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JP2022505921A - Ｃｌｌ１を標的とする抗体およびその応用 - Google Patents

Ｃｌｌ１を標的とする抗体およびその応用 Download PDF

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JP2022505921A
JP2022505921A JP2021523007A JP2021523007A JP2022505921A JP 2022505921 A JP2022505921 A JP 2022505921A JP 2021523007 A JP2021523007 A JP 2021523007A JP 2021523007 A JP2021523007 A JP 2021523007A JP 2022505921 A JP2022505921 A JP 2022505921A
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amino acid
acid sequence
chain variable
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リー，ゾンハイ
ワン，ペン
ワン，フアマオ
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Cafa Therapeutics Ltd
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Cafa Therapeutics Ltd
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Abstract

Figure 2022505921000001
本発明は、ＣＬＬ１を標的とする抗体およびその応用を提供する。本発明によって提供されるＣＬＬ１特異的抗体は、ＣＬＬ１に対してより高い親和性を有し、キメラ抗原受容体修飾のＴ細胞に調製された後、ＣＬＬ１を発現する細胞に対して明らかな殺傷効果を有する。

Description

本発明は、腫瘍免疫治療または診断の分野に属し、より具体的には、本発明は、ＣＬＬ１を標的とする抗体およびその応用に関する。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成ヒトの急性白血病の最も一般的なタイプである。最も伝統的な治療方法は、同種造血幹細胞移植であるが、移植の初期または後期に関連する合併症が存在し、同時に手術後再発の可能性が存在する。現在、ＡＭＬを治療する化学療法薬物には、主にダウノルビシン（ＤＮＲ）、イダルビシン（デメトキシダウノマイシン）、およびシタラビン等があり、化学療法や放射線療法は、ある程度ＡＭＬに明らかな阻害効果があるが、副作用が強く、再発しやすいため、臨床コンプライアンスに影響を及ぼすため、ＡＭＬに対する新しい治療法が急務となっている。
ヒトＣ型レクチン様分子１（ＣＬＬ１）は、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、それの発現は、骨髄性細胞およびほとんどのＡＭＬ細胞に限定される。さらに、ＣＬＬ１は、白血病幹細胞（ＬＳＣｓ）で発現するが、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）では発現せず、従って、ＣＬＬ１は、ＡＭＬを治療する潜在的な標的である。
現在、研究者らは、例えば、ＣＮ１０４７３６５６２Ｂが抗ＣＬＬ１抗体を開示する等の、抗ＣＬＬ１抗体の研究を行っているが、市場には、ＡＭＬの治療に使用できる抗ＣＬＬ１抗体がない。
本発明の目的は、ＣＬＬ１を標的とする特異的抗体を提供することである。
第１の態様において、本発明は、ＣＬＬ１を標的とする抗体を提供し、前記抗体は、
ＳＹＸ１ＭＸ２に示されるＨＣＤＲ１、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｇに示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０または４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１２ＬＸ１３に示されるＬＣＤＲ１、Ｘ１４ＡＳＸ１５ＬＸ１６Ｓに示されるＬＣＤＲ２、およびＱＱＸ１７ＹＳＸ１８ＰＸ１９Ｘ２０Ｔに示されるＬＣＤＲ３を有し、
ここで、前記Ｘ１は、ＡまたはＹから選択され、Ｘ２は、ＳまたはＨから選択され、Ｘ３は、ＡまたはＩであり、Ｘ４は、ＩまたはＦから選択され、Ｘ５は、ＳまたはＮから選択され、Ｘ６は、ＧまたはＰから選択され、Ｘ７は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ８は、ＤまたはＱから選択され、Ｘ９は、ＳまたはＫから選択され、Ｘ１０は、ＶまたはＦから選択され、Ｘ１１は、ＫまたはＱから選択され、Ｘ１２は、ＷまたはＹから選択され、Ｘ１３は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ１４は、ＤまたはＶから選択され、Ｘ１５は、ＮまたはＳから選択され、Ｘ１６は、ＥまたはＱから選択され、Ｘ１７は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ１８は、ＹまたはＴから選択され、Ｘ１９は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ２０は、Ｉであるか、または存在しない。
好ましい実施形態において、前記抗体は、
（１）その重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５または３６に示されるＨＣＤＲ１を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８または３９に示されるＨＣＤＲ２を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０または４１に示されるＨＣＤＲ３を含む抗体、
（２）その軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３または４４に示されるＬＣＤＲ１を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６、４７または４８に示されるＬＣＤＲ２を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９または５０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
（３）（１）に記載の重鎖可変領域および（２）に記載の軽鎖可変領域を含む抗体、および
（４）（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体と同じまたは類似の活性を有する（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体の変異体からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、前記抗体ＬＣＤＲ１には、ＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１２ＬＸ１３からＲＡＳＱＷＩＡＲＸ１２ＬＸ１３への突然変異が生じており、好ましくは、前記突然変異したＬＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示される。
好ましい実施形態において、前記抗体ＨＣＤＲ２のＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、ＡＩＳＧまたはＩＦＮＰである。
好ましい実施形態において、前記抗体ＨＣＤＲ２には、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＧからＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｇへの突然変異が生じており、好ましくは、前記突然変異されたＨＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される。
好ましい実施形態において、前記抗体は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、および
（６）（１）～（５）のいずれか１項に記載の抗体と同じまたは類似の活性を有する（１）～（５）のいずれか１項に記載の抗体の変異体から選択される。
好ましい実施形態において、前記抗体は、
（１）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
（２）軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
（３）（１）に記載の抗体の重鎖可変領域および（２）に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、および
（４）（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体と同じまたは類似の活性を有する（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体の変異体から選択される。
好ましい実施形態において、前記抗体は、
（１）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
（２）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
（３）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
（４）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
（５）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有する抗体、および
（６）（１）～（５）のいずれか１項に記載の抗体と同じまたは類似の活性を有する（１）～（５）のいずれか１項に記載の抗体の変異体から選択される。
好ましい実施形態において、前記抗体の軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ３を有し、
好ましくは、前記軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有し、
より好ましくは、前記抗体の軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有し、前記抗体の重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、６７、６８または６９に示されるアミノ酸配列を有する。
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載の抗体と同じ抗原決定部位を識別する抗体を提供する。
好ましい実施形態において、本発明によって提供される第１の態様または第２の態様の抗体は、完全ヒト抗体である。
好ましい実施形態において、本発明によって提供される第１の態様または第２の態様の抗体は、完全抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
第３の態様において、本発明は、本発明の第１のまたは第２の態様に記載の抗体をコードする核酸を提供する。
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。
第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様に記載の発現ベクターを含むか、またはゲノムに本発明の第３の態様に記載の核酸が組み込まれた宿主細胞を提供する。
第６の態様において、本発明は、腫瘍を治療する薬物の調製、または腫瘍を診断する試薬の調製に使用される、本発明の第１の態様または第２の態様に記載の抗体の用途を提供する。
具体的な実施例において、前記腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫瘍または骨髄線維症である。
具体的な実施例において、前記腫瘍は、ＣＬＬ１陽性腫瘍である。
第７の態様において、本発明は、免疫コンジュゲートを提供し、前記免疫コンジュゲートは、
本発明の第１の態様または第２の態様に記載の抗体、および連結される機能性分子を含み、前記機能性分子は、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を阻害する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子、および検出可能なマーカーから選択される。
好ましい実施形態において、前記腫瘍を阻害する分子は、抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素であり、好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、Ｉ型インターフェロンおよびＴＮＦ－アルファーの一つまたは複数を含む。
好ましい実施形態において、前記免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は、免疫細胞の表面マーカーに結合する抗体またはリガンド（ｌｉｇａｎｄ）である。好ましくは、前記免疫細胞の表面マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ１６およびＣＤ２８の一つまたは複数を含み、より好ましくは、前記免疫細胞表面マーカーに結合する抗体は、抗ＣＤ３抗体である。
好ましい実施形態において、前記免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の表面マーカーに結合する抗体である。
第８の態様において、本発明は、本発明の第７の態様に記載の多機能性免疫コンジュゲートをコードする核酸を提供する。
第９の態様において、腫瘍を治療する薬物の調製、または腫瘍を診断する試薬の調製に使用される本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供する。
具体的な実施例において、前記腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫瘍または骨髄線維症である。
具体的な実施例において、前記腫瘍は、ＣＬＬ１陽性腫瘍である。
第１０の態様において、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナルドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、前記キメラ抗原受容体は、本発明の第１のまたは第２の態様に記載の抗体を含む。
好ましい実施形態において、前記抗体は、一本鎖抗体または単一ドメイン抗体である。
好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体の細胞内シグナルドメインは、一つまたは複数の共刺激シグナルドメインおよび／または一次シグナルドメイン。
好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ヒンジドメインをさらに含む。
好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体の膜貫通ドメインは、ＴＣＲのアルファー（ａｌｐｈａ）、ベータ（ｂｅｔａ）、ゼータ（ｚｅｔａ）鎖、ＣＤ３ε，ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５，ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４およびＰＤ１の分子の膜貫通領域の一つまたは複数から選択され、および／または
前記共刺激シグナルドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ２２３、ＣＤ２７０、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７８、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＦｃεＲＩγ、ＭｙＤ８８および４１ＢＢＬの分子の細胞内シグナル領域の一つまたは複数から選択され、および／または
前記一次シグナルドメインは、ＴＣＲξ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄおよびＣＤ３ζの分子の一次シグナルドメインの一つまたは複数から選択される。
好ましい具体的な実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α，ＣＤ４，ＣＤ４５，ＰＤ１，ＣＤ１５４およびＣＤ２８の分子の膜貫通領域の一つまたは複数から選択され、および／または
前記共刺激シグナルドメインは、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ２８およびＯＸ４０の分子の細胞内シグナル領域一つまたは複数から選択され、および／または
前記一次シグナルドメインは、ＣＤ３ζの一次シグナルドメインから選択される。
より好ましい具体的な実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８の膜貫通領域から選択され、前記共刺激シグナルドメインは、ＣＤ１３７またはＣＤ２８の細胞内シグナル領域から選択され、前記一次シグナルドメインは、ＣＤ３ζの一次シグナルドメインから選択される。
好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、
本発明の第１または第２の態様に記載の抗体、ＣＤ８の膜貫通領域およびＣＤ３ζの一次シグナルドメイン、
本発明の第１または第２の態様に記載の抗体、ＣＤ８の膜貫通領域、ＣＤ１３７の細胞内シグナルドメインおよびＣＤ３ζの一次シグナルドメイン、
本発明の第１または第２の態様に記載の抗体、ＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内シグナルドメインおよびＣＤ３ζの一次シグナルドメイン、または
本発明の第１または第２の態様に記載の抗体、ＣＤ２８の膜貫通領域、ＣＤ２８の細胞内シグナルドメイン、ＣＤ１３７の細胞内シグナル領域およびＣＤ３ζの一次シグナルドメインの順序で連結される抗体、膜貫通領域および細胞内シグナル領域を含む。
好ましい実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５または６６に示される配列を有する。
第１１の態様において、本発明は、本発明の第１０の態様に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を提供する。
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様に記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。
第１３の態様において、本発明は、ウイルスを提供し、前記ウイルスは、本発明の第１２の態様に記載のベクターを含む。
好ましい実施形態において、前記ウイルスは、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。
第１４の態様において、本発明は、腫瘍を治療する薬物の調製に使用される、本発明の第１０の態様に記載のキメラ抗原受容体、または本発明の第１１の態様に記載の核酸、または本発明の第１２の態様に記載の発現ベクター、または本発明の第１３の態様に記載のウイルスの用途を提供する。好ましくは、前記薬物は、遺伝子修飾された免疫細胞を含む薬物である。
好ましい実施形態において、具体的な実施例において、前記腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫瘍または骨髄線維症である。
好ましい実施形態において、前記腫瘍は、ＣＬＬ１陽性腫瘍である。
第１５の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様に記載の核酸、または本発明の第１２の態様に記載の発現ベクターまたは本発明の第１３の態様に記載のウイルスが形質導入されるか、または本発明の第１０の態様に記載のキメラ抗原受容体が発現される、遺伝子修飾された免疫細胞を提供する。
好ましい実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔリンパ球，ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞から選択されるのが好ましい。
好ましい実施形態において、前記遺伝子修飾された免疫細胞は、本発明の第１０の態様に記載のキメラ抗原受容体以外の第二の配列が発現され、前記第二の配列は、サイトカイン、または別のキメラ抗原受容体、またはケモカイン受容体、またはＰＤ－１発現を低下させるｓｉＲＮＡ、またはＰＤ－Ｌ１を遮断するタンパク質、またはＴＣＲ、または安全スイッチを含み、
好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１およびＩ型インターフェロンの一つまたは複数を含み、
好ましくは、前記ケモカイン受容体は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４の一つまたは複数を含み、
好ましくは、前記安全スイッチは、ｉＣａｓｐａｓｅ－９、トランケート（Ｔｒｕａｎｃａｔｅｄ）ＥＧＦＲおよびＲＱＲ８の一つまたは複数を含む。
第１６の態様において、本発明提は、本発明の第１５の態様に記載の免疫細胞の用途を提供し、前記遺伝子修飾された免疫細胞は、腫瘍を治療する薬物の調製に使用される。
好ましい実施形態において、前記腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫瘍または骨髄線維症である。
好ましい実施形態において、前記腫瘍は、ＣＬＬ１陽性腫瘍である。
第１７の態様において、本発明は、
本発明の第１のまたは第２の態様に記載の抗体または当該抗体コードする核酸、または
本発明の第７の態様に記載の免疫コンジュゲートまたは当該コンジュゲートをコードする核酸、または
本発明の第１５の態様に記載の遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
抗体４Ｆ２および２５Ｈ８のＥＬＩＳＡ測定結果を示す。 抗体４Ｆ２および２５Ｈ８のＢｉａｃｏｒｅ測定結果を示す。 ＦＡＣｓによって検出された抗体４Ｆ２および２５Ｈ８とＨＬ６０／Ｕ９３７細胞およびｋ５６２との結合状況を示す。 抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍのＥＬＩＳＡ測定結果を示す。 抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍのＢｉａｃｏｒｅ測定結果を示す。
ＦＡＣｓによって検出された抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍとＨＬ６０／Ｕ９３７細胞およびｋ５６２との結合状況を示す。 抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍとヒトＣＬＬ１とが結合するＥＬＩＳＡ測定結果を示す。 抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍのモノマー比の検出結果を示す。 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によって精製された抗ＣＬＬ１ ｓｃＦｖ＿Ｆｃ抗体（還元条件）を示す。
ＦＡＣｓによって検出されたＵ９３７細胞に結合する抗体７Ｆ８、１２Ｇ４ｍ、４Ｆ２および２５Ｈ８のＥＣ５０を示す。 ＦＡＣｓによって検出されたＣＬＬ１－ＣＡＲ ＴウイルスがＴリンパ球を感染する陽性率を示す。 本発明の抗体および先行技術の抗体のインビトロ殺傷毒性試験の結果を示す。 本発明の抗体のインビトロ殺傷毒性試験の結果を示す。
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究を通じて、特異性が高く、結合能力が良好な抗ＣＬＬ１抗体を開発した。これに基づいて、本発明を完了した。
本明細書で使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じまたは類似の意味を有する。本発明を容易に理解するために、いくつかの用語を次のように定義する。
本発明における「ＣＬＬ１」という用語は、ＩＩ型膜貫通タンパク質である「Ｃ型レクチン様分子－１（Ｃ－Ｔｙｐｅ Ｌｅｃｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１）」を指す。具体的な実施例において、ＣＬＬ１とは、ヒトＣＬＬ１を指す。
本明細書における「抗体」という用語は、免疫系の抗原結合タンパク質を指す。本明細書で言及された「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する完全な全長抗体およびその「抗原結合部分」または「抗原結合領域」に保持されたその任意のフラグメント、または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）等のその一本鎖を含む。天然抗体とは、ジスルフィド結合によって互いに結合される少なくとも二つの重鎖（Ｈ）および二つの軽鎖（Ｌ）、またはその抗原結合フラグメントを含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語は、原核細胞で発現される抗体、非グリコシル化抗体並びに抗原に結合する抗体フラグメントおよび以下に記載される等の、すべての組換え形態の抗体（特に、本明細書に記載の抗体）をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。ＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化されることができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在する。各ＶＨおよびＶＬは、三つのＣＤＲおよび四つのＦＲからなり、それらは、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原に相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、当該免疫グロブリンと宿主組織または因子との結合を仲介し、前記宿主組織または因子は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む。
抗体フラグメントは、（ｉ）Ｆａｂ’およびＦａｂ’－ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインで構成されるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインで構成されるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインで構成されるＦｖフラグメント、（ｉｖ）単一の可変領域で構成されるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）、（ｖ）連結された二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント等の、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｖｉ）一本鎖Ｆｖ分子抗原結合部位（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８５：５８７９５８８３）、（ｖｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、（ｖｉｉｉ）「ダイソーム」または「トリソーム」、遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性フラグメント（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１－４７９、ＷＯ９４／１３８０、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ９０：６４４４－６４４８）、および（ｉｘ）同じまたは異なる抗体と遺伝的に融合するｓｃＦｖ（Ｃｏｌｏｍａ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５、１５９１６３）を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「親抗体」または「親免疫グロブリン」という用語は、修飾されていない抗体を含み、前記抗体は、その後に修飾されて変異体を生成する。前記親抗体は、天然に存在する抗体、または天然に存在する抗体の変異体または操作されたバージョンであり得る。親抗体は、抗体自体、前記親抗体を含む組成物、またはそのコーディングアミノ酸配列を指すことができる。本明細書で使用される「親抗体」または「親免疫グロブリン」という用語は、その後に修飾されてヒト化抗体を生成するマウス抗体またはキメラ抗体を含む。
本明細書で使用される「変異体抗体」または「抗体変異体」という用語は、親と比較して少なくとも一つのアミノ酸が修飾されるため、親抗体配列とは異なる抗体配列を含む。本明細書の変異体抗体配列は、好ましくは、親抗体配列と少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％のアミノ酸配列相同性を有する。抗体変異体は、抗体本身、前記親抗体を含む組成物、またはそのコーディングアミノ酸配列を指すことができる。
本明細書で使用される「変異体」という用語は、親と比較して少なくとも一つのアミノ酸が修飾されるため、親抗体配列とは異なる抗体配列を含む。具体的な実施形態において、本明細書の変異体抗体配列は、親抗体配列と少なくとも約８０％、好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９７％、より好ましくは、なくとも約９８％、最も好ましくは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列相同性を有する。抗体変異体は、抗体自体、前記親抗体を含む組成物、または他のアミノ酸をコードする配列を含むことができる。「アミノ酸修飾」という用語は、アミノ酸置換、付加および／または欠失を含み、「アミノ酸置換」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを指す。例えば、置換Ｒ９４Ｋとは、９４番目のアルギニンのリジンによる置換を指し、本明細書で使用される「アミノ酸插入」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸の付加を指す。本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸の除去を指す。
本発明で論じられるすべての免疫グロブリン重鎖定常領域の位置は、カバット（Ｋａｂａｔ）のＥＵインデックスに従って番号が付けられる（カバットら、１９９１、免疫学的に関心のあるたんぱく質の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、米国公衆衛生局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、全文は、参照により統合される）。「カバットのＥＵインデックス」とは、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）６３：７８－８５に記載されるように、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
本明細書で使用される「抗原決定部位」という用語は、エピトープとも呼ばれ、ＣＬＬ１タンパク質配列の連続配列からなるか、またはＣＬＬ１タンパク質配列が連続していない３次元構造からなることができる。
「単一ドメイン抗体」という用語は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部を含むか、または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含む抗体フラグメントを指す。例えば、一つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）のみを含む。
「免疫エフェクター細胞」とも呼ばれる、「免疫細胞」という用語は、免疫応答に関与し、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラル殺傷（ＮＫ）細胞、ナチュラル殺傷Ｔ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、ＣＩＫ細胞、マクロファージ、マスト細胞等の、免疫効果を生成する細胞を指す。いくつかの実施形態において、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞、異種Ｔ細胞、同種異系Ｔ細胞であり得る。いくつかの実施形態において、前記ＮＫ細胞は、同種異系ＮＫ細胞であり得る。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、抗原に結合できる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナルを構造ドメインに伝達するポリペプチド（即ち、細胞内シグナルドメイン）を含むことを指し、細胞内シグナルドメインとは、特定のシグナル伝達経路を介して第二のメッセンジャーを生成することにより細胞活性を調節するために細胞に情報を伝達するタンパク質、または一次シグナルドメインを含む、以下に定義される刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン（即ち、共刺激シグナルドメイン）をさらに含むことができる、そのようなメッセンジャーに対応することによりエフェクターとして機能するタンパク質を指す。細胞内シグナルドメインは、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の免疫エフェクター機能を促進できるシグナルを生成し、ＣＡＲＴ細胞等の、免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性およびサイトカイン分泌を含む補助活性を含む。
「一次シグナルドメイン」という用語は、刺激的な方法でＴＣＲ複合体の初期活性化を調節する。一方では、一次シグナルドメインは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドをロードしたＭＨＣ分子の結合によって引き起こされることにより、Ｔ細胞反応（増殖、活性化、分化等を含むが、これらに限定されない）を仲介する。刺激的に作用する一次シグナルドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭのシグナル伝達モチーフを含むことができる。本発明において、特定に有用であるＩＴＡＭを含む一次シグナルドメインの例としては、ＴＣＲξ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」とも呼ばれる）およびＣＤ６６ｄに由来する配列を含むが、これらに限定されず、本発明のＣＡＲの特別なＣＡＲの特例において、本発明の任意の一つまたは複数のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ξの一次シグナルドメイン等の、細胞内シグナル伝達配列を含む。
「共刺激シグナルドメイン」という用語は、「共刺激分子」を指し、Ｔ細胞上の牽連する結合パートナーであり、共刺激リガンドに特異的に結合することにより、Ｔ細胞の共刺激反応を媒介し、例えば、増殖等を含むが、これらに限定されない。共刺激分子は、効果的な免疫反応に必要な、非抗原受容体の細胞表面分子またはそのリガンドである。共刺激分子は、ＭＨＣＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含むが、これらに限定されない。
本発明において、一態様において、ＣＡＲは、キメラ融合タンパク質を含み、前記タンパク質は、細胞外抗原識別ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、刺激分子に由来する機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一態様において、ＣＡＲは、キメラ融合タンパク質を含み、前記タンパク質は、細胞外抗原識別ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子に由来する機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一態様において、ＣＡＲは、キメラ融合タンパク質を含み、前記タンパク質は、細胞外抗原識別ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内伝達ドメインを含み、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも二つの機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ酸（ＮＤ末端）に任意のリーダー配列を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原識別ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、ここで、リーダー配列は、ＣＡＲの細胞加工および細胞膜への局在化の間に、選択的に抗原識別ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切り取られる。
本明細書における「ＣＤ３ξ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１によって提供されるタンパク質、またはマウス、げっ歯類、サルおよび類人猿等の非ヒト種に由来する同等の残基として定義される。「ＣＤ３ξドメイン」は、ξ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義され、Ｔ細胞の活性化に必要な初期シグナルを十分に機能的に伝達する。一態様において、ξの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、およびその機能的オルソゴルとして、マウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の、非ヒト種に由来する同等の残基を含む。
本明細書における「４－１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸配列、またはマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種に由来する同等の残基を有する、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸配列２１４－２５５、またはマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種に由来する同等の残基として定義される。一態様において、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で提供される配列、またはマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種に油愛する同等の残基である。
本明細書における「インターフェロン」という用語は、全長インターフェロン、または全長野生型インターフェロンの生物学的活性（例えば、全長の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、９８％または９９％を維持する）を基本的に維持するインターフェロンフラグメント（切り捨てられたインターフェロン）またはインターフェロン突然変異体を指す。インターフェロンは、Ｉ型インターフェロン（例えば、インターフェロンαおよびインターフェロンβ）およびＩＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）を含む。
場合によっては、「Ｔ細胞」は、胸腺で免疫学的活性を有する成熟Ｔ細胞に分化および成熟する、骨髄由来の多能性幹細胞であり得る。場合によっては、「Ｔ細胞」は、特定の表現型の特徴を有する細胞集団、または異なる表現型の特徴を有する混合細胞集団であり得、例えば、「Ｔ細胞」は、幹細胞様記憶性Ｔ細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ、Ｔｓｃｍ細胞）、中央記憶性Ｔ細胞（Ｔｃｍ）、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆ、Ｔｅｆｆ）、調節性Ｔ細胞（ｔｒｅｇｓ）および／またはエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）等の少なくとも一つのＴ細胞サブグループを含む細胞であり得る。場合によっては、「Ｔ細胞」は、γδＴ細胞等の、特定のサブタイプのＴ細胞であり得る。
Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織ならびに感染部位、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍に由来する組織等の多くの供給源から入手することができる。ある場合によっては、ＦｉｃｏｌｌＴＭ分離等の、当業者に知られている任意の数の技術を使用して、個体から収集された血液からＴ細胞を取得することができる。一実施形態において、個人の循環血液からの細胞は、単一の採決によって得られる。アフェレーシス製品は、一般にＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板等のリンパ球を含む。一実施形態において、アフェレーシス収集によって収集された細胞を洗浄して血漿分子を除去し、細胞を適切な緩衝液または培地に入れて、後続の処理段階に使用される。あるいは、癌と診断された患者からの健康なドナーに由来する細胞を誘導することができる。
本発明の抗体またはその変異体は、様々な標的化抗腫瘍および腫瘍を診断する薬物の調製、特にＣＬＬ１を標的とする免疫エフェクター細胞の調製に適用することができる。
抗ＣＬＬ１抗体
本発明において、抗体を含む、ｓｃＦｖベースの抗原結合領域を有する抗原結合タンパク質が記載されている。ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーからｓｃＦｖを選択する。これらの分子は、精密な特異性を示す。例えば、当該抗体は、ＨＬ６０およびＵ９３７細胞を安定的に識別することができるが、ｋ５６２細胞を識別しない。
いくつかの実施形態において、本発明は、ｓｃＦｖ配列を有する抗体を含み、前記ｓｃＦｖ配列は、一つまたは複数の重鎖定常領域と融合して、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を有する抗体を形成して、二価タンパク質を生成することにより、抗体の全体的な親和性および安定性を向上させる。さらに、Ｆｃ部分は、親和性測定、治療薬の標的送達、免疫エフェクター細胞を使用してＦｃによって媒介した細胞毒性および他の多くの応用に使用される抗体を固定するために、例えば、抗原定量化研究で使用される抗体と他の分子（蛍光染料、細胞毒素および放射性同位元素等）の直接結合を可能にする。
本明細書で提供される結果は、ＣＬＬ１を標的とする際の本発明の抗体の特異性、感度および有用性を強調する。
本発明の分子は、ファージディスプレイを使用して、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を同定および選択することに基づいて、前記一本鎖可変フラグメントのアミノ酸配列は、ＣＬＬ１に対する分子の特異性を与え、本発明のすべての抗原結合タンパク質の基礎を形成する。従って、前記ｓｃＦｖを使用して、全長抗体、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２等のそのフラグメント、融合タンパク質（ｓｃＦｖ＿Ｆｃを含む）、多価抗体、即ち、同じ抗原または異なる抗原に対して一つ以上の特異性を有する抗体、例えば、二重特異性Ｔ細胞結合抗体（ＢｉＴＥ）、トリア抗体（Ｃｕｅｓｔａら、多価抗体：設計が進化をこう得る場合（Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｗｈｅｎ ｄｅｓｉｇｎ ｓｕｒｐａｓｓｅｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：３５５－３６２、２０１０）等の、一連の異なる「抗体」分子を設計することができる。
抗原結合タンパク質が全長抗体である実施形態において、本発明の抗体の重鎖および軽鎖は、全長（例えば、抗体は、少なくとも一つ、好ましくは、二つの完全な重鎖、および少なくとも一つ、好ましくは、二つの完全な掲載を含むことができる）であるか、または抗原結合部分（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ）を含むことができる。他の実施形態において、抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥから選択される。抗体タイプの選択は、設計された抗体によって引き起こされる免疫エフェクター細胞に依存する。組換え免疫グロブリンを構築する場合、様々な免疫グロブリンのアイソタイプの定常領域の適切なアミノ酸配列および多種多様な抗体を生成するための方法が当業者に知られている。
第１の態様において、本発明は、ＣＬＬ１に結合する抗体またはそのフラグメントを提供し、前記抗体は、
ＳＹＸ１ＭＸ２に示されるＨＣＤＲ１、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｇに示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０または４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１２ＬＸ１３に示されるＬＣＤＲ１、Ｘ１４ＡＳＸ１５ＬＸ１６Ｓに示されるＬＣＤＲ２、およびＱＱＸ１７ＹＳＸ１８ＰＸ１９Ｘ２０Ｔに示されるＬＣＤＲ３を有し、ここで、前記Ｘ１は、ＡまたはＹから選択され、Ｘ２は、ＳまたはＨから選択され、Ｘ３は、ＡまたはＩであり、Ｘ４は、ＩまたはＦから選択され、Ｘ５は、ＳまたはＮから選択され、Ｘ６は、ＧまたはＰから選択され、Ｘ７は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ８は、ＤまたはＱから選択され、Ｘ９は、ＳまたはＫから選択され、Ｘ１０は、ＶまたはＦから選択され、Ｘ１１は、ＫまたはＱから選択され、Ｘ１２は、ＷまたはＹから選択され、Ｘ１３は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ１４は、ＤまたはＶから選択され、Ｘ１５は、ＮまたはＳから選択され、Ｘ１６は、ＥまたはＱから選択され、Ｘ１７は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ１８は、ＹまたはＴから選択され、Ｘ１９は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ２０は、Ｉから選択されるか、または存在しない。
好ましい実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５および３６の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８および３９の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０および４１の任意のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ３を含む。別の態様において、本発明は、ＣＬＬ１に結合する抗体またはそのフラグメントを提供し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３および４４の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６、４７および４８の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および５０の任意のアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ３を含む。別の態様において、本発明は、ＣＬＬ１に結合する抗体またはそのフラグメントを提供し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５および３６任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８および３９の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０および４１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３および４４の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６、４７および４８の任意のアミノ酸配列的軽鎖ＣＤＲ２、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および５０の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。好ましくは、前記ＣＬＬ１に結合する抗体またはそのフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５および３６の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８および３９の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３および４４の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６、４７および４８の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および５０の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。より好ましくは、前記ＣＬＬ１に結合する抗体またはそのフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５および３６の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８および３９の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０および４１の任意のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３および４４の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６、４７および４８の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９および５０の任意のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
別の態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、５、１３、６７、６８および６９から選択される重鎖可変領域配列を含む、ＣＬＬ１に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。
別の態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、７、１１および１５から選択される軽鎖可変領域配列を含む、ＣＬＬ１に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。
これらの重鎖および軽鎖可変領域配列がそれぞれＣＬＬ１に結合することができることを考慮すると、重鎖および軽鎖可変領域配列を「混合およびマッチング」させて、本発明の抗ＣＬＬ１結合分子を生成することができる。
別の態様において、本発明は、ＣＬＬ１に結合する抗体またはそのフラグメントの変異体を提供する。従って、本発明は、重鎖または軽鎖の可変領域配列と少なくとも８０％同一である重鎖および／または軽鎖可変領域を有する、抗体またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、重鎖および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列の相同性は、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、特に９６％、より特に、９７％、さらにより特に、９８％、最も特に、９９％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％を含む。変異体は、本発明に記載の抗体を親抗体として使用して、酵母ライブラリースクリーニング、ファージライブラリースクリーニング、および点突然変異等の方法によって得られることができる。
別の態様において、本発明によって提供される抗体ＬＣＤＲ１には、ＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１２ＬＸ１３からＲＡＳＱＷＩＡＲＸ１２ＬＸ１３への突然変異が生じており、例えば、突然変異したＬＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示される。
別の態様において、本発明によって提供される抗体ＨＣＤＲ２「Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｇ」のＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、ＡＩＳＧまたはＩＦＮＰから選択される。
別の態様において、前記抗体ＨＣＤＲ２には、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＧからＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｇへの突然変異が生じており、例えば、突然変異されたＨＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される。
別の態様において、本発明の抗体の重鎖可変領域に対して、突然変異させることができ、例えば、重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、６８または６９に突然変異する。
別の態様において、本発明は、前述の抗ＣＬＬ１抗体と同じ抗原決定部位を識別する抗体を提供する。
抗ＣＬＬ１抗体特性
例えば、抗ＣＬＬ１抗体の結合能力等の抗体を評価する標準的な測定は、当技術分野で知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ｂｉａｃｏｒｅ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットおよびフローサイトメトリー分析を含む。適切な測定は、実施例に詳細に記載されている。
核酸、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、ＣＬＬ１に結合する抗体およびそのフラグメントをコードする単離された核酸、ベクターおよび前記核酸またはベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。核酸は、無傷の細胞、細胞溶解液、または部分的に精製されたか、または実質的に精製された形態の中に位置することができる。
標準的な分子生物学技術を使用して、本発明の核酸得ることができ、例えば、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術を使用して、抗体をコードする軽鎖および重鎖またはＶＨおよびＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡを得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ技術を使用する）から得られた抗体については、抗体をコードする一つまたは複数の核酸をライブラリーから回収することができる。外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で一般に知られており、使用される宿主細胞によって異なることができる。
好ましい本発明の核酸分子は、重鎖可変領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、６および１４から選択されるものであるか、および／または軽鎖可変領域をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、８、１２および１６から選択されるものである。より好ましいののような核酸分子は、重鎖をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列、軽鎖をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４配列または重鎖をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６配列、軽鎖をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８配列または重鎖をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列、軽鎖をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２配列または重鎖をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４配列、軽鎖をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６配列を含む。
タンパク質を発現させるために、本発明の抗体をコードする核酸を発現ベクターに組み込まれることができる。様々な発現ベクターは、タンパク質の発現に使用されることができる。発現ベクターは、自己複製する染色インビトロベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターを含むことができる。本発明で使用される発現ベクターは、タンパク質が哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母およびインビトロシステムで発現させることを可能にするものを含むが、これらに限定されない。当技術分野で知られているように、様々な発現ベクターは、市販または他の方法で得ることができる。本発明では、抗体を発現させるために使用することができる。
免疫コンジュゲート
本発明は、本明細書に記載の抗体を含み、少なくとも一つの他のタイプの機能性分子をさらに含む、多機能性免疫コンジュゲートを提供する。前記機能性分子は、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を阻害する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子または検出可能なマーカーから選択されるが、これらに限定されない。前記抗体と前記機能性分子とは、共有結合、カップリング、付着、架橋等の方法によってコンジュゲートを形成することができる。
好ましい方法として、前記免疫コンジュゲートは、本発明の抗体、および少なくとも一つの腫瘍表面マーカーを標的とする分子または腫瘍を阻害する分子を含むことができる。前記腫瘍を阻害する分子は、抗腫瘍サイトカイン、または抗腫瘍毒素であり得、好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、Ｉ型ＩＦＮ、およびＴＮＦ－アルファーを含む（これらに限定されない）。具体的な実施形態において、前記腫瘍表面マーカーを標的とする分子は、本発明の抗体が標的とする同じ腫瘍の表面マーカーを標的とする分子である。例えば、前記腫瘍表面マーカーを標的とする分子は、腫瘍表面マーカーに結合する抗体またはリガンドであり得、例えば、本発明の抗体と相乗的に作用して、腫瘍細胞をより正確に標的化することができる。
好ましい方法として、前記免疫コンジュゲートは、本発明の抗体および検出可能なマーカーを含むことができる。前記検出可能なマーカーは、例えば、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、陽電子放出金属および非放射性常磁性金属イオン等の、蛍光マーカーおよび発色マーカーを含むが、これらに限定されない。一つ以上のマーカーを含むこともできる。検出および／または分析および／または診断の目的のために、抗体を標識するための標識は、例えば、免疫組織化学染色（組織）サンプル、フローサイトメトリー等の、使用される特定の検出／分析／診断技術および／または方法に依存する。当業者は、当技術分野で知られている検出／分析／診断技術および／または方法に適した標識がよく知られている。
好ましい方法として、前記免疫コンジュゲートは、本発明の抗体および免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子を含むことができる。前記免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は、免疫細胞を識別することができ、本発明の抗体を保有して免疫細胞に運び、同時に本発明の抗体が免疫細胞を腫瘍細胞に標的させることができることにより、免疫細胞が腫瘍を特異的に殺傷するようにする、免疫細胞の表面マーカーに結合する抗体またはリガンドであり得る。前記免疫細胞の表面マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ１６およびＣＤ２８から選択されることができ、より好ましくは、免疫細胞の表面マーカーに結合する抗体は、抗ＣＤ３抗体である。免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞から選択されることができる。
直接または間接（例えば、リンカーを介して）のコンジュゲーションによって免疫コンジュゲートを化学的に生成する方法として、前記免疫コンジュゲートは、融合タンパク質として生成されることができ、前記融合タンパク質は、本発明の抗体および他の適切なタンパク質を含む。融合タンパク質は、当技術分野で知られている方法によって精製することができ、例えば、核酸分子を構築し、次に前記核酸分子を発現させることにより組換えて生成し、前記核酸分子は、フレームに適合する、抗体をコードするヌクレオチド配列および適切な標識をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明の別の態様は、本発明の少なくとも一つの抗体、その機能的変異体または免疫コンジュゲートをコードする核酸分子を提供する。関連する配列が得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。これは、それをベクターにクローニングし、細胞に移し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することにより得られる。
本発明は、上記の適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように、適切な宿主細胞の形質転換に使用されることができる。宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞、または哺乳動物細胞等の高等真核細胞であり得る。
抗ＣＬＬ１抗体を含むキメラ抗原受容体
本発明は、本発明の抗体または抗体フラグメントを含む様々なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、当該ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗腫瘍特性を示す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするウイルスベクターは、細胞（例えば、Ｔ細胞）の形質導入のために使用される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＡＲを安定的に発現することができる。
好ましい例において、ＣＡＲのＣＬＬ１結合部分は、ｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、由来するＩｇＧ抗体と比較して、同等の親和性結合を維持し、例えば、相当な効果で同じ抗原に結合する。当該抗体フラグメントは、機能的であり、それにより、免疫反応の活性化、標的抗原からのシグナル伝達の開始の阻害、キナーゼ活性の阻害等の生化学的反応を提供する。従って、本発明は、Ｔ細胞に操作される、ＷＴ１結合ドメインを含むＣＬＬ１－ＣＡＲ、および養子免疫療法に使用される方法を提供する。
一態様において、ＣＡＲの抗ＣＬＬ１抗原結合ドメインは、由来するマウス配列ｓｃＦｖと比較したヒト化ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
一態様において、本発明のＣＡＲは、特定の抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子とを組み合わせる。例えば、いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ξ鎖、４－１ＢＢならびにＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
一態様において、ＣＬＬ１－ＣＡＲは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ξシグナルドメイン、およびそれらの任意の組み合わせを選択する、少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一態様において、ＣＬＬ１－ＣＡＲは、一つまたは複数の非ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）またはＣＤ２８の共刺激分子に由来する、少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一例としては、ＣＬＬ１－ＣＡＲの配列は、４Ｆ２ ２８Ｚ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）、４Ｆ２ ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）、４Ｆ２ ２８ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、２５Ｈ８ ２８Ｚ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）、２５Ｈ８ ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）、２５Ｈ８ ２８ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、７Ｆ８ ２８Ｚ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、７Ｆ８ ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）、７Ｆ８ ２８ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、１２Ｇ４ｍ ２８Ｚ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、１２Ｇ４ｍ ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、１２Ｇ４ｍ ２８ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）２８Ｚ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、および１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）２８ＢＢＺ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）であり得、前述ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５－６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－１０の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、当業者によって従来の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで置き換えることができ、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
キメラ抗原受容体修飾されたＴ細胞
本発明は、本発明に記載のキメラ抗原受容体を含む免疫細胞を提供する。
別の態様において、本発明によって提供されるキメラ抗原受容体修飾されたＴ細胞は、外因性サイトカインのコード配列を保有し、好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１を含む。前記免疫細胞は、好ましくは、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞から選択される。
一方、本発明によって提供されるキメラ抗原受容体修飾されたＴ細胞は、例えば、天然ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１に結合できる突然変異ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１に結合できる天然または突然変異ＰＤ－１のフラグメント、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体等の、ＰＤ－Ｌ１ブロッカーまたはＰＤ－Ｌ１を遮断するタンパク質を保有する。
医薬組成物
本発明の抗体、当該抗体を含む免疫コンジュゲートおよび遺伝子修飾された免疫細胞は、医薬組成物または診断試薬の調製に適用することができる。前記組成物は、有効量の前記抗体、免疫コンジュゲートまたは免疫細胞を含むことに加えて、薬学的に許容されるベクターをさらに含むことができる。「薬学的に許容される」という用語は、分子実体および組成物が動物またはヒトに適切に投与された場合、有害、アレルギーまたは他の有害反応を引き起こさないことを指す。
薬学的に許容されるベクターまたはその成分として使用できるいくつかの物質の具体的な例としては、例えば、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）およびスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）等の糖（ｓｕｇａｒｓ）、例えば、トウモロコシデンプン（ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ）および馬鈴薯デンプン（ｐｏｔａｔｏ ｓｔａｒｃｈ）等のデンプン（ｓｔａｒｃｈｅｓ）、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、エチルセルロース（ｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）およびメチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）等のセルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）およびその誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、トラガカント粉末（Ｔｒａｇａｃａｎｔ Ｇｕｍ ｐｏｗｄｅｒ）、モルト（ｍａｌｔ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、タルク（ｔａｌｃ）、例えば、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）およびステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）等の固体潤滑剤（ｓｏｌｉｄ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ）、硫酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）、例えば、ピーナッツ油（ｐｅａｎｕｔ ｏｉｌ）、綿実油（ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ ｏｉｌ）、ゴマ油（ｓｅｓａｍｅ ｏｉｌ）、オリーブ油（ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）、トウモロコシ油（ｃｏｒｎ ｏｉｌ）およびカカオバター（ｃｏｃｏａ ｂｕｔｔｅｒ）等の植物油（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌｓ）、例えば、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、グリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）およびポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）等のポリオール（ｐｏｌｙｏｌｓ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）等の乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ）、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）等の湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、着色剤（ｃｏｌｏｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、香味剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、錠剤（ｔａｂｌｅｔｉｎｇ）、安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）、酸化防止剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、防腐剤（Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）、パイロジェンフリー水（ｐｙｒｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）、等張塩溶液（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、およびリン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）等である
本発明の組成物は、必要に応じて、様残な剤形にすることができ、医師は、患者のタイプ、年齢、体重、一般的な病状、および投与方法等の要因に従って、患者にとって有益な剤形を決定することができる。投与方法は、たとえば、注射または他の治療方法であり得る。
本発明の利点は、次のとおりである。
１．本発明は、ＣＬＬ１に対する特異的抗体を提供する。
２．本発明の抗体は、ＣＬＬ１に対して、より高い親和性を有し、キメラ抗原受容体修飾されたＴ細胞に調製された後、ＣＬＬ１を発現する細胞に対して、明らかな殺傷効果を有する。
３．本発明は、前記抗体を用いて調製したキメラ抗原受容体修飾されたＴ細胞を提供し、従って、本発明の抗体および免疫エフェクター細胞は、急性骨髄性白血病の治療に安全かつ効果的に適用することができる。
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、第３版、科学出版社、２００２に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。
実施例１：完全ヒトファージディスプレイライブラリーを使用したＣＬＬ１に特異的なｓｃＦｖのスクリーニング
本発明で使用されるファージディスプレイライブラリーは、本社によって構築された完全ヒト天然のｓｃＦｖファージライブラリーであり、貯蔵体積は、１Ｅ＋１１である。当業者に知られたいるスクリーニング方法を使用して、ＣＬＬ１に非常に特異的なｓｃＦｖフラグメントを得る。要するに、１０ｕｇ／ｍｌの抗原ＣＬＬ１－ｈｕＦｃ（真核生物発現後に、プロテイン（ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａフィラーを使用した培養上清の親和性精製によって調製される）およびヒトＦｃセグメントをそれぞれ免疫チューブでコーティングする。Ｆｃセグメントの影響を減少させるために、ファージライブラリーをヒトＦｃセグメントでコーティングされた免疫チューブに加え、１時間結合させる。上清を取り、ＣＬＬ１－ｈｕＦｃでコーティングされた免疫チューブに加えて、１．５時間結合させた後、非特異的ファージを洗い流し、結合したファージを溶出し、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染する。増殖したファージを培養物から溶出し、増殖したファージライブラリーを次のスクリーニングのためにＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿によって精製する。パニングは、ＣＬＬ１特異的に結合するｓｃＦｖファージクローンを濃縮するために３～４サイクル実行される。ＣＬＬ１－ｈｕＦｃの標準的なＥＬＩＳＡ法によって陽性クローンを決定し、ＥＬＩＳＡ検出マップは、図１に示される。ＥＬＩＳＡは、抗体の特異性を検証するために、無関係な抗原としてヒトＦｃセグメントを使用する。
スクリーニングした後、二つの特異的に結合するＨＬ６０およびＵ９３７細胞（ＨＬ６０／Ｕ９３７は、ＣＬＬ１陽性細胞であり、ｋ５６２は、ＣＬＬ１陰性細胞である）（図３）を得、クローン名は、４Ｆ２および２５Ｈ８であり、４Ｆ２および２５Ｈ８のＢｉａｃｏｒｅマップは、図２に示される。シーケンシング分析後、４Ｆ２の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列であり、２５Ｈ８の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列である。
カバット（Ｋａｂａｔ）のＥＵインデックス分析によると、４Ｆ２のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示され、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示される。
２５Ｈ８のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示され、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示される。
実施例２：抗体の親和性成熟
ファージディスプレイ技術を使用して、親和性成熟を行う。
親抗体として４Ｆ２および２５Ｈ８を使用して、それぞれ軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２に対して、ランダムの突然変異を加え、親和性が成熟したファージライブラリーを構築する。２ラウンドのスクリーニングの後、ＥＬＩＳＡ検出のために単一クローンを選択し、陽性クローンをシーケンシングし、発現させ、精製し、上記の実験を要約すると、７Ｆ８（４Ｆ２から由来する）および１２Ｇ４（２５Ｈ８から由来する）という名称のヒトＣＬＬ１に高い親和性と特異的結合を有する合計二つの抗体を得る。
シーケンシング後、７Ｆ８の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列であり、１２Ｇ４の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列である。
７Ｆ８のＬＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示され、ＬＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示され、ＬＣＤＲ３および重鎖のＣＤＲ領域の配列は、親抗体（４Ｆ２）と一致する。
１２Ｇ４のＬＣＤＲ１の配列は、２５Ｈ８の配列と同じであり、ＬＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示され、ＬＣＤＲ３および重鎖のＣＤＲ領域の配列は、親抗体（２５Ｈ８）と一致する。
ここで、１２Ｇ４は、重鎖のＣＤＲ２領域に一つのグリコシル化部位を含み、ここで、セリンをグリシンに突然変異させた後、１２Ｇ４ｍという名称の新しい抗体を得、１２Ｇ４ｍのＨＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される。
１２Ｇ４ｍの重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列である。
ＥＬＩＳＡによって、７Ｆ８および１２Ｇ４ｍのｓｃＦＶとヒトＣＬＬ１との結合状況を検出し、有意な結合（図４を参照）を示す。
７Ｆ８および１２Ｇ４ｍのｓｃＦｖをＢｉａｃｏｒｅによって検出し、結果は、図５に示され、結果は、親和性が親抗体の親和性の約１０倍向上させたことを示す。
ＥＬＩＳＡは、無関係な抗原としてヒトＦｃセグメントを使用して、抗体の特異性を検証する。抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍのｓｃＦｖとＣＬＬ１発現陽性細胞との特異的結合を図６に示され、図から、抗体は、陽性細胞に特異的に結合できるが、陰性細胞に結合できないことが分かる（ＨＬ６０およびＵ９３７は、ＣＬＬ１発現陽性細胞であり、ｋ５６２は、ＣＬＬ１非発現陰性細胞である）。
実施例３：ＥＬＩＳＡによる７Ｆ８および１２Ｇ４ｍ抗体と異なる種のＣＬＬ１との結合の検出
標準的なＥＬＩＳＡによって、抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍの種の特異性を検出する。ヒトＣＬＬ１－ｈＦｃ、マウスＣＬＬ１－ｈＦｃ、サルＣＬＬ１－ｈＦｃを４℃下でＥＬＩＳＡプレートに１ｕｇ／ｍｌで一晩コーティングし、室温下で２％ＭＰＢＳで１～２時間ブロックし、２００ｎＭの抗体７Ｆ８／１２Ｇ４ｍ（ｓｃＦｖ）を加えて、室温下で１時間インキュベートし、二次抗体を抗Ｈｉｓマウスモノクローナル抗体で１：１０００に希釈し、三次抗体をヤギ抗マウス－ＨＲＰで１：２０００に希釈し、室温下で１時間インキュベートした後発色し、１Ｍ濃硫酸を停止した後にＯＤ４５０を読み取り、図７に示される。抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍは、ヒトＣＬＬ１にのみ結合し、マウスＣＬＬ１およびサルＣＬＬ１には結合しない。
実施例４：ＣＬＬ１抗体ｓｃＦｖ－Ｆｃ形態の構築およびそのモノマー比の検出
抗ＣＬＬ１抗体７Ｆ８および１２Ｇ４ｍとヒトＩｇＧのＦｃセグメントとを融合発現し、２９３Ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬で２９３Ｆ細胞をトランスフェクトし、６日目に上清を収集し、プロテインＡフィラーを使用してアフィニティー精製し、精製した後タンパク質をＧＥ ＸＫ１６／４０空クロマトグラフィーカラムに通し、モノマーピークを収集し、モノマー比を検出し、ここで、抗体７Ｆ８のモノマー比は、９９．３０％であり、抗体１２Ｇ４ｍのモノマー比は、５８．５０％であり、結果は、図８に示される。
抗体７Ｆ８タンパク質をカットオフフローが１０ＫＤであるミリポア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）限外ろ過チューブで濃縮し、ＯＤ２８０／吸光係数で濃度を敷く停止、結果は、表１に示され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプリングして実行し、結果は、図９に示される。
表１
Figure 2022505921000002
１２Ｇ４ｍに対して、分解および重合改造を行う。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを介して、１２Ｇ４ｍの３Ｄモデルを確立し、潜在的な凝集部位を分析し、ソフトウェア予測を通じて、これらの部位に対して点突然変異を行い、突然変異後の抗体をｓｃＦｖ－Ｆｃ形態でヒトＩｇＧのＦｃセグメントと融合させ、２９３Ｆ細胞を介して発現させ、発現生成物を生成した後、ＳＥＣによりモノマー比を検出し、結果によると、それぞれ、重鎖可変領域の９番目のアラニンのプロリン（１２Ｇ４ｍ－Ａ９Ｐ）への突然変異、９３番目のバリンのイソロイシン（１２Ｇ４ｍ－Ｖ９３Ｉ）への突然変異、１１３番目のメチオニンのロイシン（１２Ｇ４ｍ－Ｍ１３３Ｉ）への突然変異等の三つのモノマー比が１２Ｇ４ｍよりも明らかに優れた突然変異体を得、ここで、１２Ｇ４ｍ－Ｍ１３３Ｉのモノマー比は、９５％以上に達することを示す。
１２Ｇ４ｍ－Ａ９Ｐ、１２Ｇ４ｍ－Ｖ９３Ｉおよび１２Ｇ４ｍ－Ｍ１３３Ｉの突然変異部位は、すべて重鎖可変領域に存在し、その重鎖可変領域の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、６８および６９に示される。
１２Ｇ４ｍ－Ａ９ＰのｓｃＦｖ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０に示され、１２Ｇ４ｍ－Ｖ９３ＩのｓｃＦｖ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示され、１２Ｇ４ｍ－Ｍ１３３ＩのｓｃＦｖ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に示される。
実施例５：ＦＡＣｓを使用した抗体とＵ９３７細胞との結合ＥＣ５０の測定
実施例４で得られたｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を使用して、ＦＡＣｓによって抗ＣＬＬ１抗体のＥＣ５０を検出し、具体的な手順は次のとおりである。Ｕ９３７細胞を９６ウェルＵ型底板に１×１０５細胞／ウェルで加え、４℃下でＦｃＲブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）試薬で３０分間密閉し、３００ｕＬ／ウェルの１％ ＦＢＳで細胞を２回洗浄し、次に、勾配希釈した１００μＬのＣＬＬ１抗体７Ｆ８、１２Ｇ４ｍ、４Ｆ２および２５Ｈ８（１０００ｎｍｏｌ／ｍＬを開始濃度として、５倍希釈、７つの濃度勾配）を加え、混合した後、４℃下で４５分間インキュベートし、遠心分離して上清を除去し、３００ｕＬ／ウェルの１％ＦＢＳで細胞を２回洗浄する。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ）Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、コード番号（Ｃｏｄｅ ｎｕｍｂｅｒ）：１０９－０９５－０９８）を１％ＦＢＳで２００倍に希釈し、細胞に添加し、４℃下で４５分間インキュベートした後、遠心分離して、上清液を除去し、３００μＬ／ウェルの１％ＦＢＳで細胞を２回洗浄する。最後に、細胞を２００μＬ／ウェルの１％ＦＢＳで再懸濁し、フローサイトメトリーによって検出する。図１０に示されるように、抗ヒトＣＬＬ１抗体７Ｆ８、１２Ｇ４ｍ、４Ｆ２および２５Ｈ８のＥＣ５０値は、それぞれ０．０６４７４ｎＭ、０．４２７１ｎＭ、０．７３７０ｎＭおよび０．１６３８ｎＭであり、そのＥＣ５０値は、すべて１ｎＭよりも小さく、良好な細胞殺傷効果を示す。
実施例６：抗ＣＬＬ１キメラ抗原受容体プラスミド（ＣＡＲ）の構築
ａ．抗ＣＬＬ１抗体７Ｆ８キメラ抗原受容体プラスミドの構築
ＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α（Ａｄｄｇｅｎｅから購入する）をベクターとして使用して、ＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－７Ｆ８－２８Ｚ、ＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－７Ｆ８－ＢＢＺおよびＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－７Ｆ８－２８ＢＢＺを含む、抗体７Ｆ８の第２世代キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスプラスミドを構築する。
７Ｆ８－２８Ｚ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、７Ｆ８ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ＣＤ８ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＣＤ２８膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）ならびにＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなり、７Ｆ８－ＢＢＺ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、７Ｆ８ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ＣＤ８ヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）および膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）ならびにＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなり、７Ｆ８－２８ＢＢＺ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、７Ｆ８ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ＣＤ８ヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＣＤ２８膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）ならびにＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなる。
ｂ．抗ＣＬＬ１抗体１２Ｇ４ｍキメラ抗原受容体プラスミドの構築
ＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１αをベクターとして使用して、ＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－１２Ｇ４ｍ－２８Ｚ、ＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺおよびＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－１２Ｇ４ｍ－２８ＢＢＺを含む、抗体１２Ｇ４ｍの第２世代キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスプラスミドを構築する。
１２Ｇ４ｍ－２８Ｚ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、１２Ｇ４ｍ ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ＣＤ８ヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＣＤ２８膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）ならびにＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなり、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、１２Ｇ４ｍ ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ＣＤ８ヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）および膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）ならびにＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなり、１２Ｇ４ｍ－２８ＢＢＺ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、１２Ｇ４ｍ ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ＣＤ８ヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）およびＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなる。
ｃ．抗ＣＬＬ１抗体１２Ｇ４ｍ－Ｍ１３３１（本明細書において、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）とも表記される）キメラ抗原受容体プラスミドの構築
ＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１αをベクターとして使用して、ＰＲＲＬＳＩＮ－ｃＰＰＴ．ＥＦ－１α－１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－ＢＢＺであり、抗体１２Ｇ４ｍ－Ｍ１３３１の第２世代キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスプラスミドを構築する。１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－２８Ｚ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）、ＣＤ８ヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＣＤ２８膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）ならびにＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなり、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－ＢＢＺ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）、ＣＤ８ヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）および膜貫通領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）ならびにＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなり、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－２８ＢＢＺ配列は、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）ｓｃＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）、ＣＤ８ヒンジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）およびＣＤ３ξ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）からなる。
実施例７：ＣＬＬ１特異的ＣＡＲウイルスパッケージングおよびＣＡＲ Ｔ感染の陽性率の検出
まず、リン酸カルシウム法でレンチウイルスをパッケージングし、ウイルス上清をＰＥＧ８０００／ＮａＣｌによって精製し、精製した後、ＦＡＣＳ法でウイルスを滴下検出し、フローサイトメトリーの検出結果によると、７Ｆ８－ＣＡＲＴ、１２Ｇ４ｍ－ＣＡＲＴおよび１２Ｇ４ｍ－Ｍ１３３１ＣＡＲＴウイルス力価は、それぞれ２．３７Ｅ＋０８、１．４１Ｅ＋０８および７．９９Ｅ＋０７である。
次に、ウイルスを使用して、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズによって４８時間活性化した後のＴ細胞に感染し，ウイルス体積（ｍＬ）＝細胞数ｘＭＯＩ値（ＭＯＩ＝１０）／力価を加え、７Ｆ８－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔ、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔおよび１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－ＢＢＺ －ＣＡＲＴの細胞を得、ＦＡＣＳ法を使用して、感染した後９日目のＣＡＲ発現の陽性率を検出し、結果は、図１１に示され、７Ｆ８－ＢＢＺ ＣＡＲ ＴのＣＡＲ陽性率は、４１．９４％であり、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲ ＴのＣＡＲ陽性率は、６０．１４％であり、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－ＢＢＺ ＣＡＲ ＴのＣＡＲ陽性率は、５５．６４％である。
実施例８：ＣＬＬ１を標的とする陽性細胞のインビトロ殺傷毒性の検出
従来技術で報告された抗体抗体Ｍ２６（ＣＮ１０４７３６５６２Ｂ）を陽性対照として選択し、従来の方法を使用して、Ｍ２６－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔを調製する。ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性検出キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）会社）を使用する。具体的な方法は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性検出キットの説明書を参照する。
エフェクター細胞：３：１、１：１、１：３および１：９のエフェクター標的比に従って、それぞれ９６ウェルプレートに非形質導入（Ｕｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ、ＵＴＤ）Ｔ細胞、７Ｆ８－ＢＢＺ ＣＡＲＴ細胞、および１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲＴ細胞を接種する。
標的細胞：５０μＬの２×１０５／ｍＬのＣＬＬ１発現陽性のＨＬ－６０およびＵ９３７細胞ならびにＣＬＬ１発現陰性のＫ５６２細胞をそれぞれ対応する９６ウェルプレートに接種する。
実験結果は、図１２に示され、対照グループＵＴＤと比較して、本発明の７Ｆ８－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔ、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔは、ＣＬＬ１発現陽性のＨＬ－６０およびＵ９３７細胞に対して、エフェクター標的比が３：１、１：１および１：３である場合、すべて有意な毒性殺傷効果を有するが、ＣＬＬ１発現陰性のＫ５６２細胞に対して、殺傷効果がほとんどない。さらに、ＣＬＬ１発現陽性のＨＬ－６０およびＵ９３７細胞に対して、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔは、すべて従来技術Ｍ２６－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔよりもより優れた殺傷効果を示すが、７Ｆ８－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔは、ＨＬ－６０に対する殺傷効果もＭ２６－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔよりも優れる。
実施例９：マウスにおけるインビボ細胞殺傷実験
１）実験のグループ分け：６～８週齢の雌ＮＰＧマウスを６匹ずつランダムに四つのグループに分け、それぞれ、非形質導入Ｔ（ＵＴＤ）、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲＴグループ（１．０×１０６／匹マウス）、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲＴグループ（２．０×１０６／匹マウス）、および１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲＴ（４．０×１０６／匹マウス）細胞治療グループである。
２）皮下移植腫瘍の接種：対数増殖期および良好な増殖状態のＨＬ－６０細胞を収集し、細胞密度を１．５×１０７／ｍＬに調整し、ＮＰＧマウスの右腋窩の皮下部位に２００μＬの細胞懸濁液、即ち、各マウスに３．０×１０６の腫瘍細胞を接種し、接種日記を０日目として記録する。
３）ＣＡＲ－Ｔ細胞の再注入：腫瘍の平均体積が約１２２ｍｍ３である場合、即ち、腫瘍接種後８日目に、対応する数の１２Ｇ４ｍ ＢＢＺ細胞または非形質導入Ｔ細胞対照を注入する。結果によると、ＣＡＲ Ｔ注射した１４日後、ＵＴＤ対照グループと比較して、各グループがすべて明らかな抗腫瘍効果を示し、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ細胞濃度が２．０×１０６である場合、腫瘍阻害率は、５７．３５％であり、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ細胞濃度が４．０×１０６である場合、腫瘍阻害率は、７２．８９％である。同時に、マウスの体重は、ＵＴＤ対照グループと比較して、有意な変化はない。
実施例１０：１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－ＢＢＺ ＣＡＲＴのインビトロ殺傷結果
実施例８の方法を参照して、１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－ＢＢＺ ＣＡＲＴのインビトロ殺傷効果を検出する。
エフェクター細胞：９：１、３：１および１：１のエフェクター標的比に従って、９６ウェルプレートに非形質導入（ＵＴＤ）Ｔ細胞、７Ｆ８－ＢＢＺ ＣＡＲＴ細胞、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲＴ細胞、および１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－ＢＢＺ ＣＡＲＴ細胞を接種する。
標的細胞：５０μＬの２×１０５／ｍＬのＣＬＬ１発現陽性のＨＬ－６０およびＵ９３７細胞ならびにＣＬＬ１発現陰性のＫ５６２細胞をそれぞれ９６ウェルプレートに接種する。
実験結果は、図１３に示され、結果によると、対照グループＵＴＤと比較して、本発明の７Ｆ８－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔ、１２Ｇ４ｍ－ＢＢＺ ＣＡＲ Ｔ、および１２Ｇ４ｍ（Ｍ１３３１）－ＢＢＺ ＣＡＲＴは、ＣＬＬ１発現陽性のＨＬ－６０およびＵ９３７細胞に対して、すべて有意な毒性殺傷効果を有するが、ＣＬＬ１発現陰性のＫ５６２細胞に対して、殺傷効果がほとんどない。
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
本発明で使用される配列は、以下の表に要約されている。
Figure 2022505921000003
Figure 2022505921000004
Figure 2022505921000005
Figure 2022505921000006
Figure 2022505921000007
Figure 2022505921000008
Figure 2022505921000009

Claims (31)

  1. ＣＬＬ１を標的とする抗体であって、
    ＳＹＸ１ＭＸ２に示されるＨＣＤＲ１、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｇに示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０または４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１２ＬＸ１３に示されるＬＣＤＲ１、Ｘ１４ＡＳＸ１５ＬＸ１６Ｓに示されるＬＣＤＲ２、およびＱＱＸ１７ＹＳＸ１８ＰＸ１９Ｘ２０Ｔに示されるＬＣＤＲ３を有し、
    ここで、前記Ｘ１は、ＡまたはＹから選択され、Ｘ２は、ＳまたはＨから選択され、Ｘ３は、ＡまたはＩであり、Ｘ４は、ＩまたはＦから選択され、Ｘ５は、ＳまたはＮから選択され、Ｘ６は、ＧまたはＰから選択され、Ｘ７は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ８は、ＤまたはＱから選択され、Ｘ９は、ＳまたはＫから選択され、Ｘ１０は、ＶまたはＦから選択され、Ｘ１１は、ＫまたはＱから選択され、Ｘ１２は、ＷまたはＹから選択され、Ｘ１３は、ＡまたはＮから選択され、Ｘ１４は、ＤまたはＶから選択され、Ｘ１５は、ＮまたはＳから選択され、Ｘ１６は、ＥまたはＱから選択され、Ｘ１７は、ＹまたはＳから選択され、Ｘ１８は、ＹまたはＴから選択され、Ｘ１９は、ＭまたはＬから選択され、Ｘ２０は、Ｉであるか、または存在しないことを特徴とする、
    前記抗体。
  2. （１）その重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５または３６に示されるＨＣＤＲ１を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８または３９に示されるＨＣＤＲ２を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０または４１に示されるＨＣＤＲ３を含む抗体、
    （２）その軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３または４４に示されるＬＣＤＲ１を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６、４７または４８に示されるＬＣＤＲ２を含むか、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９または５０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
    （３）（１）に記載の重鎖可変領域および（２）に記載の軽鎖可変領域を含む抗体、
    （４）（１）～（３）のいずれか１つに記載の抗体と同じまたは類似の活性を有する、（１）～（３）のいずれか１つに記載の抗体の変異体
    の群のいずれかから選択されることを特徴とする、
    請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体ＬＣＤＲ１には、ＲＡＳＱＳＩＳＳＸ１２ＬＸ１３からＲＡＳＱＷＩＡＲＸ１２ＬＸ１３への突然変異が生じており、
    好ましくは、前記突然変異したＬＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されることを特徴とする、
    請求項１に記載の抗体。
  4. 前記抗体ＨＣＤＲ２のＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６が、ＡＩＳＧまたはＩＦＮＰであることを特徴とする、
    請求項１に記載の抗体。
  5. 前記抗体ＨＣＤＲ２には、Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＧからＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＧＧＳＴＸ７ＹＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｇへの突然変異が生じており、
    好ましくは、前記突然変異されたＨＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されることを特徴とする、
    請求項１または４に記載の抗体。
  6. （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
    （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
    （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
    （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、
    （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるＨＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるＨＣＤＲ３、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ３を含む抗体、および
    （６）（１）～（５）のいずれか１つに記載の抗体と同じまたは類似の活性を有する（１）～（５）のいずれか１つに記載の抗体の変異体の群
    のいずれかから選択されることを特徴とする、
    請求項２に記載の抗体。
  7. （１）重鎖可変領域に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
    （２）軽鎖可変領域に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
    （３）（１）に記載の抗体の重鎖可変領域および（２）に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
    （４）（１）～（３）のいずれか１つに記載の抗体と同じまたは類似の活性を有する（１）～（３）のいずれか１つに記載の抗体の変異体の群
    のいずれかから選択されることを特徴とする、
    請求項２に記載の抗体。
  8. （１）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
    （２）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
    （３）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
    （４）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
    （５）重鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有する抗体、
    （６）（１）～（５）のいずれか１つに記載の抗体と同じまたは類似の活性を有する（１）～（５）のいずれか１つに記載の抗体の変異体
    から選択されることを特徴とする、
    請求項７に記載の抗体。
  9. 軽鎖可変領域に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるＬＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＣＤＲ３を有し、
    好ましくは、前記軽鎖可変領域に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有し、
    より好ましくは、前記軽鎖可変領域に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１３、６７、６８または６９に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、
    請求項２に記載の抗体。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体と同じ抗原決定部位を識別する抗体。
  11. 完全ヒト抗体であることを特徴とする、
    請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 完全抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする、
    請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
  15. 請求項１４に記載の発現ベクターを含むか、またはゲノムに請求項１３に記載の核酸が組み込まれたことを特徴とする、宿主細胞。
  16. 腫瘍を治療する薬物の調製、または腫瘍を診断する試薬の調製に使用されることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体の用途。
  17. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体、および連結される機能性分子を含み、
    前記機能性分子は、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を阻害する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子、および検出可能なマーカーから選択される、免疫コンジュゲート。
  18. 腫瘍を阻害する分子が、抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素であることを特徴とする、
    請求項１７に記載の免疫コンジュゲート。
  19. 免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子が、免疫細胞の表面マーカーに結合する抗体またはリガンド（ｌｉｇａｎｄ）であることを特徴とする、
    請求項１７に記載の免疫コンジュゲート。
  20. 免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の表面マーカーに結合する抗体であることを特徴とする、
    請求項１９に記載の免疫コンジュゲート。
  21. 請求項１７～２０のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートをコードする核酸。
  22. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体を含むことを特徴とする、キメラ抗原受容体。
  23. 一本鎖抗体または単一ドメイン抗体であることを特徴とする、
    請求項２２に記載のキメラ抗原受容体。
  24. 請求項２２に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  25. 請求項２４に記載の核酸を含むことを特徴とする、発現ベクター。
  26. 請求項２５に記載のベクターを含むことを特徴とする、ウイルス。
  27. 請求項２４に記載の核酸が形質導入されるか、または請求項２２に記載のキメラ抗原受容体が発現されることを特徴とする、遺伝子修飾された免疫細胞。
  28. キメラ抗原受容体に加えて、第二の配列がさらに発現されることを特徴とする、
    請求項２７に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
  29. 第二の配列が、サイトカイン、または別のキメラ抗原受容体、またはケモカイン受容体、またはＰＤ－１発現を低下させるｓｉＲＮＡ、またはＰＤ－Ｌ１を遮断するタンパク質、またはＴＣＲ、または安全スイッチを含むことを特徴とする、
    請求項２８に記載の免疫細胞。
  30. 腫瘍を治療する薬物の調製に使用される請求項２８に記載の遺伝子修飾された免疫細胞の用途。
  31. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体または当該抗体をコードする核酸、または
    請求項１７～２０のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートまたは当該コンジュゲートをコードする核酸、または
    請求項２７～２９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された免疫細胞を含むことを特徴とする、医薬組成物。
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