JP2022518500A - 経口薬物送達のための脂質小胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、医薬として使用するための核酸分子を担持する脂質小胞であって、３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄｈを有する脂質小胞に関する。脂質小胞は経口投与用であり、核酸分子は、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される１種以上の標的組織に送達される。

Description

発明の分野
本発明は、医薬として使用するための核酸分子を担持する脂質小胞であって、３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄ_ｈを有する脂質小胞に関する。脂質小胞は経口投与用であり、核酸分子は、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される１種以上の標的組織に送達される。

背景
特定の細胞及び組織への薬物の送達は、薬物の安定性、標的組織に到達する前の薬物の代謝、薬物が細胞膜を通過する能力、細胞間の密着結合又は血液脳関門等の多くの因子によって影響される。高分子薬物（例えば、核酸、ペプチド及びタンパク質）による疾患の治療は、現在、一般に経時的に薬物の全身分布をもたらす非経口投与に限定されている。これは、主に、リピンスキーの５の法則を満たさないこれらの薬物の化学的及び物理的特性、並びに消化管（ＧＩＴ）の厳しい条件での多くの薬物の潜在的な低い安定性に起因し得る。そのような薬物を経口投与するためのいくつかの戦略、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の送達のための乳エキソソーム（ｍＥｘｏ）の使用が最近記載された。エキソソームは、全てのタイプの細胞によって分泌される細胞外小胞である。最近の刊行物Ｍａｎｃａ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：１１３２１（非特許文献１）では、経口投与後の合成ｍｉＲＮＡを含む乳エキソソームの分布を分析した。Ｍａｎｃａによれば、異なるｍｉＲＮＡカーゴは独特の組織分布パターンを有する（）。更に、Ｍｕｎａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．３７１（１）：４８－６１（非特許文献２）には、ウシ乳からのエキソソームの単離、及び単離エキソソームへの化学療法剤の封入が記載されている。

初期の結果は有望に見えるが、乳エキソソームの単離及び精製、バッチ間変動、微生物汚染、及び効率的な薬物負荷等の技術的限界は、このようなシステムを商業規模で適用する前に解決する必要がある（例えば、Ｓｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．７（１）：１４４０１３２（非特許文献３）を参照）。

技術的な開発可能性を提供し、堅牢で再現可能な方法で製造することができる代替のシステムが非常に必要とされている。

Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．５５０（１－２）：１００－１１３（非特許文献４）には、エキソソーム模倣小胞の作製、及び製造された小胞と従来のリポソームとの比較が記載されている（）。エキソソーム模倣小胞はＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞及びＨＵＶＥＣ細胞に送達することができることが示された。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏ実験は行われなかった。

エキソソーム模倣における治療用核酸分子の経口送達がＣＮＳ、消化管、脾臓又はＴ細胞において標的調節をもたらすことは、本発明者らの知る限り示されていない。

Ｍａｎｃａ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：１１３２１ Ｍｕｎａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．３７１（１）：４８－６１ Ｓｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．７（１）：１４４０１３２ Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．５５０（１－２）：１００－１１３

発明の目的
本発明者らは、本発明の基礎となる研究において、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸分子を担持する脂質小胞の経口投与が、中枢神経系（例えば、脳）、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞における標的核酸の調節を可能にすることを示した（実施例の欄を参照）。脂質小胞は、３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄ_ｈを有し、天然に存在する細胞外小胞の特性を模倣する。脂質小胞は、時間及び費用がかかる乳からの単離を必要とせずに大量に容易に製造することができる。更に、脂質小胞は、乳、細胞培養物及び天然体液等の生供給源単離エキソソームからの潜在的な汚染がない。

１種以上の核酸分子を含む脂質小胞は、経口投与された場合、当該核酸分子を、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される１種以上の標的組織に送達して、組織における標的核酸の調節をもたらすことができる。本発明の知見は、中枢神経系（例えば、脳）、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞における標的核酸の発現増加、発現低下又は望ましくない抑制、スプライススイッチングエラー又は突然変異エラー等の異常発現に関連する疾患等の様々な疾患の処置に特に有用である。

本出願において試験された脂質小胞Ｆ１～Ｆ３４中の脂質成分の概要、並びに無負荷小胞のサイズ及び模擬胃液（ＳＧＦ）又は絶食状態の模擬腸液（ＦａＳＳＩＦ）中でのインキュベーション時のサイズ変化に基づく経口送達のためのそれらの評価された安定性。＋＋＝６０～１８０ｎｍのＤｈ、並びにＳＧＦ中６０％未満及びＦａＳＳＩＦ中２５％未満のＤｈの変化％を有する安定した小胞；＋＝５０～３００ｎｍのＤｈ、並びにＳＧＦ中９０％未満及びＦａＳＳＩＦ中４０％未満のＤｈの変化％を有する安定した小胞；－＝３００超のＳＧＦ及びＦａＳＳＩＦ中でのインキュベーションの前後のＤｈ、又はＳＧＦ中で９０％超及びＦａＳＳＩＦ中で４０％超のＤｈの変化％。脂質成分は、Ｃｈｏｌ＝コレステロール、ＳＭ＝スフィンゴミエリン、ＰＣ＝ホスファチジルコリン、ＤＳＰＣ＝１、２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＬＰＣ＝１、２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＯＰＣ＝ジオレオイル－ホスファチジルコリン、ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン、ＰＳ＝ホスファチジルセリン、ＤＡＧ＝ジアシルグリセロール、ＴＡＧ＝トリアシルグリセロール、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール、ＬＢＰＡ＝リソビスホスファチジン酸と略される。

発明の提示
本発明は、医薬として使用するための核酸分子を担持する脂質小胞であって、当該核酸分子が、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される標的組織の１種以上に送達するためのものである、脂質小胞を提供する。好ましくは、脂質小胞は、本明細書でより詳細に説明するように、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定して３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄ_ｈを有する。

有利には、脂質小胞は、２０℃の温度で５時間まで胃液中で安定である。

一実施形態では、脂質小胞は、ＤＬＳに従って測定される１８０ｎｍ未満の流体力学的径、特に６０～１８０ｎｍの範囲の直径を有する。

一実施形態では、脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総量［ｍｏｌ］に基づいて、１０～７０モルパーセント（ｍｏｌ％）の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミンと、２～４５ｍｏｌ％、好ましくは４～１５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリンとを含み、脂質小胞は、必要に応じて、少なくとも１種のジアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のトリアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のホスファチジルイノシトールを含み、ジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールとホスファチジルイノシトールとの合計の総量は、無負荷脂質小胞自体の総量［ｍｏｌ］に基づいて、１５ｍｏｌ％未満である。更なる実施形態では、脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総量［ｍｏｌ］に基づいて、５ｍｏｌ％未満のジアシルグリセロールと、５ｍｏｌ％未満のトリアシルグリセロールと、５ｍｏｌ％未満のホスファチジルイノシトールとを含む。

一実施形態では、脂質小胞は、コレステロールと、少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミンと、少なくとも１種の乳スフィンゴミエリンと、少なくとも１種のホスファチジルコリンと、少なくとも１種のジアシルグリセロールと、少なくとも１種のトリアシルグリセロールと、少なくとも１種のホスファチジルイノシトールと、リゾビスホスファチジン酸と、少なくとも１種のホスファチジルセリンとを含む。更なる実施形態では、脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総量［ｍｏｌ］に基づいて、１０～２５ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロールと、４～１０ｍｏｌ％の範囲の量のスフィンゴミエリンと、５ｍｏｌ％未満のジアシルグリセロールと、５ｍｏｌ％未満のトリアシルグリセロールと、５ｍｏｌ％未満のホスファチジルイノシトールと、１０～３０ｍｏｌ％の量のホスファチジルエタノールアミンとを含む。

核酸分子は、治療用又は診断用核酸分子である。本発明の一実施形態では、核酸分子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ等のＲＮＡｉ分子である。本発明の別の実施形態では、核酸分子は、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等の一本鎖アンチセンス分子である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、７～３０ヌクレオチド、例えば１０～３０ヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態では、修飾された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、例えば少なくとも５０％の修飾ヌクレオシド間結合を有する。

一実施形態では、修飾された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも３つの２’糖修飾ヌクレオシドを有する。

本発明は更に、核酸分子を担持する脂質小胞を調製するための方法、並びに当該方法によって得ることができる又は得られる脂質小胞、組成物を提供し、該脂質小胞は、ＤＬＳによって測定される３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄ_ｈを有し、当該脂質小胞は経口投与され、当該核酸分子が、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される１種以上の標的組織に送達するためのものである。

定義
脂質小胞
本発明の意味の範囲内で、「脂質小胞」という用語は、少なくとも１種の脂質二重層又は多層（脂質膜）から作製された人工的に、好ましくは合成的に調製された小胞を指し、脂質小胞は、天然由来又は合成のリン脂質又は他の界面活性剤又はペグ化脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００又は他の脂質アンカー又はＰＥＧサイズ）等のステルス性成分（マクロファージ認識を低下させる）、並びに必要に応じて、コレステロール及びタンパク質等の他の膜成分を含む。脂質小胞の構造は、本明細書に記載の核酸分子等の薬学的に活性な成分の物理的リザーバとして作用することができる。

本発明の脂質小胞の流体力学的径（本明細書では「直径」とも呼ばれる粒径）は、ＤＬＳによって測定される、３００ｎｍ未満、より好ましくは２８０ｎｍ未満、より好ましくは２５０ｎｍ未満、より好ましくは２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満、より好ましくは１８０ｎｍ未満である。

好ましくは、流体力学的径は、ＤＬＳによって測定される、１０～３００ｎｍの範囲、２０～２８０ｎｍの範囲、より好ましくは３０～２５０ｎｍの範囲、より好ましくは４０～２２０ｎｍの範囲、より好ましくは５０～２００ｎｍの範囲、より好ましくは６０～１８０ｎｍの範囲、より好ましくは７０～１８０ｎｍの範囲の直径である。

好ましくは、本明細書で提供される脂質小胞は、生理学的条件下で負から中性のゼータ電位、好ましくは－３０～０ｍＶの範囲、より好ましくは－１５～０の範囲のゼータ電位を有し、０．１ｍＭの総脂質濃度で測定され、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳＰ（英国マルバーンのＭａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて２５℃で０．１×ＤＰＢＳにおいて決定される。

一実施形態では、脂質小胞は合成脂質小胞である。したがって、脂質小胞は、本明細書に記載の様々な構成要素を組み合わせることによって人工的に生成されている。脂質小胞は動物源、例えば哺乳動物から単離されないことが想定される。例えば、ウシ乳等の乳から単離されていないものとする。脂質小胞の個々の成分（スフィンゴミエリン等）は、天然の（例えば、動物又は植物）供給源から単離されたものであり得る。

粒径／直径
「粒径」又は「流体力学的径」という用語は、本明細書では動的光散乱（ＤＬＳ）と呼ばれる光子相関分光法によって測定される脂質小胞の平均／平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）を指す。平均／平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は、脂質小胞組成物において、個々の小胞が所与の範囲外にあり得るが、組成物の平均粒径が所与の範囲内にあることを意味する。ＤＬＳ法は、粒子によるレーザー光の散乱に基づいており、粒子がブラウン運動によって拡散する速度の測定値を利用する。粒子速度は、粒子のサイズと相関する。本出願では、光子相関分光法（ＤＬＳ）を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（英国マルバーンのＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して６８５ｎｍのレーザー波長で行った。散乱光は１７３°の角度で検出された。結果を、室温でのＤＰＢＳ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１４１９０２５０）におけるｎ＝３の測定値の平均±ＳＤとして表す。脂質小胞の安定性評価のために、無負荷小胞を使用した。

安定性
好ましくは、本発明による脂質小胞は、胃液中で安定である。本出願内で使用される「胃液中で安定」という用語は、２０℃の温度で１ｍＭの脂質小胞濃度で少なくとも５時間、模擬胃液［ＳＧＦ］（ＮａＣｌ ３４ｍＭ、ＨＣｌ ０．８３Ｍ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｐＨ１．２））中でインキュベートした場合の、（上記で測定されたそれぞれの初期Ｄｈと比較した場合）最大で９０％、例えば最大で８６％の脂質小胞の平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）の変化（すなわち、減少又は増加）として定義される。好ましくは、胃液中でのインキュベーションの０時間又は５時間後での脂質小胞の平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は、３００ｎｍ未満、例えば５０～２５０ｎｍの範囲である。

一実施形態によれば、脂質小胞の流体力学的径は、模擬胃液（ＮａＣｌ ３４ｍＭ、ＨＣｌ ０．８３Ｍ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｐＨ１．２））［ＳＧＦ］中、１ｍＭの濃度で、２０℃の温度にて少なくとも５時間インキュベートした場合、最大で６０％、例えば５０％、例えば４０％、例えば３０％、より好ましくは最大で２５％しか変化しない。好ましくは、胃液中でのインキュベーションの０時間又は５時間後の脂質小胞の平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は、３００ｎｍ未満、例えば６０～１８０ｎｍの範囲である。好ましい実施形態では、サイズは最大で２５％変化し、胃液中でのインキュベーションの０時間又は５時間後の脂質小胞のサイズ及び平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）の減少並びに増加が含まれ、１００～１６５ｎｍの範囲内である。

好ましくは、ＳＧＦ中でのインキュベーション後の脂質小胞の平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は、３００ｎｍ未満、例えば５０～２５０ｎｍの範囲、好ましくは６０～１８０ｎｍの範囲、より好ましくは１００～１６５ｎｍの範囲等である。

更に、本発明による脂質小胞は、好ましくは、絶食状態の腸液中でも安定である。本出願で使用される「絶食状態の腸液中で安定」という用語は、絶食状態の模擬腸液［ＦａＳＳＩＦ］（ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２８．６ｍＭ、タウロコール酸ナトリウム塩３ｍＭ、レシチン０．７５ｍＭ、ＮａＣｌ １０５．８ｍＭ（ｐＨ６．５）中で１ｍＭの濃度で少なくとも３時間、例えば少なくとも５時間、２０℃の温度でインキュベートした場合の、脂質小胞の平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）の最大４０％の変化（すなわち、減少又は増加）として定義される。

好ましくは、脂質小胞の流体力学的径は、絶食状態の模擬腸液（ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２８．６ｍＭ、タウロコール酸ナトリウム塩３ｍＭ、レシチン０．７５ｍＭ、ＮａＣｌ １０５．８ｍＭ（ｐＨ６．５）中、１ｍＭの濃度で少なくとも３時間、例えば２０℃の温度で少なくとも５時間インキュベートした場合、最大で４０％、より好ましくは最大で３５％、より好ましくは最大で３０％、より好ましくは最大で２５％、より好ましくは最大で２００％、より好ましくは最大で１５％、より好ましくは最大で１０％変化する。好ましくは、ＦａＳＳＩＦ中でのインキュベーション後０時間及び５時間の脂質小胞の平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は、３００ｎｍ未満、例えば５０～２７５の範囲、例えば６０～１８０の範囲である。好ましい実施形態では、サイズは、最大で１５％変化し、ＦａＳＳＩＦ中でのインキュベーション後の時間０及び５時間での脂質小胞のサイズ及び平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）の減少並びに増加が含まれ、これらは１００～１５０ｎｍの範囲である。好ましい実施形態では、安定な脂質小胞は、ＳＧＦ及びＦａＳＳＩＦの両方について上記のパラメータの範囲内である。

更に好ましい実施形態では、安定な脂質小胞は、以下のパラメータを満たすと定義される：ＳＧＦ中でのインキュベーション後、サイズ変化は５５％未満であり、サイズの減少及び増加を含み、ＳＧＦ中でのインキュベーション後０時間及び５時間の時点での脂質小胞の平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は８０～１６５ｎｍの範囲であり、ＦａＳＳＩＦ中でのインキュベーション後、サイズ変化は２５％未満であり、ＦａＳＳＩＦ中でのインキュベーション後０時間及び５時間の時点での脂質小胞のサイズ及び平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は８０～１５０ｎｍの範囲である。

更に好ましい実施形態では、安定な脂質小胞は、以下のパラメータを満たすと定義される：ＳＧＦ中でのインキュベーション後、サイズ変化は２５％未満であり、サイズの減少及び増加を含み、ＳＧＦ中でのインキュベーション後０時間及び５時間の時点での脂質小胞の平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は１００～１６５ｎｍの範囲であり、ＦａＳＳＩＦ中でのインキュベーション後、サイズ変化は１５％未満であり、ＦａＳＳＩＦ中でのインキュベーション後０時間及び５時間の時点での脂質小胞のサイズ及び平均流体力学的径（Ｄ_ｈ）は１００～１５０ｎｍの範囲である。

脂質小胞の構成要素
脂質小胞の好ましい成分（上で定義したもの）を、ここでより詳細に記載する。別途示されない場合、脂質小胞のそれぞれの成分の好ましい量は、無負荷脂質小胞の総量［ｍｏｌ単位］、すなわち小胞の量（ヌクレオチドなし）に基づいて、ｍｏｌ％で与えられる。

コレステロール
本発明の意味の範囲内で使用されるコレステロールという用語は、エステル化コレステロール及び非エステル化コレステロールを含む。

本発明の好ましい脂質小胞では、コレステロールは、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、４～５０ｍｏｌ％の量、より好ましくは５～４５ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～２０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１４～３５ｍｏｌ％の量で存在する。

ホスファチジルエタノールアミン
「ホスファチジルエタノールアミン」という用語は、ホスホリルエタノールアミン頭部基を有するホスホグリセリドを指す。本発明の意味において使用される「少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン」という用語は、１種の特定のホスファチジルエタノールアミン並びに２種以上の異なるホスファチジルエタノールアミンの混合物を含む。

ホスファチジルエタノールアミンは、以下の構造を有し得る：

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Ｒ_１及びＲ_２の残基は、脂肪酸残基、典型的には天然に存在する脂肪酸又は天然に存在する脂肪酸誘導体の残基である。別の実施形態では、脂肪酸残基は、飽和脂肪酸部分に由来する残基である。「飽和」とは、炭化水素鎖に二重結合が存在しないことを指す。好適な脂肪酸の非限定的な例は１４：０、１５：０、１６：０、１６：１、１７：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１９：０、２０：０、２０：１、２０：２、２０：３、１０：４、２２：０、２２：１、２２：４、２２：６、２４：０及び２４：１である。したがって、Ｒ_１及びＲ_２は、好ましくは、互いに独立して、１４：０、１５：０、１６：０、１６：１、１７：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１９：０、２０：０、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２２：０、２２：１、２２：４、２２：６、２４：０及び２４：１からなる群から選択される。Ｒ_１及びＲ_２の好ましい組合せは、任意の可能な脂肪酸長の組合せにおける２種の完全飽和脂肪酸（例えば、１４：０、１４：０、１４：０、１６：０等）、１種の完全脂肪酸と少なくとも１つの二重結合を有する１種の不飽和脂肪酸（例えば、１４：０、１４：１、１４：０、１６：１等）又は少なくとも１つの二重結合を有する２種の不飽和脂肪酸（例えば、１４：１、１４：１、１４：１、１６：１等）である。

脂質小胞は、２種以上の異なるホスファチジルエタノールアミンの混合物を含み得ることが理解されるべきである。

ホスファチジルエタノールアミンは、天然に存在するホスファチジルエタノールアミン又は合成ホスファチジルエタノールアミンであり得る。好ましくは、ホスファチジルエタノールアミンは、天然に存在するホスファチジルエタノールアミンである。

ホスファチジルエタノールアミンの非限定的な例は、ジメチルジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、Ｌ－アルファ－ホスファチジル－エタノールアミン、（２－ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ））、及び上に列挙した脂肪酸部分のいずれかで修飾されたホスファチジルエタノールアミンである。好ましくは、ホスファチジルエタノールアミンはＬ－アルファ－ホスファチジル－エタノールアミンである。

ほとんどの場合、例えば全ての場合、本発明のホスファチジルエタノールアミン（複数可）の脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、２～７０ｍｏｌ％の脂質小胞、例えば１０～７０ｍｏｌ％、例えば１０～５０ｍｏｌ％、より好ましくは１０～３０ｍｏｌ％、より好ましくは１９～２３．５ｍｏｌ％の量で存在する。

ホスファチジルエタノールアミン及びコレステロール
本発明の一実施形態によれば、本発明による脂質小胞は、コレステロール及び少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミンを含む。

好ましくは、脂質小胞は、ホスファチジルエタノールアミン及びコレステロールの総量を、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、２～９０ｍｏｌ％、例えば３０～９０ｍｏｌ％、好ましくは３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％の範囲で含み、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの合計として計算される。好ましくは、ホスファチジルエタノールアミンはＬ－アルファ－ホスファチジル－エタノールアミンである。

好ましくは、脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総モル量に基づいて、５～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールを含む。本発明の一実施形態によれば、脂質小胞はコレステロールを４～５０ｍｏｌ％の量、より好ましくは５～４５ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～２０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１４～３５ｍｏｌ％の量で含み、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、各脂質小胞の総量に基づいて２～９０ｍｏｌ％、例えば３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％の範囲であり、好ましくはホスファチジルエタノールアミン（複数可）はＬ－アルファ－ホスファチジル－エタノールアミンである。

好ましくは、脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、２～７０ｍｏｌ％の量のホスファチジルエタノールアミン（複数可）、より好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンを含む。より好ましくは、脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）、特にＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンを１０～７０ｍｏｌ％の量で含む。

本発明の好ましい一実施形態によれば、脂質小胞は、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）、より好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンを、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、１０～７０、より好ましくは１０～５０ｍｏｌ％、より好ましくは１０～３０ｍｏｌ％、より好ましくは１９～２３．５ｍｏｌ％の量で含み、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は２～９０ｍｏｌ％、例えば３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％である。

更なる実施形態では、脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、４～５０ｍｏｌ％の量、より好ましくは５～４５ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～２０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１４～３５ｍｏｌ％の量のコレステロールと、２～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～５０ｍｏｌ％、より好ましくは１０～３０ｍｏｌ％、より好ましくは１９～２３．５ｍｏｌ％の量のホスファチジルエタノールアミン（複数可）、より好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンとを含み、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールとの総和は、２～９０ｍｏｌ％、例えば３０～９０ｍｏｌ％、例えば３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％である。

好ましい実施形態において、脂質小胞は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロール及び１０～７０ｍｏｌ％のホスファチジルエタノールアミン（複数可）を含み、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）及びコレステロールの総和は３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％である。

ホスファチジルコリン
「ホスファチジルコリン」という用語は、ホスホリルコリン頭部基を有するホスホグリセリドを指す。本発明の意味の範囲内で使用される「少なくとも１種のホスファチジルコリン」という用語は、１種の特定のホスファチジルコリン並びに２種以上の異なるホスファチジルコリンの混合物を含む。

ホスファチジルコリン化合物は、典型的には以下の構造を有する：

。

Ｒ_３及びＲ_４残基は脂肪酸残基、典型的には天然に存在する脂肪酸又は天然に存在する脂肪酸誘導体の残基である。別の実施形態では、脂肪酸残基は、飽和脂肪酸部分に由来する残基である。「飽和」とは、炭化水素鎖に二重結合が存在しないことを指す。適切な脂肪酸の非限定的な例は、カプリル酸、ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ、８：０；カプリン酸、ＣＨ３（ＣＨ２）８ＣＯＯＨ、１０：０；ラウリン酸、ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＯＯＨ、１２：０；ミリスチン酸、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１２ＣＯＯＨ、１４：０；パルミチン酸、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１４ＣＯＯＨ、１６：０；ステアリン酸、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１６ＣＯＯＨ、１８：０；アラキジン酸、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１８ＣＯＯＨ、２０：０；ベヘン酸、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_２０ＣＯＯＨ、２２：０；リグノセリン酸、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_２２ＣＯＯＨ、２４：０；セロチン酸、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_２４ＣＯＯＨ、２６：０、並びに１５：０、１６：１、１７：０、１８：１、１８：２、１８：３、１９：０、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２２：１、２２：４、２２：６、２４：０及び２４：１である。

したがって、Ｒ_３及びＲ_４は、好ましくは、互いに独立して、８：０、１０：０、１２：０、１４：０、１５：０、１６：０、１６：１、１７：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１９：０、２０：０、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２２：０、２２：１、２２：４、２２：６、２４：０及び２４：１からなる群から選択される。脂質小胞は、２種以上の異なるホスファチジルコリンの混合物を含み得ることが理解されるべきである。

少なくとも１種のホスファチジルコリンは、天然に存在するホスファチジルコリン又は合成ホスファチジルコリンであり得る。好ましくは、ホスファチジルコリンは対称ホスファチジルコリン（すなわち、２種の脂肪酸部分が同一であるホスファチジルコリン）である。

ホスファチジルコリンの非限定的な例は、ダイズホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン（卵－ＰＣ）、２種の（ベヘン酸）ホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイル－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイル－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイル－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、及び上に列挙した脂肪酸部分のいずれかで修飾されたホスファチジルコリンである。

本明細書で使用される「ダイズホスファチジルコリン」という用語は、ホスファチジルコリンの複数の不飽和及び飽和脂肪酸組成を指す。一実施形態では、ダイズホスファチジルコリンは、ダイズ植物、例えばダイズ種子から単離されている。典型的には、ダイズホスファチジルコリンは、１６：０、１８：０、１８：１、１８：２及び１８：３からなる群から選択される脂肪酸残基を含むホスファチジルコリンの混合物を含む。一実施形態では、ダイズホスファチジルコリンは、１６：０、１８：０、１８：１、１８：２及び１８：３に由来する脂肪酸残基を含むホスファチジルコリンとの混合物を含む。

更なる実施形態では、ダイズホスファチジルコリンは、約１２％～約３３ｍｏｌ％のパルミチン酸（１６：０）、約３％～約１２％ｍｏｌ％のステアリン酸（Ｃ１８：０）；約４％～約４０ｍｏｌ％のオレイン酸（１８：１）；約１７％～約６６ｍｏｌ％のリノール酸（１８：２）；約２％～約１０ｍｏｌ％のリノレン酸（１８：３）を含む（Ｓｚｕｈａｊ，Ｂ．Ｆ．（Ｅｄ．）．（１９８９）．Ｌｅｃｉｔｈｉｎｓ：Ｓｏｕｒｃｅｓ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅｓ（ＡＯＣＳ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ＩＳＢＮ ９７８０９３５３１５２７１，Ｕｒｂａｎａ，ＵＳＡ．）。

本出願で使用される場合、「卵ホスファチジルコリン」という用語は、限定されないが、様々な飽和及び不飽和の脂肪酸を含むＬ－アルファ－ホスファチジルコリンの組成物を指す。好ましくは、卵ホスファチジルコリンは、約３３ｍｏｌ％のパルミチン酸；約１０％ｍｏｌ％のステアリン酸；約３１％ｍｏｌ％のオレイン酸；約１８ｍｏｌ％の量で存在するリノール酸を含む。

一実施形態では、少なくとも１つのホスファチジルコリンは、卵－ＰＣ及び／又はＤＬＰＣ及び／又はＤＯＰＣ、特に卵－ＰＣ及び／又はＤＯＰＣである。

更に、ホスファチジルコリンはＤＳＰＣ又はＤＬＰＣではないため、脂質小胞は好ましくはＤＳＰＣを含まず、及び／又はＤＬＰＣを含まず、好ましくはＤＳＣＰもＤＬＣＰも含まないことが想定される。

更に、ホスファチジルコリンは合成的に誘導され、混合飽和及び不飽和の脂肪酸基（例えば、１４：０～１６：０；１４：０～１８：０；１６：０～１４：０；１６：０～１８：０；１６：０～１８：１；１６：０～１８：２；１６：０～２０：４；１６：０～２２：６；１８：０～１４：０；１８：０～１６：０；１８：０～１８：１；１８：０～１８：２；１８：０～２０：４；１８：０～２２：６；１８：１～１４：０；１８：１～１６：０；１８：１～１６：０；１８：１～１８：０；１６：０～２０：０）の両方を含むことが想定される。

本発明の脂質小胞の場合、ホスファチジルコリンは、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、０～４０ｍｏｌ％の脂質小胞の量で存在し、例えば１．９～４０ｍｏｌ％、例えば４～３６ｍｏｌ％、好ましくは４～１５ｍｏｌ％、好ましくは２０～３６ｍｏｌ％の量で存在する。

ホスファチジルセリン
「ホスファチジルセリン」という用語は、グリセロールの第１及び第２の炭素にエステル結合で結合した２つの脂肪酸と、グリセロールの第３の炭素にホスホジエステル結合を介して結合したセリンとを含むリン脂質を指す。本発明の意味の範囲内で使用される「少なくとも１種のホスファチジルセリン」という用語は、１種の特定のホスファチジルセリン並びに２種以上の異なるホスファチジルセリンの混合物を含む。
ホスファチジルセリンは、以下の構造を有し得る：

。

Ｒ_５及びＲ_６残基は、エステル結合を介して結合した脂肪酸残基、典型的には天然に存在する脂肪酸又は天然に存在する脂肪酸誘導体の残基である。別の実施形態では、脂肪酸残基は、飽和脂肪酸部分に由来する残基である。「飽和」とは、炭化水素鎖に二重結合が存在しないことを指す。適切な脂肪酸の非限定的な例は、８：０、１０：０、１２：０、１４：０である。１５：０、１６：０、１６：１、１７：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１９：０、２０：０、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２２：０、２２：１、２２：４、２２：６、２４：０及び２４：１、特に１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：４及び２２：６である。したがって、Ｒ_５及びＲ_６は、好ましくは、互いに独立して、８：０、１０：０、１２：０、１４：０、１５：０、１６：０、１６：１、１７：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１９：０、２０：０、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２２：０、２２：１、２２：４、２２：６、２４：０及び２４：１からなる群から選択される。脂質小胞は、２種以上の異なるホスファチジルセリンの混合物を含み得ると理解されるべきである。

少なくとも１種のホスファチジルセリンは、天然に存在する又は合成のホスファチジルセリンであり得る。好ましくは、ホスファチジルセリンは、対称ホスファチジルセリン（すなわち、２種の脂肪酸部分が同一であるホスファチジルセリン）である。

ホスファチジルセリンの非限定的な例は、Ｌ－アルファ脳ＰＳ（典型的には、１８：０、１８：１及び２０：４、２２：６由来の脂肪酸残基を含む）又はダイズＰＳ（典型的には、１６：０、１８：０、１８：１、１８：２及び１８：３由来の脂肪酸残基を含む）である。好ましくは、ホスファチジルセリンは、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（Ｌ－アルファ－ＰＳ）、好ましくはダイズに由来するものである。好ましくは、ホスファチジルセリンは、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（Ｌ－アルファ－ＰＳ）、好ましくはウシ脳由来（典型的には、１８：０、１８：１、２０：４、及び２２：６由来の脂肪酸残基を含む）である。

本発明の脂質小胞の場合、ホスファチジルセリンは、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、０～４５ｍｏｌ％の脂質小胞の量で存在し、例えば２～２０ｍｏｌ％、例えば４～３６ｍｏｌ％、好ましくは１２～２０ｍｏｌ％、好ましくは２０～３１ｍｏｌ％の量で存在する。

リゾビスホスファチジン酸
ビス（モノアシルグリセロ）ホスフェート（「ＢＭＰ」）としても知られる「リソビスホスファチジン酸」という用語は、負に帯電したリン脂質、より具体的にはグリセロール－リン脂質を指す。ＢＭＰは、最初にウサギ肺から単離されたが、現在では、全ての動物組織の一般的であるが少量の構成成分であることが知られている。その立体化学的配置は、ホスホジエステル部分が位置ｓｎ－３ではなくグリセロールの位置ｓｎ－１及びｓｎ－１’に結合しているという点で、他の動物グリセロ－リン脂質の立体化学的配置とは異なる。グリセロール部分の位置ｓｎ－３及び３’又はｓｎ－２及びｓｎ－２’が脂肪酸でエステル化されているかどうかは不明のままである。

リソビスホスファチジン酸の非限定的な例は、例は、１８：１ＢＭＰ（Ｒ，Ｒ）、ｓｎ－（１－オレオイル－２－ヒドロキシ）－グリセロール－３－ホスホ－ｓｎ－３’－（１’－オレオイル－２’－ヒドロキシ）－グリセロールである。１８：１ＢＭＰ（Ｓ，Ｓ）、ｓｎ－（３－オレオイル－２－ヒドロキシ）－グリセロール－１－ホスホ－ｓｎ－１’－（３’－オレオイル－２’－ヒドロキシ）－グリセロール；１４：０ＢＭＰ（Ｓ，Ｒ）、ビス（モノミリストイルグリセロ）ホスフェート（Ｓ，Ｒ異性体）；１８：１ＢＭＰ（Ｓ，Ｒ）、ビス（モノオレオイルグリセロ）ホスフェート（Ｓ，Ｒ異性体）である。

好ましくは、リソビスホスファチジン酸は、ビス（モノオレオイルグリセロ）ホスフェート（Ｓ，Ｒ異性体）である。

好ましくは、脂質小胞は、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて、０～１２ｍｏｌ％の範囲の量、例えば４～１２ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～６ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～１２ｍｏｌ％の量の少なくとも１種のリゾビスホスファチジン酸を含む。

ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びリソビスホスファチジン酸
上記又は下記の脂質小胞は、好ましくは、少なくとも１種のホスファチジルコリン及び／又は少なくとも１種のホスファチジルセリン及び／又は少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸を更に含む。

好ましくは、脂質小胞中に存在するホスファチジルコリンとホスファチジルセリンとリソビスホスファチジン酸の合計は、ホスファチジルコリン（複数可）とホスファチジルセリン（複数可）とリゾビスホスファチジン酸（複数可）との和として計算され、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲にある。好ましくは、脂質小胞は、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて、０～４５ｍｏｌ％の範囲の量、例えば１．９～４０ｍｏｌ％、例えば１０～４０ｍｏｌ％、例えば４～３６ｍｏｌ％、好ましくは４～１５ｍｏｌ％、好ましくは２０～３６ｍｏｌ％の量の少なくとも１種のホスファチジルコリンを含む。好ましくは、脂質小胞は、少なくとも１種のホスファチジルセリンを、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、０～４５ｍｏｌ％の範囲の量、例えば２～２０ｍｏｌ％、例えば４～３６ｍｏｌ％、好ましくは１２～２０ｍｏｌ％、好ましくは１４～４２ｍｏｌ％、より好ましくは１４～２０ｍｏｌ％、好ましくは２０～３１ｍｏｌ％の量で含む。

好ましくは、脂質小胞は、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて、０～１２ｍｏｌ％の範囲の量、例えば４～１２ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～６ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～１２ｍｏｌ％の量の少なくとも１種のリゾビスホスファチジン酸を含む。

好ましくは、脂質小胞は、０ｍｏｌ％超、例えば２～４０ｍｏｌ％のホスファチジルコリンを含み、より好ましくは、ホスファチジルコリンは卵－ＰＣ及び／又はＤＯＰＣである。脂質小胞が少なくとも１種のホスファチジルコリンを含む場合、ホスファチジルコリンは、好ましくは、無負荷脂質小胞の総量に基づいて４～３６ｍｏｌ％の量で含まれ、脂質小胞に存在する全てのホスファチジルコリンの合計として計算される。

更なる実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％、より好ましくは５～４５ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～２０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１４～３５ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）２～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～５０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～３０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１９～２３．５ｍｏｌ％の量のホスファチジルエタノールアミン（複数可）、より好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンとを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）ホスファチジルコリン（複数可）及びホスファチジルセリン（複数可）及び／又はリゾビスホスファチジン酸（複数可）は、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン並びにリゾビスホスファチジン酸の合計として計算して、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲にある。

更なる実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）１０～７０ｍｏｌ％のホスファチジルエタノールアミン（複数可）とを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）ホスファチジルコリンは０～４０ｍｏｌ％、例えば４～３６ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｉｖ）ホスファチジルセリンは０～４５ｍｏｌ％の脂質小胞、例えば１２～２０ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｖ）リソビスホスファチジン酸は０～１２ｍｏｌ％の範囲、例えば４～１２の量であり、
ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン及び／又はリソビスホスファチジン酸の総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲で存在する。

更なる成分
上に概説したように、脂質小胞は、少なくとも１種のスフィンゴミエリン及び／又はジアシルグリセロール及び／又はトリアシルグリセロール及び／又はホスファチジルイノシトールを更に含み得る。

スフィンゴミエリン
「スフィンゴミエリン」という用語は当業者に公知であり、ホスホコリン頭部基、スフィンゴシン及び脂肪酸を通常含む脂質を指す。これは、グリセロールから合成されない数少ない膜リン脂質の１種である。

スフィンゴミエリンは、乳スフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン、合成スフィンゴミエリン及びそれらの２種以上の混合物、又は完全合成由来のスフィンゴミエリンからなる群から選択され得る。スフィンゴミエリンは、例えば、８：０、１０：０、１２：０、１４：０、１５：０、１６：０、１６：１、１７：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１９：０、２０：０、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２２：０、２２：１、２２：４、２２：６、２３：０、２４：０及び２４：１等の脂肪酸に由来する脂肪酸誘導体を含み得る。

例えば、スフィンゴミエリンは、脳スフィンゴミエリン、例えばブタ又はサル脳スフィンゴミエリンであり、好ましくは典型的には、１６：０、１８：０、２０：０、２２：０、２４：０及び２４：１等の脂肪酸に由来する脂肪酸誘導体を含むスフィンゴミエリンの混合物を含む。

又は、スフィンゴミエリンは、卵スフィンゴミエリンであり、好ましくは、典型的には、１６：０、１８：０及び２４：０等の脂肪酸に由来する脂肪酸誘導体を含むスフィンゴミエリンの混合物を含む。

又は、スフィンゴミエリンは、乳スフィンゴミエリンであり、好ましくは、典型的には、１６：０、２２：０、２３：０、２４：０、２４：１等の脂肪酸に由来する脂肪酸誘導体を含むスフィンゴミエリンの混合物を含む。

好ましくは、スフィンゴミエリンは、乳スフィンゴミエリンであり得る。

脂質小胞が少なくとも１つのスフィンゴミエリンを含む場合、脂質小胞は、少なくとも１種のスフィンゴミエリンを、無負荷脂質小胞自体の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて、好ましくは２～４５ｍｏｌ％の範囲の量、例えば１５～４５、例えば４～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは２～１５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～１３ｍｏｌ％の量、より好ましくは２～７ｍｏｌ％の量で含む。

更なる実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％、より好ましくは５～４５ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～２０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１４～３５ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）２～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～５０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～３０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１９～２３．５ｍｏｌ％の量のホスファチジルエタノールアミン（複数可）、より好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンとを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）少なくとも１種のスフィンゴミエリンは、２～４５ｍｏｌ％、例えば１５～４５、例えば４～２５ｍｏｌ％、より好ましくは２～１５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～１３ｍｏｌ％の量である。

更なる実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）１０～７０ｍｏｌ％のホスファチジルエタノールアミン（複数可）とを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン及び／又はリゾビスホスファチジン酸は、ホスファチジルコリン（複数可）及びホスファチジルセリン（複数可）及びリゾビスホスファチジン酸（複数可）の合計として計算して、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲で存在し、
ｉｖ）少なくとも１種のスフィンゴミエリンは、２～４５ｍｏｌ％、例えば１５～４５、例えば４～２５ｍｏｌ％、より好ましくは２～１５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～１３ｍｏｌ％の量である。

好ましい実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）１０～７０ｍｏｌ％のホスファチジルエタノールアミン（複数可）とを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）少なくとも１種のスフィンゴミエリンは、２～４０ｍｏｌ％、例えば４～１３の範囲の量である。

好ましい実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）１０～７０ｍｏｌ％のホスファチジルエタノールアミン（複数可）とを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）０から４０ｍｏｌ％、例えば４から３６ｍｏｌ％の範囲の量のホスファチジルコリン、
ｉｖ）ホスファチジルセリンは０～４５ｍｏｌ％、例えば１２～２０ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｖ）リソビスホスファチジン酸は０～１２ｍｏｌ％の脂質小胞の範囲、例えば４～１２ｍｏｌ％の量であり、
ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン及び／又はリソビスホスファチジン酸の総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲で存在し、
ｖｉ）少なくとも１種のスフィンゴミエリンは、２～４５ｍｏｌ％、例えば２～１５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～１３ｍｏｌ％の量である。

ジアシルグリセロール
「ジアシルグリセロール」（ＤＡＧ）という用語は、エステル結合を介してグリセロールに共有結合した２つの脂肪酸残基を含むグリセリドを指す。２つの可能な形態、１，２－ジアシルグリセロール及び１，３－ジアシルグリセロールが存在する。１，２－ジアシル－ｒａｃ－グリセロールが有用であるが、ジアシルグリセロールは、好ましくは１，２－ジアシルグリセロールであり、最も好ましくは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリコールである。

グリセロールに結合した脂肪酸残基が由来し得る代表的な飽和遊離脂肪酸（脂肪酸）としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：メタン酸（ギ酸）；エタン酸（酢酸）；プロパン酸（プロピオン酸）；ブタン酸（酪酸）；ペンタン酸（吉草酸）；ヘキサン酸（カプロン酸）；ヘプタン酸（エナンチオ）；オクタン酸（カプリル酸）；ノナン（ペラルゴン）；デカン酸（カプリン酸）；ウンデカン酸（ウンデシル酸）；ドデカン酸（ラウリン）；トリデカン酸（トリデシル酸）；テトラデカン酸（ミリスチン酸）；ペンタデカン酸（ペンタデシル酸）；ヘキサデカン酸（パルミチン酸）；ヘプタデカン酸（マルガリン酸）；オクタデカン酸（ステアリン酸）；ノナデカン酸（ノナデシル酸）；エイコサン酸（アラキジン）；ヘネイコサン酸；ドコサン酸（ベヘン酸）；トリコサノン酸（ｔｒｉｃｏｓａｎｏｉｃ）；テトラコサン酸；ペンタコサン酸；ヘキサコサン酸（セロチック）；ヘプタコサン酸；オクタコサン酸（モンタン酸）；ノナコサン酸；トリアコンタン酸（メリシン酸）酸；等。

好ましくは、ジアシルグリセロールは、存在する場合、ジパルミチンであり、したがって、グリセロールに結合した脂肪酸残基は、好ましくはヘキサデカン酸（パルミチン酸）に由来する。

好ましくは、脂質小胞は、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて０～５ｍｏｌ％、例えば３～５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のジアシルグリセロールを含む。

トリアシルグリセロール
「トリアシルグリセロール」（ＴＡＧ）という用語は、エステル結合を介してグリセロールに共有結合した３つの脂肪酸残基を含むグリセリドを指す。

グリセロールに結合した脂肪酸残基が由来し得る代表的な飽和遊離脂肪酸（脂肪酸）としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：メタン酸（ギ酸）、エタン酸（酢酸）、プロパン酸（プロピオン酸）、ブタン酸（酪酸）、ペンタン酸（吉草酸）、ヘキサン酸（カプロン酸）、ヘプタン酸（エナンチオ）、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン（ペラルゴン）、デカン酸（カプリン酸）、ウンデカン酸（ウンデシル酸）、ドデカン酸（ラウリン）、トリデカン酸（トリデシル酸）、テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ペンタデカン酸（ペンタデシル酸）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸（マルガリン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、ノナデカン酸（ノナデシル酸）、エイコサン酸（アラキジン）、ヘネイコサン酸、ドコサン酸（ベヘン酸）、トリコサノン酸（ｔｒｉｃｏｓａｎｏｉｃ）、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸（セロチック）、ヘプタコサン酸、オクタコサン酸（モンタン酸）、ノナコサン酸、トリアコンタン酸（メリシン酸）酸等。

好ましくは、トリグリセリド（ＴＡＧ）はグリセロールトリステアレートであり、したがって、グリセロールに結合した脂肪酸残基は、好ましくはオクタデカン酸に由来する。

好ましくは、脂質小胞は、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて０～５ｍｏｌ％、例えば３～５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のトリグリセロールを含む。

ホスファチジルイノシトール
「ホスファチジルイノシトール」又は「ＰＩ」という用語は、ホスファチジン酸のリン酸基に結合したイノシトールを含有する酸性リン脂質を指す。

ホスファチジルイノシトールは、天然ホスファチジルイノシトールであっても合成ホスファチジルイノシトールであってもよい。天然ホスファチジルイノシトールとしては、例えば、Ｌ－ａ－ホスファチジルイノシトール（ナトリウム塩）（例えば、ウシの肝臓又はダイズから）、Ｌ－ａ－ホスファチジルイノシトール－４－リン酸（アンモニウム塩）（例えば、ブタの脳から）（Ｂｒａｉｎ ＰＩ（４）Ｐ）、Ｌ－ａ－ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸（アンモニウム塩）（例えば、ブタの脳から）（脳ＰＩ（４，５）Ｐ２）等が挙げられる。好ましくは、ホスファチジルイノシトールは、１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、２０：３、２０：４及びそれらの組合せからなる群から選択される脂肪酸を含む。

好ましくは、ホスファチジルイノシトールはＬ－ａ－ホスファチジルイノシトールであり、より好ましくはＬ－ａ－ホスファチジルイノシトール（ウシ肝臓（「肝臓ＰＩ」）である。

好ましくは、脂質小胞は、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて０～５ｍｏｌ％、例えば３～５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のトリグリセロールを含む。

好ましくは、脂質小胞が、少なくとも１種のジアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のトリアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のホスファチジルイノシトールを含み、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロール並びにホスファチジルイノシトールの合計の総量が、脂質小胞の０～１５ｍｏｌ％の範囲の量である場合である。

好ましくは、脂質小胞は、０～５ｍｏｌ％のジアシルグリセロール及び０～５ｍｏｌ％のトリアシルグリセロール及び０～５ｍｏｌ％のホスファチジルイノシトールの範囲の量を含む。

更なる実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％、より好ましくは５～４５ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～２０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１４～３５ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）２～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～５０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～３０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１９～２３．５ｍｏｌ％の量のホスファチジルエタノールアミン（複数可）、より好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンとを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）少なくとも１種のジアシルグリセロール（複数可）は０～５ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｉｖ）少なくとも１種のトリアシルグリセロール（複数可）は０～５ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｖ）少なくとも１種のホスファチジルイノシトール（複数可）は０～５ｍｏｌ％の範囲の量である。

更なる実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％、より好ましくは５～４５ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～２０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１４～３５ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）２～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～５０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～３０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１９～２３．５ｍｏｌ％の量のホスファチジルエタノールアミン（複数可）、より好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンとを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン及び／又はリゾビスホスファチジン酸は、ホスファチジルコリン（複数可）とホスファチジルセリン（複数可）とリゾビスホスファチジン酸（複数可）の合計として計算して、脂質小胞の総量（［ｍｏｌ］単位）に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲で存在し、
ｉｖ）少なくとも１種のスフィンゴミエリンは、２～４５ｍｏｌ％、例えば１５～４５、例えば４～２５ｍｏｌ％、より好ましくは２～１５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～１３ｍｏｌ％の量であり、
ｖ）少なくとも１種のジアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のトリアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のホスファチジルイノシトールを含み、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロール並びにホスファチジルイノシトールの合計の総量は、脂質小胞の０～１５ｍｏｌ％の範囲の量である。

好ましい実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）１０～７０ｍｏｌ％のホスファチジルエタノールアミン（複数可）とを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）少なくとも１種のジアシルグリセロール（複数可）は０～５ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｉｖ）少なくとも１種のトリアシルグリセロール（複数可）は０～５ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｖ）少なくとも１種のホスファチジルイノシトール（複数可）は０～５ｍｏｌ％の範囲の量である。

好ましい実施形態では、脂質小胞は、
ｉ）４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールと、
ｉｉ）１０～７０ｍｏｌ％のホスファチジルエタノールアミン（複数可）とを含み、
ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％であり、
ｉｉｉ）ホスファチジルコリンは０～４０ｍｏｌ％、例えば４～３６ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｉｖ）ホスファチジルセリンは０～４５ｍｏｌ％、例えば１２～２０ｍｏｌ％の範囲の量であり、
ｖ）リソビスホスファチジン酸は０～１２ｍｏｌ％の脂質小胞の範囲、例えば４～１２ｍｏｌ％の量であり、
ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリン及び／又はリソビスホスファチジン酸の総和は、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲で存在し、
ｖｉ）少なくとも１種のスフィンゴミエリンは、２～４５ｍｏｌ％、例えば２～１５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～１３ｍｏｌ％の量であり、
ｖｉｉ）少なくとも１種のジアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のトリアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のホスファチジルイノシトールを含み、ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロール並びにホスファチジルイノシトールの合計の総量は、脂質小胞の０～１５ｍｏｌ％の範囲の量である。

核酸分子
本明細書で提供される脂質小胞は、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子等の核酸分子を担持するものとする。本明細書で使用される「核酸分子」又は「治療用核酸分子」という用語は、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシド（即ち、ヌクレオチド配列）を含む分子として一般的に理解されているように定義される。本発明の方法において言及される核酸分子（複数可）は、一般に、５０ヌクレオチド長未満の治療用オリゴヌクレオチドである。核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、若しくはそれを含み得、又は例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー若しくはリボザイム等の他の核酸分子であり得る。治療用核酸分子は、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって、研究室内で作製される。しかしながら、ｓｈＲＮＡは、多くの場合、レンチウイルスベクターを用いて細胞に送達され（例えばＳｏａｎ ａｎｄ Ｙａｎｇ ２０１０ Ｎ Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２（１２）：５９８を参照）、次いで転写されて一本鎖ＲＮＡを生成し、これは、ＲＮＡ干渉機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を含む）と相互作用することができるステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成するであろう。核酸分子の配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が参照される。本発明の核酸分子は、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分詞は標的細胞への侵入時にベクターから転写されるｓｈＲＮＡではない。本発明の核酸分子は、１種以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、７～６０個のヌクレオチド長、例えば８～６０個、例えば１０～５５個、例えば１２～５０個、例えば１３～４５個、例えば１４～４０個、例えば１５～３０個、例えば１６～２２個、例えば１６～１８個又は１５～１７個の連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれからなる。

いくつかの実施形態では、核酸分子又はその連続ヌクレオチド配列は、２４個以下のヌクレオチド、例えば２２個以下のヌクレオチド、例えば２０個、例えば１８個以下のヌクレオチド、例えば１４個、１５個、１６個又は１７個のヌクレオチドを含むか、又はそれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、核酸分子が１２～３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１２ヌクレオチド及び３０ヌクレオチドの両方が含まれる。

いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれらからなる。

この核酸分子（複数可）は、哺乳動物における標的核酸の発現の調節用である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸分子は、典型的には、標的核酸（複数可）の発現を阻害するためのものである。

本発明の一実施形態において、核酸分子は、ＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡから選択される。別の実施形態では、核酸分子は、ＲＮａｓｅＨと相互作用する高親和性修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド等の、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、非ヌクレオシド部分（コンジュゲート部分）に結合され得る。

核酸分子のライブラリは、変異体核酸分子の集合体として理解されるべきである。オリゴヌクレオチドのライブラリの目的は変化し得る。いくつかの実施形態では、核酸分子のライブラリは、オリゴヌクレオチドのライブラリ内で最も強力な配列を同定する目的で、１種以上の哺乳動物ＦＵＢＰ１標的核酸を標的とする重複する核酸塩基配列を有する核酸分子から構成される。いくつかの実施形態では、核酸分子のライブラリは、親核酸分子又は祖先核酸分子の核酸分子設計変異体（子核酸分子）のライブラリであり、核酸分子設計変異体は、親核酸分子のコア核酸塩基配列を保持する。

オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者によって一般的に理解されるように定義される。このような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマーとも称される場合がある。オリゴヌクレオチドは、通常、オリゴヌクレオチド合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの、核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾に対して言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシド等の１種以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの完全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）又は相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。

有利には、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を低下させるためＲＮＡヌクレオシドを含まない。

有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシド等の１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。更に、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。

ＲＮＡｉ分子
本明細書では、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」という用語は、細胞の細胞質中のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介してＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングを誘導することができる短い二本鎖ＲＮＡ分子であって、触媒ＲＩＳＣ成分アルゴノートと相互作用するものを指す。ＲＮＡｉ分子の１つのタイプは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）であり、これは、２つの相補的オリゴヌクレオチドから構成される二本鎖ＲＮＡ分子であり、転写後に一方の鎖が相補的ｍＲＮＡに結合すると、その分解及び翻訳の喪失が生じる。小ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）はステムループ（ヘアピン）構造を形成する一本鎖ＲＮＡ分子であり、これは発現の際に、ＤＩＣＥＲ及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）を介してｍＲＮＡを低減することができる。ＲＮＡｉ分子は、目的の遺伝子（標的核酸）の配列に基づいて設計することができる。次いで、対応するＲＮＡｉは、化学的に若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成され得るか、又はベクター若しくはＰＣＲ産物から発現され得る。

ｓｈＲＮＡ分子は、一般に、４０ヌクレオチド～７０ヌクレオチド長、例えば４５ヌクレオチド～６５ヌクレオチド長、例えば５０ヌクレオチド～６０ヌクレオチド長であり、Ｄｉｃｅｒとして公知のエンドヌクレアーゼと相互作用し、Ｄｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡを特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９塩基対～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡにプロセシングし、その後ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれると考えられている。ｓｉＲＮＡ分子は二本鎖であり、各鎖は１８～３５ヌクレオチド長、例えば２０～３０ヌクレオチド長、例えば２２～２７ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡは、多くの場合、ＲＩＳＣ基質を形成するＤｉｃｅｒによって産生される産物に類似するように２塩基３’突出部を有するように設計される。Ｄｉｃｅｒ基質の有効な拡張形態は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３４９，８０９号及び米国特許第８，５１３，２０７号に記載されている。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合及び２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環式リボース修飾ヌクレオシド（ＬＮＡ及びｃＥＴ又は２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡのような２’置換修飾、並びにトリシクロＤＮＡ（ＴｃＤＮＡ；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１５，３（２１），２７０－２７５）を含む）を用いて化学的に修飾されてもよい。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ核酸分子は、１種以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ＲＮＡｉ分子において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲＩＣＳにおけるヌクレアーゼ切断を低減し得るため、全てのヌクレオシド間結合が修飾されるのではないことが有利である。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ＲＮＡｉ核酸分子の３’及び／又は５’末端、特に標的核酸に相補的ではない分子の部分（例えば、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖（ｓｔａｎｄ）又はパッセンジャー鎖）に配置されることが有利であり得る。しかしながら、標的核酸に相補的なＲＮＡｉ分子の領域（例えば、ｓｉＲＮＡ分子中のアンチセンス又はガイド鎖）も、３’及び／又は５’末端の最初の２～３ヌクレオシド間結合において修飾され得る。

連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で「連続核酸塩基配列」という用語及び「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」という用語は互換的に使用される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列、例えばＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域を含み、必要に応じて更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。有利には、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に１００％相補的である。

ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、上記目的のために、天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む。天然では、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチド等のヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１種以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。

核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えばウラシル、チミン及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンと、非天然の変異体との両方を指す。このような変異体は、例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。

核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示すことができ、各文字は、等価の機能の修飾核酸塩基を必要に応じて含むことができる。例えば、例示的オリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ及び５－メチルシトシンから選択される。必要に応じて、オリゴヌクレオチドを含むＬＮＡ、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。

修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間でホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、並びに領域Ｆ及びＦ’等の修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステル由来の修飾された１種以上のヌクレオシド間結合、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性となるような１種以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらは両方とも当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。

一実施形態では、修飾された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で言及されるオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であり、例えばオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部は、修飾ヌクレオシド間結合である。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基に結合する、例えばコンジュゲートに結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。

好ましくは、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ジホスホロチオエートヌクレオシド間結合又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である。

好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態及び製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、例えばオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部は、ホスホロチオエート結合である。

ホスホロチオエート結合等のヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーの領域Ｇにおいて特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域及び／又はギャップマーのための領域Ｆ及びＦ’等の親和性増強領域において、又はミクスマー及びトータルマーにおいても有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、領域Ｆ若しくはＦ’、又は領域Ｆ及びＦ’の両方に１つ以上のホスホジエステル結合を含んでもよく、領域Ｇのヌクレオシド間結合は、完全にホスホロチオエートであってもよい。

有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

欧州特許第２ ７４２ １３５号明細書に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外）、例えば、欧州特許第２ ７４２ １３５号明細書によれば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る、アルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合等を含んでもよいことが認識されよう。

修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、オリゴヌクレオチドの骨格を形成する部分の１種以上の化学修飾、例えば糖部分への修飾又は代替化学構造での糖部分の置換の導入によって、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾ヌクレオシドを指す修飾ヌクレオシドという用語はまた、「ヌクレオシド類縁体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用されてもよい。

リボース糖部分の修飾を有する数多くのヌクレオシドが、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性等の核酸分子の特定の性質を改善することを主な目的として作製されてきた。

そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）又は二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、又は典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。

修飾ヌクレオシドにはまた、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、又はモルホリノ核酸が含まれる。

ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、又はＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオシドに天然に存在する－ＯＨ基に変更することによる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’、又は５’位で導入され得る。

非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドと称される。

ＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、ワトソン・クリック塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。

２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）、又はリボース環の２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）ヌクレオシドである。

実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾ヌクレオシドは、結合親和性の向上、及び／又はヌクレアーゼ耐性の増大をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下に、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドを例示する。

リボースに基づくヌクレオシド修飾に加えて、いわゆる三輪車ＤＮＡ（ＴｃＤＮＡ）は、ヌクレオシド修飾の上記リストへの更なる追加である。

本発明に関連して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。

修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される場合、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較してオリゴヌクレオチド骨格が修飾されているオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド骨格は、ヌクレオチド間結合及び／又は糖部分を指すが、一般に塩基部分の修飾を指すものではない。

アンチセンスオリゴヌクレオチド骨格の修飾は、特にヌクレアーゼに対する安定性を高めるため、又は標的核酸に対する親和性を高めるために、治療用オリゴヌクレオチドに一般的に使用される。

安定性を高める修飾は、例えば、修飾ヌクレオシド間結合、いくつかの糖修飾並びにペプチド骨格である。親和性を増加させる修飾は、例えば糖修飾である。

本明細書で言及される修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種以上の修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含む。修飾オリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドとの混合物を含むことができ、例えばギャップマー又はミクスマー設計では、これらは「キメラ」オリゴヌクレオチドと呼ばれることもある。ＰＮＡオリゴヌクレオチド及びモルホリノオリゴヌクレオチドは、一般に、ＰＮＡ部分又はモルホリノモイエティのみから構成されるように、同じ骨格から構成される。

修飾オリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、ギャップマー、ミクスマー又はトータルマー領域等の標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列、並びに標的核酸に完全に相補的ではない場合がある更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか又はそれらからなり得る。そのような追加の末端ヌクレオシドは、例えば、２～４個のホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドであり得、標的核酸に相補的な連続ヌクレオチド配列と、例えばコンジュゲート部分との間の生体切断性リンカーとして役立ち得る。

修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には７～３５ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７～３０ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４～３０ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４～２０ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７～１４ヌクレオチドの長さを有する。別の実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８～１２ヌクレオチドの長さを有する。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド」という単数形のアンチセンスオリゴヌクレオチドという用語は、共通の核酸塩基配列及び化学修飾のパターンを共有し、典型的には共通の製造プロセスに由来するオリゴヌクレオチドの集団を指す。

ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、上記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環のコンホメーションを制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースのコンホメーションの固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これは通常、オリゴヌクレオチド／相補的二本鎖の融解温度を測定することにより決定され得る。

非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７を参照されたい。

更なる非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドを、スキーム１に開示する。
スキーム１：

特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。

特定の有利なＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。

ギャップマー
本明細書で提供される脂質小胞に含まれる修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチド又はギャップマー設計とも呼ばれるギャップマーであり得る。アンチセンスギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性分解を介して標的核酸を阻害するために使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの別個の構造領域、５’－フランク、ギャップ及び３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’→３’方向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを動員することを可能にする一続きの連続するＤＮＡヌクレオチド、例えば５～１６個の連続するＤＮＡヌクレオチドを含む。ギャップ領域には、１種以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性２’糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）と、１種以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性２’糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）が隣接する。隣接領域は、独立して、各末端を規定する糖修飾ヌクレオシドを有する１～８個の連続ヌクレオチドからなる。領域Ｆ及びＦ’の１種以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる（すなわち、これは親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態において、領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、高親和性２’糖修飾等の２’糖修飾ヌクレオシドである。

ギャップマー設計では、ギャップ領域の５’及び３’大部分のヌクレオシドは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％等のＤＮＡヌクレオシドである。ＤＮＡは常に、それぞれ５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置される。Ｇａｐ領域は、いくつかの例では、ＲＮａｓｅＨ切断を妨げない修飾ヌクレオシド、例えば、アルファ－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（国際公開第２００９／０９０１８２号及びＶｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２００８）２２９６－２３００（いずれも参照により本明細書に組み込まれる））、ＡＮＡ及び２’Ｆ－ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシド（Ｍａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５，６５４－６６１）、ＵＮＡ（ロックされていない核酸）（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９に記載される）を含み得る。フランクは更に、ギャップ領域から最も遠い端、即ち５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも１種の糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されてもよい。

領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。

ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１４～２０、例えば１６～１８ヌクレオシドであり得る。

例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_１－８、例えば
Ｆ_１－８－Ｇ_７－１６－Ｆ’_２－８
但し、ギャップマー領域の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。

ＬＮＡギャップマー
本明細書で提供される脂質小胞による修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡギャップマーであり得る。ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’のいずれか一方又は両方が、ＬＮＡヌクレオシドを含むか、又はそれからなるギャップマーである。ベータ－Ｄ－オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’のいずれか一方又は両方が、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか、又はそれからなるギャップマーである。

古典的なＬＮＡギャップマーでは、両側面はＬＮＡヌクレオシドからなる。しかしながら、交互の隣接するＬＮＡギャップマーも記載されており、隣接領域の一方又は両方がＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む（例えば、国際公開第２０１６／１２７００２号を参照）。このような交互の設計では、隣接領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである。

いくつかの実施形態において、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］_１－５－［Ｇ］_６－１６－［ＬＮＡ］_１－５（式中、ＧはＲＮａｓｅ動員ギャップ領域である）。３－１０－３設計（ＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡ）を有するＬＮＡギャップマーは、当該技術分野で広く使用されている。

ＭＯＥギャップマー
本明細書で提供される脂質小胞による修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＯＥギャップマーであり得る。ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］_１－８－［Ｇ］_５－１６－［ＭＯＥ］_１－８、例えば［ＭＯＥ］_２－７－［Ｇ］_６－１４－［ＭＯＥ］_２－７、例えば［ＭＯＥ］_３－６－［Ｇ］_８－１２－［ＭＯＥ］_３－６のものであり、式中、ＧはＲＮａｓｅ動員ギャップ領域である。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当該技術分野で広く使用されている。

混合ウィングギャップマー
本明細書で提供される脂質小胞に含まれる修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、混合ウィングギャップマーであり得る。混合ウィングギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位からなる群より独立して選択される２’置換ヌクレオシド含むＬＮＡギャップマーである。領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態において、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウィング実施形態において、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドを更に含んでもよい。

混合ウィングギャップマー設計は、国際公開第２００８／０４９０８５号及び国際公開第２０１２／１０９３９５号（これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

トータルマー（Ｔｏｔａｌｍｅｒ）
本明細書で提供される脂質小胞に含まれる修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、トータルマーであり得る。トータルマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含まず、一般に１種類のヌクレオシド類縁体のみを含む、一本鎖修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列である。トータルマーオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列は、一般に７～１６ヌクレオチドの間、例えば８～１２の２’糖修飾ヌクレオシドであり、これは２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオシドからなる群から選択することができる。

一般に、短いトータルマー（長さが１０ヌクレオチド未満）は、１００％のＬＮＡ単位で構成される。より長いトータルマーの場合、ヌクレオシド単位の１つ以上は、本明細書で言及される２’糖置換ヌクレオシド等の非ＬＮＡヌクレオチド類縁体から選択され得る。

いくつかの実施形態では、トータルマーは、ＬＮＡ単位トのみからなる連続ヌクレオチド配列からなるか、又はそれを含む。

ＰＮＡオリゴヌクレオチド及びモルホリノオリゴヌクレオチドもまた、トータルマーと見なすことができる。

トータルマー設計は、治療用オリゴヌクレオチドとして、特にマイクロＲＮＡを標的とする場合（抗ｍｉＲ）又はスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）として有効であることが示されている。

ミクスマー（Ｍｉｘｍｅｒ）
本明細書で提供される脂質小胞に含まれる修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミクスマーであり得る。ミクスマーは、一本鎖修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続するヌクレオチド配列であり、ギャップマーとは対照的に、５個を超える天然に存在するＤＮＡヌクレオシドの連続する配列は存在せず、したがってＲＮａｓｅ Ｈを動員しない。

一般に、ミクスマーは、２’糖修飾ヌクレオシド等の１種類のヌクレオシド類縁体と、ＤＮＡ等の天然に存在するヌクレオシドとの反復パターンの連続ヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。これは、例えば、５’末端及び３’末端のＬＮＡで開始及び終了するＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの反復パターンであり得る。しかしながら、ミクスマーはまた、異なるタイプのヌクレオシド類縁体を組み合わせてもよく、その結果、例えば、毎秒又は２つおきの繰り返しパターンは、ＬＮＡ等のヌクレオシド類縁体であり、残りのヌクレオシドは、天然に存在するヌクレオシド、例えばＤＮＡ、又は２’フルオロ類縁体の２’ＭＯＥ等の２’糖置換ヌクレオシド類縁体、又は本明細書で言及される他の２’糖置換ヌクレオシドである。ミクスマーは、一般に、５’又は３’末端にヌクレオシド類縁体（独立して選択される）を有する。ミクスマーの例は、国際公開第２００７／０２７８９４号、国際公開第２００７／１１２７５４号、国際公開第２００７／１１２７５４号（抗ｍｉＲ）及び国際公開第２００８／１３１８０７号（ＳＳＯ）に記載されている。ヌクレオシド類縁体及びＤＮＡの分布パターンは、オリゴヌクレオチド配列に応じて最適化される。

ミクスマー設計は、治療用オリゴヌクレオチドとして、特にマイクロＲＮＡを標的とする場合（抗ｍｉＲ）、ｍＲＮＡ上のマイクロＲＮＡ結合部位を標的とする場合（ブロックｍｉｒ）、又はスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として非常に効果的である。

抗ｍｉＲ（ａｎｔｉｍｉＲ）
本明細書で提供される脂質小胞に含まれる修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗ｍｉＲであり得る。抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても知られる抗ｍｉＲは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のｉｎ ｖｉｖｏ活性を制御することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡと相補的な配列（およそ２２ｂｐ）であり、ＲＮＡの切断又は翻訳の抑制に関与する。抗ｍｉＲは、主に、細胞標的ｍＲＮＡと競合して成熟型ｍｉＲＮＡを捕捉することによって機能し、それにより、ｍｉＲＮＡの機能的阻害及び直接的標的の抑制解除をもたらす（例えば、国際公開第２００９／０４３３５３号及びＳｔｅｎｖａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｓｉｌｅｎｃｅ ３：１を参照）。抗ｍｉＲは、マイクロＲＮＡに対する結合親和性が増加し、ヌクレアーゼ耐性が増加して、マイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡへの結合を防止する能力が改善されるように設計される。抗ｍｉＲは、一般に、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導しないトータルマー又はミクスマーとして設計される。

ブロックｍｉｒ（Ｂｌｏｃｋｍｉｒ）
本明細書で提供される脂質小胞に含まれる修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ブロックｍｉｒであり得る。アンタゴｍｉｒ（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）としても知られるブロックｍｉｒは、他の分子がｍＲＮＡ分子上の所望の部位に結合するのを妨げるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これは、例えば、ｍＲＮＡ上のマイクロＲＮＡ結合部位であり得、それによってｍｉＲＮＡによるその調節を妨げる。したがって、抗ｍｉＲがｍｉＲＮＡを直接標的とする場合、ブロックｍｉｒは、特定のｍＲＮＡのみを標的とし、例えばｍｉＲＮＡとの相互作用を妨げる。ブロックｍｉｒは、一般に、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導しないトータルマー又はミクスマーとして設計される。

スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）
本明細書で提供される脂質小胞に含まれる修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドであり得る。スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、プレｍＲＮＡと塩基対を形成し、スプライシング機構の構成要素とプレｍＲＮＡとの間で生じるＲＮＡ－ＲＮＡ塩基対形成又はタンパク質－ＲＮＡ結合相互作用を遮断することによって転写物の通常のスプライシングレパートリーを破壊するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。スプライシングの調節は、正常なスプライシングの破壊をもたらす突然変異によって引き起こされる疾患の場合、又は遺伝子転写物の正常なスプライシング過程を妨害する場合に特に価値があり、治療的であり得る（例えば、Ｈａｖｅｎｓ ａｎｄ Ｈａｓｔｉｎｇｓ ２０１６ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４：６５４９を参照）。現在、市場には、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するためのＥｘｏｎｄｙｓ ５１（モルホリノＳＳＯ）、及び脊髄性筋萎縮症を処置するためのスピンラザ（ＭＯＥトータルマーＳＳＯ）の２種の承認されたＳＳＯ分子が存在する。ＳＳＯは、一般に、ＲＮａｓｅＨ切断を誘導しないトータルマー又はミクスマーとして設計される。

コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。

脂質への一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、オリゴヌクレオチドの疎水性を高めることによって、脂質小胞への一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの封入を改善し得る。

一実施形態では、脂質小胞に封入されることになる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、親油性コンジュゲート部分と５’又は３’末端でコンジュゲート化される。脂環式コンジュゲート部分は、ステロール、スタノール、ステロイド、多環式芳香族基、脂肪族基、脂質、リン脂質、親油性アルコール、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、脂質、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ｈ－ホスホネート又は親油性アルコール、パルミチル部分、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、及び脂肪酸、例えばステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレエイド酸、リノレン酸、及びミリスチン酸であるか、又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、Ｃ４～Ｃ３０飽和又は不飽和アルキル鎖を含む。アルキル鎖は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。

親油性コンジュゲート部分としては、例えば、ステロールスタノール、及びステロイド、並びにコレステロール（米国特許第４，９５８，０１３号、及びＬｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３）、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コール酸、デオキシコール酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、トコフェロール、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン、１７－ヒドロキシコルチコステロン、それらの誘導体等の関連化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、抱合体は、コレステロール、チオコレステロール、ヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コール酸、デオキシコール酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン及び１７－ヒドロキシコルチコステロンからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分はトコフェロールを含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分はコレステロールを含む。

他の親油性コンジュゲート部分としては、脂肪族基、例えば、直鎖、分枝鎖及び環状アルキル、アルケニル及びアルキニルが挙げられる。脂肪族基は、例えば、５～約５０個、６～約５０個、８～約５０個又は１０～約５０個の炭素原子を有することができる。脂肪族基の例としては、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、ドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、テルペン、ボルニル、アダマンチル、それらの誘導体等が挙げられる。いくつかの実施形態において、脂肪族基中の１個以上の炭素原子は、Ｏ、Ｓ又はＮ（例えば、ゲラニルオキシヘキシル）等のヘテロ原子によって置き換えられ得る。更に好適な親油性コンジュゲート部分には、アルキルグリセロール、ビス（アルキル）グリセロール、トリス（アルキル）グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド等のグリセロールの脂肪族誘導体が含まれる。いくつかの実施形態では、親油性コンジュゲートは、ジ－ヘキシルデシル－ｒａｃ－グリセロール又は１，２－ジ－Ｏ－ヘキシルデシル－ｒａｃ－グリセロール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１；Ｓｈｅａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７）又はそのホスホネートである。例えば、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル及び脂肪アミン等の飽和及び不飽和脂肪官能基も親油性コンジュゲート部分として機能することができる。いくつかの実施形態では、脂肪官能基は、約６～約３０個又は約８～約２２個の炭素を含むことができる。脂肪酸の例としては、カプリン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコセン酸等が挙げられる。

更なる実施形態では、親油性共役部分は、６～約５０個、１０～約５０個、又は１４～約４０個の炭素原子を有する多環式芳香族基であり得る。多環式芳香族基の例としては、ピレン、プリン、アクリジン、キサンテン、フルオレン、フェナントレン、アントラセン、キノリン、イソキノリン、ナフタレン、それらの誘導体等が挙げられる。他の適切な親油性コンジュゲート部分としては、メントール、トリチル（例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ））、フェノキサジン、リポ酸、リン脂質、エーテル、チオエーテル（例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール）、それらの誘導体等が挙げられる。オリゴヌクレオチドの親油性コンジュゲートの調製は、当技術分野、例えば、Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９；（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９，ａｎｄ Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１に十分に記載されている。

生体切断性（Ｂｉｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）ヌクレオチドリンカー
脂質小胞にカプセル化される一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、ギャップマーＦ－Ｇ－Ｆ’、トータルマー又はミクスマーの領域等の標的核酸に相補的であり、追加の５’及び／又は３’ヌクレオシドを更に含み得るオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり得る。更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、又は完全に相補的でなくてもよく、そのような更なる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ’’と呼ばれることがある。

領域Ｄ’又はＤ’’の付加は、ギャップマー、トータルマー又はミクスマーの連続ヌクレオチド配列等の連続ヌクレオチド配列を、コンジュゲート部分又は別の官能基に、コンジュゲートがその標的組織に到達した後に連続ヌクレオシド配列からコンジュゲートを除去できるように結合する目的で使用され得る。連続するヌクレオチド配列とコンジュゲート部分との間に生体切断性リンカーを形成するために、追加のヌクレオシド（領域Ｄ’又はＤ’’）を、ホスホジエステルヌクレオシド間結合等のヌクレアーゼに適した結合で結合する。領域Ｄ’又はＤ’’は、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオシドを含むか、又はそれからなり、標的核酸に相補的であってもよく、又は相補的でなくてもよい。領域Ｄ’又はＤ’’とギャップマー、ミクスマー又はトータルマーとの間の転移は、ホスホロチオエート連結糖修飾ヌクレオシドからホスホジエステル連結非糖修飾ヌクレオシド、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はこれらの塩基修飾バージョンへの転移によって認識される。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、両方とも領域Ｄ’又はＤ’’ヌクレオシド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の間のホスホジエステル結合で結合されるが、ギャップマー、ミクスマー又はトータルマーの末端の糖修飾ヌクレオシドを追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチド（領域Ｄ）と接続するヌクレオシド間結合も、好ましくはホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合ＤＮＡ又はＲＮＡであり、好ましくは、ギャップマー、ミクスマー又はトータルマーの５’末端又は３’末端とコンジュゲート部分との間に少なくとも２個、例えば少なくとも３個、例えば少なくとも５個の連続したホスホジエステル結合が存在する。

領域Ｄ’又はＤ’’としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断性リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これには例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドが含まれる。

ギャップマーの場合、生体切断性ヌクレオチドリンカーを使用する設計は、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’又はＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’によって説明することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。

一実施形態では、本発明の脂質小胞に封入される一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマー、ミクスマー又はトータルマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。

いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’_１－３－Ｆ_１－８－Ｇ_５－１６－Ｆ’_２－８－Ｄ’’_１－３

いくつかの実施形態において、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態において、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。

相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成の能力を表す。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５－メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を包含することが理解されよう（例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。

本明細書で使用される用語「相補性％」は、個別の核酸分子（例えば、標的核酸又は標的配列）の所与の位置のヌクレオチドの連続配列に所与の位置において相補的な（すなわち、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する）、核酸分子内の連続ヌクレオチド配列（例えばオリゴヌクレオチド）のヌクレオチドの数を％で表したものを指す。百分率は、２つの配列間で対を形成する（標的配列５’－３’とオリゴヌクレオチド配列３’－５’を整列させたとき）、整列した塩基の数を計数し、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の相補性％の計算において許容されない。

「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。

同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（例えば、本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列）の間で同一の（一致する）整列された塩基の数を計数し、その数を整列された領域内のヌクレオチドの総数で除し、１００を乗ずることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致数×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。

標的核酸
本明細書で使用される「標的核酸」という用語は、本明細書で言及される修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドによって意図的に調節される遺伝子、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列を指す。本発明の標的核酸は、少なくとも中枢神経系（例えば、脳組織）、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞において発現される。標的核酸は、処置される疾患に関連することが理解されるべきである。したがって、本明細書で言及される単離された脂質小胞によって処置される疾患は、標的核酸又は標的核酸によって直接調節される標的又は標的核酸によってコードされるタンパク質のレベルを変化させることによって改善されると予測される。一実施形態では、疾患は、標的核酸又は標的核酸によってコードされるタンパク質の異常なレベルによって引き起こされる。別の実施形態では、疾患は、標的核酸によってコードされるタンパク質の機能不全変異体、例えばスプライス変異体又は変異変異変異体によって引き起こされる。別の実施形態では、例えば、そのような増加が別の疾患原因タンパク質の異常レベルを低下させるのに役立つ場合、疾患は、正常レベルと比較して標的核酸の／からの発現を増加させることによって改善され得る。特に、疾患は、中枢神経系（例えば、脳組織）、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞において標的核酸を調節することによって改善することができる。「異常レベル」という表現は、当業者にはよく理解されており、一般に、処置される疾患に罹患している対象において、疾患に罹患していない対象（特に、中枢神経系（例えば、脳組織）、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞において、）と比較して増加又は減少する標的核酸又はそれにコードされるタンパク質のレベルを指す。いくつかの態様において、疾患は、標的核酸の発現をダウンレギュレーションすることによって処置される。

標的核酸は、上記の細胞又は組織で発現される任意の核酸であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、バイオマーカを含む。別の実施形態では、標的核酸はプレ－ｍＲＮＡである。別の実施形態では、標的核酸は、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。別の実施形態では、標的核酸はｍｉＲＮＡである。

修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続する配列は、典型的には、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定した場合、標的核酸と相補的、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば完全に相補的である。修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸に完全に相補的であることが有利である。必要に応じて、標的核酸に対する１つ又は２つのミスマッチが許容され得る。配列相補性は、一般に、オリゴヌクレオチドをコンジュゲート又は他の非相補的末端ヌクレオチド等の任意の官能基に連結し得るヌクレオチドに基づくリンカー領域を必要に応じて除外して、オリゴヌクレオチドの全長にわたって、又は好ましくはオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列にわたって測定される。

標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、脂質小胞にロードされたオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態において、標的配列は、標的核酸上の、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な領域からなる。

標的の調節
本明細書で使用される「調節」という用語は、本発明の脂質小胞の投与前の標的核酸の量と比較した場合に標的核酸の量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力の全体的な用語として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。例えば、対照は、生理食塩水組成物又は無負荷の単離された脂質小胞で処置された個々の細胞又は標的細胞である。

一実施形態では、調節は、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションによって達成され、それにより、ｉ）上記標的核酸の発現をダウンレギュレートする、すなわち減少させる、ｉｉ）標的核酸のスプライススイッチングを達成して、標的核酸のスプライスバリアントの発現をもたらす、又はｉｉｉ）下流のｍＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させるために標的核酸、例えばｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを遮断する。

別の実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン・クリック塩基対合を介する代わりに、静電相互作用、疎水性相互作用及びそれらの相補的形状等の非共有結合性相互作用を介して標的核酸又は標的タンパク質に結合し、それによって標的を遮断又は活性化するアプタマーである。

標的の調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％をもたらす。

いくつかの実施形態において、本発明の脂質小胞負荷オリゴヌクレオチドは、脂質小胞に少なくとも１種の１μＭ核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子）、例えば５μＭオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子を経口投与した後、ｉｎ ｖｉｖｏで標的ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも４０％阻害することができる場合がある。

いくつかの実施形態において、脂質小胞負荷オリゴヌクレオチドは、脂質小胞に少なくとも１種の１μＭ核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子）、例えば５μＭオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子を経口投与した後、ｉｎ ｖｉｖｏで標的タンパク質の発現レベルを少なくとも２０％増加することができる場合がある。

いくつかの実施形態では、本発明の脂質小胞負荷オリゴヌクレオチドは、５μＭオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子等の少なくとも１μＭ核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子）を有する脂質小胞の経口投与後に、ｉｎ ｖｉｖｏで総標的タンパク質の少なくとも２０％を構成する選択的にスプライシングされた標的タンパク質を提供するために、標的核酸のスプライススイッチングを変化させることができる場合がある。

処置
本明細書で使用される「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の処置、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。処置される対象は、好ましくは哺乳動物、例えばマウスである。一実施形態では、対象はヒト対象である。処置される疾患には、中枢神経系疾患（脳疾患等）、脾臓疾患、胃腸疾患、肝疾患及びＴ細胞が関与する疾患が含まれる。好ましい疾患は、本明細書の他の箇所に開示されている。

発明の詳細な説明
第一の態様では、本発明は、医薬品として使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子等の核酸分子を担持する３００ｎｍ未満の合成的に調製された脂質小胞等の脂質小胞に関し、当該脂質小胞は経口投与される、すなわち該小胞は経口投与用に製剤化される。

脂質小胞という用語は、上記の定義で定義されている。好ましくは、当該脂質小胞は、上記のようにＤＬＳに従って測定される３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄｈを有する。好ましくは、脂質小胞は、５０～３００ｎｍの範囲の直径を有する。更なる実施形態では、脂質小胞の流体力学的径Ｄ_ｈは、ＤＬＳに従って測定される２００ｎｍ未満、好ましくは５０～２７５ｎｍ、例えば５０～２５０、好ましくは６０～１８０ｎｍの範囲の直径である。

第一の実施形態によれば、脂質小胞は、コレステロール、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン、少なくとも１種のホスファチジルセリン、少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、少なくとも１種のジアシルグリセロール、少なくとも１種のトリアシルグリセロール、少なくとも１種のホスファチジルイノシトール、少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸及びホスファチジルセリンからなる群から独立して選択される１種以上、例えば少なくとも２種、少なくとも３種又は少なくとも４種の脂質を含む。

更なる実施形態では、脂質小胞は、好ましくは、以下からなる群から独立して選択される１種以上の脂質を含む：
－ ４～５０ｍｏｌ％の範囲の量、より好ましくは５～４５ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～２５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～２０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１４～３５ｍｏｌ％の量のコレステロール、
－ 必要に応じて、０～４５ｍｏｌ％、例えば２～４５ｍｏｌ％、例えば１５～４５ｍｏｌ％、例えば４～２５ｍｏｌ％の範囲の量、より好ましくは２～１５ｍｏｌ％の量、より好ましくは４～１３ｍｏｌ％の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリン、
－ ０～４０ｍｏｌ％の脂質小胞、例えば１．９～４０ｍｏｌ％、例えば４～３６ｍｏｌ％、好ましくは４～１５ｍｏｌ％、好ましくは２０～３６ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルコリン、
－ ２～７０ｍｏｌ％の範囲の量、より好ましくは１０～７０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～５０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～３０ｍｏｌ％の量、より好ましくは１９～２３．５ｍｏｌ％の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、
－ ０～４５ｍｏｌ％の脂質小胞、例えば２～２０ｍｏｌ％、例えば４～３６ｍｏｌ％、好ましくは１２～２０ｍｏｌ％、好ましくは２０～３１ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルセリン、
－ ０～１２ｍｏｌ％、例えば４～１２ｍｏｌ％、より好ましくは４～６ｍｏｌ％の量、より好ましくは１０～１２ｍｏｌ％の量の少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸、
－ ５ｍｏｌ％未満のジアシルグリセロール、
－ ５ｍｏｌ％未満のトリアシルグリセロール、及び
－ ５ｍｏｌ％未満のホスファチジルイノシトール
（全てのｍｏｌ％量は、無負荷脂質小胞の量［ｍｏｌ単位］に基づいて計算される）。好ましい実施形態では、脂質小胞は、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）及びコレステロールを、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、各脂質小胞の２～９０ｍｏｌ％、好ましくは３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％の総量で含み、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの合計として計算される。

一実施形態では、脂質小胞は、以下の範囲の全ての脂質を含むか、又はそれらからなる：
－ １０～１５ｍｏｌ％、例えば１２～１４．５ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロール、
－ ２～８ｍｏｌ％、例えば３～５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリン、
－ ２５～３０ｍｏｌ％、例えば２６～２９ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルコリン、
－ １０～２５ｍｏｌ％、例えば１５～１９．５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、
－ １２～２０ｍｏｌ％、例えば１２～１４．５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルセリン、
－ ３～５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸、
－ ３～５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１つのジアシルグリセロール、
－ ３～６ｍｏｌ％の範囲の少なくとも１種のトリアシルグリセロール、及び
－ ３～５ｍｏｌ％の範囲の少なくとも１種のホスファチジルイノシトール
（全てのｍｏｌ％量は、無負荷脂質小胞の量［ｍｏｌ単位］に基づいて計算される）。好ましくは、脂質小胞は、上記の好ましい範囲の脂質、コレステロール、Ｌ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミン、Ｌ－アルファＰＳ、少なくとも１種のホスファチジルコリン、ジパルミチン、グリセロールトリステアレート、Ｌ－アルファ－ホスファチジルイノシトール及びビス（モノオレオイルグリセロ）ホスフェートを含むか又はそれらからなり、スフィンゴミエリンは、乳スフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの混合物からなる群から選択され、ホスファチジルコリンは卵ＰＣ及び／又はＤＯＰＣである。

第２の実施形態によれば、脂質小胞は、コレステロール、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン、少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン及び少なくとも１種のホスファチジルセリンを含むか、又はそれらからなる。更なる実施形態では、脂質小胞は、以下を含むか、又はそれらからなる：
－ １０～２５ｍｏｌ％の範囲、好ましくは１４～２２ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは１７～１９ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロール、
－ ４～１０ｍｏｌ％の範囲、好ましくは４～８ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは５～６ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリン、
－ １０～４０ｍｏｌ％の範囲、好ましくは１０～３７ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは３０～３６ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルコリン（好ましくはホスファチジルコリンはＥＧ ＰＣ、ＤＬＰＣ及び／又はＤＯＰＣから選択される）、
－ １０～３０ｍｏｌ％、好ましくは１５～２５ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは２０～２４ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、
－ １０～２０ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは１５～１８ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルセリン
（全てのｍｏｌ％量は、無負荷脂質小胞の量［ｍｏｌ単位］に基づいて計算される）。好ましくは、脂質小胞は、上記の好ましい範囲で、コレステロール、Ｌ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミン、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン及びＬ－アルファＰＳを含み、スフィンゴミエリンは、乳スフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの混合物からなる群から選択され、ホスファチジルコリンは、卵ＰＣ及び／又はＤＯＰＣである。

第二の実施形態の別の好ましい実施形態では、脂質小胞は、以下を含むか、又はそれらからなる：
－ 少なくとも４～１４．５ｍｏｌ％、又は１６～１９ｍｏｌ％、又は３０～５０ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロール、
－ ２～２４、例えば３～４．８ｍｏｌ％、又は５．９～２４ｍｏｌ％、又は３５～４５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリン、
－ １．５～２９ｍｏｌ％、例えば１２～２９ｍｏｌ％、又は３２～３６ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルコリン、
－ ２．５～３ｍｏｌ％、又は１０～２０ｍｏｌ％、例えば１１～１９ｍｏｌ％、又は２２～２５ｍｏｌ％、例えば２３～２５ｍｏｌ％、又は３０～４０ｍｏｌ％、又は４４～７０ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、及び
－ ２～３ｍｏｌ％又は１０～２０ｍｏｌ％、例えば１０～１４．５ｍｏｌ％、例えば１６～１８ｍｏｌ％又は２５～４５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルセリン
（全てのｍｏｌ％量は、無負荷脂質小胞の量［ｍｏｌ単位］に基づいて計算される）。好ましくは、脂質小胞は、上記の好ましい範囲で、コレステロール、Ｌ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミン、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン及びＬ－アルファＰＳを含み、スフィンゴミエリンは、乳スフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの混合物からなる群から選択され、ホスファチジルコリンは、卵ＰＣ及び／又はＤＯＰＣである。好ましくは、上記実施形態の脂質小胞は、脂質小胞は、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）及びコレステロールを、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、各脂質小胞の２～９０ｍｏｌ％、好ましくは３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％の総量で含み、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの合計として計算される。

第３の好ましい実施形態によれば、脂質小胞は、コレステロール、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン、少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン及び少なくとも１種のホスファチジルセリン、並びに少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸を含むか、又はそれらからなる。この実施形態によれば、脂質小胞は、好ましくは、以下を含むか、又はそれらからなる：
－ １０～２５ｍｏｌ％の範囲、好ましくは１５～２２ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは１５～１８ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロール、
－ ４～１０ｍｏｌ％の範囲、好ましくは４～１３ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは５～６ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリン、
－ １５～４０ｍｏｌ％の範囲、好ましくは２０～３７ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは２５～３５ｍｏｌ％、より好ましくは３１～３４ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルコリン、
－ １５～４５ｍｏｌ％、好ましくは１８～２５ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは２０～２３ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、
－ １０～３０ｍｏｌ％、好ましくは１２～２０ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは１５～１８ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルセリン、
－ ７ｍｏｌ％未満、好ましくは３～６ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸
（全てのｍｏｌ％量は、無負荷脂質小胞の量［ｍｏｌ単位］に基づいて計算される）。好ましくは、脂質小胞は、上記の好ましい範囲で、コレステロール、Ｌ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミン、少なくとも１つのスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン、ビス（モノオレオイルグリセロ）ホスフェート及びＬ－アルファＰＳを含むか又はそれらからなり、ホスファチジルコリンは卵ＰＣ及び／又はＤＯＰＣであり、スフィンゴミエリンは、ミルクスフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは乳スフィンゴミエリンである。

第４の好ましい実施形態によれば、脂質小胞は、コレステロール、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、及び少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸を含むか、又はそれらからなる。この実施形態によれば、脂質小胞は、好ましくは、以下を含むか、又はそれらからなる：
－ １０～５０ｍｏｌ％の範囲、好ましくは２０～３８ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは３１～３４ｍｏｌ％の範囲、又は２５～３８ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロール、
－ ４～１５ｍｏｌ％の範囲、好ましくは８～１３ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは１０～１３ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリン、
－ ２０～５０ｍｏｌ％、好ましくは４０～５０ｍｏｌ％の範囲、より好ましくは４３～４０ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、
－ ０～１２ｍｏｌ％、好ましくは１～９ｍｏｌ％、好ましくは３～７ｍｏｌ％、好ましくは４～１２ｍｏｌ％、好ましくは１０～１２ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸
（全てのｍｏｌ％量は、無負荷脂質小胞の量［ｍｏｌ単位］に基づいて計算される）。好ましくは、脂質小胞は、上記の好ましい範囲で、コレステロール、Ｌ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミン、少なくとも１種の乳スフィンゴミエリン、及びビス（モノオレオイルグリセロ）ホスフェートを含むか又はそれらからなり、スフィンゴミエリンは、ミルクスフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは乳スフィンゴミエリンである。好ましくは、上記実施形態の脂質小胞は、脂質小胞は、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）及びコレステロールを、無負荷脂質小胞自体の総量に基づいて、ｍｏｌ単位で、各脂質小胞の２～９０ｍｏｌ％、好ましくは３０～８０ｍｏｌ％、より好ましくは３１～６５ｍｏｌ％の総量で含み、ホスファチジルエタノールアミン（複数可）とコレステロールの合計として計算される。

第５の好ましい実施形態によれば、脂質小胞は、コレステロール、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン、少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン及び少なくとも１種のホスファチジルセリンを含むか、又はそれらからなる。この実施形態によれば、脂質小胞は、好ましくは、以下を含むか、又はそれらからなる：
－ ４０～５５ｍｏｌ％の範囲、好ましくは４５～５０ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロール、
－ １０～１５ｍｏｌ％、例えば１２～１５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリン、
－ １０～１５ｍｏｌ％、例えば１２～１５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルコリン、
－ １０～１５ｍｏｌ％、例えば１２～１５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、及び
－ １０～１５ｍｏｌ％、例えば１２～１５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルセリン
（全てのｍｏｌ％量は、無負荷脂質小胞の量［ｍｏｌ単位］に基づいて計算される）。好ましくは、脂質小胞は、上記の好ましい範囲で、コレステロール、Ｌ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミン、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン及びＬ－アルファＰＳを含み、スフィンゴミエリンは、乳スフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの混合物からなる群から選択され、ホスファチジルコリンは、好ましくは卵ＰＣ及び／又はＤＯＰＣである。

第６の好ましい実施形態によれば、脂質小胞は、コレステロール、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン、少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン及び少なくとも１種のホスファチジルセリンを含むか、又はそれらからなる。この実施形態によれば、脂質小胞は、好ましくは、以下を含むか、又はそれらからなる：
－ ２～１０ｍｏｌ％の範囲、好ましくは４～６ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロール、
－ ２～１０ｍｏｌ％の範囲、好ましくは４～５ｍｏｌ％の範囲の量のコ少なくとも１種のスフィンゴミエリン、
－ ２～１０ｍｏｌ％の範囲、好ましくは４～６ｍｏｌ％の範囲の量のコ少なくとも１種のホスファチジルコリン、
－ ６０～７５、例えば６８～７２ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、
－ １０～２０ｍｏｌ％の範囲、例えば１６～１８ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルセリン
（全てのｍｏｌ％量は、無負荷脂質小胞の量［ｍｏｌ単位］に基づいて計算される）。好ましくは、脂質小胞は、上記の好ましい範囲で、コレステロール、Ｌ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミン、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、少なくとも１種のホスファチジルコリン及びＬ－アルファＰＳを含み、スフィンゴミエリンは、乳スフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの混合物からなる群から選択され、ホスファチジルコリンは、好ましくは卵ＰＣ及び／又はＤＯＰＣである。

本発明の試験では、本発明の脂質小胞の経口投与後に、本明細書に記載の脂質小胞に含まれる核酸分子が、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞に送達されることが示されている（実施例の欄を参照）。

したがって、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載の核酸分子を担持する脂質小胞であって、当該核酸分子が、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される１種以上の標的組織に送達される、脂質小胞を提供する。

本発明は、経口投与後にこれらの細胞／組織における標的核酸の効率的な調節を可能にする、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞への核酸分子の送達方法を提供する。

本発明は、医薬として使用するための核酸分子を担持する本明細書で定義される脂質小胞であって、当該脂質小胞が経口投与され、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される標的組織の１種以上における標的核酸の発現が調節される、脂質小胞を提供する。

「核酸分子」という用語は上記で定義されている。一実施形態では、核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、核酸分子はＲＮＡｉ分子である。

一実施形態では、本明細書に提供される脂質小胞に含まれる核酸分子は、修飾ヌクレオシド間結合及び／又は修飾された糖ヌクレオシドから選択される少なくとも１つの骨格修飾を有する修飾ｓｉＲＮＡである。

好ましくは、オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。

一実施形態では、本明細書に提供される脂質小胞に含まれる核酸分子は、修飾ヌクレオシド間結合及び／又は修飾された糖ヌクレオシドから選択される少なくとも１つの骨格修飾を有する修飾された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

一実施形態では、本明細書中に提供される脂質小胞に含まれる修飾された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％が、修飾ヌクレオシド間結合である。更に、当該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合であることが想定される。

一実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、ホスホルジアミデート及びボラノホスフェート結合を含む群から選択される。特に、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。一実施形態では、全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。

一実施形態では、本明細書に提供される脂質小胞に含まれる修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、骨格に少なくとも１つの糖修飾を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。糖修飾は、例えば、モルホリノ、ＰＮＡ又は２’糖修飾ヌクレオシドから選択され得る。

一実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。

好ましい実施形態では、修飾された一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合及び１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含むか、又はそれらからなる。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、特にオリゴヌクレオチド又はその連続するヌクレオチド配列の５’及び３’末端に位置する少なくとも３つの２’糖修飾ヌクレオシドを含む場合が有利である。１種以上の２’糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオシドからなる群から選択され得る。好ましい実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を有する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、１種以上のＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオシドを含む。したがって、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％のホスホロチオエートヌクレオシド結合を有する一本鎖アンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドである。

少なくとも１つの２’糖修飾ヌクレオシド、好ましくは少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を有する修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマー、ミクスマー、トータルマー、抗ｍｉＲ、ブロックｍｉＲ及びスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の群から選択される。したがって、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるギャップマー（ＬＮＡギャップマー等）であり得る。あるいは、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるミクスマーであり得る。あるいは、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるトータルマーであり得る。あるいは、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で定義される抗ｍｉＲであり得る。あるいは、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書で定義されるスプライススイッチングオリゴヌクレオチドであり得る。

特に、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドがＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが想定される。

本明細書で提供される脂質小胞に充填される修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば骨格修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には７～３５ヌクレオチド、例えば７～３０ヌクレオチドの長さを有する。それらは、薬学的に許容され得る塩の形態であり得る。

一実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７～３５ヌクレオチド、例えば７～３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、標的組織中の標的核酸に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。

一実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも７～２６ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、標的組織中の標的核酸に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。

一実施形態では、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド、例えば７～１４ヌクレオチド、又は１４～２０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、標的組織中の標的核酸に対して少なくとも９０％相補的、例えば完全に相補的である。

一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが親油性コンジュゲート部分に複合化されている実施形態。好ましくは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、親油性コンジュゲート部分が共有結合しているオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端に生体切断性ヌクレオチドリンカーを含む。

一実施形態では、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマー、ミクスマー又はトータルマーの連続するヌクレオチド配列と親油性コンジュゲート部分、例えばコレステロール又はトコフェロールコンジュゲート部分との間に位置する生体切断性ヌクレオチド領域（領域Ｄ’及び／又はＤ’’）を含む。

本明細書の脂質小胞は、本明細書で言及される核酸分子（修飾一本鎖オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子等）を担持する、すなわち含むものとする。したがって、核酸分子は脂質小胞に封入又は吸着される。換言すれば、本明細書で提供される脂質小胞は、核酸分子を担持している。更なる実施形態では、脂質小胞は経口送達用に製剤化される。

脂質小胞は、（特に標的組織／標的細胞において）標的核酸の改変を可能にする量の核酸分子を含む。核酸分子を担持する脂質小胞は、核酸分子のペイロードを含むとも言える。したがって、脂質小胞は、標的遺伝子の発現を調節することを可能にする量の核酸を含み得る。

本明細書で言及されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉオリゴヌクレオチド等の核酸分子を担持する脂質小胞は、経口投与される。好ましくは、核酸分子を担持する脂質小胞の薬学的有効量が投与される。経口投与は、脂質小胞、したがって核酸分子のペイロードを、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される標的組織に送達することを可能にする。

本発明に従って処置される疾患は、標的核酸の発現に関連するか、又は標的核酸の発現を変化させることによって処置することができる。したがって、疾患は、標的核酸の異常なレベルによって引き起こされ得る。好ましい実施形態では、疾患は、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞における標的核酸の発現に関連する。したがって、この疾患は、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞における標的核酸の異常なレベルによって引き起こされ得る。好ましい実施形態では、疾患は、標的核酸、特に中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞のレベルの低下によって処置することができる疾患である。好ましい実施形態では、疾患は、標的核酸から発現される機能性タンパク質の量を増加させるために、特に中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及び／又はＴ細胞において、標的核酸のスプライススイッチング（ｓｌｉｃｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）によって処置することができる疾患である。

一実施形態では、核酸分子は中枢神経系に送達される。「中枢神経系」という用語は、好ましくは脳及び脊髄を包含する。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが送達され得る脳内の特定の組織は、小脳、大脳皮質、中脳、視床、視床下部、海馬、線条体、前頭側頭葉、運動皮質及び脳幹を包含する。脊髄の特定の組織は、基底核、後角及び前角である。したがって、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳、脊髄、又は脳及び脊髄の両方、又はそれらの特定の組織に送達される。

好ましくは、中枢神経系（脳等）への送達は、脳がん（脳腫瘍等）、発作障害、神経変性障害、神経精神障害及び運動障害からなる群から選択される疾患の処置を可能にする。より好ましくは、中枢神経系（脳等）への送達は、アンジェルマン障害、アレキサンダー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、統合失調症、うつ病、双極性疾患、自閉症、てんかん、前頭側頭型認知症、進行性延髄麻痺、進行性核上性麻痺、レット症候群、トゥレット症候群、神経線維腫症、進行性筋萎縮症、遺伝性痙性対麻痺、ペリツェウス・メルツバッハー病、ゴーシェ病、脊髄小脳失調症、パゴン・バードデッター（Ｐａｇｏｎ Ｂｉｒｄ Ｄｅｔｔｅｒ）症候群、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、ディジョージ症候群、Ｄｕｐ１５ｑ症候群、ドゥーゼ症候群、Ｇｌｕｔ１欠損症、ＣＤＫＬ５障害、前頭葉てんかん、小児欠神てんかん、早期ミオクロニー脳症（ＥＭＥ）、レノックス・ガストー症候群（ＬＧＳ）、大田原症候群及びランドウ・クレフナー症候群からなる群から選択される疾患の処置を可能にする。したがって、上述の疾患は、本明細書で言及される脂質小胞の経口投与によって処置することができる。

一実施形態では、核酸分子は脾臓に送達される。

好ましくは、脾臓への送達は、脾臓がん等のがん、炎症性疾患及び免疫障害からなる群から選択される疾患の処置を可能にする。したがって、上述の疾患は、本明細書で言及される脂質小胞の経口投与によって処置することができる。

一実施形態では、核酸分子は肝臓に送達される。

好ましくは、肝臓への送達は、肝臓がん、心血管疾患、凝固カスケード欠損、炎症性疾患、代謝性疾患及び感染症からなる群から選択される疾患の処置を可能にする。より好ましくは、肝臓への送達は、肝細胞癌、他の組織の原発性がんから転移した肝悪性腫瘍、１型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、インスリン抵抗性、血糖値の制御、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール不均衡、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、心血管疾患、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、肥満症、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、血栓症、希な出血障害、Ｂ型又はＣ型肝炎、サイトメガロウイルス感染、住血吸虫感染及びレプトスピラ感染、マラリア、カンテツ感染、関節リウマチ、肝線維症、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝性ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、重症筋無力症、視神経脊髄炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、クッシング症候群、並びにトランスサイレチン型家族性アミロイドーシスから選択される疾患の処置を可能にする。したがって、上述の疾患は、本明細書で言及される脂質小胞の経口投与によって処置することができる。

一実施形態では、核酸分子はＴ細胞に送達される。

好ましくは、Ｔ細胞への送達は、がん、炎症性疾患及び感染症からなる群から選択される疾患の処置を可能にする。

一実施形態では、核酸分子は消化管に送達される。消化管は、胃及び腸を含む消化器系の一部である。したがって、核酸分子は、胃及び／又は腸、すなわち小腸又は大腸に送達され得る。好ましくは、消化管への送達は、結腸直腸がん、胃がん、代謝障害又は炎症性腸疾患（クローン病又は潰瘍性大腸炎等）の処置を可能にする。

更なる態様では、本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書の他の箇所で定義される一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）等の核酸を担持する本明細書で提供される脂質小胞を含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントを更に含み得る。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。特に、医薬組成物は、経口投与に適した製剤である。

本発明は、上記のように本明細書で提供される脂質小胞に含まれる（例えば、製剤化された、包含された、カプセル化された、充填された）治療有効量の核酸分子又は本発明の医薬組成物を、疾患に罹患している対象に経口投与することによって疾患を処置する方法を提供する。

本発明は、上記のように本明細書で提供される脂質小胞に含まれる（例えば、製剤化された、包含された、カプセル化された、充填された）治療有効量の核酸分子又は本発明の医薬組成物を、疾患に罹患している対象に経口投与することによって、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞における疾患を処置する方法を提供する。好ましい疾患は上記で言及されている。経口投与すると、修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸分子は、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される１種以上の標的組織に送達される。

本発明はまた、疾患を処置するための医薬品を製造するための、上記の修飾一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸分子を含む脂質小胞の使用を提供する。好ましい疾患は上記で言及されている。上記の定義及び説明は、それに応じて適用される。好ましくは、脂質小胞は経口投与され、それによって核酸分子を、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される１種以上の標的組織に送達する。

製造方法
更なる態様では、本発明は、本発明に関連して本明細書で言及される核酸分子を担持する、すなわちそれを含む脂質小胞を製造する方法を提供する。先の定義は適宜、適用される。

本発明の脂質小胞は、薄膜再水和法を用いて調製されることが好ましい。この方法は、好ましくは、
－ 有機溶媒中で少なくとも１種の脂質小胞形成成分の溶液を形成する工程
－ 当該溶媒を除去して脂質膜を形成する工程
－ アンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子等の核酸分子の存在下で、水性溶媒、好ましくは緩衝液中でフィルムを再水和させ、
それにより、当該核酸分子を担持する上記脂質小胞を形成する工程、を含む。

有機溶媒は、好ましくは、メタノール、クロロホルム及びジクロロメタン、エタノール、ジクロロメタン、並びにイソプロパノール及びそれらの２種以上の混合物からなる群から選択される。水性溶媒としては、好ましくは水性緩衝液が用いられる。

したがって、本発明はまた、上記の方法、並びに当該方法によって得られる又は得ることができる脂質小胞に関する。

実施形態の一覧
以下では、本発明の特に好ましい実施形態が記載される。

１．医薬として使用するための核酸分子を担持する脂質小胞であって、該脂質小胞が、ＤＬＳに従って測定される３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄ_ｈ、好ましくは５０～３００ｎｍの範囲の直径を有し、脂質小胞が経口投与され、核酸分子が、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される標的組織の１種以上に送達するためのものである、脂質小胞。

２．ＤＬＳに従って測定される２００ｎｍ未満、好ましくは５０～２５０ｎｍの範囲の直径の流体力学的径Ｄ_ｈを有する、実施形態１に記載の使用のための脂質小胞。

３．ＤＬＳに従って測定される１８０ｎｍ未満の流体力学的径Ｄｈ、好ましくは６０～１８０ｎｍ、例えば１００～１６０ｎｍの範囲の直径を有する、実施形態１又は２に記載の使用のための脂質小胞。

４．２０℃の温度で少なくとも５時間、胃液中で安定である、実施形態１から３のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

５．２０℃の温度で少なくとも５時間、絶食状態の腸液中で安定である、実施形態１又は実施形態４のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

６．脂質小胞の流体力学的径が、インキュベーション前に測定されたそれぞれの初期Ｄｈと比較した場合、胃液中で５時間のインキュベーション後に最大で９０％変化する、実施形態４又は５に従って使用するための脂質小胞。

７．インキュベーション後０時間及び５時間の両方において、脂質小胞の流体力学的径が最大で６０％変化し、脂質小胞のＤｈが８０～１８０ｎｍの範囲にある、実施形態６に記載の使用のための脂質小胞。

８．脂質小胞の流体力学的径が、インキュベーション前に測定されたそれぞれの初期Ｄｈと比較した場合、腸液中で５時間のインキュベーション後に最大で４０％変化する、実施形態４から７に記載の使用のための脂質小胞。

９．インキュベーション後０時間及び５時間の両方において、脂質小胞の流体力学的径が最大で２５％変化し、脂質小胞のＤｈが８０～１８０ｎｍの範囲にある、実施形態８に記載の使用のための脂質小胞。

１０．脂質小胞がコレステロール及び少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、実施形態１から９のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

１１．ホスファチジルエタノールアミンがＬ－アルファ－ホスファチジル－エタノールアミンである、実施形態１０に記載の使用のための脂質小胞。

１２．脂質小胞が、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールを含む、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

１３．脂質小胞が、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて４～１４．５ｍｏｌ％、又は１６～１９ｍｏｌ％、又は３０～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールを含む、実施形態１２に記載の使用のための脂質小胞。

１４．脂質小胞が、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて２～７０ｍｏｌ％の量のＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンを含む、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

１５．脂質小胞が、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて１１～１９ｍｏｌ％、又は２３～２５ｍｏｌ％、又は３０～４０ｍｏｌ％、又は４４～７０ｍｏｌ％の量のＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンを含む、実施形態１４に記載の使用のための脂質小胞。

１６．脂質小胞が、少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジル－エタノールアミン、及びコレステロールを、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて２～９０ｍｏｌ％、好ましくは３０～８０ｍｏｌ％の総量で含む、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

１７．脂質小胞が、少なくとも１種のホスファチジルコリン及び／又は少なくとも１種のホスファチジルセリン及び／又は少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸を更に含む、実施形態１０から１６のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

１８．実施形態１７に記載の使用のための脂質小胞であって、
ｉ．ホスファチジルコリンは、０～４０ｍｏｌ％、例えば１．５～２９ｍｏｌ％、例えば１２～２９ｍｏｌ％、例えば３２～３６ｍｏｌ％の量であり、及び／又は
ｉｉ．少なくとも１種のホスファチジルセリンは、０～４５ｍｏｌ％、例えば２～３ｍｏｌ％、例えば１０～２０ｍｏｌ％、例えば２５～４５ｍｏｌ％の量であり、及び／又は
ｉｉｉ．少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸は、０から１２ｍｏｌ％、例えば４～１２ｍｏｌ％、例えば１０～１２ｍｏｌ％の量である、脂質小胞。

１９．脂質小胞中のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びリゾビスホスファチジン酸の総量が、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲である、実施形態１７又は１８に記載の使用のための脂質小胞。

２０．少なくとも１種のホスファチジルコリンが卵－ＰＣ、ＤＬＰＣ又はＤＯＰＣである、実施形態１７又は１９に記載の使用のための脂質小胞。

２１．少なくとも１種のホスファチジルコリンが卵－ＰＣ又はＤＯＰＣである、実施形態１７又は２０に記載の使用のための脂質小胞。

２２．脂質小胞が、少なくとも１種のスフィンゴミエリン、特に、乳スフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの２種以上の混合物からなる群から選択されるスフィンゴミエリンを更に含む、実施形態１０から２１のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

２３．脂質小胞が、少なくとも１種のスフィンゴミエリンを、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて２～４５ｍｏｌ％、例えば２～２４ｍｏｌ％、例えば３～４．８ｍｏｌ％、例えば４～１５ｍｏｌ％、例えば５．９～２４ｍｏｌ％、例えば３５～４５ｍｏｌ％の範囲の量で含む、実施形態２２に記載の使用のための脂質小胞。

２４．脂質小胞が、必要に応じて、少なくとも１種のジアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のトリアシルグリセロール及び／又は少なくとも１種のホスファチジルイノシトールを更に含み、ジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールとホスファチジルイノシトールの合計の総量が、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて０～１５ｍｏｌ％の範囲にある、実施形態１０から２３のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

２５．脂質小胞が、
ｉ．０～５ｍｏｌ％、例えば３～５ｍｏｌ％の量のジアシルグリセロールと、
ｉｉ．０～５ｍｏｌ％、例えば３～５ｍｏｌ％の量のトリアシルグリセロールと、
ｉｉｉ．０～５ｍｏｌ％、例えば３～５ｍｏｌ％の量のホスファチジルイノシトールと、を含み、
ジアシルグリセロール及びトリアシルグリセロール並びにホスファチジルイノシトールの総量は、それぞれ無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて４～１５ｍｏｌ％の範囲である、実施形態２４に記載の使用のための脂質小胞。

２６．脂質小胞が、５０～２５０ｎｍの流体力学的径Ｄ_ｈを有し、
ｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて４～５０ｍｏｌ％の量のコレステロール、
ｉｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて１０～７０ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、脂質小胞、
ｉｉｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて４～１５ｍｏｌ％の範囲の量の少なくとも１種のスフィンゴミエリンであって、脂質小胞、並びに
ｉｖ．必要に応じて、少なくとも１種のジアシルグリセロール、及び／又は少なくとも１種のトリアシルグリセロール、及び／又は少なくとも１種のホスファチジルイノシトールを含み、ジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールとホスファチジルイノシトールの合計の総量は、無負荷脂質小胞の総量に基づいて、０～１５ｍｏｌ％、例えば４～１５ｍｏｌ％の範囲である、実施形態１から２５に記載の使用のための脂質小胞。

２７．脂質小胞が、ホスファチジルコリン、及び／又はホスファチジルセリン、及び／又はリソビスホスファチジン酸を更に含む、実施形態２６に記載の使用のための脂質小胞。

２８．ホスファチジルコリンが卵－ＰＣ又はＤＯＰＣである、実施形態２６又は２７に記載の脂質小胞。

２９．脂質小胞が、無負荷脂質小胞の総量に基づいて、４～３６ｍｏｌ％の卵－ＰＣ、又は４～３６ｍｏｌ％のＤＯＰＣを含む、実施形態２７又は２８に記載の使用のための脂質小胞。

３０．ホスファチジルセリンが、無負荷脂質小胞の総量に基づいて１２～２０ｍｏｌ％の範囲である、実施形態２６から２９に記載の脂質小胞。

３１．リソビスホスファチジン酸が、無負荷脂質小胞の総量に基づいて４～１２ｍｏｌ％の範囲である、実施形態２６から３０に記載の脂質小胞。

３２．脂質小胞が、６０～１８０ｎｍの流体力学的径Ｄ_ｈを有し、
ｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて１０～１５ｍｏｌ％、例えば１２～１４．５ｍｏｌ％の範囲の量のコレステロール、
ｉｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて１０～２５ｍｏｌ％、例えば１５～１９．５ｍｏｌ％の範囲の少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、
ｉｉｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて２～８ｍｏｌ％、例えば３～５ｍｏｌ％の範囲の少なくとも１種の乳スフィンゴミエリン、
ｉｖ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて２５～３０ｍｏｌ％、例えば２６～２９ｍｏｌ％の範囲の卵－ＰＣ、
ｖ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて３～５ｍｏｌ％の範囲の少なくとも１種のジアシルグリセロール、
ｖｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて３～５ｍｏｌ％の範囲の少なくとも１種のトリアシルグリセロール、
ｖｉｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて３～５ｍｏｌ％の範囲の少なくとも１種のホスファチジルイノシトール、
ｖｉｉｉ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて３～６ｍｏｌ％の範囲のリソビスホスファチジン酸、及び
ｉｘ．無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて１２～２０ｍｏｌ％、例えば１２～１４．５ｍｏｌ％の範囲のホスファチジルセリンを含む、実施形態１から３１に記載の使用のための脂質小胞。

３３．脂質小胞が、Ｆ１、Ｆ３、Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１７、Ｆ１８、Ｆ２０、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２４、Ｆ２５、Ｆ２６、Ｆ２８、Ｆ３０、Ｆ３３又はＦ３４から選択される、実施形態１に記載の使用のための脂質小胞。

３４．脂質小胞が、組成物Ｆ１、Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１７、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２５又はＦ３３から選択される、実施形態１又は３３に記載の使用のための脂質小胞。

３５．核酸分子が、標的組織中の標的核酸を調節することができる、実施形態１から３２のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

３６．核酸分子が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１から３５のいずれか１つに記載の使用の脂質小胞。

３７．修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオシドからなる群から独立して選択される２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態３６に記載の使用の脂質小胞。

３８．修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合、ジホスホロチオエート結合及びボラノホスフェート結合からなる群から選択される実施形態３６又は３７に記載の使用のための脂質小胞。

３９．核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子である、実施形態１から３８のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

４０．アンチセンスオリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである、実施形態３９に記載の使用のための脂質小胞。

４１．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、７～３０ヌクレオチド長、例えば８～１２ヌクレオチド長、例えば１４～２０ヌクレオチド長である、実施形態３９又は４０に記載の使用のための脂質小胞。

４２．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ギャップマー、ミクスマー、トータルマー、抗ｍｉＲ、ブロックｍｉＲ及びスプライススイッチングオリゴヌクレオチドの群から選択される、実施形態３９から４１に記載の使用のための脂質小胞。

４３．アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％、例えば少なくとも７５％がホスホロチオエート結合である実施形態４０から４２に記載の使用のための脂質小胞。

４４．一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態４３に記載の使用のための脂質小胞。

４５．一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが１種以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態４０から４４のいずれか１つに記載の使用のための脂質小胞。

４６．修飾ヌクレオシドが、リボースが、ヘキソース環（ＨＮＡ）、非連結リボース環ＵＮＡ、ビシクロヘキソース、トリシクロヌクレオシド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸からなる群から選択される修飾によって置換されているヌクレオシドである、実施形態４５に記載の使用のための脂質小胞。

４７．修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオシドからなる群から独立して選択される２’糖修飾ヌクレオシド等の２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項４５に記載の使用のための脂質小胞。

４８．ＬＮＡヌクレオシドが、オキシ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、及びＥＮＡから選択される、実施形態４７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

４９．修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ_２－を有するオキシ－ＬＮＡである、実施形態４７又は４８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。

５０．オキシ－ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施形態４９に記載の使用のための脂質小胞。

５１．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーであり、Ｆ及びＦ’ウィング領域が、実施形態４７から５０に従って１～７個の２’糖修飾ヌクレオシドを独立して含むか又はそれからなり、Ｇが、ＤＮＡ等のＲＮａｓｅＨを動員することができる５個～１８個のヌクレオシドの間の領域である、実施形態４２に記載の使用のための脂質小胞。

５２．請求項１から５１のいずれか一項に記載の使用のための脂質小胞であって、
ａ）当該核酸分子は、脳及び／又は脊髄等の中枢神経系に送達可能であって、該医薬は、脳がん（脳腫瘍等）、発作性障害、神経変性障害、神経精神障害及び運動障害の処置のためのものであり、例えば、発作性障害、神経変性障害、神経精神障害又は運動障害は、アンジェルマン障害、アレキサンダー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、統合失調症、うつ病、双極性疾患、自閉症、てんかん、前頭側頭型認知症、進行性延髄麻痺、進行性核上性麻痺、レット症候群、トゥレット症候群、神経線維腫症、進行性筋萎縮症、遺伝性痙性対麻痺、ペリツェウス・メルツバッハー病、ゴーシェ病、脊髄小脳失調症、パゴン・バードデッター（Ｐａｇｏｎ Ｂｉｒｄ Ｄｅｔｔｅｒ）症候群、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、ディジョージ症候群、Ｄｕｐ１５ｑ症候群、ドゥーゼ症候群、Ｇｌｕｔ１欠損症、ＣＤＫＬ５障害、前頭葉てんかん、小児欠神てんかん、早期ミオクロニー脳症（ＥＭＥ）、レノックス・ガストー症候群（ＬＧＳ）、大田原症候群及びランドウ・クレフナー症候群からなる群から選択され、
ｂ）当該核酸分子は脾臓に送達可能であって、
当医薬は、脾臓がん等のがん、炎症性疾患及び免疫障害からなる群から選択される疾患を処置するためのものであり、
ｃ）当該核酸分子はＴ細胞に送達可能であって、当医薬は、がん、炎症性疾患及び感染症疾患からなる群から選択される疾患を処置するためのものであり、及び／又は
ｄ）当該核酸分子は肝臓に送達可能であって、該医薬は、肝がん、心血管疾患、凝固カスケード不全、炎症性疾患、代謝性疾患及び感染症からなる群から選択される疾患の処置のためのものであり、例えば、肝疾患は、肝細胞癌、他の組織の原発性がんから転移した肝悪性腫瘍、１型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、インスリン抵抗性、血糖値の制御、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール不均衡、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、心血管疾患、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、肥満症、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、血栓症、希な出血障害、Ｂ型又はＣ型肝炎、サイトメガロウイルス感染、住血吸虫感染及びレプトスピラ感染、マラリア、カンテツ感染、関節リウマチ、肝線維症、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝性ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、重症筋無力症、視神経脊髄炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、クッシング症候群、並びにトランスサイレチン型家族性アミロイドーシスからなる群から選択される。

５３．核酸分子を担持する脂質小胞を調製する方法であって、当該脂質小胞は、ＤＬＳに従って測定される３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄ_ｈ、好ましくは５０～３００ｎｍの範囲の直径を有し、当該脂質小胞は経口投与用であり、当該オリゴヌクレオチドは、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される１種以上の標的組織に送達するためのものであり、当該方法は、
－ 有機溶媒中で少なくとも１種の脂質小胞形成成分の溶液を形成する工程
－ 当該溶媒を除去して脂質膜を形成する工程
－ 核酸分子の存在下、水性溶媒、好ましくは緩衝液中で該フィルムを再水和させ、
それにより、当該核酸分子を担持する上記脂質小胞を形成する工程、を含む。

５４．実施形態５３に記載の方法によって得られる又は得ることができる脂質小胞。

５５．実施形態１から５１に記載の特性を有する、実施形態５４に記載の脂質小胞。

材料及び方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドの一覧
（表１）使用したオリゴヌクレオチド：

大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合は、指定されない限りホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、小文字はホスホジエステルヌクレオシド間結合を示す。

流体力学的径の分析
脂質小胞の平均流体力学的径を、レーザー波長６８５ｎｍでＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（英国マルバーンのＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。散乱光を１６５°の角度で検出した。結果を、室温でのＤＰＢＳ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１４１９０２５０）におけるｎ＝３の測定値の平均±ＳＤとして表す。

透過型電子顕微鏡による粒子形態の分析
粒子形態は、酢酸ウラニル陰性染色後に透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて分析することができる。ホルムバール被覆銅グリッドをグロー放電させ、ＤＰＢＳ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１４１９０２５０）中の５μＬの脂質小胞試料と１分間インキュベートする。サンプルを除去し、グリッドを超純水（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１０９７７０２３）で２回洗浄する。次いで、グリッドを２％酢酸ウラニルを用いて１回洗浄し、その後、２％酢酸ウラニル中で１５秒間インキュベートする。酢酸ウラニルを除去し、グリッドを分析前に乾燥させる。ＪＥＭ－１４００ Ｐｌｕｓ透過型電子顕微鏡（日本国東京のＪＥＯＬ）を用いて画像を取得する。

動的電気泳動光散乱によるゼータ電位
脂質小胞のゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ（英国マルバーンのＭａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を製造者の推奨に従って使用して決定することができる。脂質小胞Ｆ１を、２５℃の０．１×ＤＰＢＳ中で測定した。結果を、ｎ＝３の測定値の平均±ＳＤとして以下の実施例３の表６に示す。これらのデータから、脂質小胞Ｆ１は、わずかな負の表面電荷を有する単分散として特徴付けられる。

ロックド核酸アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ ＡＳＯ）を脂質小胞に充填する
ＤＰＢＳ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１４１９０２５０）中で脂質薄膜をＬＮＡ ＡＳＯで再水和させることによってＬＮＡ ＡＳＯをロードした。

脂質小胞の調製は、再水和工程において所望量のＬＮＡ－ＡＳＯを添加して、「脂質小胞の調製」の項で上述したように行った。非カプセル化ＬＮＡ ＡＳＯを、３００ ｋＤａのＭＷＣＯ（米国マサチューセッツウォルサムのＦｌｏａｔ－ａ－ｌｙｚｅｒ、Ｎｏ．Ｇ２３５０３６、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を使用して４℃で７２時間、ＤＰＢＳに対して透析することによって除去した。

ＬＮＡ ＡＳＯ負荷脂質小胞の特性評価
ＬＮＡ ＡＳＯを負荷した脂質小胞は、以下の分析によって特徴付けることができる。

精製の分析
非カプセル化ＬＮＡ ＡＳＯの除去は、アガロースゲル電気泳動を用いて確認することができる。２０μＬのＬＮＡ ＡＳＯ負荷脂質小胞を７５の振幅で５分間３回超音波処理して、ＬＮＡ ＡＳＯカーゴ（封入ＬＮＡ ＡＳＯ）を放出させる。２０μＬの未処置ＬＮＡ ＡＳＯ負荷脂質小胞、２０μＬの超音波処理されたＬＮＡ ＡＳＯ負荷脂質小胞、及びＤＰＢＳ中のＬＮＡ ＡＳＯ標準を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ標識された２％アガロースゲル（Ｎｏ．Ｇ５２１８０２、米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、核酸を１０分間分離する。次いで、Ｅ－Ｇｅｌイメージャ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．）を使用してゲルを撮像する。

ＬＮＡ ＡＳＯ薬物負荷含有量の定量化
薬物負荷含有量は、ＨＰＬＣ（米国マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒ）を用いて分析した。試料をＣ１８カラム（ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ ２．５μｍ、４．６×１００ｍｍカラムＸＰ；Ｎｏ．１８６００６０３９、米国マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒｓ）に注入し、試料を５０℃のカラム温度でアセトニトリル／２００ｍＭ酢酸塩勾配で実行した。ＬＮＡ ＡＳＯは、２６０ｎｍの波長で検出された。ＬＮＡ ＡＳＯの検量線を作成し、カプセル化ＬＮＡ ＡＳＯの量を定量するために使用した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養
初代ヒト肝細胞
初代ヒト凍結保存肝細胞（英国ウエストサセックスのＢｉｏＩＶＴ、ＰＨＨ，Ｎｏ．Ｆ００９９５）を、１０Ｕ／ｍＬペニシリン及びストレプトマイシン（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１５１４０１２２）並びに１０％ＦＢＳ（米国ペンシルベニア州ラドナーのＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎｏ．９７０６８－０８５）を添加したウィリアムズ培地Ｅ（米国ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｏ．Ｗ１８７８）中、３７℃及び５％ＣＯ_２で培養した。４×１０^４個の細胞を、コラーゲン被覆（米国ニュージャージー州フランクリンレイクスのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏ．３５６４０７）９６ウェル培養プレート（米国ニューヨーク州コーニング、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｏ．３４７４）上にプレーティングした。細胞を４時間接着させた後、試験物質を添加した。

ＨｅｐＧ２細胞
ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）を、１０％ＦＢＳ（Ｎｏ．Ａ３１６０４０１、米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｎｏ．４１０９０１０１、米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したイーグル最小必須培地（Ｎｏ．Ｍ２２７９、米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃及び５％ＣＯ_２で培養した。ノックダウン実験のために、細胞をＤＰＢＳ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１４１９０２５０）で１回洗浄し、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．２５２０００５６）を用いて剥離した。完全培養培地を添加し、１３００ｒｐｍ及び５分での遠心分離によって細胞を回収した。上清を吸引し、細胞ペレットを完全培養培地に再懸濁した。死細胞を０．４％トリパンブルー（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．Ｔ１０２８２）を用いて染色し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を計数した。次いで、細胞を９６ウェルプレート（米国ニューヨーク州コーニングのＣｏｒｎｉｎｇ、Ｎｏ．３４７４）にウェルあたり２×１０^４細胞の密度で播種し、試験物質を添加する前に一晩接着させた。

乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ
脂質小胞とのインキュベーションの４８時間後にＰＨＨ細胞培養上清を回収し、製造業者の推奨に従って細胞傷害性検出キット（スイス国ロトクロアスのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｏ．１１６４４７９３００１）を使用してＬＤＨ放出を決定した。簡潔に言えば、収集した細胞培養上清を希釈し、透明底９６ウェルプレート（米国ニューヨーク州コーニングのＣｏｒｎｉｎｇ、Ｎｏ．３９０６）に移した。細胞傷害性検出反応混合物を新たに調製し、各ウェルに添加し、プレートを１０００ｒｐｍで１分間振盪し、室温で３０分間インキュベートした。吸光度を、ＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して４９０ｎｍで測定した。ＬＤＨ濃度は、ＬＤＨ標準として沈殿物Ｕ（スイス国ロトクロアスのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｏ．１０１７１７７８１２２）を使用して決定した。ＤＰＢＳ処置細胞を対照として使用した。結果を、ｎ＝４回の技術的反復実験の平均±ＳＤとして表す。

細胞内ＡＴＰ含量
脂質小胞処置ＰＨＨ中の細胞内ＡＴＰ含量を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏキット（米国ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ、Ｎｏ．Ｇ７５７１）を製造者の説明書に従って使用して、インキュベーションの４８時間後に測定した。簡潔に言えば、５０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を、５０μＬの完全培養培地中の処置されたＰＨＨ（３．１１節参照）を含有する各ウェルに添加し、プレートを２分間振盪して細胞溶解を誘導し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。７０μＬの細胞溶解物を白色不透明な９６ウェルプレート（米国ニューヨーク州コーニングのＣｏｒｎｉｎｇ、Ｎｏ．３６０１）に移し、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光を収集した。完全培養培地中のＡＴＰの希釈物を標準として使用した。ＤＰＢＳ処置細胞を対照として使用した。結果を、ｎ＝４回の技術的反復実験の平均±ＳＤとして表す。

アルブミン放出アッセイ
製造業者の推奨に従って、ＡｌｐｈａＬＩＳＡビオチン不含ヒト血清アルブミン検出キット（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏ．ＡＬ３６３）を使用して、インキュベーションの４８時間後に、脂質小胞処置後のＰＨＨによるアルブミン分泌を決定した。結果を、ｎ＝４回の技術的反復実験の平均±ＳＤとして示す。

ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ（ｈＥＬＩＳＡ）を使用した組織ホモジネート中のＡＳＯ濃度
一般的な方法は、Ｓｔｒａａｒｕｐ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３８（２０）：ｐ．７１００－１１に記載される。簡潔には、捕捉検出溶液（ＣＤＳ）を、５×ＳＳＣ緩衝液（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｏ．９３０１７）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｏ．Ｐ９４１６）を補充し、ビオチン化捕捉プローブ及びジゴキシゲニン結合検出プローブ（デンマーク国ヘルスホルムのＲｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ＲＴＲ Ｎｏ．３５１４８－３及びＮｏ．３１４４３－７）を３５ｎＭの最終濃度で加えることによって調製した。ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．４３６０１４）を５×ＳＳＣ－Ｔ緩衝液で３回洗浄し、１００μＬの組織ホモジネート（ＣＤＳで１：１０に希釈）又はＣＤＳ中のＲＴＲ１７２９３標準を添加した。試料を一定に撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを２×ＳＳＣＴ緩衝液で３回洗浄した。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を補充したＤＰＢＳで１：３０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体（スイス国ロトクロアスのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｏ．１１０９３２７４９１０）と共に、一定に撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを２×ＳＳＣＴ緩衝液で３回洗浄した。Ｂｌｕｅ Ｐｈｏｓ基質（米国マサチューセッツ州ミルフォードのＳｅｒａｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏ．５５－８８－０２）を製造者の指示に従って混合し、１００μＬの基質を各ウェルに添加した。ＧｌｏｗＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒプレートリーダー（米国ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）を用いて６００ｎｍの波長で吸光度を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０７（カリフォルニア州ラホヤのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてＳ字形（４ＰＬ）標準曲線を作成することによって未知の濃度を決定した。結果を、ｎ＝４反復の平均±ＳＤとして表す。

実施例１：脂質小胞の調製
本実施例は、本発明で試験した脂質小胞の成分及び調製を記載する。
（表２）使用される脂質／成分：

製品番号を括弧内に示す。

（ａ）薄膜再水和
薄膜再水和法を用いて、以下の表３に列挙する脂質小胞（リポソーム）を調製した。脂質をクロロホルム／メタノール（２：１ ｖ／ｖ）に溶解し、指示されたモル比で混合した。脂質を丸底フラスコに移し、溶媒を６５℃及び２０ｍｂａｒ未満のロータリーエバポレータで除去した。乾燥脂質フィルムを、１．５ｇの３ｍｍガラスビーズを使用して１０ｍＭの最終脂質濃度で６５℃でリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で再水和した。大型のマルチラメラ小胞（ＬＵＶ）を５回の凍結融解サイクル（ドライアイス及び６５℃）に供して、マルチラメラ構造を破壊した。その後、２００ｎｍの孔径を有するハンド押出機（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて６５℃で１１～２１回押出することによって小胞サイズを縮小した。リポソームを更なる分析まで４℃で１週間未満貯蔵した。調製された小胞の各成分の量を［ｍｏｌ］で表３に示す。

（ｂ）マイクロ流体
選択された脂質小胞は、代替的に、マイクロ流体を用いて調製され得る。脂質を、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ又はアセトン等の適切な水混和性溶媒に溶解する。次いで、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して脂質を水性緩衝液と混合することによって、リポソームを調製する。それに応じて、流量比（ＦＲＲ）及び総流量（ＴＦＲ）を調整することができる。次いで、ＰＢＳに対する３００ｋＤａの分子量カットオフを使用して透析によって溶媒を除去する。

（ｃ）プローブ超音波処理
１０ｍＭの総脂質濃度の製剤Ｆ１（表３）の脂質を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に分散させた。次いで、プローブ超音波処理（米国コネチカット州ニュータウンのＱｓｏｎｉｃａ Ｌ．Ｌ．Ｃ．、Ｑ７００）を使用して、１０の振幅での２サイクルの超音波処理（３０分及び２０分）によって、小型で均質な脂質小胞を調製した。次いで、小型脂質小胞を０．２２μｍシリンジフィルタ（ドイツ国ダームシュタットのＭｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を用いて滅菌濾過し、４℃で保存した。

（表３）調製された小胞の脂質組成物。使用した脂質を表２に示す。

^１ 特に断りがない限り、乳ＳＭ
^２ 脳ＳＭ
^３ 卵ＳＭ
^４ 特に断りのない限り、卵ＰＣ
^５ ＤＳＰＣ
^６ ＤＬＰＣ
^７ ＤＯＰＣ

安定性試験
上記の材料及び方法の欄に記載されているように、ＤＬＳによってＤｈの変化を測定することによって、模擬胃液（ＳＧＦ：ＮａＣｌ ３４ｍＭ、ＨＣｌ ０．８３Ｍ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｐＨ１．２））及び空腹状態の腸液（ＦａＳＳＩＦ：ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２８．６ｍＭ、タウロコール酸ナトリウム塩３ｍＭ、レシチン０．７５ｍＭ、ＮａＣｌ １０５．８ｍＭ（ｐＨ ６．５））中の脂質小胞の安定性を経時的に試験した。

脂質小胞を１ｍＭの最終脂質濃度でＳＧＦ又はＦａＳＳＩＦと混合し、指示された時点で２０℃でＤｈを測定した。データをｎ＝１実験の平均として示す。

（表４）安定性試験の結果、表中、サイズ（Ｄｈ）をｎｍで示し、０時間のサイズと比較した５時間のインキュベーション後のサイズの変化を示す。

表４のデータに基づいて、以下の脂質小胞組成物Ｆ１、Ｆ３、Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１７、Ｆ１８、Ｆ２０、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２４、Ｆ２５、Ｆ２６、Ｆ２８、Ｆ３０、Ｆ３３、Ｆ３４は、安定であり、経口送達に適していると特徴付けられる。特に、脂質小胞組成物Ｆ１、Ｆ１２、Ｆ１３、Ｆ１４、Ｆ１７、Ｆ２１、Ｆ２２、Ｆ２３、Ｆ２５、Ｆ３３は、経口送達に特に適していると考えられる。脂質小胞の脂質成分及び安定性の概要を図１に示す。

実施例２：脂質小胞Ｆ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
実施例１からの精製された脂質小胞Ｆ１がｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において許容されるかどうかを調べた。

初代ヒト凍結保存肝細胞を、材料及び方法の節に記載されるように培養した。脂質小胞をＦＢＳを含まない培養培地で希釈して、ＨＰＬＣ分析によって決定された総脂質濃度に基づいて０．０４ｍｇ／ｍＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬの最終アッセイ濃度に達した。脂質小胞をウェルに添加し、ＰＨＨを３７℃で２４時間インキュベートした。培地を完全培地と交換し、ＰＨＨを３７℃で更に２４時間インキュベートした。

耐容性を、全て材料及び方法の節に記載されている乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ、細胞内ＡＴＰ含有量及びアルブミン放出アッセイを使用して評価した。

結果を表５に示し、Ｆ１の脂質小胞がＰＰＨ細胞によって十分に許容されることを明確に示している。

（表５）凍結保存された初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性評価。結果を、ｎ＝４回の技術的反復実験の平均±ＳＤとして示す。

実施例３：脂質小胞Ｆ１へのＬＮＡ ＡＳＯのローディング
実施例１からの脂質小胞Ｆ１に、材料及び方法の欄に記載されているように、ＬＮＡ－ＡＳＯの存在下で脂質薄膜を再水和させることによってＡＳＯ１をローディングした。

装填した脂質小胞の物理化学的特性並びにＬＮＡ ＡＳＯ含有量を、材料及び方法の節に記載されているように分析した。ＡＳＯ１を負荷した脂質小胞の結果を以下の表６に示す。ＬＮＡ ＡＳＯ負荷脂質小胞は、一定のサイズ及びＰＤＩによって示されるように、４℃で２ヶ月にわたって安定であった。

（表６）生体模倣脂質小胞の物理化学的特性評価。結果を、ｎ＝３の実験の平均±ＳＤとして示す。

^１ ０．１ ＤＰＢＳ（０．８１ｍＭリン酸塩、１３．７ｍＭ ＮａＣｌ）で決定
^２ 脂質１ｍｇ当たりのＬＮＡ ＡＳＯ含有量

実施例４：Ｈｅｐ２Ｇ細胞におけるＬＮＡ ＡＳＯ負荷脂質小胞Ｆ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
実施例３に記載のＡＳＯ１を負荷した脂質小胞Ｆ１をＨｅｐＧ２細胞で試験して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物で忍容性があるかどうか、及び標的の減少を達成できるかどうかを評価した。

材料及び方法の欄に記載されているように、ＨｅｐＧ２細胞を培養した。細胞を、ＤＰＢＳ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１４１９０２５０）中のＡＳＯ１、又は以下のＬＮＡ－ＡＳＯ濃度１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、及び５０００ｎＭを有する脂質小胞に封入されたＡＳＯ１で処置した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳで一回洗浄し、新鮮な完全培養培地と更に２４時間インキュベートした。インキュベーションの４８時間後、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄した。

ＲＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＮｏ．１２１７３０１１Ａ）を使用して単離した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０機器でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｓｔｅｒキット（スイス国ロトクロアスのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｏ．０７０８３１７３００１）を使用してＲＮＡ発現を分析した。Ｍａｌａｔ－１ ｌｎｃＲＮＡ（Ｈｓ００２７３９０７＿ｓ１）及びＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）プライマーは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から注文した。Ｍａｌａｔ－１ ｌｎｃＲＮＡ発現を、ＧＡＰＤＨに対するΔΔｃｔ法によって分析した。結果を、ｎ＝４回の技術的反復実験の平均変化倍率±ＳＤとして表す。

結果は表７に示されており、ｍａｌａｔ－１標的ノックダウンが、ＤＰＢＳ配合ＬＮＡ－ＡＳＯと同じレベルまでＬＮＡ－ＡＳＯ負荷脂質小胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで達成され得ることを示している。

（表７）ＨＥＰ２Ｇ細胞におけるＬＮＡ－ＡＳＯ負荷脂質小胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価。結果を、ｎ＝４回の技術的反復実験の対照平均値±ＳＤのパーセンテージとして示す。

実施例５：ＬＮＡ－ＡＳＯ負荷脂質小胞Ｆ１のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＬＮＡ－ＡＳＯ負荷脂質小胞の生体内分布及び標的減少を達成する能力は、静脈内注射又は経口投与のいずれかを用いたマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイであった。

全ての動物実験を、スイス国動物保護法に従って、国際的なガイドライン及び適正実施に従って行った。

Ｃ５７ＢＬ６マウスに、実施例３に記載のように、ＤＰＢＳ中のＡＳＯ１又は脂質小胞Ｆ１に封入されたＡＳＯ１を投与した。投与プロトコルを以下の表８に要約する。

（表８）ｉｎ ｖｉｖｏ投与プロトコル

処置の３日後にマウスを屠殺し、器官を回収し、０．９％ＮａＣｌ中ですすいだ。脾臓を２片に切断し、半分を即時Ｔ細胞単離のために４℃でＲＰＭＩ－１６４０培地（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．１１８７５０９３）に入れた（下記参照）。他の全ての臓器を、更なる処置まで－８０℃のＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｏ．ＡＭ７０２１）中で保存した。臓器を３倍容量のＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（ドイツ、ヒルデンのＱｉａｇｅｎ、Ｎｏ．７９３０６）に入れ、セラミックビーズを含む２ｍＬ又は５ｍＬのＰｒｅｃｅｌｌｙｓ管（フランス国モンティニー－ル－ブルトンヌーのＢｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏ．ＫＴ０３９６１－１－００２．２ 又はＮｏ．ＫＴ０３９６１－１－３０２．７）に移し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎホモジナイザー（フランス国モンティニー－ル－ブルトンヌーのＢｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてホモジナイズした。組織ホモジネート中のＡＳＯ１濃度を、材料及び方法の欄に記載されるようにハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ（ｈＥＬＩＳＡ）を使用して決定した。ＡＳＯ１の体内分布は表９に示されており、静脈内投与時及び強制経口投与による両方で、いくつかの組織へのＬＮＡ＿ＡＳＯ負荷脂質小胞の分布を明確に示している。静脈内投与は、最大のオリゴヌクレオチド濃度を提供するようである。

（表９）ＡＳＯ１のｉｎ ｖｉｖｏ体内分布評価。示されている組織中のＡＳＯ１の濃度はｎＭであり、ｎ＝４の反復の平均±ＳＤとして示されている。

ｎｄ＝ｈＥＬＩＳＡで検出不能

標的ＲＮＡ（Ｍａｌａｔ－１ ｍＲＮＡ）のノックダウンも、ＲＴ－ＰＣＲによって収集した組織で分析した。簡潔には、全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ドイツ国ヒルデンのＱｉａｇｅｎ、Ｎｏ．２１７００４）を製造者の推奨に従って使用して組織ホモジネートから単離した。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキット（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒ１１４９０）を使用して全ＲＮＡを定量した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０機器（（スイス国ロトクロアスのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｓｔｅｒキット（スイス国ロトクロアスのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｏ．０７０８３１７３００１）を使用してＲＮＡ発現を分析した。Ｍａｌａｔ－１ ｌｎｃＲＮＡ（Ｍｍ０１２２７９１２＿ｓ１）及びＧＡＰＤＨ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）プライマーは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から注文した。Ｍａｌａｔ－１ ｍＲＮＡ発現を、ＧＡＰＤＨ／全ＲＮＡ含量に対して正規化に対するΔΔｃｔ法によって分析した。結果を表１０に示し、ｎ＝４反復の平均変化倍率±ＳＤとして表す。結果は、肝臓、脳、脾臓及びＴ細胞において標的減少が達成され得ることを示す。強制経口投与によって投与されたＬＮＡ ＡＳＯ負荷脂質小胞は、脾臓において非常に効率的な標的ノックダウンをもたらすようである。経口投与後、脳及びＴ細胞においてもいくらかのノックダウンが観察されるが、ＤＰＳ中のＡＳＯ又は脂質小胞中のＡＳＯの静脈内投与によって達成されるノックダウンを超えない。ＡＳＯを脂質小胞中で経口投与すると、腎臓における標的ノックダウンが排除されるようである。

（表１０）ＡＳＯ１ ＬＮＡ ＯＮのｉｎ ｖｉｖｏ標的ノックダウン効率。ＤＰＢＳに製剤化された、又は脂質小胞（Ｆ１）に封入されたＡＳＯ１を、静脈内注射（０．５ｍｇ／ｋｇ）又は強制経口投与（１ｍｇ／ｋｇ）によってマウスに投与した。標的ＲＮＡ（Ｍａｌａｔ－１）のノックダウンを、総ＲＮＡ含有量に対して正規化したＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。発現値を、ｎ＝４反復の対照（ＤＰＢＳ処置動物）±ＳＤの変化倍率として示す。

Claims (21)

1. 医薬として使用するための核酸分子を担持する脂質小胞であって、前記脂質小胞が、ＤＬＳに従って測定される３００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄ_ｈ、好ましくは５０～３００ｎｍの範囲の直径を有し、前記脂質小胞が経口投与され、前記核酸分子が、中枢神経系、脾臓、消化管、肝臓及びＴ細胞からなる群から選択される標的組織の１種以上に送達するためのものである、脂質小胞。
2. ２０℃の温度で少なくとも５時間、胃液中で安定である、請求項１に記載の脂質小胞。
3. ２０℃の温度で少なくとも５時間、絶食状態の腸液中で安定である、請求項１又は２に記載の脂質小胞。
4. 無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて５～５０ｍｏｌ％の量のコレステロールを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の脂質小胞。
5. 無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて２～７０ｍｏｌ％の量のＬ－アルファ－ホスファチジルエタノールアミンを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の脂質小胞。
6. 少なくとも１種のホスファチジルエタノールアミン、好ましくはＬ－アルファ－ホスファチジル－エタノールアミン、及びコレステロールを、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて３０～９０ｍｏｌ％の総量で含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の脂質小胞。
7. 少なくとも１種のホスファチジルコリン及び／又は少なくとも１種のホスファチジルセリン及び／又は少なくとも１種のリソビスホスファチジン酸を更に含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の脂質小胞。
8. 脂質小胞中のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びリゾビスホスファチジン酸の総量が、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて１０～５４ｍｏｌ％の範囲である、請求項７に記載の脂質小胞。
9. 少なくとも１種のホスファチジルコリンが卵－ＰＣ又はＤＯＰＣである、請求項７又は８に記載の脂質小胞。
10. 少なくとも１種のスフィンゴミエリン、特に、乳スフィンゴミエリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン及びそれらの２種以上の混合物からなる群から選択されるスフィンゴミエリンを更に含む、請求項４から９のいずれか一項に記載の脂質小胞。
11. 少なくとも１種のスフィンゴミエリンを、無負荷脂質小胞の総量（ｍｏｌ単位）に基づいて４～１５ｍｏｌ％の範囲の量で含む、請求項４から１０のいずれか一項に記載の脂質小胞。
12. ＤＬＳに従って測定される２００ｎｍ未満の流体力学的径Ｄ_ｈ、好ましくは５０～２００ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の脂質小胞。
13. 核酸分子が、標的組織において標的核酸を調節することができる、実施形態１から１２のいずれか一つに記載の使用のための脂質小胞。
14. 核酸分子が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合及び／又は修飾ヌクレオシドを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用の脂質小胞。
15. 修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオシドからなる群から独立して選択される２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項１４に記載の使用の脂質小胞。
16. 核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ分子である、実施形態１から１５のいずれか一つに記載の使用のための脂質小胞。
17. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、７～３０ヌクレオチド長の一本鎖修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載の使用のための脂質小胞。
18. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ギャップマー、ミクスマー、トータルマー、抗ｍｉＲ、ブロックｍｉＲ及びスプライススイッチングオリゴヌクレオチドの群から選択される、請求項１７に記載の使用のための脂質小胞。
19. アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエート結合であり、特に、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１７又は１８に記載の使用のための脂質小胞。
20. 一本鎖修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ及びＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオシドからなる群から独立して選択される少なくとも３つの２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の使用のための脂質小胞。
21. ａ）前記核酸分子は、脳及び／又は脊髄等の中枢神経系に送達可能であって、医薬は、脳がん（脳腫瘍等）、発作性障害、神経変性障害、神経精神障害及び運動障害からなる群から選択される疾患を処置するためのものであり、例えば、発作性障害、神経変性障害、神経精神障害又は運動障害は、アンジェルマン障害、アレキサンダー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病、レビー小体病、パーキンソン病、脊髄性筋萎縮症、統合失調症、うつ病、双極性疾患、自閉症、てんかん、前頭側頭型認知症、進行性延髄麻痺、レット症候群、トゥレット症候群、神経線維腫症、進行性筋萎縮症、遺伝性痙性対麻痺、ペリツェウス・メルツバッハー病、ゴーシェ病、脊髄小脳失調症、パゴン・バードデッター（Ｐａｇｏｎ Ｂｉｒｄ Ｄｅｔｔｅｒ）症候群、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、ディジョージ症候群、Ｄｕｐ１５ｑ症候群、ドゥーゼ症候群、Ｇｌｕｔ１欠損症、ＣＤＫＬ５障害、前頭葉てんかん、小児欠神てんかん、早期ミオクロニー脳症（ＥＭＥ）、レノックス・ガストー症候群（ＬＧＳ）、大田原症候群及びランドウ・クレフナー症候群からなる群から選択され、
    ｂ）前記核酸分子は脾臓に送達可能であって、医薬は、脾臓がん等のがん、炎症性疾患及び免疫障害からなる群から選択される疾患を処置するためのものであり、
    ｃ）前記核酸分子はＴ細胞に送達可能であって、医薬は、がん、炎症性疾患及び感染症疾患からなる群から選択される疾患を処置するためのものであり、及び／又は
    ｄ）前記核酸分子は肝臓に送達可能であって、医薬は、肝がん、心血管疾患、凝固カスケード不全、炎症性疾患、代謝性疾患及び感染症からなる群から選択される疾患を処置するためのものであり、例えば、肝疾患は、肝細胞癌、他の組織の原発性がんから転移した肝悪性腫瘍、１型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、インスリン抵抗性、血糖値の制御、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール不均衡、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、心血管疾患、冠動脈疾患（ＣＡＤ）及び冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、肥満症、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、血栓症、希な出血障害、Ｂ型又はＣ型肝炎、サイトメガロウイルス感染、住血吸虫感染及びレプトスピラ感染、マラリア、カンテツ感染、関節リウマチ、肝線維症、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝性ポルフィリン症、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、重症筋無力症、視神経脊髄炎、アルファ１アンチトリプシン欠損症、クッシング症候群、並びにトランスサイレチン型家族性アミロイドーシスからなる群から選択される、
    請求項１から２０のいずれか一項に記載の使用のための脂質小胞。

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