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JP2022036961A - Lipids as synthetic vectors to enhance antigen processing and presentation ex-vivo in dendritic cell therapy - Google Patents

Lipids as synthetic vectors to enhance antigen processing and presentation ex-vivo in dendritic cell therapy Download PDF

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JP2022036961A
JP2022036961A JP2021185922A JP2021185922A JP2022036961A JP 2022036961 A JP2022036961 A JP 2022036961A JP 2021185922 A JP2021185922 A JP 2021185922A JP 2021185922 A JP2021185922 A JP 2021185922A JP 2022036961 A JP2022036961 A JP 2022036961A
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antigen
cells
dendritic cells
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cancer
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ベデュ-アッド,フランク
Bedu-Addo Frank
コン,グレッグ
Conn Greg
ケイ. ガンダプディ,シヴァ
K Gandhapudi Siva
キーオ,マーティン
Keough Martin
モース,アンジェラ
Mohs Angela
パテル,リチュ
Patel Ritu
シン,スウェータ
Singh Shweta
ワード,マーティン
Ward Martin
ウッドワード,ジェロルド
Woodward Jerold
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PDS Biotechnology Corp
Original Assignee
PDS Biotechnology Corp
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a composition for activating dendritic cells ex vivo.
SOLUTION: The present invention discloses a composition for producing vaccine, containing a population of isolated dendritic cells, at least one cationic lipid, and at least one peptide antigen.
SELECTED DRAWING: None
COPYRIGHT: (C)2022,JPO&INPIT

Description

関連出願へのクロスリファレンス Cross-reference to related applications

本国際出願は、2015年11月13日に出願された米国特許仮出願第62/254,794号および2016年10月5日に出願された米国特許仮出願第62/404,504号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。 This international application is prioritized by US Patent Provisional Application Nos. 62 / 254,794 filed on November 13, 2015 and US Patent Provisional Application Nos. 62 / 404,504 filed on October 5, 2016. It asserts the interests of the right and is incorporated herein by reference in its entirety.

本発明は、癌における樹状細胞療法に関する。10年以上にわたって、ex vivoで自家培養された造血前駆細胞または単球由来樹状細胞(DC)の養子移入が癌ワクチンとして試験されている。これらの研究は、樹状細胞ワクチンが安全であり、腫瘍抗原に特異的で体内を循環するCD4T細胞およびCD8T細胞の増殖を誘導できることを示唆している。客観的な臨床応答が観察された患者もいた。臨床応答が成立するには時間を要するものの、非常に長期間にわたって寛解が続く可能性があることが確立されている。前臨床抗腫瘍研究では、動物から単離し、ex vivoで腫瘍抗原を負荷した上で細胞療法として投与されたDCが、予防効果と治療効果の両方を誘導することが示されている。 The present invention relates to dendritic cell therapy in cancer. For more than 10 years, adoptive transfer of ex vivo autologous hematopoietic progenitor cells or monocyte-derived dendritic cells (DCs) has been tested as a cancer vaccine. These studies suggest that dendritic cell vaccines are safe and can induce the proliferation of tumor antigen-specific and circulating CD4 + T cells and CD8 + T cells. Some patients had an objective clinical response. Although it takes time for a clinical response to be established, it has been established that remission may continue for a very long period of time. Preclinical antitumor studies have shown that DCs isolated from animals, loaded with tumor antigens ex vivo and administered as cell therapy induce both prophylactic and therapeutic effects.

DCの抗原提示特性の研究によって、近年、効果的な癌免疫療法の開発において有望であることが示され、近時における複数の臨床試験で有望な結果が得られている。転移性前立腺癌をsipuleucel-Tで治療したところ、第III相治験で生存期間の中央値が約4ヶ月間長くなった。sipuleucel-T(Provenge(登録商標))は、患者から採取し、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)とGM-CSFの融合タンパク質を用いて培養した、濃縮血液から得られた樹状細胞をベースにした細胞の製品である。樹状細胞は、それから静脈への注入(静注)によって患者に戻す。このプロセスをさらに2回、2週間おきに繰り返し、患者に3用量の細胞が投与されるようにする。sipuleucel-Tは、転移性前立腺癌の治療用で米国食品医薬品局(FDA)の認可を受けたことで、次世代の細胞免疫療法製品の臨床開発および規制への道を切り開いた。腫瘍抗原ペプチドを負荷した活性化DCのワクチンを受けた転移性黒色腫患者に、抗原特異的CD4T細胞応答およびCD8T細胞応答を示した患者がいた。このように有望視されていたにもかかわらず、臨床応答は思ったほどではなく、昔からの客観的な抗腫瘍応答率もかろうじて15%を超えるくらいであった。 Studies of the antigen-presenting properties of DC have shown promise in recent years in the development of effective cancer immunotherapies, with promising results in recent clinical trials. Treatment of metastatic prostate cancer with sipuleucel-T resulted in a median survival of approximately 4 months in Phase III trials. Sipuleucel-T (Provenge®) is a dendritic cell-based cell taken from a patient and cultured with a fusion protein of prostatic acid phosphatase (PAP) and GM-CSF from concentrated blood. It is a product of. Dendritic cells are then returned to the patient by intravenous injection (intravenous injection). This process is repeated twice more every two weeks to allow the patient to receive 3 doses of cells. With the US Food and Drug Administration (FDA) approval for the treatment of metastatic prostate cancer, sipuleucel-T paved the way for clinical development and regulation of next-generation cellular immunotherapeutic products. Among metastatic melanoma patients who received a vaccine of activated DC loaded with a tumor antigen peptide, there were patients who showed antigen-specific CD4 + T cell response and CD8 + T cell response. Despite this promising view, the clinical response was not as good as expected, and the traditional objective antitumor response rate was barely over 15%.

樹状細胞療法は、癌をはじめとする様々な衰弱性疾患を治療するための有望な手法である。この手法によって、患者に合わせてカスタマイズされ、パーソナライズされた治療法の開発が可能になる。たとえば、特定の癌に対する特異的なタンパク質抗原を使用するのではなく、治療のために患者の腫瘍から抗原を得て患者自身の樹状細胞に負荷することができる。ex vivoで樹状細胞療法を用いる手法は、治療後2年目の患者において持続的な免疫応答を示した承認済製品で、有意な前途を示すことがわかっている。しかしながら、治療結果は最良には至らず、これらの治療法を改善するための手法がいくつか研究されている。 Dendritic cell therapy is a promising method for treating various debilitating diseases such as cancer. This technique allows the development of personalized and personalized therapies for the patient. For example, instead of using a protein antigen specific for a particular cancer, the antigen can be obtained from the patient's tumor for treatment and loaded onto the patient's own dendritic cells. The technique of using dendritic cell therapy in ex vivo is an approved product that has shown a sustained immune response in patients 2 years after treatment and has been shown to show significant prospects. However, treatment results have not been excellent, and several methods for improving these treatments have been studied.

重要な問題のひとつに、DCを負荷するための腫瘍抗原の選択がある。候補となる抗原には、特異的な(変異)抗原と、非特異的な非変異自己抗原が含まれる。広く適用可能な治療法を生み出すには、ネガティブセレクションによって高親和性のクローンの集団が除
去されるとしても、非変異自己抗原が最も好ましい。変異抗原を使用すると、この欠点を回避することができるだろう。RNAシークエンシング技術が開発されたことは、全範囲の原発腫瘍由来の変異抗原および転移腫瘍由来の変異抗原を決定する一助となっており、これによって治療を特定の患者に合わせることができるようになっている。
One of the important issues is the selection of tumor antigens for loading DC. Candidate antigens include specific (mutant) antigens and non-specific non-mutant self-antigens. Non-mutant self-antigens are most preferred for producing widely applicable therapies, even though the negative selection eliminates a population of high-affinity clones. Mutant antigens could be used to avoid this shortcoming. The development of RNA sequencing technology has helped determine the range of mutated antigens from primary tumors and metastatic tumors, allowing treatment to be tailored to specific patients. It has become.

ペプチドまたはタンパク質抗原、および腫瘍由来の自己抗原では、DCワクチンの適用を成功させる上で制約となる重要な要因は、利用できる抗原の量であることが非常に多い。克服すべき技術的な障壁のひとつは、樹状細胞に対してこれらの抗原を効果的に提示し、MHCクラスI(CD8+T細胞)およびMHCクラスII(CD4+T細胞)による一層効果的な提示を可能にすることである。これも依然として最良には至らない、得られるT細胞応答の効力と安定性に直接的に影響する。 For peptide or protein antigens, and tumor-derived self-antigens, a key limiting factor in the successful application of DC vaccines is very often the amount of antigen available. One of the technical barriers to overcome is the effective presentation of these antigens to dendritic cells, allowing for more effective presentation by MHC class I (CD8 + T cells) and MHC class II (CD4 + T cells). Is to. This also directly affects the efficacy and stability of the resulting T cell response, which is still not the best.

DCは、抗原を交差提示することもできる。交差提示とは、外来性の可溶性タンパク質またはペプチドが抗原提示細胞に取り込まれる経路のことであり、タンパク質が分解されMHCクラスIIとともに提示される経路に入るのではなく、ペプチドまたはタンパク質がMHCクラスIのプロセシング経路に入る経路をいう。これは、細胞質内の経路またはエンドソーム内の経路の2つの方法で起こり得る。どちらの経路でも、タンパク質はまず、エンドソーム/ファゴソームに取り込まれる。細胞質内の経路では、部分的に分解されたエンドソームのタンパク質の一部が最終的に細胞質に入る。そのメカニズムはほとんど理解されていないが、エンドソームのタンパク質がプロテアソームでプロセシングされ、これによって生じるペプチドがTAPによって輸送されて、MHCクラスIと結合するための小胞体または他のエンドソームのいずれかに入る。あるいは、タンパク質がエンドソームで分解されて、ペプチドがエンドソームに存在するMHCクラスIに結合することもある。この後者の経路は、プロテアソーム非依存的で、エンドソームのプロテアーゼによる正しいペプチドの偶然の産生に依るため、非効率である。タンパク質分解活性が限られている初期エンドソームへのタンパク質の侵入は交差提示に有利であるのに対し、タンパク質分解活性のレベルが高い後期エンドソームは、交差提示を阻害する場合がある。 The DC can also cross-present the antigen. Cross-presentation is the pathway by which an exogenous soluble protein or peptide is taken up by antigen-presenting cells, where the peptide or protein is MHC class I rather than degraded and enters the pathway presented with MHC class II. Refers to the route that enters the processing route of. This can occur in two ways: the cytoplasmic pathway or the endosome pathway. In either pathway, proteins are first incorporated into endosomes / phagosomes. In the cytoplasmic pathway, some of the partially degraded endosome proteins eventually enter the cytoplasm. Although the mechanism is poorly understood, endosome proteins are processed in the proteasome, and the resulting peptides are transported by TAP into either the endoplasmic reticulum or other endosomes for binding to MHC class I. Alternatively, the protein may be degraded in the endosome and the peptide may bind to MHC class I present in the endosome. This latter pathway is inefficient because it is proteasome-independent and depends on the accidental production of the correct peptide by endosome proteases. Invasion of proteins into early endosomes with limited proteolytic activity favors cross-presentation, whereas late endosomes with high levels of proteolytic activity may inhibit cross-presentation.

上記の考察から、エンドソーム経路、特に初期エンドソーム経路に入るタンパク質がMHCクラスI上で交差提示され得ることは明らかである。また、交差提示の程度は、初期エンドソームに取り込まれるタンパク質/ペプチドの量、およびその後に細胞質に運ばれる抗原断片の量に依存することになる。DCスカベンジャー受容体に結合する可溶性タンパク質は、交差提示することができる。古典的な例は、マンノース受容体に結合するオボアルブミンである。しかしながら、タンパク質/ペプチドにすでに導入されている標的受容体への手法は様々であって、全てがDCスカベンジャー受容体に結合するわけではない。これらの経路には、Fc受容体、CD205などの様々なC型レクチン受容体、CD207、CLEC9a、インテグリンまたは糖脂質を標的とすることが含まれる。これらの手法には、いくつかの欠点がある。抗原を特定の受容体結合タンパク質、通常はモノクローナル抗体に結合する必要があり、非常に面倒な手法になる。タンパク質の取り込み量は、起こり得る受容体の細胞内への取り込みの量に限定され、いったん取り込まれると、限定的ではあるが細胞質へ放出される。DC受容体の中には後期エンドソームを標的とするものがあり、そのため結果的に、交差提示が非効率的になってしまう。最後に、ヒトDCサブセット上での交差提示型DC受容体の分布は、ほとんど理解されておらず、このことは、そのような技術の設計を困難にしている上、マウスでの研究をヒトにうまく置き換えられない理由の説明となり得る。もう少し特異性の低い別の手法として、可溶性抗原をナノ粒子に付着させて微粒子の形に変換する手法がある。この手法は、十分な抗原を運ぶのが困難であること、DCが成熟しリンパ節に運ばれるにつれて貪食能力を失うという事実に悩まされている。 From the above considerations, it is clear that proteins entering the endosomal pathway, especially the early endosomal pathway, can be cross-presented on MHC class I. Also, the degree of cross-presentation will depend on the amount of protein / peptide taken up by the early endosomes and the amount of antigen fragment subsequently carried to the cytoplasm. Soluble proteins that bind to the DC scavenger receptor can be cross-presented. A classic example is ovalbumin, which binds to the mannose receptor. However, there are various approaches to target receptors that have already been introduced into proteins / peptides, and not all bind to DC scavenger receptors. These pathways include targeting Fc receptors, various C-type lectin receptors such as CD205, CD207, CLEC9a, integrins or glycolipids. These methods have some drawbacks. The antigen needs to be bound to a specific receptor-binding protein, usually a monoclonal antibody, which is a very cumbersome technique. The amount of protein uptake is limited to the amount of possible receptor uptake into the cell, and once taken up, it is released into the cytoplasm, albeit in a limited manner. Some DC receptors target anaphase endosomes, resulting in inefficient cross-presentation. Finally, the distribution of cross-presentation DC receptors on human DC subsets is poorly understood, which makes the design of such techniques difficult and makes studies in mice into humans. It can explain why it is not replaced successfully. Another method with a little lower specificity is to attach a soluble antigen to nanoparticles and convert them into fine particles. This technique suffers from the difficulty of carrying sufficient antigen and the fact that it loses its phagocytic capacity as DC matures and is delivered to the lymph nodes.

本出願によって、ペプチド系DCワクチン、および抗原が腫瘍に由来する自家DCワク
チンの開発において、樹状細胞による抗原の取り込みが抗原量に大きく依存することを証明する。この樹状細胞による取り込みを促進し、重要な抗原の交差提示を促進するために、カチオン性脂質を安全に使用することができる。
This application demonstrates that the uptake of antigen by dendritic cells is highly dependent on the amount of antigen in the development of peptide-based DC vaccines and autologous DC vaccines in which the antigen is derived from tumors. Cationic lipids can be safely used to facilitate uptake by this dendritic cell and promote cross-presentation of important antigens.

したがって、本出願は、DNA/RNAによらない樹状細胞ワクチンの開発に焦点を当て、DCに対する毒性を限定的なものにしながら、DCによる抗原の取り込みとプロセシングを向上させるようなワクチンの開発を容易にする手段を示す。 Therefore, this application focuses on the development of DNA / RNA-free dendritic cell vaccines, and develops vaccines that improve the uptake and processing of antigens by DC while limiting toxicity to DC. Shows the means to facilitate.

免疫療法を成功させる上でのさらに別の重大な障害が、抗腫瘍細胞溶解性T細胞応答を妨げる様々な免疫抑制機構を進める主役である、腫瘍の抑制的微小環境である。この作用は、「免疫回避」または「免疫寛容化」と呼ばれてきた。末期の腫瘍に存在する阻害効果を避けるために、最小限の残存病変と高い再発リスクを有し、アジュバントを投与された患者で臨床試験が行われた[Sears AK, Perez SA, Clifton
GT, et al., AE37: a novel T-cell-eliciting vaccine for breast cancer. Expert Opin Biol Ther. 2011; 11(11): 1543-1550]。この臨床的な設定におけるワクチン接種を支える合理的な点は、腫瘍負荷が最小限の患者に、確実な抗腫瘍応答をすることができる十分な能力のある免疫系を依然として持たせることにある。さらに、初期の癌またはアジュバント投与におけるワクチン接種には、T細胞が不活性化され得る免疫抑制性腫瘍環境内でのT細胞の蓄積を最小限に抑えるという利点がある。
Yet another significant impediment to the success of immunotherapy is the tumor suppressive microenvironment, which is responsible for promoting various immunosuppressive mechanisms that impede antitumor cell-lytic T cell responses. This effect has been called "antigenic escape" or "immune tolerance". Clinical trials were conducted in adjuvant-administered patients with minimal residual lesions and a high risk of recurrence to avoid the inhibitory effects present in end-stage tumors [Sears AK, Perez SA, Clifeton]
GT, et al. , AE37: a novel T-cell-eliciting vaccine for breast cancer. Expert Opin Biol Ther. 2011; 11 (11): 1543-1550]. A reasonable support for vaccination in this clinical setting is to ensure that patients with minimal tumor burden still have a sufficiently competent immune system to provide a reliable antitumor response. In addition, vaccination in early stage cancer or adjuvant administration has the advantage of minimizing T cell accumulation in an immunosuppressive tumor environment in which T cells can be inactivated.

本発明のある例示的な態様を以下に示す。これらの態様は、本発明がとりうる形態の簡単な概要を読者に提供するためだけに提示され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。実際、本発明は、以下に明示的に記載されていない多種多様な態様を包含することができる。 An exemplary embodiment of the invention is shown below. It should be understood that these embodiments are presented solely to provide the reader with a brief overview of the forms in which the invention may be taken and are not intended to limit the scope of the invention. In fact, the invention can embrace a wide variety of aspects not explicitly described below.

本明細書に記載の一実施形態では、ex vivoでの樹状細胞活性化のための組成物が提供される。この組成物は、少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを有する1つ以上の脂質を含む。この組成物は、他の脂質ならびに、樹状細胞の生存率および増殖を亢進させるための成長因子を含んでもよい。 In one embodiment described herein, a composition for dendritic cell activation in ex vivo is provided. The composition comprises one or more lipids having at least one cationic lipid and at least one antigen. The composition may contain other lipids as well as growth factors for enhancing the viability and proliferation of dendritic cells.

ex vivoでのDC活性化のための組成物は、少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを有する1つ以上の脂質を含み、抗原は、腫瘍または癌において見られるタンパク質またはポリペプチドである。あるカチオン性脂質は、受容体に依存しない形で樹状細胞に速やかに結合する能力において独特であり、速やかに初期エンドソームに取り込まれる。重要なことに、一旦初期エンドソームに入ると、カチオン性脂質は、クラスIのプロセシング経路に入るためのエンドソームの不安定化と内容物の細胞質への放出を助長する。これによって、標的となる受容体の取り込みで生じるであろうよりもかなり多くのエンドソーム内容物を細胞質に放出できるようになる。また、適切なカチオン性脂質は、T細胞を活性化および増殖させ、T細胞のリンパ節への移動を引き起こす、あるサイトカインおよびケモカインの産生を誘導する免疫学的危険信号(Danger Signal)を提供することもできる。また、適切なカチオン性脂質は、好ましくは腫瘍抗原との併用時に、腫瘍微小環境内のTreg細胞の集団を減少させることができる。 The composition for DC activation in ex vivo comprises one or more lipids having at least one cationic lipid and at least one antigen, where the antigen is a protein or polypeptide found in tumors or cancers. be. Certain cationic lipids are unique in their ability to rapidly bind to dendritic cells in a receptor-independent manner and are rapidly incorporated into early endosomes. Importantly, once entering the early endosomes, cationic lipids facilitate endosome destabilization and release of the contents into the cytoplasm to enter the class I processing pathway. This allows the release of significantly more endosomal contents into the cytoplasm than would result from the uptake of targeted receptors. Appropriate cationic lipids also provide an immunological danger signal (Danger Signal) that induces the production of certain cytokines and chemokines that activate and proliferate T cells and cause T cell migration to lymph nodes. You can also do it. Also, suitable cationic lipids can reduce the population of Treg cells in the tumor microenvironment, preferably when used in combination with tumor antigens.

別の実施形態では、対象が哺乳動物である、ex vivoで対象の樹状細胞を処理する方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを含む1つ以上の脂質で樹状細胞を処理する工程を含む。また、この組成物は、in vitroでの細胞の維持と増殖を助長するためのGM-CSFおよびサイ
トカインなどの成長因子も含む。少なくとも1つの抗原は癌抗原である。
In another embodiment, an ex vivo method of treating a subject's dendritic cells, wherein the subject is a mammal, is provided. The method comprises treating dendritic cells with one or more lipids comprising an effective amount of at least one cationic lipid and at least one antigen. The composition also contains growth factors such as GM-CSF and cytokines to promote cell maintenance and proliferation in vitro. At least one antigen is a cancer antigen.

癌DCワクチンの製造方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを含む1つ以上の脂質で樹状細胞を処理する工程を含む。また、この組成物は、in vitroでの細胞の維持と増殖を助長するためのGM-CSFおよびサイトカインなどの成長因子も含む。 A method for producing a cancer DC vaccine is provided. The method comprises treating dendritic cells with one or more lipids comprising an effective amount of at least one cationic lipid and at least one antigen. The composition also contains growth factors such as GM-CSF and cytokines to promote cell maintenance and proliferation in vitro.

腫瘍微小環境内のTreg集団の大幅な減少を誘導しながら、高レベルの腫瘍浸潤T細胞を誘導することができる癌DCワクチンの製造方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを含む1つ以上の脂質で樹状細胞を活性化する工程を含む。また、この方法は、in vitroでの細胞の維持と増殖を助長するためのGM-CSFおよびサイトカインなどの成長因子でDCをさらに活性化することを含む。カチオン性脂質を腫瘍抗原と組み合わせてin vitroでのDCの活性化に使用し、その後、癌を有する対象にDCを注入すると、DCは、腫瘍微少環境内の腫瘍特異的CD8+Tの量を増加させることにより、腫瘍微小環境を変化させるとともに、Treg集団を大幅に減少させることができる。その結果、CD8+T細胞に対するTregの比が大幅に小さくなる。 A method for producing a cancer DC vaccine capable of inducing high levels of tumor infiltrating T cells while inducing a significant reduction in the Treg population within the tumor microenvironment is provided. The method comprises activating dendritic cells with one or more lipids comprising an effective amount of at least one cationic lipid and at least one antigen. The method also comprises further activating DC with growth factors such as GM-CSF and cytokines to promote cell maintenance and proliferation in vitro. When a cationic lipid is used in vitro to activate DC in vitro and then injected into a subject with cancer, DC increases the amount of tumor-specific CD8 + T in the tumor microenvironment. Thereby, the tumor microenvironment can be changed and the Treg population can be significantly reduced. As a result, the ratio of Treg to CD8 + T cells is significantly reduced.

有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを含む1つ以上の脂質で前処理されたDCを患者に投与する工程を含み、抗原が癌抗原である、DCワクチンで対象を免疫する方法が提供される。この方法は、対象を2回以上免疫することを含む。この方法は、免疫後の対象における癌特異的CD8+T細胞のレベルおよびTreg細胞のレベルを確認することを含む。 Immunizing a subject with a DC vaccine, comprising administering to the patient DC pretreated with one or more lipids comprising an effective amount of at least one cationic lipid and at least one antigen, wherein the antigen is a cancer antigen. A way to do it is provided. This method involves immunizing the subject more than once. The method comprises ascertaining cancer-specific CD8 + T cell levels and Treg cell levels in post-immune subjects.

さらに別の実施形態では、哺乳動物において予防用または治療用の免疫応答を高める方法が提供される。この方法は、場合によってはGM-CSFおよびサイトカインなどの成長因子とともに有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と抗原とを含む1つ以上の脂質で樹状細胞を活性化する工程と、活性化した樹状細胞を哺乳動物に投与する工程とを含む。様々な実施形態において、哺乳動物はヒトである。 Yet another embodiment provides a method of enhancing a prophylactic or therapeutic immune response in a mammal. This method comprises activating dendritic cells with one or more lipids, optionally with growth factors such as GM-CSF and cytokines, as well as effective amounts of at least one cationic lipid and an antigen. Includes the step of administering dendritic cells to a mammal. In various embodiments, the mammal is a human.

本発明の一実施形態は、ex vivoで樹状細胞と組み合わせて投与される場合、腫瘍由来抗原ならびにタンパク質抗原およびペプチド抗原の取り込みおよび提示を促進するためのカチオン性脂質の使用に関する。この実施の、樹状細胞に対する毒性は限定的であって、樹状細胞の生存率と成長を維持し、その増殖を促進することが意図されている増殖因子およびサイトカインの存在下で使用することができる。 One embodiment of the invention relates to the use of tumor-derived antigens and cationic lipids to facilitate the uptake and presentation of protein and peptide antigens when administered ex vivo in combination with dendritic cells. This practice has limited toxicity to dendritic cells and should be used in the presence of growth factors and cytokines intended to maintain and promote dendritic cell viability and growth. Can be done.

カチオン性リポソームは、遺伝子治療で使用するためのRNAおよびDNAのトランスフェクションおよび送達ならびに、DNA系樹状細胞ワクチンにおいて、in vivoで広く使用されている。最近、カチオン性脂質は、MAPキナーゼの活性化を通じて強い免疫応答を刺激することができる強力なアジュバントであることも報告されている。 Cationic liposomes are widely used in vivo in RNA and DNA transfection and delivery for use in gene therapy, as well as in DNA-based dendritic cell vaccines. Recently, cationic lipids have also been reported to be potent adjuvants capable of stimulating a strong immune response through activation of MAP kinase.

カチオン性脂質は、受容体に依存しない形で樹状細胞に速やかに結合する能力において独特であり、速やかに初期エンドソームに取り込まれる。重要なことに、一旦初期エンドソームに入ると、カチオン性脂質は、クラスIのプロセシング経路に入るためのエンドソームの不安定化と内容物の細胞質への放出を助長するようである。これにより、エンドソーム含有量のより多くが、標的受容体取り込みで生じるよりも、細胞質に放出されることが可能になる。これによって、標的になる受容体の取り込みで生じるであろうよりもかなり多くのエンドソーム内容物を細胞質に放出できるようになる。 Cationic lipids are unique in their ability to rapidly bind to dendritic cells in a receptor-independent manner and are rapidly incorporated into early endosomes. Importantly, once entering the early endosomes, cationic lipids appear to facilitate endosome destabilization and release of the contents into the cytoplasm to enter the class I processing pathway. This allows higher endosome content to be released into the cytoplasm than would result from target receptor uptake. This allows the release of significantly more endosomal contents into the cytoplasm than would result from the uptake of targeted receptors.

本発明の一実施形態では、本開示は、カチオン性脂質が、樹状細胞の成熟を誘導するの
にアジュバントを使用するといった現行の手法よりも数桁多くのタンパク質がMHCクラスIおよびMHCクラスII経路に入るのを助長することができることを示す。
In one embodiment of the invention, the disclosure discloses MHC class I and MHC class II with orders of magnitude more protein than current approaches such as cationic lipids using an adjuvant to induce dendritic cell maturation. Show that it can help you enter the route.

一実施形態では、本発明は、ex vivoで腫瘍に対するDCワクチンを調製するために必要な、カチオン性脂質と特定の腫瘍抗原とを含む組成物を提供する。 In one embodiment, the invention provides a composition comprising a cationic lipid and a particular tumor antigen necessary for preparing a DC vaccine against a tumor ex vivo.

一実施形態では、腫瘍に対するDCワクチンを調製するために必要な組成物は、非核酸抗原、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質またはリポペプチドを含む。 In one embodiment, the composition required to prepare a DC vaccine against a tumor comprises a non-nucleic acid antigen, protein, polypeptide, peptide, lipoprotein or lipopeptide.

一実施形態では、抗原は腫瘍抗原または変異腫瘍抗原である。抗原は、患者の遺伝子のタンパク質産物であり、遺伝子は、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、変異を有する遺伝子、腫瘍細胞に特有の再構成を有する遺伝子、再活性化胚遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的分化遺伝子、成長因子受容体、および細胞表面タンパク質遺伝子からなる群から選択される。 In one embodiment, the antigen is a tumor antigen or a mutant tumor antigen. An antigen is a protein product of a patient's gene, and the gene is a cancer gene, a tumor suppressor gene, a gene having a mutation, a gene having a rearrangement peculiar to a tumor cell, a reactivated embryo gene product, a cancer fetal antigen, It is selected from the group consisting of tissue-specific differentiation genes, growth factor receptors, and cell surface protein genes.

一実施形態では、抗原は、微生物抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または微生物抗原の天然単離物、断片およびその誘導体である。 In one embodiment, the antigen is a microbial antigen, a viral antigen, a bacterial antigen, a fungal antigen or a natural isolate of a microbial antigen, a fragment and a derivative thereof.

一実施形態では、抗原はウイルス抗原である。 In one embodiment, the antigen is a viral antigen.

一実施形態では、DCワクチンを製造するための、DCを刺激または活性化する組成物は、複数のペプチド抗原を含む。 In one embodiment, the composition for stimulating or activating DC for producing a DC vaccine comprises a plurality of peptide antigens.

一実施形態では、DCワクチンを製造するための、DCを刺激または活性化する組成物は、自己会合複合体であるペプチド抗原を含む。 In one embodiment, the composition that stimulates or activates DC for producing a DC vaccine comprises a peptide antigen that is a self-associating complex.

一実施形態では、カチオン性脂質と抗原とは、化学結合によって構造的に結合していない。 In one embodiment, the cationic lipid and the antigen are not structurally bound by a chemical bond.

一実施形態では、カチオン性脂質と抗原とは、化学結合によって結合している。 In one embodiment, the cationic lipid and the antigen are bound by a chemical bond.

一実施形態では、カチオン性脂質と抗原とはリンカーによって結合している。 In one embodiment, the cationic lipid and the antigen are bound by a linker.

一実施形態では、カチオン性脂質は抗原をカプセル封入する。 In one embodiment, the cationic lipid encapsulates the antigen.

一実施形態では、カチオン性脂質はリポソームを形成する。 In one embodiment, the cationic lipid forms liposomes.

一実施形態では、カチオン性脂質および抗原はエマルジョンを形成する。 In one embodiment, cationic lipids and antigens form an emulsion.

一実施形態では、カチオン性脂質はタンパク質またはペプチド抗原の取り込みを促進する。 In one embodiment, cationic lipids promote the uptake of protein or peptide antigens.

一実施形態では、DCワクチンの開発過程においてDCを取り込んで刺激するための、組成物のペプチドまたはタンパク質抗原をさらに修飾して、抗原の疎水性を低下させる。抗原の疎水性は、たとえば、カチオン性脂質の疎水性アシル鎖における抗原の溶解性を改善するために、脂質鎖または疎水性アミノ酸に結合させることによって、分子の抗原特性を維持しながら高めることができる。 In one embodiment, the peptide or protein antigen of the composition for uptake and stimulation of DC during the development of the DC vaccine is further modified to reduce the hydrophobicity of the antigen. The hydrophobicity of an antigen can be enhanced while preserving the antigenic properties of the molecule, for example by binding to a lipid chain or hydrophobic amino acid to improve the solubility of the antigen in the hydrophobic acyl chain of a cationic lipid. can.

修飾された抗原は、アミノ酸配列の疎水性が高められた、修飾されたリポタンパク質、
リポペプチド、タンパク質またはペプチド、それらの組み合わせであってもよい。
The modified antigen is a modified lipoprotein with enhanced hydrophobicity in the amino acid sequence.
It may be a lipopeptide, a protein or a peptide, or a combination thereof.

修飾された抗原は、脂質と抗原との間にリンカーを結合させることができ、たとえば、セリン-セリンのジペプチドリンカーを介してN末端αまたはε-パルミトイルリジンを抗原に結合することができる。 The modified antigen can bind a linker between the lipid and the antigen, for example, the N-terminal α or ε-palmitoyl lysine via a serine-serine dipeptide linker.

一実施形態では、カチオン性脂質は、R-DOTAP、S-DOTAP、DOEPC、DDA、およびDOTMAを含む。カチオン性脂質は無毒であり、抗原の内在化とDC成熟を促進することができる。より具体的には、カチオン性脂質は、樹状細胞による抗原の内在化のみならず、そのプロセシング、細胞質への侵入、その後のin vivoでのMHCクラスIおよびII経路による提示の亢進を促進することができる。これによって、抗原特異的免疫応答が改善される。 In one embodiment, the cationic lipid comprises R-DOTAP, S-DOTAP, DOEPC, DDA, and DOTMA. Cationic lipids are non-toxic and can promote antigen internalization and DC maturation. More specifically, cationic lipids promote not only the internalization of the antigen by dendritic cells, but also its processing, cytoplasmic invasion, and subsequent enhanced presentation by the MHC class I and II pathways in vivo. be able to. This improves the antigen-specific immune response.

別の実施形態では、カチオン性脂質はDOTAPである。 In another embodiment, the cationic lipid is DOTAP.

さらに別の実施形態では、カチオン性脂質はDOTMAである。 In yet another embodiment, the cationic lipid is DOTMA.

別の実施形態では、カチオン性脂質はDOEPCである。 In another embodiment, the cationic lipid is DOEPC.

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は精製されている。 In some embodiments, the cationic lipid has been purified.

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はエナンチオマーである。 In some embodiments, the cationic lipid is an enantiomer.

いくつかの実施形態では、エナンチオマーは精製されている。 In some embodiments, the enantiomer is purified.

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とタンパク質抗原とを含む組成物は、DC癌ワクチンの製造におけるDC取り込みのための粒子状組成物を形成する。 In some embodiments, the composition comprising a cationic lipid and a protein antigen forms a particulate composition for DC uptake in the production of a DC cancer vaccine.

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とタンパク質抗原とを含む組成物は、DC癌ワクチンの製造におけるDC取り込みのためのナノ粒子組成物を形成する。 In some embodiments, the composition comprising a cationic lipid and a protein antigen forms a nanoparticle composition for DC uptake in the production of a DC cancer vaccine.

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、直径が約10,000nm未満である。 In some embodiments, the nanoparticles are less than about 10,000 nm in diameter.

いくつかの実施形態では、本発明は、単離された樹状細胞を、有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの癌抗原とを含む1つ以上の脂質でex vivoにて処理することを含む、癌樹状細胞ワクチンを製造する方法を提供する。抗原。 In some embodiments, the invention treats isolated dendritic cells ex vivo with one or more lipids, including an effective amount of at least one cationic lipid and at least one cancer antigen. Provided is a method for producing a cancer dendritic cell vaccine, including the above. antigen.

よって、本開示は、単離された樹状細胞を得て、(a)有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と、(b)少なくとも1つの癌抗原と、(c)少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、を含む組成物で、単離された樹状細胞を活性化することによって、活性化された樹状細胞を作製し、適切な数の活性化された樹状細胞を患者に投与することを含み、適切な数の活性化された樹状細胞を投与することによって、癌患者を治療する、癌患者を治療するための方法を提供する。 Thus, the present disclosure provides isolated dendritic cells with (a) an effective amount of at least one cationic lipid, (b) at least one cancer antigen, and (c) at least a growth factor or at least a cytokine. By activating isolated dendritic cells with a composition comprising, or a combination thereof, activated dendritic cells are produced and an appropriate number of activated dendritic cells is administered to the patient. Provided are methods for treating cancer patients, including treating cancer patients by administering an appropriate number of activated dendritic cells.

また、本開示は、組成物中の少なくとも1つの抗原に特異的なCD8+T細胞のレベルを周期的に確認することを含む、上記の方法による癌患者の治療の成功を評価する方法であって、評価工程は、組成物中の少なくとも1つの抗原に特異的なCD8+T細胞のレベルを周期的に確認し、樹状細胞を患者に投与した後に患者におけるTreg細胞のレベルを確認することを含み、抗原特異的CD8+T細胞のレベルが高く、Treg細胞のレベルが低いことが、患者に対して癌を効果的に治療していることを示す、方法を提供する。 Also disclosed is a method for assessing the success of treatment of a cancer patient by the method described above, comprising periodically checking the level of CD8 + T cells specific for at least one antigen in the composition. The evaluation step comprises periodically checking the level of CD8 + T cells specific for at least one antigen in the composition and checking the level of Treg cells in the patient after administering the dendritic cells to the patient. High levels of specific CD8 + T cells and low levels of Treg cells provide a method to show that patients are effectively treating cancer.

蛍光オボアルブミンを取り込んでいる細胞によって放射される幾何平均蛍光強度。2元ANOVAを用いて統計的有意性を評価したところ、*値は処理間で有意に異なっていた。Geometric mean fluorescence intensity emitted by cells incorporating fluorescent ovalbumin. When statistical significance was evaluated using binary ANOVA, the * values were significantly different between treatments. DCによって取り込まれ、プロセシングされたDQ-OVAの量を表す、ゲートされたCD11c陽性細胞の緑色蛍光の平均蛍光強度。Average fluorescence intensity of green fluorescence in gated CD11c positive cells, representing the amount of DQ-OVA taken up and processed by DC. 表記の濃度でのDOTAPの存在下におけるDCおよびTC1細胞によるDQ-OVAの取り込みを示す平均蛍光強度。Average fluorescence intensity indicating uptake of DQ-OVA by DC and TC1 cells in the presence of DOTAP at the indicated concentrations. マウスDCによるDQ-OVAの取り込みおよびプロセシングを示す緑色対赤色蛍光のフローサイトメトリー分析。Flow cytometric analysis of green vs. red fluorescence showing uptake and processing of DQ-OVA by mouse DC. DOTAPまたはMPLの存在下におけるマウスDCによるDQ-OVAの取り込みおよびプロセシングを示す緑色対赤色蛍光。Green vs. red fluorescence indicating uptake and processing of DQ-OVA by mouse DC in the presence of DOTAP or MPL. DQ-OVAの取り込みとプロセシングを示す、レーザー走査共焦点顕微鏡法およびフローサイトメトリー。Laser scanning confocal microscopy and flow cytometry showing uptake and processing of DQ-OVA. 相対吸光度(570nm)の測定値(任意の単位)を示すベータガラクトシダーゼアッセイ。2元ANOVAを用いて統計的有意性を評価したところ、*値は処理間で有意に異なっていた。A beta-galactosidase assay showing a measured value (arbitrary unit) of relative absorbance (570 nm). When statistical significance was evaluated using binary ANOVA, the * values were significantly different between treatments. DOTAPを含むまたは含まない場合で、OVA刺激BDMCの存在下でのOT1細胞によるH-チミジン取り込みの平均CPM。Average CPM of 3H -thymidine uptake by OT1 cells in the presence of OVA-stimulated BDMC with or without DOTAP. DO11.10脾細胞およびOVAp323-339によるH-チミジン取り込みの平均CPM。Average CPM of 3H -thymidine uptake by DO11.10 splenocytes and OVAp323-339. OVAのみまたはOVAとDOTAPを注射したマウスの流入領域リンパ節からのT細胞のCFSE希釈プロフィールのフローサイトメトリー分析。Flow cytometric analysis of the CFSE dilution profile of T cells from the influx region lymph nodes of mice injected with OVA alone or OVA and DOTAP. OVAおよび3種類のカチオン性脂質で「パルス」したBMDCの存在下でのOT1 T細胞増殖。培養の最後の18時間におけるH-チミジン取り込みの平均CPM。OT1 T cell proliferation in the presence of BMDCs "pulsed" with OVA and three cationic lipids. Average CPM of 3H -thymidine uptake in the last 18 hours of culture. カチオン性脂質(RDOTAP、DOTMA)または中性脂質(DOPC)と混合したパルミトイル化-KSSSIINFEKLペプチドまたは等張性スクロース(280mM)でパルスしたBMDCでワクチン接種したマウスからのT細胞のIFN- ELISPOTアッセイ。IFN-ELISPOT assay of T cells from mice vaccinated with palmitoylation-KSSIINFEKL peptide or isotonic sucrose (280 mM) pulsed with palmitoylation mixed with cationic lipids (RDOTAP, DOTMA) or neutral lipids (DOPC). カチオン性脂質(RDOTAP、DOTMA)または中性脂質(DOPC)と混合した腫瘍関連ペプチド(a)、HPV関連抗原および(b)ムチン1または等張性スクロース(280mM)でパルスしたBMDCでワクチン接種したマウスからのT細胞のIFN- ELISPOTアッセイ。Vaccinated with tumor-related peptide (a) mixed with cationic lipid (RDOTAP, DOTMA) or neutral lipid (DOPC), HPV-related antigen and (b) BMDC pulsed with mucin 1 or isotonic sucrose (280 mM). IFN-ELISPOT assay of T cells from mice. A:ELISpotによる、HPV16特異的CD8+T細胞誘導に対する、HPV16-E7、R-DOTAP/HPV16-E7、S-DOTAP/HPV16-E7およびAlum/MPL/HPV16-E7ワクチン接種による作用。B.確立されたHPV16陽性TC-1腫瘍の退縮に対する、R-DOTAP、R-DOTAP/HPV16-E7、S-DOTAP/HPV16-E7ワクチン接種の作用。A: Effect of ELISpot on HPV16-specific CD8 + T cell induction by HPV16-E7, R-DOTAP / HPV16-E7, S-DOTAP / HPV16-E7 and Alum / MPL / HPV16-E7 vaccination. B. Effect of R-DOTAP, R-DOTAP / HPV16-E7, S-DOTAP / HPV16-E7 vaccination on the regression of established HPV16-positive TC-1 tumors. フローサイトメトリーを用いて分析した、RF9特異的デキストラマーによる腫瘍浸潤HPV16特異的CD8+Tの定量。データは、各群4~5匹のマウスの平均+SEMを表す。Quantification of tumor infiltration HPV16-specific CD8 + T by RF9-specific dextramers analyzed using flow cytometry. The data represent the mean + SEM of 4-5 mice in each group. 腫瘍のあるマウスを様々なワクチンで治療した後の腫瘍内の調節性T細胞の定量。データは、各群4~5匹のマウスの平均+SEMを表す。*他のすべての群(R-DOTAPのみを除く)と比較した、統計的に有意なR-DOTAP+抗原。P<0.01。Quantification of regulatory T cells in tumors after treating tumor-bearing mice with various vaccines. The data represent the mean + SEM of 4-5 mice in each group. * Statistically significant R-DOTAP + antigen compared to all other groups (except R-DOTAP only). P <0.01. CD45+細胞中のHPV16 E7特異的CD8+T細胞に対するT調節性細胞(Treg)の比である。データは、各群4~5匹のマウスの平均+SEMを表す。The ratio of T-regulatory cells (Tregs) to HPV16 E7-specific CD8 + T cells in CD45 + cells. The data represent the mean + SEM of 4-5 mice in each group. 確立されたTC-1腫瘍の退縮に対するワクチン接種の作用。*他のすべての群と比較した、統計的に有意なR-DOTAP+抗原腫瘍退縮。P<0.01。The effect of vaccination on the established regression of TC-1 tumors. * Statistically significant R-DOTAP + antigen tumor regression compared to all other groups. P <0.01. IFN-γELISPOTによる、CD8+T細胞誘導の定量。データは、各群4~5匹のマウスの平均+SEMを表す。*他のすべての群と比較した、統計的に有意なR-DOTAP+抗原。P<0.01。ダネットの多重比較試験。Quantification of CD8 + T cell induction by IFN-γ ELISPOT. The data represent the mean + SEM of 4-5 mice in each group. * Statistically significant R-DOTAP + antigen compared to all other groups. P <0.01. Dunnett's multiple comparison test. R-DOTAPカチオン性脂質系ワクチン接種後の流入領域リンパ節におけるTリンパ球および全リンパ球の定量。Quantification of T lymphocytes and total lymphocytes in inflow area lymph nodes after R-DOTAP cationic lipid vaccination. ワクチン接種に応答するMCP-1およびIP-10レベルの定量。図は、ワクチン接種後12時間、24時間および48時間目のMCP-1およびIP-10のレベルを示す。Quantification of MCP-1 and IP-10 levels in response to vaccination. The figure shows the levels of MCP-1 and IP-10 12 hours, 24 hours and 48 hours after vaccination.

カチオン性脂質は、特にin vitroで細胞に対する毒性が報告されていることから、遺伝子トランスフェクション剤として想定される医薬品にはほとんど使用されていない。一方、樹状細胞を含む細胞にDNAおよびRNAを複合化して送達するためのトランスフェクション剤としてカチオン性脂質を使用することには成功している。また、この手法は、DCワクチンにおいてRNA/DNA剤を抗原として用いる場合にこれらを送達するのに使用されている。そのような場合には、正電荷が中和され、毒性が最小限に抑えられる。 Cationic lipids are rarely used in pharmaceuticals envisioned as gene transfection agents, especially since they have been reported to be toxic to cells in vitro. On the other hand, we have succeeded in using cationic lipids as transfection agents for complexing and delivering DNA and RNA to cells including dendritic cells. This technique has also been used to deliver RNA / DNA agents as antigens in DC vaccines. In such cases, the positive charge is neutralized and toxicity is minimized.

本明細書に記載の方法によって、タンパク質およびペプチド系樹状細胞療法を改善することが可能である。ex vivoで処理する場合、R-DOATP、S-DOTAP、DOEPC、DDA、DOTMAを含むクラスのカチオン性脂質は、毒性を限定的にする条件下で樹状細胞に投与することができ、樹状細胞による抗原の内在化のみならず、そのプロセシング、サイトゾルへの侵入、その後のin vivoでのMHCクラスIおよびII経路による提示を促進することができる。これによって、抗原特異的免疫応答が改善される。この効果は他の脂質に共通ではなく、むしろカチオン性脂質に特有のものであった。 The methods described herein can improve protein and peptide based dendritic cell therapy. When treated ex vivo, classes of cationic lipids including R-DOATP, S-DOTAP, DOEPC, DDA, DOTMA can be administered to dendritic cells under conditions that limit toxicity and are dendritic. It can promote not only the internalization of the antigen by cells, but also its processing, cytosol entry, and subsequent presentation by the MHC class I and II pathways in vivo. This improves the antigen-specific immune response. This effect was not common to other lipids, but rather unique to cationic lipids.

また、この効果は、最近報告された免疫アジュバントとしてのカチオン性脂質の効果とは無関係である。なぜなら、強い(R-DOTAP、DOTMA)カチオン性脂質アジュバントと弱い(S-DOTAP、DDA)カチオン性脂質アジュバントの両方ならびに、in vivoで免疫アジュバントとしての作用がないことが示されている中性脂質で同様の効果がもたらされたためである。また、S-DOTAPとDDAのいずれも、過去に報告された研究ではin vivoで効果的な抗原特異的免疫応答を誘導しなかったが、現在ではex vivoで抗原プロセシングと抗原の提示を促進することが示されている。抗原の取り込み、プロセシングおよび提示を容易にすることにおけるこの効果は、in
vitro/ex vivoの条件設定する際、樹状細胞とカチオン性脂質を近接させることによって容易になることもあるが、in vivoでは必ずしも起こらない。この重要な発見によって、一層効果的なex vivoでの樹状細胞療法の開発におけるカチオン性脂質の新たな用途につながっている。今日まで、カチオン性脂質のこの能力は知られていなかったため、ex vivoでの樹状細胞療法でカチオン性脂質を用いてタンパク質およびペプチドの取り込みと提示を促進することは報告されていない。
Also, this effect is independent of the recently reported effect of cationic lipids as an immune adjuvant. Because both strong (R-DOTAP, DOTMA) cationic lipid adjuvants and weak (S-DOTAP, DDA) cationic lipid adjuvants, as well as neutral lipids that have been shown to have no action as immunoadjudicants in vivo. This is because the same effect was brought about in. Also, neither S-DOTAP nor DDA induced an effective antigen-specific immune response in vivo in previously reported studies, but now ex vivo promotes antigen processing and antigen presentation. It is shown that. This effect in facilitating antigen uptake, processing and presentation is in
When setting conditions for in vitro / ex vivo, it may be facilitated by bringing dendritic cells and cationic lipids close to each other, but this does not always occur in vivo. This important discovery has led to new uses for cationic lipids in the development of more effective ex vivo dendritic cell therapies. To date, this ability of cationic lipids has not been known, and therefore it has not been reported that cationic lipids are used to promote protein and peptide uptake and presentation in ex vivo dendritic cell therapy.

以下、本発明の様々な実施形態を記載する。本明細書に記載の一実施形態では、ex vivoの樹状細胞治療組成物が提供される。この組成物は、少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを有する1つ以上の脂質を含む。この組成物は、他の脂質ならびに、樹状細胞の生存率および増殖を亢進させるための成長因子を含んでもよい。 Hereinafter, various embodiments of the present invention will be described. In one embodiment described herein, ex vivo dendritic cell therapy compositions are provided. The composition comprises one or more lipids having at least one cationic lipid and at least one antigen. The composition may contain other lipids as well as growth factors for enhancing the viability and proliferation of dendritic cells.

対象が哺乳動物である場合には、ex vivoで対象の樹状細胞を治療する方法が提
供される。この方法は、有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質および抗原を、in vitroでの細胞の維持と成長を容易にするために場合によってはGM-CSFおよびサイトカインなどの成長因子と一緒に含む1つ以上の脂質で樹状細胞を処理する工程を含む。
If the subject is a mammal, a method of treating the subject's dendritic cells with ex vivo is provided. This method comprises an effective amount of at least one cationic lipid and antigen, optionally with growth factors such as GM-CSF and cytokines, to facilitate cell maintenance and growth in vitro. The step of treating dendritic cells with the above lipids is included.

哺乳類において予防用または治療用の免疫応答を増強する方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質および抗原を、場合によってはGM-CSFおよびサイトカインなどの成長因子と一緒に含む1つ以上の脂質で樹状細胞を処理する工程と、成熟した樹状細胞を対象に投与する工程と、を含む。様々な実施形態において、組成物は、少なくとも1つのカチオン性脂質および少なくとも1つの抗原を有する1つ以上の脂質を含む。 Methods are provided for enhancing a prophylactic or therapeutic immune response in mammals. This method matures with the step of treating dendritic cells with one or more lipids containing at least one cationic lipid and antigen in effective amounts, optionally with growth factors such as GM-CSF and cytokines. Includes a step of administering a dendritic cell to a subject. In various embodiments, the composition comprises at least one cationic lipid and one or more lipids having at least one antigen.

この発見によって、極めて限られた量で抗原を提示できる自己の腫瘍由来の抗原をベースにした樹状細胞ワクチンの開発と、タンパク質では極めて低用量の抗原の投与を可能にするためのペプチド系の樹状細胞ワクチンにおいて、大きな利点を提供し得る。樹状細胞ワクチンの手法は重要な将来性を示しているが、しっかりしたT細胞応答が欠けていることから、実施可能な癌療法としてのその有効性と用途は限られてしまっている。本開示は、カチオン性脂質の使用を限定的な毒性で使用して、自己の腫瘍由来の抗原またはタンパク質およびペプチド系抗原を利用するこのような樹状細胞ワクチンの効力を増強し得ることを証明する。 This discovery will lead to the development of dendritic cell vaccines based on self-tumor-derived antigens capable of presenting antigens in very limited amounts, and peptide-based proteins to enable administration of very low doses of antigens. It can provide great advantages in dendritic cell vaccines. Although the dendritic cell vaccine approach offers significant potential, its lack of robust T-cell response limits its effectiveness and use as a viable cancer therapy. The present disclosure demonstrates that the use of cationic lipids can be used with limited toxicity to enhance the efficacy of such dendritic cell vaccines utilizing their own tumor-derived antigens or protein and peptide-based antigens. do.

以下、本発明の様々な実施形態を次のとおり記載する。本明細書に記載の一実施形態では、ex vivoでの樹状細胞治療組成物が提供される。この組成物は、少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを有する1つ以上の脂質を含む。この組成物は、他の脂質ならびに、樹状細胞の生存率および増殖を向上させるための成長因子を含んでもよい。 Hereinafter, various embodiments of the present invention will be described as follows. In one embodiment described herein, an ex vivo dendritic cell therapy composition is provided. The composition comprises one or more lipids having at least one cationic lipid and at least one antigen. The composition may contain other lipids as well as growth factors to improve the viability and proliferation of dendritic cells.

本発明は、MHCクラスIおよびクラスIIの文脈にて、樹状細胞への抗原提示ならびにCD4+およびCD8+T細胞への提示を安全に促進するワクチン剤としてカチオン性脂質を使用できることを示す。カチオン性脂質は、高レベルの腫瘍に浸潤するT細胞の誘導を促進する一方、腫瘍微小環境内のTreg集団の有意な減少も誘導するのに有効である。これらの効果は、腫瘍細胞の非常に効果的な死滅につがるTreg対CD8+T細胞比を低減することによって、腫瘍微小環境を大幅に変化させる。Therapeutic
Cancer Vaccines J Clin Invest.2015;125(9):3401-3412の最近のレビューにおいて、Meliefらは、次のように述べている。「最適には至らないワクチン設計と免疫抑制性の癌微小環境は、癌の撲滅に至らない根本的な原因である。薬剤や物理的な治療は、免疫抑制性の癌微小環境を和らげることができ、化学療法、放射線、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)阻害剤、T細胞チェックポイントの阻害剤、選択されたTNF受容体ファミリーメンバーのアゴニスト、望ましくないサイトカインの阻害剤が含まれる。そのような免疫調節と組み合わせた治療用ワクチン接種の特異性は、将来の癌療法の開発に向けて魅力的な手段を提供する。
抗原
The present invention shows that in the context of MHC class I and class II, cationic lipids can be used as vaccines to safely promote antigen presentation to dendritic cells and presentation to CD4 + and CD8 + T cells. Cationic lipids promote the induction of T cells that infiltrate high levels of tumors, while also being effective in inducing a significant reduction in the Treg population within the tumor microenvironment. These effects significantly alter the tumor microenvironment by reducing the Treg to CD8 + T cell ratio, which leads to the highly effective killing of tumor cells. Therapeutic
Cancer Vaccines J Clin Invest. In a recent review of 2015; 125 (9): 3401-3421, Melief et al. Stated: "Unoptimal vaccine design and immunosuppressive cancer microenvironments are the root causes of cancer eradication. Drugs and physical treatments can relieve immunosuppressive cancer microenvironments. It can include chemotherapy, radiation, indolamine 2,3-dioxygenase (IDO) inhibitors, T cell checkpoint inhibitors, selected TNF receptor family member agonists, and unwanted cytokine inhibitors. The specificity of therapeutic vaccination combined with such immunosuppression provides an attractive tool for the development of future cancer therapies.
antigen

一実施形態では、カチオン性脂質は、患者自身の腫瘍由来の抗原などの自己抗原とともに投与される。別の実施形態では、カチオン性脂質は、合成ペプチド、組換えタンパク質またはDNAなどの非自己抗原と組み合わせて投与される。それぞれの場合において、目的は、抗原に特異的な免疫応答を惹起することであり、その抗原とともに樹状細胞がカチオン性脂質と一緒に処理される。ex vivoで処理された樹状細胞の注入時に生じるin vivoでの応答は、特定の細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞またはB細胞の産
生を含むことがあり、これらの抗原に関連する特定の疾患の予防または当該疾患に対する治療応答につながる。抗原は、どのような腫瘍関連抗原または微生物抗原であってもよく、当業者に知られた他のどのような抗原であってもよい。
In one embodiment, the cationic lipid is administered with an autoantigen such as an antigen derived from the patient's own tumor. In another embodiment, the cationic lipid is administered in combination with a non-self antigen such as a synthetic peptide, recombinant protein or DNA. In each case, the purpose is to elicit an antigen-specific immune response, along with which dendritic cells are treated with cationic lipids. The in vivo response that occurs upon injection of ex vivo-treated dendritic cells may include the production of certain cytotoxic T cells, memory T cells or B cells, and certain specific antigens associated with these antigens. It leads to prevention of the disease or therapeutic response to the disease. The antigen may be any tumor-related antigen or microbial antigen, and may be any other antigen known to those of skill in the art.

本明細書で使用する場合、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍または癌細胞に関連し、MHC分子の文脈において抗原提示細胞の表面で発現されると免疫応答(体液性および/または細胞性)を引き起こすことが可能な分子または化合物(たとえば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、RNAおよび/またはDNA)である。腫瘍関連抗原には、自己抗原ならびに、癌に特異的に関連しないかもしれないが、それにもかかわらず動物に投与した場合に腫瘍または癌細胞の免疫応答を増強および/または低下させる他の抗原が含まれる。より具体的な実施形態を本明細書で提供する。 As used herein, a "tumor-related antigen" is associated with a tumor or cancer cell and, when expressed on the surface of an antigen-presenting cell in the context of an MHC molecule, provides an immune response (humoral and / or cellular). A molecule or compound that can be triggered (eg, protein, peptide, polypeptide, lipoprotein, lipopeptide, glycoprotein, glycopeptide, lipid, glycolipid, carbohydrate, RNA and / or DNA). Tumor-related antigens include self-antigens and other antigens that may not be specifically associated with cancer but nevertheless enhance and / or reduce the immune response of the tumor or cancer cells when administered to animals. included. More specific embodiments are provided herein.

本明細書で使用する場合、「微生物抗原」は、微生物の抗原であり、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫および感染性真菌を含むがこれらに限定されるものではない。微生物抗原は、無傷の微生物、天然の単離物、断片またはそれらの誘導体、天然に存在する微生物抗原と同一または類似の合成化合物であり、好ましくは(天然に存在する微生物抗原が得られた起源である)対応する微生物に特異的な免疫応答を誘導する。好ましい実施形態では、化合物は、天然に存在する微生物の抗原と同様の免疫応答(体液性および/または細胞性)を誘導するのであれば、天然に存在する微生物の抗原と同等である。天然に存在する微生物の抗原と同等である化合物または抗原は、たとえば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、RNA、および/またはDNAなど、などの当業者に周知である。天然に存在する微生物の抗原と類似である化合物の別の非限定的な例は、多糖抗原のペプチド模倣物である。 As used herein, "microbial antigen" is an antigen of a microorganism, including, but not limited to, infectious viruses, infectious bacteria, infectious parasites and infectious fungi. Microbial antigens are intact microorganisms, natural isolates, fragments or derivatives thereof, synthetic compounds identical to or similar to naturally occurring microbial antigens, preferably (origin from which naturally occurring microbial antigens were obtained). ) Induces an immune response specific to the corresponding microorganism. In a preferred embodiment, the compound is equivalent to a naturally occurring microbial antigen as long as it induces an immune response (humoral and / or cellular) similar to that of a naturally occurring microbial antigen. Compounds or antigens that are equivalent to naturally occurring microbial antigens include, for example, proteins, peptides, polypeptides, lipoproteins, lipopeptides, glycoproteins, glycopeptides, lipids, glycolipids, carbohydrates, RNA, and / or DNA. Etc., which are well known to those in the art. Another non-limiting example of a compound that is similar to a naturally occurring microbial antigen is a peptide mimetic of a polysaccharide antigen.

「抗原」という用語は、本明細書に記載されているものなどの既知の抗原または野生型抗原のペプチドまたはタンパク質類似体を包含することをさらに意図する。類似体は、野生型抗原よりも可溶性または安定性が高く、抗原を免疫学的に一層活性化する変異または修飾も含み得る。抗原は、脂質または糖部分の付加、ペプチドまたはタンパク質アミノ酸配列の変異、DNAまたはRNA配列の変異または当業者に知られた他の何らかの修飾など、どのような方法でも修飾することができる。抗原は、当業者に知られた標準的な方法を用いて修飾することができる。 The term "antigen" is further intended to include peptide or protein analogs of known or wild-type antigens, such as those described herein. Analogs are more soluble or stable than wild-type antigens and may also contain mutations or modifications that further immunologically activate the antigen. The antigen can be modified in any way, including addition of lipid or sugar moieties, mutations in peptide or protein amino acid sequences, mutations in DNA or RNA sequences, or any other modification known to those of skill in the art. The antigen can be modified using standard methods known to those of skill in the art.

同じく本発明の組成物および方法において有用なのが、所望の抗原のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質であり、この場合、その相同性を有する抗原がそれぞれの腫瘍、微生物または感染細胞に対する免疫応答を誘導する。 Also useful in the compositions and methods of the invention are peptides or proteins having an amino acid sequence that is homologous to the amino acid sequence of the desired antigen, in which case the antigen having that homology is the respective tumor, microorganism or infected cell. Induces an immune response to.

一実施形態では、カチオン性脂質複合体の抗原は、腫瘍を予防または治療するためのワクチンを製造するための、腫瘍または癌に関連する抗原、すなわち腫瘍関連抗原を含む。このように、一実施形態では、本発明の腫瘍ワクチンまたは癌ワクチンは、少なくとも1つの腫瘍関連抗原の少なくとも1つのエピトープをさらに含む。別の好ましい実施形態では、本発明の腫瘍ワクチンまたは癌ワクチンは、1つ以上の腫瘍関連抗原由来の複数のエピトープをさらに含む。本発明のカチオン性脂質複合体および方法において使用される腫瘍関連抗原は、本質的に免疫原性または非免疫原性、あるいはわずかに免疫原性であり得る。本明細書に証明されるように、腫瘍関連自己抗原ですら、治療効果を得るべく本ワクチンに有利に使用することができる。これは、本組成物がこのような抗原に対する免疫寛容を破壊することができるためである。例示的な抗原としては、合成抗原、組換え抗原、外来抗原または相同性を有する抗原があげられるが、これらに限定されるものではなく、抗原の材料としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプ
チド、脂質、糖脂質、炭水化物、RNA、DNAがあげられるが、これらに限定されるものではない。このような治療法の例として、乳癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、腸癌、あるいは免疫療法に感受性である従来技術において知られた他の癌の治療または予防があげられるが、これらに限定されるものではない。そのようなex vivoでの治療法では、カプセル封入せずに抗原をカチオン性脂質と組み合わせることも可能である。
In one embodiment, the antigen of the cationic lipid complex comprises a tumor or cancer-related antigen, i.e., a tumor-related antigen, for producing a vaccine for preventing or treating a tumor. Thus, in one embodiment, the tumor vaccine or cancer vaccine of the invention further comprises at least one epitope of at least one tumor-related antigen. In another preferred embodiment, the tumor vaccine or cancer vaccine of the invention further comprises a plurality of epitopes derived from one or more tumor-related antigens. The tumor-related antigens used in the cationic lipid complexes and methods of the invention can be immunogenic, non-immunogenic, or slightly immunogenic in nature. As evidenced herein, even tumor-related self-antigens can be used in favor of the vaccine to obtain therapeutic effects. This is because the composition can disrupt immune tolerance to such antigens. Exemplary antigens include, but are not limited to, synthetic antigens, recombinant antigens, foreign antigens or antigens with homology, and the materials for the antigens include proteins, peptides, polypeptides and lipos. Examples include, but are not limited to, proteins, lipopeptides, lipids, glycolipids, carbohydrates, RNA and DNA. Examples of such treatments are breast cancer, head and neck cancer, melanoma, cervical cancer, lung cancer, prostate cancer, intestinal cancer, or the treatment or prevention of other cancers known in the art that are sensitive to immunotherapy. However, it is not limited to these. In such ex vivo treatments, it is also possible to combine the antigen with a cationic lipid without encapsulation.

本発明で使用するのに適した腫瘍関連抗原としては、単一の腫瘍型の指標となり得る、いくつかのタイプの腫瘍で共有される、および/または腫瘍細胞において排他的に発現されるか正常な細胞と比較して過剰に発現される、天然に存在する分子と修飾された分子の両方があげられる。タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド、リポペプチドに加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質、ムチンの発現の腫瘍特異的なパターンも示されている。癌ワクチンに使用される例示的な腫瘍関連抗原としては、腫瘍遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍細胞に特有の変異または再構成を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化胚遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的(ただし腫瘍特異的ではない)分化抗原、成長因子受容体、細胞表面の炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、多数の他の自己タンパク質があげられる。 Tumor-related antigens suitable for use in the present invention can be indicators of a single tumor type, are shared by several types of tumors, and / or are exclusively expressed or normal in tumor cells. These include both naturally occurring and modified molecules that are overexpressed compared to normal cells. In addition to proteins, glycoproteins, lipoproteins, peptides and lipopeptides, tumor-specific patterns of expression of carbohydrates, gangliosides, glycolipids and mutin have also been shown. Exemplary tumor-related antigens used in cancer vaccines include tumor genes, tumor suppressor genes, protein products of other genes with mutations or rearrangements specific to tumor cells, reactivated embryo gene products, and cancer fetal. These include antigens, tissue-specific (but not tumor-specific) differentiation antigens, growth factor receptors, cell surface carbohydrate residues, exogenous viral proteins, and numerous other autoproteins.

腫瘍関連抗原の特定の実施形態としては、たとえば、Ras p21癌原遺伝子、腫瘍抑制因子p53、HER-2/neuおよびBCR-abl癌遺伝子のタンパク質産物などの変異抗原または改変抗原、ならびにCDK4、MUM1、カスパーゼ8、ベータカテニン;ガレクチン4、ガレクチン9、炭酸脱水酵素、アルドラーゼA、PRAME、Her2/neu、ErbB-2およびKSAなどの過剰発現抗原;アルファフェトプロテイン(AFP)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)などの癌胎児性抗原;癌胚性抗原(CEA)などの自己抗原およびMart1 / MelanA、gp100、gp75、チロシナーゼ、TRP1およびTRP2などのメラノサイト分化抗原;PSA、PAP、PSMA、PSM-P1およびPSM-P2などの前立腺関連抗原;MAGE1、MAGE3、MAGE4、GAGE1、GAGE2、BAGE、RAGE、さらにはNY-ESO1、SSX2およびSCP1といった他の癌精巣抗原などの再活性化胚遺伝子産物; Muc-1およびMuc-2などのムチン;GM2、GD2、GD3などのガングリオシド、Lewis(y)およびglobo-Hなどの中性糖脂質および糖タンパク質;Tn、Thompson-Freidenreich抗原(TF)およびsTnなどの糖タンパク質があげられる。また、本明細書における腫瘍関連抗原としては、全細胞および腫瘍細胞溶解物ならびにその免疫原性部分、さらにはB細胞リンパ腫に対して用いられるBリンパ球のモノクローナル増殖で発現される免疫グロブリンイディオタイプがあげられる。 Specific embodiments of tumor-related antigens include, for example, mutant or modified antigens such as Ras p21 proto-oncogene, tumor suppressor p53, HER-2 / neu and protein products of BCR-abl cancer genes, and CDK4, MUM1. , Caspase 8, beta-catenin; overexpressing antigens such as galectin 4, galectin 9, carbonate dehydratase, aldolase A, PRAME, Her2 / neu, ErbB-2 and KSA; alphafetoprotein (AFP), human villous gonadotropin (hCG). Cancer fetal antigens such as; self-antigens such as cancer embryonic antigens (CEA) and melanosite differentiation antigens such as Mart1 / MelanA, gp100, gp75, tyrosinase, TRP1 and TRP2; PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 and PSM- Prostate-related antigens such as P2; reactivated embryonic gene products such as MAGE1, MAGE3, MAGE4, GAGE1, GAGE2, BAGE, RAGE, and other cancer testicular antigens such as NY-ESO1, SSX2 and CSP1; Muc-1 and Muc Mutin such as -2; gangliosides such as GM2, GD2, GD3, neutral glycolipids and glycoproteins such as Lewis (y) and globo-H; Be done. Tumor-related antigens herein include whole cells and tumor cell lysates and their immunogenic portions, as well as immunoglobulin idiotypes expressed by monoclonal proliferation of B lymphocytes used for B cell lymphoma. Can be given.

腫瘍関連抗原およびそのそれぞれの腫瘍細胞標的としては、たとえば、悪性癌に対する抗原として、サイトケラチン、特にサイトケラチン8、18、19があげられる。上皮膜抗原(EMA)、ヒト胚抗原(HEA-125)、ヒト乳脂肪球、MBr1、MBr8、Ber-EP4,17-1A、C26、T16も既知の癌腫抗原である。デスミンおよび筋肉特異的アクチンは、筋原性の肉腫の抗原である。胎盤アルカリ性ホスファターゼ、β-ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、α-フェトプロテインは、栄養膜および胚細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異的抗原は、前立腺癌の抗原、結腸腺癌の癌胎児性抗原である。HMB-45は、黒色腫の抗原である。子宮頸癌では、有用な抗原がヒトパピローマウイルスによってコードされている可能性がある。クロマグラニン-Aおよびシナプトフィジンは、神経内分泌腫瘍および神経外胚葉性腫瘍の抗原である。特に興味深いのは、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する攻撃的な腫瘍である。そのような壊死細胞の溶解は、抗原提示細胞のための抗原の豊富な供給源であり、したがって、本治療法には、従来の化学療法および/または放射線療法と組み合わせて有利な用途を見いだすことができる。 Tumor-related antigens and their respective tumor cell targets include, for example, cytokeratin, particularly cytokeratin 8, 18, 19 as an antigen for malignant cancer. Capsular antigen (EMA), human embryo antigen (HEA-125), human milk fat globules, MBr1, MBr8, Ber-EP4, 17-1A, C26, T16 are also known carcinoma antigens. Desmin and muscle-specific actin are antigens of myogenic sarcoma. Placental alkaline phosphatase, β-human chorionic gonadotropin, and α-fetoprotein are antigens for trophoblasts and germ cell tumors. Prostate-specific antigens are prostate cancer antigens and carcinoembryonic antigens of colon adenocarcinoma. HMB-45 is an antigen for melanoma. In cervical cancer, useful antigens may be encoded by the human papillomavirus. Chromagranin-A and synaptophysin are antigens for neuroendocrine and neuroectodermal tumors. Of particular interest are aggressive tumors that form solid tumor masses with necrotic areas. Dissolution of such necrotic cells is a rich source of antigen for antigen-presenting cells, and therefore this treatment finds advantageous uses in combination with conventional chemotherapy and / or radiation therapy. Can be done.

腫瘍関連抗原は、従来技術において周知の方法で調製することができる。たとえば、これらの抗原は、(たとえばCohen et al.,Cancer Res.,54:1055(1994)に記載されているように)癌細胞の粗抽出物を調製する、抗原を部分的に精製する、組換え技術による、あるいは既知の抗原のde novo合成によるなどの方法で、癌細胞から調製することができる。また、抗原は、対象における発現および免疫される対象の免疫系への提示に適した形態の抗原ペプチドをコードする核酸の形態であってもよい。さらに、抗原は完全抗原であってもよいし、少なくとも1つのエピトープを含む完全抗原の断片であってもよい。 Tumor-related antigens can be prepared by methods well known in the art. For example, these antigens prepare a crude extract of cancer cells (eg, as described in Cohen et al., Cancer Res., 54: 1055 (1994)), partially purifying the antigens. It can be prepared from cancer cells by methods such as by recombinant techniques or by de novo synthesis of known antigens. The antigen may also be in the form of a nucleic acid encoding an antigenic peptide in a form suitable for expression in the subject and presentation to the immune system of the subject to be immunized. Further, the antigen may be a complete antigen or may be a fragment of a complete antigen containing at least one epitope.

ある種の癌の素因となることが知られている病原体由来の抗原も、本発明の癌ワクチンに有利に含むことができる。全世界での癌発生率の16%近くが感染性病原体に起因すると推定でき、いくつかの一般的な悪性疾患は、特定のウイルス遺伝子産物が発現することで特徴付けられる。よって、癌の発生に関与する病原体由来の1つ以上の抗原を含むことで、宿主の免疫応答を拡大し、癌ワクチンの予防効果または治療効果を増す一助となり得る。本明細書で提供する癌ワクチンで使用される特に興味深い病原体として、B型肝炎ウイルス(肝細胞癌)、C型肝炎ウイルス(肝腫)、エプスタインバーウイルス(EBV)(バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、免疫抑制個体におけるPTLD)、HTLVL(成人T細胞白血病)、発がん性ヒトパピローマウイルス16、18、33、45型(成人子宮頸癌)、ヘリコバクターピロリ菌(B細胞胃リンパ腫)があげられる。哺乳動物、特にヒトにおいて抗原として働くことができる他の医学的に関連する微生物は、C.G.A Thomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall,Great Britain 1983などの文献に記載されており、その内容全体を本明細書に援用する。 Antigens derived from pathogens known to predispose to certain types of cancer can also be advantageously included in the cancer vaccines of the invention. It can be estimated that nearly 16% of global cancer incidence is due to infectious pathogens, and some common malignancies are characterized by the expression of specific viral gene products. Thus, inclusion of one or more antigens from pathogens involved in the development of cancer can help expand the immune response of the host and enhance the prophylactic or therapeutic effect of the cancer vaccine. Of particular interest as pathogens used in the cancer vaccines provided herein are hepatitis B virus (hepatocellular carcinoma), hepatitis C virus (hepatic tumor), Epstein-Barr virus (EBV) (Berkit lymphoma, nasopharyngeal cancer). , PTLD in immunosuppressed individuals), HTLVL (adult T-cell leukemia), carcinogenic human papillomavirus types 16, 18, 33, 45 (adult cervical cancer), Helicobacter pylori (B-cell gastric lymphoma). Other medically related microorganisms that can act as antigens in mammals, especially humans, include C.I. G. A It is described in documents such as Thomas, Medical Microbiology, Balliere Tindall, Great Britain 1983, and the entire contents thereof are incorporated herein by reference.

別の実施形態では、抗原は、病原体に由来する抗原または病原体に関連する抗原、すなわち微生物抗原を含む。このように、一実施形態では、本発明の病原体ワクチンは、少なくとも1つの微生物抗原の少なくとも1つのエピトープをさらに含む。本ワクチンの標的になり得る病原体としては、ウイルス、細菌、寄生虫および真菌があげられるが、これらに限定されるものではない。別の実施形態では、本発明の病原体ワクチンは、1つ以上の微生物抗原由来の複数のエピトープをさらに含む。 In another embodiment, the antigen comprises an antigen derived from or associated with a pathogen, i.e. a microbial antigen. Thus, in one embodiment, the pathogen vaccine of the invention further comprises at least one epitope of at least one microbial antigen. Pathogens that can be targeted by this vaccine include, but are not limited to, viruses, bacteria, parasites and fungi. In another embodiment, the pathogen vaccine of the invention further comprises a plurality of epitopes derived from one or more microbial antigens.

カチオン性脂質複合体および方法において有用な微生物抗原は、固有の免疫原性を有してもよく、または非免疫原性であってもよく、あるいはわずかに免疫原性であってもよい。例示的な抗原としては、合成抗原、組換え抗原、外来抗原または相同性を有する抗原があげられるが、これらに限定されるものではなく、抗原の材料としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、RNA、DNAがあげられるが、これらに限定されるものではない。 Microbial antigens useful in cationic lipid complexes and methods may have intrinsic immunogenicity, may be non-immunogenic, or may be slightly immunogenic. Exemplary antigens include, but are not limited to, synthetic antigens, recombinant antigens, foreign antigens or antigens with homology, and the materials for the antigens include proteins, peptides, polypeptides and lipos. Examples include, but are not limited to, proteins, lipopeptides, lipids, glycolipids, carbohydrates, RNA and DNA.

例示的なウイルス病原体としては、哺乳動物、特にヒトに感染するウイルスがあげられるが、これらに限定されるものではない。ウイルスの例としては、レトロウイルス科(たとえば、HIV-1などのヒト免疫不全ウイルス(HTLV-III、LAVまたはHTLV-III/LAVまたはHIV-IIIとも呼ばれる;ならびにHIV-LPなどの他の分離株など)、ピコルナウイルス科(たとえば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルスなど)、カリシウイルス科(たとえば、胃腸炎を引き起こす菌株など)、トガウイルス科(たとえば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルスなど)、フラビウイルス科(たとえば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルスなど)、コロナウイルス科(たとえば、コロナウイルスなど)、ラブドウイルス科(たとえば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルスなど)、フィロウイルス科(たとえば、エボラウイルスなど)、パラミクソウイルス科(たとえば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体
ウイルスなど)、オルソミクソウイルス科(たとえば、インフルエンザウイルスなど)、ブンガウイルス科(たとえば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、プラボウイルス、ナイロウイルスなど)、アレナウイルス科(出血熱ウイルス)、レオウイルス科(たとえば、レオウイルス、アルボウイルス、ロタウイルスなど)、ビルナウイルス科、ヘパドナウイルス科(B型肝炎ウイルス)、パルボウイルス科(パルボウイルス)、パポバウイルス科(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス)、アデノウイルス科(大半のアデノウイルス)、ヘルペスウイルス科(単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス科(Poxyiridae)(痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス)、イリドウイルス科(たとえば、アフリカ豚コレラウイルスなど)、未分類のウイルス(たとえば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の因子(B型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられている)、非A非B型肝炎の因子(クラス1=内因的に伝染、クラス2=非経口的に伝染(すなわち、C型肝炎)、ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、アストロウイルス)があげられるが、これらに限定されるものではない。
Exemplary viral pathogens include, but are not limited to, viruses that infect mammals, especially humans. Examples of viruses include human immunodeficiency viruses such as HIV-1 (also referred to as HTLV-III, LAV or HTLV-III / LAV or HIV-III; and other isolates such as HIV-LP). Picornavirus family (eg, poliovirus, hepatitis A virus; enterovirus, human coxsackie virus, rhinovirus, echovirus, etc.), calicivirus family (eg, strains that cause gastroenteritis), togavirus family (eg, etc.) , Horse encephalitis virus, ruin virus, etc.), Flavivirus family (eg, dengue virus, encephalitis virus, yellow fever virus, etc.), Coronavirus family (eg, coronavirus, etc.), Rabdovirus family (eg, bullous stomatitis virus, mad dog disease, etc.) Family of phylloviruses (eg, Ebola virus), Paramyxoviruses (eg, parainfluenza virus, epidemic parotitis, measles virus, respiratory follicles virus, etc.), Orthomyxoviruses (eg, respiratory follicles virus, etc.) , Influenza virus, etc.), Bungavirus family (eg, Hantan virus, Bungavirus, Pravovirus, Nyrovirus, etc.), Arenavirus family (hemorrhagic fever virus), Leovirus family (eg, Leovirus, Arbovirus, Rotavirus) , Birnavirus family, Hepadnavirus family (hepatitis B virus), Parvovirus family (parvovirus), papovavirus family (papillomavirus, polyomavirus), adenovirus family (most adenovirus), herpesvirus Family (simple herpesvirus (HSV) 1 and 2, varicella herpes virus, cytomegalovirus (CMV), herpesvirus), Poxylidae (pox virus, vaccinia virus, poxvirus), iridvirus family (eg , African pig cholera virus, etc.), unclassified virus (eg, causal encephalopathy pathogen, delta hepatitis factor (believed to be a hepatitis B virus deficient satellite), non-A non-B hepatitis Factors (class 1 = endogenous transmission, class 2 = parenteral transmission (ie, hepatitis C), nowalk virus and related viruses, astrovirus) are, but are not limited to.

また、脊椎動物では、グラム陰性菌およびグラム陽性菌を本組成物および方法の標的とすることができる。このようなグラム陽性菌としては、パスツレラ種、ブドウ球菌種、ストレプトコッカス種があげられるが、これらに限定されるものではない。グラム陰性菌としては、大腸菌、シュードモナス種、サルモネラ種があげられるが、これらに限定されるものではない。感染性細菌の具体例として、Helicobacter pylori、Borella burgdorferiLegionella pneumophiliaii、Mycobacteria sps(たとえば、M.tuberculosis、M.avium、M.intracellulare、M.kansaii、M.gordonaeなど)、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes(A群Streptococcus)、Streptococcus agalactiae(B群Streptococcus)、Streptococcus(ビリダンス群)、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、Streptococcus(anaerobic sps.)、Streptococcus pneumoniae、病原性Campylobacter sps.、Enterococcus sp.、Haemophilus infuenzae、Bacillus antracis、corynebacterium diphtheriae、corynebacterium sp.、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringers、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides sp.、Fusobacterium nucleatumii、Streptobacillus moniliformis、Treponema pallidium、Treponema pertenue、Leptospira、Rickettsia、Actinomyces israeliiがあげられるが、これらに限定されるものではない。 Also, in vertebrates, Gram-negative and Gram-positive bacteria can be targeted by the compositions and methods. Examples of such Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Pasteurella species, Staphylococcus species, and Streptococcus species. Examples of Gram-negative bacteria include, but are not limited to, Escherichia coli, Pseudomonas, and Salmonella. Specific examples of infectious bacteria, Helicobacter pylori, Borella burgdorferiLegionella pneumophiliaii, Mycobacteria sps (e.g., M.tuberculosis, M.avium, M.intracellulare, M.kansaii, etc. M.gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis , Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (A group Streptococcus), Streptococcus agalactiae (B group Streptococcus), Streptococcus (viridans group), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sps. , Enterococcus sp. , Haemophilus influenza, Bacillus anthracis, corynebacterium diphtheria, corynebacterium sp. , Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pastelella muscle. , Fusobacterium nucleatumi, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pallidium, Leptospira, Rickettsia, Actinomyces, but not limited to Actinomyces.

本組成物中の微生物抗原の供給源として有用でありうる細菌病原体のポリペプチドとしては、鉄調節外膜タンパク質(「IROMP」)、外膜タンパク質(「OMP」)、フルネグリシスを引き起こすAeromonis salmonicidaのAタンパク質、細菌性腎疾患(「BKD」)を引き起こすRenibacterium salmoninarumのp57タンパク質、主要表面関連抗原(「msa」)、表面発現細胞毒(「mpr」)、表面発現溶血素(「ish」)、Yersiniosisの鞭毛抗原、細胞外タンパク質(「ECP」)、鉄調節外膜タンパク質(「IROMP」)、パスツレラ症
の構造タンパク質、OMPおよびVibrosis anguillarumおよびV.ordaliiの鞭毛タンパク質、Edwardsiellosis ictaluriおよびE.tardaの鞭毛タンパク質、OMPタンパク質、aroA、purA、Ichthyophthiriusの表面抗原、Cytophaga columnariの構造タンパク質および調節タンパク質、Rickettsiaの構造タンパク質および調節タンパク質があげられるが、これらに限定されるものではない。このような抗原は、組換えまたは従来技術において知られた他の手段によって単離または調製することができる。
Bacterial pathogen polypeptides that may be useful as sources of microbial antigens in the composition include iron-regulated outer membrane proteins (“IOLP”), outer membrane proteins (“OMP”), and Aeromonis salmonicida, which causes flunegrisis. Protein, p57 protein of Renibacterium salmoninarum that causes bacterial kidney disease (“BKD”), major surface-related antigen (“msa”), surface-expressed cytotoxicity (“mpr”), surface-expressed hemolytic element (“ish”), Yersinosis Foal antigens, extracellular proteins (“ECP”), iron-regulated outer membrane proteins (“IROP”), structural proteins of pasturella disease, OMP and Vibrosis angillum and V.I. Ordalii's flagellar proteins, Edwardiellosis ictaluri and E. coli. Examples include, but are not limited to, tarda flagellar proteins, OMP proteins, aroA, purA, surface antigens of Ichthyophthirius, structural and regulatory proteins of Cytophaga colimunari, and structural and regulatory proteins of Rickettsia. Such antigens can be isolated or prepared by recombination or other means known in the art.

病原体の例としては、哺乳動物、特にヒトに感染する真菌がさらにあげられるが、これらに限定されるものではない。真菌の例としては、Cryptococcus neoformansi、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、Blastomyces dermatitidis、Chlamydia trachomatis、Candida albicansがあげられるが、これらに限定されるものではない。感染性寄生虫の例としては、Plasmodium falciparum、Plasmodium malariae、Plasmodium ovale、Plasmodium vivaxなどのマラリア原虫があげられる。他の感染性生物(すなわち原生生物)として、Toxoplasma gondiiがあげられる。寄生虫病原体のポリペプチドには、Ichthyophthiriusの表面抗原があげられるが、これに限定されるものではない。 Examples of pathogens include, but are not limited to, fungi that infect mammals, especially humans. Examples of fungi include Cryptococcus neoformansi, Histoplasma capsulatum, Coccidioides imitis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans, and not limited to Candida albicans. Examples of infectious parasites include Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax and other plasmodium protozoa. Other infectious organisms (ie, protists) include Toxoplasma gondii. Polypeptides of parasite pathogens include, but are not limited to, surface antigens of Ichthyophythirius.

哺乳動物、特にヒトにおいて抗原として作用する、医学的に関連のある他の微生物については、文献に広く記載されている。たとえば、C.G.A Thomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall,Great Britain 1983(その内容全体を本明細書に援用する)を参照のこと。感染性ヒト疾患およびヒト病原体の治療に加えて、本発明の組成物および方法は、非ヒト哺乳動物の感染を治療するにも有用である。非ヒト哺乳動物を治療するための多くのワクチンが、Bennett,K. Compendium of Veterinary Products,3rd ed. North American Compendiums,Inc.,1995に開示されており、WO02/069369号も併せて参照のこと(その開示内容を明示的に本明細書に援用する)。 Other medically relevant microorganisms that act as antigens in mammals, especially humans, are widely described in the literature. For example, C.I. G. A. Thomas, Medical Microbiology, Balliere Tindall, Great Britain 1983 (the entire content of which is incorporated herein by reference). In addition to treating infectious human diseases and human pathogens, the compositions and methods of the invention are also useful in treating infections in non-human mammals. Many vaccines for treating non-human mammals are available in Bennett, K. et al. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendium, Inc. , 1995, also see WO02 / 069369 (the disclosure of which is expressly incorporated herein).

例示的な非ヒト病原体としては、マウス乳房腫瘍ウイルス(「MMTV」)、ラウス肉腫ウイルス(「RSV」)、トリ白血病ウイルス(「ALV」)、トリ骨髄芽球症ウイルス(「AMV」)、マウス白血病ウイルス(「MLV」)、ネコ白血病ウイルス(「FeLV」)、マウス肉腫ウイルス(「MSV」)、テナガザル白血病ウイルス(「GALV」)、脾臓壊死ウイルス(「SNV」)、細網内皮症ウイルス(「RSV」)、サル肉腫ウイルス(「SSV」)、マソン・ファイザーサルウイルス(「MPMV」)、サルレトロウイルス1型(「SRV-1」)、さらにはHIV-1、HIV-2、SIV、Visnaウイルス、ネコ免疫不全ウイルス(「FIV」)などのレンチウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス(「EIAV」)、HTLV-1、HTLV-II、サルT細胞白血病ウイルス(「STLV」)、ウシ白血病ウイルス(「BLV」)などのT細胞白血病ウイルス、ヒト泡沫ウイルス(「HFV」)、サル泡沫ウイルス(「SFV」)、ウシ泡沫ウイルス(「BFV」)などの泡沫ウイルスがあげられるが、これらに限定されるものではない。 Exemplary non-human pathogens include mouse breast tumor virus (“MMTV”), laus sarcoma virus (“RSV”), trileukemia virus (“ALV”), trimyelyoblastosis virus (“AMV”), and mice. Leukemia virus (“MLV”), feline leukemia virus (“FeLV”), mouse sarcoma virus (“MSV”), tenagazal leukemia virus (“GALV”), splenic necrosis virus (“SNV”), reticular endothelosis virus (“SNV”) "RSV"), monkey sarcoma virus ("SSV"), Masson Faiser monkey virus ("MPMV"), monkey retrovirus type 1 ("SRV-1"), as well as HIV-1, HIV-2, SIV, Visna virus, lentivirus such as feline immunodeficiency virus ("FIV"), horse infectious anemia virus ("EIAV"), HTLV-1, HTLV-II, monkey T-cell leukemia virus ("STLV"), bovine leukemia virus Examples include, but are limited to, T-cell leukemia virus such as (“BLV”), human foam virus (“HFV”), monkey foam virus (“SFV”), and bovine foam virus (“BFV”). It is not something that will be done.

いくつかの実施形態では、感染性病原体に関して本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」、「治療している」は、病原体による感染に対する対象の耐性を高めるか、対象が病原体に感染することになる尤度を下げる予防的治療および/または対象が感染した後に、たとえば感染を低減または排除するか、感染が悪化するのを防ぐなど、感染と戦
うための治療をいう。
In some embodiments, as used herein with respect to an infectious agent, "treating,""treating," and "treating" increase the subject's resistance to infection by the pathogen, or the subject is the pathogen. Prophylactic treatment and / or treatment to combat infection after the subject has been infected, for example, reducing or eliminating the infection or preventing the infection from getting worse.

微生物抗原は、従来技術において周知の方法で調製することができる。たとえば、これらの抗原は、粗抽出物を調製する、抗原を部分的に精製する、組換え技術による、あるいは既知の抗原のde novo合成によって、ウイルスおよび細菌細胞から直接調製することができる。また、抗原は、対象における発現および免疫される対象の免疫系への提示に適した形態の抗原ペプチドをコードする核酸の形態であってもよい。さらに、抗原は完全抗原であってもよいし、少なくとも1つのエピトープを含む完全抗原の断片であってもよい。
脂質
Microbial antigens can be prepared by methods well known in the art. For example, these antigens can be prepared directly from viral and bacterial cells by preparing crude extracts, partially purifying the antigens, by recombinant techniques, or by de novo synthesis of known antigens. The antigen may also be in the form of a nucleic acid encoding an antigenic peptide in a form suitable for expression in the subject and presentation to the immune system of the subject to be immunized. Further, the antigen may be a complete antigen or may be a fragment of a complete antigen containing at least one epitope.
Lipids

カチオン性脂質ベシクルへの抗原の取り込みを改善し、また免疫系の細胞への送達を改善するために、抗原を修飾してその疎水性または抗原表面の負電荷を高めてもよい。たとえば、分子の抗原特性を維持しながらカチオン性脂質の疎水性アシル鎖における抗原の溶解性を改善するために、脂質鎖または疎水性アミノ酸に結合させることで抗原の疎水性を高めてもよい。修飾された抗原は、アミノ酸配列の疎水性が高められた、修飾されたリポタンパク質、リポペプチド、タンパク質またはペプチド、それらの組み合わせとすることができる。修飾された抗原は、脂質と抗原との間に結合されたリンカーを有するものであってもよく、たとえば、N末端αまたはε-パルミトイルリジンをセリン-セリンのジペプチドリンカーを介して抗原に結合させてもよい。以下でより詳細に考察するように、DOTAP/E7-リポペプチド複合体は、DOTAP/E7調製物と比較して、in vivoで機能的な抗原特異的CD8 Tリンパ球応答が増強していた。さらに、抗原がカチオン性脂質の複合体に封入されている調製物のバッファーを変えることによって、あるいは、たとえばアニオン性アミノ酸などのアニオン性部分を抗原に共有結合させることによって、負電荷が高まるように抗原を操作してもよい。 In order to improve the uptake of the antigen into the cationic lipid vesicles and also to improve the delivery of the immune system to cells, the antigen may be modified to increase its hydrophobicity or the negative charge on the surface of the antigen. For example, in order to improve the solubility of an antigen in the hydrophobic acyl chain of a cationic lipid while maintaining the antigenic properties of the molecule, the hydrophobicity of the antigen may be enhanced by binding to the lipid chain or a hydrophobic amino acid. The modified antigen can be a modified lipoprotein, lipopeptide, protein or peptide, or a combination thereof, with enhanced hydrophobicity in the amino acid sequence. The modified antigen may have a linker bound between the lipid and the antigen, for example, N-terminal α or ε-palmitoyl lysine bound to the antigen via a serine-serine dipeptide linker. You may. As discussed in more detail below, the DOTAP / E7-lipopeptide complex had an enhanced in vivo functional antigen-specific CD8 T lymphocyte response compared to the DOTAP / E7 preparation. In addition, the negative charge may be increased by changing the buffer of the preparation in which the antigen is encapsulated in a cationic lipid complex, or by covalently attaching an anionic moiety, such as an anionic amino acid, to the antigen. The antigen may be manipulated.

本明細書に記載した実施例1に示されるように、E7抗原の免疫原性は、抗原を共有結合で修飾することによって増大した。得られる抗原アミノ酸配列が、もともと抗原を得た親タンパク質には見られないようなものになるアミノ酸配列を抗原に共有結合させることが可能であった。修飾された抗原のほうがネイティブな抗原よりもMHCクラスI結合親和性が優れていることを示すために、研究を行った。この研究で証明されたような優れた結合親和性のために、HPV陽性TC-1腫瘍に対するin vivoでの優れた抗腫瘍免疫応答が生じることとなった。本発明は、以下の実施例に照らしてさらに理解されるであろう。 As shown in Example 1 described herein, the immunogenicity of the E7 antigen was increased by covalently modifying the antigen. It was possible to covalently bind an amino acid sequence to the antigen so that the obtained antigen amino acid sequence would not be found in the parent protein that originally obtained the antigen. Studies were conducted to show that modified antigens have better MHC class I binding affinity than native antigens. The excellent binding affinity as demonstrated in this study resulted in an excellent in vivo antitumor immune response to HPV-positive TC-1 tumors. The present invention will be further understood in the light of the following examples.

本明細書に記載のいくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、ナノ粒子アセンブリーの形態であってもよい。本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」という用語は、測定されるサイズがナノメートル台である粒子をいう。たとえば、「ナノ粒子」とは、サイズが約10,000ナノメートル未満の構造を有する粒子をいうことができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子はリポソームである。 In some embodiments described herein, the cationic lipid may be in the form of a nanoparticle assembly. As used herein, the term "nanoparticles" refers to particles whose measured size is in the nanometer range. For example, "nanoparticles" can refer to particles having a structure less than about 10,000 nanometers in size. In some embodiments, the nanoparticles are liposomes.

本明細書で使用する場合、「カチオン性脂質」という用語は、生理学的pHで正味の正電荷を保持するか、プロトン化可能な基を有し、pKaより低いpHで正に荷電される多数の脂質種のすべてをいう。本開示による好適なカチオン性脂質としては、3-β[N-(N,ジグアニジノスペルミジン)-カルバモイル]コレステロール(BGSC)、3-β[N,N-ジグアニジノエチル-アミノエタン)-カルバモイルコレステロール(BGTC)、N,N,N,N テトラメチルテトラミルスペルミン(セルフェクチン)、N-t-ブチル-N’-テトラデシル-3-テトラデシルアミノプロピオンアミジン(CLONfectin)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(DDAB)、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルア
ンモニウムブロミド(DMRIE)、2,3-ジオレオイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロセテート)(DOSPA)、1,3-ジオレイルオキシ-2-(6-カルボキシスペルミル)-プロピルアミド(DOSPER)、4-(2,3-ビス-パルミトイルオキシ-プロピル)-1-メチル-1H-イミダゾール(DPIM)Ν,Ν,Ν’,Ν’-テトラメチル-N,N’-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2,3-ジオレオイルオキシ-1,4-ブタン-ジアンモニウムヨージド)(Tfx-50)、N-1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル-Ν,Ν,Ν-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)または他のN-(N,N-1-ジアルコオキシ)-アルキル-N,N,N-三置換アンモニウム界面活性剤、1,2ジオレオイル-3-(4’-トリメチルアンモニオ)ブタノール-sn-グリセロール(DOBT)またはコレステリル(4’トリメチルアンモニア)ブタノエート(ChOTB)(ここで、トリメチル-アンモニウム基は、ブタノールスペーサーアームを介して二本鎖(DOTBの場合)またはコレステリル基(ChOTBの場合)に接続されている)、DORI(DL-1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアンモニウム)またはDORIE(DL-1,2-O-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアンモニウム)(DORIE)またはそれらの類似体(WO93/03709に開示されているものなど)、1,2-ジオレオイル-3-スクシニル-sn-グリセロールコリンエステル(DOSC)、コレステリルヘミスクシネートエステル(ChOSC)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(DOGS)およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン(DPPES)などのリポポリアミン、コレステリル-3β-カルボキシル-アミド-エチレントリメチルアンモニウムヨージド、1-ジメチルアミノ-3-トリメチルアンモニオ-DL-2-プロピル-コレステリルカルボキシレートヨージド、コレステリル-3-O-カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル-3-β-オキシスクシンアミド-エチレントリメチルアンモニウムヨージド、1-ジメチルアミノ-3-トリメチルアンモニオ-DL-2-プロピル-コレステリル-3-β-オキシスクシネートヨージド、2-(2-トリメチルアンモニオ)-エチルメチルアミノエチル-コレステリル-3-β-オキシスクシネートヨージド、3-β-N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)カルバモイルコレステロール(DC-chol)、3-β-N-(ポリエチレンイミン)-カルバモイルコレステロール、Ο,Ο’-ジミリスチル-N-リシルアスパルテート(DMKE)、Ο,Ο’-ジミリスチル-N-リシル-グルタメート(DMKD)、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、1,2-じらウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DLEPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMEPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOEPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DPEPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DSEPC)、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、ジオレオイルジメチルアミノプロパン(DODAP)、1,2-パルミトイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DPTAP)、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DSTAP)、1,2-ミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)があげられるが、これらに限定されるものではない。さらに、記載されたカチオン性脂質のいずれの構造的変異体および誘導体も、企図される。
As used herein, the term "cationic lipid" is a large number that retains a net positive charge at physiological pH or has a protonatable group that is positively charged at a pH lower than pKa. Refers to all of the lipid species of. Suitable cationic lipids according to the present disclosure include 3-β [ 4 N- ( 1 N, 8 N - diguanidinospermidine) -carbamoyl] cholesterol (BGSC), 3-β [N, N-diguanidinoethyl-aminoethane. )-Carbamoylcholesterol ( BGTC ), N, N1, N2 , N3 Tetramethyltetramilspermin (selffectin), Nt-butyl-N'-tetradecyl- 3 -tetradecylaminopropionamidin (CLONfectin), dimethyl Dioctadecylammonium bromide (DDAB), 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE), 2,3-dioleoyloxy-N- [2 (spermine-carboxamide) ethyl]- N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluorosate) (DOSPA), 1,3-dioreyloxy-2- (6-carboxyspermil) -propylamide (DOSPER), 4- (2,3-) Bis-palmitoyloxy-propyl) -1-methyl-1H-imidazole (DPIM) Ν, Ν, Ν', Ν'-tetramethyl-N, N'-bis (2-hydroxyethyl) -2,3-diore Oiloxy-1,4-butane-diammonium iodide) (Tfx-50), N-1- (2,3-dioleoyloxy) propyl-Ν, Ν, Ν-trimethylammonium chloride (DOTMA) or others N- (N, N-1-dialcooxy) -alkyl-N, N, N-trisubstituted ammonium surfactant, 1,2 dioleoil-3- (4'-trimethylammonio) butanol-sn-glycerol (DOBT) ) Or cholesteryl (4'trimethylammonium) butanoate (ChOTB) (where the trimethyl-ammonium group is connected to a double chain (in the case of DOTB) or a cholesteryl group (in the case of ChOTB) via a butanol spacer arm. ), DORI (DL-1,2-diore oil-3-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylammonium) or DORIE (DL-1,2-O-diore oil-3-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylammonium) ( DORIE) or an analog thereof (such as those disclosed in WO93 / 03709), 1,2-dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerol choline ester (DOSC), co. Lipopolyamines such as resteryl hemiscusinate ester (ChOSC), dioctadecylamide glycyl spermin (DOGS) and dipalmitoyl phosphatidyl ethanol amyl spermin (DPPES), cholesteryl-3β-carboxyl-amide-ethylenetrimethylammonium iodide, 1- Dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl carboxylate iodide, cholesteryl-3-O-carboxyamide ethyleneamine, cholesteryl-3-β-oxysuccinamide-ethylenetrimethylammonium iodide, 1 -Dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl-3-β-oxysuccinate iodide, 2- (2-trimethylammonio) -ethylmethylaminoethyl-cholesteryl-3-β- Oxysuccinate iodide, 3-β-N- (N', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol (DC-chol), 3-β-N- (polyethyleneimine) -carbamoyl cholesterol, Ο, Ο' -Dimyristyl-N-Resil Aspartate (DMKE), Ο, Ο'-Dimyristyl-N-Lisyl-Glutamate (DMKD), 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE), 1 , 2-Jirauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DLEPC), 1,2-dimiristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DMEPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero- 3-Ethylphosphocholine (DOEPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DPEPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC), 1 , 2-diore oil-3-trimethylammonium propane (DOTAP), diore oil dimethylaminopropane (DODAP), 1,2-palmitoyle-3-trimethylammonium propane (DPTAP), 1,2-distearoyl-3-trimethylammonium Examples include, but are not limited to, propane (DSTAP), 1,2-myristoyl-3-trimethylammonium propane (DMTAP), and sodium dodecyl sulfate (SDS). In addition, structural variants and derivatives of any of the cationic lipids described are contemplated.

ある実施形態では、カチオン性脂質は、DOTAP、DOTMA、DOEPC、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態では、カチオン性脂質はDOTAPである。さらに他の実施形態では、カチオン性脂質はDOTMAである。他の実施形態では、カチオン性脂質はDOEPCである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が精製される。 In certain embodiments, the cationic lipid is selected from the group consisting of DOTAP, DOTMA, DOEPC, and combinations thereof. In another embodiment, the cationic lipid is DOTAP. In yet another embodiment, the cationic lipid is DOTMA. In another embodiment, the cationic lipid is DOEPC. In some embodiments, the cationic lipid is purified.

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、カチオン性脂質のエナンチオマーである。「エナンチオマー」という用語は、その対になる立体異性体、たとえばRエナンチオマーおよびSエナンチオマーのように、互いに重ね合わせることのできない鏡像であるカチオン性脂質の立体異性体をいう。様々な例において、エナンチオマーはR-DOTAPまたはS-DOTAPである。一例では、エナンチオマーはR-DOTAPである。別の例では、エナンチオマーはS-DOTAPである。いくつかの実施形態では、そのエナンチオマーは精製される。様々な例において、エナンチオマーはR-DOTMAまたはS-DOTMAである。一例では、エナンチオマーはR-DOTMAである。別の例では、エナンチオマーはS-DOTMAである。いくつかの実施形態では、そのエナンチオマーは精製される。様々な例において、エナンチオマーは、R-DOPECまたはS-DOPECである。一例では、エナンチオマーはR-DOPECである。別の例では、エナンチオマーはS-DOPECである。いくつかの実施形態では、そのエナンチオマーは精製される。 In some embodiments, the cationic lipid is an enantiomer of the cationic lipid. The term "enantiomer" refers to a pair of stereoisomers, such as R enantiomers and S enantiomers, which are mirror images of cationic lipids that cannot be superimposed on each other. In various examples, the enantiomer is R-DOTAP or S-DOTAP. In one example, the enantiomer is R-DOTAP. In another example, the enantiomer is S-DOTAP. In some embodiments, the enantiomer is purified. In various examples, the enantiomer is R-DOTMA or S-DOTMA. In one example, the enantiomer is R-DOTMA. In another example, the enantiomer is S-DOTMA. In some embodiments, the enantiomer is purified. In various examples, the enantiomer is R-DOPEC or S-DOPEC. In one example, the enantiomer is R-DOPEC. In another example, the enantiomer is S-DOPEC. In some embodiments, the enantiomer is purified.

例示の目的で、実施例はいずれも、十分に研究され、二重蛍光標識と一緒に利用可能なモデルタンパク質であるオボアルブミンを用いて実施されることに注意されたい。モデルタンパク質を用いることで、カチオン性脂質がどのようにして抗原の取り込みプロセシングと提示を亢進するかを示す優れた例が提供される。また、クラスIおよびクラスII拘束性OVAペプチドに特異的なTCRトランスジェニックT細胞を利用可能であることから、両方の経路を介した詳細な研究と抗原提示の確認が可能になる。 Note that for illustrative purposes, all examples are well studied and performed with ovalbumin, a model protein available with dual fluorescent labels. Using model proteins provides excellent examples of how cationic lipids enhance antigen uptake processing and presentation. In addition, the availability of TCR transgenic T cells specific for class I and class II restrictive OVA peptides allows for detailed studies and confirmation of antigen presentation via both pathways.

実施例で報告されたin vitroでの研究はいずれも、代表的な抗原としてモデルタンパク質であるオボアルブミンを用いて実施した。抗原提示細胞による抗原の取り込みとプロセシングに対するカチオン性脂質の作用を評価するために、フローサイトメーターを用いて容易に追跡できる蛍光OVAコンジュゲート(DQ-OVAコンジュゲート、Alexa Fluor(登録商標)647 OVAコンジュゲート)を使用した。さらに、抗原としてオボアルブミンタンパク質を使用することで、オボアルブミン特異的CD4およびCD8 T細胞受容体を有するオボアルブミン特異的T細胞ハイブリドーマ細胞およびTCRトランスジェニックマウス(OT-1およびDO11.10)を用いるMHC
IおよびMHC IIによる抗原提示の確認が容易になった。この研究で示された結果は、一般にあらゆるタンパク質およびペプチド抗原に適用可能である。
<実施例1:樹状細胞による抗原取り込みに対するカチオン性脂質の作用>
All in vitro studies reported in the Examples were performed using the model protein ovalbumin as a representative antigen. Fluorescent OVA conjugates (DQ-OVA conjugates, Alexa Fluor® 647 OVA) that can be easily traced using a flow cytometer to assess the effect of cationic lipids on antigen uptake and processing by antigen presenting cells. Conjugate) was used. In addition, by using the ovalbumin protein as an antigen, ovalbumin-specific T-cell hybriddoma cells and TCR transgenic mice (OT-1 and DO11.10) with ovalbumin-specific CD4 and CD8 T cell receptors are used. MHC
Confirmation of antigen presentation by I and MHC II became easier. The results shown in this study are generally applicable to all protein and peptide antigens.
<Example 1: Effect of cationic lipid on antigen uptake by dendritic cells>

タンパク質抗原の取り込みに対するカチオン性脂質の作用を決定するために、マウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)をAlexa Fluor(登録商標)647-OVAコンジュゲートでパルスし、フローサイトメトリーを用いてBMDCによるオボアルブミン取り込みを定量した。簡単に説明すると、20μg/mlのオボアルブミン(Ovalbumin AlexaFluor(登録商標)647コンジュゲート;ライフテクノロジーズ、カタログ番号034784)と50μMのカチオン性脂質(RDOTAP)または280mMのスクロース希釈剤を含む無血清RPMI 1640細胞培養培地において、2×10個/mlのBMDCを37℃で10~60分間インキュベートした。細胞をパルス後に洗浄して細胞に結合していないオボアルブミンを除去し、フローサイトメーターでの分析用に1%ホルムアルデヒドで固定した。BD LSR IIフローサイトメーターを用いてオボアルブミンの取り込みを定量した。図1に示すように、カチオン性脂質は、測定したすべての時点でBMDCによるタンパク質の取り込みを有意に増加した。さらに、タンパク質の取り込みはカチオン性ナノ粒子の存在下で非常に急速に起こったことから、カチオン性脂質が、樹状細胞ワクチンの調製時に抗原パルスの時間を大幅に短縮する上で有益であることを示唆している。
<実施例2:樹状細胞および上皮細胞による抗原プロセシングに対するカチオン性脂質の作用>
To determine the effect of cationic lipids on protein antigen uptake, mouse bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) are pulsed with Alexa Fluor® 647-OVA conjugate and ovo by BMDCs using flow cytometry. Albumin uptake was quantified. Briefly, serum-free RPMI 1640 containing 20 μg / ml ovalbumin (Ovalbumin AlexaFluor® 647 conjugate; Life Technologies, Catalog No. 0347884) and 50 μM cationic lipid (RDOTAP) or 280 mM sucrose diluent. In cell culture medium, 2 × 10 6 cells / ml BMDCs were incubated at 37 ° C. for 10-60 minutes. The cells were washed after pulse to remove ovalbumin not bound to the cells and fixed with 1% formaldehyde for analysis on a flow cytometer. Ovalbumin uptake was quantified using a BD LSR II flow cytometer. As shown in FIG. 1, cationic lipids significantly increased protein uptake by BMDCs at all measured time points. In addition, protein uptake occurred so rapidly in the presence of cationic nanoparticles that cationic lipids are beneficial in significantly reducing antigen pulse time during the preparation of dendritic cell vaccines. It suggests.
<Example 2: Effect of cationic lipid on antigen processing by dendritic cells and epithelial cells>

樹状細胞によるex vivoでの抗原の取り込みとプロセシングに対するカチオン性脂質の作用を決定するために、DQ-OVAと呼ばれる蛍光オボアルブミンタンパク質を使用した。DQ-OVAは、インタクトな状態では蛍光性ではないが、タンパク質が分解されると赤色と緑色の両方の蛍光を発する。BMDCを、DQ-OVAのみまたは濃度の異なるカチオン性脂質DOTAPと混合したDQ-OVAと一緒に、37℃または4℃で1時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、樹状細胞のマーカーであるCD11cに対する蛍光抗体で染色した。次に、赤色および緑色蛍光チャネルの両方で、LSRIIフローサイトメーターで細胞を分析した。 A fluorescent ovalbumin protein called DQ-OVA was used to determine the effect of cationic lipids on ex vivo antigen uptake and processing by dendritic cells. DQ-OVA is not fluorescent in the intact state, but emits both red and green fluorescence when the protein is degraded. BMDCs were incubated with DQ-OVA alone or mixed with different concentrations of cationic lipid DOTAP at 37 ° C or 4 ° C for 1 hour. The cells were then washed, fixed and stained with a fluorescent antibody against CD11c, a marker for dendritic cells. The cells were then analyzed with an LSRII flow cytometer for both red and green fluorescent channels.

図2の結果は、培地のみで蛍光DQ-OVAと一緒にインキュベートしたBMDCが37℃で蛍光を増大させ、取り込みとプロセッシングがなされたことを示している。これは、DCによる、OVAのよく知られたマンノース受容体が介在する取り込みを表す。DOTAPは、DCによる抗原の取り込みとプロセシングを亢進する。フローサイトメトリーで測定したBMDCへのDQ-OVAの蛍光取り込みのグラフ表示。プロットは、DCによって取り込まれ、プロセシングされたDQ-OVAの量を表す、ゲートされたCD11c陽性細胞の緑色蛍光の平均蛍光強度を示す。 The results in FIG. 2 show that BMDCs incubated with fluorescent DQ-OVA in medium alone increased fluorescence at 37 ° C. for uptake and processing. This represents DC-mediated uptake of the well-known mannose receptor for OVAs. DOTAP enhances the uptake and processing of antigens by DC. Graph display of fluorescence uptake of DQ-OVA to BMDC measured by flow cytometry. The plot shows the average fluorescence intensity of the green fluorescence of the gated CD11c positive cells, which represents the amount of DQ-OVA taken up and processed by DC.

この取り込みとプロセシングは4℃で阻害され、このタイプの取り込みにはアクティブな細胞骨格の再構成が必要であることが確認された。DOTAPの純粋なR-エナンチオマー(R-DOTAP)の存在下でDQ-OVAと一緒にインキュベートされたBMDCでは蛍光の倍増が認められ、カチオン性脂質であるR-DOTAPがDCでのタンパク質の取り込みとプロセシングを大幅に亢進することが示された。4℃でになってもなお有意な取り込みが認められ、アクティブな細胞代謝がなくてもR-DOTAPがタンパク質の取り込みを助長し得ることが示された。R-DOTAPによる作用は濃度依存的であり、50μMで最大の作用が認められた。R-DOTAPによるタンパク質取り込みの亢進が細胞依存であるか否かを決定するために、マウス上皮細胞株をBMDCと同一条件下でDQ-OVAと一緒にインキュベートした。図3の結果は、このOVAの取り込みとプロセシングがDCでのみ観察され、TC1上皮細胞では観察されないことを示している。これらのデータから、DOTAPが、ex vivoで完全タンパク質の樹状細胞への取り込みとプロセシングを大幅に亢進できることがわかる。さらに、この亢進が樹状細胞に対して選択的であり、他の非抗原提示細胞型に対して選択的ではないこともわかる。
<実施例3:抗原のプロセシングおよびエンドソーム侵入に対する、カチオン性脂質と既知のアジュバントによる作用の比較>
This uptake and processing was inhibited at 4 ° C, confirming that this type of uptake requires active cytoskeleton reconstruction. BMDCs incubated with DQ-OVA in the presence of pure R-enantiomer (R-DOTAP) of DOTAP showed doubling of fluorescence and the cationic lipid R-DOTAP with protein uptake at DC. It has been shown to significantly enhance processing. Significant uptake was still observed at 4 ° C., indicating that R-DOTAP can facilitate protein uptake in the absence of active cell metabolism. The action by R-DOTAP was concentration-dependent, and the maximum action was observed at 50 μM. Mouse epithelial cell lines were incubated with DQ-OVA under the same conditions as BMDCs to determine if enhanced protein uptake by R-DOTAP was cell-dependent. The results in FIG. 3 show that this OVA uptake and processing is observed only in DC, not in TC1 epithelial cells. These data indicate that DOTAP can significantly enhance complete protein uptake and processing into dendritic cells ex vivo. Furthermore, it can be seen that this enhancement is selective for dendritic cells and not for other non-antigen presenting cell types.
<Example 3: Comparison of the effects of cationic lipids and known adjuvants on antigen processing and endosome invasion>

脂質アジュバントがR-DOTAPと同じ作用に介在し得るか否かを決定するために、図1で説明したように、培地のみまたはR-DOTAPを用いて、BMDCをDQ-OVAと一緒にインキュベートした。また、強力な脂質アジュバントであるリポ多糖(LPS)を用いる同一の条件下で、BMDCをインキュベートした。25μMのDOTAPナノ粒子、10μg/mlのLPSまたは培地のみの存在下、37℃または4℃/アジドのいずれかで、蛍光DQ-OVAの存在下でマウス骨髄DCを1時間インキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。図1に示すように、DQ-OVAは、R-DOTAPの非存在下でDCによってアクティブに取り込まれ、プロセシングされたが、R-DOTAPの存在下では、赤色蛍光が強く増したことから明らかなように、取り込みが大幅に亢進された。対照的に、図4に示すように、このような増大はLPSでの処理では観察されなかった。モノホスホリルリピドA(MPL)は、毒性が低いLPSの誘導体であり、現在、いくつかのワクチンでFDAの承認済みのアジュバントである。図5におけるLPSでの結果と同様に、MPLはBMDCにおけるタンパク質の取り込みを亢進する能力を示さな
かった。
<実施例4:ヒト単球細胞株における抗原プロセシングに対するカチオン性脂質の作用>
BMDCs were incubated with DQ-OVA using medium alone or R-DOTAP to determine if the lipid adjuvant could intervene in the same action as R-DOTAP, as described in FIG. .. The BMDC was also incubated under the same conditions with lipopolysaccharide (LPS), a potent lipid adjuvant. Incubate mouse bone marrow DC for 1 hour in the presence of fluorescent DQ-OVA at either 37 ° C or 4 ° C / azide in the presence of 25 μM DOTAP nanoparticles, 10 μg / ml LPS or medium alone, and flow cytometry. Analyzed in. As shown in FIG. 1, DQ-OVA was actively taken up and processed by DC in the absence of R-DOTAP, apparently from the strong increase in red fluorescence in the presence of R-DOTAP. As such, uptake was significantly enhanced. In contrast, as shown in FIG. 4, no such increase was observed with treatment with LPS. Monophosphoryl lipid A (MPL) is a derivative of LPS with low toxicity and is currently an FDA-approved adjuvant for several vaccines. Similar to the LPS results in FIG. 5, MPL did not show the ability to enhance protein uptake in BMDCs.
<Example 4: Effect of cationic lipid on antigen processing in human monocyte cell line>

ヒトの細胞に対するカチオン性脂質の作用を決定するために、ヒト単球細胞株であるTHP-1を用いてex vivoでのDQ-OVAの取り込みを評価した。THP-1は、ヒト血液由来の単球細胞の代表であり、ex vivoでのDC療法の手法で患者からDCを作製するのに用いられるものと同じ細胞である。R-DOTAP(25μg/ml)の存在下(A、B)または非存在下(C、D)で、37℃にて1時間、DQ-OVA(10μg/ml)と一緒にTHP-1細胞をインキュベートした。レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて同じ細胞を画像化し、フローサイトメトリーで緑色対赤色蛍光を測定することによって定量した。図6の結果は、R-DOTAPがTHP-1細胞におけるDQ-OVAの取り込みを劇的に増したことを示している。マウスBMDCとは異なり、R-DOTAPが存在しない場合、DQ-OVAの取り込みは観察されなかった。これは、血液由来の単球は樹状細胞の前駆体であるが、タンパク質の取り込みに必要な受容体をまだ持たないためであると考えられる。この結果は、重要である。なぜなら、R-DOTAPが、通常であれば受容体による取り込みが不可能な細胞で取り込みとプロセシングを亢進できることを示しているからである。もうひとつ、図6Aおよび図Bから顕著に観察できるのが、エンドサイトーシスのベシクルにおけるプロセシングされたOVAの蓄積である。エンドサイトーシスのベシクルのタンパク質は、CD4 T細胞を刺激するためにMHCクラスII分子に効率的に取り込まれるか、MHCクラスIからCD8 T細胞への提示のための交差提示経路を行き来することは良く知られている。したがって、カチオン性脂質は、MHCクラスI分子およびクラスII分子の両方への抗原の提示を最大限に最適化する形でタンパク質の取り込みを助長し、CD8およびCD4 T細胞のそれぞれを最大限刺激する。
<実施例5:MHCクラスI拘束性T細胞に対する抗原のプロセシングと交差提示に対するDOTAPおよびDOTMAの作用>
To determine the action of cationic lipids on human cells, the human monocyte cell line THP-1 was used to evaluate the uptake of DQ-OVA ex vivo. THP-1 is representative of monocyte cells derived from human blood and is the same cells used to make DCs from patients in ex vivo DC therapy techniques. THP-1 cells with DQ-OVA (10 μg / ml) at 37 ° C. for 1 hour in the presence (A, B) or non-existence (C, D) of R-DOTAP (25 μg / ml). Incubated. The same cells were imaged using a laser scanning confocal microscope and quantified by measuring green vs. red fluorescence by flow cytometry. The results in FIG. 6 show that R-DOTAP dramatically increased the uptake of DQ-OVA in THP-1 cells. Unlike mouse BMDCs, no uptake of DQ-OVA was observed in the absence of R-DOTAP. This is thought to be because blood-derived monocytes are precursors of dendritic cells but do not yet have the receptors required for protein uptake. This result is important. This is because R-DOTAP has been shown to enhance uptake and processing in cells that would normally not be uptake by the receptor. Another prominent observation from FIGS. 6A and B is the accumulation of processed OVA in the endocytic vesicles. Endocytotic vesicle proteins can be efficiently incorporated into MHC class II molecules to stimulate CD4 T cells, or cross-presentation pathways for presentation from MHC class I to CD8 T cells. Well known. Therefore, cationic lipids promote protein uptake in a manner that maximizes the presentation of antigen to both MHC class I and class II molecules, maximally stimulating CD8 and CD4 T cells, respectively. ..
<Example 5: Action of DOTAP and DOTMA on antigen processing and cross-presentation on MHC class I restrictive T cells>

カチオン性脂質が抗原の取り込みを助長することが、MHCクラスI(交差提示)での抗原提示の亢進に実際につながることを検証するために、カチオン性脂質の存在下で交差提示を評価するための2つの異なる方法を利用した。第1の方法では、T細胞ハイブリドーマ細胞株(B3Z細胞)を用いた。この細胞株は、β-ガラクトシダーゼ酵素を誘導することによって、MHC Iを介してSIINFEKLペプチドを交差提示する抗原提示細胞に応答することができ、これはβ-galアッセイを用いて定量化することが可能である。50μMのRDOTAPと混合したオボアルブミンペプチドを有するBMDC(OVA241-270;SMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTS)または等張性スクロース(280mM)(Suc)のみ。ペプチドでパルスしたBMDCを洗浄し、MHCI(H2Kb)を介して抗原提示細胞によって提示されるSIINEKLエピトープを認識できる抗原特異的T細胞ハイブリドーマ細胞株(B3Z細胞)と37℃で一晩共培養した。B3Z細胞は、β-ガラクトシダーゼ酵素を産生することによってSIINFEKLエピトープに応答し、これを樹状細胞によるペプチド交差提示の指標に比色β-ガラクトシダーゼアッセイを用いて定量した。データは、試験ウェル(任意の単位)における相対吸光度(570nm)を表す。2元ANOVAを用いて統計的有意性を評価し、*値は処理ごとに有意に異なっていた(図7に示す)。 To evaluate cross-presentation in the presence of cationic lipids to verify that facilitating antigen uptake in cationic lipids actually leads to enhanced antigen presentation in MHC class I (cross-presentation). Two different methods were used. In the first method, a T cell hybridoma cell line (B3Z cell) was used. This cell line can respond to antigen-presenting cells that cross-present the SIINFEKL peptide via MHC I by inducing β-galactosidase enzyme, which can be quantified using the β-gal assay. It is possible. Only BMDC (OVA241-270; SMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTS) or isotonic sucrose (280 mM) (Suc) with an ovalbumin peptide mixed with 50 μM RDOTAP. Peptide-pulsed BMDCs were washed and co-cultured overnight at 37 ° C. with an antigen-specific T-cell hybriddoma cell line (B3Z cells) capable of recognizing SIINEKL epitopes presented by antigen-presenting cells via MHCI (H2Kb). B3Z cells responded to the SIINFFEKL epitope by producing a β-galactosidase enzyme, which was quantified using a colorimetric β-galactosidase assay as an indicator of peptide cross-presentation by dendritic cells. The data represent relative absorbance (570 nm) in the test well (arbitrary unit). Statistical significance was evaluated using a binary ANOVA, and the * values were significantly different for each treatment (shown in FIG. 7).

図7に示すように、カチオン性ナノ粒子によるペプチドパルスは、効率的なパルスに必要なペプチドの濃度を有意に減少させることが観察された。カチオン性脂質を利用するこの方法は、特に、利用できるペプチド抗原の量またはペプチドの濃度がゆえに樹状細胞の交差提示が制限される条件下(たとえば、エピトープが限られる自己腫瘍ワクチンの場合など)でのペプチドローディングで重要な利点を提供する。 As shown in FIG. 7, peptide pulses with cationic nanoparticles were observed to significantly reduce the concentration of peptide required for efficient pulses. This method utilizing cationic lipids is particularly advantageous under conditions where cross-presentation of dendritic cells is restricted due to the amount of peptide antigen available or the concentration of peptide (eg, for autologous tumor vaccines with limited epitopes). Provides significant advantages in peptide loading in.

2つ目の方法では、すべてのT細胞がOVAの内部ペプチドに特異的であるTCRトランスジェニックマウス(OT-1)由来のT細胞を使用した。これらのT細胞は、OVAを処理し、MHCクラスI分子にOVAペプチドを提示したDCで提示された場合にのみ増殖する。 In the second method, T cells derived from TCR transgenic mice (OT-1), in which all T cells are specific for the internal peptide of OVA, were used. These T cells are treated with OVA and proliferate only when presented at the DC presenting the OVA peptide to the MHC class I molecule.

したがって、これは、交差提示に対する厳密なアッセイとなる。BMDCを、2種類のカチオン性脂質であるDOTAPまたはDOTMAのいずれかの存在下または非存在下で、異なる濃度のOVA完全タンパク質と一緒に37℃で1時間インキュベートした。その後、DCを洗浄し、固定し、OVAペプチド特異的T細胞に添加した。図8の結果は、DOTAPまたはDOTMAの存在下でOVAと一緒にインキュベートしたDCが、カチオン性脂質なしでOVAと一緒にインキュベートしたDCよりもはるかに強くCD8+T細胞に抗原を交差提示したことを示している。この応答は、OVA濃度に関して用量依存的であり、DCを4℃でOVAと一緒にインキュベートした場合にも明らかであった。 Therefore, this is a rigorous assay for cross-presentation. BMDCs were incubated with different concentrations of OVA complete protein for 1 hour at 37 ° C. in the presence or absence of either of the two cationic lipids DOTAP or DOTMA. The DCs were then washed, immobilized and added to OVA peptide-specific T cells. The results in FIG. 8 show that DCs incubated with OVA in the presence of DOTAP or DOTMA cross-presented the antigen to CD8 + T cells much more strongly than DCs incubated with OVA without cationic lipids. ing. This response was dose-dependent with respect to OVA concentration and was also evident when DC was incubated with OVA at 4 ° C.

これらの結果は、カチオン性脂質によって抗原の取り込みが亢進されることで、CD8
T細胞の効果的な活性化の絶対的前提条件である、効率的な抗原のプロセシングとMHCクラスI経路へのペプチドの取り込みに実際につながることを示している。
<実施例6:MHCクラスII拘束性T細胞に対する抗原のプロセシングと交差提示に対するDOTMAおよびDOTAPの作用>
These results show that cationic lipids enhance antigen uptake, resulting in CD8.
It has been shown to actually lead to efficient antigen processing and peptide uptake into the MHC class I pathway, which are absolute prerequisites for effective activation of T cells.
<Example 6: Effect of DOTMA and DOTAP on antigen processing and cross-presentation on MHC class II restrictive T cells>

カチオン性脂質が実際にCD4 T細胞への抗原提示を増すか否かを確認するために、MHCクラスII分子に提示されるOVAペプチドに特異的なT細胞を有するDO11.10トランスジェニックマウス由来の細胞を使用した。図9の結果は、クラスII提示にも図8のクラスI提示で観察されたものと同じ傾向が観察されたことを示している。カチオン性脂質の存在下でOVAが取り込まれることで、CD4 T細胞に対する抗原提示が亢進された。 Derived from DO11.10 transgenic mice with T cells specific for the OVA peptide presented on MHC class II molecules to determine if cationic lipids actually increase antigen presentation to CD4 T cells. Cells were used. The results of FIG. 9 show that the same trends as those observed in the class I presentation of FIG. 8 were observed in the class II presentation. Incorporation of OVA in the presence of cationic lipids enhanced antigen presentation to CD4 T cells.

これらの結果は、カチオン性脂質によって抗原の取り込みが亢進されることで、CD4
T細胞の効果的な活性化の絶対的前提条件である、効率的な抗原のプロセシングとMHCクラスII経路へのペプチドの取り込みに実際につながることを示している。
<実施例7:in vivoでの実際のワクチン設定における抗原提示に対するDOTAPによる作用>
These results show that cationic lipids enhance antigen uptake, resulting in CD4.
It has been shown to actually lead to efficient antigen processing and peptide uptake into the MHC class II pathway, which are absolute prerequisites for effective activation of T cells.
<Example 7: Effect of DOTAP on antigen presentation in actual vaccine setting in vivo>

実際のワクチン設定におけるDOTAPの作用をモデル化するために、T細胞受容体養子移入系を使用した。この系では、図8および図9で説明したのと同じTCRトランスジェニックマウス由来のT細胞を用いているが、これらの細胞がワクチン接種後にin vivoでどのように応答するかを分析する。最初に、OT-1(OVA特異的CD8+)またはDO11.10(OVA特異的CD4+)T細胞を追跡用の蛍光色素CFSEで標識した。24時間後、マウスに、OVAのみまたはDOTAPの存在下のOVAを注射した。これらのT細胞が、免疫化後に流入領域リンパ節でDCによって提示される抗原を認識すれば、T細胞は増殖し、全ての娘細胞でCFSE色素が希釈される。次に、DOTAPを用いる場合と用いない場合でマウスにOVAを注射した。3日後、ワクチン接種部位の流入領域リンパ節を取り出し、T細胞を抗CD8抗体および抗CD4抗体で染色し、CFSEのレベルをフローサイトメトリーで可視化した。図10の結果は、完全OVAまたはDOTAPと混合した完全OVAのいずれかをさらに注射(免疫化)した場合のCFSE標識OT1(CD8 T細胞)またはDO11.10(CD4 T細胞)を示している。マウスにOVA+DOTAPをワクチン接種した場合のみ、T細胞の有意な分裂が生じた。これらの結果は、DOTAPの抗原送達特性が、ワクチン接種後の流入領域リンパ節におけるT細胞応答の増大につながることを示している。
<実施例8:MHCクラスI拘束性T細胞に対する抗原のプロセシングと交差提示に対す
る様々な脂質の作用>
A T cell receptor adoption system was used to model the effects of DOTAP on actual vaccine settings. This system uses the same TCR transgenic mouse-derived T cells as described in FIGS. 8 and 9, but analyzes how these cells respond in vivo after vaccination. First, OT-1 (OVA-specific CD8 +) or DO11.10 (OVA-specific CD4 +) T cells were labeled with the follow-up fluorescent dye CFSE. Twenty-four hours later, mice were injected with OVA alone or in the presence of DOTAP. If these T cells recognize the antigen presented by DC in the influx region lymph node after immunization, the T cells will proliferate and the CFSE dye will be diluted in all daughter cells. Next, mice were injected with OVA with and without DOTAP. Three days later, the inflow region lymph nodes at the vaccination site were removed, T cells were stained with anti-CD8 and anti-CD4 antibodies, and CFSE levels were visualized by flow cytometry. The results in FIG. 10 show CFSE-labeled OT1 (CD8 T cells) or DO11.10 (CD4 T cells) when either complete OVA or complete OVA mixed with DOTAP is further injected (immunized). Significant T cell division occurred only when mice were vaccinated with OVA + DOTAP. These results indicate that the antigen delivery properties of DOTAP lead to an increased T cell response in the influx region lymph nodes after vaccination.
<Example 8: Action of various lipids on antigen processing and cross-presentation on MHC class I restrictive T cells>

抗原の取り込みと交差提示に対する他のカチオン性脂質および中性脂質の作用を確認するために、完全OVAタンパク質と様々な濃度のDOTAP、DOTMA、DOPC、DOEPCまたはDDAの存在下、BMDCを37℃または4℃で30分間インキュベートした。その後、DCを洗浄し、マイクロタイタープレートでOT1脾細胞(クラスI拘束性OVAペプチドSIINFEKLに特異的なTCRトランスジェニックT細胞)に添加し、37℃で3日間培養した。プロットは、培養の最後の18時間におけるHチミジン取り込みの平均CPMを示している。対照培養には、OT1脾細胞とSIINFEKLだけを含有し、これは抗原プロセシングの必要性を回避する。 To confirm the effect of other cationic and triglyceride on antigen uptake and cross-presentation, BMDCs at 37 ° C. or in the presence of complete OVA protein and various concentrations of DOTAP, DOTMA, DOPC, DOEPC or DDA. Incubated at 4 ° C. for 30 minutes. Then, the DCs were washed, added to OT1 splenocytes (TCR transgenic T cells specific for class I-restricted OVA peptide SIINFFEKL) on a microtiter plate, and cultured at 37 ° C. for 3 days. The plot shows the average CPM of 3H thymidine uptake during the last 18 hours of culture. Control cultures contain only OT1 splenocytes and SIINFFEKL, which avoids the need for antigen processing.

図11の結果は、カチオン性脂質であるDOTAP、DOTMA、DOEPC、DDAがいずれも、BMDCによるOVAの取り込みと交差提示の亢進を助長することを示している。また、カチオン性脂質S-DOTAPも取り込みと提示を助長した。中性脂質DOPCも、取り込みと提示を助長した。これらの結果は、ひとつのクラスとしてのカチオン性脂質が、抗原の効果的な取り込みと樹状細胞によるタンパク質抗原の送達を介在するのに有効であることを示している。
<実施例9:カチオン性脂質は、樹状細胞ワクチンの有効性を改善する>
The results in FIG. 11 show that the cationic lipids DOTAP, DOTMA, DOEPC, and DDA all promote OVA uptake and cross-presentation enhancement by BMDCs. The cationic lipid S-DOTAP also facilitated uptake and presentation. The triglyceride DOPC also facilitated uptake and presentation. These results indicate that a class of cationic lipids is effective in mediating the effective uptake of antigens and the delivery of protein antigens by dendritic cells.
<Example 9: Cationic lipid improves the efficacy of dendritic cell vaccine>

カチオン性脂質がin vivoで樹状細胞系ワクチンの有効性を改善するという概念の証拠として示すために、樹状細胞ワクチンによるCTL誘導に対するカチオン性脂質の作用を評価した。ペプチド単独(パルミトイル化-KSSSIINFEKL)またはカチオン性(50μMR-DOTAP、DOTMA)ナノ粒子または中性脂質ナノ粒子(DOPC)と混合したペプチドでパルスしたBMDCまたは等張性スクロースのみで、B6マウスを免疫した。0日目と7日目に、ペプチドでパルスしたBMDCを用いてC57BL6/Jマウスの群(n=5)を皮下免疫し、14日目にELISPOTアッセイを用いて抗原特異的IFN-γ応答を測定することで、ワクチン応答を評価した。データは、代表的な研究における各マウスのスポット形成細胞を表す。 The effect of cationic lipids on CTL induction by dendritic cell vaccines was evaluated to show evidence of the concept that cationic lipids improve the efficacy of dendritic cell vaccines in vivo. B6 mice were immunized with only peptide-pulsed BMDC or isotonic sucrose with peptide alone (palmitoylated-KSSSINFEKL) or a peptide mixed with cationic (50 μMR-DOTAP, DOTMA) nanoparticles or neutral lipid nanoparticles (DOPC). .. On days 0 and 7, a group of C57BL6 / J mice (n = 5) was subcutaneously immunized with peptide-pulsed BMDCs, and on day 14 an antigen-specific IFN-γ response was obtained using the ELISPOT assay. Vaccine response was assessed by measurement. The data represent spot-forming cells in each mouse in a representative study.

図12に示すように、ペプチドを負荷したカチオン性ナノ粒子で樹状細胞をパルスすると、ワクチンによって誘導される抗原特異的T細胞応答が有意に増加するため、in vitroでのアッセイで見られるカチオン性ナノ粒子の有益な作用が樹状細胞系ワクチンの有効性に影響し得るということが直接的に示される。以下の研究では、CTL誘導におけるカチオン性ナノ粒子の有効性を、HPV関連腫瘍およびムチン1関連腫瘍に由来する腫瘍関連抗原を用いて検討した。予想通り、腫瘍関連抗原を負荷したカチオン性ナノ粒子は、ワクチン接種したマウスにマウントされた抗原特異的T細胞免疫応答を改善した(図13)。この実験では、50μMのカチオン性脂質(RDOTAP)と混合した腫瘍関連抗原(HPV腫瘍関連(a)またはムチン1関連(b))を含有するペプチド混合物または等張性スクロース(280nM)で、マウスBMDCを10分間パルスした。0日目および7日目に、ペプチドでパルスしたBMDCまたはパルスなしのBMDCでC57BL6/Jマウス(n=5)の群を皮下免疫し、14日目にELISPOTアッセイを用いて抗原特異的IFN-γ応答を測定することで、ワクチン応答を評価した。データは、代表的な研究における各マウスのスポット形成細胞を表す。DOTAP、DOTMA、DOPCでは、いくらか亢進が認められたのに対し、DOEPCとDDAでは、抗原提示が大幅に亢進された。注:DDAは、OVAで希釈すると沈殿を形成した。カチオン性脂質ではいずれも亢進がみとめられるが、全体の大きさは実験によって変わる。また、中性脂質であるDOPCも、この実験ではいくらか亢進が認められた。 As shown in FIG. 12, pulsed dendritic cells with peptide-loaded cationic nanoparticles significantly increases the vaccine-induced antigen-specific T cell response, and thus the cations seen in the in vitro assay. It is directly shown that the beneficial effects of sex nanoparticles can affect the efficacy of dendritic cell vaccines. In the following studies, the effectiveness of cationic nanoparticles in inducing CTL was investigated using tumor-related antigens derived from HPV-related tumors and mucin 1-related tumors. As expected, the cationic nanoparticles loaded with tumor-related antigens improved the antigen-specific T cell immune response mounted in vaccinated mice (FIG. 13). In this experiment, a mouse BMDC with a peptide mixture or isotonic sucrose (280 nM) containing a tumor-related antigen (HPV tumor-related (a) or mucin 1-related (b)) mixed with 50 μM cationic lipid (RDOTAP). Was pulsed for 10 minutes. On days 0 and 7, a group of C57BL6 / J mice (n = 5) was subcutaneously immunized with peptide-pulsed BMDCs or pulse-free BMDCs, and on day 14 antigen-specific IFN- using the ELISPOT assay. Vaccine response was evaluated by measuring γ response. The data represent spot-forming cells in each mouse in a representative study. Some enhancement was observed with DOTAP, DOTMA, and DOPC, whereas antigen presentation was significantly enhanced with DOEPC and DDA. Note: DDA formed a precipitate when diluted with OVA. All of the cationic lipids are found to be enhanced, but the overall size varies depending on the experiment. DOPC, which is a triglyceride, was also found to be somewhat enhanced in this experiment.

これらの結果は、ひとつのクラスとしてのカチオン性脂質が、抗原の効果的な取り込みと樹状細胞によるタンパク質抗原の送達を介在するのに有効であることを示している。さ
らに、抗原を負荷したカチオン性脂質でパルスした樹状細胞は、樹状細胞ワクチンの有効性を大幅に改善することができる。
<実施例10:腫瘍微小環境内のT細胞および調節性T細胞の集団に対するR-DOTAPの作用>
These results indicate that a class of cationic lipids is effective in mediating the effective uptake of antigens and the delivery of protein antigens by dendritic cells. In addition, dendritic cells pulsed with antigen-loaded cationic lipids can significantly improve the efficacy of dendritic cell vaccines.
<Example 10: Effect of R-DOTAP on a population of T cells and regulatory T cells in the tumor microenvironment>

R-DOTAPおよびS-DOTAPによって、抗原特異的CD8+T細胞を誘導した。 Antigen-specific CD8 + T cells were induced by R-DOTAP and S-DOTAP.

C57BLマウスに、様々な調製物をワクチン接種した。
群1:KF18 HPVペプチド(GQAEPDRAHYNIVTF)
群2:KF18 HPVペプチド+R-DOTAPリポソーム
群3:KF18 HPVペプチド+S-DOTAPリポソーム
群4:KF18ペプチド+MPL/Alumアジュバント
C57BL mice were vaccinated with various preparations.
Group 1: KF18 HPV peptide (GQAEPDRAHYNIVTF)
Group 2: KF18 HPV peptide + R-DOTAP liposome Group 3: KF18 HPV peptide + S-DOTAP liposome Group 4: KF18 peptide + MPL / Alum adjuvant

1群あたり5匹のマウスに、様々な調製物を注射した。0日目および7日目に、マウスにワクチン接種し、14日目に屠殺した。脾細胞を取り出し、ELISPOT研究を行った。ペプチドRAHYNIVTF(RF9)で脾細胞を刺激し、C57マウスによって認識されるHPV16 CD8+T細胞エピトープペプチドをC57マウスによって認識した。この研究は、R-DOTAPが強いHPV特異的CD8+T細胞応答を誘導するのに有効であることを示している。しかしながら、抗原の取り込み、内在化、プロセシングならびに、樹状細胞の成熟を促進する同一の能力を示したS-DOTAPは、ペプチドだけのときに見られたほどはCD8+T細胞応答の増大につながらなかった(図14A)。MPLは、R-DOTAPとS-DOTAPのどちらと比較しても抗原の取り込みを促進する上で有効ではなかったため、CD8+T細胞応答がR-DOTAPよりも有意に低くなると想定されていた。この作用の別の例が、カチオン性脂質であるDDAでも観察される。図14Bは、DDAが抗原の取り込みと提示を助長する能力を示している。しかしながら、強い抗原特異的T細胞応答を誘導するために、DDAを強力なアジュバントと組み合わせて使用することが報告されている(Brandt L.et al,ESAT-6 Subunit Vaccination against Mycobacterium tuberculosis,Infect Immun.2000 Feb;68(2):791-795)。 Five mice per group were injected with various preparations. Mice were vaccinated on days 0 and 7 and sacrificed on day 14. Spleen cells were removed and ELISPOT studies were performed. Spleen cells were stimulated with the peptide RAHYNIVTF (RF9) and the HPV16 CD8 + T cell epitope peptide recognized by C57 mice was recognized by C57 mice. This study shows that R-DOTAP is effective in inducing a strong HPV-specific CD8 + T cell response. However, S-DOTAP, which showed the same ability to promote antigen uptake, internalization, processing, and dendritic cell maturation, did not lead to an increased CD8 + T cell response as seen with peptides alone. (FIG. 14A). Since MPL was not effective in promoting antigen uptake compared to either R-DOTAP or S-DOTAP, it was assumed that the CD8 + T cell response would be significantly lower than R-DOTAP. Another example of this effect is also observed with the cationic lipid DDA. FIG. 14B shows the ability of DDA to facilitate antigen uptake and presentation. However, it has been reported that DDA is used in combination with a potent adjuvant to induce a strong antigen-specific T cell response (Brandt L. et al, ESAT-6 Subunit Vaccination aggregation Mycobacterium tuberculosis, Infect Immuno. 2000 Feb; 68 (2): 791-795).

R-DOTAPによる抗原取り込みの亢進と提示ならびに、in vivoでの優れたCD8+T細胞誘導が観察されることから、腫瘍抗原を用いるR-DOTAPおよびGM-CSFを基にした免疫療法を使用して直接比較(head-to-head)の研究を実施し、この2種のワクチンが腫瘍微小環境へのT細胞の浸潤や、免疫抑制性腫瘍微小環境をダウンレギュレートする能力に及ぼす影響を研究した。 Directly using R-DOTAP and GM-CSF-based immunotherapy with tumor antigens, as enhanced and presented antigen uptake by R-DOTAP and excellent CD8 + T cell induction in vivo are observed. A comparative (head-to-head) study was conducted to study the effect of these two vaccines on the infiltration of T cells into the tumor microenvironment and the ability to downregulate the immunosuppressive tumor microenvironment.

C57マウスを、1群あたり8匹として、R-DOTAP+HPV16 E7ペプチドKF18(GQAEPDRAHYNIVTF)、GM-CSF+HPV16 E7ペプチドKF18、R-DOTAP、GM-CSF、HPV16 E7ペプチドKF18、未処理群の各群にわけた。1日目に、1×10個のTC-1腫瘍細胞をマウスの脇腹に注射した。腫瘍移植後12日目と19日目に様々な調製物を投与した。19日目に、1群あたり4~5匹のマウスを屠殺し、複数の評価を行って腫瘍微小環境の免疫学を評価した。 Eight C57 mice per group were divided into R-DOTAP + HPV16 E7 peptide KF18 (GQAEPDRAHYNIVTF), GM-CSF + HPV16 E7 peptide KF18, R-DOTAP, GM-CSF, HPV16 E7 peptide KF18, and untreated groups. .. On day 1, 1 × 10 5 TC-1 tumor cells were injected into the flank of the mouse. Various preparations were administered 12 and 19 days after tumor transplantation. On day 19, 4-5 mice per group were sacrificed and multiple assessments were performed to assess the immunology of the tumor microenvironment.

RF9特異的デキストラマー染色とフローサイトメトリーを使用して、腫瘍微小環境に浸潤したHPV特異的CD8+T細胞の数を定量した。この研究では、マウスエピトープRF9に特異的なCD8+T細胞の数を定量した。これらのCD8+T細胞を、腫瘍中に存在する全ての免疫細胞(CD45、CD3、CD8)の割合として測定した。腫瘍に浸潤する抗原特異的T細胞を、フローサイトメトリーによってRF9特異的デキストラマー
を用いて測定した。図15は、研究の結果を示し、他のすべての群と比較して、R-DOTAP/HPVと比べてHPV特異的T細胞の統計的に有意な増加を示している。データは、各群の4~5匹のマウスの平均+SEMを表す。
RF9-specific dextramer staining and flow cytometry were used to quantify the number of HPV-specific CD8 + T cells infiltrating the tumor microenvironment. In this study, the number of CD8 + T cells specific for mouse epitope RF9 was quantified. These CD8 + T cells were measured as a percentage of all immune cells (CD45, CD3, CD8) present in the tumor. Antigen-specific T cells infiltrating the tumor were measured by flow cytometry using RF9-specific dextramers. FIG. 15 shows the results of the study, showing a statistically significant increase in HPV-specific T cells compared to R-DOTAP / HPV compared to all other groups. The data represent the mean + SEM of 4-5 mice in each group.

19日目に、免疫抑制性腫瘍微小環境、特に調節性T細胞の集団を研究するためにフローサイトメトリーを使用した。14日目と19日目に、T細胞(CD45+CD3+CD4+CD25+Foxp3+)細胞が腫瘍に浸潤した。結果を図16に示す。この研究は、腫瘍内のTreg集団の約40%という統計的に有意な減少がワクチン接種後1週間以内にR-DOTAP+抗原のみで観察されることを示している(P<0.01)。この群では統計的有意性が達成されなかったが、R-DOTAP群以外の群では、いずれもTregの集団を減らす能力が示されなかった。 On day 19, flow cytometry was used to study immunosuppressive tumor microenvironments, especially regulatory T cell populations. On the 14th and 19th days, T cells (CD45 + CD3 + CD4 + CD25 + Foxp3 +) cells invaded the tumor. The results are shown in FIG. This study shows that a statistically significant reduction of about 40% of the Treg population within the tumor is observed with R-DOTAP + antigen alone within 1 week after vaccination (P <0.01). Statistical significance was not achieved in this group, but none of the groups other than the R-DOTAP group showed the ability to reduce the Treg population.

どの免疫療法でも臨床的な有効性に非常に重要なのは、腫瘍微小環境でCD8+T細胞を標的とする腫瘍に対する免疫抑制細胞の比である。CD8+T細胞に対する免疫抑制細胞の比率が低いほど、抗腫瘍効果に向けて予後の改善が促進される。この研究は、GM-CSF+抗原の場合や抗原だけの場合に比が約1であるのと比較して、R-DOTAP+抗原では、Treg/CD8+T細胞比が劇的に低下して0.13未満となることを示している。腫瘍抗原のない群では比が約32であった(図17に示す)。カチオン性脂質は、TregsよりもエフェクターT細胞の正しい表現型の優先的な拡大を促進するようである。これは、攻撃者が免疫抑制性Tregs「擁護者」よりもCD8+T細胞に有利な「力のシフト」を生むため免疫療法が非常に効果的になる、腫瘍微小環境の大幅な改変につながる。 Very important to the clinical efficacy of any immunotherapy is the ratio of immunosuppressive cells to tumors that target CD8 + T cells in the tumor microenvironment. The lower the ratio of immunosuppressive cells to CD8 + T cells, the better the prognosis towards antitumor effect. In this study, the Treg / CD8 + T cell ratio dropped dramatically to less than 0.13 for R-DOTAP + antigen, compared to a ratio of about 1 for GM-CSF + antigen or for antigen alone. It shows that it becomes. The ratio was about 32 in the tumor antigen-free group (shown in FIG. 17). Cationic lipids appear to promote preferential expansion of the correct phenotype of effector T cells over Tregs. This leads to significant alteration of the tumor microenvironment, which makes immunotherapy highly effective because the attacker produces a "force shift" that favors CD8 + T cells over immunosuppressive Tregs "advocates".

同じ研究で、確立されたTC-1腫瘍に対する様々な調製物の影響を評価した。図18は、R-DOTAP+抗原で処理した動物(Treg/CD8+比<0.13)ではいずれも、26日目までに腫瘍が完全に消失したことを示している。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定した。ナイーブマウス群は、未処理のままで腫瘍のあるマウスである。ワクチンで使用したHPV16 E7ペプチドは、KF18である。GM-CSF+抗原および抗原のみ(Treg/CD8+比は約1.0)ではどちらも、腫瘍の退縮が誘導されなかったが、腫瘍の成長が阻害され、26日目に腫瘍体積が約200mmとなった。R-DOTAPまたはGM-CSFで抗原なしで処理した動物または未処理の動物からなる3つ目の群(Treg/CD8+比>30)では、腫瘍体積が300~700mmであった。 The same study evaluated the effects of various preparations on established TC-1 tumors. FIG. 18 shows that the tumors had completely disappeared by day 26 in all animals treated with R-DOTAP + antigen (Treg / CD8 + ratio <0.13). Tumor volume was measured using a caliper. The naive mouse group is mice that remain untreated and have tumors. The HPV16 E7 peptide used in the vaccine is KF18. Neither the GM-CSF + antigen nor the antigen alone (Treg / CD8 + ratio of about 1.0) induced tumor regression, but tumor growth was inhibited and the tumor volume was about 200 mm 3 on day 26. became. In the third group (Treg / CD8 + ratio> 30) consisting of animals treated with R-DOTAP or GM-CSF without antigen or untreated animals, the tumor volume was 300-700 mm 3 .

この研究では、IFN-γ ELISPOT研究を行い、生成する腫瘍特異的T細胞の「質」を定量化して理解した。この研究では26日目に動物を屠殺し、脾細胞を使用した。結果を図19に示す。この研究は、細胞をHPV16 CD8+マウスエピトープRF9で刺激すると、R-DOTAP+抗原調製物のほうがGM-CSF+抗原よりもIFN-γの生成量が約4~5倍多かったことを示している。これは、図11において、腫瘍微小環境に浸潤しているCD8+ 細胞の量がGM-CSFでの結果の2倍未満であるという事実がゆえ、カチオン性脂質がGM-CSFよりも「高品質」のT細胞を生成することができることを示唆している。T細胞のプライミングが優れているのかという理由については、別の研究で評価された。
<実施例11:リンパ節へのT細胞およびB細胞の浸潤に対するR-DOTAPワクチン接種の評価>
In this study, IFN-γ ELISPOT studies were performed to quantify and understand the “quality” of tumor-specific T cells produced. In this study, animals were sacrificed on day 26 and splenocytes were used. The results are shown in FIG. This study shows that when cells were stimulated with HPV16 CD8 + mouse epitope RF9, the R-DOTAP + antigen preparation produced about 4-5 times more IFN-γ than the GM-CSF + antigen. This is because, in FIG. 11, cationic lipids are "higher quality" than GM-CSF due to the fact that the amount of CD8 + cells infiltrating the tumor microenvironment is less than twice the result with GM-CSF. It is suggested that T cells can be generated. The reason for the superior priming of T cells was evaluated in another study.
<Example 11: Evaluation of R-DOTAP vaccination against infiltration of T cells and B cells into lymph nodes>

12mMのR-DOTAPまたは対照としてのスクロースを、それぞれマウスの右足と左足の肉趾に注射し、流入領域リンパ節へのT細胞と全リンパ球の流入をフローサイトメトリーで定量した。この実験では、ワクチン接種の15時間後に膝窩のリンパ節を取り出して、分析した。図17は、R-DOTAPがリンパ節へのT細胞の有意な浸潤を誘導し
たことを示している。第2の実験では、5時間、16時間、3日目、4日目の時点で分析を行い、リンパ節へのリンパ球の浸潤が4日間にわたって増加することがわかった(図20)。1つの研究でマウス5匹を使用した。
実施例12:リンパ節へのリンパ球浸潤に対するケモカインの役割の評価
12 mM R-DOTAP or sucrose as a control was injected into the toes of the right and left foot of the mice, respectively, and the influx of T cells and total lymphocytes into the inflow region lymph nodes was quantified by flow cytometry. In this experiment, popliteal lymph nodes were removed and analyzed 15 hours after vaccination. FIG. 17 shows that R-DOTAP induced significant infiltration of T cells into the lymph nodes. In the second experiment, analysis was performed at 5 hours, 16 hours, 3rd day, and 4th day, and it was found that the infiltration of lymphocytes into the lymph nodes increased over 4 days (Fig. 20). Five mice were used in one study.
Example 12: Evaluation of the role of chemokines in lymphocyte infiltration into lymph nodes

現在の実験の主目的は、5匹のマウスを用いて実施例7に記載の研究を行い、養子移入されたCFSE標識細胞のホーミングを可視化することであった。この研究には、in vitroにて百日咳毒素で処理してケモカイン受容体を不活化した細胞集団が含まれていた。百日咳毒素と未処理の細胞とをフローサイトメトリーで区別することができるように、これらの細胞を2通りの濃度のCFSEで標識した。リンパ球は、リンパ節に帰るように誘導されるべきである。しかしながら、DOTAPで亢進されるホーミングがケモカインによるものである場合、DLNに百日咳毒素集団は存在しないはずであるか、大幅に低減されたレベルで存在するだけのはずである。 The main purpose of the current experiment was to perform the study described in Example 7 using 5 mice to visualize the homing of adopted CFSE-labeled cells. This study included a population of cells in vitro treated with pertussis toxin to inactivate chemokine receptors. These cells were labeled with two concentrations of CFSE so that pertussis toxin and untreated cells could be distinguished by flow cytometry. Lymphocytes should be guided back to the lymph nodes. However, if the DOTAP-enhanced homing is due to chemokines, the pertussis toxin population should not be present in the DLN, or it should only be present at significantly reduced levels.

脾臓細胞を1匹のB6マウスから調製し、半分に分けた。細胞のうち半分を100ng/mlの百日咳毒素で37℃にて1時間処理し、洗浄した。次に、2つの細胞集団をフローサイトメトリーで区別することができるように、これらの細胞集団を2通りの濃度のCFSEで標識し、一緒に混合した。混合物(細胞10個)を5匹のB6マウスの尾静脈に静脈注射した。次にマウスを麻酔し、スクロース(右足肉趾)とR-DOTAP(左足肉趾、50μl、600ナノモル)のいずれかを肉趾に注射した。 Spleen cells were prepared from one B6 mouse and split in half. Half of the cells were treated with 100 ng / ml pertussis toxin at 37 ° C. for 1 hour and washed. The two cell populations were then labeled with two concentrations of CFSE and mixed together so that the two cell populations could be distinguished by flow cytometry. The mixture ( 107 cells) was intravenously injected into the tail vein of 5 B6 mice. Mice were then anesthetized and either sucrose (right toe) or R-DOTAP (left toe, 50 μl, 600 nanomoles) was injected into the toe.

16時間後、マウスを屠殺し、膝窩のLNと脾臓を採取した。各マウスの左右の節から回収した総細胞数をカウントした。移動したCFSE標識リンパ球も、R-DOTAPワクチン接種時にリンパ節に浸潤した。しかしながら、これは百日咳で処理した細胞では起こらなかったことから、リンパ節へのリンパ球の流入をカチオン性脂質が誘導し、この現象にはおそらくケモカインが介在していることを示している。 After 16 hours, the mice were sacrificed and the knee fossa LN and spleen were harvested. The total number of cells collected from the left and right nodes of each mouse was counted. The migrated CFSE-labeled lymphocytes also infiltrated the lymph nodes during R-DOTAP vaccination. However, this did not occur in cells treated with whooping cough, indicating that cationic lipids induce the influx of lymphocytes into the lymph nodes, probably mediated by chemokines.

過去の研究(Yanら)では、カチオン性脂質がケモカインCCL2、3、4を誘導することが示唆された。しかしながら、これらのケモカインは、リンパ節のホーミングに関与していない。したがって、この研究は、R-DOTAPなどのカチオン性脂質も、CCL21またはCXCL12などの他のリンパ節ホーミングケモカインを誘導することを示唆している。
<実施例13:リンパ節内でのサイトカインおよびケモカインの誘導>
Previous studies (Yan et al.) Suggested that cationic lipids induce chemokines CCL2, 3, and 4. However, these chemokines are not involved in lymph node homing. Therefore, this study suggests that cationic lipids such as R-DOTAP also induce other lymph node homing chemokines such as CCL21 or CXCL12.
<Example 13: Induction of cytokines and chemokines in lymph nodes>

アジュバントの重要な副作用の1つは、サイトカインを誘導し、循環する血液にそのようなサイトカインを増やしてしまうことである。サイトカインが血中に存在すると、重大な炎症反応が起こることが多く、結果的に、これは発熱、悪心、嘔吐、頭痛、さらには極端な症例になると毒によるショックや死にすらつながる毒性が生じる。様々なアジュバントの投与にサイトカインストームが関連していることも多い。 One of the important side effects of an adjuvant is to induce cytokines and increase such cytokines in the circulating blood. The presence of cytokines in the blood often results in a significant inflammatory response, which results in fever, nausea, vomiting, headache, and in extreme cases poisonous shock and even death. Cytokine storms are often associated with the administration of various adjuvants.

したがって、この研究では、カチオン性脂質ワクチンを皮下投与した後に全身におけるサイトカインの存在の評価に焦点を当てた。ヒトHPV抗原を認識することができるヒトHLA-A2マウスに、高用量および低用量のR-DOTAP+抗原を投与した。
群1:
高用量R-DOTAP(3.4mg/mL)とスクロース溶液の1:1混合物100μLをマウスにワクチン接種
群2:
サイトカイン誘導の陽性対照として50μgのLPSをワクチン接種
群3:
高用量のR-DOTAP+HPV抗原(RDOTAPが3.4mg/mLとHPVMi
xが0.14mg/mLの1:1混合物)100μLをマウスにワクチン接種
群4:
低用量のR-DOTAP+HPV抗原(RDOTAPが3.4mg/mLとHPVMixが0.14mg/mLの1:1混合物)100μLをマウスにワクチン接種
Therefore, this study focused on assessing the presence of cytokines systemically after subcutaneous administration of a cationic lipid vaccine. High-dose and low-dose R-DOTAP + antigens were administered to human HLA-A2 mice capable of recognizing human HPV antigens.
Group 1:
Mice vaccinated with 100 μL of a 1: 1 mixture of high dose R-DOTAP (3.4 mg / mL) and sucrose solution Group 2:
Vaccinated with 50 μg LPS as a positive control for cytokine induction Group 3:
High dose R-DOTAP + HPV antigen (RDOTAP 3.4 mg / mL and HPVMi
Mice vaccinated with 100 μL (1: 1 mixture with x of 0.14 mg / mL) Group 4:
Mice are vaccinated with 100 μL of low dose R-DOTAP + HPV antigen (1: 1 mixture of RDOTAP 3.4 mg / mL and HPV Mix 0.14 mg / mL).

1回のワクチン接種の後、全てのマウスから以下のように採血した。
1.採血前(ワクチン接種前)
2.12時間
3.24時間
4.48時間
After one vaccination, blood was collected from all mice as follows.
1. 1. Before blood sampling (before vaccination)
2.12 hours 3.24 hours 4.48 hours

約200μLの血液を上記の時点で各マウスから採取した。 Approximately 200 μL of blood was collected from each mouse at the time point above.

サイトカイン分析は、製造業者の指示に従って、Luminexアッセイで行った。 Cytokine analysis was performed in the Luminex assay according to the manufacturer's instructions.

陽性対照として、十分に研究されたトール様受容体(TLR)アゴニストリポ多糖(LPS)をマウスにワクチン接種した。 As a positive control, mice were vaccinated with a well-studied Toll-like receptor (TLR) agonist lipopolysaccharide (LPS).

研究結果:Luminex Mouse cytokine 20-plexパネル(サイトカインについては以下に列挙する)を使用して、マウスの血清を分析した。Luminexソフトウェアを使用して、同じプレートで実行したサイトカイン標準と比較することで、サイトカインの強度レベルを定量した。陽性対照群(LPS)は、ワクチン接種時のIL-12、IP-10、KC、MCP-1、MIGの全身レベルが増加することを示していた。図21に示すように、研究したサイトカインとケモカインのいずれの全身誘導も、高用量と低用量のPDS0101でワクチン接種前のベースラインを超えて誘導されることはなかった。 Study Results: Mouse sera were analyzed using the Luminex Mouse cytokine 20-plex panel (cytokines are listed below). Luminex software was used to quantify cytokine intensity levels by comparison with cytokine standards performed on the same plate. The positive control group (LPS) showed increased systemic levels of IL-12, IP-10, KC, MCP-1, and MIG at the time of vaccination. As shown in FIG. 21, neither systemic induction of the cytokines or chemokines studied was induced beyond the pre-vaccination baseline with high and low doses of PDS0101.

マウスサイトカイン20-plexパネル:
FGF、IL-1b、IL-10、IL-13、IL-6、IL-12(P40/P70)、IL-17、MIP-1a、GM-CSF、MCP-1、IL-5、VEGF、IL-1a、IFN-γ、TNFa、IL-2、IP-10、MIG、KC、IL-4。
Mouse Cytokine 20-plex Panel:
FGF, IL-1b, IL-10, IL-13, IL-6, IL-12 (P40 / P70), IL-17, MIP-1a, GM-CSF, MCP-1, IL-5, VEGF, IL -1a, IFN-γ, TNFa, IL-2, IP-10, MIG, KC, IL-4.

試験したすべてのサイトカインで見られる結果に典型的なMCP-1(CCL2)およびIP-10についての研究結果を図20に示す。この研究は、カチオン性脂質の場合、サイトカインおよびケモカイン誘導が主にリンパ節に限定されるようであることを示している。典型的なTLRアゴニストであるLPSの場合、サイトカイン誘導はリンパ節に限定されず、ワクチン接種から12時間以内にサイトカインレベルの全身スパイクが観察される。血液循環にサイトカインが存在しないと、カチオン性脂質が、腫瘍微小環境を変化させるための免疫療法の独特で安全な手段を提供することを示唆している。
等価物
The study results for MCP-1 (CCL2) and IP-10, which are typical of the results found in all the cytokines tested, are shown in FIG. This study shows that in the case of cationic lipids, cytokine and chemokine induction appears to be predominantly restricted to lymph nodes. For LPS, a typical TLR agonist, cytokine induction is not limited to lymph nodes and systemic spikes at cytokine levels are observed within 12 hours of vaccination. The absence of cytokines in the blood circulation suggests that cationic lipids provide a unique and safe means of immunotherapy for altering the tumor microenvironment.
Equivalent

当業者であれば、慣用的な実験にすぎないものを用いて、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、確認することができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

One of ordinary skill in the art will be able to recognize or confirm many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein using only idiomatic experiments. .. Such equivalents are intended to be included in the appended claims.

Claims (41)

単離された樹状細胞の集団と、
少なくとも1つのカチオン性脂質と、
少なくとも1つのペプチド抗原と、を含む、ワクチンを製造するための組成物。
With a population of isolated dendritic cells,
With at least one cationic lipid,
A composition for producing a vaccine comprising at least one peptide antigen.
前記少なくとも1つのペプチド抗原は、自己会合複合体である、請求項1に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the at least one peptide antigen is a self-associating complex. 前記少なくとも1つの抗原は、疎水性が高められたアミノ酸を有する、修飾されたタンパク質、リポタンパク質、リポペプチド、ペプチドまたはそれらの組み合わせである、請求項1に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the at least one antigen is a modified protein, lipoprotein, lipopeptide, peptide or a combination thereof, which has an amino acid with enhanced hydrophobicity. 前記少なくとも1つの抗原は、癌または腫瘍関連抗原を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the at least one antigen comprises a cancer or tumor-related antigen. 前記少なくとも1つの抗原は、患者における遺伝子のタンパク質産物を含み、前記遺伝子は、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、変異を有する遺伝子、腫瘍細胞に特有の再構成を有する遺伝子、再活性化胚遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的分化遺伝子、成長因子受容体、および細胞表面タンパク質遺伝子からなる群から選択される、請求項1~4のいずれか1項に記載の組成物。 The at least one antigen comprises a protein product of a gene in a patient, wherein the gene is a cancer gene, a tumor suppressor gene, a gene having a mutation, a gene having a rearrangement peculiar to a tumor cell, a reactivated embryo gene product, and the like. The composition according to any one of claims 1 to 4, selected from the group consisting of a cancer fetal antigen, a tissue-specific differentiation gene, a growth factor receptor, and a cell surface protein gene. 前記少なくとも1つの抗原は、微生物抗原を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the at least one antigen contains a microbial antigen. 前記微生物抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、および微生物抗原の天然単離物、断片、およびその誘導体からなる群から選択される、請求項6に記載の組成物。 The composition according to claim 6, wherein the microbial antigen is selected from the group consisting of a viral antigen, a bacterial antigen, a fungal antigen, and a natural isolate, fragment, and derivative thereof of the microbial antigen. 複数の抗原を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 7, which comprises a plurality of antigens. 前記少なくとも1つの抗原は、非免疫原性のペプチドまたは免疫原性が乏しいペプチドを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 8, wherein the at least one antigen comprises a non-immunogenic peptide or a peptide having poor immunogenicity. 前記少なくとも1つのカチオン性脂質は、リンカーによって前記少なくとも1つの抗原と構造的に結合している、請求項1に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the at least one cationic lipid is structurally bound to the at least one antigen by a linker. 前記リンカーは、セリン-セリンのジペプチドリンカーである、請求項10に記載の組成物。 The composition according to claim 10, wherein the linker is a serin-serine dipeptide linker. 前記カチオン性脂質は、前記抗原をカプセル封入する、請求項1に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cationic lipid encapsulates the antigen. 前記カチオン性脂質は、リポソームを含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 12, wherein the cationic lipid contains liposomes. 前記カチオン性脂質および前記抗原は、エマルジョンである、請求項1~12のいずれか1項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 12, wherein the cationic lipid and the antigen are emulsions. 前記少なくとも1つのカチオン性脂質は、R-DOTAP、S-DOTAP、DOEPC、DDA、およびDOTMAからなる群から選択される、請求項1~14に記載の組成物。 The composition according to claim 1-14, wherein the at least one cationic lipid is selected from the group consisting of R-DOTAP, S-DOTAP, DOEPC, DDA, and DOTMA. 前記カチオン性脂質は精製されている、請求項1~15に記載の組成物。 The composition according to claim 1 to 15, wherein the cationic lipid is purified. 前記カチオン性脂質はエナンチオマーである、請求項1~16に記載の組成物。 The composition according to claim 1 to 16, wherein the cationic lipid is an enantiomer. 前記カチオン性脂質はナノ粒子を形成する、請求項1~17に記載の組成物。 The composition according to claim 1 to 17, wherein the cationic lipid forms nanoparticles. 前記ナノ粒子は直径が約10,000nm未満である、請求項18に記載の組成物。 18. The composition of claim 18, wherein the nanoparticles have a diameter of less than about 10,000 nm. 樹状細胞をex vivoで活性化する方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
単離された樹状細胞を、有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と少なくとも1つの抗原とを含む組成物で処理する工程と、
を含み、
前記単離された樹状細胞を処理するによって、前記単離された樹状細胞が活性化される、方法。
A method of activating dendritic cells ex vivo,
The process of obtaining isolated dendritic cells and
A step of treating isolated dendritic cells with a composition comprising an effective amount of at least one cationic lipid and at least one antigen.
Including
A method in which the isolated dendritic cells are activated by treating the isolated dendritic cells.
前記少なくとも1つのカチオン性脂質は、R-DOTAP、S-DOTAP、DOEPC、DDA、およびDOTMAからなる群から選択され、
前記少なくとも1つの抗原は癌抗原である、請求項20に記載の方法。
The at least one cationic lipid is selected from the group consisting of R-DOTAP, S-DOTAP, DOEPC, DDA, and DOTMA.
The method of claim 20, wherein the at least one antigen is a cancer antigen.
前記樹状細胞を、少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせで処理する工程をさらに含む、請求項20に記載の方法。 20. The method of claim 20, further comprising treating the dendritic cells with at least a growth factor or at least a cytokine or a combination thereof. 前記単離された樹状細胞はヒトである、請求項20~22のいずれか1項に記載の方法。 The method according to any one of claims 20 to 22, wherein the isolated dendritic cells are human. 前記少なくとも1つのサイトカインはGMCSFである、請求項20~23のいずれか1項に記載の方法。 The method according to any one of claims 20 to 23, wherein the at least one cytokine is GMCSF. 癌ワクチンの製造に使用するために樹状細胞をex vivoで活性化する方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
前記単離された樹状細胞を、
有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と、
少なくとも1つの癌抗原と、
少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、
を含む組成物で処理する工程と、
を含み、
前記樹状細胞を処理することによって、前記樹状細胞が活性化される、方法。
A method of ex vivo activation of dendritic cells for use in the production of cancer vaccines.
The process of obtaining isolated dendritic cells and
The isolated dendritic cells
With an effective amount of at least one cationic lipid,
With at least one cancer antigen,
With at least growth factors or at least cytokines or combinations thereof,
And the process of treating with a composition containing
Including
A method in which the dendritic cells are activated by treating the dendritic cells.
前記樹状細胞は、ヒト樹状細胞である、請求項25に記載の方法。 25. The method of claim 25, wherein the dendritic cell is a human dendritic cell. 前記少なくとも1つのサイトカインはGMCSFである、請求項25または26に記載の方法。 25. The method of claim 25 or 26, wherein the at least one cytokine is GMCSF. 癌樹状細胞ワクチンを製造するための方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
前記単離された樹状細胞を、
有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と、
少なくとも1つの癌抗原と、
少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、
を含む組成物で処理する工程と、
を含み、
前記樹状細胞を処理することによって、前記樹状細胞が活性化される、方法。
A method for producing a cancer dendritic cell vaccine,
The process of obtaining isolated dendritic cells and
The isolated dendritic cells
With an effective amount of at least one cationic lipid,
With at least one cancer antigen,
With at least growth factors or at least cytokines or combinations thereof,
And the process of treating with a composition containing
Including
A method in which the dendritic cells are activated by treating the dendritic cells.
前記樹状細胞を成長因子およびGM-CSFで処理することをさらに含む、請求項28に記載の方法。 28. The method of claim 28, further comprising treating the dendritic cells with growth factors and GM-CSF. 癌患者において治療免疫応答を高めるための方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
前記単離された樹状細胞を、
有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と、
少なくとも1つの癌抗原と、
少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、
を含む組成物で処理する工程と、
を含み、
前記樹状細胞を処理することによって、前記樹状細胞が活性化される、方法。
A method for enhancing the therapeutic immune response in cancer patients
The process of obtaining isolated dendritic cells and
The isolated dendritic cells
With an effective amount of at least one cationic lipid,
With at least one cancer antigen,
With at least growth factors or at least cytokines or combinations thereof,
And the process of treating with a composition containing
Including
A method in which the dendritic cells are activated by treating the dendritic cells.
癌患者を治療するための方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
前記単離された樹状細胞を、
有効量の少なくとも1つのカチオン性脂質と、
少なくとも1つの癌抗原と、
少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、
を含む組成物で活性化する工程と、
それによって活性化された樹状細胞を作製する工程と、
適切な数の活性化された樹状細胞を前記患者に投与する工程と、
を含み、
前記適切な数の活性化された樹状細胞を投与することによって、前記癌の前記患者が治療される、方法。
A method for treating cancer patients
The process of obtaining isolated dendritic cells and
The isolated dendritic cells
With an effective amount of at least one cationic lipid,
With at least one cancer antigen,
With at least growth factors or at least cytokines or combinations thereof,
And the step of activating with a composition containing
The process of producing activated dendritic cells and
The step of administering an appropriate number of activated dendritic cells to the patient, and
Including
A method of treating said patient with said cancer by administering the appropriate number of activated dendritic cells.
前記組成物中の前記少なくとも1つの抗原に特異的なCD8+T細胞のレベルを周期的に確認する工程と、
前記樹状細胞を前記患者に投与した後に続いて、前記患者におけるTreg細胞のレベルを確認する工程と、
をさらに含み、
抗原特異的CD8+T細胞のレベルが高く、Treg細胞のレベルが低いことが、前記患者に対し、前記癌を効果的に治療していることを示す、請求項31に記載の方法。
A step of periodically confirming the level of CD8 + T cells specific to the at least one antigen in the composition.
Following the administration of the dendritic cells to the patient, a step of confirming the level of Treg cells in the patient, and
Including
31. The method of claim 31, wherein high levels of antigen-specific CD8 + T cells and low levels of Treg cells indicate to the patient that the cancer is being effectively treated.
前記カチオン性脂質は、R-DOTAP、S-DOTAP、DOEPC、DDA、およびDOTMAからなる群から選択される、請求項28、30、31または32のいずれか1項に記載の方法。 The method according to any one of claims 28, 30, 31 or 32, wherein the cationic lipid is selected from the group consisting of R-DOTAP, S-DOTAP, DOEPC, DDA, and DOTMA. 腫瘍微小環境を変化させるための、腫瘍抗原と組み合わせた、カチオン性脂質の使用。 Use of cationic lipids in combination with tumor antigens to alter the tumor microenvironment. 前記腫瘍微小環境を変えることとは、免疫抑制性調節性T細胞の集団を減少させることである、請求項34に記載の使用。 34. The use according to claim 34, wherein altering the tumor microenvironment is to reduce the population of immunosuppressive regulatory T cells. 前記腫瘍内の免疫抑制性調節性T細胞の集団が減少し、腫瘍特異的CD8+T細胞また
はCD4+T細胞または両方の集団が増加する、請求項34に記載の方法。
34. The method of claim 34, wherein the population of immunosuppressive regulatory T cells within the tumor is reduced and the population of tumor-specific CD8 + T cells and / or CD4 + T cells is increased.
効果的な免疫療法に対して重要な3つの機能である、i)前記抗原の、MHCクラスIによるCD8+T細胞と、MHCクラスIIによるCD4+T細胞と、に対する提示、ii)T細胞の増殖とT細胞の活性化を促進する前記サイトカインおよびケモカインの誘導、iii)腫瘍に浸潤するT細胞の誘導、iv)前記腫瘍微小環境内における前記免疫抑制性細胞集団の低減、の各々を行うための、カチオン性脂質系ワクチンの使用。 Three important functions for effective immunotherapy: i) presentation of the antigen to CD8 + T cells by MHC class I and CD4 + T cells by MHC class II, ii) proliferation of T cells and T cells. Cationic for inducing the cytokines and chemokines that promote activation of the tumor, iii) inducing T cells that infiltrate the tumor, and iv) reducing the immunosuppressive cell population in the tumor microenvironment. Use of lipid-based vaccines. 前記免疫抑制性細胞集団は前記Treg集団である、請求項37に記載の使用。 37. The use according to claim 37, wherein the immunosuppressive cell population is the Treg population. in vivoでの抗原特異的T細胞応答を亢進させるための、タンパク質およびペプチド系樹状細胞ワクチンにおけるカチオン性脂質の使用。 Use of cationic lipids in protein and peptide-based dendritic cell vaccines to enhance antigen-specific T cell responses in vivo. 前記カチオン性脂質は、R-DOTAP、S-DOTAP、DOEPC、DDA、およびDOTMAからなる群から選択される、請求項34~39に記載の使用。 The use according to claims 34 to 39, wherein the cationic lipid is selected from the group consisting of R-DOTAP, S-DOTAP, DOEPC, DDA, and DOTMA. 前記カチオン性脂質は、少なくとも1つの癌ペプチド抗原との組み合わせである、請求項34~39に記載の使用。

The use according to claims 34 to 39, wherein the cationic lipid is a combination with at least one cancer peptide antigen.

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