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JP2021519099A - 抗体を回避するウイルスベクター - Google Patents

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JP2021519099A JP2020552403A JP2020552403A JP2021519099A JP 2021519099 A JP2021519099 A JP 2021519099A JP 2020552403 A JP2020552403 A JP 2020552403A JP 2020552403 A JP2020552403 A JP 2020552403A JP 2021519099 A JP2021519099 A JP 2021519099A
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Abstract

本開示は、そのアミノ酸配列に改変を含む組み換えＡＡＶカプシドタンパク質、及びその組み換えＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターを提供する。本開示は、本開示のウイルスベクター及びウイルスカプシドを細胞または対象にｉｎ ｖｉｖｏで投与する方法も提供する。【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年３月１５日に出願した米国特許仮出願第６２／８１９，３８８号、２０１８年１２月７日に出願した米国特許仮出願第６２／７７６，８１４号、２０１８年４月３日に出願した米国特許仮出願第６２／６５２，１１１号に基づく優先権を主張するものであり、各仮出願は、参照により、その全体が、あらゆる目的で、本明細書に援用される。
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する改変カプシドタンパク質、ならびにそのカプシドタンパク質を含むウイルスカプシド及びウイルスベクターに関するものである。特には、本開示は、形質導入効率の低下なしに、中和抗体を回避する表現型を付与する目的で、ウイルスベクターに組み込むことができる改変ＡＡＶカプシドタンパク質、及びそのカプシドタンパク質を含むカプシドに関するものである。
配列表
本願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表が含まれ、その配列表は、参照により、その全体が本明細書に援用される。２０１９年４月３日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＳＴＲＤ−＿００６＿０３ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、約２ＭＢのサイズである。
ＡＡＶベクターまたは組み換えＡＡＶベクターと天然の状態で遭遇すると産生される宿主由来の既存抗体は、ワクチンとしてのＡＡＶベクター及び／または遺伝子療法でのＡＡＶベクターの初回投与及び反復投与の妨げとなる。血清学的な研究により、世界全体のヒト集団において、抗体保有率が高いことが明らかとなり、約６７％の人が、ＡＡＶ１に対する抗体を有し、７２％が、ＡＡＶ２に対する抗体を有し、約４０％が、ＡＡＶ５〜ＡＡＶ９に対する抗体を有する。
さらに、遺伝子療法では、遺伝子サイレンシングまたは組織変性を伴う特定の臨床的シナリオでは、導入遺伝子の長期的な発現を維持するために、ＡＡＶベクターの投与が複数回必要になることがある。これらの問題を避けるためには、抗体による認識を回避する組み換えＡＡＶベクター（ＡＡＶｅ）が必要となる。このようなベクターは、ａ）ＡＡＶベースの遺伝子療法に適する適用可能な患者コホートを拡大し、及びｂ）ＡＡＶベースの遺伝子療法ベクターの反復投与を複数回可能にするのを助けることとなる。
本開示は、１つ以上のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を含む方法及び組成物であって、その置換によって、これらの改変カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、宿主抗体を回避する能力が導入する方法及び組成物を提供する。
本開示は、１つ以上のアミノ酸改変を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、その１つ以上のアミノ酸改変が、そのＡＡＶカプシドタンパク質の１つ以上の抗原部位を改変するＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。そのＡＡＶカプシドタンパク質をＡＡＶベクターに組み込むいくつかの実施形態では、その１つ以上の抗原部位の改変により、中和抗体が回避される。
いくつかの実施形態では、本開示は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、そのカプシドタンパク質が、そのＡＡＶカプシドタンパク質の抗原部位に置換を含み、その置換が、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つの配列を有する組み換えＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、その組み換えＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶから選択したＡＡＶセロタイプのものである。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶカプシドタンパク質は、キメラＡＡＶカプシドタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本開示は、組み換えＡＡＶカプシドタンパク質であって、配列番号１８〜８０、３００〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つとの配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または１００％であるアミノ酸配列を含む組み換えＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。
本開示は、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列、またはそのヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本開示は、本開示の１つ以上のヌクレオチド配列または発現ベクターを含む細胞も提供する。
本開示は、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドも提供する。さらに本発明で提供するのは、本開示のＡＡＶカプシドを含むウイルスベクター、ならびに薬学的に許容される担体に本開示のＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシド及び／またはウイルスベクターを含む組成物である。
加えて、本開示は、核酸を細胞に、ＡＡＶカプシドに対する抗体の存在下で導入する方法であって、その細胞と、本開示のウイルスベクターを接触させることを含む方法を提供する。その細胞は、対象内の細胞であることができ、いくつかの実施形態では、その対象は、ヒト対象であることができる。
いくつかの実施形態では、治療の必要な患者の治療方法であって、その患者に、本開示のＡＡＶウイルスベクターを治療有効量投与することを含む方法を提供する。
下に示されている詳細な説明では、上記及びその他の態様についてさらに詳しく述べられている。
Ａは、ライブラリーの多様性、指向性進化及び新規な抗原フットプリントの濃縮の解析結果を示すバブルプロットである。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを用いて、親ＡＡＶライブラリーに対して高スループットシーケンシングを行った。カスタムＰｅｒｌスクリプトによる解析後、濃縮されたアミノ酸配列をプロットした。各バブルは、別個のカプシドアミノ酸配列を表し、バブルの半径は、それぞれのライブラリーにおけるそのバリアントのリード数に比例する。ｙ軸は、ｌｏｇ（底＝２）に変換した絶対リード数を表している。データは、見やすいように、ｘ軸沿いに拡散されている。Ｂは、ライブラリーの多様性、指向性進化及び新規な抗原フットプリントの濃縮の解析結果を示すバブルプロットである。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを用いて、進化させたＡＡＶライブラリーに対して高スループットシーケンシングを行った。カスタムＰｅｒｌスクリプトによる解析後、濃縮されたアミノ酸配列をプロットした。各バブルは、別個のカプシドアミノ酸配列を表し、バブルの半径は、それぞれのライブラリーにおけるそのバリアントのリード数に比例する。ｙ軸は、ｌｏｇ（底＝２）に変換した絶対リード数を表している。データは、見やすいように、ｘ軸沿いに拡散されている。ユニーククローンの割合の低下（９３．４％）によって、第１ラウンドの進化後に、多くの「不適合な」配列が除去されたことが直接的に示されている。 Ａは、第１ラウンドの進化における親（インプット）ライブラリーを示すバブルプロットである。Ｂは、第１ラウンドの進化におけるアウトプットライブラリーを示すバブルプロットであり、このアウトプットライブラリーは、第２ラウンドの進化におけるインプットライブラリーとして使用した。Ｃは、第２ラウンドの進化におけるアウトプットライブラリーを示すバブルプロットであり、このアウトプットライブラリーは、第３ラウンドの進化におけるインプットライブラリーとして使用した。Ｄは、第３ラウンドの進化におけるアウトプットライブラリーを示すバブルプロットであり、ユニーククローンが全体的に、Ａに示されている親ライブラリーと比較して９７．３％減少している。注目すべきことに、Ａには、図１Ａと同じデータ、Ｂには、図１Ｂと同じデータが示されているが、そのデータは、総リードに対する割合に正規化したものであり、第２ラウンド以降の進化にわたって縦方向の比較が可能になっている。 組み換えＡＡＶ（ＡＡＶ−ＳＢ１、ＡＡＶ−ＳＢ２、ＡＡＶ−ＳＢ３、ＡＡＶ−ＳＢ４、ＡＡＶ−ＳＢ５）に１０，０００ｖｇ／細胞の用量で感染させた後のヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７）におけるルシフェラーゼ発現量である。 ヒト静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）による組み換えＡＡＶ（ＡＡＶ−ＳＢ１、ＡＡＶ−ＳＢ２、ＡＡＶ−ＳＢ３、ＡＡＶ−ＳＢ４、ＡＡＶ−ＳＢ５）の中和を、親ＡＡＶ８の中和と比較したものである。データは、ＩＶＩＧで処理した後の形質導入を、ＩＶＩＧによる処理を行わなかった形質導入に対する割合として表されている。 様々な用量のＩＶＩＧ（０〜４ｍｇ／ｍＬ）によって処理した後の親ＡＡＶ８及びＡＡＶ−ＳＢ１の形質導入率（％）（すなわち中和度）を示す曲線である。 Ａは、示されているカプシドで中和されたドナー試料及び中和されなかったドナー試料（合計１００個の試料）の割合（％）である。Ｂは、年齢群ごとのセロポジティブドナー試料の内訳である。 親ＡＡＶ８またはＡＡＶ−ＳＢ１のいずれかに３×１０12ｖｇ／ｍＬの用量で感染させた後の正常なマウスから得た肝臓の代表的な免疫組織化学（ＩＨＣ）像である。 ＧＦＰをパッケージングした親ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ−ＳＢ１ベクターまたはＡＡＶ−ＳＢ６ベクターをＭＯＩ４０，０００で形質導入してから４８時間後のＵ８７細胞の代表的な蛍光顕微鏡像である。参照のために、代表的な光学顕微鏡像も示されている。
別段の定義のない限り、本明細書で用いられているすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味である。本明細書における詳細な説明で用いられている専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するものとは意図されてはいない。
本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、ＧｅｎＢａｎｋまたはその他のアクセッション番号、及びその他の参照文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本開示及び添付の請求項におけるＡＡＶカプシドタンパク質のすべてのアミノ酸位置の指定は、ＶＰ１カプシドサブユニットのナンバリングに関するものである。本明細書に記載されている改変は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子に挿入されると、ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３カプシドサブユニットにおける改変をもたらし得ることを当業者は理解するであろう。あるいは、それらのカプシドサブユニットを独立して発現させて、カプシドサブユニット（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１＋ＶＰ２、ＶＰ１＋ＶＰ３またはＶＰ２＋ＶＰ３）のうちの１つまたは２つのみにおいて改変を行うこともできる。
定義
本発明の説明及び添付の請求項では、下記の用語が用いられている。
文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数形も含まれるように意図されている。
さらに、「約」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の長さの量、用量、時間、温度などのような測定可能な値に言及するときには、指定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％またはさらには±０．１％の変動を含むように意図されている。
また、本明細書で使用する場合、「及び／または」とは、列挙された関連項目のうちの１つ以上のあらゆる考え得る組み合わせ、及び択一形式（「または」）で解釈するときには、組み合わせを除外したものを指すとともに、それらを含む。
文脈上、別段に示されている場合を除き、本明細書に記載されている様々な特徴は、いずれかに組み合わせて使用できるように具体的に意図されている。
さらに、本開示では、いくつかの実施形態において、本明細書に定められているいずれかの特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できるように企図されている。さらに例示すると、例えば、明細書で、特定のアミノ酸をＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ及び／またはＶから選択できることが示されている場合には、そのアミノ酸を、これらのアミノ酸（複数可）のいずれのサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、ＩまたはＬ、Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ、ＡまたはＧ、Ｌのみなどからも、このような各サブコンビネーションが本明細書に明示的に定められているかのように選択できることも示す。さらに、このような文言では、所定のアミノ酸のうちの１つ以上を排除できることも示す。例えば、特定の実施形態では、そのアミノ酸は、Ａ、ＧまたはＩでないか、Ａではないか、ＧまたはＶではないなどであり、このような考え得る各排除項目は、本明細書に明示的に定められているのと同等である。
本明細書で使用する場合、「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低下する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低下」という用語、及び類似の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３５％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％またはこれを超える割合低下することを意味する。
本明細書で使用する場合、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強」という用語、及び類似の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％またはこれを超える割合増加することを示す。
本明細書で使用する場合、「パルボウイルス」という用語には、自律複製するパルボウイルス及びディペンドウイルスを含むＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科が含まれる。自律性パルボウイルスには、Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｂｏｃａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属及びＤｅｎｓｏｖｉｒｕｓサブファミリーのメンバーが含まれる。例示的な自律性パルボウイルスとしては、マウスの微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、マスコビーダックパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、及び現在知られているかまたは今後発見されるいずれかの他の自律性パルボウイルスが挙げられるが、これらに限らない。他の自律性パルボウイルスは、当業者に知られている。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｏｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ＤＯＩ １０．１００７／Ｓ００７０５−０１３−１９１４−１）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語には、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶｒｈ３２．３３型、ＡＡＶｒｈ８型、ＡＡＶｒｈ１０型、ＡＡＶｒｈ７４型、ＡＡＶｈｕ．６８型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ及び現在知られているかまたは今後発見されるいずれかの他のＡＡＶが含まれるが、これらに限らない。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。多くのＡＡＶセロタイプ及びクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１−６３８８、Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３−：３７５−３８３及び表２を参照されたい）。
本明細書で使用する場合、「キメラＡＡＶ」という用語は、２つ以上の異なるセロタイプのＡＡＶに由来する領域、ドメイン、個々のアミノ酸を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶを指す。いくつかの実施形態では、キメラＡＡＶは、第１のＡＡＶセロタイプに由来する第１の領域、及び第２のＡＡＶセロタイプに由来する第２の領域から構成されるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、キメラＡＡＶは、第１のＡＡＶセロタイプに由来する第１の領域、第２のＡＡＶセロタイプに由来する第２の領域、及び第３のＡＡＶセロタイプに由来する第３の領域から構成されるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、キメラＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び／またはＡＡＶ１２のうちの２つ以上に由来する領域、ドメイン、個々のアミノ酸を含んでよい。例えば、キメラＡＡＶは、下（表１）に示されているように、第１及び第２のＡＡＶセロタイプに由来する領域、ドメイン及び／または個々のアミノ酸を含んでよく、表中、ＡＡＶＸ＋Ｙは、ＡＡＶＸ及びＡＡＶＹに由来する配列を含むキメラＡＡＶを示す。
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複数のＡＡＶセロタイプに由来する個々のアミノ酸または領域を１つのカプシドタンパク質に含めることによって、複数のＡＡＶセロタイプに別々に由来する複数の所望の特性を有するカプシドタンパク質を得ることができる。
様々なセロタイプのＡＡＶ及び自律性パルボウイルスのゲノム配列、ならびに天然型の末端反復配列（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットの配列は、当該技術分野において知られている。このような配列は、文献、またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースで入手できる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照されたい（これらの開示内容は、参照により、パルボウイルス及びＡＡＶの核酸配列及びアミノ酸配列を教示する目的で、本明細書に援用される）。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８、Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４、Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５−３８３、国際公開第００／２８０６１号、同第９９／６１６０１号、同第９８／１１２４４号、及び米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたい（これらの開示内容は、参照により、パルボウイルス及びＡＡＶの核酸配列及びアミノ酸配列を教示する目的で、本明細書に援用される）。表２も参照されたい。自律性パルボウイルス及びＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）にさらに詳細に説明されている。ＡＡＶ２（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５−１０）、ＡＡＶ９（ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：６９４７−６９５８）、ＡＡＶ８（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２２６０−１２２７１）、ＡＡＶ６（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１２９４５−１２９５７）、ＡＡＶ５（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，１１１８７−１１１９９）、ＡＡＶ４（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１５５６−１１５７０）、ＡＡＶ３Ｂ（Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０３：２６−３６）、ＢＰＶ（Ｋａｉｌａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：２６０３−２６１４）、ならびにＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７−５２０及びＴｓａｏ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６−６４）の結晶構造の説明も参照されたい。
Figure 2021519099
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「トロピズム」という用語は、本明細書で使用する場合、ウイルスが特定の細胞または組織に優先的に侵入し、任意に、その後、そのウイルスゲノムに含まれる配列（複数可）の発現（例えば、転写及び任意に翻訳）をその細胞内で行うこと、例えば、組み換えウイルスでは、目的の異種核酸（複数可）の発現を行うことを指す。
ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは別段に調節される核酸配列では、トランス作用因子の非存在下では開始しない場合があることは当業者には明らかであろう。ｒＡＡＶゲノムの場合には、そのウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定に組み込まれたプロウイルス、組み込まれないエピソーム、及びそのウイルスが細胞内で取り得るいずれかの他の形態から行うことができる。
本明細書で使用する場合、「全身性トロピズム」及び「全身性形質導入」（ならびに同等の用語）とは、それぞれ、本開示のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、全身の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓及び／または膵臓）に対してトロピズムを示すか、または形質導入することを示す。実施形態では、筋肉組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋及び心筋）の全身性形質導入が観察される。別の実施形態では、骨格筋組織の全身性形質導入が行われる。例えば、特定の実施形態では、全身の本質的にすべての骨格筋が形質導入される（ただし、形質導入の効率は、筋肉の種類によって変動し得る）。特定の実施形態では、四肢筋、心筋及び横隔膜筋の全身性形質導入が行われる。任意に、本開示のウイルスカプシドまたはウイルスベクターは、全身経路（例えば、静脈内、関節内またはリンパ管内のような全身経路）を介して投与する。
あるいは、別の実施形態では、本開示のカプシドまたはウイルスベクターは、局部（例えば、フットパッド、筋肉内、皮内、皮下、局所）送達する。
別段に示されていない限り、「効率的な形質導入」もしくは「効率的なトロピズム」、または類似の用語は、好適なコントロールを参照することによって判断することができる（例えば、コントロールの形質導入またはトロピズムの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはこれを超える割合）。特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、骨格筋、心筋、横隔膜筋、膵臓（膵島β細胞を含む）、脾臓、胃腸管（例えば、上皮及び／または平滑筋）、中枢神経系の細胞、肺、関節細胞及び／または腎臓に対して、効率的な形質導入を行うか、または効率的なトロピズムを有する。好適なコントロールは、所望のトロピズムプロファイルを含む様々な要因によって決定されることになる。例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、骨格筋、心筋及び横隔膜筋に形質導入する効率性が高いが、高効率で肝臓に形質導入する問題点もある。したがって、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の骨格筋、心筋及び／または横隔膜筋への効率的な形質導入を示すが、肝臓への形質導入効率がかなり低いウイルスベクターを特定することができる。さらに、対象とするトロピズムプロファイルは、複数の標的組織に対するトロピズムを反映するものであり得るので、好適なベクターには、いくつかのトレードオフが存在し得ることは明らかであろう。例示としては、本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９よりも、骨格筋、心筋及び／または横隔膜筋に形質導入する効率が低くなり得るが、しかしその一方で、肝臓への形質導入レベルが低いので、非常に望ましいことがある。
同様に、ウイルスが、標的組織に対して「効率的な形質導入を行わない」か、もしくは「効率的なトロピズムを有さない」か、または類似の状況については、好適なコントロールを参照することによって判断できる。特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、肝臓、腎臓、性腺及び／または生殖細胞に対して効率的な形質導入を行わない（すなわち、効率的なトロピズムを有さない）。特定の実施形態では、組織（複数可）（例えば肝臓）への望ましくない形質導入は、所望の標的組織（複数可）（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋及び／または中枢神経系の細胞）への形質導入のレベルの約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下である。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語には、別段に示されていない限り、ペプチド及びタンパク質の両方が含まれる。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの配列であってよい（天然及び非天然のヌクレオチドの両方を含む）が、代表的な実施形態では、一本鎖ＤＮＡ配列または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。
本明細書で使用する場合、「単離」ポリヌクレオチド（例えば、「単離ＤＮＡ」または「単離ＲＮＡ」）とは、天然の生物またはウイルスの少なくともいくつかの他の構成要素、例えば、細胞もしくはウイルスの構造的な構成要素、または一般的にそのポリヌクレオチドと関連して見られる他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離」ヌクレオチドは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍またはそれを上回る倍率で濃縮されている。
同様に、「単離」ポリペプチドとは、天然の生物またはウイルスの少なくともいくつかの他の構成要素、例えば、細胞もしくはウイルスの構造的な構成要素、または一般的にそのポリペプチドと関連して見られる他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離」ポリペプチドは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍またはそれを上回る倍率で濃縮されている。
本明細書で使用する場合、ウイルスベクターを「単離する」もしくは「精製する」（または文法的に同等な語）とは、出発物質中の少なくともいくつかの他の構成要素から、ウイルスベクターを少なくとも部分的に分離することを意味する。代表的な実施形態では、「単離」ウイルスベクターまたは「精製」ウイルスベクターは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍またはそれを上回る倍率で濃縮されている。
「治療用ポリペプチド」とは、細胞もしくは対象のタンパク質の不在または欠損に起因する症状を緩和し、軽減し、予防し、遅延し及び／または安定させることができるポリペプチドであり、及び／または別段の形で対象に利益、例えば抗がん作用、もしくは移植生存性の向上をもたらすポリペプチドである。
「治療する」、「治療すること」、「〜の治療」という用語（及びその文法的変形表現）とは、対象の状態の重症度を低下させ、少なくとも部分的に改善させ、もしくは安定させること、及び／または少なくとも１つの臨床症状をいくらか緩和、軽減、減少もしくは安定化させること、及び／または疾患または障害の進行の遅延が見られることを意味する。
「予防する」、「予防すること」及び「予防」（ならびにその文法的変形表現）とは、対象における疾患、障害及び／または臨床症状（複数可）の発生を予防及び／または遅延すること、及び／または疾患、障害及び／または臨床症状（複数可）の発生の重症度を、本開示の方法を行わない状態で見られる重症度よりも低下させることを指す。予防は、完全な予防、例えば、疾患、障害及び／または臨床症状（複数可）が完全に見られないことであることができる。予防は、部分的であり、対象における疾患、障害及び／または臨床症状（複数可）の発生、及び／または発生の重症度が、本開示を行わない状態で見られるものよりも低くなるような予防であることもできる。
「治療有効量」とは、本明細書で使用する場合、疾患または疾患の臨床症状のうちの少なくとも１つを治療するために対象に投与したときに、疾患またはその症状の治療を行うのに充分である量を指す。「治療有効量」は、例えば、疾患及び／またはその疾患の症状、疾患及び／または疾患もしくは障害の症状の重症度、治療対象の患者の年齢、体重及び／または健康状態、ならびに処方医の判断に応じて変動し得る。いずれかの所定の場合における適切な量は、当業者が確認し得るか、または常法的な実験によって決定できる。
本明細書で使用する場合、「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能するとともに、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えばウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含むウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を指す。あるいは、いくつかの文脈では、「ベクター」という用語は、そのベクターゲノム／ｖＤＮＡのみを指す目的で用いられる場合もある。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」とは、１つ以上の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわちｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターでは概して、ウイルスの生成には、シス位の末端反復配列（複数可）（ＴＲ（複数可））のみが必要となる。他のすべてのウイルス配列は、必須ではなく、トランス位に供給し得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。典型的には、ベクターに効率的にパッケージングできる導入遺伝子のサイズを最大化するために、ｒＡＡＶベクターゲノムは、１つ以上のＴＲ配列のみを保持することになる。構造タンパク質及び非構造タンパク質のコード配列は、（例えば、プラスミドのようなベクターによるか、またはその配列をパッケージング細胞に安定的に組み込むことによって）トランス位に供給してもよい。実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、任意に２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、その２つのＴＲは典型的には、ベクターゲノムの５’末端及び３’末端に位置して、異種核酸を挟み込むことになるが、その異種核酸に隣接する必要はない。それらのＴＲは、同じであることも、互いと異なることもできる。
「末端反復配列」または「ＴＲ」という用語には、ヘアピン構造を形成して、逆位末端反復配列として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組み込み及び／またはプロウイルスレスキューなどのような所望の機能を媒介する）いずれのウイルス末端反復配列または合成配列も含まれる。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲであることも、非ＡＡＶ ＴＲであることもできる。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）のＴＲ配列またはいずれかの他の好適なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製起点として機能するＳＶ４０ヘアピン）のような非ＡＡＶ ＴＲ配列をＴＲとして使用でき、その配列は、トランケーション、置換、欠失、挿入及び／または付加によってさらに改変できる。さらに、ＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載されているような「ダブルＤ配列」など、部分的または完全に合成によるものであることができる。
「ＡＡＶ末端反復配列」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、いずれかのＡＡＶに由来してよく、そのＡＡＶとしては、セロタイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または現在知られているかもしくは今後発見されるいずれかの他のＡＡＶが挙げられるが、これらに限らない（例えば、表２を参照されたい）。ＡＡＶ末端反復配列は、天然型の末端反復配列を有する必要はない（例えば、挿入、欠失、トランケーション及び／またはミスセンス変異によって、天然型のＡＡＶ ＴＲ配列を改変してよい）。ただし、その末端反復配列が、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み及び／またはプロウイルスレスキューなどを媒介することを条件とする。
本開示のウイルスベクターはさらに、「標的化」ウイルスベクター（例えば、指向型トロピズムを有するベクター）、及び／または国際公開第００／２８００４号及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載されているような「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲ及びウイルスカプシドが、異なるパルボウイルスに由来するウイルス）であることができる。
本開示のウイルスベクターはさらに、国際公開第０１／９２５５１号（その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているような二本鎖パルボウイルス粒子であることができる。したがって、いくつかの実施形態では、二本鎖（デュプレックス）ゲノムを本開示のウイルスカプシドにパッケージングできる。さらに、本開示のウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失及び／または置換を含む他の改変を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語には、いずれの天然アミノ酸、その改変形態及び合成アミノ酸が含まれる。
天然の左旋性（Ｌ−）アミノ酸は、表３に示されている。
Figure 2021519099
あるいは、アミノ酸は、改変アミノ酸残基（非限定的な例は、表４に示されている）であることができ、及び／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化もしくは硫酸塩化）によって改変されているアミノ酸であることができる。
Figure 2021519099
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さらに、非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）アミノ酸は、（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５−４９（２００６）に記載されているような）「非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）」アミノ酸であることができる。有益なことに、これらの非天然アミノ酸を用いて、対象とする分子を本開示のＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結することができる。
改変ＡＡＶカプシドタンパク質、ならびにその改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシド及びウイルスベクター
本開示は、アミノ酸配列に改変（例えば置換）を含むＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３）、ならびにその改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシド及びウイルスベクターを提供する。本明細書に記載されている改変によって、その改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、１つ以上の所望の特性（中和抗体を回避する能力が挙げられるが、これに限らない）を付与できることを本発明者は発見した。すなわち、本開示は、従来のＡＡＶベクターに付随するいくつかの制限に対処するものである。
したがって、一態様では、本開示は、１つ以上のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、その１つ以上の置換によって、そのＡＡＶカプシドタンパク質の１つ以上の抗原部位が改変されるＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。その１つ以上の抗原部位の改変によって、その１つ以上の抗原部位への抗体の結合が阻害され、及び／または前記ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子の感染性の中和が阻害される。その１つ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ−抗体複合体のペプチドエピトープマッピング及び／または低温電子顕微鏡による試験によって特定された１つ以上の抗原フットプリントに位置することができる。いくつかの実施形態では、その１つ以上の抗原部位は、共通の抗原モチーフ、ＷＯ２０１７／０５８８９２（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているようなすなわちＣＡＭである。いくつかの実施形態では、その抗原部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質の可変領域（ＶＲ）、ＶＲ−Ｉ、ＶＲ−ＩＩ、ＶＲ−ＩＩＩ、ＶＲ−ＩＶ、ＶＲ−Ｖ、ＶＲ−ＶＩ、ＶＲ−ＶＩＩ、ＶＲ−ＶＩＩＩ、ＶＲ−ＩＸなどにある。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＨＩループにある。
いくつかの実施形態では、その改変された抗原部位によって、抗体が、ＡＡＶカプシドと結合するか、またはＡＡＶカプシドを認識もしくは中和するのを防ぐことができ、その抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む）、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＡである。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ウシＡＡＶまたはトリＡＡＶのカプシドタンパク質が、下記の表５に定められている領域のうちの１つ以上に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸置換は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９及び４１１〜４２１からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸置換は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１との配列相同性が少なくとも９５％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
Figure 2021519099
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いくつかの実施形態では、そのアミノ酸置換では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ウシＡＡＶまたはトリＡＡＶというセロタイプのうちのいずれか１つに由来するＡＡＶカプシドタンパク質におけるいずれかの６個、７個または８個のアミノ酸が置き換えられている。例えば、そのアミノ酸置換では、上で列挙したＡＡＶセロタイプのうちのいずれかにおける２８０〜２８６番目、２７９〜２９３番目、２９４〜３００番目、３０１〜３０７番目、３０８〜３１４番目、３１５〜３２１番目、３２２〜３２８番目、３２９〜３３５番目、３３６〜３４２番目、３４３〜３４９番目、３５０〜３５６番目、３５７〜３６３番目、３６４〜３７０番目、３７１〜３７７番目、３７８〜３８４番目、３８５〜３９１番目、３９２〜３９８番目、３９９〜４０５番目、４０６〜４１２番目、１４３〜１４９番目、４２０〜４２６番目、４２７〜４３３番目、４３４〜４４０番目、４４１〜４４７番目、４４８〜４５４番目、４５５〜４６１番目、４６２〜４６８番目、４６９〜４７５番目、４７６〜４８２番目、４８３〜４８９番目、４９０〜４９６番目、４９７〜５０３番目、５０４〜５１０番目、５１１〜５１７番目、５１８〜５２４番目、５２５〜５３１番目、５３２〜５３８番目、５３９〜５４５番目、５４６〜５５２番目、５５３〜５５９番目、５６０〜５６６番目、５６７〜５７３番目、５７４〜５８０番目、５８１〜５８７番目、５８８〜５９４番目、５９５〜６０１番目、６０２〜６０８番目、６０９〜６１５番目、６１６〜６２２番目、６２３〜６２９番目、６３０〜６３６番目、６３７〜６４３番目、６４４〜６５０番目、６５１〜６５７番目、６５８〜６６４番目、６６５〜６７１番目、６７２〜６７８番目、６７９〜６８５番目、６８６〜６９２番目、６９３〜６９９番目のアミノ酸（ＶＰ１ナンバリング）が置き換えられていてよい。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸置換では、上で列挙したＡＡＶセロタイプのうちのいずれかにおける２９４〜３０１番目、３０２〜３０９番目、３１０〜３１７番目、３１８〜３２５番目、３２６〜３３３番目、３３４〜３３１番目、３４２〜３４９番目、３５０〜３５７番目、３５８〜３６５番目、３６６〜３７３番目、３７４〜３８１番目、３８２〜３８９番目、３９０〜３９７番目、３９８〜４０５番目、４０６〜４１３番目、４１４〜４２１番目、４２２〜４２９番目、４３０〜４３７番目、４３８〜４４５番目、４４６〜４５３番目、４５４〜４６１番目、４６２〜４６９番目、４７０〜４７７番目、４７８〜４８５番目、４８６〜４９３番目、４９４〜５０１番目、５０２〜５０９番目、２１０〜５１７番目、５１８〜５２５番目、５２６〜５３３番目、５３４〜５４１番目、５４２〜５４９番目、５５０〜５５７番目、５５８〜５６５番目、５６６〜５７３番目、５７４〜５８１番目、５８２〜５８９番目、５９０〜５９７番目、５９８〜６０５番目、５０６〜６１３番目、６１４〜６２１番目、６２２〜６２９番目、６３０〜６３７番目、６３８〜６４５番目、６４６〜６５３番目、６５４〜６６１番目、６６２〜６６９番目、６７０〜６７７番目、６７８〜６８５番目、６８６〜６９３番目、６９４〜７０１番目のアミノ酸（ＶＰ１ナンバリング）が置き換えられていてよい。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸置換では、上で列挙したＡＡＶセロタイプのうちのいずれかにおける４００〜４０５番目、４０６〜４１１番目、４１２〜４１７番目、４１８〜４２３番目、４２４〜４２９番目、４３０〜４３５番目、４３６〜４４１番目、４４２〜４４７番目、４４８〜４５３番目、４５４〜４５９番目、４６０〜４６５番目、４６６〜４７１番目、４７２〜４７７番目、４７８〜４８３番目、４８４〜４８９番目、４９０〜４９５番目、４８４〜４８９番目、４９０〜４９５番目、４９６〜５０１番目、５０２〜５０７番目、５０８〜５１３番目、５１４〜５１９番目、５２０〜５２５番目、５２６〜５３１番目、５３２〜５３７番目、５３８〜５４３番目、５４４〜５４９番目、５５０〜５５５番目、５５６〜５６１番目、５６２〜５６７番目、５６８〜５７３番目、５７４〜５７９番目、５８０〜５８５番目、５８６〜５９１番目、５９２〜５９７番目、５９８〜６０３番目、６０４〜６０９番目、６１０〜６１５番目、６１６〜６２１番目、６２２〜６２７番目、６２８〜６３３番目、６３４〜６３９番目、６４０〜６４５番目、６４６〜６５１番目、６５２〜６５７番目、６５８〜６６３番目、６６４〜６６９番目、６７０〜６７５番目、６７６〜６８１番目、６８２〜６８７番目、６８８〜６９３番目、６９４〜６９９番目、７００〜７０５番目のアミノ酸（ＶＰ１ナンバリング）が置き換えられていてよい。
いくつかの実施形態では、その置換により、ＡＡＶカプシド配列に欠失が導入される。例えば、６個のアミノ酸の配列に置換されて、天然型のアミノ酸カプシド配列の７個のアミノ酸が置き換えられるか、７個のアミノ酸の配列に置換されて、天然型のアミノ酸カプシド配列の８個のアミノ酸が置き換えられるか、８個のアミノ酸の配列に置換されて、天然型のアミノ酸カプシド配列の９個のアミノ酸が置き換えられるか、または９個のアミノ酸の配列に置換されて、天然型のアミノ酸カプシド配列の１０個のアミノ酸が置き換えられる。いくつかの実施形態では、その置換により、ＡＡＶカプシド配列への挿入が導入される。例えば、６個のアミノ酸の配列に置換されて、天然型のアミノ酸カプシド配列の５個のアミノ酸が置き換えられるか、７個のアミノ酸の配列に置換されて、天然型のアミノ酸カプシド配列の６個のアミノ酸が置き換えられるか、８個のアミノ酸の配列に置換されて、天然型のアミノ酸カプシド配列の７個のアミノ酸が置き換えられるか、または９個のアミノ酸の配列に置換されて、８個のアミノ酸が置き換えられる。
本開示のカプシドタンパク質は、中和抗体を回避する表現型を有するＡＡＶウイルス粒子またはＡＡＶウイルスベクターに存在するＡＡＶカプシドが生成されるように改変されている。本開示のＡＡＶウイルス粒子またはＡＡＶウイルスベクターは、中和抗体を回避する表現型に加えて、形質導入効率が向上または維持された表現型も有することもできる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原部位の１つ以上の置換では、第１のＡＡＶセロタイプのカプシドタンパク質に由来する１つ以上の抗原部位を、前記第１のＡＡＶセロタイプとは異なる第２のＡＡＶセロタイプのカプシドタンパク質に導入できる。
本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、トリＡＡＶ、または現在知られているかもしくは今後特定されるいずれかの他のＡＡＶから選択したＡＡＶセロタイプのカプシドタンパク質であることができる。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶカプシドタンパク質は、キメラカプシドタンパク質である。
本明細書には、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質のいくつかの例が示されている。下記の例では、そのカプシドタンパク質は、記載されている具体的な置換を含むことができ、いくつかの実施形態では、記載されている置換よりも少ないかまたは多い置換を含むことができる。本明細書で使用する場合、「置換」とは、単一アミノ酸置換、または２つ以上のアミノ酸の置換を指してよい。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質は、単一アミノ酸置換を少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の連続するアミノ酸の１つ以上の置換など、複数の連続するアミノ酸の１つ以上の置換を含むことができる。
さらに、本明細書に記載されている実施形態のうち、アミノ酸残基が、野生型または天然型のアミノ酸配列に存在するアミノ酸残基以外のいずれかのアミノ酸残基によって置換されている実施形態では、前記いずれかの他のアミノ酸残基は、当該技術分野において知られているいずれの天然または非天然のアミノ酸残基であることもできる（例えば、表３及び４を参照されたい）。いくつかの実施形態では、その置換は、保存的置換であることができ、いくつかの実施形態では、その置換は、非保存的置換であることができる。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換は、表６．１に列挙されている配列から選択されている。
Figure 2021519099
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換を含み、その第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換はそれぞれ、そのＡＡＶカプシドタンパク質の異なる抗原部位を改変する。いくつかの実施形態では、その第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換はそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９及び４１１〜４２１から選択されている。
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、第１の酸置換、第２のアミノ酸置換及び第３のアミノ酸置換を含み、その第１のアミノ酸置換、第２のアミノ酸置換及び第３のアミノ酸置換はそれぞれ、そのＡＡＶカプシドタンパク質の異なる抗原部位を改変する。いくつかの実施形態では、その第１のアミノ酸置換、第２のアミノ酸置換及び第３のアミノ酸置換はそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９及び４１１〜４２１から選択されている。いくつかの実施形態では、その第１のアミノ酸置換は、配列番号９を含み、第２のアミノ酸置換は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちの１つを含み、第３のアミノ酸置換は、配列番号１７を含む。いくつかの実施形態では、その第１のアミノ酸置換は、配列番号９を含み、第２のアミノ酸置換は、配列番号１０のうちの１つを含み、第３のアミノ酸置換は、配列番号１７を含む。いくつかの実施形態では、その第１のアミノ酸置換は、配列番号９を含み、第２のアミノ酸置換は、配列番号１４のうちの１つを含み、第３のアミノ酸置換は、配列番号１７を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つとの配列相同性が少なくとも９５％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４９を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４９との配列相同性が少なくとも９５％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４９の４５４〜４６０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号９と置き換えることによって改変されている。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４９の４９３〜５００番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちの１つと置き換えることによって改変されている。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４９の５８５〜５９０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１７と置き換えることによって改変されている。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４９の４５４〜４６０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号９と置き換え、配列番号４９の４９３〜５００番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちの１つと置き換え、配列番号４９の５８５〜５９０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１７と置き換えることによって改変されている。
本明細書に記載されているＡＡＶカプシドのいずれも、ＨＩループに改変（例えば、置換または欠失）をさらに含んでよい。ＨＩループは、βストランドのβＨ及びβＩの間にある、ＡＡＶカプシド表面上の突出ドメインであって、各ウイルスタンパク質（ＶＰ）サブユニットから延びて、隣接する５回軸ＶＰの一部を覆っている突出ドメインである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＨＩループに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶカプシドは、ＨＩループに、Ｐ６６１Ｒ、Ｔ６６２Ｓ、Ｑ６６６Ｇ、Ｓ６６７Ｄという置換のうちの１つ以上を含み、このナンバリングは、野生型ＡＡＶ８カプシド（配列番号６）に対応するものである。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶカプシドは、ＨＩループに、Ｐ６５９Ｒ、Ｔ６６０Ｓ、Ａ６６１Ｔ、Ｋ６６４Ｇという置換のうちの１つ以上を含み、このナンバリングは、野生型ＡＡＶ９カプシド（配列番号７）に対応するものである。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、１個、２個、３個または４個のアミノ酸置換を含み、各置換によって、ＡＡＶカプシドタンパク質の異なる抗原部位が改変され、そのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つによって、そのカプシドタンパク質のＨＩループが改変される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、第１、第２、第３及び第４のアミノ酸置換を含む。実施形態では、その第１のアミノ酸置換、第２のアミノ酸置換及び第３のアミノ酸置換はそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９及び４１１〜４２１から選択されており、その第４のアミノ酸置換により、そのカプシドタンパク質のＨＩループが改変されている。いくつかの実施形態では、その第１のアミノ酸置換は、配列番号９を含み、第２のアミノ酸置換は、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちの１つを含み、第３のアミノ酸置換は、配列番号１７を含み、第４のアミノ酸置換により、そのカプシドタンパク質のＨＩループが改変されている。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶカプシドは、ＨＩループに、Ｐ６６１Ｒ、Ｔ６６２Ｓ、Ｑ６６６Ｇ、Ｓ６６７Ｄ（そのナンバリングは、野生型ＡＡＶ８カプシド（配列番号６）に対応するものである）、またはＰ６５９Ｒ、Ｔ６６０Ｓ、Ａ６６１Ｔ、Ｋ６６４Ｇ（そのナンバリングは、野生型ＡＡＶ９カプシド（配列番号７）に対応するものである）という置換のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、表６．２に示されているように、第１の置換、第２の置換、及び任意に、第３の置換を含んでよい。
Figure 2021519099
Figure 2021519099
Figure 2021519099
いくつかの実施形態では、組み換えカプシドタンパク質は、配列番号６（ＡＡＶ８）または配列番号７（ＡＡＶ９）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％少なくとも９９％または１００％同一である配列を有し、表６．２に示されているように、第１の置換、第２の置換、及び任意に、第３の置換を含む。
いくつかの実施形態では、組み換えカプシドタンパク質は、配列番号６（ＡＡＶ８）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を有し、Ｇ４５５Ｓ、Ｇ４５６Ｎ、Ｇ４５６Ｓ、Ｔ４５７Ｇ、Ｔ４５７Ｎ、Ａ４５８Ｒ、Ａ４５８Ｇ、Ｎ４５９Ｇ、Ｎ４５９Ｒ、Ｔ４６０Ｖ、Ｔ４６０Ｇ、Ｎ４５９Ｒ、Ｑ４６１Ｖ、Ｔ４９４Ｎ、Ｔ４９４Ｖ、Ｔ４９４Ｍ、Ｔ４９４Ｇ、Ｔ４９４Ｓ、Ｔ４９４Ａ、Ｔ４９４Ｒ、Ｔ４９４Ｙ、Ｔ４９５Ｌ、Ｔ４９５Ｓ、Ｔ４９５Ｔ、Ｔ４９５Ｓ、Ｔ４９５Ｖ、Ｔ４９５Ｆ、Ｔ４９５Ｒ、Ｔ４９５Ｐ、Ｇ４９６Ａ、Ｇ４９６Ｓ、Ｇ４９６Ｎ、Ｇ４９６Ｈ、Ｇ４９６Ｔ、Ｇ４９６Ｎ、Ｇ４９６Ｒ、Ｇ４９６Ｌ、Ｑ４９７Ｅ、Ｑ４９７Ｇ、Ｑ４９７Ａ、Ｑ４９７Ｌ、Ｑ４９７Ｓ、Ｑ４９７Ｒ、Ｑ４９７Ａ、Ｑ４９７Ｎ、Ｑ４９７Ｅ、Ｑ４９７Ｅ、Ｎ４９８Ｄ、Ｎ４９８Ｓ、Ｎ４９８Ｇ、Ｎ４９８Ｍ、Ｎ４９９Ｆ、Ｎ４９９Ｈ、Ｎ４９９Ｇ、Ｎ４９９Ｋ、Ｎ４９９Ｔ、Ｎ４９９Ｐ、Ｎ４９９Ｍ、Ｎ５００Ｋ、Ｎ５００Ｓ、Ｎ５００Ｅ、Ｎ５００Ｎ、Ｎ５００Ｑ、Ｎ５００Ｇ、Ｎ５００Ｖ、Ｎ５００Ｉ、Ｎ５００Ｔ、Ｓ５０１Ｙ、Ｓ５０１Ａ、Ｓ５０１Ｇ、Ｓ５０１Ｑ、Ｓ５０１Ｌ、Ｓ５０１Ｔ、Ｓ５０１Ｖ、Ｓ５０１Ｇ、Ｓ５０１Ｉ、Ｌ５８６Ｖ、Ｑ５８７Ｍ、Ｑ５８８Ｅ、Ｑ５８９Ｐ、Ｎ５９０Ｔ、Ｔ５９１Ｒというアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、組み換えカプシドタンパク質は、配列番号６（ＡＡＶ８）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を有し、Ｔ４９４Ｙ、Ｔ４９５Ｐ及び／またはＧ４９６Ｌというアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、組み換えカプシドタンパク質は、配列番号３８０、３８４、７８３、７８４または７８５の配列の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を有する。
本開示は、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。そのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列であっても、ＲＮＡ配列であってもよい。本開示は、本開示の１つ以上のヌクレオチド配列または発現ベクターを含む細胞も提供する。
また、提供するのは、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドである。さらに、本発明で提供するのは、本開示のＡＡＶカプシドを含むウイルスベクター、ならびに薬学的に許容される担体に、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシド及び／またはウイルスベクターを含む組成物である。
いくつかの実施形態では、その１つ以上の抗原部位の改変によって、その１つ以上の抗原部位への抗体の結合が阻害される。いくつかの実施形態では、その１つ以上の抗原部位の改変によって、そのＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子の感染性の中和が阻害される。
本明細書に記載されているように、多くのＡＡＶに由来するカプシドタンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列が、当該技術分野において知られている。したがって、天然型のＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸位置「に対応する」アミノ酸は、いずれの他のＡＡＶにおいても、（例えば、配列アラインメントを用いることによって）容易に判断できる。
本開示では、現在知られているかまたは今後発見されるいずれかのＡＡＶのカプシドタンパク質を改変することによって、改変カプシドタンパク質を作製できることが企図されている。
さらに、改変を施すＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０もしくはＡＡＶ１１のカプシドタンパク質、または表２に示されているＡＡＶのうちのいずれか）であることができるが、それらに限らない。ＡＡＶカプシドタンパク質に対する様々な操作が、当該技術分野において知られていること、及び本開示が、天然のＡＡＶカプシドタンパク質の改変に限定されないことを当業者は理解するであろう。例えば、改変を施すカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ（例えば、天然のＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、または現在知られているかもしくは今後発見されるいずれかの他のＡＡＶに由来するもの）と比較して、すでに改変を有してもよい。いくつかの実施形態では、そのカプシドタンパク質は、キメラカプシドタンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、そのカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂのように、操作されたＡＡＶであってよい。このようなＡＡＶカプシドタンパク質も、本開示の範囲内である。
したがって、特定の実施形態では、改変を施すＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶに由来することができるが、そのカプシドタンパク質に挿入及び／または置換された１つ以上の外来配列（例えば、天然型のウイルスにとって外来性である配列）をさらに含み、及び／または１つ以上のアミノ酸の欠失によって改変されている。
したがって、具体的なＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０もしくはＡＡＶ１１のカプシドタンパク質、または表２に示されているＡＡＶのうちのいずれかに由来するカプシドタンパク質など）に言及するときには、天然型のカプシドタンパク質、及び本開示の改変以外の改変を有するカプシドタンパク質を含むように意図されている。このような改変には、置換、挿入及び／または欠失が含まれる。特定の実施形態では、そのカプシドタンパク質は、天然型のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、そのタンパク質に挿入されたアミノ酸（本開示の挿入以外の挿入）を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満または７０個未満含む。実施形態では、そのカプシドタンパク質は、天然型のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、アミノ酸置換（本開示によるアミノ酸置換以外のアミノ酸置換）を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満または７０個未満含む。本開示の実施形態では、そのカプシドタンパク質は、天然型のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、アミノ酸の欠失（本開示のアミノ酸欠失以外のアミノ酸欠失）を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満または７０個未満含む。
２つ以上のアミノ酸配列の間の配列の類似性または同一性を求める方法は、当該技術分野において知られている。配列の類似性または同一性は、当該技術分野において知られている標準的な技法を用いて求めてよく、その技法としては、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューターによるインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５（１９８４）に記載されているベストフィット配列プログラム、または検証によるものが挙げられるが、これらに限らない。
別の好適なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３−５７８７（１９９３）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０−４８０（１９９６）、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得たＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２というプログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２では、いくつかの検索パラメーターが使用され、それらは任意に、デフォルト値に設定する。それらのパラメーターは、動的な値であり、特定の配列の組成、及び対象とする配列を検索する特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体によって構築されるが、それらの値を調整して、感度を向上させてもよい。
さらには、追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２に報告されているようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。
本開示は、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むか、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質から本質的になるか、または本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質からなるウイルスカプシドも提供する。特定の実施形態では、そのウイルスカプシドは、パルボウイルスカプシドであり、そのパルボウイルスカプシドはさらに、自律性パルボウイルスカプシドまたはディペンドウイルスカプシドであってよい。任意に、そのウイルスカプシドは、ＡＡＶカプシドである。特定の実施形態では、そのＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶカプシド、トリＡＡＶカプシド、または現在知られているかもしくは今後特定されるいずれかの他のＡＡＶである。ＡＡＶセロタイプの非限定的なリストは、表２に示されており、本開示のＡＡＶカプシドは、表２に列挙されているいずれのＡＡＶセロタイプであることも、１つ以上の挿入、置換及び／または欠失によって、上記のうちのいずれかから得たものであることもできる。その改変ウイルスカプシドは、例えば米国特許第５，８６３，５４１号に記載されているように、「カプシドビヒクル」として使用できる。その改変ウイルスカプシドにパッケージングして、細胞に移入できる分子としては、異種のＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、有機小分子、金属またはこれらを組み合わせたものが挙げられる。
異種分子は、ＡＡＶ感染の際に天然では見られない分子、例えば、野生型ＡＡＶゲノムによってはコードされない分子として定義する。さらに、治療上有用な分子を宿主標的細胞に移入するために、その分子をそのキメラウイルスカプシドの外側と結合させることができる。このような結合分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機小分子、金属、糖鎖、脂質及び／またはポリペプチドを挙げることができる。本開示の一実施形態では、その治療上有用な分子は、カプシドタンパク質に共有結合している（すなわち、コンジュゲートまたは化学的にカップリングしている）。分子を共有結合する方法は、当業者に知られている。
本開示の改変ウイルスカプシドには、その新規カプシド構造に対する抗体を産生させる用途も見られる。さらなる代替用途として、本開示の改変ウイルスカプシドに外来のアミノ酸配列を挿入して、細胞に対する抗原提示が行われるように、例えば、対象に投与して、その外来のアミノ酸配列に対する免疫応答を引き起こすようにしてよい。
別の実施形態では、対象とするポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする核酸を送達するウイルスベクターを投与する前及び／またはその投与と同時に（例えば、それぞれの投与から数分もしくは数時間以内に）、本開示のウイルスカプシドを投与して、特定の細胞部位をブロックできる。例えば、本発明のカプシドを送達して、肝細胞上の細胞受容体をブロックでき、その後またはそれと同時に、送達ベクターを投与でき、それによって、肝細胞への形質導入を減少させ、他の標的（例えば、骨格筋、心筋及び／または横隔膜筋）への形質導入を増大させ得る。
代表的な実施形態によれば、改変ウイルスカプシドは、本開示による改変ウイルスベクターの前及び／またはそのウイルスベクターと当時に、対象に投与できる。さらに、本開示は、本発明の改変ウイルスカプシドを含む組成物及び医薬製剤を提供し、任意に、その組成物は、本開示の改変ウイルスベクターも含む。
本開示は、本開示の改変ウイルスカプシド及びカプシドタンパク質をコードする核酸（任意に単離核酸）も提供する。さらに、本開示の核酸を含むベクター、本開示の核酸及び／またはベクターを含む細胞（ｉｎ ｖｉｖｏまたは培養液中）を提供する。一例として、本開示は、（ａ）本開示の改変ＡＡＶカプシド、及び（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸であって、そのＡＡＶカプシドに封入された核酸を含むウイルスベクターを提供する。
その他の好適なベクターとしては、以下に限らないが、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルスなど）、プラスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このような核酸、ベクター及び細胞は、例えば、本明細書に記載されているような改変ウイルスカプシドまたはウイルスベクターを作製するための試薬（例えば、ヘルパーパッケージングコンストラクトまたはパッケージング細胞）として使用できる。
本開示によるウイルスカプシドは、当該技術分野において知られているいずれかの方法を用いて、例えば、バキュロウイルスから発現させることによって作製できる（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４７７−４８８）。
本開示による、ＡＡＶカプシドタンパク質に対する改変は、「選択的」改変である。このアプローチは、ＡＡＶセロタイプ間での全サブユニットまたは大きなドメインのスワップによるこれまでの研究とは対照的である（例えば、国際公開第００／２８００４号及びＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８−２７７４を参照されたい）。特定の実施形態では、「選択的」改変によって、約２０個以下、１８個以下、１５個以下、１２個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下または３個以下の連続するアミノ酸の挿入及び／または置換及び／または欠失が行われる。
本開示の改変カプシドタンパク質及びカプシドは、現在知られているかまたは今後特定されるいずれかの他の改変をさらに含むことができる。
例えば、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質及びウイルスカプシドは、別のウイルス、任意に、例えば、国際公開第００／２８００４号に記載されているような別のパルボウイルスまたはＡＡＶに由来するカプシドサブユニットの全部または一部を含むことができる点で、キメラであることができる。
本開示のいくつかの実施形態では、そのウイルスカプシドは、所望の標的組織（複数可）に存在する細胞表面分子と相互作用するように、そのウイルスカプシドを誘導するターゲティング配列（例えば、そのウイルスカプシドにおいて置換または挿入された配列）を含む標的化ウイルスカプシドであることができる（例えば、国際公開第００／２８００４号及びＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８−２７７４、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：３５３−３６１（２００６）［ＡＡＶカプシドサブユニットの５２０位及び／または５８４位に、インテグリン受容体結合モチーフＲＧＤを挿入することについて記載］、及び米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットのアミノ酸４４７位、５３４位、５７３位及び５８７位の後に、ＲＧＤモチーフを含むＰＩペプチドを挿入することについて記載］を参照されたい）。ＡＡＶカプシドサブユニットにおける他の位置のうち、挿入に耐えられる位置は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４−９７５（２００１）に記載されている４４９位及び５８８位）。
例えば、本開示のウイルスカプシドは、対象とする特定の標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞及び／または肺）に対するトロピズムが比較的非効率である場合がある。有益なことに、ターゲティング配列をこれらの低形質導入ベクターに組み込むことによって、そのウイルスカプシドに、所望のトロピズム、及び任意に、特定の組織（複数可）に対する選択的トロピズムを付与することができる。ターゲティング配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、カプシド及びベクターは、例えば国際公開第００／２８００４号に記載されている。別の例としては、低形質導入ベクターを所望の標的組織（複数可）に再誘導する手段として、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５−４９（２００６）に記載されているような１つ以上の非天然アミノ酸を本開示のＡＡＶカプシドサブユニットに、直交する部位で組み込むことができる。有益なことに、これらの非天然アミノ酸を用いて、対象とする分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結することができ、その分子としては、グリカン（マンノース−樹状細胞ターゲティング）、所定の種類のがん細胞に標的化送達するためのＲＧＤ、ボンベシンまたは神経ペプチド、ファージディスプレイから選択されるＲＮＡアプタマーまたはペプチドであって、成長因子受容体、インテグリンのような所定の細胞表面受容体に標的化されるＲＮＡアプタマーまたはペプチドなどが挙げられるが、これらに限らない。
アミノ酸を化学的に改変する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１st ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、そのターゲティング配列は、特定の種類の細胞（複数可）への感染を誘導するウイルスカプシド配列（例えば、自律性パルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列またはいずれかの他のウイルスカプシド配列）であってよい。
別の非限定的な例として、典型的にはＨＳ受容体と結合しないカプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）に、ヘパリン結合ドメインまたはヘパラン硫酸結合ドメイン（例えば、呼吸器合胞体ウイルスヘパリン結合ドメイン）を挿入または置換して、その結果得られる変異体にヘパリン及び／またはヘパラン硫酸への結合性を付与してもよい。
Ｂ１９は、グロボシドをその受容体として用いて、初代赤血球前駆細胞に感染する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１１４）。Ｂ１９の構造は、８Å分解能で求められている（Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０３：１０６）。グロボシドに結合する、Ｂ１９カプシドの領域は、３９９〜４０６番目のアミノ酸の間（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４：４１９）、βバレル構造Ｅ及びＦの間のループアウト領域（Ｃｈｉｐｍａｎ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７５０２）にマッピングされている。したがって、ウイルスカプシドまたはウイルスカプシドを含むウイルスベクターを赤血球系細胞にターゲティングするために、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインを本開示のＡＡＶカプシドタンパク質に置換してよい。
いくつかの実施形態では、外来のターゲティング配列は、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターのトロピズムを改変するペプチドをコードするいずれのアミノ酸配列であってもよい。特定の実施形態では、そのターゲティングペプチドまたはターゲティングタンパク質は、天然であってもよく、あるいは、完全または部分的に合成によるものであってもよい。例示的なターゲティング配列としては、ＲＯＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド成長因子（例えば、上皮細胞成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩなど）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、神経ペプチド及びエンドルフィンなど、ならびに細胞をそれらの同種の受容体にターゲティングする能力を保持する、それらの断片など、細胞表面受容体及び糖タンパク質に結合するリガンド及びその他のペプチドが挙げられる。他の例示的なペプチド及びタンパク質としては、サブスタンスＰ、ケラチノサイト成長因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β−エンドルフィン、Ｌｅｕ−エンケファリン、リモルフィン、α−ネオエンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン（ｐｎｅｕｍａｄｉｎ）、血管作用性腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン及び上記のようなものの断片が挙げられる。さらなる代替策として、毒素（例えば、破傷風毒素、またはα−ブンガロトキシンのようなヘビ毒素など）に由来する結合ドメインをカプシドタンパク質にターゲティング配列として置換することができる。さらなる代表的な実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｃｌｅｖｅｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：Ｒ３１８（１９９７））によって説明されたような「非古典的な」インポート／エクスポートシグナルペプチド（例えば、線維芽細胞成長因子−１及び−２、インターロイキン１、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質など）をそのＡＡＶカプシドタンパク質に置換することによって改変できる。所定の細胞による取り込みを誘導するペプチドモチーフ（例えば、ＦＶＦＬＰ（配列番号８３）ペプチドモチーフは、肝細胞による取り込みを誘発する）も含まれる。
ファージディスプレイ技法及び当該技術分野において知られている他の技法を用いて、対象とするいずれかの種類の細胞を認識するペプチドを特定してよい。
そのターゲティング配列は、受容体（例えば、タンパク質、糖鎖、糖タンパク質またはプロテオグリカン）を含む細胞表面結合部位にターゲティングするいずれかのペプチドをコードしてよい。細胞表面結合部位の例としては、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸及びその他のグリコサミノグリカン、ムチン、糖タンパク質及びガングリオシドに見られるシアル酸部分、ＭＨＣ１糖タンパク質、膜糖タンパク質に見られる糖鎖成分（マンノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、ガラクトースなどを含む）が挙げられるが、これらに限らない。
特定の実施形態では、ヘパラン硫酸（ＨＳ）結合ドメインまたはヘパリン結合ドメインがウイルスカプシド（例えば、ＨＳ結合ドメインまたはヘパリン結合ドメインに置換しなければ、ＨＳまたはヘパリンに結合しないＡＡＶカプシド）に置換されている。ＨＳ／ヘパリンへの結合は、アルギニン及び／またはリシンに富む「塩基性パッチ」によって媒介されることは当該技術分野において知られている。例示的な実施形態では、ＢＸＸＢというモチーフ（配列番号８４）（「Ｂ」は、塩基性残基であり、Ｘは、中性及び／または疎水性である）に従う配列を用いることができる。非限定的な例として、ＢＸＸＢは、ＲＧＮＲ（配列番号８５）であることができる。別の非限定的な例として、ＢＸＸＢによって、天然型のＡＡＶ２カプシドタンパク質におけるアミノ酸２６２位〜２６５位、または別のＡＡＶセロタイプのカプシドタンパク質における対応する位置（複数可）が置換されている。
表７には、好適なターゲティング配列の他の非限定的な例が示されている。
Figure 2021519099
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さらなる実施形態として、そのターゲティング配列は、細胞への侵入を標的とする別の分子に化学的にカップリングするのに用いることができるペプチド（例えば、そのＲ基を介して化学的にカップリングできるアルギニン残基及び／またはリシン残基を含むことができるペプチド）であってよい。
別の実施形態として、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、ＷＯ２００６／０６６０６６に記載されているような変異を含むことができる。例えば、そのカプシドタンパク質は、天然型のＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６３位、７０５位、７０８位及び／または７１６位における選択的アミノ酸置換、または別のＡＡＶセロタイプに由来するカプシドタンパク質における対応する変更（複数可）を含むことができる。
これに加えて、またはこの代わりに、代表的な実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６４位のすぐ後ろに選択的アミノ酸挿入を含むか、または他のＡＡＶに由来するカプシドタンパク質に、対応する変更を含む。「アミノ酸Ｘ位のすぐ後ろに」とは、その挿入が、示されているアミノ酸位置の直後にあることを意図している（例えば、「アミノ酸２６４位の後ろ」とは、２６５位での点挿入、またはさらに広範囲での挿入、例えば、２６５〜２６８位での挿入などを示す）。
さらに、代表的な実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０９３７８４号に記載されているような改変（例えば、２ｉ８）及び／またはＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１４４２２９号に記載されているような改変（例えば、二重グリカン）のようなアミノ酸改変を含むことができる。
本開示のいくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターの由来元であるＡＡＶセロタイプの形質導入効率と比較して、形質導入効率が同等であるかまたは向上していることができる。本開示のいくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターの由来元であるＡＡＶセロタイプの形質導入効率と比較して、形質導入効率が低下していることができる。本開示のいくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターの由来元であるＡＡＶセロタイプのトロピズムと比較して、トロピズムが同等であるかまたは向上していることができる。本開示のいくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターの由来元であるＡＡＶセロタイプのトロピズムと比較して、トロピズムが改変されているかまたは異なることができる。本開示のいくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、脳組織に対するトロピズムを有するか、または脳組織に対するトロピズムを有するように操作されていることができる。本開示のいくつかの実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、肝臓組織に対するトロピズムを有するか、または肝臓組織に対するトロピズムを有するように操作されていることができる。
上記の実施形態を用いて、異種の核酸を、本明細書に記載されているような細胞または対象に送達できる。例えば、本開示の改変ベクターを用いて、本明細書に記載されているように、ムコ多糖症（例えば、スライ症候群［β−グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハーラー−シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ型［ヘパランスルファミダーゼ］、サンフィリポ症候群Ｂ型［Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ］、サンフィリポ症候群Ｃ型［アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、サンフィリポ症候群Ｄ型［Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ型［ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ］、モルキオ症候群Ｂ型［β−ガラクトシダーゼ］、マロトー−ラミー症候群［Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ］など）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、またはグリコーゲン貯蔵病（例えば、ポンペ病［リソソーム酸性α−グルコシダーゼ］）のようなリソソーム貯蔵障害を治療できる。
いくつかのＡＡＶカプシドタンパク質では、対応するアミノ酸位置が、ウイルスに部分的または完全に存在するか、あるいは、完全に見られないかに応じて、その対応する改変が挿入及び／または置換となることは、当業者には明らかであろう。本明細書の別の箇所で論じられているように、その対応するアミノ酸位置（複数可）は、周知の技法を用いれば、当業者には容易に明らかになるであろう。
本開示には、本開示の改変カプシドタンパク質及びカプシドを含むウイルスベクターも含まれる。特定の実施形態では、そのウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスのカプシド及び／またはベクターゲノムを含むもの）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶのカプシド及び／またはベクターゲノムを含むもの）である。代表的な実施形態では、そのウイルスベクターは、本開示の改変カプシドサブユニットを含む改変ＡＡＶカプシド、ならびにベクターゲノムを含む。
例えば、代表的な実施形態では、そのウイルスベクターは、（ａ）本開示の改変カプシドタンパク質を含む改変ウイルスカプシド（例えば、改変ＡＡＶカプシド）、及び（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含む核酸を含み、末端反復配列を含むその核酸は、その改変ウイルスカプシドに封入されている。その核酸は任意に、２つの末端反復配列（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含むことができる。
代表的な実施形態では、そのウイルスベクターは、対象とするポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を含む組み換えウイルスベクターである。組み換えウイルスベクターは、下にさらに詳細に説明されている。
特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、（ｉ）その改変カプシドタンパク質を含まないウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して、肝臓への形質導入が低下しており、（ｉｉ）動物対象におけるそのウイルスベクターによる全身性形質導入が、その改変カプシドタンパク質を含まないウイルスベクターによって観察されるレベルと比較して向上しており、（ｉｉｉ）内皮細胞を越えた移動が、その改変カプシドタンパク質を含まないウイルスベクターによる移動のレベルと比較して増大し、及び／またはその改変カプシドタンパク質を含まないウイルスベクターによる移動のレベルと比較して、（ｉｖ）筋肉組織（例えば、骨格筋、心筋及び／または横隔膜筋）への形質導入が選択的に向上し、（ｖ）肝臓組織への形質導入が選択的に向上し、及び／または（ｖｉ）脳組織（例えばニューロン）への形質導入が低下する。特定の実施形態では、そのウイルスベクターは、肝臓に対する全身性形質導入を有する。
本開示の改変カプシドタンパク質、ウイルスカプシド及びウイルスベクターには、示されているアミノ酸が、天然型の状態における所定の位置にある（すなわち、変異体ではない）カプシドタンパク質、カプシド及びウイルスベクターは含まれないことは、当業者にはわかるであろう。
ウイルスベクターの作製方法
本開示は、本発明のウイルスベクターの作製方法をさらに提供する。したがって、一実施形態では、本開示は、中和抗体を回避するＡＡＶベクターの作製方法であって、ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質上で３次元抗原フットプリントを形成する接触アミノ酸残基を特定すること、ｂ）（ａ）で特定した接触アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーを作製すること、ｃ）（ｂ）のＡＡＶカプシドタンパク質のライブラリーに由来するカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を作製すること、ｄ）感染及び複製が可能な条件で、（ｃ）のＡＡＶ粒子と細胞を接触させること、ｅ）少なくとも１回の感染サイクルを完了して、コントロールのＡＡＶ粒子と同等の力価まで複製できるＡＡＶ粒子を選択すること、ｆ）感染及び複製が可能な条件で、（ｅ）で選択したＡＡＶ粒子と、中和抗体及び細胞を接触させること、ならびにｇ）（ｆ）の中和抗体によって中和されないＡＡＶ粒子を選択することを含む方法を提供する。接触アミノ酸残基の特定方法の非限定的な例としては、ペプチドエピトープマッピング及び／または低温電子顕微鏡法が挙げられる。
３次元抗原フットプリント内の抗体接触残基の分解分析及び特定を行うことによって、その後、ランダム変異誘発、合理的変異誘発及び／または縮重変異誘発による改変を行って、さらなる選択及び／またはスクリーニングを通じて特定できる抗体回避性ＡＡＶカプシドを作製可能になる。
したがって、さらなる実施形態では、本開示は、中和抗体を回避するＡＡＶベクターの作製方法であって、ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質上で３次元抗原フットプリントを形成する接触アミノ酸残基を特定すること、ｂ）ランダム変異誘発、合理的変異誘発及び／または縮重変異誘発によって、（ａ）で特定した接触アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質を作製すること、ｃ）（ｂ）のＡＡＶカプシドタンパク質に由来するカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子を作製すること、ｄ）感染及び複製が可能な条件で、（ｃ）のＡＡＶ粒子と細胞を接触させること、ｅ）少なくとも１回の感染サイクルを完了して、コントロールのＡＡＶ粒子と同等の力価まで複製できるＡＡＶ粒子を選択すること、ｆ）感染及び複製が可能な条件で、（ｅ）で選択したＡＡＶ粒子と、中和抗体及び細胞を接触させること、ならびにｇ）（ｆ）の中和抗体によって中和されないＡＡＶ粒子を選択することを含む方法を提供する。
接触アミノ酸残基の特定方法の非限定的な例としては、ペプチドエピトープマッピング及び／または低温電子顕微鏡法が挙げられる。ランダム変異誘発、合理的変異誘発及び／または縮重変異誘発によって、接触アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質を作製する方法は、当該技術分野において知られている。
この包括的アプローチは、いずれのＡＡＶカプシドの改変にも適用できるプラットフォーム技術をもたらす。このプラットフォーム技術を適用すると、形質導入効率を損なうことなく、元のＡＡＶカプシドテンプレートに由来するＡＡＶ抗原バリアントが得られる。長所及び利点の１つとしては、この技術を適用すると、ＡＡＶベクターによる遺伝子療法に適用可能な患者コホートが拡大されることになる。
一実施形態では、本開示は、ウイルスベクターの作製方法であって、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えばＡＡＶ ＴＲ配列）を含む核酸テンプレート、ならびに（ｂ）その核酸テンプレートを複製して、ＡＡＶカプシドに封入するのに充分なＡＡＶ配列（例えば、本開示のＡＡＶカプシドをコードするＡＡＶ ｒｅｐ配列及びＡＡＶ ｃａｐ配列）を細胞に供給することを含む方法を提供する。任意に、その核酸テンプレートは、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、その核酸テンプレートは、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、それらのＩＴＲ配列は、異種核酸配列（存在する場合）の５’側及び３’側に位置するが、その異種核酸配列に直接接触している必要はない。
その核酸テンプレート、ならびにＡＡＶ ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされたその核酸テンプレートを含むウイルスベクターが細胞内で産生される条件で供給する。その方法は、その細胞からウイルスベクターを回収する工程をさらに含むことができる。そのウイルスベクターは、培地から、及び／または細胞を溶解させることによって回収できる。
その細胞は、ＡＡＶウイルスの複製に対する許容性がある細胞であることができる。当該技術分野において知られているいずれの好適な細胞も用いてよい。特定の実施形態では、その細胞は、哺乳動物細胞である。別の選択肢として、その細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠損された機能をもたらすトランス相補性パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞またはその他のＥ１ａトランス相補性細胞であることができる。
ＡＡＶの複製配列及びカプシド配列は、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって供給してよい。現行のプロトコールでは典型的には、単一のプラスミド上でＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現させる。ＡＡＶの複製配列及びパッケージング配列は、一緒に供給する必要はないが、一緒に供給するのが利便的なことがある。ＡＡＶ ｒｅｐ配列及び／またはｃａｐ配列は、いずれかのウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって供給してもよい。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって供給してよい（例えば、欠損アデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入する）。ＥＢＶベクターを用いて、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を発現させてもよい。この方法の長所の１つは、ＥＢＶベクターはエピソーマルベクターであるうえに、連続的な細胞分裂の全体を通じて、高いコピー数を維持することになる点である（すなわち、「ＥＢＶベースの核エピソーム」と称される染色体外エレメントとして、細胞に安定的に組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照されたい）。
さらなる代替策として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞に安定的に組み込んでもよい。
典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキュー及び／またはパッケージングを防ぐために、ＴＲに挟まれない。
核酸テンプレートは、当該技術分野において知られているいずれかの方法を用いて、細胞に供給できる。例えば、そのテンプレートは、非ウイルスベクター（例えばプラスミド）またはウイルスベクターによって供給できる。特定の実施形態では、その核酸テンプレートは、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターによって供給する（例えば、欠損アデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入する）。別の例示として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５には、ＡＡＶ ＴＲに挟まれたレポーター遺伝子を有するバキュロウイルスベクターが記載されている。ＥＢＶベクターを用いて、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子との関連で上記したようなテンプレートを送達してもよい。
別の代表的な実施形態では、核酸テンプレートは、複製型ｒＡＡＶウイルスによって供給する。さらに別の実施形態では、その核酸テンプレートを含むＡＡＶプロウイルスを細胞の染色体に安定的に組み込む。
ウイルス力価を向上させるために、増殖性のＡＡＶ感染を促すヘルパーウイルスの機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を細胞に供給できる。ＡＡＶの複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当該技術分野において知られている。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスベクターまたはヘルパーヘルペスウイルスベクターによって供給することになる。あるいは、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、ならびに米国特許第６，０４０，１８３号及び同第６，０９３，５７０号に記載されているように、そのアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの配列を別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶの効率的な産生を促すヘルパー遺伝子のすべてを有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとしてのベクター）によって供給できる。
さらに、ヘルパーウイルスの機能は、ヘルパー配列が染色体に組み込まれているかまたは安定な染色体外エレメントとして保持されているパッケージング細胞によってもたらしてよい。概して、そのヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオンにパッケージングできず、例えば、ＴＲに挟まれていない。
ＡＡＶの複製配列及びカプシド配列、ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を単一のヘルパーコンストラクトに供給するのが有益な場合のあることは当業者には明らかであろう。このヘルパーコンストラクトは、非ウイルスコンストラクトまたはウイルスコンストラクトであってよい。非限定的な実例の１つとして、そのヘルパーコンストラクトは、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであることができる。
特定の一実施形態では、そのＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給する。このベクターはさらに、核酸テンプレートをさらに含むことができる。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及び／またはｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠損領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入できる。
さらなる実施形態では、そのＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給する。この実施形態によれば、ｒＡＡＶテンプレートは、プラスミドテンプレートとして供給できる。
別の例示的な実施形態では、そのＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給し、ｒＡＡＶテンプレートは、細胞にプロウイルスとして組み込む。あるいは、ｒＡＡＶテンプレートは、細胞内に染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶベースの核エピソームとして）保持されるＥＢＶベクターによって供給する。
さらなる例示的な実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって供給する。ｒＡＡＶテンプレートは、別個の複製型ウイルスベクターとして供給できる。例えば、ｒＡＡＶテンプレートは、ｒＡＡＶ粒子または第２の組み換えアデノウイルス粒子によって供給できる。
上記の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的には、アデノウイルスの複製及びパッケージングに充分なアデノウイルスの５’シス配列及び３’シス配列（すなわち、アデノウイルスの末端反復配列及びＰＡＣ配列）を含む。そのＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、及び存在する場合にはｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス骨格に組み込まれ、５’シス配列及び３’シス配列に挟まれて、これらの配列をアデノウイルスカプシドにパッケージングし得るようになっている。上記のように、そのアデノウイルスヘルパー配列及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は概して、ＴＲによって挟まれておらず、これらの配列がＡＡＶビリオンにパッケージングされないようになっている。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４−１２）には、アデノウイルス遺伝子、ならびにＡＡＶのｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーが記載されている。
ＡＡＶパッケージング法では、ヘルペスウイルスもヘルパーウイルスとして用いてよい。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは有益なことに、拡張可能なＡＡＶベクター産生スキームを促進し得る。ＡＡＶ−２のｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を発現させるハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）ベクターが説明されてきている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６及びＷＯ００／１７３７７）。
さらなる代替策として、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５−４３に記載されているように、バキュロウイルスベクターを用いて、本開示のウイルスベクターを昆虫細胞で産生させて、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びｒＡＡＶテンプレートを送達することができる。
混入ヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックは、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって得てよい。例えば、ＡＡＶ及びヘルパーウイルスは、サイズに基づき、容易に区別し得る。ＡＡＶは、ヘパリン基質に対する親和性に基づき、ヘルパーウイルスから分離し得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。欠失のある複製欠損ヘルパーウイルスを用いて、いずれの混入ヘルパーウイルスも、複製コンピテントとならないようにできる。ＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するのに必要なのは、アデノウイルス初期遺伝子の発現のみであるので、さらなる代替策として、後期遺伝子の発現を欠損したアデノウイルスヘルパーを用いてよい。後期遺伝子の発現を欠損したアデノウイルス変異体は、当該技術分野において知られている（例えば、アデノウイルス変異体ｔｓ１００Ｋ及びｔｓ１４９）。
組み換えウイルスベクター
本開示のウイルスベクターは、核酸を細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで送達するのに有用である。特に、本開示のウイルスベクターは有益なことに、哺乳動物を含む動物の細胞に核酸を送達または移入するのに用いることができる。したがって、いくつかの実施形態では、核酸（「カーゴ核酸」）を本開示のカプシドタンパク質に封入してよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つとの配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である組み換えカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号３８０または３８４との配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である組み換えカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つとの配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である組み換えカプシドタンパク質を含み、そのカプシドタンパク質に封入されたカーゴ核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号３８０または３８４との配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である組み換えカプシドタンパク質を含み、そのカプシドタンパク質に封入されたカーゴ核酸をさらに含む。
本開示のウイルスベクターで送達するカーゴ核酸配列は、対象とするいずれの異種核酸配列（複数可）であってもよい。対象とする核酸としては、治療用ポリペプチド（例えば、医学的または獣医学的用途のもの）または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用のもの）を含むポリペプチドまたはＲＮＡをコードする核酸が挙げられる。
治療用ポリペプチドとしては、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニジストロフィン及びマイクロジストロフィンを含む。例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０、米国特許出願公開第２００３／０１７１３１号、国際公開第２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１ ３７１４−１３７１９（２０００）及びＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７−６４（２００８）を参照されたい）、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、ａｐｏＡ（ａｐｏＡ１、ａｐｏＡ２、ａｐｏＡ４、ａｐｏＡ−Ｖ）、ａｐｏＢ（ａｐｏＢ１００、ＡｐｏＢ４８）、ａｐｏＣ（ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＣＩＶ）、ａｐｏＤ、ａｐｏＥ、ａｐｏＨ、ａｐｏＬ、ａｐｏ（ａ）のようなアポリポタンパク質、Ｉｋａｐｐａ Ｂドミナント変異体のような抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンギオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、プログラニュリン、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α−１−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、アミロイドβ、タウ、バッテニン、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、フラタキシン、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン−２、インターロイキン−４、αシヌクレイン、パーキン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド成長因子、神経栄養因子及び神経栄養ホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様成長因子１及びインスリン様成長因子２、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３及び神経栄養因子４、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質［ＲＡＮＫＬ及びＶＥＧＦを含む］、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子α及びトランスフォーミング成長因子βなど）、ハンチンチン、リソソーム酸性α−グルコシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死成長因子可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウムハンドリングを調節する分子（例えば、ＳＥＲＣＡ2A、ＰＰ１の阻害剤１及びその断片［例えば、ＷＯ２００６／０２９３１９及びＷＯ２００７／１００４６５］）、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ２型のノックダウンを行う分子（トランケート型構成的活性型ｂＡＲＫｃｔなど）、ＩＲＡＰのような抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（一本鎖モノクローナル抗体を含む。例示的なＭａｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、神経ペプチド及びその断片（例えば、ガラニン、神経ペプチドＹ（Ｕ．Ｓ．７，０７１，１７２を参照されたい））、バゾヒビン及びその他のＶＥＧＦ阻害剤（例えば、バゾヒビン２［ＷＯ ＪＰ２００６／０７３０５２を参照されたい］）のような血管新生阻害剤が挙げられるが、これらに限らない。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素及び腫瘍壊死因子）、宿主の因子の転写を増大または阻害するタンパク質（例えば、転写エンハンサーエレメントまたは転写阻害エレメントに連結したヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９、転写エンハンサーエレメントまたは転写阻害エレメントに連結したジンクフィンガータンパク質、転写エンハンサーエレメントまたは転写阻害エレメントに連結した転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター）、がん療法で用いる薬剤に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド、ならびに治療の必要な対象において治療作用を有するいずれかの他のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターを用いて、モノクローナル抗体及び抗体断片、例えば、ミオスタチンに対する抗体または抗体断片を送達することもできる（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４−５９０（２００５）を参照されたい）。ポリペプチドをコードする異種核酸配列には、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする配列が含まれる。レポーターポリペプチドは当該技術分野において知られており、そのポリペプチドとしては、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限らない。
任意に、その異種核酸は、分泌ポリペプチド（例えば、その天然型の状態において分泌ポリペプチドであるか、または例えば、当該技術分野において知られているように、分泌シグナル配列と機能可能に会合することによって、分泌されるように操作したポリペプチド）をコードする。
あるいは、本開示の特定の実施形態では、その異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されているようなもの）、スプライセオソームの媒介によるトランススプライシングが行われるＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、米国特許第６，０８３，７０２号を参照されたい）、遺伝子サイレンシングを媒介する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照されたい）、及び「ガイド」ＲＮＡのようなその他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９、Ｙｕａｎらの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードしてもよい。例示的な非翻訳ＲＮＡとしては、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療及び／または予防するためのもの、及び／または化学療法による損傷を予防する目的で心臓に投与するためのもの）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対するもの）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療及び／または予防するもの）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を治療するためのもの。例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０： １３２−１４２（２００８）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１−５５（２００５）を参照されたい）、ホスホランバンＳ１６Ｅのような、ホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子（例えば、心血管疾患を治療するためのもの。例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４−８７１（２００２）を参照されたい）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかんに対するもの）、ならびに病原性の生物及びウイルス（例えば、Ｂ型及び／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）に対するＲＮＡｉが挙げられる。
さらに、選択的スプライシングを誘導する核酸配列を送達できる。実例として、Ｕ１またはＵ７核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと併せて、ジストロフィンエキソン５１の５’及び／または３’スプライス部位と相補的であるアンチセンス配列（またはその他の阻害配列）を送達して、このエキソンのスキッピングを誘導できる。例えば、アンチセンス／阻害配列（複数可）の５’側に位置するＵ１またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列を本開示の改変カプシド内にパッケージングして、送達できる。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集を誘導する核酸配列を送達できる。例えば、その核酸は、ガイドＲＮＡをコードしてよい。いくつかの実施形態では、そのガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、その核酸は、ヌクレアーゼをコードしてよい。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＮｇＡｇｏ（アルゴノートエンドヌクレアーゼ）、ＳＧＮ（構造誘導型エンドヌクレアーゼ）、ＲＧＮ（ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）、またはそれらの改変バリアントもしくはトランケート型バリアントである。いくつかの実施形態では、そのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２（ａ）ヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＴｒｐＢ様ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ、またはそれらの改変バリアントもしくはトランケート型バリアントである。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓから単離したものまたはそれに由来するものである。
いくつかの実施形態では、遺伝子ノックダウンを誘導する核酸配列を送達できる。例えば、その核酸配列は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンス核酸をコードしてよい。
本開示のウイルスベクターは、宿主染色体上のとある座位と相同性を有し、その座位と組み換わる異種核酸も含んでよい。このアプローチを用いて、例えば、宿主細胞における遺伝的欠損を修正することができる。
本開示は、例えばワクチン接種用の免疫原性ポリペプチドを発現させるウイルスベクターも提供する。その核酸は、対象とするいずれかの免疫原であって、当該技術分野において知られている免疫原をコードしてよく、その免疫原としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原などに由来する免疫原が挙げられるが、これらに限らない。
パルボウイルスをワクチンベクターとして使用することは、当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｌ ａｌ，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７、Ｙｏｕｎｇらの米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａらの米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，８６３，５４１号を参照されたい）。その抗原は、パルボウイルスカプシドにおいて提示されてよい。
あるいは、その抗原は、組み換えベクターゲノムに導入した異種核酸から発現させてよい。対象とするいずれかの免疫原であって、本明細書に記載されており及び／または当該技術分野において知られているような免疫原を、本開示のウイルスベクターによって供給できる。
免疫原性ポリペプチドは、感染及び／または疾患に対する免疫応答を誘発し及び／またはそれらから対象を保護するのに適するいずれのポリペプチドであることもでき、その感染及び／または疾患としては、微生物、細菌、原虫、寄生虫、真菌及び／またはウイルスへの感染及びそれらの疾患が挙げられるが、これらに限らない。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルトミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質のようなインフルエンザウイルス免疫原、またはウマインフルエンザウイルス免疫原）、あるいはレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のエンベロープＧＰ １６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶのマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物及びｅｎｖ遺伝子産物のようなＳＩＶ免疫原またはＨＩＶ免疫原）であることができる。その免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質及びラッサ熱エンベロープ糖タンパク質のようなラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬＩ遺伝子産物もしくはＬ８遺伝子産物のようなワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱ウイルス免疫原もしくは日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰ遺伝子産物及びＧＰ遺伝子産物のようなエボラウイルス免疫原もしくはマールブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶウイルス免疫原、ＣＣＨＦウイルス免疫原及び／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質のような感染性ヒトコロナウイルス免疫原、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原もしくはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫原）であることもできる。その免疫原性ポリペプチドはさらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶの免疫原）、ムンプス免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素もしくはその他のジフテリアの免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）の免疫原、及び／または当該技術分野において現在知られているかもしくは今後免疫原として特定されるいずれかの他のワクチン免疫原であることができる。
あるいは、その免疫原性ポリペプチドは、いずれかの腫瘍細胞抗原またはがん細胞抗原であることができる。任意に、その腫瘍抗原またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現するものである。
例示的ながん細胞抗原及び腫瘍細胞抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載されている。他の例示的ながん抗原及び腫瘍抗原としては、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＦＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５、Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７、Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ−１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４．９６８．６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＮＳＥ、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ−１、ＣＡ７２−４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ−ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）、ムチン抗原（国際公開第９０／０５１４２号）、テロメラーゼ、核マトリックスタンパク質、前立腺酸性ホスファターゼ、パピローマウイルス抗原、及び／またはメラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝臓癌、大腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、脳腫瘍及び現在知られているかもしくは今後特定されるいずれかの他のがんもしくは悪性の病態、またはそれらの転移といったがんと結合することが現在知られているかまたは今後発見される抗原が挙げられるが、これらに限らない（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ． ４７：４８１−９１を参照されたい）。
さらなる代替策として、その異種核酸は、細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで産生させるのが望ましいいずれかのポリペプチドをコードできる。例えば、本開示のウイルスベクターを培養細胞に導入して、発現した遺伝子産物をその細胞から単離してよい。
対象とする異種核酸（複数可）は、適切な調節配列と機能可能に結合できることを当業者は理解するであろう。例えば、その異種核酸は、転写／翻訳調節シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター及び／またはエンハンサーなどのような発現調節エレメントと機能可能に結合できる。
さらに、対象とする異種核酸（複数可）の調節発現は、（例えば、ＷＯ２００６／１１９１３７に記載されているように）例えば、所定の部位におけるスプライシング活性を選択的にブロックするオリゴヌクレオチド、小分子及び／またはその他の化合物の有無によって、異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することによって、転写後レベルで行うことができる。
所望のレベル及び組織特異的な発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントを用いることができることは当業者には明らかであろう。そのプロモーター／エンハンサーは、所望の発現のパターンに応じて、構成的または誘導性のものであることができる。そのプロモーター／エンハンサーは、天然型または外来のものであることができ、天然または合成の配列であることができる。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主において、その転写開始領域が見られないことが意図されている。
特定の実施形態では、そのプロモーター／エンハンサーエレメントは、治療する標的の細胞または対象にとって天然型のものであることができる。代表的な実施形態では、そのプロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にとって天然型のものであることができる。そのプロモーター／エンハンサーエレメントは概して、対象とする標的細胞（複数可）において機能するように選択する。さらに、特定の実施形態では、そのプロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物プロモーター／エンハンサーエレメントである。そのプロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性のものであってよい。
誘導性発現調節エレメントは典型的には、異種核酸配列（複数可）の発現に対する調節を行うのが望ましい用途において有益である。遺伝子送達に対する誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントであることができ、筋肉に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメント（心筋、骨格筋及び／または平滑筋に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントを含む）、神経組織に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメント（脳に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントを含む）、眼に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメント（網膜に特異的なプロモーター／エンハンサーエレメント及び角膜に特異的なプロモーター／エンハンサーエレメントを含む）、肝臓に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメント、骨髄に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメント、膵臓に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメント、脾臓に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメント、ならびに肺に特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントが挙げられる。その他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ホルモン誘導性エレメント及び金属誘導性エレメントが挙げられる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター及びメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限らない。
異種核酸配列（複数可）が標的細胞で転写されてから翻訳される実施形態では、概して、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、所定の開始シグナルが含まれる。これらの外来の翻訳調節配列は、開始コドンＡＴＧ及び隣接配列を含んでよく、天然及び合成の両方である様々な供給源のものであることができる。
本開示によるウイルスベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞を含む広範な細胞内に異種核酸を送達する手段を提供する。本開示のウイルスベクターを用いて、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリペプチドを作製するために、またはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法を行うために、対象とする核酸を細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで送達できる。本開示のウイルスベクターは、さらに、核酸の送達が必要な対象に核酸を送達して、例えば、免疫原性ポリペプチド、治療用ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを発現させる方法において有用である。この方式では、そのポリペプチドまたは機能性ＲＮＡは、その対象において、ｉｎ ｖｉｖｏで産生させることができる。その対象は、そのポリペプチドが欠損しているために、そのポリペプチドが必要であることができる。さらに、その方法は、そのポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを対象において産生させることによって、何らかの有益な作用をもたらし得るという理由で行うことができる。
本開示のウイルスベクターを用いて、対象とするポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを培養細胞または対象で産生させることもできる（例えば、対象をバイオリアクターとして用いて、そのポリペプチドを産生させるか、または例えばスクリーニング法との関連で、機能性ＲＮＡが対象に及ぼす作用を観察する）。
概して、治療用ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを送達するのが有益であるいずれかの病態を治療及び／または予防するために、本開示のウイルスベクターを用いて、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を送達することができる。例示的な病態としては、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）及びその他の肺疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β−グロビン）、貧血（エリスロポエチン）及びその他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ、ネプリライシン）、多発性硬化症（β−インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（リピートを除去するＲＮＡｉ）、カナバン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）及びその他の神経障害、がん（エンドスタチン、アンギオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド、インターフェロンを含むサイトカイン、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉまたは多剤耐性遺伝子産物、ｍｉｒ−２６ａ［例えば、肝細胞癌に対するもの］）、真性糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィン、ミニ−ジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンプロペプチドに対するＲＮＡｉ、ホリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド（Ｉｋａｐｐａ Ｂドミナント変異体など）、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エキソンスキッピングを誘導する、ジストロフィン遺伝子におけるスプライスジャンクションに対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照されたい］、エキソンスキッピングを誘導する、Ｕ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照されたい］、及びミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体またはその抗体断片）ならびにベッカー型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損（アデノシンデアミナーゼ）、グリコーゲン貯蔵病（例えば、ファブリー病［α−ガラクトシダーゼ］及びポンペ病［リソソーム酸性α−グルコシダーゼ］）ならびにその他の代謝障害、先天性肺気腫（α−１−アンチトリプシン）、レッシュ−ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマンピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ−サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（ならびにその他の眼疾患及び網膜疾患、例えば、黄斑変性に対するＰＤＧＦ及び／またはバゾヒビンもしくはその他のＶＥＧＦ阻害剤、または例えば、Ｉ型糖尿病における網膜障害を治療／予防するたまのその他の血管新生阻害剤）、脳疾患（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンギオスタチン及び／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、グリオブラストーマ［エンドスタチン、アンギオスタチン及び／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］を含む）、肝臓疾患、腎臓疾患、うっ血性心不全または末梢動脈障害（ＰＡＤ）を含む心臓疾患（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ−１）及びその断片（例えば、ＩＩＣ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、［３２−アドレナリン受容体、２−アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ２型のノックダウンを行う分子（トランケート型構成的活性型ｂＡＲＫｃｔなど）、カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ、ホスホランバン阻害分子、またはドミナントネガティブ分子（ホスホランバンＳ１６Ｅなど）などの送達による）のような固形臓器の疾患、関節炎（インスリン様成長因子）、関節障害（インスリン様成長因子１及び／またはインスリン様成長因子２）、内膜肥厚（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓの送達による）、心臓移植の生存率の向上（スーパオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様成長因子Ｉ）、腎不全（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（Ｉ ＲＡＰ及びＴＮＦａ可溶性受容体のような抗炎症性因子）、肝炎（ａ−インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２及びＳＣＡ３を含む脊髄小脳失調症、フェニルケトン尿（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患などが挙げられるが、これらに限らない。本開示はさらに、臓器移植後に用いて、（例えば、サイトカインの産生をブロックする免疫抑制剤または阻害核酸を投与することによって）移植の成功率を上昇させ及び／または臓器移植もしくは補助療法のマイナスの副作用を軽減することができる。別の例として、例えば、骨折またはがん患者での外科的切除の後、骨形成タンパク質（ＢＮＰ２、ＢＮＰ７など、ＲＡＮＫＬ及び／またはＶＥＧＦを含む）を骨同種移植片とともに投与できる。
いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターを用いて、肝臓疾患または肝臓障害を治療及び／または予防するためのポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を送達できる。その肝臓疾患または肝臓障害は、例えば、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝疾患、線維症、黄疸、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、バッド−キアリ症候群、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール性線維症、非アルコール性線維症、肝脂肪変性、ジルベール症候群、胆道閉鎖症、α−１−アンチトリプシン欠乏症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、血友病Ｂ、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、家族性高コレステロール血症（ホモ接合体）（ＨｏＦＨ）、家族性高コレステロール血症（ヘテロ接合体）（ＨｅＦＨ）、フォンギールケ病（ＧＳＤ Ｉ）、血友病Ａ、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、ホモシスチン尿症、フェニルケトン尿（ＰＫＵ）、チロシン血症１型、アルギナーゼ１欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素１欠損症、シトルリン血症１型、シトリン欠損症、クリグラー−ナジャール症候群１型、シスチン症、ファブリー病、グリコーゲン貯蔵病１ｂ型、ＬＰＬ欠損症、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、オルニチントランスロカーゼ欠損症、原発性高シュウ酸尿症１型またはＡＤＡ ＳＣＩＤであってよい。
本開示を用いて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を作製することもできる。例えば、本開示のウイルスベクターを用いて、成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞などのような非多能性細胞内に幹細胞関連核酸（複数可）を送達できる。
幹細胞と関連する因子をコードする核酸は、当該技術分野において知られている。幹細胞及び多能性と関連するこのような因子の非限定的な例としては、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及び／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、ＫＨＺ Ｋｌｆ４及び／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ及び／またはＮ−ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧ及び／またはＬＩＮ２８が挙げられる。
本開示を実施して、糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、ムコ多糖症（例えば、スライ症候群［β−グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハーラー−シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、サンフィリポ症候群Ｂ［Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ］、サンフィリポ症候群Ｃ［アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、サンフィリポ症候群Ｄ［Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース−硫酸スルファターゼ］、モルキオ症候群Ｂ［β−ガラクトシダーゼ］、マロトー−ラミー症候群［Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ］など）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、またはグリコーゲン貯蔵病（例えば、ポンペ病、リソソーム酸性α−グルコシダーゼ）のようなリソソーム貯蔵障害といった代謝障害を治療及び／または予防することもできる。
遺伝子移入には、病態に対する療法を理解及び提供するためのかなりの用途がある。異常遺伝子がわかっており、その遺伝子がクローニングされている遺伝性疾患は数多く存在する。概して、上記の病態は、概ね劣性遺伝する欠乏状態（通常は酵素の欠乏状態）、及び調節タンパク質または構造タンパク質に関与し得るとともに、典型的には優性遺伝する不均衡状態という２つの種類に分類される。欠乏状態の疾患では、遺伝子移入を用いて、補充療法のために、正常遺伝子を罹患組織に導入すること、及びアンチセンス変異を用いて、疾患の動物モデルを作製することができる。不均衡状態では、遺伝子移入を用いて、モデル系において病態を作り出すことができ、そして、そのモデル系は、その病態を解消する取り組みにおいて利用できる。すなわち、本開示によるウイルスベクターによって、遺伝子疾患の治療及び／または予防が可能になる。
本開示によるウイルスベクターを用いて、機能性ＲＮＡを細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで供給してもよい。その機能性ＲＮＡは、例えば、非コードＲＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、細胞で機能性ＲＮＡを発現させると、その細胞による特定の標的タンパク質の発現を減少させることができる。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の発現を減少させる必要のある対象において、そのタンパク質の発現を減少させることができる。いくつかの実施形態では、細胞で機能性ＲＮＡを発現させると、その細胞による特定の標的タンパク質の発現を増加させることができる。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の発現を増加させる必要のある対象において、そのタンパク質の発現を増加させることができる。いくつかの実施形態では、機能性ＲＮＡの発現によって、細胞内の特定の標的ＲＮＡのスプライシングを調節できる。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のＲＮＡのスプライシングを調節する必要のある対象において、そのＲＮＡのスプライシングを調節できる。いくつかの実施形態では、細胞で機能性ＲＮＡを発現させると、その細胞による特定の標的タンパク質の機能を調節できる。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の機能を調節する必要のある対象において、そのタンパク質の機能を調節できる。機能性ＲＮＡは、遺伝子発現及び／または細胞生理作用を調節して、例えば、細胞もしくは組織の培養系を最適化するために、細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで、あるいはスクリーニング方法において投与することもできる。
加えて、本開示によるウイルスベクターには、診断方法及びスクリーニング方法における用途があり、そのベクターによって、対象とする核酸を細胞培養系あるいはトランスジェニック動物モデルにおいて一過性または安定的に発現させる。
本開示のウイルスベクターは、様々な非治療的目的でも用いることができ、当業者には明らかなように、遺伝子ターゲティング、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコールでの用途が挙げられるが、これらに限らない。本開示のウイルスベクターは、安全性（分散、毒性、免疫原性など）を評価する目的でも用いることができる。このようなデータは例えば、米国食品医薬品局が薬事認可プロセスの一部として、臨床効果の評価前に検討する。
さらなる態様として、本開示のウイルスベクターを用いて、対象において免疫応答を引き起こしてもよい。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターを対象に投与でき、その免疫原性ポリペプチドに対して、能動免疫応答が対象によって発揮される。免疫原性ポリペプチドは、上記したようなものである。いくつかの実施形態では、防御免疫応答が誘導される。
あるいは、本開示のウイルスベクターを細胞にｅｘ ｖｉｖｏで投与してよく、その改変細胞を対象に投与する。異種核酸を含むウイルスベクターをその細胞に導入し、その細胞を対象に投与し、免疫原をコードする異種核酸を発現させ、その対象において、その免疫原に対する免疫応答を誘導することができる。特定の実施形態では、その細胞は、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）である。
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原と遭遇後、宿主の組織及び細胞が関与すること」によって特徴付けられる。「能動免疫には、リンパ網内系組織における免疫担当細胞の分化及び増殖を伴い、これにより、抗体の合成もしくは細胞媒介性反応の発現、またはこれらの両方に至る。」Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）。別段に述べると、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種によって免疫原に暴露された後、宿主によって発揮される。能動免疫は、受動免疫と対比でき、受動免疫は、能動免疫した宿主から、事前に形成した物質（抗体、移入因子、胸腺移植片、インターロイキン−２）を非免疫宿主に移入することを通じて獲得される。
「防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書で使用する場合、その免疫応答によって、疾患の発症を予防または低減するという点で、対象にいくつかの利点をもたらすことを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患の治療及び／または予防、特に、（例えば、がんもしくは腫瘍の形成を予防することによって、がんもしくは腫瘍を退縮させることによって、及び／または転移を予防することによって、及び／または転移性結節の成長を予防することによって）がんまたは腫瘍の治療及び／または予防において有用なことがある。その防御作用は、完全または部分的な作用であってもよい。ただし、治療の利点が、そのいずれかの問題点を上回ることを条件とする。
特定の実施形態では、その異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、下記のように、免疫原性的に有効な量で投与することができる。
本開示のウイルスベクターは、１つ以上のがん細胞抗原（もしくは免疫学的に類似の分子）、またはがん細胞に対する免疫応答を引き起こすいずれかの他の免疫原を発現させるウイルスベクターの投与によるがん免疫療法のために投与することもできる。例示として、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによって、対象において、そのがん細胞抗原に対して免疫応答を引き起こして、例えば、がん患者を治療し及び／または対象において、がんの発生を予防することができる。そのウイルスベクターは、本明細書に記載されているように、対象にｉｎ ｖｉｖｏで、またはｅｘ ｖｉｖｏの方法を用いることによって、投与してよい。
あるいは、そのがん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現させるか、または別段の形で、（例えば、上記のように）ウイルスカプシドと結合することができる。
別の代替策として、当該技術分野において知られているいずれかの他の治療用の核酸（例えばＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えばサイトカイン）を投与して、がんを治療及び／または予防できる。
本明細書で使用する場合、「がん」という用語には、腫瘍形成がんが含まれる。同様に、「がん性組織」という用語には、腫瘍が含まれる。「がん細胞抗原」には、腫瘍抗原が含まれる。
「がん」という用語は、当該技術分野において理解されている意味であり、例えば、体の遠位部位に広がる（すなわち、転移する）可能性のある組織の無制御な増殖という意味である。例示的ながんとしては、メラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝臓癌、大腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、脳腫瘍、及び現在知られているかまたは今後特定されるいずれかの他のがんまたは悪性の病態が挙げられるが、これらに限らない。代表的な実施形態では、本開示は、腫瘍形成がんの治療及び／または予防方法を提供する。
「腫瘍」という用語も、当該技術分野において、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として理解されている。腫瘍は、悪性であることも良性であることもできる。代表的な実施形態では、本発明で開示されている方法を用いて、悪性腫瘍を予防及び治療する。
「がんを治療すること」、「がんの治療」という用語、及び同等の用語は、そのがんの重症度を低下させるかもしくは少なくとも部分的に解消させるか、及び／またはその疾患の進行を遅らせ及び／または制御し、及び／またはその疾患を安定させることが意図されている。特定の実施形態では、これらの用語は、そのがんの転移を予防するか、低減するかもしくは少なくとも部分的に解消すること、及び／または転移性結節の成長を予防するか、低減するかもしくは少なくとも部分的に解消することを示す。
「がんの予防」または「がんを予防すること」、及び同等の用語は、その方法が、がんの発症及び／または発症時の重症度を少なくとも部分的に解消、低減及び／または遅延することが意図されている。別段に述べると、対象におけるがんの発症の可能性もしくは確率を低下させ、及び／または発症を遅らせることができる。
特定の実施形態では、がんの対象から細胞を取り出し、その細胞と、本開示によるがん細胞抗原を発現させるウイルスベクターとを接触させてよい。そして、その改変細胞を対象に投与し、それによって、がん細胞抗原に対する免疫応答を誘発する。この方法は有益なことに、充分な免疫応答を体内で発揮できない（すなわち、促進抗体を充分な量産生できない）免疫不全の対象に用いることができる。
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、インターロイキン−１−α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１８、Ｂ細胞成長因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、単球走化性タンパク質−１、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子及びリンホトキシン）によって増強し得ることは当該技術分野において知られている。したがって、本開示のウイルスベクターと併せて、免疫調節性サイトカイン（好ましくはＣＴＬ誘導性サイトカイン）を対象に投与してよい。サイトカインは、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって投与してよい。外因性サイトカインを対象に投与してもよく、あるいは、好適なベクターを用いて、サイトカインをコードする核酸を対象に送達して、そのサイトカインをｉｎ ｖｉｖｏで産生させてもよい。
対象、医薬製剤及び投与経路
本開示によるウイルスベクター及びカプシドは、獣医学的用途及び医学的用途の両方で使用される。好適な対象には、トリ及び哺乳動物の両方が含まれる。本明細書で使用する場合、「トリ」という用語には、ニワトリ、カモ、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコなどが含まれるが、これらに限らない。本明細書で使用する場合、「哺乳動物」という用語には、ヒト、ヒト以外の霊長類動物、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどが含まれるが、これらに限らない。ヒト対象には、新生児、乳児、若年者、成人及び高齢者の対象が含まれる。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、生後６カ月未満、２歳未満、５歳未満、１０歳未満、１０〜１８歳、１９〜２９歳、３０〜３５歳、３６〜４０歳または４０歳超であることができる。
代表的な実施形態では、対象は、本明細書に記載されている方法「が必要な」者である。
特定の実施形態では、薬学的に許容される担体中の本開示のウイルスベクター及び／またはカプシド及び／またはカプシドタンパク質及び／またはウイルス粒子、ならびに任意に、他の薬剤、医薬剤、安定剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含む医薬組成物を提供する。注射用では、その担体は典型的には、液体となる。他の投与方法では、その担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与では、その担体は、吸入可能なものとなり、任意に、固体または液体の微粒子形態であることができる。
「薬学的に許容される」とは、毒性でないかまたは別段の形で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、いずれかの望ましくない生体作用を引き起こすことなく、対象に投与し得る。
本開示の一態様は、核酸を細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで移入する方法である。本開示のウイルスベクターを細胞内に、適切な多重感染度で、特定の標的細胞に適する標準的な形質導入方法に従って導入してよい。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞の種類及び数、ならびにその特定のウイルスベクターに応じて変動し得るとともに、当業者が過度の実験なしに求めることができる。代表的な実施形態では、少なくとも約１０3感染単位、任意に少なくとも約１０5感染単位をその細胞に導入する。
本開示のウイルスベクターを導入する細胞（複数可）は、いずれの種類のものであることもでき、神経細胞（末梢神経系及び中枢神経系の細胞、特に、ニューロン及びオリゴデンドロサイトのような脳細胞を含む）、肺細胞、眼細胞（網膜細胞、網膜色素上皮細胞及び角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸上皮細胞及び呼吸上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などが挙げられるが、これらに限らない。代表的な実施形態では、その細胞は、いずれかの前駆細胞であることができる。さらなる可能性として、その細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であることができる。さらなる代替策として、その細胞は、がん細胞または腫瘍細胞であることができる。さらに、その細胞は、上に示したように、供給源がいずれの種であることもできる。
本開示のウイルスベクターは、改変細胞を対象に投与する目的で、細胞内にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入できる。特定の実施形態では、対象から細胞を取り出し、ウイルスベクターをその細胞に導入してから、その細胞を対象に投与して戻す。ｅｘ ｖｉｖｏで操作するために、対象から細胞を取り出した後、対象に導入して戻す方法は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい）。あるいは、組み換えウイルスベクターを、ドナー対象に由来する細胞、培養細胞または、いずれかの他の好適な供給源に由来する細胞に導入でき、その細胞を、必要な対象（すなわち「レシピエント」対象）に投与する。
ｅｘ ｖｉｖｏでの核酸送達に適する細胞は、上記のようなものである。対象に投与する細胞の投与量は、対象の年齢、状態及び種、細胞の種類、その細胞によって発現させる核酸、投与経路などによって変動することになる。典型的には、１回当たり、少なくとも約１０2〜約１０8個の細胞または少なくとも約１０3〜約１０6個の細胞を薬学的に許容される担体中で投与することになる。特定の実施形態では、ウイルスベクターを形質導入した細胞を対象に、治療有効量で、製剤用担体と組み合わせて投与する。
いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターを細胞に導入し、その細胞を対象に投与して、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子として発現させたかまたはカプシド内のポリペプチド）に対する免疫原性反応を誘導することができる。典型的には、免疫原性的に有効な量のポリペプチドを発現する量の細胞を、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与する。「免疫原性的に有効な量」は、医薬製剤が投与される対象において、そのポリペプチドに対する能動免疫応答を誘発するのに充分である発現ポリペプチドの量である。特定の実施形態では、投与量は、防御免疫応答（上で定義したような応答）を引き起こすのに充分な量である。その免疫原性ポリペプチドを投与する利点が、そのいずれかの問題点を上回る限りは、付与される防御の程度は、完全または恒久的なものである必要はない。
したがって、本開示は、核酸を細胞に投与する方法であって、その細胞と、本開示のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／または組成物とを接触させること含む方法を提供する。
本開示のさらなる態様は、本開示のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／またはウイルスカプシドを対象に投与する方法である。したがって、本開示は、核酸を対象に送達する方法であって、その対象に、本開示のウイルス粒子、ウイルスベクター及び／または組成物を投与することを含む方法も提供する。本開示によるウイルスベクター、ウイルス粒子及び／またはカプシドを投与する必要のあるヒト対象または動物へのそれらの投与は、当該技術分野において知られているいずれかの手段による投与であることができる。任意に、本開示のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／またはカプシドは、治療上有効な用量で、薬学的に許容される担体中で送達する。好ましい実施形態では、治療有効量のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／またはカプシドを送達する。
さらに、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドを投与して、（例えばワクチンとして）免疫原性反応を誘導できる。典型的には、本開示の免疫原性組成物は、免疫原性的に有効な量のウイルスベクター及び／またはカプシドを、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。任意に、その投与量は、防御免疫応答（上で定義したような応答）を引き起こすのに充分な量である。その免疫原性ポリペプチドを投与する利点が、そのいずれかの問題点を上回る限りは、付与される防御の程度は、完全または恒久的なものである必要はない。対象及び免疫原は、上記のようなものである。
対象に投与するウイルスベクター及び／またはカプシドの投与量は、投与経路、治療及び／または予防する疾患または状態、個々の対象の状態、その特定のウイルスベクターまたはカプシド、ならびに送達する核酸などによって左右され、常法で決定できる。治療作用をもたらすための例示的な用量は、少なくとも約１０5形質導入単位、約１０6形質導入単位、約１０7形質導入単位、約１０8形質導入単位、約１０9形質導入単位、約１０10形質導入単位、約１０11形質導入単位、約１０12形質導入単位、約１０13形質導入単位、約１０14形質導入単位、約１０15形質導入単位、任意に約１０8〜１０13形質導入単位の力価である。
特定の実施形態では、様々な時間的間隔、例えば、１日、１週間、１カ月、１年などにわたって、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回またはこれを上回る回数の投与）を用いて、所望のレベルの遺伝子発現をもたらしてよい。
例示的な投与経路としては、経口経路、直腸経路、経粘膜経路、鼻腔内経路、吸入（例えば、エアゾールによる）経路、口腔内（例えば舌下）経路、膣経路、髄腔内経路、眼内経路、経皮経路、子宮内（または卵内）経路、非経口経路（例えば、静脈内経路、皮下経路、皮内経路、筋肉内経路［骨格筋、横隔膜筋及び／または心筋への投与を含む］、皮内経路、胸膜内経路、脳内経路及び関節内経路）、局所経路（例えば、気道表面を含む皮膚表面及び粘膜表面の両方への経路、ならびに経皮投与）、リンパ内経路など、そして、直接組織または器官に注射する経路（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への注射経路）が挙げられる。投与は、腫瘍に対するもの（例えば、腫瘍またはリンパ節の中または近辺への投与）であることもできる。いずれの所定の場合においても、最も好適な経路は、治療及び／または予防する状態の性質及び重症度、ならびに用いられている特定のベクターの性質に左右されることになる。
本開示による骨格筋への投与としては、四肢（例えば、上腕、前腕、上脚部及び／または下脚部）、背部、頸部、頭部（例えば舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰及び／または指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限らない。好適な骨格筋としては、小指外転筋（手）、小指外転筋（足）、母指外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、顎二腹筋、背側骨間筋（手）、背側骨間筋（足）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短趾伸筋、長趾伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手）、短小趾屈筋（足）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、おとがい舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手）、虫様筋（足）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋、ヒラメ筋、頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋及び小頬骨筋、ならびに当該技術分野において知られているようないずれかの他の好適な骨格筋が挙げられるが、これらに限らない。
本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、骨格筋に静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意に、脚及び／または腕への温熱四肢灌流。例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５： ３４５８−３４６４を参照されたい）、及び／または直接筋肉内注射によって送達できる。特定の実施形態では、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドを対象（例えば、ＤＭＤのような筋ジストロフィーである対象）の肢（腕及び／または脚）に、四肢灌流、任意に温熱四肢灌流によって（例えば、静脈内または関節内投与によって）投与する。本開示の実施形態では、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは有益なことに、「ハイドロダイナミック」法を用いずに投与できる。先行技術のベクターの組織送達（例えば筋肉への送達）は、ハイドロダイナミック法（例えば、大量の静脈内／静脈内投与）によって増大させることが多く、この技法は、血管系内の圧力を上昇させ、ベクターが内皮細胞バリアを通過する能力を促進するものである。特定の実施形態では、ハイドロダイナミック法を用いずに、例えば、大量注入及び／または血管内圧の上昇なしに（例えば、正常収縮期圧よりも高い圧力なしに、例えば、正常収縮期圧に対する血管内圧の上昇率が５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下）、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドを投与できる。このような方法は、浮腫、神経損傷及び／またはコンパートメント症候群など、ハイドロダイナミック法と関連する副作用を軽減または回避し得る。心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室及び／または中隔への投与が挙げられる。本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、静脈内投与、大動脈内投与のような動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への直接注射）及び／または冠状動脈灌流によって、心筋に送達できる。
横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与及び／または腹膜内投与を含むいずれかの好適な方法によるものであることができる。
標的組織への送達は、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドを含むデポ剤を送達することによって行うこともできる。代表的な実施形態では、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドを含むデポ剤を骨格筋、心筋及び／または横隔膜筋の組織に埋め込むか、あるいはその組織と、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドを含むフィルムまたはその他のマトリックスを接触させることができる。このような埋め込み型のマトリックスまたは物質は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載されている。
特定の実施形態では、本開示によるウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドは、（例えば、筋ジストロフィー、心疾患［例えば、ＰＡＤまたはうっ血性心不全］を治療及び／または予防する目的で）骨格筋、横隔膜筋及び／または心筋に投与する。
代表的な実施形態では、本開示を用いて、骨格筋、心筋及び／または横隔膜筋の障害を治療及び／または予防する。
代表的な実施形態では、筋ジストロフィーの治療及び／または予防が必要な対象の筋ジストロフィーの治療及び／または予防方法であって、本開示のウイルスベクターを治療または予防に有効な量、哺乳動物の対象に投与することを含み、そのウイルスベクターが、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド（Ｉｋａｐｐａ Ｂドミナント変異体など）、サルコスパン、ユートロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン−ａ２、α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、ＩＧＦ−１、ミオスタチンもしくはミオスタチンプロペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、及び／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉをコードする異種核酸を含む方法を提供する。特定の実施形態では、そのウイルスベクターは、本明細書の別の箇所に記載されているように、骨格筋、横隔膜及び／または心筋に投与できる。
あるいは、本開示を実施して、核酸を骨格筋、心筋または横隔膜筋に送達でき、その筋肉は、通常は血中を循環するポリペプチド（例えば酵素）もしくは機能性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）を産生させるか、または他の組織に全身送達するためのプラットフォームとして用いて、障害（例えば、糖尿病［例えば、インスリン］、血友病［例えば、第ＩＸ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子］、ムコ多糖障害［例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー−シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー−ラミー症候群など］、ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］もしくはファブリー病［α−ガラクトシダーゼＡ］などのリソソーム貯蔵障害、またはポンペ病［リソソーム酸性αグルコシダーゼ］などのグリコーゲン貯蔵病のような代謝障害）を治療及び／または予防する。代謝障害を治療及び／または予防するための他の好適なタンパク質は、本明細書に記載されている。対象とする核酸を発現させるためのプラットフォームとして、筋肉を使用することは、米国特許出願公開第２００２／０１９２１８９号に記載されている。
したがって、一態様として、本開示は、代謝障害の治療及び／または予防が必要な対象の代謝障害の治療及び／または予防方法であって、本開示のウイルスベクターを治療または予防に有効な量、対象の骨格筋に投与することを含み、そのウイルスベクターが、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、その代謝障害が、そのポリペプチドの欠乏及び／または欠損によるものである方法をさらに含む。例示的な代謝障害、及びポリペプチドをコードする異種核酸は、本明細書に記載されている。任意に、そのポリペプチドは、分泌される（例えば、その天然型の状態において分泌ポリペプチドであるか、または例えば、当該技術分野において知られているような分泌シグナル配列と機能可能に結合することによって、分泌されるように操作されたポリペプチドである）。本開示のいずれの特定の理論にも限定されずに、この実施形態によれば、骨格筋への投与により、ポリペプチドを体循環に分泌させ、標的組織（複数可）に送達させることができる。ウイルスベクターを骨格筋に送達する方法は、本明細書にさらに詳細に記載されている。
本開示を実施して、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはその他の機能性ＲＮＡ（例えばリボザイム）のような非コードＲＮＡを全身送達のために産生させることもできる。
本開示は、先天性心不全またはＰＡＤの治療及び／または予防の必要な対象の先天性心不全またはＰＡＤの治療及び／または予防方法であって、本開示のウイルスベクターを治療または予防に有効な量、哺乳動物の対象に投与することを含み、そのウイルスベクターが、例えば、筋小胞体Ｃａ2+−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤１（Ｉ−１）及びその断片（例えばＩ１Ｃ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ、ホスホランバン阻害分子またはホスホランバンＳ１６Ｅのようなドミナントネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、β−２−アドレナリン受容体、β−２−アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルシン、β−アドレナリン受容体キナーゼ阻害剤（ＰＡＲＫｃｔ）、タンパク質ホスファターゼ１の阻害剤１及びその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ２型のノックダウンを行う分子（トランケート型構成的活性型ｂＡＲＫｃｔなど）、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−Ｉα、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣ−ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、サイモシン−ｐ４、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６、ｍｉｒ−２０８及び／またはｍｉｒ−２６ａをコードする異種核酸を含む方法も提供する。
液体の溶液もしくは懸濁液、注射前に液体に溶解または懸濁させるのに適する固体形態、または乳剤のいずれかとして、注射剤を従来の形態で調製できる。あるいは、本開示のウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドを全身形式ではなく局所で、例えば、デポ製剤または徐放性製剤で投与し得る。さらに、本開示のウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドは、（例えば、米国特許出願公開第２００４−００１３６４５−Ａ１号に記載されているように）外科的に埋め込むマトリックスに結合した状態で送達できる。
本明細書に開示されているウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドは、対象の肺に、いずれかの好適な手段によって、任意に、そのウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドから構成される吸入可能な粒子のエアゾール懸濁剤を投与することによって投与でき、その懸濁剤を対象が吸入する。その吸入可能な粒子は、液体であることも固体であることもできる。本開示のウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアゾールは、当業者に知られているように、圧力によるエアゾールネブライザーまたは超音波ネブライザーなどのいずれかの好適な手段によって作製し得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドを含む固体粒子のエアゾールも同様に、いずれかの固体粒子医薬エアゾール発生装置を用いて、医薬分野において知られている技法によって作製し得る。
本開示のウイルスベクター及びウイルスカプシドは、ＣＮＳの組織（例えば、脳、眼）に投与でき、有益なことに、そのウイルスベクターまたはカプシドを、本開示の非存在下で観察される分布よりも広く分布させ得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載されている送達ベクターを投与して、遺伝子障害、神経変性障害、精神障害及び腫瘍を含むＣＮＳ疾患を治療してよい。例示的なＣＮＳ疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄またな頭部の損傷による外傷、テイサックス病、レッシュ−ナイハン病、てんかん、脳梗塞、気分障害を含む精神障害（例えば、抑うつ症状、双極性気分障害、持続性気分障害、二次性気分障害）、統合失調症、薬物依存症（例えば、アルコール依存症及びその他の物質依存）、神経症（例えば、不安、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、分娩後抑うつ症状）、精神病（例えば、幻覚及び妄想）、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食または体重障害（例えば、肥満症、悪液質、神経性無食欲症及び過食症）、ならびにＣＮＳのがん及び腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限らない。
ＣＮＳの障害としては、網膜、後索及び視神経の関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜障害及びその他の網膜変性疾患、ぶどう膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が挙げられる。
すべてではないが、大半の眼科疾患及び眼科障害は、（１）血管新生、（２）炎症及び（３）変性という３つの種類の適応のうちの１つ以上と関連する。本開示の送達ベクターを用いて、抗血管新生因子、抗炎症性因子、細胞変性を遅らせるか、細胞温存を促すか、または細胞の成長を促す因子、及び上記を組み合わせたものを送達できる。
糖尿病性網膜障害は例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜障害は、１つ以上の抗血管新生因子を眼内（例えば硝子体内）または眼周囲（例えばテノン領域下）のいずれかに送達することによって治療できる。１つ以上の神経栄養因子を眼内（例えば硝子体内）または眼周囲のいずれかに同時送達してもよい。
ぶどう膜炎は、炎症を伴う。本開示の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体または前眼房）に投与することによって、１つ以上の抗炎症性因子を投与することができる。
これに対して、網膜色素変性症は、網膜変性によって特徴付けられる。代表的な実施形態では、網膜色素変性症は、１つ以上の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体）投与によって治療できる。
加齢性黄斑変性は、血管新生及び網膜変性の両方を伴う。この障害は、１つ以上の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）に投与し、及び／または１つ以上の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内もしくは眼周囲（例えば、テノン領域下）に投与することによって治療できる。
緑内障は、眼圧の上昇及び網膜神経節細胞の消失によって特徴付けられる。緑内障の治療には、本発明の送達ベクターを用いて、興奮毒性による損傷から細胞を保護する１つ以上の神経保護剤を投与することが含まれる。このような薬剤としては、眼内、任意に硝子体内に送達されるＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン及び神経栄養因子が挙げられる。
別の実施形態では、本開示を用いて、発作を治療して、例えば、発作の発症、発生または重症度を低減してよい。発作に対する治療的処置の有効性は、行動的手段（例えば、振戦、眼もしくは口のチック）及び／または脳波的手段（大半の発作には、固有の脳波異常がある）によって評価できる。したがって、本開示を用いて、経時的な重積発作を特徴とするてんかんを治療することもできる。
代表的な一実施形態では、本開示の送達ベクターを用いて、ソマトスタチン（またはその活性断片）を脳に投与して、下垂体腫瘍を治療する。この実施形態によれば、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする送達ベクターは、下垂体への微量注入によって投与する。同様に、このような治療を用いて、先端巨大症（下垂体からの成長ホルモンの異常分泌）を治療できる。ソマトスタチンの核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００３０６）及びアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１１６６、プロセッシングされた活性ペプチドであるソマトスタチン−２８及びソマトスタチン−１４を含む）は、当該技術分野において知られている。
特定の実施形態では、本開示のベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載されているような分泌シグナルを含むことができる。
本開示の代表的な実施形態では、本開示のウイルスベクター及び／またはウイルスカプシドをＣＮＳ（例えば、脳または眼）に投与する。本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉及び前頭葉を含む大脳、皮質、大脳基底核、海馬、ならびに扁桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、そして下丘に導入してよい。本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、網膜、角膜及び／または視神経など、眼の異なる領域にも投与してよい。
本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、その送達ベクターをさらに分散させて投与するために、脳脊髄液に（例えば腰椎穿刺によって）送達してよい。本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドはさらに、血液脳関門が脆弱化している状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）では、ＣＮＳに血管内投与してよい。
本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、ＣＮＳの所望の領域（複数可）に、当該技術分野において知られているいずれかの経路によって投与でき、その経路としては、髄腔内送達、眼内送達、脳内送達、脳室内送達、静脈内送達（例えば、マンニトールのような糖の存在下）、鼻腔内送達、耳内送達、眼内送達（例えば、硝子体内送達、網膜下送達、前眼房送達）及び眼周囲（例えば、テノン領域下）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行送達を伴う筋肉内送達が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、液体製剤で、ＣＮＳにおける所望の領域または区画への直接注射（例えば、定位注射）によって投与する。別の実施形態では、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、局所塗布によって所望の領域に、またはエアゾール製剤の鼻腔内投与によって供給してもよい。眼への投与は、液滴の局所点眼によってもよい。さらなる代替策として、本開示のウイルスベクター及び／またはカプシドは、固体の徐放性製剤として投与してもよい（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。
さらなる追加の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、運動ニューロンに関わる疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療及び／または予防するための逆行輸送用に用いることができる。例えば、本開示のウイルスベクターは、そのベクターをニューロンに移動させる起点となり得る筋肉組織に送達できる。
番号の付された実施形態
下記の番号の付された実施形態は、本開示の範囲に含まれる。
１．組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、そのカプシドタンパク質が、そのＡＡＶカプシドタンパク質の抗原部位に置換を含み、その置換が、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つの配列を有する組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２．その置換が、配列番号９、１０、１４または１７のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態１に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
３．そのＡＡＶカプシドタンパク質が、第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換含み、その第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換がそれぞれ、そのＡＡＶカプシドタンパク質の異なる抗原部位を改変し、その第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換がそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つを含む、実施形態１または２に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
４．そのＡＡＶカプシドタンパク質が、第１の酸置換、第２のアミノ酸置換及び第３のアミノ酸置換を含み、その第１のアミノ酸置換、第２のアミノ酸置換及び第３のアミノ酸置換がそれぞれ、そのＡＡＶカプシドタンパク質の異なる抗原部位を改変し、その第１のアミノ酸置換、第２のアミノ酸置換及び第３のアミノ酸置換がそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つを含む、実施形態１または２に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
５．その第１のアミノ酸置換が、配列番号９を含み、第２のアミノ酸置換が、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つを含み、第３のアミノ酸置換が、配列番号１７を含む、実施形態４に記載の組み換えＡＡＶカプシド。
その第１のアミノ酸置換が、配列番号９を含み、第２のアミノ酸置換が、配列番号１０を含み、第３のアミノ酸置換が、配列番号１７を含む、実施形態５に記載の組み換えＡＡＶカプシド。
７．その第１のアミノ酸置換が、配列番号９を含み、第２のアミノ酸置換が、配列番号１４を含み、第３のアミノ酸置換が、配列番号１７を含む、実施形態５に記載の組み換えＡＡＶカプシド。
８．そのカプシドのＨＩループを改変する置換をさらに含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
９．Ｐ６６１Ｒ、Ｔ６６２Ｓ、Ｑ６６６Ｇ、Ｓ６６７Ｄであって、そのナンバリングが、野生型ＡＡＶ８カプシド（配列番号６）に対応する置換、または
Ｐ６５９Ｒ、Ｔ６６０Ｓ、Ａ６６１Ｔ、Ｋ６６４Ｇであって、そのナンバリングが、野生型ＡＡＶ９カプシド（配列番号７）に対応する置換
という、ＨＩループにおける置換のうちの１つ以上を含む、実施形態８に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１０．ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ及びトリＡＡＶから選択したＡＡＶセロタイプのものである、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１１．キメラＡＡＶカプシドタンパク質である、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１２．２つ以上のＡＡＶセロタイプに由来する配列を含む、実施形態１１に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１３．３つ以上のＡＡＶセロタイプに由来する配列を含む、実施形態１２に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１４．配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つとの配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１５．配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１４に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１６．配列番号３８０または配列番号３８４のアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１７．その１つ以上の抗原部位の改変により、その１つ以上の抗原部位への抗体の結合が阻害される、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１８．その１つ以上の抗原部位の改変により、前記ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子の感染性の中和が阻害される、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
１９．配列番号４９のアミノ酸配列を含む組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２０．配列番号４９の４５４〜４６０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号９と置き換えることによって改変されている、実施形態１９に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２１．配列番号４９の４９３〜５００番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つと置き換えることによって改変されている、実施形態１９または２０のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２２．配列番号４９の５８５〜５９０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１７と置き換えることによって改変されている、実施形態１９〜２１のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２３．配列番号４９の４５４〜４６０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号９と置き換え、配列番号４９の４９３〜５００番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つと置き換え、配列番号４９の５８５〜５９０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１７と置き換えることによって改変されている、実施形態１９〜２２のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２４．その改変により、そのＡＡＶカプシドタンパク質への抗体の結合が阻害される、実施形態１９〜２３のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２５．その改変により、そのＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子の感染性の中和が阻害される、実施形態１９〜２４のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２６．配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２７．配列番号３８０または配列番号３８４のアミノ酸配列を含む組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
２８．実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
２９．ＤＮＡ配列である、実施形態２８に記載のヌクレオチド配列。
３０．ＲＮＡ配列である、実施形態２８に記載のヌクレオチド配列。
３１．実施形態２８〜３０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
３２．実施形態２８〜３０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列または実施形態３１に記載の発現ベクターを含む細胞。
３３．実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の組み換えカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクター。
３４．そのカプシドタンパク質に封入されたカーゴ核酸をさらに含む、実施形態３３に記載のＡＡＶウイルスベクター。
３５．そのカーゴ核酸が、治療用のタンパク質またはＲＮＡをコードする、実施形態３４に記載のＡＡＶウイルスベクター。
３６．そのカーゴ核酸が、遺伝子編集分子をコードする、実施形態３４〜３５のいずれか１つに記載のＡＡＶウイルスベクター。
３７．その遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、実施形態３６に記載のＡＡＶウイルスベクター。
３８．その遺伝子編集分子が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態３７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
３９．その遺伝子編集分子が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、実施形態３７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
４０．その遺伝子編集分子が、シングルガイドＲＮＡである、実施形態３６に記載のＡＡＶウイルスベクター。
４１．実施形態３３〜４０のいずれか１つに記載のＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物。
４２．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態４１に記載の医薬組成物。
４３．実施形態３２に記載の細胞または実施形態３１に記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
４４．薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態４３に記載の医薬組成物。
４５．治療の必要な患者の治療方法であって、その患者に、実施形態３３〜４０のいずれか１つに記載のＡＡＶウイルスベクターまたは実施形態４１〜４４のいずれか１つに記載の医薬組成物を治療有効量投与することを含む方法。
４６．その患者が、肝臓疾患または肝臓障害である、実施形態４５に記載の方法。
４７．その肝臓疾患または肝臓障害が、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝疾患、線維症、黄疸、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、バッド−キアリ症候群、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール性線維症、非アルコール性線維症、肝脂肪変性、ジルベール症候群、胆道閉鎖症、α１−アンチトリプシン欠乏症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、血友病Ｂ、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、家族性高コレステロール血症（ホモ接合体）（ＨｏＦＨ）、家族性高コレステロール血症（ヘテロ接合体）（ＨｅＦＨ）、フォンギールケ病（ＧＳＤ Ｉ）、血友病Ａ、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、ホモシスチン尿症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、チロシン血症Ｉ型、アルギナーゼＩ欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素１欠損症、シトルリン血症１型、シトリン欠損症、クリグラー−ナジャール症候群１型、シスチン症、ファブリー病、グリコーゲン貯蔵病Ｉｂ、ＬＰＬ欠損症、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、オルニチントランスロカーゼ欠損症、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型またはＡＤＡ ＳＣＩＤである、実施形態４６に記載の方法。
４８．その肝臓疾患または肝臓障害が、肝臓癌または肝転移である、実施形態４６に記載の方法。
４９．その患者が、哺乳動物である、実施形態４５〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．その患者が、ヒトである、実施形態４９に記載の方法。
５１．核酸分子の細胞への導入方法であって、その細胞と、実施形態３３〜４０のいずれか１つに記載のＡＡＶウイルスベクターを接触させることを含む方法。
５２．医薬として使用するための、実施形態３３〜４０のいずれか１つに記載のＡＡＶウイルスベクター。
５３．治療方法で使用するための、実施形態３３〜４０のいずれか１つに記載のＡＡＶウイルスベクター。
下記の実施例は、例示目的で含まれているに過ぎず、限定するようには意図されていない。
実施例１．抗体を回避するＡＡＶベクターのコンビナトリアルな操作及び選択
抗体を回避するＡＡＶ変異体の作製方法は、以下のとおりである。第１の工程は、例えば低温電子顕微鏡法を用いて、そのＡＡＶカプシド表面上の立体構造的な３Ｄ抗原エピトープを特定することを含む。続いて、縮重プライマーを用いて、抗原モチーフ内の、選択された残基に対して、変異誘発を行い、各コドンをヌクレオチドＮＮＫによって置換し、遺伝子断片をギブソンアセンブリー及び／または多段階ＰＣＲによって連結する。変異した抗原モチーフの縮重ライブラリーを含むカプシドコード遺伝子を野生型ＡＡＶゲノムにクローニングして、ＤＮＡ配列をコードする元のＣａｐを置き換え、プラスミドライブラリーを作製する。そして、プラスミドライブラリーを２９３プロデューサー細胞株に、アデノウイルスヘルパープラスミドとともにトランスフェクションして、ＡＡＶライブラリー（すなわち、上記の変異ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶのライブラリー）を作製し、続いて、そのライブラリーで選択を行うことができる。ＡＡＶライブラリーの作製がうまくいったか、ＤＮＡシーケンシングで確認する。
中和抗体（ＮＡｂ）を回避できる新たなＡＡＶ株について選択を行うために、ヒト以外の霊長類動物において、ＡＡＶライブラリーに複数ラウンド感染させる。各段階に、対象とする組織を動物対象から単離する。対象とする組織から採取した細胞溶解物をシーケンシングして、抗体による中和を回避するＡＡＶ分離株を特定する。ヒト以外の霊長類動物において感染を複数ラウンド行った後、各変異誘発領域に由来する単離配列をすべての順列及び組み合わせで組み合わせる。それぞれの感染ラウンド、組織の単離及びシーケンシングは、本明細書では、進化ラウンドと称する。
非限定的な具体例として、ＡＡＶカプシドタンパク質上の共通の抗原モチーフに対して、上記のように変異誘発を行った。続いて、ヒト以外の霊長類動物において、その変異カプシドを含む組み換えＡＡＶの縮重ライブラリーへの第１のラウンドの感染を行った（図１Ａ、図２Ａ）。感染から７日後に、肝臓を採取し、シーケンシングして、単一の組み換えＡＡＶ分離株を特定した（図１Ｂ、図２Ｂ）。
続いて、第１ラウンドの進化の際に単離したＡＡＶ（図２Ｂ）を第２のヒト以外の霊長類動物に再導入した。感染から７日後に、肝臓を採取し、シーケンシングして、単一の組み換えＡＡＶ分離株を特定した（図２Ｃ）。
続いて、第２ラウンドの進化の際に単離したＡＡＶ（図２Ｃ）を第３のヒト以外の霊長類動物に再導入した。感染から７日後に、肝臓を採取し、シーケンシングして、単一の組み換えＡＡＶ分離株を特定した（図２Ｄ）。
各進化ラウンド後に、肝臓試料において、様々な組み換えＡＡＶ分離株が特定された。様々な分離株の明細は、表８及び上記の表６．１に示されている。
Figure 2021519099
実施例２．組み換えＡＡＶベクターを培養細胞に形質導入する。
実施例１において肝臓から単離した様々なＡＡＶベクターが概ね、感染性を有し、培養細胞に形質導入できるかを確認するために、ＧＦＰ導入遺伝子をパッケージングした様々なＡＡＶベクターを調製した（ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＳＢ１（配列番号３８０）、ＡＡＶ−ＳＢ６（配列番号４３７））。これらのＡＡＶベクターと、標準的な培養条件下で維持したＵ８７細胞（初代グリオブラストーマ細胞株）を接触させた。それらの細胞は、多重感染度（ＭＯＩ）４０，０００ｖｇ／細胞で感染させた。４８時間後、蛍光顕微鏡を用いて、それらの細胞を画像化した。
図８に示されているように、試験を行ったすべてのＡＡＶベクターは、無事にＵ８７培養細胞に形質導入でき、その結果、そのベクターにパッケージングされた導入遺伝子（ＧＦＰ）が、それらの細胞内で発現された。このデータにより、これらの組み換えＡＡＶベクターが、感染性を有し、それらのベクターを用いて、対象とする細胞に導入遺伝子を送達できることが確認される。
実施例３．肝臓を標的とする組み換えＡＡＶのｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴付け
ｉｎ ｖｉｖｏでの進化後、上記の実施例１で特定された置換のうちの１つ以上を含む５つの組み換えカプシドタンパク質、すなわち、ＳＢ１（配列番号３８０）、ＳＢ２（配列番号３８４）、ＳＢ３（配列番号７８３）、ＳＢ４（配列番号７８４）、ＳＢ５（配列番号７８５）をｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴付けのために選択した。上記の組み換えカプシドタンパク質を含むとともに、ルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングした組み換えＡＡＶベクターを調製した。これらのＡＡＶベクター（ＡＡＶ−ＳＢ１、ＡＡＶ−ＳＢ２、ＡＡＶ−ＳＢ３、ＡＡＶ−ＳＢ４及びＡＡＶ−ＳＢ５）は、親ＡＡＶ８株に由来するものであった。
その５つの組み換えＡＡＶベクターと、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｕｈ７細胞を培養下、多重感染度（ＭＯＩ）１０，０００ｖｇ／細胞で接触させた。その後、それらの細胞を溶解させ、その溶解物と、生物発光基質を接触させ、ＲＦＵを測定した。図３に示されているように、５つのすべてのＡＡＶで、ヒト肝細胞に対するトロピズムがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、親ＡＡＶ８株と比較して向上し、ＡＡＶ−ＳＢ１では、ルシフェラーゼ発現量の対数増加値が最大で２であった。
親ＡＡＶ８に対して、抗体の中和回避性が向上するのを調べるために、Ｕ８７ヒトグリオブラストーマ細胞に形質導入する前に、上記の５つのＡＡＶ−ルシフェラーゼコンストラクトを０．２５ｍｇ／ｍＬのヒト静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の存在下または非存在下でインキュベートした。図４に示されているのは、形質導入率（％）（ルシフェラーゼ発現量によって測定）を、ＩＶＩＧの非存在下でインキュベーションした場合と比較したものである。ＡＡＶ−ＳＢ１、ＡＡＶ−ＳＢ２及びＡＡＶ−ＳＢ５では、ＩＶＩＧの存在下において、親ＡＡＶ８と比較して、形質導入効率が特に大きく向上した。さらに、様々な用量のＩＶＩＧによる分析によって、ＡＡＶ−ＳＢ１を中和するには、親ＡＡＶ８よりも高濃度のＩＶＩＧが必要であることが示された（図５）。
勘案すると、これらのデータにより、親ＡＡＶ８セロタイプと比較して、組み換えＡＡＶのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける肝細胞へのトロピズムが有意に向上し、抗体回避性が向上することが確認される。
実施例４．ＡＡＶ中和抗体のヒト血清スクリーニング
ドナー血清の１００個の試料に対する中和アッセイにおいて、親ＡＡＶ８、ＡＡＶ−ＳＢ１、ＡＡＶ−ＳＢ２、ならびに肝臓を標的とする他の３つのカプシド（ＡＡＶ５、ＨＳＣ１５及びＬＫ０３）を試験した。１：５の希釈率の血清の存在下での各ＡＡＶのＵ８７細胞への形質導入効率と、血清の非存在下での形質導入効率を比較した（ルシフェラーゼ発現レベルによって測定）。ＡＡＶベクターのルシフェラーゼ発現量が、血清の非存在下でのルシフェラーゼレベルの５０％未満まで低下した血清試料では、中和されたものとみなした。
図６Ａには、示されているＡＡＶが中和された試料の割合（％）が示されている（強力な中和：形質導入率２０％未満、中度の中和：形質導入率２０〜５０％）。中和された試料が最も少なかったのはＡＡＶ−ＳＢ１であり（１５％）、それに対して、親ＡＡＶ８カプシドでは、２５％の試料が中和された。他のカプシドの中では、中和された試料の数が最も多かったのはＬＫ０３であり（４０％）、最も少なかったのはＡＡＶ５であった（２０％）。留意すべきことに、ＡＡＶ−ＳＢ０１に対してセロポジティブであった試料はいずれも、１つを除き、他のカプシドのすべてに対してセロポジティブであった。その１つの例外は、形質導入効率が４９．５８％であった（５０％のカットオフ値をわずかに下回った）。
示されているカプシドに対してセロポジティブであるドナーの年齢群ごとの内訳が、下の図６Ｂに示されている。セロポジティブなドナーの数が最も多い３０〜３５歳群、及び数が最も少ない３６〜４０歳群では、類似の年齢群間分布パターンが見られる。
実施例５．組み換えＡＡＶの正常なマウスにおける生体内分布
この試験は、ヒト以外の霊長類動物（ＮＨＰ）における肝臓に対するカプシドトロピズムの進化が、マウスにおける肝臓に対するトロピズムに影響を及ぼすのかを評価する目的で行った。このことは、利用可能なマウスモデルにおいて、概念実証試験を実施するために重要である。正常なＢＩ／６マウスにおいて、小規模な試験を行った。試験デザインは、下記の表９に示されている。マウスに、２つの用量のうちの１つをＩＶ注射し、注射から３０日後に、ＧＦＰ発現に関する免疫組織化学（ＩＨＣ）解析、及びｑＰＣＲによるベクターゲノム（ｖｇ）の定量のために、組織を採取した。
Figure 2021519099
マウスの肝臓に対するＡＡＶ−ＳＢ１−ＧＦＰのトロピズムは、親ＡＡＶ８ベクターのトロピズムと同様であることが確認された。ＩＨＣ染色（図７）により、ＡＡＶ８及びＡＡＶ−ＳＢ１では、ＧＦＰ発現レベルが同程度であったが、雌雄間では異なるようであることが示された。下記の表１０には、組織ごとに、全ＤＮＡ １μｇ当たりのｖｇコピー数が示されている。列ごとに、異なるマウスが示されている。
Figure 2021519099
 *腓腹筋
BLOD - 検出限界未満
上記は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。本発明は、下記の請求項によって定義され、請求項の均等物も本発明に含まれる。

Claims (53)

  1. 組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、前記カプシドタンパク質が、前記ＡＡＶカプシドタンパク質の抗原部位に置換を含み、前記置換が、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つの配列を有する前記組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  2. 前記置換が、配列番号９、１０、１４または１７のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項１に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  3. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、第１のアミノ酸置換及び第２のアミノ酸置換含み、前記第１のアミノ酸置換及び前記第２のアミノ酸置換がそれぞれ、前記ＡＡＶカプシドタンパク質の異なる抗原部位を改変し、前記第１のアミノ酸置換及び前記第２のアミノ酸置換がそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つを含む、請求項１または２に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  4. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、第１の酸置換、第２のアミノ酸置換及び第３のアミノ酸置換を含み、前記第１のアミノ酸置換、前記第２のアミノ酸置換及び前記第３のアミノ酸置換がそれぞれ、前記ＡＡＶカプシドタンパク質の異なる抗原部位を改変し、前記第１のアミノ酸置換、前記第２のアミノ酸置換及び前記第３のアミノ酸置換がそれぞれ、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つを含む、請求項１または２に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  5. 前記第１のアミノ酸置換が、配列番号９を含み、前記第２のアミノ酸置換が、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つを含み、前記第３のアミノ酸置換が、配列番号１７を含む、請求項４に記載の組み換えＡＡＶカプシド。
  6. 前記第１のアミノ酸置換が、配列番号９を含み、前記第２のアミノ酸置換が、配列番号１０を含み、前記第３のアミノ酸置換が、配列番号１７を含む、請求項５に記載の組み換えＡＡＶカプシド。
  7. 前記第１のアミノ酸置換が、配列番号９を含み、前記第２のアミノ酸置換が、配列番号１４を含み、前記第３のアミノ酸置換が、配列番号１７を含む、請求項５に記載の組み換えＡＡＶカプシド。
  8. 前記カプシドのＨＩループを改変する置換をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  9. Ｐ６６１Ｒ、Ｔ６６２Ｓ、Ｑ６６６Ｇ、Ｓ６６７Ｄであって、そのナンバリングが、野生型ＡＡＶ８カプシド（配列番号６）に対応する置換、または
    Ｐ６５９Ｒ、Ｔ６６０Ｓ、Ａ６６１Ｔ、Ｋ６６４Ｇであって、そのナンバリングが、野生型ＡＡＶ９カプシド（配列番号７）に対応する置換
    という、ＨＩループにおける置換のうちの１つ以上を含む、請求項８に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  10. ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ及びトリＡＡＶから選択したＡＡＶセロタイプのものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  11. キメラＡＡＶカプシドタンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  12. ２つ以上のＡＡＶセロタイプに由来する配列を含む、請求項１１に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  13. ３つ以上のＡＡＶセロタイプに由来する配列を含む、請求項１２に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  14. 配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つとの配列同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  15. 配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  16. 配列番号３８０または配列番号３８４のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  17. 前記１つ以上の抗原部位の改変により、前記１つ以上の抗原部位への抗体の結合が阻害される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  18. 前記１つ以上の抗原部位の改変により、前記ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子の感染性の中和が阻害される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  19. 配列番号４９のアミノ酸配列を含む組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  20. 配列番号４９の４５４〜４６０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号９と置き換えることによって改変されている、請求項１９に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  21. 配列番号４９の４９３〜５００番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つと置き換えることによって改変されている、請求項１９または２０のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  22. 配列番号４９の５８５〜５９０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１７と置き換えることによって改変されている、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  23. 配列番号４９の４５４〜４６０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号９と置き換え、配列番号４９の４９３〜５００番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２９７、２９８、２９９または４１１〜４２１のうちのいずれか１つと置き換え、配列番号４９の５８５〜５９０番目のアミノ酸に及ぶ領域を配列番号１７と置き換えることによって改変されている、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  24. 前記改変により、前記ＡＡＶカプシドタンパク質への抗体の結合が阻害される、実施形態１９〜２３のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  25. 前記改変により、前記ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子の感染性の中和が阻害される、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  26. 配列番号１８〜８０、３００〜４１０、４２２〜６１２または７８３〜７８５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  27. 配列番号３８０または配列番号３８４のアミノ酸配列を含む組み換えＡＡＶカプシドタンパク質。
  28. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組み換えＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
  29. ＤＮＡ配列である、請求項２８に記載のヌクレオチド配列。
  30. ＲＮＡ配列である、請求項２８に記載のヌクレオチド配列。
  31. 請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
  32. 請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列または請求項３１に記載の発現ベクターを含む細胞。
  33. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組み換えカプシドタンパク質を含むＡＡＶウイルスベクター。
  34. 前記カプシドタンパク質に封入されたカーゴ核酸をさらに含む、請求項３３に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  35. 前記カーゴ核酸が、治療用のタンパク質またはＲＮＡをコードする、請求項３４に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  36. 前記カーゴ核酸が、遺伝子編集分子をコードする、請求項３４〜３５のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  37. 前記遺伝子編集分子が、ヌクレアーゼである、請求項３６に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  38. 前記遺伝子編集分子が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  39. 前記遺伝子編集分子が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項３７に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  40. 前記遺伝子編集分子が、シングルガイドＲＮＡである、請求項３６に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  41. 請求項３３〜４０のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物。
  42. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項４１に記載の医薬組成物。
  43. 請求項３２に記載の細胞または請求項３１に記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
  44. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 治療の必要な患者の治療方法であって、前記患者に、実施形態３３〜４０のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルスベクターまたは請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の医薬組成物を治療有効量投与することを含む前記方法。
  46. 前記患者が、肝臓疾患または肝臓障害である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記肝臓疾患または肝臓障害が、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝疾患、線維症、黄疸、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、バッド−キアリ症候群、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール性線維症、非アルコール性線維症、肝脂肪変性、ジルベール症候群、胆道閉鎖症、α１−アンチトリプシン欠乏症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、血友病Ｂ、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、家族性高コレステロール血症（ホモ接合体）（ＨｏＦＨ）、家族性高コレステロール血症（ヘテロ接合体）（ＨｅＦＨ）、フォンギールケ病（ＧＳＤ Ｉ）、血友病Ａ、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、ホモシスチン尿症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、チロシン血症Ｉ型、アルギナーゼＩ欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素１欠損症、シトルリン血症１型、シトリン欠損症、クリグラー−ナジャール症候群１型、シスチン症、ファブリー病、グリコーゲン貯蔵病Ｉｂ、ＬＰＬ欠損症、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、オルニチントランスロカーゼ欠損症、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型またはＡＤＡ ＳＣＩＤである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記肝臓疾患または肝臓障害が、肝臓癌または肝転移である、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記患者が、哺乳動物である、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記患者が、ヒトである、請求項４９に記載の方法。
  51. 核酸分子の細胞への導入方法であって、前記細胞と、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルスベクターを接触させることを含む前記方法。
  52. 医薬として使用するための、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  53. 治療方法で使用するための、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載のＡＡＶウイルスベクター。
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