JP2023541482A - バイオマーカー法および使用法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際にがん患者についての肯定的な臨床的アウトカムを予測するための方法、対象において、好ましくはがん患者においてそのような4-1BBアゴニスト作用物質の活性を評価するための方法、およびがんなどの疾患を処置するために4-1BBアゴニスト作用物質の用量を選択するための方法を提供する。本開示はまた、がんを処置する方法、ならびにバイオマーカーの使用およびそれらの検出のためのキットの使用も提供する。
Description
I. 背景
4-1BBは、共刺激免疫チェックポイントであり、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ファミリーのメンバーである。それは、活性化されたCD4+およびCD8+T細胞、活性化されたB細胞、ならびにナチュラルキラー（NK）細胞上に主に発現しており、免疫応答の調節において重要な役割を果たす。4-1BBのクラスター形成は、受容体および下流のシグナル伝達の活性化をもたらす（Yao et al., 2013, Snell et al., 2011）。同系の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）標的に結合するT細胞受容体（TCR）によって予め刺激されたT細胞では、4-1BBを介した共刺激は、増強された活性化、生存、および増殖、ならびに炎症誘発性サイトカインの産生および死滅させる能力の向上をもたらす（Dawicki and Watts, 2004, Lee et al., 2002）。
4-1BBは、共刺激免疫チェックポイントであり、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ファミリーのメンバーである。それは、活性化されたCD4+およびCD8+T細胞、活性化されたB細胞、ならびにナチュラルキラー（NK）細胞上に主に発現しており、免疫応答の調節において重要な役割を果たす。4-1BBのクラスター形成は、受容体および下流のシグナル伝達の活性化をもたらす（Yao et al., 2013, Snell et al., 2011）。同系の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）標的に結合するT細胞受容体（TCR）によって予め刺激されたT細胞では、4-1BBを介した共刺激は、増強された活性化、生存、および増殖、ならびに炎症誘発性サイトカインの産生および死滅させる能力の向上をもたらす（Dawicki and Watts, 2004, Lee et al., 2002）。
4-1BBアゴニスト作用物質は現在、臨床で試験されており、適したバイオマーカー、例えば、有益な臨床的アウトカムに関連するバイオマーカーを特定する必要性がある。
II. 概要
本開示は、特に、4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際にがん患者についての肯定的な臨床的アウトカムを予測するための方法、および対象において、好ましくはがん患者においてそのような4-1BBアゴニスト作用物質の活性を評価するための方法を提供する。本開示はまた、がんを処置する方法、ならびにバイオマーカーおよびそれらを検出するためのキットの使用もまた提供する。
本開示は、特に、4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際にがん患者についての肯定的な臨床的アウトカムを予測するための方法、および対象において、好ましくはがん患者においてそのような4-1BBアゴニスト作用物質の活性を評価するための方法を提供する。本開示はまた、がんを処置する方法、ならびにバイオマーカーおよびそれらを検出するためのキットの使用もまた提供する。
より具体的には、本開示は可溶性4-1BB（s4-1BB）を伴う方法および使用に関する。
III. 定義
以下のリストは、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略語を定義する。本明細書において列挙され定義される用語はすべて、あらゆる文法的語形を包含することを意図する。
以下のリストは、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略語を定義する。本明細書において列挙され定義される用語はすべて、あらゆる文法的語形を包含することを意図する。
本明細書において用いられる場合、別段の指定がない限り、「4-1BB」はヒト4-1BB（hu4-1BB）を意味する。ヒト4-1BBは、UniProt Q07011によって定義される完全長タンパク質、その断片、またはそのバリアントを意味する。4-1BBは、CD137、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー 9（TNFRSF9）、およびリンパ球活性化によって誘導される物質（induced by lymphocyte activation）（ILA）としても公知である。いくつかの特定の態様において、非ヒト種の4-1BB、例えば、カニクイザル4-1BBおよびマウス4-1BBが用いられる。
用語「可溶性4-1BB（s4-1BB）」は、活性化されたリンパ球から放出され得る、可溶（すなわち、非細胞膜結合）型の4-1BBを指す。用語「循環s4-1BB」は、本明細書において用いられる場合、血流中に循環しているs4-1BBを指す。生物学的試料（血清または血漿など）中のs4-1BBを測定する方法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）の手段による方法は当業者に公知であり、例えば、Segal et al., 2018に記載される。対応するキットもまた、例えば、Invitrogen/Thermo Fisher（「CD137（4-1BB）（可溶性） Human ELISA Kit」）またはBioLegend（「LEGEND MAX(商標) Human Soluble CD137/4-1BB ELISA Kit」）から市販されている。
本明細書において用いられる場合、別段の指定がない限り、用語「s4-1BBレベル」は、生物学的試料、例えば、血清または血漿中のs4-1BBの、絶対レベル（例えば、（液体）生物学的試料の体積単位当たりの重量、例えば、pg/mlで示される）、指定期間にわたる曲線下面積（AUC）、または相対的レベル（例えば、ベースライン、例えば、4-1BBアゴニスト作用物質での処置前の生物学的試料中のs4-1BBのレベルを基準として）を指す。
用語「4-1BBアゴニスト作用物質」は、本明細書において用いられる場合、4-1BBおよび4-1BBシグナル伝達経路を活性化できる、作用物質を指す。A4-1BBアゴニスト作用物質は、4-1BBに特異的に結合し得る。
本明細書において用いられる場合、別段の指定がない限り、「HER2」はヒトHER2（huHER2）を意味する。ヒトHER2は、UniProt P04626によって定義される完全長タンパク質、その断片、またはそのバリアントを意味する。HER2はまた、ヒト上皮増殖因子受容体 2、HER2/neu、受容体型チロシンプロテインキナーゼerbB-2、分化抗原群（cluster of differentiation）340（CD340）、癌原遺伝子Neu、ERBB2（ヒト）、Erbb2（げっ歯類）、c-neu、またはp185としても公知である。ヒトHER2はERBB2遺伝子によってコードされる。いくつかの特定の態様において、非ヒト種のHER2、例えば、カニクイザルHER2およびマウスHER2が用いられる。
用語「抗」または「ターゲティング」は、関心対象のタンパク質標的（例えば、4-1BBまたはHER2）に関連してある分子を説明するために用いられる場合、前記タンパク質標的に結合することができる、かつ/または前記タンパク質標的の1つまたは複数の生物学的機能を調節することができる、分子を意味する。例えば、本明細書において記載される「抗4-1BB」分子は、4-1BBに結合でき、かつ/または4-1BBの1つまたは複数の生物学的機能を調節することができる。タンパク質標的の「生物学的機能」は、タンパク質標的がその生物学的使命を実行する能力、例えば、その結合パートナーに結合しかつシグナル伝達経路を媒介する能力を指す。
本明細書において用いられる場合、「T細胞活性化」は、T細胞の増殖および/または分化をもたらすプロセスを指す。T細胞の活性化は、免疫応答の開始および/または永続化をもたらし得る。本明細書において用いられる場合、T細胞活性化は、免疫応答の調節不全に関連する疾患または障害、例えば、がん、自己免疫疾患、および炎症性疾患を有する対象の健常状態を評価するために用いられ得る。T細胞増殖は、T細胞集団の増大を指す。「T細胞増殖」および「T細胞増大」は、本明細書において互換的に用いられる。
用語「T細胞活性を増強する」、「T細胞を活性化する」、および「T細胞応答を刺激する」は、本明細書において互換的に用いられ、持続性のまたは増幅された生物学的機能を有するか、または疲弊したT細胞または不活性化T細胞を再生もしくは再活性化するようにT細胞を誘導する、それを引き起こす、またはそのように刺激すること指す。増強されたT細胞活性の例示的な徴候としては、これらに限定されないが、T細胞からのインターロイキン-2（IL-2）の増加した分泌、T細胞からのインターフェロン-γ（IFN-γ）の増加した分泌、増加したT細胞増殖、および/または増加した抗原反応性（例えば、ウイルス、病原体、および腫瘍のクリアランス）が挙げられる。そのような増強を測定する方法は、当業者に公知である。
「がん」および「がん性」は、典型的に未制御の細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理的状態を指す。「腫瘍」は、1つまたは複数のがん性細胞を含み得る。「病変」は、組織または器官における局所的変化である。腫瘍は病変のタイプである。「標的病変」は、特異的に測定されている病変である。「非標的病変」は、その存在が認められているが、その測定は行われていない、病変である。用語「がん」、「腫瘍」、および「病変」は、本明細書において互換的に用いられる。がんは、胃がん、婦人科がん（例えば、卵管がん、子宮内膜がん、または卵巣がん）、乳がん、肺がん、特に非小細胞肺がん、胆嚢がん、胆管細胞がん、黒色腫、食道がん、胃食道がん（例えば、胃食道接合部がん）、結腸直腸がん、直腸がん、結腸がん、膵臓がん、胆道がん、唾液管がん、膀胱がん、および原因不明のがんからなる群より選択され得る。がんは、HER2発現腫瘍/がんであってもよい。
本明細書において用いられる場合、用語「HER2発現腫瘍」は、例えば、mRNAベースのqRT-PCRアッセイなどの定量的アッセイによって検出可能な、HER2の検出可能な発現を有する腫瘍を指すことを意味する。いくつかの態様において、用語「HER2発現腫瘍」は、HER2陽性（HER2+）腫瘍、または低発現のHER2を特徴とする腫瘍を指す。
本明細書において用いられる場合、用語「HER2陽性（HER2+）腫瘍」は、例えば、乳がんにおけるHER2検査のための2018 ASCO/CAPガイドライン（Wolff et al., 2018）または胃または胃食道腺がんにおけるHER2検査のための2016 CAP/ASCP/ASCOガイドライン（Bartley et al., 2016）に従って、免疫組織化学的検査（IHC）および/または（蛍光）インサイチューハイブリダイゼーション（(F）ISH）分析によりHER2+腫瘍として分類される腫瘍を指すことを意味する。いくつかの特定の態様において、HER2+腫瘍は、IHC3+、IHC2+/(F）ISH+または（F）ISH+、好ましくはIHC3+またはIHC2+/(F）ISH+のHER2状態を特徴とする。いくつかの態様において、HER2+腫瘍は、例えば、（F）ISHまたは次世代シーケンシング（NGS）分析に決定されるような、HER2遺伝子増幅を特徴とする。
「HER2の低発現を特徴とする腫瘍」（本明細書において「HER2低腫瘍」とも呼ばれる）は、IHCおよび（F）ISHによるHER2+腫瘍としてのその分類を保証するものではないレベルだが、HER2の発現を呈する腫瘍を指す。いくつかの態様において、HER2低腫瘍は、mRNAベースのqRT-PCRアッセイなどの定量的アッセイにより検出可能だが、例えば、乳がんにおけるHER2検査の2018 ASCO/CAPガイドライン（Wolff et al., 2018）または胃または胃食道腺がんにおけるHER2検査の2016 CAP/ASCP/ASCOガイドライン（Bartley et al., 2016）に従って、IHCおよび/または（F）ISHによりHER2+腫瘍として分類されないレベルでのHER2の発現を呈する腫瘍である。いくつかの特定の態様において、HER2低腫瘍は、IHC1+またはIHC2+/(F）ISH-のHER2状態を特徴とする。しかしながら、疑義を避けるために明記すると、HER2低腫瘍は、例えば、IHC0（および（F）ISH-）のHER2状態を特徴とするが、例えば、mRNAベースのqRT-PCRアッセイなどの定量的アッセイで決定される、HER2の発現を依然として呈する、腫瘍も含み得る。いくつかの態様において、HER2低腫瘍は、例えば、（F）ISHまたは次世代シーケンシング（NGS）分析によって決定される、HER2遺伝子増幅を呈さない。
用語「転移性」は、がん細胞が、それらが最初に形成された場所から抜け出し、身体の他の部位で新たな腫瘍（転移性腫瘍）を形成する、がんの状態を指す。「進行性」がんは、局所的に進行性または転移性であってよい。局所的に進行性のがんは、原発部位または原発器官の外へと成長しているが、身体の遠隔部位にはまだ広がっていない、がんを指す。
「腫瘍微小環境（TME）」は、非がん細胞およびそれらの間質で構成される、腫瘍の周りの環境を指す。腫瘍間質は、線維芽細胞/筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、免疫細胞、血管性細胞、平滑筋細胞、および免疫細胞を含む細胞、血管、シグナル伝達分子、および細胞外マトリックス（ECM）の集合物を含み、かつ構造的または結合的な役割を果たす。この文脈において、「全腫瘍組織」は、腫瘍細胞および腫瘍間質からなる。
本明細書において用いられる場合、「抗腫瘍剤」または「抗腫瘍薬」は、腫瘍、特に悪性腫瘍に対して作用することができ、好ましくは、抗腫瘍作用または抗腫瘍活性を有する。「抗腫瘍作用」または「抗腫瘍活性」は、腫瘍、特に悪性腫瘍に対する抗腫瘍剤の作用を指し、これらには、腫瘍特異的免疫応答の刺激、標的病変の低減、腫瘍サイズの低減、腫瘍細胞の成長の抑制、転移の抑制、完全寛解、部分寛解、疾患の安定化、再発前の期間の延長、患者の生存期間の延長、または患者の生活の質の改善が含まれる。
本明細書において用いられる場合、「処置する」または「処置」は、生理的な状態もしくは障害または臨床的病態の過程で処置される対象の自然経過を変えるように設計された臨床的介入を指す。処置は、治療的処置および/または予防的もしくは防止的手段であってよく、その目的は、望ましくない生理学的な変化または障害、例えば、がんなどの過剰増殖状態の増大、発達、または広がりを予防するか、または遅らせる（低減させる）ことである。処置の望ましい作用には、検出可能であるかまたは検出不可能であるかにかかわらず、疾患進行速度の低下、疾患状態の寛解または緩和、症状の軽減、疾患状態の安定化または悪化防止、および改善した予後の寛解が含まれるが、これらに限定されない。処置の望ましい作用には、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長させることも含まれる。処置の必要がある対象には、状態もしくは障害を既に有しているかまたは状態もしくは障害を有する傾向がある対象、または状態もしくは障害を予防すべき対象が含まれる。
腫瘍を有する対象に与えられる処置は、固形がんの治療効果判定規準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）（RECIST）ガイドライン（バージョン1.1）に記載されるような腫瘍縮小効果をもたらし得る（Eisenhauer et al., 2009）。例えば、腫瘍を有する対象に与えられる処置は、完全奏効、部分奏功、安定、または進行をもたらし得る。「完全奏効（CR）」はすべての標的病変の消失を指す。「部分奏功（PR）」は、ベースライン径和と比較して、標的病変の径和の少なくとも30％の減少を指す。「進行（PD）」は、試験中の最小の径和（ベースライン径和が試験中の最小値である場合、これにはベースライン径和が挙げられる）と比較して、標的病変の径和の少なくとも20％の増加を指す。20％の相対的増加に加えて、前記径和は、少なくとも5 mmの絶対値での増加も示さなければならない。「安定（SD）」は、試験中の最小の径和に比して、PRとするには縮小が十分ではなく、PDとするには増大が十分ではないことを指す。「奏効期間（DoR）」は、最初に記録された奏功（CRまたはPR）の日から奏功達成後に進行または死亡が記録された日までの時間として算出され得る。
薬物または治療剤の「有効量」は、処置の有益なまたは望ましい作用をもたらすのに十分な量である。例えば、抗腫瘍剤の有効量は、所望のレベルまでT細胞活性化を増強するのに十分な量であってよい。いくつかの態様において、薬物または治療剤の有効性は、当技術分野において公知である適切な方法によって決定することができる。例えば、抗腫瘍剤の有効性は、固形がんの治療効果判定規準（RECIST）によって決定され得る。有効量は、1回または複数回の個別の投与または用量で投与することができる。有効量は、1種類の作用物質を単独で、または1種類もしくは複数種類の付加的な作用物質との組み合わせで、投与することができる。
本明細書において用いられる場合、「抗体」には、全体抗体またはその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合ドメイン」）もしくは単鎖が含まれる。全体抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも2本の重鎖（HC）および2本の軽鎖（LC）を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（VHまたはHCVR）および重鎖定常領域（CH）から構成される。重鎖定常領域は、3種類のドメイン、CH1、CH2、およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（VLまたはLCVR）および軽鎖定常領域（CL）から構成される。軽鎖定常領域は、1種類のドメイン、CLから構成される。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存されている領域が散在している、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置されている：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原（例えば、PD-L1）と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第1成分（C1q）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を任意で媒介し得る。
本明細書において用いられる場合、抗体の「抗原結合ドメイン」または「抗原結合断片」は、抗原（例えば、HER2）に特異的に結合する能力を保持している、抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片によって実施できることが示されている。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例としては、（i）VHドメイン、VLドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなるFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含むF(ab′）2断片；（iii）VHドメイン、VLドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメイン、ならびにCH1ドメインとCH2ドメインとの間の領域からなるFab′断片；（iv）VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片；（v）抗体の1つのアームのVHドメインおよびVLドメインからなる単鎖 Fv断片、（vi）VHドメインからなるdAb断片（Ward et al., 1989）；および（vii）単離された相補性決定領域（CDR）、または任意で合成リンカーによって連結されうる2つもしくはそれ以上の単離されたCDRの組み合わせ；（viii）短いリンカーを用いて同じポリペプチド鎖内で連結されたVHおよびVLを含む「ダイアボディ」（例えば、特許文書EP 404,097；WO 93/11161；およびHolliger et al., 1993を参照）；（ix）VHまたはVLのみを含有し、一部の場合では、2つ以上のVH領域が共有結合的に連結されている、「ドメイン抗体断片」が挙げられる。
抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル；異種、同種、もしくは同系；またはそれらの改変型（例えば、ヒト化、キメラ、もしくは多重特異性）であってよい。抗体はまた、完全にヒトであってもよい。
用語「エフェクター機能」は、抗体に関連して本明細書において用いられる場合、抗体のFc領域に起因しうるその生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ADCC）、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取込み、細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御、およびB細胞活性化が挙げられる。
本明細書において用いられる場合、用語「リポカリン」は、一方の端で複数の（好ましくは4つの）ループによって2つ1組で連結されている複数のβ鎖（好ましくはA～Hと名付けられた8本のβ鎖）を含み、それによって、リガンド結合ポケットを構成し、リガンドポケットへの入口を画定する、円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有する、重量でおよそ18～20 kDaの単量体タンパク質を指す。好ましくは、本発明で用いられるリガンド結合ポケットを構成するループは、β鎖AおよびB、CおよびD、EおよびF、ならびにGおよびHの開放端を連結するループであり、ループAB、CD、EF、およびGHと名付けられる。他の点では剛性のリポカリン骨格における前記ループの多様性がリポカリンファミリーメンバー間で種々の異なる結合様式を生じさせ、各々が、異なるサイズ、形状、および化学的特徴の標的を収容できるということが十分に確立されている（例えば、Skerra, 2000, Flower et al., 2000, Flower, 1996で概説される）。リポカリンファミリーのタンパク質は、広範なリガンドに結合するように自然に進化しており、全体的配列保存は著しく低レベルだが（多くの場合、20％未満の配列同一性を有する）、高度に保存された全体的フォールディングパターンを保持していることが理解されている。さまざまなリポカリンにおける位置間の対応関係もまた、当業者に周知である（例えば、米国特許第7,250,297号を参照）。本明細書において用いられる「リポカリン」の定義に属するタンパク質には、これらに限定されないが、涙液リポカリン（Tlc、Lcn1）、リポカリン-2（Lcn2）、または好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、アポリポタンパク質D（ApoD）、アポリポタンパク質M、α1-酸性糖タンパク質1、α1-酸性糖タンパク質2、α1-ミクログロブリン、補体成分8γ、レチノール結合タンパク質（RBP）、精巣上体レチノイン酸結合タンパク質、グリコデリン、臭気物質結合タンパク質 IIa、臭気物質結合タンパク質 IIb、リポカリン-15（Lcn15）、およびプロスタグランジンDシンターゼを含む、ヒトリポカリンが含まれる。
本明細書において用いられる場合、「リポカリン-2」または「好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン」は、ヒトリポカリン-2（hLcn2）またはヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）を指し、成熟ヒトリポカリン-2または成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンをさらに指す。用語「成熟」は、タンパク質を特徴づけるために用いられる場合、シグナルペプチドを本質的に含まないタンパク質を意味する。本開示の「成熟hNGAL」は、シグナルペプチドを含まない、成熟型のヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンを指す。成熟hNGALは、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO: 1に示される、アクセッション番号P80188下でSWISS-PROTデータバンクに寄託された配列の残基21～198によって記載される。
本明細書において用いられる場合、「ネイティブな配列」は、その調製の様式にかかわらず、自然界に存在する配列を有するかまたは野生型配列を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。そのようなネイティブな配列タンパク質またはポリペプチドは、自然界から単離することができるか、または組換え方法または合成方法などの他の手段によって生成することができる。
「ネイティブな配列リポカリン」は、自然界に由来する対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するリポカリンを指す。したがって、ネイティブな配列リポカリンは、任意の生物、特に哺乳動物に由来する個々の天然に生じる（野生型）リポカリンのアミノ酸配列を有することができる。用語「ネイティブな配列」は、リポカリンの文脈で用いられる場合、天然に生じる切断型または分泌型のリポカリン、天然に生じるバリアント、例えば、選択的にスプライシングされた形態および天然に生じる対立遺伝子バリアントのリポカリンを特に包含する。用語「ネイティブな配列リポカリン」および「野生型リポカリン」は、本明細書において互換的に用いられる。
本明細書において用いられる場合、「ムテイン」、「変異した」実体（タンパク質であろうと核酸であろうと）、または「変異体」は、天然に生じる（野生型）タンパク質または核酸と比較しての、1個または複数個のアミノ酸またはヌクレオチドの交換、欠失、または挿入を指す。前記用語には、本明細書において記載されるようなムテインの断片も含まれる。本開示は、本明細書において記載されるように、4つのループのうち少なくとも3つの各々の少なくとも1個アミノ酸が、ネイティブな配列リポカリンと比較して変異している、4つのループによって一方の端で2つ1組で連結されている8本のβ鎖を含み、それによって、リガンド結合ポケットを構成し、リガンドポケットへの入口を画定する、円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有する、リポカリンムテインを明示的に包含する。本開示のリポカリンムテインは好ましくは、本明細書において記載されるような4-1BBに結合する機能を有する。
本明細書において用いられる場合、本開示のリポカリンムテインに関連する用語「断片」は、N末端および/またはC末端で切断される、すなわち、N末端および/またはC末端アミノ酸を少なくとも1個欠いている、完全長成熟hNGALまたはリポカリンムテインに由来するタンパク質またはポリペプチドを指す。そのような断片は、それが由来する成熟hNGALまたはリポカリンムテインの一次配列の少なくとも10個またはそれ以上の、例えば20もしくは30個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含んでもよく、通常、成熟hNGALのイムノアッセイで検出可能である。そのような断片は、N末端および/またはC末端アミノ酸の2個まで、3個まで、4個まで、5個まで、10個まで、15個まで、20個まで、25個まで、または30個まで（間の数を全て含む）を欠いている場合がある。断片は好ましくは、それが由来する成熟hNGALまたはリポカリンムテインの機能性断片であり、機能性断片は、それが由来する成熟hNGALまたはリポカリンムテインの結合特異性、好ましくは4-1BBに対する結合特異性を好ましくは保持していることを意味することが理解される。例示的な例として、そのような機能性断片は、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列に対応する13～157位、15～150位、18～141位、20～134位、25～134位、または28～134位にあるアミノ酸を少なくとも含んでもよい。
4-1BBまたはHER2に関する「断片」は、N末端および/またはC末端で切断された4-1BBもしくはHER2または4-1BBもしくはHER2のタンパク質ドメインを指す。本明細書において記載される4-1BBまたはHER2の断片は、本開示のリポカリンムテイン、抗体、および/または融合タンパク質によって認識されかつ/または結合される完全長4-1BBまたはHER2の能力を保持している。
本明細書において用いられる場合、本明細書において記載されるタンパク質の「バリアント」は概して、前記タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を有するバリアントタンパク質を指す場合がある。いくつかの態様において、バリアントは、天然に生じるバリアント、例えば、前記タンパク質の選択的にスプライシングされた形態および天然に生じる対立遺伝子バリアントであってよい。いくつかの態様において、バリアントは機能的バリアントである。
本明細書において用いられる場合、「特異的な」、「特異的結合」、「特異的に結合する」、または「結合特異性」は、望ましい標的（例えば、4-1BBまたはHER2）と1つまたは複数の参照標的とを識別する生体分子の能力に関する。そのような特異性は、絶対値による特性ではなく、相対的特性であること、および、例えば、SPR、ウエスタンブロット、ELISA、蛍光活性化細胞選別（FACS）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、電気化学発光（ECL）、イムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）、免疫組織化学的検査（IHC）、およびペプチドスキャンの手段よって、決定できることが理解される。本明細書において記載される作用物質またはそれらの個別の抗原ターゲティング部分の文脈において本明細書で用いられる場合、用語「特異的な」、「特異的結合」、「特異的に結合する」、または「結合特異性」は、作用物質またはそれらのターゲティング部分が、本明細書において記載されるように、4-1BBおよび/またはHER2に結合するか、それらと反応するか、またはそれらに対して向けられているが、別のタンパク質には本質的に結合しないことを意味する。用語「別のタンパク質」には、4-1BBもしくはHER2または4-1BBもしくはHER2と密接に関連しているかもしくは相同であるタンパク質ではない、任意のタンパク質が含まれる。しかしながら、ヒト以外の種に由来する4-1BBまたはHER2、ならびに4-1BBまたはHER2の断片および/もしくは（天然に生じる）バリアントは、用語「別のタンパク質」によって除外されない。用語「本質的に結合しない」は、本明細書において記載される作用物質またはそれらの個別の抗原ターゲティング部分が、4-1BBおよび/またはHER2より低い結合親和性で別のタンパク質に結合する、すなわち、30％未満、好ましくは20％、より好ましくは10％、特に好ましくは9、8、7、6、または5％未満の交差反応性示すことを意味する。本明細書において記載される作用物質またはそれらの個別の抗原ターゲティング部分が、本明細書において上記に定義されるように反応するかどうかは、特に、本明細書において記載される作用物質またはそれらの個別の抗原ターゲティング部分と4-1BBおよび/またはHER2との反応と、本明細書において記載される作用物質またはそれらの個別の抗原ターゲティング部分と他のタンパク質との反応とを比較することによって、容易に試験することができる。
用語「低分子」は、本明細書において用いられる場合、概して、低分子量（例えば、＜900ダルトン）の有機化合物を指す。
本明細書において用いられる場合、「二重特異性」は、少なくとも2つの異なる標的に特異的に結合することができる分子を指す。典型的には、二重特異性分子は、それらの各々が異なる標的に特異的である、2つの標的結合部位を含む。いくつかの態様において、二重特異性分子は、2つの標的に同時に結合することができる。
本明細書において互換的に用いられる場合、用語「コンジュゲートする」、「コンジュゲーション」、「融合する」、「融合」、または「連結された」は、これらに限定されないが、遺伝子融合、化学的コンジュゲーション、リンカーまたは架橋剤によるカップリング、および非共有結合的結合を含む手段による、あらゆる形態の共有結合的または非共有結合的連結により、2つまたはそれ以上のサブユニットを一緒に連結することを指す。
用語「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、本明細書において用いられる場合、2つまたはそれ以上のサブユニットを含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。いくつかの態様において、本明細書において記載される融合タンパク質は、2つまたはそれ以上のサブユニットを含み、これらのサブユニットの少なくとも1つは、4-1BBに特異的に結合することができ、さらなるサブユニットは、腫瘍抗原、例えば、HER2などの腫瘍の表面上に発現している腫瘍抗原に特異的に結合することができる。融合タンパク質内では、これらのサブユニットは、共有結合または非共有結合によって連結され得る。好ましくは、融合タンパク質は、2つまたはそれ以上のサブユニット間での翻訳融合である。翻訳融合は、さらなるサブユニットのコード配列を有するリーディングフレーム中に一方のサブユニットのコード配列を遺伝的に操作することによって作製され得る。両方のサブユニットは、リンカーをコードするヌクレオチド配列が間に割り込んでもよい。しかしながら、本開示の融合タンパク質のサブユニットは、化学的コンジュゲーションにより連結されてもよい。融合タンパク質を形成するサブユニットは典型的には、以下のように相互に連結される：1つのサブユニットのC末端が別のサブユニットのN末端に、または1つのサブユニットのC末端が別のサブユニットのC末端に、または1つのサブユニットのN末端が別のサブユニットのN末端に、または1つのサブユニットのN末端が別のサブユニットのC末端に。融合タンパク質のサブユニットは、任意の順序で連結することができ、構成サブユニットのいずれかを2つ以上含んでもよい。サブユニットの1つまたは複数が、2つ以上のポリペプチド鎖からなるタンパク質（複合体）の一部である場合、用語「融合タンパク質」はまた、タンパク質（複合体）の融合された配列および全ての他のポリペプチド鎖を含む、タンパク質を指す場合がある。例示的な例としては、完全長免疫グロブリンが、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖を介してリポカリンムテインに融合される場合、用語「融合タンパク質」は、リポカリンムテインおよび免疫グロブリンの重鎖または軽鎖を含む、単一のポリペプチド鎖を指す場合がある。用語「融合タンパク質」はまた、免疫グロブリン全体（軽鎖と重鎖の両方）、ならびにその重鎖および/または軽鎖の一方または両方に融合されたリポカリンムテインを指す場合がある。
本明細書において用いられる場合、本明細書において開示される融合タンパク質の「サブユニット」という用語は、それ自体で安定な折り畳み構造を形成し、標的に対する結合モチーフを提供する独自の機能を画定し得る、単一のタンパク質または独立したポリペプチド鎖を指す。いくつかの態様において、本開示の好ましいサブユニットは、リポカリンムテインである。いくつかの他の態様において、本開示の好ましいサブユニットは、完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインである。
本開示の融合タンパク質によって含まれ得る「リンカー」は、本明細書において記載される融合タンパク質の2つまたはそれ以上のサブユニットを一緒に連結する。連結は共有結合性または非共有結合性であり得る。好ましい共有結合は、アミノ酸間のペプチド結合などのペプチド結合を介する。好ましいリンカーはペプチドリンカーである。したがって、好ましい態様において、前記リンカーは、1つまたは複数のアミノ酸、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれを上回るアミノ酸を含む。好ましいペプチドリンカーが本明細書において記載され、これらには、グリシン-セリン（GS）リンカー、グリコシル化GSリンカー、およびプロリン-アラニン-セリンポリマー（PAS）リンカーが含まれる。例示的なリンカーとしては、これらに限定されないが、SEQ ID NO: 4～14のアミノ酸配列を有するリンカーが挙げられる。他の好ましいリンカーには、化学的リンカーが含まれる。
用語「PRS-343」は、「cinrebafusp alfa」としても公知であり、SEQ ID NO: 50および51のアミノ酸配列を有する4-1BB/HER2二重特異性融合タンパク質を指す。PRS-343の全体構造を図13Dに示す。
本明細書において用いられる場合、用語「配列同一性」または「同一性」は、配列同士の類似性または関連性を判断する配列の性質を表す。用語「配列同一性」または「同一性」は、本開示で用いられる場合、本開示のタンパク質またはポリペプチド配列と問題の配列との（相同性）アライメント後の、これらの2つの配列のより長い方の残基の数を基準にした、対をなす同一残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一のアミノ酸残基の数を残基の総数で割り、その結果に100を掛けることによって測定される。当業者は、標準的なパラメーターを用いて配列同一性を決定するための、利用可能なコンピュータプログラム、例えば、BLAST（Altschul et al., 1997）、BLAST2（Altschul et al., 1990）、FASTA（Pearson and Lipman, 1988）、GAP（Needleman and Wunsch, 1970）、Smith-Waterman（Smith and Waterman, 1981）、およびWisconsin GCG Packageを認識している。配列同一性のパーセンテージは、例えば、BLASTPプログラム、バージョン2.2.5、2002年11月16日（Altschul et al., 1997）を用いて、アライメントのために選択されたアミノ酸の総数から「ポジティブ」（相同なアミノ酸）の数のパーセンテージを算出して、本明細書において決定することができる。
「ギャップ」は、アミノ酸の付加または欠失の結果である、アライメント中の空白である。したがって、2コピーの全く同じ配列は100％同一性を有するが、それほど高度に保存されておらず、欠失、付加、または置換を有する配列は、より低い程度の配列同一性を有し得る。
「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料として定義される。生物学的試料には、これらに限定されないが、血液、血清、尿、大便、精液、または腫瘍組織を含む組織が含まれる。好ましくは、生物学的試料は血清または血漿である。
「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。用語「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指すように本明細書において用いられ、これらに限定されないが、ほんの数例を挙げると、ヒト、家畜および農場動物、ならびに動物園、競技用、またはペット用の動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、マウス、ブタ、類人猿、例えばカニクイザルが含まれる。好ましくは、本明細書において用いられる「哺乳動物」はヒトである。本明細書において用いられる場合、用語「患者」は、上記に定義される対象、好ましくはヒト患者を指す。
本明細書において用いられる場合、用語「パーツのキット」（要するに「キット」）は、1つまたは複数の容器、および、任意で、データキャリアを含む製造物品を指す。前記容器は、本明細書において記載される作用物質（試薬）および組成物で満たされてもよい。例えば、希釈剤、緩衝剤、および/またはさらなる作用物質（試薬）もしくは組成物を含有する、追加的な容器が、キットに含まれてもよい。前記データキャリアは、非電子的データキャリア、例えば、情報リーフレット、情報シート、バーコード、もしくはアクセスコードなどのグラフィックデータキャリア、または電子的データキャリア、例えば、CD、DVD、マイクロチップ、もしくは別の半導体ベースの電子的データキャリアであってもよい。アクセスコードは、データベースへのアクセスを可能にし得る。前記データキャリアは、本明細書において記載される作用物質（試薬）および組成物を用いるための、ならびに/または本明細書において記載される方法および使用を実施するための、説明書を含んでもよい。
本明細書において用いられる場合、用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の20％以内、好ましくは15％以内、好ましくは10％以内、およびより好ましくは5％以内を意味する。前記用語には、その具体的な数も含まれ、すなわち、「約20」には20という数も含まれる。用語「少なくとも約」には、本明細書において用いられる場合、その具体的な数も含まれ、すなわち、「少なくとも約20」には、20が含まれる。
本明細書において用いられる場合、用語「および/または」は、「および」、「または」、および「前記用語によって連結される要素のすべてまたは他の任意の組合せ」の意味を含む。
本明細書において用いられる場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈によって明白に他の意味に定められない限り、複数の指示対象を含む。
IV. 図面の説明
HER2/4-1BB二重特異性融合タンパク質（SEQ ID NO: 50および51、SEQ ID NO: 50および53、SEQ ID NO: 52および49、およびSEQ ID NO: 54および49）、参照抗体SEQ ID NO: 50および48、ならびに陽性対照キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のインビトロT細胞免疫原性評価の結果を提供する。世界人口における分布を反映した32名のドナーおよびヒト白血球抗原（HLA）アロタイプにより、実施例1に記載されたPBMCに基づく形式を用いてアッセイを実施した。図1Aは、刺激指標（試験物質の存在下 対 非存在下での増殖）を示す。平均反応を横棒として表示する。反応しているドナーを定義する閾値（刺激指数＞2）を点線として表示する。図2Bは、各試験物質に対する反応者の数を示す。
標的依存的にT細胞活性化を同時刺激するPRS-343の細胞に基づく活性を示す。精製したヒト T細胞（図2A）または4-1BBを過剰発現するJurkat NF-κBレポーター細胞株（図2B）を、HER2発現腫瘍細胞株（NCI-N87（HER2高）、MKN45（HER2低）、およびHepG2（HER2ヌル））と共に、または腫瘍細胞なしで、PRS-343の存在下で共培養した。HER2陽性細胞株の存在下で、Jurkat NF-κBレポーター細胞においてIL-2の用量依存的誘導または4-1BBのクラスター形成および下流のシグナル伝達が、PRS-343によって観察された。本明細書において図示される全てのデータは、最低2名の異なるドナーにより実行された実験の代表的な例である。統計学的分析: *、P＜0.05；**、P＜0.01；および***、P＜ 0.001、Dunnet多重比較検定による一元配置ANOVAを用いる。
PRS-343の第1相非盲検用量漸増試験の加速タイトレーションデザイン（図3A）および全般的試験デザイン（図3B）を図示する。
全般的試験デザインを図示する。
0.015 mg/kg～8 mg/kgの範囲の単回投与（初回用量、サイクル1の1日目の投与で投与される）後の幾何平均PRS-343血清濃度-時間プロファイルを示す。8 mg/kgプロットには、コホート11（8 mg/kg、Q3W）および11B（8 mg/kg、Q2W）の両方の患者が含まれる。
コホート1～11B（0.0005 mg/kg Q3W～8 mg/kg Q2Wの範囲の用量レベル）の薬物曝露/薬力学関連性を示す。
PRS-343を受けた患者の全腫瘍組織（図7A）、腫瘍間質（図7B）、および腫瘍細胞（図7C）におけるCD8+T細胞増大を示す。CD8+T細胞の増加は、低用量コホート1～8と比較して、コホート9の試験以降（2.5 mg/kg以上の用量レベル）における患者でより顕著である。
反応している患者107-012における全腫瘍組織（図8A）、腫瘍間質（図8B）、および腫瘍細胞（図8C）でのCD8+T細胞増大を示す。CD8+T細胞の増加は、全腫瘍組織または腫瘍間質より腫瘍細胞でより顕著である。
反応している患者108-002における全腫瘍組織（図9A）、腫瘍間質（図9B）、および腫瘍細胞（図9C）でのCD8+T細胞増大を示す。CD8+T細胞の増加は、全腫瘍組織または腫瘍間質より腫瘍細胞でより顕著である。
反応している患者108-002における全腫瘍組織（図10A）、腫瘍間質（図10B）、および腫瘍細胞（図10C）でのCD8+Ki67+T細胞増大を示す。CD8+Ki67+T細胞の増加は、腫瘍細胞でのみ観察される。
PRS-343での処置の平均時間は、コホート9～11（それぞれ2.5 mg/kg、5 mg/kg、および8 mg/kg、Q3W）と比較して、コホート11B（8 mg/kg、Q2W）で増加していることを示す。
コホート1～11B（図12A）およびコホート9～11B（図12B）での標的病変における最良効果を図示する。
本明細書において記載されるHER2/4-1BB二重特異性融合タンパク質の設計に対する概要を提供する。代表的なHER2/4-1BB二重特異性融合タンパク質を、HER2に特異的な抗体（例えば、SEQ ID NO: 50および48に示す抗体）および4-1BBに特異的なリポカリンムテイン（例えば、SEQ ID NO: 22に示すリポカリンムテイン）をベースとして作製した。1つまたは複数の抗4-1BBリポカリンムテインを、N末端またはC末端にてペプチドリンカーを介して、抗体重鎖ドメイン（HC）のC末端（図13D）、HCのN末端（図13A）、抗体軽鎖（LC）のC末端（図13C）、および/またはLCのN末端（図13B）にて抗HER2抗体に遺伝子融合して、SEQ ID NO: 50および51、SEQ ID NO: 50および53、SEQ ID NO: 52および49、ならびにSEQ ID NO: 54および49などの融合タンパク質をもたらした。変異S228P、F234A、およびL235Aを有する操作されたIgG4骨格を、融合タンパク質に含まれる抗HER2抗体で使用した。
0.015 mg/kg～18 mg/kgの範囲の単回投与（初回用量、サイクル1、1日目）後の幾何平均PRS-343血清濃度-時間プロファイルを示す。8 mg/kgプロットには、コホート11（8 mg/kg、Q3W）および11B（8 mg/kg、Q2W）の両方の患者が含まれる。12 mg/kgプロットにはコホート12B（12 mg/kg、Q2W）の患者が含まれ、18 mg/kgにはコホート13B（18 mg/kg、Q2W）の患者が含まれる。
非有効用量コホート1～8 における患者 対 有効用量コホート9～13Bにおける患者の全腫瘍組織におけるCD8+T細胞増大（図15A）および可溶性4-1BB（s4-1BB）の血清レベル（図15 B）を示す。有効用量のPRS-343で処置した患者は、腫瘍組織中のCD8+T細胞および循環s4-1BBの増加を示し、PRS-343の4-1BBアーム活性を実証した。
コホート11B、11C、12B、13B、およびObi+11Bにおける患者の処置の過程を、臨床状態（該当する場合）を含めて示す。
コホート9、10、11、11B、11C、12B、13B、およびObi+11Bでの標的病変における最良効果を図示する。
有効用量コホートにおけるCD8+T細胞増大（誘導倍率x） 対 標的病変の％増大/縮小を示す。SD≧C6、PR、およびCRを有する患者は、CD8+T細胞の少なくとも2.3倍の増加を呈した。
反応している患者103-021におけるベースライン時、C2処置後、およびC6処置後での標的病変のCTスキャン（肺；色の濃い円形を参照）を示す。患者は完全奏効（CR）を示した。
CR患者103-021の、全腫瘍組織における処置後のCD8+T細胞増大（図20A）および血清中の循環s4-1BBの増加（図20B）を示し、PRS-343の4-1BBアーム活性を実証する。
反応している患者107-012におけるベースライン時およびC4処置後での標的病変のCTスキャン（色の濃い円形を参照）を示す。患者は部分奏功（PR）を示した。
PR患者107-012の、全腫瘍組織における処置後のCD8+T細胞およびCD8+Ki67+T細胞の増大（図22A）ならびに血清中の循環s4-1BBの増加（図22B）を示し、PRS-343の4-1BBアーム活性を実証する。
複数回の処置サイクルの過程の間に、PR患者103-012の血清中の循環s4-1BBが繰り返し増加することを示す。
「PD＆SD＜C6」患者および「CR、PR＆SD＞C6」患者に分けた有効コホート患者の全腫瘍組織における処置前のCD8+T細胞の絶対数（図24A）、および有効用量コホートの個々の反応している患者での処置前のCD8+T細胞の絶対数に対する総免疫細胞の％PD-L1+細胞（ICスコア）のプロット（図24B）を示す。PRS-343は、PD-L1低/陰性患者および治療前にCD8+T細胞が少ない患者において臨床的有用性を推進する。
全ての試験した用量コホート（8 mg/kgのデータには、Q1W、Q2WまたはQ3Wで処置した患者のデータが含まれる）にわたる、PRS-343での処置時のs4-1BBの血清レベル（サイクル1の過程で測定された）の用量依存性を示す。18 mg/kg用量でのs4-1BB血清レベルの低下は、4-1BB経路の過剰活性化または4-1BB経路の過剰活性化の可能性を示している可能性がある。ベースライン：PRS-343での処置前のs4-1BB血清レベル；灰色線：群平均を結ぶ；黒線：中央値；Mann-Whitney U試験を統計解析のために用いた。
PRS-343での処置時の5名のHER2低患者（HER2 IHC2+/FISH-またはIHC1+/FISH-）の血清中のs4-1BBレベルの最大誘導倍率を示す。サイクル1でのs4-1BBの最大誘導倍率は、進行（PD）を有する患者より臨床反応（安定、SD）を有する患者で有意に高かった。ベースライン：PRS-343での処置前のs4-1BB血清レベル。
臨床的有用性を有する2名のHER2低患者、乳がん患者103-016（図27A；サイクル2および4で安定）、および結腸直腸がん患者103-019（図27B；サイクル2、4、および6で安定）のs4-1BBプロファイルを示す。生検分析によって、これらの患者の腫瘍がHER2の低発現を特徴とすることが明らかになった。
V. 本開示の詳細な説明
本開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2021/089588 A1にも記載されるような、PRS-343の安全性および有効性を評価するために（推定上の）進行性または転移性のHER2+固形腫瘍を有する患者において行われた、PRS-343の最初のヒトでの第1相試験の結果に一部依拠する。
本開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2021/089588 A1にも記載されるような、PRS-343の安全性および有効性を評価するために（推定上の）進行性または転移性のHER2+固形腫瘍を有する患者において行われた、PRS-343の最初のヒトでの第1相試験の結果に一部依拠する。
1つの局面において、本開示は、4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際にがん患者についての肯定的な臨床的アウトカムを予測する方法であって、（a）4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与する前にがん患者から得られた生物学的試料における可溶性4-1BB（s4-1BB）のレベルを測定する段階；および（b）4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与した後にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階を含み、4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与した後にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与する前にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して増加している場合に、肯定的な臨床的アウトカムが予測される、方法を提供する。
いくつかの態様において、肯定的な臨床的アウトカムは、安定（SD）、部分奏功（PR）、完全奏効（CR）、増加した全生存期間（OS）、および/または増加した無増悪生存期間（PFS）を含む。
別の局面において、本開示は、4-1BBアゴニスト作用物質で処置した対象において、好ましくはがん患者において4-1BBアゴニスト作用物質の活性を評価する方法であって、（a）4-1BBアゴニスト作用物質を対象に投与する前に対象から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階；および（b）4-1BBアゴニスト作用物質を対象に投与した後に対象から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階を含み、4-1BBアゴニスト作用物質を対象に投与する前に対象から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して増加している、4-1BBアゴニスト作用物質を対象に投与した後に対象から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、対象における4-1BBアゴニスト作用物質の活性を示す、方法を提供する。
いくつかの態様において、活性は用量依存的活性である。
いくつかの態様において、活性は4-1BBシグナル伝達の活性化である。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質の活性は複数の対象において評価される。
いくつかの態様において、方法は、用量反応曲線、例えば、図25に示されるような用量反応曲線を作成することをさらに含む。
別の局面において、本開示は、上記に定義される方法に従って4-1BBアゴニスト作用物質の活性を評価する段階を含む、疾患、例えばがんを処置するために4-1BBアゴニスト作用物質の用量を選択する方法を提供する。
別の局面において、本開示は、疾患、例えばがんを処置するために4-1BBアゴニスト作用物質の用量を選択する方法であって、（a）異なる用量の4-1BBアゴニスト作用物質の投与の際に、疾患を有する複数の対象から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階、および（b）段階（a）で得られた結果に基づき用量反応曲線を作成する段階を含み、s4-1BBのレベル（例えば、平均レベル）が用量Xにおいて減少している場合、用量Xより低い用量が、疾患を処置するための用量として選択される、方法を提供する。
いくつかの態様において、用量Xにおけるs4-1BBのレベルの減少は、4-1BB経路の過剰活性化または4-1BB経路の過剰活性化の可能性を示す。
いくつかの態様において、用量は、より高い初回量（すなわち、負荷用量）の投与後に投与される維持用量である。
別の局面において、本開示は、がん患者に有効量の4-1BBアゴニスト作用物質を投与する段階を含む、がん患者を処置する方法であって、（a）4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与する前にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階；（b）4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与する段階；（c）4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与した後にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階；および（d）4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与した後にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与する前にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して増加している場合に、4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与することを継続する段階を含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、がん患者への4-1BBアゴニスト作用物質の投与は、4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与した後にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、4-1BBアゴニスト作用物質をがん患者に投与する前にがん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して増加していない場合に、中止される。
上記方法のいくつかの態様において、生物学的試料は血清または血漿である。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルは、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与する前に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、またはさらにそれより高い倍率で増加する。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルは、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与する前に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、生物学的試料1 ml当たり約500 pgもしくはそれ以上、約1000 pgもしくはそれ以上、約2000 pgもしくはそれ以上、約3000 pgもしくはそれ以上、約4000 pgもしくはそれ以上、約5000 pgもしくはそれ以上、約6000 pgもしくはそれ以上、約7000 pgもしくはそれ以上、約8000 pgもしくはそれ以上、約9000 pgもしくはそれ以上、約10000 pgもしくはそれ以上、約15000 pgもしくはそれ以上、または約20000 pgもしくはそれ以上増加する。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルは、生物学的試料1 ml当たり約500 pgもしくはそれ以上、約1000 pgもしくはそれ以上、約2000 pgもしくはそれ以上、約3000 pgもしくはそれ以上、約4000 pgもしくはそれ以上、約5000 pgもしくはそれ以上、約6000 pgもしくはそれ以上、約7000 pgもしくはそれ以上、約8000 pgもしくはそれ以上、約9000 pgもしくはそれ以上、約10000 pgもしくはそれ以上、約15000 pgもしくはそれ以上、または約20000 pgもしくはそれ以上の濃度まで増加する。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定することは、複数（例えば、2、3、4、またはそれより多い）サイクルの4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中および/またはその後にs4-1BBのレベルを測定することを含む。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルは、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与する前に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、少なくとも1サイクル、少なくとも2サイクル、少なくとも3サイクル、または少なくとも4サイクルの4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中またはその後に増加する。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルは、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与する前に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、複数（例えば、2、3、4、またはそれより多い）サイクルの4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中またはその後に繰り返し増加する。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルは、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与する前に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、複数（例えば、2、3、4、またはそれより多い）サイクルの4-1BBアゴニスト作用物質での処置の各々の最中またはその後に増加する。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質での処置のサイクルは、（i）約21日、4-1BBアゴニスト作用物質が3週毎に約1回の間隔で投与される（Q3W）；（ii）約28日、4-1BBアゴニスト作用物質が2週毎に約1回の間隔で投与される（Q2W）；または（iii）約21日、4-1BBアゴニスト作用物質が毎週約1回の間隔で投与される（Q1W）を含む。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルは、1または複数（例えば、2、3、4、もしくはそれより多い）サイクルの4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中および/またはその後に測定されたs4-1BBの最大レベルである。いくつかの態様において、それは、4-1BBアゴニスト作用物質での処置の初回サイクルの間に測定されたs4-1BBの最大レベルである。
いくつかの態様において、1または複数（例えば、2、3、4、もしくはそれより多い）サイクルの 4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中および/またはその後に測定されたs4-1BBの最大レベルは、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与する前に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、またはさらにそれより高い倍率で増加する。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質を対象/がん患者に投与した後に対象/がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルは、1または複数（例えば、2、3、4、もしくはそれより多い）サイクルの4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中および/またはその後に測定されたs4-1BBの平均レベルである。
別の局面において、本開示は、4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際のがん患者の臨床的アウトカムについての予測バイオマーカー（例えば、血清に基づくバイオマーカー）としての、s4-1BBの使用を提供する。
別の局面において、本開示は、4-1BBアゴニスト作用物質で処置した対象における、好ましくはがん患者における4-1BBアゴニスト作用物質の活性、好ましくは用量依存的活性についてのバイオマーカー（例えば、血清に基づくバイオマーカー）としての、s4-1BBの使用を提供する。
別の局面において、本開示は、疾患、例えばがんを処置するために4-1BBアゴニスト作用物質の用量（例えば、維持用量）を選択するためのバイオマーカー（例えば、血清に基づくバイオマーカー）としての、s4-1BBの使用を提供する。
別の局面において、本開示は、4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際にがん患者についての肯定的な臨床的アウトカムを予測するために生物学的試料においてs4-1BBを検出するための手段を含むキットの使用を提供する。
別の局面において、本開示は、4-1BBアゴニスト作用物質で処置された対象において、好ましくはがん患者において4-1BBアゴニスト作用物質の活性、好ましくは用量依存的活性を評価するために生物学的試料においてs4-1BBを検出するための手段を含むキットの使用を提供する。
別の局面において、本開示は、疾患、例えばがんを処置するために4-1BBアゴニスト作用物質の用量（例えば、維持用量）を選択するために生物学的試料においてs4-1BBを検出するための手段を含むキットの使用を提供する。
上記の使用のいくつかの態様において、生物学的試料は血清または血漿である。
いくつかの態様において、生物学的試料においてs4-1BBを検出するための手段は、4-1BBおよび/またはs4-1BBに特異的な抗体を含む。
いくつかの態様において、キットはイムノアッセイキットである。
いくつかの態様において、キットは、希釈剤を含有する容器、緩衝剤を含有する容器、酵素コンジュゲートを含有する容器、基質溶液を含有する容器、二次抗体を含有する容器、ビーズを含有する容器、マルチウェルプレート、データキャリア、のうちの1つまたは複数をさらに含む。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質は、4-1BBアゴニスト活性を有する抗体およびその抗原結合断片、抗体ミメティック、低分子、ならびに他の抗原結合分子、例えばアプタマーからなる群より選択される。いくつかの態様において、抗体ミメティックは、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、リポカリンムテイン、アビマー、DARPin、ファイノマー（Fynomer）、クニッツドメインペプチド、モノボディ、およびnanoCLAMPからなる群より選択される。いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質は二重特異性作用物質である。
上記方法または使用のいくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質は、4-1BBに特異的なリポカリンムテインを含むか、またはそれである。
いくつかの態様において、リポカリンムテインは、4-1BBに結合特異性を有する成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）のムテインである。成熟hNGALのムテインは、本明細書において、「hNGALムテイン」と呼ばれる場合がある。
いくつかの態様において、リポカリンムテインは、高い親和性でヒト4-1BBに結合することができ、かつ/または抗CD3抗体と共にプラスチック皿上に固定されたときにヒトT細胞を共刺激することができる。いくつかの態様において、リポカリンムテインは、SEQ ID NO: 21～39またはその断片もしくはバリアントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リポカリンムテインは、SEQ ID NO: 22に示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、リポカリンムテインは、SEQ ID NO: 21～39からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して高い配列同一性、例えば、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、リポカリンムテインは、SEQ ID NO: 22に示されるアミノ酸配列に対して高い配列同一性、例えば、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を有する。4-1BBに特異的な適切なリポカリンムテインは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2016/177762 A1にも記載される。
いくつかの態様において、リポカリンムテインは、SEQ ID NO: 22に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 22に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質は、融合タンパク質の一部、特に4-1BBアゴニスト作用物質と腫瘍ターゲティング部分を含む融合分子の一部である。腫瘍ターゲティング部分は、抗体およびその抗原結合断片、抗体ミメティック、低分子、ならびに他の抗原結合分子、例えばアプタマーからなる群より選択され得る。いくつかの態様において、抗体ミメティックは、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、リポカリンムテイン、アビマー、DARPin、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、およびnanoCLAMPからなる群より選択される。いくつかの態様において、腫瘍ターゲティング部分は、腫瘍細胞の表面上に発現している腫瘍抗原に特異的である。いくつかの態様において、腫瘍ターゲティング部分は、抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、融合分子は、腫瘍細胞の表面上に発現している腫瘍抗原に特異的な抗体と、4-1BBに特異的なリポカリンムテイン、例えば、上記に定義されるようなリポカリンムテインとを含む、融合タンパク質であり、好ましくは、抗体は、両方の重鎖のC末端で、4-1BBに特異的なリポカリンムテインのN末端に融合される。
いくつかの態様において、腫瘍抗原はHER2である。いくつかの態様において、4-1BBアゴニスト作用物質は、4-1BB/HER2二重特異性作用物質である。
いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、4-1BBアゴニスト活性を有する少なくとも1つの4-1BBターゲティング部分および少なくとも1つのHER2ターゲティング部分を含み、前記ターゲティング部分は独立して、抗体およびその抗原結合断片、抗体ミメティック、低分子、ならびに他の抗原結合分子、例えばアプタマーからなる群より選択される。いくつかの態様において、抗体ミメティックは、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、リポカリンムテイン、アビマー、DARPin、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、およびnanoCLAMPからなる群より選択される。HER2ターゲティング抗体は当技術分野において公知であり、それらには、例えば、トラスツズマブおよびペルツズマブが含まれる。4-1BBターゲティング抗体もまた当技術分野において公知であり、それらには、例えば、ウレルマブおよびウトミルマブが含まれる。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、コンジュゲートまたは融合分子、特に融合タンパク質である。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は二重特異性抗体である。
いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、融合分子、特に、HER2に特異的な抗体またはその抗原結合ドメインと4-1BBに特異的な少なくとも1つのリポカリンムテイン、例えば、上記に定義されるようなリポカリンムテインとを含む融合タンパク質である。より具体的には、融合タンパク質は、任意の順序で少なくとも2つのサブユニット：（1）HER2に特異的な抗体またはその抗原結合ドメインを含む第1のサブユニット、および（2）4-1BBに特異的なリポカリンムテインを含む第2のサブユニットを含んでもよい。いくつかの態様において、融合タンパク質は、少なくとも1つの追加のサブユニット、例えば、第3のサブユニットを含有する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、4-1BBに特異的なリポカリンムテインを含む第3のサブユニットを含有する。いくつかの態様において、融合タンパク質の少なくとも1つのサブユニットは、そのN末端および/またはそのC末端で別のサブユニットに融合される。いくつかの態様において、融合タンパク質の少なくとも1つのサブユニットは、リンカーを介して別のサブユニットに融合される。本明細書において記載されるリンカーは、ペプチドリンカー、例えば、不定形のグリシン-セリン（GS）リンカー、グリコシル化 GSリンカー、またはプロリン-アラニン-セリンポリマー（PAS）リンカーであってよい。いくつかの態様において、SEQ ID NO: 4 に示される(Gly4Ser)3リンカー（(G4S)3）が用いられる。他の例示的なリンカーは、SEQ ID NO: 5～14に示される。いくつかの態様において、融合タンパク質の第2のサブユニットは、そのN末端で、リンカー、好ましくは(G4S)3リンカーを介して、第1のサブユニットに含まれる抗体またはその抗原結合ドメインの重鎖定常領域（CH）のC末端の各々に連結される。いくつかの態様において、リポカリンムテインサブユニットは、ペプチドリンカーを介して、融合タンパク質の抗体サブユニットに融合される。いくつかの態様において、リポカリンムテインサブユニットは、そのN末端またはそのC末端で、ペプチドリンカーを介して、抗体重鎖（HC）のC末端、HCのN末端、抗体軽鎖（LC）のC末端、および/またはLCのN末端で抗体サブユニットに融合される（例えば、図13に示すように）。いくつかの特定の態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、HER2に特異的な抗体を含む融合タンパク質であり、前記HER2に特異的な抗体は、好ましくはペプチドリンカー、例えば、(G4S)3リンカーを介して、両方の重鎖のC末端で、4-1BBに特異的なリポカリンムテインのN末端に融合されている。
いくつかの態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインのFc領域のFc機能は、保持される。したがって、融合タンパク質は、4-1BBおよびHER2に同時にエンゲージしながら、同時にFc受容体陽性細胞に結合できる可能性がある。いくつかの他の態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインのFc領域のFc機能は、融合タンパク質が4-1BBおよびHER2に同時にエンゲージしながら、低減されるかまたは十分に抑制される。いくつかの態様において、IgG4は、IgG1と比較して低下したFc-γ受容体相互作用を示すことが公知であることから、これは、例えば、IgG1骨格からIgG4への切り替えによって達成され得る。いくつかの態様において、Fc-γ受容体への残っている結合をさらに低下させるために、F234AおよびL235Aなどの変異がIgG4骨格に導入されてもよい。いくつかの態様において、IgG4ハーフ抗体の交換を最小化するために、S228P変異もまたIgG4骨格に導入されてもよい（Silva et al., 2015）。いくつかの態様において、F234AおよびL235A変異が、ADCCおよびADCPを減少させるために導入されてもよく（Glaesner et al., 2010）、かつ/またはM428LおよびN434S変異またはM252Y、S254T、およびT256E変異が、血清半減期を延ばすために導入されてもよい（Dall'Acqua et al., 2006, Zalevsky et al., 2010）。いくつかの態様において、天然のグリコシル化モチーフを除去するために、追加のN297A変異が融合タンパク質の抗体重鎖中に存在してもよい。
いくつかの態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、およびSEQ ID NO: 42に示される3つの重鎖相補性決定領域（CDR）、ならびに/またはSEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、およびSEQ ID NO: 45に示される3つの軽鎖CDRを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 46に示される重鎖可変領域（HCVR）および/またはSEQ ID NO: 47に示される軽鎖可変領域（LCVR）を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 49に示される重鎖および/またはSEQ ID NO: 50に示される軽鎖を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 46に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくはそれよりもさらに高い配列同一性を有するHCVR、および/またはSEQ ID NO: 47に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくはそれよりもさらに高い配列同一性を有するLCVRを有する。他の態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインは、SEQ ID NO: 49に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくはそれよりもさらに高い配列同一性を有する重鎖、および/またはSEQ ID NO: 50に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくはそれよりもさらに高い配列同一性を有する軽鎖を有する。
いくつかの態様において、抗体は、（a）SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、およびSEQ ID NO: 42に示される3つの重鎖相補性決定領域（CDR）、ならびにSEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、およびSEQ ID NO: 45に示される3つの軽鎖 CDRと；（b）SEQ ID NO: 49に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖、およびSEQ ID NO: 50に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖とを含む。
いくつかの態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインは、抗HER2抗体である。いくつかの態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインは、トラスツズマブである。いくつかの態様において、融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合ドメインは、IgG4骨格を有するトラスツズマブである。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、可動性の非免疫原性ペプチドリンカーによって連結される、トラスツズマブIgG4バリアントへの4-1BB特異的hNGALムテインの遺伝子融合によって作製される。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 50および51、SEQ ID NO: 50および53、SEQ ID NO: 52および49、ならびにSEQ ID NO: 54および49からなる群より選択されるアミノ酸配列のセットを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 50および51、SEQ ID NO: 50および53、SEQ ID NO: 52および49、ならびにSEQ ID NO: 54および49に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質が、2つ以上のアミノ酸鎖を含む場合、配列同一性についての所与値は、両方のアミノ酸鎖中のアミノ酸残基の数によって正規化された平均配列同一性に関する。例えば、ある融合タンパク質が、100個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖Aおよび50個のアミノ酸を有するアミノ酸鎖Bからなり、かつ別の融合タンパク質が、100個のアミノ酸およびアミノ酸鎖Aに対して80 ％の配列同一性を有する有するアミノ酸鎖A’、および50個のアミノ酸およびアミノ酸鎖B’に対して95％の配列同一性を有するアミノ酸鎖B’からなる場合、両方の融合タンパク質間の平均配列同一性は、（100/(100＋50））×80％＋（50/(100＋50））×95％＝85％の配列同一性である。いくつかの好ましい態様において、融合タンパク質が2つ以上のアミノ酸鎖を含む場合、配列同一性についての所与値は、関心対象のタンパク質が、二重特異性融合タンパク質の一方の鎖に対して所与値の配列同一性を少なくとも有するアミノ酸配列を含み、かつ融合タンパク質のもう一方の鎖に対して所与値の配列同一性を少なくとも有するアミノ酸配列を含むことを意味する。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 50および51に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、SEQ ID NO: 50に示されるアミノ酸配列を有する2つの鎖、およびSEQ ID NO: 51に示されるアミノ酸配列を有する2つの鎖を含む。HER2に特異的な抗体またはその抗原結合ドメインおよび4-1BBに特異的なリポカリンムテインを含む適切な4-1BB/HER2二重特異性融合タンパク質はまた、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2016/177802 A1にも記載される。
いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、HER2および4-1BBに同時にエンゲージすることができる。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、HER2依存的に4-1BBクラスター形成およびシグナル伝達を誘導することができる。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、HER2発現腫瘍微小環境において4-1BBシグナル伝達を活性化することができる。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、T細胞応答を共刺激することができ、かつ/またはHER2発現腫瘍微小環境においてT細胞機能を増強することができる。
いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、3週毎に約1回、2週毎に約1回、または毎週約1回の間隔で投与される。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、2週毎に約1回の間隔で投与される。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、約2.5 mg/kg～約27 mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、約2.5 mg/kg、約5 mg/kg、約8 mg/kg、約12 mg/kg、または約18 mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、約8 mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、約18 mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、4-1BB/HER2二重特異性作用物質は、静脈内に、例えば、静脈内注入によって投与される。特異的4-1BB/HER2二重特異性作用物質cinrebafusp alfaを投与する段階を含む腫瘍を処置する方法が、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、WO 2021/089588 A1に記載される。
上記の方法および使用のいくつかの態様において、腫瘍/がんはHER2発現腫瘍/がんである。
いくつかの態様において、腫瘍/がんは、HER2の低い発現を特徴とする。いくつかの態様において、腫瘍/がんは、IHC1+またはIHC2+/(F）ISH-のHER2状態を特徴とする。いくつかの態様において、腫瘍/がんは、例えば、（F）ISHまたは次世代シーケンシング（NGS）分析によって決定される、HER2遺伝子増幅を呈さない。
いくつかの態様において、腫瘍/がんは、HER2陽性（HER2+）腫瘍/がんである。いくつかの態様において、腫瘍/がんは、IHC3+、IHC2+/(F）ISH+、または（F）ISH+、好ましくはIHC3+またはIHC2+/(F）ISH+のHER2状態を特徴とする。いくつかの態様において、腫瘍/がんは、例えば、（F）ISHまたは次世代シーケンシング（NGS）分析によって決定される、HER2遺伝子増幅を呈する。
いくつかの態様において、腫瘍/がんは、胃がん、婦人科がん（例えば、卵管がん、子宮内膜がん、または卵巣がん）、乳がん、肺がん、特に非小細胞肺がん、胆嚢がん、胆管細胞がん、黒色腫、食道がん、胃食道がん（例えば、胃食道接合部がん）、結腸直腸がん、直腸がん、結腸がん、膵臓がん、胆道がん、唾液管がん、膀胱がん、および原因不明のがんからなる群より選択される。
本開示のさらなる目的、利点、および特徴は、限定することを意図しない以下の実施例およびその添付の図面の検討により当業者に明らかになるであろう。したがって、本開示は例示的な態様および任意の特徴によって具体的に開示されるが、本明細書において開示されその中で具体化される本開示の改変および変更が当業者によって行われ得ること、ならびにそのような改変および変更が本開示の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
VI. 実施例
実施例1：HER2/4-1BB二重特異性融合タンパク質のT細胞免疫原性評価
ヒトにおける抗薬物抗体の形成のリスクを調べるために、HER2/4-1BB二重特異性融合タンパク質SEQ ID NO: 50および51、SEQ ID NO: 50および53、SEQ ID NO: 52および49、ならびにSEQ ID NO: 54および49について、ならびに参照抗体SEQ ID NO: 50および48について、インビトロでのT細胞免疫原性評価を実施した。
実施例1：HER2/4-1BB二重特異性融合タンパク質のT細胞免疫原性評価
ヒトにおける抗薬物抗体の形成のリスクを調べるために、HER2/4-1BB二重特異性融合タンパク質SEQ ID NO: 50および51、SEQ ID NO: 50および53、SEQ ID NO: 52および49、ならびにSEQ ID NO: 54および49について、ならびに参照抗体SEQ ID NO: 50および48について、インビトロでのT細胞免疫原性評価を実施した。
ヒト白血球抗原（HLA）アロタイプを網羅するように選択されかつ世界人口の分布を反映している、32名のドナーに由来するヒト末梢血単核細胞（PBMC）を解凍し、洗浄し、3×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートの上に播種した。アッセイ用培地で希釈した試験物質を、30 μg/mLの濃度で細胞に添加し、次いで、37℃および5％CO2での加湿雰囲気中で7日間インキュベートした。アッセイ用培地単独をブランクとして用い、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）をナイーブな陽性対照として試験した。7日目に、PBMCを、表面の表現型CD3+およびCD4+マーカーについて、および細胞増殖マーカーとして用いられる、DNAに組み込まれるEdU（5-エチニル-2’デオキシウリジン）について、標識した。CD3+CD4+EdU+増殖細胞のパーセンテージを、Guava easyCyte 8HTフローサイトメーターを用いて測定し、GuavaSoft InCyteソフトウェアを用いて分析した。
このアッセイの結果を図1に示す。図1Aでは、刺激指標をプロットし、刺激指標は、試験物質の存在下 対 非存在下での増殖の比率によって得られた。反応しているドナーを定義する閾値（刺激指標＞2）を点線として表示する。図1Bでは、この閾値によって定義される反応しているドナーの数をプロットした。明らかなように、参照抗体SEQ ID NO: 50および48に反応するドナーの数は1であることから少なく、一方で、32名のドナー全員が、閾値を上回る強い増殖で陽性対照KLHに反応する。二重特異性融合タンパク質では、反応しているドナーの数は、SEQ ID NO: 50および51、SEQ ID NO: 54および49、SEQ ID NO: 50および53、ならびにSEQ ID NO: 52および49に対してそれぞれ、0、1、2、および3である。
結果は、二重特異性融合タンパク質、特に、SEQ ID NO: 50および51ならびにSEQ ID NO: 54および49が、インビトロでのT細胞免疫原性評価において反応をほとんど誘導しないことを実証し、ヒトにおいて免疫原性反応を誘導するリスクは低いことを示す。
実施例2: PRS-343のインビトロでのT細胞活性化
PRS-343によって媒介されるHER2標的依存性T細胞活性化を、さまざまなレベルのHER2を発現する細胞株のパネルを用いて、共培養試験において評価した。臨床的に関連するレベルの範囲のHER2受容体を示すがん細胞株（NCI-N87：HER2高、MKN45：HER2低、HepG2：HER2ヌル）を、PRS-343のクラスター形成およびそれに続くT細胞の活性化を媒介する能力について試験した。潜在的な治療域を評価するために、バックグラウンドレベルのHER2を発現することが公知である健常組織に由来する細胞株も含めた。
PRS-343によって媒介されるHER2標的依存性T細胞活性化を、さまざまなレベルのHER2を発現する細胞株のパネルを用いて、共培養試験において評価した。臨床的に関連するレベルの範囲のHER2受容体を示すがん細胞株（NCI-N87：HER2高、MKN45：HER2低、HepG2：HER2ヌル）を、PRS-343のクラスター形成およびそれに続くT細胞の活性化を媒介する能力について試験した。潜在的な治療域を評価するために、バックグラウンドレベルのHER2を発現することが公知である健常組織に由来する細胞株も含めた。
簡単に説明すると、10 μg/mLのマイトマイシンC（Sigma Aldrich）で前処理したがん細胞または健常組織に由来する細胞を、抗CD3で予めコーティングした培養プレートに播種し、5％CO2加湿雰囲気中で37℃にて一晩インキュベートした。T細胞懸濁液（5×104個の細胞）を試験物質と一緒に添加し、3日間インキュベートした。電気化学発光（ECL）イムノアッセイ（IL2 DuoSetキット； R&D Systemsを用いる）を用いて上清中のヒトIL-2を定量化することによって、T細胞活性化のレベルを測定した。
PRS-343による4-1BB経路の特異的活性化もまた、ルシフェラーゼレポーター細胞アッセイ（Promega）を用いて評価され、前記アッセイでは、4-1BBを過剰発現するレポーター細胞株（NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat細胞）が、HER2陽性腫瘍細胞株と同時培養され、4-1BB経路活性化がルミネセンスによって測定された。
例示的な実験の結果を図2に示す。HER2陽性細胞株の存在下で、PRS-343によるIL-2の用量依存的誘導が観察された。具体的には、PRS-343は、約35 pmol/L（EC50）の効力でHER2陽性NCI-N87細胞の存在下でのIL-2産生を誘導する。基本レベルのHER2を発現する細胞株を用いて実験を実施した場合、PRS-343依存的IL-2誘導は観察されなかった。加えて、PRS-343は、およそ50 pmol/L（EC50）の効力で、HER2陽性細胞の存在下でJurkat NF-κBレポーター細胞株において4-1BBクラスター形成および下流のシグナル伝達を誘導する。
釣り鐘型の反応が、初代T細胞活性化アッセイおよびJurkat NF-κBレポーターアッセイの両方で観察され、これは、反応が、腫瘍細胞標的HER2、薬物PRS-343、およびT細胞受容体4-1BBの三元複合体の形成を必要とし、HER2および4-1BBが個々にPRS-343で飽和される場合には妨害されるおそれがあることを示唆した。
実施例3：進行性または転移性のHER2+固形腫瘍を有する患者におけるPRS-343の用量漸増試験
実施例3は、コホート1～11についてのこの試験の情報を提供し、コホート1～13についての追加情報は実施例4において提供される。
実施例3は、コホート1～11についてのこの試験の情報を提供し、コホート1～13についての追加情報は実施例4において提供される。
A. 試験の目的と概要
本実施例は、標準治療オプションが利用できないか、もはや有効ではないか、許容されないか、または患者が標準療法を拒否している、進行性または転移性のHER2+固形腫瘍を有する患者におけるPRS-343の第1相非盲検、用量漸増試験を記載する。試験の主要目的は、安全性プロファイルを特徴決定し、PRS-343の最大耐用量（MTD）および推奨第2相用量（RP2D）を特定することである。試験の副次的目的は、PRS-343の薬物動態学的（PK）プロファイルを特徴決定し、PRS-343の投与スケジュールを調べ、PRS-343の有効性の予備的な推定値を得、PRS-343の潜在的免疫原性を評価し、PRS-343の薬力学的（PD）作用を評価し、かつPK/安全性、PK/PD、およびPK/有効性の相関性の可能性を評価することである。
本実施例は、標準治療オプションが利用できないか、もはや有効ではないか、許容されないか、または患者が標準療法を拒否している、進行性または転移性のHER2+固形腫瘍を有する患者におけるPRS-343の第1相非盲検、用量漸増試験を記載する。試験の主要目的は、安全性プロファイルを特徴決定し、PRS-343の最大耐用量（MTD）および推奨第2相用量（RP2D）を特定することである。試験の副次的目的は、PRS-343の薬物動態学的（PK）プロファイルを特徴決定し、PRS-343の投与スケジュールを調べ、PRS-343の有効性の予備的な推定値を得、PRS-343の潜在的免疫原性を評価し、PRS-343の薬力学的（PD）作用を評価し、かつPK/安全性、PK/PD、およびPK/有効性の相関性の可能性を評価することである。
20 mMヒスチジン、250 mMソルビトール、pH 6.3、0.01％PS80中に25 mg/mLの標的タンパク質濃度で16 mLのPRS-343製剤を含有する20 mLガラス製バイアル中の水溶液として、PRS-343を供給した。登録された対象は、最初に、3週毎に2時間にわたる静脈内（IV）注入（Q3W、21日サイクル）（スケジュール1）によって投与されるPRS-343を受けた。安全性、PK、およびPDデータが、異なる投与スケジュールを評価すべきであると示唆した場合には、スケジュール2または3（それぞれ、28日サイクルで2週毎（Q2W）または4週毎（Q4W）に投与）を実施する場合がある。評価した各スケジュールについて、個々のMTDを決定する場合がある。患者を、目的別に分けたコホートにおけるさまざまな用量レベル（表1）に割り当て、スケジュール1では各21日サイクルの1日目に、スケジュール2では各28日サイクルの1日目および15日目に、またはスケジュール3では各28日サイクルの1日目に、PRS-343を受けさせた。
（表１）PRS-343用量レベル
初期コホートに対して加速タイトレーションデザインを利用した（図3A）。患者がサイクル1においてグレード2の治療関連有害作用（AE）を経験するまで、各漸増用量コホートにおいて、1コホート当たり1名の患者のみを登録し、経験した時点で、2名の追加の患者を登録した。第2の患者がグレード2治療関連AEを経験した場合には、標準的な用量漸増期を開始した。いずれの患者もグレード2の治療関連AEを経験しなかった場合には、加速タイトレーションを継続した。1名の患者が用量制限毒性（DLT）を経験した場合には、改変3＋3デザインを開始した（図3B）。標準的な用量漸増期では、改変3＋3デザインを利用し、1コホートに3名または4名の患者を登録し、DLTが観察される場合には最大で合計6名の評価可能な患者まで拡大させることが可能である。改変3＋3デザインは、以前に開始されていない場合には、用量レベル8から11およびそれより高い用量レベル（それぞれ、1 mg/kg～8 mg/kgまたはそれより高い）で開始されるように予定された。各コホートが登録され、コホート中の全患者がサイクル1を完了した後に、全コホートからの安全性データを再検討し、さらなる用量漸増を進めるかどうかを決定した。
非耐用量を特定した後、その用量が6名の評価可能な患者に投与されるまで、それより前の用量での登録が再開される。MTDは、33％以上の患者においてDLTを誘導する用量を下回る用量レベルと定義される。用量レベルをMTDと呼ぶためには、前記用量レベルにおいて、少なくとも6名の評価可能な患者を評価しなければならない。MTDを確立する際に、RP2Dを決定するために、安全性/PD/PK/有効性データがより低い用量レベルをさらに評価することを支持する場合、MTDおよび/またはより低用量レベルでの個々の拡大コホートに、最大で30名の追加の患者を登録する。
以下の基準に基づいて、対象を試験に登録した：1. スクリーニング手順を含む任意の試験手順を実施する前に、署名された書面によるインフォームドコンセントを得ていること；2. 18歳以上の男性および女性；3. 用量漸増：切除不能/局所的に進行性および/または転移性のHER2+固形悪性腫瘍の組織学的または細胞学的な確定診断、標準療法が利用できないか、もはや有効ではないか、許容されないか、または患者によって拒否されている。拡大コホート：HER2標的化4-1BBアゴニストに反応する可能性が高いとみなされる切除不能/局所的に進行性または転移性のHER2+固形腫瘍（例えば、胃/胃食道/食道、乳房、膀胱）；4. 用量漸増および拡大コホート：臨床病理学的報告によって実証されているHER2+固形腫瘍；5. 乳がんならびに胃および胃食道接合部がんを有する患者は、進行性/転移性疾患に対するHER2標的化療法を以前に少なくとも1回受けていなければならない；6. 米国東海岸がん臨床試験グループ（Eastern Cooperative Oncology Group）（ECOG）パフォーマンスステータス（PS）0～1；7. 少なくとも3ヶ月の推定余命；8. 用量漸増：RECIST v1.1により評価可能または測定可能な疾患。拡大コホート（追加の30名の患者）：RECISTにより測定可能な疾患；9. 以下に定義する適切な器官機能：a）血清ASTおよびALT≦3×ULN；肝臓が存在する場合は、≦5×ULN。b）総血清ビリルビン≦1.5×ULN。C）血清クレアチニン≦1.5×ULNまたはCockcroft-Gault式によって算出された糸球体濾過量（GFR）≧50 mL/分。d）ヘモグロビン≧9 g/dL。e） ANC≧1500/mm3。f）血小板数≧75,000/mm3。g）心エコー図またはマルチゲート収集スキャンによって決定される左室駆出率（LVEF）≧50％；10. 以前の累積ドキソルビシン用量は、360 mg/m2以下でなければならない；以前の累積エピルビシン用量は、720 mg/m2以下でなければならない；11. 妊娠可能な女性は、試験薬の開始前96時間以内に血清妊娠検査または尿妊娠検査が陰性でなければならない；12. 女性は授乳中であってはならない；13. 妊娠可能な女性は、試験薬PRS-343での処置期間中およびそれに加えて処置完了後90日の間、避妊方法についての指示に従うことに同意しなければならない；14. 妊娠可能な女性との性交渉を有する男性は、試験薬PRS-343での処置期間中およびそれに加えて処置完了後90日の間、避妊方法についての指示に従うことに同意しなければならない。
加えて、以下の基準のいずれかを満たす対象は、登録しなかった：1. 制御不能な中枢神経系(CNS)転移および/または脳軟膜転移がんが知られていること。注意：脳転移を以前に処置処置された患者は、脳転移が安定であり（試験処置の初回投与前の少なくとも4週間にわたって画像化による進行の証拠がなく、かつ任意の神経症状がベースラインに戻っている）、新たな脳転移または脳転移の拡大の証拠もなく、かつ試験処置前の少なくとも7日間にわたってステロイドを中止しても臨床的に安定していることを条件として、参加してよい。脳軟膜転移がんは、臨床的安定性にかかわらず試験参加から患者を除外する；2. 過去24週間以内に心筋梗塞、冠動脈バイパス移植、不安定狭心症、冠動脈形成術、またはステント術を含む、急性冠動脈症候群の病歴；3. ニューヨーク心臓協会（New York Heart Association）（NYHA）の機能分類システムによって定義されるII度、III度、もしくはIV度の心不全の病歴があるか、または現在罹患している；4. トラスツズマブおよび/またはペルツズマブによって、正常値の下限を下回る駆出率の低下の病歴；5. 患者が患者情報を理解する能力、インフォームドコンセントを示す能力、試験プロトコールを遵守する能力、または試験を完了する能力を弱める、医学的、精神医学的、認知的、または他の状態；6. 試験責任者の判断において、患者にとって試験参加を不適切にすると思われる、任意の重度の併発疾患または併発状態（活動性感染、心臓不整脈、間質性肺疾患を含む）；7. ヒト免疫不全ウイルス(HIV)またはB型肝炎感染もしくはC型肝炎感染による活動性感染がこれまでに知られていること。B型肝炎コア抗体（HBcAb）が陽性である患者は、ウイルスデオキシリボ核酸(DNA)の状態の評価およびモニタリングを必要とする；C型肝炎ウイルス（HCV）コア抗体が陽性である患者は、HCVリボ核酸（RNA）が陰性である場合に登録できる；8. PRS-343の任意の成分/賦形剤に対する注入反応の病歴；9. 試験処置の初回投与前7日以内に、全身性ステロイド療法(＞10 mgのプレドニゾンもしくは等価物を毎日)または他の任意の形態の免疫抑制療法（注意：局所的ステロイド、吸入ステロイド、鼻用ステロイド、および眼科用ステロイドは禁止されない）；10. 過去に全身的処置（すなわち、疾患修飾剤、コルチコステロイド、または免疫抑制薬による）を必要としていた自己免疫疾患。補充療法（例えば、副腎機能不全または下垂体機能不全等に対するチロキシン、インスリン、または生理的コルチコステロイドの補充療法）は許容される；11. 以前の抗がん処置の有害作用から、処置前のベースラインまたはグレード1まで回復していない。ただし、脱毛症、貧血（ヘモグロビンレベルは、試験選択基準を満たさなければならない）および末梢神経障害（グレード2以下まで回復していなければならない）、制吐処置および抗下痢処置が使い果たされていない場合の悪心および下痢を除く；12. 二次原発がんの病歴。ただし、1）根治的に処置された非黒色腫皮膚がん、2）インサイチューで根治的に処置された子宮頸がんもしくは乳がん、または3）活動性疾患の存在が知られておらず、かつ過去2年間に処置が施与されていない、他の悪性腫瘍を除く；13. 予定されるサイクル1の1日目（C1D1）の投与から3週間以内に治験処置を受けていること；14. 予定されるC1D1の投与から3週間（ニトロソ尿素およびマイトマイシンCでは6週間）以内に細胞障害性化学療法を受けていること；15. 予定されるC1D1投与から3週間以内に放射線療法を受けていること。ただし、放射線が、内臓以外の構造に限定された照射野（例えば、四肢骨転移）を含んだ場合を除く；16. 予定されるC1D1投与から3週間以内に、免疫療法、生物学的療法、標的化低分子、ホルモン療法による処置を受けていること；17. 予定されるC1D1投与から4週間以内に、トラスツズマブもしくはアドトラスツズマブエムタンシンまたはトラスツズマブと同じエピトープにエンゲージする他の任意の実験薬を受けていること；18. 別の治療的臨床試験への同時登録；19. 予定されるC1D1の投与から3週間以内に大手術。
B. 試験手順
HER2状態が不明である対象からは、スクリーニング前にHER2検査を受けるためのプレスクリーニング来院時に個別に同意を得た。全ての対象を、薬物の投与前28日以内（-28日目～-1日目）にスクリーニングして、彼らが試験選択基準を満たしていることを確定し、ベースライン（投与前1日目）について評価した。
HER2状態が不明である対象からは、スクリーニング前にHER2検査を受けるためのプレスクリーニング来院時に個別に同意を得た。全ての対象を、薬物の投与前28日以内（-28日目～-1日目）にスクリーニングして、彼らが試験選択基準を満たしていることを確定し、ベースライン（投与前1日目）について評価した。
スケジュール1において、対象は、サイクル1の1日目にPRS-343の初回投与を受け、続いて、各サイクル（3週毎）の1日目に後続投与を受けた。サイクル1の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目；サイクル2の1日目および2～8日目；サイクル3の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目；次いで、すべての後続のサイクルの1日目に、患者評価を行った。評価はまた、サイクル2、4、6、および8の21日目（± 7日）、ならびにその後、4サイクル（12週 [± 7日]）毎の21日目にも行われた。
スケジュール2において、対象は、サイクル1の1日目にPRS-343の初回投与、続いて、サイクル1の15日目に投与および各サイクル（4週毎）の1日目および15日目に後続投与を受けた。サイクル1の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、15日目、および22日目；サイクル2の1日目、2～8日目、および15日目；サイクル3の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目；次いで全ての後続サイクルの1日目および15日目に、患者評価を行った。評価はまた、サイクル2、4、および6の28日目（± 7日）、ならびにその後、3サイクル（12週 [± 7日]）毎の28日目にも行われた。
スケジュール3において、対象は、サイクル1の1日目にPRS-343の初回投与、続いて、各サイクル（4週毎）の1日目に後続投与を受けた。サイクル1の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目；サイクル2の1日目および2～8日目；サイクル3の1日目；サイクル4の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目；次いで全ての後続サイクルの1日目に、患者評価を行った。評価はまた、サイクル2、4、および6の28日目（± 7日）、ならびにその後、3サイクル（12週 [± 7日]）毎の28日目にも行われた。
用量制限毒性（DLT）が、各スケジュールの第1のサイクル中に報告された（例えば、スケジュール1ではサイクル1での初回投与の21日後）。対象は、試験全体を通して安全性についてモニターされた。投与は、試験薬中止の基準を満たす（疾患の進行または試験からの脱落）まで、継続された。対象は、最後の投与を受けた後30日目（± 3日）に、安全性追跡のために再来院した。
C. エンドポイントおよび評価
この試験のプライマリーエンドポイントは、米国国立がん研究所の有害事象共通用語規準（National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events）（NCI CTCAE）バージョン4.03によりグレード分類される有害作用（AE）の発生率および重症度である。PRS-343の安全性および忍容性もまた、試験の間、生命徴候、身体診察、ECOGパフォーマンスステータス、心電図（ECG）、および臨床安全性検査に基づいて継続的に評価した。
この試験のプライマリーエンドポイントは、米国国立がん研究所の有害事象共通用語規準（National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events）（NCI CTCAE）バージョン4.03によりグレード分類される有害作用（AE）の発生率および重症度である。PRS-343の安全性および忍容性もまた、試験の間、生命徴候、身体診察、ECOGパフォーマンスステータス、心電図（ECG）、および臨床安全性検査に基づいて継続的に評価した。
試験参加期間中（試験薬が最初に投与される時点から始まる）および試験薬の最終投与の30日後まで、患者をAEについてモニターした。すべての継続中の重篤な有害事象（SAE）を、解消または安定化するまで追跡した。生命徴候の評価には、体温、収縮期および拡張期の血圧測定値（mm Hg）、脈拍（毎分脈拍[BPM]）、および呼吸数（毎分呼吸回数[BRPM]）が含まれた。3つ1組の12リードECG測定を、予め決めた時点に実施し、予定される収集時間の10分以内に、血液が同時に収集される場合には血液収集よりも前に、収集した。1日目に投与前に実施した3つ1組のECG測定の平均値は、全ての投与後の比較で患者のベースライン補正QT（QTc）値としての役割を果たした。血液学検査、凝血、血清化学検査、尿検査、妊娠スクリーニング、左室駆出率、サイトカイン、およびウォッシュアウト後血液試料を含む臨床検査による評価のために、血液試料および尿試料を収集した。
プライマリーエンドポイントについて、PRS-343の少なくとも1回の投与を受けた全ての対象が、安全性分析に含められた。安全性データを、表形式および/またはグラフ形式で提示し、必要に応じて、用量コホートおよび時間によって記述的に要約する。絶対値データおよびベースラインデータからの変化を、必要に応じて要約する。
この試験のセカンダリーエンドポイントは、血清PKパラメーター；スケジュール1、ならびに該当する場合にはスケジュール2およびスケジュール3でのPKおよび安全性プロファイル；腫瘍縮小効果；奏効期間；病勢コントロール率；抗PRS-343抗体（ADA）の存在および/または濃度；ならびにPDマーカーである。
PK分析およびADA評価用の静脈血試料を、予め決定した時点で収集した。単剤PRS-343のPK特性を評価するためのPKプロファイルを、登録した対象全員から収集した。PRS-343にっついて決定されるPKパラメーターには、これらに限定されないが、PRS-343の曲線下面積（AUC）、AUC24h、AUCinf、Cmax、最高用量濃度到達時間（tmax）、および消失半減期（t1/2）が含まれる。腫瘍マーカーを含む腫瘍評価は、予め決定した時点で実施され、腫瘍縮小効果および進行は、RECIST、バージョン 1.1により評価された。PDマーカーは、投与期間の前、その間、およびその後の予め決められた時点に腫瘍生検または末梢血におけるリンパ球サブタイプまたはマーカーおよび血漿中のサイトカインレベルを定量化することによって評価された。利用可能かつ実行可能であるとして測定されるPDマーカーには、これらに限定されないが、処置前（サイクル1、1日目の投与の前）および処置時の腫瘍生検（サイクル2、2～8日目）において評価されるIHC細胞サブセット（例えば、CD8、CD4、PDL-1、Ki67）、処置前（サイクル1、1日目の投与の前）および処置時の血漿試料において評価される4-1BB、可溶性HER2、およびIFN-γ、処置前（サイクル1、1日目の投与の前）および処置時の血液試料において評価されるCD8 T細胞、CD4 T細胞、ならびに再発後（任意）の腫瘍生検において評価されるIHC細胞サブセット（例えば、CD8、CD4、PDL-1、Ki67）が含まれる。加えて、PK/PD関連性および腫瘍縮小効果との関連性も調査する。
実施例4. 進行性または転移性のHER2+固形腫瘍を有する患者におけるPRS-343の用量漸増試験
この実施例は、コホート1～13についてのこの試験の情報およびコホート1～11についての中間データを提供する。
この実施例は、コホート1～13についてのこの試験の情報およびコホート1～11についての中間データを提供する。
A. 試験の目的および概要
試験の目的は、実施例3に記載したとおりであった。
試験の目的は、実施例3に記載したとおりであった。
患者を、追加のコホート12および13を含む目的別に分けたコホートにおけるさまざまな用量レベル（表2）に割り当て、3週毎に（Q3W）2時間にわたる静脈内（IV）注入（スケジュール1）によって投与されるPRS-343を初めに受けさせた。安全性、PK、およびPDデータが、異なる投与スケジュールを評価すべきであると示唆した場合には、スケジュール2（2週毎、Q2W）またはスケジュール3（毎週、Q1W）を実施する場合がある。評価した各スケジュールについて、個々のMTDを決定する場合がある。評価した各スケジュールについて、個々のMTDを決定する場合がある。
1+3 用量漸増デザインをコホート1～4（それぞれ0.0005 mg/kg～0.015 mg/kg）で利用し、3+3デザインをコホート5～11（それぞれ0.05 mg/kg～8 mg/kg）で使用した。コホート11（8 mg/kg）以降およびコホート13（18 mg/kg）まででは、3種類の投与スケジュール、すなわち、Q1W、Q2W、およびQ3Wを試験した（図4）。
（表２）PRS-343用量レベル
B. 試験手順
スケジュール3において、サイクル1の1日目にPRS-343の初回投与、続いて、サイクル1の8日目および15日目に投与、各サイクル（3週毎）の1日目、8日目、および15日目に後続投与を対象に受けさせた点を除いて、試験手順は実施例3に記載されたとおりであった。スケジュール3での患者評価は、サイクル1の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目；サイクル2の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目、ならびに21日目（± 7日）；次いで、全ての後続のサイクルの1日目、8日目、および15日目に行った。評価はまた、サイクル4、6、8、およびその後は3サイクル毎の21日目（± 7日）にも行われた。
スケジュール3において、サイクル1の1日目にPRS-343の初回投与、続いて、サイクル1の8日目および15日目に投与、各サイクル（3週毎）の1日目、8日目、および15日目に後続投与を対象に受けさせた点を除いて、試験手順は実施例3に記載されたとおりであった。スケジュール3での患者評価は、サイクル1の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目；サイクル2の1日目、2日目、3日目、4日目、8日目、および15日目、ならびに21日目（± 7日）；次いで、全ての後続のサイクルの1日目、8日目、および15日目に行った。評価はまた、サイクル4、6、8、およびその後は3サイクル毎の21日目（± 7日）にも行われた。
具体的には、患者を、RECIST v1.1に従って腫瘍縮小効果/進行について評価した。スケジュール1では、投与の最初の24週（最初の8サイクル）の間、患者を6週毎に評価する。24週目のスキャン後、腫瘍評価を12週毎に行う。スケジュール 2および3では、投与の最初の24週（スケジュール2では最初の6サイクル、およびスケジュール3では最初の8サイクル）の間、患者を8週毎に評価する。24週目のスキャン後、腫瘍評価を12週毎に行う。
C. エンドポイントおよび評価
試験手順は、実施例3に記載されるとおりであった。
試験手順は、実施例3に記載されるとおりであった。
D. データ分析/方法
（i）PK
PRS-343の予備的薬物動態（PK）の結果は、3週毎（Q3W）に投与される0.0005 mg/kg、0.0015 mg/kg、0.005 mg/kg、0.015 mg/kg、0.05 mg/kg、1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kgおよび8 mg/kg、ならびに2週毎（Q2W）の8 mg/kgの用量レベルで利用可能である。PRS-343は、2時間の静脈内注入として投与された。Q3W投与レジメンにおいて、PRS-343の単回投与および複数回投与の薬物動態を、それぞれ、初回投与（サイクル1の1日目）および3回目の投与（サイクル3の1日目）後に特徴決定した。Q2W投与レジメンにおいて、PRS-343の単回投与および複数回投与の薬物動態を、それぞれ、初回投与（サイクル1の1日目）および5回目の投与（サイクル3の1日目）後に特徴決定した。ノンコンパートメント法を用いて、血清濃度データおよび計画した時間を分析した。予備的なPKの結果を本明細書に提示する。
（i）PK
PRS-343の予備的薬物動態（PK）の結果は、3週毎（Q3W）に投与される0.0005 mg/kg、0.0015 mg/kg、0.005 mg/kg、0.015 mg/kg、0.05 mg/kg、1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kgおよび8 mg/kg、ならびに2週毎（Q2W）の8 mg/kgの用量レベルで利用可能である。PRS-343は、2時間の静脈内注入として投与された。Q3W投与レジメンにおいて、PRS-343の単回投与および複数回投与の薬物動態を、それぞれ、初回投与（サイクル1の1日目）および3回目の投与（サイクル3の1日目）後に特徴決定した。Q2W投与レジメンにおいて、PRS-343の単回投与および複数回投与の薬物動態を、それぞれ、初回投与（サイクル1の1日目）および5回目の投与（サイクル3の1日目）後に特徴決定した。ノンコンパートメント法を用いて、血清濃度データおよび計画した時間を分析した。予備的なPKの結果を本明細書に提示する。
（ii）抗薬物抗体の形成
コホート当たりのサンプルサイズが比較的小さく、より多くのデータが進行中の試験から収集されつつあることを考慮すると、抗薬物抗体の結果および結論は予備的なものとして解釈されるべきである。収集された免疫原性試料を、抗PRS-343抗体（ADA）について検証済みのアッセイを用いて分析し、試料がADAについて陽性であることが確認された場合、力価の値を決定した。アッセイの最も低い測定可能な力価の値は50であった。いずれの免疫原性試料でもADAが検出されなかった場合、患者はADA陰性であるとみなされた。ADAが検出された場合、観察された最大力価の値に応じて、患者を、低力価（定量限界未満の値、50および150の値）または高力価（150を上回る任意の値）のいずれかに分類した。150を上回る力価の値がPRS-343薬物動態に対して有意な影響を与えるということに一部基づいて、ADA陽性患者を分類するために、150の力価の値のカットオフを用いた。
コホート当たりのサンプルサイズが比較的小さく、より多くのデータが進行中の試験から収集されつつあることを考慮すると、抗薬物抗体の結果および結論は予備的なものとして解釈されるべきである。収集された免疫原性試料を、抗PRS-343抗体（ADA）について検証済みのアッセイを用いて分析し、試料がADAについて陽性であることが確認された場合、力価の値を決定した。アッセイの最も低い測定可能な力価の値は50であった。いずれの免疫原性試料でもADAが検出されなかった場合、患者はADA陰性であるとみなされた。ADAが検出された場合、観察された最大力価の値に応じて、患者を、低力価（定量限界未満の値、50および150の値）または高力価（150を上回る任意の値）のいずれかに分類した。150を上回る力価の値がPRS-343薬物動態に対して有意な影響を与えるということに一部基づいて、ADA陽性患者を分類するために、150の力価の値のカットオフを用いた。
（iii）有効性
RECISTバージョン 1.1（付属書類1）を用いて試験責任者によって評価される、測定可能なまたは評価可能な疾患を有する患者での腫瘍縮小効果によって、有効性を評価した。奏効期間は、完全奏効（CR）または部分奏功（PR）を達成した患者について算出され、奏功（CRまたはPR）が最初記録された日から、奏功を達成した後に進行または死亡が記録される日までの時間として定義された。病勢コントロール率は、少なくとも12週間持続するCR、PR、またはSD（安定）を達成している患者のパーセンテージとして定義された。
RECISTバージョン 1.1（付属書類1）を用いて試験責任者によって評価される、測定可能なまたは評価可能な疾患を有する患者での腫瘍縮小効果によって、有効性を評価した。奏効期間は、完全奏効（CR）または部分奏功（PR）を達成した患者について算出され、奏功（CRまたはPR）が最初記録された日から、奏功を達成した後に進行または死亡が記録される日までの時間として定義された。病勢コントロール率は、少なくとも12週間持続するCR、PR、またはSD（安定）を達成している患者のパーセンテージとして定義された。
（iv）PD - 処置によって誘導されたCD8 T細胞数の変化の定量
PRS-343が活性な薬物であるかどうかを調査するために、免疫組織化学的検査（IHC）染色により処置前（サイクル1、1日目の投与の前）および処置時の腫瘍生検（サイクル2、2～8日目以内）における腫瘍生検中のCD8+T細胞を定量化することによって、処置によって誘導されたPDマーカーの変化を評価した。
PRS-343が活性な薬物であるかどうかを調査するために、免疫組織化学的検査（IHC）染色により処置前（サイクル1、1日目の投与の前）および処置時の腫瘍生検（サイクル2、2～8日目以内）における腫瘍生検中のCD8+T細胞を定量化することによって、処置によって誘導されたPDマーカーの変化を評価した。
臨床プロトコールによって指定されるようにコア針生検を採取し、ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、抗CD8抗体ならびに他のマーカーによる発色性IHCのために3 μM切片で薄片を作製した。腫瘍細胞および間質領域の病理に基づくデジタルアノテーションを実施した。1 mm2の腫瘍細胞、腫瘍間質、および全腫瘍組織(腫瘍間質＋腫瘍細胞)あたりのCD8+T細胞を計数した。
E. 予備的な結果
合計52名の患者は、単剤として投与されるPRS-343で処置されている（表3および4）。処置時の年齢の中央値は61歳であり、32名（62％）の患者は女性であった。40名（77％）の処置した患者は、1のECOG PS有しており、残りは0のPSを有した。これは、以前に多くの処置を受けた患者集団であり、20名または38％は5+ラインの治療を受けたことがあり、10名(19％)は4ラインの治療を受けたことがあり、かつ11名または21％は3ラインの治療を受けたことがあった。試験された広範囲の腫瘍型のうち、19名(37％)が胃食道がんを有し、13名(25％)が乳がんを有し、6名(12％)が婦人科がんを有していた。
合計52名の患者は、単剤として投与されるPRS-343で処置されている（表3および4）。処置時の年齢の中央値は61歳であり、32名（62％）の患者は女性であった。40名（77％）の処置した患者は、1のECOG PS有しており、残りは0のPSを有した。これは、以前に多くの処置を受けた患者集団であり、20名または38％は5+ラインの治療を受けたことがあり、10名(19％)は4ラインの治療を受けたことがあり、かつ11名または21％は3ラインの治療を受けたことがあった。試験された広範囲の腫瘍型のうち、19名(37％)が胃食道がんを有し、13名(25％)が乳がんを有し、6名(12％)が婦人科がんを有していた。
（表３）PRS-343試験の現在の登録
（表４）登録された対象のベースライン特性
報告されている治療関連有害事象のうち、最も頻度の高いものは、注入に関連する反応（全TRAEのうち10例または9％）、疲労（全TRAEのうち10例または9％）、および全ての報告されたTRAEのうち7例または6％における悪寒であった（表５）。
（表５）治療関連有害事象
（i）予備的なPKの結果
単回投与の幾何平均血清濃度を図5に示し、予備的なPKパラメーターを表6に示す。
単回投与の幾何平均血清濃度を図5に示し、予備的なPKパラメーターを表6に示す。
（表６）単回投与（サイクル1）のPRS-343薬物動態学的パラメーターの予備的な幾何平均（％CV）
BLQ 定量限界未満
1 中央値（範囲）
2 n＝5
1 中央値（範囲）
2 n＝5
血清PRS-343濃度は、0.0005 mg/kg～0.05 mg/kg用量レベルで非常に低いかまたは定量限界未満であった。0.15 mg/kg用量レベルでは、血清PRS-343濃度は、投与後3日間、測定可能であり、0.5 mg/kgおよび1 mg/kg用量レベルでは、血清PRS-343濃度は、数名の患者において投与後最長14日まで測定可能であった。2.5 mg/kg用量レベルで開始すると、血清濃度は、数名の患者において、3週間の投与間隔の全体を通じて測定可能であった。
PRS-343の最大血清濃度は典型的には、注入終了後5分以内に観察された。ごく少数の患者では、最大血清濃度は、注入終了の4または8時間後に観察された；しかしながら、これらの濃度は、注入終了時の濃度が定量限界未満であった1名の患者を除いて、注入終了時の濃度より実質的に高くはなかった。
0.5 mg/kg～8 mg/kgの用量範囲では、PRS-343のCmaxおよびAUC24は、用量に比例して増加した。PRS-343は、2.5 mg/kg～8 mg/kg用量レベルで、用量比例的なAUCINFを示した。PRS-343薬物動態学的パラメーターの変動は、低度から中等度であった。半減期の信頼性の高い推定にとって十分なデータ点が利用可能であった、2.5 mg/kgおよびそれより高い用量レベルでは、少なくとも3日の平均半減期が推定された。8 mg/kg Q3Wの最高用量では、平均PRS-343半減期は、104時間（4.3日）であると推定された。
サイクル3の複数回投与の薬物動態の結果は、限られた人数の患者において入手可能であり、免疫原性の結果（ADA形成）との関連で考察される。
（ii）予備的なADA形成の結果
ADAについて少なくとも1つの投与後試料が分析されている患者におけるADAの発生率を、表7に要約する。
ADAについて少なくとも1つの投与後試料が分析されている患者におけるADAの発生率を、表7に要約する。
（表７）抗PRS-343抗体（抗薬物抗体、ADA）の発生率
少なくとも1つの投与後免疫原性試料を有する、0.0005 mg/kg～8 mg/kgの範囲の用量でのPRS-343で処置された40名の患者のうち、17名の患者はADA陰性であった。残りの23名の患者における少なくとも1つの投与後試料では、ADAが検出され、8名の患者は低力価を有するとみなされ、15名の患者は高力価を有すると見なされた。
全体的な安全性プロファイルに基づき、PRS-343のさらなる評価は、より高い用量レベルで継続する予定である。したがって、2.5 mg/kg、5 mg/kg、および8 mg/kgの3種類の最高用量レベル（臨床的に関連すると現時点で考えられる）についての免疫原性データも概説する。コホート9以降では、18名の患者のうち6名の患者がADA陰性であり、7名の患者が低力価でADA陽性であり、かつ5名の患者が高力価でADA陽性であった。
ADA陽性患者の大部分で、ADAは、早ければ初回投与の14日後、免疫原性評価の初回の時点で検出された。
11名の患者におけるPRS-343曝露の薬物動態に対するADAの作用を、サイクル1および3の両方における予備的な薬物動態学的データと、該当する場合にはADA力価と共に、表8に示す。
（表８）患者におけるPRS-343の曝露と、サイクル1および3の両方の予備的PKデータ
1 サイクル1の1日目のPRS-343用量：481.6 mg；サイクル3の1日目のPRS-343用量：309 mg
サイクル3のPRS-343曝露の減少と最長でサイクル4の1日目まで決定されたADA 力価の値との間の関連性の評価は、サイクル3でのPRS-343曝露の実質的な低下が、1名の患者（対象ID 104-006）を除いて、少なくとも450の力価の値と関連することを示す。
ADAを有さない患者では、サイクル1およびサイクル3の曝露は同程度であり、Q3W投与後に蓄積がないことが示された。1名の患者（Subject ID 108-002）は、サイクル3での曝露が低下しており、サイクル4の1日目までADAが検出されなかった。
（iii）PK/PD関連性
PRS-343の最大活性が10 nM（=2 μg/mL）にてインビトロで観察されたことを実証する前臨床データ、および薬物の10％が腫瘍に達するという仮定に基づき、20 μg/mL以上の血清濃度が、腫瘍におけるPRS-343の十分な活性に必要とされると予測された。
PRS-343の最大活性が10 nM（=2 μg/mL）にてインビトロで観察されたことを実証する前臨床データ、および薬物の10％が腫瘍に達するという仮定に基づき、20 μg/mL以上の血清濃度が、腫瘍におけるPRS-343の十分な活性に必要とされると予測された。
図6は薬物曝露/PDの関連性のグラフを示す。コホート1～8（0.0005 mg/kg～1 mg/kg の範囲の用量レベル）では、薬物曝露は20 μg/mLを下回る。コホート9以降（2.5 mg/kgおよびそれを上回る用量レベル）では、血漿薬物レベルは20 μg/mlを上回る。
コホート9以降（2.5 mg/kgおよびそれを上回る用量レベル）から、CD8+T細胞浸潤の強い増加が一部の患者、特に、安定（SD）（108-002）および部分奏功（PR）（107-012）が長く持続する患者で観察され、治療時にCD8+T細胞の3倍および4.8倍の誘導をそれぞれ示した（図6）。
これらの結果は、PRS-343の4-1BBアーム活性が、腫瘍中のCD8+T細胞レベルの増加をもたらし、患者に利益をもたらすことができることを実証し、PRS-343の強力な免疫刺激作用によって証明されるように、2.5 mg/kgおよびそれを上回る用量レベルが有効用量範囲内であることを示す。
（iv）薬物活性および新しい反応決定因子
CD8+T細胞のより顕著な増加がコホート9以降の2.5 mg/kg以上の用量を受けている患者において測定される（図7）という観察に基づき、PRS-343によって誘導されるCD8+T細胞数の増加を、より高用量のコホート（コホート9～11B）で定量化し、低用量のコホート（コホート1～8）と比較した。
CD8+T細胞のより顕著な増加がコホート9以降の2.5 mg/kg以上の用量を受けている患者において測定される（図7）という観察に基づき、PRS-343によって誘導されるCD8+T細胞数の増加を、より高用量のコホート（コホート9～11B）で定量化し、低用量のコホート（コホート1～8）と比較した。
概して、全腫瘍組織において、低用量コホートと比較して高用量コホートで2倍のCD8+T細胞の誘導が観察された（図7）。加えて、CD8+T細胞の変化は、腫瘍間質および全腫瘍組織（図7Aおよび7C）と比較して、HER2+腫瘍細胞（図7B）においてより顕著であり、これは、HER2+腫瘍細胞と4-1BB発現CD8+T細胞とを近接させる、本明細書において開示されるHER2/4-1BB二重特異性の作用様式と一致する。
薬物活性のさらなる証拠は、CD8+T細胞の増加が、処置から恩恵を受けている患者、例えば、例えば、SD＞120日を有する患者108-002（図7Aおよび9）およびPRを有する患者107-012（図7Aおよび8）において特に強力であることを示すデータに由来する。
反応している患者 107-012および108-002の例示的な結果をそれぞれ、図8および図9に示す。驚くべきことに、患者107-012は、処置前の生検において非常に低いCD8+T細胞数、すなわち、全腫瘍組織1 mm2当たり46個のCD8+T細胞を示し、処置時に4.6倍に増加した。両方の患者でのCD8+T細胞の増加率は、腫瘍間質（患者107-012で4倍および患者108-002で1.9倍）と比較して、腫瘍細胞（患者107-012で5.7倍および患者108-002で5.1倍）でより顕著であり、これは、HER2+腫瘍細胞と4-1BB+/CD8+T細胞との近接関係を駆動する、本明細書おいて開示されるHER2/4-1BB二重特異性分子の作用様式と一致した。
現在の文献証拠は、適応症に応じて、薬物が患者において有効性を示すためには、チェックポイント分子が、処置前に腫瘍組織1 mm2当たり250個以上のCD8+T細胞を必要とすることを示唆する（Blando et al., 2019, Chen et al., 2016, Tumeh et al., 2014）。驚くべきことに、コホート11B中の反応している患者107-012および103-012はそれぞれ、処置前の生検において非常に低い数のCD8+T細胞、すなわち、腫瘍組織1 mm2当たり46個および110個のCD8+T細胞を示した。これは、本明細書において開示される4-1BBに基づく二重特異性薬物が、標準的なチェックポイント薬物が生じさせることのできない患者利益を生じさせることを示唆する。
反応している患者108-002のCD8+Ki67+T細胞増大についての例示的な結果もまた、本明細書において提示する（図10）。注目すべきことに、CD8+Ki67+T細胞増大は、腫瘍細胞（図10C）においてのみ観察されたが、腫瘍間質（図10B）では観察されず、本明細書において記載される4-1BBに基づく二重特異性薬物は、腫瘍細胞の近傍でのみCD8+T細胞を活性化することをさらに示唆する。
（v）腫瘍縮小効果
試験集団における前臨床データおよびPK/PD相関関係から、20 μg/mLが、腫瘍微小環境において有効用量をもたらす薬物の血清濃度であることを推定した。コホート9では、この血清濃度に到達した。18名の評価可能な患者がコホート9～11Bに存在し、そのうち2名の患者が部分奏功を記録し、8名の患者が安定を示した（表９）。
試験集団における前臨床データおよびPK/PD相関関係から、20 μg/mLが、腫瘍微小環境において有効用量をもたらす薬物の血清濃度であることを推定した。コホート9では、この血清濃度に到達した。18名の評価可能な患者がコホート9～11Bに存在し、そのうち2名の患者が部分奏功を記録し、8名の患者が安定を示した（表９）。
（表９）PRS-343の有効用量範囲での効果の要約
図11は、PRS-343による患者の処置期間を図示する。コホート9（2.5 mg/kg、Q3W）では、患者は、平均69日間（54日の標準偏差またはSD）にわたって試験（サイクル1の1日目から治療終了時来院まで期間と定義される）を続け、コホート10（5 mg/kg、Q3W）の患者は、平均50日間（39日のSD）にわたって試験を続け、コホート11（8 mg/kg、Q3W）では、患者は、平均49日間（39日のSD）にわたって試験を続け、かつコホート11B（8 mg/kg、Q2W）では、患者は、平均119日間（9日のSD）にわたって試験を続けた。用量の増加による試験期間の長さの延長は、薬物の血清濃度の増加ならびに疾患反応の確率および期間の増大に対応している可能性がある。
実施例5. 進行性または転移性のHER2+固形腫瘍を有する患者におけるPRS-343の用量漸増試験
この実施例は、コホート1～13ならびにオビヌツズマブ（obi）前治療コホートについてのデータを提供する。実施例4はコホート1～13についてのデータを提供し、実施例3はコホート1～11についてのデータを提供する。
この実施例は、コホート1～13ならびにオビヌツズマブ（obi）前治療コホートについてのデータを提供する。実施例4はコホート1～13についてのデータを提供し、実施例3はコホート1～11についてのデータを提供する。
A. 試験の目的および概要
試験の目的は、実施例3に記載されるとおりである。
試験の目的は、実施例3に記載されるとおりである。
実施例4に記載されるように、患者を、目的別に分けたコホート1～13におけるさまざまな用量レベルに割り当て、PRS-343を受けさせる。
オビヌツズマブ前処置がADAの形成を低減させる可能性を、スケジュール2（Q2W）に従って8 mg/kgの用量にてPRS-343を受ける最大10名の患者（コホート11に相当）において試験する。B細胞枯渇を伴うさらなる投与およびスケジュールを試してもよい。オビヌツズマブが、ADA形成を低減させることが示され、かつ新たな安全性の懸念が生じない場合、この戦略が、PRS-343を受けるさらなる患者におけるB細胞枯渇およびADA発生率の低減のために用いられてもよい。
対象選択基準は、実施例3に記載されるとおりであり、除外基準も以下を加えて同様である：7. 潜伏B型肝炎感染または活動性B型肝炎感染を有する患者は、オビヌツズマブを受ける前処置コホートから除外される；9. 試験処置の初回投与前7日以内に、全身性ステロイド療法（＞10 mgのプレドニゾンまたは等価物を毎日）または任意の他の形態の免疫抑制療法（注記：局所的ステロイド、吸入ステロイド、鼻用ステロイド、および眼科用ステロイドは禁止されない）。この基準は、前処置としてオビヌツズマブを受けている患者には適用されない。
B. 試験手順
試験手順は、実施例3および4に記載されるとおりである。
試験手順は、実施例3および4に記載されるとおりである。
オビヌツズマブ前処置コホート（PRS-343をQ2W、8 mg/kgで受ける）に登録された対象では、オビヌツズマブは、GAZYVA(登録商標)（オビヌツズマブ）の添付文書または施設ガイドラインにしたがって投与される。
C. エンドポイントおよび評価
試験手順は、実施例3に記載されるとおりである。臨床検査評価では、HBVによる活動性感染および潜伏感染がオビヌツズマブ投与前に除外されるように、B型肝炎ウイルス（HBV）感染もまた、評価される。
試験手順は、実施例3に記載されるとおりである。臨床検査評価では、HBVによる活動性感染および潜伏感染がオビヌツズマブ投与前に除外されるように、B型肝炎ウイルス（HBV）感染もまた、評価される。
実施例6. 進行性または転移性のHER2+固形腫瘍を有する患者におけるPRS-343の用量漸増試験
この実施例は、コホート1～13ならびにオビヌツズマブ前処置コホートについてのこの試験の情報を提供し、かつこれらのコホートについての（さらなる）中間データを提供する。
この実施例は、コホート1～13ならびにオビヌツズマブ前処置コホートについてのこの試験の情報を提供し、かつこれらのコホートについての（さらなる）中間データを提供する。
A. 試験の目的および概要
試験の目的は、実施例3、4および5に記載されるとおりである。
試験の目的は、実施例3、4および5に記載されるとおりである。
表10に示すように、患者を、目的別に分けたコホートにおけるさまざまな用量レベルに割り当て、それぞれ、3週毎（Q3W；1日目に投与；21日サイクル）、2週毎（Q2W；1日目および15日目に投与；28日サイクル）、および毎週（Q1W； 1日目、8日目および15日目に投与； 21日サイクル）に、2時間にわたる静脈内（IV）注入によって投与されるPRS-343を、患者に受けさせた。
（表１０）PRS-343試験の患者コホート
対象選択基準および除外基準は、実施例3に記載されるとおりであった。主な選択基準は以下であった：標準療法下で進行しているかまたは標準療法が利用できない進行性/転移性のHER2+固形悪性腫瘍の診断；ASCO、CAP、または施設のガイドラインによって実証されているHER2+固形腫瘍；乳がん、胃がんおよびGEJがんを有する患者は、進行性/転移性の疾患に対する少なくとも1つの以前のHER2標的化療法を受けていなければならない；RECIST v1.1に従って測定可能な疾患；ECOG 0または1；適切な肝臓、腎臓、心臓、および骨髄の機能。主な除外基準は以下であった：トラスツズマブおよび/またはペルツズマブにより駆出率が正常下限未満；登録前7日以内の全身性ステロイド療法または任意の他の形態の免疫抑制療法；症候性の、不安定型の、または進行性のCNS原発性悪性腫瘍が知られていること；登録前21日以内の放射線療法（内臓以外の構造、例えば四肢骨転移への照射部位が限定された放射線は許容される）。
B. 試験手順
試験手順は、実施例4に記載されているとおりであった（オビヌツズマブによる前処置に関する実施例5も参照）。
試験手順は、実施例4に記載されているとおりであった（オビヌツズマブによる前処置に関する実施例5も参照）。
C. エンドポイントおよび評価
試験手順は、実施例3および5に記載されているとおりであった。加えて、循環s4-1BBのレベルを評価した。s4-1BBは、抗4-1BBアゴニストモノクローナル抗体で処置された患者の血清中で増加することが以前に示されている（Segal et al., 2018）。
試験手順は、実施例3および5に記載されているとおりであった。加えて、循環s4-1BBのレベルを評価した。s4-1BBは、抗4-1BBアゴニストモノクローナル抗体で処置された患者の血清中で増加することが以前に示されている（Segal et al., 2018）。
D. データ分析/方法
データ分析および方法は、実施例4に記載されるとおりであった。
データ分析および方法は、実施例4に記載されるとおりであった。
独自の酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）の手段によって、血清s4-1BBレベルを評価した。血清s4-1BBレベル評価するための代替アッセイは、Segal et al., 2018に記載される。
PD-L1陽性細胞のパーセンテージ（ICスコア）を免疫組織化学的検査（IHC）染色によって決定した。
E. 予備的結果
合計74名の患者は、単剤として投与されたPRS-343で処置されている（表10および11）。治療時年齢の中央値は63歳であり、患者のうち44名（59％）は女性であった。処置した患者のうち55名（74％）は1のECOG PSを有し、残りは0のPSを有した。これは、以前に多くの処置を受けた患者の集団であり、28名または38％は5+ラインの治療を受けたことがあり、11名（15％）は4ラインの治療を受けたことがあり、15名または21％は3ラインの治療を受けたことがある。試験された広範囲の腫瘍型のうち、27名（36％）が胃食道がんを有し、16名（22％）が乳がんを有し、10名（14％）が結腸直腸がんを有した。
合計74名の患者は、単剤として投与されたPRS-343で処置されている（表10および11）。治療時年齢の中央値は63歳であり、患者のうち44名（59％）は女性であった。処置した患者のうち55名（74％）は1のECOG PSを有し、残りは0のPSを有した。これは、以前に多くの処置を受けた患者の集団であり、28名または38％は5+ラインの治療を受けたことがあり、11名（15％）は4ラインの治療を受けたことがあり、15名または21％は3ラインの治療を受けたことがある。試験された広範囲の腫瘍型のうち、27名（36％）が胃食道がんを有し、16名（22％）が乳がんを有し、10名（14％）が結腸直腸がんを有した。
（表１１）登録された対象のベースライン特性および原発性がんの種類
報告されている治療関連有害事象のうち、最も頻度の高いものは、注入に関連する反応（全TRAEのうち27例または19％）、疲労（全TRAEのうち11例または8％）、および全ての報告されたTRAEのうち11例または8％における悪心であった（表12）。1つのTRAEがグレード3を上回っていた：コホート10（5 mg/kg PRS-343、Q3W）においてグレード4の注入関連反応。
（表１２）治療関連有害作用（TRAE）
PRS-343の単回投与の幾何平均血清濃度を図14に示す。PRS-343の平均消失半減期はおよそ5日であった。患者の36％はADA陽性であり、有効用量範囲（≧ 2.5 mg/kg）をカバーするコホートにおいて1：150を上回る力価であった（データを示さず）。
試験集団における臨床データに基づいて、20 μg/mLが、腫瘍微小環境において有効用量をもたらす薬物の血清濃度であることを推定した。コホート9では、この血清濃度に到達した。33名の評価可能な患者がコホート9～13Bに存在し、そのうち1名の患者が完全奏効を記録し、3名の患者が部分奏功を記録し、13名の患者が安定を示した（表13）。
（表１３）PRS-343の有効用量範囲での効果の要約
投与前生検および投与後生検（サイクル2；2～8日目）を実施した。図15Aに示すように、有効用量のPRS-343で処置された患者（コホート9～13B）は、腫瘍組織中のCD8+T細胞の増加を示した。さらに、これらの患者は、血清中の循環s4-1BBのレベルの増加も示し（図15B）、PRS-343の4-1BBアーム活性を実証した。コホート11B、11C、12B、13B、およびObi+11Bにおける患者の経時的な処置の経過を、完全奏効、部分奏功、安定、および進行などの臨床状態（該当する場合）を含めて、図16に示す。図17は、コホート9、10、11、11B、11C、12B、13B、およびObi+11Bでの標的病変の最良効果を示す。図18に示すように、長期の臨床的有用性（SD≧C6、PRおよびCR）を有する患者は、全腫瘍組織においてCD8+T細胞の増加を示した。
表13および14ならびに図16～19に示すように、コホート13B（18 mg/kg、Q2W）の1名の患者は、PRS-343による治療時に完全奏効を示した（特に、図19に図示するCTスキャンを参照）。患者は、ステージ4の直腸腺がんを有する59歳の男性であり、前記がんは心臓および肺に転移していた（以前の治療ライン：5+；FoundationOne HER2増幅、院内検査IHC3+；MSS、低TMB（2 mt/Mb））。
（表１４）CRが確定された直腸がん患者
図20に示すように、処置後、患者は、腫瘍中のCD8+T細胞数の増加（図20A）および血清中の循環s4-1BBレベルの増加を示し、PRS-343の4-1BBアーム活性を実証した（図20B）。
表15は、部分奏功が確定されたコホート11B（8 mg/kg、Q2W）の胃がん患者（107-012）についての処置アウトカムを示す（図21のCTスキャンも参照）。患者は、ステージ4の胃腺がんを有する80歳の女性であり、前記がんは、肝臓、リンパ節、および副腎に転移していた（以前の治療ライン: 2；HER2 IHC3+；PD-L1陽性（CPS=3）；NGS：ERBB2増幅、TP53変異、CDK12およびSF3B1の改変）。
（表１５）PRが確定された胃がん患者
図22に示すように、処置後、患者は、腫瘍中のCD8+T細胞数およびCD8+Ki67+T細胞数の増加（図22A）ならびに血清中の循環s4-1BBレベルの増加を示し、PRS-343の4-1BBアーム活性を実証した（図22B）。
図23は、複数の処置サイクルの過程にわたる、コホート11B（8 mg/kg、Q2W）のPR患者103-012の血清中の循環s4-1BBの増加の繰り返しを示す。患者は卵管がんを有する。
図24は、PRS-343が、治療前のCD8+T細胞数が少ない（＜250/mm2腫瘍領域；図24Aおよび24B）患者ならびにPD-L1低/陰性患者（全免疫細胞の＜25％のPD-L1+細胞（ICスコア）；図24B）において長期の臨床的有用性（部分奏功および完全奏効を含む）をもたらすことを示す。
図25は、全ての試験した用量コホートにわたるPRS-343での処置時のs4-1BBの血清レベル（サイクル1の過程にわたって測定される）の用量依存性を示し、s4-1BBレベルを用いて、PRS-343などの4-1BBアゴニスト作用物質の用量依存的活性を評価できることを示す。
新鮮な生検に対するHER2の検査に基づいて、5名の患者は、保管されている組織評価とは異なり、HER2が低かったことが特定された。図26に示すように、5名の患者は全員、s4-1BB血清レベルの増加を示したが、PRS-343での処置から臨床上の利益を得る2名の患者、乳がん患者103-016（サイクル 2および4で安定）および結腸直腸がん患者103-019（サイクル 2、4および6で安定）は、進行を有する3名の患者より有意に高い最大誘導倍率（＞40倍）を示した。このことは、s4-1BB誘導の程度と臨床反応との間の相関性を示す。図27Aおよび27Bは、それぞれ、患者103-016および103-109のs4-1BB血清プロファイルを示す。
本明細書において例示的に記載される態様は、本明細書において具体的に開示しない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制限の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」などの用語は、拡張的に、かつ非限定的に読み取られるべきである。さらに、本明細書において使用される用語および表現は、限定するのではなく説明する用語として使用されており、そのような用語および表現を使用する際、示されかつ記載される特徴またはその一部分の任意の等価物を除外する意図はないが、請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本態様は好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示されるが、その修正および変更を当業者は行ってもよいこと、ならびにそのような修正および変更が本発明の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。本明細書において記載されるすべての特許、特許出願、教科書、および査読済み刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、参照により本明細書に組み入れられる参照文献におけるある用語の定義または使用が、本明細書において提供されるその用語の定義と一致しないか、または異なる場合、本明細書において提供されるその用語の定義が適用され、その参照文献におけるその用語の定義は適用されない。属の（generic）開示の範囲内に属するより狭い種（species）および亜属(subgeneric)の分類群のそれぞれも、本発明の一部分を形成する。これには、削除される材料が本明細書において具体的に挙げられるか否かに関わらず、属（genus）から任意の対象を除く条件または消極的限定を伴う本発明の属の記載が含まれる。加えて、特徴がマーカッシュ群の観点から記載される場合、本開示はまた、それによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位集団の観点からも記載されることを、当業者は認識する。さらなる態様は、添付の特許請求の範囲から明らかになる。
等価物:当業者は、日常的な実験法を用いるだけで、本明細書において記載される本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されると意図される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書において、個々の各刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み入れられることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に参照により本明細書中に組み入れられる。
VII. 非特許参照文献
Claims (45)
- 4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際にがん患者についての肯定的な臨床的アウトカムを予測する方法であって、
（a）前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた生物学的試料における可溶性4-1BB（s4-1BB）のレベルを測定する段階；および
（b）前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階
を含み、
前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して増加している場合に、肯定的な臨床的アウトカムが予測される、
前記方法。 - 前記肯定的な臨床的アウトカムが、安定（SD）、部分奏功（PR）、完全奏効（CR）、増加した全生存期間（OS）、および/または増加した無増悪生存期間（PFS）を含む、請求項1記載の方法。
- 4-1BBアゴニスト作用物質で処置したがん患者において前記4-1BBアゴニスト作用物質の活性を評価する方法であって、
（a）前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階；および
（b）前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階
を含み、
前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して増加している、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記がん患者における前記4-1BBアゴニスト作用物質の活性を示す、
前記方法。 - 前記活性が用量依存的活性である、請求項3記載の方法。
- がん患者に有効量の4-1BBアゴニスト作用物質を投与する段階を含む、前記がん患者を処置する方法であって、
（a）前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階；
（b）前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する段階；
（c）前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階；および
（d）前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して増加している場合に、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与することを継続する段階
を含む、前記方法。 - 前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して増加していない場合に、前記がん患者への前記4-1BBアゴニスト作用物質の投与が中止される、請求項5記載の方法。
- 疾患、例えばがんを処置するために4-1BBアゴニスト作用物質の用量を選択する方法であって、
（a）異なる用量の前記4-1BBアゴニスト作用物質の投与の際に、前記疾患を有する複数の対象から得られた生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階、および
（b）段階（a）で得られた結果に基づき用量反応曲線を作成する段階
を含み、
s4-1BBのレベルが用量Xにおいて減少している場合、用量Xより低い用量が、前記疾患を処置するための用量として選択される、
前記方法。 - 用量Xにおけるs4-1BBのレベルの減少が、4-1BB経路の過剰活性化または4-1BB経路の過剰活性化の可能性を示す、請求項7記載の方法。
- 前記用量が、より高い初回量の投与後に投与される維持用量である、請求項7または8記載の方法。
- 前記生物学的試料が血清または血漿である、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、またはさらにそれより高い倍率で増加する、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、前記生物学的試料1 mlあたり約500 pgもしくはそれ以上、約1000 pgもしくはそれ以上、約2000 pgもしくはそれ以上、約3000 pgもしくはそれ以上、約4000 pgもしくはそれ以上、約5000 pgもしくはそれ以上、約6000 pgもしくはそれ以上、約7000 pgもしくはそれ以上、約8000 pgもしくはそれ以上、約9000 pgもしくはそれ以上、約10000 pgもしくはそれ以上、約15000 pgもしくはそれ以上、または約20000 pgもしくはそれ以上増加する、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記生物学的試料1 mlあたり約500 pgもしくはそれ以上、約1000 pgもしくはそれ以上、約2000 pgもしくはそれ以上、約3000 pgもしくはそれ以上、約4000 pgもしくはそれ以上、約5000 pgもしくはそれ以上、約6000 pgもしくはそれ以上、約7000 pgもしくはそれ以上、約8000 pgもしくはそれ以上、約9000 pgもしくはそれ以上、約10000 pgもしくはそれ以上、約15000 pgもしくはそれ以上、または約20000 pgもしくはそれ以上の濃度まで増加する、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルを測定する段階が、複数（例えば、2、3、4、またはそれより多い）サイクルの前記4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中および/またはその後にs4-1BBのレベルを測定することを含む、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、少なくとも1サイクル、少なくとも2サイクル、少なくとも3サイクル、または少なくとも4サイクルの前記4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中またはその後に増加する、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、複数（例えば、2、3、4、またはそれより多い）サイクルの前記4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中またはその後に繰り返し増加する、請求項14または15記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、複数（例えば、2、3、4、またはそれより多い）サイクルの前記4-1BBアゴニスト作用物質での処置の各々の最中またはその後に増加する、請求項14～16のいずれか一項記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質での処置のサイクルが、（i）約21日、前記4-1BBアゴニスト作用物質が3週毎に約1回の間隔で投与される（Q3W）；（ii）約28日、前記4-1BBアゴニスト作用物質が2週毎に約1回の間隔で投与される（Q2W）；または（iii）約21日、前記4-1BBアゴニスト作用物質が毎週約1回の間隔で投与される（Q1W）を含む、請求項14～17のいずれか一項記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、1または複数（例えば、2、3、4、もしくはそれより多い）サイクルの前記4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中および/またはその後に測定されたs4-1BBの最大レベルである、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
- 1または複数（例えば、2、3、4、もしくはそれより多い）サイクルの前記4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中および/またはその後に測定されたs4-1BBの最大レベルが、前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与する前に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルと比較して、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、またはさらにそれより高い倍率で増加する、請求項19記載の方法。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質を前記がん患者に投与した後に前記がん患者から得られた前記生物学的試料におけるs4-1BBのレベルが、1または複数（例えば、2、3、4、もしくはそれより多い）サイクルの前記4-1BBアゴニスト作用物質での処置の最中および/またはその後に測定されたs4-1BBの平均レベルである、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
- 4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際のがん患者の臨床的アウトカムについての予測バイオマーカーとしての、s4-1BBの使用。
- 4-1BBアゴニスト作用物質で処置したがん患者における前記4-1BBアゴニスト作用物質の活性、好ましくは用量依存的活性についてのバイオマーカーとしての、s4-1BBの使用。
- 疾患、例えばがんを処置するために4-1BBアゴニスト作用物質の用量を選択するためのバイオマーカーとしての、s4-1BBの使用。
- 4-1BBアゴニスト作用物質での処置の際にがん患者についての肯定的な臨床的アウトカムを予測するために生物学的試料においてs4-1BBを検出するための手段を含むキットの使用。
- 4-1BBアゴニスト作用物質で処置されたがん患者において前記4-1BBアゴニスト作用物質の活性、好ましくは用量依存的活性を評価するために生物学的試料においてs4-1BBを検出するための手段を含むキットの使用。
- 疾患、例えばがんを治療するために4-1BBアゴニスト作用物質の用量を選択するために生物学的試料においてs4-1BBを検出するための手段を含むキットの使用。
- 前記生物学的試料が血清または血漿である、請求項25～27のいずれか一項記載の使用。
- 生物学的試料においてs4-1BBを検出するための前記手段が、4-1BBおよび/またはs4-1BBに特異的な抗体を含む、請求項25～28のいずれか一項記載の使用。
- 前記キットがイムノアッセイキットである、請求項25～29のいずれか一項記載の使用。
- 前記キットが、希釈剤を含有する容器、緩衝剤を含有する容器、酵素コンジュゲートを含有する容器、基質溶液を含有する容器、二次抗体を含有する容器、ビーズを含有する容器、マルチウェルプレート、データキャリアのうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項25～30のいずれか一項記載の使用。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質が、4-1BBに特異的なリポカリンムテインを含む、請求項1～31のいずれか一項記載の方法または使用。
- 前記リポカリンムテインが、SEQ ID NO: 22に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 22に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項32記載の方法または使用。
- 前記4-1BBアゴニスト作用物質が、前記4-1BBアゴニスト作用物質と腫瘍ターゲティング部分とを含む融合分子の一部である、請求項1～33のいずれか一項記載の方法または使用。
- 前記腫瘍ターゲティング部分が、腫瘍細胞の表面上に発現している腫瘍抗原に特異的である、請求項34記載の方法または使用。
- 前記腫瘍抗原がHER2である、請求項35記載の方法または使用。
- 前記がんがHER2の低い発現を特徴とする、請求項1～36のいずれか一項記載の方法または使用。
- 前記がんがIHC1+またはIHC2+/(F）ISH-のHER2状態を特徴とする、請求項37記載の方法または使用。
- 前記腫瘍ターゲティング部分が抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項34～38のいずれか一項記載の方法または使用。
- 前記融合分子が、腫瘍細胞の表面上に発現している腫瘍抗原に特異的な抗体を含み、前記腫瘍抗原に特異的な抗体が、両方の重鎖のC末端で、4-1BBに特異的なポカリンムテインのN末端に融合されている、請求項34～39のいずれか一項記載の方法または使用。
- 前記抗体が、
HER2に特異的であり、かつ
（i）SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、およびSEQ ID NO: 42に示される3つの重鎖相補性決定領域（CDR）、ならびにSEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、およびSEQ ID NO: 45に示される3つの軽鎖 CDRと；（ii）SEQ ID NO: 49に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する重鎖、およびSEQ ID NO: 50に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する軽鎖とを含む、
請求項39または40記載の方法または使用。 - 前記融合分子が、HER2に特異的な抗体を含む融合タンパク質であり、前記HER2に特異的な抗体が、両方の重鎖のC末端で、4-1BBに特異的なリポカリンムテインのN末端に融合されている、請求項34～41のいずれか一項記載の方法または使用。
- 前記融合タンパク質が、SEQ ID NO: 50および51に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項42記載の方法または使用。
- 前記融合タンパク質が、SEQ ID NO: 50および51に示されるアミノ酸配列を含む、請求項42または43記載の方法または使用。
- 前記融合タンパク質が、SEQ ID NO: 50に示されるアミノ酸配列を有する2つの鎖、およびSEQ ID NO: 51に示されるアミノ酸配列を有する2つの鎖を含む、請求項42～44のいずれか一項記載の方法または使用。
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