔlpxL1、Δrmp)タンパク質プロファイルは、質量分析(例えば、実施例12に開示される)によって測定される。一実施形態では、二重突然変異体FA1090(ΔlpxL1、Δrmp)タンパク質プロファイルは、PorB、Opa、PilQ、BamA、BamD及びTon-B依存性受容体タンパク質(NGO0952)を含む。一実施形態では、二重突然変異体FA1090(ΔlpxL1、Δrmp)タンパク質プロファイルは、PorB 1B、PilQ、BamA及びBamDを含む。
免疫原性組成物及びワクチン
本発明のさらなる一態様では、本発明の外膜小胞を含む免疫原性組成物が提供される。
したがって、本発明のこの態様は、FA1090株淋菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞を含む免疫原性組成物を提供し、上記外膜小胞は、Lpxl1とRmpポリペプチドの両方の減少したレベル又は検出不可能なレベルのいずれかを含む。
したがって、本発明のこの態様は、遺伝子改変されたFA1090株淋菌由来の外膜小胞(OMV)を含む免疫原性組成物を提供し、上記遺伝子改変されたFA1090株淋菌は、a)lpxl1遺伝子、lpxl1 mRNA、及び/又はLpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子、rmp mRNA、及び/又はRmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含み、上記OMVは、
I. 比較対照OMVにおけるRmpポリペプチドのレベルと比較して、減少したレベルのRmpポリペプチドを含み、上記比較対照OMVは、上記遺伝子改変を欠く淋菌FA1090株由来であり、及び
II. 比較対照OMVからのヘキサ-アシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドAを含む。
一実施形態では、前記OMVは、
III. 比較対照OMVからのラウリン酸を欠くペンタアシル化リピドAのレベルと比較して、ラウリン酸を欠く増加したレベルのペンタアシル化リピドA
をさらに含む。
本発明のこの態様はまた、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞を含む免疫原性組成物を提供し、上記細菌は、
a) lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b) rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞を含む免疫原性組成物が提供され、上記細菌は、
a) lpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させ、
b) rmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られる又は得ることができる外膜小胞を含む免疫原性組成物が提供され、上記細菌は、
a) Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、及び
b) Rmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞を含む免疫原性組成物が提供され、上記細菌は、
a) Lpxl1ポリペプチドの発現を消失させ、及び
b) Rmpポリペプチドの発現を消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む。
一実施形態では、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞を含む免疫原性組成物が提供され、上記細菌は、Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、Rmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含み、遺伝子改変(複数可)は、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含む。一実施形態では、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞を含む免疫原性組成物が提供され、上記細菌は、Lpxl1ポリペプチドの発現を低下又は消失させ、Rmpポリペプチドの発現を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含み、遺伝子改変(複数可)は遺伝子欠失であり、上記遺伝子欠失(複数可)は、lpxl1及びrmp遺伝子座内の配列付加、置換又は欠失改変の結果であり、場合により、上記遺伝子欠失は、lpxl1及びrmp遺伝子の一部又は複数の一部を異種配列で置換した結果であり、場合により、上記異種配列は抗生物質耐性遺伝子をコードする。
OMVを含む組成物の文脈における用語「免疫原性」は、表面(又は実質的に表面露出)に存在する抗原が、例えば、対象を免疫化するために使用される場合、細胞媒介性応答及び/又は抗体応答などの免疫応答を誘導することができることを意味するために使用される。本発明の免疫原性組成物は、ワクチンに有用であり得る。したがって、免疫原性組成物及びワクチンは、薬学的に許容され得る。用語「得られるか又は得ることができる」とは、本発明の遺伝子改変された淋菌から単離されるOMVを意味し、上記単離はOMVの豊富な集団をもたらす。上記OMVはまた、汚染を除去するために、例えば、細胞質タンパク質汚染を除去するために精製され得る。
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、いずれの生きている及び/又は全細菌も含まない。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される。
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。本発明の組成物は、さらに、本発明の外膜小胞とともに対象に投与された場合、OMVの表面に存在する抗原に対する免疫応答の増加又は増強が観察されるようなアジュバントをさらに含み得る。本発明の組成物は、本発明の外膜小胞とともに対象に投与された場合、反応原性の低下が観察されるようなアジュバントをさらに含み得る。
本発明の組成物は、アルミニウム塩アジュバントを含むことができる。適切なアルミニウム塩アジュバントには、水酸化物、リン酸塩又はそれらの混合物が含まれる。塩は、好適な形態(例えば、ゲル、結晶性、非晶質など)をとることができ、抗原の塩への吸着が好ましい。一実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩アジュバント、例えば水酸化アルミニウムである。一実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウムである。一実施形態では、本発明のOMVは水酸化アルミニウムに吸着される。一実施形態では、アジュバントはゲルベースではない。一実施形態では、アジュバントはALHYDROGELではない。
「水酸化アルミニウム」として公知であるアジュバントは、典型的には、通常少なくとも部分的に結晶性であるオキシ水酸化アルミニウム塩である。式AlO(OH)で表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、他のアルミニウム化合物、例えば水酸化アルミニウムAl(OH)3と、赤外(IR)分光法によって、特に1070cm-1の吸着バンドと3090-3100cm-1の強い肩の存在によって区別することができる[Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman)の9章、Plenum Press 1995年]。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半値幅(WHH)での回折バンドの幅によって反映され、結晶性の低い粒子は、より小さい結晶子サイズのために、より大きな広がりを示す。表面積はWHHが増加するにつれて増加し、より高いWHH値を有するアジュバントは抗原吸着能力がより大きいことが分かっている。水酸化アルミニウムアジュバントには、繊維状の形態(透過型電子顕微鏡写真に見られるような)が典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのpIは、典型的には約11であり、すなわち、アジュバント自体は、生理的pHにおいて正の表面電荷を有する。pH7.4のAl+++のmgあたり1.8～2.6mgタンパク質の吸着能が水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
本発明の組成物は、種々の形態で調製することができる。組成物は、一般に、水性形態で対象(例えば、哺乳動物)に投与されるが、しかしながら、投与前に、組成物は非水性形態(例えば、乾燥又は凍結乾燥)であり得る。組成物は、注射剤(溶液又は懸濁液のいずれか)として液体形態で調製することができる。本発明の組成物は、保存剤、例えばチメロサール及び/又は2-フェノキシエタノールを含むことができる。しかしながら、好ましくは、組成物は実質的に自由な形態の水銀物質である。水銀を含有しないワクチンがより好ましい。
本発明の組成物又はワクチンは、賦形剤をさらに含み得る。本発明の組成物は、浸透圧を提供するためにナトリウム塩(例えば、塩化ナトリウム)を含み得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。本発明の組成物は、界面活性剤、例えばTween(ポリソルベート)をさらに含み得る。
組成物は、1種以上の緩衝剤を含み得る。典型的な緩衝剤には、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤(特に水酸化アルミニウムアジュバントを含む)、又はクエン酸緩衝剤が含まれる。
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物を対象に投与した場合、淋菌の相同株及び/又は異種株に対する抗体、例えば、淋菌の相同株及び/又は異種株に対する殺菌性抗体を誘発する。一般に、本発明の組成物は、対象に投与された後、血清殺菌性抗体反応を誘導することができる。これらの応答は、典型的には、例えば、マウスへの投与後に測定され、ワクチン有効性の標準的指標である。血清殺菌活性(SBA)は、補体によって媒介される細菌殺菌を測定し、ヒト又はウサギ補体(SBAを測定するための例示的な方法は、本明細書の実施例16に見出され得る)を用いてアッセイすることができる。本明細書で使用される場合、用語「異種株」とは、対象を免疫化するために使用されるOMVが由来する淋菌株とは異なる淋菌株を指す。対象を免疫化するために使用されるOMVは、本明細書においては、FA1090株淋菌に由来するため、異種株(複数可)は、非FA1090株淋菌を指す。本明細書で使用される場合、用語「相同株」とは、淋菌のFA1090株を指す。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、交差殺菌力価を誘発することができる。
本発明のさらなる一態様では、本発明の外膜小胞又は本発明の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチンが提供される。
本発明に係るワクチンは、予防的(すなわち、感染を予防する)であり得るか、又は治療的(すなわち、感染を処置する)であり得るが、典型的には予防的である。本発明のワクチンは、免疫学的に有効な量の抗原を含み、上記抗原は、本発明のOMVの表面上に存在する。
処置
本開示は、医薬として使用するための免疫原性組成物及びワクチンを提供する。それはまた、本発明の免疫原性組成物及びワクチンの形態の医薬としての本発明の外膜小胞の使用を提供する。したがって、さらなる一態様では、医薬に使用するための本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンが提供される。
さらなる一態様では、ナイセリア感染、例えば淋菌感染に対する対象の免疫化に使用するための、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンが提供される。したがって、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンは、ナイセリア属の他の細菌、特に髄膜炎菌(N. meninigitidis)及び淋菌(N. gonorrhoea)に対する対象の免疫化に使用することができる。
さらなる一態様では、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンは、ナイセリア、例えば淋菌により引き起こされる疾患の処置又は予防に使用するために提供される。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、泌尿生殖器、肛門直腸及び/又は口腔咽頭部位における淋病感染の処置又は予防に使用される。さらなる一実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、淋菌関連骨盤炎症性疾患、播種性淋菌感染症、子宮外妊娠及び/又は不妊症の処置又は予防に使用される。
予防的及び治療的処置の有効性は、本発明の免疫原性組成物又はワクチンの投与後に淋菌感染をモニタリングすることによって試験することができる。世界保健機関(WHO)は、感染予防は、疾患のエンドポイントではなく、有効性の臨床エンドポイントとして診断検査によって測定されることを示唆しており、これにより、無症候状態でも伝播の制御が確実に行われると考えられる[Gottlieb SLら、Gonococcal vaccines: Public health value and preferred product characteristics; report of a WHO global stakeholder consultation, January 2019. Vaccine 2020年6月9日;38巻(28号):4362～4373頁]。ワクチン接種の防御効果は、組成物又はワクチンの投与後に、外膜小胞又は他の抗原における免疫原性タンパク質に対する免疫応答をモニタリングすることによって試験することができる。本開示の組成物の免疫原性は、それらを試験対象に投与し、次に標準的な血清学的パラメータ(例えば、抗OMV IgGのレベル/濃度及び機能的抗体の存在)を決定することによって決定することができる。これらの免疫応答は、一般に、組成物の投与後に決定され、組成物の投与前に決定された値と比較される。組成物の1回を超える投与が行われる場合、1回を超える投与後の決定を行うことができる。本発明の免疫原性組成物又はワクチンはまた、特定の解剖学的部位における淋菌感染が、対照/プラセボワクチンを投与された対象と比較して、本発明の免疫原性組成物又はワクチンを投与された対象において減少/低下する場合に有効であると考えられる。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、淋菌感染に対して少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%の防御である。
さらなる一態様では、それを必要とする対象におけるナイセリア(例えば、淋菌)によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための方法が提供され、上記方法は、上記対象に治療有効量の本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンを投与することを含む。
さらなる一態様では、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンを対象に投与することを含む、それを必要とする対象をナイセリア(例えば、淋菌)に対して免疫化する方法が提供される。
さらなる一態様では、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンを対象に投与することを含む、対象における免疫応答を上昇させる方法が提供される。さらなる一態様では、本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンを対象に投与することを含む、対象におけるナイセリア感染(例えば、淋菌感染)に対する免疫応答を上昇させる方法が提供される。
さらなる一態様では、ナイセリアによって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンの使用が提供される。さらなる一態様では、淋菌によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物又は本発明のワクチンの使用が提供される。
投薬処置は、単回投与スケジュールであり得るか、又は複数回投薬スケジュールであり得る。さらなる一態様では、少なくとも2用量の組成物が対象に投与される、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供される。一次免疫化スケジュール及び/又は追加免疫化スケジュールにおいて、複数回用量を使用することができる。初回用量スケジュールの後に追加用量スケジュールを設けることができる。したがって、さらなる一態様では、少なくとも2用量の組成物が対象に投与され、少なくとも1用量は追加用量である、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供される。
さらなる一態様では、対象が青年及び/又は成人(例えば、若年成人)である、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供される。世界保健機関(WHO)は、最初の性的曝露の前にワクチン接種を行うことを推奨しているが、一般に青年期後期及び若年成人期である、発生率が最も高い時期には最大限の予防を提供する。WHOは、年齢が10～19歳のヒトを青少年と定義している[Rosen JE. Adolescent health and development (AHD): a resource guide for World Bank operations staff and government counterparts. Washington, D.C., The World Bank, 2004年]。したがって、本明細書で使用される場合、用語「青少年」とは、10～19歳の対象を意味する。本明細書で使用される場合、「成人」とは、年齢が20歳以上(例えば、20～25歳、20～45歳、20～55歳など)の対象を指す。
本明細書に開示される方法又は使用に従って予防又は処置の対象を同定するために、スクリーニング方法を採用して、標的化された若しくは疑われる疾患又は状態に関連する危険因子を決定するか、あるいは対象における既存の疾患又は状態の状態を決定することができる。これらのスクリーニング方法は、例えば、淋菌感染又は淋菌関連疾患に関連する可能性のある環境、家族、職業及び他のこのような危険因子の決定、並びに診断方法(例えば、細菌培養又はイムノアッセイ方法)を誘導する。これら及び他の慣用的な方法により、臨床医は治療を必要とする患者を選択することができる。さらなる一態様では、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供され、対象は、一般集団における平均リスクと比較して、淋菌感染のリスクが増加する。一般集団の平均リスクと比較して淋菌感染のリスクが高い対象の例には、(限定されないが)セックスワーカー、男性とセックスする男性(MSM)、曝露前予防(PreP)使用者、現在又は過去のSTI診断のある個人、ケアに従事しているHIV+患者、及び医療センターでSTIスクリーニング若しくは他のSTIサービスを求めているか又は求めていた個人が含まれる。
さらなる一態様では、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供され、対象は1種以上のさらなる感染性因子に対して同時免疫される。同時免疫化は、本発明のワクチン内の1種以上のさらなる感染性因子に対する免疫化を含み得る(すなわち、本発明のワクチンは、1種以上のさらなる感染性因子に対する抗原をさらに含む)。しかしながら、同時免疫化には、1種以上のさらなる感染性因子に対する免疫化も含めることもでき、さらなるワクチンは、本発明のワクチンと実質的に同時に(例えば、同じ臨床予約時に)投与される。例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、1種以上のさらなる感染性因子に対する抗原を含むさらなる免疫原性組成物又はワクチンとともに対象に投与することができる。一実施形態では、1種以上のさらなる感染性因子は、性感染症を引き起こす感染性因子である。
さらなる一態様では、本発明の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用が提供され、上記免疫原性組成物又はワクチンは、筋肉内又は腹腔内投与経路を介して投与される。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、筋肉内投与経路を介して投与される。一実施形態では、投与経路は、第1の免疫化とその後の任意の免疫化の間で変化しないままである。一実施形態では、投与経路は鼻腔内経路を含まない。
本発明の実施形態は、後続の段落にさらに記載される。
1. FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌であって、
a. リピドA生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼ(lpxl1)遺伝子、mRNA、及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b. 還元改変可能タンパク質(rmp)遺伝子、mRNA、及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌。
2. 発現及び/又は機能の低下又は消失が、野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含むFA1090株の淋菌細菌と比較される、段落1の淋菌細菌。
3. lpxl1遺伝子が、配列番号3に記載される配列と少なくとも80%同一である配列を含み、rmp遺伝子が、配列番号1に記載される配列と少なくとも80%同一である配列を含む、段落1又は2の淋菌細菌。
4. lpxl1遺伝子が、配列番号3に記載される配列と少なくとも90%同一である配列を含み、rmp遺伝子が、配列番号1に記載される配列と少なくとも90%同一である配列を含む、段落1～3の淋菌細菌。
5. lpxl1遺伝子が配列番号3を含み、rmp遺伝子が配列番号1を含む、段落1～4の淋菌細菌。
6. 遺伝子改変(複数可)が、
a. Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
b. Rmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる、
先行する任意の段落の淋菌細菌。
7. Lpxl1ポリペプチドが、配列番号4と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、Rmpポリペプチドが、配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、段落1～6の淋菌細菌。
8. Lpxl1ポリペプチドが配列番号4と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含み、Rmpポリペプチドが配列番号2と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、段落1～7の淋菌細菌。
9. Lpxl1ポリペプチドが配列番号4のアミノ酸配列を含み、Rmpポリペプチドが配列番号2のアミノ酸配列を含む、段落1～8の淋菌細菌。
10. 細菌は、野生型Lpxl1遺伝子を含む淋菌FA1090株と比較して、Lpxl1ポリペプチドを10%未満、5%未満又は1%未満を発現し、野生型rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株と比較して、Rmp遺伝子を10%未満、5%未満又は1%未満を発現する、先行する任意の段落の淋菌細菌。
11. 細菌がLpxl1ポリペプチド及び/又はRmpポリペプチドを発現しない、段落1～10の淋菌細菌。
12. lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失が、リピドAのペンタ-アシル化をもたらし、場合により、リピドAのアシル化は、MALDI-TOFスペクトロメトリーによって決定される、段落1～11の淋菌細菌。
13. Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失が、50%を超えるリピドAのペンタ-アシル化、例えば、60%を超える、70%を超える、80%を超える、90%を超える、95%を超える、又は99%を超えてもたらす、段落12の淋菌細菌。
14. Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失は、リピドAの100%ペンタ-アシル化をもたらす、段落12又は段落13の淋菌細菌。
15. Rmpポリペプチドの発現及び/又は機能の低下又は消失が、野生型rmp遺伝子を含む淋菌FA1090株と比較して、過剰ブレブ形成性である淋菌をもたらす、段落1～14の淋菌細菌。
16. 遺伝子改変(複数可)が、
a) 内因性Lpxl1及びrmp遺伝子の破壊若しくは欠失、又は
b) 野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む菌株におけるLpxl1及びRmpポリペプチド発現の抑制
からなるか又はそれを含む、段落1～15の淋菌細菌。
17. 遺伝子改変が、内因性lpxl1及びrmp遺伝子の破壊若しくは欠失からなるか又はそれを含む、段落1～16の淋菌細菌。
18. 内因性lpxl1及び/又はrmpの破壊が、非機能的Lpxl1及び/又はRmpポリペプチドの発現をもたらす、段落17の淋菌細菌。
19. 破壊が、内因性lpxl1及び/若しくはrmp遺伝子配列への付加、それからの欠失又はその置換を含む、段落17又は段落18の淋菌細菌。
20. 遺伝子改変(複数可)が内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失を含む、すなわち、遺伝子欠失である、先行する任意の段落の淋菌細菌。
21. 内因性lpxl1及びrmp遺伝子の欠失が、二重突然変異体FA1090淋菌(Δlpxl1、Δrmp)をもたらす、段落20の淋菌細菌。
22. 内因性lpxl1及びrmp遺伝子が相同組換えによって欠失される、段落20又は段落21の淋菌細菌。
23. 遺伝子改変(複数可)がコード領域及び/又は非コード領域であり得る、先行する任意の段落の淋菌細菌。
24.段落1～23の前記遺伝子改変(複数可)を除き、細菌が野生型淋菌FA1090株と同質遺伝子性である、先行する任意の段落の淋菌細菌。
25. 最大3個、最大5個、最大10個、又は最大20個のナイセリア抗原の過剰発現及び/又は低下若しくは消失した発現をもたらすさらなる遺伝子改変(複数可)をさらに含む、先行する任意の段落の淋菌細菌。
26. a)淋菌FA1090細菌中のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌由来のrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製すること、あるいは
b)第1の淋菌FA1090細菌由来のrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌由来のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製すること
のいずれかを含む、段落1～25に記載の淋菌細菌を作製する方法。
27. a)第1の淋菌FA1090細菌が単一突然変異体(Δlpxl1)であり、第2の淋菌FA1090細菌が二重突然変異体(Δlpxl1、Δrmp)であり、及びb)第1の淋菌FA1090細菌が単一突然変異体(Δrmp)であり、第2の淋菌FA1090細菌が二重突然変異体(Δlpxl1、Δrmp)である、段落26の方法。
28. lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失がゲノム組換えによって行われる、段落26又は段落27の方法。
29. lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失が遺伝子欠失であり、場合により、上記遺伝子欠失が、lpxl1及びrmp遺伝子座内の配列付加、置換又は欠失改変の結果である、段落26～28記載の方法。
30. lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失が、lpxl1及びrmpコード配列内の異種遺伝子配列の付加、並びに/又はlpxl1及びrmpコード配列、若しくはその一部を異種遺伝子配列で置換することによって行われる、段落26～29の方法。
31. lpxl1遺伝子とrmp遺伝子の両方の発現の低下又は消失が、lpxl1及びrmpコード配列内の抗生物質耐性カセットの付加、及び/又はlpxl1及びrmpコード配列、若しくはその一部を抗生物質耐性カセットで置換することによって行われる、段落26～30の方法。
32. 外膜小胞の産生における段落1～25のいずれかに記載の淋菌細菌の使用。
33. lpxl1とrmpポリペプチドの両方の減少したレベル又は検出不可能なレベルのいずれかを含む、FA1090株淋菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞。
34. Lpxl1とRmpポリペプチドの両方の減少したレベル又は検出不可能なレベルが、野生型FA1090細菌又は野生型Lpxl1及びRmp遺伝子を含むFA1090細菌由来のOMVと比較して測定される、段落33の外膜小胞。
35. 遺伝子改変されたFA1090株淋菌由来の外膜小胞(OMV)であって、上記遺伝子改変されたFA1090株淋菌は、a)lpxl1遺伝子、lpxl1 mRNA、及び/又はLpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子、rmp mRNA、及び/又はRmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含み、
上記OMVは、
I. 上記遺伝子改変を欠く淋菌FA1090株由来の比較対照OMV中のRmpポリペプチドのレベルと比較して減少したレベルのRmpポリペプチドを含み、及び
II. 比較対照OMVからのヘキサアシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサアシル化リピドA
を含む外膜小胞(OMV)。
36.上記OMVが、
III. 比較対照OMVからのラウリン酸を欠くペンタ-アシル化リピドAのレベルと比較して、ラウリン酸を欠く増加したレベルのペンタ-アシル化リピドA
をさらに含む、段落35に記載の外膜小胞(OMV)。
37. 段落1～25のいずれかに記載の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞。
38. Lpxl1ポリペプチドの発現の低下又は消失、及びRmpポリペプチドの発現の低下又は消失を含む、段落37の外膜小胞。
39. Lpxl1及びRmpを発現しない段落37又は段落38の外膜小胞。
40. 上記遺伝子改変(複数可)を欠く淋菌FA1090株由来の比較対照OMVにおけるRmpポリペプチドのレベルと比較して、減少したレベルのRmpポリペプチドと、比較対照OMVからのヘキサ-アシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドAとを含む、段落37の外膜小胞。
41. 比較対照OMVからのラウリン酸を欠くペンタ-アシル化リピドAのレベルと比較して、ラウリン酸を欠く増加したレベルのペンタ-アシル化リピドAをさらに含む、段落40の外膜小胞。
42. 上記外膜小胞が天然の外膜小胞である、すなわち、界面活性剤で抽出されていない、段落33～41のいずれかの外膜小胞。
43. 孔サイズが0.5μm、0.4μm又は0.3μm未満の滅菌フィルターを通して濾過することによって精製される、段落33～42のいずれかの外膜小胞。
44. 上記外膜小胞が二重突然変異体FA1090(ΔlpxL1、Δrmp)タンパク質プロファイルを含み、上記タンパク質プロファイルが質量分析により測定される、段落33～43のいずれかの外膜小胞。
45. 二重突然変異体FA1090(ΔlpxL1、Δrmp)タンパク質プロファイルが、PorB 1B、PilQ、BamA及びBamDを含む、段落44の外膜小胞。
46. 段落33～45のいずれかに記載の外膜小胞を含む免疫原性組成物。
47. アジュバントをさらに含む、段落46の免疫原性組成物。
48. アジュバントがアルミニウム塩アジュバント、例えば水酸化アルミニウムである、段落47の免疫原性組成物。
49. 対象に投与した場合、淋菌の相同株及び/又は異種株に対する抗体、例えば、淋菌の相同株及び/又は異種株に対する殺菌性抗体を誘発する、段落46～48の免疫原性組成物。
50. 段落33～45のいずれかの外膜小胞、又は段落46～49の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
51. 医薬に使用するための、段落46～49に記載の免疫原性組成物又は段落50に記載のワクチン。
52. ナイセリア感染、例えば淋菌感染に対する対象の免疫化に使用するための、段落46～49に記載の免疫原性組成物又は段落50に記載のワクチン。
53. ナイセリア、例えば淋菌によって引き起こされる疾患の処置又は予防に使用するための、段落46～49に記載の免疫原性組成物、又は段落50に記載のワクチン。
54. それを必要とする対象におけるナイセリア(例えば、淋菌)によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための方法であって、上記対象に治療有効量の段落46～49に記載の免疫原性組成物又は段落50に記載のワクチンを投与することを含む方法。
55. 免疫学的に有効な量の段落46～49に記載の免疫原性組成物又は段落50に記載のワクチンを対象に投与することを含む、それを必要とする対象をナイセリア(例えば、淋菌)に対して免疫化する方法。
56. 段落46～49に記載の免疫原性組成物又は段落50に記載のワクチンを対象に投与することを含む、対象における免疫応答を上昇させる方法。
57. ナイセリアによって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における、段落46～49に記載の免疫原性組成物又は段落50に記載のワクチンの使用。
58. 淋菌によって引き起こされる疾患の処置又は予防のための医薬の製造における、段落46～49に記載の免疫原性組成物又は段落50に記載のワクチンの使用。
59. 少なくとも2用量の組成物が対象に投与される、段落51～58のいずれかに記載の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用。
60. 対象が青年及び/又は成人である、段落51～58のいずれかに記載の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用。
61. 対象が、一般集団の平均リスクと比較して、淋菌による感染のリスクが増加している、段落51～58のいずれかに記載の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用。
62. 対象が1種以上のさらなる感染性因子に対して同時免疫される、段落51～58のいずれかに記載の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用。
63. 上記免疫原性組成物又はワクチンが、筋肉内又は腹腔内の投与経路を介して投与される、段落51～58のいずれかに記載の使用のための免疫原性組成物若しくはワクチン、方法又は使用。
以下の実施例は、例示のみを意図したものであり、本発明の範囲をいかなる方法でも限定することを意図したものではない。
[実施例]
[実施例1]
FA1090と淋菌の全般的変動性とのゲノム比較
2つのFA1090全ゲノムを以下のように比較ゲノム分析のために選択した:
(1)FA1090-GenBank(GenBankアクセッションID:AE004969.1を参照されたい)
(2)ボストン大学医学部のLee Wetzler教授から入手したFA1090-FA1090株淋菌。
FA1090株(1)のゲノムをGenBank(アクセッションID:AE004969.1)からダウンロードした。FA1090株(2)のゲノムをIllumina Miseq技術(実施例9に記載されているように実施する)で配列決定した。配列決定したゲノムをアセンブリして、全染色体配列を決定した。
FA1090ゲノム(1)と(2)の同一性は、Lee I, Ouk Kim Y, Park SC, Chun J. OrthoANI: An improved algorithm and software for calculating average nucleotide identity. Int J Syst Evol Microbiol. 2016;66(2):1100-1103.]に記載された方法を用いて計算した。ゲノムは99.97%同一である。
これら2つのFA1090株のゲノムを、以下を含む多数の他の淋菌ゲノムと比較した:
- 世界保健機関の14菌株(内部コレクションに存在する)、
- ATCCから得られる12菌株(内部コレクションに存在する)、
- 院内淋菌ライブラリーの一部を構成する30の淋菌株、及び
- この種の世界的なコレクションを代表する、淋菌株の公に利用可能な4000のゲノム。
したがって、計4058のゲノムが分析に利用可能であった。全体として、この分析で検討した菌株は異なる国を代表しており、淋菌循環株の関連するコレクションに対応していた(図1を参照されたい)。
材料及び方法:
データソース: 淋菌ゲノムの世界的なコレクション(公に入手可能な4000のゲノム)は、PubMLSTデータベース(2019年5月にアクセル)からダウンロードされた。FA1090 GenBank株(アクセッションAE004969.1)ゲノム及びWHOゲノム(アクセッションPRJEB14020)を、それぞれGenBank及び欧州ヌクレオチドアーカイブ(ENA)データベースからダウンロードした。FA1090(2)、ATCCコレクション(12株)及び院内淋菌ライブラリー(30株)のゲノムを、次世代シークエンシングにより得た。
アセンブリ: 配列決定された菌株のアセンブリをスペード(v.3.6.2)アセンブリソフトウェアを用いて行った。
一塩基多型(SNPs)検出及び比較: ゲノム配列をkSNP3ソフトウェア(v.021)を用いて比較した。kSNP3は、入力として提供されるゲノム配列間のコア及びノンコアSNPsの検出を可能にする。分析の生の結果は、挿入と欠失を含むアラインメントしたSNPsのマルチファスタファイルである。このmfastaファイルは、系統発生と個体群構造再構築のための任意のソフトウェアパイプラインの入力となり得る。これらの系統発生分析のために、臨時パイプラインをRプログラミング言語(類人猿、phangorn、clValid及びクラスターRパッケージに基づく)で開発したか、又はスプリットストレーソフトウェア(v.4.14)で直接実施した。
拡張多座配列タイピング(MLST): ゲノム配列は、Bigsdbソフトウェア(v. 1.20)を使用して特徴付けも行い、ナイセリア属のパブリックコアゲノムMLSTスキーマ(NM_cgMLST_v1.0)で規定された遺伝子座のリストに対立遺伝子とタンパク質識別子を割り当てた。全ての場合において、これらの拡張MLSTタイピングプロファイルを用いて、菌株間の遺伝的距離(多様な対立遺伝子の数に基づく)を計算し、集団系統発生を再構築した。
ゲノムアノテーション: コード配列検出及びアノテーションは、プロッカソフトウェアパイプライン(v.1.13.3)を用いて行われた。ゲノム(1)については、最初に発表されたゲノムアノテーションを使用したが、それも再注釈した。ゲノム(2)については、モーブパイプラインにより、コンティグを(1)ゲノム足場上で再配列し、次に6フレーム停止リンカーモチーフと融合させて、仮想単一コンティグ(r1cと標識)を形成した。アセンブリの概要を表1に報告する。
Figure 2023541876000001
全ゲノム比較: コア及びノンコア一塩基多型(SNPs)検出及び拡張多座対立遺伝子割り当て(PubMLSTデータベースからのcgMLST_v1.0スキーム)に基づく2つの技術を用いてゲノム比較を行った。
一塩基多型系統発生
SNPsに基づく系統発生的再構築は、計算的に困難な作業であり、ゲノム間の比較及びそれらの可視化を容易にするために、分析は選択されたゲノムのサブセット上で行われた。全369個のゲノムが分析に含まれ、利用可能な4058個のゲノムのうちから無作為に選択した。コア及びノンコアSNPsを決定し、kSNPパイプラインと整合させた。
菌株の類似性の系統発生的ネットワーク表現を図2に示す。FA1090ゲノムは、F62株ゲノムとあるレベルの類似性を示すが、一般に、それはコレクションの全てのゲノムから非常に離れているようである。一般に、ネットワークは、約6個のコンパクトなクラスターの存在を有する星状構造を示す(図2の黒い矢印)。
cgMLST系統発生
全4058株の包括的ゲノム分析を、髄膜炎菌タイピングスキーマ(NM cgMLST v1.0)特性評価により行った。スキーマは、各ゲノム中の1605個の遺伝子座の配列に識別番号を割り当てる。この拡張多座プロファイル(識別番号のリスト)を用いて、ゲノムを互いに比較し、(菌株の系統発生を再構築するために)遺伝的距離を定義した。
遺伝子対称マトリックス(図3に示される)を調製し、菌株対間で計算した遺伝的マトリックス距離を示す。図2に示される再構成と一致して、集団の構造は、互いに分離された明確に規定されたクラスターによって特徴付けられた。対距離に基づく階層関係をマトリックスの両側に表す。このツリーでは、クラスターは十分に分離され、規定されている。
次に、シルエット最適化技術によってクラスターの最適数を決定した(図4)。この手順は、クラスター間の平均距離を最大化するツリー内のパーティションを識別する。スコアを最大化したパーティション数は24であった。
図3に示される菌株の対間の遺伝的距離のマトリックスに基づいて、各菌株について、他の全ての菌株からのその平均距離も計算した。この分析は、全集団に関する菌株「中心性」を表し、分析された全ての菌株について図5に示す。
中心性スコアは、淋菌集団の各菌株が遺伝的距離の観点からどれだけ中心又は末梢にあるかを測定する。より中心にある菌株は、平均して集団の他の菌株により類似している。このスコアに基づいて、本発明者らは、一般に、末梢にある菌株は、集団の平均の特徴を代表する良好な候補ではないと推測することができる。これらの菌株は、集団において特別であり、固有である傾向にある(すなわち、他の菌株とは異なる)。菌株のサブセットの中心性スコアを下記の表2に示す。
Figure 2023541876000002
図5に示されるように、菌株(丸印)は、プロットの最も「中心の」領域にある。参照FA1090株は、プロットの右隅にあり、最も末梢の菌株の1つであった。この位置から、FA1090株はコレクションの他の菌株とは遺伝的に多様であることが示唆される。
結論: 他の淋菌株の利用可能なゲノムと比較したFA1090全ゲノムの分析は、他の全ての淋菌株からのこの菌株の平均遺伝的距離が他の菌株のそれと比較してはるかに高いことを示した。これらの分析に基づいて、OMVベースのワクチン(OMVはFA1090株からブレブ形成される)は、ゲノム類似性に基づいて、広く交差防御ではない可能性がある。
[実施例2]
細菌株及び培養条件
GenbankアクセッションID: AE004969.1に開示されるFA1090株と99.97%の同一性を有する淋菌FA1090株を下記の実験に使用した(すなわち、実施例1からのFA1090株(2))。1% Isovitalexを添加した淋菌(GC)寒天培地(Difco)上で、37℃、5%CO2雰囲気下で18～24時間、菌株を慣用的に培養した。
[実施例3]
プラスミドの構築と形質転換
DNA操作は、標準的な実験方法[Sambrook J FE, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. 2012年;第4版]に記載されるように、慣用的に行われた。
Lpxl1: プラスミドpBS-ΔlpxL1 kanR [Oliver Koeberling, Anja Seubert, Dan M. Granoff. Bactericidal Antibody Responses Elicited by a Meningococcal Outer Membrane Vesicle Vaccine with Overexpressed Factor H-Binding Protein and Genetically Attenuated Endotoxin, The Journal of Infectious Diseases, 198巻, Issue 2, 15 July 2008, Pages 262-270を参照されたい]は、カナマイシン耐性遺伝子と相同組換えの上流及び下流領域とを含み、形質転換に必要なDNAの増幅のための鋳型として使用された。PCRは、プライマーlpxl1_UP FW(GGCATTTGTATTTTGCCGTCTG、配列番号9)及びlpxl1_DO REV(GCGAAATGTACGCCATTTTCTACGC、配列番号10)及びKAPA Hifi 2Xマスターミックス(Roche)を用いて、次の反応条件: 94℃で5分間、40サイクルの94℃、30秒、60℃で30秒及び72℃で3分間、最終ステップを72℃にて5分間で行われた。DNA精製は、製造業者のプロトコールに従ってQIAquick PCR精製キット(QIAGEN)を用いて行われた。
Rmp: rmp遺伝子の上流及び下流領域の増幅を、FA1090株のゲノムDNAの鋳型50ngとして使用して、プライマーカップルUpIII-FOR/REV及びDpIII-FOR/REVで行った。一方、エリスロマイシン耐性遺伝子(eryR)の増幅は、プライマーカップルEryR_gono_SmaI-Fw/Revを用いて、遺伝子を担持するプラスミドの鋳型10ngとして用いて行った(Serrutoら、2010)。下記の表3を参照されたい。精製されたPCR産物を、XbaI-SmaI(UP rmp)、SmaI(eryR)及びSmaI-XhoI(DOWN rmp)として、XbaI-XhoI(NEB)で消化したpBluescript KS+(Agilent,#212207)中にクローニングした。正確なクローニングを二重消化と電気泳動によって確認した。
Figure 2023541876000003
形質転換: 形質転換には、PCR産物(Lpxl1欠失の場合)又はXbaI線形化プラスミド(Rmp欠失の場合)のいずれかを用いた。野生型FA1090を、上述のPCR産物で形質転換して、FA1090(1KO)ΔlpxL1株を生成した。次に、この1KO株をXbaI線形化プラスミドで形質転換して、FA1090(2KO)Δlpxl1,Δrmpを生成した。形質転換を前述のように行い(Dillard JP. Genetic Manipulation of Neisseria gonorrhoeae. Curr Protoc Microbiol. 2011;Chapter 4:Unit4A.2)、形質転換体を、カナマイシン40μg/ml(Δlpxl1)又はエリスロマイシン2μg/ml(Δrmp)のいずれかを含むGC寒天プレート+1% Isovitalexに選択した。
全ての形質転換体を、Accuprime Taqポリメラーゼ(Thermo Scientific)及び外部プライマー(プライマーカップルlpxl1 est FW/REV及びUP_CHECK_NGO1577-Fw/DW_CHECK_NGO1577-Rev、それぞれΔlpxL1及びΔrmp)を用いたPCR分析により試験し、二重組換えの正しい事象を確認した(下記の実施例4及び7を参照されたい)。
[実施例4]
FA1090単一突然変異体(lpxL1)の生成
リポ多糖(LPS)は、主にリピドAに起因するエンドトキシン活性を有する。その毒性は顕著な反応原性をもたらすことができる。したがって、淋菌に対するOMVベースのワクチンの反応原性を低下させるために、lpxl1遺伝子(NGO0154)を欠失させた。
PorB IB対立遺伝子を含有するFA1090株を欠失のバックグラウンド株として用いた。
FA1090ΔlpxL1は、lpxL1遺伝子のコード配列の領域を抗生物質耐性カセット(カナマイシン)で置き換えた二重相同組換えによって得られた。
カナマイシンに耐性の突然変異体ΔlpxL1クローンを選択し、増幅し、それらのDNAを正しい突然変異の存在について試験した(図6)。
クローン#2を、カナマイシン及び誘導クローン(#2.1)を用いてプレートに画線し、グリセロールストックを調製し、DNA溶解物を生成した。組換え事象の外部にプライマーを用いることにより(図6A)、選択されたクローンを、lpxl1遺伝子の欠失及びカナマイシン耐性の遺伝子の獲得についてスクリーニングした。
全ての形質転換体を、Accuprime Taqポリメラーゼ(Thermo Scientific)及び外部プライマー(プライマーカップルlpxl1 est FW(CCGCCAAACTCAATCCTTCG、配列番号17)及びlpxl1 est REV(GCAAACTTTTGTTTCACCGTTTCCG、配列番号18)を用いたPCR分析により試験し、二重組換えの正しい事象を確認した。
野生型株におけるアンプリコンの予想される長さは、欠失突然変異体(2344bp)におけるものよりも短かった(1703bp)。図7に示されるように、クローン#2のDNAからのPCR産物は、野生型を表すより短いバンドと、欠失突然変異体の予想される長さのより長い1つとの2つのバンドを有する。他の全てのクローンは、サブクローン#2.1を含むより長いバンドを有し、これらのクローンの全てにおいて組換えが起こり、これらのクローンはlpxl1遺伝子を欠損していることを示唆している。
[実施例5]
FA1090単一突然変異体(lpxl1)における残存FA1090 WT淋菌の存在の調査
形質転換の間に、いくつかの細菌は使用した抗生物質に対して自然耐性を獲得するが、組換えから耐性カセットを獲得しない。
残留FA1090(すなわちWT)細胞の存在を調べるために(図6C)、野生型ゲノムに特異的なプライマーを用いたPCRを行った(図6B)。プライマーは親株ゲノムに特異的であるため、産物の存在は、総集団内の野生型細胞の存在を示している。逆に、産物が存在しないことは、均質な突然変異体集団を示す。
PCRスクリーニングは、野生型DNAに特異的な内部プライマー(NGO_lpxL1wtcheck-Fw(CCGCGTTCGAGATGG、配列番号19)及びNGO_lpxL1wtcheck-Rev(GCGGAACTGTTTGACGAG、配列番号20)を使用してAccuprime Taqポリメラーゼ(Thermo Scientific)を用いて行われた。
lpxl1欠失突然変異体の生成については、野生型特異的アンプリコンの予想される長さは176bpであった。したがって、バンドが観察されなかったクローンFA1090ΔlpxL1#4及び#2.1(図8)において、突然変異体集団は野生型細胞汚染から清浄であった。よって、外部プライマーを用いて適切な増幅プロファイルを有するFA1090ΔlpxL1#2.1を、さらなる実験のために選択した。
[実施例6]
LOSのペンタアシル化
lpxl1の欠失は、リピドAのペンタアシル化形態を有するリポオリゴ糖含量をもたらすことが公知である。したがって、リピドAのアシル化状態をMALDI-TOF分光法を用いて評価し、FA1090単一突然変異体(Δlpxl1)から得られたOMVにおけるLpxl1機能の欠失を確認した。
方法
リピドA抽出: 淋菌FA1090野生型株及びΔlpxl1(単一突然変異体)株から放出及び精製した100μgのOMVから、それぞれ1%(vol/vol)酢酸による穏やかな酸加水分解を用いて100℃で3時間沈殿させた。試料を14,000×gで15分間遠心分離し、ペレットを水に再懸濁し、水で2回洗浄した。次に、ペレットをSpeedVacを用いて一晩乾燥し、20μLのクロロホルム/メタノール(4:1比)に再懸濁し、以前に[Rossiら、Modulation of endotoxicity of Shigella generalized modules for membrane antigens (GMMA) by genetic lipid A modifications: relative activation of TLR4 and TLR2 pathways in different mutants. J Biol Chem. 2014年, 289巻(36号):24922～35頁]で報告されているように、同体積のSuper DHB溶液(Sigma)と混合した。
MALDI TOF分析: 2μlのリピドA抽出物を標的プレート(MTP 384標的プレート研削鋼BC、Bruker Daltonics)にロードし、反射イオン陰性モードでUltraflex MALDI-TOF(Bruker Daltonics)により分析した(Rossiら、上記で示した参考文献)。Super DHB溶液と混合したペプチド較正標準(Bruker Daltonics)を各分析に含めた。リピドAのMS/MS分析では、衝突誘導解離のために線形モード分析からの主ピークを選択し、得られた断片をイオン陰性モードでMALDI TOF-TOFにより検出した。スペクトルは、20個の異なるスポット領域上に50個の単一レーザーショットを集積化したものである。
結果: リピドAのMS分析: 野生型OMV(すなわち、遺伝子改変を伴わない野生型FA1090からブレブ形成したOMV)と、ΔLpxl1 OMVとからのリピドA構造をMS分析により評価した。
野生型OMVからのリピドAはm/z 1,632.03の主要分子イオンで観察され、これはリピドA(MPLA)のヘキサ-アシル、モノ-ホスホリル構造の理論質量と一致した。この主要形態に加えて、m/z1,711.97におけるジホスホリル種(BPLA)もまた同定された(図9A)。
m/z 1,449.84の分子イオンを有する主成分は、ΔLpxl1 OMVリピドAから取得したMALDIスペクトルから観察された(図9B)。野生型リピドAのMPLA型で観察された182 Daの質量の差は、単一のラウリン酸鎖(計算質量: 182.3 Da)の欠如と一致する。加えて、ΔLpxl1 OMVのスペクトルはまた、ラウリン酸鎖も欠くリピドAのジホスホリル型に対応するm/z 1,529.79のシグナルを明らかにした。リピドAの野生型に起因し得るMSシグナルは観察されなかった。
結果として、FA1090Δlpxl1から産生されたOMVは、MALDI TOF分析により、モノ及びジホスホリル種の両方の100%ペンタ-アシル化形態のLOS含量を有することが確認された(図9)。
[実施例7]
二重突然変異体FA1090(ΔlpxL1、Δrmp)の生成
PIIIとして以前に公知である還元改変可能タンパク質(Rmp)は、他の殺菌性抗体の効果を阻害することができるブロッキング抗体を誘導することが示されている[Gulati Sら、Antibody to reduction modifiable protein increases the bacterial burden and the duration of gonococcal infection in a mouse model. J Infect Dis. 2015年;212巻(2号):311～315頁][Joiner KA, Scales R, Warren KA, Frank MM, Rice PA. Mechanism of action of blocking immunoglobulin G for Neisseria gonorrhoeae. J Clin Invest. 1985年;76巻(5号):1765～1772頁]。
lpxl1単一突然変異体FA1090株からRmpを除去するために(したがって、二重突然変異体FA1090Δlpxl1,Δrmpを作製するために)、FA1090Δlpxl1#2.1株をpBSΔrmp eryR線形化構築物で形質転換した。
FA1090Δlpxl1,Δrmpは、rmp遺伝子のコード配列の領域を抗生物質耐性カセット(エリスロマイシン)で置き換えた二重相同組換えによって得られた。
エリスロマイシンに耐性の突然変異体Δlpxl1,Δrmpクローンを選択し、増幅し、それらのDNAを正しい突然変異の存在について試験した(図10)。組換え事象の外側のプライマーを用いて、rmp遺伝子を喪失し、エリスロマイシン耐性遺伝子を獲得したクローンを選択した。
全ての形質転換体を、Accuprime Taqポリメラーゼ(Thermo Scientific)及び外部プライマー(UP_CHECK_NGO1577-Fw(GTGTGTCCAGTCGTAGCAGG、配列番号21)DW_CHECK_NGO1577-Rev(AGGGATGATGATAAAACCATATCC、配列番号22)を用いたPCR分析により試験し、二重組換えの正しい事象を確認した。
野生型株におけるアンプリコンの予想される長さは2089bpであり、欠失突然変異体におけるアンプリコンの予想される長さは2590bpである。図10に示されるように、全てのクローンのPCR産物は、欠失突然変異体について予想される長さを有し、一方、野生型対照のバンドは、より短い見かけのサイズを有し、したがって、組換えが全てのクローンで起こり、これらでrmp遺伝子が欠失されたことを示唆する。
[実施例8]
残存単一突然変異体FA1090(Δlpxl1)淋菌の存在の調査
クローン#1(実施例7から)を、エリスロマイシン及び誘導クローン(#1.1)を用いてプレートに画線し、グリセロールストック及びDNA溶解物を生成した。
生成した二重突然変異体中の残存FA1090Δlpxl1細胞の存在を調べるために、元のゲノムに特異的なプライマーを用いてPCRを行った(図11を参照されたい)。PCRスクリーニングは、Accuprime Taqポリメラーゼ(Thermo Scientific)を用い、野生型DNAに特異的な内部プライマー(INTwt_NGO1577-Fw(TCGTACGCAACAACTATGGAG、配列番号23)及びINTwt_NGO1577-Rev(CATCAACATATTGAGGAGCCTG、配列番号24)を用いて行われた。
野生型特異的アンプリコンの予想される長さは150bpであった。バンドを鋳型として元のFA1090ΔlpxL1#2.1を用いて観察した。
アガロースゲルから、クローンFA1090ΔlpxL1Δrmp#1のDNAとの微弱バンドを観察することができたが、クローンFA1090ΔlpxL1Δrmp#1.1ではバンドが観察されなかったことから、突然変異体集団は元の細胞による汚染から清浄であることが示唆された。
さらなる実験のために、FA1090ΔlpxL1Δrmp#1.1を選択した。
[実施例9]
次世代配列決定によるlpxl1とrmp欠失の確認
方法: 凍結FA1090野生型(野生型)、Δlpxl1(単一突然変異体、1KO)及びΔlpxl1,Δrmp(二重突然変異体、2KO)ストックからのループフル(loopful)細菌をGC + 1% Isovitalex寒天プレート上に画線し、37℃及び5% CO2で24時間インキュベートした。細菌を5mLのPBS中に600nmで0.6の光学密度まで再懸濁した(Ultrospec 10細胞密度計 GE Healthcare)。2mlの細菌懸濁液を13000rpm、4℃で5分間、2回遠心分離し、上清を捨て、得られたペレットをGenElute Bacterial Genomic DNA Kits(Sigma Aldrich Cat #NA2110)を用いて、グラム陰性菌について、製造者の指示に従ってDNA精製に使用した。溶出は、予め加温した(70℃)ヌクレアーゼ不含水(ThermoFisher cat#10977-035)100μlで行われた。精製DNA濃度を、NanoDrop 1000 UV-Vis分光光度計を用いて測定し、DNA完全性を、0.8% TAEアガロースゲル電気泳動によってチェックした。
次世代配列決定ライブラリーは、製造業者のプロトコール(文書番号15031942 v02、2017年4月、Illumina)に従って、Nextera XT DNA Library Prepを用いて調製した。時間タグ化を8分間行い、配列決定アダプター(Nextera XT Indexキット24 インデックス-96試料; REF 15055294; LOT 10026832)でライブラリーにタグを付けた。ライブラリーを標準化し、1:25に希釈した。他のライブラリーは、製造業者のプロトコール(文書番号#1000000025416 v07;2019年5月;米国Illumina)に従って、Nextera DNA Flex Library Prepキットを用いて構築した。300ngのDNAをタグ化し、磁気ビーズで洗浄し、Illumina Enhanced PCR Mix及びデュアルインデックスアダプターを用いて5サイクルのPCRについて増幅した。インデックスは、インデックスアダプタープーリングガイド、Nextera DNA CDインデックス、Illumina(文書番号#1000000041074 v09)に従って選択した。増幅されたDNAを洗浄し、500～600塩基対の平均断片サイズに対してサイズを選択した。最終ライブラリーは、高感度DNAキットを用いてAgilent 2100バイオアナライザーで検査した。ライブラリーをプールし、4nM濃度に希釈した。プールを変性させ、MiSeq System(Denature and Dilute Libraries Guide Document # 15039740 v10, Illumina)に従って、1%非索引(non-indexed)PhiX対照ライブラリーでスパイクした。変性ライブラリーを12 pMの濃度でロードした。全てのライブラリーをIllumina MiSeqシーケンサー上で行い、250塩基対(2×250)のペアドエンドリード(paired-end reads)を用いて、500サイクルMiSeq試薬キットv2(Illumina, Cat No. MS-103-1003)を用いて配列決定を行った。
結果: FA1090Δlpxl1,Δrmp#1.1株のゲノムDNAを単離し、完全ゲノムをアセンブリした。このことから、2つの欠失遺伝子座の配列を抽出した。
次世代配列決定を用いて、
a)野生型FA1090(2)分離株におけるlpxl1遺伝子座の存在(図12)、
b)FA1090Δlpxl1Δrmp突然変異体におけるlpxl1の予想される欠失(図13)、
c)野生型FA1090(2)分離株におけるrmp遺伝子座の存在(図14)、及び
d)FA1090Δlpxl1Δrmp突然変異体におけるrmpの予想される欠失(図15)
を確認した。
[実施例10]
OMV調製
OMVは、界面活性剤の非存在下で調製され、したがって、天然OMV(nOMV)である。
本明細書に提示される分析のためのOMVを産生するために、500mLの細菌増殖を12,000×gで30分間遠心分離した。ペレットを廃棄した。
500mLの上清を100μlのベンゾナーゼ(1000U/mL)とともに24～72時間、4℃でインキュベートした。接種物を0.22μmフィルターで濾過し、次に300kDaカットオフの接線流濾過(TFF)を用いて一連の濃度及び洗浄ステップを行った。250mlまでの第1の濃度に続いて、5L PBS(20CV)との緩衝液交換を行った。次に、50mlまでの第2の濃度に続いて、2L PBS(40CV)での第2の洗浄を行った。次に、5～15mlへの最終濃縮ステップを行った。
次に、PBS中の精製OMVを、0.22μmシリンジフィルターで再度濾過することによって得た。
[実施例11]
Rmpタンパク質欠失の確認
SDS-PAGE及びペプチド質量フィンガープリント法: 野生型FA1090淋菌、FA1090ΔlpxL1(単一突然変異体)及びFA1090ΔlpxL1,Δrmp(二重突然変異体)から単離したOMVを、それぞれ、2%SDS最終を含有するSDS試料緩衝液中で5分間、95℃で変性させた。続いて、各調製物10μgを4～12%ポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad)にロードした。ゲルをクーマシーブルーで染色し、目的のバンドをゲルから切り出し、50mM重炭酸アンモニウム及びアセトニトリル(50:50、vol/vol)で1回洗浄し、純粋なアセトニトリルで1回洗浄し、風乾した。50mMの炭酸水素アンモニウム中の0.012μg/μl配列決定グレード改変トリプシン(Promega, Madison, WI)50μlを乾燥バンドに添加し、37℃で一晩消化させた。ペプチド混合物を含有する溶液をC18逆相カラムAcquity UPLCペプチドCSH C18 130Å、1.7μm 1×150mmにロードし、流速50μl/分及び50℃で28～85%緩衝液B(ACN中の0.1%(v/v)ギ酸)の直線勾配で分離した。MSデータは、HCD断片化のための70,000分解能でのサーベイスキャン(300～1600m/z)から最も豊富な5つの前駆体イオンを動的に選択するデータ依存捕獲モード(DDA)を用いてQ-Exactiveバイオファーマ質量分析計上で陽性モードにおいて得た。自動利得制御(AGC)を3×106に設定した。MS/MS獲得のために、3m/zウィンドウで前駆体の分離を行い、MS/MS走査を標準化衝突エネルギー26 eVにて200m/zで17,500の分解能で獲得した。
配列決定された淋菌FA1090ゲノムから推定されたタンパク質配列を含有するデータベースを用いて、Peaks Xソフトウェア(Bioinphormatics solution)を使用してMSスペクトルを分析し、タンパク質の同定を行った。
結果: 野生型、Δlpxl1(単一突然変異体)及びΔlpxl1,Δrmp(二重突然変異体)FA1090淋菌から得たOMVをSDS-PAGEにより分析した。ゲルのクーマシー染色後、見かけの分子量約28kDaで移動するバンドのタンパク質含量を同定した。タンパク質をゲルトリプシン消化し、生成したペプチドをLC-MS/MSにより分析した。野生型OMV及びΔlpxl1(単一突然変異体)OMVから観察されたバンドから、Rmp並びに不透明タンパク質B及びDを同定した。ΔLpxl1、Δrmp(二重突然変異体)OMV(図16参照)から観察されたバンドからは、不透明タンパク質B及びDのみが同定された。
[実施例12]
FA1090二重突然変異体によって産生されたOMVに存在するタンパク質成分に基づく、全球淋菌株間の遺伝的変動性の比較
本質的に同じゲノム比較(実施例1に概説される)が、FA1090二重突然変異淋菌Δlpxl1、Δrmpからブレブ形成された外膜小胞のタンパク質成分のみを考慮して行われた。
OMVのタンパク質成分のリストは、以下のようにOMV生成物の質量分析特徴付けによって導いた。
FA1090ΔLpxl1、Δrmp二重突然変異体(2KO)株からの4つの異なるOMV産生を質量分析(MS)のために考慮した。これら4つの産生物のうち3つを、2つの異なる消化プロトコールを用いて2回分析した。全部で7つの調製物をMSにより分析した。各試料のMSデータを独立に分析し、タンパク質及びそれらの相対的存在量を同定した。FA1090公開ゲノム注釈及びPSORTbソフトウェアと比較して、タンパク質に注釈を付け、細胞局在を予測した。各々独立したMS分析のタンパク質のリストは、細胞質として予測され、0.05%を下回る相対的存在量を有するタンパク質を除去することによって濾過した。最後に、得られた59種のタンパク質の最終リストを、各MS実験によって明らかにされた7つのフィルタリングされたリストを結合することによって決定した。
MSによって同定された59種のタンパク質のうち、多くのタンパク質が全てのOMV産生(下記の表4に概説される)にわたって同定され、総OMVタンパク質の0.6%(w/w)を超える濃度で観察された。
Figure 2023541876000004
MS特徴付けを用いて同定された59種のタンパク質を用いて、(タンパク質配列レベルで)多座タイピングスキーマを規定した。コレクションの全4058株をタイピングして、各菌株にタンパク質対立遺伝子識別子を割り当てた。
実施例1に記載したように、これらの拡張プロファイルを用いて、菌株間の変異を測定し、遺伝的距離を測定した。シルエットスコア分析から得たクラスターの最適数は22群であった。
以前に記載したように、中心性スコアは、淋菌集団の各菌株が遺伝的距離の観点からどれだけ中心又は末梢にあるかを測定する。遺伝的距離に基づいて、FA1090二重突然変異体OMV組成物の中心性を図17に報告する。菌株のサブセットの中心性スコアを以下の表5に示す。
Figure 2023541876000005
この分析は、全ゲノムレベルで行われた以前の分析と一致している(実施例1を参照されたい)。さらに、この分析はまた、FA1090 OMVのタンパク質成分について、FA1090がコレクションの他の菌株からゲノム的に離れていることを確認する。
[実施例13]
TLR-4を活性化するためのFA1090突然変異体由来のOMVの能力の試験
lpxl1遺伝子の欠失は、ペンタ-アシル化リピドAのみを産生し、減少したToll様受容体4(TLR4)シグナル伝達を示す細菌を生じさせる[Zhou X, Gao X, Broglie PMら、Hexa-acylated lipid A is required for host inflammatory response to Neisseria gonorrhoeae in experimental gonorrhoea. Infection and Immunity. 2014年1月;82巻(1号):184～192頁]。
FA1090Δlpxl1突然変異体及びFA1090Δlpxl1、Δrmp突然変異体によって発現されるリピドAのペンタ-アシル化形態がTLR4を活性化する能力を評価するために、野生型FA1090株由来のOMVと同様にこれらの突然変異体から調製されたOMV(図18においてGMMAと称する)を、ヒトTLR4を安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞及びNF-kBの制御下でルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドで試験した。
これらのデータは、FA1090Δlpxl1(単一突然変異体又は1KO)及びFA1090ΔlpxL1、Δrmp(二重突然変異体又は2KO)突然変異体の両方が、野生型FA1090株によって発現されるものと比較してTLR4を活性化する能力が非常に減少した突然変異型リピドAを発現することを確認する(図18を参照されたい)。
[実施例14]
他の淋菌株で調製した二重突然変異体(ΔlpxL1、Δrmp)の液体増殖に対するFA1090二重突然変異体(Δlpxl1、Δrmp)の液体増殖の比較
本実験の目的は、プレート(液体増殖に適応しない)からの液体培養中の多数のΔlpxl1、Δrmp株の増殖プロファイルを直接比較することであった。選択したワクチン株のスケールアップの可能性を評価するためには、液体培養中での二重突然変異株の増殖能が重要な考慮事項であった。
実施例3～4及び7に記載したように、FA1090、F62、SK92-679、BG13、BG17及びBG27株において二重突然変異体(Δlpxl1、Δrmp)を作製した。
以下の菌株を、凍結グリセロールストックからのGC+ Isovitalex 1%プレート上に画線した。
1. FA1090 Δlpxl1、Δrmp (FA1090ΔΔ)
2. F62 Δlpxl1、Δrmp (F62ΔΔ)
3. SK92-679 Δlpxl1、Δrmp (SK92-679ΔΔ)
4. BG13 Δlpxl1、Δrmp (BG13ΔΔ)
5. BG17 Δlpxl1、Δrmp (BG17ΔΔ)
6. BG27 lΔpxl1、Δrmp (BG27ΔΔ)
単一のコロニーを得るために、グリセロールストックからのループフル細菌を画線した。各菌株について4プレートを調製した。プレートを37℃及び5%CO2で30時間インキュベートした。
この実験のために2種の異なる培地を調製した。
1. GC+ Isovitalex 1%+乳酸塩7.5g/L(又はGC+乳酸塩):3gのNa-(DL)乳酸塩(Sigma Aldrich)をGC+ Isovitalex 1%培地400mLに可溶化し、500mLの0.22μmフィルターボトル(Millipore)で濾過滅菌した。
2. MCDMI-mod(又はMCDMI-5g/L乳酸塩): 培地1Lを下記の方法(表6)に従って調製した: PHをNaOHで7に調整し、次に培地を1Lの0.22μmフィルターボトル(Millipore)で濾過滅菌した。
Figure 2023541876000006
全ての菌株を6mLのGC+乳酸塩中で寒天プレートから再懸濁した。単一のコロニーのみを用いた。
次に、懸濁液を50mLのGC+乳酸塩及びMCDMI-mod培地中で、換気カップ(Corning)を有する250mL使い捨てバッフル振とうフラスコ中で、約0.3のOD600nm(600nnmにおける光学密度)まで希釈した。開始OD600nmを記録し、フラスコを37℃及び160rpmで振とうしながらインキュベートした。
固定相に達するまでOD600nmをモニタリングした。
異なる増殖性能が、2つの異なる培地において観察された(図19に示されるデータ)。
- 乳酸塩を添加したGCでは、F62ΔΔ及びSK92 - 679ΔΔでのみ増殖不良が観察された。他の菌株の増殖は成功した。MCDMIでは、F62ΔΔが最良の成績であった。一般に、MCDMI培地は、F62とFA1090二重突然変異体株(「ΔΔ」は二重突然変異体を示す)の両方の増殖に適しているように思われたが、一方、BG13ΔΔ及びBG27ΔΔは増殖することができたが、増殖速度及びバイオマス収量に関しては限定的であった。BG17ΔΔについて、MCDMI-mod培地は液体の増殖には適さないようである。SK92-679ΔΔは、試験した両方の培地において増殖欠損を示した。
要約すると、
- BG13ΔΔとBG27ΔΔはGCベース培地を強く好む両方の培地を培養することができる。
F62ΔΔ(MCDMI培地を強く好む)では逆の状況が観察された。
- BG17ΔΔはGCベース培地でのみ培養できる。
- SK92-672ΔΔはGCベースの培地でのみわずかな増殖が観察され、試験した両培地において増殖欠損を示す。
- FA1090ΔΔは両方の培地で培養することができ、将来のスケールアップを可能にするための柔軟な菌株となる。それは試験した両培地で同等の増殖速度を示す。しかしながら、培地によっては、他の二重突然変異株は同等の増殖を示す(MCDMI-mod中のF62ΔΔ、並びにGC+乳酸塩中のBG13ΔΔ、BG17ΔΔ及びBG27ΔΔ)。
[実施例15]
培養上清由来のOMVの直接定量によるOMV生産性の評価
6種類のΔlpxl1、Δrmp株(実施例14において利用した)を用いて、OMV生産性を評価した。
培養物を4000rpmで30分間ペレット化し、上清をステリカップ0.22μmフィルターで濾過した。
蛍光色素FM4-64を用いて、2つの増殖条件(実施例14に記載される)における各菌株についてOMV生産性を推定した。色素は、膜二重層に挿入された場合に蛍光を発する。蛍光強度は、培養上清(OMV)中の膜の量に比例し、標準曲線を用いて決定した直線性範囲である。各試料について、色素を試料上清に直接1:100に希釈した。標準曲線は、FA1090から精製したOMVを、増殖に使用したのと同じ培地中で、1:100に希釈したFM4-64色素で連続希釈することによって調製した。
各試料について、色素添加有り及び無しで蛍光を記録し、色素無しの上清のバックグラウンド蛍光を色素処理試料値から差し引いた。培地のみのブランクも差し引いた。培養上清中のOMV濃度を、標準曲線からの値外挿によって評価し、図20において、各菌株及び増殖条件についての2つの生物学的複製の平均として報告した。
図20Aに示されるように、OMV体積生産性は、異なる菌株によって2つの培地に到達した異なるバイオマスを反映するF62ΔΔ株を除いて、GCベース培地においてより高かった。驚くべきことに、特にMCDMI培地で観察された非常に低い増殖にもかかわらず、SK92-679ΔΔ株についても高い値が得られた。最も高い生産性は、GCベース培地においてFA1090ΔΔによって達成された。
算出された値はまた、各条件における各菌株によって到達した異なるOD600nm上で標準化され、特定の生産性を比較した(図20Bを参照されたい)。特定の生産性に関して、両方の培地において到達した低いOD600nmと登録されたOMVの比較的高い体積生産性を考慮すると、SK92-679ΔΔ菌株は予想通り非常に高い値を示した。しかしながら、これらの生産性値が実際のOMV放出によるものか、又は培養上清中に非特異的に放出された細胞残渣によるものかは不明である。
GCベースの培地における他の菌株について、生産性の範囲は、FA1090ΔΔ、BG13ΔΔ及びBG17ΔΔで20～30mg/L/ODであり、一方、F62ΔΔではわずかに高く、BG27ΔΔでは低かった。同様の状況がMCDMI-mod培地で観察され、大部分の菌株は10～20mg/L/ODの生産性範囲を示し、BG27ΔΔではわずかに低かった。
FA1090及びF62の二重突然変異体はいずれも健全な増殖性能を示し、OMV産生に関して最も生産性の高い菌株とみなされた(低バイオマスに起因するSK92-679の異常所見を除く)ことから、これら2つの菌株のOMVを免疫原性分析のために選択した。
[実施例16]
FA1090突然変異体由来のOMVの免疫原性の評価
OMVは、FA1090Δlpxl1、Δrmp二重突然変異体(2KO)及び同様の淋菌のF62株のΔlpxL1、Δrmp二重突然変異体から調製された。
これらのOMVの免疫原性をCD1マウスにおいてインビボで試験した。
7週齢のCD1雌マウスに、Alum(3mg/ml)に製剤化したこれらのOMV製剤(10μg)又はAlum単独を腹腔内(IP)経路で1日目及び29日目に2回免疫化した。血清は、ワクチンの初回投与前(免疫前血清)及び2回目のワクチン投与後(2回後血清)に採取された。
機能的抗体は、ヒト血清殺菌アッセイ(hSBA)及び細菌付着阻害(BAI)によって測定された。
hSBA法
細菌を、丸いGC+1%Isovitalex寒天プレート上の凍結アリコートから画線し、37℃、5%CO2で16(±2)時間インキュベートした。
インキュベーション後、コロニーを10μlの滅菌細菌ループを用いて採取し、1%Isovitalexを含有する10mlのGCブロス(37℃で予熱)に接種して、開始レベルの光学濃度(OD、600nm)0.1を得た。次に、培養物がOD600nm＝約0.3～0.4に達するまで、細菌懸濁液を穏やかに振とう(180rpm)しながら37℃でインキュベートした。次に、細菌をSBA緩衝液(DPBS、1%BSA、0.1%グルコース)中で1:10,000に希釈した。
次に、熱不活化マウス血清をSBA緩衝液中で希釈し、プレート中の最終体積を25μl/ウェルとした。次に、希釈細菌17μl/ウェル及び正常ヒト血清8μl/ウェルを添加した。反応混合物を、穏やかに振とうしながら1時間、37℃でインキュベートした。反応後、各ウェル7μlをスクエアGC+1%Isovitalexプレート上にプレートし、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。
培養後、プレート上の各スポットのコロニー数を手動でカウントし、各プレート上の各スポットに記録した(コロニー形成単位、CFU)。プレートは、MACROLAB装置によって獲得された。
陰性対照は、潜在的な血清毒性を検出するために、熱不活化補体及び血清試料の存在下で試験した細菌と、潜在的な補体毒性を検出するために、血清試料を含まない活性ヒト補体の存在下で試験した細菌とであった。
殺菌力価は、血清希釈の逆数として計算され、血清なしの対照と比較して50%の殺菌を与えた。
BAI法
-4日目:SV-HUC-1細胞を、F-12 Nutミックス培地+10%FBS中の96ウェルプレートに播種した(35000細胞/ウェル)。
-1日目:GC+1%Isovitalex寒天プレート上の凍結アリコートから細菌を画線培養し、一晩、37℃でインキュベートした。
0日目:
ステップ1)細菌調製: 培地GC1%Isovitalex中でA600nm=0.5まで細菌を増殖させた。次に、細菌をオレゴングリーンで染色して最終A600=0.05に到達させた。
染色を行うために、細菌を5分間、8000rpmで遠心分離し、次にPBS中で1:200に希釈した1mg/mlオレゴングリーンに再懸濁した。次に、染色された細菌を15分間、37℃でインキュベートし、PBS中で洗浄し、1mlのPBS/BSA2%に再懸濁した。
ステップ2)血清希釈: 96個の丸型ウェルプレートで血清を1:100に希釈し、次に10希釈点(1:100～1:51200又は1:100～1:1968300)について連続希釈した(相同株又は異種株に依存する)。
ステップ3)中和: 60μlの血清+60μlの細菌を室温で15分間インキュベートした。
血清+細菌(100μl/ウェル)を添加する前に、細胞をPBS中で3回洗浄し、次に37℃で1時間インキュベートし、2回目の洗浄(PBS中で3回)後、細胞をホルムアルデヒド4%、暗所において20分間、室温で再懸濁した。次に、別の洗浄(PBS中で1回)後、それらをウェルあたり100μlのH2Oに再懸濁した。
プレートをOpera Phenix(又は暗所にて+4℃で保存)で読み取った。BAIは、血清の非存在下において、細菌と比較して、血清試料の各希釈によって誘導された細菌付着阻害のパーセンテージとして、以下のように計算した。
各希釈iにおける各試料jについて、細菌付着阻害%を以下のように計算した。
Figure 2023541876000007
0% 細菌体積は、Alumで免疫化した試料の血清について観察された細菌体積の平均値と等しい。
100% 細菌体積は0に等しいが、付着は認められない。
結果:
補体源としてヒト血清を用いた2回の免疫化後に採取したプール血清において、FA1090、WHO-M、F62、MS11、WHO-N、及びSK92-679株に対してhSBAを測定した(図21)。
結果は、試験した6菌株のうち5菌株について、FA1090二重突然変異体由来のOMV(図21においてGMMAと称する)は、F62株における同様のΔlpxl1,Δrmp二重突然変異体から産生されたOMVによって誘導された力価よりも驚くほど高いSBA力価を誘導することができた。FA1090とF62二重突然変異体(Δlpxl1,Δrmp)由来のOMVはいずれも、SK92-679株に対して殺菌力価を誘導することができなかった。
2回の免疫化後に収集したプール血清中のFA1090(図22A)、SK-92-679(図22B)及びWHO-M(図22C)株に対してBAIを試験した。
結果は、全ての試験された菌株について、FA1090 2KO由来のOMV(図22においてGMMAと称される)が、細胞への細菌付着を阻害することができる機能的抗体を誘導することを示す。
[実施例17]
FA1090突然変異体由来のOMVによる抗rmp抗体の誘導の評価
7週齢のCD1雌マウスを、1日目及び29日目に、FA1090ΔlpxL1突然変異体(又は1KO)由来の1ロットのOMV、及びAlum(上記される)中に製剤化されたFA1090Δlpxl1,Δrmp二重突然変異体(又は2KO)由来の2ロットのOMVで2回、IPで免疫化した。
抗rmp IgGは、プール血清についてLuminexアッセイによって測定された。
図23における結果は、FA1090ΔlpxL1単一突然変異体(1KO)由来のOMV(図23においてGMMAと称される)がrmpに対する抗体の産生を誘導することができる一方で、FA1090二重突然変異体(2KO)由来のOMVは抗rmp IgGを誘導しないことを示し、さらに、FA1090 2KOにおけるこのタンパク質の不在を実証する。
[実施例18]
Rmp欠失は過剰ブレブ形成性である淋菌をもたらす
10回の2Lスケール発酵を行った。FA1090Δlpxl1(試行#1～3)を有する3株、及びFA1090Δlpxl1,Δrmp(2KO)株を有する7株(試行#4～10)である。OMVの収量は、最終濾過ステップ(実施例10に概説したステップ)後に得られたOMV画分に対応する濃縮バルク(CB)の時点で計算した。データを表7に示す。
Figure 2023541876000008
Δlpxl1(単一突然変異体)は回収時にΔlpxl1,Δrmp(二重突然変異体)と比較して高い最終OD OD590に達し、すなわち6.8±0.3対4.3±0.8である。しかしながら、濃縮バルクで測定したOMV収量は、Δlpxl1,Δrmp(二重突然変異体)(49±11対15±1mgタンパク質/L濾過上清)で2倍以上である。したがって、二重突然変異体の生産性(ODあたり)は5.28倍(2dp)高い。
[実施例19]
CD1マウスにおけるフォローアップ免疫原性研究
研究設計: 7～8週齢(10/群)の雌CD1マウスに、Alum(3mg/mL)に吸着させた2KO(Δlpxl1,Δrmp)FA1090 OMV(200μL中10μg)若しくはAlum単独(200μL)又は比較対照ワクチンBexsero(200μL)の7つの異なるロット(TRD4～TRD10と標識)で、1日目、29日目及び57日目に3回腹腔内(IP)免疫化した。
Bexseroの髄膜炎菌B群外膜小胞成分が淋菌感染に対して交差防御可能であることが観察されたため、比較対照ワクチンとしてBexseroを使用した(Petousis-Harris Hら、Lancet 2017年; 390巻:1603～1610頁)。
OMVロットは、発酵が2Lスケールで行われたことを除き、以前に記載したように調製され(実施例10を参照されたい)、OMVを精製するために、各試行について400～550mLの濾過された上清に対応するアリコートを処理した。
1回目のワクチン接種前(0日目)、2回目のワクチン接種後4週間(4wp2)及び3回目のワクチン接種後2週間(2wp3)に血液試料を採取した。膣洗浄液を2週間後に採取した。
免疫応答の分析は、4wp2及び2wp3を試験する2KO FA1090 OMVの全7ロットで免疫化した動物由来のプール血清について行われた。7ロットのうち3ロット(TRD4、TRD5及びTRD9)で免疫化した動物からの1回の血清2wp3及び膣洗浄液2wp3について、免疫応答のより広範で統計的に検出力の高い分析を行った。TRD4、TRD5及びTRD9は、ウエスタンブロット(データは示さず)によって決定した場合、それらの純度(GROELタンパク質汚染の低下)に基づいて選択した。
方法:
・hSBAを実施例16に記載のように測定した。実施例12で行われた遺伝学的分析に基づいて、10個の異種株を選択した(すなわち、異なる遺伝子クラスターにわたって代表的な菌株のパネルを選択した)。以下のように異なるPorBバリアントを発現する菌株も選択した:
〇PorB 1a株-SK92-679、WHO-F、WHO-G、WHO-N
〇PorB 1b染色-FA1090、F62、MS11、BG27、WHO-M、BG8、GC14。
・血清及び膣洗浄液中のIgG、又はFA1090 2KOワクチン候補に対する膣洗浄液中のIgAの定量は、本質的に以下に記載されるようにLuminexを使用して行われた。
- Luminex Magplexビーズを室温で平衡化し、製造者の指示に従って使用するために調製した。活性化及び洗浄したビーズを、50mM MES pH5に懸濁した40μg/mLの2KO FA1090 OMV(TRD9)とともに2時間インキュベートした。結合ビーズを最終的にPBS/0.05%Tweenで2回洗浄し、500μLのPBS/0.05%Tween/0.5%BSA(アッセイ緩衝液)中に4℃で保存した。
- 個々の血清試験については、各プレートを独立した試験とみなし、8個のブランクウェル、標準血清(STD)の2個の複製及び試験される9個の血清を含んだ。個々の膣洗浄試験では、各プレートを独立した試験とみなし、10個のブランクウェル、標準血清(STD)の2個の複製及び試験される10個の膣洗浄液を含んだ。
- 血清及びSTDをアッセイ緩衝液中で予め希釈し、次に96ウェルマイクロタイタープレート(最終体積50μL/ウェル)中で8個の連続した3倍希釈ステップを行った。膣洗浄に関して、7個の連続した3倍希釈ステップを分析した。
- 2KO FA1090 OMVs TRD9と結合したビーズを調製して、3000ビーズ/ウェルを分配した。プレートに分注する直前に、ビーズを約20秒間ボルテックスにより混合し、次に、50μLを、ウェルあたり100μLの最終体積で予め希釈された血清に添加した。
- プレートを700rpmのプレート振とう機上の暗所にて室温で60分間インキュベートし、インキュベーション後、未結合抗体を200μLのPBS(洗浄緩衝液)でプレートを3回洗浄することにより除去した。
- 特異的抗OMVs IgG検出のために、次に、各ウェルに、PBS pH7.2、0.05%Tween 20、0.5%BSA中の2.5μg/mLのR-Phycoerythrin-AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗マウス-IgG Fcγ断片特異的(Jackson Immunoresearch 115-116-071)を50μLロードし、プレートを700rpmのプレート振とう機上で暗所にて60分間室温でインキュベートした。
- 特異的抗OMV IgA検出のために、次に、各ウェルに、PBS pH 7.2、0.05%Tween 20、0.5%BSA中の5μg/mLのR-Phycoerythrinヤギ抗マウスIgA(Southern Biotech 1040-09)を50μLロードし、プレートを700rpmのプレート振とう機上で暗所にて室温で60分間インキュベートした。
- 洗浄後、ビーズを100μLのPBSに懸濁し、振とうした後、Bioplex 200で分析した。データは、Bioplex Managerソフトウェア 6.2(BioRad)によってリアルタイムで取得され、標準曲線のモデルに適合させるためにも使用された。
結果: Alumに吸着されたFA1090 2KO OMVワクチン候補を用いたCD1マウスの免疫化は、以下の誘導をもたらした:
・試験した全てのFA1090 2KO OMVワクチンロット(7ロット)のFA1090相同株に対する4wp2及び2wp3プール血清中の同等のhSBA力価 - 図24を参照されたい
・AlumとBexseroの両方と比較した、相同株FA1090及び試験した10の異種株のうちの8株に対する、全FA1090 2KO OMV試験ロット(3ロット)の単一2wp3血清のヒト補体(hSBA)力価を用いた場合の統計的に有意に高いSBA - 図25を参照されたい
・試験した全FA1090 2KO OMVワクチンロット(7ロット)の4wp2及び2wp3プール血清における同等の特異的抗OMV IgG力価 - 図26
・AlumとBexseroの両方と比較した、FA1090 2KO OMV試験した3つ全ロット(図27)及び膣洗浄液の単一2wp3血清の統計的に有意に高い抗OMV IgG力価 - 図28A及び28B、
・AlumとBexseroの両方と比較した、FA1090 2KO OMV試験した3つ全ロットの膣洗浄液の統計的に有意に高い抗OMV IgA力価 - 図29A及び29B。
結論:異なる免疫学的メカニズムを遮断することができる機能的免疫応答の実証及びBexsero市販ワクチンと比較した優位性は、FA1090 2KO(Δlpxl1、Δrmp)OMVワクチン候補を支持する重要な証拠を構成する。
FA1090 2KO OMVワクチンは、同種株FA1090及び試験した異種株の大多数において、統計学的に優れた殺菌力価(AlumとBexseroの両方と比較して)を誘導することができた。
マウス血清及び膣洗浄液のLuminex分析により測定した免疫原性応答は、OMV特異的抗体の有意な誘導を示した。特に、FA1090 2KO OMVワクチンは、血清と膣洗浄液の両方でAlum及びBexseroと比較して、GMR≧2(LL 95%CI)のより高い抗OMV IgG力価を誘導し、膣洗浄液のAlum及びBexseroと比較して、GMR≧2(LL 95%CI)の抗OMV IgA力価を誘導することができた。
最後に、マウスにおけるデータ(実施例16に提示された)は、3つの異なる淋菌株(相同株FA1090及び2つの選択された異種株)の尿路上皮を代表する一次尿管細胞株SVHUC-1細胞への付着を阻害する抗体を誘発するFA1090 2KO OMVワクチン候補の能力を実証した。
これらの前臨床結果を総合すると、Alumに吸着されたFA1090 2KO OMVワクチン候補の免疫原性が支持される。
[実施例20]
FA1090ワクチン株対GC_0817560の比較
目的: FA1090 2KO OMVに存在する最も豊富なタンパク質の公に利用可能で配列決定されたゲノムからタンパク質配列を検索し(実施例12を参照されたい)、FA1090 2KO((Δlpxl1、Δrmp)及びGC_0817640株の間でOMVに存在する最も豊富なタンパク質のタンパク質配列及び多様性を比較し、機能的OpaBの発現を制御する相可変経路を特徴付けること。
材料及び方法
FA1090_2KOゲノムのアセンブリ: 本明細書に提示された実施例で使用されるFA1090 2KO株のゲノム(Δlpxl1、Δrmp)を、実施例9に記載されるように配列決定した。2回の配列決定から得られた生データを混合し、一緒にアセンブルして、合計2,161,273bpの染色体及びアクセサリーショートプラスミドの最終的な、閉じた、完全なアセンブリを作製した。
GC_0817560ゲノムのアセンブリ: 淋菌株GC_0817560のゲノム配列(コンティグレベルで)は、PubMLSTデータベースから公に利用可能であった。利用可能な配列は閉じておらず、151個のコンティグで構成されており、全長は2,154,632bpである。データベースはまた、European Nucleotide Archive (ENA)から入手可能な、アクセッション番号ERR349896のオリジナルのIllumina生データも指した。
最も豊富なGMMAタンパク質成分のタンパク質配列の同定: 実施例12に記載したように、上位タンパク質成分はOMVのタンパク質質量の>80%を占めた。最も豊富なタンパク質は、PorB及びOpaファミリータンパク質であった。
FA1090 2KO、GC_0817560及び他の公に利用可能なゲノム上のPorB遺伝子の同定: PorBのタンパク質配列を、DNA及びタンパク質配列レベルでの相同性BLAST検索により抽出した。BLAST相同性検索に基づくBigsdbソフトウェアを用いて検索を行った。PorBの推定開始及び終止遺伝子配列位置は、PubMLSTデータベース(遺伝子座NEIS2020、FA1090ゲノム識別子NGO1812)によって注釈付けされたものである。
Bigsdbソフトウェアは、ゲノム配列上の遺伝子座の位置を同定を可能にし、各ゲノム中のこれらの遺伝子座に、遺伝子及びタンパク質のユニークな識別子を割り当てた。PubMLSTデータベースから現在までに入手可能な全ての淋菌株のタンパク質配列のマルチプルアラインメントを、MUSCLEソフトウェアを用いてPorBについて行った。NJ法及び配列間のp-距離により、MEGAソフトウェアを用いてタンパク質系統発生の再構築を行った。
FA1090 2KO及びGC_0817560ゲノムから抽出したタンパク質配列のグラフ表示を、BioEditソフトウェアを用いて作成した。可変コドンは、Blosum62同一性/類似性距離マトリックス(Blosum62マトリックスにより定義され、BioEditソフトウェアにより報告されているように、黒色の可変コドン、ボックス内の類似の物理化学的特性を有する可変コドン)により着色した。
FA1090 2KOゲノム上のOpa遺伝子の同定: 淋菌FA1090株ゲノムの注釈(GenBank Refseqデータベースからのアクセッション識別子NC_002946)を用いて、内部配列決定されたFA1090 2KO(Δlpxl1、Δrmp)閉鎖ゲノム上の遺伝子に注釈を付けた。遺伝子配列をBedtools getfasta機能で抽出し、次にBLASTを用いて最も近いマッチを得た。
GC_0817560ゲノム上のOpa遺伝子の同定: GC_0817560ゲノム上の遺伝子座の同定は、FA1090 2KOゲノム+それらの隣接領域(上流及び下流1000ヌクレオチド)から抽出された配列から出発して、FA1090 2KOゲノムと本質的に同じ方法で行われた。これらの配列を使用して、BLASTを用いて遺伝子の正確な位置を同定した。このアプローチはまた、GC_0817560ゲノム上で、各Opa遺伝子の上流及び下流に注釈を付けた隣接する遺伝子の位置を検索することによって補完された。
opaBのための集団定量化: タンパク質の完全なバージョンで翻訳された配列を有する集団中の細菌数を評価するために使用された分析パイプラインは、Illumina配列決定リードを、FA1090 2KOゲノムの閉じたゲノム配列にマッピングすることから始まる。
この実施例に含まれる試料は、次の通りである:
・FA1090_野生型(遺伝子改変を伴わない野生型FA1090株)
・FA1090_2KO_適合(Δlpxl1、Δrmp)
・ENA(id:ERR349896)からダウンロードしたGC_0817560リード
・他の株: F62、SK92-679、WHO-F及びWHO-Gの配列、並びにENAからダウンロードしたWHO-M及びWHO-Nの公開配列(id:WHO-MについてはERR352751及びERR388420、WHO-NについてはERR363586)を含む。
マッピングのために、デフォルトパラメータを有するBurrows-Wheeler Aligner(BWA)memアルゴリズムを利用した。これは、それが自動的にmate-pairを使用し、各リードをゲノム上の単一位置に割り当てるためである。これらの2つの特徴は、密接によく似たパラログを有する遺伝子リードの正確なアラインメントに特に重要である。アラインメント後、作成されたファイルは選別され、samtools suiteでインデックスを付された。samtools tviewの反復を通して、参照配列(スペースを除去した後)が閉じたゲノム上の短い反復配列(SSR)+2つの隣接塩基の長さに達するまで、目的の領域にアラインメントする全てのリードを抽出するためにRスクリプトを使用した。その後、スクリプトは領域全体をカバーしないリードを削除し、リードごとに観察されたSSRの長さを要約した。
翻訳スクリプトは、次のように連結してその遺伝子座の塩基配列をアセンブルした:
- 開始コドンからSSRの開始までのFA1090 2KOゲノムから抽出した配列
- SSR全体にわたって整列された各リードから切断されたSSRの配列
- SSRの末端から終止コドンまでのFA1090 2KOゲノムから抽出された配列。
次に、各アセンブルされた配列は、seqinr Rパッケージからの特定の関数を使用して翻訳され、ON/OFF集団のパーセンテージが計算される。
結果
PorB: PorBは、FA1090_2KO株由来のOMVにおいて最も豊富なタンパク質である(実施例12を参照されたい)。PorB分子の淋菌の全体的な多様性は、図30の系統発生樹に示される。
FA1090_2KO及びGC_0817560由来のPorBタンパク質配列の直接比較は、PubMLST分類から細胞外可変ループ(1～8)が同定される、図31のタンパク質配列アラインメントに示される。
この2つの菌株に含まれる分子は、PorB IB対立遺伝子型に分類される。図31は、2つの菌株間のPorBの多様性が主に細胞外ループ5、6及び7に焦点を当てていることを示す。細胞外ループの機能的役割は、淋菌PorB分子について深く研究され(Infect Immun. 2013年12月; 81巻(12号): 4383～4391頁)、特にループ4～7は補体調節因子C4bpに結合し、血清媒介性殺傷に対する耐性の変動に役割を果たすことが示された。
Opa: FA1090 2KO株では、11個のOpa遺伝子座が同定された(表8を参照されたい)。それらの大部分はコンセンサス配列におけるOFF相変異であった。公開データベース上ではON配列を有するopaDについて、本発明者らは、内部的に配列決定された試料中にOFF配列を観察した。2KO FA1090株では、opaBが優勢である。
Figure 2023541876000009
この分析は、opaBの完全なアミノ酸配列をもたらす配列決定された集団における細菌の割合を評価することに成功した。
opaBは、FA1090淋菌OMVにおける2番目に豊富な抗原であり、ほぼ全集団が、FA1090 WT(89%)と2KO(中央値96%)の両方における完全なタンパク質において翻訳することができる配列を発現する。逆に、GC_0817560、及びこの分析において報告された他の菌株は、完全なタンパク質の量がそれぞれ20%及び中央値19%と低い(図32を参照されたい)。
結論
このデータは、分析した2つの菌株のPorB配列がループ領域において相違し、機能的OpaBタンパク質はFA1090 2KO(Δlpxl1,Δrmp)と比較してGC_0817560株では少ないことが予想されることを示す。
PorB及びOpaBは淋菌OMVに存在する最も豊富なタンパク質のうちの2つである。
配列表:
配列番号1-FA1090 Rmpヌクレオチド配列
ATGACCAAACAGCTGAAATTAAGCGCATTATTCGTTGCATTGCTCGCTTCCGGCACTGCTGTTGCGGGCGAGGCGTCCGTTCAGGGTTACACCGTAAGCGGCCAATCGAACGAAATCGTACGCAACAACTATGGAGAATGCTGGAAAAACGCCTACTTTGATAAAGCAAGCCAAGGTCGCGTAGAATGCGGCGATGCGGTTGCCGTCCCCGAGCCCGAACCCGCGCCTGTCGCCGTTGTGGAGCAGGCTCCTCAATATGTTGATGAAACCATTTCCCTGTCTGCCAAAACCCTGTTCGGTTTCGATAAGGATTCATTGCGCGCCGAAGCTCAAGACAACCTGAAAGTATTGGCGCAACGCCTGAGTCGAACCAATGTCCAATCTGTCCGCGTCGAAGGCCATACCGACTTTATGGGTTCTGAAAAATACAATCAGGCTCTGTCCGAACGCCGCGCATACGTAGTGGCAAACAACCTGGTCAGCAACGGCGTACCTGCTTCTAGAATTTCTGCTGTCGGCTTGGGCGAATCTCAAGCGCAAATGACTCAAGTTTGTCAAGCCGAAGTTGCCAAACTGGGTGCGAAAGCCTCTAAAGCCAAAAAACGTGAGGCTCTGATTGCATGTATCGAACCTGACCGCCGCGTAGATGTGAAAATCCGCAGCATCGTAACCCGTCAGGTTGTGCCGGCACGCAATCATCACCAACACTAA
配列番号2-FA1090 Rmpタンパク質配列
MTKQLKLSALFVALLASGTAVAGEASVQGYTVSGQSNEIVRNNYGECWKNAYFDKASQGRVECGDAVAVPEPEPAPVAVVEQAPQYVDETISLSAKTLFGFDKDSLRAEAQDNLKVLAQRLSRTNVQSVRVEGHTDFMGSEKYNQALSERRAYVVANNLVSNGVPASRISAVGLGESQAQMTQVCQAEVAKLGAKASKAKKREALIACIEPDRRVDVKIRSIVTRQVVPARNHHQH
配列番号3-FA1090 lpxl1ヌクレオチド配列
ATGAAATTTATATTTTTTGTACTGTATGTTTTGCAGTTTCTGCCGTTTGCGCTGCTGCACAAGATTGCCGGCCTGATCGGTTCGCTTGCCTACCTTCTGGTCAAACCGCGCCGCCGTATCGGCGAAATCAATTTGGCAAAATGTTTTCCCGAATGGGACGAAGAAAAGCGTAAAACCGTGTTGAAACAGCATTTCAAACACATGGCAAAACTGATGCTCGAATACGGCTTATATTGGTACGCGTCTGCCAAATGCCTGAAATCGCTGGTGCGCTACCGCAATAAGCATTATTTGGACGACGCGCTGGCGGCGGGGGAAAAAGTCATCATCCTGTACCCGCACTTTACCGCGTTCGAGATGGCGGTGTACGCGCTTAATCAGGATGTCCCGCTGATCAGTATGTATTCCCACCAAAAAAACAAGATATTGGACGAACAGATTTTGAAAGGCCGCAACCGCTATCACAACGTCTTCCTTATCGGGCGCACCGAAGGGCTGCGCGCCCTCGTCAAACAGTTCCGCAAAAGCAGTGCGCCGTTCCTGTATCTGCCCGATCAGGATTTCGGACGCAACAATTCGGTTTTTGTGGATTTTTTCGGCATTCAGACGGCAACGATTACCGGCTTGAGCCGCATTGCCGCGCTTGCAAATGCAAAAGTGATACCCGCCATTCCCGTCCGCGAGGCGGACAATACGGTTACATTGCAATTCTATCCCGCTTGGAAATCCTTTCCGAGTGAAGACGCGCAAGCCGACGCGCAACGTATGAACCGCTTTATCGAAGAACGCGTGCGCGAACACCCGGAACAATATTTCTGGCTGCACAAGCGTTTCAAAACCCGTCCGGAAGGCAGCCCCGATTTTTACTGA
配列番号4-FA1090 Lpxl1タンパク質配列
MKFIFFVLYVLQFLPFALLHKIAGLIGSLAYLLVKPRRRIGEINLAKCFPEWDEEKRKTVLKQHFKHMAKLMLEYGLYWYASAKCLKSLVRYRNKHYLDDALAAGEKVIILYPHFTAFEMAVYALNQDVPLISMYSHQKNKILDEQILKGRNRYHNVFLIGRTEGLRALVKQFRKSSAPFLYLPDQDFGRNNSVFVDFFGIQTATITGLSRIAALANAKVIPAIPVREADNTVTLQFYPAWKSFPSEDAQADAQRMNRFIEERVREHPEQYFWLHKRFKTRPEGSPDFY
配列番号5-Lpxl1遺伝子座(図12に対応する)
CCGGCATCGACGCTGATGCTCGGTCAGGCGCGCGGAGCGGCATTGGCGGCTTTGGTCAGCCATAAGCTGCCCGTTTCGGAATACACGGCCTTGCAGGTCAAACAGGCGGTGGTCGGCAAAGGCAAGGCGGCGAAAGAACAGGTGCAGCATATGGTGGTGCAAATGCTGGGACTTTCGGGAACGCCGCAGGCGGATGCGGCGGACGGTCTTGCCGTCGCGCTGACCCACGCCTTACGCAACCACGGGCTTGCCGCCAAACTCAATCCTTCGGGGATGCAGGTCAAGCGCGGAAGGTTTCAATAGTTTCAGACGGCATTTGTATTTTGCCGCCTGAAAAGAAAATGTGTACCGAGATGAAATTTATATTTTTTGTACTGTATGTTTTGCAGTTTCTGCCGTTTGCGCTGCTGCACAAGATTGCCGGCCTGATCGGTTCGCTTGCCTACCTTCTGGTCAAACCGCGCCGCCGTATCGGCGAAATCAATTTGGCAAAATGTTTTCCCGAATGGGACGAAGAAAAGCGTAAAACCGTGTTGAAACAGCATTTCAAACACATGGCAAAACTGATGCTCGAATACGGCTTATATTGGTACGCGTCTGCCAAATGCCTGAAATCGCTGGTGCGCTACCGCAATAAGCATTATTTGGACGACGCGCTGGCGGCGGGGGAAAAAGTCATCATCCTGTACCCGCACTTTACCGCGTTCGAGATGGCGGTGTACGCGCTTAATCAGGATGTCCCGCTGATCAGTATGTATTCCCACCAAAAAAACAAGATATTGGACGAACAGATTTTGAAAGGCCGCAACCGCTATCACAACGTCTTCCTTATCGGGCGCACCGAAGGGCTGCGCGCCCTCGTCAAACAGTTCCGCAAAAGCAGTGCGCCGTTCCTGTATCTGCCCGATCAGGATTTCGGACGCAACAATTCGGTTTTTGTGGATTTTTTCGGCATTCAGACGGCAACGATTACCGGCTTGAGCCGCATTGCCGCGCTTGCAAATGCAAAAGTGATACCCGCCATTCCCGTCCGCGAGGCGGACAATACGGTTACATTGCAATTCTATCCCGCTTGGAAATCCTTTCCGAGTGAAGACGCGCAAGCCGACGCGCAACGTATGAACCGCTTTATCGAAGAACGCGTGCGCGAACACCCGGAACAATATTTCTGGCTGCACAAGCGTTTCAAAACCCGTCCGGAAGGCAGCCCCGATTTTTACTGACTACATAAAATTACAAAACAAATCAGGCGTTTCAGATCAAAAACCCCGATTGTTTTTGGGAATTTGAAACCCGGGTTGTACAAACAGGATTTGCCGGACGGTTTTAACGGTTCAGTTGTTTGTAAAAACAATGCTTTTTTAAAATTGACAAAAAACGAAATCGGTTTTAAAGGCTTATTCCGAGAACAAAGGGGAGTGGATGCCGAAAACCCGGTTAATATATTATAGTGGATTAACAAAAACCAATACGGCGTTGCTTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCCCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGCGAATCGGTTCCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGCCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATAAAATTAAATTTGTTTAAAAACATAAAGTTGTAAACAAGTATCTCATATAAGCCTTTTTCATTAAACAGATAGTCAGATATTTTGTGCTAAAAATTTATATAATATTTAAATTAATATCAAGTTATAAAAAATATATGGAATTTTATTTTGTTTATTTATAATTTTAAGCA
配列番号6-FA1090 Δlpxl1,Δrmp株から抽出したLpxl1遺伝子座(図13に対応する)
CCGGCATCGACGCTGATGCTCGGTCAGGCGCGCGGAGCGGCATTGGCGGCTTTGGTCAGCCATAAGCTGCCCGTTTCGGAATACACGGCCTTGCAGGTCAAACAGGCGGTGGTCGGCAAAGGCAAGGCGGCGAAAGAACAGGTGCAGCATATGGTGGTGCAAATGCTGGGACTTTCGGGAACGCCGCAGGCGGATGCGGCGGACGGTCTTGCCGTCGCGCTGACCCACGCCTTACGCAACCACGGGCTTGCCGCCAAACTCAATCCTTCGGGGATGCAGGTCAAGCGCGGAAGGTTTCAATAGTTTCAGACGGCATTTGTATTTTGCCGTCTGAAAAGAAAATGTGTATCGAGATGAAATTTATATTTTTTGTACTGTATGTTTTGCAGTTTCTGCCGTTTGCGCTGCTGCACAAGATTGCCGACCTGACGGGTTTGCTTGCCTACCTTCTGGTCAAACCGCGCCGCCGTATCGGCGAAATCAATTTGGCAAAATGTTTTTCCGAATGGAGTGAGGAAAAGCGTAAAACCGTGTTGAAACAGCATTTCAAACACATGGCGAAACTGATGTTGGAATACGGTTTATATTGGTACGCGCCTGCCGGACGTTTGAAATCGCTGGTGCGCTACCGCAATAAGCATTATTTGGACGACGCGCTGGCGGCGGGGGAAAAAGTCATCATCCTGTATCCGCACTTCACCGCTGCAGTTGCAGTGACTAACTAGGAGGAATAAATGGCTAAAATGAGAATATCACCGGAATTGAAAAAACTGATCGAAAAATACCGCTGCGTAAAAGATACGGAAGGAATGTCTCCTGCTAAGGTATATAAGCTGGTGGGAGAAAATGAAAACCTATATTTAAAAATGACGGACAGCCGGTATAAAGGGACCACCTATGATGTGGAACGGGAAAAGGACATGATGCTATGGCTGGAAGGAAAGCTGCCTGTTCCAAAGGTCCTGCACTTTGAACGGCATGATGGCTGGAGCAATCTGCTCATGAGTGAGGCCGATGGCGTCCTTTGCTCGGAAGAGTATGAAGATGAACAAAGCCCTGAAAAGATTATCGAGCTGTATGCGGAGTGCATCAGGCTCTTTCACTCCATCGACATATCGGATTGTCCCTATACGAATAGCTTAGACAGCCGCTTAGCCGAATTGGATTACTTACTGAATAACGATCTGGCCGATGTGGATTGCGAAAACTGGGAAGAAGACACTCCATTTAAAGATCCGCGCGAGCTGTATGATTTTTTAAAGACGGAAAAGCCCGAAGAGGAACTTGTCTTTTCCCACGGCGACCTGGGGGACAGCAACATCTTTGTGAAAGATGGCAAAGTAAGTGGCTTTATTGATCTTGGGAGAAGCGGCAGGGCGGACAAGTGGTATGACATTGCCTTCTGCGTCCGGTCGATCAGGGAGGATATCGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGGAGAAAATAAAATACTATATTTTACTGGATGAATTGTTTTAGTACCTGGAAGGAATAATGAGTCGACAGGATTTCGGACGCAACGATTCGGTTTTTGTGGATTTTTTCGGTATTCAGACGGCAACGATTACCGGATTGAGCCGCATTGCCGCGCTTGCAAATGCAAAAGTGATACCCGCCATTCCCGTCCGCGAGGCAGACAATACGGTTACATTGCATTTCTATCCCGCTTGGAAATCCTTTCCGGGTGAAGACGCGAAAGCCGACGCGCAGCGCATGAACCGTTTTATCGAAGACAGGGTGCGCGAACATCCGGAACAATATTTTTGGCTGCACAAGCGTTTTAAAACCCGTCCGGAAGGCAGCCCCGATTTTTACTGACTACATAAAATTACAAAACAAATCAGGCGTTTCAGATCAAAAACCCCGATTGTTTTTGGGAATTTGAAACCCGGGTTGTACAAACAGGATTTGCCGGACGGTTTTAACGGTTCAGTTGTTTGTAAAAACAATGCTTTTTTAAAATTGACAAAAAACGAAATCGGTTTTAAAGGCTTATTCCGAGAACAAAGGGGAGTGGATGCCGAAAACCCGGTTAATATATTATAGTGGATTAACAAAAACCAATACGGCGTTGCTTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCCCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGCGAATCGGTTCCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGCCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATAAAATTAAATTTGTTTAAAAACATAAAGTTGTAAACAAGTATCTCATATAAGCCTTTTTCATTAAACAGATAGTCAGATATTTTGTGCTAAAAATTTATATAATATTTAAATTAATATCAAGTTATAAAAAATATATGGAATTTTATTTTGTTTATTTATAATTTTAAGCA
配列番号7-Rmp遺伝子座(図14に対応する)
CAACGGCAATCGTGCGATATGGAAAAAATCCCCCTAAAGTAATGACACGGAATTGATTTTTCGGCATGATAGACTATCAGGAAACAGGCTGTTTTACGGTTGTTTTCAGGCGTTGAGTATTGACAGTCCGCCCCCTGTTTCTTTATAGTGGAGACTGAAATATCCGATTTGCCGCCATGTTTCTACAGCGGCCTGTATGTTGGCAATTCAGCAGTTGCTTCTGTATCTGCTGTACAAATCTAATGAGGGAATAAAATGACCAAACAGCTGAAATTAAGCGCATTATTCGTTGCATTGCTCGCTTCCGGCACTGCTGTTGCGGGCGAGGCGTCCGTTCAGGGTTACACCGTAAGCGGCCAATCGAACGAAATCGTACGCAACAACTATGGAGAATGCTGGAAAAACGCCTACTTTGATAAAGCAAGCCAAGGTCGCGTAGAATGCGGCGATGCGGTTGCCGTCCCCGAGCCCGAACCCGCGCCTGTCGCCGTTGTGGAGCAGGCTCCTCAATATGTTGATGAAACCATTTCCCTGTCTGCCAAAACCCTGTTCGGTTTCGATAAGGATTCATTGCGCGCCGAAGCTCAAGACAACCTGAAAGTATTGGCGCAACGCCTGAGTCGAACCAATGTCCAATCTGTCCGCGTCGAAGGCCATACCGACTTTATGGGTTCTGAAAAATACAATCAGGCTCTGTCCGAACGCCGCGCATACGTAGTGGCAAACAACCTGGTCAGCAACGGCGTACCTGCTTCTAGAATTTCTGCTGTCGGCTTGGGCGAATCTCAAGCGCAAATGACTCAAGTTTGTCAAGCCGAAGTTGCCAAACTGGGTGCGAAAGCCTCTAAAGCCAAAAAACGTGAGGCTCTGATTGCATGTATCGAACCTGACCGCCGCGTAGATGTGAAAATCCGCAGCATCGTAACCCGTCAGGTTGTGCCGGCACGCAATCATCACCAACACTAAGGCTAGGTAATATCTTGCCGATGCATGAGGTTAGCGGATTTTGTACCGGGTACTGTTGCAATATTCGTGAAACGTCGGCCGGTATCGATGATGTGAAACAAACCCCGCTTTTGCGGGGTTTGTTTTTTTGGGTGGTTTTCTGAAACGGCTATCGTCAGAATCGGGGTGCAGGTTCGGATTCGGATTCAGATTCATGTTTGTGTCCCATTGCCGCGCTTTATAGTGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAATAGTACGGCAAGGCGAGGCAACGCCGTACCGGTTTAAATTTAATCCACTATATCGGTTGAAACTCTGATTTTAAGGCGGTAGGATGTGGGTTTGCCCATAGCAAGGGAATCCTTTCTGTATCAAGCCCCGAAAGGGATAATTCATACAAATTCACGCCTTTCCCCCTCATTGGGAAATGGATGGAATCGTGCCCGATGTGTGCGGCACTGTATGCCGGATATGGTTTTATCATCATCCCT
配列番号8-FA1090Δlpxl1,Δrmp株から抽出したRmp遺伝子座(図15に対応する)
CAACGGCAATCGTGCGATATGGAAAAAATCCCCCTAAAGTAATGACACGGAATTGATTTTTCGGCATGATAGACTATCAGGAAACAGGCTGTTTTACGGTTGTTTTCAGGCGTTGAGCCCGGGACCTCTTTAGCTTCTTGGAAGCTGTCAGTAGTATATCTAATAATTTATCTCCATTCCCTTTAGTAACGTGTAACTTTCCAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTATTTCCTCCCGTTAAATAATAGATAACTATTAAAAATAGACAATACTTGCTCATAAGTAATGGTACTTAAATTGTTTACTTTGGCGTGTTTCATTGCTTGATGAAACTGATTTTTAGTAAACAGTTGACGATATTCTCGATTGACCCATTTTGAAACAAAGTACGTATATAGCTTCCAATATTTATCTGGAACATCTGTGGTATGGCGGGTAAGTTTTATTAAGACACTGTTTACTTTTGGTTTAGGATGAAAGCATTCCGCTGGCAGCTTAAGCAATTGCTGAATCGAGACTTGAGTGTGCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTTGTAGAATCCTTCTTCAACAATCAGATAGATGTCAGACGCATGGCTTTCAAAAACCACTTTTTTAATAATTTGTGTGCTTAAATGGTAAGGAATACTCCCAACAATTTTATACCTCTGTTTGTTAGGGAATTGAAACTGTAGAATATCTTGGTGAATTAAAGTGACACGAATGTTCAGTTTTAATTTTTCTGACGATAAGTTGAATAGATGACTGTCTAATTCAATAGACGTTACCTGTTTACTTATTTTAGCCAGTTTCGTCGTTAAATGCCCTTTACCTGTTCCAATTTCGTAAACGGTATCGGTTTCTTTTAAATTCAATTGTTTTATTATTTGGTTGAGTACTTTTTCACTCGTTAAAAAGTTTTGAGAATATTTTATATTTTTGTTCATGTAATTACTCCTGAAGTGATTACATCTGTAAATAAATACAGAAGTTAAACGATTTGTTTGTAATTTTAGTTATCTGTTTAAAAAGTCATAAGATTAGTCACTGGTAGGAATTAATCTAACGTATTTATTTATCTGCGTAATCACTGTTTTTAGTCTGTTTCAAAACAGTAGATGTTTTATCTACATTACGCATTTGGAATACCAACATGACGAATCCCTCCTTCTTAATTACAAATTTTTAGCATCTAATTTAACTTCAATTCCTATTATACACAAAATTTTAAGATACTGCACTATCAACACACTCTTAAGTTTCCCGGGTCAAGCGCAAATGACTCAAGTTTGTCAAGCCGAAGTTGCCAAACTGGGTGCGAAAGCCTCTAAAGCCAAAAAACGTGAGGCTCTGATTGCATGTATCGAACCTGACCGCCGCGTAGATGTGAAAATCCGCAGCATCGTAACCCGTCAGGTTGTGCCGGCACGCAATCATCACCAACACTAAGGCTAGGTAATATCTTGCCGATGCATGAGGTTAGCGGATTTTGTACCGGGTACTGTTGCAATATTCGTGAAACGTCGGCCGGTATCGATGATGTGAAACAAACCCCGCTTTTGCGGGGTTTGTTTTTTTGGGTGGTTTTCTGAAACGGCTATCGTCAGAATCGGGGTGCAGGTTCGGATTCGGATTCAGATTCATGTTTGTGTCCCATTGCCGCGCTTTATAGTGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAATAGTACGGCAAGGCGAGGCAACGCCGTACCGGTTTAAATTTAATCCACTATATCGGTTGAAACTCTGATTTTAAGGCGGTAGGATGTGGGTTTGCCCATAGCAAGGGAATCCTTTCTGTATCAAGCCCCGAAAGGGATAATTCATACAAATTCACGCCTTTCCCCCTCATTGGGAAATGGATGGAATCGTGCCCGATGTGTGCGGCACTGTATGCCGGATATGGTTTTATCATCATCCCT
配列番号9-lpxl1_UP FW
GGCATTTGTATTTTGCCGTCTG
配列番号10-lpxl1_DO REV
GCGAAATGTACGCCATTTTCTACGC
配列番号11-UpIII-FOR
gctctagaGGTCGTCTATCCGTTCCGTA
配列番号12-UpIII-REV
tcccccgggCTCAACGCCTGAAAACAACC
配列番号13-DpIII-FOR
tcccccgggTCAAGCGCAAATGACTCAAG
配列番号14-DpIII-REV
cccgctcgagGGGAAAGGCGTGAATTTGTA
配列番号15-EryR_gono_SmaI-Fw
ATTCGCCCGGGAAACTTAAGAGTGTGTTGATAGTG
配列番号16-EryR_gono_SmaI-Rev
ATTCGCCCGGGACCTCTTTAGCTTCTTGG
配列番号17-lpxl1 est FW
CCGCCAAACTCAATCCTTCG
配列番号18-lpxl1 est REV
GCAAACTTTTGTTTCACCGTTTCCG
配列番号19-NGO_lpxL1wtcheck-Fw
CCGCGTTCGAGATGG
配列番号20-NGO_lpxL1wtcheck-Rev
GCGGAACTGTTTGACGAG
配列番号21-UP_CHECK_NGO1577-Fw
GTGTGTCCAGTCGTAGCAGG
配列番号22-DW_CHECK_NGO1577-Rev
AGGGATGATGATAAAACCATATCC
配列番号23-INTwt_NGO1577-Fw
TCGTACGCAACAACTATGGAG
配列番号24-INTwt_NGO1577-Rev
CATCAACATATTGAGGAGCCTG
配列番号25-FA1090 2KO PorBタンパク質
MKKSLIALTLAALPVAAMADVTLYGAIKAGVQTYRSVEHTDGKVSKVETGSEIADFGSKI
GFKGQEDLGNGLKAVWQLEQGASVAGTNTGWGNKQSFVGLKGGFGTIRAGSLNSPLKNTG
ANVNAWESGKFTGNVLEISGMAQREHRYLSVRYDSPEFAGFSGSVQYAPKDNSGSNGESY
HVGLNYQNSGFFAQYAGLFQRYGEGTKKIEYDGQTYSIPSLFVEKLQVHRLVGGYDNNAL
YVSVAAQQQDAKLYGAMSGNSHNSQTEVAATAAYRFGNVTPRVSYAHGFKGTVDSANHDN
TYDQVVVGAEYDFSKRTSALVSAGWLQEGKGADKIVSTASAVVLRHKF
配列番号26-FA1090 2KO PorBタンパク質(ループ1)
TYRSVEHTDGKVSKVETGSEIA
配列番号27-FA1090 2KO PorBタンパク質(ループ2)
ASVAGTNTGWG
配列番号28-FA1090 2KO PorBタンパク質(ループ3)
LNSPLKNTGANVNAWESGKFTGNVLEISGMAQREHRY
配列番号29-FA1090 2KO PorBタンパク質(ループ4)
APKDNSGSNGE
配列番号30-FA1090 2KO PorBタンパク質(ループ5)
RYGEGTKKIEYDGQTYSIPSLFVEKL
配列番号31-FA1090 2KO PorBタンパク質(ループ6)
DAKLYGAMSGNSHN
配列番号32-FA1090 2KO PorBタンパク質(ループ7)
FKGTVDSANHDNT
配列番号33-FA1090 2KO PorBタンパク質(ループ8)
GWLQEGKGADKIVSTA

Claims (16)

  1. a.リピドA生合成ラウロイルアシルトランスフェラーゼ(lpxl1)遺伝子、mRNA、及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
    b.還元改変可能タンパク質(rmp)遺伝子、mRNA、及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる
    遺伝子改変(複数可)を含む、FA1090株の遺伝子改変された淋菌細菌。
  2. lpxl1遺伝子が、配列番号3に記載される配列と少なくとも80%同一である配列を含み、rmp遺伝子が、配列番号1に記載される配列と少なくとも80%同一である配列を含む、請求項1に記載の淋菌細菌。
  3. 遺伝子改変(複数可)が、
    a. Lpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、
    b. Rmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる、請求項1又は2に記載の淋菌細菌。
  4. Lpxl1ポリペプチドが、配列番号4と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、Rmpポリペプチドが、配列番号2と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の淋菌細菌。
  5. 遺伝子改変(複数可)が、
    a) 内因性lpxl1及びrmp遺伝子の破壊若しくは欠失、又は
    b) 野生型lpxl1及びrmp遺伝子を含む菌株におけるLpxl1及びRmpポリペプチド発現の抑制
    からなるか又はそれを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の淋菌細菌。
  6. a) 淋菌FA1090細菌中のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌由来のrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製すること、あるいは
    b) 第1の淋菌FA1090細菌由来のrmp遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第1の淋菌FA1090細菌を作製し、第1の淋菌FA1090細菌由来のlpxl1遺伝子mRNA及び/又はポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させて第2の淋菌FA1090細菌を作製すること
    のいずれかを含む、請求項1から5のいずれかに記載の淋菌細菌を作製する方法。
  7. Lpxl1ポリペプチドとRmpポリペプチドの両方の減少したレベル又は検出不可能なレベルのいずれかを含み、場合により、Lpxl1ポリペプチドとRmpポリペプチドの両方の前記減少したレベル又は検出不可能なレベルが、野生型FA1090細菌から得られる外膜小胞と比較して測定される、FA1090株淋菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞。
  8. 遺伝子改変されたFA1090株淋菌由来の外膜小胞(OMV)であって、前記遺伝子改変されたFA1090株淋菌は、a)lpxl1遺伝子、lpxl1 mRNA、及び/又はLpxl1ポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させ、b)rmp遺伝子、rmp mRNA、及び/又はRmpポリペプチドの発現及び/又は機能を低下又は消失させる遺伝子改変(複数可)を含み、
    前記OMVが、
    I. 前記遺伝子改変を欠く淋菌(N. gonorrhoeae)FA1090株由来の比較対照OMVにおけるRmpポリペプチドのレベルと比較して、減少したレベルのRmpポリペプチド、
    II. 比較対照OMVからのヘキサ-アシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドA
    を含む、外膜小胞(OMV)。
  9. 請求項1から5のいずれか一項に記載の淋菌細菌から得られるか又は得ることができる外膜小胞。
  10. Lpxl1ポリペプチドの発現の低下又は消失、及びRmpポリペプチドの発現の低下又は消失を含む、請求項9に記載の外膜小胞。
  11. 前記遺伝子改変(複数可)を欠く淋菌FA1090株由来の比較対照OMVにおけるRmpポリペプチドのレベルと比較して、減少したレベルのRmpポリペプチドと、比較対照OMVからのヘキサ-アシル化リピドAのレベルと比較して、減少したレベルのヘキサ-アシル化リピドAとを含む、請求項9に記載の外膜小胞。
  12. 前記外膜小胞が天然の外膜小胞である、すなわち、界面活性剤で抽出されていない、請求項7、8又は9から11のいずれか一項に記載の外膜小胞。
  13. 請求項7から12のいずれか一項に記載の外膜小胞を含む免疫原性組成物であって、場合により免疫原性組成物がアジュバントをさらに含み、場合によりアジュバントがアルミニウム塩アジュバント、例えば水酸化アルミニウムである、免疫原性組成物。
  14. 請求項7から12のいずれか一項に記載の外膜小胞又は請求項13に記載の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。
  15. 医薬に使用するための、請求項13に記載の免疫原性組成物又は請求項14に記載のワクチン。
  16. ナイセリア(Neisseria)、例えば淋菌によって引き起こされる疾患の処置又は予防における使用のための、請求項13に記載の免疫原性組成物又は請求項14に記載のワクチン。
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