JP2020534797A - リガンド指向型抗体設計の方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、とりわけ、標的タンパク質に対する抗体を生成する方法を提供する。幾つかの実施形態において、抗原結合領域、及び標的タンパク質に結合するリガンドを含む複数のテザー抗体を含むライブラリーが提供される。幾つかの実施形態において、標的タンパク質への結合についての複数の候補抗体を含むライブラリーが提供される。【選択図】図１

Description

[2]伝統的な動物免疫又はｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法による、膜タンパク質、例えば、膜貫通型受容体、酵素又は構造タンパク質を認識し、モジュレートする親和性試薬の開発は、困難である。膜タンパク質を標的にする抗体が少数存在するが、開発の成功率は、溶解性又は抹消のアンカードタンパク質を標的にする抗体に比べ、劣っている。これらの抗体の大部分は、膜タンパク質機能をモジュレートしない。

[3]膜タンパク質を認識し、モジュレートする親和性試薬の開発の改善された方法及びそのための組成物が依然として必要とされている。

[4]例えば、ＧＰＣＲ、イオンチャネル結合受容体、ウイルス受容体、又は酵素結合タンパク質受容体等のような、膜タンパク質におけるエピトープを特異的に標的にする抗体及び抗体フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ及びＩｇＧを開発する方法が、本明細書において提供される。本明細書において開示される方法及び組成物は、天然のリガンド親和性を利用して、膜タンパク質の活性部位、例えば、ＧＰＣＲの活性部位に対する固有のバイアスを有する抗体バリアントのライブラリーを生成する新規ストラテジーを提供する。幾つかの実施形態において、無作為化ＣＤＲ配列を有する抗体を提示するファージライブラリーを使用する代わりに、ＣＤＲの１つ又はＮ末端内でコードされるか、又は架橋結合した天然のリガンドを有する焦点が絞られた抗体ライブラリーが、生成される。これらの方法は、例えば、ＧＰＣＲ及び他の不可欠な膜タンパク質を含む、不十分なエピトープ暴露を用いて高価値の標的に対する抗体（例えば、アゴニストとアンタゴニストの両方）の迅速な生成を可能にする。

[5]本開示は、とりわけ、（ａ）抗原結合領域、及び標的タンパク質のエピトープに結合するリガンドを含むテザー抗体鋳型を用意する工程；（ｂ）リガンドとエピトープの間の結合部位に隣接する抗原結合領域の、１個又は複数の接触領域を無作為化することにより、第１のライブラリーを生成する工程；（ｃ）第１のライブラリーをスクリーニングして、リガンドと比較して、エピトープに対して改善された結合親和性を有する１個又は複数の抗体を同定する工程；（ｄ）工程（ｃ）において同定された１個又は複数の抗体の、リガンドを有する領域を無作為化することにより、第２のライブラリーを生成する工程；（ｅ）第２のライブラリーをスクリーニングして、リガンドと比較して、同じ又は改善された親和性で標的タンパク質に結合する１個又は複数の抗体を同定する工程を含む、標的タンパク質に対する抗体を生成する方法及び組成物を提供する。

[6]実施形態において、エピトープは、機能的エピトープである。実施形態において、生成された抗体は、アゴニスト又はアンタゴニストである。実施形態において、生成された抗体は、アゴニスト又はアンタゴニストではない。

[7]幾つかの実施形態において、標的タンパク質は、膜タンパク質である。幾つかの実施形態において、膜タンパク質は、膜貫通型受容体、酵素又は構造タンパク質である。幾つかの実施形態において、膜貫通型受容体は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル結合受容体、ウイルス受容体、又は酵素結合タンパク質受容体である。幾つかの実施形態において、酵素結合タンパク質受容体は、受容体チロシンキナーゼである。幾つかの実施形態において、機能的エピトープは、活性部位である。幾つかの実施形態において、活性部位は、リガンド結合部位である。幾つかの実施形態において、活性部位は、触媒部位である。

[8]幾つかの実施形態において、テザー抗体鋳型の抗原結合領域は、ペプチド結合を介してリガンドに融合される。幾つかの実施形態において、テザー抗体鋳型の抗原結合領域は、共有結合を介してリガンドに結合される。幾つかの実施形態において、共有結合は、ジスルフィド結合である。幾つかの実施形態において、テザー抗体は、結合される。実施形態において、テザー抗体は、ソルターゼ又はトランスグルタミナーゼにより結合される。幾つかの実施形態において、テザー抗体の抗原結合領域は、抗体フラグメントである。幾つかの実施形態において、テザー抗体鋳型の抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＩｇＧである。幾つかの実施形態において、テザー抗体鋳型の抗原結合領域は、ｓｃＦｖである。

[9]幾つかの実施形態において、リガンドは、ペプチドである。幾つかの実施形態において、リガンドは、低分子化合物である。幾つかの実施形態において、リガンドは、抗原結合領域のＣＤＲに融合又は結合される。幾つかの実施形態において、リガンドは、軽鎖可変領域のＮ末端又はＣ末端に融合又は結合される。幾つかの実施形態において、抗原結合領域は、ｓｃＦｖであり、リガンドは、ｓｃＦｖのＣ末端に融合又は結合される。幾つかの実施形態において、リガンドは、抗原結合領域にリガンドのＮ末端又はＣ末端を介して融合又は結合される。幾つかの実施形態において、抗原結合領域とリガンドの間に結合ループが存在する。幾つかの実施形態において、結合ループは、ペプチドである。幾つかの実施形態において、ペプチドは、３〜５０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチドは、３〜２１個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、結合ループは、タンパク質である。

[10]幾つかの実施形態において、方法は、結合ループを最適化する工程をさらに含む。幾つかの実施形態において、結合ループを最適化する工程は、様々な長さを有する複数のペプチドを含むミニライブラリーをスクリーニングする工程を含む。幾つかの実施形態において、結合ループは、酵素切断部位を含む。幾つかの実施形態において、酵素切断部位は、トロンビン切断部位である。

[11]幾つかの実施形態において、工程（ａ）に先立ち、方法は、複数の候補テザー抗体鋳型を設計する工程；及び機能的エピトープに対する所望の結合親和性を有するテザー抗体鋳型を選択する工程をさらに含む。幾つかの実施形態において、設計工程は、抗原結合領域及び／又はリガンドの構造解析を含む。幾つかの実施形態において、複数の候補テザー抗体鋳型は、ファージディスプレイにより提示される。幾つかの実施形態において、複数の候補テザー抗体鋳型は、ペリプラズムにおいて溶解性タンパク質として発現される。幾つかの実施形態において、複数の候補テザー抗体鋳型は、Ｍ１３ファージコートタンパク質ｇｐＩＩＩへの融合物として発現される。

[12]幾つかの実施形態において、選択する工程は、ホールセルパニングを含む。幾つかの実施形態において、選択する工程は、ホールセルＥＬＩＳＡを含む。幾つかの実施形態において、機能的エピトープに対する選択されたテザー抗体鋳型の所望の結合親和性は、１０ｎＭより高いｋ_ｄを有する。幾つかの実施形態において、１個又は複数の接触領域は、リガンドと機能的エピトープの間の結合部位を囲む１３〜１６個の残基を含む。

[13]幾つかの実施形態において、１個又は複数の接触領域は、１個又は複数の停止コドン及び／又制限酵素切断部位を組み込むこと、１個又は複数の停止コドン及び／又は制限酵素部位を部位特異的変異誘発により置換し、ＤＮＡ鋳型を得て、得られたＤＮＡ鋳型をローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）により増幅し、これにより、第１のライブラリーを生成することにより、無作為化される。幾つかの実施形態において、ＲＣＡは、エラープローンＲＣＡである。幾つかの実施形態において、１個又は複数の接触領域は、テザー抗体鋳型の、リガンドを有する領域を変化させることなく、無作為化される。幾つかの実施形態において、第１のライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。幾つかの実施形態において、第１のライブラリーは、少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２の多様性を有する。幾つかの実施形態において、第１のライブラリーをスクリーニングする工程は、ホールセルパニングを含む。幾つかの実施形態において、ホールセルパニングは、エマルジョンベースである。幾つかの実施形態において、機能的エピトープに対する改善された結合親和性を有する１個又は複数の抗体は、フリーのリガンドを使用した競合アッセイにより選択される。

[14]幾つかの実施形態において、第２のライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。幾つかの実施形態において、第２のライブラリーは、ＲＣＡにより生成される。幾つかの実施形態において、ＲＣＡは、エラープローンＲＣＡである。幾つかの実施形態において、エラープローンＲＣＡは、１〜１０％の変異の割合を有する。幾つかの実施形態において、第２のライブラリーをスクリーニングする工程は、ホールセルパニングを含む。幾つかの実施形態において、方法は、工程（ｅ）において同定された１個又は複数のリガンドフリーな抗体を検証する工程をさらに含む。幾つかの実施形態において、１個又は複数のリガンドフリーな抗体は、機能的アッセイにより検証される。幾つかの実施形態において、工程（ｅ）において同定された１個又は複数のリガンドフリーな抗体を検証する工程は、ｓｃＦｖをＩｇＧに変換する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、１個又は複数のリガンドフリーな抗体が、アンタゴニスト抗体又はアゴニスト抗体であるかを決定する工程をさらに含む。幾つかの実施形態において、目的の標的タンパク質に対する機能的抗体が、生成される。幾つかの実施形態において、第１のライブラリーが、生成される。幾つかの実施形態において、第２のライブラリーが、生成される。

[15]１つの態様において、ライブラリーは、抗原結合領域、及び標的タンパク質に結合するリガンドを含む複数のテザー抗体を含み、複数のテザー抗体は、テザー抗体鋳型からもたらされ、リガンド及び標的タンパク質のエピトープの結合部位に隣接する無作為化された１個又は複数の接触領域を含む。実施形態において、エピトープは、機能的エピトープである。幾つかの実施形態において、複数のテザー抗体は、変化していない、リガンドを有する領域を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合領域は、ペプチド結合を介してリガンドに融合される。幾つかの実施形態において、抗原結合領域は、共有結合を介してリガンドに結合される。幾つかの実施形態において、共有結合は、ジスルフィド結合である。幾つかの実施形態において、抗原結合領域は、抗体フラグメントである。幾つかの実施形態において、抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＩｇＧである。幾つかの実施形態において、抗原結合領域は、ｓｃＦｖである。

[16]幾つかの実施形態において、リガンドは、ペプチドである。幾つかの実施形態において、リガンドは、低分子化合物である。幾つかの実施形態において、リガンドは、ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は糖である。幾つかの実施形態において、リガンドは、抗原結合領域のＣＤＲに融合又は結合される。幾つかの実施形態において、リガンドは、軽鎖可変領域のＮ末端又はＣ末端に融合又は結合される。幾つかの実施形態において、抗原結合領域は、ｓｃＦｖであり、リガンドは、ｓｃＦｖのＣ末端に融合又は結合される。幾つかの実施形態において、リガンドは、抗原結合領域にリガンドのＮ末端又はＣ末端を介して融合又は結合される。

[17]幾つかの実施形態において、抗原結合領域とリガンドの間に結合ループが存在する。幾つかの実施形態において、結合ループは、ペプチドである。幾つかの実施形態において、ペプチドは、３〜５０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、ペプチドは、３〜２１個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、結合ループは、酵素切断部位を含む。幾つかの実施形態において、酵素切断部位は、トロンビン切断部位である。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。幾つかの実施形態において、複数のテザー抗体は、ペリプラズムにおいて溶解性タンパク質として発現される。幾つかの実施形態において、複数のテザー抗体は、Ｍ１３ファージコートタンパク質ｇｐＩＩＩへの融合物として発現される。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２の多様性を有する。

[18]１つの態様において、標的タンパク質への結合についての複数の候補抗体を含むライブラリーが提供され、複数の候補抗体は、リガンドと標的タンパク質のエピトープの間の結合部位に隣接する１個又は複数の接触領域、及びエピトープと接触しリガンドと競合する、リガンドを有する領域を含む親抗体からもたらされ、複数の候補抗体は、無作為化された、リガンドを有する領域を含む。実施形態において、エピトープは、機能的エピトープである。

[19]幾つかの実施形態において、複数の候補抗体は、実質的に同一の１個又は複数の接触領域を含む。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。幾つかの実施形態において、複数の候補抗体は、ペリプラズムにおいて溶解性タンパク質として発現される。幾つかの実施形態において、複数のテザー抗体は、Ｍ１３ファージコートタンパク質ｇｐＩＩＩへの融合物として発現される。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２の多様性を有する。

[20]１つの態様において、（ａ）抗原結合領域、及び標的タンパク質のエピトープに結合するリガンドを含むテザー抗体鋳型を用意する工程；（ｂ）リガンドとエピトープの間の結合部位に隣接する抗原結合領域の、１個又は複数の接触領域を無作為化することにより、第１のライブラリーを生成する工程；（ｃ）第１のライブラリーをスクリーニングして、リガンドと比較して、エピトープへの改善された結合親和性を有する１個又は複数の結合剤を同定する工程；（ｄ）工程（ｃ）において同定された１個又は複数の結合剤の、リガンドを有する領域を無作為化することにより、第２のライブラリーを生成する工程；（ｅ）第２のライブラリーをスクリーニングして、リガンドと比較して、同じ又は改善された親和性で標的タンパク質に結合する１個又は複数の結合剤を同定する工程を含む、標的タンパク質に対する結合剤を生成する方法が提供される。実施形態において、リガンドは、ペプチド模倣又はアプタマーである。

[21]本出願において使用される、用語「約」及び「およそ」は、均等なものとして使用される。本明細書における刊行物、特許、又は特許出願への任意の引用は、それらの全体が参照により取り込まれる。約／およそと共に又はなしで本出願において使用される任意の数は、当業者により認識される任意の通常の変動をカバーすることを意味する。

[22]本発明の他の特性、目的、及び利点は、続く詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明が、本発明の実施形態を示しながら、制限ではなく説明のみの目的で与えられることは、理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び修飾は、詳細な説明から当業者に明らかとなる。

図１、パネルａ〜ｄは、リガンド指向型抗体設計のワークフローを示す一連の模式図である。図１、パネルａは、典型的なリガンド受容体対を示す模式図である。リガンド受容体対を同定する際、鋳型を設計し、検証する（図１、パネルｂ）。この工程は、初期のテザーの生成を含む。初期のテザー生成後、第１ラウンドのスクリーニングプロセスが行われ、テザーの受容体への可能性のある接触領域を無作為化することにより、第１のライブラリーを生成し、スクリーニングする（図１、パネルｃ）。これに、リガンドを有する領域内の変異を介した第２のライブラリーの生成及びスクリーニングが続く（図１、パネルｄ）。 図２、パネルａ〜ｄは、構造ベースの鋳型の設計及び第１ラウンドのスクリーニングについての無作為化領域の選択を示す一連の模式図である。図２、パネルａは、モデル受容体ＡＴ１Ｒの模式図である（リボン、及び表面ループ及び天然のリガンドとしてのＰＤＢＩＤ：４ＹＡＹ、ＴＭ及び細胞／エクトドメインを、結合ポケット：アンジオテンシンＩＩにおいてモデル化する）。図２、パネルｂは、深い基質結合ポケットの模式図である（ＡＴ１Ｒファン・デル・ワールス表面の断面図）。図２、パネルｃは、リボンとしてｓｃＦｖ上のＣＤＲにある、リガンド結合ループ、３つの可能性のある結合点及び可能性のある接触領域の設計を示す模式図である。図２、パネルｄの上半分は、ｓｃＦｖにおける可能性のある相互作用領域の図を示す。図２、パネルｄの下半分は、膜貫通型（ＴＭ）らせん体の向きの断面図を示し、リボンとしての提案した相互作用領域はまた、表面として提示されるＡＴ１Ｒ表面暴露領域と十分に重複する。 図３は、標的へのリガンド−ファージ／ｓｃＦｖ鋳型結合の３つのフォーマットから得られたデータを描写する模式図（パネルａ）及び棒グラフ（パネルｂ）である。図３、パネルａは、リガンド−ファージ／ｓｃＦｖの３つのフォーマットの設計を示す。図３、パネルｂは、３つのフォーマット及び２つのトロンビン処理したバージョンのフォーマットを使用したホールセルＥＬＩＳＡデータから得られたデータを描写する棒グラフを示す。使用した陰性対照は、抗Ｍ１３ＨＲＰのみであった。結合部位の部分占有（「ＦＯＢ」）を、ＡＴ１Ｒ（＋）細胞に適用したファージのＥＬＩＳＡの４２５ｎＭの照度をＡＴ１Ｒ（−）細胞で割ることにより、計算した（本アッセイにおいて使用した１個のウェル当たりの５×１０^５個の一過性ＡＴ１Ｒ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）。 図４、パネルａ〜ｂは、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）ライブラリー生成パイプライン及び伝統的なクンケル変異誘発ベースのライブラリー生成を描写する一連の模式図及びグラフである。図４、パネルａは、ＲＣＡライブラリー生成及びクンケル変異誘発ベースのライブラリー生成を描写する一連の模式図である。伝統的な方法により生成されたライブラリーは、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、直線化及び再環化を使用しておよそ１００倍選択的に増幅される。図４、パネルｂは、伝統的なライブラリー生成との比較におけるＲＣＡライブラリー生成の、ＤＮＡ濃度、組換え、１回の形質転換当たりのコロニー、及び１回の形質転換当たりの多様性を描写する一連のグラフである。データは、ＴＧ１細胞に形質転換したとき、新規ライブラリーが、形質転換の多様性を考慮して、１回の形質転換当たりのトータルのコロニーの態様において開始ライブラリーより優れた効率を提示し、多様性を認識したことを示す。（^＊）ＴＧ１細胞を使用した形質転換。 図５、パネルａ〜ｄは、多様性及び親和性成熟を増大させる方法を描写する一連の模式図及びグラフである。図５、パネルａは、細胞表面受容体に対する典型的な抗体についてのホールセルを使用したファージマイクロエマルジョンテクノロジーを描写する。微小滴内で、ファージで形質導入した大腸菌は、膜を覆うタンパク質を発現する抗原でコートしたビーズ又は細胞（ＳＦ９、哺乳類、ロドバクター、アラビドプシス等）に結合する。一晩インキュベーション後、エマルジョンを破壊し、ビーズ又は細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗Ｍ１３Ａｂを加えて、結合したファージを検出する。次に、ビーズ又は細胞を、ＦＡＣＳによりソーティングする（図５、パネルｂ）。ホールセルＥＬＩＳＡ（図５、パネルｃ）及び機能的競合アッセイ（図５、パネルｃ、右グラフ）（ＮＣ１：無関連のｓｃＦｖ、ＰＣ１、市販のモノクローナル抗体、ＮＣ２、ｓｃＦｖなし）を使用することにより、ビーズ又は細胞を検証する。図５、パネルｄは、誘導した６量体化を介したホールセルパニングのための濃縮を増強する方法の模式図を描写する。６量体化タンパク質（ＴＨ７）（ＰＤＢエントリーＩＤ：２ｍ３ｘ）を、ＧＰＣＲの細胞質又は細胞外ドメインに遺伝的に結合させて、親和性を増強することができる。実験上（右パネル）、ＴＨ７を、ＯｍｐＡの細胞外ドメインに遺伝的に結合させた。抗原ペプチド（ＦＬＡＧペプチド）を、大腸菌外膜の多価抗原ディスプレイプラットフォーム（ＯｍｐＡ−ＴＨ７−リンカー−ＦＬＡＧ）として働くそれぞれのＴＨ７サブユニットのＣ末端に遺伝的に結合した。ホールセルパニングにおけるこのディスプレイシステムを有する大腸菌の使用は、１回のラウンドのセルパニングにおいて優れた濃縮を示した。比較において、伝統的な１価のディスプレイシステム（ＯｍｐＡ−リンカー−ＦＬＡＧ）は、観察できる濃縮を示さなかった。 図６は、ソルターゼ化学、部位特異的結合を示す一連の模式図を描写する。図６は、ソルターゼ介在性反応を使用したタンパク質の部位特異的Ｃ末端及び内部ループ標識の模式図を示す。 図７、パネルａ〜ｂは、ＡＸＭ親和性成熟変異誘発法（パネルａ）、及び典型的な成熟結果（パネルｂ）の模式図を描写する。結果は、Ｋｄ変化のμＭ〜ｎＭを、ＡＸＭ親和性成熟変異誘発の使用を通じて達成したことを示す。 図８は、複数のラウンドのスクリーニング後、ＮＴＳＲ１細胞への増大した結合を示すニューロテンシン受容体１型（ＮＴＳＲ１）リガンドライブラリーの一連のＦＡＣＳグラフである。Ｒ１＝ラウンド１。Ｒ２＝ラウンド２。Ｒ３＝ラウンド３。図８は、ＮＴＳＲ１の複数のパニングについてのポリクローナルファージＦＡＣＳ ＦＩＴＣアッセイを使用したラウンドを用いた、パニングの改善のモニタリングを提供する。 図９は、２つの典型的な強力な抗ＮＴＳＲ１ファージヒットを示す一連のＦＡＣＳグラフである。 図１０は、ＮＴＳＲ１ライブラリースクリーニング由来の５つの選択した弱いファージヒットに関するデータを示す一連のＦＡＣＳグラフである。 図１１は、ＮＴＳＲ１ライブラリースクリーニング由来の弱いヒットと強力なヒットの間のファージタイターの差を示す棒グラフ及び一連のＦＡＣＳグラフである。 図１２は、結合したＮＴＳＲ２リガンドを用いて４つのライブラリーから得られたデータを示す一連のＦＡＣＳグラフである。 図１３、パネルＡ〜Ｄは、単離されたＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤の検証を示す一連のグラフである。図１３、パネルＡ及びＢは、フローサイトメトリーによる、単離したＮＳＴＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤の特徴を示す。図１３Ｃ及び図１３Ｄは、単離したＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤を、カルシウムアッセイアゴニスト／アンタゴニストアッセイにより評価し、機能的であることを示す一連のグラフである。 図１３、パネルＡ〜Ｄは、単離されたＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤の検証を示す一連のグラフである。図１３、パネルＡ及びＢは、フローサイトメトリーによる、単離したＮＳＴＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤の特徴を示す。図１３Ｃ及び図１３Ｄは、単離したＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤を、カルシウムアッセイアゴニスト／アンタゴニストアッセイにより評価し、機能的であることを示す一連のグラフである。 図１３、パネルＡ〜Ｄは、単離されたＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤の検証を示す一連のグラフである。図１３、パネルＡ及びＢは、フローサイトメトリーによる、単離したＮＳＴＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤の特徴を示す。図１３Ｃ及び図１３Ｄは、単離したＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤を、カルシウムアッセイアゴニスト／アンタゴニストアッセイにより評価し、機能的であることを示す一連のグラフである。 図１３、パネルＡ〜Ｄは、単離されたＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤の検証を示す一連のグラフである。図１３、パネルＡ及びＢは、フローサイトメトリーによる、単離したＮＳＴＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤の特徴を示す。図１３Ｃ及び図１３Ｄは、単離したＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２結合剤を、カルシウムアッセイアゴニスト／アンタゴニストアッセイにより評価し、機能的であることを示す一連のグラフである。 図１４、パネルＡ及びＢは、親和性成熟を経験した単離したＮＴＳＲ１結合剤が、ＮＴＳＲ１発現細胞上の１価のファージとして高親和性で結合することを示す一連のフローサイトメトリーグラフである（パネルＡ及びＢ）。フローサイトメトリーグラフはまた、親和性成熟ＮＴＳＲ１結合剤が、親和性成熟していないものより強固に結合することを示す。 図１４、パネルＡ及びＢは、親和性成熟を経験した単離したＮＴＳＲ１結合剤が、ＮＴＳＲ１発現細胞上の１価のファージとして高親和性で結合することを示す一連のフローサイトメトリーグラフである（パネルＡ及びＢ）。フローサイトメトリーグラフはまた、親和性成熟ＮＴＳＲ１結合剤が、親和性成熟していないものより強固に結合することを示す。 図１５、パネルＡ及びＢは、親和性成熟後のＮＴＳＲ１（パネルＡ）及びＮＴＳＲ２（パネルＢ）の改善した特異性を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。 図１５、パネルＡ及びＢは、親和性成熟後のＮＴＳＲ１（パネルＡ）及びＮＴＳＲ２（パネルＢ）の改善した特異性を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。 図１６、パネルＡ〜Ｄは、単離したＣＸＣＲ４結合剤の結合特異性を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。図１６、パネルＣにおいて提示するデータは、バルクパニング及びラウンド１のホールセルパニング後のファージ結合を示すＣＸＣＲ４ポリクローナルファージＦＡＣＳ解析（左グラフ、図１６、パネルＣ）及び第２ラウンドのホールセルパニング後のファージ結合の増大（右グラフ、図１６、パネルＣ）を示す。図１６、パネルＤは、クローンの混合した集団を含むＣＸＣＲ４ファージのフローサイトメトリーグラフを描写する。 図１６、パネルＡ〜Ｄは、単離したＣＸＣＲ４結合剤の結合特異性を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。図１６、パネルＣにおいて提示するデータは、バルクパニング及びラウンド１のホールセルパニング後のファージ結合を示すＣＸＣＲ４ポリクローナルファージＦＡＣＳ解析（左グラフ、図１６、パネルＣ）及び第２ラウンドのホールセルパニング後のファージ結合の増大（右グラフ、図１６、パネルＣ）を示す。図１６、パネルＤは、クローンの混合した集団を含むＣＸＣＲ４ファージのフローサイトメトリーグラフを描写する。 図１６、パネルＡ〜Ｄは、単離したＣＸＣＲ４結合剤の結合特異性を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。図１６、パネルＣにおいて提示するデータは、バルクパニング及びラウンド１のホールセルパニング後のファージ結合を示すＣＸＣＲ４ポリクローナルファージＦＡＣＳ解析（左グラフ、図１６、パネルＣ）及び第２ラウンドのホールセルパニング後のファージ結合の増大（右グラフ、図１６、パネルＣ）を示す。図１６、パネルＤは、クローンの混合した集団を含むＣＸＣＲ４ファージのフローサイトメトリーグラフを描写する。 図１６、パネルＡ〜Ｄは、単離したＣＸＣＲ４結合剤の結合特異性を示す一連のフローサイトメトリーグラフである。図１６、パネルＣにおいて提示するデータは、バルクパニング及びラウンド１のホールセルパニング後のファージ結合を示すＣＸＣＲ４ポリクローナルファージＦＡＣＳ解析（左グラフ、図１６、パネルＣ）及び第２ラウンドのホールセルパニング後のファージ結合の増大（右グラフ、図１６、パネルＣ）を示す。図１６、パネルＤは、クローンの混合した集団を含むＣＸＣＲ４ファージのフローサイトメトリーグラフを描写する。 図１７は、単離したＣＸＣＲ４結合剤が、強力なアンタゴニス特性を発揮することを示す一連のグラフである。

定義
[40]本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語が、まず以下で定義される。以下の用語及び他の用語についての追加の定義は、本明細書を通じて説明される。

[41]親和性試薬：本明細書において使用される、用語「親和性試薬」は、標的分子に特異的に結合して、例えば、標的分子の活性を同定する、追跡する、捕捉するか、又は影響する任意の分子である。本明細書において記載される方法により同定されるか、又は回収される親和性試薬は、「遺伝子でコードされる」、例えば、抗体、ペプチド又は核酸であり、したがって、配列決定される能力がある。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」を、本明細書において互換的に使用して、一緒に結合した２個以上のアミノ酸を指す。

[42]動物：本明細書において使用される、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。幾つかの実施形態において、「動物」は、発生の任意のステージにあるヒトを指す。幾つかの実施形態において、「動物」は、発生の任意のステージにある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／又はブタ）である。幾つかの実施形態において、動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／又は虫を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子操作された動物、及び／又はクローンであってもよい。

[43]抗体：本明細書において使用される、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。「結合する」又は「免疫反応する」により、抗体が、所望の抗原の１個又は複数の抗原決定基と反応することを意味する。抗体は、抗体フラグメントを含む。抗体はまた、ポリクローナル、モノクローナル、キメラｄＡｂ（ドメイン抗体）、１本鎖、Ｆ_ａｂ、Ｆ_ａｂ’、Ｆ_{（ａｂ’）２}フラグメント、ｓｃＦｖ、及びＦ_ａｂ発現ライブラリーを含むが、これらに限定されない。抗体は、抗体全体、又は免疫グロブリン、又は抗体フラグメントであってもよい。

[44]抗原結合部位：本明細書において使用される、用語「抗原結合部位」又は「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端の可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。「高可変領域」として言及される、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐の区間は、「フレームワーク領域」、又は「ＦＲ」として公知のより保存された隣接区間の間に挿入される。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンにおける高可変領域の間、高可変領域に隣接する天然で見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの高可変領域及び重鎖の３つの高可変領域を、３次元空間において互いに関連して取り決めて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖のそれぞれの３つの高可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」として言及される。

[45]およそ又は約：本明細書において使用される、目的の１個又は複数の値に適用される、用語「およそ」又は「約」は、規定の参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態において、用語「およそ」又は「約」は、別段規定されないか、又は別段前後から明白でない限り（かかる数字が、可能性のある値の１００％を超える場合を除き）、規定の参照値のいずれかの向き（大きいか、又は小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下以内にある値の範囲を指す。

[46]結合剤：本明細書において使用される、「結合剤」は、標的に結合する能力がある天然に生じる又は天然で生じない任意の化合物を指す。実施形態において、「結合剤」は、低分子、抗体又は他の化学化合物若しくは部分である。

[47]生物学的に活性：本明細書において使用される、語句「生物学的に活性」は、生物学的システム、特に、生物において活性を有する任意の剤の特徴を指す。例えば、生物に投与されるとき、その生物に対する生物学的効果を有する剤は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態において、ペプチドが、生物学的に活性である場合、ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのペプチドの一部が、「生物学的に活性な」部分として典型的に言及される。

[48]エピトープ：本明細書において使用される、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、又はフラグメントに特異的に結合する能力がある任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基から通常なり、特異的な３次元構造特徴、並びに特異的な電荷特徴を通常有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のペプチドに対して生じてもよい。

[49]機能的エピトープ：本明細書において使用される、用語「機能的エピトープ」は、結合相互作用へのエネルギー関与及び／又はタンパク質の任意の物理的若しくは生化学的機能に関与するエピトープ内の残基を意味する。

[50]機能的均等物又は誘導体：本明細書において使用される、用語「機能的均等物」又は「機能的誘導体」は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈において、オリジナルの配列のものと実質的に類似する生物学的活性（機能又は構造のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体又は均等物は、天然の誘導体であり得るか、又は合成で調製される。典型的な機能的誘導体は、１個又は複数のアミノ酸の置換、欠損、又は付加を有するアミノ酸配列を含み、但し、タンパク質の生物学的活性は保存される。置換しているアミノ酸は、置換されたアミノ酸のものと類似する物理化学的特性を望ましくは有する。所望の類似の物理化学的特性は、電荷、バルキネス、疎水性、親水性等における類似性を含む。

[51]ＧＰＣＲ：本明細書において使用される、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質結合受容体）は、７個の膜貫通型（７ＴＭ）らせん体を有する不可欠な膜タンパク質の群である。

[52]ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書において使用される、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物内よりむしろ人工的環境において、例えば、試験官又は反応容器において、細胞培養液等において生じる現象を指す。

[53]ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書において使用される、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物のような、多細胞生物内で生じる現象を指す。細胞ベースのシステムの文脈において、用語を使用して、生きている細胞内で生じる現象を指し得る（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムと逆）。

[54]単離された：本明細書において使用される、用語「単離された」は、（１）最初に産生される（天然において及び／又は実験設定においてのいずれかで）とき、関連した成分の少なくとも幾つかと異なり、及び／又は（２）人の手により産生され、調製され、及び／又は製造された物質及び／又は実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、物質及び／又は実体が最初に関連した他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、又は１００％異なってもよい。幾つかの実施形態において、単離された剤は、約８０％より高い、約８５％より高い、約９０％より高い、約９１％より高い、約９２％より高い、約９３％より高い、約９４％より高い、約９５％より高い、約９６％より高い、約９７％より高い、約９８％より高い、約９９％より高い、実質的に１００％、又は１００％の純品である。本明細書において使用される、物質が、他の成分を実質的に含まないなら、物質は、「純品」である。本明細書において使用される、用語「単離された細胞」は、多細胞生物において含有されない細胞を指す。

[55]免疫学的結合：用語「免疫学的結合」は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的な抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強さ、又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の点で表され得、Ｋ_ｄが小さいほど、高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野において周知の方法を使用して定量することができる。

[56]分子ディスプレイシステム：本明細書において使用される、用語「分子ディスプレイシステム」は、標的分子又はリガンドへの可能性のある結合剤についてスクリーニングするための可能性のある親和性試薬のライブラリーを提示する能力がある任意のシステムである。分子ディスプレイシステムの例は、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ及びｍＲＮＡディスプレイを含む。幾つかの実施形態において、ファージディスプレイが使用される。

[57]ポリペプチド：本明細書において使用される、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に結合したアミノ酸の連続的な鎖を指す。用語を使用して、任意の長さのアミノ酸鎖を指すが、当業者は、用語が、非常に長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に結合した２個のアミノ酸を含む最短の鎖を指し得ることを理解する。当業者に公知である通り、ポリペプチドは、処理され、及び／又は修飾されてもよい。

[58]ペプチド模倣：用語「ペプチド模倣」は、ペプチドを模倣する任意の化合物を指す。ペプチド模倣は、無関連のリガンドペプチドの結合又は機能性を模倣するが、実質的に異なる配列を有する第１のペプチドであり得る。ペプチド模倣は、任意の遺伝子操作された又は天然に生じる化合物であってもよい。実施形態において、ペプチド模倣は、複数のペプチド結合により結合された複数のアミノ酸残基及び第１の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸残基（又はアナログ）と同じ分子を有する第２の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸残基（又はアナログ）の間で大環状分子を形成する少なくとも１個の大環状分子形成リンカーを含む化合物である、ペプチド模倣大環状分子である。

[59]タンパク質：本明細書において使用される、用語「タンパク質」は、別々の単位として機能する１個又は複数のポリペプチドを指す。単一ポリペプチドが、別々の機能する単位であり、別々の機能する単位を形成するために他のポリペプチドとの永久的又は一時的な物理的関連を必要としないなら、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され得る。別々の機能単位が、互いに物理的に関連する１個より多くのポリペプチドを含むなら、用語「タンパク質」は、物理的に結合し、別々の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。

[60]ｓｃＦｖ：１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチド分子は、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、ペプチドをコードするリンカーにより結合したＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現され得る（Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５（１６）：５８７９〜５８８３頁を参照）。多数の方法を記載して、抗体Ｖ領域由来の天然で凝集しているが、化学的には分離したポリペプチド軽鎖及び重鎖のｓｃＦｖ分子への変換のための化学構造を区別しており、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造にフォールディングする。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；第５，１３２，４０５号；及び第４，９４６，７７８号を参照。

[61]実質的に：本明細書において使用される、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性のトータル又はほぼトータルの範囲又は程度を示す定量的状態を指す。生物学的技術分野における当業者は、生物学的及び化学的現象は、完了まで達し、及び／或いは完全に進行する、又は絶対的な結果を達成若しくは回避することが仮にあるとしても稀であることを理解する。それ故、用語「実質的に」を本明細書において使用して、多くの生物学的及び化学的現象における固有の完全性の可能性のある欠如を取得する。

[62]治療タンパク質標的：本明細書において使用される、用語「治療タンパク質標的」又は「生物学的標的」は、幾つかの他の実体がそれへと方向付けられ、及び／又は結合する、生きている生物（例えば、細胞、タンパク質、低分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ等）内の全てを意味し、結合が、生きている生物の生理を変更する。

ある特定の実施形態の詳細な説明
[63]本発明の様々な態様は、以下のセクションにおいて詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定しようとするものではない。それぞれのセクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「又は」の使用は、別段規定されない限り、「及び／又は」を意味する。

[64]本開示は、とりわけ、標的タンパク質に対する抗体を含む、結合剤を生成する方法及びそのための組成物を提供する。標的タンパク質は、目的の任意のタンパク質であり得る。実施形態において、標的タンパク質は、ＧＰＣＲ、細胞表面タンパク質、単離されたタンパク質、又は治療タンパク質標的である。治療標的（例えば、細胞及び／又は生物の生理学を制御する標的）の例は、当業者により知られている。実施形態において、本明細書において提供される方法により、標的ペプチド活性部位、又は活性部位に隣接する領域と相互作用する抗体を含む、結合剤の発見を可能にする。実施形態において、本明細書において提供される方法により、標的タンパク質の活性部位から離れた標的タンパク質の領域と相互作用する結合剤の発見を可能にする。

[65]それ故、本明細書において提供される方法は、標的タンパク質又はペプチドの任意のエピトープに結合し得る結合剤の発見を可能にする。実施形態において、結合剤は、標的タンパク質又はペプチドに結合すると、アゴニスト又はアンタゴニストとして働かない。実施形態において、結合剤は、標的タンパク質又はペプチドに結合すると、アゴニスト又はアンタゴニストとして働く。実施形態において、本明細書において提供される方法は、タンパク質標的のアロステリック又は競合的インヒビターとして働き得る結合剤の単離を可能にする。例えば、本明細書における方法は、タンパク質標的の活性を修飾するために使用され得る結合剤の単離を可能にする。タンパク質標的の活性のかかる修飾は、タンパク質標的と関連する活性のアップレギュレーション、ダウンレギュレーション又はアブレーションを含む。

[66]本明細書において提供される方法をまた、ペプチド模倣又はアプタマーと組み合わせて利用して、高い結合親和性を有する結合剤を見出すことができる。例えば、ペプチド模倣は、当該技術分野において公知の手段を通じてまず発見され、単離される。単離されたペプチド模倣又はアプタマーは、例えば、受容体又は他のペプチド若しくはタンパク質に結合し得る。実施形態において、単離されたペプチド模倣又はアプタマーは、機能的インヒビター又は活性化因子である。実施形態において、単離されたペプチド模倣又はアプタマーは、その標的に結合すると、結合した標的における任意の機能を阻害しないか、又は活性化しない。実施形態において、単離されたペプチド模倣又はアプタマーは、抗体ライブラリーのＣＤＲに組み込まれ、続いて、高い親和性で結合することができる、ライブラリーにおける抗体をスクリーニングする。実施形態において、ペプチド模倣又はアプタマーは、ライブラリーの抗体に酵素でライゲーションされる。以下でより詳細に説明される通り、酵素ライゲーションの様々な方法は、例えば、ソルターゼ（「ＬＰＸＴＧ」を認識する）又はトランスグルタミナーゼ（両方の側の最大６個の特異的なアミノ酸が有するグルタミンを認識する）の使用を通じて、使用され得る。

[67]実施形態において、本明細書において提供される方法は、機能的標的タンパク質のエピトープを標的にする抗体の生成を可能にする。この方法において、機能的標的タンパク質のエピトープの標的化は、抗体が、標的タンパク質の機能をモジュレートすることを可能にする。例えば、機能的エピトープを標的にする能力は、抗体が、標的タンパク質の機能を刺激するか、又は拮抗することを可能にする。幾つかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、標的タンパク質の機能をモジュレートし得る抗体の開発のためリガンド結合抗体ライブラリーを使用する。

標的タンパク質
[68]任意のタンパク質は、標的タンパク質であり得る。幾つかの実施形態において、不可欠な膜タンパク質は、標的タンパク質である。不可欠な膜タンパク質は、細胞膜に完全にまたがる、１個又は複数の領域を含有する。しばしば、これらの分子は、重要な細胞表面認識又はシグナル伝達分子を構成する。不可欠な膜タンパク質の例は、７個の膜貫通型スパニング領域、並びにイオンチャネル及びゲートを古典的に有し、孔を形成しているサブユニットが複数の膜貫通型ドメインを典型的に有するＧタンパク質結合受容体を含む。不可欠な膜タンパク質の特異的な非限定的な例は、例えば、受容体チロシンキナーゼ、インスリン、インテグリン、カドヘリン、ＮＣＡＭ及びセレクチンを含む選択細胞接着分子（ＣＡＭ）、グリコホリン、ロドプシン、ＣＤ３６、ＧＰＲ３０、グルコースパーミアーゼ、ギャップ結合タンパク質、並びにセイピンを含む。

[69]幾つかの実施形態において、標的タンパク質は、例えば、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル結合受容体、ウイルス受容体、又は酵素結合タンパク質受容体等のような、不可欠な膜タンパク質である。ＧＰＣＲのような膜タンパク質は、多くの生物学的機能の制御に関与する。ＧＰＣＲは、感覚知覚、細胞成長及びホルモン応答を制御する。ＧＰＣＲは、４０％を超える現在の知覚薬物の標的であり、これらの薬物のマーケットは、世界中で１００億ドルを超える（２０１４年のデータ）。ＧＰＣＲ機能を刺激するか、又は拮抗する能力は、基礎研究と医薬適用の両方の中心となる課題である。様々な薬剤、すなわち、化学製剤又は生物製剤を探索して、活性又は不活性な構造のこの不可欠な膜タンパク質をロックする。抗体及び１本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）は、抗体及び１本鎖抗体フラグメントの生体適合性、優れた特異性又は開発の特異性及び頑健性のため、期待できるツールとして浮上した。受容体結合ばかりでなく、その機能をモジュレートする能力がある機能的抗体は、高い医薬価値がある。機能的標的タンパク質のエピトープを特異的に標的にするｓｃＦｖ及びＩｇＧを開発する方法が、本明細書において開示される。

[70]幾つかの実施形態において、標的タンパク質は、ＧＰＣＲである。ＧＰＣＲは、任意のＧＰＣＲである。非限定的な例として、ＧＰＣＲは、５−ヒドロキシトリプタミン受容体、アセチルコリン受容体（ムスカリン性）、アデノシン受容体、接着クラスのＧＰＣＲ、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カルシトニン受容体、カルシウムセンシング受容体、カンナビノイド受容体、ケマリン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、クラスＦｒｉｚｚｌｅｄ ＧＰＣＲ、補体ペプチド受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、Ｇタンパク質結合エストロゲン受容体、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ＧＡＢＡＢ受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、グルカゴン受容体ファミリー、糖タンパク質ホルモン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ５５及びＧＰＲ１１９、ヒスタミン受容体、ヒドロキシカルボン酸受容体、キスペプチン受容体、ロイコトリエン受容体、リゾリン脂質（ＬＰＡ）受容体、リゾリン脂質（Ｓ１Ｐ）受容体、メラニン濃縮ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、代謝型グルタミン酸受容体、モチリン受容体、ニューロメジンＵ受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オレキシン受容体、オキソグルタル酸受容体、Ｐ２Ｙ受容体、副甲状腺ホルモン受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、タンパク質分解酵素活性化受容体、ＱＲＦＰ受容体、レラキシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、タキキニン受容体、サイロトロピン放出ホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシン及びオキシトシン受容体、ＶＩＰ及び／又はＰＡＣＡＰ受容体であり得る。

[71]幾つかの実施形態において、標的タンパク質は、リパーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、ソルターゼ、及び／又はＣａｓ９から選択される。

[72]ある特定の実施形態において、標的タンパク質は、治療タンパク質標的又は生物学的標的である。生物においてある特定の生理学的効果を達成するように操作され得る治療タンパク質標的又は生物学的標的が、当該技術分野において公知である。様々なカテゴリーの治療タンパク質、例えば、抗凝固薬、血液因子、骨形成タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質スキャフォールド、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、及び血栓溶解薬が、当該技術分野において公知である。

リガンド指向型抗体
[73]１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の様な組換え抗体（ｒＡｂ）は、ハイブリドーマからもたらされたポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体と比較して多くの魅力的な性状を有する。組換え抗体は、適当な異種性宿主における過剰発現を通じて新たに補充することが可能であり、組換え抗体は、容易に保存され、ＤＮＡとして伝達され、組換え抗体は、様々な酵素、蛍光タンパク質、及びエピトープタグへの融合物として遺伝子操作され得る。しかしながら、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、及びリボソームディスプレイのような、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択方法は、今まで、膜タンパク質を標的にするカスタマイズ抗体の要求と合致して非効率的であった。幾つかの方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体多様性を生じさせている。幾つかの方法は、免疫した又は免疫していない脊椎動物細胞（ナイーブライブラリーを生成するため）のいずれかの免疫領域（天然のアプローチ）のｃＤＮＡをクローニングする工程、混合したヌクレオチド合成を用いた抗体ＣＤＲ遺伝子フラグメントのトータルの合成、及び半合成アプローチを含み、それにより、フレームワーク遺伝子が、合成され、多様性が、多数のＣＤＲをクローニングすることにより、生成される。これらのライブラリータイプの欠点は、合成及び半合成アプローチにおいて混合ヌクレオチド配列における不均一なフレームワーク、及び停止コドンを有する天然のライブラリーを使用した、可変生物物理学的特性及び発現レベルを含む。しかしながら、これらのライブラリーを用いたトータルの可能性のある多様性は、標本抽出され得る多様性（典型的には、ファージライブラリーを用いて１０^１１〜１０^１２）より依然として実質的に高く（＞１０^２３）、所定のＣＤＲ位置における全てのアミノ酸がフォールディングされた抗体を生じわけではない。

[74]リガンド指向型抗体を生成する方法が、本明細書において開示される。リガンド指向型抗体は、リガンド−標的相互作用の使用により、目的のタンパク質の機能的エピトープを特異的に標的にする。幾つかの実施形態において、機能的エピトープは、活性部位、リガンド結合部位又は触媒部位である。指向型リガンド抗体（ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｌｉｇａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の生成は、１）抗原結合領域、及び機能的標的タンパク質のエピトープに結合するリガンドを含むテザー抗体鋳型を用意する工程；２）リガンドと機能的エピトープの間の結合部位に隣接する抗原結合領域の、１個又は複数の接触領域を無作為化することにより、第１のライブラリーを生成する工程；３）第１のライブラリーをスクリーニングして、リガンドとの比較において、機能的エピトープへの改善された結合親和性を有する１個又は複数の抗体を同定する工程；４）前の工程において同定された１個又は複数の抗体の、リガンドを有する領域を無作為化することにより、第２のライブラリーを生成する工程；及び５）第２のライブラリーをスクリーニングして、リガンドとの比較において、同じ又は改善された親和性で機能的エピトープに結合する１個又は複数の抗体を同定する工程を含む。

リガンド受容体対同定及びリガンドへのテザー抗体鋳型の融合
[75]幾つかの実施形態において、リガンド指向型抗体の生成における初期の工程は、リガンド受容体対の同定である。目的のリガンドは、任意の化合物であり得る。例えば、目的のリガンドは、ペプチド、又は低分子化合物であり得る。幾つかの実施形態において、リガンドは、ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は糖であり得る。実施形態において、リガンドは、ペプチド模倣又はアプタマーである。リガンド受容体対を同定する方法は、目的のペプチド若しくはタンパク質及び／又は目的のリガンドにおける抗原結合領域の構造解析を含む。適当なリガンド受容体対の同定の際、リガンドは、テザー抗体鋳型に融合される。リガンドは、ＣＤＲ、又は軽鎖可変領域のＮ末端若しくはＣ末端に融合又は結合され得る。実施形態において、融合は、例えば、ソルターゼ又はトランスグルタミナーゼを用いて、酵素的に行われる。幾つかの実施形態において、抗原結合領域は、ｓｃＦｖであり、リガンドは、ｓｃＦｖのＣ末端に融合又は結合される。幾つかの実施形態において、リガンドは、抗原結合領域のリガンドのＮ末端又はＣ末端を介して融合又は結合される。

[76]目的のリガンドにテザー抗体鋳型を融合又は結合する多数の方法が存在する。テザー抗体鋳型は任意の後退又は抗体フラグメントであってよい。

[77]当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、テザー抗体鋳型と目的のリガンドの間の融合又は結合を生成することができる。幾つかの実施形態において、テザー抗体鋳型の抗原結合領域は、ペプチド結合、共有結合、ジスルフィド結合、又はエステル結合を通じて、リガンドに融合又は結合される。幾つかの実施形態において、ソルターゼ（「ＬＰＸＴＧ」を認識する）又はトランスグルタミナーゼ（両方の側の最大６個の特異的なアミノ酸が有するグルタミンを認識する）を使用して、目的のリガンドにテザー抗体鋳型を融合する。ソルターゼは、リガンドへのテザー抗体鋳型の部位得意的な融合を可能にする。ソルターゼの使用は、同様の精度の遺伝子融合方法を可能にし、遺伝的に達成不可能であるタンパク質誘導体構造の評価をもたらす。天然で生じるソルターゼは、特異的なＣ末端及びＮ末端の認識モチーフアミノ酸配列ＬＰＸＴＧ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）選択性である。基質におけるＴ及びＧは、ペプチド結合又はエステル結合を使用して結合され得る。幾つかの実施形態において、ソルターゼ認識配列を操作して、目的のリガンドへのテザー抗体の融合を可能にする。

第１のライブラリーの生成
[78]本明細書において記載される方法において、第１の抗体ライブラリーが生成される。幾つかの実施形態において、第１の抗体ライブラリーは、ファージライブラリーである。ファージライブラリーにおいて使用されるファージは、任意のファージであり得る。幾つかの実施形態において、使用されるファージは、Ｍ１３、ｆｄ糸状ファージ、Ｔ４、Ｔ７又はλファージである。幾つかの実施形態において、ファージライブラリーにおいて使用されるファージは、Ｍ１３ファージである。幾つかの実施形態において、テザー抗体鋳型は、選択されたファージコートタンパク質上で発現される。適当なファージコートタンパク質は、当該技術分野において知られている。幾つかの実施形態において、ファージコートタンパク質は、ｇｐＩＩＩである。

[79]第１の抗体ライブラリーの生成は、当該技術分野において公知の任意の方法を通じて作製することができる。幾つかの実施形態において、第１のライブラリーは、リガンドと機能的エピトープの間の結合部位に隣接する抗原結合領域の、１個又は複数の接触領域を無作為化することにより、生成される。この方法において、１個又は複数の接触領域は、テザー抗体鋳型の、リガンドを有する領域を変更させることなく、無作為化される。幾つかの実施形態において、接触領域は、変異誘発のため選択される１個又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）であり得る。幾つかの実施形態において、停止コドン及び／又は制限酵素切断部位は、選択されたＣＤＲに組み込まれる。停止コドン及び制限酵素切断部位は、部位特異的変異誘発を通じて置換される。当該技術分野において公知の任意の種類の部位特異的変異誘発を使用することができる。幾つかの実施形態において、クンケルベースの変異誘発を使用して、組み込まれた停止コドン及び／又は制限酵素認識部位を、選択されたＣＤＲ位置おける天然で分布するセットの残基をコードするトリ−オリゴヌクレオチドで置換する。次に、得られたＤＮＡ鋳型は、増幅される。

[80]当該技術分野において公知の任意の種類のライブラリー増幅方法は、ライブラリー増幅のため使用され得る。幾つかの実施形態において、目的の配列は、オリゴヌクレオチドの対を使用して増幅されてもよく、対のうち一方のオリゴヌクレオチドは、保護されたオリゴヌクレオチドであり、他方は、保護されていないオリゴヌクレオチドである。目的の配列は、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、等温性増幅、又はローリングサークル増幅のような増幅反応により、かかるオリゴヌクレオチド対を使用して増幅されてもよい。幾つかの実施形態において、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）が使用される。幾つかの実施形態において、エラープローンローリングサイクル増幅が使用される。ＲＣＡは、ライブラリーを約５０〜１５０倍（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、及び間の任意の値）増幅することができる。幾つかの実施形態において、ＲＣＡは、ライブラリーを約１００倍増幅することができる。幾つかの実施形態において、ＲＣＡ増幅ライブラリーは、直線化され、再度環状にされる。

[81]リガンド−抗体ライブラリーは、当該技術分野において公知の任意の適当な細胞に導入され得る。細胞は、古細菌細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、又は真核生物の細胞であり得る。細胞は、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞であり得る。幾つかの場合において、細胞は、大腸菌細胞又は出芽酵母細胞であり得る。細胞株は、任意の電気又は化学的コンピテント細胞であり得る。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、Ｃ６００、ＨＢ１０１、又はＴＧ１に形質転換され得る。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＴＧ１細胞に形質転換される。幾つかの実施形態において、複数のテザー抗体は、ペリプラズムにおいて溶解性タンパク質として表現される。

[82]幾つかの実施形態において、第１のライブラリーは、多様な約１０^７〜１０^１４（すなわち、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、及び１０^１４）個の固有のリガンド−抗体を有する。幾つかの実施形態において、第１のライブラリーは、多様な少なくとも１０^８及び１０^１２（すなわち、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２）を有する。

第１のライブラリーのスクリーニング及び検証
[83]第１のライブラリーをスクリーニングして、機能的エピトープに対して改善された結合親和性を有する１個又は複数の抗体を同定する。当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、機能的エピトープへの結合について第１のライブラリーをスクリーニングすることができる。幾つかの実施形態において、エマルジョンホールセルベースライブラリースクリーニング方法が、使用される。ホールセルスクリーニング方法（例えば、ホールセルパニング）は、米国特許出願公開第２０１５０３２２１５０号において記載され、その内容の全体が参照により本明細書に取り込まれる。ホールセルスクリーニング方法は、例えば、リガンド−抗体ファージライブラリーを用いて形質導入されている大腸菌が、目的の抗原を提示する細胞又はビーズと一緒にインキュベートされる、エマルジョンの生成を含む。一晩のインキュベーションプロセス中、リガンド−抗体ディスプレイファージは、大腸菌から分泌され、抗原を提示する細胞又はビーズに結合する。続く処理は、ファージに結合した標識された抗体の付加、及びホールセル又はビーズに提示された抗原に結合したリガンド−抗体提示ファージを単離するための続くＦＡＣＳソーティングを含む。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、複数ラウンドのホールセルスクリーニングのため処理される。幾つかの実施形態において、ホールセルスクリーニングは、約３〜８回（すなわち、３、４、５、６、７、８）行われる。幾つかの実施形態において、ホールセルスクリーニングは、約３回行われる。幾つかの実施形態において、複数のラウンドのホールセルスクリーニングは、より特異的なエピトープ結合抗体の単離をもたらす。

[84]幾つかの実施形態において、単離されたリガンド−抗体は、ＥＬＩＳＡ及び機能的競合アッセイの使用によりさらに検証される。競合アッセイは、例えば、フリーなリガンドを使用した競合アッセイを含み得る。これらのさらなる検証は、抗体のエピトープへの結合が、リガンド単独の結合との比較において、改善されることを確認することを意図する。さらなる実施形態において、ホールセルパニングの濃縮を増強する方法を使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、ホールセルパニングの濃縮は、誘導された６量体化を介して達成される。膜タンパク質の細胞質又は細胞外ドメインへの６量体化タンパク質（ＴＨ７）を遺伝的に結合させることにより６量体化を行って、親和性を増強する。細胞の外膜上のＯｍｐＡ−ＴＨ７−リンカー−ＦＬＡＧの生成は、ホールセルパニングを濃縮する。図５、パネルｄを参照のこと。

第２のライブラリーの生成及びスクリーニング
[85]スクリーニングし、検証した結合剤の第１のライブラリーからの単離後、第２のライブラリーが生成される。幾つかの実施形態において、第２のライブラリーは、ファージライブラリーである。第２のライブラリーの目的は、単離されたリガンド−抗体におけるリガンドが関与する親和性を除去し、低減し、及び／又は段階的に減らすことである。この目的のため、変異は、第１のライブラリーにおいて変異していない、リガンドを有する領域に導入される。

[86]幾つかの実施形態において、２種の無作為化ストラテジーが使用され、最終製品を組み合わせて、第２のラウンドのライブラリーを生じる。

[87]幾つかの実施形態において、第１の無作為化ストラテジーは、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、リガンド及びリガンド隣接領域に、約１〜１０％の変異の割合（すなわち、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、又は間の任意の値）で導入する。幾つかの実施形態において、第１の無作為化ストラテジーは、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、リガンド及びリガンド隣接領域に、２〜５％（すなわち、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、又は間の任意の値）の変異の割合で導入する。幾つかの実施形態において、変異は、エラープローンＰＣＲにより導入される。

[88]幾つかの実施形態において、第２の無作為化ストラテジーは、部分無作為化を導入する。幾つかの実施形態において、部分無作為化は、リガンド及び隣接領域の−４ａａ及び＋４ａａにおいて適用される９個のヌクレオチド（又は３個のアミノ酸）のＮＮＫ無作為化スキャニングウィンドウを使用する。

[89]当該技術分野において公知の任意の種類のライブラリー増幅方法は、第２のライブラリーの増幅のため使用することができる。幾つかの実施形態において、目的の配列は、一方のオリゴヌクレオチドが、保護されたオリゴヌクレオチドであり、他方が、保護されていないオリゴヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドの対を使用して増幅されてもよい。目的の配列は、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、等温増幅、又はローリングサイクル増幅のような増幅反応により、かかるオリゴヌクレオチド対を使用して増幅されてもよい。幾つかの実施形態において、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）が使用される。幾つかの実施形態において、エラープローンローリングサイクル増幅が使用される。ＲＣＡは、約５０〜１５０倍（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、及び間の任意の値）、ライブラリーを増幅することができる。幾つかの実施形態において、ＲＣＡは、約１００倍、ライブラリーを増幅することができる。幾つかの実施形態において、ＲＣＡにより増幅したライブラリーは、直線化され、再環状化される。

[90]リガンド−抗体ライブラリーは、当該技術分野において公知の任意の適当な細胞に導入することができる。細胞は、古細菌細胞、原核生物細胞、細菌細胞、真菌細胞、又は真核生物細胞であってもよい。細胞は、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞であってもよい。ある場合において、細胞は、大腸菌細胞又は出芽酵母細胞であってもよい。細胞株は、任意の電気又は化学コンピテント細胞であり得る。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、Ｃ６００、ＨＢ１０１、又はＴＧ１に形質転換され得る。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、ＴＧ１細胞に形質転換される。

[91]幾つかの実施形態において、第２のライブラリーは、約１０^７〜１０^１４（すなわち、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、及び１０^１４）の固有のリガンド−抗体の多様性を有する。幾つかの実施形態において、第１のライブラリーは、少なくとも１０^８及び１０^１２（すなわち、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２）の多様性を有する。

[92]幾つかの実施形態において、第２のライブラリーは、ホールセルベースのライブラリースクリーニング方法により、スクリーニングされる。幾つかの実施形態において、ライブラリーは、複数のラウンドのホールセルスクリーニングのため処理される。幾つかの実施形態において、ホールセルスクリーニングは、約３〜８回（すなわち、３、４、５、６、７、８）行われる。幾つかの実施形態において、ホールセルスクリーニングは、３回行われる。幾つかの実施形態において、複数のラウンドのホールセルスクリーニングが、より特異的なエピトープ結合抗体の単離を生じる。

[93]第２のライブラリー結合剤は、ＥＬＩＳＡ及び機能的競合アッセイの使用により、さらに検証される。幾つかの実施形態において、バックグラウンドより２倍高いＥＬＩＳＡシグナルを有する単離されたクローンは、大腸菌において発現され、金属クロマトグラフィーにより精製される。幾つかの実施形態において、さらなる機能的検証が、単離された第２のライブラリー結合剤において行われる。当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、第２のライブラリー結合剤を検証することができる。

結合ループ
[94]幾つかの実施形態において、本明細書における方法は、結合ループ（本明細書において、「テザー」又は「テザーループ」としても言及される）によりリガンドにデザーされた抗体を使用する。結合ループは、抗体とリガンドの抗原結合領域の間で見られる。結合ループは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であり得る。幾つかの実施形態において、結合ループは、ペプチドである。

[95]幾つかの実施形態において、結合ループの長さは、約３〜５０（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）個のアミノ酸である。幾つかの実施形態において、結合ループの長さは、約３〜２１（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１）個のアミノ酸である。

[96]幾つかの実施形態において、結合ループは、抗体及び／又はリガンドの結合を増強するように最適化される。幾つかの実施形態において、結合ループの長さは、様々な長さを有する複数の結合ループペプチドを含むミニライブラリーをスクリーニングすることにより、最適化される。ミニライブラリーは、細胞ＥＬＩＳＡ検証において最善の親和性を有していた鋳型由来のｓｓＤＮＡから構築される。幾つかの実施形態において、約３〜８０個のヌクレオチド（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７５、８０、又は間の任意の数）の無作為化された長さの中心領域を有するオリゴセットが、使用される。幾つかの実施形態において、約６〜６６個のヌクレオチド（すなわち、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６６、又は間の任意の数）の無作為化された長さの中心領域を有するオリゴセットが、使用される。１つの実施形態において、オリゴは、鋳型ｓｓＤＮＡにアニーリングされる２種の１５〜３０（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドコグネイト領域により隣接される。幾つかの実施形態において、オリゴセットは、鋳型ｓｓＤＮＡにアニーリングされる２種の２０個のヌクレオチドコグネイト領域により隣接される。幾つかの実施形態において、変動した結合ループ長を有するｓｃＦｖ−リガンド融合物を提示するファージの得られたミニライブラリーは、クンケル変異誘発により作製される。当該技術分野において公知の他の方法を使用して、結合ループ長を変動させることができる。幾つかの実施形態において、変動した結合ループ長を有するミニライブラリーは、ホールセルパニングにより最強の結合剤について濃縮され、単離された結合剤が、配列決定される。

[97]幾つかの実施形態において、結合ループは、公知の切断可能な領域を有する。例えば、結合ループは、例えば、トロンビン切断部位（「ＧＲＧ」）のような、酵素切断部位を有してもよい。

抗体
[98]幾つかの実施形態において、テザー抗体は、抗体全体又は免疫グロブリン又は抗体フラグメントであってもよい。幾つかの実施形態において、テザー抗体は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＩｇＧである。

[99]幾つかの実施形態において、抗体接触領域は、リガンドと機能的エピトープの間の結合部位を囲む約１０〜２０（すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は２０）個の残基を含む。幾つかの実施形態において、抗体接触領域は、リガンドと機能的エピトープの間の結合部位を囲む約１３〜１６（すなわち、１３、１４、１５、又は１６）個の残基を含む。

[100]幾つかの実施形態において、本明細書において記載される方法の最終製品は、アゴニスト及びアンタゴニストの生成を可能にする、天然のリガンドを含まない抗体である。幾つかの実施形態において、リガンドは、ペプチド又はタンパク質に制限されない。例えば、人工ジスルフィド結合の架橋結合の使用を通じて、フリーのチオールを有する任意の分子が結合され、初期のスクリーニングに適用され得る。人工的な結合が、第２ラウンドのスクリーニングにおいて段階的に減らされるので、リガンドを有する領域はまた、ＣＤＲに制限されない。したがって、リガンドを有する領域は、ＣＤＲ領域の外側であってもよく、例えば、フレームワーク領域に位置していてもよい。

[101]幾つかの実施形態において、リガンドは、最終抗体産物に含まれない。したがって、最終産物の親和性は、天然のリガンドの親和性に依らない。さらに、より弱い結合リガンドは、初期のテザー及び方向付けの目的のため均等に演じてもよい。

[102]本開示の抗体は、複数特異的、例えば、二重特異的であってもよい。抗体は、哺乳類（例えば、ヒト又はマウス）、ヒト化、キメラ、組換え、合成産生されたか、又は天然で単離されたものであり得る。本開示の典型的な抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＡｓｅｃ）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｅｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、並びにＳＭＩＰ結合部分を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖが、抗原結合を可能にする異なる向きで生じることを可能にする、例えば、柔軟なリンカーを含んでもよい。様々な実施形態において、抗体は、細胞質安定性ｓｃＦｖ又は細胞の内側の低減する環境においてその構造及び機能を保持する細胞内抗体であってもよい（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ及びＤｅＬｉｓａ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８５（１）：２９９〜３１１頁、２００９年を参照；参照により本明細書に取り込まれる）。特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、本明細書において記載される方法に従い、ＩｇＧ又はキメラ抗原受容体に変換される。

[103]ヒトを含む、大抵の哺乳類において、抗体全体は、ジスルフィド結合により結合された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を有する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）並びにＣＨ１とＣＨ２の間のヒンジ領域からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存される領域と共に分散された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域にさらに分割され得る。それぞれのＶＨ及びＶＬは、次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシル末端に整列された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。

[104]抗体は、抗体の全ての公知の形態及び抗体様特性を有する他のタンパク質スキャフォールドを含む。例えば、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異的な抗体、１価の抗体、キメラ抗体、又はフィブロネクチン又はアンキリンリピートのような、抗体様特性を有するタンパク質スキャフォールドであり得る。抗体は、次のアイソタイプ：ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＡｓｅｃ）、ＩｇＤ、又はＩｇＥのいずれかを有し得る。

[105]抗体フラグメントは、抗体からもたらされる１個又は複数のセグメントを含んでもよい。抗体からもたらされるセグメントは、特定の抗原に特異的に結合する能力を保持し得る。抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｅｂ、ｓｃＦｖ、又はＳＭＩＰであってもよい。抗体フラグメントは、例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、アフィボディー、ナノボディ、アプタマー、ドメイン抗体、直線性抗体、１本鎖抗体、又は抗体フラグメントから形成され得る様々な複数特異的な抗体のいずれかであってもよい。

[106]抗体フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋結合により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント：ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント：抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるフラグメント；（ｖ）ｄＡｂフラグメント：ＶＨ及びＶＬドメインを含むフラグメント；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント：ＶＨドメインであるフラグメント；（ｖｉｉ）ｄＡｂフラグメント：ＶＬドメインであるフラグメント；（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｉｘ）１個又は複数の合成リンカーにより任意選択で結合され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、ＶＬ及びＶＨは、組換え方法を使用して、例えば、ＶＬ及びＶＨを単一タンパク質として発現されるのを可能にする合成リンカーにより、結合することができ、ＶＬ及びＶＨ領域対が、１価の結合部分（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する。抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して得られてもよく、幾つかの場合では、インタクトな抗体として同じ方法において使用されてもよい。抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術又はインタクトな免疫グロブリンの酵素若しくは化学切断により、産生されてもよい。抗体フラグメントは、追加のＣ末端のアミノ酸、Ｎ末端のアミノ酸、又は個々のフラグメントを分けるアミノ酸の付加を含む、上で記載された抗体フラグメントのいずれかをさらに含んでもよい。

[107]抗体は、第１の種からもたらされた１個又は複数の抗原決定領域又は定常領域及び第２の種からもたらされた１個又は複数の抗原決定領域又は定常領域を含むなら、抗体は、キメラとして言及され得る。キメラ抗体は、例えば、遺伝子操作により構築されてもよい。キメラ抗体は、異なる種（例えば、マウス及びヒト由来）に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントを含んでもよい。

[108]抗体は、ヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は、フレームワークとＣＤＲ領域の両方が、ヒト免疫グロブリン配列からもたらされる、可変領域を有する結合部分を指す。さらに、抗体が、定常領域を含有するなら、定常領域はまた、ヒト免疫グロブリン配列からもたらされる。ヒト抗体は、１個又は複数の配列バリエーション、例えば、変異のような、ヒト免疫グロブリン配列において同定されていないアミノ酸残基を含んでもよい。バリエーション又は追加のアミノ酸は、例えば、ヒト操作により、導入されてもよい。本開示のヒト抗体は、キメラではない。

[109]抗体は、ヒト化であってもよく、抗体が、非ヒト免疫グロブリンから実質的にもたらされた１個又は複数の抗原決定領域（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）を含むか、又は抗体が、ヒト免疫グロブリン又は抗体から実質的にもたらされた少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含むように操作されることを意味する。抗体は、本明細書において記載される従来の方法を使用して、例えば、第１のベクターによりコードされる非ヒト抗体由来の抗原認識配列を、第２のベクターによりコードされるヒトフレームワークに挿入することにより、ヒト化であってもよい。例えば、第１のベクターは、非ヒト抗体（又はそのフラグメント）及び部位特異的な組換えモチーフをコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、一方、第２のベクターが、第１のベクター上の部位特異的な組換えモチーフに相補的なヒトフレームワーク及び部位特異的な組換えをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。部位特異的な組換えモチーフは、組換え現象が、非ヒト抗体由来の１個又は複数の抗原決定領域のヒトフレームワークへの挿入をもたらし、これにより、ヒト化抗体をコードするポリヌクレオチドを形成するように、それぞれのベクターに位置してもよい。

[110]ある特定の実施形態において、リガンドフリーな抗体は、ｓｃＦｖからＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に変換される。当該技術分野において、ｓｃＦｖフラグメントをＩｇＧに変換する様々な方法がある。ｓｃＦｖフラグメントをＩｇＧに変換する１つのかかる方法は、米国特許出願公開第２０１６０３６２４７６号において開示され、その内容は、参照により本明細書に取り込まれる。

結合親和性
[0111]抗体及び抗体フラグメントについての結合親和性は、当該技術分野において公知の様々な方法を通じて決定することができる。例えば、結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０、（１９８０年）のスキャッチャード解析により決定され得る。別の方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の割合を測定することを必要とし、割合は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方の向きで割合に等しく影響する幾何学パラメーターに依存する。したがって、「結合速度定数」（Ｋ_ｏｎ）と「解離速度定数」（Ｋ_ｏｆｆ）の両方は、濃度の計算並びに結合及び解離の実際の割合により決定され得る。（Ｎａｔｕｒｅ、３６１：１８６〜８７頁、（１９９３年）を参照）。Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎの比は、親和性と関連しない全てのパラメーターの解除を可能にし、解離定数Ｋ_ｄと等しい。（一般に、Ｄａｖｉｅｓら、（１９９０年）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、５９：４３９〜４７３頁を参照）。

[112]幾つかの実施形態において、機能的エピトープに対するテザー抗体鋳型結合親和性は、約１ｎＭのＫ_ｄより高い。幾つかの実施形態において、機能的エピトープに対するテザー抗体鋳型結合親和性は、約１〜５０ｎＭ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は間の任意の値）のＫ_ｄである。幾つかの実施形態において、機能的エピトープに対するテザー抗体鋳型結合親和性は、約１〜１５ｎＭ（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は間の任意の値）のＫ_ｄである。

実施例１−リガンド指向型抗体設計
[113]本実施例は、リガンド指向型抗体設計ストラテジーを記載する。リガンド指向型抗体設計の典型的なワークフローを、図１、パネルａ〜ｄにおいて描写する。ワークフローを、およそ４工程に分けることができる。第１の工程は、選択したリガンド−受容体対の同定である（図１、パネルａ）。同定工程後、鋳型を設計し、検証する（図１、パネルｂ）。本工程は、初期のテザーの生成を含む。初期のテザー生成後、第１ラウンドスクリーニングプロセスが生じ、第１のライブラリーを、テザーの受容体への可能性のある接触領域を無作為化することにより生成され、スクリーニングされる（図１、パネルｃ）。これに、リガンドを有する領域内の変異を介した第２のライブラリー生成及びスクリーニングが続く（図１、パネルｄ）。

[114]このワークフローは、膜タンパク質の活性部位に対する固有のバイアスを用いた抗体バリアントのライブラリーを生成するために天然のリガンド親和性を利用する新規ストラテジーを利用する。したがって、この方法論は、ＣＤＲの１つ又はＮ末端内又は架橋結合したコードした天然のリガンドを含む焦点が絞られた的抗体ライブラリーをもたらす。この方法論の一部として、活性部位に結合する末端に変化していない、リガンドを有する部分をそのままにしながら、リガンド周りの領域におけるアミノ酸に対する抗体の無作為化を成す。次に、リガンドを有する部分の第２ラウンドの無作為化を行い、リガンドのバイアスを除去する。この無作為化により、ＧＰＣＲ及び他の不可欠な膜タンパク質を含む不十分なエピトープ暴露を用いた、高価値の標的に対する機能的抗体（アゴニストとアンタゴニストの両方）の迅速な生成を可能にする。

実施例２−Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）標的化
[115]溶解性標的、又は周辺膜タンパク質との比較において、ＧＰＣＲは、伝統的な抗体開発を検証する２つの固有の構造特性を有する。例えば、ＧＰＣＲの構造及び機能的中心、すなわち、７−ＴＭ束（７回膜貫通型の束）は、非常に限定された溶解性領域（１個のループ当たり２０個未満のアミノ酸）のみを露出させる。図２、パネルａを参照のこと。これは、低い抗原性を極端にもたらす。しばしば、外部ループ又は細胞外ドメイン由来のペプチドに対して生じた抗体は、細胞表面の類似の結合を回復しない。高い質の初期のヒットの有効性は、依然として開発の初期段階の第一の障害である。

[116]別の挑戦は、典型的なＧＰＣＲの細胞外ループが、膜に深く埋没し、通常にはアクセス不可能であるリガンド結合部位から通常離れている（例えば、およそ２０オングスロトーム）ことである。図２、パネルｂを参照のこと。結果として、結合するばかりでなく、その機能をモジュレートする抗体を得ることは、抗体開発の現在のパイプラインでは非常に予測不可能である。

[117]上記挑戦に、活性部位内の結合ＧＰＣＲ標的について天然の傾向を有する特定のリガンド指向型ライブラリーの生成により対処することができる。これにより、下流成熟についての十分な初期のヒットが可能になる。次に、リガンド指向型結合は、スクリーニングプロセスを通じて親和性読み取りを機能と結びつける。

実験設計
[118]直接的コード（ペプチジルリガンドについて）又はジスルフィド結合（非ペプチジルリガンドについて）を介して、機能的リガンドを、ｓｃＦｖ ＣＤＲ領域の１つ又はｓｃＦｖのＣ末端に結合して、膜受容体に弱くテザーする鋳型を生成する。ホールセルパニングパイプライン、及び／又はリガンド受容体結合を決定する他の方法を使用して、結合を評価する。このｓｃＦｖを鋳型として使用し、焦点が絞られたスクリーニングライブラリーを、構造モデルに基づき可能性のある接触残基を無作為化することにより、生成する。ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）ベースのファージライブラリー構築方法の使用は、１０^１０個の完全に組換えライブラリーを、コスト効率的に（１０回の形質転換内）一貫して生成する。初期のヒットを、リガンドを有する領域を変換するプライマーを無作為化することを介する第２のライブラリーのコスト効率的生成によりさらに成熟させる。最終のヒットを、細胞−ＥＬＩＳＡ及び細胞機能的アッセイにより評価する。

初期の弱いテザーフレームワークの設計及び検証
[119]既に開発した細胞表面受容体抗体（抗Ｔｙｒｏ３）を、ライブラリーを生成する出発フレームワークとして使用し、ＧＰＣＲアンジオテンシンＩＩ受容体タイプ１（ＡＴ１Ｒ）を、モデル標的として使用する。ＡＴ１Ｒは、１０ｎＭの親和性でペプチジルリガンドアンジオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＦ）を認識し、本発明者らが、リガンドを抗体に架橋結合する遺伝子コード又はジスルフィドテクノロジーのいずれかを使用することを可能にする。入手可能な結晶構造及びｓｃＦｖモデルに基づく構造解析（Ｇｒｅｙ教授が確立した抗体モデルプロトコールを使用した）は、潜在的に３つの異なるテザーポイント（ＣＤＲ Ｈ３上の２つの部位及び軽鎖ＶＬドメインのＮ末端）が存在し、結合ループについて最短の長さが存在することを示唆する。この情報を使用して、出発鋳型の幾つかのバージョンを設計し、ホールセルＥＬＩＳＡを使用してそれらを検証する。この目的のため、３つの異なるファージ−ｓｃＦｖリガンド／ファージ−リガンドフォーマットを構築した（図３、パネルＡ及びＢを参照）。ＡＴ１Ｒ（＋）細胞への結合及びＡＴ１Ｒ（−）細胞に結合しないことを提示する、１つのフォーマットを検証した。このフォーマットは、リガンドペプチドのＣ末端における遺伝子操作したトロンビン切断部位を含有するので、トロンビン処理を行い、リガンドペプチドの１つのフリーのＣ末端をｓｃＦｖから放出した。結果は、消化したファージ−ｓｃＦｖディスプレイが、標的への一貫した結合活性を提示することを示した。

初期のテザー鋳型のバリアントバージョンのクローニング及び産生
[120]全３つの可能性のあるテザー部位における遺伝子コード（ＧＥクローン）又はフリーのシステイン（ＦＣクローン）を含む、複数のフォーマット（例えば、６つ）のリガンド−ｓｃＦｖ鋳型を、本発明者らのファージミドベクター、ｐＩＴ２にクローニングする。ｐＩＴ２ベクターにおいて、ｓｃＦｖ発現を、ｌａｃプロモーターから誘導し、発現株が、ｓｃＦｖとｇｐＩＩＩ遺伝子の間のアンバー変異（例えば、ＴＧ１）を抑制するなら、タンパク質を、ペリプラズムにおいてタンパク質溶解形態で、又はＭ１３ファージコートタンパク質ｇｐＩＩＩへの融合物のいずれかとして産生する。これは、複数のコピーのｓｃＦｖを提示するファージの産生を可能にする。複数のコピーのｓｃＦｖを提示するファージは、増加した親和性が改善した感受性のために必要とされる、細胞ベースのパニング及びホールセルＥＬＩＳＡ（図５、パネルｃを参照）において重要であることを示した。ファージ粒子を、ホールセルＥＬＩＳＡのため処理し、ＧＥクローンを、トロンビンにより消化して、リガンドのアミノ又はカルボキシ末端を遊離させ、ＦＣクローンを、当業者に公知の方法を使用して、ペプチジルリガンド含有チオールを用いて架橋結合させる。

セルＥＬＩＳＡによる最善のｓｃＦｖ−リガンドフォーマットの選択
[121]市販のＡＴ１Ｒモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ９３９１）を、陽性対照として使用し、全６種の異なるフォーマットの３つの異なるタイトレーションを、本発明者らの確立した過剰発現ＡＴ１Ｒ細胞株及び親（ＡＴ１Ｒ陰性）細胞株に適用する。ＥＬＩＳＡアッセイを並行して行い、ＡＴ１Ｒ陽性細胞に対して最大のシグナル及び対照（ＡＴ１Ｒ陰性）細胞に結合しないクローンを、続く処理のため選択する。

結合ループの長さの最適化
[122]リガンドを抗体に結合する、結合ループを長さについて最適化する。この目的のため、最適なフレームワークを使用して、約３個のアミノ酸〜約２１個のアミノ酸の範囲にあるループの長さをカバーするミニライブラリーに対するスクリーニングを通じて結合ループの長さを最適化する。セルＥＬＩＳＡにおいて最善の親和性を有する鋳型由来のｓｓＤＮＡを産生し、２つの２０ｎｔコグネイト領域に隣接する無作為化長さの中心領域（６〜６６ｎｔ）を有するオリゴセットを、鋳型ｓｓＤＮＡにアニーリングする。変動した結合ループ長を有するｓｃＦｖ−リガンド融合物を提示するファージのミニライブラリーを、クンケル変異誘発により作製し、ファージディスプレイによりスクリーニングする。クンケル変異誘発の模式図を、図４、パネルａにおいて示す。最強の結合剤を、ホールセルパニングにより濃縮し、最適な結合ループ長を、スクリーニングにより得る。

標的受容体へのリガンド結合の最適化
[123]リガンドの受容体への最適な結合を有するために、フリーのＮ末端又はＣ末端が必要であり得る。トロンビン処理を通じたいずれかの末端の放出を含む、幾つかのリガンド結合設計ストラテジーが利用可能である。図３、パネルａを参照のこと。さらに、十分な長さ（例えば、約１０Å〜２０Å）を有するリンカーを作製して、リガンドの可動性を確かにする。

[124]リガンドを３つの可能性のあるテザー部位に架橋結合する、幾つかのストラテジーを使用してもよい。２つの典型的なストラテジーは、１）Ｎ又はＣ末端のいずれかにＮＱＭＰ結合リガンドに架橋結合するフリーなシステインの導入；２）テザー部位におけるソルターゼ認識配列（ＬＰＸＴＧ）の導入を含み、ソルターゼが触媒したとき、順に、高い効率でリガンドを含有するＮ末端のグリシンに共有結合する（図６、パネルａを参照）。いずれかのストラテジーを使用して、ｓｃＦｖ割合を超えるリガンドを、実験で決定して、抗リガンドＥＬＩＳＡ／ウェスタンブロット（ａｂ８９８９２、Ａｂｃａｍ）を使用して、最大の誘導体化を確かにする。

[125]取得したデータは、これらのアッセイにおいてホールセルＥＬＩＳＡの使用の実現可能性を有利にする。例えば、図５、パネルｃ及びｄは、鋳型として使用した抗Ｔｙｒｏ３ ｓｃＦｖが発現し、適当な標的発現細胞に結合することを示す。さらなるデータは、試験した３つのうち１つのフォーマットが、ホールセルＥＬＩＳＡを使用して特異的に結合し得ることを示す（図３、パネルｂを参照）。さらに、ヒト／ラクダナノボディを含む他のフレームワークを試験して、最適な結合のためのＴｙｒｏ３ ｓｃＦｖフレームワークと比較する。

実施例３：天然のリガンドの競合を用いたライブラリー生成及びホールセルパンニング
[126]ＡＴ１Ｒの溶媒暴露した表面を、７−ＴＭらせん体束の縁に限定する。それ故、天然のリガンド−受容体界面を囲む余分な結合界面を、それに合うように制限する（図２、パネルｄ）。この構造特性を、第１ラウンドのライブラリーの生成において利用する。

[127]第１ラウンドのライブラリーについて、本発明者らのモデルにおいて天然のリガンドを囲む接触している縁内にある、１２〜１５個の残基を選択する（図２、パネルｄ）。これらの残基の多様性を、カバットデータベースにおける配列決定したヒト抗体において参照する。

ＲＣＡベースのライブラリーの構築
[128]第１ラウンドのホールセルパニングについての第１ラウンドのライブラリーを構築した。構築中、停止コドン及び制限酵素切断部位を、変異誘発の標的である相補性決定領域（ＣＤＲ）に組み込み（図２、パネルｄ）、次に、本発明者らは、クンケルベースの部位特異的変異誘発（図４）を使用して、これらの停止コドン及び制限酵素部位を、選択したＣＤＲ位置における残基の天然で分布するセットをコードするトリ−オリゴヌクレオチドで置換し、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）を使用して、生じたライブラリーＤＮＡを増幅した。伝統的なライブラリーと比較して、少なくとも、ＲＣＡから得られたＤＮＡの質と量の両方が、非常に増強され得るので、ＲＣＡは、伝統的な方法より遥かに優れている（図４、パネルｂを参照）。結果は、１０^１０個のライブラリーを、１０回の形質転換を用いて作製し得ることを示す。

[129]ｓｃＦｖのライブラリーを、ｇｐＩＩＩコートタンパク質への遺伝子融合物として細菌ファージＭ１３の表面で提示する。高い親和性を確かにするために、多価のファージシステムを使用した。

ホールセルベースのライブラリースクリーニング及び検証
[130]所望のｓｃＦｖを有するファージ粒子を産生する大腸菌細胞の単離のための油中水型エマルジョンを、スクリーニングのため使用した。エマルジョンを使用し、ファージ産生大腸菌細胞のライブラリーは、１０９個のナノ液滴コンパートメントにおける市販のＣＨＯと自家製ヒト−ＡＴ１Ｒ過剰発現細胞（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＣＨＯ−Ｋ１ ＡＧＴＲ１ β−アレスチン細胞株、及び高発現自家製ヒトＨＥＫ２９３Ｔレンチウイルスベースの安定なＡＴ１Ｒ細胞株）の両方に結合する（図５）。バルク溶液と比較して、マイクロエマルジョンは、より速い成長速度を有するクローンを選択するバイアスを低減し、それ故、初期のヒットの実際の多様性を増強する。ＦＩＴＣ標識した抗Ｍ１３Ａｂを細胞に加え、細胞を、ＦＡＣＳによりソーティングした（図５、パネルｂ）。ソーティングした集団を増幅し、次のラウンドのエマルジョンスクリーニングに適用する。３ラウンドのスクリーニングを、市販のＣＨＯ ＡＴ１Ｒ細胞において行い、最終ラウンド後、個々のクローンを、ホールセルＥＬＩＳＡを使用して検証する。

[131]標的外の結合を防ぐために、各ラウンドについて、標的の結合剤を、トリプシン溶液と並行して、高濃度の天然リガンドを用いて溶出する。異なる種由来の細胞が、異なる標的外の結合剤を有するべきである現象において、２回の余分なラウンドの、自家製ヒトＨＥＫ２９３Ｔ−ＡＴ１Ｒ発現細胞株に対するクロススクリーニングを行う。必要なら、ｓｃＦｖ−標的結合親和性を増強し、及び／又は弱い濃縮を検出するためにＮＧＳを使用する標的−６量体化ストラテジー（図５、パネルｄ）を使用する。

実施例３：第２ラウンドのライブラリーの生成及び検証
[132]第２ラウンドのライブラリーを生成して、リガンドが関与する親和性を段階的に減らす。

ライブラリー設計及びＲＣＡベースのライブラリー構築
[133]鋳型として第１ラウンドのヒットから産生されたｓｓＤＮＡを使用して、変異を導入するが、第１のライブラリーにおいては変更していない、リガンドを有する領域内の全体的な配列を保持する２つの強固に制御した無作為化ストラテジーを組み合わせる。２つの異なるストラテジーに基づくライブラリーを作製し、第２ラウンドのライブラリーとして混合する。２つの異なる無作為化ストラテジーは以下である、１）２〜５％の変異割合を、親和性成熟パイプラインにおいてエラープローンＰＣＲプロトコールを使用して、リガンド及びリガンド隣接領域（計約１５０ｎｔ）を導入する；及び２）セグメント無作為化を行い、９ｎｔ（又は３ａａ）のＮＮＫ無作為化スキャニングウィンドウを、リガンド並びに−４ａａ及び＋４ａａ隣接配列（計約４５ｎｔ、５つの無作為化オリゴを使用する）に適用する。得られたＤＮＡを使用して、上で記載し、図４、パネルａにおいて示す同じＲＣＡベースのプロトコールを使用して、第２のライブラリーを生成する。ファージ粒子を産生し、天然のペプチドリガンドとの競合を使用して、複数ラウンドのホールセルスクリーニングに適用する。

抗体特徴決定
[134]スクリーニングから単離した４４０個以上の個々のクローンを、ＡＴ１Ｒ（＋）及びＡＴ１Ｒ（−）細胞に対するホールセルファージＥＬＩＳＡにより、解析する。バックグラウンドより＞２倍のＥＬＩＳＡシグナルを有するクローンを、大腸菌において発現させ、金属親和性クロマトグラフィーにより、精製する。

機能的検証
[135]溶解性ｓｃＦｖを、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＣＨＯ−Ｋ１ ＡＧＴＲ１β−アレスチン細胞株を使用したベータ−アレスチン動員アッセイによりさらに検証する。ＡＴ１Ｒの活性化を、βガラクトース相補性に起因した酵素活性により定量する。ｓｃＦｖを細胞に適用するとき、アゴニストｓｃＦｖを、βアレスチン動員の活性化シグナルを検出する。アンタゴニストｓｃＦｖを、ｓｃＦｖとの細胞の事前インキュベーション、続いて、アンジオテンシンＩＩの付加により検出する。ｓｃＦｖの存在下での活性化シグナルを、ｓｃＦｖを含まないアンジオテンシンＩＩ活性化シグナルと比較する。可変重及び軽鎖遺伝子をベクターにクローニングし、ＨＥＫ−２９３又はＣＨＯ細胞の一過性遺伝子導入によりそれらを発現させることにより、検証したｓｃＦｖを、完全な免疫グロブリン（ＩｇＧ）に変換する。

ＡＸＭ親和性成熟
[136]ｓｃＦｖ結合特性が弱い（例えば、マイクロモル親和性以上）現象において、リガンドをｓｃＦｖに結合するリンカーの長さを変動して、最適な増大した結合を達成する。加えて、ＡＸＭ親和性成熟変異誘発を行う（図７、パネルａ及びｂを参照）。標的のより弱い認識を示すｓｃＦｖ抗体を、約４週間という短さで並行して親和性成熟させることができる。必要なら、この検証に先立ち、候補ｓｃＦｖを、ＩｇＧに変換することができる。

[137]ＡＸＭ親和性成熟変異誘発プロセス（図７、パネルａ）において、組換え抗体（ｒＡｂ）のコード領域を、エラープローンＰＣＲ条件下、５’末端にエキソヌクレアーゼ抵抗性連鎖を含有するリバースプライマーを使用して、増幅する。得られた２本鎖ＤＮＡを５’から３’へのエキソヌクレアーゼを用いて処理し、ｄｓＤＮＡ分子の未修飾のプライマー鎖を選択的に分解する。次に、得られた１本鎖ＤＮＡを、６個のＳａｃ ＩＩ部位（６個のＣＤＲのそれぞれにおいて１個）を含有するウラシル化環状１本鎖「マスター」ファージミドＤＮＡ鋳型にアニーリングし、使用して、ＤＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を刺激する。次に、ライゲーションしたヘテロ二本鎖産物を、ＳａｃＩＩイソ制限酵素制限酵素Ｅｃｏ２９ｋＩをコードする大腸菌ＴＧ１細胞に形質転換する。ウラシル化ＳａｃＩＩ−親の鎖を、Ｅｃｏ２９ｋＩ及びウラシルＮ−グリコシラーゼによりｉｎ ｖｉｖｏで切断し、これにより、新たに合成した組換え鎖の残存を好ましくする。合成に必要なクンケル変異誘発におけるプライマーの一般的なセットを使用することにより、高価なカスタム変異誘発プライマーを回避する。クンケル変異誘発の環状産物の大腸菌への形質転換は、非常に効率的である。エラープローンＰＣＲ変異誘発において使用するベクターへのサブクローニング及びライゲーションは、非常に非効率的である。エラープローンＰＣＲのサブクローニング工程をなくすことにより、巨大なエラープローンライブラリーの生成においておよそ１００〜１０００×高い効率である。

実施例４：ＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２リガンドライブラリーの生成及び検証
[138]上記の方法を使用して、ニューロテンシン受容体タイプ１（ＮＴＳＲ１）及びニューロテンシン受容体タイプＩＩ（ＮＴＳＲ２）について、リガンドライブラリーを開発した。リガンドライブラリーの解析を行った。ＮＴＳＲ１ライブラリーのＦＡＣＳ解析は、増加したラウンドの選択が、結合抗体の分離の増加をもたらすことを示した（図８）。これらの実験のため、ＮＴＳＲ１リガンドライブラリーを、対照及びＮＴＳＲ１＋細胞に対してスクリーニングした。図８において提示するデータは、ＮＴＳＲ１上の複数のパニングについてのポリクローナルファージＦＡＣＳ ＦＩＴＣアッセイを使用してラウンドで、パニングの改善を示す。溶出したポリクローナルファージについてのＦＡＣＳ抗Ｍ１３ ＦＩＴＣシグナル（抗Ｍ１３ ＦＩＴＣ結合抗体（カタログ番号ａｂ２４２２９ Ａｂｃａｍ）の１：５００希釈）。それぞれのバイオ−パニングラウンド後、多価のヘルパーファージ（ＭＯＩ２０：１での（ＰＲＯＧＥＮのＭ１３ Ｋ０７ΔｐＩＩＩカタログ番号ＰＲＨＹＰＥ））を用いて形質導入した５０ｍｌの一晩の大腸菌培養物から沈殿させたファージを、０．５Ｍ標的細胞又は親細胞と、１時間、室温にてインキュベートし、０．０１％ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により洗浄し、抗Ｍ１３ ＦＩＴＣと、１時間、室温にてインキュベートし、ＰＢＳを用いて洗浄した。ＦＡＣＳ解析のため、細胞を再懸濁した。２０００回の現象を、ＢＤ Ｊａｚｚフローサイトメーターに集め、デブリ及びデュプレットを、前方散乱及び側方散乱制限を使用した適当なゲートを介してフィルターをかけた。ヒストグラム（ｙ軸は、細胞のカウントを表し、ｘ軸は、ＦＩＴＣ蛍光シグナルを表す）を生成し、色のついた曲線は、陰性対照としての親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を表し、黒色の曲線は、標的発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を表す。４個のライブラリー（９９９３、９９９４，５８６０及びＰＤＣ−ｎｔ）を介した３ラウンド（Ｒ１、Ｒ２及びＲ３）のパニングは、正と負のピークの位置の間の距離を増加させることにより示す、親細胞と標的細胞の間のシグナルのコントラストを増加することを示した。

[139]典型的な強力な抗ＮＴＳＲ１ファージヒットのＦＡＣＳ解析により得られるデータを、図９において示す。

[140]ＮＴＳＲ１ライブラリーの解析は、弱いヒットが、強力なヒットより大量であることを示した。弱い結合剤の代表的なＦＡＣＳグラフを、図１０において示す。弱いヒットと強力なヒットの間のファージタイターのさらなる解析は、２つの群間のファージタイターの差を明らかにした。強力なヒットと弱いヒットの間のファージタイターの差は、約１０〜３０倍である（図１１）。続くアッセイのため、少数の細胞を使用して、１個の細胞当たりの１０６個のＮＴＳＲ１受容体の競合を防ぐことができる。

[141]ＮＴＳＲ２リガンドライブラリーの検証をまた行った。これらの実験から得られたＦＡＣＳデータを、図１２において提示する。データは、リガンド含有ライブラリーの良好な分離（例えば、高い特異性）を示す。

[142]フローサイトメトリー解析及び機能的活性測定を含む、ＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２単離した抗体の数ラウンドの検証を行った（図１３Ａ〜Ｄ）。これらのアッセイのデータは、フローサイトメトリーアッセイにおけるＮＴＳＲ１又はＮＴＳＲ２結合剤の強力な高い特異性を示す（図１３Ａ）。親和性成熟の作用をまた試験して、親和性成熟が、改善された結合を生じたかどうかを評価した。結果は、親和性成熟が、単離したＮＴＳＲ１結合剤結合特異性及び強さに対して顕著な作用を有することを示す（図１３Ｂ及び図１５Ａ及び１５Ｂ）。

[143]ＮＴＳＲ１及びＮＴＳＲ２単離した結合剤の機能性を、機能的アッセイにおいて評価した。これらのアッセイのため、細胞を、アゴニストモード又はアンタゴニストモードのいずれかの下でのＮＰＳカルシウムアッセイにおいて単離した結合剤とインキュベートした。データは、ＮＴＳＲ２アンタゴニストが、ＮＴＳＲ１細胞を刺激し、ＮＴＳＲ１アゴニストが、ＮＴＳＲ２細胞と拮抗することを示す（図１３Ｃ及びＤ）。

[144]単離したＮＴＳＲ１結合剤を用いた結合アッセイ及びＦＡＣＳ解析は、親和性成熟ＮＴＳＲ１結合剤が、ＮＴＳＲ１細胞上の１価ファージと同じくらい高い親和性で結合したことを示した。データはまた、親和性成熟ファージが、非親和性成熟ファージより高いタイターで結合することを示した（図１４、パネルＡ及びＢ）。これらの実験のため、１価ファージ上清（１％ＢＳＡを含む２００μＬ）を、ＫＭ１３を用いて形質導入し、無関連のＧＰＣＲ細胞ＡＴ２Ｒ及び関連するＧＰＣＲ ＮＴＳＲ１とインキュベートした。１価の発見クローンファージは、無関連の細胞上でファージからわずかに離れてシフトするが、親和性成熟（「ａｆｆｍａｔ」）法後、ファージの関連するＮＴＳＲ１発現細胞への良好な結合を示すシフトを増大させる。ＦＡＣＳ解析を行い、標準的な方法により検証した。

実施例５：ＣＸＣＲ４抗体の生成及び機能的検証
[145]本明細書において提供する方法に従い、ＧＰＣＲ、ＣＸＣＲ４に対する結合剤をまた開発した。ＣＸＣＲ４ポリクローナルファージを単離し、結合を、ＦＡＣＳ解析により確認した（図１６、パネルＣ）。ＦＡＣＳ解析のデータは、ファージが、バルクパニング及び１ラウンドのホールセルパニング後に結合したことを示した。ファージ結合の量は、第２ラウンドのパニング後に増大した（図１６、パネルＣ）。パニング法のため、バルクパニングと負のパニングの両方を行い、続いて、ソーティング／正の選択、及び品質制御測定としてＦＡＣＳ解析を行った。

[146]ＣＸＣＲ４結合剤を同定し、ＩｇＧに変換し、精製し、結合及び機能的試験のためアッセイした（図１６Ａ〜１６Ｃ及び図１７）。モノクローナルファージ配列を、ＦＡＣＳ解析のため、ＩｇＧにクローニングした。これらのアッセイのため、ＩｇＧを、無関連のＧＰＣＲを発現するＡＴ２Ｒ細胞及びＣＸＣＲ（すなわち、目的のＧＰＣＲ）を発現するＡＴ２Ｒ細胞とインキュベートした。細胞を、標準的な方法を使用したフローサイトメトリー解析のため処理した。クローンＣＸＣＲ４ Ａ１０＿２及びＣＸＣＲ４ Ａ１０＿４は、ＩｇＧと同じくらい良好な結合を示した。データは、単離したＣＸＣＲ４結合剤の両方におけるシグナルの高い特異性及び分離を示した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。

[147]機能的アッセイは、ＣＸＣＲ４結合剤が、強力なアンタゴニストであることを示した。機能的アッセイには、対照細胞（無関連のペプチドを過剰発現する細胞）とＣＸＣＲ４を発現する細胞の両方の使用を組み込んだ。標準的な方法に従って、ＣＸＣＲ４カルシウムアッセイアゴニスト及びアンタゴニストモードを行った。これらのデータから得られたデータにより、単離した結合剤が機能的であることを確認する（図１７）。

均等物及び範囲
[148]当業者は、日常的な実験未満を使用して、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、又は解明することができる。本発明の範囲は、上の説明を制限することは意図しておらず、むしろ次の請求の範囲を説明するものである。

関連出願
[1]本出願は、２０１７年８月４日に出願された、米国仮出願第６２／５４１，５３３号に基づく優先権を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。

Claims (97)

1. 標的タンパク質に対する抗体を生成する方法であって、
   （ａ）抗原結合領域、及び標的タンパク質のエピトープに結合するリガンドを含むテザー抗体鋳型を用意する工程；
   （ｂ）前記リガンドと前記エピトープの間の結合部位に隣接する前記抗原結合領域の、１個又は複数の接触領域を無作為化することにより、第１のライブラリーを生成する工程；
   （ｃ）前記第１のライブラリーをスクリーニングして、前記リガンドと比較して、前記エピトープに対して改善された結合親和性を有する１個又は複数の抗体を同定する工程；
   （ｄ）工程（ｃ）において同定された前記１個又は複数の抗体の、リガンドを有する領域を無作為化することにより、第２のライブラリーを生成する工程；
   （ｅ）前記第２のライブラリーをスクリーニングして、前記リガンドと比較して、同じ又は改善された親和性で前記標的タンパク質に結合する１個又は複数の抗体を同定する工程
   を含む方法。
2. 前記エピトープが、機能的エピトープである、請求項１に記載の方法。
3. 前記生成された抗体が、アゴニスト又はアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
4. 前記生成された抗体が、アゴニスト又はアンタゴニストではない、請求項１に記載の方法。
5. 前記標的タンパク質が、膜タンパク質である、請求項１に記載の方法。
6. 前記膜タンパク質が、膜貫通型受容体、酵素又は構造タンパク質である、請求項５に記載の方法。
7. 前記膜貫通型受容体が、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル結合受容体、ウイルス受容体、又は酵素結合タンパク質受容体である、請求項６に記載の方法。
8. 前記酵素結合タンパク質受容体が、受容体チロシンキナーゼである、請求項６に記載の方法。
9. 前記機能的エピトープが、活性部位である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記活性部位が、リガンド結合部位である、請求項９に記載の方法。
11. 前記活性部位が、触媒部位である、請求項９に記載の方法。
12. 前記テザー抗体鋳型の前記抗原結合領域が、ペプチド結合を介して前記リガンドに融合される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記テザー抗体鋳型の前記抗原結合領域が、共有結合を介して前記リガンドに結合される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記共有結合が、ジスルフィド結合である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記テザー抗体が、ソルターゼ又はトランスグルタミナーゼにより結合される、請求項１３に記載の方法。
16. 前記テザー抗体の前記抗原結合領域が、抗体フラグメントである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記テザー抗体鋳型の前記抗原結合領域が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＩｇＧである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記テザー抗体鋳型の前記抗原結合領域が、ｓｃＦｖである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記リガンドが、ペプチドである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記リガンドが、低分子化合物である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記リガンドが、前記抗原結合領域のＣＤＲに融合又は結合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記リガンドが、軽鎖可変領域のＮ末端又はＣ末端に融合又は結合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記抗原結合領域が、ｓｃＦｖであり、前記リガンドが、ｓｃＦｖのＣ末端に融合又は結合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記リガンドが、前記抗原結合領域にリガンドのＮ末端又はＣ末端を介して融合又は結合される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記抗原結合領域と前記リガンドの間に結合ループが存在する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記結合ループが、ペプチドである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ペプチドが、３〜５０個のアミノ酸を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ペプチドが、３〜２１個のアミノ酸を含む、請求項２６に記載の方法。
29. 前記結合ループが、タンパク質である、請求項２５に記載の方法。
30. 前記結合ループを最適化する工程をさらに含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記結合ループを最適化する工程が、様々な長さを有する複数のペプチドを含むミニライブラリーをスクリーニングする工程を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記結合ループが、酵素切断部位を含む、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記酵素切断部位が、トロンビン切断部位である、請求項３２に記載の方法。
34. 工程（ａ）に先立ち、
    複数の候補テザー抗体鋳型を設計する工程；及び
    前記機能的エピトープに対する所望の結合親和性を有するテザー抗体鋳型を選択する工程
    をさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記設計工程が、前記抗原結合領域及び／又はリガンドの構造解析を含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記複数の候補テザー抗体鋳型が、ファージディスプレイにより提示される、請求項３４に記載の方法。
37. 前記複数の候補テザー抗体鋳型が、ペリプラズムにおいて溶解性タンパク質として発現される、請求項３７に記載の方法。
38. 前記複数の候補テザー抗体鋳型が、前記Ｍ１３ファージコートタンパク質ｇｐＩＩＩへの融合物として発現される、請求項３７に記載の方法。
39. 前記選択する工程が、ホールセルパニングを含む、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記選択する工程が、ホールセルＥＬＩＳＡを含む、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記機能的エピトープに対する選択された前記テザー抗体鋳型の前記所望の結合親和性が、１０ｎＭより大きいｋ_ｄを有する、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記１個又は複数の接触領域が、前記リガンドと前記機能的エピトープの前記結合部位を囲む１３〜１６個の残基を含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記１個又は複数の接触領域が、
    １個又は複数の停止コドン及び／又制限酵素切断部位を組み込むこと、
    部位特異的変異誘発により、前記１個又は複数の停止コドン及び／又は制限酵素部位を置換して、ＤＮＡ鋳型を得る工程、及び
    ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）により、得られた前記ＤＮＡ鋳型を増幅して、これにより、前記第１のライブラリーを生成すること
    により、無作為化される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記ＲＣＡが、エラープローンＲＣＡである、請求項４３に記載の方法。
45. 前記１個又は複数の接触領域が、前記テザー抗体鋳型の前記リガンドを有する領域を変化させることなく、無作為化される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記第１のライブラリーが、ファージディスプレイライブラリーである、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記第１のライブラリーが、少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２の多様性を有する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記第１のライブラリーをスクリーニングする前記工程が、ホールセルパニングである、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記ホールセルパニングが、エマルジョンベースである、請求項４８に記載の方法。
50. 前記機能的エピトープに対する改善された結合親和性を有する前記１個又は複数の抗体が、フリーなリガンドを使用した競合アッセイにより選択される、請求項４８又は４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記第２のライブラリーが、ファージディスプレイライブラリーである、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記第２のライブラリーが、ＲＣＡにより生成される、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記ＲＣＡが、エラープローンＲＣＡである、請求項５２に記載の方法。
54. 前記エラープローンＲＣＡが、１〜１０％の変異の割合を有する、請求項５３に記載の方法。
55. 前記第２のライブラリーの前記スクリーニング工程が、ホールセルパニングを含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 工程（ｅ）において同定された１個又は複数のリガンドフリーな抗体を検証する工程をさらに含む、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
57. １個又は複数のリガンドフリーな抗体が、機能的アッセイにより検証される、請求項５６に記載の方法。
58. 工程（ｅ）において同定された１個又は複数のリガンドフリーな抗体を検証する工程が、ｓｃＦｖをＩｇＧに変換する工程を含む、請求項５６又は５７に記載の方法。
59. １個又は複数のリガンドフリーな抗体が、アンタゴニスト抗体又はアゴニスト抗体であるかを決定する工程をさらに含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法に従い生成された、目的の標的タンパク質に対する機能的抗体。
61. 請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法に従い生成された、第１のライブラリー。
62. 請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法に従い生成された、第２のライブラリー。
63. 抗原結合領域、及び標的タンパク質に結合するリガンドを含む複数のテザー抗体を含むライブラリーであって、前記複数のテザー抗体が、テザー抗体鋳型からもたらされ、前記リガンド及び前記標的タンパク質のエピトープの結合部位に隣接する無作為化された１個又は複数の接触領域を含む、ライブラリー。
64. 前記エピトープが、機能的エピトープである、請求項６３に記載のライブラリー。
65. 前記複数のテザー抗体が、変化していないリガンドを有する領域を含む、請求項６３に記載のライブラリー。
66. 前記抗原結合領域が、ペプチド結合を介して前記リガンドに融合されている、請求項６３又は６５に記載のライブラリー。
67. 前記抗原結合領域が、共有結合を介して前記リガンドに結合されている、請求項６３又は６５に記載のライブラリー。
68. 前記共有結合が、ジスルフィド結合である、請求項６７に記載のライブラリー。
69. 前記抗原結合領域が、抗体フラグメントである、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載のライブラリー。
70. 前記抗原結合領域が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＩｇＧである、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載のライブラリー。
71. 前記抗原結合領域が、ｓｃＦｖである、請求項７０に記載のライブラリー。
72. 前記リガンドが、ペプチドである、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載のライブラリー。
73. 前記リガンドが、低分子化合物である、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載のライブラリー。
74. 前記リガンドが、ポリマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は糖である、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載のライブラリー。
75. 前記リガンドが、前記抗原結合領域のＣＤＲに融合又は結合されている、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載のライブラリー。
76. 前記リガンドが、軽鎖可変領域のＮ末端又はＣ末端に融合又は結合されている、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載のライブラリー。
77. 前記抗原結合領域が、ｓｃＦｖであり、前記リガンドが、ｓｃＦｖのＣ末端に融合又は結合されている、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載のライブラリー。
78. 前記リガンドが、前記抗原結合領域にリガンドのＮ末端又はＣ末端を介して融合又は結合されている、請求項６３〜７７のいずれか一項に記載のライブラリー。
79. 前記抗原結合領域と前記リガンドの間に結合ループが存在する、請求項６３〜７７のいずれか一項に記載のライブラリー。
80. 前記結合ループが、ペプチドである、請求項７９に記載のライブラリー。
81. 前記ペプチドが、３〜５０個のアミノ酸を含む、請求項８０に記載のライブラリー。
82. 前記ペプチドが、３〜２１個のアミノ酸を含む、請求項８１に記載のライブラリー。
83. 前記結合ループが、酵素切断部位を含む、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載のライブラリー。
84. 前記酵素切断部位が、トロンビン切断部位である、請求項８３に記載のライブラリー。
85. ファージディスプレイライブラリーである、請求項６３〜８４のいずれか一項に記載のライブラリー。
86. 前記複数のテザー抗体が、ペリプラズムにおいて溶解性タンパク質として発現される、請求項７５に記載のライブラリー。
87. 前記複数のテザー抗体が、前記Ｍ１３ファージコートタンパク質ｇｐＩＩＩへの融合物として発現される、請求項８５に記載のライブラリー。
88. 少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２の多様性を有する、請求項６３〜８７のいずれか一項に記載のライブラリー。
89. 標的タンパク質への結合についての複数の候補抗体を含むライブラリーであって、前記複数の候補抗体が、リガンドと前記標的タンパク質のエピトープの間の結合部位に隣接する１個又は複数の接触領域、及び前記エピトープと接触し前記リガンドと競合するリガンドを有する領域を含む親抗体からもたらされ、前記複数の候補抗体が、無作為された、リガンドを有する領域を含む、ライブラリー。
90. 前記エピトープが、機能的エピトープである、請求項８９に記載のライブラリー。
91. 前記複数の候補抗体が、実質的に同一の１個又は複数の接触領域を含む、請求項８９に記載のライブラリー。
92. ファージディスプレイライブラリーである、請求項８９又は９１に記載のライブラリー。
93. 前記複数の候補抗体が、ペリプラズムにおいて溶解性タンパク質として発現される、請求項９２に記載のライブラリー。
94. 前記複数のテザー抗体が、前記Ｍ１３ファージコートタンパク質ｇｐＩＩＩへの融合物として発現される、請求項９２に記載のライブラリー。
95. 少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２の多様性を有する、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載のライブラリー。
96. 標的タンパク質に対する結合剤を生成する方法であって、
    （ａ）抗原結合領域、及び標的タンパク質のエピトープに結合するリガンドを含むテザー抗体鋳型を用意する工程；
    （ｂ）前記リガンドと前記エピトープの間の結合部位に隣接する前記抗原結合領域の、１個又は複数の接触領域を無作為化することにより、第１のライブラリーを生成する工程；
    （ｃ）前記第１のライブラリーをスクリーニングして、前記リガンドと比較して、前記エピトープに対して改善された結合親和性を有する１個又は複数の結合剤を同定する工程；
    （ｄ）工程（ｃ）において同定された前記１個又は複数の結合剤のリガンドを有する領域を無作為化することにより、第２のライブラリーを生成する工程；
    （ｅ）前記第２のライブラリーをスクリーニングして、前記リガンドと比較して、同じ又は改善された親和性で前記標的タンパク質に結合する１個又は複数の結合剤を同定する工程
    を含む方法。
97. 前記リガンドが、ペプチド模倣又はアプタマーである、請求項９６に記載の方法。

Images