JP2022513463A - 容積測定ローディング流量を低減し、そして結合及び溶出クロマトグラフィー精製の生産性を増大するためのインライン生成物濃縮 - Google Patents

Abstract

目的の生体分子及び不純物を含むサンプルを精製するための方法及びシステムであって、この方法は、目的の生体分子をバイオリアクター内で発現させて目的の分子及び不純物を含む生成物サンプルを形成すること；この生成物サンプルをシングルパス接線流濾過に供して濃縮生成物サンプルを形成すること；及びこの濃縮生成物サンプルをアフィニティクロマトグラフィーに供して濃縮生成物サンプルから不純物を除去することを含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７８２，６７１号の優先権を主張し、その内容は、その全体が本明細書中で参照として組み込まれる。

分野
本開示は、治療用抗体及びＦｃ含有タンパク質を含む生物学的分子の精製のための効率的なプロセス及びシステムに関する。

背景
生体分子、例えばタンパク質、詳細には組換えタンパク質の製造のための一般的なプロセスは、典型的には２つの主な工程を含む：（１）宿主細胞におけるタンパク質の発現、及びそれに続く（２）タンパク質の精製。第１の工程は、所望の宿主細胞をバイオリアクターにおいて増殖させて、タンパク質の発現を引き起こすことを含む。この目的のために使用される細胞株のいくつかの例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫（ＮＳＯ）細菌細胞（例えばＥ－コリ（ｅ－ｃｏｌｉ））及び昆虫細胞が、挙げられる。一旦、タンパク質が所望のレベルに発現されると、このタンパク質は、宿主細胞から取り出され、回収される。懸濁している微粒子、例えば細胞、細胞断片、脂質及び他の不溶性物質が、典型的には、下流の精製プロセスにおいてタンパク質含有液から取り出され、溶液及び他の可溶性不純物中に目的のタンパク質を含む清澄化された液体を生じる。

第２の工程は、プロセスに固有の不純物を除去するための、タンパク質の精製を含む。回収及び下流の操作の主な目的は、可溶性／不溶性の不純物から生成物（例えば、発現されたタンパク質）を単離することである。不純物の例としては、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ、所望の又は標的のタンパク質以外のタンパク質）、核酸、内毒素、ウイルス、タンパク質バリアント、タンパク質凝集物、及び細胞培養培地構成成分／付加物が挙げられる。この精製は、典型的には、多孔性アガロース、ポリマー性吸着剤若しくはガラス吸着剤又は膜ベースの吸着剤などの固体マトリックス上の、１以上のアフィニティクロマトグラフィー、結合／溶出様式のカチオン交換クロマトグラフィー、フロースルー様式のアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用などを含み得る、いくつかのクロマトグラフィー工程を含む。

プロセステンプレートの１つの例は、遠心分離による一次清澄化、濾過による二次清澄化及び結合／溶出様式のプロテインＡアフィニティ、それに続く結合／溶出様式のカチオン交換、それに続くフロースルー様式のアニオン交換を含む、クロマトグラフィープロセス連を含む。プロテインＡカラムは、目的のタンパク質又は標的タンパク質を、アフィニティメカニズムによって捕捉するが、そのとき、不純物の大部分は、カラムを通って廃棄される。次いで、タンパク質は、溶出によって、カラムから回収される。目的のタンパク質のほとんどが、塩基性の範囲（８～９）の等電点（ＰＩ）有するので、したがって、通常の処理条件下（タンパク質のＰＩより低いｐＨ）において、正に荷電しているため、第２カラムにおいて、カチオン交換に結合する。他の正に荷電した不純物もまた、樹脂に結合する。次いで、目的のタンパク質は、タンパク質は溶出するが同時に不純物は樹脂に結合したままとなる条件（ｐＨ、塩濃度）下での、カラムからの溶出によって、回収される。アニオン交換カラムは、典型的には、何らかの負に荷電した不純物が樹脂に結合している一方で、正に荷電した目的のタンパク質がフロースルーの流れの中で回収されるように、フロースルー様式で操作される。下流の精製プロセスに次いで、限外濾過／透析濾過が、緩衝液系を調えるため及び生成物を濃縮するために、最終フィルユニット操作の前に使用されて、製造プロセスを完了させてもよい。このプロセスは、高度に精製されかつ濃縮されたタンパク質溶液を生じ、これは特に、治療用タンパク質がヒトのために使用されるべきものであり、食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制当局によって認可される必要がある場合に、決定的である場合がある。

図３は、１つの従来のプロセスを図示する。このプロセスは、細胞及び細胞屑を細胞培養ブロスから取り除くための遠心分離の使用を含んでもよい細胞回収工程、及びそれに続く深層濾過を含む。細胞回収工程は、通常、ウイルス不活性化に続く捕捉工程（例えばプロテインＡアフィニティ精製工程）の後に続く。ウイルス不活性化は、典型的には、ポリッシング工程とも呼ばれる１以上のクロマトグラフィー工程の後に続き、クロマトグラフィー工程は、通常、１以上のカチオン交換クロマトグラフィー及び／又はアニオン交換クロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は混合様式クロマトグラフィー及び／又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む。ポリッシング工程は、ウイルス濾過及び限外濾過／透析濾過の後に続き、このプロセスを完了させる。

捕捉工程は、プロテインＡ樹脂、例えばＥｓｈｍｕｎｏ（Ｒ）Ａ樹脂、剛性、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー樹脂又はＰｒｏＳｅｐ（Ｒ）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ媒体（どちらも、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）を、特に、Ｆｃ領域を含む抗体のために、使用してもよい。結合及び溶出様式で操作される他の樹脂もまた、捕捉に好適であり得る。結合及び溶出クロマトグラフィーは、（１）標的結合能力への生成物ローディング、（２）カラムからの生成物の溶出、及び（３）洗浄して樹脂を再利用のために調製することを、含む。

このプロセスを費用効果の高いものにするために、比較的低い結合能力と本用途に好適なクロマトグラフィー樹脂に伴う高い費用とを考えあわせて、製造業者に、多くの結合／溶出及びクロマトグラフィー媒体を用いるカラム再生サイクルを実施することを要求する。再生プロセスは、生成物スループットの減少、緩衝液及び洗浄剤の消費の増大、検証費用並びに資本設備要件の増大に起因して、さらに生産費用を増大させる。

図１に示す通り、クロマトグラフィー樹脂の動的結合能力（ＤＢＣ）と体積ローディング流速との間には、重要な関係がある。ＤＢＣは、所定のローディングにおいて、樹脂に対して結合した生成物の質量として定義される。体積流速は、滞留時間（保持されていない分子がカラムを通って移動するためにかかる時間の長さ）に反比例する。低い流速において、標的分子が樹脂孔構造に拡散する時間はより長いので、したがって、ＤＢＣは、典型的には高くなる。より高い流速においては、ローディングされた生成物の有意な量が未結合で流れて通過し、ＤＢＣはより低くなる。図２は、体積流量の範囲に対する質量ローディングの関数としての、未結合生成物ブレークスルーの百分率をプロットする。

タンパク質結合能力は、クロマトグラフィー媒体についての重要なパラメーターである；これは、所定の量のタンパク質を精製するために必要な媒体の量を決定する。理想的には、各クロマトグラフィーカラムは、樹脂の最大能力である樹脂の静的結合能力（ＳＢＣ）に近似したＤＢＣで操作される。樹脂のＳＢＣは、流速と無関係である。ＤＢＣ対ＳＢＣの比は、樹脂利用率である。

捕捉カラム（単数又は複数）を、低い体積流速で操作することが好ましいことが、図１及び２に示され得る。しかし、低い体積流量操作は、質量流速の対応する低下及び生産性（クロマトグラフィー樹脂の体積及び処理時間あたりで処理された質量として定義される）の低下をもたらすので、必ずしも実用的ではない。

多カラム捕捉アプローチにおいて、２～６の同一のカラムの回転は、少なくとも１つのカラムが、（溶出及び再生が、他の単数のカラム又は複数のカラムで起こっている間に、）常に生成物ローディングが可能であるように使用されてもよい。樹脂利用率を最大化するために、２以上のカラムが、連続して使用されてもよい。系列ローディングアプローチは、この系列の第１のカラムからの未結合生成物ブレークスルーを捕捉して、収量を最大化するために使用される。

連続的バイオプロセシングのための現行の方法において、上流のバイオリアクターが、多カラム捕捉工程に直接連結され、そしてこの２つの工程の流速は、調和していなければならない。バイオリアクター生産速度の低下は実用的な選択肢ではないので、バイオリアクター回収速度は、典型的には、その後の工程についての処理速度を規定する。従来の操作において高いプロテインＡ結合能力を維持するためには、比較的大容量のカラムを用いて所定の体積流速における滞留時間を増大すること、及び／又は回すカラムの数を増やすことが、一般的である。しかし、カラムの数を増やすこと又はカラムの大きさを大きくすることは、プロセス生産性に対して悪い影響を与える。

したがって、連続的バイオプロセシング操作において、生産性に悪影響を及ぼさず、捕捉クロマトグラフィーを最適化することが、望ましい。また、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）などの生体分子の製造のための、効率的でありかつ費用効果の高い、システム及びプロセスを提供することが、望ましい。

先行技術の問題は、本明細書中で開示される実施形態によって克服されている。この実施形態は、バイオマニュファクチャリングプロセスにおいて、生成物質量流速に影響を及ぼすことなく、低体積流量クロマトグラフィーローディングを可能にするための、方法及びシステムを提供する。特定の実施形態において、インライン生成物濃縮は、捕捉クロマトグラフィーの上流のシングルパス接線流濾過などによって、実施される。インライン濃縮を加えることは、割り当てられた処理時間に影響を与えず、より低い体積流速にて操作する（同じ時間の長さにおいてより少ない体積を処理する）ことを可能にする。さらに、インライン濃縮は同時に生成物濃縮を上げるので、比例して体積が減少する間、生成物質量流速は変わらない。図１及び図２に示されるように、低体積流量操作は、標的ローディングにおけるＤＢＣを増大すると同時に、未結合生成物ブレークスルーの量を減らす。結果は、クロマトグラフィー樹脂のより好適な利用率である。

本明細書中で開示される実施形態は、細胞培養液に由来する目的の生体分子の精製及び単離を含む。特定の実施形態において、開示の方法及びシステムは、下流精製プロセスに続くインライン濃縮を含む。特定の実施形態において、下流精製プロセスは、１以上のクロマトグラフィーカラムによる連続的な精製を含み得る。

特定の実施形態において、目的の生体分子及び不純物を含むサンプルを精製するための方法が開示され、この方法は、目的の生体分子をバイオリアクター内で発現させて目的の生体分子及び不純物を含む生成物サンプルを形成すること；この生成物サンプルをシングルパス接線流濾過に供して濃縮生成物サンプルを形成すること；及びこの濃縮生成物サンプルをアフィニティクロマトグラフィーに供してそれから不純物を取り除くことを含む。特定の実施形態において、バイオリアクターからの生成物サンプル（例えば、回収した細胞培養物）は、シングルパス接線流濾過に供される前に、１以上の清澄化工程に供される。１以上の清澄化工程は、遠心分離、接線流濾過、深層濾過、及び無菌濾過の１以上を含み得る。特定の実施形態において、シングルパス接線流濾過操作から出された濃縮された生成物サンプルは、アフィニティクロマトグラフィーに供される前に、１以上の無菌フィルターを通るか、又はタンクに入る。

特定の実施形態において、アフィニティクロマトグラフィーは、プロテインＡアフィニティリガンドを使用する。

特定の実施形態において、この方法は、濃縮された生成物サンプルをウイルス不活性化工程に供することを、さらに含む。

特定の実施形態において、この方法は、濃縮された生成物サンプルをアフィニティクロマトグラフィーによる捕捉の下流のポリッシング工程に供することを含む。いくつかの実施形態において、ポリッシング工程は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの１以上を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス活性化及びポリッシングの両方が、実施され得る。

特定の実施形態において、生体分子は、組換え抗体、組換えモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体及び抗体断片からなる群から選択される抗体である。いくつかの実施形態において、生体分子は、タンパク質である。

特定の実施形態において、目的の生体分子を精製するためのシステムが開示され、このシステムは、バイオリアクター；バイオリアクターから出た生成物サンプルを連続的に濃縮するための、バイオリアクターの下流のインラインシングルパス接線流濾過ユニット；濃縮された生成物の流れをインラインシングルパス接線流濾過ユニットから受け取るためにインラインシングルパス接線流濾過ユニットの下流に連続して構成された、少なくとも２つのアフィニティクロマトグラフィーカラム；少なくとも２つのアフィニティクロマトグラフィーカラムの下流に配置されたウイルス不活性化フィルター；及びウイルス不活性化フィルターの下流に配置された、１以上のアニオン交換、カチオン交換又は疎水性相互作用交換クロマトグラフィーカラムを含む。

いくつかの実施形態において、このシステムは、遠心分離、接線流濾過ユニット、深層濾過ユニット、及びバイオリアクターの下流かつＳＰＴＦＦユニットの蒸留の無菌濾過ユニットの、１以上を含む。いくつかの実施形態において、このシステムは、ＳＰＴＦＦユニットの下流かつアフィニティクロマトグラフィーカラムの上流に、１以上の無菌フィルター及び／又は１以上のタンク又は容器を含む。

いくつかの実施形態において、少なくとも２つのアフィニティクロマトグラフィーカラムは、各々、プロテインＡアフィニティリガンドを含む。いくつかの実施形態において、ちょうど２つのアフィニティクロマトグラフィーカラムが存在する。

異なるフィード流速における、質量ローディング対動的結合能力（ＤＢＣ）のグラフである。 異なるフィード流速における、質量ローディング対未結合質量ブレークスルーのグラフである。 産業において使用される従来型精製プロセスの図解である。 特定の実施形態における精製システムの図解である。

以下の記載において、用語「選択された生体分子」、「標的の生体分子」若しくは「分子」、「標的のタンパク質」、「目的の生体分子若しくはタンパク質」又は類似の用語は、全て、生体分子製造プロセスの生成物をいう。

用語「夾雑物」、「不純物」、及び「屑」は、本明細書中で相互交換可能に使用され得、何らかの外来性若しくは不都合な分子をいい、外来性又は不都合な分子の１以上から隔てられている目的の生成物を含むサンプル中に存在し得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１以上の宿主細胞タンパク質、内毒素、脂質、タンパク質凝集物及び１以上の付加物などの生物学的高分子を含む。さらに、このような夾雑物は、分離プロセスより前に行われ得る工程において使用される何らかの試薬を含む場合がある。

本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、標的分子（例えば精製されようとしている標的タンパク質）を含む、任意の組成物又は混合物をいう。サンプルは、生物学的供給源に由来してもよく、又は他の供給源に由来してもよい。生物学的供給源としては、真核細胞供給源及び原核細胞供給源、例えば植物及び動物の細胞、組織及び器官が挙げられる。いくつかの実施形態において、サンプルは、精製されようとしている目的のタンパク質を含む、生物製剤調製物を含む。詳細な実施形態において、サンプルは、精製されようとしている目的のタンパク質を含む、細胞培養物フィードである。サンプルはまた、標的タンパク質又は目的のタンパク質と混合して見出される、希釈剤、緩衝液、洗浄剤及び夾雑する種、屑などを含んでもよい。サンプルは、「部分的に精製されて」（すなわち、１以上の精製工程、例えば濾過工程に供されて）いてもよく、又は標的分子を産生する宿主細胞又は生物から直接得られてもよい（例えば、サンプルが、回収した細胞培養液を含んでもよい）。

用語「結合及び溶出様式」及び「結合及び溶出プロセス」は、本明細書中で使用される場合、サンプル中に含まれる少なくとも１つの標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質）が好適な樹脂又は媒体（例えば、アフィニティクロマトグラフィー媒体又はカチオン交換クロマトグラフィー媒体）に結合してその後溶出される、分離技術をいう。

用語「ブレークスルー」は、本明細書中で使用される場合、充填されたクロマトグラフィーカラム又は分離ユニットへの、標的分子を含むサンプルのローディングの間の、このカラム又は分離ユニットから出たものの中に標的分子が最初に現れる時点をいう。言い換えると、用語「ブレークスルー」は、標的分子の喪失が開始する時点である。

本明細書中で使用される場合、語句「～から本質的に成っている」は、請求の範囲を特定した物質又は工程、及び特許請求の対象の基本的及び新規な特徴に実質的に影響しないものに、限定する。この用語は、検討中の装置、システム又は方法の基本的及び新規な特徴に実質的に影響しない要素又は工程を含めることを許容する。したがって、表現「～から本質的に成る」又は「～から本質的に成っている」は、挙げられた実施形態、要点、構成要素、工程などは、存在しなければならず、他の実施形態、要点、構成要素、工程などは、挙げられた実施形態、要点、構成要素、工程などの性能、特徴又は効果に実質的に影響しない限り、存在してもよいことを意味し得る。サンプル又は生成物に対して実質的な影響を有さない操作又は工程の存在は、許容される。例えば、目的の生体分子及び不純物を含むサンプルを精製することから本質的に成る方法は、目的の生体分子をバイオリアクター内で発現させて目的の生体分子及び不純物を含む生成物サンプルを形成すること；この生成物サンプルを清澄化すること；この清澄化された生成物サンプルをシングルパス接線流濾過に供して濃縮された生成物サンプルを形成すること；この濃縮された生成物サンプルをアフィニティクロマトグラフィーに供して濃縮された生成物サンプルから不純物を取り除くことから本質的に成り、清澄化操作とシングルパス接線流濾過操作との間に実施される、生成物サンプルの組成を実質的に変更する他の工程又はユニット操作を排除し、そしてシングルパス接線流濾過操作とアフィニティクロマトグラフィー操作との間に実施される、生成物サンプルの組成を実質的に変更する他の工程又はユニット操作を排除する。ＳＰＴＦＦユニットの下流かつ捕捉クロマトグラフィーの上流に配置された無菌濾過工程又はタンク若しくは容器は、生成物サンプルの組成を実質的に変更しない。

特定の実施形態において、プロセスの開始物質であるサンプルは、サンプルが中で増殖した細胞株及びサンプルが増殖し、そして回収された条件に依存して、変動し得る。例えば、ほとんどのＣＨＯ細胞プロセスにおいて、細胞は、細胞壁の外側に、媒体の中に分子を発現する。ある者は、混合物中の不純物の量を減らすために、回収の間に細胞を破壊しないよう試みた。しかし、いくつかの細胞は、増殖及び回収の間、せん断若しくは他の操作条件に起因して破裂したり、又は死滅及び溶解したりして、その内容物を混合物中に放出する場合がある。細菌細胞システムにおいては、生体分子は、多くの場合、細胞壁内に保たれるか、又は実際には細胞壁の一部分である場合がある（プロテインＡ）。これらのシステムにおいて、細胞壁は、目的の生体分子を回収するために、破壊されるか、又は溶解されなければならない。

精製されようとする標的分子は、任意の生体分子であってよく、好ましくはタンパク質であり、詳細には任意の宿主細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、オランダのＣｒｕｃｅｌｌから入手可能なＰｅｒ．Ｃ６（Ｒ）細胞株、ＮＳＯ細胞などの骨髄腫細胞、マウス細胞、昆虫細胞などの他の動物細胞、又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくは酵母などの微生物細胞が挙げられるがこれらに限定されない）において産生された、組換えタンパク質である。さらに、混合物は、目的の生体分子を含むトランスジェニックな体液（例えば、乳汁若しくは血液）を産生するように改変された動物に由来する体液であってもよい。最適な標的タンパク質は、抗体、イムノアドヘシン及び他の抗体様分子、例えば、Ｃ_Ｈ２／Ｃ_Ｈ３領域を含む融合タンパク質であるい。例えば、この生成物及びプロセスは、組換えヒト化モノクローナル抗体、例えば、調整された、回収した細胞培養液（ＨＣＣＦ）（ＲｈｕＭＡｂを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において増殖させた）由来の（ＲｈｕＭＡｂ）の精製のために、使用されてもよい。

特定の実施形態において、下流精製プロセスにおいて、所望の化学的官能性を有する一連の精製媒体が、可溶性の不純物の除去を果たすために使用されて、その間、生成物は溶液中に保持され、そして精製媒体を素通りして流れ、生成物を含む精製された流れを生じる。精製媒体の好適な形態としては、誘導体化した膜、官能性付与したクロマトグラフィー媒体、又は、種々の不純物と相互作用して媒体が静電性、疎水性若しくはアフィニティ相互作用によって不純物を捕捉することができるような所望の化学的官能性を有する任意の他の多孔性物質が、挙げられる。不純物の複雑かつ多様な性質の観点から、異なる化学的官能性を有する多くの精製媒体が、異なる化学的特性を有する種々の不純物を取り除くために、連続して配置されてもよい。

特定の実施形態において、サンプル由来の標的分子を精製するためのプロセスが開示され、ここで、このプロセスは、以下を含む：（ａ）バイオリアクターにおいてタンパク質を発現させてタンパク質サンプルを形成すること；（ｂ）このタンパク質サンプルをインライン濃縮工程に供して濃縮されたタンパク質サンプルを形成すること；（ｃ）得られた濃縮されたタンパク質サンプルを、１以上のアフィニティクロマトグラフィーユニットを使用するプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーに供すること。特定の実施形態において、タンパク質サンプルは、インライン濃縮工程に供される前に１以上の清澄化工程に供される。図４に図示されるように、サンプル由来の標的分子を精製するためのシステムもまた開示され、このシステムは、バイオリアクター、インラインシングルパス接線流フィルター、及びインラインシングルパス接線流フィルターに液体連絡している１以上のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラムを含む。特定の実施形態において、このシステムは、バイオリアクターの下流かつシングルパス接線流フィルターの上流に、遠心分離、接線流フィルター、深層フィルター、及び無菌フィルターの１以上を含み得る。いくつかの実施形態において、このシステムは、シングルパス接線流フィルターの下流かつアフィニティクロマトグラフィーカラムの上流に、無菌フィルター及びタンク又は容器の１以上を含み得る。タンク又は容器は、サージタンク又は容器であってもよい。いくつかの実施形態において、１以上のウイルス不活性化ユニットは、アフィニティクロマトグラフィーカラムの下流であってもよい。いくつかの実施形態において、ポリッシング相は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラムの下流であってもよく、そして、アニオン交換クロマトグラフィーカラム、カチオン交換クロマトグラフィーカラム、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの１以上を含んでもよい。いくつかの実施形態において、このシステムは、ポリッシング相の下流に、ウイルスフィルター、無菌フィルター、及び濃縮／透析濾過デバイスの１以上を含み得る。

いくつかの実施形態において、このシステム内の種々のデバイス間に接続ラインが存在する。このデバイスは、システム内の各デバイスがシステム内の先行するデバイス及び後続するデバイスに液体連絡しているように、インラインで繋がっている。特定の実施形態において、シングルパス接線流濾過ユニットは、１以上の清澄化ユニット、例えば、遠心分離、接線流濾過ユニット（例えば、１以上のＴＦＦモジュール）、深層濾過ユニット（例えば、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから市販されるＣｌａｒｉｓｏｌｖｅ（Ｒ）深層フィルター）、及び／又は無菌濾過ユニット（例えば、無菌濾過膜）のすぐ下流にあり、清澄化工程とシングルパス接線流濾過との間に実施されるユニット操作はない。特定の実施形態において、シングルパス接線流濾過ユニットは、単数又は複数のアフィニティクロマトグラフィーカラム（好ましくは単数又は複数のプロテインＡカラム）のすぐ上流にあり、その間に実施されるユニット操作はない。他の実施形態において、シングルパス接線流濾過ユニットは、無菌濾過膜及び／又はタンクのすぐ上流にあり、無菌濾過膜及び／又はタンクは、単数又は複数のアフィニティクロマトグラフィーカラム（好ましくは単数又は複数のプロテインＡカラム）のすぐ上流にある。タンクは、連続するプロセスにおけるユニット操作間のポンプ変化性に対して保護するための、又はプロセス中間体プールのための操作者サンプリング点を提供するための、サージ容器として使用されてもよい。タンクはまた、以下でより詳細に議論されるように、単数カラム操作を可能にするための、サージ容器として使用されてもよい。タンクはまた、例えば、連続する下流プロセスに接続するバッチ式上流プロセスの場合に、生成物保持容器として使用されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のシステムにおいて使用されるバイオリアクターは、使い捨て、すなわち単回使用用のバイオリアクターである。いくつかの実施形態において、このシステムは、無菌環境内に収容される。

いくつかの実施形態において、開始サンプルは、細胞培養物である。このようなサンプルは、バイオリアクター内に提供され得る。特定の実施形態において、バイオリアクターは、潅流バイオリアクターである。

特定の実施形態にしたがい、インライン生成物濃縮は、フィードから過剰な水及び緩衝液を除去し、それにより、インライン濃縮の下流の単数又は複数のクロマトグラフィーカラムにローディングされる体積が減少する。

いくつかの実施形態において、結合及び溶出クロマトグラフィー装置は、各ユニットが同じクロマトグラフィー媒体、例えば、プロテインＡアフィニティ媒体を含む、少なくとも２つの分離ユニットを備える。特定の実施形態において、プロテインＡ媒体は、剛性の親水性ポリビニルエーテルポリマーマトリックスに結合したプロテインＡリガンドを含む。他の実施形態において、プロテインＡリガンドは、アガロース又は孔が調整されたガラスに結合してもよい。プロテインＡリガンドは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡの天然に存在するドメインに基づいても、又は天然に存在するドメインのバリアント若しくは断片であってもよい。詳細な実施形態において、プロテインＡリガンドは、スタフィロコッカス・アウレウスのプロテインＡのＣドメインに由来する。分離ユニットは、液体が１つの分離ユニットから次の分離ユニットへ流れ得るように、互いに連続して、液体連絡して接続されている。

他の実施形態において、結合及び溶出クロマトグラフィー装置は、少なくとも３つの分離ユニットを備える。分離ユニットは、液体が１つの分離ユニットから次の分離ユニットへ流れ得るように、互いに連続して、液体連絡して接続されている。いくつかの実施形態において、結合及び溶出クロマトグラフィー装置は、互いに連続して液体連絡して接続されている、少なくとも４つの分離ユニット、又は少なくとも５つの分離ユニット、又は少なくとも６つの分離ユニットを備える。

シングルパス接線流濾過（ＳＰＴＦＦ）は、フィルターアセンブリを連続様式で通る単回通過において生成物の充分な濃縮を可能にし、したがって、被保持物の戻り及びバッチ様式でのフィルターの多数回通過は必要ない。このことは、多数回通過ＴＦＦよりも低いフィード流束及び／又はより長いチャネルを介してデバイス内の膜チャネルにおける液体滞留時間を長くすることによって、可能とすることができ得る。さらなる利点としては、一定のフィード流量及び保持圧力、並びにより小さいポンプ及びより小さい設備面積を用いることができることが、挙げられる。ＳＰＴＦＦのための好適な膜としては、１～１０００ｋＤの範囲の名目分子量限界の限外濾過膜が挙げられる。例えば、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから市販されるＰｅｌｌｉｃｏｎ（Ｒ）２カセット又はＰｅｌｌｉｃｏｎ（Ｒ）３カセットが、使用され得る。１つのカセットが使用されても、又は変換を改善するために複数のカセットが連続して配置されて使用されてもよい。接線流濾過工程は、生成物サンプルを十分に濃縮するので、被保持物の再利用は、必要ない。特定の実施形態において、ＳＰＴＦＦＴＦＦカセットを連続して構成することにより、サンプル滞留時間の延長を達成する。

特定の実施形態において、ＳＰＴＦＦデバイスは、捕捉クロマトグラフィーカラム、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーカラムのすぐ上流に配置される。他の実施形態において、無菌フィルター及び／又はタンクは、ＳＰＴＦＦデバイスと捕捉クロマトグラフィーカラムとの間に配置されてもよい。特定の実施形態において、ＳＰＴＦＦデバイスは、回収した細胞培養物清澄化ユニット操作、例えば、１以上の遠心分離、接線濾過モジュール、深層濾過ユニット、又は無菌濾過ユニットのすぐ下流に置かれる。ＳＰＴＦＦデバイスを用いる目的の生体分子の事前濃縮は、全体の処理時間又は生成物質量流速を変えることなく、バイオリアクターからの（捕捉クロマトグラフィー工程へと進む）全体のプロセス体積を減らす。

特定の実施形態において、アフィニティクロマトグラフィーの上流にシングルパス接線流濾過ユニットを入れることは、所望の収量を維持するために一連にローディングされなければならないアフィニティクロマトグラフィーカラムの数を減らす。体積流量が減るので、（例えば、プロテインＡアフィニティリガンドを含む）アフィニティクロマトグラフィー媒体は、より低い質量ローディングにて最小のブレークスルーで、標的動的結合能力に到達し、それによって、そうでなければ必要であったカラムの数の低減を、可能にする。特定の実施形態において、連続した２つのアフィニティクロマトグラフィーカラムのみ（例えば、プロテインＡアフィニティリガンドを含む）が、必要である。いくつかの実施形態において、カラム洗浄、溶出及び清浄化の間に、ローディングされた物質を収集するために、サージ容器などが使用される場合、１つのアフィニティクロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティリガンドを含む）カラムのみが、必要である。

より少ないカラムが使用される場合、カラムは、処理の間により頻繁に回されなければならず、このことは、クロマトグラフィー媒体の寿命及び費用をエンドユーザーに理解させることを容易にする。回されるカラムの数を減らすことはまた、システム圧力を下げ（例えば２５％の低下）、そしてシステムの大きさ及び複雑さを低減し、必要とされるバルブ及びバルブスイッチをより少なくする。

シングルパス接線流濾過デバイスの使用はまた、クロマトグラフィー樹脂のより効率のよい利用率を可能にするので、同じ物質を同じ時間で処理するために必要な樹脂が少なくなり、生産性を改善し、そして費用を下げる。低減した体積流速は、システム内のポンプの負荷を減らし、より多くの生成物質量を処理することが可能な、より小さなシステムを可能にする。

Claims (12)

1. 目的の生体分子及び不純物を含むサンプルを精製するための方法であって、目的の生体分子をバイオリアクターにおいて発現させて目的の生体分子及び不純物を含む生成物サンプルを形成すること；前記生成物サンプルを清澄化操作に供し、得られた清澄化された生成物を、シングルパス接線流濾過に供して濃縮生成物サンプルを形成すること；並びに前記濃縮生成物サンプルをアフィニティクロマトグラフィーに供して前記濃縮生成物サンプルから不純物を取り除くことを含む、方法。
2. 前記アフィニティクロマトグラフィーは、プロテインＡアフィニティリガンドを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記濃縮生成物サンプルを、前記アフィニティクロマトグラフィーの下流のウイルス不活性化工程に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記濃縮生成物サンプルを、前記ウイルス不活性化工程の下流のポリッシング工程に供することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記ポリッシング工程は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーの１以上を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記生体分子は、組換え抗体、組換えモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体及び抗体断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 前記生体分子は、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
8. 前記濃縮生成物サンプルを、アフィニティクロマトグラフィーに供する前に、無菌濾過に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 目的の生体分子を精製するためのシステムであって、以下：
   ａ． バイオリアクター；
   ｂ． 前記バイオリアクターから出された生成物サンプルを連続的に濃縮するための、前記バイオリアクターの下流のインラインシングルパス接線流濾過ユニット；
   ｃ． 前記インラインシングルパス接線流濾過ユニットからの濃縮した生成物の流れを受け取るための、前記インラインシングルパス接線流濾過ユニットの下流に連続して構成された、少なくとも２つのアフィニティクロマトグラフィーカラム；
   ｄ． 前記少なくとも２つのアフィニティクロマトグラフィーカラムの下流に配置されたウイルス不活性化フィルター；及び
   ｅ． 前記ウイルス不活性化フィルターの下流に配置された、アニオン交換、カチオン交換又は疎水性相互作用交換クロマトグラフィーカラムの１つ以上
   を含む、システム。
10. 前記少なくとも２つのアフィニティクロマトグラフィーカラムが、それぞれ、プロテインＡアフィニティリガンドを含む、請求項９に記載のシステム。
11. 前記バイオリアクターと前記シングルパス接線流濾過ユニットとの間に配置される無菌フィルターをさらに含む、請求項９に記載のシステム。
12. 目的の生体分子及び不純物を含むサンプルを精製する方法であって、
    前記目的の生体分子をバイオリアクター内に発現させて、前記目的の生体分子及び不純物を含む生成物サンプルを形成すること；前記生成物サンプルをシングルパス接線流濾過に供して、濃縮生成物サンプルを形成すること；並びに前記濃縮生成物サンプルをアフィニティクロマトグラフィーに供して、前記濃縮生成物サンプルから不純物を除去することから本質的に成る、方法。

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