JP2021036789A - Novel plants, methods for producing the same, and methods for improving germination rate or seedling rate of stay-green plants - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Description
本発明は、新規植物体、当該植物体の生産方法、およびステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法に関する。 The present invention relates to a novel plant, a method for producing the plant, and a method for improving the germination rate or the seedling rate of a stay green plant.
葉野菜等の緑色野菜は老化により黄変し易いことが知られている。緑色野菜はわずかでも黄変すると、消費者の購買意欲および食欲が大きく減退してしまう。よって、黄変した緑色野菜の売れ残りおよび購買後の廃棄等のフードロスが問題になっている。 It is known that green vegetables such as leafy vegetables tend to turn yellow due to aging. If green vegetables turn yellow even slightly, consumers' willingness to buy and appetite will be greatly reduced. Therefore, food loss such as unsold yellowed green vegetables and disposal after purchase has become a problem.
例えば、栽培後期に黄変が起こり易く、出荷時に黄変した部位の除去が行われている。また、長時間の緑色野菜の輸送中に黄変が起こり易いことが知られている。輸送中の黄変を抑制するために、緑色野菜の保存設備の改善等が行われている。一方、収穫後の労働コストおよび設備コストの上昇に伴う緑色野菜の高価格化が懸念される。したがって、栽培時および輸送時等に、黄変が起こり難く緑色が維持された、ステイグリーン植物の開発が望まれている。 For example, yellowing is likely to occur in the late stage of cultivation, and the yellowed part is removed at the time of shipment. It is also known that yellowing is likely to occur during the transportation of green vegetables for a long time. In order to suppress yellowing during transportation, improvement of storage equipment for green vegetables is being carried out. On the other hand, there is concern that the price of green vegetables will increase due to the rise in labor costs and equipment costs after harvesting. Therefore, it is desired to develop a stay green plant that is less likely to cause yellowing and maintains a green color during cultivation and transportation.
例えば、非特許文献１には、クロロフィル分解酵素の発現が抑制されることによって、ステイグリーン植物を得ることができることが記載されている。一方、非特許文献２および３には、シロイヌナズナおよびダイズにおいて種子におけるクロロフィル分解が抑制されると、発芽・成苗率が低下することが記載されている。また、非特許文献４には、ダイズでは種子にクロロフィル蓄積するＣｙｔＧ系統の、青豆（種子緑色）形質を抑制する突然変異体について記載されている。 For example, Non-Patent Document 1 describes that a stay green plant can be obtained by suppressing the expression of a chlorophyll-degrading enzyme. On the other hand, Non-Patent Documents 2 and 3 describe that when chlorophyll decomposition in seeds is suppressed in Arabidopsis thaliana and soybean, the germination / seedling rate decreases. In addition, Non-Patent Document 4 describes a mutant of the CytG strain that accumulates chlorophyll in seeds in soybean, which suppresses the green bean (seed green) trait.
上述のとおり、ステイグリーン植物には発芽・成苗率が低いという問題があり、実用化に至っていない。したがって、ステイグリーン植物の発芽・成苗率の改善が望まれる。 As mentioned above, stay green plants have a problem of low germination / seedling rate and have not been put into practical use. Therefore, it is desired to improve the germination and seedling rate of stay green plants.
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、発芽・成苗率低下が抑制された、黄変が起こり難いステイグリーン植物を提供することである。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a stay green plant in which a decrease in germination / seedling rate is suppressed and yellowing is unlikely to occur.
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る植物体は、以下の（１）〜（５）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のクロロフィル分解酵素遺伝子の発現が抑制されているか、または前記クロロフィル分解酵素遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されており、さらに、以下の（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現が抑制されているか、または前記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている、植物体である：
（１）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列番号１〜４のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（３）配列番号１〜４に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（４）配列番号５〜８のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
In order to solve the above problems, the plant according to one aspect of the present invention suppresses the expression of any one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the following (1) to (5). One or more CaaX protease-like substances selected from the group consisting of the following (6) to (10), in which the function of the polypeptide encoded by the chlorophyll-degrading enzyme gene is inhibited. A plant in which the expression of the gene is suppressed or the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene is inhibited:
(1) A gene encoding a protein having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
(2) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and a chlorophyll-degrading enzyme. A gene encoding a protein that functions as
(3) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 4 and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(4) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5 to 8;
(5) A gene encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (1) to (4) above and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12;
(7) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and CaaX protease-like. A gene encoding a protein that functions as a protein;
(8) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12 and functions as a CaaX protease-like protein;
(9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16;
(10) A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (6) to (9) above under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. ..
本発明の一態様に係る植物体は双子葉植物であることが好ましい。 The plant according to one aspect of the present invention is preferably a dicotyledonous plant.
また、本発明の一態様に係る植物体の生産方法は、植物体において、以下の（１）〜（５）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のクロロフィル分解酵素遺伝子の発現を抑制するか、または前記クロロフィル分解酵素遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程と、以下の（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現を抑制するか、または前記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、植物体の生産方法である：
（１）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列番号１〜４のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（３）配列番号１〜４に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（４）配列番号５〜８のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
In addition, the method for producing a plant according to one aspect of the present invention suppresses the expression of any one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the following (1) to (5) in the plant. Or, the step of inhibiting the function of the polypeptide encoded by the chlorophyll-degrading enzyme gene, and the expression of any one or more CaaX protease-like genes selected from the group consisting of the following (6) to (10). A method for producing a plant, which comprises a step of suppressing the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene or inhibiting the function of the polypeptide.
(1) A gene encoding a protein having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
(2) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and a chlorophyll-degrading enzyme. A gene encoding a protein that functions as
(3) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 4 and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(4) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5 to 8;
(5) A gene encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (1) to (4) above and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12;
(7) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and CaaX protease-like. A gene encoding a protein that functions as a protein;
(8) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12 and functions as a CaaX protease-like protein;
(9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16;
(10) A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (6) to (9) above under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. ..
本発明の一態様に係る植物体の生産方法において、植物体は双子葉植物であることが好ましい。 In the method for producing a plant according to one aspect of the present invention, the plant is preferably a dicotyledon.
また、本発明の一態様に係るステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法は、以下の（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現を抑制する、または、前記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、ステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法である：
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
Further, the method for improving the germination rate or the seedling rate of the stay green plant according to one aspect of the present invention is one or more CaaX protease-like selected from the group consisting of the following (6) to (10). A method of improving the germination rate or seedling rate of staygreen plants, which comprises the step of suppressing the expression of the gene or inhibiting the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene.
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12;
(7) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and CaaX protease-like. A gene encoding a protein that functions as a protein;
(8) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12 and functions as a CaaX protease-like protein;
(9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16;
(10) A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (6) to (9) above under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. ..
また、本発明の一態様に係るステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法は、以下の（１）〜（５）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のクロロフィル分解酵素遺伝子の発現が抑制された、または、前記クロロフィル分解酵素遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されたステイグリーン植物において、
以下の（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現を抑制、または、前記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、ステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法である：
（１）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列番号１〜４のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（３）配列番号１〜４に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（４）配列番号５〜８のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子。
Further, the method for improving the germination rate or the seedling rate of the stay green plant according to one aspect of the present invention is any one or more chlorophyll-degrading enzymes selected from the group consisting of the following (1) to (5). In staygreen plants in which gene expression is suppressed or the function of the polypeptide encoded by the chlorophyll-degrading enzyme gene is inhibited.
A step of suppressing the expression of any one or more CaaX protease-like genes selected from the group consisting of the following (6) to (10) or inhibiting the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene. How to improve the germination rate or seedling rate of stay green plants, including:
(1) A gene encoding a protein having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
(2) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and a chlorophyll-degrading enzyme. A gene encoding a protein that functions as
(3) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 4 and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(4) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5 to 8;
(5) A gene encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (1) to (4) above and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12;
(7) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and CaaX protease-like. A gene encoding a protein that functions as a protein;
(8) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12 and functions as a CaaX protease-like protein;
(9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16;
(10) A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (6) to (9) above under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. ..
本発明の一態様に係るステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法において、ステイグリーン植物が双子葉植物であることが好ましい。 In the method for improving the germination rate or the seedling rate of the stay green plant according to one aspect of the present invention, it is preferable that the stay green plant is a dicotyledonous plant.
本発明の一態様によれば、発芽率または成苗率低下が抑制され、黄変が起こり難い、ステイグリーン植物を提供することができる。 According to one aspect of the present invention, it is possible to provide a stay green plant in which a decrease in germination rate or seedling rate is suppressed and yellowing is unlikely to occur.
〔用語等の定義〕
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、特に言及のない限り、デオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、「ポリペプチド」は、「タンパク質」とも換言できる。
[Definition of terms, etc.]
As used herein, "polynucleotide" can also be referred to as "nucleic acid" or "nucleic acid molecule" and is intended as a polymer of nucleotides. The "base sequence" can also be rephrased as a "nucleic acid sequence" or a "nucleotide sequence", and is intended to be a deoxyribonucleotide sequence or a ribonucleotide sequence unless otherwise specified. In addition, "polypeptide" can be paraphrased as "protein".
本明細書において、「ステイグリーン植物」は、栽培、収穫、保存および輸送等の際に黄変が起こり難く、緑色が維持される植物を意図している。ステイグリーン植物の例として、クロロフィルが種子に蓄積する突然変異体等が挙げられる。クロロフィルが種子に蓄積する突然変異体の例として、クロロフィル分解酵素遺伝子の変異体およびクロロフィル分解抑制遺伝子の変異体等が挙げられる。クロロフィル分解酵素遺伝子の例として、後述する（１）〜（５）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のクロロフィル分解酵素遺伝子等が挙げられる。また、クロロフィル分解制御遺伝子の例として、ＣｙｔＧ遺伝子（例えば、配列番号１８に記載される塩基配列）等が挙げられる。 As used herein, the term "stay green plant" is intended to be a plant that is less likely to cause yellowing during cultivation, harvesting, storage, transportation, etc., and maintains a green color. Examples of stay green plants include mutants in which chlorophyll accumulates in seeds. Examples of mutants in which chlorophyll accumulates in seeds include mutants of the chlorophyll-degrading enzyme gene and mutants of the chlorophyll-degrading inhibitory gene. Examples of the chlorophyll-degrading enzyme gene include any one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of (1) to (5) described later. In addition, examples of the chlorophyll degradation control gene include the CytG gene (for example, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18).
〔植物体〕
本実施形態に係る植物体は、クロロフィル分解酵素遺伝子の発現が抑制されているか、当該クロロフィル分解酵素遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている。さらに、本実施形態に係る植物体は、ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現が抑制されているか、または当該ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている。
[Plant]
In the plant body according to the present embodiment, the expression of the chlorophyll-degrading enzyme gene is suppressed, or the function of the polypeptide encoded by the chlorophyll-degrading enzyme gene is inhibited. Furthermore, in the plant according to the present embodiment, the expression of the CaaX protease-like gene is suppressed, or the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene is inhibited.
本明細書において、「遺伝子の発現が抑制されている」とは、ゲノム上にある遺伝子が本来の機能を発揮しない状態を意味する。「遺伝子の発現抑制」は、例えば、「遺伝子の破壊」および「遺伝子の変異」によって生じ得る。 As used herein, the term "gene expression is suppressed" means a state in which a gene on the genome does not exert its original function. "Suppression of gene expression" can be caused, for example, by "gene disruption" and "gene mutation".
「遺伝子の破壊」は、ゲノム上に本来ある遺伝子が存在しないこと、またはゲノム上にある遺伝子から転写産物が生成されないことを意味する。「遺伝子の変異」は、本来の機能的なタンパク質が生成されない遺伝子の変異、タンパク質が生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、またはタンパク質が生成されるものの、タンパク質の安定性が低下する遺伝子の変異を意味している。 "Gene disruption" means that the original gene does not exist on the genome, or that no transcript is produced from the gene on the genome. A "gene mutation" is a mutation in a gene that does not produce the original functional protein, a mutation in a gene that produces a protein but reduces the amount produced, or a protein stability that produces a protein. Means a mutation in a gene that reduces.
本明細書において、「変異」は、野生型のゲノム上にある塩基、または野生型タンパク質にあるアミノ酸残基の変化（例えば、置換、欠失、挿入、付加、重複または逆位など）を意味する。ゲノム上にある塩基の変化には、複数の塩基の転座も含まれる。 As used herein, "mutation" means a change in an amino acid residue in a base in the wild-type genome or in a wild-type protein (eg, substitution, deletion, insertion, addition, duplication or inversion, etc.). To do. Changes in bases on the genome also include crossovers of multiple bases.
また、「遺伝子の発現抑制」には、当該遺伝子には変化を生じていないが、遺伝子の機能（ｍＲＮＡへの転写からそれに続くタンパク質への翻訳まで）が他の因子を介して修飾されて、タンパク質の生成量が低下しているか、またはタンパク質の生成が生じていない状態も含まれる。「遺伝子の発現抑制」は、例えば、当該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解によって生じ得る。 In addition, in "suppression of gene expression", the function of the gene (from transcription to mRNA to subsequent translation into protein) is modified via other factors, although the gene is not changed. It also includes a state in which the amount of protein produced is low or no protein is produced. "Suppression of gene expression" can occur, for example, by degradation of mRNA transcribed from the gene.
本明細書において、「遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている」とは、ポリペプチドが生成されるものの、生成されるポリペプチドの量が低下することによって、ポリペプチドの本来の機能を発揮しない状態を含む。また、「遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている」とは、生成されるポリペプチドの量は抑制されないものの、活性を有しないか不完全な機能のみを有していることにより、ポリペプチドの本来の機能を発揮しない状態を含む。 As used herein, "the function of a polypeptide encoded by a gene is inhibited" means that a polypeptide is produced, but the amount of the produced polypeptide is reduced, so that the original function of the polypeptide is reduced. Including the state of not exhibiting. In addition, "the function of the polypeptide encoded by the gene is inhibited" means that the amount of the polypeptide produced is not suppressed, but it has no activity or only an incomplete function. Includes a state in which the original function of the polypeptide is not exerted.
（クロロフィル分解酵素遺伝子）
本実施形態に係る植物体のクロロフィル分解酵素遺伝子は、以下の（１）〜（５）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のクロロフィル分解酵素遺伝子である。
（１）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１〜４のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１〜４に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号５〜８のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子
上記クロロフィル分解酵素遺伝子は、クロロフィル分解酵素として機能するポリペプチドをコードする遺伝子である。当該クロロフィル分解酵素は、クロロフィルａを分解する酵素である。これにより、ステイグリーン形質を効果的に維持できる。
(Chlorophyll degrading enzyme gene)
The plant chlorophyll-degrading enzyme gene according to the present embodiment is any one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the following (1) to (5).
(1) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4 (2) One or several amino acid residues in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4. A gene consisting of an amino acid sequence in which is substituted, deleted, inserted and / or added and encoding a protein that functions as a chlorophyll-degrading enzyme (3) 50% with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1 to 4. A gene encoding a protein having the above sequence identity and functioning as a chlorophyll-degrading enzyme (4) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5 to 8 (5) The above (1) to (4) ) Is a gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes under stringent conditions and functions as a chlorophyll-degrading enzyme. The above-mentioned chlorophyll-degrading enzyme gene is used as a chlorophyll-degrading enzyme. A gene encoding a functional polypeptide. The chlorophyll-degrading enzyme is an enzyme that decomposes chlorophyll a. As a result, the stay green trait can be effectively maintained.
クロロフィル分解酵素遺伝子は以下に示す配列番号５〜８に示す塩基配列に限定されるものでない。すなわち、シロイヌナズナもしくはダイズに内在するクロロフィル分解酵素遺伝子の相同遺伝子の発現を抑制してもよい。また、シロイヌナズナおよびダイズ以外の植物においては、当該植物に内在するクロロフィル分解酵素遺伝子の相同遺伝子の発現を抑制すればよい。本明細書において、相同遺伝子とは、共通の祖先に由来し、同じ構造および機能を有する遺伝子を示し、オルソログおよびパラログ等を含む。上記相同遺伝子は、特に限定されず、種々の生物に関する遺伝子配列を格納したデータベースを検索することで特定することができる。 The chlorophyll-degrading enzyme gene is not limited to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 8 below. That is, the expression of the homologous gene of the chlorophyll-degrading enzyme gene inherent in Arabidopsis thaliana or soybean may be suppressed. Further, in plants other than Arabidopsis thaliana and soybean, the expression of the homologous gene of the chlorophyll-degrading enzyme gene inherent in the plant may be suppressed. As used herein, the homologous gene refers to a gene derived from a common ancestor and having the same structure and function, and includes orthologs, paralogs, and the like. The homologous gene is not particularly limited, and can be identified by searching a database containing gene sequences related to various organisms.
配列番号５に示す塩基配列は、シロイヌナズナに内在する遺伝子AT4G22920（AtSGR1）である。配列番号１に示すアミノ酸配列は、遺伝子AT4G22920（AtSGR1）がコードするタンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the gene AT4G22920 (AtSGR1) endogenous to Arabidopsis thaliana. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the protein encoded by the gene AT4G22920 (AtSGR1).
配列番号６に示す塩基配列は、シロイヌナズナに内在する遺伝子AT4G11910（AtSGR2）であり、遺伝子AT4G22920（AtSGR1）の相同遺伝子である。配列番号２に示すアミノ酸配列は、遺伝子AT4G11910（AtSGR2）がコードするタンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 is the gene AT4G11910 (AtSGR2) endogenous to Arabidopsis thaliana and a homologous gene of the gene AT4G22920 (AtSGR1). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the protein encoded by the gene AT4G11910 (AtSGR2).
配列番号７に示す塩基配列は、ダイズに内在する遺伝子Glyma11g02980（GmSGR1）である。配列番号３に示すアミノ酸配列は、遺伝子Glyma11g02980（GmSGR1）がコードするタンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 is the gene Glyma11g02980 (GmSGR1) endogenous to soybean. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the protein encoded by the gene Glyma11g02980 (GmSGR1).
配列番号８に示す塩基配列は、ダイズに内在する遺伝子Glyma01g42390（GmSGR2）であり、遺伝子Glyma11g02980（GmSGR1）の相同遺伝子である。配列番号４に示すアミノ酸配列は、遺伝子Glyma01g42390（GmSGR2）がコードするタンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 is the gene Glyma01g42390 (GmSGR2) endogenous to soybean, and a homologous gene of the gene Glyma11g02980 (GmSGR1). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the protein encoded by the gene Glyma01g42390 (GmSGR2).
上記クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の相同遺伝子を取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではない。例えば、上記クロロフィル分解酵素遺伝子またはＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。 The method for obtaining (isolating) the homologous gene of the chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene is not particularly limited. For example, a probe that specifically hybridizes with a part of the base sequence of the chlorophyll-degrading enzyme gene or the CaaX protease-like gene may be prepared and screened for a genomic DNA library or a cDNA library.
本明細書において、「１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加」は、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法等の部位特異的突然変異誘発法を用いて人為的に変異を導入してもよいし、天然に存在する同様の変異ポリペプチドに由来するものであってもよい。置換、欠失、挿入および／または付加されるアミノ酸残基の数は、通常は、３０アミノ酸残基以内であり、好ましくは２０アミノ酸残基以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸残基以内であり、最も好ましくは５アミノ酸残基以内（例えば、５、４、３、２、１アミノ酸）である。 In the present specification, "one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added" artificially introduces a mutation by using a site-specific mutagenesis method such as the Kunkel method. It may be derived from a similar naturally occurring mutant polypeptide. The number of amino acid residues substituted, deleted, inserted and / or added is usually within 30 amino acid residues, preferably within 20 amino acid residues, and even more preferably within 10 amino acid residues. Most preferably, it is within 5 amino acid residues (for example, 5, 4, 3, 2, 1 amino acid).
本明細書において、「（アミノ酸配列の）配列同一性」は、基準となる（アミノ酸）配列に対して、言及されている（アミノ酸）配列が一致している割合を意味する。ここで、配列の一致していない部分は、（アミノ酸残基の）置換、付加、欠失または挿入が存在している部分である。 In the present specification, "sequence identity (of amino acid sequence)" means the ratio of the referred (amino acid) sequence to the reference (amino acid) sequence. Here, the mismatched portion of the sequence is the portion where substitutions, additions, deletions or insertions (of amino acid residues) are present.
上記（３）の遺伝子がコードするアミノ酸配列の配列同一性は、配列番号１〜４のいずれかに記載されるアミノ酸配列に対して、５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990) を利用して決定することができる。 The sequence identity of the amino acid sequence encoded by the gene of (3) above is 50% or more, preferably 55% or more, more preferably 60% with respect to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4. (For example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more). .. Sequence identity can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990).
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件を挙げることができる。条件の一例を示すと、緩衝液（０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液）中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせる。さらに緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う。 As used herein, the term "stringent condition" refers to a condition in which a so-called base sequence-specific double-stranded polynucleotide is formed and a non-specific double-stranded polynucleotide is not formed. In other words, conditions for hybridizing nucleic acids with high homology, for example, from the melting temperature (Tm value) of a perfectly matched hybrid to a temperature in the range of 15 ° C., preferably 10 ° C., more preferably 5 ° C. lower. It can be said that. For example, a condition for hybridization in a general hybridization buffer solution at 68 ° C. for 20 hours can be mentioned. As an example of the conditions, the temperature is 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C., more preferably 65 ° C. in a buffer solution (0.25M Na 2 HPO 4, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA, 1 × Denhardt solution). Hybridizes under the condition of 68 ° C. for 16 to 24 hours. Further, washing in a buffer solution (20 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA) at a temperature of 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C., more preferably 68 ° C. for 15 minutes was performed for 2 minutes. Do it times.
上記クロロフィル分解酵素遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。上記クロロフィル分解酵素遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列等の付加的な配列を含むものであってもよい。 The chlorophyll-degrading enzyme gene can be present in the form of RNA (eg, mRNA) or DNA (eg, cDNA or genomic DNA). The DNA may be double-stranded or single-stranded. The chlorophyll-degrading enzyme gene may contain an additional sequence such as a sequence of an untranslated region (UTR).
（ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子）
本実施形態に係る植物体のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子は、以下の（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上の遺伝子である。
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子
上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子は、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するポリペプチドをコードする遺伝子である。ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質は、シグナル伝達に関与しているＣａａＸタンパク質を分解する酵素（ＣａａＸプロテアーゼ）と共通のアミノ酸モチーフを持つ。
(CaaX protease-like gene)
The CaaX protease-like gene of the plant according to the present embodiment is any one or more genes selected from the group consisting of the following (6) to (10).
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12 (7) One or several amino acid residues in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12. A gene encoding a protein consisting of a substituted, deleted, inserted and / or added amino acid sequence and functioning as a CaaX protease-like protein (8) 50 with respect to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12. A gene encoding a protein having a sequence identity of% or more and functioning as a CaaX protease-like protein (9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16 (10) Above (6) to A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes in (9) under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. The CaaX protease-like gene is CaaX. A gene encoding a polypeptide that functions as a protease-like protein. The CaaX protease-like protein shares an amino acid motif with the enzyme that degrades the CaaX protein involved in signal transduction (CaaX protease).
ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子は以下に示す配列番号１３〜１６に示す塩基配列に限定されるものでない。すなわち、シロイヌナズナもしくはダイズに内在する相同遺伝子またはシロイヌナズナおよびダイズ以外の植物に内在する相同遺伝子の発現を抑制してもよい。 The CaaX protease-like gene is not limited to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 13 to 16 shown below. That is, the expression of the homologous gene endogenous to Arabidopsis thaliana or soybean or the homologous gene endogenous to plants other than Arabidopsis thaliana and soybean may be suppressed.
配列番号１３に示す塩基配列は、シロイヌナズナに内在する遺伝子AT2G35260（AtYTH1）である。配列番号９に示すアミノ酸配列は、遺伝子AT2G35260（AtYTH1）がコードするタンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 is the gene AT2G35260 (AtYTH1) endogenous to Arabidopsis thaliana. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of the protein encoded by the gene AT2G35260 (AtYTH1).
配列番号１４に示す塩基配列は、シロイヌナズナに内在する遺伝子AT4G17840（AtYTH2）であり、遺伝子AT2G35260（AtYTH1）の相同遺伝子である。配列番号１０に示すアミノ酸配列は、遺伝子AT4G17840（AtYTH2）がコードするタンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 is the gene AT4G17840 (AtYTH2) endogenous to Arabidopsis thaliana, which is a homologous gene of the gene AT2G35260 (AtYTH1). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of the protein encoded by the gene AT4G17840 (AtYTH2).
配列番号１５に示す塩基配列は、ダイズに内在する遺伝子Glyma01g40650（GmYTH1）である。配列番号１１に示すアミノ酸配列は、遺伝子Glyma01g40650（GmYTH1）がコードするタンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 is the gene Glyma01g40650 (GmYTH1) endogenous to soybean. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of the protein encoded by the gene Glyma01g40650 (GmYTH1).
配列番号１６に示す塩基配列は、ダイズに内在する遺伝子Glyma11g04660（GmYTH2）であり、遺伝子Glyma01g40650（GmYTH1）の相同遺伝子である。配列番号１２に示すアミノ酸配列は、遺伝子Glyma11g04660（GmYTH2）がコードするタンパク質のアミノ酸配列である。 The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 is the gene Glyma11g04660 (GmYTH2) endogenous to soybean, and a homologous gene of the gene Glyma01g40650 (GmYTH1). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of the protein encoded by the gene Glyma11g04660 (GmYTH2).
上記（８）の遺伝子がコードするアミノ酸配列の配列同一性は、配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列に対して、５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990)を利用して決定することができる。 The sequence identity of the amino acid sequence encoded by the gene (8) is 50% or more, preferably 55% or more, more preferably 60% with respect to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12. (For example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more). .. Sequence identity can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990).
上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列等の付加的な配列を含むものであってもよい。 The CaaX protease-like gene can be present in the form of RNA (eg, mRNA) or DNA (eg, cDNA or genomic DNA). The DNA may be double-stranded or single-stranded. The CaaX protease-like gene may contain additional sequences such as untranslated region (UTR) sequences.
本実施形態において発現または活性が抑制されるクロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子はそれぞれ、通常、内在性のクロロフィル分解酵素遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに、内在性のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子およびその相同遺伝子である。例えば、その植物の内在性クロロフィル分解酵素遺伝子が１種である場合には、その発現または活性が抑制されていればよい。その植物が２種以上の内在性クロロフィル分解酵素遺伝子およびその相同遺伝子を有する場合には、そのうちの１種以上の発現または活性が抑制されていればよく、全部の発現または活性が抑制されていてもよいが、そのうちの２種以上の発現または活性が抑制されていることが好ましい。ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子も同様である。また、植物細胞が有する１種の内在性クロロフィル分解酵素遺伝子の対立遺伝子（アレル）のうち、少なくとも１つのアレルの発現または活性が抑制されていればよく、両方のアレルの発現または活性が抑制されていることが好ましい。ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子も同様である。さらに、本発明の目的に反しない限り、クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子以外の遺伝子の発現および活性が同時に抑制されていてもよい。 The chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene whose expression or activity is suppressed in the present embodiment are usually the endogenous chlorophyll-degrading enzyme gene and its homologous gene, and the endogenous CaaX protease-like gene and its homologous gene, respectively. Is. For example, when the plant has only one endogenous chlorophyll-degrading enzyme gene, its expression or activity may be suppressed. When the plant has two or more endogenous chlorophyll-degrading enzyme genes and their homologous genes, it is sufficient that the expression or activity of one or more of them is suppressed, and the expression or activity of all of them is suppressed. However, it is preferable that the expression or activity of two or more of them is suppressed. The same applies to the CaaX protease-like gene. Further, it is sufficient that the expression or activity of at least one allele of one allele of the endogenous chlorophyll-degrading enzyme gene possessed by the plant cell is suppressed, and the expression or activity of both alleles is suppressed. Is preferable. The same applies to the CaaX protease-like gene. Furthermore, the expression and activity of genes other than the chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene may be suppressed at the same time as long as the object of the present invention is not violated.
本実施形態に係る植物体は、発芽率または成苗率の低下が抑制された、黄変が起こり難いステイグリーン植物であるという特徴を有している。実施例に示すとおり、本実施形態に係る植物体は、クロロフィル分解酵素遺伝子に変異を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子には変異を有さないステイグリーン植物と比較して、発芽率または成苗率が大きく改善されている。また、実施例に示すとおり、本実施形態に係る植物体は、野生型の植物と同等の発芽率または成苗率を有している。 The plant according to the present embodiment is characterized in that it is a stay green plant in which a decrease in germination rate or seedling rate is suppressed and yellowing is unlikely to occur. As shown in Examples, the plant according to the present embodiment has a germination rate or a seedling rate as compared with a stay green plant having a mutation in the chlorophyll-degrading enzyme gene and no mutation in the CaaX protease-like gene. Has been greatly improved. Further, as shown in Examples, the plant body according to this embodiment has a germination rate or a seedling rate equivalent to that of a wild-type plant.
当該技術分野では、クロロフィル分解酵素遺伝子の発現または活性が抑制されると、黄変が起こり難いステイグリーン植物が得られることが知られていた。一方、当該ステイグリーン植物は種子へのクロロフィル蓄積が原因で発芽率または成苗率が低く実用化に至っていなかった。しかしながら、驚くべきことに、クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方の発現または活性を抑制することによって、種子へのクロロフィル蓄積は抑制され、従来のステイグリーン植物よりも発芽・成苗率が大きく改善される。このことは、ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子が種子におけるクロロフィル蓄積変異のサプレッサー遺伝子として機能することを意味する。 In the art, it has been known that when the expression or activity of the chlorophyll-degrading enzyme gene is suppressed, a stay green plant that is less likely to cause yellowing can be obtained. On the other hand, the stay green plant has a low germination rate or seedling rate due to the accumulation of chlorophyll in seeds and has not been put into practical use. However, surprisingly, by suppressing the expression or activity of both the chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene, chlorophyll accumulation in seeds is suppressed, and the germination and seedling rate is higher than that of conventional stay green plants. It will be greatly improved. This means that the CaaX protease-like gene functions as a suppressor gene for chlorophyll accumulation mutations in seeds.
本実施形態に係る植物体の対象となる植物は、特に限定されず、如何なる植物であってもよい。対象となる植物の例として、双子葉植物および単子葉植物等が挙げられる。本発明の効果を十分に発揮できる点で、対象となる植物は双子葉植物であることが好ましい。また、対象となる植物の例として、一年生植物、二年生植物および多年生植物等が挙げられる。また、対象となる植物は、本発明の効果を十分に発揮できる点で、種子植物等の緑色植物であることがより好ましく、葉菜類の植物がさらに好ましい。 The target plant of the plant according to the present embodiment is not particularly limited and may be any plant. Examples of target plants include dicotyledonous plants and monocotyledonous plants. The target plant is preferably a dicotyledonous plant in that the effects of the present invention can be sufficiently exerted. In addition, examples of target plants include annual plants, biennial plants, and perennial plants. Further, the target plant is more preferably a green plant such as a seed plant, and further preferably a leafy vegetable plant, in that the effect of the present invention can be sufficiently exerted.
双子葉植物の例として、ナタネ、ダイコン、ワサビダイコン、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、メキャベツ、カイラン、シロイヌナズナ、コマツナ、ハクサイ、ミズナ、アブラナ、カブ、ケール、カラシナ、タカナ、ワサビ、チンゲンサイ、ノザワナおよびハツカダイコン等のアブラナ科；キク、ヒマワリ、レタス、ゴボウ、シュンギク、ショクヨウギク、エンダイブ、チコリー、キクイモ、ショクヨウタンポポ等のキク科；ダイズ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、ナタマメ、インゲンマメ等のマメ科；オカヒジキおよびホウレンソウ等のアカザ科；ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシおよびピーマン等のナス科；シソ、セージ、チョロギ、タイム、エゴマおよびハッカ等のシソ科；オクラ等のアオイ科；ニンジン、パセリ、セロリ、アシタバ、ミツバおよびセリ等のセリ科；リンゴ、サクランボおよびイチゴ等のバラ科；ジュンサイおよびハス等のスイレン科；サンショウ等のミカン科；ウドおよびタラノキ等のウコギ科；サツマイモ等のヒルガオ科；トウガン、スイカ、マクワウリ、メロン、キュウリ、カボチャ、ヘチマおよびニガウリ等のウリ科；等の植物が挙げられる。 Examples of dicotyledonous plants include rapeseed, daikon, wasabi daikon, broccoli, cauliflower, cabbage, mekabetsu, kairan, shiroinu nazuna, komatsuna, hakusai, mizuna, mustard, turnip, kale, mustard, takana, wasabi, chingensai, nozawana and tsukadaikon. Brassicaceae; Cucurbitaceae such as Kiku, Sunflower, Lettuce, Gobo, Shungiku, Shokuyougiku, Endive, Chicory, Kikuimo, Shokuyodanpopo; Brassicaceae such as; Brassicaceae such as eggplant, potato, tomato, pepper and pepper; Labiatae such as perilla, sage, chologi, thyme, egoma and cucurbit; And Labiatae such as Seri; Rosaceae such as apples, cherry and strawberry; Brassicaceae such as Junsai and Hass; Cucurbitaceae such as Japanese pepper; Cucurbitaceae such as Udo and Mustard; Plants such as Brassicaceae such as mustard, melon, cucumber, turnip, horseradish and carrot;
単子葉植物の例として、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、アワおよびソルガム等のイネ科；タロイモ、サトイモおよびハスイモ等のサトイモ科；ユリ、チューリップ、タマネギ、ラッキョウ、ネギ、ワケギ、ニンニク、アサツキ、ニラ、アスパラガスおよびヤマユリオニユリ等のユリ科；ヤマイモおよびジネンジョ等のヤマノイモ科；ミョウガおよびショウガ等のショウガ科；等の植物が挙げられる。 Examples of monocotyledonous plants include grasses such as rice, corn, wheat, barley, awa and sorghum; , Liliaceae such as Asparagus and Yamayurioniyuri; Yamidae such as Yam and Jinenjo; Araceae such as Myoga and Gyoga; and other plants.
本実施形態に係る植物体の例として、植物個体全体（例えば、成体、苗、種子および果実）、植物器官（例えば、根、茎、葉および花弁等）、植物細胞、植物組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、生殖器官および胚等）、カルス等が挙げられる。 Examples of plants according to the present embodiment include whole plant individuals (eg, adults, seedlings, seeds and fruits), plant organs (eg, roots, stems, leaves and petals, etc.), plant cells, plant tissues (eg, epidermis). , Sieve, soft tissue, xylem, canal bundle, reproductive organs and embryos, etc.), callus and the like.
また、本実施形態に係る植物体には、植物細胞を生育させた植物、上記植物体の、後代、子孫またはクローンである植物、および繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）が含まれる。 In addition, the plant body according to the present embodiment includes a plant in which plant cells are grown, a plant that is a protoplast, a protoplast or a clone of the above-mentioned plant body, and a breeding material (for example, seed, fruit, cut ear, clump stem, clump root). , Strains, callus, protoplasts, etc.) are included.
また、本実施形態に係る植物体には、交配によって得られた育種後代も含まれる。 In addition, the plant body according to the present embodiment also includes breeding progeny obtained by mating.
〔植物体の生産方法〕
本実施形態における植物体の生産方法は、植物体において、上記（１）〜（５）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のクロロフィル分解酵素遺伝子の発現を抑制するか、または上記クロロフィル分解酵素遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程と、上記（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現を抑制するか、または上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む。上記工程の順序は特に限定されず、同時に行ってもよい。
[Plant production method]
The method for producing a plant in the present embodiment is to suppress the expression of any one or more chlorophylle-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the above (1) to (5) in the plant, or to suppress the expression of the chlorophyll degrading enzyme gene. Inhibiting the function of the polypeptide encoded by the degrading enzyme gene and suppressing the expression of any one or more CaaX protease-like genes selected from the group consisting of the above (6) to (10), or the above. It comprises the step of inhibiting the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene. The order of the above steps is not particularly limited and may be performed at the same time.
本実施形態における植物体の生産方法において、「遺伝子の発現を抑制する工程」とは、「ゲノム上にある遺伝子が本来の機能を発揮しない状態となるように植物体を改変する」ことを意味する。したがって、「遺伝子の発現を抑制する工程」としては、「遺伝子を破壊する」および「遺伝子に変異を導入する」ことを含み得る。 In the method for producing a plant in the present embodiment, the "step of suppressing gene expression" means "modifying the plant so that the gene on the genome does not exert its original function". To do. Therefore, the "step of suppressing gene expression" may include "disrupting the gene" and "introducing a mutation into the gene".
「遺伝子を破壊する」は、ゲノム上に本来ある遺伝子が存在しない状態にすること、またはゲノム上にある遺伝子から転写産物が生成させないことを意味する。「遺伝子に変異を導入する」は、本来の機能的なタンパク質が生成されないよう遺伝子に変異を導入する、タンパク質が生成されるものの、生成される量が低下するよう遺伝子に変異を導入する、またはタンパク質が生成されるものの、タンパク質の安定性が低下するよう遺伝子に変異を導入することを意味している。 "Destructing a gene" means that the gene that is originally present in the genome does not exist, or that a transcript is not produced from the gene that is present in the genome. "Introducing a mutation into a gene" means introducing a mutation into the gene so that the original functional protein is not produced, or introducing a mutation into the gene so that the protein is produced but the amount produced is reduced. It means that a mutation is introduced into the gene so that the protein is produced but the stability of the protein is reduced.
また、「遺伝子の発現を抑制する工程」としては、当該遺伝子には変化を生じていないが、遺伝子の機能（ｍＲＮＡへの転写からそれに続くタンパク質への翻訳まで）が他の因子を介して修飾させて、タンパク質の生成量を低下させるか、またはタンパク質の生成を生じさせないように植物体を改変することも含み得る。 In addition, as a "step of suppressing gene expression", although no change has occurred in the gene, the function of the gene (from transcription to mRNA to subsequent translation into protein) is modified via other factors. It may also include modifying the plant to reduce protein production or prevent protein production.
本明細書において、「遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程」とは、ポリペプチドが生成されるものの、生成されるポリペプチドの量が低下することによって、ポリペプチドの本来の機能が発揮されないように植物体を改変すること、生成されるポリペプチドの量は抑制されないものの、活性を有しないか不完全な機能のみを有していることにより、ポリペプチドの本来の機能が発揮されないように植物体を改変することを含む。 In the present specification, the "step of inhibiting the function of a polypeptide encoded by a gene" means that although a polypeptide is produced, the original function of the polypeptide is reduced by reducing the amount of the produced polypeptide. By modifying the plant body so that it is not exerted, and although the amount of the polypeptide produced is not suppressed, the original function of the polypeptide is not exerted due to having no activity or only an incomplete function. Including modifying the plant as such.
例えば、本実施形態の植物体の生産方法において、上記（１）〜（５）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のクロロフィル分解酵素遺伝子および上記（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子に変異を導入することにより、当該遺伝子の発現を抑制または当該遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害することができる。変異の導入方法の例として、ゲノム編集法、物理的変異導入法、化学的変異導入法、およびトランスポゾンまたはアグロバクテリウムを使用する方法等が挙げられる。また、遺伝子の発現を抑制する方法として、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）およびアンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子に変異を導入するまたは発現を抑制する順序は特に限定されず、同時に行ってもよい。 For example, in the method for producing a plant of the present embodiment, any one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the above (1) to (5) and the group consisting of the above (6) to (10). By introducing a mutation into any one or more of the CaaX protease-like genes selected from the above, the expression of the gene can be suppressed or the function of the polypeptide encoded by the gene can be inhibited. Examples of the method for introducing a mutation include a genome editing method, a physical mutation introduction method, a chemical mutation introduction method, and a method using a transposon or Agrobacterium. Further, as a method for suppressing gene expression, RNA interference (RNAi), antisense RNA and the like can be mentioned. The order in which mutations are introduced or suppressed in the chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene is not particularly limited, and may be performed at the same time.
ゲノム編集法の例として、ＺＦＮ（zinc-finger nucleases）、ＴＡＬＥＮ（transcription activator-like effector nucleases）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム等が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムでは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮでは、融合タンパク質（ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼが融合されている）が、標的細胞内に存在すれば、ゲノム編集可能である。したがって、上記ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質、ならびに上記融合タンパク質はいずれも、標的細胞に直接的に導入され得る。これらを標的細胞に直接的に導入する方法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、およびパーティクルボンバードメント法などが挙げられる。 Examples of genome editing methods include ZFN (zinc-finger nucleases), TALEN (transcription activator-like effector nucleases), CRISPR-Cas9 system and the like. In the CRISPR-Cas9 system, the guide RNA and Cas9 protein are genome-editable, and in TALEN and ZFN, the fusion protein (which is fused with the DNA-binding domain and nuclease) is present in the target cell. Therefore, the guide RNA and Cas9 protein, as well as the fusion protein, can all be introduced directly into the target cell. Examples of methods for directly introducing these into target cells include a PEG method, an electroporation method, and a particle bombardment method.
物理的変異導入法の例として、放射線または紫外線照射による変異導入等が挙げられる。化学的変異導入法の例として、ＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）等の変異誘導物質による変異原処理等が挙げられる。 Examples of the physical mutation introduction method include mutation introduction by irradiation with radiation or ultraviolet rays. Examples of the chemical mutagen introduction method include mutagen treatment with a mutagen such as EMS (ethyl methanesulfonic acid).
本実施形態の植物体は、育種法によっても生産することができる。育種法としては、例えば、上記クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現が抑制された品種と任意の品種を交雑させることを特徴とする一般的な育種法（交雑育種法等）を挙げることができる。該方法によって、発現率が改善されたステイグリーン植物体を作出することができる。 The plant body of the present embodiment can also be produced by a breeding method. Examples of the breeding method include a general breeding method (cross breeding method, etc.) characterized by crossing an arbitrary variety with a variety in which the expression of the chlorophyll degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene is suppressed. Can be done. By this method, a stay green plant having an improved expression rate can be produced.
〔ステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法〕
また、本実施形態におけるステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法は上記（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現を抑制、または、上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含むものであればよく、その他の工程、条件、材料等については特に限定されるものではない。
[How to improve the germination rate or seedling rate of stay green plants]
In addition, the method for improving the germination rate or seedling rate of stay green plants in the present embodiment suppresses the expression of any one or more CaaX protease-like genes selected from the group consisting of the above (6) to (10). , Or, as long as it includes a step of inhibiting the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene, other steps, conditions, materials and the like are not particularly limited.
ステイグリーン植物の例として、自然突然変異等の変異により生じたステイグリーン植物等が挙げられる。また、ステイグリーン植物の例として、上記（１）〜（５）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のクロロフィル分解酵素遺伝子の発現が抑制された、または、上記クロロフィル分解酵素遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されたステイグリーン植物が挙げられる。 Examples of stay green plants include stay green plants produced by mutations such as natural mutations. Further, as an example of the stay green plant, the expression of any one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the above (1) to (5) was suppressed, or the above-mentioned chlorophyll-degrading enzyme gene was encoded. Examples include stay green plants in which the function of the polypeptide is inhibited.
上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現を抑制、または、上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程は、上述の〔植物体の生産方法〕と同様に、上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子に変異を導入することにより、当該遺伝子の発現を抑制または当該遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害することができる。変異の導入方法および遺伝子の発現を抑制する方法は、上述の〔植物体の生産方法〕と同様である。 The step of suppressing the expression of the CaaX protease-like gene or inhibiting the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene is mutated to the CaaX protease-like gene in the same manner as in the above-mentioned [method for producing a plant]. By introducing the gene, the expression of the gene can be suppressed or the function of the polypeptide encoded by the gene can be inhibited. The method for introducing the mutation and the method for suppressing the expression of the gene are the same as the above-mentioned [plant production method].
本明細書において、「発芽率または成苗率の改善」とは、従来のステイグリーン植物（クロロフィル分解抑制変異体）の発芽率または成苗率よりも高いことを示す。本明細書において、発芽率または成苗率には、発芽率、成苗率、本葉展開率およびアルビノ（白化）発生抑制率等が含まれる。また、本明細書において、「発芽率または成苗率」を「発芽・成苗率」と略記する場合がある。 In the present specification, "improvement of germination rate or seedling rate" means higher than the germination rate or seedling rate of a conventional stay green plant (chlorophyll degradation inhibitory mutant). In the present specification, the germination rate or the seedling rate includes the germination rate, the seedling rate, the true leaf development rate, the albino (whitening) occurrence suppression rate, and the like. Further, in the present specification, "germination rate or seedling rate" may be abbreviated as "germination / seedling rate".
〔発芽・成苗率が改善されたステイグリーン植物の選抜方法〕
本実施形態の選抜方法は、植物において、上記（１）〜（５）からなる群より選択されるクロロフィル分解酵素遺伝子および上記（６）〜（１０）からなる群より選択されるＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現が抑制されているか、または上記クロロフィル分解酵素遺伝子および上記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを判定する工程を含む。
[Selection method for stay green plants with improved germination and seedling rate]
The selection method of the present embodiment is a chlorophyll-degrading enzyme gene selected from the group consisting of the above (1) to (5) and a CaaX protease-like gene selected from the group consisting of the above (6) to (10) in a plant. It comprises a step of determining whether the expression of is suppressed or the function of the polypeptide encoded by the chlorophyll degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene is inhibited.
上記（１）〜（５）の遺伝子はクロロフィル分解酵素をコードし、上記（６）〜（１０）の遺伝子はＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質をコードしている。植物においてこれらの遺伝子の発現が抑制されているか否かを判定することにより、当該植物の発芽・成苗率が改善し、緑色を維持する表現型を有するか否かを簡易に判断できる。 The genes (1) to (5) above encode chlorophyll-degrading enzymes, and the genes (6) to (10) above encode CaaX protease-like proteins. By determining whether or not the expression of these genes is suppressed in a plant, it is possible to easily determine whether or not the plant has a phenotype in which the germination and seedling rate of the plant is improved and the green color is maintained.
具体的な判定方法については従来公知の方法を用いることができる。例えば、(i)対象となる植物からＤＮＡ試料を得て、遺伝子の有無または遺伝子に変異が入っているか否かを調べる方法、(ii)上記遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの有無または量を調べる方法、(iii)上記遺伝子の転写産物であるタンパク質の有無または量を調べる方法等を挙げることができる。 As a specific determination method, a conventionally known method can be used. For example, (i) a method of obtaining a DNA sample from a target plant and examining whether or not a gene is present or whether or not a gene is mutated, and (ii) examining the presence or absence or amount of mRNA which is a transcript of the above gene. Methods, (iii) methods for examining the presence or absence or amount of a protein that is a transcript of the above gene, and the like can be mentioned.
上記ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を調べる手法としては、従来公知の方法を利用できる。例えば、プローブを用いる手法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、抗体を用いた各種イムノアッセイ法、マイクロアレイを利用する方法等を挙げることができる。 As a method for examining the above-mentioned DNA, RNA or protein, a conventionally known method can be used. For example, a method using a probe, a PCR method, an RT-PCR method, various immunoassay methods using an antibody, a method using a microarray, and the like can be mentioned.
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明の以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。 Examples are shown below, and embodiments of the present invention will be described in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible for details. Furthermore, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the present invention also relates to an embodiment obtained by appropriately combining the disclosed technical means. It is included in the technical scope of the invention. In addition, all the documents described in the present specification are incorporated by reference.
〔実施例１〕シロイヌナズナの突然変異体の作製
アブラナ科であるシロイヌナズナについて、クロロフィルａ分解酵素遺伝子であるAtSGR1遺伝子（配列番号５）およびAtSGR2遺伝子（配列番号６）に変異を有するatsgr1atsgr2二重突然変異体（ＡｔｓｇｒＤＭ）は、Fudan大学のBunke Kuaiらのグループから譲渡されたＣｏｌ株由来の二重突然変異体を使用した。
[Example 1] Preparation of mutant of Shiroinu-nazuna Atsgr1 atsgr2 double mutation having mutations in AtSGR1 gene (SEQ ID NO: 5) and AtSGR2 gene (SEQ ID NO: 6), which are chlorophyll a-degrading enzyme genes, in Shiroinu-nazuna, which belongs to the family Abrana. For the body (AtsgrDM), a double mutant derived from the Col strain transferred from the group of Bunke Kuai et al. Of Fudan University was used.
また、ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子であるAtGSC1（AtYTH1）遺伝子（配列番号１３）に変異を有するatgsc1突然変異体は、ＡＢＲＣ（Arabidopsis Biological Resource）から入手した。ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子であるAtGSC2（AtYTH2）遺伝子（配列番号１４）に変異を有するatgsc2突然変異体は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集により作製した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集においては、ガイドＲＮＡとして塩基配列ＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＡＴＴＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号１７）を使用した。また、ゲノム編集用ベクターｐＥｇＰ１２６＿Ｐａｅｆ１−２ａ−ＧＦＢＳＤ２（Osakabe et al., Sci Rep 6, 26685, 2016）にこのガイドＲＮＡを組み込み、AtGSC1突然変異体へ導入ることにより、atgsc1atgsc2二重突然変異体（ＡｔｙｔｈＤＭ）を作製した。 In addition, an atgsc1 mutant having a mutation in the AtGSC1 (AtYTH1) gene (SEQ ID NO: 13), which is a CaaX protease-like gene, was obtained from ABRC (Arabidopsis Biological Resource). A atgsc2 mutant having a mutation in the AtGSC2 (AtYTH2) gene (SEQ ID NO: 14), which is a CaaX protease-like gene, was prepared by genome editing with CRISPR-Cas9. In the genome editing by CRISPR-Cas9, the nucleotide sequence GCAGGAATAGAATTACACAGG (SEQ ID NO: 17) was used as a guide RNA. In addition, by incorporating this guide RNA into the genome editing vector pEgP126_Paef1-2a-GFBSD2 (Osakabe et al., Sci Rep 6, 26685, 2016) and introducing it into the AtGSC1 mutant, the atgsc1 atgsc2 double mutant (AthythDM) ) Was prepared.
そして、ＡｔｓｇｒＤＭとＡｔｙｔｈＤＭを交雑することにより、クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方に変異を有する、atsgr1atsgr2 atyth1atyth2四重突然変異体（ＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍ）を作製した。各変異体は、ＰＣＲにより、目的の遺伝子に変異が導入されていることを確認した。 Then, by crossing AtsgrDM and AthysDM, an atsgr1atsgr2 atyth1atyth2 quadruple mutant (AtsgrAtyth4M) having mutations in both the chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene was prepared. For each mutant, it was confirmed by PCR that the mutation was introduced into the gene of interest.
〔実施例２〕ダイズの突然変異体の作製
マメ科であるダイズについて、クロロフィルａ分解酵素遺伝子であるGmSGR１（D2）遺伝子（配列番号７）およびGmSGR２（D1）遺伝子（配列番号８）に変異を有するgmsgr1gmsgr2二重突然変異体（天津大青豆）は、農業生物資源ジーンバンクから入手した。また、ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子であるGmYTH1（GmGSC1）遺伝子（配列番号１５）およびGmYTH2（GmGSC2）遺伝子（配列番号１６）に変異を有する、gmyth1gmyth2二重突然変異体（T139）はＵＳＤＡ（United States Department of Agriculture）から入手した。そして、gmsgr1gmsgr2二重突然変異体とgmyth1gmyth2二重突然変異体を交雑することにより、クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方に変異を有する、gmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2四重突然変異体を作製した。また、交雑することにより、クロロフィル分解酵素遺伝子CytG遺伝子（配列番号１８）およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方に変異を有する、cytG gmyth1gmyth2突然変異体を作製した。各変異体は、ＰＣＲにより、目的の遺伝子に変異が導入されていることを確認した。
[Example 2] Preparation of mutant of soybean In soybean, which is a legume family, mutations are made in the GmSGR1 (D2) gene (SEQ ID NO: 7) and the GmSGR2 (D1) gene (SEQ ID NO: 8), which are chlorophyll a degrading enzyme genes. The gmsgr1 gmsgr2 double mutant (Tianjin Dai-Aozu) with gmsgr1 was obtained from the Agricultural Bioresource Gene Bank. In addition, the gmyth1 gmyth2 double mutant (T139), which has mutations in the GmYTH1 (GmGSC1) gene (SEQ ID NO: 15) and GmYTH2 (GmGSC2) gene (SEQ ID NO: 16), which are CaaX protease-like genes, is USDA (United States Department of Agriculture). Obtained from Agriculture). Then, by crossing the gmsgr1 gmsgr2 double mutant and the gmyth1 gmyth2 double mutant, a gmsgr1 gmsgr2 gmyth1 gmyth2 quadruple mutant having mutations in both the chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene was prepared. In addition, by crossing, a cytG gmyth1 gmyth2 mutant having a mutation in both the chlorophyll-degrading enzyme gene CytG gene (SEQ ID NO: 18) and the CaaX protease-like gene was prepared. For each mutant, it was confirmed by PCR that the mutation was introduced into the gene of interest.
〔評価例１〕シロイヌナズナ種子の発芽率の測定
野生型のシロイヌナズナ、実施例１で作製したシロイヌナズナの突然変異体ＡｔｓｇｒＤＭおよびＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍの種子をそれぞれの処理区に約５０粒播種した。培地は１／２ＭＳ培地を使用し、無菌的に播種した。種子は吸水後、遮光した環境下で、４℃において４日間静置したものを播種した。播種後、９０μｍｏｌの蛍光灯下で、２２℃において３日間培地を静置した。播種後３日目の発芽率の測定結果を、図１に示す。
[Evaluation Example 1] Measurement of germination rate of Arabidopsis seeds About 50 seeds of wild-type Arabidopsis thaliana, Arabidopsis mutants AtsgrDM and AtsgrAthys4M prepared in Example 1 were sown in each treatment group. As the medium, 1 / 2MS medium was used and aseptically seeded. After absorbing water, the seeds were sown after being allowed to stand at 4 ° C. for 4 days in a light-shielded environment. After sowing, the medium was allowed to stand at 22 ° C. for 3 days under a 90 μmol fluorescent lamp. The measurement result of the germination rate on the third day after sowing is shown in FIG.
図１中、「Ｃｏｌ」は野生型のシロイヌナズナを示す。２回の反復実験を行い、各処理区の左側が１回目の結果、右側が２回目の結果を示す。図１に示すとおり、クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方に変異を有することにより、クロロフィル分解酵素遺伝子変異により生じる発芽率低下を抑制した。そして、ＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍは野生型のシロイヌナズナと同等の発芽率まで発芽率が回復することがわかった。 In FIG. 1, "Col" indicates a wild-type Arabidopsis thaliana. Two iterative experiments were performed, and the left side of each treatment group shows the result of the first time, and the right side shows the result of the second time. As shown in FIG. 1, by having mutations in both the chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene, the decrease in germination rate caused by the chlorophyll-degrading enzyme gene mutation was suppressed. Then, it was found that the germination rate of AtsgrAtyth4M was restored to the same germination rate as that of wild-type Arabidopsis thaliana.
〔評価例２〕シロイヌナズナ葉のクロロフィル含量の測定
野生型のシロイヌナズナ、実施例１で作製したシロイヌナズナの突然変異体ＡｔｓｇｒＤＭおよびＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍの種子を評価例１と同様の条件で低温処理した後、培養土に播種した。播種後２５日目のシロイヌナズナの上から数えて８枚目の葉を切り取り、遮光した環境下（暗黒処理下）で、２２℃において高湿条件下で静置した。ＳＰＡＤ葉緑素計（コニカミノルタ社製）によって葉のクロロフィル含量を測定した。クロロフィル含量の測定結果を図２に示す。
[Evaluation Example 2] Measurement of chlorophyll content in Arabidopsis leaves The seeds of wild-type Arabidopsis thaliana, Arabidopsis mutants AtsgrDM and AtsgrAthys4M prepared in Example 1 were subjected to low-temperature treatment under the same conditions as in Evaluation Example 1 and then put into a culture soil. Seeded. Eighth leaves of Arabidopsis thaliana counting from the top of Arabidopsis thaliana on the 25th day after sowing were cut off and allowed to stand at 22 ° C. under high humidity conditions in a shaded environment (under dark treatment). The chlorophyll content of leaves was measured by a SPAD chlorophyll meter (manufactured by Konica Minolta). The measurement result of the chlorophyll content is shown in FIG.
図２の縦軸は、クロロフィル含量（相対値）を示し、暗黒処理前の葉のクロロフィル含量を１とする。各処理区について、３〜４回の反復実験を行った。図２の測定値は、平均値±標準誤差を示す。図２に示すとおり、ＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４ＭおよびＡｔｓｇｒＤＭはＣｏｌ（野生型のシロイヌナズナ）に比べて、葉に含まれるクロロフィル含量の低下が抑制された。 The vertical axis of FIG. 2 shows the chlorophyll content (relative value), and the chlorophyll content of the leaves before dark treatment is 1. Repeated experiments were performed 3 to 4 times for each treatment group. The measured values in FIG. 2 show the mean ± standard error. As shown in FIG. 2, AtsgrAtyth4M and AtsgrDM suppressed the decrease in chlorophyll content in leaves as compared with Col (wild-type Arabidopsis thaliana).
〔評価例３〕シロイヌナズナ種子の色の観察
野生型のシロイヌナズナ、実施例１で作製したシロイヌナズナの突然変異体ＡｔｓｇｒＤＭ、ＡｔｙｔｈＤＭおよびＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍの種子の色を観察した。種子の色は、純水にサスペンドした状態で観察した。図３は、各シロイヌナズナの種子の写真を示す。
[Evaluation Example 3] Observation of Arabidopsis Seed Color The seed colors of wild-type Arabidopsis thaliana and Arabidopsis mutants AtsgrDM, AtithDM, and AtsgrAtith4M prepared in Example 1 were observed. The seed color was observed in a state of being suspended in pure water. FIG. 3 shows a photograph of the seeds of each Arabidopsis thaliana.
図３に示すように、野生型のシロイヌナズナ（Ｃｏｌ）、ＡｔｙｔｈＤＭおよびＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍの種子の色はうす茶色であった。一方、ＡｔｓｇｒＤＭの種子の色はクロロフィル分解酵素に変異を有するため、クロロフィルが種子に蓄積し、種子の色は茶緑色であった。ＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍは、クロロフィル分解酵素遺伝子のサプレッサー遺伝子であるＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子にも変異が導入されているため、クロロフィル分解酵素遺伝子変異による種子へのクロロフィル蓄積が抑制された。 As shown in FIG. 3, the seed colors of wild-type Arabidopsis thaliana (Col), AthysDM and AtsgrAtyth4M were light brown. On the other hand, since the seed color of AtsgrDM had a mutation in the chlorophyll degrading enzyme, chlorophyll was accumulated in the seed and the seed color was brownish green. Since mutations were also introduced into the CaaX protease-like gene, which is a suppressor gene of the chlorophyll-degrading enzyme gene, AtsgrAtyth4M suppressed the accumulation of chlorophyll in seeds due to the chlorophyll-degrading enzyme gene mutation.
〔評価例１〜３のまとめ〕
図４は、評価例１〜３の結果をまとめたものである。図４の上段は、評価例２における、暗黒処理後６日目の葉の写真を示す。図４の下段は、評価例３における、種子の写真と、評価例２と同様に播種した、播種後７日目のシロイヌナズナの子葉を示す写真である。
[Summary of Evaluation Examples 1 to 3]
FIG. 4 summarizes the results of evaluation examples 1 to 3. The upper part of FIG. 4 shows a photograph of the leaves on the 6th day after the dark treatment in Evaluation Example 2. The lower part of FIG. 4 is a photograph of seeds in Evaluation Example 3 and a photograph showing cotyledons of Arabidopsis thaliana sown in the same manner as in Evaluation Example 2 on the 7th day after sowing.
図４に示すように、野生型のシロイヌナズナは、播種後７日目にほとんどの種子から正常な発芽・子葉の発達が観察された。一方、暗黒処理から６日経過した葉は、クロロフィル含量が減少し、葉が黄変した。クロロフィル分解酵素遺伝子に変異が導入されたＡｔｓｇｒＤＭは、暗黒処理から６日経過した葉のクロロフィル含量の減少は抑制された。一方、播種後３日目の発芽率は約５０％と、野生型のシロイヌナズナと比較して大きく減少した。 As shown in FIG. 4, in the wild-type Arabidopsis thaliana, normal germination and cotyledon development were observed from most of the seeds 7 days after sowing. On the other hand, in the leaves 6 days after the dark treatment, the chlorophyll content decreased and the leaves turned yellow. AtsgrDM, in which a mutation was introduced into the chlorophyll-degrading enzyme gene, suppressed a decrease in the chlorophyll content of leaves 6 days after dark treatment. On the other hand, the germination rate on the third day after sowing was about 50%, which was significantly reduced as compared with the wild-type Arabidopsis thaliana.
クロロフィル分解酵素遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方に変異を有するＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍは、播種後７日目の発芽率は野生型のシロイヌナズナと同等であり、アルビノ個体も観察されなかった。また、暗黒処理から６日経過した葉のクロロフィル含量の減少は、クロロフィル分解酵素遺伝子に変異が導入されたＡｔｓｇｒＤＭと同様に抑制された。すなわち、ＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍは、発芽・成苗率が高いステイグリーン系統であることが分かった。 AtsgrAtyth4M, which has mutations in both the chlorophyll-degrading enzyme gene and the CaaX protease-like gene, had a germination rate equivalent to that of wild-type Arabidopsis thaliana on the 7th day after seeding, and no albino individuals were observed. In addition, the decrease in chlorophyll content of leaves 6 days after dark treatment was suppressed in the same manner as AtsgrDM in which a mutation was introduced into the chlorophyll degrading enzyme gene. That is, it was found that AtsgrAtyth4M is a stay green line having a high germination / seedling rate.
〔評価例４〕ダイズの本葉展開率の測定
市販されているダイズ（品種名：フクユタカおよびキヨミドリ）、ジーンバンクより入手した在来種・天津大青豆、実施例２で作製したダイズの突然変異体cytG gmyth1gmyth2およびgmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2の種子をそれぞれの処理区に１５粒播種した。種子は調湿した環境下（高湿度状態）で、４℃において３日間静置したものを培養土に播種した。播種後、明条件下で、２５℃において９日間培地を静置した。播種後７〜８日目の各ダイズ系統の本葉展開率（発芽・成苗率）の測定結果を図５に示す。
[Evaluation Example 4] Measurement of true leaf development rate of soybean Commercially available soybean (variety name: Fukuyutaka and Kiyomidori), native species Tianjin large green soybean obtained from Genebank, mutation of soybean produced in Example 2. 15 seeds of body cytG gmyth1 gmyth2 and gmsgr1 gmsgr2 gmyth1 gmyth2 were sown in each treatment plot. The seeds were allowed to stand at 4 ° C. for 3 days in a humidity-controlled environment (high humidity) and sown in the culture soil. After sowing, the medium was allowed to stand at 25 ° C. for 9 days under light conditions. FIG. 5 shows the measurement results of the true leaf development rate (germination / seedling rate) of each soybean line 7 to 8 days after sowing.
「フクユタカ」は、一般的な栽培ダイズであり、GmYTH１遺伝子に変異を有する。「キヨミドリ」は、クロロフィル分解制御遺伝子であるCytG遺伝子に変異を有するダイズである。「天津大青豆」は、クロロフィル分解酵素遺伝子であるGmSGR1遺伝子およびGmSGR2遺伝子の両方に変異を有するダイズである。なお、ダイズの場合、クロロフィル分解酵素遺伝子であるGmSGR1遺伝子およびGmSGR2遺伝子の両方に変異を有さないと、表現型（種子の緑色化）が現れない。 "Fukuyutaka" is a common cultivated soybean and has a mutation in the GmYTH1 gene. "Kiyomidori" is soybean having a mutation in the CytG gene, which is a chlorophyll degradation control gene. "Tianjin pea" is a soybean having mutations in both the GmSGR1 gene and the GmSGR2 gene, which are chlorophyll-degrading enzyme genes. In the case of soybean, the phenotype (greening of seeds) does not appear unless both the GmSGR1 gene and the GmSGR2 gene, which are chlorophyll-degrading enzyme genes, are mutated.
図５に示すように、クロロフィル分解酵素遺伝子GmSGR1とGmSGR2に変異が導入されている天津大青豆、クロロフィル分解制御遺伝子CytGに変異が導入されているキヨミドリは、フクユタカに比べて本葉展開率が低かった。一方、クロロフィル分解酵素遺伝子（GmSGR1とGmSGR2）およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方に変異が導入されている「gmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2」の本葉展開率は、天津大青豆の本葉展開率より高かった。CytG遺伝子およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方に変異が導入されている「cytG gmyth1gmyth2」の本葉展開率も、キヨミドリの本葉展開率よりも高かった。 As shown in FIG. 5, Tianjin large green beans with mutations in the chlorophyll-degrading enzyme genes GmSGR1 and GmSGR2 and Kiyomidori with mutations in the chlorophyll degradation control gene CytG have lower true leaf expansion rates than Fukuyutaka. It was. On the other hand, the true leaf expansion rate of "gmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2" in which mutations were introduced into both the chlorophyll-degrading enzyme genes (GmSGR1 and GmSGR2) and the CaaX protease-like gene was higher than the true leaf expansion rate of Tianjin large green beans. The true leaf expansion rate of "cytG gmyth1 gmyth2" in which mutations were introduced into both the CytG gene and the CaaX protease-like gene was also higher than that of Kiyomidori.
〔評価例５〕ダイズの種子の色の観察
評価例４で評価した各ダイズ系統の種子の色を観察した。図６は、各ダイズの種子の写真を示す。
[Evaluation Example 5] Observation of Seed Color of Soybean The color of seeds of each soybean line evaluated in Evaluation Example 4 was observed. FIG. 6 shows a photograph of each soybean seed.
図６に示すように、天津大青豆の種子の色はクロロフィル分解酵素の発現が抑制されているため、クロロフィルが種子に蓄積し、種子の色はＰＡＮＴＯＮＥ（登録商標）３７８Ｃに近似した緑色であった。また、キヨミドリもクロロフィル分解が抑制されているため、クロロフィルが種子に蓄積し、種子の色はＰＡＮＴＯＮＥ（登録商標）６２８Ｃに近似した緑色であった。 As shown in FIG. 6, since the expression of chlorophyll-degrading enzyme is suppressed in the seed color of Tianjin large green beans, chlorophyll is accumulated in the seed, and the seed color is green similar to PANTONE® 378C. It was. In addition, since the decomposition of chlorophyll was suppressed in Kiyomidori, chlorophyll was accumulated in the seeds, and the color of the seeds was green, which was close to PANTONE (registered trademark) 628C.
一方、クロロフィル分解酵素遺伝子GmSGR1（D2）とGmSGR2（D1）およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の両方に変異が導入されている「gmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2」の種子の色は、ＰＡＮＴＯＮＥ（登録商標）７４０３Ｃに近似した黄色であった。すなわち、「gmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2」は、クロロフィル分解抑制突然変異のサプレッサー遺伝子であるＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子に変異が導入されているため、クロロフィル分解酵素遺伝子変異による種子へのクロロフィル蓄積が抑制された。 On the other hand, the seed color of "gmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2" in which mutations have been introduced into both the chlorophyll-degrading enzyme genes GmSGR1 (D2) and GmSGR2 (D1) and the CaaX protease-like gene is yellow, which is similar to PANTONE® 7403C. there were. That is, in "gmsgr1 gmsgr2 gmyth1 gmyth2", a mutation was introduced into the CaaX protease-like gene, which is a suppressor gene of the chlorophyll degradation inhibitory mutation, so that the accumulation of chlorophyll in the seed due to the chlorophyll degrading enzyme gene mutation was suppressed.
評価例４および５の結果はそれぞれ、評価例１および３と同様の結果が得られた。したがって、クロロフィル分解酵素遺伝子であるGmSGR1（D2）とGmSGR2（D1）およびＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子GmYTH1GmYTH2に変異が導入されている「gmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2」は、シロイヌナズナの変異体ＡｔｓｇｒＡｔｙｔｈ４Ｍと同様に、発芽・成苗率が高いステイグリーン系統であることが示唆された。また、シロイヌナズナに内在するYTHタイプのＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質（配列番号９、１０）に対して、ダイズに内在するYTHタイプのＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質（配列番号１１、１２）の配列同一性は６７．２％〜５３．７％であった。 The results of Evaluation Examples 4 and 5 were similar to those of Evaluation Examples 1 and 3, respectively. Therefore, "gmsgr1gmsgr2 gmyth1gmyth2", in which mutations have been introduced into the chlorophyll-degrading enzyme genes GmSGR1 (D2) and GmSGR2 (D1) and the CaaX protease-like gene GmYTH1GmYTH2, has the same germination rate and germination rate as Arabidopsis thaliana. It was suggested that this is a high stay green strain. In addition, the sequence identity of the YTH-type CaaX protease-like protein (SEQ ID NOs: 11 and 12) contained in soybean is 67.2 with respect to the YTH-type CaaX protease-like protein (SEQ ID NOs: 9 and 10) contained in Arabidopsis thaliana. It was% to 53.7%.
本発明によれば、発芽・成苗率が改善されたステイグリーン植物を得ることができる。また、本発明は、食品、農業および園芸等の分野に利用することができる。 According to the present invention, a stay green plant having an improved germination / seedling rate can be obtained. The present invention can also be used in fields such as food, agriculture and horticulture.
Claims (7)
さらに、以下の（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現が抑制されているか、または前記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている、植物体：
（１）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列番号１〜４のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（３）配列番号１〜４に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（４）配列番号５〜８のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子。 The expression of any one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the following (1) to (5) is suppressed, or the function of the polypeptide encoded by the chlorophyll-degrading enzyme gene is inhibited. And
Furthermore, the expression of any one or more CaaX protease-like genes selected from the group consisting of the following (6) to (10) is suppressed, or the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene is Inhibited plant body:
(1) A gene encoding a protein having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
(2) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and a chlorophyll-degrading enzyme. A gene encoding a protein that functions as
(3) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 4 and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(4) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5 to 8;
(5) A gene encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (1) to (4) above and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12;
(7) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and CaaX protease-like. A gene encoding a protein that functions as a protein;
(8) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12 and functions as a CaaX protease-like protein;
(9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16;
(10) A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (6) to (9) above under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. ..
以下の（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現が抑制するか、または前記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害する工程を含む、植物体の生産方法：
（１）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列番号１〜４のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（３）配列番号１〜４に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（４）配列番号５〜８のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子。 In a plant, the expression of any one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the following (1) to (5) is suppressed, or the function of the polypeptide encoded by the chlorophyll-degrading enzyme gene. And the process of inhibiting
A step of suppressing the expression of any one or more CaaX protease-like genes selected from the group consisting of the following (6) to (10) or inhibiting the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene. Plant production methods, including:
(1) A gene encoding a protein having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
(2) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and a chlorophyll-degrading enzyme. A gene encoding a protein that functions as
(3) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 4 and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(4) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5 to 8;
(5) A gene encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (1) to (4) above and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12;
(7) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and CaaX protease-like. A gene encoding a protein that functions as a protein;
(8) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12 and functions as a CaaX protease-like protein;
(9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16;
(10) A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (6) to (9) above under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. ..
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子。 A step of suppressing the expression of any one or more CaaX protease-like genes selected from the group consisting of the following (6) to (10), or inhibiting the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene. How to improve the germination rate or seedling rate of stay green plants, including:
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12;
(7) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and CaaX protease-like. A gene encoding a protein that functions as a protein;
(8) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12 and functions as a CaaX protease-like protein;
(9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16;
(10) A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (6) to (9) above under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. ..
以下の（６）〜（１０）からなる群より選択されるいずれか１つ以上のＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子の発現を抑制する、または、前記ＣａａＸプロテアーゼ様遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、ステイグリーン植物の発芽率または成苗率を改善する方法：
（１）配列番号１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列番号１〜４のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（３）配列番号１〜４に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（４）配列番号５〜８のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、クロロフィル分解酵素として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列番号９〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列番号９〜１２のいずれかに記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列番号９〜１２に記載されるアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有し、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列番号１３〜１６のいずれかに記載される塩基配列からなる遺伝子；
（１０）上記（６）〜（９）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＣａａＸプロテアーゼ様タンパク質として機能するタンパク質をコードする遺伝子。 The expression of one or more chlorophyll-degrading enzyme genes selected from the group consisting of the following (1) to (5) was suppressed, or the function of the polypeptide encoded by the chlorophyll-degrading enzyme gene was inhibited. In the stay green plant
A step of suppressing the expression of any one or more CaaX protease-like genes selected from the group consisting of the following (6) to (10), or inhibiting the function of the polypeptide encoded by the CaaX protease-like gene. How to improve the germination rate or seedling rate of stay green plants, including:
(1) A gene encoding a protein having the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
(2) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 4, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and a chlorophyll-degrading enzyme. A gene encoding a protein that functions as
(3) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 4 and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(4) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5 to 8;
(5) A gene encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (1) to (4) above and functions as a chlorophyll-degrading enzyme;
(6) A gene encoding a protein having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12;
(7) In the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9 to 12, one or several amino acid residues consist of an amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and CaaX protease-like. A gene encoding a protein that functions as a protein;
(8) A gene encoding a protein that has 50% or more sequence identity with respect to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 to 12 and functions as a CaaX protease-like protein;
(9) A gene consisting of the nucleotide sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13 to 16;
(10) A gene encoding a protein that hybridizes with a polynucleotide having a base sequence complementary to any of the genes (6) to (9) above under stringent conditions and functions as a CaaX protease-like protein. ..
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114467760A (en) * | 2022-04-15 | 2022-05-13 | 三亚南京农业大学研究院 | Method for inducing and proliferating calluses of water lily mature embryos |
| CN114467760B (en) * | 2022-04-15 | 2022-07-26 | 三亚南京农业大学研究院 | Water lily mature embryo callus induction and proliferation method |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7367923B2 (en) | 2023-10-24 |
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