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JP2021506264A - Ｌｅｍｄ１を標的とするがんワクチンおよびその使用 - Google Patents

Ｌｅｍｄ１を標的とするがんワクチンおよびその使用 Download PDF

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Abstract

変異コンセンサスＬＥＭＤ１抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に開示される。変異コンセンサスＬＥＭＤ１抗原をコードする１つ以上の核酸配列を含むベクター、組成物、およびワクチンを開示する。ＬＥＭＤ１発現腫瘍を有する対象の治療方法およびＬＥＭＤ１発現腫瘍の予防方法を開示する。変異コンセンサスＬＥＭＤ１抗原を開示する。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５９８，３２９号および２０１７年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／５９８，６１２号に対する優先権およびその利益を主張し、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年１２月１２日に作成された該ＡＳＣＩＩのコピーは、１０４４０９＿０００４４９＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２５，０４０バイトである。
本発明は、ＬＥＭＤ１抗原およびそれをコードする核酸分子に関する。本発明は、そのようなＬＥＭＤ１免疫原および／または核酸分子を含むワクチンにも関する。本発明はさらに、免疫応答を誘導し、ＬＥＭＤ１を発現するがん細胞もしくは腫瘍を予防し、かつ／またはそれを有する対象を治療するためのワクチンの使用方法に関する。
がんは、米国において、および世界的に依然として主な死亡原因である。がんワクチン市場は急速に成長している。有効な腫瘍ワクチンは、腫瘍の成長を阻止するために有用であり得、かつ／または進行がんの患者の標準治療のより有効で毒性が低い代替品として有用であり得る。がんと関連する抗原、したがって抗腫瘍ワクチンの標的はＬＥＭＤ１である。
ＬＥＭＤ１は、内核膜（ＩＮＭ）に局在する２０ｋＤのタンパク質である。これは核の機械的機能およびヘテロクロマチン構造化に関与する核ラミナと関連がある。ＬＥＭＤ１はそのＬＡＰ２−エメリン−ＭＡＮ１（ＬＥＭ）ドメインを特徴とし、初めは、ＤＮＡ結合タンパク質である、自己統合因子に対する障壁（Ｂａｒｒｉｅｒ−ｔｏ−Ａｕｔｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）（ＢＡＦ）への結合を付与するおよそ４０個のアミノ酸の保存された球状モジュールであると記述された。
ＢＡＦ−ＤＮＡ核タンパク質複合体は、ラミンと関連する核の再組立てに重要な役割を果たし、有糸分裂の終了時にクロマチンの脱凝縮を増強する。ＬＥＭＤ１の発現の増加は、急速に成長するがん細胞の有糸分裂に関与し得る。Ｙｕｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＥＭ Ｄｏｍａｉｎ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １，ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｒｅｐｏｒｔｓ １２，２７５−２８０（２００４）。
６つのＬＥＭＤ１アイソフォームがＬＥＭＤ１Ａ〜ＬＥＭＤ１Ｆとして同定されている。
がんの治療および予防のためのワクチンが関心のものである。しかしながら、腫瘍細胞抗原を標的とする既存のワクチンは、インビボでの不十分な抗原発現によって制限される。したがって、がんを予防および／または治療する、ならびにがんに罹患している対象における死亡率を低減するための安全かつ有効なワクチンおよびその使用方法の必要性が当該技術分野において残存する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１をコードする核酸配列、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、（ｊ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｋ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、ならびに（ｌ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が本明細書に開示される。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００、（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８、（ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９、（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である断片、（ｈ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である断片、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である断片、（ｊ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号１のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１、３、または５に記載の核酸配列を含む。
本明細書に記載される核酸分子も提供され、この核酸分子はプラスミドまたはベクターに組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、プロモーターおよびポリ−アデニル化シグナルから選択される調節要素に動作可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である。また他の実施形態では、ポリ−アデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）であり得る。またさらなる実施形態では、核酸分子は、ウイルスベクターに組み込まれ得る。
本明細書に記載される１つ以上の核酸分子を含む組成物も開示される。いくつかの態様では、これらの組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８、（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４、（ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列、（ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｊ）配列番号２のアミノ酸配列１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４のアミノ酸配列１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列１９〜１９８ならびに２０６および２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質およびペプチドも本明細書に提供される。
抗原を含むワクチンも本明細書に提供され、この抗原は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８、（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４、（ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列、（ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｊ）配列番号２のアミノ酸配列１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４のアミノ酸配列１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列１９〜１９８ならびに２０６および２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンの抗原は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００、（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８、（ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９、（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である断片、（ｈ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である断片、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である断片、（ｊ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号１のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子によってコードされる。
核酸分子を含むさらなるワクチンが提供され、この核酸分子は、配列番号１、３、または５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む。
核酸分子を含むワクチンも本明細書に開示され、この核酸分子は、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、発現ベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤またはアジュバントをさらに含む。
ペプチドを含むワクチンも開示され、このペプチドは、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
治療有効量の本明細書に記載のワクチンを投与することを含む、ＬＥＭＤ１発現がん性細胞を有する対象の治療方法も本明細書に提供される。
対象へのＬＥＭＤ１発現がん性細胞のワクチン接種方法は、液性免疫応答を誘導するのに有効な量の本明細書に記載されるワクチンを投与することを含む。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ（配列番号１）のアミノ酸１９〜１９８と天然ヒトＬＥＭＤ１Ａ（配列番号１１）との配列アライメントである。 天然と合成コンセンサスのＬＥＭＤ１Ａとの間の配列同一性および相違を示す。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａの略図である。 ｐＧＸ１４３１を生成するために用いられたクローニング戦略を図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ（配列番号４）のアミノ酸１９〜８４と天然ヒトＬＥＭＤ１Ｆ（配列番号１２）との配列アライメントである。 天然と合成コンセンサスのＬＥＭＤ１Ｆとの間の配列同一性および相違を示す。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆの略図である。 ｐＧＸ１４３２を生成するために用いられたクローニング戦略を図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦの略図である。 ｐＧＸ１４３３を生成するために用いられたクローニング戦略を図示する。 横紋筋肉腫細胞において、それぞれ構築物ｐＧＸ１４３１、ｐＧＸ１４３２、およびｐＧＸ１４３３から生成された合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、ＬＥＭＤ１Ｆ、およびＬＥＭＤ１ＡＦの発現を決定するためのウエスタンブロットを示す。 細胞免疫応答を特徴付けするために使用されたフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦの免疫原性をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦの免疫原性をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦの免疫原性をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａおよび合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の相対頻度を比較する。 ＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントにおいて合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、ＬＥＭＤ１Ｆ、およびＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたサイトカインプロファイルを図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａおよび合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆにより誘導されたＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の相対頻度を比較する。 ｐＧＸ１４３１、ｐＧＸ１４３２、およびｐＧＸ１４３３によりＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋において誘導されたサイトカインプロファイルを図示する。 ＬＥＭＤ１Ａ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３１）、ＬＥＭＤ１Ｆ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３２）、およびＬＥＭＤ１ＡＦ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３３）により誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 ＬＥＭＤ１Ａ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３１）、ＬＥＭＤ１Ｆ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３２）、およびＬＥＭＤ１ＡＦ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３３）により誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 ＬＥＭＤ１Ａ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３１）、ＬＥＭＤ１Ｆ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３２）、およびＬＥＭＤ１ＡＦ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３３）により誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａおよび合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆにより誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度を比較する。 ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントにおける合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、ＬＥＭＤ１Ｆ、およびＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたサイトカインプロファイルを図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａおよび合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆにより誘導されたＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の相対頻度を比較する。 ＬＥＭＤ１Ａ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３１）、ＬＥＭＤ１Ｆ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３２）、およびＬＥＭＤ１ＡＦ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３３）によりＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋において誘導されたサイトカインプロファイルを図示する。
本発明は、ＬＥＭＤ１抗原を含むワクチンに関する。ＬＥＭＤ１は、多くの腫瘍において発現される。したがって、ワクチンは、ＬＥＭＤ１を発現するがんまたはがんに基づく腫瘍のための治療を提供する。本発明のワクチンは、治療を必要とする対象のがんの特定の予防または治療のための特定のがん抗原の任意の組み合わせを提供することができる。
組換えがん抗原の核酸およびそのコードされたアミノ酸配列を設計するための１つの様式は、天然がん抗原の全体的なアミノ酸配列において特定のアミノ酸を変更する変異を導入することによるものである。変異の導入によってがん抗原はそれほど変更されないため、哺乳類対象、好ましくはヒトまたはイヌ対象にわたって広く適用することはできないが、得られるアミノ酸配列が寛容を破壊するか、または免疫応答を生成するために外来抗原とみなされるには十分にそれを変更する。別の様式は、その対応する天然がん抗原に対して少なくとも８５％および最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％および最大９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％および最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％および最大９８％の配列同一性を有するコンセンサス組換えがん抗原を創出することであり得る。場合によっては、組換えがん抗原は、その対応する天然がん抗原に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性である。天然がん抗原は、特定のがんまたはがん腫瘍と通常関連する抗原である。がん抗原によって、がん抗原のコンセンサス配列は、哺乳類種にわたって、もしくは種のサブタイプ内、またはウイルス株もしくは血清型にわたってもよい。いくつかのがん抗原は、野生型アミノ酸配列のがん抗原と大きく異ならない。いくつかのがん抗原は、種にわたって非常に異なるため、コンセンサス配列を生成することができない核酸／アミノ酸配列を有する。これらの場合では、その対応する天然がん抗原に対して少なくとも８５％および最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％および最大９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％および最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％および最大９８％の配列同一性を有する、寛容を破壊し、免疫応答を生成する組換えがん抗原が生成される。場合によっては、組換えがん抗原は、その対応する天然がん抗原に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性である。前述のアプローチは、最終組換えがん抗原が上で考察された天然がん抗原のアミノ酸配列に対して類似性パーセントを有するように組み合わされ得る。
ＬＥＭＤ１抗原は、異なる種または種内の異なるアイソフォームからのＬＥＭＤ１の配列に由来するコンセンサスＬＥＭＤ１抗原であり得、したがって、コンセンサスＬＥＭＤ１抗原は非天然である。組換えＬＥＭＤ１は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価抗体応答を誘導し、それにより抗原を発現するがんまたは腫瘍に指向されるか、またはそれに対して反応性である免疫応答を誘導または誘発することができる。いくつかの実施形態では、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、細胞性、液性、または細胞性および液性両方の免疫応答であり得る。いくつかの実施形態では、誘導されたまたは誘発された細胞性免疫応答には、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の誘導または分泌が含まれ得る。他の実施形態では、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を上方制御する因子、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生された可溶性因子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ−１、ならびに免疫チェックポイント分子を低減または阻害することができる。
ワクチンは、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わされて、細胞性および液性両方の免疫応答の刺激を増加させることができる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１抗体を使用することによって、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを阻止する。全般的に、免疫系によって認識されるがん抗原を設計することにより、腫瘍細胞による他の形態の免疫抑制を克服するのを助け、これらのワクチンは、Ｔ細胞および／またはＢ細胞応答をさらに増加させるために、抑制または阻害療法（抗ＰＤ−１および抗−ＰＤＬ−１抗体療法など）と組み合わせて使用することができる。
定義
特に別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が優先する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載のものと類似のまたは同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができる。本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、一例にすぎず、制限することを意図しない。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、制限することを意図しない。
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、およびそれらの異形は、追加の作用または構造の可能性を除外しない変更可能移行句、用語、または語句であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないと明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。本開示は、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
本明細書の数値範囲の列挙に関して、列挙される範囲の最小値および最大値と同程度の精度を有する各介在値は明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲に関して、６および９に加えて７および８という数字が企図され、６．０〜７．０の範囲に関して、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数字が明示的に企図される。
本明細書で使用される「アジュバント」は、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドおよびコード核酸配列によりコードされる抗原の免疫原性を増強するために、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される任意の分子を意味する。
本明細書で使用される「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、ならびにそれらの誘導体を含む。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を呈する、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはその任意の混合物であり得る。
「抗原」は、配列番号２を含む変異されたＬＥＭＤ１アミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８などの本明細書に記載の長さのその断片を有するタンパク質、バリアント、すなわち、本明細書に記載される配列番号２に対して同一性を有する配列を伴うタンパク質および本明細書に記載の長さを有するバリアントの断片、ならびにそれらの組み合わせを指す。「抗原」は、配列番号４を含む変異されたＬＥＭＤ１アミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４などの本明細書に記載の長さのその断片を有するタンパク質、バリアント、すなわち、本明細書に記載される配列番号４に対して同一性を有する配列を伴うタンパク質および本明細書に記載の長さを有するバリアントの断片、ならびにそれらの組み合わせも指す。「抗原」は、配列番号６を含む変異されたＬＥＭＤ１アミノ酸配列および配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１などの本明細書に記載の長さのその断片を有するタンパク質、バリアント、すなわち、本明細書に記載される配列番号６に対して同一性を有する配列を伴うタンパク質および本明細書に記載の長さを有するバリアントの断片、配列番号６、ならびにそれらの組み合わせも指す。抗原は、他のタンパク質からのものなどのシグナルペプチドを任意選択で含み得る。
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される対象または哺乳動物の細胞において発現を指向することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素に動作可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。
本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、核酸がヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間のワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味し得ることを意味する。
本明細書で使用される、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、異なる生物からの同じ遺伝子に対する複数の配列のアライメントの分析に基づいたポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。コンセンサス配列を含むタンパク質および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンを使用して、抗原に対して広範な免疫を誘導することができる。
本明細書で使用される、「定電流」は、同じ組織に送達される電気パルスの持続期間にわたって、組織または該組織を定義する細胞が受信または経験する電流を記載する。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。本明細書に提供される電気穿孔装置はフィードバック要素を有する、好ましくは即時フィードバックを有するため、この電流は、電気パルスの寿命にわたって該組織において一定のアンペア数に保たれる。フィードバック要素は、パルスの持続期間全体を通して組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置にその電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ため、同じ組織内の電流が電気パルス全体を通して（数マイクロ秒ほど）およびパルス間で一定に保たれる。いくつかの実施形態では、フィードバック要素はコントローラを備える。
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」は、交換可能に使用されてもよく、電極間の組織の電流を測定し、一定のレベルに電流を維持するためにＥＰ装置によって送達されるエネルギー出力を適宜変更することを含む、提供される電気穿孔装置の能動応答を意味し得る。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気治療の開始前にユーザによって予め調整される。フィードバックは、中の電気回路が電極間の組織の電流を継続的に監視し、その監視される電流（または組織内の電流）を予め調整した電流と比較し、継続的にエネルギー出力調整を行って、監視される電流を予め調整したレベルに維持することができるため、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えばコントローラによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、即時的であり得る。
本明細書で使用される「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、このパターンは、電気穿孔される組織の任意のエリアの電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、好ましくは排除する。
本明細書で交換可能に使用される「電気穿孔」、「電気透過処理」、または「電気運動増強」（「ＥＰ」）は、生体膜において微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水などの生体分子が細胞膜の片側から反対側に通過することが可能になる。
核酸配列に関して本明細書で使用される「断片」は、本明細書に開示の抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部分を意味する。断片は、以下に記載のタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。断片は、付加される異種シグナルペプチドを除く、以下に記載の核酸配列のうちの１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。断片は、以下に記載の核酸配列のうちの１つ以上の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得、加えて任意選択で、同一性パーセントを計算するときに含まれない異種シグナルペプチドをコードする配列を含む。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。
いくつかの実施形態では、断片は、以下に記載の核酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも２０ヌクレオチド以上、少なくとも３０ヌクレオチド以上、少なくとも４０ヌクレオチド以上、少なくとも５０ヌクレオチド以上、少なくとも６０ヌクレオチド以上、少なくとも７０ヌクレオチド以上、少なくとも８０ヌクレオチド以上、少なくとも９０ヌクレオチド以上、少なくとも１００ヌクレオチド以上、少なくとも１５０ヌクレオチド以上、少なくとも２００ヌクレオチド以上、少なくとも２５０ヌクレオチド以上、少なくとも３００ヌクレオチド以上、少なくとも３５０ヌクレオチド以上、少なくとも４００ヌクレオチド以上、少なくとも４５０ヌクレオチド以上、少なくとも５００ヌクレオチド以上、少なくとも５５０ヌクレオチド以上、少なくとも６００ヌクレオチド以上、少なくとも６５０ヌクレオチド以上、少なくとも７００ヌクレオチド以上、少なくとも７５０ヌクレオチド以上を含み得る。
ポリペプチド配列に関して「断片」または「免疫原性断片」は、本明細書に開示の抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。断片は、以下の様々なアミノ酸配列のうちの少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。コンセンサスタンパク質の断片は、付加される任意の異種シグナルペプチドを除く、コンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。断片は、以下に記載のアミノ配列のうちの１つ以上の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得、加えて任意選択で、同一性パーセントを計算するときに含まれない異種シグナルペプチドを含む。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、コンセンサスタンパク質の断片は、本明細書に開示のタンパク質配列の少なくとも２０個以上のアミノ酸、少なくとも３０個以上のアミノ酸、少なくとも４０個以上のアミノ酸、少なくとも５０個以上のアミノ酸、少なくとも６０個以上のアミノ酸、少なくとも７０個以上のアミノ酸、少なくとも８０個以上のアミノ酸、少なくとも９０個以上のアミノ酸、少なくとも１００個以上のアミノ酸、少なくとも１１０個以上のアミノ酸、少なくとも１２０個以上のアミノ酸、少なくとも１３０個以上のアミノ酸、少なくとも１４０個以上のアミノ酸、少なくとも１５０個以上のアミノ酸、少なくとも１６０個以上のアミノ酸、少なくとも１７０個以上のアミノ酸、少なくとも１８０個以上のアミノ酸、少なくとも１９０個以上のアミノ酸、少なくとも２００個以上のアミノ酸、少なくとも２１０個以上のアミノ酸、少なくとも２２０個以上のアミノ酸、少なくとも２３０個以上のアミノ酸、少なくとも２４０個以上のアミノ酸、少なくとも２５０個以上のアミノ酸、少なくとも２６０個以上のアミノ酸を含み得る。
本明細書で使用される「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される対象の細胞において発現を指向することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素に動作可能に連結された開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用される、「発現可能な形態」という用語は、対象の細胞に存在するとき、コード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に動作可能に連結された必須調節要素を含有する遺伝子構築物を指す。
本明細書で使用される「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。完全な相補性配列が標的核酸へハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する部分的な相補性配列は、「実質的に相同」という機能的用語を使用して表される。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用される、「実質的に相同」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズすることができるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用される、「実質的に相同」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸テンプレート配列にハイブリダイズすることができる（すなわち、その補体である）プローブを指す。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される、「同一」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである特定の割合の残基を有することを意味する。割合は、２つの配列を最適にアライメントし、特定の領域にわたって２つの配列を比較し、同一の残基が両配列で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより計算することができる。２つの配列が異なる長さのものであるか、またはアライメントにより１つ以上の付着端が生じ、特定の比較領域が単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等とみなされ得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータシーケンスアルゴリズムを使用することによって行うことができる。
本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバック機構を考察する場合に使用され得、オームの法則に従う電流値に変換され、したがって予め調整された電流と比較することができる。
本明細書で使用される「免疫応答」は、抗原の導入に応答して、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系が活性化することを意味する。免疫応答は、細胞性もしくは液性応答の形態、またはその両方であり得る。
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述も相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸は記述される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントが所与の核酸と同じ目的のために使用され得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖両方の配列の一部分を含有し得る。核酸がデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る場合、核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得る。核酸は、化学合成法または組換え法により得ることができる。
本明細書で使用される「動作可能に連結される」は、遺伝子の発現が空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子において、そのプロモーターと、それが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野において既知であるように、この距離の変化は、プロモーターの機能を喪失することなく調整され得る。
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し得、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組み合わせであり得る。
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、細胞における核酸の発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写調節配列を含み得る。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などの外部刺激に応答して、構成的または差次的に遺伝子成分の発現を調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端で連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を指向する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質が産生される細胞からその分泌を容易することが好ましい。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、しばしば成熟タンパク質と称される、タンパク質の残りの部分から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端（すなわち、Ｎ末端）で連結される。
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複雑な混合物などにおいて、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨで特異的配列の熱的融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）であり得る（標的配列は過剰で存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％は平衡で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブについては（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、そして長いプローブについては（例えば、約５０ヌクレオチド超）少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の添加によっても達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、正のシグナルは背景ハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は次を含む：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、６５℃で０．２ｘＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳで洗浄。
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫化されることを望む、またはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットであり得る。
本明細書で使用される「実質的に相補的」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
本明細書で使用される「実質的に同一」は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または核酸に関して、第１の配列が第２の配列の補体と実質的に相補的であることを意味する。
本明細書で使用される「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、阻止する、または完全に排除することにより疾患から動物を保護することを意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の抑制は、疾患の誘導後であるが、その臨床的出現の前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の阻止は、疾患の臨床的出現後に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその一部分の補体、（ｉｉｉ）参照核酸またはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味する。
ペプチドまたはポリペプチドに関して本明細書で使用される「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドを意味する。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似する特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、当該技術分野において典型的にわずかな変化を伴うと認識されている。これらのわずかな変化は、当該技術分野において理解されるように、一部、アミノ酸の疎水性親水性指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって同定され得る。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷を考慮することに基づく。類似する疎水性親水性指数のアミノ酸が置換され、尚もタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野において既知である。一態様では、±２の疎水性親水性指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈において、アミノ酸の親水性を考慮することにより、抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な手段である、そのペプチドの最大局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ ｌｏｃａｌ ａｖｅｒａｇｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）の計算が可能となる。米国特許第４，５５４，１０１号、参照により本明細書に完全に組み込まれる。類似する親水性値を有するアミノ酸を置換することにより、当該技術分野において理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性親水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の特性により明らかにされるように、アミノ酸の相対類似性および特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
バリアントは、完全な遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種核酸配列を含有するか、それを含み得る。
ワクチン
本明細書に記載されるＬＥＭＤ１抗原またはＬＥＭＤ１抗原をコードする核酸を含むワクチンが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、本明細書に記載されるＬＥＭＤ１抗原をコードする１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、アミノ酸をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸分子は抗原をコードする。いくつかの実施形態では、核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００、（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８、（ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９、（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である断片、（ｈ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である断片、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である断片、（ｊ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号１のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、核酸分子は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８、（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４、（ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列、（ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｊ）配列番号２のアミノ酸配列１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４のアミノ酸配列１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列１９〜１９８ならびに２０６および２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質およびペプチドをコードする。
本開示のいくつかの態様では、ワクチンは抗原を含み、この抗原は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８、（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４、（ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列、（ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｊ）配列番号２のアミノ酸配列１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４のアミノ酸配列１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列１９〜１９８ならびに２０６および２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本開示のいくつかの態様では、ワクチンは核酸分子を含み、この核酸分子は、配列番号１、３、または５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、ワクチンは核酸分子を含み、この核酸分子は、それぞれ、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５．６％、９５．５％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
本発明のいくつかの実施形態では、ワクチンに存在する核酸分子は、発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは薬学的に許容される賦形剤をさらに含み、いくつかの実施形態では、ワクチンは、実施形態のいくつかの態様では、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳであり得るアジュバントをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ワクチンはペプチドを含み、このペプチドは、それぞれ、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５．６％、９５．５％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ワクチンはペプチドを含み、このペプチドは、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列を含む。
ワクチンは、対象において、抗原に対して免疫応答を生成することが可能であり得る。免疫応答は、治療的または予防的免疫応答であり得る。
ワクチンを使用して、がん、例えば、ＬＥＭＤ１を発現するがんまたは腫瘍を防ぐことができる。ワクチンは、ＬＥＭＤ１を発現する腫瘍を予防および／または治療するために、それを必要とする対象において使用することができる。ワクチンは、ＬＥＭＤ１に対しておよびＬＥＭＤ１を発現する腫瘍に対して細胞性および／または抗体応答を誘導することができる。
本明細書に記載されるがんワクチンの開発には、免疫系によって認識されず、自己抗原であるがん抗原、例えばＬＥＭＤ１を同定することを含む。同定されたがん抗原は、免疫系によって認識されるために、自己抗原から外来抗原に変更される。自己から外来抗原に組換えがん抗原の核酸およびアミノ酸配列を再設計することにより、免疫系による抗原の寛容が破壊される。寛容を破壊するために、以下に記載されるように、いくつかの再設計手段ががん抗原に適用され得る。
ワクチンの組換えがん抗原は、自己として認識されず、それにより寛容を破壊する。寛容の破壊は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価抗体応答を誘導し、それにより抗原を発現するがんまたは腫瘍に指向されるか、またはそれに対して反応性である免疫応答を誘導または誘発することができる。いくつかの実施形態では、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、細胞性、液性、または細胞性および液性両方の免疫応答であり得る。いくつかの実施形態では、誘導されたまたは誘発された細胞性免疫応答には、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の誘導または分泌が含まれ得る。他の実施形態では、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を上方制御する因子、ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−１０およびＴＦＧ−βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生された可溶性因子、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ−１、ならびに免疫チェックポイント分子を低減または阻害することができる。
ワクチンは、無腫瘍生存率（ｔｕｍｏｒ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、および４５％増加させることができる。ワクチンは、免疫化後、腫瘍量を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％低減することができる。ワクチンは、骨髄由来サプレッサー細胞により分泌されるサイトカインである単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の増加を阻止または遮断することができる。ワクチンは、腫瘍生存率を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％増加させることができる。
ワクチンは、ワクチンを投与されない対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫応答を、約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンを投与されない対象における細胞性免疫応答と比較して、ワクチンを投与された対象における細胞性免疫応答を、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
ワクチンは、ワクチンを投与されない対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベルと比較して、ワクチンを投与された対象におけるＩＦＮ−γレベルを、約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンを投与されない対象におけるＩＦＮ−γレベルと比較して、ワクチンを投与された対象におけるＩＦＮ−γレベルを、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
ワクチンはＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号（参照により完全に本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＤＮＡワクチンは、それが染色体に組み込まれるのを阻害する要素または試薬をさらに含み得る。
ワクチンは、１つ以上のがん抗原のＲＮＡであり得る。ＲＮＡワクチンは、細胞内に導入され得る。
ワクチンは、弱毒化生ワクチン、抗原を送達するための組換えベクターを使用するワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチン、例えば、限定されないが、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、および同第６，５８９，５２９号（各々参照により本明細書に組み込まれる）に記載のワクチンであり得る。
いくつかの実施形態では、ワクチンは分子アジュバントをさらに含み得、場合によっては、分子アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳであり得、場合によっては、分子アジュバントは、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、抗プログラム死受容体−１（ＰＤ−１）、および抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）を含むチェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは分子アジュバントのコード配列をさらに含み得、場合によっては、分子アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳであり得、場合によっては、分子アジュバントは、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、抗プログラム死受容体−１（ＰＤ−１）、および抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）を含むチェックポイント阻害剤である。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列は、１つ以上の抗原のコード配列を含む１つ以上の核酸分子上に含まれ得る。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、および／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列は、別個のプラスミドなどの別個の核酸分子上に含まれ得る。
本発明のワクチンは、ワクチン自体が病気もしくは死を引き起こさないように安全である、病気を防ぐ、中和抗体を誘導する、防御性Ｔ細胞受容体を誘導する、ならびに投与が容易であり、副作用が少なく、生物学的に安定であり、また用量あたりのコストが低いなど、有効なワクチンに求められる特徴を有し得る。ワクチンは、以下に考察されるがん抗原を含有することによりこれらの特徴のいくつかまたはすべてを達成することができる。
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下により詳細に説明される。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラスによる提示、Ｔ細胞による提示、および／もしくは分化、Ｂ細胞による提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達などの免疫系における任意の構成成分の抑制を阻止する任意の核酸またはタンパク質である。また以下により詳細に説明されるように、ワクチンは、ＰＤ−１およびＰＤＬ−１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わされて、細胞性および液性両方の免疫応答の刺激を増加させることができる。抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ−１抗体を使用することによって、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを阻止する。
抗原
上述のように、ワクチンは、ＬＥＭＤ１抗原またはＬＥＭＤ１抗原をコードする核酸分子を含み得る。抗原は、ＬＥＭＤ１、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。
ワクチンは、ＬＥＭＤ１発現がんに罹患する対象を治療するために使用され得る。ワクチンは、ＬＥＭＤ１を発現するがんもしくは腫瘍を有する対象を治療するため、または対象のそのような腫瘍の発達を予防するためにも使用され得る。ＬＥＭＤ１抗原は、天然の「正常な」ＬＥＭＤ１遺伝子とは異なり、したがってＬＥＭＤ１抗原発現腫瘍に対する療法または予防法を提供することができる。したがって、天然のＬＥＭＤ１遺伝子とは異なるＬＥＭＤ１抗原配列（すなわち、変異されたＬＥＭＤ１遺伝子または配列）が本明細書に提供される。例えば、本開示のいくつかの態様は、配列番号１、３、または５に記載の核酸配列を含む核酸分子を含むワクチンを提供し、いくつかの態様は、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子を含むワクチンを提供する。核酸分子を含むワクチンのいくつかの態様では、核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００、（ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８、（ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９、（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である断片、（ｈ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である断片、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である断片、（ｊ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号１のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。
上述の異種配列を含む単離された核酸分子が提供される。上述の異種配列からなる単離された核酸分子が提供される。上述の異種配列を含む単離された核酸分子は、プラスミド、ウイルスベクター、および以下に記載される核酸分子の他の形態などのベクターに組み込まれ得る。ＬＥＭＤ１抗原をコードする核酸配列が本明細書に提供される。ＬＥＭＤ１抗原をコードするコード配列は、上述された配列を有する。
上述の異種アミノ酸配列を含むタンパク質分子が提供される。上述の異種アミノ酸配列からなるタンパク質分子が提供される。上述の配列を有するタンパク質およびポリペプチドが本明細書に提供される。本開示のいくつかの実施形態は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８、（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４、（ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１、（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列、（ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、（ｊ）配列番号２のアミノ酸配列１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｋ）配列番号４のアミノ酸配列１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに（ｌ）配列番号６のアミノ酸配列１９〜１９８ならびに２０６および２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
タンパク質およびポリペプチドは、ＬＥＭＤ１抗原およびＬＥＭＤ１免疫原と称され得る。ＬＥＭＤ１抗原は、ＬＥＭＤ１抗原を発現するがん細胞および腫瘍に対して免疫応答を誘発することができる。
本発明の一態様では、コンセンサス抗原が以下のうちの１つ以上を有することを含む、改善された転写および翻訳を提供することが望ましい：転写を増加させるための低ＧＣ含有量リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化、ならびに可能な限りシス作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の排除。
本発明のいくつかの態様では、以下のうちの１つ以上を有することを含む、複数の株にわたって広範な免疫応答を生成するコンセンサス抗原を生成することが望ましい：すべての利用可能な完全長配列の組み込み、各位置で最も一般的に生じるアミノ酸を利用するコンピュータが生成した配列、および株間での交差反応の増加。
ＬＥＭＤ１抗原は、２つ以上の種に由来するコンセンサス抗原（または免疫原）配列であり得る。ＬＥＭＤ１抗原は、発現を改善するためのコンセンサス配列および／または修飾（複数可）を含み得る。修飾は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増加させるためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ ＡＣＣ）の追加、および／またはＬＥＭＤ１抗原の免疫原性を増加させるための免疫グロブリンリーダー配列の追加を含み得る。ＬＥＭＤ１抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含み得る。ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、対応するコドン最適化ＬＥＭＤ１抗原よりも強く広範な細胞性および／または液性免疫応答を誘発するように設計され得る。
ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、１つ以上の変異を含み、それにより対応するコドン最適化ＬＥＭＤ１抗原よりも強く広範な細胞性および／または液性免疫応答を誘発することができる。
ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８をコードする核酸の配列番号１のヌクレオチド５５〜６００であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態では、ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４をコードする核酸の配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態では、ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１をコードする核酸の配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号５に記載の核酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列であり得る。他の実施形態では、ＬＥＭＤ１コンセンサス抗原は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であり得る。
ＬＥＭＤ１抗原は、発現を改善するための修飾を含み得る。修飾は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増加させるためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ ＡＣＣ）の追加、および／または抗原の免疫原性を増加させるための免疫グロブリンリーダー配列の追加を含み得る。ＬＥＭＤ１抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み得る。
ＬＥＭＤ１抗原は、エピトープを最適化するための修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような切断部位は、複数のＬＥＭＤ１抗原配列間に挿入され得る。切断部位はフーリン切断部位であり得る。
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたワクチン
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下により詳細に説明される。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラスによる提示、Ｔ細胞による提示、および／もしくは分化、Ｂ細胞による提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達などの免疫系における任意の構成成分の抑制を阻止する任意の核酸またはタンパク質である。
そのような阻害剤は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤に連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列も含み得る。小分子は、低分子量、例えば８００ダルトン未満の、酵素基質として機能し得る有機もしくは無機化合物、タンパク質もしくは核酸により結合されるリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの調節因子であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列であり得る。他の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
１．免疫チェックポイント分子
免疫チェックポイント分子は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤に連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列も含み得る。小分子は、低分子量、例えば８００ダルトン未満の、酵素基質として機能し得る有機もしくは無機化合物、タンパク質もしくは核酸により結合されるリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの調節因子であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
ａ．ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１
免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、それらの断片、それらのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ−１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされる細胞表面タンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現され、したがって、これらの細胞の運命および／または分化に寄与する。特に、ＰＤ−１は、Ｔ細胞調節因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーの１型膜タンパク質であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルを負に調節し、それにより免疫応答を負に調節する。ＰＤ−１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を負に調節することができ、したがって、ＣＤ８媒介性細胞傷害性を阻害し、腫瘍成長を増強する。
ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーのメンバーであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の２つのリガンドを有する。ＰＤ−Ｌ１は、ＬＰＳおよびＧＭ−ＣＳＦ治療に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）上で、ならびにＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達時にＴ細胞およびＢ細胞上で上方制御される。ＰＤ−Ｌ１は、骨髄腫、マスト細胞腫、および黒色腫を含む多くの腫瘍細胞株によって発現される。
２．抗免疫チェックポイント分子抗体
上述のように、免疫チェックポイント阻害剤は抗体であり得る。抗体は、抗原（すなわち、上述の免疫チェックポイント分子）に結合するか、またはそれと反応し得る。したがって、抗体は、抗免疫チェックポイント分子抗体または免疫チェックポイント分子抗体とみなされ得る。抗体は、に含有される核酸配列によってコードされ得る。
抗体は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含み得る。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、ならびに／またはヒンジ領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。他の実施形態では、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含有し得る。重鎖ポリペプチドのＮ末端から始まり、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含み得る。軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含有し得る。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から始まり、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
抗体は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）への支持を提供し、互いに対してＣＤＲの空間的関係を画定する重鎖と軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットとの間にそれぞれ挿入される、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み得る。ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含有し得る。重鎖または軽鎖のＮ末端から始まり、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含み得る。
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
加えて、タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片をもたらし、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）は各々、無傷抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むいくつかの断片（Ｆ（ａｂ’）2断片を含む）を提供することができる。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種からの抗体であり得る。
ａ．ＰＤ−１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ−１抗体（本明細書において「ＰＤ−１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ−１抗体はニボルマブであり得る。抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍成長を減少させることができる。
ｂ．ＰＤ−Ｌ１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（本明細書において「ＰＤ−Ｌ１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍成長を減少させることができる。
ベクター
ワクチンは、ＬＥＭＤ１抗原をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含み得る。１つ以上のベクターが、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含有する核酸配列を有し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであり得る。
１つ以上のベクターは、特異的遺伝子を標的細胞に導入するために使用される、一般的にプラスミドである発現構築物であり得る。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質が細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として機能し、発現ベクターで運ばれる遺伝子の効率的な転写をもたらす調節配列を含有するように頻繁に操作される。本発明のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質を発現する。
ベクターは、強いプロモーター、強い終結コドン、プロモーターとクローニングされた遺伝子との間の距離の調整、ならびに転写終結配列およびＰＴＩＳ（ポータブルな転写開始配列（ｐｏｒｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））の挿入などの発現シグナルを有し得る。
ベクターは、プロモーターおよびポリ−アデニル化シグナルから選択される調節要素に動作可能に連結される核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である。いくつかの実施形態では、ポリ−アデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である。
ベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸であり得る。環状プラスミドおよび直鎖状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指向することができる。ベクターは、終結シグナルに動作可能に連結され得る抗原コードヌクレオチド配列に動作可能に連結されるプロモーターを有し得る。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含有し得る。関心のヌクレオチド配列を含むベクターはキメラであり得る、つまり、その構成成分のうちの少なくとも１つがその他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して異種である。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特定の外部刺激に曝されるときにのみ転写を開始する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは臓器または発達段階に特異的であってもよい。ベクターはプラスミドであり得る。プラスミドは、抗原をコードする核酸を細胞にトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞は、培養され、抗原の発現が起こる条件下で維持される。
プラスミドは、抗原に対して免疫応答を誘発することができる合成のコンセンサス抗原、そのようなタンパク質の断片、そのようなタンパク質のバリアント、バリアントの断片、またはコンセンサスタンパク質および／もしくはコンセンサスタンパク質の断片および／もしくはコンセンサスタンパク質のバリアントおよび／もしくはバリアントコンセンサスタンパク質の断片の組み合わせで構成される融合タンパク質をコードするコード配列を含む、上に開示される様々な抗原のうちの１つ以上をコードする核酸配列を含み得る。
単一のプラスミドは、単一の抗原のコード配列、２つの抗原のコード配列、３つの抗原のコード配列、または４つの抗原のコード配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、プラスミドは、ＣＣＲ２０のみをコードするか、またはこれらのプラスミドの一部としてコード配列をさらに含み得る。同様に、プラスミドは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−２８のコード配列をさらに含み得る。
プラスミドは、コード配列の上流であり得る開始コドン、およびコード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含み得る。開始および終結コドンは、コード配列とインフレームであり得る。
プラスミドは、コード配列に動作可能に連結されるプロモーターも含み得る。コード配列に動作可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）などのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１７５７２７号に記載されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
プラスミドは、コード配列の下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
プラスミドは、コード配列の上流のエンハンサーも含み得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶからのものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、各々の内容は参照により完全に組み込まれる。
プラスミドは、プラスミドを染色体外で維持し、細胞においてプラスミドの複数コピーを産生するために、哺乳類の複製起点も含み得る。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐ Ｖ ＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であってもよく、これは、組込むことなく高コピーのエピソーム複製を産生し得るエプスタイン・バーウイルス複製起点および核内抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得る。プラスミドの骨格はｐＡ Ｖ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
プラスミドは、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現によく適している可能性がある調節配列も含み得る。コード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。
コード配列は、Ｉｇリーダー配列も含み得る。リーダー配列は、コード配列の５’’であり得る。この配列によってコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ末端Ｉｇリーダー、続いてコンセンサス抗原タンパク質を含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
プラスミドはｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであってもよく、これは昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。プラスミドはまた、ｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、これはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生に使用され得る。ベクターは、細胞ゲノムに組み込むことによって標的細胞を形質転換するか、または染色体外で存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）であり得る。
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
電気穿孔により対象に効率的に送達され、１つ以上の所望の抗原を発現することができる直鎖状核酸ワクチンまたは直鎖状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、任意のリン酸骨格を欠く任意の直鎖状ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、１つ以上の抗原をコードし得る。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含有し得る。抗原の発現はプロモーターにより制御され得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現に無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
ＬＥＣは、線状化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、抗原を発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。ＬＥＣはｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
ベクターはプロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離された核酸の発現を調節することができる任意のプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、本明細書に記載の抗原配列を転写する、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる転写に必要なシス作用性配列要素である。異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、ベクターがその天然環境において転写開始部位からであるため、ベクターの転写開始からほぼ同じ距離に位置し得る。しかしながら、この距離の変化は、プロモーターの機能を喪失することなく調整され得る。
プロモーターは、転写物、リボソーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な抗原およびシグナルをコードする核酸配列に動作可能に連結され得る。
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞において発現に有効であると示される別のプロモーターであり得る。
ベクターは、機能的なスプライスドナーおよびアクセプター部位を有するエンハンサーおよびイントロンを含み得る。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含有し得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得てもよい。
ベクターの調製方法
本明細書で考察されるＬＥＭＤ１抗原をコードする核酸分子を含むベクターの調製方法が本明細書に提供される。哺乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップ後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ベクターを大規模な発酵タンクにおいて細胞培養物に播種するために使用することができる。
以下により詳細に説明されるＥＰ装置で使用するためのベクターは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００７年５月２３日に出願された利用許諾の同時係属中の米国仮特許出願第６０／９３９，７９２号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術は、２００７年７月３日に発行された利用許諾特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に既知である様々な装置およびプロトコルも含むか、またはそれらも組み込む。上記に参照される出願および特許、米国第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
賦形剤およびワクチンの他の構成成分
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤はトランスフェクション促進剤であり得、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などの界面活性剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであり、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在し得る。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞も含み得、遺伝子構築物とともに投与されるヒアルロン酸も使用され得る。ＤＮＡプラスミドワクチンは、脂質、リポソーム（ＤＮＡ−リポソーム混合物として、レシチンリポソームまたは当該技術分野において既知の他のリポソームを含む）（例えばＷ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などのトランスフェクション促進剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤も含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。ワクチンにおけるトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、代替えのプラスミドにおいて発現されるか、またはワクチンにおいて上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１〜、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、欠失したシグナル配列をコードするシグナル配列またはコード配列を有し、任意選択でＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチド、もしくはＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を有するＩＬ−１５、およびそれらの機能断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、アジュバントは、１つ以上のタンパク質および／またはＣＣＬ−２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、もしくはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸分子であり得る。ＩＬ−１２構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号および対応する米国出願第０８／９５６，８６５号、ならびに２０１１年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５６９６００号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号および対応する米国出願第１０／５６０，６５０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号および対応する米国出願第１２／１６０，７６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳＩ０／０４８８２７号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２８構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号および対応する米国出願第１２／９３６，１９２号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第および０９／６２２４５２号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、およびＭＥＣ構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号および対応する米国出願第１１／７１９，６４６号に開示されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および他の免疫調節剤の例は米国出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節剤の例は、米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、ＩＬ−２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードするものを含む。
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願された米国第０２１，５７９号（参照により完全に組み込まれる）に説明される遺伝子ワクチン促進剤をさらに含み得る。
ワクチンは、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で抗原およびプラスミドを含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるワクチンは、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムの抗原またはそのプラスミドを含有し得る。
ワクチンは、使用される投与モードにより製剤化され得る。注射可能なワクチン医薬組成物は、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｆｒｅｅ）であり得る。等張製剤または溶液を使用することができる。等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。ワクチンは、血管収縮剤（ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を含み得る。等張溶液は、リン酸緩衝食塩水を含み得る。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む安定剤は、製剤を長期間室温または周囲温度で安定させることができる。
ワクチンの医薬組成物
ワクチンは、医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物はワクチンを含み得る。医薬組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）〜約１０ミリグラム（ｍｇ）のＤＮＡのワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、約２５ｎｇ〜約５ｍｇのＤＮＡのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５０ｎｇ〜約１ｍｇのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２０マイクログラム〜約８０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２５マイクログラム〜約６０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３０ｎｇ〜約５０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３５ｎｇ〜約４５マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含有する。
いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇのＤＮＡのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムのＤＮＡのワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ以上のＤＮＡのワクチンを含み得る。
他の実施形態では、医薬組成物は、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇ（これらの値を含む）のＤＮＡのワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５．９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラム（これらの値を含む）のＤＮＡのワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ（これらの値も含む）のＤＮＡのワクチンを含み得る。
医薬組成物は、使用される投与モードにより製剤目的のための他の薬剤をさらに含み得る。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含である。等張製剤を使用することが好ましい。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得る。
いくつかの実施形態では、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。一実施形態では、トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在する。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞も含み得、遺伝子構築物とともに投与されるヒアルロン酸も使用され得る。いくつかの実施形態では、トランスフェクション促進剤は、脂質、リポソーム（ＤＮＡ−リポソーム混合物として、レシチンリポソームまたは当該技術分野において既知の他のリポソームを含む）（例えばＷ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。ワクチンにおけるトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満であり得る。
薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントであり得る。アジュバントは、１つ以上の代替えのプラスミドにおいて発現されるか、またはワクチンにおいて上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（欠失したシグナル配列を有し、任意選択でＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含む）からなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。例示的な実施形態では、アジュバントはＩＬ−１２である。
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードするものを含む。
ワクチン接種方法
上述の医薬製剤を使用して、ＬＥＭＤ１発現がんを治療および／または予防するための方法が本明細書に提供される。対象におけるがんの治療および／または予防に上述の医薬製剤を使用する方法も本明細書に記載される。対象にワクチン接種する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の医薬製剤を、それを必要する対象に投与する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の医薬製剤を使用する治療方法と集合的に称される本明細書に記載の方法は、治療的および／または予防的免疫応答を誘導するために、本明細書に記載される１つ以上のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含み得る。ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強するために対象に投与され得る。ワクチンの投与は、細胞において発現され、細胞の表面に送達されると、免疫系が認識して、細胞性、液性、または細胞性および液性応答を誘導する核酸分子としての本明細書に開示されるがん抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの投与は、本明細書で考察されるワクチンを対象に投与することにより、対象において、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を誘導または誘発するために使用され得る。
ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節するために対象に投与され、それにより免疫応答を増強させることができる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。哺乳動物にワクチンを投与し、それによりベクターを哺乳動物の細胞に導入すると、トランスフェクトされた細胞が本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上を発現および分泌する。これらの分泌されたタンパク質または合成抗原は、１つ以上のがん抗原に対して作られた抗体、および特異的に１つ以上のがん抗原に対するＴ細胞応答を含み得る免疫応答を開始する免疫系により異物として認識される。いくつかの例では、本明細書で考察されるワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、抗原刺激を受けた（ｐｒｉｍｅｄ）免疫系を有し、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を接種された場合、抗原刺激を受けた免疫系は、液性、細胞性、または細胞性および液性両方の免疫応答によるものかにかかわらず、本明細書に開示される後のがん抗原を迅速に除去することができる。
ワクチンのＤＮＡの投与方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、その両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ワクチンを哺乳動物に投与して、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、そして好ましくはヒト、ウシ、またはブタであり得る。ワクチンは同様に、免疫応答を誘発するために、非哺乳動物対象、例えば、ニワトリに投与され得る。
ワクチンの用量は、時間あたりの１キログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム〜１０ｍｇの活性成分（成分／ｋｇ体重／時間）であり得、２０マイクログラム〜１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／時間であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
ワクチンにより免疫応答を生成する方法
ワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、哺乳動物または非哺乳動物対象において免疫応答を生成することができる。免疫応答は、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原に指向される抗体および／またはキラーＴ細胞を生成することができる。そのような抗体およびＴ細胞は単離され得る。
いくつかの実施形態は、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を生成する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態は、上述のがん抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に対して対象に予防的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、がん抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に罹患している対象に治療的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。ワクチンの投与前に本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を発現するがんまたは腫瘍の診断は、日常的に行うことができる。
ワクチンによりがんを治療する方法
ワクチンを使用して、哺乳動物またはそれを必要とする対象のがんまたは腫瘍（例えば、ＨＰＶ媒介性がん、卵巣上皮癌、黒色腫、頭頸部癌、子宮頸癌、肝臓癌、前立腺癌、血液癌、食道扁平上皮癌、胃癌）に反応性であるか、またはそれに指向される、哺乳動物における免疫応答を生成または誘発することができる。誘発された免疫応答は、がんまたは腫瘍成長を阻止することができる。
誘発された免疫応答は、がん性または腫瘍細胞の転移を阻止、かつ／または低減することができる。したがって、ワクチンは、ワクチンを投与された哺乳動物または対象におけるがんまたは腫瘍を治療および／または予防する方法において使用され得る。治療されるがんまたは腫瘍に基づく成長は、限定されないが、結腸直腸癌などの任意の種類のがんであり得る。
いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、（１）単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の産生を遮断する抗体を生成し、それにより骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を遅延し、腫瘍成長を抑制するＢ細胞応答による液性免疫、（２）腫瘍細胞を攻撃し、殺傷するＣＤ８+などの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の増加、（３）Ｔヘルパー細胞応答の増加、（４）ならびにＩＦＮ−γおよびＴＦＮ−αによる炎症応答の増加、または好ましくは前述のすべてを誘導することにより、腫瘍細胞のクリアランスを媒介するか、またはその成長を阻止することができる。
いくつかの実施形態では、免疫応答は、ワクチンを投与された対象において、様々な組織または系（例えば、脳または神経系など）に損傷を与えないか、またはその炎症を引き起こさない液性免疫応答および／または抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を生成することができる。
いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、対象の生存率を増加させるか、腫瘍量を低減するか、またはそれらの組み合わせであり得る。ワクチンの投与により、対象の無腫瘍生存率を、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％増加させることができる。ワクチンの投与により、免疫化後の対象において、腫瘍量を、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、および７０％低減することができる。ワクチンの投与により、ワクチンを投与されない対象における細胞性免疫応答と比較して、ＬＥＭＤ１媒介性腫瘍発生および／または腫瘍進行を阻止および遮断することができる。ワクチンは、骨髄由来サプレッサー細胞により分泌されるサイトカインである単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）の増加を阻止または遮断することができる。ワクチンは、腫瘍生存率を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％増加させることができる。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、がん性もしくは腫瘍細胞または組織を標的とする抗原特異的免疫応答を確立して、ワクチンを投与された対象において、損傷を与える、または病気もしくは死を引き起こすことなく、１つ以上のがん抗原を発現するがんまたは腫瘍を除去または排除するために、末梢に投与され得る（以下により詳細に説明される）。
ワクチンの投与により、ワクチンを投与されない対象における細胞性免疫応答と比較して、対象における細胞性免疫応答を、約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンの投与により、ワクチンを投与されない対象における細胞性免疫応答と比較して、対象における細胞性免疫応答を、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
ワクチンの投与は、ワクチンを投与されない対象における細胞性免疫応答と比較して、対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベルを、約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンの投与は、ワクチンを投与されない対象における細胞性免疫応答と比較して、対象におけるＩＦＮ−γレベルを、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
ワクチンの用量は、時間あたりの１キログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム〜１０ｍｇの活性成分（成分／ｋｇ体重／時間）であり得、２０マイクログラム〜１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／時間であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
投与経路
ワクチンまたは医薬組成物は、経口、非経口、舌下、経皮的、直腸に、経粘膜的、局所的、吸入により、頬側投与により、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内 くも膜下腔内、および／もしくは関節内を含む異なる経路により、またはそれらの組み合わせにより投与され得る。獣医学的使用において、本組成物は、通常の獣医学的実践に従い、好適に許容可能な製剤として投与され得る。獣医は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｇｕｎｓ）」、または電気穿孔法（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法により投与され得る。
ワクチンのベクターは、インビボ電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、ナノ粒子促進トランスフェクション（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を伴うまたは伴わないＤＮＡ注射（ＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含む、いくつかの周知の技術により哺乳動物に投与され、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、および組換えワクシニアなどの組換えベクターを使用することができる。ワクチンの１つ以上のがん抗原がインビボ電気穿孔とともにＤＮＡ注射により投与され得る。
電気穿孔法
ワクチンまたは医薬組成物は、電気穿孔法により投与され得る。電気穿孔法によるワクチンの投与は、可逆性細孔を細胞膜において形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得る電気穿孔装置を使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザによって入力される予め調整された電流と同等の定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。電気穿孔構成要素は、コントローラ、電流波形発生装置、インピーダンステスター、波形ロガー、入力素子、ステータス報告要素、通信ポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチを含む、電気穿孔装置の様々な要素のうちの１つ以上を含み、かつそれらを組み込むことができる。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して達成され得る。
本発明のＤＮＡワクチンの投与を容易にし得る電気穿孔装置および電気穿孔方法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの投与を容易にするために使用され得る他の電気穿孔装置および電気穿孔方法は、２００７年１０月１７日に出願された同時係属中および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００６年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号に対して利益を主張する）に提供されるものを含み、これらのすべてはそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを容易にするためのモジュール電極システムおよびそれらの使用を説明している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクタ、および電源を備え得る。オペレーターは、支持構造に載置される複数の針電極を把持し、それらを身体もしくは植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次に、生体分子を、皮下針により選択された組織内に投与する。プログラム可能な定電流パルスコントローラを作動させ、定電流電気パルスを複数の針電極に適用する。適用された定電流電気パルスは、生体分子を、複数の電極間の細胞に導入するのを容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを効果的に容易にするために使用することができる電気穿孔装置を説明している。電気穿孔装置は、操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電装置（「ＥＫＤ装置」）を備える。ＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づいた一連の電極とパルスパラメータの入力との間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを作り出し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、一連の針電極を有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および着脱可能なガイドディスクも備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に説明される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく他の組織または臓器にも深く浸透させるのに適応し得る。電極アレイの構成により、注射針（ｓ）は標的臓器にも完全に挿入され、注射は電極によって予め描かれたエリアの標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に説明される電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込むいくつかの実施形態において企図される、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載されるものの電気穿孔装置がある。さらに、様々な装置のいずれかを使用したＤＮＡの投与に関係する２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注射する方法が注目された２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号に提供される主題を網羅する特許が、本明細書に企図される。上記の特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。
ワクチンの調製方法
本明細書に考察されるワクチンを含むＤＮＡプラスミドの調製方法が本明細書において提供される。哺乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップ後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＤＮＡプラスミドを大規模な発酵タンクにおいて細胞培養物に播種するために使用することができる。
本発明のＥＰ装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００７年５月２３日に出願された米国公開出願第２００９／０００４７１６号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術は、２００７年７月３日に発行された利用許諾特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に既知である様々な装置およびプロトコルも含むか、またはそれらを組み込む。上記に参照される出願および特許、米国第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって図示される多くの態様を有する。
本発明は、以下の実施例においてさらに図示される。これらの実施形態は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に実例として示されることを理解するべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、様々な使用および条件に適応させることができる。したがって、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
実施例１
コンセンサスＬＥＭＤ１
コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ
ヒトコンセンサスＬＥＭＤ１Ａを生成するために、８つのＬＥＭＤ１Ａ配列がＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）から集められた。選択された配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＮＰ＿００１１８５９７９．１、ＸＰ＿００３９３８３７９．１、ＸＰ＿０１２３１４７６０．１、ＸＰ＿００２７６０７５４．２、ＸＰ＿０１２５１３３０７．１、ＸＰ＿０１１３７１２９３．１、ＸＰ＿０１１２２１９３５．１、およびＸＰ＿００７０８６６０２．１である。
コンセンサス配列は、ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（バージョン１３．０．０．３５７）を使用して生成された。上に列記される８つの配列をＭｅｇＡｌｉｇｎに取り込み、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントプログラムを使用してアライメントした。得られたＬＥＭＤ１Ａ配列は、ヒト天然ＬＥＭＤ１Ａと９７．２％の同一性を共有する。
コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ
ヒトコンセンサスＬＥＭＤ１Ｆを生成するために、６つのＬＥＭＤ１Ｆ配列がＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）から集められた。選択された配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＮＰ＿００１１８５９８１．１、ＸＰ＿０１１８４５８００．１、ＸＰ＿０１１８１３１２９．１、ＸＰ＿０１０３４７２７３．１、ＸＰ＿０１２３１４７６４．１、およびＸＰ＿０１２５１３３１１．１である。
コンセンサス配列は、ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（バージョン１３．０．０．３５７）を使用して生成された。上に列記される６つの配列をＭｅｇＡｌｉｇｎに取り込み、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントプログラムを使用してアライメントした。得られたＬＥＭＤ１Ｆ配列は、ヒト天然ＬＥＭＤ１Ｆと９８．５％の同一性を共有する。
実施例２
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ
ＬＥＭＤ１Ａの生物学的機能の無効化
得られたコンセンサスＬＥＭＤ１Ａの潜在的な生物学的機能を無効化するために、ＬＥＭドメインに３つの変異（Ｇ２０Ａ、Ｐ２５Ａ、およびＹ３４Ａ）を導入して、ＢＡＦ結合を破壊した。結果として、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａタンパク質は、図１Ａおよび１Ｂに示されるように、天然ヒトＬＥＭＤ１Ａタンパク質と９５．６％の同一性を共有する。
発現の最適化
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ ＤＮＡ配列が得られたら、高レベルの発現を有するために、合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡのＮ末端メチオニンを除去し、上流コザック配列およびＩｇＥリーダーをＮ末端に付加した。さらに、この遺伝子のコドン使用を、ヒト遺伝子のコドンバイアスに適合させ、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域、内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位などのシス作用性配列モチーフは避けて、ＲＮＡ最適化も行った。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａの略図を図２に示す。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａの特徴を表１に提供する。
図３を参照すると、合成された合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化され、発現ベクターｐＧＸ０００１（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）にクローニングされた。ｐＧＸ０００１骨格は、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）の制御下の修飾されたｐＶＡＸ１発現ベクターである。修飾をｐＶＡＸ１に導入してｐＧＸ０００１を創出し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なｐＶＡＸ１の報告された配列に基づいて同定する。これらの修飾を表２に列記する。
ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。２９９８塩基対ｐＧＸ０００１に存在する要素は以下のものを含む：
ＣＭＶプロモーター：塩基１３７〜７２４
Ｔ７プロモーター／プライミング部位：塩基６６４〜６８３
多重クローニング部位：塩基６９６〜８１１
ウシＧＨポリアデニル化シグナル：塩基８２９〜１０５３
カナマイシン耐性遺伝子：塩基１２２６〜２０２０
ｐＵＣ起源：塩基２３１９〜２９９２
ＬＥＭＤ１ＡをｐＧＸ０００１骨格内にクローニングすることから得られたプラスミドをｐＧＸ１４３１と名付け、完全長配列は正しいことが確認された。ｐＧＸ１４３１は、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドである。関連するｍＲＮＡ産生はヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ１４３１の特徴を表３に示す。
ｐＧＸ１４３１のアミノ酸挿入配列（配列番号２）
Ｎ末端リーダー配列は挿入配列のアミノ酸残基１〜１８からなり、アミノ酸残基１９〜１９８は合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ抗原である。
ｐＧＸ１４３１の一本鎖ＤＮＡ配列（配列番号７）：

Ｎ末端リーダー配列は上記配列のヌクレオチド１〜５４からなり、残りのヌクレオチドはＬＥＭＤ１Ａ抗原をコードする。
実施例３
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ
得られたコンセンサスＬＥＭＤ１Ｆの潜在的な生物学的機能を無効化するために、ＬＥＭドメインに２つの変異（Ｇ２０ＡおよびＰ２５Ａ）を導入して、ＢＡＦ結合を破壊した。結果として、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆタンパク質は、図４Ａおよび４Ｂに示されるように、天然ヒトＬＥＭＤ１Ｆタンパク質と９５．５％の同一性を共有する。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ ＤＮＡ配列が得られたら、高レベルの発現を有するために、合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＦのＮ末端メチオニンを除去し、上流コザック配列およびＩｇＥリーダーをＮ末端に付加した。さらに、この遺伝子のコドン使用を遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、ＲＮＡ最適化も行った：非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域、ならびに内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位などのシス作用性配列モチーフは避けられた。合成コンセンサスタンパク質の略図を図５に示す。表４は、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆのいくつかの特徴を示す。
発現ベクターｐＧＸ１４３２を、ｐＧＸ１４３１の構築に使用したのと同じｐＧＸ０００１骨格を使用して構築した。図６を参照すると、合成された合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化され、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下に配置された発現カセットとともに発現ベクターｐＧＸ０００１（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）にクローニングされた。得られたプラスミドはｐＧＸ１４３２と名付けられ、完全長配列が確認された。ｐＧＸ１４３２の特徴を表５に提供する。
ｐＧＸ１４３２のアミノ酸挿入配列（配列番号４）：
Ｎ末端リーダー配列は挿入配列のアミノ酸残基１〜１８からなり、アミノ酸残基１９〜８４は合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ抗原である。
ｐＧＸ１４３２の一本鎖ＤＮＡ配列（配列番号８）：

Ｎ末端リーダー配列は上記配列のヌクレオチド１〜５４からなり、残りのヌクレオチドはＬＥＭＤ１Ｆ抗原をコードする。
実施例３
合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦ
多抗原構築物の合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦを、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａのアミノ酸配列と合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆのアミノ酸配列との間にフーリン切断部位（ＲＧＲＫＲＲＳ、配列番号１０）を挿入することにより創出した。合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦ ＤＮＡ配列が得られたら、高レベルの発現を有するために、合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦのＮ末端メチオニンを除去し、上流コザック配列およびＩｇＥリーダーをＮ末端に付加した。さらに、この遺伝子のコドン使用をヒト遺伝子のコドンバイアスに適合させた。加えて、ＲＮＡ最適化も行った：非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域ならびに内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位などのシス作用性配列モチーフは避けられた。コンセンサスＬＥＭＤ１ＡおよびコンセンサスＬＥＭＤ１Ｆタンパク質の両方のＮ末端ドメイン（アミノ酸２〜２７）は同一であるため、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａのアミノ酸２〜２７領域および合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆのアミノ酸２〜２７領域をコードするＤＮＡ配列は、プラスミドの安定性を増加させるために異なって最適化された（６４．１％配列同一性）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦ構築物の略図を図７に示す。
図８を参照すると、合成された合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化され、前の実施例に記載されるように、発現ベクターｐＧＸ０００１（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）にクローニングされた。発現カセットは、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下に配置された。得られたプラスミドはｐＧＸ１４３３と名付けられ、完全長配列が確認された。
ｐＧＸ１４３３は、合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドである。関連するｍＲＮＡ産生はヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）によって駆動され、ウシ成長ホルモン３’端ポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）によって終結される。ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は真核細胞において機能的ではない。表６はｐＧＸ１４３３に関連する追加情報を提供する。
ｐＧＸ１４３３のアミノ酸挿入配列（配列番号６）
Ｎ末端リーダー配列は挿入配列のアミノ酸残基１〜１８からなり、アミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１は合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡおよびＦ抗原である。フーリン切断部位のアミノ酸残基１９９〜２０５はＬＥＭＤ１配列間に存在する。
ｐＧＸ１４３３の一本鎖ＤＮＡ配列（配列番号９）：
Ｎ末端リーダー配列は上記配列のヌクレオチド１〜５４からなり、ヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９はＬＥＭＤ１ＡＦ抗原構築物をコードする。ヌクレオチド５９５〜６１５はフーリン結合部位をコードする。
実施例４
インビトロ抗原発現
ｐＧＸ１４３１、ｐＧＸ１４３２、およびｐＧＸ１４３３による抗原タンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングにより確認された。１０％のＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭ培地中に維持されたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１３６）を、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎ ８（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用して、ｐＧＸ１４３１、ｐＧＸ１４３２、ｐＧＸ１４３３、またはｐＧＸ０００１（６μｇ／１０ｃｍ2皿）でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して細胞を溶解し、細胞溶解物を収集した。総タンパク質濃度を決定するためのＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）後、１５μｇの細胞溶解物を、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気穿孔し、抗ＬＥＭＤ１モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、クローンａｂ２０１２０６）で検出を行い、次いでＥＣＬウエスタンブロット分析システム（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＳＣ−２００４）で可視化した。ローディング対照として、抗β−アクチンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、クローン、Ｃ４）を使用して、アクチン発現についてブロットを再検出した。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ（ｐＧＸ１４３１）および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦ（ｐＧＸ１４３３）構築物の予想された分子量のタンパク質バンドが検出されたが、バンドは合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ（ｐＧＸ１４３２）構築物については検出されなかった（図９）。ＡＦ抗原の予想された分子量で検出されたため、ＬＥＭＤ１Ｆ抗原はＬＥＭＤ１ＡＦ抗原の一部として発現されたと推測され得る。ｐＧＸ０００１レーンにおいて、タンパク質バンドは検出されなかった。類似する強度の抗β−アクチンバンドが検出され、等量のタンパク質が各レーンにローディングされたことを示す。要約すると、ｐＧＸ１４３１およびｐＧＸ１４３３は、それらのそれぞれの抗原タンパク質を発現することが分かった。
実施例５
合成コンセンサスＬＥＭＤ１ワクチン構築物の免疫原性
材料および方法
動物および免疫化
雌の８週齢のＣＢ６Ｆ１マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。すべての動物を、ＢＴＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の温度制御された光サイクル施設に収容した。動物のケアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｐｒｏｐｏｓａｌ（ＡＣＵＰ）（ＢＴＳ ＡＣＵＰ ＃１５−０９１）のガイドラインに従って行われた。表１に詳述されるように、マウスを１０の群に分けた。
免疫化群のマウスに、示された用量のｐＧＸ０００１、ｐＧＸ１４３１、ｐＧＸ１４３２、またはｐＧＸ１４３３をワクチン接種した。簡潔に、示される用量が筋肉内注射により３０μＬの注射量で前脛骨筋に送達されるように、プラスミドを減菌注射用水（ＶｅｔＯｎｅ）用に製剤化した。各筋肉内注射の直後に、３Ｐアレイを備えるＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用する電気穿孔（ＥＰ）が続いた。装置は、５２ｍｓパルス幅の２つの０．１Ａｍｐパルスを１秒遅れの間隔で送達するように構成された。マウスは３週間隔で３回免疫化を受けた。最後の免疫化の１週間後にマウスを屠殺し、細胞免疫の読み取りのために脾臓を採取した。他の組織は収集されなかった。
脾臓リンパ球の単離
脾細胞を無菌で単離し、５ｍＬのＲ１０培地（１０％のウシ胎仔血清および１％の抗生物質−抗真菌薬で補充されたＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ １６４０）に入れた。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ機器（Ｓｅｗａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して脾臓を機械的に破砕することにより脾細胞を単離し、４０−μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用して、得られた産物を濾過した。得られた産物を遠心分離し、ＲＢＣの溶解のためにペレットをＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）で５分間処理した。次いで、脾細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、その後Ｒ１０培地に再懸濁し、さらなる分析のために直ちに使用した。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ
マウスＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（ＭａｂＴｅｃｈ）を行って、抗原特異的細胞性応答を評価した。簡潔に、抗マウスＩＦＮγ抗体で予めコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳ中で洗浄し、完全培養培地培地（１０％のＦＢＳおよび抗生物質で補充されたＲＰＭＩ １６４０）で、室温で２時間遮断した。脾臓リンパ球をＲ１０培地に再懸濁し、（次いで、２×１０5細胞／ウェルの投入細胞数で３つ組で添加した。ペプチドのセットを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、各々は、全合成コンセンサスＬＥＭＤ１タンパク質配列を表す、９個のアミノ酸が重複する１５のアミノ酸残基を含有する。ペプチドのこれらのセットをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、約２μｇ／ｍｌのペプチドの濃度で２つのペプチドプールにプールした。１つ目のペプチドプールは、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ抗原タンパク質に対応するペプチドを含有し、２つ目のペプチドプールは、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ抗原タンパク質に対応するペプチドを含有した。５μｇ／ｍｌのコンカバリン（Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）Ａ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用し、完全培養培地を陰性対照として使用した。プレートを、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベータ中で、３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、ビオチン化抗マウスＩＦＮγ検出抗体（ＭａｂＴｅｃｈ）を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＬＰ抗体（ＭａｂＴｅｃｈ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。キット製造業者の指示（ＭａｂＴｅｃｈ）に従いスポット検出を完了した。プレート上のスポットは、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して計数した。スポット形成単位（Ｓｐｏｔ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔｓ）（ＳＦＵ）の平均数は、データ表示のために１×１０6脾細胞に調整された。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔによる抗原特異的応答は、培地のみの対照のＳＦＵよりも大きい１×１０6脾細胞あたりのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数として報告される。
フローサイトメトリー
合成コンセンサスＬＥＭＤ１により誘導された細胞性免疫応答は、フローサイトメトリーによりさらに特徴付けされた。簡潔に、ワクチン接種されたおよびナイーブマウスからの２×１０6脾細胞を、単離後に、ブレフェルディンＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、モネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で６時間、各群に応じて合成コンセンサスＬＥＭＤ１ペプチドで直ちに刺激した。ペプチドでの刺激後、脾細胞を沈降させ、２０μＬ／ウェルのマウスＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液に再懸濁した。ＰＢＳ中１：４０の初期希釈でＦｃ Ｂｌｏｃｋを使用し、４℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、残りの細胞外抗体（ＰＢＳ中）を３０μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞外株の添加により、１：１００の最終希釈でのＦｃ Ｂｌｏｃｋおよびそれらの適切な作業希釈での細胞外抗体からなる、各ウェルの最終容積は５０μＬである。次いで、細胞を、生存率染色（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）（Ｖｉｖｉｄ Ｖ４５０，Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）および以下の細胞外抗体：ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗マウスＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＲＭ４−５）およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン６３−６．７）で染色した。細胞を固定し、４℃で２０分間透過処理した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５４７１４）。細胞内染色を、その後、以下の抗体：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗マウスＣＤ３ｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１４５−２Ｃ１１）、ＢＶ６０５抗マウスＩＦＮγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＸＭＧ１．２）、ＡＰＣ−Ｒ７００抗マウスＩＬ−２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＪＥｓ６−５Ｈ４）、およびＰＥ抗マウスＴＮＦ−α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＭＰ６−ＸＴ２２）で完了した。１０色ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＩＣＳデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を完了した。フローサイトメトリーゲーティング戦略を以下の図１０に示す。
フローサイトメトリーにより抗原特異的と呼ばれる細胞に関して、報告されたパラメータの頻度は、培地のみの対照の頻度を超えなければならない。抗原特異的ＣＤ１０７ａを産生すると同定される細胞に関して、細胞は、ブーリアンゲーティングにより同定される、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦαの抗原特異的産生にも陽性であると同定されなければならない。
統計分析
ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２２（ＩＢＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して統計分析を完了した。多重比較を調整するためにＴｕｋｅｙの事後Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＨＳＤ）とともにＡＮＯＶＡを使用して、群間の分析を行った。等分散性は多重比較の前にＦ統計を使用して確認された。すべての統計分析に関して、０．０５０のｐ値が有意であるとみなされた。
結果
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ
３つの合成コンセンサスＬＥＭＤ１構築物の免疫原性を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ およびフローサイトメトリー（ｎ＝８／群）により、３つの用量（１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇ）で評価した。マウスを、陰性対照として空のプラスミド骨格（ｐＧＸ０００１）で免疫化した（ｎ＝４／群）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａでのワクチン接種は、陰性対照ワクチン接種されたマウスと比較して有意なＩＦＮγ応答をもたらした。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａによって誘導されたＩＦＮγ産生において用量依存的増加のエビデンスがあり（図１１Ａ）、最大平均応答は３０μｇの投与量で達成された。具体的には、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ ＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇにおいて、それぞれ、６４６±３７３、１，６８３±１２４８、および１，６４５±１００２であった。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３１の３０μｇ（ｐ＝０．０２４）および５０μｇ（ｐ＝０．０２８）の投与量においてナイーブ（３±４）よりも有意に大きかったが、１０μｇの投与量ではそうではなかった（ｐ＝０．６４２）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆでのワクチン接種は、最小のＩＦＮγ応答をもたらし、投与量の増加による用量依存的増加のエビデンスはなかった（図１１Ｂ）。ＬＥＭＤ１Ｆ ＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇにおいて、それぞれ、１６３±３８２、８８±１０９、および１４０±２４６であった。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３２の投与量のいずれにおいてもナイーブ（３±４）よりも有意に大きくはなかった。合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦでのワクチン接種は、陰性対照ワクチン接種されたマウスと比較して有意なＩＦＮγ応答をもたらした。合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦによって誘導されたＩＦＮγ産生において用量依存的増加のエビデンスがあり（図１１Ｃ）、最大平均応答は５０μｇの投与量で達成された。具体的には、合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦ ＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇにおいて、それぞれ、４７８±２６９、７７９±３９２、および８７９±５５２であった。合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦ ＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３３の３０μｇ（ｐ＝０．０１８）および５０μｇ（ｐ＝０．００７）の投与量においてナイーブ（３±４）よりも有意に大きかったが、１０μｇの投与量ではそうではなかった（ｐ＝０．２２７）。ＩＦＮγ応答を表８に要約する。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａは、５０μｇの投与量（１．３４％±０．５８％）（ｐ＜０．００５）でナイーブ（０．０４％±０．０３％）よりも有意により頑強な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答頻度を誘導したが、１０μｇ（０．５０％±０．１７０％）（ｐ＜０．００４）または３０μｇ（１．０２％±０．５７％）（ｐ＜０．１２２）の投与量群ではそうではなかった（図１２Ａ）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、用量依存的であり、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα＋ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋またはＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞からなった（図１２Ｅ）。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆは、ナイーブ（０．０６％±０．０２％）よりも最小限に大きい抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度を誘導した。具体的には、ｐＧＸ１４３２は、１０μｇの投与量（０．２７％±０．３４％）、３０μｇ（０．２４％±０．１０％）、および５０μｇ（０．２０％±０．２０％）の投与量群において有意な応答を誘導しなかった（図１２Ｂ）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、用量依存的であり、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα−、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ−ＩＬ−２−ＴＮＦα＋、またはＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞からなった（図１２Ｅ）。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦは、５０μｇの投与量（０．８０％±０．５１％）（ｐ＜０．００６）でナイーブ（０．０９％±０．０３％）よりも有意により頑強な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答頻度を誘導したが、１０μｇ（０．５３％±０．１９％）（ｐ＜０．１３５）または３０μｇ（０．５０％±０．２０％）（ｐ＜０．１７６）の投与量群ではそうではなかった（図１２Ｃ）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、用量非依存的であり、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα＋ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−、またはＩＦＮγ−ＩＬ−２−ＴＮＦα＋産生ＣＤ４＋Ｔ細胞からなった（図１２Ｅ）。
抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は、表９にさらに詳述される。
すべての投与量の合成コンセンサスＬＥＭＤ１構築物がナイーブよりもわずかに大きいＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞頻度を誘導したが、最高投与量のｐＧＸ１４３１構築物のみが有意により頑強であった。
具体的には、ｐＧＸ１４３１抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．５３２）、３０μｇ（ｐ＝０．３１４）、および５０μｇ（ｐ＝０．００２）の投与量群において、それぞれ、０．１７％±０．０９％、０．３４％±０．１９％、および０．５０％±０．３０％であった（図１３Ａ）。ｐＧＸ１４３１特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋、およびＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−細胞で構成された（図１３Ｅ）。
ｐＧＸ１４３２抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量群において、それぞれ、０．１０％±０．１４％、０．１１％±０．０８％、および０．０４％±０．０３％であった（図１３Ｂ）。ｐＧＸ１４３２特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、１０μｇおよび３０μｇの投与量群で類似し、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα−、およびＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−細胞で構成されたが、５０μｇの投与量では、サイトカインプロファイルは、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋、およびＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−細胞で構成された（図１３Ｅ）。
ｐＧＸ１４３３抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．３６５）、３０μｇ（ｐ＝０．９９２）、および５０μｇ（ｐ＝０．１０９）の投与量群において、それぞれ、０．２０％±０．１０％、０．１７％±０．１０％、および０．３９％±０．３１％であった（図１３Ｃ）。ｐＧＸ１４３３特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、１０μｇおよび３０μｇの投与量群で類似し、ある程度のＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋およびＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−細胞を伴って、大半はＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα＋で構成されたが、５０μｇの投与量群では、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα−、およびＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋を伴って主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−で構成された（図１３Ｅ）。
抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７＋Ｔ細胞の頻度は、表９にさらに詳述される。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａは、ナイーブ（０．０８％±０．０１％）よりも頑強な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答頻度を誘導したが、１０μｇ（１．４６％±０．７９％）、３０μｇ（２．３４％±１．４７％）、および５０μｇ（２．１２％±１．８９７％）の投与量群では有意ではなかった（図１４Ａ）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、用量非依存的であり、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−およびある程度のＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋産生ＣＤ８＋Ｔ細胞からなった（図１４Ｅ）。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆはナイーブ（０．０９％±０．０５％）より大きい抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答頻度を誘導しなかった。具体的には、ｐＧＸ１４３２は、１０μｇの投与量（０．０９％±０．０４％）、３０μｇ（０．０７％±０．０５％）、および５０μｇ（０．１７％±０．０７％）の投与量群において有意な応答を誘導しなかった（図１４Ｂ）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、用量非依存的であり、主にＩＦＮγ−ＩＬ−２＋−ＴＮＦα−、ＩＦＮγ−ＩＬ−２−ＴＮＦα＋、およびＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−産生ＣＤ８＋Ｔ細胞からなった（図１４Ｅ）。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦは、５０μｇの投与量でナイーブ（０．１７％±０．０４３％）よりも有意により頑強な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答頻度を誘導したが（１．７３％±１．４０％）（ｐ＝０．０４６）、１０μｇ（０．７２％±０．３６％）（ｐ＝０．０６１）または３０μｇ（１．６５％±０．８６％）（ｐ＝０．０６１）の投与量群ではそうではなかった（図１４Ｃ）。合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、用量依存的であり、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−ならびにある程度のＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋およびＩＦＮγ−ＩＬ−２＋−ＴＮＦα−産生ＣＤ８＋Ｔ細胞からなった（図１４Ｅ）。
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、表１０にさらに詳述される。
ｐＧＸ１４３２は誘導しなかったが、合成コンセンサスＬＥＭＤ１構築物ｐＧＸ１４３１およびｐＧＸ１４３３は、ナイーブよりも大きいＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞頻度を誘導したが、いずれの投与量でも有意ではなかった。
具体的には、ｐＧＸ１４３１抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量群において、それぞれ、１．３７％±０．７８％、２．２３％±１．４５％、および１．９７％±１．８４％であった（図１５Ａ）。ｐＧＸ１４３１特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、投与量群にわたって類似し、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−およびある程度のＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋細胞で構成された（図１５Ｅ）。
ｐＧＸ１４３２抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ、３０μｇ、および５０μｇの投与量群において、それぞれ、０．０２％±０．０２％、０．０５％±０．０４％、および０．０４％±０．０３％であった（図１５Ｂ）。ｐＧＸ１４３２特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、主にＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−、ＩＦＮγ−ＩＬ−２＋ＴＮＦα−、およびＩＦＮγ＋ＩＬ−２＋ＴＮＦα−細胞で構成された（図１５Ｅ）。
ｐＧＸ１４３３抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．８９７）、３０μｇ（ｐ＝０．０８９）、および５０μｇ（ｐ＝０．０５３）の投与量群において、それぞれ、０．５４％±０．３９％、１．４３％±１．３９％、および１．５７％±１．３９％であった（図１５Ｃ）。ｐＧＸ１４３３特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、大半はＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα−およびある程度のＩＦＮγ＋ＩＬ−２−ＴＮＦα＋細胞で構成された（図１５Ｅ）。
前述の詳細な説明および付随する実施例は一例にすぎず、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されないことが理解される。
本開示の実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者には明らかであろう。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含む、本開示の実施形態に対するそのような変更および修正は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。
合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ（配列番号１３）のアミノ酸１９〜１９８と天然ヒトＬＥＭＤ１Ａ（配列番号１４）との配列アライメントである。 天然と合成コンセンサスのＬＥＭＤ１Ａとの間の配列同一性および相違を示す。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａの略図である。 ｐＧＸ１４３１を生成するために用いられたクローニング戦略を図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ（配列番号１５）のアミノ酸１９〜８４と天然ヒトＬＥＭＤ１Ｆ（配列番号１６）との配列アライメントである。 天然と合成コンセンサスのＬＥＭＤ１Ｆとの間の配列同一性および相違を示す。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆの略図である。 ｐＧＸ１４３２を生成するために用いられたクローニング戦略を図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦの略図である。 ｐＧＸ１４３３を生成するために用いられたクローニング戦略を図示する。 横紋筋肉腫細胞において、それぞれ構築物ｐＧＸ１４３１、ｐＧＸ１４３２、およびｐＧＸ１４３３から生成された合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、ＬＥＭＤ１Ｆ、およびＬＥＭＤ１ＡＦの発現を決定するためのウエスタンブロットを示す。 細胞免疫応答を特徴付けするために使用されたフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦの免疫原性をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦの免疫原性をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦの免疫原性をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａおよび合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆにより誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞の相対頻度を比較する。 ＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントにおいて合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、ＬＥＭＤ１Ｆ、およびＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたサイトカインプロファイルを図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａおよび合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆにより誘導されたＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の相対頻度を比較する。 ｐＧＸ１４３１、ｐＧＸ１４３２、およびｐＧＸ１４３３によりＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋において誘導されたサイトカインプロファイルを図示する。 ＬＥＭＤ１Ａ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３１）、ＬＥＭＤ１Ｆ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３２）、およびＬＥＭＤ１ＡＦ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３３）により誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 ＬＥＭＤ１Ａ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３１）、ＬＥＭＤ１Ｆ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３２）、およびＬＥＭＤ１ＡＦ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３３）により誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 ＬＥＭＤ１Ａ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３１）、ＬＥＭＤ１Ｆ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３２）、およびＬＥＭＤ１ＡＦ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３３）により誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度をグラフにより図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａおよび合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆにより誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対頻度を比較する。 ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントにおける合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、ＬＥＭＤ１Ｆ、およびＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導されたサイトカインプロファイルを図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 それぞれ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａ、合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆ、および合成コンセンサスＬＥＭＤ１ＡＦにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の細胞溶解能力をグラフにより図示する。 合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ａおよび合成コンセンサスＬＥＭＤ１Ｆにより誘導されたＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の相対頻度を比較する。 ＬＥＭＤ１Ａ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３１）、ＬＥＭＤ１Ｆ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３２）、およびＬＥＭＤ１ＡＦ（合成コンセンサスｐＧＸ１４３３）によりＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋において誘導されたサイトカインプロファイルを図示する。

Claims (42)

  1. 核酸分子であって、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８をコードする核酸配列、
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４をコードする核酸配列、
    （ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１をコードする核酸配列、
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
    （ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
    （ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
    （ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９６％超同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
    （ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９６％超同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
    （ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、
    （ｊ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、
    （ｋ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、ならびに
    （ｌ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  2. 核酸分子であって、
    （ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００、
    （ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８、
    （ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９、
    （ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｅ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｆ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｇ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である断片、
    （ｈ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である断片、
    （ｉ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である断片、
    （ｊ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｋ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに
    （ｌ）配列番号１のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
  3. 配列番号１、３、または５に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  5. 前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項４に記載のベクター。
  6. 前記核酸分子が、プロモーターおよびポリ−アデニル化シグナルから選択される調節要素に動作可能に連結される、請求項４に記載のベクター。
  7. 前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である、請求項６に記載のベクター。
  8. 前記ポリ−アデニル化シグナルが、ウシ成長ホルモンポリ−アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である、請求項６に記載のベクター。
  9. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸分子または請求項５〜８のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。
  10. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
  11. タンパク質であって、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８、
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４、
    （ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１、
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９６％超同一であるアミノ酸配列、
    （ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９６％超同一であるアミノ酸配列、
    （ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
    （ｊ）配列番号２のアミノ酸配列１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｊ）配列番号４のアミノ酸配列１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに
    （ｊ）配列番号６のアミノ酸配列１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  12. 配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
  13. 抗原を含むワクチンであって、前記抗原が、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８、
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４、
    （ｃ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１、
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｅ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｇ）配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列、
    （ｈ）配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列、
    （ｉ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
    （ｊ）配列番号２のアミノ酸配列１９〜１９８と９５．６％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｋ）配列番号４のアミノ酸配列１９〜８４と９５．５％超同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに
    （ｌ）配列番号６のアミノ酸配列１９〜１９８ならびに２０６および２７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ワクチン。
  14. 前記抗原が、
    （ａ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００、
    （ｂ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８、
    （ｃ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９、
    （ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｅ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｆ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９を含む全長の核酸分子の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｇ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である断片、
    （ｈ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である断片、
    （ｉ）配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である断片、
    （ｊ）配列番号１のヌクレオチド５５〜６００と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、
    （ｋ）配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片、ならびに
    （ｌ）配列番号１のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９と少なくとも９５％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項１３に記載のワクチン。
  15. 核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、配列番号１、３、または５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９５％の同一性を有する核酸配列を含む、ワクチン。
  16. 核酸分子を含むワクチンであって、前記核酸分子が、それぞれ、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５．６％、９５．５％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ワクチン。
  17. 前記核酸分子が、発現ベクターを含む、請求項１５または１６に記載のワクチン。
  18. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のワクチン。
  19. アジュバントをさらに含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載のワクチン。
  20. 前記アジュバントが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳである、請求項１９に記載のワクチン。
  21. ペプチドを含むワクチンであって、前記ペプチドが、それぞれ、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９５．６％、９５．５％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ワクチン。
  22. ペプチドを含むワクチンであって、前記ペプチドが、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列を含む、ワクチン。
  23. ＬＥＭＤ１発現がん性細胞を有する対象の治療方法であって、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の治療有効量のワクチンを投与することを含む、方法。
  24. 投与が、電気穿孔ステップを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 投与が、前記対象の１つ以上の部位で生じる、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 対象へのＬＥＭＤ１発現がん性細胞のワクチン接種方法であって、液性免疫応答を誘導するのに有効な量の請求項１３〜２２のいずれか一項に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
  27. 薬剤として使用するための、配列番号１、３、または５に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  28. 薬剤として使用するための、配列番号１のヌクレオチド５５〜６００に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  29. 薬剤として使用するための、配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  30. 薬剤として使用するための、配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  31. がんの治療において薬剤として使用するための、配列番号１、３、または５に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  32. がんの治療において薬剤として使用するための、配列番号１のヌクレオチド５５〜６００に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  33. がんの治療において薬剤として使用するための、配列番号３のヌクレオチド５５〜２５８に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  34. がんの治療において薬剤として使用するための、配列番号５のヌクレオチド５５〜５９４および６１６〜８１９に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
  35. 薬剤の調製において使用するための、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
  36. 薬剤の調製において使用するための、配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
  37. 薬剤の調製において使用するための、配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
  38. 薬剤の調製において使用するための、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
  39. がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、配列番号２、４、または６に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
  40. がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、配列番号２のアミノ酸残基１９〜１９８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
  41. がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、配列番号４のアミノ酸残基１９〜８４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
  42. がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１９８および２０６〜２７１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
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