JP2021502822A - ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子送達のための非ヒトパピローマウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、真核細胞又は細胞株における発現のためにコドン最適化された少なくとも1つのパピローマキャプシドタンパク質を含む非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子、並びに、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子と、診断剤、造影剤、及び治療剤からなる群から選択される薬剤とを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、医薬として使用するための、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子に関する。本発明はさらに、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成する方法であって、（a）真核細胞における発現のために非ヒトパピローマウイルスのキャプシドタンパク質をコドン最適化するステップ；（b）配列を合成し、合成した配列を発現ベクターへクローニングするステップ；並びに（c）非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成するステップを含む方法を包含する。最後に、本発明は、in vitroでの非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の形質導入増強剤としてのι-カラギーナンの使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、真核細胞又は細胞株における発現のためにコドン最適化された少なくとも1つのパピローマキャプシドタンパク質を含む非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子、並びに、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子と、診断剤、造影剤、及び治療剤からなる群から選択される薬剤とを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、医薬として使用するための、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子に関する。本発明はさらに、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成する方法であって、（a）真核細胞における発現のために非ヒトパピローマウイルスのキャプシドタンパク質をコドン最適化するステップ；（b）配列を合成し、合成した配列を発現ベクターへクローニングするステップ；並びに（c）非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成するステップを含む方法を包含する。最後に、本発明は、in vitroでの非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の形質導入増強剤としてのι-カラギーナンの使用に関する。

遺伝子ワクチンとしての核酸の使用にはいくつかの利点があるが、最も重要なのは、迅速な生成、簡単な適応及び周囲温度における高い安定性である。さらに、ワクチン接種を受けた細胞自体がコードされた抗原を発現するため、タンパク質の正しい翻訳後修飾及びフォールディングが保証されている。DNAワクチンによる免疫処置は、体液性免疫と細胞性免疫の両方を活性化するため、遺伝子ワクチンは強力なプラットフォームとなる。裸のDNAの筋肉内注射は、げっ歯類においては、程よい（reasonable）細胞取り込みとその後の発現につながるが、より大きな動物、特に非ヒト霊長類においては、プラスミドDNAの取り込みを強化するために追加の刺激が必要となる。

DNAの取り込みを強化する最も強力な方法の1つは、エレクトロポレーションの使用である。エレクトロポレーションは非常に効果的だが、侵襲的で痛みを伴う手順であり、局所麻酔と特別な装置の存在が必要となる。

他の送達方法には、圧力インジェクター及び遺伝子銃などの物理デバイス、並びにブロック共重合体、カチオン性リポソーム及びポリエチレンイミンなどの化学製剤が含まれる。

さらに、遺伝子キャリアとしての細菌及びウイルスの適用が探索されており、ヒトパピローマウイルスはその1つである。パピローマウイルスを使用した遺伝子送達は、他の、より一般的に使用されているウイルスと同様の問題、つまりベクターに対する免疫（vector immmunity）の問題に直面する。ヒトパピローマウイルス（HPV）、特に16型は遺伝子送達担体として非常によく機能するが、異なるパピローマの型のウイルス様粒子（VLP）もますますHPVに対するワクチンに加わってきている。2014年12月にFDAによって承認されたMerckの「Gardasil 9」には、HPV6、11、16、18、31、33、45、52、及び58型のVLPが含まれている。そのため、これらのパピローマウイルス型を、Gardasil 9ワクチン接種を受けた者において遺伝子キャリアとして適用することはできない。ワクチン誘導性のHPVに対する免疫に加えて、自然感染が非常に頻繁に発生するため、一般集団への遺伝子ワクチンの送達にHPVを確実に適用することは困難である。

上記を踏まえると、パピローマウイルスによる核酸の導入のための効果的かつ安全な手段及び方法の開発に対する継続的な要求が存在する。

本発明の根底にある技術的課題は、前述のニーズを満たすための手段及び方法の提供と考えられる。

前記技術的課題は、特許請求の範囲及び本明細書の以下で特徴付けられる（characterized）実施形態によって解決される。

本発明は、真核細胞又は細胞株における発現のためにコドン最適化された少なくとも1つのパピローマキャプシドタンパク質を含む、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子に関する。

本発明者らは、以下の実施例に示されるように、非ヒトパピローマウイルス様粒子（VLP）及びシュードビリオン（PsV）のin vitroでの生成、並びにそれらがin vitro及びin vivoにおいてレポータープラスミドを送達する能力を探索した。以下の表３に示す10種類の非ヒトパピローマウイルスのキャプシドタンパク質L1及びL2の公開された配列を、ヒト細胞株での発現用にコドン最適化して合成し、発現ベクターにクローニングした。VLPとPsVは、わずかな変更を加えたBuck et. alのプロトコル(C. Buck, D. Pastrana, D. Lowy, J. Schiller, Human Papillomaviruses, C. Davy, J. Doorbar, Eds. (Humana Press, 2006), vol.119, pp. 445-462)に従って生成した。ピューマパピローマウイルス1（PcPV1）及びカニクイザルパピローマウイルス11型、分離株Mac1637（MfPV11）からのVLP及びPsVを、in vitroにおいて効率的な遺伝子ベクターとして特定できた。さらに、ピューマパピローマウイルス1（PcPV1）からのPsVを、in vivoでの効率的な送達ベクターとして見出すことができた。これらの知見は、遺伝子送達及び遺伝子治療、並びに治療、診断及びワクチン接種の方法のために、幅広く非ヒトパピローマウイルスを探索する価値があることを示している。

非ヒトパピローマウイルスは、そのいくつかの特性、例えばノンエンベロープであることによる安定性、特定のパッケージング配列を必要とせずに外来DNAをパッケージングする能力及び、パピローマウイルス型によっては、粘膜組織に感染する能力、によってDNA送達ベクターとして興味深い候補となる。さらに、前記ウイルスキャプシドは、自然免疫系を刺激することによって、ある程度のアジュバント効果をもたらし得る。ノンエンベロープウイルスであるパピローマウイルスは、さらに、エンベロープウイルスよりも安定である。

2013年に、260の異なるパピローマウイルス型、うち148はヒト、が同定された(A. Rector and M. van Ranst, Animal papillomaviruses, Virology. 445, 213-223 (2013), doi:10.1016/j.virol2013.05.007)。

現在までに、112の異なる非ヒトパピローマウイルス型においてゲノムの特徴が決定され（genomically characterized）、GenBankで入手可能であり、A. Rector and M. van Ranst（2013）による前記刊行物の表１に対応する下記の表１に一覧表で示した。112の異なる非ヒトパピローマウイルス型は32の異なる属にわたって分布し、残ったガンマパピローマウイルス、ミューパピローマウイルス、及びニューパピローマウイルス属のみがHPV型だけを含む（A. Rector and M. van Ranst（2013）の刊行物の図１参照）。カニクイザル、ウシ、イヌなどのいくつかのよく研究された脊椎動物種では、多数のパピローマウイルス型がすでに発見されており（それぞれ、MfPV1からMfPV11、BPV1からBPV13及びCPV1からCPV15。A. Rector and M. van Ranst（2013）の刊行物の表１参照）、このことは、非ヒト脊椎動物種も、種固有のパピローマウイルス型の独自の組み合わせを持っている可能性があることを示している。

超遠心分離による精製後の画分のウエスタンブロット。 異なる非ヒトパピローマシュードビリオン（PsV）によるHEK293TT細胞の形質導入72時間後のルシフェラーゼアッセイ。 MfPV11及びPcPV1 VLPの透過型電子顕微鏡観察。 HEK293TT細胞の形質導入によるPsVの力価測定。 PcPV1及びMfPV11による形質導入に対するι-カラギーナンの効果。 筋肉内投与後の生物発光イメージング。

本明細書で使用される「非ヒトパピローマウイルス」という用語は、以下の表１に示す112の異なる非ヒトパピローマウイルス型の一つ、好ましくは表２の非ヒトパピローマウイルス、より好ましくは表３の非ヒトパピローマウイルスを指す。

本明細書で言及される「ウイルス様粒子」（VLP）という用語は、1種類又は複数種類のウイルス構造タンパク質によって形成される自己組織化超分子構造を意味する。多くのVLPは、親ウイルスの物理化学的特性を共有しているが、複製のための遺伝情報を含む遺伝情報を全く持っていない。これらの性質は、遺伝情報又は薬剤有効成分（active drug substances）の特定の細胞型への標的化送達、並びに効果的な抗体応答の誘導のためにB細胞へ目的の抗原送達することに利用することができる。例えば、本明細書の他の箇所で詳述するように、VLPはウイルスのキャプシドタンパク質の発現により実験によって（experimentally）生成することができる。VLPは、例えば、in vitro若しくはin vivoでの遺伝子送達のために、又は例えば本明細書において以下に記載するように、診断、造影、治療若しくはワクチン接種のための医薬組成物の開発のために使用され得る。

本明細書で使用される「非ヒトパピローマシュードビリオン又はシュードウイルス（PsV）」又は「非ヒトパピローマシュードビリオン又はシュードウイルス（PsV）粒子」という用語は、キャプシド内部にパッケージングされたプラスミドDNAをさらに含むウイルス様粒子を示す。このプラスミドDNAは目的の任意のタンパク質をコードすることができ、それは例えばワクチン接種のための抗原が、PsVによって送達された後、標的細胞によって発現することを意味する。

本明細書で言及される「ペプチド又はタンパク質」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基からなる分子に関する。いくつかの、通常少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50又は少なくとも60アミノ酸からなり、それらがペプチド結合により互いに共有結合しているペプチドは、一般にポリペプチドと呼ばれる。ペプチド結合によって共有結合された20未満のアミノ酸からなる分子は、通常ペプチドと見なす。

本明細書で使用される「キャプシドタンパク質」という用語は、キャプシドタンパク質L1及び/又はL2を指す。パピローマウイルスのゲノムは、初期領域（E）（ここは6つのオープンリーディングフレーム（ORF）E1、E2、E4、E5、E6、及びE7をコードしており、これらは宿主細胞への初期感染直後に発現する）、並びに主要キャプシドタンパク質L1と副キャプシドタンパク質L2をコードしている後期領域（L）に分けられる。全てのウイルスORFは1本のDNA鎖にコードされている。適切な細胞においてキャプシドタンパク質L1及び/又はL2が発現すると、本明細書で定義されるようなウイルス様粒子（VLP）又は非ヒトパピローマシュードビリオン（PsV）の形成が可能になる。キャプシドタンパク質L1及び/又はL2は、本明細書の他の箇所で説明するように、真核細胞又は細胞株、例えばヒト細胞又は細胞株、における発現のためにコドン最適化している。非ヒトパピローマウイルスの多くのL1及びL2キャプシドタンパク質の野生型配列は、当技術分野で記載されており、例えばGenBankで入手可能である。例えば、本出願の表１、２及び３は、L1及びL2キャプシドタンパク質をコードする配列を含む、好ましい非ヒトパピローマウイルスのゲノムに対応するアクセッション番号を提供する。以下の実施例において、表３に示される10の非ヒトパピローマウイルスのキャプシドタンパク質L1及びL2を、ヒト細胞株における発現のためにコドン最適化して生成し、発現ベクターにクローニングした。

本明細書で使用される「コドン最適化パピローマキャプシドタンパク質」という用語は、Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183: p. 1-12.に定義されているように、真核細胞又は細胞株、例えばヒト細胞又は細胞株、における発現のために、同一の翻訳配列を有するが別のコドン用法での配列に変換された非ヒトパピローマキャプシド遺伝子L1又はL2を示す。

遺伝子又はコドンの最適化は、遺伝暗号の縮重を利用している。縮重のため、1つのタンパク質が多くの別の核酸配列によってコードされ得る。コドン優先度（コドン使用バイアス）は生物ごとに異なり、このことにより異種発現系で組み換えタンパク質を発現させる際に困難が生じ、その結果、低く不確かな発現になる可能性がある。

ヒト細胞での発現のためのコドン最適化の方法論は、以下のように要約できる：
（i）適切なオープンリーディングフレームのコドン配置を特定する。
（ii）野生型コドンをヒト遺伝子おいて観察される使用頻度と比較する。
（iii）コドンが最も汎用されているものでない場合は、ヒト細胞での高発現に最適なコドンに置き換える。
（iv）遺伝子セグメント（segment）全体が置き換えられるまで、この手順を繰り返す。
（v）これらのコドン置き換えによって生じた望ましくない配列（例えば「ATTTA」配列、意図しないイントロンスプライス認識部位の生成、不要な制限部位など）について新しい遺伝子配列を点検し、これらの配列をなくすようにコドンを置換する。
（vi）合成遺伝子セグメントを集め（Assemble）、発現の改善を試験する。

配列のコドン最適化のための方法及びツールは、当技術分野で十分に説明されている；例えば以下を参照：米国特許第8,326,547号；Ternette N., et al., Virology Journal 2007, Expression of RNA virus proteins by RNA polymerase II dependent expression plasmids is hindered at multiple steps. https://doi.org/10.1186/1743-422X-4-51；Haas J, Park EC, Seed B: Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope glycoprotein. Curr Biol 1996, 6: 315-324. 10.1016/S0960-9822(02)00482-7；Wagner R, Graf M, Bieler K, Wolf H, Grunwald T, Foley P, Uberla K: Rev-independent expression of synthetic gag-pol genes of human immunodeficiency virus type 1 and simian immunodeficiency virus: implications for the safety of lentiviral vectors. Hum Gene Ther 2000, 11: 2403-2413. 10.1089/104303400750038507；又はMorton CJ, Cameron R, Lawrence LJ, Lin B, Lowe M, Luttick A, Mason A, Kimm-Breschkin J, Parker MW, Ryan J, Smout M, Sullivan J, Tucker SP, Young PR: Structural characterization of respiratory syncytial virus fusion inhibitor escape mutants: homology model of the F protein and a syncytium formation assay. Virology 2003, 311: 275-288. 10.1016/S0042-6822(03)00115-6。

当業者に理解されるように、同じタンパク質配列をコードする別のコドンの使用は、ヒト細胞又は細胞株などの真核細胞又は細胞株における非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質L1及び/又はL2の発現に対する制約を取り除く。

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスベクター、例えば非ヒトパピローマウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなど、並びに人工染色体、例えば細菌又は酵母人工染色体などを包含する。さらに、この用語はまた、ターゲティングコンストラクトのゲノムDNAへのランダム又は部位特異的な組み込みを可能にするターゲティングコンストラクトにも関する。そのようなターゲティングコンストラクトは、一態様では、当技術分野で知られているように、相同組み換え又は異種組み換えのいずれかのために十分な長さである目的のDNAを含む。一態様では、ベクターは、宿主細胞における増殖及び/又は選別のための選択可能な（selectable）マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野で周知の様々な技術によって宿主細胞に組み込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物若しくは塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物、荷電脂質との複合体、又はフラーレンなどの炭素系クラスターによって導入することができる。あるいは、プラスミドベクターは、熱ショック又はエレクトロポレーション技術によって導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、宿主細胞への適用前に、適切なパッケージング細胞株を使用してin vitroでパッケージングしてもよい。レトロウイルスベクターは複製能力があるものでも、複製欠損があるものでもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は一般に、補完する（complementing）宿主/細胞（host/cells）においてのみ起こる。

本明細書で言及される「真核細胞又は細胞株」という用語は、非ヒトパピローマウイルスによる感染又は形質導入への感受性のある真核細胞又は真核細胞株由来の細胞を意味し、例えば、酵母（例えば、S.セレビシエ）、昆虫細胞（例えば、Sf9若しくはSf21）、哺乳動物細胞（例えば、P19、NIH 3T3若しくはCHO細胞）、又はヒト細胞（例えば、HEK293、HT-1080若しくはHeLa細胞）などが挙げられる。真核細胞又は細胞株及びそれらの培養条件は、当技術分野で十分に説明されている。

本明細書で言及される「ヒト細胞又は細胞株」という用語は、非ヒトパピローマウイルスによる感染又は形質導入への感受性のあるヒト細胞又はヒト細胞株由来の細胞を意味する。当技術分野で知られているように、形質導入とは、ウイルス又はウイルスベクターによって外来DNAを細胞内に導入するプロセスである。「細胞」という用語は、ヒト由来の、例えば粘膜又は皮膚細胞などの様々な細胞型由来の細胞を包含するが、不均一な細胞集団、ヒト組織又は個体（organism）から単離されてもよいし、あるいはその一部でもよい。ヒトの胚細胞は本発明の範囲から除外されることを理解されたい。本開示の態様は、一部、確立された細胞株からの細胞を含む。本明細書で使用する場合、「確立された細胞株」という用語は、「不死の細胞株」又は「形質転換された細胞株」と同義であり、ヒトの個体、組織又は器官供与源に由来する細胞集団から無期限増殖のために選択された細胞の細胞培養物を指す。定義により、初代細胞の細胞培養物は確立された細胞株から除外する。本明細書で使用する場合、「初代細胞」という用語は、新鮮なヒトの組織又は器官から直接回収した細胞であり、無期限に増殖する能力はない。確立された細胞株は、不均一な細胞集団又は均一な細胞集団を含むことができる。単一の細胞に由来する確立された細胞株は、クローン細胞株と呼ぶ。本明細書で言及されるパピローマキャプシドタンパク質は、真核細胞又は細胞株、例えば、酵母（例えば、S.セレビシエ）、昆虫細胞（例えば、Sf9若しくはSf21）、哺乳動物細胞（例えば、P19、NIH 3T3若しくはCHO細胞）又はヒト細胞（例えば、ヒト腎臓上皮細胞、HEK293、HT-1080若しくはHeLa細胞）における発現のためにコドン最適化している。ヒト細胞株は、例えば、HEK293T又はHEK293FTであり得る。

本明細書で使用される「含む（comprising）」、「含む（comprises）」及び「含む（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」又は「含む（containing）」、「含む（contains）」と同義で、包括的又は非限定であり、追加の不特定の構成物、要素、又は方法ステップを排除するものではない。明らかに、「含む」という用語は「からなる」という用語を包含する。より具体的には、本明細書で使用される「含む」という用語は、特許請求の範囲（the claim）が、列挙された要素又は方法ステップの全てを包含するが、追加の不特定の要素又は方法ステップをも含み得ることを意味している。例えば、ステップ（a）、（b）及び（c）を含む方法は、その最も狭い意味では、ステップ（a）、（b）及び（c）からなる方法を包含する。「からなる」という句は、組成物（又は装置、又は方法）が、列挙された要素（又はステップ）を有し、それ以上を有さないことを意味する。対照的に、「含む」という用語は、ステップ（a）、（b）及び（c）に加えて、さらなるステップ、例えばステップ（d）及び（e）を含む方法をも包含することができる。

本明細書で使用される「in vitro」という用語は、動物又は人体の外部又は外側（external to）を示す。本明細書で使用される「in vitro」という用語は、「ex vivo」を含むと理解されるべきである。「ex vivo」という用語は、一般的には、動物又は人体から取り出され、体外、例えば培養容器内で維持又は増殖する組織又は細胞を指す。本明細書で使用される「in vivo」という用語は、動物又は人体の内部又は内側を示す。好ましくは、本発明の方法はin vitroでの方法である。

本明細書で使用、記載した項目、数、割合%（percentage）、又は用語の値を定める場合、「約」という用語は、その記載した項目、数、割合%（percentage）、又は用語の値のプラス又はマイナス10パーセント、9パーセント、8パーセント、7パーセント、6パーセント、5パーセント、4パーセント、3パーセント、2パーセント、又は1パーセントの範囲を指す。好ましくはプラス又はマイナス10パーセントの範囲である。

値又は数又は量又は集団が統計的に有意であるかどうかは、さまざまな周知の統計評価方法、例えば信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、Mann-Whitney検定などを使用して、当業者によって格別の負担なく決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に記載されている。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、又は0.001である。好ましくは、本発明によって想定される確率は、特定のコホートの対象の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%に対して評価が正しいことを許容する（allow）。

本発明の非ヒトパピローマウイルスキャプシド構造、VLP及びPsVは、当技術分野で記載されている方法によって（例えば、C. Cerqueira et al., Efficient Production of Papillomavirus Gene Delivery Vectors in Defined In Vitro Reactions, Molecular therapy. Methods & clinical development. 5, 165-179 (2017), doi:10.1016/j.omtm.2017.04.005；Q. Zhao et al., Disassembly and reassembly of human papillomavirus virus-like particles produces more virion-like antibody reactivity, Virology journal. 9, 52 (2012), doi:10.1186/1743-422X-9-52；Buck, C., et al (2006a). Generation of HPV Pseudovirions Using Transfection and Their Use in Neutralization Assays. Human Papillomaviruses, C. Davy and J. Doorbar, eds. (Humana Press), pp. 445-462, doi: 10.1385/1-59259-982-6:445；WO 2011/039646；US6,416,945；US6,991,795及びUS7,205,126参照）、又は以下の実施例で実証されているように生成することができる。

簡単に説明すると、L1及び/又はL2などの非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質をコードするDNA配列は、まず、真核細胞又は細胞株などの所望の細胞又は細胞株における発現のためにコドン最適化し、合成する。

次に、コドン最適化されたL1及び/又はL2のDNA配列を、適切な哺乳動物発現ベクター、例えばpIRES及びpBApoベクター（Clontech）、pVITRO及びpVIVOベクター（Invivogen）、pcDNAベクター（Invitrogen）又は当技術分野で周知の他の市販の哺乳動物発現ベクターなどのマルチクローニングサイトにクローニングする。コドン最適化された非ヒトパピローマのL1及び/又はL2キャプシドDNA配列は、上記ベクター中の、原核又は真核宿主細胞又はその単離された分画における発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結されている。前記コドン最適化非ヒトパピローマL1及び/又はL2キャプシドDNA配列をコードするポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なmRNAへのDNA配列の転写反応を含む。宿主細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当技術分野で周知である。一態様では、それらは、転写の開始を確実にする調節配列、並びに/又は、転写の終結及び転写物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。追加の調節エレメントとして、転写及び翻訳エンハンサーが挙げられる。原核宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントとして想定される（Possible）ものには、例えば、大腸菌におけるlac-、trp-又はtac-プロモーターが含まれ、真核宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1-若しくはGAL1-プロモーター、又は哺乳動物及び他の動物細胞におけるCMV-、SV40-、RSV-プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサー若しくはグロビンイントロンである。さらに、本明細書で言及される発現ベクターにおいて、誘導性発現制御配列を使用してもよい。そのような誘導可能なベクターには、tet又はlacオペレーター配列、又は熱ショック若しくは他の環境因子によって誘導可能な配列が含まれてもよい。適切な発現制御配列は当技術分野で周知である。転写の開始に関与するエレメントの他に、そのような調節エレメントとして、例えばSV40-ポリ-A部位又はtk-ポリ-A部位などの転写終結シグナルをポリヌクレオチドの下流に含んでもよい。前記のように、適切な発現ベクターは当技術分野で知られている（例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pBluescript（Stratagene）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogen）又はpSPORT1（Invitrogen）など）。本明細書で言及されるコドン最適化非ヒトパピローマL1及び/又はL2キャプシドタンパク質を構築及び発現するためには、当業者に周知の方法を使用することができる。たとえば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. 及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載の技術を参照。

非ヒトパピローマウイルス様粒子（VLP）又はシュードビリオン（PsV）の生成においては、本明細書で定義される適切な真核細胞又は細胞株に、コドン最適化非ヒトパピローマL1及び/又はL2のDNA配列の発現を可能にする発現ベクターをトランスフェクションする。トランスフェクションには、ポリエチレンイミン、リポフェクタミン、DEAE-デキストラン、デンドリマー、ポリブレン、リン酸カルシウム、リポフェクチン、DOTAP、リポフェクタミン、CTAB/DOPE、DOTMA、エレクトロポレーション、又は当技術分野で記載されている他のトランスフェクション法を使用できる。レポーター遺伝子又はレポータープラスミドは、形質導入効率の測定に使用できる。トランスフェクション効率は、例えば、様々なPCR法、ウエスタンブロット解析、レポーター遺伝子アッセイ、又は当技術分野で知られるさらに他の方法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Volumes 1, 2 and 3；J.F. Sambrook and D.W. Russell, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）によって評価することができる。

VLP及びPsVの回収は、以下の実施例で説明するようにBuck et. al（C. Buck, D. Pastrana, D. Lowy, J. Schiller, Human Papillomaviruses, C. Davy, J. Doorbar, Eds. (Humana Press, 2006), vol. 119, pp. 445-462）の標準プロトコルに従って、ただし必要に応じて変更を加えて、トランスフェクション後に行うことができる。たとえば、リポフェクタミンの代わりにポリエチレンイミンをトランスフェクションに使用してもよい。さらに、OptiPrepの代わりに、Percollを精製用の超遠心分離媒体として使用してもよい。

非ヒトパピローマウイルスキャプシド構造、VLP及びPsVの形成は、当技術分野で公知の方法（C. Cerqueira et al., Efficient Production of Papillomavirus Gene Delivery Vectors in Defined In Vitro Reactions, Molecular therapy. Methods & clinical development. 5, 165-179 (2017), doi:10.1016/j.omtm.2017.04.005；Q. Zhao et al., Disassembly and reassembly of human papillomavirus virus-like particles produces more virion-like antibody reactivity, Virology journal. 9, 52 (2012), doi:10.1186/1743-422X-9-52）により検査（test）することができる。例えば、生成された非ヒトパピローマウイルスVLP又はPsVを、密度勾配超遠心分離により単離及び精製し、その後電子顕微鏡で解析できる。以下の実施例で説明するように、レポータープラスミドを形質導入効率の間接的な証拠として使用してもよい。

いくつかの実施形態では、本発明の非ヒトパピローマウイルス様粒子は、標識化されていてもよいし、あるいはハイブリダイゼーション生成物及び/若しくはキャリアへの結合の検出並びに/又は解析を可能にする他の修飾を含んでもよい。標識化は、当技術分野で周知の様々な技術によって、また、使用する標識に応じて行うことができる。特に、本発明の非ヒトパピローマウイルス様粒子は、蛍光結合物又はストレプトアビジン表面への結合を可能にするためにビオチン化されてもよい。本発明の文脈で使用される代表的な標識は、特に蛍光色素（例えばR-フィコエリスリン（R-phycoerythrin）、Cy3、Cy5、フルオレセイン（fluorescein）、ローダミン（rhodamin）、Alexa、又はテキサスレッド（Texas Red）など）を含む蛍光標識であるが、これらに限定されない。しかし、標識は酵素又は抗体であってもよい。標識として使用される酵素は、基質と反応することにより検出可能なシグナルを生成する（generate）ことを想定している。適切な酵素、基質及び技術は、当技術分野で周知である。標識として使用される抗体は、直接的に検出可能な標的分子（例えば、それ自体が蛍光性である標的分子）又は間接的に検出可能な標的分子（例えば、酵素などの、検出可能なシグナルを生成する標的分子）を特異的に認識することができる。本発明の非ヒトパピローマウイルス様粒子又はシュードウイルス粒子はまた、5'制限部位（5´ restriction sites）、架橋型核酸分子（LNA）を含み、又はペプチド核酸分子（PNA）の一部であってもよい。そのようなPNAは、原則として、例えば抗体によってペプチド部分を介して検出することができる。本発明の非ヒトパピローマウイルス様粒子が、当技術分野で周知の精製目的で使用される親和性タグ、例えばHisタグ又はFLAGタグ又はそれに類するものを含み得ることはさらに明らかである。

好ましい非ヒトパピローマウイルスの型は、以下の表１、２及び３に挙げられている。好ましくは、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、ピューマ（Puma concolor）パピローマウイルス1（PcPV1）又はカニクイザル（Macaca fascicularis）パピローマウイルス11型、分離株Mac1637（MfPV11）由来のものである。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の好ましい実施形態では、真核細胞又は細胞株における発現のためにコドン最適化されたパピローマキャプシドタンパク質は、L1及び/又はL2である。本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、キャプシドタンパク質L1、キャプシドタンパク質L2、又はキャプシドタンパク質L1及びキャプシドタンパク質L2の両方を含み得る。さらに好ましい実施形態では、本発明の非ヒトパピローマウイルス様粒子がキャプシドタンパク質L1を含むか、又は、本発明の非ヒトパピローマウイルス様粒子又はシュードウイルスがキャプシドタンパク質L1及びL2を含む。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子における別の好ましい実施形態では、パピローマキャプシドタンパク質が、アカウミガメ（Caretta caretta）パピローマウイルス1、アビシニアコロブス（Colobus guereza）パピローマウイルス1、チンパンジー（Common chimpanzee）パピローマウイルス1、ブチハイエナ（Crocuta crocuta）パピローマウイルス1、カニクイザル（Macaca fascicularis）パピローマウイルス11型、分離株Mac1637、カニクイザルパピローマウイルス6型、分離株Mac39、アライグマ（Procyon lotor）パピローマウイルス1、ピューマ（Puma concolor）パピローマウイルス1、アカゲザル（Rhesus）パピローマウイルス1b型分離株Mac170又はエジプトルーセットオオコウモリ（Rousettus aegyptiacus）パピローマウイルス1型由来である。

本発明の非ヒトパピローマウイルス様粒子のさらに好ましい実施形態では、コドン最適化L1又はL2パピローマキャプシドタンパク質は、以下からなる群から選択される核酸配列によってコードされる：
（a）配列番号1〜20に示される核酸配列；
（b）配列番号21〜40に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；及び
（c）（a）又は（b）の核酸配列と少なくとも40%同一である核酸配列。

本明細書で使用される「核酸」又は「核酸配列」という用語は、一本鎖又は二本鎖DNA分子並びにRNA分子を指す。前記用語には、ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、mRNA、並びに、全ての天然又は人工的に修飾されたそのような分子種の誘導体が包含される。一態様では、核酸は線状の分子でも又は環状の分子でもよい。さらに、本明細書で言及される核酸は、適切な転写及び/又は翻訳に必要な追加の配列、例えば5'-又は3'-UTR配列などを含んでもよい。本明細書の他の箇所に記載するように、本出願で言及される核酸配列には、遺伝暗号の縮重を考慮して、最適化されたコドンを使用する。これにより、例えば、ヒト細胞又は細胞株などの真核細胞又は細胞株における最適な発現を達成することができる。

配列番号21〜40に示されるコドン最適化非ヒトパピローマキャプシドタンパク質L1及びL2をコードする前記特定の核酸配列（配列番号1〜20）に加えて、本出願はまた、コドン最適化非ヒトパピローマキャプシドタンパク質L1及びL2をコードする核酸配列の変異体を提供する。本発明に沿って言及される変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失及び/又は付加によって異なった核酸配列を有し、ここで前記変異体のアミノ酸配列は依然として、前記特定のコドン最適化キャプシドタンパク質をコードする核酸配列と好ましくは少なくとも40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である。2つの核酸又はアミノ酸配列間の同一性の程度は、当技術分野で周知のアルゴリズムによって決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウィンドウにわたって、2つの最適アラインメントされた配列を比較することによって決定するべきであり、ここで、前記比較ウィンドウにおけるアミノ酸配列の断片は、最適なアラインメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（例えば、ギャップ又はオーバーハング（overhangs））を含み得る。好ましくは、アラインメントは、比較する核酸配列全体、又は比較するアミノ酸配列全体にわたる。割合%は、両方の配列で同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が現れる箇所の数を決定することで一致箇所の数を得、一致箇所の数を、比較する範囲内全体の箇所の数で割り、その結果に100をかけて配列同一性の割合（％）を得ることによって計算する。比較のための配列の最適アラインメントは、SmithとWatermanのローカルホモロジーアルゴリズム、NeedlemanとWunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム、PearsonとLipmanの類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピューター制御の実装であるWisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI）のTFASTA、BESTFIT、BLAST、PASTA及びGAP、又は目視検査によって行う。比較のために2つの配列が同定された場合、好ましくはGAP及びBESTFITを使用して最適アラインメントを決定し、こうして同一性の程度を決定する。好ましくは、ギャップ重みについては5.00、ギャップ重み長については0.30のデフォルト値を使用する。さらに、本明細書で言及される変異体には、コドン最適化キャプシドタンパク質又は前記のタイプの変異体をコードする核酸配列の断片が含まれる（但し、これらの断片が本明細書で言及される基本的な免疫学的及び生物学的特性を有する限り）。前記変異体は、本明細書で定義される非ヒトパピローマウイルス様粒子又はPsVを形成することができるものである。

好ましい実施形態では、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、in vitro又はin vivoでの遺伝子送達又は遺伝子導入のためのものである。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子をin vitro及び/又はin vivoで遺伝子送達するために適した手段及び方法は、当技術分野で十分に記載されている（例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y.及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)参照）。

簡単に説明すると、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子に、in vitro又はin vivoでの遺伝子送達のための目的の遺伝子又は核酸を搭載する。例えば、目的の遺伝子とはレポーター遺伝子でもよい。他の場合では、それは細胞にトランスフェクションする核酸配列でもよい。さらに別の場合では、それは、本明細書の他の箇所で定義されるような、対象における遺伝子治療又はワクチン接種に使用される核酸でもよい。トランスフェクション効率の最適化、並びにVLP及びPsVの回収の最適化は、当業者の技量の範囲内である。解析のためには、VLP及びPsVは新しい細胞に導入するのが好ましい。当業者に明らかなように、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子にプラスミドが搭載される場合、前記プラスミドは真核生物の複製起点（SV40起点）を含むものとする。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、ノンエンベロープであることによる安定性、特定のパッケージング配列を必要とせずに外来DNAをパッケージングする能力、及び、パピローマウイルス型によっては、粘膜組織に感染する能力、によってin vitro及び/又はin vivoでのDNA送達ベクターとして興味深い候補である。さらに、前記ウイルスキャプシドは、自然免疫系を刺激することによって、ある程度のアジュバント効果をもたらし得る。

例えば、ヒト腎臓上皮細胞、HEK293T又はHeLa細胞はin vitro遺伝子送達に使用できる。好ましくは、ヒト細胞株はHEK293Tである。HEK-293細胞は、当初、ヒト胎児腎臓ホモジネートを剪断アデノウイルスDNAで処理することによって作製された。HEK293T株は、目的の組み換えタンパク質の産生にも使用できる。組み換えタンパク質の産生は、例えば、ヒト伸長因子1アルファ（EF1）ハウスキーピングプロモーターなどの適切なプロモーターの制御下に目的の遺伝子を配置することによって達成することができる。

in vivoでの遺伝子導入は、例えば、本明細書の他の箇所に記載するように、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒトにおける遺伝子治療又はワクチン接種のために利用され得る。重要なことに、以下の実施例では、マウスにおいて、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の感染部位での炎症や有害反応の兆候は全く見られないことが分かった。

別の好ましい実施形態では、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、標的化ペプチドをさらに含む。「標的化ペプチド」という用語は、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を特定の場所、細胞型、罹患した細胞若しくは組織、又は細胞会合（cell association）に標的化又は導くのに役立つペプチド配列を意味する。標的化ペプチドは特定の標的分子に向けられており、これにより、目的の遺伝子若しくは核酸を担持する、又は本明細書で定義されるような、診断薬、造影剤、治療剤などの薬剤を搭載した非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の、対象の中の特定の場所における濃縮が可能となる。したがって、標的化ペプチドは、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を、in vitro及び/又はin vivoで、特定の組織及び/又は細胞に標的化する。好ましくは、前記標的ペプチドは、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を、in vivoで、動物個体、哺乳動物個体、又は好ましくはヒト個体の1つ以上の特定の部位に導くことができる。コドン最適化非ヒトパピローマL1又はL2キャプシドタンパク質に前記標的化ペプチドを含めるための適切な位置及び適切な標的化ペプチドは、当技術分野で十分に説明されている（例えば、WO2011/039646及びそこで引用されている文献を参照)。

好ましくは、前記標的化ペプチドは、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を、肝細胞、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、血液細胞、脳細胞、腸細胞、幹細胞、喉若しくは鼻の粘膜の細胞、又はがん細胞からなる群から選択されるヒト細胞に導くことができる。

本発明はさらに、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子と、診断剤、造影剤、及び治療剤からなる群から選択される薬剤とを含む医薬組成物に関する。

本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子と、診断剤、造影剤、及び治療剤からなる群から選択される薬剤とを含む混合物を指す。さらに、本発明の医薬組成物は、さらなる成分、例えば、さらなる治療用若しくは補助用成分及び/又は薬学的に許容される担体及び/若しくは希釈剤などをも含んでもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物のそのようなさらなる成分が、緩衝液、希釈剤、安定剤、湿潤剤、医薬担体、追加の医薬有効剤、放出制御剤やそれに類するものでもよい。

好ましくは、本発明の医薬組成物は、医薬として使用されるものである。前記医薬は、神経疾患、脳卒中、虚血、がん、加齢性疾患（age-related disease）、遺伝性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、細菌、ウイルス、真菌若しくは寄生虫による感染症からなる群から選択される疾患若しくは障害を処置及び/又は予防するために適用される。

パピローマウイルス様粒子を含む医薬組成物については、当技術分野で十分に説明されている（例えば、WO2011/039646；US6,416,945；US6,991,795及びUS7,205,126参照）。

本明細書で言及される「診断剤」という用語は、細胞、組織若しくは身体器官（body organ）の機能障害を検出するため、又は細胞、組織若しくは身体器官の組織構造（tissue structure）の異常を検出するために使用される化合物を意味する。診断剤は文献に詳しく記載されている。本明細書で使用される「診断する」という用語は、対象、好ましくはヒト対象が、本明細書で言及される疾患若しくは症状に罹患しているか又は罹患するであろう確率を評価することを指す。当業者によって理解されるように、そのような評価は通常、診断される対象の100%について正しいことを意味するものではない。しかしながら、この用語は、対象のうちの統計的に有意な集団（portion）を、疾患又は症状に罹患していると正しく診断できることを必要とする。ある集団が統計的に有意であるかどうかは、本明細書で上述した方法によって決定することができる。好ましくは、本明細書で言及された疾患に関連する1つ以上の症状を、診断剤を含んだ本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の投与により診断できる。例えば診断剤は、標識化抗体、siRNAなどの標識化核酸、ルシフェラーゼ若しくは他の化学発光剤、バイオマーカー又は放射性核種やそれに類するものであり得る。

本明細書で使用される「造影剤」という用語は、疾患を診断し、疾患の進行をモニターし、治療応答を追跡し、並びに、生理学及び病態生理学の知識を高める（enhancing the knowledge）ためのバイオマーカーを示す。例えば、造影剤には、ポジトロン放出断層撮影法及び単一光子放射型コンピューター断層撮影のトレーサーが含まれる。好ましくは、本明細書で言及された疾患に関連する1つ以上の症状を、造影剤を含んだ本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の投与により造影できる。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス若しくはウイルス様粒子及び造影剤若しくは診断剤を含む医薬組成物は、本明細書で定義されるような対象における疾患若しくは障害を造影又は診断するために使用することができる。

本明細書で言及される「治療剤」という用語は、ある疾患状態において治癒効果を奏することができる遺伝子、物質又は化合物である。本明細書で使用される「処置又は処置する」という用語は、治療剤を含んだ本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の投与による、本明細書で言及された疾患に関連する1つ以上の症状の改善又は除去さえも示す。本明細書において以下に記載するように、改善はまた、疾患の進行を遅延させる又は停止することとしてあらわれ得る。本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子及び治療剤を含む医薬組成物は、本明細書の他の箇所で詳述するように、対象において様々な疾患若しくは障害の予防又は治療に利用できる。本明細書で使用される「予防する」という用語は、疾患又はその少なくとも1つの症状の発症を回避することを指す。本明細書で使用される「治療剤」という用語は、ワクチンを含む。ワクチンとは、特定の疾患に対して能動獲得免疫を提供する生物学的製剤である。ワクチンは通常、疾患の原因となる微生物又はウイルスに似た作用剤（agent）を含み、微生物若しくはウイルスの弱体化若しくは死滅形態、その毒素又はその表面タンパク質の一種から作られることが多い。前記作用剤により体の免疫系が刺激され、前記作用剤を脅威として認識して破壊し、後に遭遇したこれらの微生物やウイルスのいずれかを認識して破壊する。ワクチンは予防的（すなわち、天然若しくは「野生の」病原体による将来の感染の影響を予防若しくは改善する）又は治療的（例えば、がんに対するワクチン）であり得る。ワクチン接種の有効性は広く研究、検証されてきた（例えば、インフルエンザワクチン、HPVワクチン、水痘ワクチン）。世界保健機関（WHO）は、2011年から2020年までの世界ワクチン行動計画で、認可されたワクチンは現在、25の異なる予防可能な感染症について利用可能であると報告している。ワクチンの投与は「ワクチン接種」と呼ばれる。ワクチン接種は感染性疾患を予防する最も効果的な方法であり、ワクチン接種による免疫の普及は、天然痘の世界的な根絶、並びに、ポリオ、はしか及び破傷風などの疾患の世界の大半における制限に大きく寄与している。

本発明によれば、医薬組成物は、好ましくは、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス若しくはウイルス様粒子、及び治療上有効な量の治療剤を含むものとする。本発明の医薬組成物の治療効果及び毒性は、本明細書の他の箇所に記載する標準的な薬学的手順により決定することができる。医薬組成物はさらに、本明細書の他の箇所に記載するような疾患若しくは障害の処置及び/又は予防における使用に適したものとする。望ましい投与方法は以下に記載している。組成物を医薬として製剤化するための製剤及び調剤方法は、当技術分野で周知であり、例えば、所望の組成物を形作るために適切に成分を混合、造粒、圧縮又は溶解することが含まれる。一般的には、治療活性成分を混合し、そして好ましくは、それらを薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤と組み合わせる。さらに、医薬として使用される医薬組成物の製剤は、医薬の品質、薬学的安全性、及び有効性を保証するGMPの要件の下で行われるべきであることは当業者に知られている。

本明細書で使用される「レポーター遺伝子」という用語は、細菌、酵母、昆虫、細胞培養、動物、植物又はヒトにおいて、目的の別の遺伝子の調節配列に接続された遺伝子を意味する。レポーターとしては特定の遺伝子が選択されるが、それは、それらを発現する生物に与える特徴が容易に識別及び測定できるから、又は選択可能なマーカーだからである。レポーター遺伝子は、細胞又は生物集団に、特定の遺伝子が取り込まれたか又は発現したかどうかの指標としてよく使用される。一般的に使用される、視覚的に識別可能な特徴を誘導するレポーター遺伝子は、通常、蛍光及び発光タンパク質を含む。例としては、クラゲ緑色蛍光タンパク質（GFP；それを発現する細胞が青色光の下で緑色に光る）、酵素ルシフェラーゼ（ルシフェリンとの反応を触媒して光を生成する）及びdsRed遺伝子由来の赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。細菌における一般的なレポーターは、タンパク質β-ガラクトシダーゼをコードする大腸菌lacZ遺伝子である。基質類似体X-galを含む培地上で培養すると、前記遺伝子を発現する細菌がこの酵素により青く見える。細菌のレポーターでもある選択可能なマーカーの例は、抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を付与するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子である。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成し、診断剤、造影剤、又は治療剤と共にパッケージングし、場合によりレポーター遺伝子と組み合わせる方法、及び対象へのその標的化送達の方法は文献で十分に記載されている（例えば、Buck, C., et al (2006a). Generation of HPV Pseudovirions Using Transfection and Their Use in Neutralization Assays. Human Papillomaviruses, C. Davy and J. Doorbar, eds. (Humana Press), pp. 445-462, doi: 10.1385/1-59259-982-6:445；US6,416,945；US6,991,795及びUS7,205,126参照）。好ましくは、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、診断剤、造影剤、又は治療剤を含み、場合によりレポーター遺伝子と組み合わせて、医薬組成物又は医薬として製剤化する。

本明細書で使用する「対象」という用語は、昆虫（例えば、ミツバチ）、動物（例えば、げっ歯類（マウス又はラット）、愛玩動物（ネコ、ハムスター、ウサギ、イヌ）、畜産動物（ヒツジ、家禽、ヤギ、ウシ、ウマ））、好ましくは哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類（マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、フクロウサル、ベルベットモンキー、リスザル、及びヒヒ））、より好ましくはヒトに関する。

好ましくは、治療剤は、以下からなる群から選択される：（i）低分子、好ましくは細胞傷害性薬剤；（ii）RNAi核酸；（iii）マイクロRNA；（iv）リボザイム；（v）アンチセンス核酸；（vi）モルフォリノ；（vii）抗体；及び（viii）CRISPR/Cas。治療剤は、2つ以上の言及された化合物の組み合わせでもよい（例えば、少なくとも2つの細胞傷害性薬剤、少なくとも低分子と抗体、少なくとも細胞傷害性薬剤と抗体、少なくともマイクロRNAとアンチセンス核酸との組み合わせ、又は上に挙げた（i）から（viii）のさらに適切な組み合わせなど）。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、治療剤として低分子を含み得る。本明細書で使用される「低分子」という用語は、低分子量の分子に関する。一般的には、低分子は分子量が900ダルトン未満の有機化合物である。低分子には、例えば、小さな二次代謝産物、例としてアルカロイド、脂質、グリコシド、テルペン、テトラピロール、フェナジン、オリゴヌクレオチド、及び小さなペプチド若しくはペプチド様分子などが含まれる。

低分子は、好ましくは細胞傷害性薬剤である。本明細書で言及される「細胞傷害性薬剤」という用語は、がん細胞などの増殖細胞を破壊するために使用される薬物である細胞傷害性薬剤又は細胞増殖抑制剤（細胞傷害性化学療法も含む）を示す。細胞傷害性薬剤は細胞分裂を阻害し、こうしてがん細胞を死滅させる。細胞傷害性薬剤は血流に乗って全身に輸送される。細胞傷害性薬剤は、腫瘍を破壊し、手術若しくは放射線療法の成果を高め、転移を減らし、並びに、がんの症状を緩和するために使用できる。細胞増殖抑制剤は原発腫瘍以外でも効果的であり、検査で検出されなかった小さな腫瘍を破壊することもできる。細胞傷害性薬剤は、健康な組織の細胞を含む全ての分裂細胞に影響を与える。しかし、がん細胞は正常細胞より著しく速く分裂することが多いため、細胞増殖抑制剤に特に感受性がある。正常細胞への影響はそれほど顕著ではなく、健康な細胞は回復もより早い。がん治療における細胞傷害性薬剤の役割は、薬物療法の発達に伴ってやや減少している。しかし、それらは広く使用され続けている。異なる種類の効果を有するいくつかの種類の細胞傷害性薬剤が一緒にがん治療に使用されている。最も一般的な方法は、いくつかの異なる細胞傷害性薬剤の組み合わせを投与することである。化学療法の有効性は、腫瘍の種類、その組成、分布段階（distribution stage）の細胞の割合及び発達率によって異なる。細胞傷害性薬剤は文献に詳しく記載されている。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、治療剤としてリボザイムを含み得る。本明細書で言及される「リボザイム」という用語は、RNA及びDNAの切断及び/又はライゲーション、並びにペプチド結合形成を含む、特定の生化学反応を触媒することができるRNA分子に関する。リボザイムを設計及び構築する方法は当技術分野で公知であり、例えば、de novoの合理的な設計、オリゴヌクレオチド合成及びin vitro転写が含まれる。リボザイムが、プラスミド又はベクターなどの組み換えDNA構築物の一部として細胞に安定的に組み込まれ、又は一過的に細胞に導入され得ることも当技術分野で知られている。そのようなDNA構築物は、エンハンサー、構成的若しくは誘導的プロモーター又はターミネーターなどの追加の調節エレメントを含み得ることが理解されるだろう。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、治療剤として抗体を含み得る。本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリンとも呼ばれ、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方、並びにその断片、例えば、抗原又はハプテンに結合できるFv、Fab及びF(ab)2断片などを含む。本発明はまた、所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列がヒトアクセプター抗体の配列と組み合わされているヒト化ハイブリッド抗体、及び一本鎖抗体を含む。ドナー配列は、通常、少なくともドナーの抗原結合アミノ酸残基を含むが、ドナー抗体の他の構造的及び/又は機能的に関連するアミノ酸残基を含んでもよい。そのようなハイブリッドは、当技術分野で周知のいくつかの方法によって調製することができる。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、治療剤として阻害性RNA分子を含み得る。本明細書で使用される「阻害性RNA分子」という用語は、配列特異的に遺伝子発現を阻害するRNA分子を指す。阻害性RNA分子には、例えば、低分子干渉RNA（siRNA）、低分子ヘアピンRNA（shRNA）及びマイクロRNA（miRNA）が含まれる。阻害性RNA分子は、一般的に、RNA干渉（RNAi）として知られているプロセスを誘導し、相補的配列を持つ標的mRNAの切断及び/又は翻訳阻害を引き起こす。阻害性RNA分子が、相補的標的配列に対して完全又は不完全な塩基対合を示し得ることは当業者に知られている。一般的に、siRNAとshRNAは完全な塩基対形成をし、単一の、特定の標的でのみmRNA切断を誘導する。逆に、miRNAは通常、標的との塩基対合が不完全であり、多くの場合、類似した配列を持つ多くの異なるmRNAの翻訳を阻害する。阻害性RNA分子は、例えば、それぞれの組み換えDNA構築物の導入により細胞内で発現させ、又は化学的に合成することができる。そのようなDNA構築物は、エンハンサー、構成的若しくは誘導的プロモーター又はターミネーターなどの追加の調節エレメントを含み得ることが理解されるだろう。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、治療剤としてアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、DNA及び/又はRNAプロセシングを阻害することができる一本鎖DNA及び/又はRNA分子を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のRNA又はDNA配列に相補的な核酸配列を含む。一般的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列特異的な様式で、それぞれに相補的なオリゴヌクレオチド、DNA又はRNAに結合し、これにより、DNA及び/又はRNAプロセシングを阻害する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNaseHが媒介する分解、翻訳停止、スプライシングの調節を介してmRNAプロセシングを阻害し、又はタンパク質の立体障害を介して作用し得ることが当業者に知られている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計若しくは合成のための手段及び方法は当技術分野で周知であり、例えば、合理的な設計、化学修飾、及び、架橋型核酸（LNA）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計、並びに固相化学合成が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、それぞれの組み換えDNA構築物の導入により細胞内で発現させ、又は化学的に合成することができる。そのようなDNA構築物は、エンハンサー、構成的若しくは誘導的プロモーター又はターミネーターなどの追加の調節エレメントを含み得ることが、当業者には理解されるだろう。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50ヌクレオチド以上の長さを有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はその両方の組み合わせを含み得る。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、治療剤としてモルフォリノを含むことができる。本明細書で使用される「モルフォリノ」という用語は、RNAの塩基対形成面（base-pairing surfaces）の小さな特異的配列への他の分子のアクセスを遮断する分子に関する。一般的には、前記小さな特異的配列は、約25ヌクレオチドの長さを有する。一般に、モルフォリノは、メチレンモルフォリン環の骨格とホスホロジアミデート結合とを含む。また、モルフォリノは一般的に、モルフォリノオリゴマー（MO核酸類似体）及びホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（PMO）としても知られている。モルフォリノは一般的に、ターゲットRNA分子の分解を引き起こさず、立体的な遮断によって作用する。つまり、RNA内の標的配列に結合し、これによって、本来であれば前記RNAと相互作用し得る分子の邪魔をする。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、（CRISPR/Cas）システムを含み得る。CRISPR/Casシステムは、例えばHorvathとBarrangou（Science. 2010 Jan 8;327(5962):167-70. doi: 10.1126/science.1179555）によって概説されている。CRISPR/Casシステム（クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats：CRISPR）及びCRISPR関連タンパク質（CRISPR-associated proteins：Cas））などの操作されたDNA結合分子は、様々な種由来の細胞及び様々なタイプ（type）の細胞でのゲノム編集に広く使用されている。これらの操作型DNA結合分子の配列特異的なDNA結合活性は、他の目的、例えば、転写活性化、転写抑制、クロマチン修飾、ゲノム領域の可視化及び遺伝子座特異的なクロマチンの分離などにも利用できる（Fujita and Fujii, Int J Mol Sci. 2015 Oct; 16(10): 23143-23164；Gaj et al., Trends in Biotechnology 2013, 31, p.397-405）。例えば、CRISPR/Casシステムでは、以前に使用されていた手法よりもはるかに速くマウスゲノムを編集でき、さらに重要なことに、1回の実験で複数の変異を生成（create）できる（Harms et al., Curr Protoc Hum Genet. 2014; 83: 15.7.1-15.7.27.）。

前記医薬組成物により画像化、診断又は処置される疾患は、好ましくは神経疾患、脳卒中、虚血、がん、加齢性疾患、遺伝性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、細菌、ウイルス、真菌若しくは寄生虫による感染症である。

本明細書で使用される「がん」という用語は、異常な細胞の無秩序な増殖を特徴とする疾患に関する。がんには前がん状態だけでなく、顕在化した又は進行した疾患状態も含まれる。がん又は腫瘍の病期の分類、並びに特徴及び症状は、当技術分野で知られており、医学の標準的な教科書、例えば、Stedman又はPschyremblなどで見ることができる。がん細胞は、元の腫瘍部位から移動して遠隔部位に広がる可能性があり、それが播種（dissemination）及び転移（metastasis）形成としても知られることは、当業者に理解されている。がんの例には、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病及び肺がんが含まれる。

本発明による医薬組成物の治療効果及び毒性は、標準的な薬学的手順によって、例えば実験動物において測定することができる。例えば、いわゆるED50は集団の50%において治療上有効な用量を表し、いわゆるLD50は集団の50%において致死的な用量を表す。治療効果と毒性作用の間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表現できる。投与計画は主治医及び臨床的要因によって決定される。医学分野で周知であるように、1人の患者への投与量は、患者のサイズ、年齢、投与する医薬品の特定の製剤、性別、投与の時間と経路、一般的な健康状態及び同時に投与しているその他の薬物など、多くの要因に依存する。経過は定期的な評価によってモニターできる。考慮される受容者（considered recipient）に応じた投与量の調整を予想できるように、処方者又は使用者への取扱説明書に推奨投与量を示すべきである。

別の好ましい実施形態では、治療剤は核酸である。好ましくは、核酸は、遺伝子治療又はワクチン接種のための核酸である。

本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、治療剤として遺伝子治療のための遺伝子を含み得る。当技術分野で周知であるように、遺伝子治療とは、疾患を処置するために個体の細胞及び組織に遺伝子挿入することであり、遺伝性疾患においては、欠陥のある突然変異型の対立遺伝子が機能的なものに置き換えられる。

体細胞遺伝子治療では、治療遺伝子は、配偶子、生殖細胞、配偶子母細胞又は未分化幹細胞以外の任意の細胞に導入される。生殖系列遺伝子治療では、生殖細胞（精子又は卵細胞）を、そのゲノムに機能的遺伝子を導入することによって改変する。生殖細胞を改変すると、その生物の全ての細胞に改変遺伝子が含まれることになる。したがって、前記変化は継承可能であり、後の世代に引き継がれる。ここでは、欠陥のある遺伝子が置き換えられるか、破壊されることを想定している。本発明の医薬組成物を使用する遺伝子治療手法には、網膜疾患であるレーバー先天性黒内障、脈絡膜白血病、X連鎖SCID、ADA-SCID、副腎白質ジストロフィー、慢性リンパ性白血病（CLL）、急性リンパ性白血病（ALL）、多発性骨髄腫、血友病、重症下肢虚血を含む末梢動脈疾患、及びパーキンソン病の治療が含まれるが、これらに限定されない。

あるいは、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、ワクチン接種のためのDNA（又はRNA）を含み得る。「ワクチン」という用語は、本明細書の他の箇所で定義されている。DNAワクチン接種は、遺伝子操作されたDNAを注射することで疾患から防御する技術であり、それによって細胞が直接抗原を産生し、防御免疫応答を引き起こす。DNAワクチンには、従来のワクチンに比べて潜在的な利点があり、これには、より広い範囲の様式の免疫応答を誘導する能力が含まれる。好ましくは、ワクチン接種は呼吸器合胞体ウイルス（Respiratory Syncytial Virus）に対するものである（Grunwald T. et al., 2014. Novel vaccine regimen elicits strong airway immune responses and control of respiratory syncytial virus in nonhuman primates. doi: 10.1128/JVI.02736-13；Kohlmann, R. et al., (2009). Protective efficacy and immunogenicity of an adenoviral vector vaccine encoding the codon-optimized F protein of respiratory syncytial virus. Journal of virology 83, 12601-12610；Ternette, N. et al., (2007). Immunogenicity and efficacy of codon optimized DNA vaccines encoding the F-protein of respiratory syncytial virus. Vaccine 25, 7271-7279；Grunwald T, Ulbert S. 2015 Improvement of DNA vaccination by adjuvants and sophisticated delivery devices: vaccine-platforms for the battle against infectious diseases. doi: 10.7774/cevr.2015.4.1.1.）。

ワクチン接種用の核酸を含む本発明の医薬組成物は、十分安全であるため臨床感染の危険なしに投与でき、有毒な副作用がなく、有効な経路で投与でき、安定であり、並びにワクチン担体との適合性がある。ワクチンは、経口、非経口、皮下、粘膜、静脈内又は筋肉内などの様々な経路で投与することができる。ワクチンは、カプセル、懸濁液、エリキシル、又は液体溶液などの剤形で使用し得る。ワクチンは、免疫学的に許容される担体又はアジュバント、又は他の添加剤と共に製剤化してもよい。ワクチンは、免疫学的防御応答を引き起こすのに十分な治療上有効な量で投与する。ワクチンは単回用量又は複数回用量で投与してもよい。

核酸は、野生型、組み換え型若しくは化学的に合成されたDNA又はRNAであり得る。

遺伝子治療又はワクチン接種のための治療剤としての核酸、及び本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を含む医薬組成物の適切な製剤は、当技術分野で知られている（例えば、WO2011/039646；US6,416,945；US6,991,795及びUS7,205,126参照）。

本発明の医薬組成物の好ましい実施形態では、医薬組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。

本発明による薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と混和可能であり、その受容者に有害ではないという意味で許容可能でなければならない。医薬担体としては、ラクトース、白土（terra alba）、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの、固体、ゲル又は液体担体が挙げられる。さらに、さらなる適切な担体は当技術分野で知られており、例えば、Remington´s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaなどの科学の教科書で見ることができる。

本発明の医薬組成物のさらに好ましい実施形態では、医薬組成物は、筋肉内注射によって、又は皮膚経路を介して投与される。好ましくは、医薬組成物は、筋肉内注射を介して投与されるものとする。

異なる非ヒトパピローマウイルス属の好ましい侵入部位としては皮膚又は粘膜のいずれかである可能性が考えられるため、本発明の医薬組成物の投与経路を選択するときにこれを考慮する必要がある。好ましくは、本発明の医薬組成物は、筋肉内注射によって、又は皮膚経路を介して、さらにより好ましくは、筋肉内注射を介して投与される。治療剤の投与及び投与量は、対象の健康状態及び治療される疾患などの様々な要因に依存することが当業者に知られている。

さらに、本発明は、医薬として使用するための本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子に関する。好ましくは、医薬は、以下からなる群から選択される疾患の治療用である：神経疾患、脳卒中、虚血、がん、加齢性疾患、遺伝性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、細菌、ウイルス、真菌若しくは寄生虫による感染症。

「医薬」及び「医薬組成物」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

別の実施形態では、医薬は遺伝子治療又はワクチン接種のためのものである。

本明細書の上述の定義及び説明は、以下の本発明の方法及び使用に準用する。

本発明はまた、本明細書に記載の治療剤を含む非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を治療上有効な量で対象に投与することを含む、それを必要とする対象における神経疾患、脳卒中、虚血、がん、加齢性疾患、遺伝性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、細菌、ウイルス、真菌若しくは寄生虫による感染症からなる群から選択される疾患を処置及び/又は予防する方法に関する。

さらに、本発明は以下のステップを含む、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成する方法に関する：
（a）真核細胞又は細胞株、好ましくはヒト細胞又は細胞株における発現のために、非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質L1及び/又はL2をコードするDNA配列をコドン最適化するステップ；
（b）ステップ（a）の配列を合成し、合成された配列を発現ベクターへクローニングするステップ；並びに
（c）ステップ（b）の発現ベクターを細胞へトランスフェクトし、それにより非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成するステップ。

本発明のこの方法では、本発明の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子は、まず、本明細書で定義されるように非ヒトパピローマL1及び/又はL2キャプシドタンパク質をコードするDNA配列を、真核細胞又は細胞株、好ましくはヒト細胞又は細胞株における発現のためにコドン最適化することにより生成する。その後、前記配列を合成し、発現ベクター、好ましくは哺乳動物発現ベクターにクローニングする。次に、発現ベクターを、真核細胞又は細胞株、好ましくはヒト細胞又は細胞株などの適切な細胞に導入し、前記細胞又は細胞株において、コドン最適化非ヒトパピローマL1及び/又はL2キャプシドタンパク質の発現、並びに、本発明の非ヒトパピローマウイルス様粒子の産生を行う。好ましい非ヒトパピローマウイルス、キャプシドタンパク質L1及び/又はL2、並びに細胞については、本明細書の他の箇所に示している。

さらに、本発明は、in vitroでの非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の形質導入増強剤としてのι-カラギーナンの使用に関する。

予期せぬことに、PcPV1、PlPV1、CcrPV1及びMmPV1由来の非ヒトパピローマウイルス様粒子を用いて形質導入すると、ι-カラギーナンによって細胞への形質導入効率の増加が誘導されることを本発明者らは見出した。したがって、ι-カラギーナンは、非ヒトパピローマウイルス様粒子（好ましくはPcPV1、PlPV1、CcrPV1及びMmPV1由来）の形質導入を改善するために利用することができる。

本明細書で引用した全ての参考文献は、そのすべての開示内容及び本明細書で特に言及する開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれる。

表
表１：A. Rector and M. van Ranst (2013)の刊行物の表1に対応する。
表１
ゲノムの特徴が決定された非ヒトパピローマウイルスの概要

表２：非ヒトパピローマウイルス及びアクセッション番号

非ヒトパピローマウイルス

(1)フサオネズミカンガルーパピローマウイルス1（NC_014143）
(2)イヌ口腔パピローマウイルス（NC_001619）
(3)ヤギパピローマウイルス1型（NC_008032）
(4)ノロジカ(Capreolus capreolus)パピローマウイルス1（NC_011051）
(5)アカウミガメパピローマウイルス1（NC_011530）
(6)ワタオウサギパピローマウイルス（NC_001541.1）
(7)ワタオウサギパピローマウイルス、ワタオウサギパピローマウイルス(Papillomavirus sylvilagi)a4（AJ404003.1）
(8)ワタオウサギ（ショープ）パピローマウイルス（K02708.1）
(9)ワタオウサギパピローマウイルスHershey株（JF303889.1）
(10)ワタオウサギパピローマウイルスサブタイプb（AJ243287.1）
(11)ブチハイエナパピローマウイルス1（NC_018575）
(12)シカパピローマウイルス（NC_001523）
(13)ウマパピローマウイルス2（NC_012123）
(14)ウマパピローマウイルス-1（NC_003748）
(15)カナダヤマアラシパピローマウイルス1型（NC_006951）
(16)ナミハリネズミ(Erinaceus europaeus)パピローマウイルス（NC_011765）
(17)ヨーロッパヘラジカパピローマウイルス（NC_001524.1）
(18)ナミハリネズミパ(European hedgehog)ピローマウイルス（NC_011765.1）
(19)ハゲノドシャコパピローマウイルス1（NC_013117）
(20)マストミス(Mastomys natalensis)パピローマウイルス（NC_001605）
(21)マルチマンメートラット(Multimammate rat)パピローマウイルス（U01834.1）
(22)ハツカネズミパピローマウイルス1型（NC_014326.1）
(23)カヤネズミパピローマウイルス（NC_008682.1）
(24)ヒツジパピローマウイルス3型分離株Sar1（FJ796965）
(25)コハリイルカパピローマウイルス（AJ238373）
(26)コハリイルカパピローマウイルス（NC_003348）
(27)ジャンガリアンハムスターパピローマウイルス1型（HG939559.1）
(28)アライグマパピローマウイルス1（PlPV-1）（NC_007150）
(29)ティムネオウムパピローマウイルス（NC_003973）
(30)ウサギ口腔パピローマウイルス（NC_002232）
(31)アカゲザルパピローマウイルス1型（M60184.1）
(32)エジプトルーセットオオコウモリパピローマウイルス1型（NC_008298.1）
(33)シャモアパピローマウイルス1（NC_023895）
(34)イノシシパピローマウイルス1型（NC_011280）
(35)ヨーロッパモグラパピローマウイルス分離株Bruges/2009/22（KC460987）
(36)フロリダマナティーパピローマウイルス1（NC_006563）
(37)バンドウイルカパピローマウイルス2（NC_008184）
(38)ホッキョクグマパピローマウイルス1（NC_010739）
(39)ノロジカパピローマウイルス1分離株CcPV-1（EF680235.1）
(40)ピューマパピローマウイルス1（PcPV1）,（AY904723）
(41)アビシニアコロブス(Colobus guereza, Matelaffe)パピローマウイルス1型分離株CgPV1（GU014532.1）
(42)アカゲザルパピローマウイルス1b型分離株Mac170（EF591300.1）
(43)カニクイザルパピローマウイルス6型，分離株Mac39（EF558840.1）
(44)カニクイザルパピローマウイルス11型，分離株Mac1637（GQ227670.1）
(45)チンパンジーパピローマウイルス1（AF020905.1）

表３：本出願の実施例において使用されている非ヒトパピローマウイルス

図面の簡単な説明
図１：超遠心分離による精製後の画分のウエスタンブロット。
生成された全ての非ヒトパピローマPsVを、密度勾配超遠心分離によって精製した。続いて、収集した画分をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースメンブレンにブロットし、L1について調べた。（A）MfPV6、（B）CcrPV1、（C）CcPV1、（D）CgPV1、（E）MmPV1、（F）MfPV11、（G）PcPV1、（H）PlPV1。

図２：異なる非ヒトパピローマシュードビリオン（PsV）によるHEK293TT細胞の形質導入72時間後のルシフェラーゼアッセイ。
50,000のHEK293TT細胞に、超遠心分離によって精製した非ヒトパピローマPsVの画分3〜8を10μl加えることで形質導入した。細胞培養上清を形質導入の72時間後にルシフェラーゼアッセイに使用した。（A）少なくとも2つの独立したPsV調製物による形質導入後に測定した相対光量単位（RLU）。示しているのは、各調製物（one preparation）において最高の形質導入をもたらした画分の平均RLU値。（B）PcPV1及びMfPV11 PsVによる形質導入後の画分3〜8のRLUであり、OptiPrep画分4と6の間のPsVの形質導入の典型的なピークを示している。

図３：MfPV11及びPcPV1 VLPの透過型電子顕微鏡観察。
精製したVLPを、ホルムアルデヒドによって室温で24時間かけて固定し、リンタングステン酸で染色し（contrast）、透過型電子顕微鏡で解析した。PcPV1（A）、MfPV11（B）。

図４：HEK293TT細胞の形質導入によるPsVの力価測定。
HEK293TT細胞に、レポータープラスミドとしてpEGFPを担持する標記のPsVによって形質導入した。形質導入の72時間後、GFP陽性細胞を数え、力価をPsV 1mlあたりの形質導入単位として計算した。各データポイントは1つのPsV調製物を表す（A）。形質導入単位の量をpEGFPレポータープラスミドを担持する粒子の量と比較するために、PsVからDNAを単離し、qPCRで定量した。力価は、1mlあたりのpEGFPプラスミドとして計算した（B）。

図５：PcPV1及びMfPV11による形質導入に対するι-カラギーナンの効果。
G.Lucレポータープラスミドを担持するPcPV1 PsVを用いてHEK293TT細胞を形質導入する直前に、異なる用量のι-カラギーナンを細胞培養培地に添加した。形質導入の72時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。統計解析は、2way ANOVA及びTukeyの多重比較検定によって行った（A）。さらに、HEK293TT細胞を、pEGFPレポータープラスミドを担持するPcPV1及びMfPV11 PsVを用いて10μg/mlのι-カラギーナンの添加あり（+）及び（-）添加なしで形質導入した。GFP陽性細胞を、形質導入の72時間後に数え、形質導入単位を計算した。各データポイントは、1つのPsV調製物による1つの実験を表す。統計解析は、t検定を使用して行った（B）。

図６：筋肉内投与後の生物発光イメージング。
ホタルルシフェラーゼ（F.Luc）レポータープラスミドを担持する0.2μLのPcPV1及びMfPV11 PsVを8000のHEK293TT細胞に添加して形質導入した。72時間後、細胞を溶解し、その溶解液をF.Lucアッセイに使用した（A）。上記で解析した50μlのPsV調製物を左大腿筋に注射した。生物発光イメージングは、注射の約3時間後（0日目）に遊離のF.Lucについて試験するために行い、その後は週1回行った（B）。

本発明を、以下の実施例によって単に例示する。前記実施例は、いかなる場合でも、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきものではない。

実施例１：材料と方法
１．１ 細胞
HEK293TT細胞は、10%ウシ胎児血清（Gibco）、100U/mlペニシリン‐ストレプトマイシン（Gibco）、GlutaMAX及び25mMグルコースを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で維持した。293TT細胞株は、SV40 t抗原の発現増加を達成するために線形化pTIHプラスミドを用いた293T細胞のトランスフェクションによってChristopher N. Buckによって最初に作製された（C. B. Buck, D. V. Pastrana, D. R. Lowy, J. T. Schiller, Efficient Intracellular Assembly of Papillomaviral Vectors, Journal of virology. 78, 751-757（2004）,doi：10.1128/JVI.78.2.751-757.2004）。選別のために、400μg/mlのハイグロマイシン（Santa Cruz）を細胞培養培地に添加した。

１．２ プラスミドの構築及び増幅
パピローマウイルスキャプシドタンパク質L1及びL2をコードするDNA配列は、ヒト細胞での発現用にコドン最適化がなされ、GeneArt（Invitrogen、Regensburg、Germany）によって合成された。L1及びL2配列を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1 +（Invitrogen）のマルチクローニングサイトにクローニングし、2つの配列はIRES配列によって接続している。クローニング及びプラスミド増幅は、大腸菌DH5α（New England Biolabs）で行った。トランスフェクション用のプラスミドは、NucleoBondプラスミドPC500 Maxiprepキット（Macherey Nagel）を使用して調製した。レポータープラスミドとして、pCMV-G.Luc（ガウシアルシフェラーゼレポーター）、pCR-Luc3（ホタルルシフェラーゼレポーター）及びpEGFP（GFPレポーター）を使用した。

１．３ トランスフェクション
非ヒトパピローマウイルス様粒子（VLP）及びシュードビリオン（PsV）の生成では、トランスフェクションの約18時間前に、6×10⁶のHEK293TT細胞を75cm²の細胞培養フラスコに播種した。トランスフェクションミックスは、パピローマウイルスL1及びL2をコードする19μgのプラスミドと19μgのレポータープラスミドを1mlのDMEMに加えることにより調製した。最後に、50μlのポリエチレンイミン（1mg/ml）を加え、調製物を室温で10分間インキュベートした。トランスフェクションミックスを加える前に、細胞培養培地を1.5%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMに交換した。トランスフェクションの約16時間後、培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、完全細胞培養培地を添加した。

１．４ VLP及びPsV回収
VLPとPsVの回収は、いくつかの変更を加えたBuck et al.の標準プロトコル（C. Buck, D. Pastrana, D. Lowy, J. Schiller, Human Papillomaviruses, C. Davy, J. Doorbar, Eds. (Humana Press, 2006), vol. 119, pp. 445-462）に従ってトランスフェクションの約40時間後に行った。簡単に説明すると、追加の9.5mM MgCl₂、10mM HEPES及び25mM硫酸アンモニウムを含むPBSに最終濃度0.5%でTriton-X 100を添加することにより、細胞を溶解した。ベンゾナーゼヌクレアーゼ（最終濃度≧0.25U/μl）及びPlasmid Safeエキソヌクレアーゼ（最終濃度0.01U/μl）を24時間かけて加えて、DNAを分解した。ライセートを氷上で冷却し、5,000 gで10分間、4℃で遠心分離した。VLP又はPsVを含む上清を除去した後、残りの細胞ペレットを、追加の0.8M NaClを含む100μlのPBSに再懸濁した。最初のスクリーニング実験後には、追加のNaClを含まないPBSをPcPV1調製に使用した。再懸濁した細胞を再び上記のように遠心分離し、上清を最初の遠心分離ステップからの上清と共にプールした。この得られた清澄化ライセートは-80℃で保存するか、超遠心分離によって精製した。密度勾配超遠心は、PBS + 0.8M NaClで27%、33%、39%に希釈したOptiPrep（Axis-Shield）を使用して行った。勾配は、5mlチューブ（Beckman Coulter）において下層化（underlayering）によりキャストした。清澄化したライセートを上に積層し、チューブをSW 55 Tiローター（Beckman Coulter）で50,000rpm（234,000g）で3.5時間、16℃で遠心分離した。遠心分離後、27%から33%OptiPrepへの移行までの上層を廃棄し、続いて、シリコン処理した1.5mlチューブにピペッティングすることにより、それぞれ250μlの12画分を収集した。

OptiPrepによる超遠心の代わりに、Percoll（GE Healthcare）を使用してMfPV11及びHPV16 PsVを精製した。清澄化した上清を、PBS+0.8M NaClで58.3%に希釈した4.5mlのPercollの上に積層した。チューブをSW 55 Tiローターで30,000rpmで1時間、16℃で遠心分離した。遠心分離後、Percollペレットの上に約500μlが残るまで上澄みを除去し、ペレットを回収した。

１．５ 非ヒトパピローマPsVによる形質導入
形質導入の24時間前に、ウェルあたり50,000のHEK293TT細胞を24ウェルプレートに播種するか、ウェルあたり8000のHEK293TT細胞を96ウェルプレートに播種した。非ヒトパピローマPsVを細胞培養液に直接添加した。ガウシアルシフェラーゼをレポーターとして使用した場合、20μlの細胞培養上清を回収し、ルシフェラーゼアッセイを行ってPsV懸濁液に存在する遊離ルシフェラーゼを確認するまで、-20℃で保存した。ι-カラギーナン（Sigma-Aldrich）を使用した実験では、PsVを添加する直前に、PBSに溶解したι-カラギーナンを指定の濃度で細胞培養液に添加した。全ての形質導入実験は三連で行った。

１．６ 形質導入の定量
形質導入の72時間後に、細胞培養上清20μlを黒色ルシフェラーゼプレート（NUNC）に移すことにより、ガウシアルシフェラーゼアッセイを行った。基質は、アッセイバッファー（1.1M NaCl、220mM K₂HPO₄/KH₂PO₄、0.44mg/ml BSA、1.3mM NaN₃、pH5）中に2mMセレンテラジン（p.j.k.）を1：1000希釈することにより調製した。Centro XS^зLB 960マイクロプレートルミノメーター（Berthold、Bad Wildbad、Germany）を使用して100μlの基質を注入し、各ウェルごとに注入後1秒の遅延の後に、相対光単位の測定を1秒間行った。形質導入直後に取り出した細胞培養培地のバックグラウンド測定値を、形質導入後72時間の測定値から差し引いた。形質導入の72時間後にBright-Glo試薬（Promega）を添加して2分間かけて細胞を溶解し、試薬添加後5分以内にCentro XS^зLB 960マイクロプレートルミノメーターを使用して計測を行うことでホタルルシフェラーゼアッセイを行った。GFPをレポーターとして使用した場合、GFP陽性細胞を形質導入の72時間後にカウントし、1mlあたりの形質導入単位を計算した。

１．７ ウェスタンブロット
各画分20μlをβ-メルカプトエタノールを含むローディングバッファーと混合し、タンパク質をSDS-PAGEによって分離した。ニトロセルロースメンブレンにブロットした後、5%脱脂粉乳を含むPBS-T（0.1%Tween-20を含むPBS）でメンブレンをブロッキングし、MD2H11抗体（MartinMuller、DKFZ Heidelberg）と共に一晩インキュベートした。MD2H11は、ヒトパピローマウイルスのキャプシドタンパク質L1の保存配列を標的としている。二次抗体（ヒツジ抗マウスポリクローナルIgG（H+L）、ペルオキシダーゼ結合、Jackson Immuno）とのインキュベーション後、シグナルをIntasケモスターシステムを用いたECL基質（Pierce）による化学発光によって検出した。

１．８ 非ヒトパピローマPsVからのDNAの抽出と定量的PCR
10μlのシュードウイルスサンプルを、4ユニットのDNaseI（NEB）を用いたDNA消化に60分間37℃で供し、残っている可能性のある残留DNAを全て除去した。DNaseIは、Qiamp MinElute Virus Spin Kit（Qiagen）を使用してDNAを抽出する前に、30分間75℃で熱失活させた。DNAを100μlで溶出し、そのうち、反応あたり5μlをqPCRに使用した。QuantiNova SYBR Green PCR Kit（Qiagen）を使用して、GFPに対する次のプライマーとのPCR反応を行った：5 'ATC CTG GTC GAG CTG GAC GG 3'（フォワード）及び5 'GAC GTA GCC TTC GGG CAT GG 3'（リバース）。抽出したDNAを定量するために、pEGFPプラスミドを、反応あたり3x10⁵から30コピーを含むように希釈して標準曲線を作成した。

１．９ 透過型電子顕微鏡観察
密度勾配超遠心分離精製VLPを、0.05M HEPESの存在下で2%ホルムアルデヒドによって24時間かけて固定した。透過型電子顕微鏡による解析の前に、サンプルをリンタングステン酸で染色した（contrasted）。

１．１０ マウス
9〜12週齢の雌BALB/cマウスは、社内飼育（in-house breeding）から得た。マウスは、水及びげっ歯類用固形飼料に無制限にアクセスできる隔離された換気ケージに入れた。全ての動物実験は、動物実験に関するEU指令2010/63/EUに従って実施し、地方自治体によって承認された（No.: TVV 49/15）。in vivo形質導入実験のために、50μlの非ヒトパピローマPsV懸濁液をイソフルラン吸入麻酔下で左大腿筋に注入した。

１．１１ 生物発光イメージング
200μlのd-ルシフェリン（PBS中15mg/ml）をマウスのイソフルラン吸入麻酔後に腹腔内注射した。注射から20分後、IVIS SPECTRUM（Xenogen、Perkin Elmer）を使用して発光画像を取得した（1分間の露光、中程度のビニング及びf /1）。

１．１２ 統計解析
GraphPad Prism6を使用して統計解析を行った。差は、p <0.05で有意と見なした。統計的に有意な差は次のように示した。* = p <0.05、** = p <0.01、*** = p <0.001、ns =有意でない。

実施例２：結果
２．１ 10の異なる非ヒトパピローマPsVの解析
本研究の目的は、遺伝子キャリアとしての使用に適した非ヒト（nh）パピローマウイルスの存在を探索することだった。NCBIのGenBankデータベースで、10種類のパピローマウイルスのキャプシドタンパク質L1及びL2の配列が特定された（表3, 略語は公開された通り（A. Rector, M. van Ranst, Animal papillomaviruses, Virology. 445, 213-223 (2013), doi:10.1016/j.virol.2013.05.007））。HPV PsVの遺伝子送達ベクターとしての成功的な用途（B. S. Graham et al., Mucosal delivery of human papillomavirus pseudovirus-encapsidated plasmids improves the potency of DNA vaccination, Mucosal immunology. 3, 475-486 (2010), doi:10.1038/mi.2010.31；R. C. Kines et al., Vaccination with Human Papillomavirus Pseudovirus-Encapsidated Plasmids Targeted to Skin Using Microneedles, PLoS ONE. 10, e0120797 (2015), doi:10.1371/journal.pone.0120797）によると、解析されたパピローマウイルスの半分はアルファパピローマウイルスのグループに属し、天然では非ヒト霊長類に感染する。コドン最適化DNA配列の合成及びpcDNA3.1+発現ベクターへのクローニングの後、VLPをHEK293TT細胞で生成し、OptiPrep密度勾配超遠心分離により精製した。最初の解析は得られたフラクションのウエスタンブロッティングによって行い、サイズと分子量から、精製されたVLPの大部分が画分4〜6に見られると予想されたパターンを確認した。10種の非ヒトパピローマVLPのうち8種は、予想される画分においてウエスタンブロットにより検出できた（図1）。PtPV及びRaPV VLPは検出されなかったが、MD2H11抗体がそれぞれのL1タンパク質に結合しなかった可能性が考えられる。遺伝子キャリアとしての非ヒトパピローマPsVの機能を試験するために、レポータープラスミドとしてpCMV-G.Lucを担持するPsVを生成し、HEK293TT細胞へのトランスフェクションに使用した。超遠心後の画分あたり10μlを使用して、24ウェルプレートにおいて50,000のHEK293TT細胞に形質導入した。PtPVを除いて、試験した全てのPsVにおいて形質導入後に少なくともある程度の低レベルのルシフェラーゼ発現があることがルシフェラーゼアッセイによって明らかになった。形質導入効率の間接的な指標としてのルシフェラーゼ発現は、パピローマウイルスのタイプごとに実質的に異なっていた（図2、A）。非ヒトパピローマウイルスの各タイプについて、いくつかのPsVを調製した後（after several PsV preparations）、PcPV1及びMfPV11は、最高の形質導入率を生じるだけでなく、非常に確実に生成できるタイプであることが判明した。したがって、以下の実験では、PcPV1及びMfPV11についてさらに解析した。

２．２ 遺伝子ベクターとしてのPcPV1及びMfPV11
パピローマウイルスのキャプシド構造の形成を確認するために、PcPV1及びMfPV11 VLPを生成し、OptiPrep超遠心分離により精製した。電子顕微鏡解析により、他者によりすでに報告があるように、PcPV1及びMfPV11が実際にパピローマビリオンに似たキャプシドを形成していることが明らかになった（ C. Cerqueira et al., Efficient Production of Papillomavirus Gene Delivery Vectors in Defined In Vitro Reactions, Molecular therapy. Methods & clinical development. 5, 165-179 (2017), doi:10.1016/j.omtm.2017.04.005；Q. Zhao et al., Disassembly and reassembly of human papillomavirus virus-like particles produces more virion-like antibody reactivity, Virology journal. 9, 52 (2012), doi:10.1186/1743-422X-9-52）。ガウシアルシフェラーゼレポーターを用いた形質導入は、形質導入効率の間接的な指標のみを提供するため、本発明者らは、レポーターとしてpEGFPを担持するPcPV11及びMfPV11 PsVを用いて形質導入実験を繰り返し、形質導入の72時間後にGFP陽性細胞を定量することによって形質導入単位を決定した（図4、A）。さらに、DNAをPsVから抽出し、pEGFPをqPCRによって定量した。1mlあたりのpEGFPプラスミドの発現力価は、PsVあたり1つのプラスミドがパッケージングされているという仮定に基づいている（図4、B）。qPCRによる解析により、パッケージングされたレポータープラスミドを含むPsVの量と形質導入単位の量との間に大幅な違いがあることが明らかになったことから、パピローマPsVを遺伝子導入に使用した場合、生成された粒子の数ではなく、形質導入の効率が限定要因であるという結論に至った。さらにPcPV1及びMfPV11 PsVの特性を知るために、本発明者らは、すでに報告がある、ι-カラギーナンの形質導入阻害能について試験した（C. B. Buck et al., Carrageenan is a potent inhibitor of papillomavirus infection, PLoS pathogens. 2, e69 (2006), doi:10.1371/journal.ppat.0020069）。ι-カラギーナンは、細胞培養培地にPsVと一緒に添加した場合、MfPV11 PsVによる形質導入を実際に阻害したが、観察された効果はPcPV1 PsVでは正反対だった（図5、B）。形質導入時にι-カラギーナンをPcPV1 PsVに添加すると、ガウシアルシフェラーゼレポータータンパク質の発現が有意に増加した（図5、A）。この実験をレポータープラスミドとしてpEGFPを用いて繰り返し、観察された効果は形質導入された細胞の数が多くなっていることに起因しており、レポータープラスミドの発現量が増加したためではないことが確認できた（図5、B）。同様のι-カラギーナンによって誘導される形質導入効率の増加は、PlPV1、CcrPV1、及びMmPV1 PsVでも観察されたが、MfPV6 PsVによる形質導入は阻害された（データは示していない）。

２．３ in vivoでの遺伝子キャリアとしてのMfPV11及びPcPV1
本発明者の手によるPcPV1及びMfPV11 PsVを用いた細胞株の形質導入が、HEK293TT以外の試験した細胞株のいずれに対しても適度に効果があっただけであることは注目に値する。したがって、最も差し迫った問題は、in vivoでの形質導入が観察可能かどうかだった。非ヒトパピローマPsVによる遺伝子導入及びその後のin vivoでのタンパク質発現を評価する簡単な方法の一つとして、本発明者らは、ホタルルシフェラーゼ（F.Luc）をレポーターとして選択した。F.Lucレポータープラスミドを担持するMfPV11及びPcPV1 PsVは、超遠心分離で精製せずに生成し、2μlを使用してHEK293TT細胞を形質導入し、形質導入の72時間後にF.Lucアッセイを行った（図6、A）。次に、PsV調製物を希釈して、全てのマウスが、細胞培養におけるF.Lucアッセイによって測定されたのと同じ量の形質導入単位の投与を受けるようにした。理論上2.5×10⁵のRLUを含む50μlのPsV懸濁液を、雌Balb/cマウスの左後脚に筋肉内注射した。投与の約3時間後、PsV調製物に存在していたと思われる遊離F.Lucを確認するために、マウスを生物発光イメージングに供した（図6、B、「0日目」）。その後、生物発光イメージングによってマウスを毎週モニターした（図6、B）。PcPV1 PsVを投与されたマウスでは、投与の7日後にF.Lucの顕著な発現が見られたが、MfPV11 PsVを投与されたマウスでは弱いF.Luc信号が検出されるまで28日かかった。PcPV1群のF.Luc信号は、少なくとも最後の生物発光イメージングを行った投与後10週間まで検出可能だった。重要なことに、マウスにおいて非ヒトパピローマPsV注射の部位での炎症や有害反応の兆候は全く見られなかった。

実施例３：考察
ウイルスベクターに基づく遺伝子送達は、現在承認されているタンパク質に基づくワクチンの競合的な代替物ではない遺伝子ワクチンの適用可能性を高める大きな可能性を秘めている。本研究では、遺伝子送達のために非ヒトパピローマウイルスを広範に探索することに価値があることを示すと共に、in vivoでの効率的な送達ベクターとして、PcPV1 PsVを同定した。100を超える動物パピローマウイルスのキャプシドタンパク質L1及びL2の遺伝子配列が利用可能であり、本出願におけるPcPV1 PsVに例示されるように、シュードビリオンを生成するために非常に容易に使用することができる。in vitro及びin vivoでの形質導入は、α-パピローマウイルスに属するヒトパピローマのいくつかのタイプのPsVに対して示されているため、本発明者らは、この属が遺伝子の送達に特に適した候補を提示する可能性があると推測した。興味深いことに、これが正しいとは証明されなかった。非ヒトα-パピローマウイルスの試験した全てのPsV（CgPV1、PtPV1、MfPV6、MfPV11、MmPV1）のうち、MfPV11のみがin vitroで良好な形質導入率を示した。ただし筋肉内注射においては、MfPV11 PsVは、レポータープラスミドの非常に弱い（week）形質導入及びその後のin vivoでの発現のみしか見られなかった。異なるパピローマウイルス属の好ましい侵入部位としては皮膚又は粘膜のいずれかである可能性が考えられるため（E.-M. de Villiers, C. Fauquet, T. R. Broker, H.-U. Bernard, H. Zur Hausen, Classification of papillomaviruses, Virology. 324, 17-27 (2004), doi:10.1016/j.virol.2004.03.033）、投与経路を選択するときにこれを考慮する必要があるかもしれない。ほとんどのHPVタイプは、α-パピローマウイルス属に属しているため、粘膜に感染する。HPV PsVは、マウスの性器感染に実際に成功的に使用されている（C. Cerqueira et al., Efficient Production of Papillomavirus Gene Delivery Vectors in Defined In Vitro Reactions, Molecular therapy. Methods & clinical development. 5, 165-179 (2017), doi:10.1016/j.omtm.2017.04.005）。このアプローチは、パピローマPsVの遺伝子ベクターとしての粘膜投与の可能性を示しているが、無傷のマウス生殖器上皮はHPV16 PsVの感染に非常に耐性があることがわかったため、粘膜の念入りな（intense）前処理が必要だった（B. S. Graham et al., Mucosal delivery of human papillomavirus pseudovirus-encapsidated plasmids improves the potency of DNA vaccination, Mucosal immunology. 3, 475-486 (2010), doi:10.1038/mi.2010.31）。筋肉内注射は、ワクチン投与において十分に確立され、一般に受け入れられている経路を使用している。本発明者らは本明細書において、この投与形態が、遺伝子導入のためのパピローマPsV投与のための簡単な代替手段となり得ることを示している。

さらに、in vivoでの追加の形質導入増強剤としてι-カラギーナンの使用について解析することは興味深いと思われる。ι-カラギーナンは、ビリオンの細胞への結合を防止することにより、ヒトパピローマウイルス感染の強力な阻害剤であることが既に示されている（C. B. Buck et al., Carrageenan is a potent inhibitor of papillomavirus infection, PLoS pathogens. 2, e69 (2006), doi:10.1371/journal.ppat.0020069）。本発明者の知る限りでは、特定の非ヒトパピローマウイルスのタイプにおいてはι-カラギーナンの効果が正反対であり、in vitroでの形質導入が大幅に増加する、ということは以前に報告されていない。そしてこれがin vivoでもそうであるかどうかはまだ解明されていない。HPVの接着メカニズムを解析するいくつかの研究では、上皮細胞でHPVがヘパラン硫酸プロテオグリカンを主要な接着因子として使用することを示している。この知見は、HPVの感染がヘパリンやカラギーナンのような他の硫化ポリマーによって遮断され得るという事実によって裏付けられている。動物パピローマウイルスによって採用される、潜在的に異なる侵入経路についてはほとんど知られていない。したがって、本発明者らが特定のパピローマウイルスタイプにおいて見出した、ι−カラギーナンが媒介する形質導入の増強の背後にあるメカニズムは、現時点では不明である。非ヒトパピローマウイルスの多くは皮膚から体内に侵入するため、PsVを投与するために皮膚経路を探索する価値はあるだろう。遺伝子ワクチンの投与という文脈の中では、ランゲルハンス細胞及び樹状細胞が大量に存在するため、皮膚は魅力的な標的である。

結論として、本発明者らは、PcPV1 PsV、及び可能性としてはさらに多くの非ヒトパピローマPsVが筋肉への投与後にin vivoでレポータープラスミドを効率的に導入し、レポータープラスミドの数週間にわたる発現をもたらすことを示した。膨大な量の既知の配列決定された非ヒトパピローマウイルスは、遺伝子ベクターとしての適用のためにさらに探索されるべき大きな可能性を提供している。

Claims (15)

1. 真核細胞又は細胞株における発現のためにコドン最適化された少なくとも1つのパピローマキャプシドタンパク質を含む、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子。
2. 前記パピローマキャプシドタンパク質がL1及び/又はL2である、請求項１に記載の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子。
3. 前記パピローマキャプシドタンパク質が、アカウミガメ（Caretta caretta）パピローマウイルス1、アビシニアコロブス（Colobus guereza）パピローマウイルス1、チンパンジー（Common chimpanzee）パピローマウイルス1、ブチハイエナ（Crocuta crocuta）パピローマウイルス1、カニクイザル（Macaca fascicularis）パピローマウイルス11型、分離株Mac1637、カニクイザルパピローマウイルス6型、分離株Mac39、アライグマ（Procyon lotor）パピローマウイルス1、ピューマ（Puma concolor）パピローマウイルス1、アカゲザル（Rhesus）パピローマウイルス1b型分離株Mac170又はエジプトルーセットオオコウモリ（Rousettus aegyptiacus）パピローマウイルス1型由来である、請求項１又は２に記載の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子。
4. 前記コドン最適化パピローマキャプシドタンパク質が、以下からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１から３のいずれか一項に記載の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子。
   （a）配列番号1〜20に示される核酸配列；
   （b）配列番号21〜40に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列。
5. 前記非ヒトパピローマウイルス様粒子が、in vitro又はin vivoでの遺伝子送達用である、請求項１から４のいずれか一項に記載の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子。
6. 前記非ヒトパピローマウイルス様粒子が標的化ペプチドをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子。
7. 前記標的化ペプチドが、非ヒトパピローマウイルス様粒子を肝細胞、肺細胞、心臓細胞、腎臓細胞、血液細胞、脳細胞、腸細胞、幹細胞、喉若しくは鼻の粘膜の細胞、又はがん細胞に導くことができる、請求項６に記載の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子。
8. 請求項１から７のいずれか一項に記載の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子と、診断剤、造影剤、及び治療剤からなる群から選択される薬剤とを含む医薬組成物。
9. 前記治療剤が、以下からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
   （i）低分子、好ましくは細胞傷害性薬剤；（ii）RNAi核酸；（iii）マイクロRNA；（iv）リボザイム；（v）アンチセンス核酸；（vi）モルフォリノ；（vii）抗体；及び（viii）CRISPR/CAS。
10. 前記治療剤が核酸、好ましくは遺伝子治療又はワクチン接種のための核酸である、請求項８に記載の医薬組成物。
11. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. 前記医薬組成物が筋肉内注射又は経皮により投与される、請求項８から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 医薬として使用するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子。
14. 以下のステップ：
    （a）真核細胞又は細胞株、好ましくはヒト細胞又は細胞株における発現のために、非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質L1及び/又はL2をコードするDNA配列をコドン最適化するステップ；
    （b）ステップ（a）の配列を合成し、合成された配列を発現ベクターへクローニングするステップ；並びに
    （c）ステップ（b）の発現ベクターを細胞へトランスフェクトし、それにより非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成するステップ
    を含む、非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子を生成する方法。
15. in vitroでの非ヒトパピローマシュードウイルス又はウイルス様粒子の形質導入増強剤としてのι-カラギーナンの使用。