JP2023171783A - テルペノイド産物を微生物生産するための代謝工学 - Google Patents

Abstract

【課題】テルペン及びテルペノイドを工業的規模で生産する方法及び細菌株を提供する。【解決手段】テルペンまたはテルペノイド産物の生産方法であって、上流のメチルエリスリトール経路（ＭＥＰ）を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供することと；前記テルペンまたはテルペノイド産物を生産する前記細菌株を培養することとを含み、解糖系に入る炭素の１％超がＭＥＰ炭素になる、前記方法である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月３日出願の米国仮特許出願第６２／４５４，１２１号の利益及び同仮特許出願に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式でＥＦＳ－Ｗｅｂを経由して提出された配列表を含み、配列表はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年２月２日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＭＡＮ－００８ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、そのサイズは２０，４８０バイトである。

食品産業及び飲料産業はもとより、香料産業、化粧品産業、及びヘルスケア産業などの他の産業も、テルペン及び／またはテルペノイド産物を日常的に使用しており、それには着香剤及び芳香剤としての使用を含む。しかしながら、（ｉ）植物原料の可用性及び高価格；（ｉｉ）植物中のテルペン含有量の相対的低さ；ならびに（ｉｉｉ）十分量のテルペン産物を工業的規模で生産するには抽出方法が面倒で非効率などの要因はすべて、植物に依存しない系を用いたテルペンの生合成に関する研究を活性化させた。その結果、グルコースなどの再生可能資源をテルペノイド産物に変換するように微生物を操作する技術の開発に労力が費やされてきた。従来の方法と比較して、微生物は土地を必要とせずに急速に成長し、開発を持続できるという利点がある。

重要なイソプレノイド前駆体であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）には、メバロン酸（ＭＶＡ）経路とメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路という２つの主要な生合成経路がある。ＭＶＡ経路は、ほとんどの真核生物、古細菌、及びいくつかの真正細菌に見られる。ＭＥＰ経路は、真正細菌、植物の葉緑体、シアノバクテリア、藻類、及びアピコンプレックス門寄生生物に見られる。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他のグラム陰性菌は、ＭＥＰを利用してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ代謝前駆体を合成する。ＭＥＰ経路はＭＶＡ経路よりも理論上の化学量論的収率が高いが、Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌におけるＭＥＰ経路は、この経路を通る炭素フラックスを制御及び／または制限する様々な固有の調節機構を有する。Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ
Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３；８２：４９７－５３０；Ａｊｉｋｕｍａｒ ＰＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｐａｔｈｗａｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔａｘｏｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ
２０１０；３３０－７０－７４を参照のこと。

細菌系においてテルペン及びテルペノイドを工業的規模で生産するには、ＭＥＰ経路を通る炭素フラックスを向上させるための微生物株及び方法が必要とされている。

様々な態様において、本発明は、テルペン及びテルペノイド産物を生産するための方法及び細菌株（Ｅ．ｃｏｌｉなど）に関する。ある特定の態様では、本発明は、ＭＥＰ経路を通る炭素フラックスを向上させる細菌株を提供し、それによってグルコースなどの炭素源を用いた発酵によってテルペン及び／またはテルペノイドの生産収率を増加させる。例
えば、いくつかの実施形態では、本方法は、ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供することを含む。この細菌株は、グルコースなどの炭素源を用いて培養すると、ＭＥＰ経路を介して解糖系に入る炭素の１％超を代謝する。また様々な実施形態において、ＭＥＰ経路を介して解糖系に入る炭素の１５％超（１５％超の「ＭＥＰ炭素」）を代謝する。

様々な実施形態において、本発明は、株の増殖または生存率に実質的なまたは測定可能な影響を及ぼさずに、細菌生産株での１つ以上の競合する酵素または経路（ユビキノン合成経路など）の発現または活性を下方「調整」することを含む。いくつかの実施形態では、ＩｓｐＢ酵素の発現または活性が、場合により、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、プロモーター、もしくはアミノ酸配列に対する変更、またはＩｓｐＢオルソログとの置き換えによって低下される。

代わりに、または加えて、本発明は、場合により、ｉｓｃオペロンの発現を変更すること、及び／またはｒｙｈＢの小分子ＲＮＡの欠失によって、Ｆｅ－Ｓ酵素であるＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨの高活性を維持するように、Ｆｅ－Ｓクラスタータンパク質の可用性または活性を増加させることを含む。

代わりに、または加えて、いくつかの実施形態では、本発明は、有益な変異体もしくはオルソログ（複数可）の過剰発現及び／または選択による、ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨの活性の調整を含む。そのような変異体またはオルソログは、炭素をさらに下流のＭＥＰ経路へ流入させることによってＭＥＰ炭素を増加させることができる。代わりに、または加えて、ＭＥＰ酵素の補完をメタボロミクスによって評価することで、ＭＥＰ酵素の補完が、ＭＥｃＰＰ中間体に至るさらに下流の経路への炭素の流入により高濃度のＭＥＰ炭素をもたらすことを確認することができる。

ある特定の実施形態では、細菌細胞は、特に、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、及びジテルペノイドなどの１つ以上のテルペノイド化合物を産生する。そのようなテルペノイド化合物は、香料に（例えばパチョロール）、香味産業で（例えばヌートカトン）、甘味剤として（例えばステビオールグリコシド）、または治療薬に（例えばタキソール）使用される。この宿主細胞は一般に、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体からテルペンまたはテルペノイドを生産する組換え下流経路を備えることになる。

回収されたテルペンまたはテルペノイドを製品（例えば、消費者製品または工業製品）に組み込むことができる。例えば、製品は、着香製品、芳香製品、甘味剤、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または害虫駆除製品であり得る。本発明の実施形態では、生産収率が高いため、大幅なコスト上の利点に加え、テルペンまたはテルペノイド成分の持続可能性及び品質管理をもたらすことができる。

他の態様では、本発明は、本明細書で詳細に記載する、ＭＥＰ炭素を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有するＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞を提供する。

本発明の他の態様及び実施形態は、本発明に関する以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。

ＭＥＰ経路によるテルペノイド生産の概略図である。炭素源としてグルコースを取り入れる細菌細胞を表している。グルコースは、ＴＣＡサイクルを経てバイオマスに変換されるか、またはＭＥＰ経路を通り目的とするテルペノイド産物になる。グルコースは細胞内に入り、中間体であるグリセルアルデヒド－３－リン酸（ＧＡＰ）によりピルビン酸（ＰＹＲ）に変換される。ＰＹＲとＧＡＰが化合してＤＯＸＰを生成し、これがＭＥＰに変換され、（ＭＥｃＰＰを通過して）ＦＰＰへの経路に渡される。ＤＯＸ及びＭＥは、それぞれＤＯＸＰ及びＭＥＰの脱リン酸化産物である。ＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰは細胞外に見られる。ＭＥＰ経路に送り込まれるフラックスが多いほど、これらの産物が細胞外に多く見られる。これらの副産物は、ＭＥＰ経路におけるボトルネックのマーカーとして、操作の標的を特定するために使用することができる。黒色の矢印はテルペノイドに対する酵素介在性の生化学反応を示し、薄灰色の矢印は競合する副産物を示し、暗灰色の矢印は細胞外への産物の輸送を示し、白色の矢印は簡潔にするために簡略化された経路を示す。 例示的なテルペノイド産物（産物Ａ）でのＭＥＰ経路を介したテルペノイド生産量を向上させるためのＥ．ｃｏｌｉ株シャーシに対する遺伝子改変を示す。 株Ｇ２から株Ｇ４への移行時（図２参照）の産物Ａ株に対する変更を示す。これらの変更により、炭素がＭＥＰ生化学経路の「下流」に移動することを可能にし、中間産物プールがＤＯＸＰ（及び細胞外ＤＯＸ）からＭＥＰ（及び細胞外ＭＥ）へと移動する。ＭＥＰ経路の大きな中間体プールの細胞外蓄積を利用して、炭素フラックスを経路の下流へと移動させ、ＭＥｃＰＰに至らせることを意図する遺伝子工学設計を知ることができる。図３に示す実験では、株Ｇ２から株Ｇ４への移行で炭素の４０％にＤＯＸからＭＥへの移動が観察される。 産物ＢでのＭＥＰ経路を介したテルペノイド生産量を向上するためのＥ．ｃｏｌｉ株シャーシに対する遺伝子改変を示す。ｐｇｉ変異体の改変は高生産性クローンにおいて同定した。 ｒｙｈＢ及びｉｓｃオペロンの関与についての証拠を提供する、トランスクリプトームプロファイリング実験からの結果を示す。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、産物Ａまたは産物Ｂを生産する下流テルペノイド経路の導入に伴い、ｒｙｈＢの発現が上方制御され、ｉｓｃオペロンが一般に下方制御される。 ｒｙｈＢ及びｉｓｃオペロン改変の組み合わせ効果を示す。ＭＥＰテルペノイド代謝における鉄及び鉄－硫黄（Ｆｅ－Ｓ）クラスター生化学反応の重要性を考慮して、生産シャーシに産物（産物Ａ）の力価を増加させる一連の改変を実施した。順次、Ｇ２産物ＡシャーシのｒｙｈＢを欠失させ、次いでｉｓｃＳの野生型プロモーターを構成的プロモーター配列で置換し、天然のｉｓｃＲ遺伝子を欠失させた。改変のたびに産物Ａの力価は増加する。 ＩｓｐＧ酵素操作を図示する。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＩｓｐＧ遺伝子の変異ライブラリーを、予測される変化に基づいて構造モデルを設計した（図７Ａ）。ライブラリーは、反応速度、タンパク質の安定性、または株の頑強性を改善するように設計された。特定の変異体を個々の各ライブラリーの配列内の異なった位置に導入した（図７Ｂ）。約１０００個の多様なｉｓｐＧオルソログに対する配列アラインメントを用いて、合計９つのコンビナトリアルライブラリーを設計した。 産物Ａを生産する３つの株における、野生型遺伝子を置き換える野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ｉｓｐＧ遺伝子の変異ライブラリーのスクリーニングを示す。統合ライブラリーの予備スクリーニングにより、導入変異体の２０～４０％に生産力価の向上が認められ、最大１．５倍のテルペノイド産物の増加が観察された。 一次スクリーニングから得られたリードの検証及び二次再スクリーニングの結果を示す。Ｇ１１変異体を産物Ａと産物Ｂ両方の生産シャーシに組み込んだ。 選択した変異型を、生産株の野生型ｉｓｐＧ遺伝子に補足した結果を示す。補足により２０％の生産力価の増加がもたらされる。テルペノイド産物を問わずこの向上の完全な橋渡しにより、「汎用シャーシ」が、ＭＥＰ経路を介していかなるテルペノイドの高濃度生産も促し得るという可能性を示唆している。 天然ＲＢＳ配列の改変によるｉｓｐＢの翻訳速度の調整が、テルペノイド産物の生産量を向上させることを示す。野生型（ＷＴ）ｉｓｐＢ ＲＢＳ（リボソーム結合部位）の様々な変異体を、天然のｉｓｐＢ ＲＢＳ上に導入してタンパク質翻訳を調整した。このようなＲＢＳの変更はテルペノイド生産量に影響を及ぼし、そのうちのいくつかは生産量の向上をもたらす。一次スクリーニングからいくつかのヒットが特定され、産物Ａで１．７倍、産物Ｂで２倍の向上を有する株が得られた。一番左の列は親対照のものであり、これを値１に設定する。リードヒットを繰り返して検証し、完全に配列決定した後、各生産株のリード作製に移る。 ｉｓｐＢ ＲＢＳの一次スクリーニングで観察された向上を確認する、複製を伴う二次スクリーニングによって検証された４つの変異株を示す。 ＭＥＰ遺伝子の過剰発現は生産力価の低下を引き起こす。ＭＥＰ遺伝子の発現レベルが親Ｇ５のレベルよりも増加すると、生産されるテルペノイド産物Ａは約５０％減少し、この減少は、強度の発現（＋＋＋）では、それより弱強度の発現（＋）よりも悪化する。対照的に、ｄｘｒを発現するオペロンにｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子を付加すると、生産力価を親のレベルまで回復させることができる。これは、この経路における遺伝子発現を注意深くバランス調整することで高いテルペノイド生産力価が可能になることを示す。 力価は低下するが、ＭＥＰ経路に入る炭素は増加することを示す。ＭＥＰ経路の補完操作により、遺伝子発現の変化に応じて産物Ａの力価は低下するかまたは同じままであることを示したが、中間体ＭＥＰ経路代謝産物は著しく濃度が増加した。ＭＥＰ炭素代謝産物を、正規標準物質に対する液体クロマトグラフィー及び質量分析によって定量し、対照Ｇ５株と比較して補完株で著しく増加することがわかった。ＭＥＰ経路を経て目的産物に至る炭素分子の流れに着目するため、得られる代謝産物濃度をモル濃度換算で表す。ＭＥＰ中間体の大部分は細胞外で観察され、ＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰがその大多数を占める。主要な細胞内産物はＣＤＰ－ＭＥであり、補完株では蓄積の増加が観察される。ｄｘｒの過剰発現は産物Ａの力価を２分の１に低下させたが、ＭＥＰ経路に入り、中間体として蓄積する炭素の量は６倍に上昇した。すなわち、ＭＥＰ経路へ入る炭素は増加するが、出て行く炭素は減少する。さらに、親Ｇ５は主にＤＯＸ（及びいくらかのＭＥｃＰＰ）を蓄積したが、（ＤＯＸＰをＭＥＰに変換する）ｄｘｒが増加すると炭素が下流の経路へと移動し、その結果、より多くの炭素がＭＥ及びＭＥｃＰＰとして細胞外にプールされる。さらにｄｘｒに加えてｉｓｐＥの発現が増加すると、ＭＥＰ経路における炭素量が親Ｇ５のほぼ１０倍に増加し、その炭素のほぼすべてが下流のＭＥｃＰＰへと移動した。興味深いことに、ｄｘｒに加えてｉｓｐＧ及びｉｓｐＨを過剰発現させると、ｄｘｒのみの過剰発現と酷似した中間体プロファイルが得られるが、前者の場合には生産力価が２倍になる。 図１４のＭＥＰ経路に蓄積するすべての炭素が最終産物まで問題なく変換された場合に生産されるであろう産物Ａの総量を示す。このデータは、空のプラスミドで補完されたＧ５株と、（＋から＋＋＋まで増加する様々な発現レベルで）ＭＥＰ経路遺伝子を発現する同じプラスミド骨格で補完されたＧ５株との生産潜在能力の比較を示す。ＭＥＰ経路の総炭素量（図１４のように定量）を産物Ａの等価物に変換すると、経路を通る炭素フラックスは補完により増加し、これらの株では産物Ａの潜在能力がほぼ９倍超になる可能性があることを示す。

様々な態様において、本発明は、テルペン及びテルペノイド産物を生産するための細菌株及び方法に関する。ある特定の態様では、本発明は、ＭＥＰ経路を通る炭素フラックスを向上させる細菌株を提供し、それによってグルコースなどの炭素源を用いた発酵によってテルペン及び／またはテルペノイドの生産収率を増加させる。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供することを含む。この細菌株は、グルコースなどの炭素源を用いて培養すると、ＭＥＰ経路を介して解糖系に入
る炭素の１％超（１％超の「ＭＥＰ炭素」）を代謝する。いくつかの実施形態では、解糖系に入る炭素の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１７％、または少なくとも約２０％がＭＥＰ炭素になる。さらに他の実施形態では、解糖系に入る炭素の少なくとも約２２％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約２７％がＭＥＰ炭素になる。炭素源としてグルコースを用いると、ＭＥＰ経路に流入する炭素の理論上の最大値は、Ｅ．ｃｏｌｉの場合の約３０％である。いくつかの実施形態では、株はこの理論上のＭＥＰ炭素の最大収率を実質的に満たす。これは、この株が最大理論収率の少なくとも約８０％をもたらすことを意味する。文献に報告されているＭＥＰ炭素の以前の収率は１％未満である。Ｚｈｏｕ Ｋ，Ｚｏｕ Ｒ，Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ，Ｔｏｏ Ｈ－Ｐ（２０１２）Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ Ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ Ｃｙｃｌｏｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｅｆｆｌｕｘ ａｓ ａ Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｓｔｅｐ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（１１）：ｅ４７５１３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４７５１３を参照のこと。

様々な実施形態において、微生物株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．から選択される細菌である。いくつかの実施形態では、細菌種は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから選択される。いくつかの実施形態では、細菌株はＥ．ｃｏｌｉである。

この宿主細菌細胞は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を産生するＭＥＰ経路を発現する。グルコースが細胞内に入り、中間体としてのグリセルアルデヒド－３－リン酸（Ｇ３ＰまたはＧＡＰ）によりピルビン酸（ＰＹＲ）に変換される。Ｇ３ＰとＰＹＲが化合して１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸（ＤＯＸＰ）を生成し、これが２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－リン酸（ＭＥＰ）に変換され、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの経路に渡される。ＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰは細胞外に見られる。ＭＥＰ経路へのフラックスが多いほど、これらの産物が細胞外に多く見られる。図１を参照のこと。

ＭＥＰ（２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－リン酸）経路はまた、ＭＥＰ／ＤＯＸＰ（２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－リン酸／１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸）経路または非メバロン酸経路またはメバロン酸非依存性経路とも呼ばれる。この経路は典型的には以下の酵素の作用を伴う：１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ（Ｄｘｓ）、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｄｘｒ、またはＩｓｐＣ）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、２Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２，４－シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）、１－ヒドロキシ－２－メチル－２－（Ｅ）－ブテニル４－二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）、１－ヒドロキシ－２－メチル－２－（Ｅ）－ブテニル４－二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ）、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｉｄｉ）。ＭＥＰ経路、ならびにＭＥＰ経路を構成する遺伝子及び酵素は、ＵＳ８，５１２，９８８に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ＭＥＰ経路を構成する遺伝子として、ｄｘｓ、ｄｘｒ（またはｉｓｐＣ）、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、及びｉｓｐＡが挙げられる。

ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ（ＭＥＰ経路の産物）は、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、及びトリテルペノイドを含むテルペン及びテルペノイドの前駆体であり、これらは、香料、芳香剤、化粧品、及び食品の分野において特に有用である。テルペン及びテルペノイドの合成は、プレニルトランスフェラーゼ酵素（例えば、ＧＰＰＳ、ＦＰＰＳ、またはＧＧＰＰＳ）の作用により、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体をゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、またはゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）に変換することによって進行する。そのような酵素は公知であり、例えば、ＵＳ８，９２７，２４１、ＷＯ２０１６／０７３７４０、及びＷＯ２０１６／０２９１５３に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、用語「ＭＥＰ炭素」とは、ＭＥＰ経路の投入物、中間体、代謝産物、または産物として存在する全炭素を指す。代謝産物には、分解産物などの誘導体、ならびにリン酸化及び脱リン酸化の産物が含まれる。ＭＥＰ炭素には、テルペノイド合成経路を含む下流経路の産物及び中間体を含む。本開示の目的では、ＭＥＰ炭素には、ＭＥＰ経路の以下の投入物、中間体、及び代謝産物を含む：Ｄ－グリセルアルデヒド３－リン酸、ピルビン酸、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール－５－リン酸、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール、２－ホスホ－４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール、２Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２，４－シクロ二リン酸、１－ヒドロキシ－２－メチル－２－（Ｅ）－ブテニル４－二リン酸、イソペンテニル二リン酸、及びジメチルアリル二リン酸。ＭＥＰ炭素には、細胞によって発現する下流のテルペノイド合成経路における中間体及び主要な代謝産物をさらに含む。同一性は使用される経路及び酵素に応じて異なるが、そのような産物には以下が含まれる：ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、またはゲラニルファルネシル二リン酸（ＦＧＰＰ）；それらのモノリン酸化型であるゲラニルリン酸、ファルネシルリン酸、ゲラニルゲラニルリン酸、またはゲラニルファルネシルリン酸；それらのアルコール類であるゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、またはゲラニルファルネソール；ならびに下流のテルペン及びテルペノイド産物。ＭＥＰ炭素には、ＦＰＰまたはＦＰＰを使用する経路に由来する化合物がさらに含まれ、これには、スクアレン、ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）、ウンデカプレニルリン酸、オクタプレニル二リン酸（ＯＰＰ）、４－ヒドロキシベンゾエート、３－オクタプレニル－４－ヒドロキシベンゾエート、２－オクタプレニルフェノール、３－オクタプレニルベンゼン－１，２－ジオール、２－メトキシ－６－オクタプレニル－２－メトキシ－１，４－ベンゾキノール、６－メトキシ－３－メチルオクタプレニル－１，４－ベンゾキノール、３－デメチルユビキノール－８、ユビキノール－８、ユビキノン、２－カルボキシ－１，４－ナフトキノール、デメチルメナキノール－８、メナキノール－８、及びメナキノンを含む。ＭＥＰ炭素には、イソプレノール、プレノール、イソペンテニルリン酸、及びジメチルアリルリン酸代謝産物をさらに含む。ＭＥＰ炭素はさらに、プレニル化インドールを含むプレニル化代謝産物及びタンパク質を含む。ＭＥＰ炭素（上記中間体及び代謝産物）は、三連四重極（ＱＱＱ）質量検出器によるタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）などの質量分析（ＭＳ）によって定量することができる。例示的なシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４６０ ＱＱＱである。あるいは、定量的飛行時間型（ＱＴＯＦ）、飛行時間型（ＴＯＦ）、またはイオントラップ質量検出器を用いる。

本発明に従って生産することができる例示的なテルペンまたはテルペノイド産物は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，９２７，２４１に記載されており、これには、アルファ－グアイエン、アルファ－シネンサール、アモルファジエン、アルテミシン酸、ベータ－ビサボレン、ベータ－ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、シネオ
ール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ゲラニオール、リモネン、メントール、メントン、ミルセン、ヌートカトン、ヌートカトール、パチョリ、ピペリトン、ロツンドン、ローズオキシド、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド（レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＭを含む）、タキサジエン、チモール、及びバレンセンが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉの経路を組換えにより構築するための酵素は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，９２７，２４１、ＷＯ２０１６／０７３７４０、及びＷＯ２０１６／０２９１５３に記載されている。

いくつかの実施形態では、微生物株は、１つ以上のｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び／またはｉｄｉ遺伝子のうち少なくとも１つの追加コピーを有する。これらは律速を可能にし、オペロンまたはモジュールからプラスミドで発現させることも、または細菌染色体に組み込むこともできる。いくつかの実施形態では、細菌株は、オペロン／モジュールとして発現させたｄｘｓ及びｉｄｉ；またはオペロンもしくはモジュールとして発現させたｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉのうち、少なくとも１つの追加コピーを有する。これらの実施形態では、この株は、野生型と比較して、ＭＥＰ経路を通るフラックスを増加させる。ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び／またはｉｄｉの過剰発現に加え、後述するＭＥＰ経路の補完が行われてもよい。

様々な実施形態において、ＦＰＰと競合する、ユビキノン合成経路またはＩｓｐＢ酵素などの、１つ以上の競合する酵素または経路の発現または活性を下方「調整」することを含む。代わりに、または加えて、本発明は、Ｆｅ－Ｓ酵素であるＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの高活性を維持するように、Ｆｅ－Ｓクラスタータンパク質の可用性または活性を増加させることを含む。代わりに、または加えて、いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、炭素をさらに下流の経路へ流入させることによってＭＥＰ炭素を増加させる効果のある有益な変異体またはオルソログの選択による、ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨの過剰発現、または発現もしくは活性の調整を含む。代わりに、または加えて、さらなるＭＥＰ酵素の補完をメタボロミクスによって評価することで、ＭＥＰ酵素の補完が、高濃度のＭＥＰ炭素をもたらすことを確認することができる。上記及び他の実施形態を以下に詳細に記載する。

様々な実施形態において、微生物株は、例えば培養物の光学密度（Ｏ．Ｄ．）、ピークＯ．Ｄ．、及び／または増殖速度によって決定される、炭素源としてグルコースを用いた株の増殖及び生存率に実質的な影響を与えることなく、ＭＥＰ炭素の実質的な増加をもたらす。例えば、本明細書に記載の１つ以上の必須遺伝子または経路に対する変更を問わず、微生物株はピークＯ．Ｄ．が約２０％を超える低下を示さず、またはいくつかの実施形態では、ピークＯ．Ｄ．が約１５％を超える、または約１０％を超える、または約５％を超える低下を示さない。いくつかの実施形態では、株は、例えば増殖速度またはピークＯ．Ｄ．を測定することによって決定される、株の増殖または生存率に対して測定可能な影響を示さない。

いくつかの実施形態では、ユビキノン生合成経路は、例えば、ＩＰＰ及びＦＰＰ基質を使用するＩｓｐＢの発現または活性を低減することによって下方制御される。ｉｓｐＢ遺伝子は、ユビキノンの合成を制御するオクタプレニル二リン酸シンターゼをコードしており、そのため、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体をＦＰＰシンターゼと直接競合する。ＩｓｐＢは、Ｅ．ｃｏｌｉの必須遺伝子である。Ｋａｉｎｏｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｍｅｒ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｔａｐｒｅｎｙｌ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩｓｐＢ）ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１１）：７８６７－７８８３（２００１）を参照のこと。しかしながら、ＩｓｐＢ ＲＢＳ配列を改変し、ｍＲＮＡの翻訳を下方調整することによって、細胞内のＩｓ
ｐＢ酵素の量を減少させると、株の増殖及び生存率に実質的なまたは測定可能な影響を及ぼさずに炭素フラックスをテルペノイド組換え経路に移動させることができる。いくつかの実施形態では、ＩｓｐＢの活性または発現は、親株の約８０％以下、または親株の約７０％以下、または親株の５０％以下、または親株の４０％以下、または親株の２５％に減少する。

シャイン－ダルガノ（ＳＤ）配列は、細菌中のリボソーム結合部位であり、一般に、開始コドンＡＵＧの約８塩基上流に位置する。このＲＮＡ配列は、リボソームをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に動員するのを助け、リボソームを開始コドンに配置することによってタンパク質合成を開始させる。いくつかの実施形態では、ｉｓｐＢ遺伝子中の６塩基ＳＤ配列は、ＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣに変更されるか、またはＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣから１もしくは２ヌクレオチドが変更されたその修飾体に変更される。そのような実施形態では、ＩｓｐＢ翻訳が下方調整され、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖及び生存率に実質的なまたは測定可能な影響を及ぼすことなく、テルペノイド生合成への炭素フラックスの増加を可能にする。

いくつかの実施形態では、ＩｓｐＢの発現または活性は、ｉｓｐＢ遺伝子の発現を変更すること、すなわち転写を減少させるためにプロモーター領域を変更すること、またはｉｓｐＢ ＲＮＡまたはコードタンパク質の分解速度を速めることによって変更される。いくつかの実施形態では、ｉｓｐＢ酵素の活性を、ｉｓｐＢアミノ酸配列の変異によって、または細菌株での活性を低下させたｉｓｐＢオルソログの選択によって低下させる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来の野生型ＩｓｐＢアミノ酸配列は、本明細書で配列番号３として示されている。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を低下させるために、ＩｓｐＢアミノ酸配列（配列番号３）に対して１～約１０個、または１～約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられ、これには、１つ以上の基質結合部位及び／または活性部位への置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（オルソログの配列か変異体の配列かを問わない）は、配列番号３と約５０％～約９９％の配列同一性、または配列番号３と約６０％～約９９％の配列同一性、または配列番号３と約７０％～約９９％の配列同一性、または配列番号３と約８０％～約９９％の配列同一性、または配列番号３と約９０％～約９９％の配列同一性、または配列番号３のアミノ酸配列と約９５％～約９９％の配列同一性を有する。そのような変異体及びオルソログは、Ｋａｉｎｏｕ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｔａｐｒｅｎｙｌ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩｓｐＢ）ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｃｈａｉｎ
ｌｅｎｇｔｈ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１１）：７８６７－７８８３（２００１）；またはＨａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ－ｂｏｕｎｄ
ｏｃｔａｐｒｅｎｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｃｈａｉｎ－ｌｅｎｇｔｈ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２０１５ Ｊａｎ；８３（１）：３７－４５によって知ることができる。

いくつかの実施形態では、細菌株は、株のＭＥＰ炭素の量を向上させる可能性がある、ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨなどのＦｅ－Ｓ酵素の生物反応の増強を促進する。ＭＥＰ経路のＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素は鉄－硫黄クラスター酵素であり、これを機能させ、その化学反応を起こすには、活性部位のＦｅ－Ｓイオンの特別な配置を必要とすることを意味する。これらのＦｅ－Ｓクラスターは生命に不可欠であるが、それを不活性化する酸素及び酸素化に極めて反応しやすい。嫌気性または好気性いずれかの増殖条件下で、ｉｓｃＲはＦｅ－Ｓクラスター生合成経路の遺伝子をコードするオペロンｉｓｃＲＳＵＡの転写を抑制する。ｉｓｃオペロンの転写を抑制できるようにするには、ｉｓｃＲがＦｅ－Ｓ基に結合される必要があるため、ｉｓｃＲによるｉｓｃオペロンの抑制は、培地中のＦｅ－
Ｓクラスターの要求量に応答。嫌気性下では、Ｆｅ－Ｓ基の要求量は好気性下よりも低く、したがってオペロンの抑制は好気性下よりも強い。ｉｓｃＲは、プロモーター配列と重複する２つのＤＮＡ結合部位を認識して結合し、ｉｓｃＲＳＵＡオペロンの転写を抑制する。タンパク質がこれらの部位に結合すると、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター領域に結合して転写を開始することができなくなる可能性が高い。

いくつかの実施形態では、強強度、中強度、または弱強度のいずれかの細菌プロモーターを使用して、テルペンまたはテルペノイドの生産に用いられる条件下でｉｓｃオペロンが発現される。プロモーターの強度を変化させて調整することで、テルペノイド産物を向上させることができる。プロモーターは構成的であっても誘導性であってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは強力な構成的プロモーターである。

ｉｓｃオペロンのプロモーター及び最初の遺伝子（すなわちｉｓｃＲ）を欠失させ、それを構成的または誘導性プロモーターで置換して、オペロン内の残りの遺伝子の発現を誘導することで、鉄－硫黄クラスター酵素性能の改善が得られる。したがって、いくつかの実施形態では、細菌株（例えばＥ．ｃｏｌｉ）は、ｉｓｃＳＵＡの誘導性または構成的な過剰発現を伴うｉｓｃＲ欠失を含む。Ｅ．ｃｏｌｉの誘導性及び構成的プロモーターは公知であり、当業者は、オペロンの発現を調整するために選択することができる。様々な実施形態において、ｉｓｃＲ遺伝子は完全にまたは部分的に欠失されているか、またはＲＢＳもしくは開始コドンに対する１つ以上の変異によって不活性化されている。いくつかの実施形態では、ｉｓｃＲ遺伝子はアミノ酸変異によって不活性化されている。様々な実施形態において、Ｆｅ－Ｓ酵素制御に対する改変は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるテルペノイド生産に使用されることが多い好気条件下または微好気条件下を含め、株の増殖または生存率に実質的なまたは測定可能な影響を及ぼすことなく、ＭＥＰ炭素を増加させる。ｉｓｃオペロンは、Ｓａｎｔｏｓ ＪＡ，Ｗｈａｔ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａ ｃｌｕｓｔｅｒ ｍａｋｅｓ：Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＩｓｃＲ ｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １８５４（９）：１１０２－１２（２０１５）にさらに概説されている。

いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉはｒｙｈＢの欠失または不活性化を含む。ＲｙｈＢとは、ＴＣＡサイクル及び好気性呼吸連鎖の酵素を含め、含鉄タンパク質の発現を下方制御することによって、低量の鉄条件下での鉄消費を低減する作用をする小分子ＲＮＡである。さらに、ｒｙｈＢはシデロフォアエンテロバクチンの合成を促進する。ＲｙｈＢは約９０ｎｔ長の小分子ＲＮＡである。ＲｙｈＢは、ｉｓｃＲとｉｓｃＳのオープンリーディングフレーム間でのポリシストロン性ｉｓｃＲＳＵＡ ｍＲＮＡの切断を促進する。ＩｓｃＲをコードする５’断片は安定なままであり、ｉｓｃＳＵＡの３’断片が分解されると思われる。Ｍａｎｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ，ＩｓｃＲ，ａｎｄ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＲＮＡ，ＲｙｈＢ，ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｆｅ－Ｓ ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｍＢｉｏ ７（５）：ｅ００９６６－１６を参照のこと。様々な実施形態において、ｒｙｈＢの欠失または不活性化（例えば、ヌクレオチド変異）は、株のスクリーニングまたはテルペノイドの生産に使用される好気、微好気、または嫌気条件下を含め、株の増殖または生存率に実質的なまたは測定可能な影響を及ぼすことなく、ＭＥＰ炭素を増加させる。

いくつかの実施形態では、ＭＥＰ酵素の発現または活性は、例えばプラスミドにあるかゲノムに組み込まれているかを問わず、追加の酵素コピーによる補完によって、炭素をさらに下流の経路に移動させるように変更またはバランスが調整される。図１３に示すように、ＭＥＰ遺伝子の過剰発現は生産力価の低下を引き起こし得る。例えば、ＭＥＰ遺伝子
の発現レベルが親Ｇ５のレベルよりも増加すると、生産されるテルペノイド産物Ａは約５０％減少し、この減少は、強度の発現（＋＋＋）では、それより弱度の発現（＋）よりも悪化する。対照的に、ｄｘｒを発現するオペロンにｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子を付加すると、生産力価を親のレベルまで回復させることができる。これは、この経路における遺伝子発現を注意深くバランス調整することで高いテルペノイド生産力価が可能になることを示す。

産物Ａの力価はＭＥＰの補完によって低下するかまたは同じままであったが、中間体ＭＥＰ経路代謝産物は、著しく濃度が増加した。ＭＥＰ中間体の大部分は細胞外で観察され、ＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰがその大多数を占める。主要な細胞内産物はＣＤＰ－ＭＥであり、補完株では蓄積の増加が観察される。ｄｘｒの過剰発現は産物Ａの力価を２分の１に低下させたが、ＭＥＰ経路に入り、中間体として蓄積する炭素の量は６倍に上昇した。すなわち、ＭＥＰ経路へ入る炭素は増加するが、出て行く炭素は減少する。さらに、親Ｇ５は主にＤＯＸ（及びいくらかのＭＥｃＰＰ）を蓄積したが、（ＤＯＸＰをＭＥＰに変換する）ｄｘｒが増加すると炭素が下流の経路へと移動し、その結果、より多くの炭素がＭＥ及びＭＥｃＰＰとして細胞外にプールされる。さらにｄｘｒに加えてｉｓｐＥの発現が増加すると、ＭＥＰ経路における炭素量が親Ｇ５のほぼ１０倍に増加し、その炭素のほぼすべてが下流のＭＥｃＰＰへと移動した。興味深いことに、ｄｘｒに加えてｉｓｐＧ及びｉｓｐＨを過剰発現させると、ｄｘｒのみの過剰発現と酷似した中間体プロファイルが得られるが、前者の場合には生産力価が２倍になる。

いくつかの実施形態では、細菌株は、ｄｘｒまたはそのホモログもしくはオルソログならびにｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨの過剰発現に加え、場合によりｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、及びｉｓｐＦのうち１つ以上の過剰発現を含む。遺伝子は個別にまたはオペロン内で過剰発現させることができる。追加のコピーは、プラスミドから発現させることも、またはゲノムに組み込むこともできる。ｄｘｒの過剰発現により、ＤＯＸＰはＭＥ及びＭＥｃＰＰへと送られ、ボトルネックが下流に移動する。図１を参照のこと。いくつかの実施形態では、ｄｘｒ及びｉｓｐＥ（またはそのホモログ、オルソログ、もしくは誘導体）が過剰発現され、それによってＤＯＸＰが主にＭＥｃＰＰに送られる。図１４を参照のこと。ボトルネックがＭＥｃＰＰに移行すると、ＭＥＰ経路の潜在能力が３倍になることを観察できる（図１５）。

Ｅ．ｃｏｌｉ由来の野生型Ｄｘｒアミノ酸配列は、配列番号４として示されている。いくつかの実施形態では、野生型ｄｘｒ活性は、１つ以上の追加の遺伝子コピーで補完され、この遺伝子コピーは、野生型酵素をコードしても、または酵素活性または安定性を増加させるため、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失から独立して選択される１～１０個の修飾）を有する非天然もしくは修飾酵素をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ酵素よりも高い活性を有するｄｘｒオルソログで補完される。

いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ＤＲＬ酵素（配列番号８）を発現し、これはＥ．ｃｏｌｉ Ｄｘｒに対して低い配列相同性を有するＤｘｒ様酵素である。Ｐｅｒｅｚ－Ｇｉｌ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｄｅｏｘｙｘｙｌｕｌｏｓｅ－５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ－ｌｉｋｅ（ＤＲＬ）ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８７（１９），ｐｐ．１５８０３－１５８０９。いくつかの実施形態では、ＤＲＬ酵素は、細菌宿主細胞における活性及び／または発現に関する酵素の性質を改善する１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失から独立して選択される１～１０個の修
飾）を有する。

例えば、様々な実施形態において、細菌株は、配列番号４または８と５０％以上の配列同一性、または配列番号４または８のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性を有するＤｘｒ酵素を過剰発現するかまたはそれにより補完される。いくつかの実施形態では、Ｄｘｒ酵素は、タンパク質の活性を変化させるために、ＤｘｒまたはＤＲＬアミノ酸配列（例えば、配列番号４または８）に対して１～約１０個、または１～約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入を含み、これには、１つ以上の基質結合部位及び／または活性部位への置換を含む。そのような変異体は、Ｙａｊｉｍａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ １－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｘｙｌｕｌｏｓｅ ５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎ ａ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｉｏｎ，ＮＡＤＰＨ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇ ｆｏｓｍｉｄｏｍｙｃｉｎ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｆ６３，４６６－４７０（２００７）、及びＰｅｒｅｚ－Ｇｉｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｄｅｏｘｙｘｙｌｕｌｏｓｅ－５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ－ｌｉｋｅ（ＤＲＬ）ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８７（１９）：１５８０３－１５８０９（２０１２）を含め、当技術分野において利用可能な酵素構造によって知ることができる。

いくつかの実施形態では、野生型ＩｓｐＥ活性は、１つ以上の追加の遺伝子コピーで補完され、この遺伝子コピーは、野生型酵素をコードしても、または酵素活性または安定性を増加させるため、１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失から独立して選択される１～１０個の修飾）を有する修飾酵素をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ酵素または天然細菌酵素よりも高い活性を有するＩｓｐＥオルソログで補完される。Ｅ．ｃｏｌｉ ＩｓｐＥアミノ酸配列は、配列番号７として示されている。いくつかの実施形態では、細菌株は、ｉｓｐＥまたはその誘導体、ホモログ、もしくはオルソログの少なくとも１つの追加の遺伝子コピーを発現する。いくつかの実施形態では、追加のＩｓｐＥ酵素はＥ．ｃｏｌｉ ＩｓｐＥであるか、または酵素の活性及び／または安定性の増加をもたらし得る１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失から独立して選択される１～１０個の修飾）を含む。

例えば、様々な実施形態において、細菌株は、配列番号７と５０％以上の配列同一性、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性を有するＩｓｐＥ酵素を過剰発現するかまたはそれにより補完される。

いくつかの実施形態では、この株は、ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨによる補完を含む。いくつかの実施形態では、追加遺伝子は、天然遺伝子と同一もしくは実質的に同一であっても、または活性を増加させるために改変されていても、または天然の細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）酵素よりも活性が高いＩｓｐＧもしくはＩｓｐＨのオルソログであってもよい。例えば、ＩｓｐＧに関して、アミノ酸配列は、配列番号５と５０％以上の配列同一性、または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９７％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化
させるために、ＩｓｐＧアミノ酸配列（配列番号５）に対して１～約１０個、または１～約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられ、これには、１つ以上の基質結合部位または活性部位への置換を含む。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他のＩｓｐＧに対する改変は、相同性モデルの構築によって知ることができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＩｓｐＧ相同性モデルの構築に適したホモログは、Ｌｅｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ：ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ［４Ｆｅ－４Ｓ］ ｃｌｕｓｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩｓｐＧ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｄｅｃ １０；４０４（４）：６００－１０に開示されている。

いくつかの実施形態では、ＩｓｐＧ酵素は、Ｖ３０、Ｓ３２、Ｔ３４、Ｎ３５、Ｒ３７、Ｖ５９、Ｖ６１、Ｓ６２、Ｖ６３、Ｌ８３、Ｖ８４、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｐ１３１、Ｉ１３２、Ｉ１３４、Ａ１３８、Ｋ１４３、Ｆ１７６、Ｋ１７７、Ｖ１７８、Ｖ１８０、Ａ１８２、Ｌ２０５、Ｉ２０７、Ａ２１０、Ｇ２１２、Ａ２１３、Ｌ２３６、Ｖ２３８、Ａ２４１、Ａ２４２、Ｄ２４３、Ｒ２５９、Ｓ２６２、Ｒ２６３、Ｉ２６５、Ｎ２６６、Ｆ２６７、Ｉ２６８、Ａ２６９、Ｔ２７２、Ｓ２７４、Ｑ２７６、Ｅ２７７、Ｆ２７８、Ｄ２８９、Ｓ３０１、Ｉ３０２、Ｉ３０３、Ｖ３０６から選択される位置に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、以下から選択される複数の位置に修飾が加えられる：（１）Ｖ３０、Ｓ３２、Ｔ３４、Ｎ３５、Ｒ３７；または（２）Ｖ５９、Ｖ６１、Ｓ６２、Ｖ６３、Ｌ８３、Ｖ８４；または（３）Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｓ３０１、Ｉ３０２、Ｉ３０３、Ｖ３０６；または（４）Ｐ１３１、Ｉ１３２、Ｉ１３４、Ａ１３８、Ｋ１４３；または（５）Ｆ１７６、Ｋ１７７、Ｖ１７８、Ｖ１８０、Ａ１８２；または（６）Ｌ２０５、Ｉ２０７、Ａ２１０、Ｇ２１２、Ａ２１３；または（７）Ｌ２３６、Ｖ２３８、Ａ２４１、Ａ２４２、Ｄ２４３；または（８）Ｒ２５９、Ｓ２６２、Ｒ２６３、Ｉ２６５、Ｎ２６６；または（９）Ｆ２６７、Ｉ２６８、Ａ２６９、Ｔ２７２、Ｓ２７４、Ｑ２７６、Ｅ２７７、Ｆ２７８、Ｄ２８９。

いくつかの実施形態では、ＩｓｐＧ酵素は以下の変異、Ｌ２０５Ｖ、Ａ２１０Ｓ、Ｇ２１２Ｔ、及びＡ２１３Ｉのうち１つ、２つ、３つ、またはすべてを有する。

さらに、ＩｓｐＨに関して、アミノ酸配列は、配列番号６と５０％以上の配列同一性、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化させるために、ＩｓｐＨアミノ酸配列（配列番号６）に対して１～約１０個、または１～約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられ、これには、１つ以上の基質結合部位または活性部位への置換を含む。ＩｓｐＨ酵素に対する修飾は、Ｇｒａｗｅｒｔ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ＩｓｐＨ ｅｎｚｙｍｅ
ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ２００９ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４８：５７５６－５７５９を含め、入手可能なＩｓｐＨ構造によって知ることができる。

上記または他の実施形態では、ｐｇｉ（グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）活性変異体（例えば、活性が低下したもの）を組み込んで、潜在的に炭素フラックスを変化させ、生産力価をさらに向上することができる。いくつかの実施形態では、ｐｇｉは部分的に欠失または不活性化されている。いくつかの実施形態では、ｐｇｉは、生産力価またはＭＥＰ炭素に対する酵素の活性を変更または調整するため、１～約３０個のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失（例えば、約１～２０、または約１～１０個のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失）を含む。

ヌクレオチド及びアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性の比率は、配列アラインメントによって決定することができる。そのようなアラインメントは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌの数学的アルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７）、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）、またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．＆Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３－８０）などによる、技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムを用いて実施することができる。配列同一性（配列一致）の程度は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、またはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を用いて計算することができる。同様のアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰに組み込まれている。ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。

ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。比較目的としてギャップありアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されるようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの初期設定パラメーターを使用する。Ｓｈｕｆｆｌｅ－ＬＡＧＡＮ（Ｂｒｕｄｎｏ Ｍ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００３ｂ，１９ Ｓｕｐｐｌ １：１５４－１６２）またはマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術によって、配列一致解析を補完することができる。

「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性といった性質の類似性に基づいて行うことができる。２０種の天然型アミノ酸は、以下の６つの標準アミノ酸群に分類することができる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、あるアミノ酸を上記の６つの標準アミノ酸群の同じ群内に列挙された別のアミノ酸に交換することであると定義される。例えば、ＡｓｐをＧｌｕに交換しても、そのように修飾されたポリペプチドには１つの負電荷が保持される。加えて、グリシンとプロリンとは、α－ヘリックスを妨害するその能力に基づいて、互いに置換可能である。上記の６つの群内でのいくつかの好ましい保存的置換は、以下のサブグループ内での交換である：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ；（ｉｉ）Ｓｅｒ及びＴｈｒ；（ｉｉ）Ａｓｎ及びＧｉｎ；（ｉｖ）Ｌｙｓ及びＡｒｇ；ならびに（ｖ）Ｔｙｒ及びＰｈｅ。

本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、あるアミノ酸を上記（１）～（６）の６つの標準アミノ酸群の異なる群内に列挙された別のアミノ酸に交換することであると定義される。

本明細書に記載の酵素の修飾は、保存的変異及び／または非保存的変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、酵素における特異的変異の構築に「合理的設計」を伴う。合理的設計とは、反応熱力学及び反応速度論、３次元構造、活性部位（複数可）、基質（複数可）、及び／または酵素と基質との間の相互作用など、酵素または関連酵素の知見を特異的変異の設計に取り入れることを指す。合理的設計手法に基づいて、酵素に変異を生じさせた後、対照レベルと比較したテルペンまたはテルペノイド生産量の増加についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、相同性モデリングに基づいて、変異を合理的に設計することができる。本明細書で使用される場合、「相同性モデリング」とは、あるタンパク質のアミノ酸配列及び関連する相同タンパク質の３次元構造から、タンパク質の原子分解能モデルを構築する方法を指す。

ある特定の実施形態では、細菌細胞は、１つ以上のテルペンまたはテルペノイド化合物を産生する。イソプレノイドとも呼ばれるテルペノイドは、５炭素イソプレン単位（Ｃ５）に由来する有機化学物質である。テルペノイドは、テルペノイドに含まれるイソプレン単位の数に基づいて分類され、いくつかの非限定的な例として、ヘミテルペノイド（１イソプレン単位）、モノテルペノイド（２イソプレン単位）、セスキテルペノイド（３イソプレン単位）、ジテルペノイド（４イソプレン単位）、セスタテルペノイド（５イソプレン単位）、トリテルペノイド（６イソプレン単位）、テトラテルペノイド（８イソプレン単位）、及びこれより多数のイソプレン単位を有するポリテルペノイドが挙げられる。一実施形態では、細菌宿主細胞は、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルペノイド、またはトリテルペノイドから選択されるテルペノイドを産生する。テルペノイドとは、食品及び飲料産業はもとより、香料産業、化粧品産業、及びヘルスケア産業を含む多数の商業的用途を提供する多様なクラスの分子を表す。例として、テルペノイド化合物は、香料に（例えばパチョロール）、香味産業で（例えばヌートカトン）、甘味剤として（例えばステビオール）、または治療薬として（例えばタキソール）使用され、従来は多くが植物から抽出されている。それにもかかわらず、テルペノイド分子は本質的にｐｐｍレベルで存在するため、商業的用途に足る量を得るには大量の収穫を必要とする。

この宿主細胞は一般に、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体からテルペノイドを生産する組換え下流経路を備えることになる。モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、及びトリテルペン（Ｃ３０）などのテルペンは、テルペン（テルペノイド）シンターゼと呼ばれる非常に大きな酵素群の作用によって、プレニル二リン酸基質である、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ゲラニルファルネシル二リン酸（ＦＧＰＰ）、及びＦＰＰからそれぞれ誘導される。これらの酵素は、反応産物が環化され、様々なモノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、セスタテルペン、及びトリテルペン炭素骨格産物を形成しているため、テルペンシクラーゼと呼ばれる場合が多い。得られた炭素骨格の多くは、シトクロムＰ４５０酵素による後続の酸素化を受けて、大きなファミリーの誘導体となる。

ジテルペン及びセスキテルペン骨格に作用する例示的なシトクロムＰ４５０酵素は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０７３７４０及びＷＯ２０１６／０２９１５３に記載されている。さらに、本明細書に記載の細菌株に使用されるシトクロムＰ４５０レダクターゼタンパク質は、ＷＯ２０１６／０２９１５３及びＷＯ２０１６／０７３７４０に記載されている。

いくつかの実施形態では、本発明の産物は１つ以上の酸素化テルペノイドである。本明細書で使用される場合、用語「酸素化テルペノイド」とは、１つ以上の酸素化事象を有し、対応するアルコール、アルデヒド、カルボン酸、及び／またはケトンを生成するテルペ
ン骨格を指す。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、アビエタジエン、アビエチン酸、アルファ－シネンサール、アルテミシン酸、ベータ－ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、セラストロール、セロプラストール、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ククルビタン、フォルスコリン、ガスカルジン酸（Ｇａｓｃａｒｄｉｃ Ａｃｉｄ）、ゲラニオール、ハスレン、レボピマル酸、リモネン、ルペオール、メントール、メントン、モグロサイド、ヌートカトン、ヌートカトール、オフィオボリンＡ、パチョリ、ピペリトン、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド、タキサジエン、チモール、及びウルソール酸から選択される少なくとも１つのテルペノイドを産生する。

いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０２９１５３及びＷＯ２０１６／０７３７４０に開示されるように、テルペノイドシンターゼ酵素を上方制御して、酵素の反応速度、安定性、産物プロファイル、及び／または温度耐性を増強する。

別の実施形態では、細菌細胞はバレンセン及び／またはヌートカトンを産生する。そのような実施形態では、細菌細胞は、ファルネシル二リン酸シンターゼ、バレンセンシンターゼ、及びバレンセンオキシダーゼをさらに含む生合成経路を発現させることができる。ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からファルネシル二リン酸を生成する。例示的なファルネシル二リン酸シンターゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ２０（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０８５２４）及びＥ．ｃｏｌｉ ｉｓｐＡである。バレンセンシンターゼはセスキテルペン骨格を生成し、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１２／０１０７８９３、ＵＳ２０１２／０２４６７６７、及びＵＳ７，２７３，７３５に記載されている。バレンセン及び／またはヌートカトンを含むテルペノイド産物を生産するための遺伝子及び宿主細胞は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０２９１５３に記載されている。

一実施形態では、細菌細胞はステビオールまたはステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭ）を産生する。ステビオールは、２つのＰ４５０酵素、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及びカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）の作用によってカウレンから生産される。ステビオールの生産後に、一連のグリコシル化反応を経て、様々なステビオールグリコシド産物を生産することができる。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。ステビオール及びステビオールグリコシドを生産するための経路及び酵素は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０１７１３２８、ＵＳ２０１２／０１０７８９３、ＷＯ２０１２／０７５０３０、ＷＯ２０１４／１２２３２８に開示されている。ＷＯ２０１６／０７３７４０はさらに、ＲｅｂＭを生産するための酵素及び細菌宿主細胞を開示している。

テルペンまたはテルペノイド化合物を生産するための他の生合成経路は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，９２７，２４１に開示されている。

テルペノイド産物を産生させるとともに、ＭＥＰ経路のフラックスを増強させる細菌宿主細胞を培養する。いくつかの実施形態では、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、及び／またはＣ６炭素基質などの炭素基質をテルペンまたはテルペノイド産物の生産に用いる。例示的実施形態では、炭素源はグルコース、スクロース、フルクトース、キシロース、及び／またはグリセロールである。培養条件は、一般に、好気性、微好気性、及び嫌気性から選択される。

様々な実施形態において、細菌宿主細胞は、２２℃～３７℃の温度で培養され得る。Ｅ
．ｃｏｌｉなどの細菌中での商業的生合成は、過剰発現酵素及び／または外来酵素（例えば、植物由来の酵素）が安定である温度によって制限される可能性があるが、組換え酵素（テルペノイドシンターゼを含む）は、より高温で培養物を維持することを可能にするように操作できるため、収率及び全体生産性をより高めることができる。いくつかの実施形態では、培養は、約２２℃以上、約２３℃以上、約２４℃以上、約２５℃以上、約２６℃以上、約２７℃以上、約２８℃以上、約２９℃以上、約３０℃以上、約３１℃以上、約３２℃以上、約３３℃以上、約３４℃以上、約３５℃以上、約３６℃以上、または約３７℃で実施される。

いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞が、商業規模での商業生産にさらに適している。いくつかの実施形態では、培養物の規模は、少なくとも約１００Ｌ、少なくとも約２００Ｌ、少なくとも約５００Ｌ、少なくとも約１，０００Ｌ、または少なくとも約１０，０００Ｌである。一実施形態では、培養は、バッチ培養、連続培養、または半連続培養で実施することができる。

様々な実施形態において、方法には、細胞培養物または細胞溶解物からテルペンまたはテルペノイド産物を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約５００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約１ｇ／Ｌ、または少なくとも約２ｇ／Ｌ、または少なくとも約５ｇ／Ｌ、または少なくとも約１０ｇ／Ｌ、または少なくとも約２０ｇ／Ｌ、または少なくとも約３０ｇ／Ｌ、または少なくとも約４０ｇ／Ｌのテルペンまたはテルペノイド産物が培養物から生産される。

いくつかの実施形態では、インドール（プレニル化インドールを含む）の生産量がテルペノイド生産量の代用マーカーとして使用され、及び／または培養物中のインドールの蓄積を制御して生産量を増加させる。例えば、様々な実施形態において、培養物中のインドールの蓄積は、約１００ｍｇ／Ｌ未満、または約７５ｍｇ／Ｌ未満、または約５０ｍｇ／Ｌ未満、または約２５ｍｇ／Ｌ未満、または約１０ｍｇ／Ｌ未満に制御される。インドールの蓄積は、ＵＳ８，９２７，２４１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の多変数モジュラー手法を用いてタンパク質の発現及び活性のバランスを調整することによって制御することができ、及び／または化学的手段によって制御される。

テルペン及びテルペノイドの効率的生産についての他のマーカーとして、培養培地中のＤＯＸまたはＭＥの蓄積が挙げられる。一般に、本明細書に記載の細菌株は、これらの化学種をあまり蓄積することがなく、培養物中の蓄積が、約５ｇ／Ｌ未満、または約４ｇ／Ｌ未満、または約３ｇ／Ｌ未満、または約２ｇ／Ｌ未満、または約１ｇ／Ｌ未満、または約５００ｍｇ／Ｌ未満、または約１００ｍｇ／Ｌ未満である。

ＭＥＰ経路遺伝子の操作、ならびに上流経路及び下流経路の操作によるテルペンまたはテルペノイド生産の最適化は、単純な線形過程または加法過程になるとは予測されない。むしろ、組み合わせ論によって、ＭＥＰ経路の構成成分ならびに上流経路及び下流経路のバランスをとることにより最適化が達成される。培養物中でのインドール（プレニル化インドールを含む）の蓄積及びＭＥＰ代謝産物の蓄積（例えば、ＤＯＸ、ＭＥ、ＭＥｃＰＰ、及び／またはファルネソール）を、この過程の指標となる代用マーカーとして使用することができる。

例えば、いくつかの実施形態では、細菌株は、オペロン／モジュールとして発現させたｄｘｓ及びｉｄｉ；またはオペロンもしくはモジュールとして発現させた（プラスミドにある、またはゲノムに組み込まれた）ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉのうち、少なくとも１つの追加コピーを有し、ＭＥＰ炭素を改善するための本明細書に記載の追加
のＭＥＰ経路で補完される。例えば、細菌株は、ｄｘｒ、ならびにｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨのさらなるコピーに加え、場合によりｉｓｐＥ及び／またはｉｄｉのさらなるコピーを有してもよく、これらの遺伝子の発現は、ＭＥＰ炭素を増加させるように、及び／またはテルペンもしくはテルペノイドの力価を向上させるように調整されている。様々な実施形態において、細菌株は、少なくともｄｘｒ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、及びｉｓｐＨのさらなるコピーに加え、場合によりｉｄｉのさらなるコピーを有し、これらの遺伝子の発現は、ＭＥＰ炭素を増加させるように、及び／またはテルペンもしくはテルペノイドの力価を向上させるように調整されている。

遺伝子モジュールを含む遺伝子及び／またはタンパク質の発現の操作は、様々な方法によって達成することができる。例えば、遺伝子またはオペロンの発現を、異なる強度（例えば、強、中、または弱）を有する、誘導性または構成的プロモーターなどのプロモーターの選択によって制御することができる。強度の異なるプロモーターのいくつかの非限定的な例としては、Ｔｒｃ、Ｔ５、及びＴ７が挙げられる。加えて、遺伝子またはオペロンの発現を、細胞内の遺伝子またはオペロンのコピー数を操作することによって制御することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子またはオペロンの発現を、モジュール内の遺伝子の順序を操作することによって制御することができる。その場合、最初に転写された遺伝子が一般に、より高レベルで発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子またはオペロンの発現は、１つ以上の遺伝子またはオペロンの染色体への組み込みによって制御される。

適切なプロモーター及びリボソーム結合部位の選択によってタンパク質発現の最適化も達成することができる。いくつかの実施形態では、これには、高コピー数プラスミド、または単一コピー数、低コピー数、もしくは中コピー数プラスミドの選択を含み得る。転写終結の段階を対象として、ステムループなどの構造の導入または排除によって遺伝子発現を制御することもできる。

発現に必要なすべての要素が含まれた発現ベクターが市販されており、当業者に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。細胞は、異種ＤＮＡの細胞への導入によって遺伝子操作される。異種ＤＮＡは、宿主細胞内での異種ＤＮＡの発現が可能になるように、転写要素の機能的制御下に置かれる。

遺伝子の補完とは対照的に、いくつかの実施形態では内因性遺伝子が編集される。編集により、内因性プロモーター、リボソーム結合配列、または他の発現制御配列を変更することができ、及び／またはいくつかの実施形態では、遺伝子制御におけるトランス作用性因子及び／またはシス作用性因子が変更される。ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集技術、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮを使用する類似の技術を用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子は相同組換えによって置換される。

いくつかの実施形態では、遺伝子コピー数を制御することによって遺伝子を少なくとも部分的に過剰発現させる。異なるコピー数を有するプラスミドを用いて遺伝子コピー数を制御すると利便であるが、遺伝子重複及び染色体組み込みもまた用いることができる。例えば、遺伝的に安定なタンデム遺伝子複製のための方法が、ＵＳ２０１１／０２３６９２７に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

テルペンまたはテルペノイド産物は任意の好適な方法で回収することができ、これには
、望ましい産物を有機相または疎水相に分配することを含む。あるいは、水相を回収して、及び／または全細胞バイオマスを回収して、さらに処理することもできる。望ましい産物の生産量は、例えばガスクロマトグラフィー（例えばＧＣ－ＭＳ）によって決定及び／または定量することができる。望ましい産物は、バッチ式または連続式バイオリアクターシステムで生産することができる。産物の生産、その産物の回収及び／または分析は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／０２４６７６７に記載されるように実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、産生油を、ヘプタンまたはドデカンなどのアルカンのような有機溶媒を使用して水性反応媒から抽出した後、分別蒸留する。他の実施形態では、植物油などの疎水相を使用して水性反応媒から産生油を抽出した後、有機溶媒抽出及び分別蒸留を行う。画分のテルペン及びテルペノイド成分を、ＧＣ／ＭＳによって定量的に測定した後、画分を混合して、所望する産物プロファイルを生成することができる。

様々な実施形態において、回収されたテルペンまたはテルペノイドが、製品（例えば、消費者製品または工業製品）に組み込まれる。例えば、製品は、着香製品、芳香製品、甘味剤、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または害虫駆除製品であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、回収される産物にはヌートカトンを含み、製品は飲料、チューインガム、キャンディー、もしくは香味添加剤から選択される着香製品であるか、または製品は虫除け剤もしくは殺虫剤である。いくつかの実施形態では、酸素化産物はステビオールまたはステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＭ）であり、これは甘味料として提供されるか、または原材料、香料、飲料、または食品に組み込まれる。

本発明はさらに、本明細書で生産されるテルペンまたはテルペノイドを組み込むことにより、食品、飲料、食感改良剤（例えば、デンプン、繊維、ガム、脂肪及び脂肪模倣物、ならびに乳化剤）、医薬品、タバコ製品、栄養補助食品、口腔衛生製品、及び化粧品などの製品を製造する方法を提供する。本発明の実施形態で生産されるような種の収率は高いため、大幅なコスト上の利点に加え、持続可能性をもたらすことができる。

他の態様では、本発明は、ＭＥＰ炭素を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有するＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞を提供する。様々な実施形態において、この細菌細胞は、ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する。下流合成経路は一般に組換え経路であり、プレニルトランスフェラーゼ、テルペンシンターゼ、ならびに場合により１つ以上のシトクロムＰ４５０酵素及びシトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素（例えば、それぞれ上記の通り）を含み得る。さらに、ＭＥＰ炭素を向上させるために、Ｅ．ｃｏｌｉは、以下の遺伝子改変のうちの１つ以上を有する：
（１）ＩｓｐＢの発現または活性の低下。場合によりＲＢＳの改変によるものであり、及び場合により、ｉｓｐＢ遺伝子中の６塩基ＳＤ配列は、ＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣに変更されているか、またはＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣから１もしくは２ヌクレオチドが変更されたその修飾体に変更される；
（２）テルペンまたはテルペノイドの生産に使用される条件下でｉｓｃオペロン（例えば、ｉｓｃＳＵＡ）内の残りの遺伝子の発現を誘導するための、ｉｓｃＲ遺伝子、及び構成的または誘導性プロモーターのすべてまたは一部の欠失または不活性化；
（３）ｒｙｈＢの欠失または不活性化；
（４）ＤＯＸ及び／またはＭＥが約２ｇ／Ｌまたは約１ｇ／Ｌを超えて蓄積しないような、ＭＥＰ酵素の発現または活性の変更またはバランス調整；
（５）ｄｘｒ遺伝子（場合により、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、及び／またはｉｓｐＦを含む）ならびにｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨ遺伝子を含むＭＥＰ経路の補完。その場合、ＩｓｐＧまたはＩｓｐＨは、場合により酵素活性を増加させるように修飾され、ＩｓｐＧは
場合により、Ｖ３０、Ｓ３２、Ｔ３４、Ｎ３５、Ｒ３７、Ｖ５９、Ｖ６１、Ｓ６２、Ｖ６３、Ｌ８３、Ｖ８４、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｐ１３１、Ｉ１３２、Ｉ１３４、Ａ１３８、Ｋ１４３、Ｆ１７６、Ｋ１７７、Ｖ１７８、Ｖ１８０、Ａ１８２、Ｌ２０５、Ｉ２０７、Ａ２１０、Ｇ２１２、Ａ２１３、Ｌ２３６、Ｖ２３８、Ａ２４１、Ａ２４２、Ｄ２４３、Ｒ２５９、Ｓ２６２、Ｒ２６３、Ｉ２６５、Ｎ２６６、Ｆ２６７、Ｉ２６８、Ａ２６９、Ｔ２７２、Ｓ２７４、Ｑ２７６、Ｅ２７７、Ｆ２７８、Ｄ２８９、Ｓ３０１、Ｉ３０２、Ｉ３０３、Ｖ３０６から選択される位置に１つ以上の変異を有し；場合により、以下から選択される複数の位置に修飾を有する：（１）Ｖ３０、Ｓ３２、Ｔ３４、Ｎ３５、Ｒ３７；または（２）Ｖ５９、Ｖ６１、Ｓ６２、Ｖ６３、Ｌ８３、Ｖ８４；または（３）Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｓ３０１、Ｉ３０２、Ｉ３０３、Ｖ３０６；または（４）Ｐ１３１、Ｉ１３２、Ｉ１３４、Ａ１３８、Ｋ１４３；または（５）Ｆ１７６、Ｋ１７７、Ｖ１７８、Ｖ１８０、Ａ１８２；または（６）Ｌ２０５、Ｉ２０７、Ａ２１０、Ｇ２１２、Ａ２１３；または（７）Ｌ２３６、Ｖ２３８、Ａ２４１、Ａ２４２、Ｄ２４３；または（８）Ｒ２５９、Ｓ２６２、Ｒ２６３、Ｉ２６５、Ｎ２６６；または（９）Ｆ２６７、Ｉ２６８、Ａ２６９、Ｔ２７２、Ｓ２７４、Ｑ２７６、Ｅ２７７、Ｆ２７８、Ｄ２８９；及び場合により、Ｌ２０５Ｖ、Ａ２１０Ｓ、Ｇ２１２Ｔ、及びＡ２１３Ｉのうち１つ、２つ、３つ、またはすべて。
（６）テルペノイド力価の増加またはＭＥＰ炭素の増加を促すｐｇｉ（グルコース－６－リン酸イソメラーゼ）の変異。

いくつかの実施形態では、細菌株は、オペロン／モジュールとして発現させたｄｘｓ及びｉｄｉ；またはオペロンもしくはモジュールとして発現させた（プラスミドにある、またはゲノムに組み込まれた）ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉのうち、少なくとも１つの追加コピーを有する。さらに、細菌株は、ｄｘｒ、ｉｓｐＥ、ならびにｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨのさらなるコピーを有してもよく、これらの遺伝子の発現は、ＭＥＰ炭素を増加させるように及び／またはテルペンもしくはテルペノイドの力価を向上させるように調整されている。

様々な実施形態において、細菌株は、上記の（１）～（６）によって定義される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つすべての改変を含む。

本明細書の他の箇所に開示されているように、組換え遺伝子の補完によって遺伝子を過剰発現させることも、または内因性遺伝子を改変して発現を変化させることもできる。

細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．から選択される細菌である。例えば、細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから選択される種である。いくつかの実施形態では、細菌株はＥ．ｃｏｌｉである。

本発明の態様及び実施形態を、以降の実施例を参照して以下でさらに説明する。

実施例１：Ｆｅ－Ｓタンパク質の可用性が増加すると、蓄積はＤＯＸからＭＥに移動する
図３に示すように、Ｇ２（図２に記載）は、３．４５ｇ／Ｌのテルペノイド産物に相当する主要な細胞外代謝産物（ＤＯＸ＋ＭＥ＋ＭＥｃＰＰ）を産生する。これと比較して、Ｆｅ－Ｓタンパク質を増加させるための改変を含まない株では、主としてＤＯＸが７ｇ／Ｌである。Ｇ４はまた、テルペノイド産物の蓄積が５６％高かった。遺伝子改変には、ｉｓｃオペロンの過剰発現を伴うΔｒｙｈＢ、ΔｉｓｃＲが含まれる。

別のテルペノイド産物（産物Ｂ）を生産するように操作されたＥ．ｃｏｌｉ株についても同様の結果が得られ、３．２６ｇ／Ｌのテルペノイド産物に相当するＤＯＸ＋ＭＥ＋ＭＥｃＰＰを示した。追加の改変には、１．４倍の改善をもたらすｐｇｉに対する改変、及びｉｓｐＢの翻訳の調整が含まれる。図４を参照のこと。

図５に示されるように、トランスクリプトーム配列決定、及び操作された生産株を野生型Ｅ．ｃｏｌｉと比較する分析により、生産株の改変表現型におけるｒｙｈＢ及びｉｓｃオペロンの関与について有力な証拠が得られた。本発明者らの操作株でｒｙｈＢ遺伝子は強く上方制御されているのに対して、ｉｓｃＲ調節遺伝子は非常に強く下方制御されている。

図６に示すように、ｒｙｈＢの欠失、ｉｓｃＳＵＡの構成的過剰発現への切換え、及びｉｓｃＲの欠失による一連の改変により、段階的に生産力価が増加する株が得られる。

実施例２：ＭＥＰ経路のフラックスを向上させるためのｉｓｐＧの操作
野生型ｉｓｐＧ遺伝子を変異型に置き換えることにより、ｉｓｐＧの活性部位を組み合わせ的に変化させた一連のライブラリーを作成し、ｉｎ ｖｉｖｏで試験した。ｉｓｐＧの操作により、酵素の反応速度、安定性、及び頑強性を改善することで、Ｆｅ－Ｓクラスターの生化学反応がＭＥＰ経路を通るフラックスに及ぼす影響を軽減することができる。約１０００個の多様なｉｓｐＧオルソログの配列アラインメントを用いて、基質及び鉄－硫黄クラスター結合部位を標的とする９個の活性部位のコンビナトリアルライブラリーを設計した（図７Ａ、７Ｂ）。

図８は、２つのバックグラウンド株におけるセスキテルペン生産力価の増加に関する、ｉｓｐＧコンビナトリアルライブラリーの一次スクリーニングの結果を示す。スクリーニングは９６ＤＷＰにて３７℃で４８時間実施する。両方のバックグラウンド株（ｉｓｐＨの過剰発現の有無を問わない）を用いた合計約３０の変異体で同様の能力が見られ、テルペノイド生産力価が１．２～１．４５倍の向上を示した。

リード変異体を再スクリーニングし、その結果を図９に示した。２つのｉｓｐＧ変異体が、Ｆｅ－Ｓタンパク質の可用性を増加させるように操作された株よりも約１．２倍のテルペン生産力価の向上を示した。リード変異体Ｇ１１は、以下の変異、Ｌ２０５Ｖ、Ａ２１０Ｓ、Ｇ２１２Ｔ、及びＡ２１３Ｉを有する。

リード変異体をリードテルペノイド生産株に組み込み、その生産力価を図１０に示す。ｉｓｐＧ Ｌｉｂ６ Ｇ１１の組み込みにより、両方の株で生産量に１．２倍の向上をもたらした。

実施例３：ｉｓｐＢの翻訳の操作
ｉｓｐＢ遺伝子は、ユビキノンの合成を制御するオクタプレニル二リン酸シンターゼをコードしており、そのため、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体をＦＰＰシンターゼと直接競合する。ｉｓｐＢのＲＢＳ配列を改変し、ｍＲＮＡの翻訳を下方調整することによって、細胞内のｉｓｐＢ酵素の量を減少させることにより、炭素フラックスを組換えテルペノイド経路に移動させることができた。

図１１に示すように、ｉｓｐＢ ＲＢＳライブラリーの一次スクリーニングから、テルペン／テルペノイド生産量に最大１．７倍の向上が得られる、いくつかの潜在的ヒットを特定する。図１２に示すようにリードヒットを検証した。テルペノイド生産量に１．５倍の向上が得られる２つの一意なヒットを特定した。これは以下のＳＤ配列、ＣＧＴＧＣＴ及びＣＧＴＧＣＣを有するものであった。

実施例４：ＭＥＰ経路の補完
図１３に示すように、ｄｘｒを単独で、またはｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、及びｉｓｐＦと組み合わせて過剰発現させると、生産量が最大２分の１に減少する。ｉｓｐＧ－ｉｓｐＨを追加すると、生産量は元のレベルに戻る。

図１４に示すように、メタボロミクス分析では、ｉｓｐＥを含まないｄｘｒの過剰発現が細胞外ＭＥ及び細胞内ＣＤＰ－ＭＥの蓄積をもたらすことを示している。ｉｓｐＥの過剰発現により、代謝産物プールがＭＥ及びＣＤＰ－ＭＥからＭＥｃＰＰへと移動する。本実施例では、株を９６ウェルプレート中にて３７℃で４８時間増殖させる。終点で細胞培養物のＯＤ６００を測定した後、次の２つの試料に分割する。第１の試料は酢酸エチルで抽出し、産物Ａを分析及び定量する。対する第２の試料は遠心分離して細胞をペレット化し、上清を細胞外ＭＥＰ代謝産物について分析する一方、細胞ペレットをさらに処理して細胞内ＭＥＰ代謝産物を抽出する。テルペノイド産物を含む有機相試料をガスクロマトグラフィー及び質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により分析する一方、細胞外及び細胞内代謝産物試料を液体クロマトグラフィー及び質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により分離及び分析する。ＬＣ／ＭＳ検出器はトリプル四重極装置であり、正規標準物質に対するＭＥＰ代謝産物の正確な定量が可能である。ＭＥＰ経路を経て目的産物に至る炭素分子の流れに着目するため、得られる代謝産物濃度をモル濃度換算で表す。

図１５に示すように、ｄｘｒまたはｄｘｒ－ｉｓｐＥをＭＥＰに補完した産物Ａ Ｇ５株のメタボロミクス分析はさらに、得られた株でのＭＥＰフラックスの潜在能力の増加が、潜在的な産物Ａ力価の増加に変換されていることを示す。これらの株培養物について測定された産物及びＭＥＰ代謝産物の濃度をモル濃度に変換し、産物Ａに対する各ＭＥＰ代謝産物の炭素当量を算出する。すなわち、１個のＭＥｃＰＰ分子は５個の炭素を含むため、それぞれ１個が、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ、５個の炭素を含む）１分子、または１／３個のセスキテルペン産物Ａ分子（１５個の炭素を含む）に換算される。この方法では、炭素が問題なくＭＥｃＰＰを通り下流に流入される場合、この株によって生産された潜在的な産物Ａの合計を算出することができる。ＭＥＰ遺伝子間での発現バランスを調整すると、最大１２倍多くの産物Ａを得ることができる。
配列表
配列番号１（改変シャイン－ダルガノ配列１）：

配列番号２（改変シャイン－ダルガノ配列２）：

配列番号３（Ｅ．ｃｏｌｉ ＩｓｐＢ）

配列番号４（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄｘｒ）

配列番号５（Ｅ．ｃｏｌｉ ＩｓｐＧ）

配列番号６（Ｅ．ｃｏｌｉ ＩｓｐＨ）

配列番号７（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓデオキシキシルロース－５－リン酸レダクトイソメラーゼ様（ＤＲＬ））

配列番号８（Ｅ．ｃｏｌｉ ｉｓｐＥ）

Claims (53)

1. テルペンまたはテルペノイド産物の生産方法であって、
   上流のメチルエリスリトール経路（ＭＥＰ）を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供することと；
   前記テルペンまたはテルペノイド産物を生産する前記細菌株を培養することとを含み、解糖系に入る炭素の１％超がＭＥＰ炭素になる、前記方法。
2. 前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項１に記載の方法。
3. 前記細菌種が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１に記載の方法。
5. ＭＥＰ炭素が以下からなる、請求項１に記載の方法：
   Ｄ－グリセルアルデヒド３リン酸；
   ピルビン酸；
   １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸；
   １－デオキシ－Ｄ－キシルロース；
   ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール－５－リン酸；
   ２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール；
   ４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール；
   ２－ホスホ－４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール；
   ２Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２，４－シクロ二リン酸；
   １－ヒドロキシ－２－メチル－２－（Ｅ）－ブテニル４－二リン酸；
   イソペンテニル二リン酸；
   ジメチルアリル二リン酸；
   ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、またはゲラニルファルネシル二リン酸（ＦＧＰＰ）；
   ゲラニルリン酸、ファルネシルリン酸、ゲラニルゲラニルリン酸、またはゲラニルファルネシルリン酸；
   ゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、またはゲラニルファルネソール；
   テルペン及びテルペノイド産物；
   スクアレン；
   ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）、ウンデカプレニルリン酸；
   オクタプレニル二リン酸（ＯＰＰ）、４－ヒドロキシベンゾエート、３－オクタプレニル－４－ヒドロキシベンゾエート、２－オクタプレニルフェノール、３－オクタプレニルベンゼン－１，２－ジオール、２－メトキシ－６－オクタプレニル－２－メトキシ－１，４－ベンゾキノール、６－メトキシ－３－メチルオクタプレニル－１，４－ベンゾキノール、３－デメチルユビキノール－８、ユビキノール－８、ユビキノン；
   ２－カルボキシ－１，４－ナフトキノール、デメチルメナキノール－８、メナキノール－８、メナキノン；イソプレノール、プレノール、イソペンテニルリン酸、及びジメチルア
   リルリン酸；ならびに
   プレニル化インドールを含むプレニル化代謝産物及びタンパク質。
6. 前記テルペンまたはテルペノイド産物が、アビエタジエン、アビエチン酸、アルファ－グアイエン、アルファ－シネンサール、アモルファジエン、アルテミシン酸、ベータ－ビサボレン、ベータ－ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、セラストロール、セロプラストール、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ククルビタン、フォルスコリン、ガスカルジン酸、ゲラニオール、ハスレン、レボピマル酸、リモネン、ルペオール、メントール、メントン、モグロサイド、ヌートカトン、ヌートカトール、オフィオボリンＡ、パチョリ、ピペリトン、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、ロツンドン、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド、タキサジエン、チモール、ウルソール酸、及びバレンセンから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記ユビキノン生合成経路が下方制御される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記株が、ＩｓｐＢの発現または活性の低減を有する、請求項７に記載の方法。
9. ＩｓｐＢの発現が改変型リボソーム結合配列（ＲＢＳ）によって低減される、請求項８に記載の方法。
10. 前記ｉｓｐＢ遺伝子のシャイン－ダルガノ（ＳＤ）配列が、ＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣであるか、またはＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣの１もしくは２ヌクレオチドが変更されたその修飾体である、請求項８に記載の方法。
11. 前記株が、変更されたｉｓｐＢプロモーターまたはｉｓｐＢ ＲＮＡ分解速度を有する、請求項８に記載の方法。
12. 前記株が、増加した分解速度を有するＩｓｐＢタンパク質をコードする、請求項８に記載の方法。
13. 前記株が、酵素活性を低下させる１つ以上のアミノ酸変化を有するＩｓｐＢタンパク質；または前記細菌株で活性が低下するＩｓｐＢオルソログを含む、請求項８に記載の方法。
14. 前記株が、ｉｓｃオペロンの誘導性発現または構成的発現を有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ｉｓｃＲ遺伝子が、場合により前記ＲＢＳに対する改変によって、全体的にもしくは部分的に欠失されるか、または不活性化されている、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ｉｓｃＲ遺伝子が誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターで置換されている、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 前記株が、ｒｙｈＢの欠失または不活性化を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記株が、場合によりｄｘｒを含む組換え遺伝子またはオペロンによる補完によって、Ｄｘｒを過剰発現する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記株が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄｘｒと比較して活性が増加している修飾Ｄｘｒ酵素またはＤｘｒオルソログを有し、ここで前記オルソログは場合によりＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ＤＲＬ（配列番号８）またはその誘導体である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記株が、場合によりＩｓｐＥを発現する組換え遺伝子またはオペロンによる補完によって、ＩｓｐＥ、修飾ＩｓｐＥ、及び／またはＩｓｐＥオルソログを過剰発現する、請求項１８に記載の方法。
21. 前記株が、場合によりＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨを発現する組換え遺伝子またはオペロンによる補完によって、ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨを過剰発現する、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記株が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨと比較して活性が増加している修飾ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨ酵素またはオルソログを有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＩｓｐＧ酵素が、Ｖ３０、Ｓ３２、Ｔ３４、Ｎ３５、Ｒ３７、Ｖ５９、Ｖ６１、Ｓ６２、Ｖ６３、Ｌ８３、Ｖ８４、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｐ１３１、Ｉ１３２、Ｉ１３４、Ａ１３８、Ｋ１４３、Ｆ１７６、Ｋ１７７、Ｖ１７８、Ｖ１８０、Ａ１８２、Ｌ２０５、Ｉ２０７、Ａ２１０、Ｇ２１２、Ａ２１３、Ｌ２３６、Ｖ２３８、Ａ２４１、Ａ２４２、Ｄ２４３、Ｒ２５９、Ｓ２６２、Ｒ２６３、Ｉ２６５、Ｎ２６６、Ｆ２６７、Ｉ２６８、Ａ２６９、Ｔ２７２、Ｓ２７４、Ｑ２７６、Ｅ２７７、Ｆ２７８、Ｄ２８９、Ｓ３０１、Ｉ３０２、Ｉ３０３、Ｖ３０６から選択される位置に１つ以上の変異を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ＩｓｐＧが、
    （１）Ｖ３０、Ｓ３２、Ｔ３４、Ｎ３５、Ｒ３７；または
    （２）Ｖ５９、Ｖ６１、Ｓ６２、Ｖ６３、Ｌ８３、Ｖ８４；または
    （３）Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｓ３０１、Ｉ３０２、Ｉ３０３、Ｖ３０６；または
    （４）Ｐ１３１、Ｉ１３２、Ｉ１３４、Ａ１３８、Ｋ１４３；または
    （５）Ｆ１７６、Ｋ１７７、Ｖ１７８、Ｖ１８０、Ａ１８２；または
    （６）Ｌ２０５、Ｉ２０７、Ａ２１０、Ｇ２１２、Ａ２１３；または
    （７）Ｌ２３６、Ｖ２３８、Ａ２４１、Ａ２４２、Ｄ２４３；または
    （８）Ｒ２５９、Ｓ２６２、Ｒ２６３、Ｉ２６５、Ｎ２６６；または
    （９）Ｆ２６７、Ｉ２６８、Ａ２６９、Ｔ２７２、Ｓ２７４、Ｑ２７６、Ｅ２７７、Ｆ２７８、Ｄ２８９から選択される複数の位置に修飾を有する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ＩｓｐＧ酵素が以下の変異、Ｌ２０５Ｖ、Ａ２１０Ｓ、Ｇ２１２Ｔ、及びＡ２１３Ｉのうち１つ、２つ、３つ、またはすべてを有する、請求項２３に記載の方法。
26. １つ以上の組換えＭＥＰ遺伝子がプラスミドから発現されるか、または前記細菌のゲノムに組み込まれる、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記細菌株が、オペロン／モジュールとして発現させたｄｘｓ及びｉｄｉ；またはオペロンもしくはモジュールとして発現させたｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉのうち、少なくとも１つの追加コピーを有する、請求項２６に記載の方法。
28. 前記株が、テルペンもしくはテルペノイド力価の増加またはＭＥＰ炭素の増加を促進す
    るｐｇｉ変異を含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記株が、酵素反応速度論、産物のプロファイル、安定性、及び温度耐性のうちの１つ以上を改善するための１つ以上の変更を有するテルペノイドシンターゼ酵素を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記株が、場合によりグルコースまたはグリセロールである、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、及び／またはＣ６炭素源とともに、好気、微好気、または嫌気条件下で培養される、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記細菌株が、２２℃～３７℃の温度で培養される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記培養物が少なくとも約１００Ｌである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記培養物中のインドールまたはプレニル化インドールの蓄積を監視することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
34. 前記培養物中のＤＯＸ、ＭＥ、またはＭＥｃＰＰの蓄積を監視することを含む、請求項３２または３３に記載の方法。
35. 前記テルペンまたはテルペノイド産物を回収することをさらに含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記テルペンまたはテルペノイド産物を有機相、疎水相、または水相から回収する、請求項３５に記載の方法。
37. 工業製品または消費者製品を製造する方法であって、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法に従って生産された前記テルペンまたはテルペノイドを前記工業製品または消費者製品に組み込むことを含む、前記方法。
38. 前記工業製品または消費者製品が、着香製品、芳香製品、甘味剤、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または害虫駆除製品である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記工業製品または消費者製品が、食品、飲料、食感改良剤、医薬品、タバコ製品、栄養補助食品、口腔衛生製品、または化粧品である、請求項３７に記載の方法。
40. ＭＥＰ炭素を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する細菌株であって、前記細菌株は、前記ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介して前記ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換し、前記遺伝子改変が、
    （１）ＩｓｐＢの発現または活性を低下させる改変；
    （２）テルペンまたはテルペノイドの生産に使用される条件下で前記ｉｓｃオペロン内の残りの前記遺伝子の発現を誘導するための、前記ｉｓｃＲ遺伝子、及び誘導性または構成的プロモーターのすべてまたは一部の欠失または不活性化；
    （３）ｒｙｈＢの欠失または不活性化；
    （４）ＤＯＸ及び／またはＭＥが約２ｇ／Ｌを超えてまたは約１ｇ／Ｌを超えて蓄積しないような、ＭＥＰ酵素の発現または活性の変更またはバランス調整；
    （５）場合によりｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、及び／またはｉｓｐＦを含むｄｘｒ遺伝子と、ｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨ遺伝子とを含むＭＥＰ経路の補完；
    （６）テルペノイド力価またはＭＥＰ炭素の増加を促すｐｇｉ（グルコース－６－リン酸
    イソメラーゼ）の変異から選択される、前記細菌株。
41. 前記株が、少なくともｄｘｒ遺伝子及びｉｓｐＥ遺伝子によるＭＥＰ経路の補完を含む、請求項４０に記載の細菌株。
42. 前記ｄｘｒ遺伝子が、配列番号４または配列番号８と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項４０または４１に記載の細菌株。
43. 前記ｉｓｐＢ ＲＢＳが改変されている、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の細菌株。
44. 前記ｉｓｐＢのシャイン－ダルガノ（ＳＤ）配列が、ＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣであるか、またはＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣから１もしくは２ヌクレオチドが変更されたＳＤ配列である、請求項４３に記載の細菌株。
45. 前記細菌株が、酵素活性を増加させるように修飾されたＩｓｐＧまたはＩｓｐＨ酵素による補完を含む、請求項４０～４４のいずれか１項に記載の細菌株。
46. 前記細菌株が、Ｖ３０、Ｓ３２、Ｔ３４、Ｎ３５、Ｒ３７、Ｖ５９、Ｖ６１、Ｓ６２、Ｖ６３、Ｌ８３、Ｖ８４、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｐ１３１、Ｉ１３２、Ｉ１３４、Ａ１３８、Ｋ１４３、Ｆ１７６、Ｋ１７７、Ｖ１７８、Ｖ１８０、Ａ１８２、Ｌ２０５、Ｉ２０７、Ａ２１０、Ｇ２１２、Ａ２１３、Ｌ２３６、Ｖ２３８、Ａ２４１、Ａ２４２、Ｄ２４３、Ｒ２５９、Ｓ２６２、Ｒ２６３、Ｉ２６５、Ｎ２６６、Ｆ２６７、Ｉ２６８、Ａ２６９、Ｔ２７２、Ｓ２７４、Ｑ２７６、Ｅ２７７、Ｆ２７８、Ｄ２８９、Ｓ３０１、Ｉ３０２、Ｉ３０３、Ｖ３０６から選択される位置に１つ以上の変異を有するＩｓｐＧ酵素を発現する、請求項４５に記載の細菌株。
47. 前記ＩｓｐＧ酵素が、
    （１）Ｖ３０、Ｓ３２、Ｔ３４、Ｎ３５、Ｒ３７；または
    （２）Ｖ５９、Ｖ６１、Ｓ６２、Ｖ６３、Ｌ８３、Ｖ８４；または
    （３）Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｓ３０１、Ｉ３０２、Ｉ３０３、Ｖ３０６；または
    （４）Ｐ１３１、Ｉ１３２、Ｉ１３４、Ａ１３８、Ｋ１４３；または
    （５）Ｆ１７６、Ｋ１７７、Ｖ１７８、Ｖ１８０、Ａ１８２；または
    （６）Ｌ２０５、Ｉ２０７、Ａ２１０、Ｇ２１２、Ａ２１３；または
    （７）Ｌ２３６、Ｖ２３８、Ａ２４１、Ａ２４２、Ｄ２４３；または
    （８）Ｒ２５９、Ｓ２６２、Ｒ２６３、Ｉ２６５、Ｎ２６６；または
    （９）Ｆ２６７、Ｉ２６８、Ａ２６９、Ｔ２７２、Ｓ２７４、Ｑ２７６、Ｅ２７７、Ｆ２７８、Ｄ２８９から選択される複数の位置に修飾を有する、請求項４６に記載の細菌株。
48. 前記ＩｓｐＧ酵素が、Ｌ２０５Ｖ、Ａ２１０Ｓ、Ｇ２１２Ｔ、及びＡ２１３Ｉから選択される、１つ、２つ、３つ、またはすべての修飾を有する、請求項４７に記載の細菌株。
49. 前記株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項４０～４８のいずれか１項に記載の細菌株。
50. 前記細菌の種が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏ
    ｎａｓ ｐｕｔｉｄａから選択される、請求項４９に記載の細菌株。
51. 前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項５０に記載の細菌株。
52. 前記細菌株が、オペロン／モジュールとして発現させたｄｘｓ及びｉｄｉ；またはオペロンもしくはモジュールとして発現させたｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉのうち、少なくとも１つの追加コピーを有する、請求項４０～５１のいずれか１項に記載の細菌株。
53. 前記テルペンまたはテルペノイド産物が、アビエタジエン、アビエチン酸、アルファ－グアイエン、アルファ－シネンサール、アモルファジエン、アルテミシン酸、ベータ－ビサボレン、ベータ－ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、セラストロール、セロプラストール、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ククルビタン、フォルスコリン、ガスカルジン酸、ゲラニオール、ハスレン、レボピマル酸、リモネン、ルペオール、メントール、メントン、モグロサイド、ヌートカトン、ヌートカトール、オフィオボリンＡ、パチョリ、ピペリトン、ロツンドン、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド、タキサジエン、チモール、ウルソール酸、及びバレンセンから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項４０～５２のいずれか１項に記載の細菌株。

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