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JP2022534813A - Ｃｄ３３改変のための組成物および方法 - Google Patents

Ｃｄ３３改変のための組成物および方法 Download PDF

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JP2022534813A JP2022515977A JP2022515977A JP2022534813A JP 2022534813 A JP2022534813 A JP 2022534813A JP 2022515977 A JP2022515977 A JP 2022515977A JP 2022515977 A JP2022515977 A JP 2022515977A JP 2022534813 A JP2022534813 A JP 2022534813A
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Abstract

本開示のいくつかの側面は、例えば、内在性のCD33遺伝子に改変（例えば挿入または欠失）を有する新規の細胞を提供する。本開示のいくつかの側面は、かかる改変を作るために用いられ得る組成物、例えばgRNAを提供する。

Description

関連出願
本願は2019年5月23日出願のU.S.シリアルNo.：62/852,238および2020年1月16日出願のU.S.シリアルNo.：62/962,127の優先権を主張する。これらのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は配列表を含有する。これはASCIIフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照によってここに組み込まれる。2020年5月21日に作成された前記ASCIIコピーはV0291.70004WO00－Reference Listing.txtと名付けられ、サイズが23,508バイトである。
癌患者が抗CD33癌治療を投与されるときには、「オンターゲットのオフ白血病」効果によって、治療はCD33＋癌細胞のみならず非癌性のCD33＋細胞をもまた枯渇させ得る。造血幹細胞（HSC）および造血前駆細胞（HPC）は典型的にはCD33を発現するので、非癌性のCD33＋細胞の喪失は患者の造血系を枯渇させ得る。この枯渇に対処するために、対象はCD33遺伝子に改変を含むレスキュー細胞（例えばHSCおよび／またはHPC）を投与され得る。これらのCD33を改変された細胞は抗CD33癌治療に対して抵抗性であり得、よって、抗CD33治療の間にまたは後に造血系において再増殖し得る。
本開示は、例えば、内在性のCD33遺伝子に改変（例えば挿入または欠失）を有する新規の細胞を提供する。本開示は、かかる改変を作るために用いられ得る組成物、例えばgRNAをもまた提供する。
態様の列挙
1．第１表の標的ドメイン（例えば、配列番号1～8のいずれかの標的ドメイン）に結合する標的化ドメインを含むgRNA）。
2．配列番号2～4または配列番号6～8のいずれかの標的ドメインに結合する標的化ドメインを含むgRNA。
3．配列番号1の標的ドメインに結合する標的化ドメインを含むgRNA。
4．配列番号5の標的ドメインに結合する標的化ドメインを含むgRNAであって、標的化ドメインが配列番号1を含まない。
5．標的ドメイン配列番号5に結合する標的化ドメインを含むgRNAであって、標的化ドメインが長さが少なくとも21ヌクレオチドである。
6．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが標的ドメインの少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20ヌクレオチドと塩基対形成するかもしくは相補的であり、または標的化ドメインが標的ドメインとの0、1、2、もしくは3つのミスマッチを含む。
7．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号13の少なくとも16（例えば、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26）連続するヌクレオチドを含む。
8．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号13の少なくとも16（例えば、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26）連続するヌクレオチドを含み、標的ドメインの少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチドと塩基対形成するかまたは相補的である。
9．先行する態様のいずれかのgRNAであって、前記標的化ドメインが、標的ドメイン上における切断イベント（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）を、例えば標的ドメインのヌクレオチド位置10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20の直後において提供するように構成される。
10．配列番号1～4のいずれかの配列を含む標的化ドメインを含むgRNA。
11．標的化ドメインを含むgRNAであって、標的化ドメインが配列番号9の配列を含む。
12．標的化ドメインを含むgRNAであって、標的化ドメインが配列番号10の配列を含む。
13．標的化ドメインを含むgRNAであって、標的化ドメインが配列番号11の配列を含む。
14．標的化ドメインを含むgRNAであって、標的化ドメインが配列番号12の配列を含む。
15．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これがシングルガイドRNA（sgRNA）である。
16．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインの長さが16ヌクレオチド以上である。
17．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインの長さが16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチドである。
18．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが、配列番号1～4もしくは9～12のいずれかの配列またはその逆相補物、あるいは前述のいずれかに対して少なくとも90%または95%の同一性を有する配列、あるいは前述のいずれかに対して相対的にせいぜい1、2、または3つの変異を有する配列を含む。
19．態様18のgRNAであって、2つの変異が互いと隣接しない。
20．態様18のgRNAであって、3つの変異のいずれも互いと隣接しない。
21．態様18～20のいずれかのgRNAであって、1、2、または3つの変異が置換である。
22．態様18～20のいずれかのgRNAであって、変異の1つ以上が挿入または欠失である。
23．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号1～4のいずれかの配列を含む。
24．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号1の配列を含む。
25．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号2の配列を含む。
26．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号3の配列を含む。
27．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号4の配列を含む。
28．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号9の配列を含む。
29．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号10の配列を含む。
30．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号11の配列を含む。
31．先行する態様のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが配列番号12の配列を含む。
32．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これが1つ以上の化学修飾（例えば、核酸塩基、糖、またはバックボーン部分への化学修飾）を含む。
33．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これが、1つ以上の2’O－メチルヌクレオチドを例えば本明細書に記載される位置に含む。
34．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これが、1つ以上のホスホロチオエートまたはチオPACE連結部を例えば本明細書に記載される位置に含む。
35．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これがCas9分子に結合する。
36．先行する態様のいずれか1つのgRNAであって、標的化ドメインの長さが約18～23、例えば20ヌクレオチドである。
37．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これがtracrRNAに結合する。
38．態様1～36のいずれかのgRNAであって、これが骨格配列を含む。
39．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これが：
第1の相補性ドメイン；
連結ドメイン；
第1の相補性ドメインに対して相補的である第2の相補性ドメイン；
近位ドメイン；および
尾部ドメイン；
の1つ以上（例えば全て）を含む。
40．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これが第1の相補性ドメインを含む。
41．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これが連結ドメインを含む。
42．態様40または41のgRNAであって、これが、第1の相補性ドメインに対して相補的である第2の相補性ドメインを含む。
43．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これが近位ドメインを含む。
44．先行する態様のいずれかのgRNAであって、これが尾部ドメインを含む。
45．態様39～44のいずれかのgRNAであって、標的化ドメインが：
第1の相補性ドメイン；
連結ドメイン；
第1の相補性ドメインに対して相補的である第2の相補性ドメイン；
近位ドメイン；および
尾部ドメイン；
の1つ以上（例えば全て）に対して非相同である。
46．キットまたは組成物であって：
a）態様1～45のいずれかのgRNA、またはgRNAをコードする核酸、および
b）第2のgRNA、または第2のgRNAをコードする核酸、
を含む。
47．態様46のキットまたは組成物であって、第1のgRNAが、CCCCAGGACTACTCACTCCT（配列番号1）の配列を含む標的化ドメインを含む。
48．態様46または47のキットまたは組成物であって、第2のgRNAが系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
49．態様46～48のいずれかのキットまたは組成物であって、第2のgRNAがCD33以外の系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
50．態様46～49のいずれかのキットまたは組成物であって、第2のgRNAがCLL－1を標的化する（例えば、第2のgRNAが、GGTGGCTATTGTTTGCAGTG（配列番号23）の配列を含む標的化ドメインを含む）。
51．態様46～50のいずれかのキットまたは組成物であって、第2のgRNAがCD123を標的化する（例えば、第2のgRNAが、TTTCTTGAGCTGCAGCTGGG（配列番号24）またはAGTTCCCACATCCTGGTGCG（配列番号25）の配列を含む標的化ドメインを含む）。
52．態様46～51のいずれかのキットまたは組成物であって、第2のgRNAが、TTTCTTGAGCTGCAGCTGGG（配列番号24）の配列を含む標的化ドメインを含む。
53．態様46～52のいずれかのキットまたは組成物であって、第2のgRNAが、AGTTCCCACATCCTGGTGCG（配列番号25）の配列を含む標的化ドメインを含む。
54．態様46～53のいずれかのキットまたは組成物であって、第2のgRNAが、第A表の配列を含む標的化ドメインを含む。
55．態様46～54のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNAが、CCCCAGGACTACTCACTCCT（配列番号1）の配列を含む標的化ドメインを含み、第2のgRNAが、GGTGGCTATTGTTTGCAGTG（配列番号23）の配列を含む標的化ドメインを含む。
56．態様46～54のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNAが、CCCCAGGACTACTCACTCCT（配列番号1）の配列を含む標的化ドメインを含み、第2のgRNAが、TTTCTTGAGCTGCAGCTGGG（配列番号24）の配列を含む標的化ドメインを含む。
57．態様46～54のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNAが、CCCCAGGACTACTCACTCCT（配列番号1）の配列を含む標的化ドメインを含み、第2のgRNAが、AGTTCCCACATCCTGGTGCG（配列番号25）の配列を含む標的化ドメインを含む。
58．態様46～57のいずれかのキットまたは組成物であって、これが、さらに、第3のgRNA、または第3のgRNAをコードする核酸を含む。
59．態様58のキットまたは組成物であって、第3のgRNAが系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
60．態様58のキットまたは組成物であって、第3のgRNAがCD33、CLL－1、またはCD123を標的化する。
61．態様58～53のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNAが、CCCCAGGACTACTCACTCCT（配列番号1）の配列を含む標的化ドメインを含み、第2のgRNAが、TTTCTTGAGCTGCAGCTGGG（配列番号24）の配列を含む標的化ドメインを含み、第3のgRNAが、AGTTCCCACATCCTGGTGCG（配列番号25）の配列を含む標的化ドメインを含む。
62．態様58～60のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNAが、CCCCAGGACTACTCACTCCT（配列番号1）の配列を含む標的化ドメインを含み、第2のgRNAが、TTTCTTGAGCTGCAGCTGGG（配列番号24）の配列を含む標的化ドメインを含み、第3のgRNAが、GGTGGCTATTGTTTGCAGTG（配列番号23）の配列を含む標的化ドメインを含む。
63．態様58～60のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNAが、CCCCAGGACTACTCACTCCT（配列番号1）の配列を含む標的化ドメインを含み、第2のgRNAが、AGTTCCCACATCCTGGTGCG（配列番号25）の配列を含む標的化ドメインを含み、第3のgRNAが、GGTGGCTATTGTTTGCAGTG（配列番号23）の配列を含む標的化ドメインを含む。
64．態様58～63のいずれかのキットまたは組成物であって、これが、さらに、第4のgRNA、または第4のgRNAをコードする核酸を含む。
65．態様64のキットまたは組成物であって、第4のgRNAが系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
66．態様64のキットまたは組成物であって、第4のgRNAがCD33、CLL－1、またはCD123を標的化する。
67．態様64～66のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNAが、CCCCAGGACTACTCACTCCT（配列番号1）の配列を含む標的化ドメインを含み、第2のgRNAが、TTTCTTGAGCTGCAGCTGGG（配列番号24）の配列を含む標的化ドメインを含み、第3のgRNAが、AGTTCCCACATCCTGGTGCG（配列番号25）の配列を含む標的化ドメインを含み、第4のgRNAが、GGTGGCTATTGTTTGCAGTG（配列番号23）の配列を含む標的化ドメインを含む。
68．態様64～67のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNA、第2のgRNA、第3のgRNA、および第4のgRNAが追加混合される。
69．態様64～67のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）のgRNA、第2のgRNA、第3のgRNA、および第4のgRNAが別個の容器中にある。
70．態様46～67のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）および（b）が混合される。
71．態様46～67のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）および（b）が別個の容器中にある。
72．態様46～71のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）の核酸および（b）の核酸が同じ核酸の一部である。
73．態様46～71のいずれかのキットまたは組成物であって、（a）の核酸および（b）の核酸が別個の核酸である。
74．遺伝子操作された造血細胞（例えば造血幹または前駆細胞）であって、これが：
（a）変異を第１表の標的ドメイン（例えば、配列番号1～8のいずれかの標的ドメイン）に；および
（b）第2の変異をCD33以外の系列特異的細胞表面抗原をコードする遺伝子に；
含む。
75．態様74の遺伝子操作された造血細胞であって、（a）の変異が配列番号1の標的ドメインにある。
76．態様74の遺伝子操作された造血細胞であって、（a）の変異が配列番号2の標的ドメインにある。
77．態様74の遺伝子操作された造血細胞であって、（a）の変異が配列番号3の標的ドメインにある。
78．態様74の遺伝子操作された造血細胞であって、（a）の変異が配列番号4の標的ドメインにある。
79．態様74～78のいずれかの遺伝子操作された造血細胞であって、（a）の変異が挿入、欠失、または置換（例えば、1ヌクレオチドバリアント）を含む。
80．態様74～79のいずれかの遺伝子操作された造血細胞であって、これが1ntもしくは2ntの挿入、または1nt、2nt、4nt、もしくは5ntの欠失をCD33に含む。
81．態様74～79のいずれかの遺伝子操作された造血細胞であって、これが、本明細書に記載されるインデル、例えば、本明細書に記載されるgRNA（例えば、gRNA A、gRNA B、gRNA C、またはgRNA Dのいずれか）によって生成するかまたは生成可能なインデルを含む。
82．態様74～79のいずれかの遺伝子操作された造血細胞であって、これが、本明細書に記載されるCRISPRシステム、例えば例1、2、4、5、または6の方法によって生成するかまたは生成可能なインデルを含む。
83．態様79の遺伝子操作された細胞であって、欠失が完全に配列番号1～8のいずれかの標的ドメイン上にある。
84．態様83の遺伝子操作された細胞であって、欠失の長さが1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、または17ヌクレオチドである。
85．態様79の遺伝子操作された細胞であって、欠失が、1つのまたは両方のエンドポイントを配列番号1～8のいずれかの標的ドメインの外側に有する。
86．態様79～85のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、変異がフレームシフトをもたらす。
87．態様79～85のいずれかの遺伝子操作された造血細胞であって、第2の変異が挿入、欠失、または置換（例えば、1ヌクレオチドバリアント）を含む。
88．CRISPR／Cas9システムを用いて造血細胞の幹細胞または前駆細胞のサンプルのCD33の発現を縮減するための、態様1～45のいずれかのgRNAまたは態様39～66のいずれかの組成物もしくはキットの使用。
89．造血細胞の幹細胞または前駆細胞のサンプルのCD33の発現を縮減するためのCRISPR／Cas9システムの使用であって、CRISPR／Cas9システムのgRNAが、態様1～45のいずれかのgRNA、または態様46～73のいずれかの組成物もしくはキットのgRNAである。
90．遺伝子操作された細胞を生成する方法であって：
（i）細胞（例えば造血幹細胞または前駆細胞、例えば野生型造血幹細胞または前駆細胞）を提供することと、
（ii）細胞に（a）態様1～45のいずれかのガイドRNA（gRNA）または態様46～73のいずれかの組成物もしくはキットのgRNA；および（b）gRNAに結合するエンドヌクレアーゼ（例えばCas9分子）を導入することと、
を含み、
それによって、遺伝子操作された細胞を生成する。
91．遺伝子操作された細胞を生成する方法であって：
（i）細胞（例えば造血幹細胞または前駆細胞、例えば野生型造血幹細胞または前駆細胞）を提供することと、
（ii）細胞に（a）態様1～45のいずれかのgRNAまたは態様46～73のいずれかの組成物もしくはキットのgRNA；および（b）gRNAに結合するCas9分子を導入することと、
を含み、
それによって、遺伝子操作された細胞を生成する。
92．態様88～91のいずれかの方法または使用であって、これが、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす。
93．態様88～92のいずれかの方法または使用であって、これが、野生型カウンターパート細胞のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞をもたらす。
94．態様88～93のいずれかの方法または使用であって、これが複数の造血幹細胞または前駆細胞について行われる。
95．態様88～94のいずれかの方法または使用であって、これが、複数の造血幹細胞および複数の造血前駆細胞を含む細胞集団について行われる。
96．態様88～95のいずれかの方法または使用であって、これが態様182～206のいずれかに従って細胞集団を生成する。
97．態様88～96のいずれかの方法であって、（a）および（b）の核酸が1つのベクター上にコードされ、これが細胞に導入される。
98．態様97の方法であって、ベクターがウイルスベクターである。
99．態様98の方法であって、（a）および（b）が、予め形成されたリボ核蛋白質複合体として細胞に導入される。
100．態様99の方法であって、リボ核蛋白質複合体がエレクトロポレーションによって細胞に導入される。
101．態様88～100のいずれかの方法であって、エンドヌクレアーゼ（例えばCas9分子）が、細胞にエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子（例えばmRNA分子またはウイルスベクター、例えばAAV）を送達することによって細胞に導入される。
102．態様88～101のいずれかの方法であって、細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）がCD34＋である。
103．態様88～102のいずれかの方法であって、造血幹細胞または前駆細胞が対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞（PBMC）からである。
104．態様88～103のいずれかの方法であって、対象が造血障害、例えば造血悪性物、例えば白血病、例えばAMLを有する。
105．態様88～104のいずれかの方法であって、対象が癌を有し、癌の細胞がCD33を発現する（例えば、癌細胞の少なくとも複数がCD33を発現する）。
106．態様88～105のいずれかの方法であって、これが、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルを引き起こす変異をもたらす。
107．態様88～106のいずれかの方法または使用であって、これが、野生型カウンターパート細胞と比較して野生型CD33の縮減された発現レベルを引き起こす変異をもたらす。
108．態様88～107のいずれかの方法または使用であって、これが、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を生成する。
109．態様88～108のいずれかの方法または使用であって、これが、野生型カウンターパート細胞と比較して野生型CD33の縮減された発現レベルを有する遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を生成する。
110．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが態様88～109のいずれかの方法によって生成する。
111．態様1～45のいずれかのgRNAをコードする核酸（例えばDNA）。
112．遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）であって、これが変異を第１表の標的ドメイン（例えば、配列番号1～8のいずれかの標的ドメイン）に含み、例えば、変異が遺伝子操作の結果である。
113．遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）であって、これが変異を第１表の標的ドメイン（例えば、配列番号1～8のいずれかの標的ドメイン）の（上流のまたは下流の）100、90、80、70、60、50、40、30、20、または10ヌクレオチド以内に含む。
114．態様113の遺伝子操作された細胞であって、変異が配列番号1、2、または4のいずれかの（上流のまたは下流の）100、90、80、70、60、50、40、30、20、または10ヌクレオチド以内にある。
115．態様113の遺伝子操作された細胞であって、変異が配列番号3の下流の100、90、80、70、60、50、40、30、20、または10ヌクレオチド以内にある。
116．態様113の遺伝子操作された細胞であって、変異が配列番号3の上流の60、50、40、30、20、または10ヌクレオチド以内にある。
117．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号1の標的ドメインに含む。
118．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号1の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
119．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号1の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
120．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号2の標的ドメインに含む。
121．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号2の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
122．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号2の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞のCD33レベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
123．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号3の標的ドメインに含む。
124．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号3の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
125．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号3の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
126．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号4の標的ドメインに含む。
127．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号4の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
128．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号4の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
129．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号5の標的ドメインに含む。
130．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号5の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
131．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号5の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
132．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号6の標的ドメインに含む。
133．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号6の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
134．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号6の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
135．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号7の標的ドメインに含む。
136．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号7の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
137．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号7の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
138．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号8の標的ドメインに含む。
139．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号8の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
140．遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞であって、これが変異を配列番号8の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
141．態様112～140のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、予測されるオフターゲット部位を含み、これが、CD33の遺伝子編集に先立つ部位の配列に対して変異または配列変化を含まない。
142．態様112～141のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、2つの予測されるオフターゲット部位を含み、これらが、CD33の遺伝子編集に先立つ部位の配列に対して変異または配列変化を含まない。
143．態様112～142のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の予測されるオフターゲット部位を含み、これらが、CD33の遺伝子編集に先立つ部位の配列に対して変異または配列変化を含まない。
144．態様112～143のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、いずれかの予測されるオフターゲット部位に、例えば標的ドメインに対して1、2、3、または4つのミスマッチを有するヒトゲノム上のいずれかの部位に、変異を含まない。
145．態様112～144のいずれかのいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、標的ドメインに対して1つのミスマッチを有するヒトゲノム上のいずれかの部位に変異を含まない。
146．態様112～145のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、標的ドメインに対して1または2つのミスマッチを有するヒトゲノム上のいずれかの部位に変異を含まない。
147．態様112～146のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、標的ドメインに対して1、2、または3つのミスマッチを有するヒトゲノム上のいずれかの部位に変異を含まない。
148．態様112～147のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、標的ドメインに対して1、2、3、または4つのミスマッチを有するヒトゲノム上のいずれかの部位に変異を含まない。
149．態様112～148の態様のいずれかのいずれかの遺伝子操作された細胞であって、変異が挿入、欠失、または置換（例えば1ヌクレオチドバリアント）を含む。
150．態様149の遺伝子操作された細胞であって、欠失が完全に配列番号1～8のいずれかの標的ドメイン上にある。
151．態様150の遺伝子操作された細胞であって、欠失の長さが1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、または17ヌクレオチドである。
152．態様149の遺伝子操作された細胞であって、欠失が、1つのまたは両方のエンドポイントを配列番号1～8のいずれかの標的ドメインの外側に有する。
153．態様112～152のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、変異がフレームシフトをもたらす。
154．態様112～153のいずれかの遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）であって、変異が、野生型カウンターパート細胞と比較して野生型CD33の縮減された発現レベルをもたらす（例えば、野生型カウンターパート細胞のレベルの50%、40%、30%、20%、15%、10%、または5%未満）。
155．態様112～153のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、細胞が、野生型カウンターパート細胞と比較して野生型CD33蛋白質の縮減されたレベルを有する（例えば、野生型カウンターパート細胞のレベルの50%、40%、30%、20%、15%、10%、または5%未満）。
156．態様112～155のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これがCD33を発現しない。
157．態様112～156のいずれかの遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）であって、変異がCD33の発現の欠如をもたらす。
158．態様112～157のいずれかの遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）であって、これが、野生型カウンターパート細胞によって発現されるCD33の20%未満を発現する。
159．態様112～158のいずれかの遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）であって、CD33の縮減された発現レベルが、造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、終末分化した）細胞にあり、野生型カウンターパート細胞が、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、終末分化した）細胞である。
160．態様158の遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）であって、造血幹細胞または前駆細胞から分化した細胞が骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である。
161．態様112～160のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これがCD34＋である。
162．態様112～161のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが対象の骨髄細胞または末梢血単核細胞からである。
163．態様162の遺伝子操作された細胞であって、対象が、造血悪性物、例えばAMLを有するヒト患者である。
164．態様162または163の遺伝子操作された細胞であって、対象が癌を有し、癌の細胞がCD33を発現する（例えば、癌細胞の少なくとも複数がCD33を発現する）。
165．態様162の遺伝子操作された細胞であって、対象が健康なヒトドナー（例えば、HLA適合ドナー）である。
166．態様112～165のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、さらに、CRISPRエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターに基づくヌクレアーゼ（TALEN）、もしくはメガヌクレアーゼから選ばれるヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、DNAもしくはRNA）を含み、任意に、ヌクレアーゼがCD33に特異的である。
167．態様112～165のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、さらに、CD33に特異的なgRNA（例えば、シングルガイドRNA）、またはgRNAをコードする核酸を含む。
168．態様167の遺伝子操作された細胞であって、gRNAが、本明細書に記載されるgRNA、例えば態様1～45のいずれかのgRNAである。
169．態様112～168のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、細胞をCRISPRエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターに基づくヌクレアーゼ（TALEN）、もしくはメガヌクレアーゼから選ばれるヌクレアーゼと接触させることを含むプロセスによって作られている（例えば、細胞をヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸と接触させることによる）。
170．態様112～168のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、これが、細胞を、例えば機能ドメイン、例えばデアミナーゼまたはデメチラーゼドメインに融合されたニッカーゼまたは触媒的に不活性なCas9分子（dCas9）と接触させることを含むプロセスによって作られている（例えば、細胞をヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸と接触させることによる）。
171．態様112～170のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、CD33の両方のコピーが変異体である。
172．態様171の遺伝子操作された細胞であって、CD33の両方のコピーが同じ変異を有する。
173．態様171の遺伝子操作された細胞であって、CD33のコピー同士が異なる変異を有する。
174．態様112～171のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、第1の変異を有するCD33の第1のコピーと第2の変異を有するCD33の第2のコピーとを含み、第1のおよび第2の変異が異なる。
175．態様174の遺伝子操作された細胞であって、CD33の第1のコピーが第1の欠失を含む。
176．態様174または175の遺伝子操作された細胞であって、CD33の第2のコピーが第2の欠失を含む。
177．態様174～176のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、第1のおよび第2の欠失がオーバーラップする。
178．態様174～177のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、第1の欠失のエンドポイントが第2の欠失上にある。
179．態様174～178のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、第1の欠失の両方のエンドポイントが第2の欠失上にある。
180．態様174～176のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、第1のおよび第2の欠失がエンドポイントを共有する。
181．態様174～176のいずれかの遺伝子操作された細胞であって、第1のおよび第2の変異がそれぞれ独立して：1ntもしくは2ntの挿入または1nt、2nt、4nt、もしくは5ntの欠失から選択される。
182．細胞集団であって、いずれかの態様112～181の遺伝子操作された造血幹または前駆細胞の複数を含む（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、またはそれらの組み合わせを含む）。
183．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号1の標的ドメインに含む。
184．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号1の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
185．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号1の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
186．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号2の標的ドメインに含む。
187．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号2の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
188．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号2の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
189．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号3の標的ドメインに含む。
190．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号3の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
191．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号3の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
192．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号4の標的ドメインに含む。
193．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号4の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
194．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号4の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
195．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号5の標的ドメインに含む。
196．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号5の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
197．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号5の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
198．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号6の標的ドメインに含む。
199．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号6の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
200．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号6の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
201．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号7の標的ドメインに含む。
202．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号7の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
203．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号7の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
204．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号8の標的ドメインに含む。
205．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号8の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団と比較してCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
206．細胞集団であって、複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含み、これらが変異を配列番号8の標的ドメインに含み、変異が、野生型カウンターパート細胞集団のCD33のレベルの20%未満であるCD33の縮減された発現レベルをもたらす。
207．態様182～206のいずれかの細胞集団であって、細胞集団が、CD33野生型造血幹細胞または前駆細胞に由来する同じ分化した細胞型によって発現されるCD33のレベルに対して縮減されているレベルでCD33を発現する細胞型に分化し得る。
208．態様182～207のいずれかの細胞集団であって、その子孫である骨髄系前駆細胞が、CD33野生型造血幹細胞または前駆細胞の子孫である骨髄系前駆細胞と比較してCD33レベルに欠損があるようにして、造血幹細胞または前駆細胞が操作されている。
209．態様182～208のいずれかの細胞集団であって、その子孫である骨髄系細胞（例えば、終末分化した骨髄系細胞）が、CD33野生型造血幹細胞または前駆細胞の子孫である骨髄系細胞（例えば、終末分化した骨髄系細胞）と比較してCD33レベルに欠損があるようにして、造血幹細胞または前駆細胞が操作されている。
210．態様182～209のいずれかの細胞集団であって、これが、さらに、1つ以上の操作されていないCD33遺伝子を含む1つ以上の細胞を含む。
211．態様182～210のいずれかの細胞集団であって、これが、さらに、CD33についてホモ接合の野生型である1つ以上の細胞を含む。
212．態様182～211のいずれかの細胞集団であって、集団の細胞の約0～1%、1～2%、2～5%、5～10%、10～15%、または15～20%がCD33についてホモ接合の野生型であり、例えば、CD33についてホモ接合の野生型である造血幹細胞または前駆細胞である。
213．態様182～212のいずれかの細胞集団であって、これが、さらに、CD33についてヘテロ接合の野生型である1つ以上の細胞を含む。
214．態様182～213のいずれかの細胞集団であって、集団の細胞の約0～1%、1～2%、2～5%、5～10%、10～15%、または15～20%がCD33についてヘテロ接合の野生型であり、例えば、CD33の1つの野生型コピーおよびCD33の1つの変異体コピーを含む造血幹細胞または前駆細胞である。
215．態様182～214のいずれかの細胞集団であって、集団のCD33のコピーの少なくとも40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%が変異体である。
216．態様182～215のいずれかの細胞集団であって、これが複数の異なるCD33変異を含み、例えば、これが少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の異なる変異を含む。
217．態様182～216のいずれかの細胞集団であって、これが少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の異なる変異を含む。
218．態様182～216のいずれかの細胞集団であって、これが2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の異なる挿入を含む。
219．態様182～218のいずれかの細胞集団であって、これが複数の挿入および複数の欠失を含む。
220．態様182～219のいずれかの細胞集団であって、これが、野生型カウンターパート細胞集団によって発現されるCD33の20%未満を発現する。
221．態様182～220のいずれかの細胞集団であって、集団の細胞の少なくとも40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%が、例えばフローサイトメトリーアッセイを用いて決定されるとCD33を発現せず、例えば、細胞が例えば例1に従うアッセイを用いて抗CD33抗体（例えば、抗体P67.7）と接触させられる。
222．態様182～221のいずれかの細胞集団であって、CD33の縮減された発現レベルが、造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、終末分化した）細胞にあり、野生型カウンターパート細胞が、野生型造血幹細胞または前駆細胞から分化した（例えば、終末分化した）細胞である。
223．態様222の細胞集団であって、造血幹細胞または前駆細胞から分化した細胞が骨髄芽球、単芽球、単球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞である。
224．態様182～223のいずれかの細胞集団であって、集団の細胞の少なくとも80%、85%、90%、または95%が生存可能な細胞である。
225．態様182～224のいずれかの細胞集団であって、集団の遺伝子操作された細胞の1つ以上（例えば、集団の遺伝子操作された細胞の少なくとも10%、20%、30%、または40%）がLT－HSCである。
226．態様182～225のいずれかの細胞集団であって、例えば、例えば例6のアッセイに従ってフローサイトメトリーによって決定されると、集団の遺伝子操作された細胞の1つ以上（例えば、集団の遺伝子操作された細胞の少なくとも10%、20%、30%、または40%）が、CD38－CD34＋CD45RA－CD90＋CD49f＋である。
227．態様182～226のいずれかの細胞集団であって、これが、対象に投与されるときに、例えば投与後の8、12、または16週にアッセイされるときに、対象においてCD45＋細胞を生成する。
228．態様227の細胞集団であって、これが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成するCD45＋細胞のレベルと同等のhCD45＋細胞のレベルを生成する。
229．態様227または228の細胞集団であって、これが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成するhCD45＋細胞のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%であるCD45＋細胞のレベルを生成する。
230．態様182～229のいずれかの細胞集団であって、これが、対象に投与されるときに、例えば投与後の8、12、または16週にアッセイされるときに、対象においてCD14＋細胞を生成する。
231．態様230の細胞集団であって、これが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成するCD14＋細胞のレベルと同等のhCD45＋細胞のレベルを生成する。
232．態様230または231の細胞集団であって、これが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成するhCD14＋細胞のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%であるCD45＋細胞のレベルを生成する。
233．態様182～232のいずれかの細胞集団であって、これが、対象に投与されるときに、例えば投与後の8、12、または16週にアッセイされるときに、対象においてCD11b＋細胞を生成する。
234．態様233の細胞集団であって、これが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成するCD11b＋細胞のレベルと同等のhCD45＋細胞のレベルを生成する。
235．態様233または235の細胞集団であって、これが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成するhCD11b＋細胞のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%であるCD45＋細胞のレベルを生成する。
236．態様182～235のいずれかの細胞集団であって、これが、対象に投与されるときに、例えば投与後の8、12、または16週にアッセイされるときに、対象においてCD19＋細胞を生成する。
237．態様236の細胞集団であって、これが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成するCD19＋細胞のレベルと同等のhCD45＋細胞のレベルを生成する。
238．態様236または237の細胞集団であって、これが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成するhCD19＋細胞のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%であるCD45＋細胞のレベルを生成する。
239．態様182～238のいずれかの細胞集団であって、これが、対象に投与されるときに、例えば投与後の8、12、または16週にアッセイされるときに、リンパ系細胞、単球、顆粒球、もしくは好中球、またはそれらのいずれかの組み合わせを対象において生成する。
240．態様239の細胞集団であって、これが、リンパ系細胞、単球、顆粒球、もしくは好中球、またはそれらのいずれかの組み合わせの、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルと同等のレベルを生成する。
241．態様239または240の細胞集団であって、これが、リンパ系細胞、単球、顆粒球、もしくは好中球、またはそれらのいずれかの組み合わせの、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%であるレベルを生成する。
242．態様227～241のいずれかの細胞集団であって、生成する細胞が、対象から得られた血液サンプル、骨髄サンプル、または脾臓サンプルから検出される。
243．態様182～242のいずれかの細胞集団であって、これが、対象に投与されるときに、少なくとも8、12、または16週に渡って対象において存続する。
244．態様182～243のいずれかの細胞集団であって、これが対象に投与されるときに多系列造血再構築を提供する。
245．態様182～244のいずれかの細胞集団であって、これが対象に投与されるときにコミットメントしていない前駆細胞を生成し、任意に、コミットメントしていない前駆細胞のレベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルと同等であり、任意に、レベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%である。
246．態様182～244のいずれかの細胞集団であって、これが対象に投与されるときにhCD34＋hCD38－細胞を生成し、任意に、コミットメントしていない前駆細胞のレベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルと同等であり、任意に、レベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%である。
247．態様182～246のいずれかの細胞集団であって、これが対象に投与されるときにコミットメントした前駆細胞を生成し、任意に、コミットメントしていない前駆細胞のレベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルと同等であり、任意に、レベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%である。
248．態様182～247のいずれかの細胞集団であって、これが対象に投与されるときにhCD34＋hCD38＋細胞を生成し、任意に、コミットメントしていない前駆細胞のレベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルと同等であり、任意に、レベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%である。
249．態様182～248のいずれかの細胞集団であって、これが対象に投与されるときにCD3＋T細胞を生成し、任意に、コミットメントしていない前駆細胞のレベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルと同等であり、任意に、レベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%である。
250．態様182～249のいずれかの細胞集団であって、これが対象に投与されるときにCD123＋細胞を生成し、任意に、コミットメントしていない前駆細胞のレベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルと同等であり、任意に、レベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%である。
251．態様182～250のいずれかの細胞集団であって、これが対象に投与されるときにCD10＋細胞を生成し、任意に、コミットメントしていない前駆細胞のレベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルと同等であり、任意に、レベルが、CD33野生型であるさもなければ類似の細胞集団によって生成する前記細胞型のレベルの少なくとも70%、80%、85%、90%、または95%である。
252．態様182～251のいずれかの細胞集団であって、これが造血幹細胞および造血前駆細胞を含む。
253．医薬組成物であって、態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む。
254．医薬組成物であって、態様182～251のいずれかの細胞集団を含む。
255．混合物、例えば反応混合物であって：
a）態様1～45のいずれかのgRNA、または態様46～73のいずれかの組成物もしくはキットのgRNA；
b）細胞、例えば造血細胞、例えばHSCまたはHPC、例えば態様112～181のいずれかの遺伝子操作された細胞；
のいずれか2つまたは全てを含む。
256．態様255の混合物、例えば反応混合物であって、細胞が、野生型細胞またはCD33に変異を有する細胞である。
257．キットであって：
a）態様1～45のいずれかのgRNA、または態様46～73のいずれかの組成物もしくはキットのgRNA；
b）細胞、例えば造血細胞、例えばHSCまたはHPC、例えば態様112～181のいずれかの遺伝子操作された細胞；
c）Cas9分子；および
d）CD33を標的化する薬剤、例えば本明細書に記載される薬剤；
のいずれか2つ以上（例えば、3つまたは全て）を含む。
258．態様253のキットであって、これが（a）および（b）、（a）および（c）、（a）およびd）、（b）および（c）、（b）および（d）、または（c）および（d）を含む。
259．態様112～181のいずれかの遺伝子操作された細胞（例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞）または態様182～251のいずれかの細胞集団を作る方法であって、これが：
（i）細胞（例えば造血幹細胞または前駆細胞、例えば野生型造血幹細胞または前駆細胞）を提供することと、
（ii）細胞に標的ドメインを切断するヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼ）を導入することと、
を含み、
それによって、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を生成する。
260．態様259の方法であって、（ii）が、細胞に、標的ドメインに結合するgRNA（例えば、態様1～45のいずれかのgRNA）およびgRNAに結合するエンドヌクレアーゼを導入することを含む。
261．態様259の方法であって、エンドヌクレアーゼがZFN、TALEN、またはメガヌクレアーゼである。
262．HSC、HPC、またはHSPCを対象に供給する方法であって、対象に、態様112～181の複数の細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団を投与することを含む。
263．それを必要とする対象に、態様112～181の複数の細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団を投与することを含む、方法。
264．態様262または263の方法であって、対象が癌を有し、癌の細胞がCD33を発現する（例えば、癌細胞の少なくとも複数がCD33を発現する）。
265．態様262～264のいずれかの方法であって、これがさらに対象に有効量のCD33を標的化する薬剤を投与することを含み、薬剤が、CD33に結合する抗原結合断片を含む。
266．態様265の方法であって、CD33を標的化する薬剤が、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する免疫細胞であり、これがCD33に結合する抗原結合断片を含む。
267．造血障害を処置することへの使用のための、態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団であって、処置することが、それを必要とする対象に有効量の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団を投与することを含み、さらに、対象に有効量のCD33を標的化する薬剤を投与することを含み、薬剤が、CD33に結合する抗原結合断片を含む。
268．CD33を標的化する薬剤であって、薬剤が、造血障害を処置することへの使用のためのCD33に結合する抗原結合断片を含み、処置することが、それを必要とする対象に有効量のCD33を標的化する薬剤を投与することを含み、さらに、対象に有効量の態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団を投与することを含む。
269．態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団とCD33を標的化する薬剤との組み合わせであって、薬剤が、造血障害を処置することへの使用のためのCD33に結合する抗原結合断片を含み、処置することが、それを必要とする対象に、有効量の遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団とCD33に結合する薬剤とを投与することを含む。
270．癌免疫療法への使用のための、態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団。
275．癌免疫療法への使用のための、態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団であって、対象が造血障害を有する。
276．造血障害を有する対象の造血再増殖への使用のための、態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団。
277．造血障害を処置する方法への使用のための態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団であって、それによって、本明細書に記載される遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本明細書に記載される細胞集団が対象において再増殖する。
278．免疫療法におけるCD33を標的化する薬剤の細胞傷害性効果を縮減することへの使用のための、態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団。
275．CD33を標的化する薬剤を用いる免疫療法方法への使用のための、態様112～181のいずれかの遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または態様182～251のいずれかの細胞集団であって、それによって、本明細書に記載される遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または本明細書に記載される細胞集団が、CD33を標的化する薬剤の細胞傷害性効果を縮減する。
276．態様262～275のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団が、CD33を標的化する薬剤に付随して投与される。
277．態様262～275のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団が、CD33を標的化する薬剤と同時に投与される。
278．態様262～275のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、CD33を標的化する薬剤が、遺伝子操作された造血幹細胞もしくは前駆細胞または細胞集団に先立って投与される。
279．態様262～278のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、免疫細胞がT細胞である。
280．態様262～279のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、免疫細胞、遺伝子操作された造血幹細胞および／もしくは前駆細胞、または両方が同種である。
281．態様262～279のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、免疫細胞、遺伝子操作された造血幹細胞および／もしくは前駆細胞、または両方が自家である。
282．態様262～281のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、キメラ受容体上の抗原結合断片が、ヒトCD33に特異的に結合する一本鎖抗体断片（scFv）である。
283．態様262～282のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、造血障害が癌であり、癌の少なくとも複数の癌細胞がCD33を発現する。
284．態様262～283のいずれかの方法、細胞、薬剤、または組み合わせであって、対象が、造血悪性物、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病または慢性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病）、または多発性骨髄腫から選ばれる造血悪性物を有する。
上の概要は、限定しない様式で、本明細書において開示されるテクノロジーの態様、利点、特徴、および使用のいくつかを例解することを意味されている。本明細書において開示されるテクノロジーの他の態様、利点、特徴、および使用は、詳細な記載、図面、例、および請求項から明らかであろう。
図1は、TIDE分析によって測定された異なるCD33 gRNAの遺伝子編集効率を示すグラフである。x軸はアッセイされたgRNAを指示し、y軸は挿入または欠失をgRNA標的座位に有する細胞のパーセンテージを指示する。各gRNAの4つのバーはHSCの4人の異なるドナーを指示する。 図2は、FACS分析によって測定された異なるCD33 gRNAの遺伝子編集効率を示すグラフである。x軸はアッセイされたgRNAを指示し、y軸はCD33表面発現について陽性である細胞のパーセンテージを指示する。各gRNAの4つのバーはHSCの4人の異なるドナーを指示する。 図3は、TIDE分析によって測定された異なるCD33 gRNAの遺伝子編集効率を示すグラフである。x軸はアッセイされたgRNAを指示し、y軸は挿入または欠失をgRNA標的座位に有する細胞のパーセンテージを指示する。各gRNAの4つのバーはHSCの4人の異なるドナーを指示する。 図4は、FACS分析によって測定された異なるCD33 gRNAの遺伝子編集効率を示すグラフである。x軸はアッセイされたgRNAを指示し、y軸はCD33表面発現について陽性である細胞のパーセンテージを指示する。各gRNAの3つのバーはHSCの3人の異なるドナーを指示する。 図5A～5Dは、CD19およびCD33両方の効率的な多重ゲノム編集を示すTIDEアッセイの結果を示すダイアグラムを包含する。5A：NALM－6細胞におけるCD19、CD33、およびCD19＋CD33のゲノム編集を示すチャート。5B：HSCにおけるCD19、CD33、およびCD19＋CD33のゲノム編集を示すチャート。5C：HL－60細胞におけるCD19、CD33、およびCD19＋CD33のゲノム編集を示すチャート。5D：NALM－6細胞におけるCD19、CD33、ならびにCD19およびCD33両方のゲノム編集を示すチャート。 図6A～6Cは、単一のRNAヌクレオフェクションと比較して、HSCおよび細胞株の生存能に対するCD19およびCD33両方の多重ゲノム編集の効果を示すヌクレオフェクションアッセイの結果を示すダイアグラムを包含する。ヌクレオフェクションに用いられたgRNAがX軸上に指示されている。6A：ゲノム編集後のHSC細胞のパーセント生存能を示すチャート。6B：ゲノム編集後のNalm－6細胞のパーセント生存能を示すチャート。左から右に、3つのバーの各セットはゼロ、24h、および48hに対応する。6C：ゲノム編集後のHL－60細胞のパーセント生存能を示すチャート。左から右に、4つのバーの各セットはゼロ、48h、96h、および7dに対応する。 図7はAML細胞株上の標的発現を示す。MOLM－13およびTHP－1細胞ならびに未染色のコントロールのCD33、CD123、ならびにCLL1の発現がフローサイトメトリー分析によって決定された。X軸は抗体染色の強度を指示し、Y軸は細胞数に対応する。 図8は、CD33およびCD123を改変されたMOLM－13細胞を示す。野生型（WT）、CD33－/－、CD123－/－、およびCD33－/－CD123－/－MOLM－13細胞におけるCD33およびCD123の発現がフローサイトメトリーによって評価された。CD33－/－またはCD123－/－MOLM－13細胞の作出のためには、WT MOLM－13細胞がCD33またはCD123標的化RNPによってエレクトロポレーションされ、次にCD33またはCD123陰性細胞のフローサイトメトリーソーティングがされた。CD33－/－CD123－/－MOLM－13細胞は、CD33－/－細胞をCD123標的化RNPによってエレクトロポレーションすることによって作出され、CD123陰性集団についてソーティングされた。X軸は抗体染色の強度を指示し、Y軸は細胞数に対応する。 図9はCD33およびCD123 CAR－Tのインビトロ細胞傷害性アッセイを示す。抗CD33 CAR－Tおよび抗CD123 CAR－Tが野生型（WT）、CD33－/－、CD123－/－、およびCD33－/－CD123－/－MOLM－13細胞とインキュベーションされ、細胞傷害性がフローサイトメトリーによって評価された。形質導入されていないT細胞がモックCAR－Tコントロールとして用いられた。CARプール群は抗CD33および抗CD123 CAR－T細胞の1：1のプールされた組み合わせからなった。スチューデントのt検定が用いられた。ns=有意ではない；*P＜0.05；**P＜0.01。Y軸は特異的な殺細胞のパーセンテージを指示する。 図10はCD33およびCLL1を改変されたHL－60細胞を示す。野生型（WT）、CD33－/－、CLL1－/－、およびCD33－/－CLL1－/－HL－60細胞におけるCD33およびCLL1の発現がフローサイトメトリーによって評価された。CD33－/－またはCLL1－/－HL－60細胞の作出のためには、WT HL－60細胞がCD33またはCLL1標的化RNPによってエレクトロポレーションされ、次にCD33またはCLL1陰性細胞のフローサイトメトリーソーティングがされた。CD33－/－CLL1－/－HL－60細胞は、CD33－/－細胞をCLL1標的化RNPによってエレクトロポレーションすることによって作出され、CLL1陰性集団についてソーティングされた。X軸は抗体染色の強度を指示し、Y軸は細胞数に対応する。 図11はCD33およびCLL1 CAR－Tのインビトロ細胞傷害性アッセイを示す。抗CD33 CAR－Tおよび抗CLL1 CAR－Tが野生型（WT）、CD33－/－、CLL1－/－、およびCD33－/－CLL1－/－HL－60細胞とインキュベーションされ、細胞傷害性がフローサイトメトリーによって評価された。形質導入されていないT細胞がモックCAR－Tコントロールとして用いられた。CARプール群は抗CD33および抗CLL－1 CAR－T細胞の1：1のプールされた組み合わせからなった。スチューデントのt検定が用いられた。ns=有意ではない；*P＜0.05；**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001。Y軸は特異的な殺細胞のパーセンテージを指示する。 図12はCD34＋細胞の遺伝子編集効率を示す。ヒトCD34＋細胞が、Cas9蛋白質およびCD33、CD123、またはCLL1標的化gRNAによって単独でまたは組み合わせでどちらかでエレクトロポレーションされた。CD33、CD123、またはCLL1座位の編集効率がSangerシーケンシングおよびTIDE分析によって決定された。Y軸は編集効率を指示する（TIDEによる%）。 図13A～13Cは遺伝子編集されたCD34＋細胞のインビトロコロニー形成を示す。コントロールまたはCD33、CD123、CLL－1を改変されたCD34＋細胞がエレクトロポレーションの2日後にMethocultにプレーティングされ、14日後にコロニー形成についてスコア付けされた。BFU－E：赤芽球バースト形成細胞；CFU－GM：顆粒球マクロファージコロニー形成細胞；CFU－GEMM：多能性骨髄系前駆細胞（顆粒球、赤血球、単球、および巨核球を作出する）。スチューデントのt検定が用いられた。 図14A～14Cは、ゲムツズマブオゾガマイシン（GO）による処置後の種々の時間におけるCD33 gRNA Aによって編集されたCD34＋HSCの集団の分析を示すダイアグラムおよび表を包含する。14A：ゲムツズマブオゾガマイシンによる処置後のCD33編集の分析を示す写真。CD33 gRNA Aを用いて編集されたサンプル中の編集された細胞（「KO」）のパーセンテージがTIDE分析によって評価された。14B：指示されている通り経時的なゲムツズマブオゾガマイシンの不在下における指示されている細胞集団中のCD14＋細胞（骨髄系分化）のパーセントを示すチャート。14C：指示されている通り経時的なゲムツズマブオゾガマイシンによる処置後の指示されている細胞集団中のCD14＋細胞（骨髄系分化）のパーセントを示すチャート。 図15は、エレクトロポレーションおよび編集後の指示されている時間に渡ってのgRNA A、gRNA B、gRNA O、またはgCtrl（コントロール）によって編集されたCD33KO mPB CD34＋HSPCの生存能を示す。 図16は、CD33KO細胞またはコントロール細胞を生着させたNSGマウスの血液、脾臓、および骨髄から単離された細胞を分析するために用いられたフローサイトメトリー分析およびゲーティングプロトコールの模式図である。 図17A～17Dは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の第8週における血液のμL当たりのそれぞれhCD33＋細胞、hCD45＋細胞、hCD14＋細胞、またはCD11b＋細胞の定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図18A～18Cは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の血液中のそれぞれ第8、12、または16週におけるhCD45＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図19A～19Cは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の血液中のそれぞれ第8、12、または16週におけるhCD33＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図20A～20Cは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の血液中のそれぞれ第8、12、または16週におけるhCD19＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図21A～21Cは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の血液中のそれぞれ第8、12、または16週におけるhCD14＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図22A～22Cは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の血液中のそれぞれ第8、12、または16週におけるhCD11b＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図23A～23Cは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の血液中のそれぞれ第8、12、または16週におけるCD33＋CD14＋（左のグラフ）またはCD33KO由来単球（hCD33－CD14＋）（右のグラフ）のパーセントの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図24A～24Bは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の第16週における骨髄のそれぞれhCD45＋細胞またはhCD33＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図25A～25Dは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の骨髄の第16週におけるそれぞれhCD19＋細胞、hCD14＋細胞、hCD11b＋細胞、またはhCD3＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図26A～26Bは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の第16週における骨髄のそれぞれhCD33＋CD14＋細胞またはhCD33－CD14＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNAのコントロール：O、A、またはB）。 図27A～Dは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の骨髄の第16週における、それぞれhCD34＋細胞、hCD38＋細胞、hCD34＋38－のコミットメントしていない前駆細胞、またはhCD34＋CD38＋のコミットメントした前駆細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図28Aは、次のgRNAによって編集されたCD33KO細胞を投与されたマウスの編集された細胞のパーセンテージを実証する：gRNA O（左パネル）、gRNA A（中央のパネル）、またはgRNA B（右パネル）。図28B～28Dは、CD33KO細胞を作出することに用いられた各gRNA（それぞれgRNA O、gRNA A、およびgRNA B）について、単離された骨髄細胞において観察された異なる編集イベントに相当する上位5つのインデル種を実証する。gRNA OのX軸上の左から右に5つのインデル種は：－1bp、－2bp、＋1bp、－2bp、および－5bpである。gRNA AのX軸上の左から右に5つのインデル種は：－1bp、＋1bp、－1bp、－3bp、および－2bpである。gRNA AのX軸上の左から右に5つのインデル種は：＋1bp、－3bp、－1bp、－2bp、および－1bpである。 図29A～29Fは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の第16週における脾臓のそれぞれhCD45＋細胞、hCD33＋細胞、hCD14＋細胞、hCD11b＋細胞、hCD19＋細胞、またはhCD3＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図30A～30Cは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の第16週における血液中のそれぞれhCD11b＋細胞、hCD33＋CD11b＋細胞、またはhCD33－CD11b＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図31A～31Cは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の第16週における骨髄中のそれぞれhCD11b＋細胞、hCD33＋CD11b＋細胞、またはhCD33－CD11b＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。 図32Aは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の第16週における血液中のhCD123＋細胞のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNAのコントロール、O、A、またはB）。図32Bは、コントロール細胞または指示されているgRNAによって編集されたCD33KO細胞によるマウスの生着後の第16週における骨髄中のhCD123＋細胞（左）またはhCD10＋細胞（右）のパーセンテージの定量を示す（X軸上の左から右にgRNA：コントロール、O、A、またはB）。
定義
標的ドメインとのgRNA相互作用を参照して本明細書において用いられる用語「結合する」は、gRNA分子および標的ドメインが複合体を形成することを言う。複合体は、二重鎖構造を形成する2つのストランド、または多重鎖複合体を形成する3つ以上のストランドを含み得る。結合は、より大規模なプロセス、例えばCasエンドヌクレアーゼによる標的ドメインの切断におけるあるステップであり得る。いくつかの態様では、gRNAは完璧な相補性によって標的ドメインに結合し、他の態様では、gRNAは部分的な相補性によって、例えば1つ以上のミスマッチによって標的ドメインに結合する。いくつかの態様では、gRNAが標的ドメインに結合するときには、gRNAの全長の標的化ドメインが標的化ドメインと塩基対形成する。他の態様では、標的ドメインのある部分のみおよび／または標的化ドメインのある部分のみが他方と塩基対形成する。ある態様では、相互作用は、標的ドメインによって媒介される切断イベントを媒介するために十分である。
その用語が本明細書において用いられる「Cas9分子」は、gRNAと相互作用し得、gRNAと協力して、標的ドメインを含む部位にホーミングまたは局在し得る分子またはポリペプチドを言う。Cas9分子は、天然に存在するCas9分子、および例えば天然に存在するCas9分子とは少なくとも1アミノ酸残基だけ異なる操作、変更、または改変されたCas9分子を包含する。
用語「gRNA」および「ガイドRNA」は一貫して交換可能に用いられ、標的核酸へのgRNA／Cas9分子複合体の特異的標的化またはホーミングを促進する核酸を言う。gRNAは、場合によっては本明細書においてはsgRNAと言われる単分子（単一のRNA分子を有する）、またはモジュラー（1つよりも多くの、典型的には2つの別個のRNA分子を含む）であり得る。gRNAはホスト細胞のゲノム上の標的ドメインに結合し得る。gRNA（例えば、その標的化ドメイン）は標的ドメインに対して部分的にまたは完全に相補的であり得る。gRNAは、gRNA配列に（例えば、gRNA配列の標的化ドメインによって）結合される標的ドメインへとCas9分子をリクルートする「骨格配列」（例えばtracrRNA配列）をもまた含み得る。骨格配列は少なくとも1つのステムループ構造を含み得、エンドヌクレアーゼをリクルートする。例示的な骨格配列は例えばJinek, et al. Science (2012) 337(6096): 816－821、Ran, et al. Nature Protocols (2013) 8: 2281－2308、PCT出願No.WO2014/093694、およびPCT出願No.WO2013/176772に見出され得る。
用語「変異」は、本明細書においては、参照配列、例えば対応する野生型核酸と比較して核酸の遺伝子変化（例えば、挿入、欠失、または置換）を言うために用いられる。いくつかの態様では、遺伝子の変異は遺伝子によって生成する蛋白質を非標的化する。いくつかの態様では、非標的化されたCD33蛋白質は、CD33を標的化する薬剤によって結合されないか、またはより低いレベルで結合される。
gRNAの「標的化ドメイン」は標的核酸上の「標的ドメイン」に対して相補的である。gRNAのコアドメインに対して相補的なヌクレオチド配列を含む標的核酸のストランドは、本明細書においては標的核酸の「相補ストランド」と言われる。標的化ドメインの選択についてのガイダンスは例えばFu Y et al, Nat Biotechnol 2014（doi：10.1038/nbt.2808）およびSternberg SH et al., Nature 2014（doi：10.1038/nature13011）に見出され得る。
ヌクレアーゼ
いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞（例えば、HSCまたはHPC）は本明細書に記載されるヌクレアーゼを用いて作られる。例示的なヌクレアーゼは、Cas分子（例えば、Cas9またはCas12a）、TALEN、ZFN、およびメガヌクレアーゼを包含する。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは本明細書に記載されるCD33 gRNAとの組み合わせで用いられる（例えば、第２表に従う）。
Cas9分子
いくつかの態様では、本明細書に記載されるCD33 gRNAはCas9分子と複合体化する。種々のCas9分子が用いられ得る。いくつかの態様では、gRNA／Cas9分子複合体をCD33上の標的ドメインへと標的化するための所望のPAM特異性を有するCas9分子が選択される。いくつかの態様では、細胞を遺伝子操作することは、1つ以上の（例えば、1、2、3、またはより多くの）Cas9分子を細胞に導入することをもまた含む。
種々の種のCas9分子が本明細書に記載される方法および組成物に用いられ得る。いくつかの態様では、Cas9分子はS. pyogenes（SpCas9）、S. aureus（SaCas9）、またはS. thermophilusのものであるか、またはそれに由来する。追加の好適なCas9分子は、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis（NmCas9）、Acidovorax avenae、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus succinogenes、Actinobacillus suis、Actinomyces sp.、cycliphilus denitrificans、Aminomonas paucivorans、Bacillus cereus、Bacillus smithii、Bacillus thuringiensis、Bacteroides sp.、Blastopirellula marina、Bradyrhizobium sp.、Brevibacillus laterosporus、Campylobacter coli、Campylobacter jejuni（CjCas9)、Campylobacter lari、Candidatus Puniceispirillum、Clostridium cellulolyticum、Clostridium perfringens、Corynebacterium accolens、Corynebacterium diphtheria、Corynebacterium matruchotii、Dinoroseobacter shibae、Eubacterium dolichum、gamma proteobacterium、Gluconacetobacter diazotrophicus、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus sputorum、Helicobacter canadensis、Helicobacter cinaedi、Helicobacter mustelae、Ilyobacter polytropus、Kingella kingae、Lactobacillus crispatus、Listeria ivanovii、Listeria monocytogenes、Listeriaceae bacterium、Methylocystis sp.、Methylosinus trichosporium、Mobiluncus mulieris、Neisseria bacilliformis、Neisseria cinerea、Neisseria flavescens、Neisseria lactamica、Neisseria meningitidis、Neisseria sp.、Neisseria wadsworthii、Nitrosomonas sp.、Parvibaculum lavamentivorans、Pasteurella multocida、Phascolarctobacterium succinatutens、Ralstonia syzygii、Rhodopseudomonas palustris、Rhodovulum sp.、Simonsiella muelleri、Sphingomonas sp.、Sporolactobacillus vineae、Staphylococcus lugdunensis、Streptococcus sp.、Subdoligranulum sp.、Tistrella mobilis、Treponema sp.、またはVerminephrobacter eiseniaeのものを包含するか、またはそれに由来する。
いくつかの態様では、Cas9分子は天然に存在するCas9分子である。いくつかの態様では、Cas9分子は、例えば、参照配列、例えば最も類似の天然に存在するCas9分子またはその全体が参照によって本明細書に組み込まれるWO2015157070の表50の配列とは少なくとも1アミノ酸残基だけ異なる操作、変更、または改変されたCas9分子である。
天然に存在するCas9分子は、典型的には2つのローブを含む：認識（REC）ローブおよびヌクレアーゼ（NUC）ローブである；これらのそれぞれは、さらに、例えばWO2015157070に、例えばその中の図9A～9Bに記載されているドメインを含む（この出願はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
RECローブはアルギニンリッチなブリッジヘリックス（BH）、REC1ドメイン、およびREC2ドメインを含む。RECローブはCas9特異的な機能ドメインであるように見える。BHドメインは長いアルファヘリックスおよびアルギニンリッチな領域であり、S. pyogenes Cas9の配列のアミノ酸60～93を含む。REC1ドメインは例えばgRNAまたはtracrRNAのリピート：アンチリピート二重鎖の認識に関わる。REC1ドメインは2つのREC1モチーフをS. pyogenes Cas9の配列のアミノ酸94から179および308から717に含む。これらの2つのREC1ドメインは直線的な一次構造においてはREC2ドメインによって離間されているが、三次構造においてはアセンブリしてREC1ドメインを形成する。REC2ドメインまたはその一部もまたリピート：アンチリピート二重鎖の認識に役割を演じ得る。REC2ドメインはS. pyogenes Cas9の配列のアミノ酸180～307を含む。
NUCローブはRuvCドメイン（本明細書においてはRuvC様ドメインともまた言われる）、HNHドメイン（本明細書においてはHNH様ドメインともまた言われる）、およびPAM相互作用（PI）ドメインを含む。RuvCドメインはレトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーに対する構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば標的核酸分子の非相補ストランドを切断する。RuvCドメインは、S. pyogenes Cas9の配列のそれぞれアミノ酸1～59、718～769、および909～1098における3つの分割されたRuvCモチーフからアセンブリされる（RuvC I、RuvCII、およびRuvCIII。これらは多くの場合には普通は当分野においてRuvCIドメインまたはN末端RuvCドメイン、RuvCIIドメイン、およびRuvCIIIドメインと言われる）。REC1ドメインに類似に、3つのRuvCモチーフは一次構造においては他のドメインによって直線的に離間される。しかしながら、三次構造においては、3つのRuvCモチーフはアセンブリし、RuvCドメインを形成する。HNHドメインはHNHエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば標的核酸分子の相補ストランドを切断する。HNHドメインはRuvC II～IIIモチーフの間に在し、S. pyogenes Cas9の配列のアミノ酸775～908を含む。PIドメインは標的核酸分子のPAMと相互作用し、S. pyogenes Cas9の配列のアミノ酸1099～1368を含む。
結晶構造が、天然に存在する細菌Cas9分子について（Jinek et al., Science, 343(6176): 1247997, 2014）およびガイドRNA（例えば、crRNAおよびtracrRNAの合成融合体）を有するS. pyogenes Cas9について（Nishimasu et al., Cell, 156: 935－949, 2014；およびAnders et al., Nature, 2014, doi：10.1038/naturel3579）決定されている。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるCas9分子はヌクレアーゼ活性、例えば二本鎖切断活性を有する。いくつかの態様では、Cas9分子はエンドヌクレアーゼの触媒残基の1つを不活性化するように改変されている。いくつかの態様では、Cas9分子はニッカーゼであり、一本鎖切断を生成する。例えば、Dabrowska et al. Frontiers in Neuroscience (2018) 12(75）を見よ。酵素のRuvCおよびHNH触媒ドメインの1つ以上の変異がCas9効率を改善し得るということが示されている。例えば、Sarai et al. Currently Pharma. Biotechnol. (2017) 18(13)を見よ。いくつかの態様では、Cas9分子は、第2のドメイン、例えばDNAまたはクロマチンを修飾するドメイン、例えばデアミナーゼまたはデメチラーゼドメインに融合される。いくつかのかかる態様では、Cas9分子はそのエンドヌクレアーゼ活性を消去するように改変され得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるCas9分子は相同組み換え修復（HDR）の鋳型と一緒に投与される。いくつかの態様では、本明細書に記載されるCas9分子はHDR鋳型なしで投与される。
いくつかの態様では、Cas9分子は酵素の特異性を増強する（例えば、オフターゲット効果を縮減する、ロバストなオンターゲット切断を維持する）ように改変される。いくつかの態様では、Cas9分子は増強した特異性のCas9バリアントである（例えば、eSPCas9）。例えば、Slaymaker et al. Science (2016) 351 (6268): 84－88を見よ。いくつかの態様では、Cas9分子は高フィデリティCas9バリアントである（例えば、SpCas9－HF1）。例えば、Kleinstiver et al. Nature (2016) 529: 490－495を見よ。
種々のCas9分子が当分野において公知であり、種々のソースから得られ得、および／または酵素の1つ以上の活性もしくは特異性を調節するように操作／改変され得る。いくつかの態様では、Cas9分子は1つ以上のPAM配列を認識するように操作／改変されている。いくつかの態様では、Cas9分子は、Cas9分子が操作／改変なしに認識するPAM配列とは異なる1つ以上のPAM配列を認識するように操作／改変されている。いくつかの態様では、Cas9分子は酵素のオフターゲット活性を縮減するように操作／改変されている。
いくつかの態様では、Cas9分子をコードするヌクレオチド配列はエンドヌクレアーゼ活性の特異性を変更する（例えば、オフターゲット切断を縮減する、エンドヌクレアーゼ活性または細胞内寿命を減少させる、相同組み換えを増大させる、および非相同末端結合を縮減する）ようにさらに改変される。例えば、Komor et al. Cell (2017) 168: 20－36を見よ。いくつかの態様では、Cas9分子をコードするヌクレオチド配列はエンドヌクレアーゼのPAM認識を変更するように改変される。例えば、Cas9分子のSpCas9はPAM配列NGGを認識するが、エンドヌクレアーゼの1つ以上の改変を含むSpCas9の緩和型バリアント（例えば、VQR SpCas9、EQR SpCas9、VRER SpCas9）はPAM配列NGA、NGAG、NGCGを認識し得る。改変されたCas9分子のPAM認識は、Cas9分子が改変されていないCas9分子と比較して多くの潜在的PAM配列を認識する場合には「緩和型」と考えられる。例えば、Cas9分子のSaCas9はPAM配列NNGRRTを認識するが、1つ以上の改変を含むSaCas9の緩和型バリアント（例えば、KKH SaCas9）はPAM配列NNNRRTを認識し得る。1つの例では、Cas9分子FnCas9はPAM配列NNGを認識するが、エンドヌクレアーゼの1つ以上の改変を含むFnCas9の緩和型バリアント（例えば、RHA FnCas9）はPAM配列YGを認識し得る。1つの例では、Cas9分子は置換変異S542RおよびK607Rを含むCpf1エンドヌクレアーゼであり、PAM配列TYCVを認識する。1つの例では、Cas9分子は置換変異S542R、K607R、およびN552Rを含むCpf1エンドヌクレアーゼであり、PAM配列TATVを認識する。例えば、Gao et al. Nat. Biotechnol. (2017) 35(8): 789－792を見よ。
いくつかの態様では、1つよりも多くの（例えば、2、3、またより多くの）Cas分子、例えばCas9分子が用いられる。いくつかの態様では、Cas分子の少なくとも1つはCas9酵素である。いくつかの態様では、Cas分子の少なくとも1つはCpf1酵素である。いくつかの態様では、Cas9分子の少なくとも1つはStreptococcus pyogenesに由来する。いくつかの態様では、Cas9分子の少なくとも1つはStreptococcus pyogenesに由来し、少なくとも1つのCas9分子はStreptococcus pyogenesではない生物に由来する。いくつかの態様では、Cas9分子は塩基編集因子である。塩基編集因子エンドヌクレアーゼは、一般的に、機能ドメインに融合された触媒的に不活性なCas9分子を含む。例えば、Eid et al. Biochem. J. (2018) 475(11): 1955－1964；Rees et al. Nature Reviews Genetics (2018) 19: 770－788を見よ。いくつかの態様では、触媒的に不活性なCas9分子はdCas9である。いくつかの態様では、触媒的に不活性なCas9分子（dCas9）は1つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害因子（UGI）ドメインに融合される。いくつかの態様では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基編集因子（ABE）、例えばRNAアデニンデアミナーゼTadAから進化したABEに融合されたdCas9を含む。いくつかの態様では、エンドヌクレアーゼはシチジンデアミナーゼ酵素（例えば、APOBECデアミナーゼ、pmCDA1、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID））に融合されたdCas9を含む。いくつかの態様では、触媒的に不活性なCas9分子は縮減された活性を有し、nCas9である。いくつかの態様では、Cas9分子は1つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害因子（UGI）ドメインに融合されたnCas9を含む。いくつかの態様では、Cas9分子は、アデニン塩基編集因子（ABE）、例えばRNAアデニンデアミナーゼTadAから進化したABEに融合されたnCas9を含む。いくつかの態様では、Cas9分子は、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、APOBECデアミナーゼ、pmCDA1、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID））に融合されたnCas9を含む。
塩基編集因子の例は、限定なしに、BE1、BE2、BE3、HF－BE3、BE4、BE4max、BE4－Gam、YE1－BE3、EE－BE3、YE2－BE3、YEE－CE3、VQR－BE3、VRER－BE3、SaBE3、SaBE4、SaBE4－Gam、Sa(KKH)－BE3、Target－AID、Target－AID－NG、xBE3、eA3A－BE3、BE－PLUS、TAM、CRISPR－X、ABE7.9、ABE7.10、ABE7.10*、xABE、ABESa、VQR－ABE、VRER－ABE、Sa(KKH)－ABE、およびCRISPR－SKIPを包含する。塩基編集因子の追加の例は例えばUS公開No.2018/0312825A1、US公開No.2018/0312828A1、およびPCT公開No.WO2018/165629A1に見出され得る。これらはそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、塩基編集因子は、標的部位における塩基除去修復を阻害および細胞性のミスマッチ修復を誘導するようにさらに改変されている。本明細書に記載されるCas9分子のいずれかは、Cas9分子を分解およびエキソヌクレアーゼ活性から保護するためのGamドメイン（バクテリオファージMu蛋白質）に融合され得る。例えば、Eid et al. Biochem. J. (2018) 475(11): 1955－1964を見よ。
いくつかの態様では、Cas9分子はCasエンドヌクレアーゼのクラス2のV型に属する。クラス2のV型CasエンドヌクレアーゼはさらにV－A型、V－B型、V－C型、およびV－U型として類別され得る。例えば、Stella et al. Nature Structural & Molecular Biology (2017)を見よ。いくつかの態様では、Cas分子はV－A型Casエンドヌクレアーゼ、例えばCpf1ヌクレアーゼである。いくつかの態様では、Ca Cas9分子はV－B型Casエンドヌクレアーゼ、例えばC2c1エンドヌクレアーゼである。例えば、Shmakov et al. Mol Cell (2015) 60: 385－397を見よ。いくつかの態様では、Cas分子はMad7である。代替的にまたは加えて、Cas9分子はCpf1ヌクレアーゼまたはそのバリアントである。当業者によって了解されるであろう通り、Cpf1ヌクレアーゼはCas12aともまた言われ得る。例えば、Strohkendl et al. Mol. Cell (2018) 71: 1－9を見よ。いくつかの態様では、本明細書に記載される組成物または方法にはProvetella spp.もしくはFrancisella spp.、Acidaminococcus sp.（AsCpf1）、Lachnospiraceae bacterium（LpCpf1）、またはEubacterium rectaleに由来するCpf1ヌクレアーゼが関わるか、あるいはホスト細胞はそれを発現する。いくつかの態様では、Cpf1ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列はホスト細胞による発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの態様では、Cpf1エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は蛋白質の活性を変更するようにさらに改変される。
いくつかの態様では、Cas分子の（例えばCas9またはCas12aの）触媒的に不活性なバリアントが本明細書に記載される方法に従って用いられる。Cpf1（Cas12a）の触媒的に不活性なバリアントはdCas12aと言われ得る。本明細書に記載されるCpf1の触媒的に不活性なバリアントは、塩基編集因子を形成するために機能ドメインに融合され得る。例えば、Rees et al. Nature Reviews Genetics (2018) 19: 770－788を見よ。いくつかの態様では、触媒的に不活性なCas9分子はdCas9である。いくつかの態様では、エンドヌクレアーゼは1つ以上のウラシルグリコシラーゼ阻害因子（UGI）ドメインに融合されたdCas12aを含む。いくつかの態様では、Cas9分子は、アデニン塩基編集因子（ABE）、例えばRNAアデニンデアミナーゼTadAから進化したABEに融合されたdCas12aを含む。いくつかの態様では、Cas分子はシチジンデアミナーゼ酵素（例えば、APOBECデアミナーゼ、pmCDA1、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID））に融合されたdCas12aを含む。
代替的にまたは加えて、Cas9分子はCas14エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントであり得る。Cas14エンドヌクレアーゼは古細菌に由来し、サイズはより小さい傾向がある（例えば、400～700アミノ酸）。加えて、Cas14エンドヌクレアーゼはPAM配列を要求しない。例えばHarrington et al. Science (2018)を見よ。
本明細書に記載されるCas9分子のいずれかは、所望の時間におけるCas9分子の発現および／または活性のレベルを制御するように調節され得る。例えば、細胞周期の特定の相（単数または複数）におけるCas9分子の発現および／または活性のレベルを増大させることが有利であり得る。相同組み換え修復のレベルは細胞周期のG1期において縮減され、よって、S期、G2期、および／またはM期におけるCas9分子の発現および／または活性のレベルを増大させることはCasエンドヌクレアーゼ編集後の相同組み換え修復を増大させ得るということが実証されている。いくつかの態様では、Cas9分子の発現および／または活性のレベルは細胞周期のS期、G2期、および／またはM期において増大する。1つの例では、Cas9分子はヒトGemininのN末端領域に融合される。例えば、Gutschner et al. Cell Rep. (2016) 14(6): 1555－1566を見よ。いくつかの態様では、Cas9分子の発現および／または活性のレベルはG1期において縮減される。1つの例では、Cas9分子は、それがG1期において縮減された活性を有するようにして改変される。例えば、Lomova et al. Stem Cells (2018)を見よ。
代替的にまたは加えて、本明細書に記載されるCas9分子のいずれかはエピジェネティック修飾因子（例えばクロマチン修飾酵素、例えばDNAメチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ）に融合され得る。例えば、Kungulovski et al. Trends Genet. (2016) 32(2): 101－113を見よ。エピジェネティック修飾因子に融合されたCas9分子は「エピエフェクター」と言われ得、時間的なおよび／または一過的なエンドヌクレアーゼ活性を可能にし得る。いくつかの態様では、Cas9分子はクロマチン修飾酵素に融合されたdCas9である。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞または細胞集団はジンクフィンガー（ZFN）テクノロジーを用いて生成する。いくつかの態様では、ZFNは本明細書において例えば第１表に記載される標的ドメインを認識する。一般的に、ジンクフィンガーによって媒介されるゲノム編集にはジンクフィンガーヌクレアーゼの使用が関わり、これは典型的にはジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、目当てのいずれかの標的ドメインを認識および結合するように操作され得る。例えば、長さが約3ヌクレオチドから約21ヌクレオチドまたは長さが約8から約19ヌクレオチドの範囲であるDNA配列を認識するように設計され得る。ジンクフィンガー結合ドメインは典型的には少なくとも3つのジンクフィンガー認識領域（例えば、ジンクフィンガー）を含む。
（認識部位における）DNAに対する配列特異的結合と結合部位またはその近くにおいてDNAを切断することとができる制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）が当分野において公知であり、ゲノム編集への使用のためのZFNを形成するために用いられ得る。例えば、IIS型制限エンドヌクレアーゼは認識部位から離れた部位においてDNAを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。1つの例では、DNA切断ドメインはFokIエンドヌクレアーゼに由来し得る。
TALEN
いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞または細胞集団はTALENテクノロジーを用いて生成する。いくつかの態様では、TALENは本明細書において例えば第１表に記載される標的ドメインを認識する。一般的に、TALENは、所望の標的DNA分子に特異的に結合および切断し得る操作された制限酵素である。TALENは、典型的には、DNA切断ドメインに融合された転写活性化因子様エフェクター（TALE）DNA結合ドメインを含有する。DNA結合ドメインは、多様な2アミノ酸RVD（リピート可変ジペプチドモチーフ）を位置12および13に有する高度に保存された33～34アミノ酸配列を含有し得る。RVDモチーフは核酸配列に対する結合特異性を決定し、所望のDNA配列に特異的に結合するように操作され得る。1つの例では、DNA切断ドメインはFokIエンドヌクレアーゼに由来し得る。いくつかの態様では、FokIドメインは、適切な向きおよび間隔を有する標的ゲノム上の部位のための独特のDNA結合ドメインを有する2つの構築物を用いて、二量体として機能する。
目当ての標的遺伝子に特異的なTALENは、細胞内で用いられて二本鎖切断（DSB）を生成し得る。修復メカニズムが切断を非相同末端結合によって不適切に修復する場合には、変異が切断部位に導入され得る。例えば、不適切な修復はフレームシフト変異を導入し得る。代替的には、所望の配列を有する外来性のDNA分子がTALENと併せて細胞に導入され得る。外来性のDNAの配列および染色体配列に依存して、このプロセスは、欠陥を修正もしくは目当ての標的遺伝子にDNA断片を導入するか、またはかかる欠陥を内在性の遺伝子に導入し、それゆえに標的遺伝子の発現を減少させるために用いられ得る。
本明細書において提供されるガイドRNAおよび遺伝子操作方法に関連しての使用にとって好適なエンドヌクレアーゼおよびヌクレアーゼバリアントのいくつかの例示的な限定しない態様が上に記載されている。追加の好適なヌクレアーゼおよびヌクレアーゼバリアントは、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。本開示はこれについて限定されない。
gRNA配列および構成
gRNA構成一般
gRNAはいくつものドメインを含み得る。ある態様では、単分子sgRNAまたはキメラgRNAは、例えば5'から3'に：
標的化ドメイン（これはCD33遺伝子上の標的核酸に対して相補的である；
第1の相補性ドメイン；
連結ドメイン；
第2の相補性ドメイン（これは第1の相補性ドメインに対して相補的である）；
近位ドメイン；および
任意に尾部ドメイン；
を含む。
これらのドメインのそれぞれがここでより詳細に記載される。
標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列に対して相補的、例えば、少なくとも80、85、90、または95%相補的、例えば完全に相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。標的化ドメインはRNA分子の一部であり、よって塩基ウラシル（U）を含み、gRNA分子をコードするいずれかのDNAは塩基チミン（T）を含むであろう。理論によって拘束されようとするものではないが、ある態様では、標的配列との標的化ドメインの相補性は標的核酸とのgRNA／Cas9分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると思われる。標的化ドメインおよび標的配列の対において、標的化ドメイン上のウラシル塩基は標的配列上のアデニン塩基と対形成するであろうということが理解される。ある態様では、標的ドメインそれ自体は5'から3'方向に任意の二次的なドメインおよびコアドメインを含む。ある態様では、コアドメインは標的配列と完全に相補的である。ある態様では、標的化ドメインは長さが5から50ヌクレオチドである。標的化ドメインは長さが15～25ヌクレオチド、18～22ヌクレオチド、または19～21ヌクレオチドの間であり得る。いくつかの態様では、標的化ドメインは長さが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドである。いくつかの態様では、標的化ドメインは長さが10～30の間または15～25ヌクレオチドの間である。
いくつかの態様では、標的化ドメインは例えば国際出願WO2015157070に記載されている通りコアドメインおよび二次的な標的化ドメインを含み、これはその全体が参照によって組み込まれる。ある態様では、コアドメインは標的化ドメインの3'端からの約8から約13ヌクレオチドを含む（例えば、標的化ドメインの最も3'の8から13ヌクレオチド）。ある態様では、二次的なドメインはコアドメインの5'に位置する。多くの態様では、コアドメインは標的配列の対応する領域との厳密な相補性を有する。他の態様では、コアドメインは標的配列の対応するヌクレオチドと相補的ではない1つ以上のヌクレオチドを有し得る。
第1の相補性ドメインは第2の相補性ドメインと相補的であり、ある態様では、第2の相補性ドメインに対する十分な相補性を有して、少なくともいくつかの生理的条件下において二重鎖領域を形成する。ある態様では、第1の相補性ドメインは長さが5から30ヌクレオチドである。ある態様では、第1の相補性ドメインは3つのサブドメインを含み、これらは5'から3'方向に：5'サブドメイン、中央サブドメイン、および3'サブドメインである。ある態様では、5'サブドメインは長さが4から9、例えば、4、5、6、7、8、または9ヌクレオチドである。ある態様では、中央サブドメインは長さが1、2、または3、例えば1ヌクレオチドである。ある態様では、3'サブドメインは長さが3から25、例えば4から22、4から18、もしくは4から10、または3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドである。第1の相補性ドメインは、天然に存在する第1の相補性ドメインとの相同性を共有し得るか、またはそれに由来し得る。ある態様では、それはS. pyogenes、S. aureus、またはS. thermophilusの第1の相補性ドメインとの少なくとも50%の相同性を有する。
上で言及されているドメインの配列および配置はWO2015157070により詳細に記載されている。これは、その中のp.88～112を包含するその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
連結ドメインは第1の相補性ドメインを単分子gRNAの第2の相補性ドメインと連結するための用をなす。連結ドメインは第1のおよび第2の相補性ドメインを共有結合的にまたは非共有結合的に連結し得る。ある態様では、連結部は共有結合的である。ある態様では、連結ドメインは、第1の相補性ドメインおよび第2の相補性ドメインの間に介在する共有結合であるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、連結ドメインは、1つ以上の、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、例えばWO2018126176に開示されている通り、連結ドメインは少なくとも1つの非ヌクレオチド結合を含む。これの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
第2の相補性ドメインは少なくとも部分的に第1の相補性ドメインと相補的であり、ある態様では、第2の相補性ドメインに対する十分な相補性を有して、少なくともいくつかの生理的条件下において二重鎖領域を形成する。ある態様では、第2の相補性ドメインは、第1の相補性ドメインとの相補性を欠く配列、例えば二重鎖領域から外れてループになる配列を包含し得る。ある態様では、第2の相補性ドメインは長さが5から27ヌクレオチドである。ある態様では、第2の相補性ドメインは第1の相補性領域よりも長い。ある態様では、相補的なドメインは長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドである。ある態様では、第2の相補性ドメインは3つのサブドメインを含み、これらは5'から3'方向に：5'サブドメイン、中央サブドメイン、および3'サブドメインである。ある態様では、5'サブドメインは長さが3から25、例えば、4から22、4から18、もしくは4から10、または3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドである。ある態様では、中央サブドメインは長さが1、2、3、4、または5、例えば3ヌクレオチドである。ある態様では、3'サブドメインは長さが4から9、例えば4、5、6、7、8、または9ヌクレオチドである。ある態様では、第1の相補性ドメインの5'サブドメインおよび3'サブドメインはそれぞれ第2の相補性ドメインの3'サブドメインおよび5'サブドメインと相補的、例えば完全に相補的である。
ある態様では、近位ドメインは長さが5から20ヌクレオチドである。ある態様では、近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインとの相同性を共有し得るか、またはそれに由来し得る。ある態様では、それはS. pyogenes、S. aureus、またはS. thermophilusの近位ドメインと少なくとも50%の相同性を有する。
幅広い範囲の尾部ドメインがgRNsAへの使用にとって好適である。ある態様では、尾部ドメインは長さが0（不在）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドである。いくつかの態様では、尾部ドメインヌクレオチドは、天然に存在する尾部ドメインの5'端からの配列からであるか、またはそれとの相同性を共有する。ある態様では、尾部ドメインは、互いに対して相補的であり、少なくともいくつかの生理的条件下において二重鎖領域を形成する配列を包含する。ある態様では、尾部ドメインは不在であるか、または長さが1から50ヌクレオチドである。ある態様では、尾部ドメインは、天然に存在する近位尾部ドメインとの相同性を共有し得るか、またはそれに由来し得る。ある態様では、それはS. pyogenes、S. aureus、またはS. thermophilus尾部ドメインとの少なくとも50%の相同性を有する。ある態様では、尾部ドメインはインビトロまたはインビボ転写の方法に関するヌクレオチドを3'端に包含する。
いくつかの態様では、モジュラーgRNAは：
例えば5'から3'に；
標的化ドメイン（これはCD33遺伝子上の標的核酸に対して相補的である）および
第1の相補性ドメイン；
を含む第1のストランドと、
好ましくは5'から3'に：
任意に5'延長ドメイン；
第2の相補性ドメイン；
近位ドメイン；および
任意に尾部ドメイン；
を含む第2のストランドと、
を含む。
いくつかの態様では、gRNAは化学修飾される。例えば、gRNAは、ホスホロチオエートバックボーン修飾、（例えば、3’および5’末端の1つまたは両方において）2'－O－Me修飾された糖、2’F修飾された糖、二環式ヌクレオチド－cEtによるリボース糖の置き換え、3'チオPACE（MSP）、またはそれらのいずれかの組み合わせから選ばれる1つ以上の修飾を含み得る。好適なgRNA修飾は例えばRahdar et al. PNAS December 22, 2015 112 (51) E7110－E7117およびHendel et al., Nat Biotechnol.2015 Sep；33(9): 985－989に記載されている。これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、本明細書に記載されるgRNAは、1つ以上の2'－O－メチル－3'－ホスホロチオエートヌクレオチド、例えば、少なくとも2、3、4、5、または6つの2'－O－メチル－3'－ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されるgRNAは、修飾ヌクレオチド（例えば、2'－O－メチル－3'－ホスホロチオエートヌクレオチド）を3つの末端位置および5'端におよび／または3つの末端位置およびおよび3'端に含む。いくつかの態様では、それらの全体が参照によって組み込まれる例えば国際出願WO/2017/214460、WO/2016/089433、およびWO/2016/164356に記載されている通り、gRNAは1つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるgRNAは化学修飾される。例えば、gRNAは1つ以上の2’－O修飾ヌクレオチド、例えば2’－O－メチルヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様では、gRNAは2’－O修飾ヌクレオチド、例えば2’－O－メチルヌクレオチドをgRNAの5'端に含む。いくつかの態様では、gRNAは2’－O修飾ヌクレオチド、例えば2’－O－メチルヌクレオチドをgRNAの3'端に含む。いくつかの態様では、gRNAは2’－O修飾ヌクレオチド、例えば2’－O－メチルヌクレオチドをgRNAの5’および3'端両方に含む。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの5'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾、例えば2’－O－メチル修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾、例えば2’－O－メチル修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、gRNAの5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾、例えば2’－O－メチル修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第4のヌクレオチドにおいて2’－O修飾、例えば2’－O－メチル修飾される。いくつかの態様では、gRNAの3'端のヌクレオチドは化学修飾されない。いくつかの態様では、gRNAの3'端のヌクレオチドは化学修飾された糖を有さない。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、gRNAの5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第4のヌクレオチドにおいて2’－O修飾、例えば2’－O－メチル修飾される。いくつかの態様では、2’－O－メチルヌクレオチドは隣接するヌクレオチドに対するリン酸連結部を含む。いくつかの態様では、2’－O－メチルヌクレオチドは隣接するヌクレオチドに対するホスホロチオエート連結部を含む。いくつかの態様では、2’－O－メチルヌクレオチドは隣接するヌクレオチドに対するチオPACE連結部を含む。
いくつかの態様では、gRNAは、1つ以上の2’－O修飾および3’リン酸修飾されたヌクレオチド、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様では、gRNAは、2’－O修飾および3’リン酸修飾された、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエートヌクレオチドをgRNAの5'端に含む。いくつかの態様では、gRNAは、2’－O修飾および3’リン酸修飾された、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエートヌクレオチドをgRNAの3'端に含む。いくつかの態様では、gRNAは、2’－O修飾および3’リン酸修飾された、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエートヌクレオチドをgRNAの5’および3'端に含む。いくつかの態様では、gRNAは、1つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置き換えられているバックボーンを含む。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの5'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、gRNAの5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第4のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエート修飾される。いくつかの態様では、gRNAの3'端のヌクレオチドは化学修飾されない。いくつかの態様では、gRNAの3'端のヌクレオチドは化学修飾された糖を有さない。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、gRNAの5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第4のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’ホスホロチオエート修飾される。
いくつかの態様では、gRNAは、1つ以上の2’－O修飾および3’－リン酸修飾された、例えば2’－O－メチル3’チオPACEヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様では、gRNAは、2’－O修飾および3’リン酸修飾された、例えば、2’－O－メチル3’チオPACEヌクレオチドをgRNAの5'端に含む。いくつかの態様では、gRNAは、2’－O修飾および3’リン酸修飾された、例えば、2’－O－メチル3’チオPACEヌクレオチドをgRNAの3'端に含む。いくつかの態様では、gRNAは、2’－O修飾および3’リン酸修飾された、例えば、2’－O－メチル3’チオPACEヌクレオチドをgRNAの5’および3'端に含む。いくつかの態様では、gRNAは、1つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置き換えられ、かつ1つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基によって置き換えられているバックボーンを含む。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの5'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’チオPACE修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’チオPACE修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、gRNAの5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’チオPACE修飾される。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第4のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’チオPACE修飾される。いくつかの態様では、gRNAの3'端のヌクレオチドは化学修飾されない。いくつかの態様では、gRNAの3'端のヌクレオチドは化学修飾された糖を有さない。いくつかの態様では、gRNAは、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、gRNAの5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第4のヌクレオチドにおいて2’－O修飾および3’リン酸修飾、例えば2’－O－メチル3’チオPACE修飾される。
いくつかの態様では、gRNAは化学修飾されたバックボーンを含む。いくつかの態様では、gRNAはホスホロチオエート連結部を含む。いくつかの態様では、1つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置き換えられている。いくつかの態様では、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの5'端から第3のヌクレオチドはそれぞれがホスホロチオエート連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドはそれぞれがホスホロチオエート連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、gRNAの5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドはそれぞれがホスホロチオエート連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、および（and at）gRNAの3'端から第4のヌクレオチドはそれぞれがホスホロチオエート連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第4のヌクレオチドはそれぞれがホスホロチオエート連結部を含む。
いくつかの態様では、gRNAはチオPACE連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAは、1つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置き換えられ、かつ1つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基によって置き換えられているバックボーンを含む。いくつかの態様では、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの5'端から第3のヌクレオチドはそれぞれがチオPACE連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドはそれぞれがチオPACE連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、gRNAの5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第3のヌクレオチドはそれぞれがチオPACE連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、および（and at）gRNAの3'端から第4のヌクレオチドはそれぞれがチオPACE連結部を含む。いくつかの態様では、gRNAの5'端のヌクレオチド、gRNAの5'端から第2のヌクレオチド、5'端から第3のヌクレオチド、gRNAの3'端から第2のヌクレオチド、gRNAの3'端から第3のヌクレオチド、およびgRNAの3'端から第4のヌクレオチドはそれぞれがチオPACE連結部を含む。
本明細書において提供されるガイドRNAおよび遺伝子操作方法に関連しての使用にとって好適な修飾、例えば化学修飾のいくつかの例示的な限定しない態様が、上に記載されている。追加の好適な修飾、例えば化学修飾は、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。Hendel, A. et al., Nature Biotech., 2015, Vol 33, No.9；WO/2017/214460；WO/2016/089433；および／またはWO/2016/164356に記載されているものを包含するが、これらに限定されない；これらのそれぞれのものはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
CD33を標的化するgRNA
本開示は、エンドヌクレアーゼをヒトCD33へと標的化し得るいくつもの有用なgRNAを提供する。下の第１表は、本明細書に記載されるgRNAによって結合され得るヒトの内在性のCD33上の標的ドメインを例解する。
Figure 2022534813000002
Figure 2022534813000003
Figure 2022534813000004
CD33（CCDS33084.1）cDNA配列は下で配列番号13として提供される。エキソン3は下線付きである。
Figure 2022534813000005
CD33のエキソン3は別個に下で配列番号14として提供される。下線付きはgRNA A、gRNA B、gRNA C、gRNA Dに対して相補的な領域を指示する（またはその逆相補物）。gRNA A、gRNA B、およびgRNA Dの標的領域は部分的にオーバーラップするということに注意せよ。
Figure 2022534813000006
二元的gRNA組成物およびそれらの使用
いくつかの態様では、例えばヌクレアーゼをゲノム上の2つの部位へと導くために、本明細書に記載されるgRNA（例えば、第２表のgRNA）は第2のgRNAとの組み合わせで用いられ得る。例えば、いくつかの態様では、例えば細胞が2つの薬剤：抗CD33薬剤および第2の系列特異的細胞表面抗原を標的化する薬剤に対して抵抗性であり得るようにして、CD33および第2の系列特異的細胞表面抗原について欠損がある造血細胞を生成することが望まれる。いくつかの態様では、2つのカットを作り、2つのカット部位間の欠失を作り出すために、CD33の異なる領域を標的化する2つの異なるgRNAと細胞を接触させることが望ましい。従って、本開示はgRNAの種々の組み合わせを提供する。
いくつかの態様では、本明細書に記載される2つ以上の（例えば、3、4、またはより多くの）gRNA同士が追加混合される。いくつかの態様では、各gRNAは別個の容器中にある。いくつかの態様では、本明細書に記載されるキット（例えば、第２表に従う1つ以上のgRNAを含むキット）はCas9分子またはCas9分子をコードする核酸をもまた含む。
いくつかの態様では、第1のおよび第2のgRNAは第２表に従うgRNAまたはそれらのバリアントである。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表のgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは：BCMA、CD19、CD20、CD30、ROR1、B7H6、B7H3、CD23、CD38、C型レクチン様分子－1、CS1、IL－5、L1－CAM、PSCA、PSMA、CD138、CD133、CD70、CD7、CD13、NKG2D、NKG2Dリガンド、CLEC12A、CD11、CD123、CD56、CD34、CD14、CD66b、CD41、CD61、CD62、CD235a、CD146、CD326、LMP2、CD22、CD52、CD10、CD3／TCR、CD79／BCR、およびCD26から選ばれる系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは、特定の型の癌に関連する系列特異的細胞表面抗原、例えば、限定なしに、CD20、CD22（非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（CLL））、CD52（B細胞CLL）、CD33（急性骨髄性白血病（AML））、CD10（gp100）（通常型（プレB）急性リンパ球性白血病および悪性メラノーマ）、CD3/T細胞受容体（TCR）（T細胞リンパ腫および白血病）、CD79/B細胞受容体（BCR）（B細胞リンパ腫および白血病）、CD26（上皮およびリンパ性悪性物）、ヒト白血球抗原（HLA）－DR、HLA－DP、およびHLA－DQ（リンパ性悪性物）、RCAS1（婦人科癌腫、胆道腺癌、および膵管腺癌）、および前立腺特異的膜抗原を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは：CD7、CD13、CD19、CD22、CD20、CD25、CD32、CD38、CD44、CD45、CD47、CD56、96、CD117、CD123、CD135、CD174、CLL-1、葉酸受容体β、IL1RAP、MUC1、NKG2D／NKG2DL、TIM-3、またはWT1から選ばれる系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD32c、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64a、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66F、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75S、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85A、CD85C、CD85D、CD85E、CD85F、CD85G、CD85H、CD85I、CD85J、CD85K、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD14、CDwl45、CD146、CD147、CD148、CD150、CD152、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158bl、CD158b2、CD158d、CD158e1/e2、CD158f、CD158g、CD158h、CD158i、CD158j、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD272、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD288、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD359、CD360、CD361、CD362、またはCD363から選ばれる系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS－1（CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24ともまた言われる）；C型レクチン様分子－1（CLECL1）；上皮成長因子受容体バリアントIII（EGFRvIII）；ガングリオシドG2（CD2）；ガングリオシドGD3（aNeu5Ac(2－8)aNeu5Ac(2－3)bDGalp(1－4)bDGlep(1－1)Cer）；TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟（BCMA）、Tn抗原（（Tn Ag）または（GalNAcアルファ－Ser/Thr））；前立腺特異的膜抗原（PSMA）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）；Fms様チロシンキナーゼ3（FLT3）；腫瘍関連糖蛋白質72（TAG72）；CD38；CD44v6；癌胎児性抗原（CEA）；上皮細胞接着分子（EPCAM）；B7H3（CD276）；KIT（CD117）；インターロイキン－13受容体サブユニットアルファ－2（IL－13Ra2またはCD213A2）；メソテリン；インターロイキン11受容体アルファ（IL－11Ra）；前立腺幹細胞抗原（PSCA）；セリンプロテアーゼ21（TestisinまたはPRSS21）；血管内皮成長因子受容体2（VEGFR2）；ルイス（Y）抗原；CD24；血小板由来成長因子受容体ベータ（PDGFRベータ）；ステージ特異的胚性抗原－4（SSEA－4）；CD20；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン蛋白質キナーゼERBB2（Her2/neu）；細胞表面関連ムチン1（MUC1）；上皮成長因子受容体（EGFR）；神経細胞接着分子（NCAM）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（PAP）；変異型伸長因子2（ELF2M）；エフリンB2；線維芽細胞活性化蛋白質アルファ（FAP）；インスリン様成長因子I受容体（IGF－I受容体）、炭酸脱水酵素IX（CAIX）、プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ9型（LMP2）；糖蛋白質100（gp100）；ブレークポイントクラスター領域（BCR）およびAbelsonネズミ白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1（Abl）からなる癌遺伝子融合蛋白質（bcr－abl）；チロシナーゼ；エフリンA型受容体2（EphA2）；フコシルGM1；シアリルルイス接着分子（sLe）；ガングリオシドGM3（aNeu5Ac(2－3)bDGalp(1－4)bDGlcp(1－1)Cer）；トランスグルタミナーゼ5（TGS5）；高分子量メラノーマ関連抗原（HMWMAA）；o－アセチル－GD2ガングリオシド（OAcGD2）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー1（TEM1／CD248）；腫瘍内皮マーカー7関連（TEM7R）；クローディン6（CLDN6）；甲状腺刺激ホルモン受容体（TSHR）；G蛋白質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）；X染色体オープンリーディングフレーム61（CXORF61）；CD97；CD179a；未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）；ポリシアル酸；胎盤特異的1（PLAC1）；globoH糖セラミドの六糖部分（GloboH）；乳腺分化抗原（NY－BR－1）；ウロプラキン2（UPK2）；A型肝炎ウイルス細胞性受容体1（HAVCR1）；アドレノセプターベータ3（ADRB3）；パネキシン3（PANX3）；G蛋白質共役受容体20（GPR20）；リンパ球抗原6複合体；座位K9（LY6K）；嗅覚受容体51E2（OR51E2）；TCRガンマ代替リーディングフレーム蛋白質（TARP）；ウイルムス腫瘍蛋白質（WT1）；癌／精巣抗原1（NY－ESO－1）；癌／精巣抗原2（LAGE－1a）；メラノーマ関連抗原1（MAGE－A1）、染色体12pに所在するETS転座バリアント遺伝子6（ETV6－AML）；精子蛋白質17（SPA17）；X抗原ファミリーメンバー1A（XAGE1）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体2（Tie2）；メラノーマ癌精巣抗原－1（MAD－CT－1）；メラノーマ癌精巣抗原－2（MAD－CT－2）；Fos関連抗原1；腫瘍蛋白質p53（p53）；p53変異体；プロステイン；サバイビン（surviving）；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－1（PCTA－1またはガレクチン8）、T細胞認識メラノーマ抗原1（MelanAまたはMART1）；ラット肉腫（Ras）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）；肉腫転座ブレークポイント；メラノーマアポトーシス阻害因子（ML－1AP）；ERG（膜貫通セリンプロテアーゼ2（TMPRSS2）ETS融合遺伝子）；N－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV（NA17）；ペアードボックス蛋白質Pax－3（PAX3）；アンドロゲン受容体；サイクリンB1；v－myc鳥骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（MYCN）；RasホモログファミリーメンバーC（RhoC）；チロシナーゼ関連蛋白質2（TRP－2）；シトクロムP4501B1（CYP1B1）；CCCTC結合因子（ジンクフィンガー蛋白質）様（BORISまたはインプリンティング部位制御因子の兄弟）、T細胞によって認識される有棘細胞癌抗原3（SART3）；ペアードボックス蛋白質Pax－5（PAX5）；プロアクロシン結合蛋白質sp32（OY－TES1）；リンパ球特異的蛋白質チロシンキナーゼ（LCK）；Aキナーゼアンカー蛋白質4（AKAP－4）；滑膜肉腫Xブレークポイント2（SSX2）；終末糖化産物受容体（RAGE－1）；腎ユビキタス1（RU1）；腎ユビキタス2（RU2）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスE6（HPV E6）；ヒトパピローマウイルスE7（HPV E7）；腸カルボキシエステラーゼ；変異型熱ショック蛋白質70－2（mut hsp70－2）；CD79a；CD79b；CD72；白血球関連免疫グロブリン様受容体1（LAIR1）；IgA受容体Fc断片（FCARまたはCD89）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2（LILRA2）；CD300分子様ファミリーメンバーf（CD300LF）；C型レクチンドメインファミリー12メンバーA（CLEC12A）；骨髄間質細胞抗原2（BST2）；EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2（EMR2）、リンパ球抗原75（LY75）；グリピカン－3（GPC3）；Fc受容体様5（FCRL5）；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1（IGLL1）から選ばれる系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは：CD11a、CD18、CD19、CD20、CD31、CD33、CD34、CD44、CD45、CD47、CD51、CD58、CD59、CD63、CD97、CD99、CD100、CD102、CD123、CD127、CD133、CD135、CD157、CD172b、CD217、CD300a、CD305、CD317、CD321、およびCLL1から選ばれる系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは：CD123、CLL1、CD38、CD135（FLT3）、CD56（NCAM1）、CD117（c-KIT）、FRβ（FOLR2）、CD47、CD82、TNFRSF1B（CD120B）、CD191、CD96、PTPRJ（CD148）、CD70、LILRB2（CD85D）、CD25（IL2Rアルファ）、CD44、CD96、NKG2Dリガンド、CD45、CD7、CD15、CD19、CD20、CD22、CD37、およびCD82から選ばれる系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは：CD7、CD11a、CD15、CD18、CD19、CD20、CD22、CD25、CD31、CD34、CD37、CD38、CD44、CD45、CD47、CD51、CD56、CD58、CD59、CD63、CD70、CD82、CD85D、CD96、CD97、CD99、CD100、CD102、CD117、CD120B、CD123、CD127、CD133、CD135、CD148、CD157、CD172b、CD191、CD217、CD300a、CD305、CD317、CD321、CLL1、FRβ（FOLR2）、またはNKG2Dリガンドから選ばれる系列特異的細胞表面抗原を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAはCLL－1を標的化する。いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAはCD123を標的化する。
いくつかの態様では、第1のgRNAは本明細書に記載されるCD33 gRNAであり（例えば、第２表に従うgRNAまたはそのバリアント）、第2のgRNAは第A表からの配列を含む。いくつかの態様では、第1のgRNAは標的化ドメインを含むCD33 gRNAであり、標的化ドメインは配列番号9の配列を含み、第2のgRNAは第A表の配列に対応する標的化ドメインを含む。いくつかの態様では、第1のgRNAは標的化ドメインを含むCD33 gRNAであり、標的化ドメインは配列番号10の配列を含み、第2のgRNAは第A表の配列に対応する標的化ドメインを含む。いくつかの態様では、第1のgRNAは標的化ドメインを含むCD33 gRNAであり、標的化ドメインは配列番号11の配列を含み、第2のgRNAは第A表の配列に対応する標的化ドメインを含む。いくつかの態様では、第1のgRNAは標的化ドメインを含むCD33 gRNAであり、標的化ドメインは配列番号12の配列を含み、第2のgRNAは第A表の配列に対応する標的化ドメインを含む。いくつかの態様では、第2のgRNAは、WO2017/066760、WO2019/046285、WO/2018/160768、またはBorot et al. PNAS June 11, 2019 116 (24) 11978－11987のいずれかに開示されているgRNAである。これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
Figure 2022534813000007
Figure 2022534813000008
2つの変異を含む細胞
いくつかの態様では、本明細書に記載される操作された細胞は2つの変異を含み、第1の変異はCD33にあり、第2の変異は第2の系列特異的細胞表面抗原にある。かかる細胞は、いくつかの態様では、2つの薬剤：抗CD33薬剤および第2の系列特異的細胞表面抗原を標的化する薬剤に対して抵抗性であり得る。いくつかの態様では、かかる細胞は、本明細書に記載される2つ以上のgRNA、例えば第２表のgRNAおよび第2のgRNAを用いて生成し得る。いくつかの態様では、細胞は例えばZFNまたはTALENを用いて生成し得る。本開示は本明細書に記載される細胞を含む集団をもまた提供する。
いくつかの態様では、第2の変異は、系列特異的細胞表面抗原、例えば先行する項において挙げられているものをコードする遺伝子にある。いくつかの態様では、第2の変異は第A表に挙げられている部位にある。
典型的には、本明細書において提供される方法および組成物によって成就される変異、例えば、例えばCD33および／または本開示において言及されるいずれかの他の標的遺伝子などの標的遺伝子の変異は、標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の機能喪失を、例えばCD33遺伝子の変異のケースではCD33蛋白質の機能喪失をもたらす。いくつかの態様では、機能喪失は、遺伝子産物の発現のレベルの縮減、例えば発現のより低いレベルへの縮減、または遺伝子産物の発現の完全な廃絶である。いくつかの態様では、変異は遺伝子産物の非機能的なバリアントの発現をもたらす。例えば、変異がコード配列上に未成熟ストップコドンを作出するケースでは短縮された遺伝子産物、または変異がナンセンスもしくはミスセンス変異を作出するケースでは、遺伝子産物を非機能的にする変更されたアミノ酸配列を特徴とする遺伝子産物である。いくつかの態様では、遺伝子産物の機能は結合パートナーの結合または認識である。いくつかの態様では、遺伝子産物の、例えばCD33の、第2の系列特異的細胞表面抗原の、または両方の発現の縮減は、野生型または操作されていないカウンターパート細胞のレベルの50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、5%以下、2%以下、または1%以下までである。
いくつかの態様では、本明細書において提供される方法によっておよび／または組成物を用いて作出される細胞の集団のCD33のコピーの少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%は、変異を有する。いくつかの態様では、細胞の集団の第2の系列特異的細胞表面抗原のコピーの少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%は変異を有する。いくつかの態様では、細胞の集団のCD33のおよび第2の系列特異的細胞表面抗原のコピーの少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%は変異を有する。いくつかの態様では、集団は1つ以上の野生型細胞を含む。いくつかの態様では、集団は、CD33の1つの野生型コピーを含む1つ以上の細胞を含む。いくつかの態様では、集団は、第2の系列特異的細胞表面抗原の1つの野生型コピーを含む1つ以上の細胞を含む。
細胞
いくつかの態様では、CD33の改変を有する細胞（例えばHSCまたはHPC）が本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはgRNAを用いて作られる。いくつかの態様では、CD33の改変および第2の系列特異的細胞表面抗原の改変を有する細胞（例えばHSCまたはHPC）が本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはgRNAを用いて作られる。細胞は細胞それ自体をヌクレアーゼおよび／もしくはgRNAと接触させることによって作られ得るか、または細胞はヌクレアーゼおよび／もしくはgRNAと接触させられた細胞の娘細胞であり得るということが理解される。いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞（例えばHSC）は対象の造血系を再構築することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞（例えばHSC）は：ヒト対象に生着すること、骨髄系列細胞を生成すること、およびリンパ系列細胞を生成すること（producing and）の1つ以上（例えば全て）ができる。
いくつかの態様では、細胞は1つの遺伝子改変のみを含む。いくつかの態様では、細胞はCD33座位のみを遺伝子改変される。いくつかの態様では、細胞は第2の座位を遺伝子改変される。いくつかの態様では、細胞はトランスジェニック蛋白質を含まず、例えばCARを含まない。
いくつかの態様では、本明細書に記載される改変された細胞は実質的にCD33蛋白質を含まない。いくつかの態様では、本明細書に記載される改変された細胞は実質的に野生型CD33蛋白質を含まないが、変異体CD33蛋白質を含む。いくつかの態様では、変異体CD33蛋白質は、治療目的のためのCD33を標的化する薬剤によって結合されない。
いくつかの態様では、細胞は造血細胞、例えば造血幹細胞である。造血幹細胞（HSC）は典型的には骨髄系およびリンパ系前駆細胞両方を生じさせることができ、これらがさらにそれぞれ骨髄系細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など）およびリンパ系細胞（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞）を生じさせる。HSCは、HSCの同定および／または単離に用いられ得る細胞表面マーカーCD34の発現（例えばCD34＋）、ならびにある細胞系列へのコミットメントに関連する細胞表面マーカーの不在を特徴とする。
いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞の集団は複数の造血幹細胞を含み；いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞の集団は複数の造血前駆細胞を含み；いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞の集団は複数の造血幹細胞および複数の造血前駆細胞を含む。
いくつかの態様では、HSCは、対象、例えばヒト対象から得られる。HSCを得る方法は例えばPCT/US2016/057339に記載されている。これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、HSCは末梢血HSCである。いくつかの態様では、哺乳類対象は非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ブタ、ウマ、または家畜である。いくつかの態様では、HSCは、ヒト対象、例えば造血悪性物を有するヒト対象から得られる。いくつかの態様では、HSCは健康なドナーから得られる。いくつかの態様では、HSCは、キメラ受容体を発現する免疫細胞が爾後に投与されるであろう対象から得られる。細胞が得られた同じ対象に投与されるHSCは自家細胞と言われ、細胞が投与されるであろう対象ではない対象から得られるHSCは同種細胞と言われる。
いくつかの態様では、細胞の集団のCD33のコピーの少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%は変異を有する。例として、集団は複数の異なるCD33変異を含み得、複数のうちの各変異は変異を有する細胞の集団のCD33のコピーのパーセントに寄与する。
いくつかの態様では、遺伝子操作された造血細胞上のCD33の発現は天然に存在する造血細胞（例えば野生型カウンターパート）上のCD33の発現と比較される。いくつかの態様では、遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞（例えば野生型カウンターパート）上のCD33の発現と比較して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%だけ、CD33の発現レベルの縮減をもたらす。例えば、いくつかの態様では、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば野生型カウンターパート）と比較してCD33の20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満を発現する。
いくつかの態様では、遺伝子操作は、天然に存在する造血細胞上の野生型CD33のレベルの発現と比較して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%だけ、野生型CD33の発現レベルの縮減をもたらす。つまり、いくつかの態様では、遺伝子操作された造血細胞は、天然に存在する造血細胞（例えば野生型カウンターパート）と比較して、CD33の20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満を発現する。
いくつかの態様では、遺伝子操作は、好適なコントロール（例えば、細胞（単数または複数））と比較して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%だけ、野生型系列特異的細胞表面抗原（例えばCD33）の発現レベルの縮減をもたらす。いくつかの態様では、好適なコントロールは、同じ対象からの複数の操作されていない細胞において測定または予想される野生型系列特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの態様では、好適なコントロールは、健康な対象からの複数の細胞において測定または予想される野生型系列特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの態様では、好適なコントロールは、健康な個体（例えば、10、20、50、または100個体）のプールからの細胞の集団において測定または予想される野生型系列特異的細胞表面抗原のレベルを含む。いくつかの態様では、好適なコントロールは、本明細書に記載される処置、例えば抗CD33治療を必要とする対象において測定または予想される野生型系列特異的細胞表面抗原のレベルを含み、例えば対象は癌を有し、癌の細胞はCD33を発現する。
いくつかの態様では、本明細書に記載される作る方法は、野生型細胞、例えば野生型造血幹または前駆細胞を提供するステップを含む。いくつかの態様では、野生型細胞は未編集の細胞であり、系列特異的細胞表面抗原（例えば、CD33、CD123、および／またはCLL1）の2つの機能的なコピーを含む（例えば発現する）。いくつかの態様では、細胞は配列番号13に従うCD33遺伝子配列を含む。いくつかの態様では、細胞は、配列番号13によってコードされるCD33蛋白質をコードするCD33遺伝子配列を含む。例えば、CD33遺伝子配列は配列番号13に対して相対的に1つ以上のサイレント変異を含み得る。いくつかの態様では、方法に用いられる細胞は天然に存在する細胞または操作されていない細胞である。いくつかの態様では、野生型細胞は系列特異的細胞表面抗原（例えばCD33）を発現するか、またはより分化した細胞を生じさせ、これがHL60もしくはMOLM－13細胞と同等の（またはその90%～110%、80%～120%、70%～130%、60～140%、もしくは50%～150%以内の）レベルで系列特異的細胞表面抗原を発現する。いくつかの態様では、野生型細胞は、系列特異的細胞表面抗原に結合する抗体（例えば抗CD33抗体、例えばP67.6）に結合するか、またはより分化した細胞を生じさせ、これがHL60もしくはMOLM－13細胞に対する抗体の結合と同等の（またはその90%～110%、80%～120%、70%～130%、60～140%、または50%～150%以内の）レベルで抗体に結合する。抗体結合は例えばフローサイトメトリーによって例えば例4に記載される通り測定され得る。
処置および投与の方法
いくつかの態様では、有効数の本明細書に記載されるCD33を改変された細胞が、抗CD33治療、例えば抗CD33癌治療との組み合わせで投与される。いくつかの態様では、改変されたCD33および改変された第2の系列特異的細胞表面抗原を含む有効数の細胞が、抗CD33治療、例えば抗CD33癌治療との組み合わせで投与される。いくつかの態様では、抗CD33治療は、抗体、ADC、またはCARを発現する免疫細胞を含む。
薬剤（例えば、CD33を改変された細胞および抗CD33治療）が組み合わせで投与されるときには、薬剤は同時にまたは時間的に近接して異なる時間に投与され得るということが理解される。さらにその上、薬剤同士は追加混合され得るかまたは別個のボリューム中にあり得る。例えば、いくつかの態様では、組み合わせでの投与は、処置の同じクールにおける、例えば抗CD33治療によって癌を処置するクールにおける投与を包含し、対象は、例えば抗CD33治療による処置の前に、間に、または後に、有効数のCD33を改変された細胞を同時的にまたは逐次的に投与され得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるCD33を標的化する薬剤は、CD33に結合することができる抗原結合断片（例えば一本鎖抗体）を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞である。免疫細胞は例えばT細胞（例えば、CD4＋もしくはCD8＋T細胞）またはNK細胞であり得る。
キメラ抗原受容体（CAR）は、少なくとも細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、機能的なシグナル伝達ドメイン、例えば刺激分子に由来するものを含む細胞質シグナル伝達ドメインとを含む組み換えポリペプチドを含み得る。1つのいくつかの態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、少なくとも1つの共刺激分子、例えば4－1BB（すなわちCD137）、CD27、および／もしくはCD28、またはそれらの分子の断片に由来する1つ以上の機能的なシグナル伝達ドメインを含む。CARの細胞外抗原結合ドメインはCD33結合抗体断片を含み得る。抗体断片は、1つ以上のCDR、可変領域（またはその部分）、定常領域（またはその部分）、または前述のいずれかの組み合わせを含み得る。
抗ヒトCD33抗体の例示的な重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列が下で提供される。CDR配列はアミノ酸配列上において太字体かつ下線付きで示されている。
抗CD33重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号15）
Figure 2022534813000009
 抗CD33軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号16）
Figure 2022534813000010
本明細書に記載される通りCD33を標的化する薬剤を構築することへの使用のための抗CD33抗体結合断片は、配列番号15および配列番号16のものと同じ重鎖および／または軽鎖CDR領域を含み得る。かかる抗体はフレームワーク領域の1つ以上にアミノ酸残基のバリエーションを含み得る。いくつかの場合では、抗CD33抗体断片は、少なくとも70%の配列同一性（例えば、75%、80%、85%、90%、95%、またはより高い）を配列番号15と共有する重鎖可変領域を含み得、および／または少なくとも70%の配列同一性（例えば、75%、80%、85%、90%、95%、またはより高い）を配列番号16と共有する軽鎖可変領域を含み得る。
例示的なキメラ受容体コンポーネント配列が下の第３表に提供されている。
Figure 2022534813000011
Figure 2022534813000012
哺乳動物（例えばヒト）に投与される細胞、例えば免疫細胞または造血細胞の典型的な数は、例えば100万から1000億細胞の範囲であり得る；しかしながら、この例示的な範囲よりも下または上の量もまた本開示の範囲内である。
いくつかの態様では、CD33を標的化する薬剤は抗体－薬物コンジュゲート（ADC）である。ADCは、毒素または薬物分子にコンジュゲート化された抗体またはその抗原結合断片を含む分子であり得る。対応する抗原に対する抗体またはその断片の結合は、その細胞表面（例えば標的細胞）上に抗原を提示する細胞への毒素または薬物分子の送達を可能にし、それによって標的細胞の死をもたらす。
いくつかの態様では、抗体－薬物コンジュゲートの抗原結合断片は、配列番号15によって提供される重鎖可変領域と同じ重鎖CDR、および配列番号16によって提供される軽鎖可変領域と同じ軽鎖CDRを有する。いくつかの態様では、抗体－薬物コンジュゲートの抗原結合断片は、配列番号15によって提供される重鎖可変領域および配列番号16によって提供される同じ軽鎖可変領域を有する。
抗体－薬物コンジュゲートへの使用について適合する毒素または薬物は当分野において公知であり、当業者には明白であろう。例えば、Peters et al. Biosci. Rep.(2015) 35(4): e00225；Beck et al. Nature Reviews Drug Discovery (2017) 16: 315－337；Marin－Acevedo et al. J. Hematol. Oncol.(2018)11: 8；Elgundi et al. Advanced Drug Delivery Reviews (2017) 122: 2－19を見よ。
いくつかの態様では、抗体－薬物コンジュゲートは、さらに、抗体および薬物分子を取り付けるリンカー（例えばペプチドリンカー、例えば切断可能なリンカー）を含み得る。
抗体－薬物コンジュゲートの例は、限定なしに、ブレンツキシマブベドチン、グレムバツムマブベドチン／CDX－011、デパツキシズマブマホドチン／ABT－414、PSMA ADC、ポラツズマブベドチン／RG7596／DCDS4501A、デニンツズマブマホドチン／SGN－CD19A、AGS－16C3F、CDX－014、RG7841／DLYE5953A、RG7882／DMUC406A、RG7986／DCDS0780A、SGN－LIV1A、エンフォルツマブベドチン／ASG－22ME、AG－15ME、AGS67E、テリソツズマブベドチン／ABBV－399、ABBV－221、ABBV－085、GSK－2857916、チソツマブベドチン／HuMax－TF－ADC、HuMax－Axl－ADC、ピナツズマブベドチン／RG7593／DCDT2980S、リファスツズマブベドチン／RG7599／DNIB0600A、インデュサツマブベドチン／MLN－0264／TAK－264、バンドルツズマブベドチン／RG7450／DSTP3086S、ソフィツズマブベドチン／RG7458／DMUC5754A、RG7600／DMOT4039A、RG7336／DEDN6526A、ME1547、PF－06263507／ADC5T4、トラスツズマブエムタンシン／T－DM1、ミルベツキシマブソラブタンシン／IMGN853、コルツキシマブラブタンシン／SAR3419、ナラツキシマブエムタンシン／IMGN529、インダツキシマブラブタンシン／BT－062、アネツマブラブタンシン／BAY94－9343、SAR408701、SAR428926、AMG224、PCA062、HKT288、LY3076226、SAR566658、ロルボツズマブメルタンシン／IMGN901、カンツズマブメルタンシン／SB－408075、カンツズマブラブタンシン／IMGN242、ラプリツキシマブエムタンシン／IMGN289、IMGN388、ビバツズマブメルタンシン、AVE9633、BIIB015、MLN2704、AMG172、AMG595、LOP628、バダスツキシマブタリリン／SGN－CD33A、SGN－CD70A、SGN－CD19B、SGN－CD123A、SGN－CD352A、ロバルピツズマブテシリン／SC16LD6.5、SC－002、SC－003、ADCT－301／HuMax－TAC－PBD、ADCT－402、MEDI3726／ADC－401、IMGN779、IMGN632、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン／CMC－544、PF－06647263、CMD－193、CMB－401、トラスツズマブデュオカルマジン／SYD985、BMS－936561／MDX－1203、サシツズマブゴビテカン／IMMU－132、ラベツズマブゴビテカン／IMMU－130、DS－8201a、U3－1402、ミラツズマブドキソルビシン／IMMU－110/hLL1－DOX、BMS－986148、RC48－ADC／ヘルツズマブ－vc－MMAE、PF－06647020、PF－06650808、PF－06664178／RN927C、ルパルツマブアマドチン／BAY1129980、アプルツマブイキサドチン／BAY1187982、ARX788、AGS62P1、XMT－1522、AbGn－107、MEDI4276、DSTA4637S／RG7861を包含する。1つの例では、抗体－薬物コンジュゲートはゲムツズマブオゾガマイシンである。
いくつかの態様では、細胞表面系列特異的蛋白質のエピトープに対する抗体－薬物コンジュゲートの結合は抗体－薬物コンジュゲートの内在化を誘導し、薬物（または毒素）は細胞内に放出され得る。いくつかの態様では、細胞表面系列特異的蛋白質のエピトープに対する抗体－薬物コンジュゲートの結合は毒素または薬物の内在化を誘導し、これは毒素または薬物が系列特異的蛋白質を発現する細胞（標的細胞）を殺すことを許す。いくつかの態様では、細胞表面系列特異的蛋白質のエピトープに対する抗体－薬物コンジュゲートの結合は毒素または薬物の内在化を誘導し、これは系列特異的蛋白質を発現する細胞（標的細胞）の活性を制御し得る。本明細書に記載される抗体－薬物コンジュゲートに用いられる毒素または薬物の型はいずれかの特定の型に限定されない。
例1：ヒト細胞のCD33の遺伝子編集
sgRNA構築物の設計
第４表に指示されているsgRNAを、標的領域に密に近接したSpCas9 PAM（5'－NGG－3'）のマニュアル点検によって設計し、オンライン検索アルゴリズム（例えばBenchlingアルゴリズム、Doench et al 2016、Hsu et al 2013）によってヒトゲノム上の潜在的オフターゲット部位を最小化することによって予測される特異性に従って優先付けした。全ての設計された合成sgRNAは5'および3'端両方の3つの末端位置に化学修飾ヌクレオチドを有して生成した。修飾ヌクレオチドは2'－O－メチル－3'－ホスホロチオエート（「ms」と略称される）を含有し、ms－sgRNAはHPLC精製した。Cas9蛋白質はSynthegoから購入した。
Figure 2022534813000013
Figure 2022534813000014
初代ヒトCD34＋HSCの編集
動員末梢血に由来する凍結CD34＋HSCをHemacareまたはFred Hutchinson Cancer Centerどちらかから購入し、製造者の説明書に従って解凍した。HSCを編集するためには、～1×106のHSCを解凍し、RNPによるエレクトロポレーション前に24～48hに渡ってStemSpan CC110カクテル（StemCell Technologies）を補ったStemSpan SFEM培地によって培養した。HSCをエレクトロポレーションするためには、1.5×105細胞をペレット化し、20μLのLonza P3溶液に再懸濁し、10μLのCas9 RNPと混合した。CD34＋HSCをLonza Nucleofector 2（プログラムDU－100）およびヒトP3細胞ヌクレオフェクションキット（VPA－1002、Lonza）を用いてエレクトロポレーションした。
ゲノムDNA分析
全ゲノム分析では、DNAを細胞から収穫し、標的領域をフランキングするプライマーによって増幅し、精製し、アレル改変頻度をTIDE（デコンポジションによるインデルのトラッキング）を用いて分析した。分析はモックトランスフェクションされたサンプルからの参照配列を用いて行った。パラメータは、10ヌクレオチドのデフォルト最大インデルサイズ、および高品質のトレースによる可能な最も大きいウインドウをカバーするデコンポジションウインドウにセットした。3.5%の検出感度よりも下の全てのTIDE分析は0%にセットした。
フローサイトメトリー分析
生きたHL60またはCD34＋HSCを抗CD33抗体（P67.7）を用いてCD33について染色し、Attune NxTフローサイトメータ（Life Technologies）によるフローサイトメトリーによって分析した。
結果
ヒトCD34＋細胞を上に記載されている通りCas9蛋白質および指示されているCD33標的化gRNAによってエレクトロポレーションした。
パーセンテージ編集を、TIDEによって評価される%インデル（図1および図3）またはフローサイトメトリーによる表面CD33蛋白質発現（図2および図4）によって決定した。編集効率をフローサイトメトリー分析から決定した。
図1に示されている通り、gRNA F、gRNA 55E、gRNA H、gRNA C、およびgRNA Dは細胞のおよそ50～100%の範囲の高い比率のインデルを与えた。比較して、gRNA Jはかなり低い比率のインデルを与えた。gRNA Eはドナー1ではなくドナー2～4において高いインデル頻度を示した。図1の他のgRNAはより類似の結果をドナーからドナーの間で示した。
図2に示されている通り、gRNAのgRNA F、gRNA E、gRNA H、gRNA C、およびgRNA DはFACSによって検出されるCD33発現の顕著な縮減を示した。図1で観察されたそのより低い活性と整合して、gRNA JはCD33発現の類似の縮減を示さなかった。
図3に示されている通り、gRNA AおよびgRNA Bは細胞のおよそ60～90%の範囲の高い比率のインデルを与えた。
図4に示されている通り、gRNA AおよびgRNA BはFACSによって検出されるCD33発現の顕著な縮減を示した。
これらのおよび他のgRNAのサブセットの遺伝子編集効率をHL60 AML（前骨髄球性白血病）細胞株において試験した。HL－60細胞を指示されているgRNAを用いてCRISPR／Cas9によって遺伝子編集した。CD33陽性細胞のパーセンテージをエレクトロポレーションの6日後にフローサイトメトリーによって評価して、CD33をノックアウトすることにおける有効性を評価した。ゲノムDNAをPCR増幅し、上に記載されている通りTIDEによって分析して、インデル（挿入／欠失）によって評価されるパーセンテージ編集を決定した。
Figure 2022534813000015
Figure 2022534813000016
例2：効率的な多重ゲノム編集
HSC細胞におけるCD19およびCD33遺伝子の効率的な二重ゲノム編集を、従来の方法または本明細書に記載されるものを踏襲してNALM－6細胞またはHSCどちらかにおいて行った。下の第８表はCD19のエキソン2およびCD33のエキソン3を標的化するgRNAを提供する。
Figure 2022534813000017
ゲノムDNAをバルク編集された細胞から単離し、TIDEアッセイを行ってNALM－6、HL－60細胞、およびHSCのゲノム編集を調べた。結果は図5A～5Dに図示されている。この研究から得られた結果は、HSCの～70%がCD19遺伝子の両方の座位に変異を包含し、HSCの～80%がCD33遺伝子の両方の座位に変異を包含するということを示し、二重編集された細胞の少なくとも50%が編集されたCD19遺伝子および編集されたCD33遺伝子両方を少なくとも1つの染色体上に有するということを指示している。編集された細胞の類似のレベルがHL－60細胞およびNalm－6細胞において観察された。
例3：生存能に対する複数座位を編集することの効果
細胞生存能に対する複数の座位におけるゲノム編集の効果をNALM－6、HL－60細胞、およびHSCにおいて評価した。ヌクレオフェクションの2日前に、HSPCを解凍するか、またはNalm－6もしくはHL－60細胞を継代した。24および48時間（ヌクレオフェクションの日）に、細胞をカウントし、細胞生存能を評価した。第６表のgRNAを含む複合体によって行われたヌクレオフェクションは、本明細書に記載される材料および方法に従って行った。指示されているタイムポイントにおいて、細胞をカウントし、細胞生存能を評価した。結果は図6A～6Cに図示され、二元的Cas9／gRNA送達が細胞株の生存能を損なわないということを指示している。シングルガイドRNAと比べて追加の傷害性はHSCでは観察されなかった。
例4：2つの細胞表面抗原を編集された細胞の作出および評価
結果
CD33、CD123、およびCLL1（CLEC12A）の細胞表面レベルを、未編集のMOLM－13細胞およびTHP－1細胞（両方ともヒトAML細胞株）においてフローサイトメトリーによって測定した。MOLM－13細胞は高いレベルのCD33およびCD123ならびに中等から低いレベルのCLL1を有した。HL－60細胞は高いレベルのCD33およびCLL1ならびに低いレベルのCD123を有した（図7）。
CD33およびCD123を本明細書に記載される通りgRNAおよびCas9を用いてMOLM－13細胞において変異させ、CD33およびCD123を改変された細胞をフローサイトメトリーソーティングによって精製し、CD33およびCD123の細胞表面レベルを測定した。CD33およびCD123レベルは野生型MOLM－13細胞では高かった；CD33のみの編集は低いCD33レベルをもたらした；CD123のみの編集は低いCD123レベルをもたらし、CD33およびCD123両方の編集はCD33およびCD123両方の低いレベルをもたらした（図8）。それから、本明細書に記載される通りインビトロ細胞傷害性アッセイを用いて、編集された細胞をCARTエフェクター細胞に対する抵抗性について試験した。全ての4つの細胞型（野生型、CD33－/－、CD123－/－、およびCD33－/－CD123－/－）はモックCARコントロール条件においては低いレベルの特異的な殺細胞を経験した（図9、バーの最も左のセット）。CD33 CAR細胞は野生型およびCD123－/－細胞を有効に殺したが、CD33－/－およびCD33－/－CD123－/－細胞はCD33 CARに対する統計的に有意な抵抗性を示した（図9、バーの第2のセット）。CD123 CAR細胞は野生型およびCD33－/－細胞を有効に殺したが、CD123－/－およびCD33－/－CD123－/－細胞はCD123 CARに対する統計的に有意な抵抗性を示した（図9、バーの第3のセット）。CD33 CARおよびCD123 CAR細胞のプールは野生型細胞、CD33－/－細胞、およびCD123－/－細胞を有効に殺したが、CD33－/－CD123－/－細胞はCAR細胞のプールに対する統計的に有意な抵抗性を示した（図9、バーの最も右のセット）。この実験は、2つの抗原（CD33およびCD123）のノックアウトが、両方の抗原を標的化するCAR細胞から細胞を保護したということを実証している。さらにその上、編集された細胞の集団は、両方の抗原の両方のアレルを編集された十分に高い比率の細胞を含有し、細胞表面抗原の十分に低い細胞表面レベルを有したので、CAR細胞の両方の型に対する統計的に有意な抵抗性が達成された。
CD33およびCLL1を本明細書に記載される通りgRNAおよびCas9を用いてHL－60において変異させ、CD33およびCLL1を改変された細胞をフローサイトメトリーソーティングによって精製し、CD33およびCLL1の細胞表面レベルを測定した。CD33およびCLL1レベルは野生型HL－60細胞では高かった；CD33のみの編集は低いCD33レベルをもたらした；CLL1のみの編集は低いCLL1レベルをもたらし、CD33およびCLL1両方の編集はCD33およびCLL1両方の低いレベルをもたらした（図10）。それから、本明細書に記載される通りインビトロ細胞傷害性アッセイを用いて、編集された細胞をCARTエフェクター細胞に対する抵抗性について試験した。全ての4つの細胞型（野生型、CD33－/－、CLL1－/－、およびCD33－/－CLL1－/－）はモックCARコントロール条件においては低いレベルの特異的な殺細胞を経験した（図11、バーの最も左のセット）。CD33 CAR細胞は野生型およびCLL1－/－細胞を有効に殺したが、CD33－/－およびCD33－/－CLL1－/－細胞はCD33 CARに対する統計的に有意な抵抗性を示した（図11、バーの第2のセット）。CLL1 CAR細胞は野生型およびCD33－/－細胞を有効に殺したが、CLL1－/－およびCD33－/－CLL1－/－細胞はCLL1 CARに対する統計的に有意な抵抗性を示した（図11、バーの第3のセット）。CD33 CARおよびCLL1 CAR細胞のプールは野生型細胞、CD33－/－細胞、およびCLL1－/－細胞を有効に殺したが、CD33－/－CLL1－/－細胞はCAR細胞のプールに対する統計的に有意な抵抗性を示した（図11、バーの最も右のセット）。この実験は、2つの抗原（CD33およびCLL1）のノックアウトが、両方の抗原を標的化するCAR細胞から細胞を保護したということを実証している。さらにその上、編集された細胞の集団は、両方の抗原の両方のアレルを編集された十分に高い比率の細胞を含有し、細胞表面抗原の十分に低い細胞表面レベルを有したので、CAR細胞の両方の型に対する統計的に有意な抵抗性が達成された。
ヒトCD34＋細胞における遺伝子編集の効率を本明細書に記載される通りTIDE分析を用いて定量した。内在性のCD33座位においては、CD33を単独でまたはCD123もしくはCLL1との組み合わせで標的化したときには、約70～90%の間の編集効率が観察された（図12、左のグラフ）。内在性のCD123座位においては、CD123を単独でまたはCD33もしくはCLL1との組み合わせで標的化したときには、約60%の編集効率が観察された（図12、中央のグラフ）。内在性のCLL1座位においては、CLL1を単独でまたはCD33もしくはCD123との組み合わせで標的化したときには、約40～70%の間の編集効率が観察された（図12、右のグラフ）。この実験は、ヒトCD34＋細胞が2つの細胞表面抗原座位を高い頻度で編集され得るということを例解している。
本明細書に記載されるコロニー形成アッセイによって測定される遺伝子編集されたヒトCD34＋細胞の分化ポテンシャル。
個々にまたは全てのペアワイズの組み合わせでCD33、CD123、またはCLL1について編集された細胞はBFU－Eコロニー（赤芽球バースト形成細胞）を生成し、細胞がこのアッセイでは有意な分化ポテンシャルを保持するということを示した（図13A）。編集された細胞はCFU－G／M／GMコロニーをもまた生成し、細胞がこのアッセイでは編集されていないコントロールとは統計的に区別できない分化ポテンシャルを保持するということを示した（図13B）。編集された細胞は検出可能なCFU－GEMMコロニーをもまた生成した（図13C）。コロニー形成単位（CFU）－G／M／GMコロニーはCFU－G（顆粒球）、CFU－M（マクロファージ）、およびCFU－GM（顆粒球／マクロファージ）コロニーを言う。CFU－GEMM（顆粒球／赤芽球／マクロファージ／巨核球）コロニーは、CFU－GMコロニーを生じさせる細胞の前駆体であるより分化していない細胞から生ずる。一緒にすると、分化アッセイは、2つの座位を編集されたヒトCD34＋細胞が種々の細胞型に分化する能力を保持するということを指示している。
材料および方法
AML細胞株
ヒトAML細胞株HL－60はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から得た。HL－60細胞は20%熱不活性化HyCloneウシ胎児血清（GE Healthcare）を補ったイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM、Gibco）によって培養した。ヒトAML細胞株MOLM－13はAddexBio Technologiesから得た。MOLM－13細胞は10%熱不活性化HyCloneウシ胎児血清（GE Healthcare）を補ったRPMI－1640培地（ATCC）によって培養した。
ガイドRNA設計
全てのsgRNAは標的領域に密に近接したSpCas9 PAM（5'－NGG－3'）のマニュアル点検によって設計し、オンライン検索アルゴリズム（例えばBenchlingアルゴリズム、Doench et al 2016、Hsu et al 2013）によってヒトゲノム上の潜在的オフターゲット部位を最小化することによって予測される特異性に従って優先付けした。全ての設計された合成sgRNAはSynthegoから購入され、5'および3'端両方の3つの末端位置に化学修飾ヌクレオチドを有した。修飾ヌクレオチドは2'－O－メチル－3'－ホスホロチオエート（「ms」と略称される）を含有し、ms－sgRNAはHPLC精製した。Cas9蛋白質はAldervonから購入した。典型的には、本明細書の例に記載されるgRNAは、20ヌクレオチド（nt）の標的化配列、12ntのcrRNAリピート配列、4ntのテトラループ配列、および64ntのtracrRNA配列を含むsgRNAである。
Figure 2022534813000018
AML細胞株エレクトロポレーション
Cas9蛋白質およびms－sgRNAを（1：1重量比で）混合し、エレクトロポレーションに先立って室温で10分に渡ってインキュベーションした。MOLM－13およびHL－60細胞をそれぞれプログラムTHP－1およびOpt－3でMaxCyte ATxエレクトロポレータシステムを用いてCas9リボ核蛋白質複合体（RNP）によってエレクトロポレーションした。フローサイトメトリーソーティングまで、細胞を37℃で5～7日に渡ってインキュベーションした。
ヒトCD34＋細胞培養およびエレクトロポレーション
凍結保存されたヒトCD34＋細胞をHemacareから購入し、製造者の説明書に従って解凍した。ヒトCD34＋細胞をヒトサイトカイン（Flt3、SCF、およびTPO。全てPeprotechから購入）を補ったGMP SCGM培地（CellGenix）によって2日に渡って培養した。CD34＋細胞をCas9 RNP（1：1重量比のCas9蛋白質およびms－sgRNA）によってLonza 4DヌクレオフェクターおよびP3初代細胞キット（プログラムCA－137）を用いてエレクトロポレーションした。二元的ms－sgRNAによるエレクトロポレーションでは、等量の各ms－sgRNAを追加した。細胞は分析まで37℃で培養した。
ゲノムDNA分析
ゲノムDNAをエレクトロポレーションの2日後の細胞からprepGEM DNA抽出キット（ZyGEM）を用いて抽出した。目当てのゲノム領域をPCRによって増幅した。PCRアンプリコンをSangerシーケンシング（Genewiz）によって分析し、アレル改変頻度をtide.deskgen.comのワールドワイドウェブにおいて利用可能なTIDE（デコンポジションによるインデルのトラッキング）ソフトウェアを用いて計算した。
インビトロコロニー形成単位（CFU）アッセイ
エレクトロポレーションの2日後に、500個のCD34＋細胞を6ウェルプレート上の1.1mLのメチルセルロース（MethoCult H4034 Optimum、Stem Cell Technologies）にデュプリケートでプレーティングし、2週に渡って培養した。それから、コロニーをカウントし、StemVision（Stem Cell Technologies）を用いてスコア付けした。
フローサイトメトリー分析およびソーティング
ヒトCD33（P67.6)、CD123（9F5)、およびCLL1（REA431）に対する蛍光色素（flurochrome）コンジュゲート化抗体はそれぞれBiolegend、BD Biosciences、およびMiltenyi Biotecから購入した。全ての抗体はそれらのそれぞれのアイソタイプコントロールと共に試験した。細胞表面染色は、細胞を特異的抗体と30minに渡って氷上でヒトTruStain FcXの存在下においてインキュベーションすることによって行った。全ての染色について、死細胞をDAPI（Biolegend）染色によって分析から除外した。全てのサンプルはAttune NxTフローサイトメータ（ThermoFisher Scientific）およびFlowJoソフトウェア（TreeStar）によって取得および分析された。
フローサイトメトリーソーティングには、細胞を蛍光色素（flurochrome）コンジュゲート化抗体によって染色し、次にMoflow Astriosセルソーター（Beckman Coulter）によるソーティングをした。
CAR構築物およびレンチウイルス産生
CD33／CLL－1多重細胞傷害性実験に用いられた抗CD33 CAR－Tを例外として、CD33、CD123、およびCLL－1を標的化するために、第2世代CARを構築した。各CARは細胞外scFv抗原結合ドメインからなり、CD8αシグナルペプチド、CD8αヒンジおよび膜貫通領域、4－1BB共刺激ドメイン、およびCD3ξシグナル伝達ドメインを用いた。抗CD33 scFv配列はクローンP67.6（Mylotarg）から；抗CD123 scFv配列はクローン32716から；CLL－1 scFv配列はクローン1075.7から得た。抗CD33および抗CD123 CAR構築物はscFvの重から軽の向きを用い、抗CLL1 CAR構築物は軽から重の向きを用いる。重および軽鎖を(GGGS)3リンカー（配列番号63）によって接続した。各標的のCAR cDNA配列をpCDH－EF1α－MCS－T2A－GFP発現ベクターのマルチクローニング部位にサブクローニングし、レンチウイルスを製造者のプロトコール（System Biosciences）を踏襲して作出した。レンチウイルスは293TN細胞（System Biosciences）の一過的なトランスフェクションによってLipofectamine 3000（ThermoFisher）を用いて作出され得る。CAR構築物は、抗CD33 scFv（クローンMy96）の軽および重鎖からCD8αヒンジドメイン、ICOS膜貫通ドメイン、ICOSシグナル伝達ドメイン、4－1BBシグナル伝達ドメイン、およびCD3ξシグナル伝達ドメインをレンチウイルスプラスミドpHIV－Zsgreenにクローニングすることによって作出された。
CAR形質導入および拡大培養
ヒト初代T細胞を、製造者のプロトコール（Stem Cell Technologies）に従って抗CD4および抗CD8マイクロビーズを用いる磁性ビーズ分離によってLeuko Pak（Stem Cell Technologies）から単離した。精製されたCD4＋およびCD8＋T細胞を1：1混合し、抗CD3／CD28カップリングダイナビーズ（Thermo Fisher）を1：1のビーズ対細胞比で用いて活性化した。用いられたT細胞培養培地は、免疫細胞血清代替物、L－グルタミン、およびGlutaMAX（全てThermo Fisherから購入）、ならびに100IU/mLのIL－2（Peprotech）を補ったCTS Optimizer T細胞拡大培養培地であった。T細胞形質導入をポリブレン（Sigma）の存在下におけるスピノキュレーションによって活性化の24時間後に行った。CAR－T細胞は凍結保存に先立って9日に渡って培養した。全ての実験に先立って、T細胞を解凍し、37℃で4～6時間に渡って静置した。
フローサイトメトリーに基づくCAR－T細胞傷害性アッセイ
負のコントロール細胞の生残に対して相対的に標的細胞の生残を比較することによって、標的細胞の細胞傷害性を測定した。CD33／CD123多重細胞傷害性アッセイでは、野生型およびCRISPR／Cas9編集MOLM－13細胞を標的細胞として用い、CD33／CLL－1多重細胞傷害性アッセイでは、野生型およびCRISPR／Cas9編集HL60細胞を標的細胞として用いた。野生型Raji細胞株（ATCC）を両方の実験について負のコントロールとして用いた。標的細胞および負のコントロール細胞をそれぞれCellTrace Violet（CTV）およびCFSE（Thermo Fisher）によって製造者の説明書に従って染色した。染色後に、標的細胞および負のコントロール細胞を1：1で混合した。
抗CD33、CD123、またはCLL1 CAR－T細胞をエフェクターT細胞として用いた。形質導入されていないT細胞（モックCAR－T）をコントロールとして用いた。CARプール群では、適当なCAR－T細胞同士を1：1で混合した。エフェクターT細胞を標的細胞／負のコントロール細胞混合物と1：1のエフェクター対標的比でデュプリケートで共培養した。エフェクターT細胞なしの標的細胞／負のコントロール細胞混合物単独の群をコントロールとして包含した。フローサイトメトリー分析前に、細胞を37℃で24時間に渡ってインキュベーションした。ヨウ化プロピジウム（ThermoFisher）を生存能色素として用いた。特異的な細胞リシスの計算には、負のコントロール生細胞に対する標的生細胞の割合（標的割合と呼称する）を用いた。特異的な細胞リシスを、（（エフェクター細胞なしの標的割合－エフェクター細胞ありの標的割合）／（エフェクターなしの標的割合））×100%として計算した。
例5：操作されたHSCに対するゲムツズマブオゾガマイシンの効果
動員末梢血に由来する凍結CD34＋HSPCを解凍し、Cas9およびsgRNAを含むリボ核蛋白質によるエレクトロポレーション前に72hに渡って培養した。サンプルは次の条件でエレクトロポレーションした：
i．）モック（Cas9のみ）、
ii．KO sgRNA（CD33 gRNA A）
細胞が72時間に渡って回復することを許し、ゲノムDNAを収集および分析した。
CD33陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって評価し、gRNA Aによる編集がCD33をノックアウトすることに有効であるということを確認した（データは示さない）。HSCにおける編集イベントは種々のインデル配列をもたらすことが見出された（データは示さない）。
（i）ゲムツズマブオゾガマイシン（ozogramicin）（GO）に対するCD33エキソン2欠失を有する細胞の感受性
インビトロの傷害性を決定するために、細胞をそれらの培養培地中のGOとインキュベーションし、生存可能な細胞数を経時的に定量した。下の表に示されている通り、CD33 gRNA Aによって作出されたCD33ノックアウト細胞は、全長CD33を発現する細胞（モック）よりもGO処置に対して抵抗性であった。CD33KO細胞で観察された50%の編集は分裂細胞では十分な保護と考えられる。
Figure 2022534813000019
（ii）CD33を改変された細胞の濃縮
CD33を改変された細胞がGO処置後に濃縮されるかどうかをアッセイするために、CD34＋HSPCを標準的なCas9／gRNA比の50%で編集した。細胞のバルク集団をGO処置に先立っておよびその後に分析した。図14Aに示されている通り、GO処置に先立って、TIDEによってアッセイすると、51%のgRNA Aによって改変された細胞（KO）であった。GO処置後には、CD33を改変された細胞は濃縮され、KO細胞のパーセンテージは80%まで増大した。このデータは、GO処置後にはCD33を改変された細胞の濃縮があるということを指示した。
（iii）CD34＋HSPCのインビトロ分化
GO処置に先立っておよびその後に、分化後の種々の日に、細胞集団を骨髄系分化について評価した。図14Bおよび14Cに示されている通り、CD33 gRNA Aによって作出されたCD33ノックアウト細胞は分化マーカーCD14の増大した発現を示したが、全長CD33を発現する細胞（モック）は分化しなかった。
例6：インビボのCD33KO CD34＋細胞の存続の評価
動員末梢血CD34＋HSC（mPB CD34＋HSPC）の編集
gRNA（Synthego）を例1に記載されている通り設計した。mPB CD34＋HSPCをFred Hutchinson Cancer Centerから購入し、製造者の説明書に従って解凍した。それから、これらの細胞を例1に記載されている通りCRISPR／Cas9によって編集した。CD33標的化ガイドRNA：gRNA A（配列番号1）、gRNA B（配列番号2）、gRNA O（CCTCACTAGACTTGACCCAC）（配列番号64）、およびヒトまたはマウスゲノム上のいずれかの領域を標的化しないように設計されたCD33を標的化しないコントロールgRNA（gCtrl）を用いた。
エクスビボ編集後の4、24、および48時間において、生存可能な編集されたCD33KO細胞およびコントロール細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーおよび7AAD生存能色素を用いて定量した（図15）。図15に示されている通り、全ての3つのgRNA（A、B、またはO）を用いて編集されたCD33KO細胞の高いレベルが生存可能であり（およそ80～95%の生存可能な細胞が観察された）、エレクトロポレーションおよび遺伝子編集後に経時的に生存可能なままであった。これはCD33を標的化しないコントロールgRNAのgCtrlによって編集されたコントロール細胞で観察されたものに類似であった。
加えて、エクスビボ編集後の48時間において、ゲノムDNAを細胞から収穫し、標的領域をフランキングするプライマーによってPCR増幅し、精製し、インデル（挿入／欠失）によって評価されるパーセンテージ編集を決定するためにTIDEによって分析した。第１０表に示されている通り、gRNA AおよびgRNA Bは、高い比率のインデル、具体的にはそれぞれ93.1%および91.3%を与えた。これはコントロールのCD33標的化gRNAのgRNA Oからのインデルの比率と同等であった。
Figure 2022534813000020
TIDE分析後に、指示されているCD33標的化gRNAによる編集後の長期HSC（LT－HSC）のパーセンテージを、CD38－CD34＋CD45RA－CD90＋CD49f＋である細胞についてゲーティングするフローサイトメトリーによって定量した。指定のgRNAによる編集後のLT－HSCのパーセンテージが第１１表に提示されている。このアッセイは、インビボのCD33KO細胞の存続の検討のためのマウスへの注射に先立って、編集された細胞の凍結保存の時間においてされた。編集された細胞はCS10培地（Stem Cell Technology）によってバイアル当たり1mL体積の培地中に5×106細胞/mLで凍結保存した。
Figure 2022534813000021
インビボのCD33KO mPB CD34＋HSPCの生着効率および存続を検討する
6から8週齢である雌NSGマウス（JAX）が2～7日に渡って順化することを許した。順化後に、マウスをX線照射装置による175cGy全身照射を用いて照射した。これを検討の第0日と見なした。4～10時間において、照射後に、マウスに、gRNA A、gRNA B、もしくはgRNA Oによって編集されたCD33KO、またはgCtrlによって編集されたコントロール細胞を生着させた（n=15）。凍結保存された細胞を解凍し、BioRad TC－20自動セルカウンターを用いてカウントした。解凍バイアルの生存可能な細胞数を定量し、これを用いてマウスへの生着のためのトータル細胞数を調製した（第１２表）。マウスに100μL体積中の1×106の編集された細胞の単一の静脈注射を与えた。体重および臨床観察を4つの群の各マウスについて毎週１回記録した。
Figure 2022534813000022
生着後の第8および12週に、50μLの血液をフローサイトメトリーによる分析のために眼窩静脈叢採血によって各マウスから収集した。生着後の第16週に、マウスを屠殺し、血液、脾臓、および骨髄をフローサイトメトリーによる分析のために収集した。骨髄を大腿骨および腓骨から単離した。大腿骨からの骨髄はオンターゲット編集分析にもまた用いた。フローサイトメトリーによって測定されたマーカーおよび用いられた抗体（BiolegendまたはBD Bioscience）は第１３表に記されている。フローサイトメトリーはFACSCanto（商標）10カラーおよびBDFACSDiva（商標）ソフトウェアを用いて行った。図16のフローサイトメトリー実験設計およびゲーティングプロトコールの模式図に図示されている通り、細胞を7AAD生存能色素を用いて生存能によって第1にソーティングした（生／死分析）。それから、生細胞をマウスCD45（mCD45）ではなくヒトCD45（hCD45）の発現によってゲーティングした。それから、hCD45＋であるこれらの細胞をヒトCD19（hCD19）の発現についてさらにゲーティングした（リンパ系細胞、具体的にはB細胞）。ヒトCD45（hCD45）を発現する細胞をもまたゲーティングし、少なくともhCD33、hCD11b、およびhCD14を包含する骨髄系列の種々の細胞性のマーカーの（of for）存在について分析した。
Figure 2022534813000023
生着した動物の血液から得られた細胞サンプルからの結果
生着後の第8週に、hCD33（図17A）、hCD45（図17B）、hCD14（図17C）、およびhCD11b（図18D）を発現するμL当たりの細胞のトータル数を、gRNA A（A）、gRNA B（B）、もしくはgRNA O（O）どちらかによって編集されたCD33KO mPB CD34＋HSPC細胞を受け取ったマウス、またはコントロールgRNAによって編集された細胞（コントロール、gCtrl）を受け取ったマウスにおいて定量した。図17Aに示されている通り、CD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、またはBによって編集された）を受け取ったマウスはコントロール細胞と比較して非常に少数のhCD33＋細胞（μL当たり≧5細胞）を有した。それらがどの編集された細胞を生着させられたのかにかかわらず、hCD45＋細胞、hCD14＋、およびCD11b＋細胞数は全てのマウスにおいて同等であった。これらの結果は、マウスの血液中のgRNA AまたはgRNA Bによって編集されたCD33KO細胞の首尾良い生着を指示した。
生着後の第8、12、および16週に、hCD45＋である有核血液細胞のパーセンテージを、コントロールgRNA（gCtrl）によって編集されたコントロール細胞またはCD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、またはBによって編集された）を受け取ったマウスの4つの群（n=15マウス／群）において定量した。これはhCD45＋の絶対的な細胞カウントをマウスCD45＋（mCD45）の絶対的な細胞カウントによって除することによって定量された（図18A～18C）。生着後の第8（図18A）、12（図18B）、および16週（図18D）において、同等のレベルのhCD45＋細胞がコントロールおよびCD33KO群の間において血液中に観察された。
血液中のhCD33＋細胞のパーセンテージをもまた生着後の第8（図19A）、12（図19B）、および16週（図19C）にコントロールおよびCD33KOマウス群において定量した。図19A～19Cに図示されている通り、CD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、またはBによって編集された）を生着させたマウスは、コントロール細胞を生着させたマウスと比較して第8、12、および16週において有意に低いレベルのhCD33＋細胞を有した。さらに、gRNA AまたはgRNA Bによって編集されたCD33KO細胞の生着は、gRNAのgRNA Oによって編集されたCD33KO細胞の生着に類似の低いレベルのhCD33＋細胞を血液中にもたらした。
次に、血液中のCD19＋リンパ系細胞（図20A～20C）、hCD14＋単球（図21A～21C）、およびhCD11b＋顆粒球／好中球（図22A～22C）のパーセンテージを、生着後の第8週（図20A、21A、22A）、第12週（図20B、21B、22B）、および第16週（図20C、21C、22C）に、CD33KO細胞（X軸上に指示されている通りgRNA：O、A、またはBによって編集された）またはコントロール細胞を生着させたマウスにおいて定量した。血液中のhCD19＋細胞、hCD14＋細胞、およびhCD11b＋細胞のレベルはコントロールおよびCD33KO群の間において同等であり、これらの細胞のレベルは生着後の第8から16週まで同等のままであった。これらのデータは、CD33KO細胞を受け取ったマウスおよびコントロール細胞を受け取ったマウスにおいて、類似のレベルのヒト骨髄系およびリンパ系細胞集団が存在するということを指示した。
最後に、ヒトCD33KO由来単球細胞（hCD33－CD14＋）のパーセンテージを、生着後の第8、12、および16週に、コントロール細胞を生着させたマウスおよびCD33KO細胞を生着させたマウスの血液において定量した（それぞれ図23A～23C）。第8週には、コントロール細胞を生着させたマウスでは、hCD33＋CD14＋単球が血液中に観察されたが、CD33KO由来単球（hCD33－CD14＋）は観察されなかった（図23A、左のグラフ）。対照的に、CD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、またはBによって編集された）を生着させたマウスでは、hCD33＋CD14＋単球は観察されず、細胞のおよそ1～3%がCD33KO由来単球（hCD33－CD14＋）であった（図23B、右のグラフ）。類似に、第12および16週には（それぞれ図23Bおよび23C）、CD33KO由来単球（hCD33－CD14＋）の増大していくパーセンテージがCD33KO細胞を生着させたマウスにおいて観察されたが（図23Bおよび23C、右のグラフ）、コントロールマウスでは、増大していくhCD33＋CD14単球数が観察された（図23Bおよび23C、左のグラフ）。これらのデータは、gRNA A、gRNA B、またはgRNA Oによって編集されたCD33KO細胞の首尾良い生着を指示している。これらは経時的に血液中において拡大および存続する能力があった。また、CD33KO細胞を生着させたマウスにおけるCD33KO由来単球（hCD33－CD14＋）のトータルの集団は、分析された全てのタイムポイントにおいて、コントロール細胞を生着させたマウスにおけるhCD33＋CD14＋単球と同等であった。
生着した動物の骨髄から得られた細胞サンプルからの結果
生着後の第16週に、hCD45＋細胞のパーセンテージ（図24A）およびhCD33＋細胞のパーセンテージ（図24B）を、コントロール細胞またはCD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、もしくはBによって編集された）を生着させたマウスの骨髄において定量した。hCD45＋細胞のパーセンテージはコントロールおよびCD33KO群において同等であり、有核骨髄細胞頻度の喪失がないことを指示した。hCD33＋細胞のパーセンテージはCD33KO群ではコントロール群と比較して有意に低く、これらの群における有核血液細胞からのCD33の喪失を指示した。これらのデータはNSGマウスの骨髄におけるCD33KO HSCの長期存続をもまた実証している。
加えて、生着後の第16週に、骨髄におけるCD19＋リンパ系細胞（図25A）、hCD14＋単球（図25B）、hCD11b＋顆粒球／好中球（図25D）、およびhCD3＋T細胞（図25E）のパーセンテージを定量した。骨髄のhCD19＋細胞、hCD14＋細胞、hCD11b＋細胞、およびhCD3＋のレベルはコントロールおよびCD33KO群の間で同等であった。これらのデータはマウスにおける編集されたCD33KO細胞からの多系列ヒト造血再構築を指示している。
CD33KO由来単球（hCD33－CD14＋）（図26B）およびhCD33＋CD14＋単球（図26A）のパーセンテージを、コントロールおよびCD33KO細胞を生着させたマウスにおいて、生着後の第16週に定量した。CD33KO由来単球（hCD33－CD14＋）が、CD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、またはBによって編集された）を生着させたマウスの骨髄において観察された。さらに、CD33KO細胞を生着させたマウスにおけるCD33KO由来単球（hCD33－CD14＋）集団は、NSGマウスの骨髄において、生着後の第16週のコントロール細胞を生着させたマウスで観察されたhCD33＋CD14＋単球集団の集団と同等のままであった。
第16週に、hCD34＋細胞（図27A）、hCD38＋細胞（図27B）、hCD34＋hCD38－のコミットメントしていない前駆細胞（図27C）、およびhCD34＋hCD38＋のコミットメントした前駆細胞（図27D）のパーセンテージを、コントロール細胞を生着させたマウスまたはCD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、もしくはBによって編集された）を生着させたマウスの骨髄において定量した。これらの結果は、CD33KO細胞を生着させたマウスの骨髄における保存された前駆細胞集団を実証した。なぜなら、類似のレベルのhCD34＋細胞、hCD38＋細胞、hCD34＋hCD38－のコミットメントしていない前駆細胞、およびhCD34＋hCD38＋のコミットメントした前駆細胞が、コントロールおよびCD33KO群において観察されたからである。
最後に、アンプリコンseqを生着後の第16週に単離された骨髄サンプルについて行って、編集されたCD33KO細胞を生着させたマウスにおいてオンターゲットCD33編集を分析した。図28Aは、次のgRNAによって編集されたCD33KO細胞を投与されたマウスにおける編集された細胞のパーセンテージを実証している：gRNA O（左パネル）、gRNA A（中央のパネル）、またはgRNA B（右パネル）。用いられた全てのgRNAは高いパーセンテージのCD33のオンターゲット編集を実証した（およそ60～90%）。図28B～28Dは、CD33KO細胞を作出することに用いられた各gRNAについて、単離された骨髄細胞において観察された異なる編集イベントに相当する上位5つのインデル種を実証する。gRNA AおよびgRNA Bは、gRNA Oに同等に、サイズが1から5塩基対の範囲であるCD33遺伝子の種々の挿入および欠失をもたらした。
生着した動物の脾臓から得られた細胞サンプルからの結果
生着後の第16週に、hCD45＋細胞のパーセンテージ（図29A）およびhCD33＋細胞のパーセンテージ（図29B）を、コントロール細胞またはCD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、もしくはBによって編集された）を生着させたマウスの脾臓においてもまた定量した。hCD45＋細胞のパーセンテージはコントロールおよびCD33KO群において同等であった。hCD33＋細胞のパーセンテージはコントロール群と比較してCD33KO群では有意に低かった。これらのデータはNSGマウスの脾臓におけるCD33KO HSCの長期存続をもまた実証している。
加えて、生着後の第16週に、脾臓におけるhCD14＋単球（図29C）、hCD11b＋顆粒球／好中球（図25D）、CD19＋リンパ系細胞（図29E）、およびhCD3＋T細胞（図29F）のパーセンテージを定量した。脾臓におけるhCD14＋細胞、hCD11b＋細胞、hCD19＋細胞、およびhCD3＋のレベルはコントロールおよびCD33KO群の間で同等であった。これらのデータは、編集されたCD33KO細胞がNSGマウスの脾臓において多系列ヒト造血細胞再構築ができたということを指示している。
好中球を評価する血液および骨髄の結果
生着後の第16週に、hCD11b＋細胞（図30A（血液）、31A（骨髄））、hCD33＋CD11b＋好中球細胞（図30B（血液）、31B（骨髄））、およびCD33KO由来の好中球（hCD33－Cd11b＋）（図30C（血液）31C（骨髄）のパーセンテージを、コントロール細胞またはCD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、もしくはBによって編集された）を生着させたマウスの血液および骨髄において定量した。CD33KO由来の好中球（hCD33－CD11b＋）が、CD33KO細胞を生着させたマウスの血液および骨髄において観察された。さらに、CD33KO細胞を生着させたマウスにおけるCD33KO由来の好中球（hCD33－CD11b＋）集団は、NSGマウスの血液および骨髄両方において、生着後の第16週のコントロール細胞を生着させたマウスで観察されたhCD33＋CD11b＋好中球集団の集団と同等のままであった。
骨髄系およびリンパ系前駆細胞を評価する血液および骨髄の結果
また、第16週には、血液中のhCD123＋細胞のパーセンテージ（図32A）、ならびに骨髄中のhCD123＋細胞のパーセンテージ（図32B、左）および骨髄中のhCD10＋細胞のパーセンテージ（図32B、右）を、コントロール細胞またはCD33KO細胞（X軸上に図示されている通りgRNA：O、A、もしくはBによって編集された）を生着させたマウスにおいて定量した。これらのデータは、骨髄系およびリンパ系前駆細胞のレベルがコントロールおよびCD33KO群の血液および骨髄では第16週において同等であったということを示している。
総体的な結論
一緒にすると、これらのデータは、gRNA AまたはBによって編集されたCD33KO mPB CD34＋HSPCが首尾良い生着をもたらし、造血組織、具体的には血液、骨髄、および脾臓における長期存続を実証したということを指示している。加えて、同等のレベルのヒトCD45＋細胞ならびに骨髄系およびリンパ系細胞集団が、コントロール細胞またはgRNA AもしくはBによって編集されたCD33KO mPB CD34＋HSPCを生着させたマウスにおいて観察された。最後に、アンプリコンseq分析は、gRNA AまたはBによって編集されたCD33KO mPB CD34＋HSPCを生着させた全てのマウスにおいて、オンターゲット編集の第16週における存続を実証した。
同等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される例示的な態様の多くの同等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめる能力があるであろう。本開示の範囲は上の記載に限定されることを意図されない。
反対に指示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は1つまたは1つよりも多くを意味し得る。反対に指示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、ある群の2つ以上のメンバー間に「または」を包含する請求項または記載は、群のメンバーの1つ、1つよりも多く、または全てが存在する場合には満たされていると考えられる。「または」を2つ以上の群のメンバー間に包含するある群の開示は、群の厳密に1つのメンバーが存在する態様、群の1つよりも多くのメンバーが存在する態様、および群のメンバーの全てが存在する態様を提供する。簡潔の目的で、それらの態様は本明細書においては個々に詳述されなかったが、これらの態様のそれぞれが本明細書において提供され、具体的に請求またはディスクレームされ得るということは理解されるであろう。
本発明は、請求項の1つ以上からのまたは明細書の1つ以上の該当部分からの1つ以上の限定、要素、節、または記述用語が別の請求項に導入される全ての変形、組み合わせ、および順列を包摂するということは理解されるはずである。例えば、別の請求項に従属する請求項は、同じベースクレームに従属するいずれかの他の請求項に見出される限定の1つ以上を包含するように改変され得る。さらにその上、別様に指示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生ずるであろうということが当業者にとって明白でない限り、請求項が組成物を記載するところでは、本明細書において開示される作るもしくは用いる方法のいずれかに従ってまたは当分野において公知の何らかの方法に従って組成物を作るまたは用いる方法が包含されるということは理解されるはずである。
要素がリストとして提示されるところでは、あらゆる可能な個々の要素または要素の部分群もまた開示されているということと、いずれかの要素または要素の部分群が群から除去され得るということとは理解されるはずである。用語「含む」は開放的であることを意図され、追加の要素、特徴、またはステップの包含を許容するということもまた注意される。一般的に、態様が特定の要素、特徴、またはステップを含むと言われるところでは、かかる要素、特徴、またはステップからなるかまたは本質的になる態様も提供されるということは理解されるはずである。簡潔の目的で、それらの態様は本明細書において個々に詳述されなかったが、これらの態様のそれぞれが本明細書において提供され、具体的に請求またはディスクレームされ得るということは理解されるであろう。
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上、別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現される値は、文脈が明瞭に別様に述べていない限り、申し立てられている範囲内のいずれかの特定の値を、いくつかの態様においては範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということは理解されるはずである。簡潔の目的で、各範囲の値は本明細書において個々に詳述されなかったが、これらの値のそれぞれが本明細書において提供され、具体的に請求またはディスクレームされ得るということは理解されるであろう。別様に指示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現される値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得るということもまた理解されるはずであり、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の十分の一と同じ正確度で表現される。
加えて、本発明のいずれかの特定の態様は請求項のいずれか1つ以上から明示的に除外され得るということは理解されるはずである。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値は請求項のいずれか1つ以上から明示的に除外され得る。簡潔の目的で、1つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外される態様の全てが本明細書において明示的に提出されているわけではない。本開示は、前述の態様のいずれか1つ以上の全ての組み合わせと、詳細な記載および例において提出された態様のいずれか1つ以上の組み合わせとを企図する。
本明細書に記載されるものに類似または同等の方法および材料は本発明の実施または試験に用いられ得るが、好適な方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書において言及される全ての公開、特許出願、特許、および他の参照（例えば、配列データベース参照番号）はそれらの全体が参照によって組み込まれる。例えば、本明細書において、例えば本明細書のいずれかの表において参照される全てのGenBank、Unigene、およびEntrez配列は参照によって組み込まれる。別様に指定されない限り、本明細書のいずれかの表を包含する本明細書において指定される配列アクセッション番号は、2019年5月23日現在のデータベースエントリーを参照する。1つの遺伝子または蛋白質が複数の配列アクセッション番号を参照するときには、配列バリアントの全てが包摂される。

Claims (22)

  1. 標的化ドメインが配列番号10の配列を含む、標的化ドメインを含むgRNA。
  2. 標的化ドメインが配列番号9の配列を含む、標的化ドメインを含むgRNA。
  3. 標的化ドメインが配列番号11の配列を含む、標的化ドメインを含むgRNA。
  4. 標的化ドメインが配列番号12の配列を含む、標的化ドメインを含むgRNA。
  5. 第1の相補性ドメイン、連結ドメイン、第1の相補性ドメインに対して相補的である第2の相補性ドメイン、および近位ドメインを含む、請求項1～4のいずれか1項に記載のgRNA。
  6. シングルガイドRNA（sgRNA）である、請求項1～5のいずれか1項に記載のgRNA。
  7. 1つ以上の2’O－メチルヌクレオチドを含む、請求項1～6のいずれか1項に記載のgRNA。
  8. 1つ以上のホスホロチオエートまたはチオPACE連結部を含む、請求項1～7のいずれか1項に記載のgRNA。
  9. （i）造血幹細胞または前駆細胞を提供することと、
    （ii）細胞に（a）請求項1～4dのいずれか1項に記載のgRNA；および（b）gRNAに結合するCas9分子を導入することと、
    を含み、
    それによって、遺伝子操作された細胞を生成する、
    遺伝子操作された細胞を生成する方法。
  10. Cas分子が、SpCas9エンドヌクレアーゼ、SaCas9エンドヌクレアーゼ、またはCpf1エンドヌクレアーゼを含む、請求項9に記載の方法。
  11. （i）および（ii）が予め形成されたリボ核蛋白質複合体として細胞に導入される、請求項9または10に記載の方法。
  12. リボ核蛋白質複合体がエレクトロポレーションによって細胞に導入される、請求項11に記載の方法。
  13. 請求項9～12のいずれか1項に記載の方法によって生成される、遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞。
  14. 請求項13に記載の複数の遺伝子操作された造血幹細胞または前駆細胞を含む、細胞集団。
  15. さらに、1つ以上の操作されていないCD33遺伝子を含む1つ以上の細胞を含む、請求項14に記載の細胞集団。
  16. 野生型カウンターパート細胞集団によって発現されるCD33の20%未満を発現する、請求項14または15に記載の細胞集団。
  17. 造血幹細胞および造血前駆細胞の両方を含む、請求項14～16のいずれか1項に記載の細胞集団。
  18. さらに、CD33以外の系列特異的細胞表面抗原をコードする遺伝子に第2の変異を含む、請求項14～17のいずれか1項に記載の細胞集団。
  19. CD33以外の系列特異的細胞表面抗原をコードする遺伝子がCLL－1またはCD123である、請求項18に記載の細胞集団。
  20. それを必要とする対象に請求項14～19のいずれか1項に記載の細胞集団を投与することを含む、方法。
  21. 対象が造血悪性物を有する、請求項20に記載の方法。
  22. さらに、CD33を標的化する有効量の薬剤を対象に投与することを含み、薬剤がCD33に結合する抗原結合断片を含む、請求項20または21に記載の方法。
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