JP2022506174A - 改変第ｉｘ因子ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、野生型未成熟（前駆体）第ＩＸ因子の３４７位に対応する位置での変異を含む改変第ＩＸ因子ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチド又はポリヌクレオチドを利用する治療に関する。【選択図】図１

Description

発明の分野
本発明は、野生型未成熟（前駆体）第ＩＸ因子の３４７位に対応する位置での変異を含む改変第ＩＸ因子ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチド又はポリヌクレオチドを利用する治療に関する。

発明の背景
Ｘ連鎖性の、致死的な出血性疾患である血友病Ｂは、３０，０００人に１人の男性に発症する。現在の治療には、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）タンパク質の頻繁な静脈内注射（週に２～３回）が関係する。この治療は出血を止めるのに非常に効果的であるが、治癒的ではなく、非常に高価であり（１５０，０００ポンド／患者／年）、従って、世界中大多数の血友病Ｂ患者は負担できない。血友病Ｂのための遺伝子治療は、第ＩＸ因子遺伝子の機能的コピーを、罹患した患者に移入した後、第ＩＸ因子の持続的な内因的産生による治癒の可能性を提供する。

しかし、遺伝子治療を受けている患者において第ＩＸ因子遺伝子から発現する第ＩＸ因子のレベルは、一般に健康な患者ほど高くはない。従って、第ＩＸ因子導入遺伝子を保有するベクターの有効性を改善する、即ち、形質導入率を増大させ、第ＩＸ因子発現を増大させ、及び／又は発現した第ＩＸ因子の活性を増大させる、メカニズムが望まれる。

本出願は、野生型の未成熟第ＩＸ因子の３４７位に対応する位置での変異を含む改変第ＩＸ因子ポリペプチドに関する。本発明者らは、驚くべきことに、野生型の未成熟第ＩＸ因子の３４７位に対応する位置での変異が、高活性の第ＩＸ因子ポリペプチドを提供できることを見出した。かかる高活性の第ＩＸ因子ポリペプチドは、さまざまな用途において有用であり得る。例えば、かかる高活性第ＩＸ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子治療の一部として投与される場合に特に有用である。

発明の要旨
本出願は、野生型の未成熟第ＩＸ因子の３４７位での変異が、高活性の第ＩＸ因子ポリペプチドをもたらすことを実証する。更に、本出願は、野生型の未成熟第ＩＸ因子の３４７位及び第３８４位の両方に対応する位置での変異が、更により活性のある改変第ＩＸ因子ポリペプチドをもたらし得ることを実証する。

野生型未成熟（即ち、前駆体、ザイモゲン形態）第ＩＸ因子の３４７位は、第ＶＩＩＩａ因子と相互作用する第ＩＸ因子触媒ドメインの側の露出ループ（Ｙ３４１～Ｆ３４８；未成熟形態に基づく番号付け）の一部である。触媒ドメイン内の領域（残基２２６～４６１；未成熟形態に基づく番号付け）は、第ＶＩＩＩａ因子の結合に関与し得る。機能獲得型変異はＹ３４１～Ｆ３４８ループ中には記述されていないが、対照的に、３４７～３４９領域における変異は、活性の低下と出血表現型につながることが知られている。驚くべきことに、リシン３４７をアルギニンと置換することにより、野生型（即ち、変異していない）第ＩＸ因子と比較して、有意に増大した第ＩＸ因子活性（即ち、「機能獲得」）が得られることが示されている。理論に拘束されることを望まないが、それは第ＶＩＩＩａ因子のより良好な結合に起因すると考えられている。

第ＩＸ因子の領域３７９～３８５は、第ＶＩＩＩａ因子の結合にも関連している。従って、この領域における機能獲得型変異は、３４７位の変異と不利に相互作用する可能性があるか、又は一方の変異が「冗長」であり、他方の存在下では事実上重要ではない可能性があると考えられるかもしれない。しかしながら、本出願は、３４７位及び３８４位での変異が互いに有利に相互作用して、３４７位のみで変異したポリペプチドや３８４位のみで変異したポリペプチドよりも更により活性のある第ＩＸ因子ポリペプチドを提供することを実証する。とりわけ、Ｒ３８４Ａ又はＲ３８４Ｌ変異と組み合わされたＫ３４７Ｒを有する改変第ＩＸ因子ポリペプチドは特に活性がある。

従って、本発明の第１の態様においては、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含む、改変第ＩＸ因子ポリペプチドが提供される。

本発明の第２の態様においては、本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドが提供される。

本発明の第３の態様においては、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含む、ウイルス粒子が提供される。

第４の実施形態においては、本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はウイルス粒子と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、組成物が提供される。

第５の実施形態においては、有効量の本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物を患者に投与することを含む、治療方法が提供される。

第６の実施形態においては、治療方法における使用のための医薬の製造における、本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物の使用が提供される。
図面の説明

図１－第ＩＸ因子構造の模式図。模式図上の数字は、シグナルペプチド及びプロペプチド領域を含む完全な第ＩＸ因子ポリペプチド（配列番号１）におけるアミノ酸位置を表す。模式図の下の数字は、成熟第ＩＸ因子（配列番号２に対応）における同等のアミノ酸位置を表す。 図２－ｒ－ｈＦＩＸを発現するＡＡＶにより形質導入した第ＩＸ因子ノックアウトマウスからの第ＩＸ因子バリアントの活性。（Ａ）ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴ（即ち、変異していないｒ－ｈＦＩＸ）、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｌ、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ及びｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４ＬをコードするＡＡＶベクターを注射してから２、４、８、及び１３週間後に採取したマウス由来の血漿中の発色性ＦＩＸ活性レベル（Ｕ／ｍｌとして表される））。（Ｂ）（Ａ）に記載のマウス由来の血漿ＦＩＸ抗原レベル（Ｕ／ｍｌとして表される）。（Ｃ）（Ａ）に記載のマウス由来のＦＩＸの比活性。データは、群あたり４～５匹の動物の平均±１標準偏差を表す。 図３－安定な細胞株由来のＦＩＸバリアントの比活性。ｒ－ｈＦＩＸ ＷＴ、Ｋ３４７Ｒ、Ｒ３８４Ｌ、Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌ、Ｒ３８４Ａ、及びＫ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ａの抗原レベルを、デュプリケートで、材料及び方法に記載の通り測定した。比活性を、活性のレベルに対して抗原のレベルで除することにより得た。データは、３回の独立した実験の平均±１標準偏差を表す。 図４－精製したＦＩＸバリアントの比活性。０．２５μｇ／ｍｌの濃度でＦＩＸ欠乏血漿にスパイクした、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴ、Ｋ３４７Ｒ、Ｒ３８４Ｌ、及びＫ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌの、固有の一段階ＦＩＸ凝固活性（ＡＰＴＴ）（パネルＡ）及び発色性ＦＩＸ活性（パネルＢ）。一段階凝固アッセイ又は発色アッセイ（ミリユニット／ｍｌで表される）によって得られたデータを、タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）により除して、比活性（ｍＵ／μｇ）を得ている。データは、６回の独立した実験の平均±１標準偏差を表す。 図５－配列表 図５－配列表 図５－配列表

詳細な説明
一般的な定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

一般に、用語「含む」は、含むが、これに限定されないという意味であることが意図される。例えば、語句「３４７位に対応する位置での変異を含む、改変第ＩＸ因子ポリペプチド」は、ポリヌペプチドが３４７位での変異を有するが、該ポリペプチドは更なる変異を含んでもよいという意味であると解釈されるべきである。同様に、語句「第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド」は、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを指すが、該ポリヌクレオチドは更なるヌクレオチドを含有してもよい。

本発明のいくつかの実施形態においては、単語「含む」は、語句「からなる」と置換される。用語「からなる」は、限定的であることが意図される。例えば、語句「第ＩＸ因子ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を有し、更なるヌクレオチドを有さないことを意味すると理解されるべきである。

用語、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では交換可能に用いられ、アミノ酸の、任意の長さのポリマー鎖を指すことが意図される。

本発明の目的のために、２の配列（２のポリヌクレオチド配列又は２のポリペプチド配列等）の同一性のパーセントを特定するために、配列は、最適な比較の目的のためにアラインされる（例、第２の配列との最適なアラインメントのために、ギャップが、第１の配列に導入され得る）。次いで、各位置でヌクレオチド残基又はアミノ酸残基が比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸で占められている場合、その位置でアミノ酸は同一である。２の配列間の同一性のパーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数（即ち、％同一性＝同一の位置の数／参照配列内の位置の総数ｘ１００）である。

典型的には、配列比較は参照配列の長さの全てにわたって行われる。例えば、ユーザーが、ある特定の（「試験」）配列が配列番号１と９５％同一であるか否かを決定したい場合、配列番号１が参照配列になる。配列が配列番号１（参照配列の例）と少なくとも８０％同一であるか否かを評価するためには、当業者は、アラインメントを配列番号１の長さの全てにわたって行い、試験配列中のどれだけの位置が配列番号１のものと同一であったかを特定する。少なくとも８０％の位置が同一である場合、試験配列は、配列番号１と少なくとも８０％同一である。該配列が配列番号１より短い場合、ギャップ又は抜けている位置は、同一でない位置であると見なされるべきである。

当業者は、２の配列間の相同性又は同一性を決定するために利用可能な種々のコンピュータプログラムを認識している。例えば、配列の比較及び２の配列間の同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成し得る。一実施形態においては、２のアミノ酸配列又は核酸配列間の同一性のパーセントは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）アルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、長さの重み１、２、３、４、５、又は６を用いて決定される。

本発明の目的のために、用語「断片」は、配列の連続部分を指す。例えば、配列番号１の、５０アミノ酸の断片は、配列番号の１の、連続する５０ヌクレオチドを指す。

改変第ＩＸ因子ポリペプチド
一態様においては、本発明は、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含む改変第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを提供する。

用語「改変第ＩＸ因子ポリペプチド」は、第ＩＸ因子と相同であるが、野生型第ＩＸ因子の配列を有さない、即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４と同一である配列を有さないポリペプチドを指す。例えば、配列番号１の配列を含むが、３４７位に対応する位置での変異を含むポリペプチドは、改変第ＩＸ因子ポリペプチドである。

野生型第ＩＸ因子は、凝固カスケードの一部を形成するセリンプロテアーゼである。第ＩＸ因子の欠如又は変異は、血液凝固の減少及び血友病Ｂの疾患をもたらし得る。典型的な野生型第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１（時に第ＩＸ因子Ｍａｌｍｏ Ｂと称される）又は配列番号２（成熟（活性型）第ＩＸ因子Ｍａｌｍｏ Ｂと称される）に存在する。代替の野生型第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１によってコードされるものと、配列番号１の１９４位に対応する位置において異なる。例えば、１９４位は、（配列番号３におけるように）アラニンの代わりにスレオニンのアミノ酸であり得る（「Ｍａｌｍｏ Ａ」）。

第ＩＸ因子（例、配列番号１の第ＩＸ因子）は、最初は、図１に示すような、疎水性シグナルペプチド（配列番号１又は配列番号３のアミノ酸１～２８）、プロペプチド領域（配列番号１又は配列番号３のアミノ酸２９～４６）及び成熟ポリペプチド領域を含む、前駆体の「未成熟」型として発現する。第ＩＸ因子の成熟（ザイモゲン）型は、疎水性シグナルペプチド及びプロペプチド領域を欠いており、配列番号２又は配列番号４により表される。用語、「成熟第ＩＸ因子」は、配列番号２又は配列番号４等の、疎水性シグナルペプチドやプロペプチド領域を含まない第ＩＸ因子ポリペプチドを指す。

凝固の間、一本鎖ザイモゲン型は第ＸＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子によって切断され、２本の鎖がジスルフィド架橋によって連結された、活性のある二本鎖形態（第ＩＸａ因子）が生成される。活性化された形態は、第Ｘ因子中のアルギニン－イソロイシン結合の加水分解を触媒して、第Ｘａ因子を形成できる。野生型第ＩＸ因子はトロンビンによって阻害される。野生型の第ＩＸ因子タンパク質には、４のタンパク質ドメイン、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦドメインの２のタンデムコピー、及び触媒的切断を担うＣ末端トリプシン様ペプチダーゼドメインがある。

用語、「第ＩＸ因子ポリペプチド」は、第ＩＸ因子の一本鎖ザイモゲン型、活性化された二本鎖形態及びそのバリアントに相同であるポリペプチドを指し、成熟第ＩＸ因子ポリペプチド又はプロペプチド領域及び／若しくはシグナルペプチド領域を含む第ＩＸ因子ポリペプチドを指し得る。

配列番号１の３４７位に対応する位置での変異
本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含む。上記の通り、配列番号１は野生型第ＩＸ因子の配列であり、配列番号２は野生型第ＩＸ因子の成熟型の配列（プロペプチド及びシグナルペプチド領域に対応する最初の４６アミノ酸を欠いている）である。配列番号１の３４７位は配列番号２の３０１位に対応する。

第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を有するか否かを決定するために、ユーザーは、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのもの等の好適なアルゴリズムを用いて、第ＩＸ因子ポリペプチドと配列番号１とのアラインメントを行い、配列番号１の３４７位とアラインする位置に存在するアミノ酸の種類を決定し得る。配列番号１の３４７位はリシン残基である。従って、配列番号１の３４７位とアラインする位置に存在するアミノ酸がリシン残基でない場合、第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含む。

配列番号１の３４７位に対応する位置での変異は、好ましくは機能獲得型変異である。機能獲得型変異は、改変第ＩＸ因子ポリペプチドの活性を増大させる変異である。上記の通り、第ＩＸ因子ポリペプチドは第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換するため、改変第ＩＸ因子ポリペプチドが第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換する速度を増大させる場合、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異は機能獲得型変異である。例えば、実施例１～３において実証される通り、リシン３４７のアルギニンアミノ酸での置換により、第ＩＸ因子ポリペプチドの比活性が増大する。

配列番号１の３４７位に対応する位置での変異が機能獲得型変異であるか否かを決定することは、当業者の能力の範囲内である。変異を含む改変第ＩＸ因子ポリペプチドを、３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較し、変異を含む改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いているポリペプチドと比較してより高い活性を有するか否かを確認することを要するのみである。配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含む改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いているポリペプチドと比較して、より高い活性を有する場合、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異は、機能獲得型変異である。

「３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチド」は、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を除いて同一の配列を有する改変第ＩＸ因子ポリペプチドであり、即ち、該ポリペプチドは３４７位に対応する位置のアミノ酸がリシン残基であることを除いて、同一の配列を有する。

３４７位に対応する位置での変異を含む第ＩＸ因子ポリペプチド及び３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチド等の第ＩＸ因子ポリペプチドの活性を決定するための様々な方法がある。これらの方法としては、発色アッセイ、凝固アッセイ又はテールクリップアッセイが挙げられる。好適な発色アッセイ及び凝固アッセイが、実施例１～３に記載される。

例えば、好適な発色アッセイは以下の通りである。第ＩＸ因子ポリペプチドは、ヒト第Ｘ因子、ヒト第ＶＩＩＩ因子、及びカルシウムと混合される。その後、第ＩＸａ因子の活性は、トロンビン、第ＸＩａ因子、及びリン脂質の添加によって惹起される。これらの条件下で、第ＸＩａ因子は第ＩＸ因子ポリペプチドを活性化して第ＩＸａ因子ポリペプチドを形成し、トロンビンはＦＶＩＩＩポリペプチドを活性化してＦＶＩＩＩａポリペプチドを形成し、これにより第Ｘ因子から第Ｘａ因子への変換を触媒する内因性Ｘａｓｅ（ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ）複合体の形成が可能になる。第Ｘａ因子ポリペプチドの活性は、発色性基質（例、ＳＸａ－１１）の切断を触媒してｐＮＡを生成できる。生成されたｐＮＡのレベルは、４０５ｎｍにおける吸光度を決定することにより測定でき、これは、試料中のＦＩＸａの活性に比例する、試料中の、ＦＩＸａによって生成された第Ｘａ因子ポリペプチドの量に比例する。

同様に、好適な凝固アッセイ（一段階凝固アッセイ）は以下の通りである。第ＩＸ因子は凝固カスケードの一部であるため、活性が増大した第ＩＸ因子ポリペプチドは、活性が低い第ＩＸ因子ポリペプチドよりも迅速に血液凝固を触媒する。

例えば、好適な凝固アッセイは以下の通りである。第ＩＸ因子ポリペプチドが血小板欠乏血漿と混合され、３７℃でインキュベーションされる。次いで、リン脂質と、カオリンやＳｙｎｔｈａＳＩＬ ＡＰＴＴ試薬等の接触活性化経路活性化因子が加えられる。次いでカルシウムが加えられ、ユーザーが凝固が起こるのにかかる時間を測定する。凝固形成は、分光光度法を用いてか、又は磁気スチールボール法により評価され得る。例えば、凝固形成は、混合物の光学密度が閾値を超えると共に、又は混合物がセンサーによって検出される磁気ボールの動きを変えるのに十分に凝固した時に、起こったと見なされ得る。

好適なテールクリップアッセイは、血液凝固不全のノックアウトマウス等のマウスに、第ＩＸ因子ポリヌクレオチド、又は遺伝子治療の関連でポリヌクレオチドを投与することを含み得る。次いで、マウスの尾が切り取られ、尾の切れ目が凝固するのにかかる時間が測定される。出血の持続時間は、投与された第ＩＸ因子の活性の相対的（例えば、機能獲得を含有する第ＩＸ因子と野生型の第ＩＸ因子との比較）な尺度を提供する。

好ましい実施形態においては、第ＩＸ因子ポリペプチドが精製され、比活性は、精製された第ＩＸ因子ポリペプチドに対して行われる凝固アッセイ又は発色アッセイによって測定される。いくつかの実施形態においては、第ＩＸ因子ポリペプチドの比活性は、第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むＡＡＶベクターを作製し、マウスにＡＡＶベクターを注射し、発色アッセイを用いてマウス由来の血漿中の比活性を検出することによって測定される。いくつかの実施形態においては、第ＩＸ因子ポリペプチドの比活性は、第ＩＸ因子ポリペプチドをコードするポリペプチドを安定して発現する細胞を提供し、細胞及び／又は培養培地から第ＩＸ因子ポリペプチドを回収し、発色アッセイを用いて第ＩＸ因子ポリペプチドの特異的活性を測定することによって測定される。

本出願の目的のために、用語「比活性」は、試料中の第ＩＸ因子ポリペプチドの量又は濃度を考慮して「正規化」される活性のような、単位あたり（例、μｇあたり、又は正常なヒト血漿中のレベルの％としての抗原レベルあたり）の第ＩＸ因子ポリペプチドの活性（例、凝固活性又は内因性のＸａｓｅ活性）を指す。（典型的には、プールされた健康なヒト血漿の第ＩＸ因子濃度は５μｇ／ｍｌであることに注意。）これは、実施例１及び２に記載のアッセイ等の標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、試料中の第ＩＸ因子ポリペプチドの濃度を測定し、活性を第ＩＸ因子の濃度で除することによって行われ得る。

例えば、第ＩＸ因子ポリペプチドに結合する抗体がプレートに結合され得る。未知の濃度の第ＩＸ因子ポリペプチドを含む試料は、プレート上を通過させられ得る。第ＩＸ因子ポリペプチドに結合する二次検出抗体をプレートに適用し、任意の過剰物を洗い流し得る。残存する（即ち、洗い流されていない）検出抗体は、第ＩＸ因子ポリペプチドに結合する。検出抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素に連結させられ得る。プレート上の第ＩＸ因子ポリペプチドに結合する検出抗体のレベルは、検出抗体の量を測定することによって測定され得る。例えば、検出抗体がセイヨウワサビペルオキシダーゼに連結されている場合、セイヨウワサビペルオキシダーゼは、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）等の基質からの青色反応生成物の生成を触媒し得、青色生成物のレベルは、４５０ｎｍでの吸収によって検出され得る。青色生成物のレベルは、洗浄ステップ後に残存した検出抗体の量に比例し、これは、試料中の第ＩＸ因子ポリペプチドの量に比例する。代替的に、例えば、精製タンパク質を用いる場合、第ＩＸ因子ポリペプチドの量又は濃度は分光光度法で決定され得る。

場合により、本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、より高い活性を有する。

場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４のポリペプチドと比較してより高い活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のポリペプチドと比較してより高い活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチド、配列番号２のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド及び配列番号４のポリペプチドと比較してより高い活性を有する。改変第ＩＸ因子ポリペプチド及び配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４のポリペプチドの活性は、上記の通り、発色アッセイ、凝固アッセイ、又はテールクリップアッセイを用いて決定され得る。

場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１又は 配列番号２のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有する。

場合により、比活性は、発色アッセイを用いて測定され、即ち、発色アッセイを用いて、改変第ＩＸ因子ポリペプチドの活性が決定され、必要に応じて、活性は、上記等のＥＬＩＳＡ試験を用いて正規化される。好適な発色アッセイが上記される。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドよりも、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のポリペプチドよりも、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドよりも、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチド、配列番号２のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド及び配列番号４のポリペプチドよりも、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する。

場合により、比活性は、凝固アッセイを用いて測定され、即ち、一段階凝固アッセイ等の凝固アッセイを用いて、改変第ＩＸ因子ポリペプチドの活性が決定され、該活性は、上記のＥＬＩＳＡ試験を用いて正規化される。好適な凝固アッセイが上記される。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３若しくは配列番号４のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチド、配列番号２のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド、及び配列番号４のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性有する。

配列番号１の３４７位に対応する位置での変異は、正に極性化した大きなアミノ酸への変異であり得る。正に極性化した大きなアミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、及びトリプトファンが挙げられる。配列番号１の３４７位に対応する位置での変異は、アルギニン、ヒスチジン、及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸残基への変異であり得る。場合により、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異は、アルギニンへの変異である。

配列番号１の３８４位に対応する位置での変異
本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、更なる変異を含み得る。好ましくは、任意の更なる変異は機能獲得型変異である。例えば、本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を含み得る。

第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３８４位に対応する位置に変異を有するか否かを決定するためには、ユーザーは、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのもの等の好適なアルゴリズムを用い、第ＩＸ因子ポリペプチドを配列番号１とアラインさせ、配列番号１の３８４位とアラインする位置に存在するアミノ酸の種類を決定してもよい。配列番号１の３８４位はアルギニン残基である。従って、配列番号１の３８４位とアラインする位置に存在するアミノ酸がアルギニン残基でない場合、第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を含む。

配列番号１の３８４位に対応する位置での変異は、好ましくは機能獲得型変異である。例えば、実施例１～３において実証される通り、アルギニン３８４のロイシン又はアラニンアミノ酸との置換により、第ＩＸ因子ポリペプチドの比活性の増大がもたらされる。同様に、アルギニン３８４のグルタミン又はアスパラギン酸との置換により、第ＩＸ因子ポリペプチドの比活性の増大がもたらされることが報告されている。

配列番号１の３８４位に対応する位置での変異が機能獲得型変異であるか否かを決定することは、当業者の能力の範囲内である。単に、変異を含む第ＩＸ因子ポリペプチドを、３８４位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較し、変異を含む第ＩＸ因子ポリペプチドが、３８４位に対応する位置に変異を欠いているポリペプチドと比較してより高い活性を有するか否かを確認することを要するのみである。配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を含む第ＩＸ因子ポリペプチドが、３８４位に対応する位置に変異を欠いているポリペプチドと比較してより高い活性を有する場合、該変異は、機能獲得型変異である。

「３８４位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチド」は、３８４位に対応する位置での変異を除いて、同一の配列を有する第ＩＸ因子ポリペプチドであり、即ち、該ポリペプチドは３８４位に対応する位置におけるアミノ酸がアルギニン残基であることを除いて、同一の配列を有する。

第ＩＸ因子ポリペプチドの比活性を決定するための好適なアッセイは、「配列番号１の３４７位に対応する位置での変異」の見出しの下で上記されている。好適なアッセイとしては、上記のもの等の発色アッセイ、凝固アッセイ、及びテールクリップアッセイが含まれる。

場合により、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異は、非極性の小さなアミノ酸への変異である。非極性の小さなアミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。場合により、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異は、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸への変異である。場合により、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異は、アラニンへの変異である。場合により、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異は、ロイシンへの変異である。配列番号１の３８４位に対応する位置での変異は、グルタミン又はアスパラギン酸への変異であり得る。

改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置及び３８４位に対応する位置の両方に変異を有し得る。例えば、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に、正に荷電した大きなアミノ酸への変異を、及び配列番号１の３８４位に対応する位置に、非極性の小さなアミノ酸への変異を有し得る。同様に、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に、アルギニン、ヒスチジン、及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸残基への変異を、及び配列番号１の３８４位に対応する位置に、グルタミン、アスパラギン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸への変異を有し得る。改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に、アルギニンへの変異を、及び配列番号１の３８４位に対応する位置に、非極性の小さなアミノ酸への変異を有し得る。改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に、アルギニンへの変異を、及び配列番号１の３８４位に対応する位置に、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸への変異を有し得る。改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に、アルギニンへの変異を、及び配列番号１の３８４位に対応する位置に、アラニン又はロイシンへの変異を有し得る。

改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いており、配列番号１の３８４位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有し得る。「配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いており、配列番号１の３８４位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチド」は、３４７位及び３８４位に対応する位置での変異を除いて同一の配列を有する改変第ＩＸ因子ポリペプチドであり、即ち、該ポリペプチドは３４７位に対応する位置におけるアミノ酸がリシン残基であり、３８４位に対応する位置におけるアミノ酸がアルギニン残基であることを除いて、同一の配列を有する。

本出願は、配列番号１の３４７位に対応する位置にアルギニンを有し、配列番号１の３８４位に対応する位置にロイシン又はアラニンを有する第ＩＸ因子ポリペプチドが、他の点では同一（同等）である、配列番号１の３４７位に対応する位置にアルギニンへの単一の変異のみを有する第ＩＸ因子ポリペプチドと比較して、より高い活性を有し、並びに、他の点では同一（同等）である、配列番号１の３８４位に対応する位置にロイシン又はアラニンのいずれかへの単一の変異のみを有する第ＩＸ因子ポリペプチドと比較して、より高い活性を有するすることを実証する。

場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号５のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号５のポリペプチドと比較して、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．３倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、又は少なくとも６倍高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号６のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号６のポリペプチドと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも２．０倍、又は少なくとも２．２倍高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号７のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号７のポリペプチドと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．１５倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、又は少なくとも１．６倍高い比活性を有する。

改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号５のポリペプチドと比較して、より高い比活性を、及び配列番号６のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有し得る。改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号５のポリペプチドに対して、より高い比活性を、及び配列番号７のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有し得る。改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号５のポリペプチドと比較して、より高い比活性を、配列番号６のポリペプチドと比較して、より高い比活性を、及び配列番号７のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有し得る。改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号５のポリペプチドと比較して、少なくとも５倍高い比活性を、配列番号６のポリペプチドと比較して、少なくとも２．０倍高い比活性を、及び配列番号７のポリペプチドと比較して、少なくとも１．５倍高い比活性を有し得る。

第ＩＸ因子ポリペプチドの比活性を決定するための好適なアッセイは、「配列番号１の３４７位に対応する位置での変異」の見出しの下で上記されている。例えば、比活性は、上記等の発色アッセイ、凝固アッセイ、又はテールクリップアッセイを用いて測定され得る。

配列番号１又は配列番号２との相同性
改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の、少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００～４１５の、２５０～４１５の、又は３００～４１５のアミノ酸の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含み得る。

好ましくは、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは機能的である。機能的な第ＩＸ因子ポリペプチドは、第Ｘ因子のアルギニン－イソロイシン結合の加水分解を実行して第Ｘａ因子を形成するものである。第ＩＸ因子ポリペプチドが機能的であるか否かを決定することは当業者の能力の範囲内である。「配列番号１の３４７位に対応する位置での変異」の見出しの下で記載される通り、発色アッセイ、凝固アッセイ、又はテールクリップアッセイにおいて、改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、活性があるか否かを決定することを要するのみである。好ましくは、機能的改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドの比活性の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％を有する。上記の通り、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含み、かかる変異は機能獲得型変異であり得るので、いくつかの実施形態においては、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドと比較してより高い活性を有する。

場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１の３００～４１５のアミノ酸の断片と、少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号２の３００～４１５のアミノ酸の断片と、少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号１と、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のポリペプチド配列を含む。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、配列番号２と、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のポリペプチド配列を含む。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含むことを除いて、配列番号１又は配列番号２と同一であるポリペプチド配列を含み、即ち、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３４７位に対応する位置にリシンではないアミノ酸を有することを除いて、配列番号１又は配列番号２と同一であるポリペプチド配列を含む。

場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、該改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置での変異及び配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を含むことを除いて、配列番号１又は配列番号２と同一であるポリペプチド配列を含み、即ち、改変第ＩＸ因子ポリペプチドは、該改変第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３４７位に対応する位置にリシンではないアミノ酸、及び配列番号１の３８４位に対応する位置にアルギニンではないアミノ酸を有することを除いて、配列番号１又は配列番号２と同一であるポリペプチド配列を含む。

第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
一態様においては、本発明は、本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

用語、「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの、ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらの類似体のポリマー形態を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）又はＲＮＡ（リボヌクレオチド）を含み得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡからなり得る。ポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり得る。ポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡを含み得るので、Ｔ（チミン）ヌクレオチドへのすべての言及はＵ（ウラシル）と置換され得る。

場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号８の、少なくとも９００の、少なくとも１０００の、少なくとも１３００の、又は少なくとも１３８０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号８の、少なくとも１３００のヌクレオチドの断片と、少なくとも９８％同一である。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号８と、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一である。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、該第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が配列番号１の３４７位に対応する位置にリシンではないアミノ酸コードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置にアルギニンではないアミノ酸をコードするコドン含むことを除いて、配列番号８と同一であるポリヌクレオチド配列を含む。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、該第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が配列番号１の３４７位に対応する位置にリシンではないアミノ酸をコードするコドンを含むことを除いて、配列番号８と同一であるポリヌクレオチド配列を含む。

第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、３４７位に対応する位置にアミノ酸をコードするコドンであって、リシンをコードしないコドンを含むか否かを決定するために、ユーザーは、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのもの等の好適なアルゴリズムを用い、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を配列番号８とアラインさせ、配列番号８のコドン３４７（ヌクレオチド１０３９～１０４１）にアラインする位置に存在するコドンの種類を決定してもよい。配列番号８のコドン３４７はリシン残基をコードする。従って、配列番号８のコドン３４７とアラインする位置に存在するコドンがリシン残基をコードしない場合、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は３４７位に対応する位置にリシンではないアミノ酸をコードするコドンを含む。

同様に、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、３８４位に対応する位置にアミノ酸をコードするコドンであって、アルギニンをコードしないコドンを含むか否かを決定するために、ユーザーは、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのもの等の好適なアルゴリズムを用い、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を配列番号８とアラインさせ、配列番号８のコドン３８４（ヌクレオチド１１５０～１１５２）にアラインする位置に存在するコドンの種類を決定してもよい。配列番号８のコドン３８４はアルギニン残基をコードする。従って、配列番号８のコドン３８４とアラインする位置に存在するコドンがアルギニン残基をコードしない場合、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、３８４位に対応する位置にアルギニンではないアミノ酸をコードするコドンを含む。

場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、ここで、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、正に極性化した大きなアミノ酸をコードする。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、ここで、配列番号１の３４７位で対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、アルギニン、ヒスチジン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸をコードする。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、ここで、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、アルギニンをコードする。

アルギニンは、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、又はＡＧＧコドンのいずれかによってコードされ得る。従って、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり得る。場合により、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、ＡＧＧである。

場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、ここで配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、非極性の小さなアミノ酸をコードする。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、ここで配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、グルタミン、アスパラギン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸をコードする。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、ここで、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸をコードする。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、ここで、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、アラニンをコードする。場合により、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、ここで、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、ロイシンをコードする。

アラニンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、又はＧＣＧコドンのいずれかによってコードされ得る。従って、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ又はＧＣＧであり得る。場合により、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンはＧＣＣである。

ロイシンは、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、又はＣＴＧコドンのいずれかによってコードされ得る。従って、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ又はＣＴＧであり得る。場合により、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、ＣＴＸであり、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドである。場合により、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンは、ＣＴＣ又はＣＴＧである。

第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置に正に極性化した大きなアミノ酸をコードするコドン、及び配列番号１の３８４位に対応する位置に非極性の小さなアミノ酸をコードするコドンを含み得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置にアルギニン、ヒスチジン又はグルタミンをコードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置に非極性の小さなアミノ酸をコードするコドンを含み得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置にアルギニンをコードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置に非極性の小さなアミノ酸をコードするコドンを含み得る。

第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置に正に極性化した大きなアミノ酸をコードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置にアラニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンをコードするコドンを含み得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置にアルギニン、ヒスチジン又はグルタミンをコードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置にアラニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンをコードするコドンを含み得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置にアルギニンをコードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置にアラニン、ロイシン、イソロイシン又はバリンをコードするコドンを含み得る。

第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置に正に極性化した大きなアミノ酸をコードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置にアラニン又はロイシンをコードするコドンを含み得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置にアルギニン、ヒスチジン又はグルタミンをコードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置にアラニン又はロイシンをコードするコドンを含み得る。第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、配列番号１の３４７位に対応する位置にアルギニンをコードするコドンを、及び配列番号１の３８４位に対応する位置にアラニン又はロイシンをコードするコドンを含み得る。

第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、転写調節エレメントに作動可能に連結され得る
第ＩＸ因子ヌクレオチド配列は、転写調節エレメントに作動可能に連結され得る。

ＨＬＰ２、ＨＬＰ１、ＬＰ１、ＨＣＲ－ｈＡＡＴ、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴ、及びＬＳＰ等の適切な転写調節エレメント（すべて肝臓特異的転写調節エレメントである）が用いられ得る。これらの転写調節エレメントは、以下：ＨＬＰ１：ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ａｐｒ ２５，１２１（１７）：３３３５－４４；ＬＰ１：Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６ Ａｐｒｉｌ １，１０７（７）：２６５３-２６６１；ＨＣＲ－ｈＡＡＴ：Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０００；１：５２２－５３２；ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴ：Ｏｋｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７，６３７－６４５（１９９６）；及びＬＳＰ：Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９９ Ｍａｒｃｈ ３０，９６（７）：３９０６-３９１０の参考文献でより詳細に説明されている。ＨＬＰ２転写調節エレメントは、配列番号９の配列を有する。

転写調節エレメントは、ＨＬＰ２、ＨＬＰ１、ＬＰ１、ＨＣＲ－ｈＡＡＴ、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴ、及びＬＳＰ由来のプロモーターエレメント及び／又はエンハンサーエレメント等のプロモーター及び／又はエンハンサーを含み得る。これらの転写調節エレメントのそれぞれは、プロモーター、エンハンサー、及び場合により他のヌクレオチドを含む。

一実施形態においては、転写調節エレメントは、ヒトアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）肝遺伝子座制御領域（ＨＣＲ；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ（２０００），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １（６）：５２２）、又はその断片であるエンハンサーを含む。一実施形態においては、転写調節エレメントは、長さが少なくとも８０の、少なくとも９０の、少なくとも１００の、１９２未満の、８０～１９２の、９０～１９２の、１００～２５０の又は１１７～１９２のヌクレオチドの断片である、ＨＣＲエンハンサーの断片を含む。場合により、ＨＣＲエンハンサーの断片は、長さが１００～２５０のヌクレオチドである。

一実施形態においては、転写調節エレメントは、ヒトアルファ－１抗トリプシンプロモーター（Ａ１ＡＴ；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ （２０００），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １（６）：５２２）であるプロモーター、又はその断片を含む。場合により、転写調節エレメントは、長さが少なくとも１００の、少なくとも１２０の、少なくとも１５０の、少なくとも１８０の、２５５未満の、１００～２５５の、１５０～２２５の、１５０～３００の、又は１８０～２５５のヌクレオチドであるＡ１ＡＴプロモーターの断片を含む。場合により、Ａ１ＡＴプロモーターの断片は、長さが１５０～３００のヌクレオチドである。

ポリヌクレオチドが肝臓における発現を目的としている場合、プロモーターは肝臓特異的プロモーターであり得る。場合により、プロモーターはヒト肝臓特異的プロモーターである。

「肝臓特異的プロモーター」は、一般的に他の細胞と比較して肝細胞においてより高レベルの発現を提供するプロモーターである。例えば、当業者は、肝細胞（Ｈｕｈ７細胞等）におけるポリヌクレオチドの発現を、他の組織からの細胞におけるポリヌクレオチドの発現と比較することによって、プロモーターが肝臓特異的プロモーターであるか否かを決定できる。他の組織からの細胞と比較して、肝細胞における発現レベルが高い場合、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。場合により、肝臓特異的プロモーターは、非肝臓細胞において感知できるレベルの発現をドライブしない。

ポリヌクレオチドを含むウイルス粒子
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含むウイルス粒子を提供する。本発明の目的のために、用語「ウイルス粒子」は、ビリオンの全部又は一部を指す。例えば、ウイルス粒子は組換えゲノムを含み、更にキャプシドを含み得る。ウイルス粒子は、遺伝子治療ベクターであり得る。本明細書中、用語「ウイルス粒子」及び「ベクター」は交換可能に使用される。本出願の目的のために、「遺伝子治療」ベクターは、遺伝子治療で用いられ得るウイルス粒子、即ち、投与後の宿主細胞において、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列等の導入遺伝子を発現するために必要なすべての機能的要素を含むウイルス粒子である。

好適なウイルス粒子としては、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルスが挙げられる。パルボウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。ウイルス粒子は、好ましくは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである。より好ましくは、ウイルス粒子はＡＡＶウイルス粒子である。用語、ＡＡＶ及びｒＡＡＶは、本明細書中、文脈で特記しない限り、交換可能に用いられる。

すべての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は非常に似ている。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド未満の線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は、非構造的な複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質についての特有のコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、－２、及び－３）がキャプシドを形成する。末端１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体のためのプライマーとして機能する。哺乳動物細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（即ち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする）は、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現し、両方のＲｅｐタンパク質はウイルスゲノムの複製における機能を有する。Ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシングイベントにより、４のＲｅｐタンパク質（即ち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）の発現がもたらされる。しかし、哺乳動物細胞においては、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする、スプライシングされていないｍＲＮＡが、ＡＡＶベクターの産生に十分であることが示されている。また、昆虫細胞においては、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質が、ＡＡＶベクターの産生に十分である。

本発明の組換えウイルスゲノムは、ＩＴＲを含み得る。本発明のＡＡＶベクターは１のＩＴＲのみで機能することが可能である。従って、ウイルスゲノムは少なくとも１のＩＴＲを含むが、より典型的には２のＩＴＲを含む（一般的に、ウイルスゲノムのいずれの端にも１、即ち、５’末端に１、及び３’末端に１）。ポリヌクレオチドと１以上のＩＴＲとの間に介在配列があり得る。本発明のポリヌクレオチドは、正規の２のＩＴＲの間に位置するか、又は２のＤ領域で改変されたＩＴＲのいずれかの側に位置するウイルス粒子に組み込まれ得る。

本発明において、ＡＡＶベクターの産生のために使用され得るＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。一般的に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで有意な相同性のゲノム配列を有し、同一の一式の遺伝的機能を提供し、実質的に物理的及び機能的に同等のビリオンを生成し、実質的に同一のメカニズムによって複製及び集合する。さまざまなＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ，１９９８；及びＷｕ ｅｔ ａｌ，２０００を参照。本発明においては、ＡＡＶ血清型１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２が用いられ得る。ＡＡＶ血清型由来の配列は、遺伝子治療ベクターの作製に用いられる場合に変異又は操作され得る。

場合により、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／又はＡＡＶ６に由来するＩＴＲ配列を含む。好ましくは、ＩＴＲ配列はＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。本明細書において、用語、ＡＡＶｘ／ｙは、ＡＡＶｘからのいくつかの成分（ここで、ｘは、ＡＡＶ血清型番号）及びＡＡＶｙからのいくつかの成分（ここで、ｙは、同一か又は異なる血清型番号）を含むウイルス粒子を指す。例えば、ＡＡＶ２／８ベクターは、ＩＴＲを含む、ＡＡＶ２株に由来するウイルスゲノムの一部分、及びＡＡＶ８株に由来するキャプシドを含み得る。

一実施形態においては、ウイルス粒子は、キャプシドを含むＡＡＶウイルス粒子である。ＡＡＶキャプシドは、一般的には、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３の３のタンパク質から形成される。ＶＰ１のアミノ酸配列はＶＰ２の配列を含む。ＶＰ２の一部を形成しないＶＰ１の一部分は、ＶＰ１ｕｎｉｑｕｅ又はＶＰ１Ｕと称される。ＶＰ２のアミノ酸配列はＶＰ３の配列を含む。ＶＰ３の一部を形成しないＶＰ２の一部分は、ＶＰ２ｕｎｉｑｕｅ又はＶＰ２Ｕと称される。好ましくは、キャプシドは、国際公開第ＷＯ２０１６／１８１１２３号中に開示されたもの等の、ＡＡＶ５キャプシド又はＭｕｔ Ｃキャプシドである。

本発明のウイルス粒子は、ウイルスＩＴＲ及びウイルスキャプシドが、異なるＡＡＶ血清型等の異なるパルボウイルスに由来する「ハイブリッド」粒子であり得る。好ましくは、ウイルスＩＴＲ及びキャプシドは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し、その場合、かかるウイルス粒子は、トランスキャプシド化又は偽型化として知られる。同様に、パルボウイルスは、「キメラ」キャプシド（例、異なるパルボウイルス、好ましくは異なるＡＡＶ血清型由来の配列を含有する）又は「標的化」キャプシド（例、指向性）を有し得る。

いくつかの実施形態においては、組換えＡＡＶゲノムは、機能的末端分離部位（ＴＲＳ）を含む完全なＩＴＲを含む。かかるＡＡＶゲノムは、１又は２の分離可能なＩＴＲ、即ち、部位特異的なニッキングが発生して、ＤＮＡポリメラーゼがＩＴＲを巻き戻し、複製するための基質として機能できる遊離の３’ヒドロキシル基を作製できる機能的ＴＲＳを含有するＩＴＲを含有し得る。好ましくは、組換えゲノムは一本鎖である（即ち、それは一本鎖形態でウイルス粒子にパッケージングされる）。場合により、組換えゲノムは、自己相補的構成でパッケージングされず、即ち、ゲノムは、ウイルス粒子内でアニーリングする実質的な自己相補的部分を有する、単一の、共有結合的に連結されたポリヌクレオチド鎖を含まない。代替的に、組換えゲノムは「単量体二重鎖」形態でパッケージングされ得る。「単量体二重鎖」は、ＷＯ２０１１／１２２９５０に記載されている。ゲノムは、ウイルス粒子内でアニーリングする２の実質的に相補的であるが、非共有結合的に連結されたポリヌクレオチドとしてパッケージングされ得る。

ウイルス粒子は、ポリＡ配列を更に含み得る。ポリＡ配列は、機能的な第ＩＸ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流に位置し得る。ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ｂＧＨｐＡ）であり得る。ポリＡ配列は、長さが２５０～２７０のヌクレオチドであり得る。

組成物、方法及び使用
本発明の更なる態様において、本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はベクター／ウイルス粒子及び医薬的に許容される賦形剤を含む組成物が提供される。

医薬的に許容される賦形剤は、担体、希釈剤及び／又は他の医薬品（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｇｅｎｔ）、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）又は補助剤等を含み得る。場合により、医薬的に許容される賦形剤は、生理食塩水を含む。場合により、医薬的に許容される賦形剤は、ヒト血清アルブミンを含む。

本発明は更に、治療方法における使用のための本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター／ウイルス粒子又は組成物を提供する。場合により、治療方法は、有効量の本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチドベクター／ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む。

本発明は更に、有効量の本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、又はベクター／ウイルス粒子を患者に投与することを含む治療方法を提供する。

本発明は更に、治療方法における使用のための薬剤の製造における、本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター／ウイルス粒子又は組成物の使用を提供する。場合により、治療方法は、有効量の本発明の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物又はベクター／ウイルス粒子を患者に投与することを含む。場合により、治療方法は遺伝子治療である。「遺伝子治療」は、それが投与される宿主において導入遺伝子（本発明のポリヌクレオチド等）を発現できる本発明のベクター／ウイルス粒子を投与することを含む。

場合により、治療方法は、血友病（例えば、血友病Ａ若しくはＢ）又はフォン・ヴィレブランド病等の凝固障害を治療する方法である。好ましくは、凝固障害は、出血の増大及び／又は凝固の減少を特徴とする。場合により、治療方法は、血友病、例えば血友病Ｂを治療する方法である。いくつかの実施形態においては、患者は血友病Ｂに罹患している患者である。場合により、患者は第ＩＸ因子に対する抗体又は阻害剤を有する。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物及び／又はベクター／ウイルス粒子は静脈内投与される。場合により、改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物及び／又はベクター／ウイルス粒子は、患者に一回のみ投与（即ち、単回投与）するためのものである。

上記の方法で血友病Ｂを「治療」する場合、これは血友病の１以上の症状が改善されることを意味する。血友病の症状が完全に改善されて患者に存在しなくなるという意味ではないが、一部の方法ではそうなる場合がある。治療方法は、血友病Ｂの症状の１以上の、治療前よりも低い重症度をもたらし得る。場合により、治療方法は、投与前の状況と比較して、患者の血液中の循環する改変第ＩＸ因子ポリペプチドの量／濃度、及び／又はある特定の量の患者の血液内で検出可能な改変第ＩＸ因子ポリペプチド活性の全体的なレベル、及び／又は患者の血液中の改変第ＩＸ因子ポリペプチドの比活性（改変第ＩＸ因子ポリペプチドの量あたりの活性）の増大をもたらす。

「治療有効量」は、投与量で、及び必要な期間の間に（機能的改変第ＩＸ因子ポリペプチド産生を、血友病Ｂの症状を改善するのに十分なレベルでもたらすために）被験体における機能的改変第ＩＸ因子ポリペプチドのレベルを上げる等の所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。

場合により、ベクター／ウイルス粒子は、患者の体重１ｋｇあたり１ｘ１０^１１未満の、１ｘ１０^１２未満の、５ｘ１０^１２未満の、２ｘ１０^１２未満の、１．５ｘ１０^１２未満の、３ｘ１０^１２未満の、１ｘ１０^１３未満の、２ｘ１０^１３未満の、又は３ｘ１０^１３未満のベクターゲノムの用量で投与される。場合により、投与されるベクター／ウイルス粒子の用量は、被験体が、第ＩＸ因子を、非血友病の健康な被験者の第ＩＸ因子活性の１０％～９０％、２０％～８０％、３０％～７０％、２５％～５０％、２０～１５０％、３０％～１４０％、４０％～１３０％、５０％～１２０％、６０％～１１０％又は７０％～１００％の活性で発現するように選択される。

配列表

実施例１：ＦＩＸバリアントのインビボ発現及び評価
材料及び方法
ＦＩＸバリアントの生成
コドン最適化ヒトＦＩＸ（ｈＦＩＸｃｏ；（配列番号８）、野生型（ＷＴ）Ｍａｌｍｏ ＢバリアントＦＩＸタンパク質をコードする）のｃＤＮＡを、ｐＡＶ－ｓｃ－ＬＰ１プラスミドにクローニングした。ヒトＦＩＸ（ｈＦＩＸ）バリアント（Ｋ３４７Ｌ、Ｋ３４７Ｒ、及びＲ３８４Ｌ）を、Ｑ５ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ （ＮＥＢ）を用いて、製造業者の指示書に従ってｐＡＶ－ｓｃ－ＬＰ１－ｈＦＩＸｃｏテンプレートの部位特異的変異誘発によって生成し、整合性について配列決定した。

ＡＡＶベクターの生成
ＡＡＶ自己相補的ＡＡＶカセットｓｃ－ＬＰ１－ｈＦＩＸｃｏをＡＡＶ８で偽型化し、ベクターを、ＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトリプルプラスミドトランスフェクションによって生成した。細胞ペレット及び上清を７２時間後に回収し、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したアフィニティクロマトグラフィーで精製した（Ｂｉｎｎｙ，ＣＪ，ａｎｄ ＡＣ Ｎａｔｈｗａｎｉ．２０１２．“Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０９－１３１．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６１７７９－８７３－３＿６）。ＡＡＶをＰＢＳで一晩透析し、４℃で保存し、ベクターをアルカリアガロースゲルにより力価測定した（Ｆａｇｏｎｅ，Ｐ，ＪＦ Ｗｒｉｇｈｔ，ＡＣ Ｎａｗｔｈｗａｎｉ，ＡＷ Ｎｉｅｎｈｕｉｓ，ＡＭ Ｄａｖｉｄｏｆｆ，ａｎｄ ＪＴＧｒａｙ．２０１２．“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｌｆ－Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．” Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１１．１０４）。

インビボ評価
ＡＡＶベクター（１ｘ１０^１０ｖｇ／マウス）を、１２９／ｓｖバックグラウンドの６～８週齢の雄性ＦＩＸ（血友病 Ｂ）ノックアウトマウス（ＣＬ５７Ｂ６）の尾静脈に注射した（Ｗａｎｇ，Ｌ，Ｍ Ｚｏｐｐｅ，ＴＭ Ｈａｃｋｅｎｇ，ＪＨ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｋ－Ｆ Ｌｅｅ，ａｎｄ ＩＭ Ｖｅｒｍａ．１９９７．“Ａ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”ＰＮＡＳ ９４：１１５６３－１１５６６））。血液試料を、注射後２、４、８、及び１３週間で尾静脈から４％クエン酸ナトリウム（１：９比）に採取し、各採取後に尾静脈は焼灼した。ＦＩＸ抗原を、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＩＸ：Ａｇ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）によって、製造業者の指示書に従って測定した。ＦＩＸ活性を、評価項目の定量化に関する製造業者の指示書に従って、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ，Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈ，ＵＫ）によって測定した。

図２Ｂに示すように、注射後１３週間の血漿ＦＩＸ抗原レベルは、ＷＴ（０．９３±０．１９Ｕ／ｍｌ）、Ｋ３４７Ｌ（０．７１±０．３５Ｕ／ｍｌ）、Ｋ３４７Ｒ（１．０３±０．４３Ｕ／ｍｌ）及びＫ３８４Ｌ（１．３４±０．６３Ｕ／ｍｌ）のいずれかを保有するベクターを形質導入したマウスで類似していた。図２Ａに示すように、１３週間で、血漿中の発色性ＦＩＸ活性レベルは、ＷＴ（１．１９±０．３８Ｕ／ｍｌ）と比較してＫ３４７Ｒ（２．１４±１．０７Ｕ／ｍｌ）を保有するベクターを注射したマウスで高かった。更に、活性は、ＷＴと比較してＫ３４７Ｌ（０．３１±０．１６Ｕ／ｍｌ）を注射したマウス由来の血漿で減少したが、Ｋ３８４Ｌ（７．７５±３．１９Ｕ／ｍｌ）では増大した。比活性を、活性レベルを抗原レベルで除することによって得た。図２Ｃに示すように、Ｋ３４７Ｒマウス由来の血漿中の比活性（２．１８±０．８７）は、ＷＴ群中のマウス由来の血漿（１．２５±０．２０）と比較して１．７倍超高かった。一方、Ｋ３４７Ｌ（０．４６±０．１２）変異は、ＷＴと比較して２．７倍のＦＩＸ活性低下をもたらした。以前の報告と整合して、Ｒ３８４Ｌの比活性（５．９７±１．７０）はＷＴと比較して４．６倍高かった。これらの結果により、Ｋ３４７位でのＦＩＸポリペプチド鎖の変異が、ＦＩＸの全体的な比活性を増大させる可能性があることが示される。

表２は、ｒ－ｈＦＩＸ Ｋ３４７Ｒ、ｒ－ｈＦＩＸ Ｋ３４７Ｌ、及びｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌの相対的な比活性を示す。

実施例２：インビトロでのＦＩＸバリアントの安定した発現及び評価
材料及び方法
ＦＩＸバリアントの生成
コドン最適化ヒトＦＩＸ（「ｈＦＩＸｃｏ」（配列番号８）、野生型（ＷＴ）Ｍａｌｍｏ ＢバリアントＦＩＸタンパク質をコードする）のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ）にクローニングした。ヒトＦＩＸバリアント（Ｋ３４７Ｒ、Ｒ３８４Ａ、Ｒ３８４Ｌ、Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌ及びＫ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ａ）を、製造業者の指示書に従って、Ｑ５ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ （ＮＥＢ）を用いて、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ－ｈＦＩＸｃｏテンプレートの部位特異的変異誘発によって生成し、整合性について配列決定した。

安定した細胞株の生成
ＦＩＸバリアントの部位特異的ゲノム組込みは、Ｆｌｐ－Ｉｎ^ＴＭＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯベクター（目的の遺伝子を含有する）とＦｌｐリコンビナーゼを含有するｐＯＧ４４ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との共トランスフェクションにより行った。組換えｈＦＩＸ（ｒ－ｈＦＩＸ）バリアントを安定して発現する細胞株を、５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有する培養培地を用い、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ抗生物質選択マーカーについてのセレクションにより得た。

インビトロ評価
ｒ－ｈＦＩＸバリアントを安定して発現する細胞（１．５ｘ１０^６）をＴ２５細胞培養フラスコにトリプリケートで播種し、２４時間培養した後、１０μｇ／ｍｌのビタミンＫを含有する無血清発現培地に切り替えた。発現培地を細胞に対して４８時間馴化し、回収し、サブサンプリングし、分析まで－８０℃で凍結した。ＦＩＸ抗原を、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＩＸ：Ａｇ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）により、製造業者の指示書に従って測定した。ＦＩＸ活性を、評価項目の定量化に関する製造業者の指示書に従って、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ，Ｑｕａｄｒａｔｅｃｈ，ＵＫ）により測定した。

図３及び表３に示すように、比活性は、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴ（０．５４±０．０６）と比較してバリアントｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ（１．２５±０．０８）において２．３倍高かった。更に、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌ（６．６９±０．３２）及びｒ－ｈＦＩＸ Ｒ３８４Ａ（３．３８±０．１７）における比活性は、ＷＴと比較して１２．４倍及び６．３倍増大した。また、二重変異体ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌ（７．７１±０．３５）及びｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ａ（４．４２±０．１７）の比活性は、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴと比較して、対応して１４．３倍及び８．２倍増大した。更に、二重変異体ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌの比活性はＲ３８４Ｌと比較して１．２倍高く、二重変異体ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ａの比活性はｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ａと比較して１．３倍高かった。これらの結果により、Ｋ３４７位での変異をＦＩＸポリペプチド鎖のＲ３８４位の変異と組み合わせて、ＦＩＸの全体的な比活性を高めることができることが示される。

表３は、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ａ、及びｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７＋Ｒ３８４Ｌの相対的な比活性を示す。

実施例３：精製したＦＩＸバリアントの特性解析
材料及び方法
組換えＦＩＸバリアントの発現
野生型組換えヒトＦＩＸ（ｒ－ＦＩＸ－ＷＴ）又は組換えヒトＦＩＸバリアント（Ｋ３４７Ｒ、Ｒ３８４Ｌ、Ｋ３４７Ｒ／Ｒ３８４Ｌ）を安定して発現するＦｌｐ－Ｉｎ ＨＥＫ２９３細胞株を、増幅させて６３２０ｃｍ^２のｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）に入れ、ＦＩＸ特異的発現培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン、１０μｇ／ｍｌＩＴＳ、及び６μｇ／ｍｌビタミンＫを添加したフェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ－１２）中で２４時間馴化した。馴化培地を８日間連続して採取し、０．４５μｍのポリエーテルスルホン膜で濾過し、－２０℃で保存する前に１ｍＭのベンズアミジンを添加した。

組換えヒトＦＩＸの精製
馴化培地（１６リットル）を３７℃で解凍し、Ａｋｔａ ｆｌｕｘ６ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ６ Ａの限外濾過中空繊維カートリッジに適用し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ）中で約５００ｍｌに透析濾過し、－２０℃で保存した。３７℃で解凍した後、プールを周囲温度で２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化した４．８×４ｃｍ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。同じバッファーで洗浄した後、結合したタンパク質を０．１５～０．７５ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶出した。ＦＩＸ活性を含む画分を－８０℃で保存した。３７℃で解凍した後、ＦＩＸ活性を含有する画分をプールし、４℃で一晩２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に透析した。透析液を周囲温度で同じバッファーで平衡化した５ｍｌ ＩＸＳｅｌｅｃｔ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４で洗浄した後、結合したタンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２Ｍ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４を用いる定組成溶出により４．００ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。ＦＩＸ活性を含有する画分を直ちにプールし、４℃で２時間２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（４リットル）に１回、２時間５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８（４リットル）に１回、再び５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８（４リットル）に一晩透析した。透析液を周囲温度で、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で平衡化したＢｉｏ－Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ５－Ｉ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にアプライした。同じバッファーで洗浄した後、結合したタンパク質を最初に１．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速で５０～３００ｍＭのリン酸ナトリウム勾配で溶出した。ＦＩＸ活性を含有する画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いて分析し、－８０℃で保存し、３７℃での解凍の際にプールし、ＨＢＳ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中、５～１０ｍｇ ｍｌ^－１に、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ（Ｍｅｒｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて限外濾過（分子量を３０ｋＤａにカットオフ）し、－２０℃で保存した。精製した組換えｈＦＩＸの濃度を、吸光係数（Ｅ_０．１％、２８０ｎｍ）１．３２を用いて、２８０ｎｍでの吸光度から分光光度法で（３２０ｎｍにおけるバックグラウンドについて補正後（吸収＝Ａ２８０－１．７ｘＡ３２０）に）決定した。完全にγ－カルボキシル化された組換えＦＩＸの典型的な収量は０．３ｍｇ／リットル（馴化培地）であった。精製産物の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いるクマシーブリリアントブルー染色により可視化し、９９％以上であることを確認した。

一段階凝固及び発色性ＦＩＸ活性アッセイ
ｒ－ｈＦＩＸバリアントを、デュプリケートで、ＦＩＸが枯渇した血漿（ＨｅｍｏｓＩＬ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＩＬ），ＭＡ，ＵＳＡ）に０．２５μｇ／ｍｌでスパイクし、等分して－８０℃で保存した。解凍に際して、ＳｙｎｔｈａＳＩＬ ＡＰＴＴ試薬（ＨｅｍｏｓＩＬ，ＩＬ）を用いて、自動ＡＣＬ ＴＯＰ ７００凝固計（ＩＬ）で一段階凝固活性（ＡＰＴＴ）をトリプリケートで測定した。更に、スパイクした血漿試料の発色性活性を、市販のＦＩＸ発色アッセイキット（Ｒｏｘ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ，Ｒｏｓｓｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、自動ＡＣＬ ＴＯＰ ７００凝固計（ＩＬ）でトリプリケートで測定した。両方のアッセイを、凍結血漿標準品（ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ Ｎｏｒｍａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｌａｓｍａ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ，Ｃａｎａｄａ）を用いて較正した。

図４Ａに示すように、一段階凝固活性のアッセイにより、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴ（１４４±１３ｍＵ／μｇ）と比較して、バリアントｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ（２７９±２２ｍＵ／μｇ）に関して、比活性が１．９倍高いことが明らかになった。更に、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌの特異的凝固（１０７１±５６ｍＵ／μｇ）は、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴと比較して７．４倍高かった。最後に、二重変異体ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌ（１６７７±５２ｍＵ／μｇ）の比活性は、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴと比較して１１．６倍高く、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌと比較して１．６倍高かった。これらの結果により、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ変異がｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴ及びｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌ変異体の両方の活性を増大させることが示される。一段階凝固アッセイは、歴史的にＦＩＸ活性の臨床的表示値のゴールドスタンダードとして使用されている。発色性ＦＩＸアッセイは、最近、一段階凝固アッセイの代替として研究に採用されている。図４Ｂに示すように、発色性ＦＩＸ活性のアッセイにより、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴ（７８±１２ｍＵ／μｇ）と比較して、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ（１４７±１８ｍＵ／μｇ）に関して、比活性が１．９倍高いことが明らかになった。このことにより、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴに対するｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７の変化倍数において、以前に観察された傾向が確認される。しかし、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴ及びｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒの両方の発色性の比活性は、一段階凝固アッセイを用いて得られた値と比較して発色アッセイにおいて低かった。機能獲得型ＦＩＸバリアントｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌ及びｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌをアッセイした場合、一段階凝固アッセイと発色アッセイとの間のＦＩＸ活性の不一致も明らかであった。例えば、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌの比活性（２９２±３３ｍＵ／μｇ）は、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴと比較して３．７倍高かったのに対し、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌの比活性（４９７±２８ｍＵ／μｇ）は、ｒ－ｈＦＩＸ－ＷＴと比較して６．４倍高かった。更に、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌの比活性はｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌと比較して１．７倍増大した。これらの結果により、発色性ＦＩＸ活性を用いて試験した場合の、野生型ＦＩＸタンパク質に対する、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ、ｒ－ｈＦＩＸ－Ｒ３８４Ｌ、及びｒ－ｈＦＩＸ－Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌ変異についてのより高い活性が確認される。

表４は、一段階凝固アッセイを用いて決定したｒ－ｈＦＩＸ Ｋ３４７Ｒ、ｒ－ｈＦＩＸ Ｋ３４７Ｌ、及びｒ－ｈＦＩＸ Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌの相対的な比活性を示す。

表５は、発色アッセイを用いて決定したｒ－ｈＦＩＸ Ｋ３４７Ｒ、ｒ－ｈＦＩＸ Ｒ３８４Ｌ、及びｒ－ｈＦＩＸ Ｋ３４７Ｒ＋Ｒ３８４Ｌの相対的な比活性を示す。

本明細書に記載の本発明は、以下の態様にも関する：
１．配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含む、改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２．配列番号１の３４７位に対応する位置での変異が機能獲得型変異である、態様１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
３．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較してより高い活性を有する、態様１又は２の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
４．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のポリペプチドと比較してより高い活性を有する、態様１～３のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
５．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
６．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
７．比活性が発色アッセイを用いて測定される、態様５又は６の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
８．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する、態様７の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
９．比活性が凝固アッセイを用いて測定される、態様５～８の１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１０．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する、態様９の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１１．配列番号１の３４７位に対応する位置での変異が正に極性化した大きなアミノ酸への変異である、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１２．配列番号１の３４７位に対応する位置での変異が、アルギニン、ヒスチジン、及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸残基への変異である、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１３．配列番号１の３４７位に対応する位置での変異がアルギニンへの変異である、態様１２の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１４．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を更に含む、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１５．配列番号１の３８４位に対応する位置での変異が非極性の小さなアミノ酸への変異である、態様１４の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１６．配列番号１の３８４位に対応する位置での変異が、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸への変異である、態様１４又は１５の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１７．配列番号１の３８４位に対応する位置での変異がアラニンへの変異である、態様１６の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１８．配列番号１の３８４位に対応する位置での変異がロイシンへの変異である、態様１６の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
１９．配列番号１の３８４位に対応する位置での変異がグルタミン又はアスパラギン酸への変異である、態様１４の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２０．配列番号１の３４７位に対応する位置でのアルギニンへの変異及び３８４位に対応する位置でのアラニンへの変異を含む、態様１７の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２１．配列番号１の３４７位に対応する位置でのアルギニンへの変異及び３８４位に対応する位置でのロイシンへの変異を含む、態様１８の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２２．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いており、配列番号１の３８４位に対応する位置に変異を欠いている、同等のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有する、態様１４～２１のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２３．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号５のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２４．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号５のポリペプチドと比較して、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．３倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、若しくは少なくとも６倍高い比活性を有する、態様２３の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２５．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号６のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２６．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号６のポリペプチドと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも２．０倍、又は少なくとも２．２倍高い比活性を有する、態様２５の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２７．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号７のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２８．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号７のポリペプチドと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．１５倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、又は少なくとも１．６倍高い比活性を有する、態様２７の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
２９．比活性が発色アッセイ又は凝固アッセイを用いて測定される、態様２２～２８のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
３０．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２の、少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００～４１５の、２５０～４１５の、又は３００～４１５のアミノ酸の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
３１．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
３２．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３００～４１５のアミノ酸の断片と少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む、態様３０又は３１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
３３．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号２の３００～４１５のアミノ酸の断片と少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む、態様３０～３２のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
３４．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む、態様３０～３３のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
３５．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む、態様３０～３４のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
３６．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、該改変第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含むことを除いて、配列番号１又は配列番号２と同一であるポリペプチド配列を含む、態様１１～１３又は３０～３５のいずれか１の改変ＦＩＸポリペプチド。
３７．改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、該改変第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を、及び配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を含むことを除いて、配列番号１又は配列番号２と同一であるポリペプチド配列を含む、前記態様のいずれか１の改変ＦＩＸポリペプチド。
３８．前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
３９．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号８の少なくとも９００の、少なくとも１０００の、少なくとも１３００の、又は少なくとも１３８００のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である、態様３８のポリヌクレオチド。
４０．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である、態様３９のポリヌクレオチド。
４１．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがアルギニンをコードする、態様３８～４０のいずれか１のポリヌクレオチド。
４２．配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧである、態様４１のポリヌクレオチド。
４３．配列番号１の３４７位に対応する位置のアミノ酸でアミノ酸をコードするコドンがＡＧＧである、態様４２のポリヌクレオチド。
４４．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがアラニンをコードする、態様３８～４３のいずれか１のポリヌクレオチド。
４５．配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ又はＧＣＧである、態様４４のポリヌクレオチド。
４６．配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＧＣＣである、態様４４又は４５のポリヌクレオチド。
４７．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがロイシンをコードする、態様３８～４３のいずれか１のポリヌクレオチド。
４８．配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＣＴＸであり、Ｘが任意のヌクレオチドである、態様４７のポリヌクレオチド。
４９．配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＣＴＣ又はＣＴＧである、態様４７又は４８のポリヌクレオチド。
５０．第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が転写調節エレメントに作動可能に連結されている、態様３８～４９のいずれか１のポリヌクレオチド。
５１．転写調節エレメントが肝臓特異的プロモーター及び／又はエンハンサーを含む、態様５０のポリヌクレオチド。
５２．転写調節エレメントが、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一である、態様５０又は５１のポリヌクレオチド。
５３．態様３８～５２のいずれか１のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含むウイルス粒子。
５４．ＡＡＶ、アデノウイルス、又はレンチウイルスのウイルス粒子である、態様５３のウイルス粒子。
５５．ウイルス粒子がＡＡＶウイルス粒子である、態様５４のウイルス粒子。
５６．ウイルス粒子が：
ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ；
ｂ）ポリＡ配列；
ｃ）複製起点；及び／又は
ｄ）２の分離可能なＩＴＲ
を更に含む、態様５３～５５のいずれか１のウイルス粒子。
５７．配列番号１又は配列番号２の第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含む同等のウイルス粒子の同等の用量の投与と比較して、ウイルス粒子の投与がマウステールクリップアッセイにおける短縮された出血時間と関連する、態様５３～５６のいずれか１のウイルス粒子。
５８．前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はウイルス粒子、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、組成物。
５９．治療方法における使用のための、前記態様のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
６０．治療方法が、有効量の態様１～５８のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、態様５９の、使用のための改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
６１．有効量の態様１～５８のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物を患者に投与することを含む、治療方法。
６２．治療方法における使用のための薬剤の製造における、態様１～５８のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物の使用。
６３．治療方法が、有効量の態様１～５８のいずれか１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は組成物を患者に投与することを含む、態様６２の使用。
６４．治療方法が血友病を治療する方法である、態様５９～６３のいずれか１の、使用のための改変第ＩＸ因子ポリペプチド、使用のためのポリヌクレオチド、使用のためのウイルス粒子、使用のための組成物、又は方法。
６５．血友病が血友病Ｂである、態様６４の、使用のための改変第ＩＸ因子ポリペプチド、使用のためのポリヌクレオチド、使用のためのウイルス粒子、使用のための組成物、又は方法。
６６．患者が第ＩＸ因子に対する抗体又は阻害剤を有する、態様６５の、使用のための改変第ＩＸ因子ポリペプチド、使用のためのポリヌクレオチド、使用のためのウイルス粒子、使用のための組成物、又は方法。

Claims (25)

1. 配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含む、改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
2. 配列番号１の３４７位に対応する位置での変異が機能獲得型変異である、請求項１の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
3. 改変第ＩＸ因子ポリペプチドが：
   （ｉ）配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチド；及び／又は
   （ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４のポリペプチド
   と比較してより高い活性を有する、請求項１又は２の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
4. 改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有する、前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
5. 改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有する、前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
6. 比活性が発色アッセイを用いて測定される、請求項４又は５の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
7. 改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する、請求項６の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
8. 比活性が凝固アッセイを用いて測定される、請求項４～７の１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
9. 改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いている同等のポリペプチドと比較して、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、若しくは配列番号４のポリペプチドと比較して、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、又は少なくとも１．８倍高い比活性を有する、請求項８の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
10. 配列番号１の３４７位に対応する位置での変異が：
    （ｉ）正に極性化した大きなアミノ酸への変異；又は
    （ｉｉ）アルギニン、ヒスチジン、及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸残基への変異
    である、前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
11. 配列番号１の３４７位に対応する位置での変異がアルギニンへの変異である、前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
12. 改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を更に含む、前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
13. 配列番号１の３８４位に対応する位置での変異が：
    （ｉ）非極性の小さなアミノ酸への変異；又は
    （ｉｉ）グルタミン、アスパラギン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸への変異
    である、請求項１２の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
14. （ｉ）配列番号１の３８４位に対応する位置での変異がアラニンへの変異である；又は
    （ｉｉ）配列番号１の３８４位に対応する位置での変異がロイシンへの変異である；又は
    （ｉｉｉ）配列番号１の３４７位に対応する位置でのアルギニンへの変異及び３８４位に対応する位置でのアラニンへの変異を含む；又は
    （ｉｖ）配列番号１の３４７位に対応する位置でのアルギニンへの変異及び３８４位に対応する位置でのロイシンへの変異を含む、
    請求項１３の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
15. 改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３４７位に対応する位置に変異を欠いており、配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を欠いている、同等のポリペプチドと比較して、より高い比活性を有する、請求項１２～１４のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
16. （ｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号５、配列番号６若しくは配列番号７のポリペプチドと比較してより高い比活性を有する；及び／又は
    （ｉｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号５のポリペプチドと比較して、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．３倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、若しくは少なくとも６倍高い比活性を有する；及び／又は
    （ｉｉｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号６のポリペプチドと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも２．０倍、若しくは少なくとも２．２倍高い比活性を有する、及び／又は
    （ｉｖ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号７のポリペプチドと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．１５倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、若しくは少なくとも１．６倍高い比活性を有する；及び／又は
    （ｖ）比活性が、発色アッセイ又は凝固アッセイを用いて測定される、
    前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
17. （ｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２の、少なくとも２００の、少なくとも２５０の、少なくとも３００の、２００～４１５の、２５０～４１５の、若しくは３００～４１５のアミノ酸の断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む；又は
    （ｉｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一のポリペプチド配列を含む；又は
    （ｉｉｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１の３００～４１５のアミノ酸の断片と、少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む；又は
    （ｉｖ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号２の３００～４１５のアミノ酸の断片と、少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む；又は
    （ｖ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号１と、少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む；又は
    （ｖｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号２と、少なくとも９８％同一のポリペプチド配列を含む；又は
    （ｖｉｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、該改変第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を含むことを除いて、配列番号１又は配列番号２と同一であるポリペプチド配列を含む；又は
    （ｖｉｉｉ）改変第ＩＸ因子ポリペプチドが、該改変第ＩＸ因子ポリペプチドが配列番号１の３４７位に対応する位置での変異を、及び配列番号１の３８４位に対応する位置での変異を含むことを除いて、配列番号１又は配列番号２と同一であるポリペプチド配列を含む
    前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
18. 前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
19. （ｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号８の少なくとも１２００の、少なくとも１３５０の、若しくは少なくとも１６５０のヌクレオチドの断片と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である；並びに／又は
    （ｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である；並びに／又は
    （ｉｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがアルギニンをコードする；並びに／又は
    （ｉｖ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンが、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ若しくはＡＧＧである；並びに／又は
    （ｖ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、配列番号１の３４７位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＡＧＧである；並びに／又は
    （ｖｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがアラニンをコードする；並びに／又は
    （ｖｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ若しくはＧＣＧである；並びに／又は
    （ｖｉｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＧＣＣである；並びに／又は
    （ｉｘ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがロイシンをコードする；並びに／又は
    （ｘ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＣＴＸであり、Ｘが任意のヌクレオチドである；並びに／又は
    （ｘｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンを含み、配列番号１の３８４位に対応する位置でアミノ酸をコードするコドンがＣＴＣ若しくはＣＴＧである；並びに／又は
    （ｘｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、転写調節エレメントに作動可能に連結されている；並びに／又は
    （ｘｉｉｉ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、肝臓特異的プロモーター及び／若しくはエンハンサーを含む転写調節エレメントに作動可能に連結されている；並びに／又は
    （ｘｉｖ）第ＩＸ因子ヌクレオチド配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である転写調節エレメントに作動可能に連結されている
    請求項１８の改変第ＩＸ因子ポリペプチド。
20. 請求項１８～１９のいずれか１項のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含む、ウイルス粒子。
21. （ｉ）ＡＡＶ、アデノウイルス、若しくはレンチウイルスのウイルス粒子である；並びに／又は
    （ｉｉ）ＡＡＶウイルス粒子である；並びに／又は
    （ｉｉｉ）ウイルス粒子が：
    ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲ；
    ｂ）ポリＡ配列；
    ｃ）複製起点；及び／若しくは
    ｄ）２の分離可能なＩＴＲ
    を更に含む；並びに／又は
    （ｉｖ）ウイルス粒子の投与が、配列番号１または配列番号２の第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする第ＩＸ因子ヌクレオチド配列を含む同等のウイルス粒子の同等の用量の投与と比較して、マウステールクリップアッセイにおける出血時間の短縮と関連している
    請求項２０のウイルス粒子。
22. 前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はウイルス粒子と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
23. 治療方法における使用のための、前記請求項のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
24. 治療方法が、有効量の請求項１～２２のいずれか１項の改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物を患者に投与することを含む、請求項２３の、使用のための改変第ＩＸ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子又は組成物。
25. （ｉ）治療方法が血友病を治療する方法である；及び／若しくは
    （ｉｉ）治療方法が血友病Ｂを治療する方法である；及び／若しくは
    （ｉｉｉ）患者が第ＩＸ因子に対する抗体又は阻害剤を有する
    請求項２３又は請求項２４の、使用のための改変第ＩＸ因子ポリペプチド、使用のためのポリヌクレオチド、使用のためのウイルス粒子、又は使用のための組成物。

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