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JP2020514363A - 腫瘍特異的細胞枯渇のためのＦｃ最適化抗ＣＤ２５ - Google Patents

腫瘍特異的細胞枯渇のためのＦｃ最適化抗ＣＤ２５ Download PDF

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Abstract

本開示は、ＩＬ−２−ＣＤ２５相互作用を阻害せず、活性化ＦｃγＲへの結合の増強を伴い、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞の効果的な枯渇及び定着腫瘍の制御の改善をもたらす抗ＣＤ２５抗体の使用に関する。抗プログラム細胞死タンパク質−１抗体との組合せは、腫瘍拒絶を更に改善する。【選択図】なし

Description

本発明は、癌免疫療法の分野にあり、固形腫瘍を治療する方法を含む癌を治療する方法に関し、該方法は、ＣＤ２５に対する抗体の使用を伴う。
癌免疫療法は、癌を治療又は予防するために被験体自身の免疫系の使用を伴う。免疫療法は、癌細胞が表面上に免疫系によって検出され得る微妙に異なる分子を有することが多いという事実を利用する。これらの分子、すなわち癌抗原は、最も一般的にはタンパク質であるが、炭水化物等の分子も含まれる。このため、免疫療法は、これらの標的抗原を介して腫瘍細胞を攻撃するように免疫系を誘発することを含む。しかしながら、悪性腫瘍、特に固形腫瘍又は血液癌は、腫瘍細胞に固有であり、かつ腫瘍微小環境の構成要素によって媒介される様々な機構を用いて免疫監視を免れることができる。後者の中でも、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞又はＴｒｅｇ）による腫瘍浸潤、より具体的には、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）対Ｔｒｅｇの好ましくないバランス（すなわち、ＴｅｆｆのＴｒｅｇに対する低い比率）が決定的因子として提唱されている（非特許文献１）。
Ｔｒｅｇは、その発見以来、免疫恒常性を媒介し、末梢性トレランスの確立及び維持を促進するのに重要であることが見出されている。しかしながら、癌の状況下でのＴｒｅｇの役割は、より複雑である。癌細胞が自己抗原及び腫瘍関連抗原の両方を発現することから、エフェクター細胞応答を抑えようとするＴｒｅｇの存在は、腫瘍の進行に寄与し得る。したがって、定着腫瘍におけるＴｒｅｇの浸潤は、効果的な抗腫瘍応答及び癌治療の全般に対する主な障害の１つである。Ｔｒｅｇによって用いられる抑制機構は、現行の療法、特に抗腫瘍応答の誘導又は強化に依存する免疫療法の制限又は更には失敗に大きく寄与すると考えられる（非特許文献２）。
癌の治療のための治療アプローチとしてのＴｒｅｇの枯渇は、マウスモデルにおける腫瘍の定着及び進行に対するＴｒｅｇの寄与を示している研究によって支持されるアプローチである。さらに、Ｔｒｅｇによる腫瘍浸潤は、幾つかのヒト癌においてより悪い予後とも関連付けられている（非特許文献３）。Ｔｒｅｇ細胞がマウスモデルにおいて腫瘍の定着及び進行に寄与し、Ｔｒｅｇ細胞の欠如が腫瘍進行を遅らせることが実証されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。ヒトにおいては、Ｔｒｅｇ細胞による高い腫瘍浸潤、より重要なことには、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞のＴｒｅｇ細胞に対する低い比率が、複数のヒト癌での転帰不良と関連付けられる（非特許文献３）。逆に、高いＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ細胞比は、ヒト及びマウスの両方で免疫療法に対する好ましい応答と関連付けられる（非特許文献９、非特許文献１０）。しかしながら、腫瘍におけるＴｒｅｇの枯渇は複雑であり、この領域における研究の結果は一致していない。
ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇの枯渇を達成する可能性がある分子標的の１つである。インターロイキン−２高親和性受容体α鎖（ＩＬ−２Ｒａ）としても知られるＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ細胞上では高レベルで構成的に発現され、Ｔエフェクター細胞上では存在しないか又は低レベルで発現されるため、Ｔｒｅｇ枯渇の有望な標的である。ＩＬ−２／ＣＤ２５相互作用は、殆どがラット抗マウスＣＤ２５マウス抗体であるＰＣ６１の使用を伴う、マウスモデルにおける幾つかの研究の対象とされている（非特許文献１１）。この抗体のＣＤ２５結合及び機能活性が、異なる著者によって生成されたモノクローナル抗体のパネルと比較されている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。元の研究では、ＰＣ６１の治療活性ではなく予防活性が実証されているが、最近の研究から、この抗ＣＤ２５抗体のＦｃ最適化型が幾つかのマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇につながり、有意な治療的有用性をもたらすことが示された（非特許文献１６）。ＰＣ６１等の利用可能な抗ＣＤ２５抗体は、多くの他の抗マウスＣＤ２５抗体及び抗ヒトＣＤ２５抗体として開示されている殆どの抗体と同様、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合を遮断又は阻害する。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４及び特許文献５を参照されたい。例えば、バシリキシマブ及びダクリズマブは、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合を阻害し、Ｔエフェクター細胞の活性化を低減するように開発されている抗ヒトＣＤ２５抗体である。バシリキシマブは、移植片対宿主病に現在認可されているキメラマウス−ヒトＣＤ２５抗体であり、ダクリズマブは、多発性硬化症の治療に認可されているヒト化ＣＤ２５抗体である。しかしながら、クローン７Ｄ４（抗マウスＣＤ２５）、クローンＭＡ２５１（抗ヒトＣＤ２５）又は７Ｇ７Ｂ６（抗ヒトＣＤ２５）等の他の抗ＣＤ２５抗体は、依然としてＣＤ２５へのＩＬ−２の結合を可能にする（非特許文献１７、非特許文献１８）。７Ｇ７Ｂ６は、研究抗体として使用され、放射性核種をＣＤ２５発現リンパ腫に標的化するための標的部分として提案されている（非特許文献１９）。
例えば、７Ｄ４は、ＰＣ６１又は同様の結合特性を有する抗体の存在下で又はそれによる処理後にＣＤ２５陽性細胞を検出するために広く使用されているラットＩｇＭ抗マウスＣＤ２５抗体である（非特許文献７）。単独での又はＰＣ６１と比較した７Ｄ４−ＩｇＭ抗体の任意の機能特性を開示している文献は極めて少ない（非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献１１、非特許文献２４）。実際、癌療法に使用される改善された抗体を得るために７Ｄ４のアイソタイプ又は他の構造的特徴を適合させるか又は何らかの形で変更する可能性は、従来技術では教示されていない。
しかしながら、７Ｄ４−ＩｇＭ（それ自体で又は改変抗体として）、又はマウスＣＤ２５に対する７Ｄ４の結合特徴と同様のＣＤ２５結合特徴を有するように設計若しくは特性評価された、７Ｇ７Ｂ６若しくはＭ−Ａ２５１等の任意の抗ヒトＣＤ２５の能力は、単独での又は他の抗体若しくは他の抗癌化合物と組み合わせた、腫瘍内のＴｒｅｇ細胞の最適化枯渇に関して詳細に評価されていない。上記で論考されるように、腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞の浸潤、特にＴｅｆｆ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する低い比率は、臨床転帰不良を引き起こし得る。ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇマーカーとして特定されているため、Ｔｒｅｇを枯渇させることを目的とする治療用抗体の興味深い標的となる可能性がある。重要なことには、ＣＤ２５は、ＩＬ−２の受容体のαサブユニットであり、ＩＬ−２は、Ｔｅｆｆ応答にとって重要なサイトカインである。これまで臨床試験が行われた抗ＣＤ２５抗体は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させる一方で、ＣＤ２５を介したＩＬ−２シグナル伝達を遮断する。本発明者らは今回、このようなＩＬ−２シグナル伝達の遮断がＴｅｆｆ応答を制限し、ＩＬ２シグナル伝達を遮断しない抗ＣＤ２５抗体が、ＩＬ−２がＴｅｆｆ細胞を刺激することを可能にしながら、Ｔｒｅｇ細胞を効果的に枯渇させ、強い抗癌効果を示す抗体を提供する可能性があることを見出した。このため、当該技術分野では、特にＩＬ−２がＴｅｆｆ細胞を刺激することを可能にしながら、Ｔｒｅｇを枯渇させることを含む、癌を治療する方法、特に適切な抗ＣＤ２５抗体を用いることによる方法が必要とされている。
国際公開第２００４／０４５５１２号 国際公開第２００６／１０８６７０号 国際公開第１９９３／０１１２３８号 国際公開第１９９０／００７８６１号 国際公開第２０１７／１７４３３１号
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本発明は、ＣＤ２５へのインターロイキン２（ＩＬ−２）の結合又はＣＤ２５を介したＩＬ−２のシグナル伝達を実質的に遮断せずにＣＤ２５に結合し、かつＴｒｅｇを特に腫瘍内で効率的に枯渇させる構造要素を特徴とする、抗ＣＤ２５抗体及び抗ＣＤ２５抗体の使用を提供する。７Ｄ４−ＩｇＭの構造的及び機能的特徴（マウスＣＤ２５に関して記載される）を、単独で又は他の抗癌剤と組み合わせて、Ｔｒｅｇを枯渇させるための使用及び腫瘍に対する有効性の点で驚くほど改善された特徴を呈する抗体を提供するために変更した。ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を遮断せず（更にはＣＤ２５を介したＩＬ２のシグナル伝達を遮断しない）、Ｔｒｅｇを効率的に枯渇させる更なる抗ＣＤ２５抗体の構造的及び機能的特徴も特性評価した。これらの知見は、ヒト被験体における腫瘍に対して同等の効果をもたらす更なる抗ヒトＣＤ２５抗体の確定及び生成に用いることができる。本明細書における「抗ＣＤ２５抗体」等への言及は、文脈上そうでないことが示されない限り、その抗原結合フラグメント、並びに変異体（親和性成熟変異体（affinity matured variants）を含む）を含む。
主な態様では、本発明は、癌を有するヒト被験体を治療する方法であって、抗ＣＤ２５抗体を被験体に投与する工程を含み、該被験体が腫瘍（好ましくは固形腫瘍）を有し、該抗体がＣＤ２５へのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の結合を阻害しない、方法を提供する。
本明細書における「遮断しない」、「非遮断」、「非ＩＬ−２遮断」、「遮断せずに」及び同様の用語への言及（抗ＣＤ２５抗体の存在下でＣＤ２５へのＩＬ−２結合が遮断されないことに関する）は、抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５を介したＩＬ−２のシグナル伝達を遮断しない実施の形態を含む。すなわち、本発明の抗ＣＤ２５抗体は、抗体の非存在下でのＩＬ−２シグナル伝達と比較して、ＣＤ２５を介したＩＬ−２シグナル伝達を５０％未満阻害する。抗ＣＤ２５抗体は、抗体の非存在下でのＩＬ−２シグナル伝達と比較して、ＩＬ−２シグナル伝達を約４０％、３５％、３０％未満、好ましくは約２５％未満阻害するのが好ましい。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５への結合について抗体７Ｇ７Ｂ６と競合し、及び／又はヒトＣＤ２５への結合について抗体ＭＡ２５１と競合する。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、抗体７Ｇ７Ｂ６によって認識されるものと同じエピトープ及び／又は抗体ＭＡ２５１によって認識されるものと同じエピトープに結合する。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８６（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７０〜８８（ＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）から選択されるアミノ酸ストレッチの１つ以上に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含む。エピトープは、配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８６（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び／又は配列番号１のアミノ酸７０〜８８（ＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）から選択される１つ以上のアミノ酸ストレッチに含まれる少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個又はそれ以上のアミノ酸残基を含むのが好ましい。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）、配列番号１のアミノ酸１７６〜１８０（ＲＷＴＱＰ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）から選択される少なくとも１つの配列を含む。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）、配列番号１のアミノ酸１７６〜１８６（ＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）から選択される少なくとも１つの配列を含む。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）、配列番号１のアミノ酸７０〜８４（ＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）及び配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）から選択される少なくとも１つの配列を含む。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）の配列を含むエピトープに結合する。一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸１５０〜１６０（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨ）の配列を含むエピトープに結合する。別の実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８８（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）の配列を含むエピトープに結合する。別の実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８８（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）の配列を含むエピトープに結合する。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸１７６〜１８０（ＲＷＴＱＰ）の配列を含むエピトープに結合する。一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）の配列を含むエピトープに結合する。一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸１７６〜１８６（ＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）の配列を含むエピトープに結合する。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）及び配列番号１のアミノ酸１７６〜１８０（ＲＷＴＱＰ）の配列を含むエピトープに特異的に結合する。一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）及び配列番号１のアミノ酸１７６〜１８６（ＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）の配列を含むエピトープに特異的に結合する。一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）及び配列番号１のアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）の配列を含むエピトープに特異的に結合する。
一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）の配列を含むエピトープに結合する。一実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、配列番号１のアミノ酸７０〜８４（ＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）の配列を含むエピトープに結合する。
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＤ２５への結合について７Ｇ７Ｂ６及び／又はＭＡ２５１と競合する抗体を含むＣＤ２５の特定のエピトープに結合する抗体が癌、特に固形腫瘍の治療に有用であることを見出した。かかる抗体は、依然として抗体が結合するＣＤ２５を介したＩＬ−２のシグナル伝達を可能にし、本発明者らは、本発明において用いられる抗体が、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させることに加え、少なくとも部分的にはＴｅｆｆ細胞上で発現されるＣＤ２５へのＩＬ−２の結合及びＣＤ２５を介したシグナル伝達を可能にすることによって、Ｔｅｆｆ細胞が抗癌効果を最適に発揮すること可能にすることを初めて発見した。
かかる抗体は、ＣＤ２５に対して１０−７Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）及び／又は少なくとも１つの活性化Ｆｃγ受容体に対して約１０−６Ｍ未満の解離定数を有するのが好ましい。抗体は、ＣＤ２５に対して１０−８又は１０−９又は１０−１０又は１０−１１又は１０−１２又は１０−１３の範囲又はそれ以下の解離定数（Ｋｄ）を有するのが好ましい。最も好ましくは、抗体は、少なくとも１つの活性化Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合し、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させるヒトＩｇＧ１抗体である。最も好ましくは、抗ＣＤ２５は、Ｆｃγ受容体に関連した他の特徴を特徴とし、特に、
（ａ）Ｆｃγ受容体に１を上回る活性化型対抑制型比（activatory to inhibitory ratio）（Ａ／Ｉ）で結合し、及び／又は、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩｂに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩａに結合する。
治療方法における抗ＣＤ２５抗体の使用を考えると、抗ＣＤ２５抗体は、更なる好ましい特徴を呈し得る。抗ＣＤ２５抗体はモノクローナル抗体、特にヒト、キメラ又はヒト化抗体であるのが好ましい。抗体は、その親和性成熟変異体、任意に７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１のヒト化又は親和性成熟変異体であってもよい。さらに、抗ＣＤ２５抗体は、その活性を発揮するための免疫細胞及び／又は免疫系の他の構成要素とのその相互作用を考慮すると、既存の抗ヒトＣＤ２５臨床抗体であるダクリズマブ及びバシリキシマブと比較して、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ応答の増強、好ましくはＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ応答の増大、より好ましくはＡＤＣＣ応答の増大を更に誘発し得る。一部の実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、既存の抗ヒトＣＤ２５臨床抗体であるダクリズマブ及びバシリキシマブと比較して、ＣＤＣ応答の減少を誘発する場合があり、より好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤＣ応答を誘発しない。
本発明の抗ＣＤ２５抗体（概して上記で、また発明を実施するための形態に更に詳細に規定される）は、上記抗ＣＤ２５抗体を被験体に投与する、ヒト被験体を治療する方法に用いることができる。一実施の形態では、被験体は癌を有する。被験体は、（好ましくは、固形腫瘍を有する被験体を特定する工程を更に含む方法において）定着固形腫瘍を有するのが好ましい。かかる方法は、更なる治療剤を上記被験体に投与することを更に含み得る。一実施の形態では、更なる作用物質は、例えば免疫チェックポイントタンパク質に結合し、これを阻害する抗体の形態の、上記被験体に対する免疫チェックポイント阻害剤であり得る。好ましい免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり得るＰＤ−１アンタゴニストである。より一般には、抗ＣＤ２５抗体は、上記抗ＣＤ２５抗体を上記被験体に投与する工程を含む、被験体において固形腫瘍中の制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法に用いることができる。
更なる態様では、本発明の抗ＣＤ２５抗体は、ヒト被験体における癌の治療のための薬剤の製造に用いることができるが、好ましくは、上記被験体は腫瘍、好ましくは固形腫瘍を有する。上記抗体は、更なる治療剤、好ましくは更なる癌治療剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤、好ましくはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路アンタゴニスト、癌ワクチンと組み合わせて投与し、及び／又は化学療法若しくは放射線療法等の標準治療（standard of care therapies）と組み合わせて用いることができる。
更なる態様では、本発明は、ヒト被験体における癌の治療に使用される、上記で規定される抗ＣＤ２５抗体と別の抗癌化合物（好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤又は発明を実施するための形態において指定される他の化合物）との組合せを提供するが、好ましくは、上記被験体は固形腫瘍を有し、抗癌化合物（例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト等の免疫チェックポイント阻害剤又はインターロイキン２等のサイトカイン）を同時、別個又は順次に投与することができる。この範囲で、本発明は、上記で規定される抗ＣＤ２５抗体と、抗癌化合物（例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト等の免疫チェックポイント阻害剤）とを含む、癌の治療に用いられるキットも提供する。
更なる態様では、本発明は、薬学的に許容可能な媒体中の上記で規定される抗ＣＤ２５抗体を含む医薬組成物も提供する。かかる組成物は、抗癌化合物（例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト等の免疫チェックポイント阻害剤）を含んでいてもよい。
また更なる態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ２５に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｂ）別の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、
を含む二重特異性抗体であって、抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５へのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の結合を阻害せず、好ましくは二重特異性抗体が、少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合し、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させるＩｇＧ１抗体である、二重特異性抗体も提供する。好ましくは、かかる第２の抗原結合部分は、免疫チェックポイントタンパク質若しくは腫瘍関連抗原から選択される抗原に結合し、又は抗ヒト活性化型Ｆｃ受容体抗体（抗ＦｃｇＲＩ、抗ＦｃｇＲＩＩａ、抗ＦｃｇＲＩＩＩ）若しくはアンタゴニスト抗ヒトＦｃγＲＩＩｂ抗体であるか、若しくはそれに基づくものであり得る。このように、第２の抗原結合部分は、ＦｃＲＩＩｂに結合し得る。第２の抗原結合部分は、代替的には拮抗活性を伴ってＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ及び／又はＦｃｇＲＩＩＩに結合し得る。
好ましくは、かかる二重特異性抗体は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ、ＬＬＴ１、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７及びＩＣＯＳからなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質に結合する第２の抗原結合部分を含む。かかる免疫チェックポイントタンパク質は、腫瘍細胞上で発現されるのが好ましい。免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４から選択されるのが好ましい。免疫チェックポイントタンパク質に結合する第２の抗原結合部分は、免疫チェックポイント阻害剤として作用する市販の抗体に含まれ得る。例えば、
（ａ）ＰＤ−１の場合、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ又はペムブロリズマブであり得る。
（ｂ）ＰＤ−Ｌ１の場合、抗ＰＤ−Ｌ１は、アテゾリズマブである。
（ｃ）ＣＴＬＡ−４の場合、抗ＣＴＬＡ−４は、イピリムマブである。
かかる二重特異性抗体は、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＢｉＴＥ ＤＡＲＴ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ノブインホール（Knobs-in-holes）、Ｔｒｉｏｍａｂを含む任意の市販のフォーマット、又は二重特異性抗体及びそのフラグメントの他の適切な分子フォーマットで提供することができる。
代替的には、かかる二重特異性抗体は、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む。この代替的な実施の形態では、かかる抗原及び対応する抗体としては、限定されるものではないが、ＣＤ２２（ブリナツモマブ）、ＣＤ２０（リツキシマブ、トシツモマブ）、ＣＤ５６（ロルボツズマブ（Lorvotuzumab））、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ（ラベツズマブ）、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）、ＣＤ２２１／ＩＧＦ１Ｒ（ＭＫ−０６４６）、ＣＤ３２６／Ｅｐｃａｍ（エドレコロマブ）、ＣＤ３４０／ＨＥＲ２（トラスツズマブ、ペルツズマブ）及びＥＧＦＲ（セツキシマブ、パニツムマブ）が挙げられる。
本発明の抗ＣＤ２５抗体と別の抗癌化合物との組合せ、及び上記で規定される二重特異性抗体は、特に被験体が固形腫瘍を有する場合の上記組合せ又は上記二重特異性抗体を被験体に投与する工程を含む、癌を治療する方法、また被験体における癌の治療への使用に用いることができる。
本発明の抗ヒトＣＤ２５抗体、及び癌を治療する方法、医薬組成物、他の抗癌化合物との組合せ、二重特異性抗体におけるそれらの使用の更なる定義を含む本発明の更なる目的は、発明を実施するための形態及び実施例において提示される。
実施例において使用される７Ｄ４及びＰＣ６１抗マウスＣＤ２５抗体の特性評価を示す図である。ＩＬ−２結合に対する影響を、タンデムフォーマット交差遮断（cross-blocking）アッセイを用いて生じさせた。ビオチン化マウスＣＤ２５をＳＡセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭマウスＩＬ−２、続いて１５０秒の時点でいずれかの抗マウスＣＤ２５抗体に曝露した。ＩＬ−２会合後の抗体による追加の結合は、抗マウスＣＤ２５がＩＬ−２結合を遮断しないことを示し、更なる結合がなければ、リガンド遮断が示される。ＰＣ−６１ ｍＩｇＧ２ａは、７Ｄ４とは対照的に、マウスＩＬ−２−マウスＣＤ２５相互作用の干渉を示す（Ａ）。組換え抗マウスＣＤ２５ ７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）の存在下でのマウスＩＬ−２／マウスＣＤ２５相互作用を、標準サンドイッチフォーマット交差遮断アッセイを用いて評価した。７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）をＡＨＱセンサー上にロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連ヒトＩｇＧ１抗体でブロッキングした。次いで、センサーを１００ｎＭ組換えマウスＣＤ２５（R&D Systems；カタログ番号２４３８−ＲＭ−０５０）、続いて組換えマウスＩＬ−２（Peprotech；カタログ番号２１２−１２）に曝露した。７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）−マウスＣＤ２５会合後のマウスＩＬ−２による追加の結合は、非占有エピトープを示し、７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）及びマウスＩＬ−２の両方は、マウスＣＤ２５に対する結合が同時であることから、マウスＣＤ２５内のエピトープについて競合しない（Ｂ）。マウスＣＤ２５への結合を、抗ヒトＣＤ２５結合抗体ダクリズマブ（ＤＡＣ）、ＰＣ６１（ｍＩｇＧ２ａ）抗体（ＡＤＣＣと関連するマウスＩｇＧ２ａ及びκ定常領域を有するクローンＰＣ−６１から得られる元の抗ＣＤ２５）及びａ７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）抗体（マウスＩｇＧ１及びκ定常領域を有するクローン７Ｄ４から得られる抗Ｄ２５）についてマウスＣＤ２５を発現するＣＨＯ細胞を用いて決定した。抗マウスＣＤ２５ ＩｇＧは、細胞で発現されるｍＣＤ２５に結合する。ＣＨＯ−ｍＣＤ２５を、９６ウェルアッセイプレートに分注し（５００００細胞／ウェル）、０．１ｍＬの抗体含有溶液（ＰＢＳ＋０．１％ウシ血清アルブミン中の１００ｎＭ濃度の抗体）と共に２５℃で１５分間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳ＋０．１％ウシ血清アルブミン）で３回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）Ｒ−ＰＥ（Southern Biotech、カタログ番号２０４０−０９）で標識し、フローサイトメトリーを用いて分析した（ヨウ化プロピジウムを用いて死細胞を区別した）。ＤＡＣについて結合は検出されなかったが、ＰＣ６１（ｍＩｇＧ２ａ）及び７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）の両方がかかる細胞に対して明らかな結合を示す（Ｃ）。 抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８による刺激後のＣＤ４ Ｔ細胞によるグランザイムＢ発現の誘導に対する抗マウスＣＤ２５抗体の影響を示す図である。全ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＣＤ４マイクロビーズを用いてマウスリンパ節及び脾臓から単離し、細胞増殖の測定のためにＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素（ThermoFisher）で標識した。標識Ｔ細胞（１０５個）をフィーダー細胞（１０５個；ＣＤ９０．２陰性画分、マウス汎Ｔ Ｄｙｎａｂｅａｄｓキットを用いる）と共に９６ウェルプレートに播種した。抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、BioXcellカタログ番号ＢＥ０００１−１；１μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（クローン３７．５１、BioXcellカタログ番号ＢＥ００１５−１；０．５μｇ／ｍｌ）をウェル（非刺激標識Ｔ細胞の対照サンプルを除く）に添加して、ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化し、増殖及びグランザイムＢ産生を誘導した。次いで、Ｔ細胞活性化に対するＩＬ−２とその受容体との相互作用の遮断の影響を示すために、以下の抗体を、標識ＣＤ４ Ｔ細胞並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を含むウェルに更に（２５μｇ／ｍＬで）添加した（標識Ｔ細胞並びに抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体のみを含むウェルを陰性対照として使用した）：ＰＣ６１（ｍＩｇＧ２ａ）、７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）、又は陽性対照として使用される中和抗マウスＩＬ−２抗体（クローンＪｅｓ６−１Ａ１２、BioXcell ６０３２９８８５６４）。次いで、標識Ｔ細胞のサンプルをおよそ８４時間インキュベートした。次いで、細胞を固定し、透過処理した後、抗マウスグランザイムＢ抗体（クローンＧＢ１１、Invitrogen）で染色した。次いで、細胞をグランザイムＢ発現及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ色素希釈（ＢＶ４５０）についてフローサイトメトリーによって分析した。増殖し、かつグランザイムＢ（ＧｎｚＢ）を発現する標識Ｔ細胞のパーセンテージを各処理の特定のグラフの左上象限（Ｑ９）に示し、増殖するが、ＧｎｚＢを発現しない標識Ｔ細胞のパーセンテージを各処理の特定のグラフの左下象限（Ｑ１２）に示す。 抗マウスＰＤ１（ａＰＤ１；クローンＲＭＰ１−１４）の存在下又は非存在下で投与した場合の、ＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用を遮断するか又は遮断しない同じアイソタイプ（マウスＩｇＧ２ａ）を有する抗マウスＣＤ２５抗体の免疫細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏでの影響を示す図である。６つのマウス群にＭＣＡ２０５腫瘍細胞（５×１０５ １５個）を０日目に皮下注射し、グラフに指定されるように別個に処理した。４つの群に抗マウスＣＤ２５抗体（ａＰＣ６１ ｍＩｇＧ２ａ又はａ７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａのいずれか；２００μｇ）を５日目に腹腔内注射する。３つの群にａＰＤ１（１００μｇ）を６日目及び９日目に腹腔内注射する。腫瘍及びリンパ節を１２日目に採取した後、所望のタイプに応じて細胞を染色するために処理し、各パネルに指定されるように、以下の抗体を用いてフローサイトメトリーによって分析した：抗ＣＤ３（クローン１７Ａ２、Biolegend）、抗ＣＤ４（クローンＲＭ４−５、BD biosciences）、抗ＣＤ８（クローン５３−６．７、Biolegend）及び抗ＦｏｘＰ３（クローンＦＪＫ−１６ｓ、eBiosciences）。ＦｏｘＰ３の核内染色は、ＦｏｘＰ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（eBioscience）を用いて行った。ＬＮ及びＴＩＬにおけるＣＤ４陽性／Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞及びＣＤ４陽性／ＦｏｘＰ３陰性エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４ Ｔｅｆｆ）のパーセンテージ、並びにエフェクターＣＤ８陽性Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ４ Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ細胞の比率を示す。データ分析は、Ｆｌｏｗｊｏバージョン１０．０．８（Tree Star Inc.）で行った。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ ６（GraphPad Software, Inc.）で行った。ｐ値は、クラスカル−ウォリス分散分析及びダンの事後検定を用いて算出した（ｎｓ＝ｐ＞０．０５；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。 Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることによる、抗マウスＰＤ１（ａＰＤ１；クローンＲＭＰ１−１４）の存在下又は非存在下での、ＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用を遮断するか又は遮断しない同じアイソタイプ（ＩｇＧ２ａ）を有する抗マウスＣＤ２５抗体のグランザイムＢの産生に対する影響を示す図である。細胞のサンプルを、図３に指定される６つの処理群においてＭＣＡ２０５ベースのモデルを用いて生成した。腫瘍細胞を所望のタイプに応じて染色し、各パネルに指定されるように、以下の抗体を用いてフローサイトメトリーによって分析した：抗ＣＤ３（ＰｅＣｙ７、クローン１４５−２Ｃ１１、Ebioscience、２５００３１８２）、抗ＣＤ４（Ｖ５００、クローンＲＭ４−５、BD biosciences、５６０７８２）、抗ＣＤ８（ＢＶ７８５、クローン５３−６．７、Biolegend、１００７５０）、抗グランザイムＢ（ＡＰＣ、クローンＧＢ１１；Invitrogen、ｇｒｂ０５）及びＫｉ６７（Ｖ４５０、クローンＳｏｌＡ１５；eBiosciences、４８５６９８８２）。Ｋｉ６７及びグランザイムＢの核内染色は、ＦｏｘＰ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（eBioscience、００−５５２３−００）を用いて行った。ＧｎｚＢ陽性増殖性（Ｋｉ６７陽性によって示される）ＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性Ｔ細胞の総数としてのＧｎｚＢ陽性ウェルのパーセンテージを比較した。統計分析は、図３と同様に行った（ｎｓ＝ｐ＞０．０５；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。 抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４）と組み合わせて又は組み合わせずに投与した抗マウスＣＤ２５（ＩｇＧ２ａアイソタイプ）のＣＴ２６マウスモデルにおける定着腫瘍の根絶に対する影響を示す図である。７Ｄ４ｍ２ａ及びＰＣ６１ｍ２ａは、どちらも抗マウスＣＤ２５ Ｔｒｅｇ枯渇抗体であるが、非ＩＬ−２遮断（７Ｄ４ｍ２ａ）又はＩＬ−２遮断（ＰＣ６１ｍ２）のいずれかである。個々のマウスの成長曲線を各処理群について経時的に確立した。５０日後の腫瘍のない生存個体の数を各グラフに示す。移植に用いるＣＴ２６細胞は、対数増殖期（log phase growth）に採取し、冷ＰＢＳに再懸濁した。研究の１日目（Ｄ１）に、各マウスの右脇腹に３×１０５個の細胞（０．１ｍＬの細胞懸濁液）を皮下注射した。抗マウスＣＤ２５を６日目（触知可能な腫瘍が検出された場合）にｉ．ｐ．注射した（１０ｍｇ／ｋｇ）。抗マウスＰＤ１を７日目、１０日目、１４日目及び１７日目にｉ．ｐ．注射した（１００μｇ／注射）。腫瘍の２つの次元を週２回ノギスで測り、成長をモニタリングした。腫瘍サイズ（ｍｍ３）は、腫瘍体積＝（ｗ２×ｌ）／２（ここで、ｗは腫瘍の幅（ｍｍ）、ｌは腫瘍の長さ（ｍｍ）である）から算出した。研究エンドポイントは、４０００ｍｍ３の腫瘍体積又は５０日間のいずれか早い方とした（異なる、より早い日で終わるデータ点は、マウスの死亡によるものである；実験の終了時に生存する動物の数を各パネル内に示す）。 処理しない（ＰＢＳ、ビヒクルのみ）、又は抗マウスＰＤ−Ｌ１クローン１０Ｆ．９Ｇ２（ａＰＤＬ１；クローン１０Ｆ．９Ｇ２）と更に組み合わせた若しくは組み合わせない、どちらもＴｒｅｇを枯渇させるが、非ＩＬ−２遮断（７Ｄ４ｍ２ａ）若しくはＩＬ−２遮断（ＰＣ６１ｍ２）のいずれかである抗マウスＣＤ２５ ＩｇＧ２ａ抗体で処理した個々のマウスのＣＴ２６腫瘍成長曲線を示す図である。モデル、レジメン及びデータ分析は、図５と同じである。 抗ＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４）と組み合わせて又は組み合わせずに投与した抗マウスＣＤ２５（ＩｇＧ２ａアイソタイプ）のＭＣ３８マウスモデルにおける定着腫瘍の根絶に対する影響を示す図である。試験した抗体は、図５に記載されるものである。個々のマウスの成長曲線を各処理群について経時的に確立した。３５日後の腫瘍のない生存個体の数を各グラフに示す。移植に用いるＭＣ３８結腸癌細胞は、対数増殖期に採取し、冷ＰＢＳに再懸濁した。各マウスの右脇腹に５×１０５個の腫瘍細胞（０．１ｍＬの細胞懸濁液）を皮下注射した。腫瘍を体積が１００ｍｍ３〜１５０ｍｍ３の標的範囲に近づいた時点でモニタリングした。腫瘍移植の２２日後、研究の１日目に、個々の腫瘍体積が７５ｍｍ３〜１２６ｍｍ３の範囲の動物を、群の平均腫瘍体積が約１０６ｍｍ３となる９つの群（ｎ＝１０）に選別した。処理は、定着ＭＣ３８腫瘍を担持するマウスにおいて１日目に開始した。１日目、２日目、５日目、９日目及び１２日目に、各処理の影響を、ＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）に与えたビヒクル処理対照群と比較した。抗ＰＤ１を２日目から開始して２週間にわたって週２回（ｂｉｗｋ×２）１００μｇ／動物でｉ．ｐ．投与した。７Ｄ４ｍ２ａ及びＰＣ６１ｍ２ａを、１日目に１回２００μｇ／動物でｉ．ｐ．投与した。腫瘍測定を週２回行った。研究エンドポイントは、４０００ｍｍ３の腫瘍体積又は３５日間のいずれか早い方とした（異なる、より早い日で終わるデータ点は、マウスの死亡によるものである；実験の終了時に生存する動物の数を各パネル内に示す）。 処理しない（ＰＢＳ、ビヒクルのみ）、又は抗マウスＰＤ−Ｌ１クローン１０Ｆ．９Ｇ２（ａＰＤＬ１；クローン１０Ｆ．９Ｇ２）と更に組み合わせた若しくは組み合わせない、どちらもＴｒｅｇを枯渇させるが、非ＩＬ−２遮断（７Ｄ４ｍ２ａ）若しくはＩＬ−２遮断（ＰＣ６１ｍ２）のいずれかである抗マウスＣＤ２５ ＩｇＧ２ａ抗体で処理した個々のマウスのＭＣ３８腫瘍成長曲線を示す図である。モデル、レジメン及びデータ分析は、図７と同じである。 雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６同系結腸腫瘍を担持するマウスにおける単独の（Ｄ）及びＩＬ−２中和抗体（ThermoFisher；ＪＥＳ６−１Ａ１２）と組み合わせた（Ｅ）又はマウスＩｇＧ１アイソタイプのＩＬ−２遮断非枯渇抗マウスＣＤ２５抗体（ＰＣ６１マウスＩｇＧ１）と組み合わせた（Ｆ）、抗マウスＣＤ２５非ＩＬ−２遮断Ｔｒｅｇ枯渇抗体である７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの治療活性の評価を示す図である。マウスＩｇＧ２ｓ対照（Ａ）、ＩＬ−２中和抗体単独（Ｂ）及びＩＬ−２遮断抗ＣＤ２５抗体単独（Ｃ）の活性を比較のために試験した。 本明細書で配列番号１と称されるヒトＣＤ２５（ＵｎｉｐｒｏｔコードＰ０１５８９）のコンセンサス配列を示す図である。アミノ酸２２〜２４０に対応する成熟ＣＤ２５の細胞外ドメインに下線を付ける。予め特定された非ＩＬ遮断抗ＣＤ２５抗体からのエピトープ：エピトープ１（完全及び短いエピトープ）、エピトープ２（完全及び短いエピトープ）、エピトープ３及びエピトープ４（完全及び短いエピトープ））の位置を示す。バシリキシマブ及びダクリズマブのエピトープ（ＤＡＣとして示す）の位置も特定する。 漸増抗体濃度での、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照と比較した、ＣＤ２５を発現するＣＨＯ細胞上で発現されたＣＤ２５に対する（Ａ）７Ｄ４、（Ｂ）ＰＣ６１及び（Ｃ）２Ｅ４の結合の特性評価を示す図である。 Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００でのｈｉｓタグ付きｒｍＣＤ２５に対する精製抗体（ｍＩｇＧ２ａ）のＳＰＲベースの分析を示す図である。（Ａ）７Ｄ４、（Ｂ）２Ｅ４。 Ｏｃｔｅｔ９６でのｈｉｓタグ付きｒｍＣＤ２５に対する抗ｍＣＤ２５抗体の競合分析を示す図である。センサーへの７Ｄ４の捕捉及び抗原会合工程後の第２の抗体による結合を示す。ｍＣＤ２５に対する競合的結合が７Ｄ４と２Ｅ４との間で観察されるが（Ａ）、７Ｄ４とＰＣ６１との間では観察されない（Ｂ）。 Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞から単離されたＴ細胞を用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関する、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照又は一次抗体の非存在下と比較した７Ｄ４、ＰＣ６１及び２Ｅ４の特性評価を示す図である。細胞を５０μｇ／ｍｌ抗体、続いて５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＴｒｅｇ細胞のパーセンテージに限定した。 マウス抗マウスＣＤ２５（７Ｄ４）抗体の投与後の４Ｔ１腫瘍を担持するｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＴｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す図である。（Ａ）〜（Ｃ）：それぞれ投与後３日目の全血中の非ＣＤ４、ＣＤ４＋及びＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞（％）。（Ｄ）〜（Ｆ）：それぞれ投与後３日目の腫瘍中の非ＣＤ４、ＣＤ４＋及びＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞（％）。（Ｇ）〜（Ｉ）：それぞれ投与後９日目の全血中の非ＣＤ４、ＣＤ４＋及びＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞（％）。（Ｊ）〜（Ｌ）：それぞれ投与後９日目の腫瘍中の非ＣＤ４、ＣＤ４＋及びＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞（％）。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞（Ａ）、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞（Ｂ）、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞（Ｃ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｄ）上で発現されたＣＤ２５に結合するマウス（Ｂ）又はキメラ（Ａ、Ｃ及びＤ）抗ヒトＣＤ２５クローン７Ｇ７Ｂ６の特性評価を示す図である。 ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関するマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ又は一次抗体の非存在下と比較した７Ｇ７Ｂ６の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて漸増濃度のＩＬ−２（図中に示される）と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 汎Ｔ細胞を用いたヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ、又は陽性対照としての市販のマウス抗ヒトＩＬ−２中和抗体（クローン：ＡＢ１２−３Ｇ４）と比較したキメラ７Ｇ７Ｂ６の機能的特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体と共にインキュベートした後、フローサイトメトリー分析前にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７２時間活性化した。結果としてグランザイムＢ陽性増殖性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ２５陽性細胞株の殺傷に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較したキメラ７Ｇ７Ｂ６の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５高又は低発現細胞、それぞれＳＵ−ＤＨＬ−１（Ａ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｂ）を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で精製ＮＫ細胞と同時培養した。標的細胞溶解を、ＮＫ細胞への添加の４時間後に上清へのカルセイン放出によって測定した。データをサポニン処理対照に対して正規化した。 ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞の食作用に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較したキメラ７Ｇ７Ｂ６の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下でＭＣＳＦ分化マクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋染色マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４-である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。 漸増抗体濃度での、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞上で発現されたＣＤ２５に結合するＭＡ−２５１の特性評価を示す図である。 マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ又は一次抗体の非存在下と比較したＭＡ−２５１の特性評価を示す図である。ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断を、ヒト起源のＰＢＭＣを用いて評定した。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて漸増濃度のＩＬ−２（図中に示される）と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 ＣＤ２５に結合するＭＡ−２５１及びＩＬ２の特性評価を示す図である。ＣＤ２５に結合するＩＬ２リガンドによる干渉を、標準サンドイッチビニングアッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システム（Pall Forte Bio Corp.、USA）上で行った。ＭＡ２５１抗体をＡＨＱセンサー上にロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連ヒトＩｇＧ１抗体でブロッキングした。センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いて１００ｎＭヒトＩＬ−２に曝露した。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０を用いてデータを処理した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質（non-competitor））、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。 Ｏｃｔｅｔにおける抗ＣＤ２５抗体の競合分析を示す図である。固定化したｒｈＣＤ２５に第１のＡｂ、続いて再び第１のＡｂ（対照）又は第２のＡｂのいずれかを結合させる。ＩＬ−２シグナルの非遮断剤であるｍＡｂは、互いに又は７Ｇ７Ｂ６及びＭＡ２５１と競合し、研究用ダクリズマブ又は研究用バシリキシマブとは競合しない（図２４（Ａ）〜（Ｎ））。（Ａ）〜（Ｃ）７Ｇ７Ｂ６の競合分析；（Ｄ）〜（Ｆ）ＭＡ２５１の競合分析；（Ｇ）〜（Ｉ）及び（Ｎ）抗体３の競合分析；（Ｊ）〜（Ｍ）抗体１の競合分析。ＩＬ−２シグナル伝達遮断剤であるｍＡｂ（ＴＳＫ０３１）は、研究用ダクリズマブ及び研究用バシリキシマブと競合し、７Ｇ７Ｂ６とは競合しない（図２４（Ｏ）〜（Ｑ））。 ビヒクル（Ａ）及び（Ｃ）、又は抗体１（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｅ）の投与後の腫瘍成長の抑制を示すｉｎ ｖｉｖｏモデルを示す図である。 Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００でのｈｉｓタグ付きｒｈＣＤ２５に対する精製抗体（ＩｇＧ１）のＳＰＲベースの分析による親和性決定を示す図である。Ａ）７ｇ７Ｂ６ｃｈ、Ｂ）ＭＡ２５１ｃｈ、Ｃ）抗体１、Ｄ）抗体３及びＥ）ダクリズマブ（対照）、又はＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６機器でのバイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry）による（Ｆ）。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞（Ｂ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｃ）上で発現されたＣＤ２５に結合する抗体１の特性評価を示す図である。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化したヒト（Ａ）及び（Ｂ）汎Ｔ細胞上で発現され、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞でゲーティングした、ＣＤ２５に結合する抗体１の特性評価を示す図である。 標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４でのバイオレイヤー干渉法による抗体１とＩＬ−２との非競合的結合（Ａ）及びＩＬ−２競合抗体とＩＬ−２との競合的結合（Ｂ）を示す図である。抗ヒトＣＤ２５抗体である抗体１をＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いてヒトＩＬ−２に曝露した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。 標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システムでのバイオレイヤー干渉法によるＣＤ２５への抗体１及びダクリズマブの非競合的結合を示す図である。参照モノクローナル抗ヒトＣＤ２５抗体ダクリズマブをＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５抗原、続いて抗ヒトＣＤ２５抗体（抗体１）に曝露した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。 ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ又は一次抗体の非存在下と比較した抗体１の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて漸増濃度のＩＬ−２（図中に示される）と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 汎Ｔ細胞を用いたヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ、又は陽性対照としての市販のマウス抗ヒトＩＬ−２中和抗体（クローン：ＡＢ１２−３Ｇ４）と比較した抗体１の機能的特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体と共にインキュベートした後、フローサイトメトリー分析前にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７２時間活性化した。結果としてグランザイムＢ陽性増殖性ＣＤ４（Ａ）又はＣＤ８（Ｂ）Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ２５陽性細胞株の殺傷に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体１の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５高又は低発現細胞、それぞれＳＵ−ＤＨＬ−１（Ａ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｂ）を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で精製ＮＫ細胞と同時培養した。標的細胞溶解を、ＮＫ細胞への添加の４時間後に上清へのカルセイン放出によって測定した。データをサポニン処理対照に対して正規化した。 ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞の食作用に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体１の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下でＭＣＳＦ分化マクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋染色マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４-である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞（Ｂ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｃ）上で発現されたＣＤ２５に結合する抗体３の特性評価を示す図である。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化したヒト（Ａ）及び（Ｂ）又はカニクイザル（Ｃ）及び（Ｄ）汎Ｔ細胞上で発現され、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞でゲーティングした、ＣＤ２５に結合する抗体３の特性評価を示す図である。 標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４でのバイオレイヤー干渉法による抗体３とＩＬ−２との非競合的結合を示す図である。抗ヒトＣＤ２５抗体である抗体３をＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いてヒトＩＬ−２に曝露した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示す（非競合物質）。 標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システムでのバイオレイヤー干渉法によるＣＤ２５への抗体３及びダクリズマブの非競合的結合を示す図である。参照モノクローナル抗ヒトＣＤ２５抗体ダクリズマブをＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５抗原、続いて抗ヒトＣＤ２５抗体（抗体３）に曝露した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。 ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ又は一次抗体の非存在下と比較した抗体３の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて漸増濃度のＩＬ−２（図中に示される）と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 汎Ｔ細胞を用いたヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ、又は陽性対照としての市販のマウス抗ヒトＩＬ−２中和抗体（クローン：ＡＢ１２−３Ｇ４）と比較した抗体３の機能的特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体と共にインキュベートした後、フローサイトメトリー分析前にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７２時間活性化した。結果としてグランザイムＢ陽性増殖性ＣＤ４（Ａ）又はＣＤ８（Ｂ）Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ２５陽性細胞株の殺傷に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体３の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５高又は低発現細胞、それぞれＳＵ−ＤＨＬ−１（Ａ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｂ）を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で精製ＮＫ細胞と同時培養した。標的細胞溶解を、ＮＫ細胞への添加の４時間後に上清へのカルセイン放出によって測定した。データをサポニン処理対照に対して正規化した。 ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞の食作用に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体３の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下でＭＣＳＦ分化マクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋染色マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４-である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞（Ｂ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｃ）上で発現されたＣＤ２５に結合する抗体４の特性評価を示す図である。 １００ｎＭ抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、非修飾ＣＨＯ−Ｓ細胞（陰性対照）（Ａ）又はｃｙｎｏ−ＣＤ２５−ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｂ）に結合する抗体４の特性評価を示す図である。 標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４でのバイオレイヤー干渉法による抗体４とＩＬ−２との非競合的結合を示す図である。抗ヒトＣＤ２５抗体である抗体４をＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いてヒトＩＬ−２に曝露した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示す（非競合物質）。 標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システムでのバイオレイヤー干渉法によるＣＤ２５への抗体４及びダクリズマブの非競合的結合を示す図である。参照モノクローナル抗ヒトＣＤ２５抗体ダクリズマブをＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５抗原、続いて抗ヒトＣＤ２５抗体（抗体４）に曝露した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。 ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ又は一次抗体の非存在下と比較した抗体４の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて漸増濃度のＩＬ−２（図中に示される）と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 汎Ｔ細胞を用いたヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ、又は陽性対照としての市販のマウス抗ヒトＩＬ−２中和抗体（クローン：ＡＢ１２−３Ｇ４）と比較した抗体４の機能的特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体と共にインキュベートした後、フローサイトメトリー分析前にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７２時間活性化した。結果としてグランザイムＢ陽性増殖性ＣＤ４（Ａ）又はＣＤ８（Ｂ）Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ２５陽性細胞株の殺傷に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体４の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５高又は低発現細胞、それぞれＳＵ−ＤＨＬ−１（Ａ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｂ）を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で精製ＮＫ細胞と同時培養した。標的細胞溶解を、ＮＫ細胞への添加の４時間後に上清へのカルセイン放出によって測定した。データをサポニン処理対照に対して正規化した。 Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＢｉｏａｓｓａｙにおけるＡＤＣＰの誘導に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体４の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５発現ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で、ＦｃγＲＩＩａ及びルシフェラーゼ発現を駆動するＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２）を発現するように遺伝子操作したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と同時培養した。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）、ＳＵ−ＤＨＬ−１細胞（Ｂ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｃ）上で発現されたＣＤ２５に結合する抗体２の特性評価を示す図である。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化したヒト（Ａ）及び（Ｂ）又はカニクイザル（Ｃ）及び（Ｄ）汎Ｔ細胞上で発現され、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞でゲーティングした、ＣＤ２５に結合する抗体２の特性評価を示す図である。 標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４でのバイオレイヤー干渉法による抗体２とＩＬ−２との非競合的結合（Ａ）及びＩＬ−２競合抗体とＩＬ−２との競合的結合（Ｂ）を示す図である。抗ヒトＣＤ２５抗体である抗体２をＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いてヒトＩＬ−２に曝露した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示す（非競合物質）。 標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システムでのバイオレイヤー干渉法によるＣＤ２５への抗体２及びダクリズマブの非競合的結合を示す図である。参照モノクローナル抗ヒトＣＤ２５抗体ダクリズマブをＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５抗原、続いて抗ヒトＣＤ２５抗体（抗体２）に曝露した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。 ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ又は一次抗体の非存在下と比較した抗体２の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて漸増濃度のＩＬ−２（図中に示される）と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ２５陽性細胞株の殺傷に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体２の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５高又は低発現細胞、それぞれＳＵ−ＤＨＬ−１（Ａ）又はＳＲ−７８６細胞（Ｂ）を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で精製ＮＫ細胞と同時培養した。標的細胞溶解を、ＮＫ細胞への添加の４時間後に上清へのカルセイン放出によって測定した。データをサポニン処理対照に対して正規化した。 ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞の食作用に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体２の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下でＭＣＳＦ分化マクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋染色マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４−である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞上で発現されたＣＤ２５に結合する抗体５の特性評価を示す図である。 ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関する抗体５の特性評価を示す図である。マウス抗ヒト抗体ＭＡ−２５１を非遮断対照として使用し、臨床用高収率合成ダクリズマブ（Daclizumab High Yield Process；ＤＡＣ ＨＹＰ）を遮断対照として使用し、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照又は一次抗体の非存在下のそれぞれと比較した。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 Ｏｃｔｅｔにおける競合アッセイを示す図である。固定化したｒｈＣＤ２５に抗体１、続いて再び第１のＡｂ（対照としての抗体１）又は第２のＡｂのいずれか（ＩＬ−２競合物質、例えば研究用ダクリズマブ及びバシリキシマブ、又はＩＬ−２非競合物質、例えば７Ｇ７Ｂ６のいずれか）を結合させる。抗体１は、ＩＬ−２シグナル遮断剤である研究用バシリキシマブ（Ａ）、ダクリズマブ（Ｂ）とは競合しないが、７Ｇ７Ｂ６（非ＩＬ−２遮断剤）と競合する（Ｃ）。 Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＢｉｏａｓｓａｙにおけるＡＤＣＣの誘導に関する抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した抗体５の特性評価を示す図である。ＣＤ２５発現ＳＲ−７８６細胞を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で、ＦｃγＲＩＩＩａ及びルシフェラーゼ発現を駆動するＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２）を発現するように遺伝子操作したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と同時培養した。 ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞の食作用に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した抗体５の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下でＭＣＳＦ分化マクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋染色マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４−である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞上で発現されたＣＤ２５に結合する抗体６、抗体７、抗体８及び抗体９の特性評価を示す図である。 Ｏｃｔｅｔにおける競合アッセイを示す図である。固定化したｒｈＣＤ２５に第１のＡｂ（抗体７）、続いて再び第１のＡｂ（対照）、又は第２のＡｂであるダクリズマブ（Ａ）若しくはバシリキシマブ（Ｂ）のいずれかを結合させる。 ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関する、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ−Ｈｙｐ又は一次抗体の非存在下と比較した抗体７の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＢｉｏａｓｓａｙにおけるＡＤＣＣの誘導に関する抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した抗体７の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５発現ＳＲ−７８６細胞を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で、ＦｃγＲＩＩＩａ及びルシフェラーゼ発現を駆動するＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２）を発現するように遺伝子操作したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と同時培養した。 ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞の食作用に関する抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した抗体７の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下でＭＣＳＦ分化マクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋染色マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４−である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。 漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞上で発現されたＣＤ２５に結合する抗体１０、抗体１１、抗体１２、抗体１２、抗体１３、抗体１４、抗体１５、抗体１６、抗体１７、抗体１８、抗体１９、抗体２０及び抗体２１の特性評価を示す図である。 Ｏｃｔｅｔにおける競合アッセイを示す図である。固定化したｒｈＣＤ２５に第１のＡｂ（抗体１９）、続いて再び第１のＡｂ（対照）、又は第２のＡｂであるダクリズマブ（Ａ）若しくはバシリキシマブ（Ｂ）のいずれかを結合させる。 ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ−２シグナル伝達の遮断に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ−Ｈｙｐ又は一次抗体の非存在下と比較した抗体１０、抗体１１、抗体１２、抗体１２、抗体１３、抗体１４、抗体１５、抗体１６、抗体１７、抗体１８、抗体１９、抗体２０及び抗体２１の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて１０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。 Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＢｉｏａｓｓａｙにおけるＡＤＣＣの誘導に関する抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した抗体１９の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５発現ＳＲ−７８６細胞を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で、ＦｃγＲＩＩＩａ及びルシフェラーゼ発現を駆動するＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２）を発現するように遺伝子操作したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と同時培養した。 ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞の食作用に関する抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した抗体１９の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下でＭＣＳＦ分化マクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋染色マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４−である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。 ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞の食作用に関する抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した抗体１９、抗体１２及び抗体２０の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下でＭＣＳＦ分化マクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋染色マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４−である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。 Ｂ１６Ｂｌ６免疫療法耐性モデルにおけるＧＶＡＸと組み合わせた非ＩＬ−２遮断抗ＣＤ２５抗体である７Ｄ４マウスＩｇＧ２ａの治療活性を示す図である。個々のマウスを、単独での又は７Ｄ４と組み合わせたＧｖａｘで処理した。 雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いたＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＩＬ−２遮断抗体（ＰＣ６１）と比較した非ＩＬ−２遮断抗ＣＤ２５抗体（７Ｄ４及び２Ｅ４）の治療活性を示す図である。抗ＣＤ２５非遮断抗体７Ｄ４及び２Ｅ４は、固形腫瘍に対して強力な治療活性を発揮する。７Ｄ４及び２Ｅ４はどちらも、ＩＬ−２遮断抗体であるＰＣ６１より強力である。 抗マウスＰＤ−Ｌ１と組み合わせた単回及び反復注射でのＭＣＡ２０５モデルにおける非ＩＬ−２遮断抗ＣＤ２５抗体７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの治療活性の評価を示す図である。＊は、実験の終了時に生きているマウスを示す。
本発明は、好ましくは被験体が固形腫瘍を有する場合の被験体における癌を治療又は予防する方法であって、ＣＤ２５に結合する抗体を上記被験体に投与する工程を含み、抗ＣＤ２５抗体が、インターロイキン２結合又はＣＤ２５を介したシグナル伝達を妨げずにＣＤ２５に結合し、かつＴｒｅｇを特に腫瘍内で効率的に枯渇させる構造要素を特徴とする、方法を提供する。本発明において規定されるＣＤ２５に結合する抗体は、癌、好ましくは固形腫瘍の治療又は予防に使用することができる。代替的には、本発明は、癌、好ましくは固形腫瘍の治療又は予防のための薬剤の製造への、ＣＤ２５に結合し、ＣＤ２５へのインターロイキン２結合を妨げないＣＤ２５への結合及びＴｒｅｇの効率的な枯渇の両方を可能にする抗体の使用を提供する。本発明は、癌、好ましくは固形腫瘍の治療又は予防における、ＣＤ２５に結合し、ＣＤ２５へのインターロイキン２結合を実質的に妨げないＣＤ２５への結合及びＴｒｅｇの枯渇の両方を可能にする抗体の使用も提供する。
本発明者らは、治療状況、例えば定着固形腫瘍における制御性Ｔ細胞の枯渇のためにＣＤ２５へのインターロイキン２の結合又はＣＤ２５を介したＩＬ−２のシグナル伝達を阻害しない（又は実質的に阻害しない）抗ＣＤ２５抗体を用いてＣＤ２５を標的化し得ることを見出した。本発明者らは、活性化型Ｆｃγ受容体への結合を増強するアイソタイプを有する非ＩＬ−２遮断抗ＣＤ２５抗体が、最適なＴｅｆｆ応答を可能にしながら腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞の効果的な枯渇をもたらし、これが例えば免疫チェックポイントタンパク質、腫瘍関連抗原又は抑制型Ｆｃγ受容体を標的とする化合物等の他の癌標的化合物と（二重特異性抗体と組み合わせて又は二重特異性抗体内で）組み合わせることができる治療アプローチであることを見出した。これらの知見により、癌の治療に適切な用量で抗ＣＤ２５の使用とインターロイキン−２とを組み合わせることも可能になる。
ＣＤ２５は、ＩＬ−２受容体のα鎖であり、活性化Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、一部のＮＫ Ｔ細胞、一部の胸腺細胞、骨髄系前駆細胞及び希突起膠細胞上に見られる。ＣＤ２５はＣＤ１２２及びＣＤ１３２と会合し、ＩＬ−２の高親和性受容体として作用するヘテロ三量体複合体を形成する。ヒトＣＤ２５のコンセンサス配列を下記の配列番号１に示す（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１５８９；アミノ酸２２〜２４０に対応する成熟ヒトＣＤ２５の細胞外ドメインに下線を付け、配列番号２として提示する）：
10 20 30 40 50
MDSYLLMWGL LTFIMVPGCQ AELCDDDPPE IPHATFKAMA YKEGTMLNCE
60 70 80 90 100
CKRGFRRIKS GSLYMLCTGN SSHSSWDNQC QCTSSATRNT TKQVTPQPEE
110 120 130 140 150
QKERKTTEMQ SPMQPVDQAS LPGHCREPPP WENEATERIY HFVVGQMVYY
160 170 180 190 200
QCVQGYRALH RGPAESVCKM THGKTRWTQP QLICTGEMET SQFPGEEKPQ
210 220 230 240 250
ASPEGRPESE TSCLVTTTDF QIQTEMAATM ETSIFTTEYQ VAVAGCVFLL
260 270
ISVLLLSGLT WQRRQRKSRR TI
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２５に結合する抗体」は、ＩＬ−２受容体のＣＤ２５サブユニットに結合することが可能な抗体を指す。このサブユニットは、ＩＬ−２受容体のαサブユニットとしても知られる。かかる抗体は、本明細書で「抗ＣＤ２５抗体」とも称される。
抗ＣＤ２５抗体は、ＩＬ−２受容体のＣＤ２５サブユニット（抗原）への特異的結合が可能な抗体である。「特異的結合」、「特異的に結合する」（"bind specifically", and "specifically bind"）は、抗体が対象の抗原に対して約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ又は１０−１３Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有することを意味するものとして理解される。好ましい実施形態では、解離定数は１０−８Ｍ未満、例えば１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ又は１０−１３Ｍの範囲である。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子及び抗原結合部位を含むそのフラグメントの両方を指し、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート（heteroconjugate）及び／又は多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（diabodies）、トリボディ（tribodies）及びテトラボディ（tetrabodies））、並びにＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、ポリペプチド−Ｆｃ融合体、一本鎖変異体（ｓｃＦｖフラグメント、ＶＨＨ、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ（商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）、サメ単一ドメイン抗体、一本鎖又はタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）、ミニボディ（minibodies）、ＢｉＴＥ（商標）、二環式ペプチド及び他の代替的な免疫グロブリンタンパク質スキャフォールド）等を含む抗体の抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない、抗体のポリクローナル形態、モノクローナル形態、遺伝子操作した形態及び別の形で修飾した形態を含む。一部の実施形態では、抗体は、自然に産生された場合にそれが有し得る共有結合修飾（例えば、グリカンの付着）を欠いていてもよい。一部の実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、検出可能な部分、治療部分、触媒部分、又はポリエチレングリコール等の抗体の安定性若しくは投与の改善をもたらす他の化学基の付着）を有していてもよい。一部の実施形態では、抗体は、マスク（masked）抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｙ（商標））の形態であってもよい。マスク抗体は、抗体の抗原結合表面に特異的に結合し、抗体の抗原結合を妨げる遮断又は「マスク」ペプチドを含み得る。マスクペプチドは、切断可能なリンカーによって（例えば、プロテアーゼによって）抗体に連結する。所望の環境、すなわち腫瘍環境におけるリンカーの選択的切断は、マスキング／遮断ペプチドを解離させ、腫瘍において抗原結合が生じるのを可能にすることで、潜在毒性の問題を制限する。「抗体」は、ラクダ科抗体（重鎖のみの抗体）及びアンチカリン（Skerra (2008) FEBS J 275, 2677-83）等の抗体様分子を指す場合もある。一部の実施形態では、抗体は、各々が単一の抗体配列に会合し、抗原内の幾らか異なるエピトープ（異なる参照抗ヒトＣＤ２５抗体に会合するヒトＣＤ２５細胞外ドメイン内の異なるエピトープ等）に結合する抗体のパネルとして生成するポリクローナル又はオリゴクローナルである。ポリクローナル又はオリゴクローナル抗体は、文献中に記載される医学的用途のための単一の調製物中で提供することができる（Kearns JD et al., 2015. Mol Cancer Ther. 14:1625-36）。
本発明の一態様では、抗体はモノクローナルである。抗体は、付加的又は代替的にはヒト化又はヒトであってもよい。更なる態様では、抗体はヒト、又はいずれにせよヒト被験体におけるその使用及び投与を可能にするフォーマット及び特徴を有する抗体である。本発明の一態様では、抗体は、親和性成熟７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１のヒト化変異体であり得る。親和性成熟抗体は、ＣＤ２５に対して少なくとも１０％高い親和性を有し、及び／又はＣＤＲ配列は、親配列のＣＤＲと少なくとも８０％同一、好ましくは９０％同一（全ての配列にわたって）である。親和性成熟抗体は、変更されたアミノ酸を有しない親株と比較してＣＤ２５に対する親和性が改善された抗体を生じる、１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更されたアミノ酸を有する抗体である。
抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＭ等の任意のクラスのものであり得る。免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４等の任意のサブクラスであり得る。本発明の好ましい態様では、抗ＣＤ２５抗体は、ＩｇＧクラス、好ましくはＩｇＧ１サブクラスのものである。一態様では、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。代替的には、一態様では、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものである。
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、幾つかの細胞Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）と相互作用し、下流のエフェクター機構を刺激及び調節する。５つの活性化受容体、すなわちＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）、並びに１つの抑制型受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）が存在する。ＩｇＧ抗体と免疫系との連絡は、抗体によって検知及び収集される情報を免疫系に取り次ぎ、特に生物学的製剤の状況下で先天免疫系と適応免疫系とを結びつけるＦｃγＲによって制御及び媒介される（Hayes J et al., 2016. J Inflamm Res 9: 209-219）。
ＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに結合する能力が異なり、この相違する結合により、様々な機能的応答を誘発するそれらの能力が決まる。例えば、ヒトでは、ＦｃγＲＩＩＩａは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化に関与する主要な受容体であり、ＩｇＧ３、それにすぐ続いてＩｇＧ１が、この受容体に対して最も高い親和性を示し、ＡＤＣＣを強く誘導するそれらの能力が反映される。ＩｇＧ２が、この受容体に対して弱い結合を有することが示されている一方で、ヒトＩｇＧ２アイソタイプを有する抗ＣＤ２５抗体がＴｒｅｇを効率的に枯渇させることも見出されている。
本発明の好ましい実施形態では、抗体はＦｃγＲに高い親和性で、好ましくは活性化受容体に高い親和性で結合する。抗体は、ＦｃγＲＩ及び／又はＦｃγＲＩＩａ及び／又はＦｃγＲＩＩＩａに高い親和性で結合するのが好ましい。特定の実施形態では、抗体は、少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍ未満の解離定数で結合する。
一態様では、抗体は、少なくとも１つのＦｃ活性化受容体に結合することが可能である、ＩｇＧ１抗体、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体である。例えば、抗体はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂから選択される１つ以上の受容体に結合し得る。一態様では、抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａに結合することが可能である。一態様では、抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩａ、並びに任意にＦｃγＲＩに結合することが可能である。一態様では、抗体は、これらの受容体に高い親和性で、例えば約１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍ未満の解離定数で結合することが可能である。
一態様では、抗体は、抑制型受容体ＦｃγＲＩＩｂに低い親和性で結合する。一態様では、抗体は、ＦｃγＲＩＩｂに約１０−７Ｍ超、約１０−６Ｍ超又は約１０−５Ｍ超の解離定数で結合する。
本発明の好ましい実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、ＩｇＧ１サブクラスのものであり、好ましくは本明細書で論考されるように、特にヒト起源の細胞に対してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する。以前に記載されているように（Nimmerjahn F et al., 2005. Science, 310:1510-2）、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプに対応する）は、少なくとも１を上回る高い活性化型対抑制型比（Ａ／Ｉ）で全てのＦｃγＲサブタイプに結合する。対照的に、他のアイソタイプ（ｒＩｇＧ１アイソタイプ等）は、単一の活性化型ＦｃγＲのみ（ＦｃγＲＩＩＩ）及び抑制型ＦｃγＲＩＩｂに同様の親和性で結合し、低いＡ／Ｉ比（１未満）をもたらす。このより低いＡ／Ｉ比は、このアイソタイプのより低い腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇及びより低い抗腫瘍治療活性と相関し得る。ヒトＩｇＧ２アイソタイプの抗体について既知のＦｃγＲ結合プロファイルにも関わらず、顕著なＴｒｅｇ枯渇は、抗ＣＤ２５抗体のヒトＩｇＧ２アイソタイプでも達成することができる。したがって、一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、ＩｇＧ２サブクラスのものである。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５に、好ましくは高い親和性で結合する。更に好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、上記に示されるようにヒトＣＤ２５の細胞外領域に結合する。一態様では、本発明は、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体を提供する。特に、実施例では、７Ｄ４ハイブリドーマによって分泌される抗体を用いて生成された実験データを提供する。本発明の背景技術において示されるように、この抗体は、モノクローナル抗体のパネル（ＰＣ６１を含む）を比較することによって示されるように、ＩＬ−２結合部位とは異なるマウスＣＤ２５内の３つのエピトープのうち１つに結合し、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合を遮断しないマウスＣＤ２５に特異的である。例えば、７Ｄ４は、［Ｕｎｉｐｒｏｔ配列Ｐ０１５９０］中のアミノ酸１８４〜１９４（ＲＥＨＨＲＦＬＡＳＥＥ）を含むエピトープでマウスＣＤ２５に結合することが示されている。７Ｄ４のＣＤ２５結合ドメインを含む組換え抗体、又はＭＡ−２５１及び７Ｇ７Ｂ６と称する非ＩＬ−２遮断抗ヒトＣＤ２５抗体を含む、文献（例えば、非特許文献１１、非特許文献２３、Teege S et al., 2015, Sci Rep 5: 8959）中の７Ｄ４及びマウスＣＤ２５に関わるアッセイは、実施例に開示されるアッセイと共に、実施例に記載されるように適切なアイソタイプが会合している場合にＣＤ２５（特に、ＩＬ−２結合を遮断せずに）及びＦｃγ受容体（特に、好ましくはヒト活性化Ｆｃγ受容体の１つ以上に結合し、効率的にＴｒｅｇを枯渇させることにより）との相互作用のレベルで７Ｄ４の同じ機能的特徴を有するヒトＣＤ２５を認識するヒト抗体を特徴付けるために適合させることができる。
本発明の一態様では、抗体は、ヒトＣＤ２５への結合について抗体７Ｇ７Ｂ６と競合し、及び／又は抗体７Ｇ７Ｂ６によって認識されるのと同じエピトープ（単数又は複数）に結合する。７Ｇ７Ｂ６は、ヒトＣＤ２５を認識するマウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有するモノクローナル抗体である。７Ｇ７Ｂ６は、配列：
EVQLVESGGDLVQPRGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLELVATINGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYFCARDRDYGNSYYYALDYWGQGTSVTVSS（配列番号３）を有する可変重鎖領域と、配列：
QIVLSQSPAILSASPGERVTMTCRASSSVSFMHWLQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVSARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSNPPAFGGGTKLEIK（配列番号４）を有する可変軽鎖領域とを含む。
一実施形態では、抗体は、可変重鎖ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＧＦＴＬＤＳＹＧＶＳ（配列番号７）、可変重鎖ＣＤＲ２としてアミノ酸配列ＧＶＴＳＳＧＧＳＡＹＹＡＤＳＶ（配列番号８）、可変重鎖ＣＤＲ３としてアミノ酸配列ＤＲＹＶＹＴＧＧＹＬＹＨＹＧＭＤＬ（配列番号９）を含む重鎖を含み、可変軽鎖ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＡ（配列番号１１）、可変軽鎖ＣＤＲ２としてアミノ酸配列ＹＡＡＳＴＬＰＦ（配列番号１２）、可変軽鎖ＣＤＲ３としてアミノ酸配列ＱＧＴＹＤＳＳＤＷＹＷＡ（配列番号１３）を含む軽鎖を含む。抗体は、ヒトＣＤ２５への結合について７Ｇ７Ｂ６と競合し得る。抗体は、配列：
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTLDSYGVSWVRQAPGKGLEWVGVTSSGGSAYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRYVYTGGYLYHYGMDLWGQGTLVTVSS（配列番号１０）を含む可変重鎖領域を含む重鎖と、配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISDYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLPFGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQGTYDSSDWYWAFGGGTKVEI（配列番号１４）を含む可変軽鎖領域を含む軽鎖とを含むのが好ましい。
別の実施形態では、抗体は、可変重鎖ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＳＧＦＳＶＤＩＹＤＭＳ（配列番号１５）、可変重鎖ＣＤＲ２としてアミノ酸配列ＹＩＳＳＳＬＧＡＴＹＹＡＤＳＶ（配列番号１６）、可変重鎖ＣＤＲ３としてアミノ酸配列ＥＲＩＹＳＶＹＴＬＤＹＹＡＭＤＬ（配列番号１７）を含む重鎖を含み、可変軽鎖ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＱＡＳＱＧＩＴＮＮＬＮ（配列番号１９）、可変軽鎖ＣＤＲ２としてアミノ酸配列ＹＡＡＳＴＬＱＳ（配列番号２０）、可変軽鎖ＣＤＲ３としてアミノ酸配列ＱＱＧＹＴＴＳＮＶＤＮＡ（配列番号２１）を含む軽鎖を含む。抗体は、ヒトＣＤ２５への結合について７Ｇ７Ｂ６と競合し得る。抗体は、配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSVDIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSSLGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERIYSVYTLDYYAMDLWGQGTLVTVSS（配列番号１８）を含む可変重鎖領域を含む重鎖と、配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGITNNLNWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYTTSNVDNAFGGGTKVEIK（配列番号２２）を含む可変軽鎖領域を含む軽鎖とを含むのが好ましい。
一実施形態では、ヒトＣＤ２５への結合について７Ｇ７Ｂ６と競合し得る抗体は、アミノ酸配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTINGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDYGNSYYYALDYWGQGTLVTVSS（配列番号２３）又は、
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTINGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDRDYGNSYYYALDYWGQGTLVTVSS（配列番号２４）を含む重鎖を含み、かつアミノ酸配列：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQAPRPLIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK（配列番号２５）又は、
QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQSPRPLIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK（配列番号２６）を含む軽鎖とを含む。
本発明の一態様では、抗体は、ヒトＣＤ２５への結合について抗体ＭＡ２５１と競合し、及び／又は抗体ＭＡ２５１によって認識されるのと同じエピトープ（単数又は複数）に結合する。ＭＡ２５１は、ヒトＣＤ２５を認識するマウスアイソタイプを有するモノクローナル抗体である。ＭＡ２５１は、配列：
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGIQWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARAYGYDGSWLAYWGQGTLVTVSS（配列番号５）を有する可変重鎖領域と、配列：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIFATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTINRVEAEDADTYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号６）を有する可変軽鎖領域とを含む。
一実施形態では、ヒトＣＤ２５への結合についてＭＡ２５１と競合し得る抗体は、アミノ酸配列：
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGIQWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQGTLVTVSS（配列番号２７）、
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGIQWVRQPPGKGLEWIGVIWAGGSTNYNSALMSRVTISKDNSKSQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQGTLVTVSS（配列番号２８）、又は、
QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGIQWVRQAPGKGLEWVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYGYDGSWLAYWGQGTLVTVSS（配列番号２９）、
を含む可変重鎖領域を含む重鎖を含み、かつアミノ酸配列：
QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRPLIFATSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号３０）；
QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRPLIFATSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号３１）；
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号３２）；又は、
QIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKSPKPLIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK（配列番号３３）を含む可変軽鎖領域を含む軽鎖を含む。
一実施形態では、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一態様では、抗体は、ヒトＣＤ２５への結合について抗体７Ｇ７Ｂ６及び抗体ＭＡ２５１の両方と競合する。一態様では、抗体は、７Ｇ７Ｂ６によって認識され、ＭＡ２５１によって認識されるのと同じエピトープ（単数又は複数）に結合する。
７Ｇ７Ｂ６抗体又はＭＡ２５１抗体と更なる抗体との間の競合は、例えば実施例において論考され、当該技術分野で既知のように測定することができる。一部の実施形態では、７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１と更なる抗体との間等の２つの抗体の間の競合は、更なる抗体をアッセイに添加し、７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１抗体とヒトＣＤ２５との間の相互作用を測定することによって決定される。かかるアッセイの１つは、７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１抗体、更なる抗体及び組換えヒトＣＤ２５の同時結合を決定するＯｃｔｅｔベースのアッセイである。組換えヒトＣＤ２５への２つの抗体の結合が検出される場合、抗体は非競合である。代替的には、かかるアッセイの１つは、組換えヒトＣＤ２５への７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１抗体の結合を検出する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）である。観察されるシグナルが更なる抗体の添加後に減少する（例えば、少なくとも７５％減少する）場合、後者の抗体は、７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１抗体に対する競合物質である。ヒトＣＤ２５発現細胞への７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１抗体と更なる抗体との同時結合は、フローサイトメトリーを用いて検出することもできる。
一態様では、本発明は、ヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合する抗ＣＤ２５抗体を提供するが、ここで、エピトープは、配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８６（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７０〜８８（ＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）から選択されるアミノ酸ストレッチの１つ以上の１つ以上のアミノ酸残基を含む。エピトープは、選択されるアミノ酸ストレッチの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ又はそれ以上の残基を含むのが好ましい。より好ましくは、エピトープは、配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）、配列番号１のアミノ酸１７６〜１８０（ＲＷＴＱＰ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）及びそれらの組合せから選択される配列を含む。これらのエピトープは、ヒトＣＤ２５中のＩＬ−２結合部位とは異なり、かかるエピトープに結合する抗体は、実施例に記載されるように、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合を遮断しない。
好ましい実施形態では、癌を有するヒト被験体を治療する方法は、本発明の抗ＣＤ２５抗体を被験体に投与する工程を含み、該被験体は、固形腫瘍を有するのが好ましく、抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害せず、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）及びＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）から選択される少なくとも１つの活性化Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合し、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させるヒトＩｇＧ１抗体であるのが好ましい。抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５に対して１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有するのが好ましい。より好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、ヒトＣＤ２５に結合し、マウスＣＤ２５に対する７Ｄ４の効果又はヒトＣＤ２５に対する７Ｇ７Ｂ６及びＭＡ２５１の効果と同様のＩＬ−２結合及びＴｒｅｇ枯渇に対する効果をもたらす。更なる実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、１を上回る活性化型対抑制型比（Ａ／Ｉ）でＦｃγ受容体に結合し、及び／又はＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）に結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）及び／又はＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合する。
７Ｄ４抗体のＣＤ２５結合ドメインは、適切な定常領域と融合した組換えタンパク質としてクローニングされ、発現されている。７Ｄ４抗体のＣＤ２５結合ドメインの配列、加えてＣＤ２５の細胞外ドメイン内の異なるエピトープに対するその特異性及び／又はその他の機能活性を、任意の適切な技法によって（例えば、ＣＤ２５で免疫化した齧歯動物からハイブリドーマのパネルを産生させるか、又は組換え抗体のライブラリーを生成した後、本明細書に記載される機能的特性評価のためＣＤ２５フラグメントを有する抗体レパートリーをスクリーニングすることによって）生成及びスクリーニングされる候補抗ＣＤ２５抗体の比較に用いることができる。その結果として特定される抗ＣＤ２５抗体は、組換え抗体、特に完全抗体、又は本明細書に記載されるフラグメント若しくは変異体としても作製することができる。
自然抗体及び免疫グロブリンは通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、アミノ末端の可変ドメイン（ＶＨ）に続く幾つかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、アミノ末端の可変ドメイン（ＶＬ）及びカルボキシ末端の定常ドメインを有する。
可変領域は、構造的に相補的な抗原性標的と相互作用することが可能であり、異なる抗原特異性の抗体とは異なるアミノ酸配列を特徴とする。Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかの可変領域は、抗原性標的に特異的に結合することが可能なアミノ酸配列を含有する。これらの配列内には、異なる特異性の抗体間での極端な可変性から「超可変」と名付けられたより小さな配列が存在する。かかる超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」領域とも称される。
これらのＣＤＲ領域により、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的な特異性が説明される。ＣＤＲは、可変領域内のアミノ酸の非連続ストレッチであるが、種に関わらず、可変重鎖及び軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の配置位置が、可変鎖のアミノ酸配列内で同様の位置を有することが見出されている。全ての抗体の可変重鎖及び軽鎖は各々、それぞれの軽（Ｌ）鎖及び重（Ｈ）鎖について各々が互いに非連続である３つのＣＤＲ領域を有する（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称される）。認められているＣＤＲ領域は、以前に記載されている（Kabat et al., 1977. J Biol Chem 252, 6609-6616）。
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）、並びにＴｒｅｇ細胞の標的化、増殖の遮断及び／又は枯渇を可能にする任意の他の機構によって機能することができる。
「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、それにより標的細胞の溶解をもたらす細胞媒介反応を指す。
「抗体依存性細胞介在性食作用」（ＡＤＣＰ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する食細胞（マクロファージ等）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、それにより標的細胞の食作用をもたらす細胞媒介反応を指す。
ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、当該技術分野で既知であり、利用可能なアッセイを用い（Clynes et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-6）、実施例において論考されるように測定することができる。抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞毒性及び食作用を媒介する抗体の能力に重要である。このため、本明細書で論考されるように、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞毒性／食作用を媒介するのに望ましいかどうかに基づいて選択することができる。
本明細書で論考されるように、本発明の一実施形態では、インターロイキン２の結合を阻害せず、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇をもたらす抗ＣＤ２５抗体が使用される。例えば、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害せず、強いＣＤＣ応答及び／又は強いＡＤＣＣ及び／又は強いＡＤＣＰ応答を誘発する抗ＣＤ２５抗体を使用することができる。ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを増大する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、ＣＤＣ応答は、Ｃ１ｑ結合の親和性を増大する抗体の突然変異により増大することができる（ldusogie et al. (2001) J lmmunol 166, 2571-5）。
本明細書における「ＣＤ２５へのインターロイキン−２の結合を阻害しない」への言及は、代替的には、抗ＣＤ２５抗体が非ＩＬ−２遮断抗体又は「非遮断」抗体である（抗ＣＤ２５抗体の存在下でのＣＤ２５へのＩＬ−２結合の非遮断に関して）、すなわち、抗体がＣＤ２５へのインターロイキン−２の結合を遮断せず、特にＣＤ２５発現細胞におけるインターロイキン−２シグナル伝達を阻害しないと表現することができる。「非遮断」、「非ＩＬ２遮断」、「遮断しない」又は「遮断せずに」等への言及（抗ＣＤ２５抗体の存在下でのＣＤ２５へのＩＬ−２結合の非遮断に関して）は、本発明の抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５を介したＩＬ−２のシグナル伝達を遮断しない実施形態を含む。すなわち、抗ＣＤ２５抗体は、抗体の非存在下でのＩＬ−２シグナル伝達と比較してＩＬ−２シグナル伝達を５０％未満阻害する。本明細書に記載される本発明の特定の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、抗体の非存在下でのＩＬ−２シグナル伝達と比較して、ＩＬ−２シグナル伝達を約４０％、３５％、３０％未満、好ましくは約２５％未満阻害する。抗ＣＤ２５非ＩＬ−２遮断抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ−２結合を妨げずに又はＣＤ２５へのＩＬ−２結合を実質的に妨げずに、ＣＤ２５への結合を可能にする。本明細書における非ＩＬ−２遮断抗体への言及は、代替的には、「ＣＤ２５へのインターロイキン−２の結合を阻害しない」抗ＣＤ２５抗体又は「ＩＬ−２のシグナル伝達を阻害しない」抗ＣＤ２５抗体と表現することができる。
幾つかの抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合を可能にし得るが、依然としてＣＤ２５受容体を介したシグナル伝達を遮断する。かかる抗ＣＤ２５抗体は、本発明の範囲内ではない。代わりに、非ＩＬ−２遮断抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合を可能にし、抗ＣＤ２５抗体の非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＣＤ２５受容体を介したシグナル伝達のレベルを少なくとも５０％助長する。
ＣＤ２５を介したＩＬ−２シグナル伝達は、実施例において論考され、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。抗ＣＤ２５抗体剤の存在下及び非存在下でのＩＬ−２シグナル伝達の比較は、同じ又は実質的に同じ条件下で行うことができる。
一部の実施形態では、ＩＬ−２シグナル伝達は、標準Ｓｔａｔ−５リン酸化アッセイを用いて、細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５タンパク質のレベルを測定することによって決定することができる。例えば、ＩＬ−２シグナル伝達を測定するＳｔａｔ−５リン酸化アッセイは、ＰＭＢＣ細胞を１０μｇ／ｍｌ濃度の抗ＣＤ２５抗体の存在下で３０分間培養することと、その後様々な濃度のＩＬ−２（例えば１０Ｕ／ｍｌ、又は０．２５Ｕ／ｍｌ、０．７４Ｕ／ｍｌ、２．２２Ｕ／ｍｌ、６．６６Ｕ／ｍｌ若しくは２０Ｕ／ｍｌと濃度を変化させる）を１０分間添加することとを含み得る。次いで、細胞を透過処理することができ、続いてＳＴＡＴ５タンパク質のレベルをフローサイトメトリーによって分析されるリン酸化ＳＴＡＴ５ペプチドに対する蛍光標識抗体により測定することができる。ＩＬ−２シグナル伝達の遮断率は、以下のように算出することができる：遮断％＝１００×［（Ｓｔａｔ５＋細胞無抗体群（％）−Ｓｔａｔ５＋細胞１０μｇ／ｍｌ抗体群（％））／（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％））］
ＡＤＣＣは、フコース部分を抗体グリカンから除去する方法、例えばＹＢ２／０細胞株における抗体の産生又はヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に対する特異的突然変異の導入（例えば、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）によって増大することができる（Lazar et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103, 2005-2010、Smith et al. (2012) Proc Natl 25 Acad Sci USA 109, 6181-6）。ＡＤＣＰもヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に対する特異的突然変異の導入によって増大することができる（Richards et al. (2008) Mol Cancer Ther 7, 2517-27）。
本発明の好ましい実施形態では、ＡＤＣＣ応答を誘発するように抗体を最適化する。すなわち、ＡＤＣＣ応答を、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗体、例えば非修飾抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を含む他の抗ＣＤ２５抗体に対して増強、増大又は改善する。
本発明の好ましい実施形態では、ＡＤＣＰ応答を誘発するように抗体を最適化する。すなわち、ＡＤＣＰ応答を、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗体、例えば非修飾抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を含む他の抗ＣＤ２５抗体に対して増強、増大又は改善する。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、ラット又はマウスの抗体等の或る種からの免疫グロブリンに由来する可変配列と、ヒト抗体等の別の種からの免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を指す。一部の実施形態では、キメラ抗体は、ＡＤＣＣの誘導について増強した定常領域を有し得る。
本発明による抗体は、部分的又は完全に合成のものであってもよく、抗体のポリペプチド鎖の少なくとも一部が合成され、場合によっては、同種抗原への結合について最適化される。かかる抗体は、キメラ又はヒト化抗体であってもよく、完全に四量体の構造であっても、又は二量体であり、単一の重鎖及び単一の軽鎖のみを含んでいてもよい。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物又はファージのクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指すものであり、それを作製する方法を指すものではない。
本発明の抗体は、ヒト抗体であってもよい。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでいてもよい（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。
本明細書に記載される特徴を呈する抗ＣＤ２５抗体が本発明の更なる目的である。該抗ＣＤ２５抗体は、薬剤に使用することができる。更なる実施形態では、本発明は、ＣＤ２５へのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の結合又はＣＤ２５を介したＩＬ−２のシグナル伝達を阻害しない抗ＣＤ２５抗体を投与することを含む、被験体において疾患を治療する方法を提供する。疾患は癌、特に固形腫瘍であるのが好ましい。
更なる実施形態では、本発明は、本明細書で規定される抗ＣＤ２５抗体をコードする核酸分子を提供する。一部の実施形態では、このような提供される核酸分子は、コドン最適化核酸配列を含有してもよく、及び／又は例えば細菌、酵母、昆虫、魚、マウス、サル又はヒトの細胞等の宿主細胞における発現のための適切な核酸ベクター内の発現カセットに含まれていてもよい。一部の実施形態では、本発明は、所望の抗体を発現する異種核酸分子（例えば、ＤＮＡベクター）を含む宿主細胞を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、上記で規定される単離抗ＣＤ２５抗体を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、かかる方法は、核酸（例えば、宿主細胞を構成し得る及び／又はベクターによって宿主細胞に送達され得る異種核酸）を含む宿主細胞を培養することを含み得る。宿主細胞（及び／又は異種核酸配列）は、抗体、又はその抗原結合フラグメント若しくは変異体が宿主細胞から分泌され、細胞培養上清から単離されるように配置及び構築するのが好ましい。
本発明の抗体は単一特異性、二重特異性又は多重特異性であり得る。「多重特異性抗体」は、１つの標的抗原若しくはポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は２つ以上の標的抗原若しくはポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る（Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol 22, 238-44）。
本発明の一態様では、抗体は単一特異性抗体である。下記で更に論考されるように、代替的な態様では、抗体は二重特異性抗体である。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」は、単一の抗原若しくはポリペプチド上又は２つの異なる抗原若しくはポリペプチド上のいずれかの２つの異なるエピトープに結合する能力を有する抗体を指す。
本明細書で論考される本発明の二重特異性抗体は、体細胞交雑等の生物学的方法；又は細胞株若しくは生物における所望の抗体構造をコードする非天然ＤＮＡ配列の発現等の遺伝子法；化学的方法（例えば、別の抗体又は抗体フラグメント等の１つ以上の分子実体への化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合又は別の形による）；又はそれらの組合せによって作製することができる。
単一特異性又は二重特異性抗体の作製を可能にする技術及び製品は、代替的なフォーマット、抗体−薬物コンジュゲート、抗体設計方法、ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法、定常領域、翻訳後修飾及び化学修飾、Ｆｃエンジニアリング（Fc engineering）等の癌細胞死を誘発する特徴の改善に関しても文献中で広範に概説されるように当該技術分野で既知である（Tiller K and Tessier P, 2015 Annu Rev Biomed Eng. 17: 191-216、Speiss C et al., 2015. Molecular Immunology 67 95-106、Weiner G, 2015. Nat Rev Cancer, 15: 361-370、Fan G et al., 2015. J Hematol Oncol 8:130）。かかる二重特異性抗体は、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＢｉＴＥ ＤＡＲＴ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ノブインホール、Ｔｒｉｏｍａｂ、又は他の適切な分子フォーマット及びそのフラグメントを含む任意の市販のフォーマットで提供することができる。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」又は「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。当該技術分野で既知のように、エピトープは、連続アミノ酸（線状エピトープ）又はタンパク質の三次フォールディングによって並置された非連続アミノ酸（立体配座エピトープ）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは通例、変性溶媒への曝露の際に保持され、三次フォールディングによって形成されるエピトープは通例、変性溶媒での処理の際に失われる。エピトープは通例、少なくとも３個、より一般には少なくとも５個又は８個〜１０個のアミノ酸を独自の空間的立体配座で含む。エピトープの空間的立体配座を決定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えばＸ線結晶構造解析及び２Ｄ核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。例えば、本発明の抗体は、抗体７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１が結合する立体配座エピトープを認識し得る。一実施形態では、立体配座エピトープは、配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）、配列番号１のアミノ酸１７６〜１８０（ＲＷＴＱＰ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）から選択される少なくとも２つの配列を含む。
一部の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、特に癌の療法又は診断のための治療剤又は診断剤等のコンジュゲートペイロードを更に含む作用物質中に含まれていてもよい。放射性核種又は毒素との抗ＣＤ２５抗体コンジュゲートを使用することができる。一般に使用される放射性核種の例は、例えば特に９０Ｙ、１３１Ｉ及び６７Ｃｕであり、一般に使用される毒素の例は、ドキソルビシン及びカリケアマイシンである。更なる実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、変更された半減期を有するように修飾することができる。半減期の変更を達成する方法は、当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体を別の治療剤又は診断剤とコンジュゲートさせない。特に、一部の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体を放射性核種とコンジュゲートさせない。すなわち、一部の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体を放射標識しない。
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載される本発明の態様のいずれかの被験体は、哺乳動物、好ましくはネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ又はモルモットであるが、最も好ましくは、被験体はヒトである。このため、本明細書に記載される本発明の全ての態様において、被験体がヒトであるのが好ましい。
本明細書で使用される場合、「癌」、「癌性」又は「悪性」という用語は、通例、無秩序な細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指す又は説明するものである。
癌の例としては、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫及び肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより特定の例としては、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞癌（ＨＣＣ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、消化器（消化管）癌、腎癌、卵巣癌、肝癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵癌、多形膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌及び頭頸部癌が挙げられる。
一態様では、癌は固形腫瘍を伴う。固形腫瘍の例は、肉腫（海綿骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織、造血組織又は線維性結合組織等の組織中の間葉起源の形質転換細胞から生じる癌を含む）、癌腫（上皮細胞から生じる腫瘍を含む）、中皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等である。固形腫瘍を伴う癌としては、限定されるものではないが、脳癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、食道癌、乳癌、結腸癌及び直腸癌、腎癌、膀胱癌、腎臓癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、口腔癌、肉腫、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、膣癌、頸部癌、リンパ腫等が挙げられる。
一態様では、癌は、ホジキンリンパ腫等のリンパ腫及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等のリンパ性白血病を含むが、これらに限定されない、ＣＤ２５を発現する腫瘍を伴う。
本発明の一態様では、癌はＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＳＬＡＭ７Ｆ、ＣＤ４７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＥＧＦＲ等のような特定の腫瘍関連マーカー及び抗原の存在によって特定されるか、又は高頻度マイクロサテライト不安定性（microsatellite instability-high；ＭＳＩ−Ｈ）若しくはミスマッチ修復機構欠損（mismatch repair deficient；ｄＭＭＲ）と称されるバイオマーカーを有することが特定されている癌である。さらに、特異的な腫瘍関連マーカー、抗原又はバイオマーカーの特定が、上皮内癌、くすぶり型骨髄腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、子宮頸部上皮内腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫／ＧＡＬＴリンパ腫（GALTomes）及び様々なリンパ増殖性障害等の患者における上記の癌の前癌性の非侵襲状態の確定に用いられている場合に抗体を使用することができる。一部の実施形態では、治療される被験体は、固形腫瘍を有するのが好ましい。
本発明の一態様では、癌は黒色腫、非小細胞肺癌、腎癌、卵巣癌、膀胱癌、肉腫及び結腸癌から選択される。本発明の好ましい態様では、癌は黒色腫、卵巣癌、非小細胞肺癌及び腎癌から選択される。一実施形態では、癌は黒色腫、卵巣癌又は乳癌ではない。好ましい態様では、癌は肉腫、結腸癌、黒色腫若しくは大腸癌、又はより一般に４Ｔ１、ＭＣＡ２０５、Ｂ１６、ＣＴ２６若しくはＭＣ３８細胞株を、化合物が治療管理に有用であることを検証するための前臨床モデルとすることができる任意のヒト癌である。
本明細書で使用される場合、癌と診断された又は癌を有する疑いがある被験体に適用される「腫瘍」という用語は、任意のサイズの悪性の又は潜在的に悪性の新生物又は組織塊を指し、原発腫瘍及び続発性新生物が含まれる。「癌」、「悪性疾患」、「新生物」、「腫瘍」及び「癌腫」という用語は、相対的に異常な、無制御の及び／又は自律的な成長を示し、顕著な制御不能の細胞増殖を特徴とする異常な成長表現型を示す腫瘍及び腫瘍細胞を指すために本明細書で区別なく用いられる場合もある。概して、検出又は治療にとって関心が持たれる細胞は、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性（pre-metastatic）、転移性及び非転移性の細胞を含む。本開示の教示は、あらゆる全ての癌に関連し得る。
本明細書で使用される場合、「固形腫瘍」は、通常は嚢胞又は液体領域を有しない組織の異常な成長又は量、特に白血病又は非固形リンパ腺癌以外の腫瘍及び／又は転移（位置を問わない）である。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の種々のタイプは、固形腫瘍を形成する細胞のタイプ及び／又は固形腫瘍が位置する組織若しくは器官から名付けられる。固形腫瘍の例は、肉腫（海綿骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織、造血組織又は線維性結合組織等の組織中の間葉起源の形質転換細胞から生じる癌を含む）、癌腫（上皮細胞から生じる腫瘍を含む）、黒色腫、リンパ腫、中皮腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫である。
本発明に従う特に好ましい癌は、固形腫瘍の存在を特徴とするものを含む。すなわち、被験体は非固形腫瘍を有しない。本明細書で論考される本発明の全ての態様において、癌が固形腫瘍であり、すなわち被験体が固形腫瘍を有する（非固形腫瘍を有しない）のが好ましい。
本明細書で使用される癌を「治療する」（"treat" or "treating"）ことへの言及は、例えば癌細胞の数の低減、腫瘍サイズの低減、末梢器官への癌細胞浸潤の速度の低減、又は腫瘍転移若しくは腫瘍成長の速度の低減等の少なくとも１つのプラスの治療効果の達成を定義するものである。
癌におけるプラスの治療効果は、多数の方法で測定することができる（例えば、Weber (2009) J Nucl Med 50, 1S-10S）。例としては、腫瘍成長阻害に関して、国立がん研究所（ＮＣＩ）標準によると、Ｔ／Ｃ≦４２％が抗腫瘍活性の最低レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％が高い抗腫瘍活性レベルとみなされ、Ｔ／Ｃ（％）＝治療群の腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００である。一部の実施形態では、治療有効量によって達成される治療は、無増悪生存（ＰＦＳ）、無病生存（ＤＦＳ）又は全生存（ＯＳ）のいずれかである。「腫瘍進行までの期間」とも称されるＰＦＳは、癌が成長しない治療中及び治療後の時間の長さを示し、患者が完全奏効又は部分奏効を経験した時間、並びに患者が安定（stable disease）を経験した時間を含む。ＤＦＳは、患者が無病のままである治療中及び治療後の時間の長さを示す。ＯＳは、未処置又は未治療の個体又は患者と比較した平均余命の延長を指す。
本明細書で使用される「予防」（又は予防法）への言及は、癌の症状の発生を遅らせる又は妨げることを指す。予防は、絶対的なものであっても（疾患が生じないような）、又は一部の個体又は限られた時間のみで効果的なものであってもよい。
本発明の好ましい態様では、被験体は定着腫瘍を有する。すなわち、被験体は、例えば固形腫瘍として分類される腫瘍を既に有する。このように、本明細書に記載される本発明は、被験体が固形腫瘍等の腫瘍を既に有する場合に用いることができる。このように、本発明は、既存の腫瘍の治療に用いることができる治療選択を提供する。本発明の一態様では、被験体は、既存の固形腫瘍を有する。本発明は、予防又は好ましくは、固形腫瘍を既に有する被験体において治療として用いることができる。一態様では、本発明は、予防法（preventative or prophylaxis）として用いられない。
一態様では、本明細書に記載される本発明を用いて、例えば他の癌治療（例えば、所与の癌の標準治療法）と比較して、腫瘍退縮を増強することができ、腫瘍成長を阻害若しくは低減することができ、及び／又は生存時間を延長することができる。
本発明の一態様では、本明細書に記載される癌を治療又は予防する方法は、癌を有する被験体を特定する工程、好ましくは固形腫瘍等の腫瘍を有する被験体を特定する工程を更に含む。一実施形態では、方法は、血液癌を有する被験体を特定することを含み得る。
癌患者を治療するのに効果的な本明細書に記載の療法の投与計画は、患者の疾患状態、年齢及び体重、並びに被験体において抗癌応答を誘発する療法の能力等の因子によって異なり得る。適切な投与量の選択は、当業者の能力の範囲内である。例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、かかる量は、適切な母集団に投与した場合に所望の又は有益な結果と相関することが決定された投与計画（すなわち、治療的投与計画）に従う投与に適切な単位投与量（又はその全画分）である。
本明細書に記載される本発明の任意の態様による抗体は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を付加的に含む医薬組成物の形態であってもよい。これらの組成物としては、例えば液体、半固体及び個体の剤形（dosage formulations）、例えば液体溶液（例えば、注射溶液及び注入溶液）、分散液若しくは懸濁液、錠剤、丸薬、又はリポソームが挙げられる。一部の実施形態では、好ましい形態は、意図される投与方法及び／又は治療用途によって異なり得る。抗体を含有する医薬組成物は、限定されるものではないが、経口投与、粘膜投与、吸入投与、局所投与、バッカル投与、経鼻投与、直腸投与又は非経口投与（例えば、静脈内、点滴、腫瘍内、節内（intranodal）、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、経皮、又は被験体の組織の物理的切開（physical breaching）及び組織の切開部を介した医薬組成物の投与を伴う他の種類の投与）を含む当該技術分野で既知の任意の適切な方法によって投与することができる。かかる配合物は、例えば皮内、腫瘍内若しくは皮下投与、又は静脈内注入に好適な注射溶液又は輸液溶液の形態であり得る。投与は、間欠投与を含んでいてもよい。代替的には、投与は、他の化合物の投与と同時の又はその投与の間の少なくとも選択期間にわたる持続投与（例えば、灌流）を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、抗体は、埋め込み注射剤、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系等の制御放出配合物のように急速な放出及び／又は分解を防ぐ担体を用いて調製することができる。生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。
当業者には、例えば送達経路（例えば、経口対静脈内対皮下対腫瘍内等）が用量に影響する可能性があり、及び／又は必要とされる用量が送達経路に影響する可能性があることが理解される。例えば、特定の部位又は位置（例えば、腫瘍内）において特に高濃度の作用物質を目的とする場合、集中的な送達（例えば、この例では腫瘍内送達）が所望される及び／又は有用である可能性がある。経路及び／又は投与スケジュールを所与の治療計画に最適化する場合に考慮すべき他の因子は、例えば治療される特定の癌（例えば、タイプ、ステージ、位置等）、被験体の臨床状態（例えば、年齢、健康全般等）、併用療法の有無、及び医師に知られている他の因子を含み得る。
医薬組成物は通例、滅菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定したものとする。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の規則構造として配合することができる。滅菌注射溶液は、必要量の抗体を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組合せと共に適切な溶媒に組み入れ、続いて濾過減菌（filtered sterilization）を行うことによって調製することができる。非経口投与用の配合物としては、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、及び本明細書で論考されるような埋め込み可能な徐放性又は生分解性配合物が挙げられるが、これらに限定されない。滅菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒を用いて調製することができる。本発明に従って使用される各医薬組成物は、用いられる投与量及び濃度で被験体に対して非毒性である薬学的に許容可能な分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、等張剤、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、担体、賦形剤、塩又は安定化剤を含み得る。好ましくは、かかる組成物は、所与の方法及び／又は投与部位に適合する、例えば非経口（例えば、皮下、皮内又は静脈注射）、腫瘍内又は腫瘍周囲投与のための癌の治療に用いられる薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含んでいてもよい。
本発明による治療方法又は使用のための組成物の実施形態は、全被験体においてプラスの治療効果を達成するのに効果的でない場合もあるが、適切な医療行為並びにスチューデントｔ検定、χ２検定、マン−ホイットニーのＵ検定、クラスカル−ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール−タプストラ検定及びウィルコクソン検定等の当該技術分野で既知の任意の統計的検定によって決定されるような統計的に有意な被験体数と適合する医薬組成物及び投与計画を用いて行うものとする。
以上及び以降で腫瘍、腫瘍性疾患、癌腫又は癌に言及する場合、代替的又は付加的に、腫瘍及び／又は転移の位置を問わず、元の器官若しくは組織及び／又は任意の他の位置における転移も意味する。
本明細書で論考されるように、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させることに関する。このため、本発明の一態様では、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体はまた、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる又は低減する。一態様では、枯渇はＡＤＣＣによるものである。別の態様では、枯渇はＡＤＣＰによるものである。
このように、本発明は、被験体において腫瘍中の制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法であって、該被験体にＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体を投与することを含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、Ｔｒｅｇを固形腫瘍中で枯渇させる。「枯渇させる」とは、Ｔｒｅｇの数、比率又はパーセンテージが、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体を投与しない場合と比べて減少していることを意味する。本明細書に記載される本発明の特定の実施形態では、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超の腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる。
本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」（「Ｔｒｅｇ」、「Ｔｒｅｇ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」）は、自己免疫、アレルギー及び感染の制御に特化したＣＤ４＋Ｔリンパ球の系統を指す。これらは通例、Ｔ細胞集団の活性を調節するが、或る特定の自然免疫系の細胞型に影響を与える場合もある。Ｔｒｅｇは通常、バイオマーカーＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３の発現によって特定される。自然発生Ｔｒｅｇ細胞は通常、末梢性ＣＤ４＋Ｔリンパ球の約５％〜１０％を占める。しかしながら、腫瘍微小環境（すなわち、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞）では、これらは全ＣＤ４＋Ｔリンパ球集団の２０％〜３０％も占める場合がある。
活性化ヒトＴｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞及びＡＰＣ等の標的細胞をパーフォリン依存性経路又はグランザイムＢ依存性経路を介して直接殺傷させることができる。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４＋）Ｔｒｅｇ細胞は、ＡＰＣによってインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を誘導し、これらが次にトリプトファンを還元することによってＴ細胞活性化を抑制する。Ｔｒｅｇ細胞は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及び形質転換成長因子（ＴＧＦβ）をｉｎ ｖｉｖｏで放出することにより、Ｔ細胞活性化を直接阻害し、ＭＨＣ分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩＬ−１２の発現を阻害することによってＡＰＣ機能を抑制する。Ｔｒｅｇ細胞は、抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６に結合し得る高レベルのＣＴＬＡ４を発現し、エフェクターＴ細胞の適当な活性化を妨げることによって免疫を抑制することもできる。
本発明の好ましい実施形態では、固形腫瘍におけるエフェクターＴ細胞の制御性Ｔ細胞に対する比率が増大する。一部の実施形態では、固形腫瘍におけるエフェクターＴ細胞の制御性Ｔ細胞に対する比率は、５、１０、１５、２０、４０又は８０超増大する。
免疫エフェクター細胞は、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞としては、骨髄又はリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性（cytolytic）Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞及び好塩基球が挙げられる。
免疫応答のエフェクター相に関与する免疫エフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を行う。エフェクター細胞は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る。例えば、好中球がＡＤＣＣを誘導することが可能である。例えば、ＦｃαＲを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球及びリンパ球は、標的細胞の特異的殺傷及び免疫系の他の構成要素への抗原の提示、又は抗原を提示する細胞への結合に関与する。エフェクター細胞は、標的抗原、標的細胞又は微生物を貪食することもできる。本明細書で論考されるように、本発明による抗体は、ＡＤＣＣを誘導する能力について最適化することができる。
一部の実施形態では、癌に対する異なる作用物質を、抗体と組み合わせて同じ又は異なる送達経路により及び／又は異なるスケジュールに従って投与することができる。代替的又は付加的には、一部の実施形態では、１つ以上の用量の第１の活性物質を１つ以上の他の活性物質と実質的に同時に、一部の実施形態では共通の経路により及び／又は単一の組成物の一部として投与する。当業者には、本発明に従って提供される併用療法の一部の実施形態が相乗効果を達成することが更に理解される。一部のかかる実施形態では、組合せで利用される１つ以上の作用物質の用量が、その作用物質が異なる治療計画で（例えば、単独療法として及び／又は異なる併用療法の一部として）利用される場合に標準の、好ましい又は必要とされるものとは実質的に異なっていてもよく（例えば、より低い）、及び／又はその作用物質が異なる治療計画で（例えば、単独療法として及び／又は異なる併用療法の一部として）利用される場合に標準の、好ましい又は必要とされる経路の代替的な経路によって送達されてもよい。
２つ以上の活性物質を本発明に従って利用する一部の実施形態では、かかる作用物質は、同時又は順次に投与することができる。一部の実施形態では、或る作用物質の投与を、別の作用物質の投与に対して特別にタイミングを合わせる。例えば、一部の実施形態では、特定の効果が観察される（又は例えば所与の投与計画と対象の特定の効果との間の相関を示す集団研究に基づいて観察されることが期待される）ように第１の作用物質を投与する。一部の実施形態では、組合せで投与される作用物質の所望の相対的投与計画を、例えばｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いて評定するか又は経験的に決定することができる。一部の実施形態では、かかる評定又は経験的決定は、ｉｎ ｖｉｖｏで患者集団（例えば、相関が確立されるように）又は代替的には対象の特定の患者において行われる。
本発明の別の態様では、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた場合に改善された治療効果を有する。ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害剤を用いた併用療法は、定着腫瘍の治療において相乗効果を有し得る。本実施例におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１についてのデータは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の干渉に関する。このように、ＰＤ−１受容体とＰＤ−Ｌ１リガンドとの間の相互作用を遮断し、「ＰＤ−１遮断」をもたらすことができる。一態様では、組合せにより腫瘍退縮の増強、腫瘍成長の障害若しくは低減の増強をもたらすことができ、及び／又は生存時間を、本明細書に記載される本発明を用いて、例えば抗ＣＤ２５抗体又はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断単独（抗ＰＤ１抗体を用いて直接的に、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて間接的に）のいずれかと比較して延長することができる。抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しないことから、抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害剤を用いた併用療法は、癌の治療に適切な投与量でのインターロイキン−２の投与を更に含んでいてもよい。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」又は「免疫チェックポイントタンパク質」は、特にＴ細胞応答の調整のための免疫系における抑制性経路に属するタンパク質を指す。正常な生理的条件下では、免疫チェックポイントは、自己免疫の予防、特に病原体に対する応答時の自己免疫の予防に極めて重要である。癌細胞は、免疫監視を回避するために免疫チェックポイントタンパク質の発現の調節を変化させることができる。
免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ及びＴＩＭ３、更にはＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ及びＨＶＥＭが挙げられるが、これらに限定されない。免疫チェックポイントタンパク質は、他の免疫チェックポイントタンパク質に結合するタンパク質を指す場合もある。かかるタンパク質としては、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ、ＬＬＴ１及びＧＡＬ９が挙げられる。
「免疫チェックポイントタンパク質阻害剤」は、免疫チェックポイントタンパク質によって媒介されるシグナル伝達及び／又はタンパク質間相互作用を妨げることができる任意のタンパク質を指す。本発明の一態様では、免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１である。本明細書に記載される本発明の好ましい態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を介してＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を妨げる。
このように、本発明は、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体及び更なる治療剤、好ましくはチェックポイント阻害剤を被験体に投与することを含む、癌を治療する方法も提供する。本発明は、癌の治療に使用される、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体及び更なる治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤も提供する。
本発明は、癌の治療のための薬剤の製造へのＣＤ２５へのインターロイキン−２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体及び更なる治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤の使用を付加的に提供する。ＣＤ２５へのインターロイキン−２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害剤等の更なる治療剤の投与は同時、別個又は順次であり得る。
本発明は、被験体における癌の治療に使用される、ＣＤ２５へのインターロイキン−２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５と更なる治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤との組合せを提供するが、ここで、ＣＤ２５へのインターロイキン−２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体及び免疫チェックポイント阻害剤等の更なる治療剤は同時、別個又は順次に投与される。ＣＤ２５へのインターロイキン−２の結合を阻害せず、ヒトＩｇＧ１アイソタイプを呈する、かかる抗ヒトＣＤ２５抗体は、特に免疫チェックポイントを標的とするが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣを可能にする配列を欠く抗体と組み合わせて用いることができる。
代替的な態様では、本発明は、癌の治療に使用される、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体を提供するが、ここで、該抗体は、更なる治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。本発明は、癌を治療するための薬剤の製造におけるＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５の使用も提供するが、ここで、上記薬剤は、更なる治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。
本発明は、薬学的に許容可能な媒体中のＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体と任意に更なる治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤とを含む医薬組成物を提供する。上記で論考されるように、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１の阻害剤、すなわちＰＤ−１アンタゴニストであり得る。
ＣＤ２７９としても知られるＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）は、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞上で発現される細胞表面受容体である。そのリガンドとの相互作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でＴ細胞応答を弱めることが示されている。ＰＤ−１は、２つのリガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に結合する。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＰＤ−１シグナル伝達は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示されるペプチド抗原にごく接近したＰＤ−１リガンドへの結合を必要とする（Freeman (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 10275-6）。したがって、Ｔ細胞膜上のＰＤ−１及びＴＣＲのコライゲーション（co-ligation）を妨げるタンパク質、抗体又は小分子は、有用なＰＤ−１アンタゴニストである。
一実施形態では、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、ＰＤ−１に特異的に結合し、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合フラグメントである。抗ＰＤ−１抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。抗ＰＤ−１抗体は、ヒト又はヒト化抗体であってもよい。抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１受容体への特異的結合が可能な抗体である。当該技術分野で既知の抗ＰＤ−１抗体としては、ニボルマブ及びペムブロリズマブが挙げられる。
本発明のＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１のリガンドを結合及び／又は遮断してＰＤ−１受容体へのリガンドの結合を妨げる若しくは阻害するか、又はＰＤ−１受容体を介した抑制性シグナル伝達を誘導することなくＰＤ−１受容体に直接結合して遮断する化合物又は作用物質も含む。特に、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路の小分子阻害剤を含む。代替的には、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、抑制性シグナル伝達を誘発することなくＰＤ−１受容体に直接結合することができ、更にはＰＤ−１受容体のリガンドに結合して、リガンドのＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達の誘発を低減する又は阻害する。ＰＤ−１受容体に結合し、抑制性シグナルの伝達を誘発するリガンドの数及び／又は量を低減することにより、より少数の細胞がＰＤ−１シグナル伝達によって送達される負のシグナルによって減弱され、より強固な免疫応答を達成することができる。
一実施形態では、ＰＤ−１受容体アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントである。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体であり得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）等のヒト又はヒト化抗体であり得る。
本発明は、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体及びＴ細胞活性化共刺激経路のアゴニストである抗体を被験体に投与することを含む、癌を治療する方法も提供する。Ｔ細胞活性化共刺激経路の抗体アゴニストとしては、限定されるものではないが、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＬＩＧＨＴ及び４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体が挙げられる。
癌を治療する更なる方法は、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体と、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）を減少させる、遮断する、阻害する及び／又はそれに拮抗する化合物とを投与することを含む。かかるＦｃγＲＩＩｂアンタゴニストは、ＦｃγＲＩＩｂによって誘導される細胞内シグナル伝達に干渉する小分子、抑制型ＦｃγＲＩＩｂ受容体に係合しない修飾抗体又は抗ヒトＦｃγＲＩＩｂ（抗ＣＤ３２ｂ）抗体であり得る。例えば、アンタゴニスト抗ヒトＦｃγＲＩＩｂ抗体は、それらの抗腫瘍特性についても特性評価されている（Roghanian A et al., 2015, Cancer Cell. 27, 473-488、Rozan C et al., 2013, Mol Cancer Ther. 12:1481-91、国際公開第２０１５１７３３８４号、国際公開第２００８００２９３３号）。
更なる態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ２５に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｂ）免疫チェックポイントタンパク質、腫瘍関連抗原、抗ヒト活性化型Ｆｃ受容体抗体（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩＩ）又はアンタゴニスト抗ヒトＦｃγＲＩＩｂ抗体に結合する第２の抗原結合部分と、
を含む二重特異性抗体であって、該抗ＣＤ２５抗体が、ＣＤ２５へのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の結合を阻害せず、好ましくは少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合し、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させるＩｇＧ１二重特異性抗体である、二重特異性抗体を提供する。好ましい実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＰＤ−Ｌ１に結合する。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞を隣接する非癌細胞と区別可能なものにする腫瘍細胞上で発現される抗原を指し、限定されるものではないが、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＰＤ−Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶ３、ＣＥＡ、ＴＹＲＰ１及びＨＥＲ２が含まれる。関連の腫瘍関連抗原及び対応する治療上有用な抗腫瘍抗体剤を記載する様々な総説論文が公開されている（例えば、Sliwkowski & Mellman (2013) Science 341, 192-8を参照されたい）。かかる抗原及び対応する抗体としては、限定されるものではないが、ＣＤ２２（ブリナツモマブ）、ＣＤ２０（リツキシマブ、トシツモマブ）、ＣＤ５６（ロルボツズマブ）、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ（ラベツズマブ）、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）、ＣＤ２２１／ＩＧＦ１Ｒ（ＭＫ−０６４６）、ＣＤ３２６／Ｅｐｃａｍ（エドレコロマブ）、ＣＤ３４０／ＨＥＲ２（トラスツズマブ、ペルツズマブ）及びＥＧＦＲ（セツキシマブ、パニツムマブ）が挙げられる。
一態様では、本明細書に記載される本発明による二重特異性抗体は、ＡＤＣＣ、又は一態様では、ＡＤＣＣの増強をもたらす。
二重特異性抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合に影響を及ぼさないＣＤ２５上の特異的エピトープと、本明細書で規定される免疫チェックポイントタンパク質又は腫瘍関連抗原上の特異的エピトープとに結合し得る。好ましい実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＰＤ−Ｌ１に結合する。好ましい態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ２５に結合し、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合に影響を及ぼさない第１の抗原結合部分と、
（ｂ）腫瘍細胞上で発現される免疫チェックポイントタンパク質に結合する第２の抗原結合部分と、
を含む二重特異性抗体を提供する。
特定の実施形態では、腫瘍細胞上で発現される免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＧＡＬ９、Ｂ７Ｈ３又はＢ７Ｈ４である。更に好ましくは、抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ−２の結合に影響を及ぼさず、少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合し、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させるＩｇＧ１抗体である。代替的には抗ＣＤ２５抗体は、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させるヒトＩｇＧ２抗体である。特定の一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体は、少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体、好ましくはＦｃγＲＩＩａに高い親和性で結合するヒトＩｇＧ２抗体である。
当業者であれば、既知の方法を用いて二重特異性抗体を作製することが可能である。本発明による二重特異性抗体は、本明細書に記載される本発明の態様のいずれかに用いることができる。本発明による二重特異性抗体内の第２の抗原結合部分は、ヒトＰＤ−１、ヒトＰＤ−Ｌ１又はヒトＣＴＬＡ−４に結合するのが好ましい。
一態様では、二重特異性抗体は、ＣＤ２５と、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ上で高レベルに発現される免疫調節受容体、例えばＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ又はＯＸ４０とに結合し得る。
本発明は、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体と、本明細書で論考される更なる治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤、好ましくはＰＤ−１アンタゴニスト（抗ＰＤ１抗体を用いて直接的に、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて間接的に）とを含むキットも提供する。一態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１である。代替的な実施形態では、キットは、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体と、Ｔ細胞活性化共刺激経路のアゴニストである抗体とを含む。キットは、使用説明書を含み得る。
本明細書に記載される本発明の任意の態様は、付加的な治療剤、特に付加的な癌療法と組み合わせて行うことができる。特に、本発明による抗ＣＤ２５抗体及び任意に免疫チェックポイント阻害剤は、共刺激抗体、化学療法及び／又は放射線療法（体外から放射線照射を行うこと又は放射性コンジュゲート化合物を投与することによる）、サイトカイン療法、標的療法、モノクローナル抗体療法、ワクチン若しくはアジュバント又は任意のそれらの組合せと組み合わせて投与することができる。
本明細書で使用される化学療法物質（entity）は、細胞に有害な物質を指す。すなわち、この物質は細胞の生存能力を低減する。化学療法物質は、細胞毒性薬であり得る。企図される化学療法剤としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、エポチロン、ニトロソウレア、エチレンイミン／メチルメラミン、スルホン酸アルキル、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン（epipodophylotoxins）、Ｌ−アスパラギナーゼ等の酵素；ＩＦＮα、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ等の生物学的応答調節物質；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン等の白金配位錯体、アントラセンジオン、ヒドロキシウレア等の置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤（adrenocortical suppressants）；プレドニゾン及び同等物等の副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドを含むホルモン及びアンタゴニスト；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール等のプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール同等物等のエストロゲン；タモキシフェン等の抗エストロゲン；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／同等物を含むアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びロイプロリド等の抗アンドロゲン；並びにフルタミド等の非ステロイド性抗アンドロゲンが挙げられる。
付加的な癌療法は、癌ワクチンの投与も含み得る。本明細書で使用される「癌ワクチン」は、癌患者に投与され、患者自身の免疫応答を強化することにより癌細胞を根絶するように設計された治療用癌ワクチンを指す。癌ワクチンとしては、腫瘍細胞ワクチン（自家及び同種）、樹状細胞ワクチン（ｅｘ ｖｉｖｏ生成及びペプチド活性化した）、タンパク質／ペプチドベースの癌ワクチン及び遺伝子ワクチン（ＤＮＡ、ＲＮＡ及びウイルスベースのワクチン）が挙げられる。したがって、治療用癌ワクチンは原則として、外科手術、放射線療法及び化学療法等の従来の療法が無効である進行癌及び／又は再発腫瘍の更なる成長を阻害するために利用することができる。腫瘍細胞ベースのワクチン（自家及び同種）は、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ１２、ＧＭＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌ）等の可溶性免疫刺激剤（immune stimulatory agents）、免疫調節受容体（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）に対する一本鎖Ｆｖ抗体を分泌し、及び／又は特にＩＣＯＳ−リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＧＩＴＲ−リガンド及び／又はＯＸ４０リガンド等の免疫刺激受容体に対するリガンドを膜上に発現するように遺伝子操作されたものを含む。一実施形態では、癌ワクチンは、ＧＶＡＸ抗腫瘍ワクチンであり得る。
付加的な癌療法は、末梢及び腫瘍微小環境内での免疫調節を低減する他の抗体又は小分子試薬、例えばＴＧＦβ経路、ＩＤＯ（インドールアミンジオキシゲナーゼ）、アルギナーゼ及び／又はＣＳＦ１Ｒを標的とする分子であり得る。
「組合せで」とは、本発明による任意の態様の投与の前、それと同時又はその後の付加的な療法の実施を指す場合がある。
ここで、以下の実施例を用いて本発明を更に説明するが、実施例は、当業者が図面を参照して本発明を実施するのを助ける働きをすることを意図し、何ら本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１ − 非ＩＬ−２遮断又はＩＬ−２遮断のいずれかである組換え抗マウスＣＤ２５ Ｔｒｅｇ枯渇抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性評価及び調製
材料及び方法
抗体の起源及びそれらの組換え作製
ラット抗マウスＣＤ２５ ＰＣ６１の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を、ＰＣ−６１．５．３ハイブリドーマ（ＡＴＣＣカタログ番号ＴＩＢ−２２２）からｃＤＮＡ末端の迅速増幅（rapid amplification of cDNA ends；ＲＡＣＥ）によって分割した後、マウスＩｇＧ２ａ及びκ鎖の定常領域（又は市販のプラスミド（Invivogen）から単離された対応するマウスＩｇＧ１配列）にクローニングした。
次いで、各抗体鎖をマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来レトロウイルスベクターにサブクローニングした。予備実験のために、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを形質導入したＫ５６２細胞を用いて抗体を産生させた。抗体を、プロテインＧ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（GE Healthcare）を用いて上清から精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で透析し、濃縮し、濾過滅菌した。
ＰＣ−６１．５．３抗体（マウスＩｇＧ２ａ）に由来する再クローニングした抗マウスＣＤ２５可変重鎖ＤＮＡ配列は、以下のタンパク質配列をコードする：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEVQLQQSGAELVRPGTSVKLSCKVSGDTITAYYIHFVKQRPGQGLEWIGRIDPEDDSTEYAEKFKNKATITANTSSNTAHLKYSRLTSEDTATY FCTTDNMGATEFVYWGQGTLVTVSS
ＰＣ−６１．５．３抗体（マウスＩｇＧ２ａ）に由来する再クローニングした抗マウスＣＤ２５可変軽鎖ＤＮＡ配列は、以下のタンパク質配列をコードする：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVVLTQPKSVSASLESTVKLSCKLNSGNIGSYYMHWYQQREGRSPTNLIYRDDKRPDGAPDRFSGSIDISSNSAFLTINNVQTEDEAMYFCHSYDGRMYIFGGGTKLTV
７Ｄ４−ＩｇＭシークエンシングを、７Ｄ４ハイブリドーマ（ECACC、８８１１１４０２）に対して行った。全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出し、逆転写を行い、抗体重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡを得た。可変重鎖及び可変軽鎖を、シグナルペプチド又はフレームワーク領域１のいずれかに結合する縮重フォワードプライマー、及び抗体定常領域に結合するリバースプライマーを用いて増幅した。増幅遺伝子を標準アプローチに従ってクローニングし、シークエンシングした。ｃＤＮＡを逆転写によって生成し、ホモポリマーテール（homopolymeric tail）をｃＤＮＡの３’末端に付加した。次いで、抗体可変ドメイン遺伝子を、遺伝子特異的プライマーを用いて増幅し、続いて標準クローニング及びシークエンシングアプローチを行った。ＤＮＡを従来のサンガーシークエンシングによってシークエンシングし、ＤＮＡＳＴＡＲ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアを用いてデータを分析した。シグナルペプチド及び可変ドメイン配列を、ＩＭＧＴデータベースにおける既知の配列との比較によって特定した。
可変重鎖及び可変軽鎖ドメインをコードする遺伝子を、ヒト細胞株での発現のためにコドン最適化し、遺伝子の５’及び３’のＮｈｅＩ及びＡｖａＩ制限部位を用いて合成した。制限消化クローニングを行い、７Ｄ４可変重鎖ドメイン遺伝子を、マウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ定常ドメインを含有する別個の発現ベクターに挿入した。制限消化クローニングを行い、７Ｆ４可変軽鎖ドメイン遺伝子を、マウスκ定常ドメインを含有する発現ベクターに挿入した。無血清培地中で培養した懸濁ＨＥＫ２９３細胞を、重鎖及び軽鎖発現ベクターで化学的にコトランスフェクトし、５％ＣＯ２環境において１４０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で更に６日間培養した。培養物を４０００ｒｐｍでの遠心分離によって採取し、０．２２μＭフィルターを通した濾過によって更に清澄化した。上清をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で予め平衡化したプロテインＡカラム上にロードし、クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出させ、１０％（ｖ／ｖ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で平衡化した。中和抗体溶液を、脱塩カラムを用いてＰＢＳ（ｐＨ７．２）にバッファー交換し、必要に応じて３０ｋＤａの分子量カットオフで遠心濃縮器を用いて濃縮した。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度の測定によって決定し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。
７Ｄ４抗体（マウスＩｇＧ１）に由来する再クローニングした抗マウスＣＤ２５重鎖ＤＮＡ配列は、以下のタンパク質配列をコードする：
EVQLQQSGAALVKPGASVKMSCKASGYSFPDSWVTWVKQSHGKSLEWIGDIFPNSGATNFNEKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRLDYGYWGQGVMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLMISLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPILHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
７Ｄ４抗体（マウスＩｇＧ２ａ）に由来する再クローニングした抗マウスＣＤ２５可変重鎖ＤＮＡ配列は、以下のタンパク質配列をコードする：
EVQLQQSGAALVKPGASVKMSCKASGYSFPDSWVTWVKQSHGKSLEWIGDIFPNSGATNFNEKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTRLDYGYWGQGVMVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
７Ｄ４（ｍＩｇ１）及び７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）抗体（マウスＩｇＧ２ａ）の両方に由来する再クローニングした抗マウスＣＤ２５κ軽鎖ＤＮＡ配列は、以下のタンパク質配列をコードする：
DVVLTQTPPTLSATIGQSVSISCRSSQSLLHSNGNTYLNWLLQRPGQPPQLLIYLASRLESGVPNRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGVYYCVQSSHFPNTFGVGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
２Ｅ４を２Ｅ４ハイブリドーマ（国立衛生研究所のEthan M. Shevach博士から寄贈）から生成した。ハイブリドーマシークエンシングを、自社開発した次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ベースの技術によって行った。ＲＮＡサンプルを用いてｃＤＮＡライブラリーを生成した。ライブラリーをIlluminaのプラットホームでシークエンシングした。ｄｅ ｎｏｖｏアセンブリを用いてサンプルトランスクリプトームを生データから再構築した。可変ドメイン配列を、既知の配列との比較によって特定した。
抗マウスＣＤ２５ ２Ｅ４抗体（マウスＩｇＧ１）の可変重鎖ドメインタンパク質配列は、以下のタンパク質配列を有する：
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPTKGLEWVASITNGGLNTYYRDSVKGRFTISRDNAKCTLYLQMDSLRSEDTATYYCATGGFSFWGQGTLVTVSS
抗マウスＣＤ２５ ２Ｅ４（ｍＩｇ１）の可変軽鎖ドメインタンパク質配列は、以下のタンパク質配列を有する：
DIVMTQSPTSMSISVGDRVTMNCKASQNVDSNVDWYQQKTGQSPKLLIYKASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTIRNMQAEDLAVYYCMQSNSYPLTFGSGTKLEIK
マウスＣＤ２５に対する組換え抗体の親和性の評定
ForteBioの親和性測定を、概して以前に記載されているようにＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４で行った（例えば、Estep P et al., 2013. Mabs. 5(2), 270-8を参照されたい）。簡潔に述べると、ForteBioの親和性測定を、ＩｇＧをオンラインでＡＨＱセンサー上にロードすることによって行った。センサーをアッセイバッファー中で３０分間、オフラインで平衡化した後、ベースライン確立のために６０秒間オンラインでモニタリングした。ＩｇＧをロードしたセンサーを１００ｎＭ抗原に３分間曝露し、その後オフレート（off-rate）測定のために３分間アッセイバッファーに移した。全ての動態を、１：１結合モデルを用いて分析した。
結果
２つのマウスハイブリドーマを、非ＩＬ−２遮断又はＩＬ−２遮断のいずれかである抗マウスＣＤ２５のＣＤ２５結合特性及びＴｒｅｇ枯渇特性を評価するために参照抗体として選択した（それぞれ、７Ｄ４（マウスＩｇＭアイソタイプ）及びＰＣ６１（マウスＩｇＧ１アイソタイプ））。文献中に記載されているＩＬ−２結合関連特性を、元の非組換え抗体及び組換えマウスＩＬ−２を用いて予め確認した（図１Ａ）。かかる抗体の組換え変異体を、アイソタイプがより活性であり、機能研究（例えば、Ｔｒｅｇ枯渇又は他の免疫細胞に対する影響についての）に適切な抗体を試験するために作製した。さらに、７Ｄ４の場合、ＩｇＭ抗体の抗体凝集特性がアッセイの結果に影響を及ぼし得ることから、アイソタイプの変化が必要とされる。元の非組換えＩｇＭアイソタイプ抗体である組換え７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）は、マウスＣＤ２５へのマウスＩＬ−２の結合を依然として可能にする（図１Ｂ）。７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）は、組換えＰＣ６１（ＩｇＧ２ａ）と同様に細胞表面上のマウスＣＤ２５にも結合するが、参照抗ヒトＣＤ２５抗体は結合しない（図１Ｃ）。
また、７Ｄ４重鎖（及びＰＣ６１）の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ（ヒトＩｇＧ１に機能的に対応する）を有するマウスＣＤ２５結合ドメインの発現を可能にするベクター内にクローニングした。このようにして、腫瘍内Ｔｒｅｇを効率的に枯渇させ得るが、マウスＣＤ２５へのマウスＩＬ−２結合に関して特有の特性を呈する最適化ＡＤＣＣ活性を有する２つの組換え抗マウスＣＤ２５抗体を比較することが可能である。得られる組換え抗マウスＣＤ２５抗体を、それらのＣＤ２５親和性について試験した。異なるアイソタイプ（マウスＩｇＧ２ａ又はマウスＩｇＧ１）は、Ｋｄが７Ｄ４ベースの組換え抗体間で同様であり（およそ１ｎＭ）、ＰＣ６１の１つ（ｍＩｇＧ２ａ）と同等であることから（４．６ｎＭと測定される）、この特性に影響を及ぼさない。
これらの組換え抗体の機能特性を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激に応答したグランザイムＢ産生に対するそれらの影響を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいても比較した（図２）。グランザイムＢ（ＧｎｚＢ）は、メモリーＴ細胞及びＮＫ細胞、並びに活性化ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞によって発現されるセリンプロテイナーゼであり、それらの細胞は免疫反応時にＧｎｚＢを強く発現し、分泌する。この酵素は、細胞死、組織病理及び疾患の重要なメディエーターである。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によるＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激及び増殖（ＣＤ４ Ｔ細胞の８０％超が増殖し、かつＧｎｚＢを発現する）は、サイトカイン及び抗体によって影響され得る。この刺激を中和抗ＩＬ−２抗体と組み合わせて行った場合、増殖ではなく、グランザイムＢ産生が阻害される。増殖し、かつＧｎｚＢを産生する細胞の頻度は、８０％超から１％未満まで低下するが、増殖性細胞の頻度は９０％超のままである。このことは、細胞増殖ではなくグランザイムＢの産生がＩＬ−２シグナル伝達に依存することを示す。グランザイムＢ産生Ｔ細胞の同様の低下が、刺激されたＴ細胞にＰＣ６１（ｍＩｇＧ１）を添加した場合に観察される。しかしながら、７Ｄ４（ｍＩｇＧ１）は主に、ＧｎｚＢを産生することによって抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激に応答するＣＤ４ Ｔ細胞の能力を保持する（６５％超の細胞が依然としてＧｎｚＢを産生し、増殖する）。これらの結果から、ＰＣ６１ベースの抗体がＩＬ−２シグナル伝達を遮断する一方で、７Ｄ４は、このシグナル伝達に対して僅かな影響しか有しないことから、ＩＬ−２シグナル伝達に影響しない、抗ヒトＣＤ２５抗体の治療可能性を特にＴｒｅｇ枯渇及び腫瘍特異的特性に関して評価するためのサロゲート抗体として用いることができることが確認される。
実施例２ − 非ＩＬ−２遮断又はＩＬ−２遮断のいずれかである組換え抗マウスＣＤ２５ Ｔｒｅｇ枯渇抗体のＴｒｅｇ枯渇特性及び抗癌特性
材料及び方法
マウス
ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、Charles River Discovery Services North Carolina（CR Discovery Services）によって行われた。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ＡｎＮｃｒ１、Charles River）及び雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎｃｒ１、Charles River）は、研究の開始時に７週齢〜９週齢であった。CR Discovery Servicesは、拘束、畜産、外科処置、食餌及び水（feed and fluid）の調節、並びに獣医医療について実験動物の管理及び使用に関する指針（Guide for Care and Use of Laboratory Animals）の推奨に特に準拠する。CR Discovery Servicesの動物の管理及び使用に関するプログラムは、実験動物の管理及び使用に関して認められる基準の準拠を保証する国際実験動物ケア評価認証協会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International）によって認可されている。
細胞株及び組織培養
ＭＣＡ２０５腫瘍細胞（３−メチルコラントレン誘導弱免疫原性線維肉腫細胞；Gustave Roussy Cancer InstituteのG. Kroemerによる）を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Sigma）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てGibcoによる）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Sigma）中で培養した。ＭＣ３８マウス結腸癌細胞（CR discovery services）を１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン及び２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で中間対数増殖期（mid-log phase）まで成長させた。ＣＴ２６マウス結腸癌細胞（CR discovery services）を１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン及び２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で成長させた。全ての腫瘍細胞を、５％ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気下にて３７℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコ中で培養した。抗体産生に用いられるＫ５６２細胞は、１０％ＩｇＧ枯渇ＦＣＳ（Life Technologies）を添加したフェノールレッド不含イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove modified Dulbecco medium；ＩＭＤＭ）中で培養した。
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍実験
培養した腫瘍細胞をトリプシン処理するか（ＭＣＡ２０５）又はトリプシン処理せず（ＭＣ３８及びＣＴ２６）、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射した（Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＣＡ２０５及びＭＣ３８モデルについては５×１０５細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６モデルについては３×１０５ １５細胞）。図面の説明文に記載される時点で抗体を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。機能実験については、腫瘍移植の１２日後に腫瘍及び排出リンパ節を採取し、記載のようにフローサイトメトリーによる分析のために処理した（Simpson et al. (2013) J Exp Med 210, 1695-710）。治療実験については、腫瘍を週２回測定し、３つの直交直径の積として体積を算出した。
フローサイトメトリー
取得をＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（BD Biosciences）で行った。以下の抗体を使用した：抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、ebioscience、２５００３１８２）、抗ＣＤ４（クローンＲＭ４−５、BD biosciences、５６０７８２）、抗ＣＤ８（クローン５３−６．７、Biolegend、１００７５０）、抗グランザイムＢ（クローンＧＢ１１、Invitrogen）、抗ＦｏｘＰ３（クローンＦＪＫ−１６ｓ、eBiosciences）及びＫｉ６７（クローンＳｏｌＡ１５、eBiosciences、４８５６９８８２）。マウスのリンパ節（鼠径、腋窩及び上腕）及び腫瘍を無血清ＲＰＭＩ中で解剖した。リンパ節は７０μｍフィルターに通して分散させたが、腫瘍はｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Miltenyl Biotech）を用いて機械的に破壊し、無血清ＲＰＭＩ中の０．３３ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ（Sigma-Aldrich）及び０．２７ｍｇ／ｍｌ Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ（Roche）の混合物を用いて３７℃で３０分間消化した。腫瘍を７０μｍフィルターに通して濾過し、得られる腫瘍単細胞懸濁液をＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（GE Healthcare）勾配にかけることによって白血球について富化した。腫瘍及びＬＮを完全ＲＰＭＩ中で洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（５００ｍＬのＰＢＳ、２％ＦＣＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、丸底９６ウェルプレートに入れた。表面抗体のマスターミックス（mastermix）を製造業者により推奨される希釈率で調製した：抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、ebioscience、２５００３１８２）、抗ＣＤ４（クローンＲＭ４−５、BD biosciences、５６０７８２）、抗ＣＤ８（クローン５３−６．７、Biolegend、１００７５０）。ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（ｅＦｌｏｕｒ７８０、eBioscience）も表面マスターミックスに含まれる。細胞内固定及び透過処理バッファーセット（eBioscience）を用いた２０分間の透過処理の後、製造業者により推奨される希釈率で用いた以下の抗体からなる細胞内染色パネルを適用した：抗グランザイムＢ（クローンＧＢ１１、Invitrogen）、抗ＦｏｘＰ３（クローンＦＪＫ−１６ｓ、eBiosciences）及びＫｉ６７（クローンＳｏｌＡ１５、eBiosciences、４８５６９８８２）。
結果
ＭＣＡ２０５肉腫マウスモデルにより、固形腫瘍に対する免疫学的応答及び全体的有効性を免疫調節化合物のパネルについて短時間で評価することができるマウスを生成することが可能である。特に、組換えマウスＩｇＧ２ａベースの抗マウスＣＤ２５抗体を、腫瘍浸潤リンパ球として又は末梢リンパ節内に存在するＴ細胞亜集団の変化、並びにＭＣＡ２０５に曝露したマウスの腫瘍成長及び生存能力を評価するために試験した。更なる抗体（抗マウスＰＤ１）をＴｒｅｇに対する免疫学的効果の陰性対照として研究に含めた。
免疫学的分析から、７Ｄ４抗体が、マウスＩｇＧ２ａ主鎖にクローニングした場合に、Ｔｒｅｇを枯渇させ、続いて腫瘍及び末梢の両方におけるＴｅｆｆのＴｒｅｇに対する比率を増大することについてＰＣ６１（マウスＩｇＧ２ａ）と同様の能力を示す一方で、抗ＰＤ１は単独又は組合せのいずれでも効果がないことが示される（図３）。このため、非ＩＬ−２遮断抗ヒトＣＤ２５抗体に対するサロゲート抗体として７Ｄ４（ｍＩｇＧ２ａ）を用いて測定される任意の更なる効果は、Ｔｒｅｇ枯渇特性の変化と関連しないようである。
また、７Ｄ４で処理したＭＣＡ２０５モデルマウスは、抗ＰＤ１処理だけでなく、Ｉｌ−２遮断ＰＣ６１（ｍＩｇ２ａ）に対してもより高い増殖性ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔ細胞等のＧｎｚＢ陽性細胞のパーセンテージを示す。このように処理したマウスでは、７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）がＰＣ６１（ｍＩｇ２ａ）と同様にＴｅｆｆ細胞に影響を及ぼさないだけでなく、ＰＣ６１（ｍＩｇ２ａ）と比較してＴｅｆｆ細胞の頻度を増大させ、ＩＬ−２／ＣＤ２５相互作用を遮断しない抗ヒトＣＤ２５抗体の更に高い抗腫瘍活性が示唆される（図４）。
癌免疫療法、特に固形腫瘍の癌免疫療法について７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）と機能的に同等の抗ヒトＣＤ２５の使用は、ＭＣＡ２０５マウスモデルだけでなく、ＣＴ２６及びＭＣ３８（結腸癌）又はＢ１６（黒色腫）モデル等の他のモデルにおいても試験することができる。どちらのＩｇＧ２ａ抗マウスＣＤ２５抗体も、抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与した場合に定着ＣＴ２６腫瘍に対する治療活性を示す。興味深いことに、単独療法として用いた場合、非ＩＬ−２遮断７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）抗体は、同じアイソタイプを有するＰＣ６１ベースの抗体よりも明らかに高い治療活性を示す。実験の終了時に、７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）で処理したマウスのみが全て５０ｍｍ３未満の体積までの腫瘍成長の制御を示し、ＰＣ６１（ｍＩｇ２ａ）で処理したマウスはいずれも５０ｍｍ３より小さい腫瘍を示さず、更には１０匹中８匹のマウスの腫瘍が２０００ｍｍ３エンドポイントに達する。これは生存の違いによっても示され、７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）で処理したマウスが全て５０日目に依然として生存しているのに対し、ＰＣ６１（ｍＩｇ２ａ）で処理したマウスでは１０匹のうち２匹しか生存していない。実際に、ＰＣ６１（ｍＩｇ２ａ）有効性の結果が抗ＰＤ１との組合せによって大きく改善するとしても、７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）の有効性は、少なくともこの抗体をこの濃度で使用した場合に更に改善されない。
これらの７Ｄ４及びＰＣ６１ベースの抗体がＴｒｅｇを枯渇させる同様の能力を示すことから（図３を参照されたい）、かかる有効性の違いは、少なくとも一部には、ＩＬ−２とその受容体との相互作用に対する７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）の影響がより少ないことによって説明され得る。これにより、ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体遮断活性の欠如が治療活性に不利益でないだけでなく、治療上の利点をもたらし得ることが示される。したがって、このデータにより、癌療法における使用への非ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体遮断ＣＤ２５標的抗体の選択が支持される。７Ｄ４（ｍＩｇ２ａ）抗体のこれらの有利な特性は、抗マウスＰＤ−Ｌ１を同じＣＴ２６マウスモデルにおいて用いた場合（図６）又はＭＣ３８マウスモデルを同じ抗体の組合せで用いた場合（図７及び図８）にも確認された。
これらのデータから、７Ｄ４特性に基づき、適切なアイソタイプを有する抗体のＴｒｅｇ枯渇特性、ＣＤ２５結合特性が免疫チェックポイントタンパク質を標的とする（例えば、ＰＤ−１に対する及び抗ＰＤ−Ｌ１）又は他の癌関連標的に対する抗体等の他の抗癌化合物と組み合わせて利用することができることが示される。このアプローチは、単一特異性抗体の新規の混合物又は新規の二重特異性抗体として２つの生成物を作製し、投与することによって追求することができる。２つの抗原結合特性と治療的に関連するアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１）とを組み合わせた二重特異性抗体の構築を伴うこのアプローチは、別個に作製され、単一の適合する点突然変異をＣＨ３ドメインに有する２つの異なる単一特異性抗体からの単一重鎖及び軽鎖の効率的な会合を可能にし、単一ヘテロマータンパク質におけるＦａｂ交換を可能にするＤｕｏｂｏｄｙ技術を用いて検証することができる（Labrijn AF et al., Nat Protoc. 2014, 9:2450-63）。このような７Ｄ４ベースのＤｕｏｂｏｄｙ生成物（例えば、抗ＰＤ１又は抗ＰＤ−Ｌ１を含む）の機能特性は、上記のような７Ｄ４ベースの抗体及び抗体の組合せを検証するために用いた細胞相互作用及び枯渇のモデルを用いて評価することができる。
これらの結果から、マウスＣＤ２５に関する７Ｄ４結合特性を、ＣＤ２５発現細胞におけるＩＬ−２とその受容体との相互作用及びＩＬ−２シグナル伝達を妨げることなく、アイソタイプがこの作用機構と適合させて選択される（例えば、ヒトＩｇＧ１）、抗ヒトＣＤ２５において利用することができることも示される。実際に、幾つかの他の特性を、調製、使用及び／又は癌、特に固形腫瘍の治療のための投与に関して更に改善された特性を有する抗ヒトＣＤ２５抗体候補のスクリーニングのために考慮することができる。
これらの特性は、全てがヒトＣＤ２５に対してナノモル範囲のＫｄを有するが、全てがヒトＣＤ２５へのヒトＩＬ−２の結合を遮断するＨｕｍａｘ−ＴＡＣ、バシリキシマブ又はダクリズマブ等の既知の抗ヒトＣＤ２５の特徴に対しても規定することができる（クローンＭ−Ａ２５１を、本発明の抗ヒトＣＤ２５の選択に加えられる潜在的な参照非ＩＬ−２遮断抗ヒトＣＤ２５として使用する）。
これらの特徴は、以下のものの１つ以上であり得る：
２５ｎＭより低い、好ましくは（preferentially）１０ｎＭ未満、更により好ましくは１ｎＭ未満のＫＤでの組換え単離単量体ヒトＣＤ２５に対する親和性（Ｏｃｔｅｔ、Ｋｉｎｅｘａ、ＥＬＩＳＡ等の技術又は他の技術を用いて確立される）；
７５ｎＭより低い、好ましくは３０ｎＭ未満、更により好ましくは３ｎＭ未満のＫＤでの組換え単離単量体カニクイザル（Cynomolgous）ＣＤ２５に対する交差反応性（Ｏｃｔｅｔ、Ｋｉｎｅｘａ、ＥＬＩＳＡ等の技術又は他の技術を用いて確立される）；
１００ｎＭより低い、好ましくは１０ｎＭ未満、更により好ましくは１ｎＭ未満のＫＤでのＣＨＯ又はＭＪ細胞の表面上の組換え単量体ヒトＣＤ２５に対する親和性（フローサイトメトリー、セルベースＥＬＩＳＡ等の技術又は他の技術を用いて確立される）；
３００ｎＭより低い、好ましくは３０ｎＭ未満、更により好ましくは３ｎＭ未満のＫＤでのＣＨＯ細胞の表面上の組換え単量体アカゲザルＣＤ２５に対する親和性（フローサイトメトリー、セルベースＥＬＩＳＡ等の技術又は他の技術を用いて確立される）；
１００ｎＭより低い、好ましくは１０ｎＭ未満、更により好ましくは１ｎＭ未満のＫＤでのヒトＴｒｅｇ細胞結合（フローサイトメトリー、セルベースＥＬＩＳＡ等の技術又は他の技術の技術を用いて確立される）；
３００ｎＭより低い、好ましくは３０ｎＭ未満、更により好ましくは３ｎＭ未満のＫＤでのカニクイザルＴｒｅｇ細胞結合（フローサイトメトリー、セルベースＥＬＩＳＡ等の技術又は他の技術の技術を用いて確立される）；
生化学アッセイにおけるヒト組換えＩＬ−２とヒト組換えＣＤ２５との相互作用の阻害の欠如（ＣＤ２５へのＩＬ−２結合の２５％未満が実施例１に記載のスクリーニングにおいて遮断される）；
活性化ＣＤ８陽性若しくはＣＤ４陽性Ｔ細胞若しくはＣＤ２５発現細胞株でのＳＴＡＴ５リン酸化等のセルベースアッセイにおけるＩＬ−２誘導シグナル伝達の欠如、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞アッセイの活性化後のグランザイムＢ上方調節（実施例１に記載されるように、ベースラインシグナルの２５％未満が阻害される）；及び／又は、
ヒトＣＤ２５を発現する細胞株又は初代Ｔｒｅｇ細胞でのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣアッセイ等のセルベースアッセイにおける関連効力評価（ＥＣ５０は１０ｎＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満、更により好ましくは０．１ｎＭ未満）。
実施例３ − 非ＩＬ２遮断抗マウスＣＤ２５抗体を用いた更なるｉｎ ｖｉｖｏマウスモデル実験
材料及び方法
非ＩＬ−２遮断抗体の治療活性：Charles Riverから入手した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０％マトリゲル中３×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を脇腹に皮下注射した（１群当たりｎ＝１５）。動物を１日目の体重に基づいて処理群に無作為化した。処理を６日目に開始し、マウスを２００μｇ／動物の各抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、ＩＬ−２中和抗体、マウスＩｇＧ１アイソタイプのＩＬ−２シグナル伝達を遮断する抗マウスＣＤ２５であるＰＣ６１ ｍＩｇＧ１、及びマウスＩｇＧ２ａアイソタイプのＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない抗マウスＣＤ２５である７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａ）の１回の注射で処理した。動物に抗体１つ当たり１群での単独療法処理、又は７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａとＩＬ−２中和抗体、若しくは７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａとＰＣ６１ ｍＩｇＧ１抗体との併用処理を行った。マウスを、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達した時点又は５０日間のいずれか早い方で屠殺した。
遮断抗体と比較した非ＩＬ−２遮断抗体の治療活性
３×１０５個のＣＴ２６細胞を脇腹に皮下移植した。ペアマッチを腫瘍が３０ｍｍ３〜６０ｍｍ３に達した時点である０日目に行い、処理を開始した。１日目及びその後２週間に１回、１０ｍｇ／ｋｇ処理をｉ．ｐ．で行った。群をＩＬ−２中和抗体ＰＣ６１−ｍ２ａ、非ＩＬ−２遮断抗体７Ｄ４、非ＩＬ−２遮断抗体２Ｅ４で処理するか又は非処理とした。
ａＰＤＬ１療法と組み合わせた非ＩＬ−２遮断抗体の治療活性
図面に指定されるように１群当たりｎ＝１０又はｎ＝５で、マウスに５００００個のＭＣＡ２０５腫瘍細胞を皮下注射した。動物を処理群に無作為化した。動物に７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａ又はａＰＤ−Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）のいずれかの単独療法処理、７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａとＰＤ−Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）との併用処理を行うか、又は非処理とした。群に以下のいずれかを与えた：ａ７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａ単独−１０日目（２００μｇ）、ａＰＤ−Ｌ１ ｒＩｇＧ２ｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）−６日目、９日目及び１２日目（２００μｇ）、ａＰＤ−Ｌ１＋ａ７Ｄ４の組合せ（６日目、９日目及び１２日目にａＰＤＬ−１、１０日目にａ７Ｄ４）、又はａＰＤ−Ｌ１＋ａ７Ｄ４の組合せ（６日目、９日目及び１２日目にａＰＤＬ−１、１０日目にａ７Ｄ４）−１５日目のａ７Ｄ４＋１８日目のａＰＤ−Ｌ１の追加ショット（５匹のマウスのみ）。
結果
抗ＣＤ２５枯渇非ＩＬ−２遮断抗体７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａは、処理マウスにおいて腫瘍拒絶を誘導し、他の抗体は、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａと比較した場合に単独療法として効果を示さなかった。ＰＣ６１ ｍＩｇＧ１又はＩＬ２ ｎＡｂのいずれかのＩＬ２遮断抗体との組合せは、非ＩＬ−２遮断抗体７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの治療活性を抑止する（図１３）。これにより、７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの非ＩＬ−２遮断特徴が治療活性に重要であることが実証される。この抗体の治療活性が、最適活性についてＩＬ−２シグナル伝達に依存するＴエフェクター細胞によって媒介される抗腫瘍免疫応答に依拠することも示唆される。これらの結果から、ＩＬ−２／ＣＤ２５遮断活性の欠如がＣＤ２５標的抗体の最適治療活性に必要とされ、癌療法における本明細書に記載の抗ＣＤ２５非ＩＬ−２遮断抗体の使用を支持することが示される。
これらの結果から、ＩＬ−２／ＣＤ２５遮断活性の欠如が抗体治療活性に不利益ではなく、癌療法における本明細書に記載の抗ＣＤ２５非ＩＬ−２遮断抗体の使用が支持されることが更に示される。
これらの結果から、非ＩＬ−２遮断抗体である７Ｄ４及び２Ｅ４がＩＬ−２遮断抗体であるＰＣ６１よりも強力であることが更に示された。抗ＣＤ２５非遮断抗体７Ｄ４及び２Ｅ４は、固形腫瘍に対して強力な治療活性を発揮する（図７５）。
結果から、ａＰＤＬ１療法の開始後の非ＩＬ２遮断ａＣＤ２５抗体７Ｄ４の単回又は反復注射が抗腫瘍応答を強化することが示された。ａＰＤＬ１処理により活性化されたＴｅｆｆ細胞は、ａＣＤ２５抗体によって温存及び強化される（図７６）。
実施例４ − 抗ＣＤ２５非ＩＬ−２遮断抗体のエピトープ特性評価
エピトープビニング
抗体のエピトープビニングを、標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システム（Pall Forte Bio Corporation，Menlo Park，CA）で行った。抗マウスＣＤ２５ ＰＣ６１抗体をＡＭＣセンサー上にロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連マウスＩｇＧ１抗体でブロッキングした。次いで、センサーを１５ｎＭ標的抗原、続いて７Ｄ４抗体に曝露した。データをForteBioのＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０を用いて処理した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。
抗ＣＤ２５非ＩＬ−２遮断抗体のエピトープマッピング
ヒトＣＤ２５配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ記録番号Ｐ０１５８９）を示す様々な直鎖、単一ループ、βターン模倣体、ジスルフィド架橋模倣体、不連続ジスルフィド架橋体、不連続エピトープ模倣体のペプチドのセットを、固相Ｆｍｏｃ合成を用いて合成した（Pepscan BV，The Netherlands；Timmermann P et al., 2007 J. Mol. Recognit., 20, 283-99、Langedijk JP et al., 2011, Analytical Biochemistry. 417:149-155）。合成ペプチドの各々への抗体の結合を、ＥＬＩＳＡ（Pepscan，The Netherlands）において試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後に、ペプチドアレイを１０００倍希釈の適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（２０１０−０５；Southern Biotech）と共に２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後に、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２０μｌ／ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２を添加した。１時間後に発色を測定した。発色を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムで定量化した。ＣＣＤカメラにより得られた値は、標準９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様、０ｍＡＵ〜３０００ｍＡＵの範囲である。合成ペプチドの品質を検証するために、別個の陽性及び陰性対照ペプチドのセットを並行して合成し、非関連対照抗体を用いてスクリーニングした。
結果
エピトープビニングを行い、抗体が市販のマウス抗ヒト非ＩＬ−２遮断ＣＤ２５抗体である７Ｇ７Ｂ６のエピトープと重複するエピトープに結合するかを決定した。抗体を更に特性評価し、非ＩＬ−２遮断抗体に対するエピトープを決定した。抗マウスＣＤ２５遮断抗体ＰＣ６１のエピトープを比較対照のために決定した。エピトープマッピングの結果を抗ヒトＣＤ２５抗体については表１、抗マウスＣＤ２５抗体については表２に示す。
アミノ酸（ａａ）配列ナンバリングは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１５８９で公開された配列からのヒトＣＤ２５に基づく。
アミノ酸（ａａ）配列ナンバリングは、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１５９０で公開された配列からのマウスＣＤ２５に基づく。
Pepscanの技術を用いて行ったエピトープマッピング研究から、抗ヒト抗体がＣＤ２５上のＩＬ−２結合部位と重複しないエピトープでヒトＣＤ２５に結合することが示される。抗ヒト抗体は、バシリキシマブ及びダクリズマブとは異なるエピトープに結合する。バシリキシマブ及びダクリズマブに対するエピトープは、ＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用部位と重複する（配列番号１の）アミノ酸１３７〜１４３の領域に残基を含む（Binder M et al, Cancer Res 2007 vol 54 67(8): 3518-23）。抗マウスＣＤ２５非遮断抗体である２Ｅ４及び７Ｄ４は、ＰＣ６１とは異なるエピトープを認識する。
実施例５：マウス抗ＣＤ２５抗体の特性評価
マウスＣＤ２５を発現するＣＨＯ細胞への抗体の結合
ＣＤ２５発現ＣＨＯ細胞への結合を、試験物（抗ＣＤ２５一次抗体、７Ｄ１、ＰＣ６１及び２Ｅ４）を３０ｍｇ／ｍｌ抗体、続いて片対数希釈系列（７点）を用いて氷上で３０分間染色することによって試験した。これに続いて、濃度１ｍｇ／ｍｌの二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂフラグメント ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch））を用いて氷上で３０分間染色した。全てのサンプルを二連で染色した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＸＹチャート上にプロットし、ＭＦＩを濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。図１１に示される結果から、抗マウスＣＤ２５抗体がマウスＣＤ２５を発現するＣＨＯ細胞に結合することが確認された。
抗ｍＣＤ２５抗体の親和性測定
抗マウスＣＤ２５抗体である７Ｄ４、ＰＣ６１及び２Ｅ４に対する親和性を、ＣＭ−５センサーチップを用いるＢｉａｃｏｒｅ ２０００でのＳＰＲによって２５℃の周囲実験温度でそれらのＫＤを測定することによって決定した。抗マウス抗体を、初めに全フローセルにわたって分析バッファー（ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中で１６０００〜１８０００のＲＵまで１０分かけて固定化した。リガンド（抗体試験物）を、続いて１１９ＲＵ〜１６３ＲＵの捕捉レベルまでロードした。次いで、分析物（ｈｉｓタグ付き組換えマウスＣＤ２５）を、分析バッファー中にて８００ｎＭから開始して３．１３ｎＭの最低濃度までの２倍希釈で６分間会合させた。解離を分析バッファー中で１０分間にわたって行った。サンプル濃度間の再生工程は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）中で１０分間行った。２５μｌ／分の流量を、プロセス全体を通して維持した。動態データを、Biacoreによって提供されるグローバルモデル二価分析物分析ソフトウェアを用いて参照サブトラクション（reference subtraction）によりフィッティングした。ＳＰＲベースの分析を図１２に示す。このアッセイにおいて確立された抗マウスＣＤ２５抗体についてのＫｄ値は、以下の通りである：７Ｄ４については２．６×１０−９Ｍ、２Ｅ４については１１４×１０−９Ｍ、ＰＣ６１については３．６×１０−９Ｍ（結果は示さない）。
Ｏｃｔｅｔにおける抗マウス抗体競合
抗体競合を、標準サンドイッチビニングアッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（Pall Forte Bio Corp.，USA）で行った。１０ｎＭ抗マウスＣＤ２５抗体をＡＭＣセンサー上に９００秒間ロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連マウスＩｇＧ２ａ抗体でブロッキングした。センサーを１５ｎＭ標的抗原（ｈｉｓタグ付きマウスＣＤ２５）に６００秒間、続いて第２の抗ＣＤ２５抗体（同様に１０ｎＭ）に曝露した。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ９．０を用いてデータを処理した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し、結合がなければエピトープ遮断が示される。
ｍＣＤ２５への競合的結合は、７Ｄ４と２Ｅ４との間で観察されるが（図１３（Ａ））、７Ｄ４とＰＣ６１との間では観察されない（図１３（Ｂ））。
ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ−２シグナル伝達：
汎Ｔ細胞を、InvitrogenのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標） ＦｌｏｗＣｏｍｐ（商標） Ｍｏｕｓｅ Ｐａｎ Ｔ（ＣＤ９０．２）キット（カタログ番号：１１４６５Ｄ）を用いて脾細胞から単離した。２０００００個の細胞をプレーティングし、３７℃で２時間静置した。抗体を５０μｇ／ｍｌで添加し、細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートし、続いて細胞をＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）により３７℃で１０分間刺激した。
細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（BD Biosciences）で処理することでＩＬ−２誘導ＳＴＡＴ５リン酸化を停止した。次いで、細胞を表面及び細胞内蛍光色素標識抗体（ＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７クローン４７／ｓｔａｔ５／ｐＹ６９４（BD Bioscience）、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローン１７Ａ２（Biolegend）、ＣＤ４−ＰＥクローンＲＭ４−５（Biolegend）、ＦｏｘＰ３−ＡＦ４８８クローンＦＪＫ−１６ｓ（Ebioscience））で同時に染色し、サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ−Ｈ対ＦＣＳ−Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ−Ａ対ＦＣＳ−Ａのパラメーターを用いてリンパ球を規定した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−Ａ対ＦＣＳ−Ａのプロットを用いて規定し、ゲートをカウント対ＳＴＡＴ５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−Ａを示すヒストグラム上に描画して、ＳＴＡＴ５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団を決定した。ＩＬ−２シグナル伝達の遮断率は、以下のように算出した：遮断（％）＝１００×［（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％）−Ｓｔａｔ５＋細胞５０μｇ／ｍｌ Ａｂ群（％））／（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％））］。異なるＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−）によるＳＴＡＴ５リン酸化の更なる分析も、それぞれのサブセットについてゲーティングすることによって評定し、上記のように分析した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った（結果は示さない）。結果を図１４に示す。
結果：
抗マウス抗体７Ｄ４及び２Ｅ４を、ＣＤ２５に結合する能力及びＣＤ２５発現標的細胞のＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力に関して更に評価した。非ＩＬ−２遮断剤である７Ｄ４及び２Ｅ４は、ＣＤ２５への結合について競合するが、ＰＣ６１（ＩＬ−２シグナル伝達遮断剤）は、ＣＤ２５に結合するのに２Ｅ４又は７Ｄ４と競合しない（図１２）。
ＳＴＡＴ５アッセイにより、７Ｄ４及び２Ｅ４がＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、ＩＬ−２シグナル伝達が「遮断」抗体ＰＣ６１によって遮断されることが確認された（図１４）。
実施例６：Ｔｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏ枯渇
２００μｌのＲＰＭＩ １６４０培地中の１×１０５個の４Ｔ１細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの第２胸部（2nd thoracic）脂肪体組織に移植した。腫瘍が５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３に達した時点で、マウスを無作為化し、マウス１匹当たり２μｇ、２０μｇ又は２００μｇのいずれかの単回腹腔内一定用量のマウス抗マウスＣＤ２５（７Ｄ４）抗体を投与した。３日目及び９日目に腫瘍組織及び全血を免疫表現型検査のために単離した。
結果：
抗体７Ｄ４は、免疫表現型検査による投与後３日目及び９日目の分析に基づき、全血及び腫瘍組織の両方でＴｒｅｇ枯渇活性を示した（図１５）。
実施例７：抗ＣＤ２５抗体７Ｇ７６Ｂの特性評価
ヒトＣＤ２５発現細胞への抗ＣＤ２５抗体の結合：
７Ｇ７６Ｂをリンパ腫ヒト細胞株であるＫａｒｐａｓ ２９９、ＳＵ−ＤＨＬ−１及びＳＲ−７８６及びｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞への結合によって評価する。ＣＤ２５発現ヒト細胞株（ＳＵ−ＤＨＬ−１及びＳＲ−７８６）への結合を、最初に細胞をＴｒｕｓｔａｉｎ（Biolegend）で遮断し、次に２０μｇ／ｍｌの最高濃度からの片対数希釈系列で力価決定した抗ＣＤ２５抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした後、洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Biolegend）と共にインキュベートすることによって試験した。細胞を再度洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅで取得した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の幾何平均強度（Geo Mean Intensity）をＸＹチャート上にプロットし、幾何平均強度を濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
ＣＤ２５発現Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞及びｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇへの結合を、試験物（抗ＣＤ２５一次抗体）を３０ｍｇ／ｍｌ抗体、続いて片対数希釈系列（７点）を用いて氷上で３０分間染色することによって試験した。これに続いて、濃度１ｍｇ／ｍｌの二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂフラグメント ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch））を用いて氷上で３０分間染色した。全てのサンプルを二連で染色した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＸＹチャート上にプロットし、ＭＦＩを濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。図１６及び図２１に示される結果から、抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５発現細胞に結合することが確認された。
ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ−２シグナル伝達：
ＩＬ−２遮断を、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを用いて特性評価し、ＩＬ−２シグナル伝達を試験した。予め凍結したＰＢＭＣ（Stemcell Technologies）をＵ字底９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２５抗体の存在下で３０分間培養した後、１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中で０．１Ｕ／ｍｌ、１Ｕ／ｍｌ又は１０Ｕ／ｍｌと様々な濃度のＩＬ−２（Peprotech）を１０分間添加した。細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（BD Biosciences）で処理することでＩＬ−２誘導ＳＴＡＴ５リン酸化を停止した。次いで、細胞を表面及び細胞内蛍光色素標識抗体（ＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７クローン４７／ｓｔａｔ５／ｐＹ６９４（BD Bioscience）、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローンＵＣＨＴ１（Biolegend）、ＣＤ４−ＢＶ５１０クローンＳＫ３（BD Bioscience）、ＣＤ８−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００クローンＲＰＡ−Ｔ８（Invitrogen）、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ−Ｃｙ７クローンＨＩ１００（Invitrogen）、ＦｏｘＰ３−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８クローン２３６Ａ／Ｅ７（Invitrogen））で同時に染色し、サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ−Ｈ対ＦＣＳ−Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ−Ａ対ＦＣＳ−Ａパラメーターを用いてリンパ球を規定した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−Ａ対ＦＣＳ−Ａのプロットを用いて規定し、ゲートをカウント対ＳＴＡＴ５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−Ａを示すヒストグラム上に描画して、ＳＴＡＴ５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団を決定した。ＩＬ−２シグナル伝達の遮断率は、以下のように算出した：遮断（％）＝１００×［（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％）−Ｓｔａｔ５＋細胞１０μｇ／ｍｌ Ａｂ群（％））／（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％））］。異なるＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋、ナイーブ及びメモリーＴ細胞）によるＳＴＡＴ５リン酸化の更なる分析も、それぞれのサブセットについてゲーティングすることによって評定し、上記のように分析した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った（結果は示さない）。結果を図１７及び図２２に示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイ：
Ｔｅｆｆ応答へのＩＬ−２シグナル伝達の影響を、細胞内グランザイムＢ（ＧｒＢ）の上方調節及び増殖を試験する、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて特性評価した。予め凍結した初代ヒト汎Ｔ細胞（Stemcell Technologies）を、ｅＦｌｕｏｒ４５０細胞増殖色素（Invitrogen）で製造業者の推奨に従って標識し、１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）の入ったＵ字底９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで添加した。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２５抗体又は対照抗体、続いてＨｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（２０：１の細胞対ビーズ比；Gibco）で処理し、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で７２時間インキュベートした。Ｔ細胞活性化を評定するために、細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅｆｌｕｏｒ７８０（Invitrogen）、続いて表面Ｔ細胞マーカーに対する蛍光色素標識抗体（ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローンＵＣＨＴ１（Biolegend）、ＣＤ４−ＢＶ５１０クローンＳＫ３（BD Bioscience）、ＣＤ８−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００クローンＲＰＡ−Ｔ８（Invitrogen）、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ−Ｃｙ７クローンＨＩ１００（Invitrogen）、ＣＤ２５−ＢＵＶ７３７クローン２Ａ３（BD Bioscience））で染色した後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、その後、細胞内ＧｒＢ及び核内ＦｏｘＰ３について染色した（グランザイムＢ−ＰＥクローンＧＢ１１（BD Bioscience）、ＦｏｘＰ３−ＡＰＣクローン２３６Ａ／Ｅ７）。サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ−Ｈ対ＦＣＳ−Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ−Ａ対ＦＣＳ−Ａパラメーターを用いてリンパ球を規定した。生ＣＤ３＋リンパ球からゲーティングしたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを、ＧｒＢ−ＰＥ−Ａ対増殖ｅＦｌｕｏｒ４５０−Ａのプロットを用いて評定した。結果を全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団からの増殖性ＧｒＢ陽性細胞のパーセンテージとして提示した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った。結果を図１８に示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ：
抗体依存性細胞介在性細胞傷害アッセイ（ＡＤＣＣアッセイ）を、抗ヒトＣＤ２５抗体の特性評価のためにＳＵ−ＤＨＬ−１又はＳＲ−７８６（ＣＤ２５陽性）ヒト細胞株を標的細胞として用い、ヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞の供給源として用いて行った。ＮＫ細胞を健常ドナーのＰＢＭＣからＮＫ細胞陰性単離キット（Stemcell Technologies）を用いて単離した。ＮＫ細胞を２ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２（Peprotech）の存在下で一晩培養した。ＳＵ−ＤＨＬ−１又はＳＲ−７８６標的細胞にカルセインＡＭ（Thermofisher）をロードし、１条件当たり４つの反復試験区で抗ＣＤ２５又はアイソタイプ抗体の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間プレーティングした。インキュベーション後に、ＮＫ細胞を１：１０の標的：エフェクター（Ｔ：Ｅ）比（１００００個の標的細胞及び１０００００個のエフェクター細胞）でウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。上清におけるカルセイン蛍光の読出しをBMGのＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダーで行った。特異的溶解率を標的細胞単独（０％溶解）及び０．１％サポニンで処理した標的細胞（１００％溶解）に対して算出した。生データのグラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて作成し、用量応答曲線を生成した。標的細胞溶解率をＸＹチャート上にプロットし、正規化カルセインＡＭ放出率を濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。結果を図１９に示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＰアッセイ：
抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）アッセイを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇを標的細胞として用い、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として用いて行った。ＰＢＭＣを白血球コーン（leucocyte cones）からフィコール勾配遠心分離によって単離した。単球（ＣＤ１４＋細胞）を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて単離した。単球を１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦの存在下で５日間培養し、Ｍ−ＣＳＦを含有する新鮮培地を３日後に添加した。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（R&D Systems）を用いて単離した。これらの細胞を３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で５日間インキュベートし、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素（Invitrogen）で製造業者の推奨に従って標識した。５日目に、マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを、下記のように抗ＣＤ２５抗体又は対照の存在下にて１０対１のエフェクター対標的比で４時間同時培養する。１０対１のエフェクター対標的比のために、標的細胞（Ｔｒｅｇ）を１×１０４細胞／ウェルで添加し、エフェクター細胞（マクロファージ）を１×１０５細胞／ウェルで添加した。次いで、抗ＣＤ２５抗体を１μｇ／ｍｌの最高濃度、続いて対数系列（７点）にて二連で添加した。細胞及び抗体を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。ＡＤＣＰを評定するために、細胞を氷上に置き、細胞表面マーカーＣＤ１４（ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローンＭｆＰ９（BD Biosciences））で染色し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ固定バッファーで固定した。二色フローサイトメトリー分析を、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０を用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４-である細胞と規定した。マクロファージは、ＣＤ１４＋として規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。結果を図２０に示す。
統計：
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いて曲線フィッティングを行い、ＥＣ５０値及び最大活性を決定した。
ヒト抗体は、ＩＬ２−ＣＤ２５相互作用を遮断しない
ＣＤ２５へのＩＬ２リガンド結合の干渉を、標準サンドイッチビニングアッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システム（Pall Forte Bio Corp.，USA）で行った。ＭＡ２５１抗体をＡＨＱセンサー上にロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連ヒトＩｇＧ１抗体でブロッキングした。センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いて１００ｎＭヒトＩＬ−２に曝露した。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０を用いてデータを処理した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。
結果：
７Ｇ７Ｂ６抗体を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して更に評価した。ＳＴＡＴ５アッセイでは、７Ｇ７Ｂ６は、試験したＩＬ−２濃度に関わらずにＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによってＩＬ−２シグナル伝達が完全に遮断された（図１７）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブ（Queen C et al, 1989, PNAS. 86(24):10029-10033及びBielekova B, 2013, Neurotherapeutics, 10(1):55？67）は、７Ｇ７Ｂ６とは異なるエピトープに結合し（図１０及び図２４Ｂ）、これにより、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてダクリズマブがＩＬ−２シグナル伝達を遮断し、７Ｇ７Ｂ６がＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図１７）。加えて、ダクリズマブは、おそらくはＩＬ−２シグナル伝達の遮断のために活性化Ｔ細胞のエフェクター応答を低減し、ＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない７Ｇ７Ｂ６は、Ｔ細胞応答に悪影響を与えない（図１８）。最後に、７Ｇ７Ｂ６キメラ抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図１９）及びＡＤＣＰ（図２０）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。
結論として、キメラ抗体としての７Ｇ７Ｂ６を特性評価したが、７Ｇ７Ｂ６は、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、７Ｇ７Ｂ６は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
ＭＡ−２５１抗体を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力に関して更に評価した。ＭＡ２５１抗体をＩＬ２−ＣＤ２５ Ｏｃｔｅｔ競合アッセイにおいて評定した。ＣＤ２５への同時のＩＬ２結合及びＭＡ２５１結合が観察され（図２３）、ＭＡ２５１が非競合的に結合することが示された。ＳＴＡＴ５アッセイでは、ＭＡ−２５１は、試験したＩＬ−２濃度に関わらずにＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによってＩＬ−２シグナル伝達が完全に遮断された（図２２）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブ（Queen C et al, 1989及びBielekova B, 2013）は、ＭＡ−２５１とは異なるエピトープに結合し（図１０及び図２４（Ｅ））、これにより、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてダクリズマブがＩＬ−２シグナル伝達を遮断し、ＭＡ−２５１がＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図２２）。
実施例８：抗ヒトＣＤ２５ Ａｂ競合アッセイ
抗体競合を、標準逐次結合アッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（Pall Forte Bio Corp.，USA）で行った。２６．８ｎＭ ｈｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ２５をＮｉ−ＮＴＡバイオセンサー上に２００秒間ロードした。動態バッファーに対するベースライン工程後に、センサーを６６．６ｎＭの第１の抗体に６００秒間又は１８００秒間のいずれか、続いて第２の抗ＣＤ２５抗体（同様に６６．６ｎＭで６００秒間又は１８００秒間のいずれか）に曝露した。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ９．０を用いてデータを処理した。第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（エピトープについての競合なし）、結合がなければエピトープ遮断が示される（エピトープについての競合）。
結果
ＩＬ−２シグナルｍＡｂ（抗体１及び抗体３）の非遮断剤は、互いに又は７Ｇ７Ｂ６及びＭＡ２５１と競合するが、研究用ダクリズマブ又は研究用バシリキシマブとは競合しない（図２４の例（Ａ）〜（Ｎ））。ＩＬ−２シグナル伝達遮断剤（すなわち、ＴＳＫ０３１）は、研究用ダクリズマブ及び研究用バシリキシマブと競合し、７Ｇ７Ｂ６とは競合しない（図２４の例（Ｏ）〜（Ｑ））。
実施例９：非遮断抗体の治療分析
０日目に、２００μｌのＲＰＭＩ １６４０中の１×１０７個のＳＵ−ＤＨＬ−１細胞を右脇腹に移植した。１２日目に、触知可能な腫瘍を有するマウスをビヒクル又は２ｍｇ／ｋｇで週２回の抗体１による処理のいずれかに無作為化した。１５日目に、腫瘍サイズが１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３のマウスを無作為化し、ビヒクル、２ｍｇ／ｋｇで週２回の抗体１又は１０ｍｇ／ｋｇの単回用量の抗体１のいずれかを投与した。
結果
抗体１は、２ｍｇ／ｋｇで週２回投与を行った触知可能な腫瘍を有する１０匹中９匹のマウスにおいて成長を妨げた（図２５（Ａ）及び（Ｂ））。腫瘍サイズが１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３のマウスでは、抗体１は、週２回の２ｍｇ／ｋｇ用量及び１０ｍｇ／ｋｇの単回用量でも腫瘍成長を妨げた（図２５（Ｃ）〜（Ｅ））。
実施例１０：抗ヒトＣＤ２５抗体の親和性測定
抗ヒトＣＤ２５抗体に対する親和性を、ＣＭ−５センサーチップを用いるＢｉａｃｏｒｅ ２０００でのＳＰＲによって２５℃の周囲実験温度でそれらのＫＤを測定することによって決定した。抗ヒト抗体を、初めに全フローセルにわたって分析バッファー（ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）中で１２０００〜１４０００のＲＵまで１０分かけて固定化した。リガンド（抗体試験物）を、続いて１４５ＲＵ〜１９０ＲＵの捕捉レベルまでロードした。次いで、分析物（ｈｉｓタグ付き組換えマウスＣＤ２５）を、分析バッファー中にて４００ｎＭから開始して３．１３ｎＭの最低濃度までの２倍希釈で６分間会合させた。解離を分析バッファー中で１０分間にわたって行った。サンプル濃度間の再生工程は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）中で１０分間行った。２５μｌ／分の流量を、プロセス全体を通して維持した。図２６（Ｃ）及び図２６（Ｄ）については、動態データを、Biacoreによって提供されるグローバル二状態反応立体配座変化分析ソフトウェアを用いて参照サブトラクションによりフィッティングした。参照サブトラクションによる１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルを図２６（Ａ）、図２６（Ｂ）及び図２６（Ｅ）に用いた。
ForteBioの親和性測定を、概して以前に記載されているようにＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４で行った（例えば、Estep P et al., 2013. Mabs. 5(2), 270-8を参照されたい）。
代替的には、抗ヒトＣＤ２５抗体に対する親和性を、バイオレイヤー干渉法によってＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６システム（Pall Forte Bio Corp.，USA）でそれらのＫＤを測定することによって決定した。センサーを動態バッファー中で１０分間、オフラインで平衡化した後、ベースライン確立のために６０秒間オンラインでモニタリングした。１３．３２ｎＭの抗体をＡＨＣバイオセンサーに２００秒間、続いて様々な濃度のｈｉｓタグ付きｒｈＣＤ２５（３倍段階希釈、５０ｎＭ〜０．５４ｎＭ）を６００秒間ロードし、動態バッファー中で４００秒間解離させた。動態データを、Pall Forte Bioによって提供されるグローバル１：１分析ソフトウェアを用いて参照サブトラクションによりフィッティングした。結果を図２６（Ｆ）に示す。
結果：
結果を図２６に示す。このアッセイにおいて確立された抗ＣＤ２５抗体についてのＫｄ値は、以下の通りである：抗体１については３．２×１０−９Ｍ、抗体３については３．８×１０−９Ｍ、ダクリズマブについては０．６１×１０−９Ｍ。
実施例１１：抗ＣＤ２５抗体（抗体１〜抗体２１）の特性評価
ＣＤ２５発現細胞への抗ＣＤ２５抗体の結合：
候補ヒットをＫａｒｐａｓ ２９９、ＳＵ−ＤＨＬ−１及びＳＲ−７８６細胞等のリンパ腫ヒト細胞株、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞、活性化ヒト又はｃｙｎｏ ＰＢＭＣ、ＨＳＣ−ＦカニクイザルＴ細胞株並びにＣＨＯ細胞への結合によって評価する。
ＣＤ２５発現ヒト細胞株（ＳＵ−ＤＨＬ−１及びＳＲ−７８６）への結合を、最初に細胞をＴｒｕｓｔａｉｎ（Biolegend）で遮断し、次に２０μｇ／ｍｌの最高濃度からの片対数希釈系列で力価決定した抗ＣＤ２５抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした後、洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Biolegend）と共にインキュベートすることによって試験した。細胞を再度洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅで取得した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の幾何平均強度をＸＹチャート上にプロットし、幾何平均強度を濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
ＣＤ２５発現Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞及びｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇへの結合を、試験物（抗ＣＤ２５一次抗体）を３０ｍｇ／ｍｌ抗体、続いて片対数希釈系列（７点）を用いて氷上で３０分間染色することによって試験した。これに続いて、濃度１ｍｇ／ｍｌの二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂフラグメント ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント ウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント（Jackson ImmunoResearch））を用いて氷上で３０分間染色した。全てのサンプルを二連で染色した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＸＹチャート上にプロットし、ＭＦＩを濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
ＣＤ２５発現活性化ヒト及びカニクイザルＰＭＢＣへの結合を、試験物（抗ＣＤ２５一次抗体）を２０ｍｇ／ｍｌ抗体、続いて片対数希釈系列（７点）を用いて氷上で３０分間染色することによって試験した。これに続いて、濃度５ｍｇ／ｍｌの二次抗体（ウサギ抗ヒトＦｃｇ Ｆ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch））を用いて氷上で３０分間染色した。全てのサンプルを三連で染色した。二次抗体の結合によって媒介される架橋誘導細胞死を最小限に抑えるために、細胞株を４つの試験物の染色コホートで一度に試験した。生リンパ球をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。ゲーティングしたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＸＹチャート上にプロットし、ＭＦＩを濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
ＣＤ２５発現ＨＳＣ−ＦカニクイザルＴ細胞株への結合を、試験物（抗ＣＤ２５一次抗体）を２０ｍｇ／ｍｌ抗体、続いて片対数希釈系列（７点）を用いて氷上で３０分間染色することによって試験した。これに続いて、濃度５ｍｇ／ｍｌの二次抗体（ウサギ抗ヒトＦｃｇ Ｆ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch））を用いて氷上で３０分間染色した。全てのサンプルを三連で染色した。二次抗体の結合によって媒介される架橋誘導細胞死を最小限に抑えるために、細胞株を４つの試験物の染色コホートで一度に試験した。生リンパ球をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。生細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＸＹチャート上にプロットし、ＭＦＩを濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
ＣＤ２５発現ＣＨＯ細胞への結合も試験した。抗原を過剰発現するおよそ１０００００個の細胞を洗浄バッファーで洗浄し、１００μｌの１００ｎＭ ＩｇＧと共に室温で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄バッファーで２回洗浄し、１００μｌの１：１００ヒト−ＰＥと共に氷上で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄バッファーで２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ分析装置（BD Biosciences）で分析した。非修飾ＣＨＯ細胞株も陰性対照として用いた。
ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ−２シグナル伝達：
ＩＬ−２遮断を、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを用いて特性評価し、ＩＬ−２シグナル伝達を試験した。予め凍結したＰＢＭＣ（Stemcell Technologies）をＵ字底９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２５抗体の存在下で３０分間培養した後、１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中で１０Ｕ／ｍｌ又は０．２５Ｕ／ｍｌ、０．７４Ｕ／ｍｌ、２．２２Ｕ／ｍｌ、６．６６Ｕ／ｍｌ又は２０Ｕ／ｍｌと様々な濃度のＩＬ−２（Peprotech）を１０分間添加した。細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（BD Biosciences）で処理することでＩＬ−２誘導ＳＴＡＴ５リン酸化を停止した。次いで、細胞を表面及び細胞内蛍光色素標識抗体（ＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７クローン４７／ｓｔａｔ５／ｐＹ６９４（BD Bioscience）、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローンＵＣＨＴ１（Biolegend）、ＣＤ４−ＢＶ５１０クローンＳＫ３（BD Bioscience）、ＣＤ８−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００クローンＲＰＡ−Ｔ８（Invitrogen）、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ−Ｃｙ７クローンＨＩ１００（Invitrogen）、ＦｏｘＰ３−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８クローン２３６Ａ／Ｅ７（Invitrogen））で同時に染色し、サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ−Ｈ対ＦＣＳ−Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ−Ａ対ＦＣＳ−Ａパラメーターを用いてリンパ球を規定した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−Ａ対ＦＣＳ−Ａのプロットを用いて規定し、ゲートをカウント対ＳＴＡＴ５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−Ａを示すヒストグラム上に描画して、ＳＴＡＴ５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団を決定した。ＩＬ−２シグナル伝達の遮断率は、以下のように算出した：遮断（％）＝１００×［（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％）−Ｓｔａｔ５＋細胞１０μｇ／ｍｌ Ａｂ群（％））／（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％））］。異なるＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋、ナイーブ及びメモリーＴ細胞）によるＳＴＡＴ５リン酸化の更なる分析を、それぞれのサブセットについてゲーティングすることによっても評定し、上記のように分析した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイ：
Ｔｅｆｆ応答へのＩＬ−２シグナル伝達の影響を、細胞内グランザイムＢ（ＧｒＢ）の上方調節及び増殖を試験する、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて特性評価した。予め凍結した初代ヒト汎Ｔ細胞（Stemcell Technologies）を、ｅＦｌｕｏｒ４５０細胞増殖色素（Invitrogen）で製造業者の推奨に従って標識し、１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）の入ったＵ字底９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで添加した。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２５抗体又は対照抗体、続いてＨｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（２０：１の細胞対ビーズ比；Gibco）で処理し、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で７２時間インキュベートした。Ｔ細胞活性化を評定するために、細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅｆｌｕｏｒ７８０（Invitrogen）、続いて表面Ｔ細胞マーカーに対する蛍光色素標識抗体（ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローンＵＣＨＴ１（Biolegend）、ＣＤ４−ＢＶ５１０クローンＳＫ３（BD Bioscience）、ＣＤ８−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００クローンＲＰＡ−Ｔ８（Invitrogen）、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ−Ｃｙ７クローンＨＩ１００（Invitrogen）、ＣＤ２５−ＢＵＶ７３７クローン２Ａ３（BD Bioscience））で染色した後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、その後、細胞内ＧｒＢ及び核内ＦｏｘＰ３について染色した（グランザイムＢ−ＰＥクローンＧＢ１１（BD Bioscience）、ＦｏｘＰ３−ＡＰＣクローン２３６Ａ／Ｅ７）。サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ−Ｈ対ＦＣＳ−Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ−Ａ対ＦＣＳ−Ａパラメーターを用いてリンパ球を規定した。生ＣＤ３＋リンパ球からゲーティングしたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを、ＧｒＢ−ＰＥ−Ａ対増殖ｅＦｌｕｏｒ４５０−Ａのプロットを用いて評定した。結果を全ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞集団からの増殖性ＧｒＢ陽性細胞のパーセンテージとして提示した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ：
抗体依存性細胞介在性細胞傷害アッセイ（ＡＤＣＣアッセイ）を、抗ヒトＣＤ２５抗体の特性評価のためにＳＵ−ＤＨＬ−１又はＳＲ−７８６（ＣＤ２５陽性）ヒト細胞株を標的細胞として用い、ヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞の供給源として用いて行った。ＮＫ細胞を健常ドナーのＰＢＭＣからＮＫ細胞陰性単離キット（Stemcell Technologies）を用いて単離した。ＮＫ細胞を２ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２（Peprotech）の存在下で一晩培養した。ＳＵ−ＤＨＬ−１又はＳＲ−７８６標的細胞にカルセインＡＭ（Thermofisher）をロードし、１条件当たり４つの反復試験区で抗ＣＤ２５又はアイソタイプ抗体の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間プレーティングした。インキュベーション後に、ＮＫ細胞を１：１０の標的：エフェクター（Ｔ：Ｅ）比（１００００個の標的細胞及び１０００００個のエフェクター細胞）でウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。上清におけるカルセイン蛍光の読出しをBMGのＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダーで行った。特異的溶解率を標的細胞単独（０％溶解）及び０．１％サポニンで処理した標的細胞（１００％溶解）に対して算出した。生データのグラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて作成し、用量応答曲線を生成した。標的細胞溶解率をＸＹチャート上にプロットし、正規化カルセインＡＭ放出率を濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
ＡＤＤＣをルシフェラーゼレポーターシステムアッセイにおいても決定した。本明細書で標的（Ｔ）細胞と称するＣＤ２５発現ＳＲ７８６細胞を、低ＩｇＧ ＦＢＳ添加培地（ＲＰＭＩ中の４％ＦＢＳ）中で異なる濃度のＣＤ２５に対するｍＡｂ（又は対照ＩｇＧ）と共に３７℃で２０分間インキュベートする。次いで、ＡＤＣＣエフェクター（Ｅ）細胞を細胞−ｍＡｂ混合物に１：１のＥ：Ｔ比で添加する。エフェクター細胞は、ルシフェラーゼレポーターシステムで安定にトランスフェクトし、ＣＤ１６／ＦｃγＲＩＩＩＡを過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Promega）である。３７℃で一晩のインキュベーション後に、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を特異的ルシフェラーゼ基質の加水分解による発光放出を用い、製造業者の説明書（PromegaのＢｉｏ−Ｇｌｏｗプロトコル）に従って測定する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化マクロファージ及びＴｒｅｇ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＰアッセイ：
抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）アッセイを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇを標的細胞として用い、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として用いて行った。ＰＢＭＣを、フィコール勾配遠心分離によって白血球コーンから単離した。単球（ＣＤ１４＋細胞）を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて単離した。単球を１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦの存在下で５日間培養し、Ｍ−ＣＳＦを含有する新鮮培地を３日後に添加した。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（R&D Systems）を用いて単離した。これらの細胞を３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で５日間インキュベートし、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素（Invitrogen）で製造業者の推奨に従って標識した。５日目に、マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを、下記のように抗ＣＤ２５抗体又は対照の存在下にて１０対１のエフェクター対標的比で４時間同時培養する。１０対１のエフェクター対標的比のために、標的細胞（Ｔｒｅｇ）を１×１０４細胞／ウェルで添加し、エフェクター細胞（マクロファージ）を１×１０５細胞／ウェルで添加した。次いで、抗ＣＤ２５抗体を１μｇ／ｍｌの最高濃度、続いて対数系列（７点）にて二連で添加した。細胞及び抗体を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。ＡＤＣＰを評定するために、細胞を氷上に置き、細胞表面マーカーＣＤ１４（ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローンＭｆＰ９（BD Biosciences））で染色し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ固定バッファーで固定した。二色フローサイトメトリー分析を、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０を用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４−である細胞と規定した。マクロファージは、ＣＤ１４＋として規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。
ＦｃγＲＩＩａ−Ｈレポーターアッセイを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＰアッセイ
ＡＤＣＰ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ（ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ）をPromegaから入手した（カタログ番号Ｇ９８８１／５；ロット番号００００２６１０９９）。５０００細胞／ウェルのＳＵＤＨＬ−１標的細胞を、９６ウェル白色ポリスチレンプレート（Costar；カタログ番号３９１７）を用いてプレーティングした（２５μｌ／ウェル）。試験抗体を、３倍希釈を用いて段階希釈し、２５μｌを細胞に添加した。１ウェル当たり５００００個のエフェクター細胞を２５μｌ容量で添加し、エフェクター及び標的細胞を１０：１の比率とした。全ての標的細胞、抗体及びエフェクター細胞を、細胞培養培地を用いてプレーティングした。プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、プレートをンキュベーターから取り出し、室温で２０分間保持した。６０μｌのＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質バッファーを各ウェルに添加し、続いて３０分間のインキュベーションを行い、発光をＧｌｏＭａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を用いて測定した。
統計：
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いて曲線フィッティングを行い、ＥＣ５０値及び最大活性を決定した。
結果
抗体１抗体を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して評価した。ｒｈＣＤ２５への結合及びＩＬ−２競合的結合分析の結果を図２７及び図２８に示す。Ｏｃｔｅｔを用いたリガンド結合アッセイにより、抗体１がＣＤ２５へのＩＬ−２結合に影響を及ぼさないことが示された（図２９）。これをＳＴＡＴ５アッセイにおいて確認したが、抗体１は、試験したＩＬ−２濃度に関わらずにＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによってＩＬ−２シグナル伝達が完全に遮断された（図３１）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブ（Queen C et al, 1989及びBielekova B, 2013）は、抗体１とは異なるエピトープに結合し（図３０）、これにより、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてダクリズマブがＩＬ−２シグナル伝達を遮断し、抗体１がＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図３１）。加えて、ダクリズマブは、おそらくはＩＬ−２シグナル伝達の遮断のために活性化Ｔ細胞のエフェクター応答を低減し、ＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない抗体１は、Ｔ細胞応答に悪影響を与えない（図３２）。最後に、抗体１は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図３３）及びＡＤＣＰ（図３４）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。
結論として、抗体１を特性評価したが、抗体１は、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、抗体１は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
抗体３抗体を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して評価した。ｒｈＣＤ２５への結合及びＩＬ−２競合的結合分析の結果を図３５及び図３６に示す。Ｏｃｔｅｔを用いたリガンド結合アッセイにより、抗体３がＣＤ２５へのＩＬ−２結合に影響を及ぼさないことが示された（図３７）。これをＳＴＡＴ５アッセイにおいて確認したが、抗体３は、試験したＩＬ−２濃度に関わらずにＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによってＩＬ−２シグナル伝達が完全に遮断された（図３９）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブは、抗体３とは異なるエピトープに結合し（図３８）、これにより、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてダクリズマブがＩＬ−２シグナル伝達を遮断し、抗体３がＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図３９）。加えて、ダクリズマブは、おそらくはＩＬ−２シグナル伝達の遮断のために活性化Ｔ細胞のエフェクター応答を低減し、ＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない抗体３は、抗体を用いない又はアイソタイプ対照を用いた条件と比較した場合に、Ｔ細胞応答に対し、たとえあったとしても最小限の影響しか有しない（図４０）。最後に、抗体３は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図４１）及びＡＤＣＰ（図４２）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。
結論として、抗体３を特性評価したが、抗体３は、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、抗体３は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
抗体４抗体を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して評価した。ｒｈＣＤ２５への結合及びＩＬ−２競合的結合分析の結果を図４３及び図４４に示す。Ｏｃｔｅｔを用いたリガンド結合アッセイにより、抗体４がＣＤ２５へのＩＬ−２結合に影響を及ぼさないことが示された（図４５）。これをＳＴＡＴ５アッセイにおいて確認したが、抗体４は、試験したＩＬ−２濃度に関わらずにＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによってＩＬ−２シグナル伝達が完全に遮断された（図４７）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブは、抗体４とは異なるエピトープに結合し（図４６）、これにより、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてダクリズマブがＩＬ−２シグナル伝達を遮断し、抗体４がＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図４７）。加えて、ダクリズマブは、おそらくはＩＬ−２シグナル伝達の遮断のために活性化Ｔ細胞のエフェクター応答を低減し、ＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない抗体４は、Ｔ細胞応答に悪影響を与えない（図４８）。最後に、抗体４は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図４９）及びＡＤＣＰ（図５０）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。
結論として、抗体４を特性評価したが、抗体４は、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、抗体４は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
抗体２抗体を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して評価した。ｒｈＣＤ２５への結合及びＩＬ−２競合的結合分析の結果を図５１及び図５２に示す。Ｏｃｔｅｔを用いたリガンド結合アッセイにより、抗体２がＣＤ２５へのＩＬ−２結合に影響を及ぼさないことが示された（図５３）。これをＳＴＡＴ５アッセイにおいて確認したが、抗体２は、試験したＩＬ−２濃度に関わらずにＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによってＩＬ−２シグナル伝達が完全に遮断された（図５５）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５とＩＬ−２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブは、抗体２とは異なるエピトープに結合し（図５４）、これにより、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてダクリズマブがＩＬ−２シグナル伝達を遮断し、抗体２がＩＬ−２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図５５）。最後に、抗体２は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図５６）及びＡＤＣＰ（図５７）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。
結論として、抗体２を特性評価したが、抗体２は、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、抗体２は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
抗体５抗体は、配列：
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTLDSYGVSWVRQAPGKGLEWVGVTSSGGSAYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRYVYTGGYLYHYGMDLWGQGTLVTVSS（配列番号１０）を含む重鎖可変領域と、配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISDYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLPFGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQGTYDSSDWYWAFGGGTKVEIK（配列番号１４）を含む可変軽鎖とを含むとして特徴付けられる。
上記に指定される相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及びフレームワーク領域（ＦＲ）の配列をＫａｂａｔナンバリングスキームに従って規定した。
抗体５を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して評価した。ｒｈＣＤ２５への結合の結果を図５８に示す。ＳＴＡＴ５アッセイにより、抗体５が試験したＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、ＩＬ−２シグナル伝達が抗体ダクリズマブによって完全に遮断されることが示された（図５９）。競合アッセイにより、抗体５がＩＬ−２シグナル遮断剤であるダクリズマブ又はバシリキシマブと競合せず（図６０（Ａ）及び（Ｂ））、７Ｇ７Ｂ６（非ＩＬ−２遮断剤）と競合する（図６０（Ｃ））ことが示された。最後に、抗体５は、抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図６１）及びＡＤＣＰ（図６１）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。
結論として、抗体５を特性評価したが、抗体５は、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、抗体５は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
抗体６、抗体７、抗体８及び抗体９抗体は、以下の配列を含むとして特徴付けられる：
抗体６は、配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTINGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDYGNSYYYALDYWGQGTLVTVSS（配列番号２３）を含む重鎖可変領域と、配列：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQAPRPLIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK（配列番号２５）を含む可変軽鎖とを含むとして特徴付けられる。
抗体７は、配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTINGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDYGNSYYYALDYWGQGTLVTVSS（配列番号２３）を含む重鎖可変領域と、配列：
QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQSPRPLIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK（配列番号２６）を含む可変軽鎖とを含むとして特徴付けられる。
抗体８は、配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTINGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDRDYGNSYYYALDYWGQGTLVTVSS（配列番号２４）を含む重鎖可変領域と、配列：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQAPRPLIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK（配列番号２５）を含む可変軽鎖とを含むとして特徴付けられる。
抗体９は、配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVSTINGYGDTTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARDRDYGNSYYYALDYWGQGTLVTVSS（配列番号２４）を含む重鎖可変領域と、配列：
QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSFMHWLQQKPGQSPRPLIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPPAFGQGTKLEIK（配列番号２６）を含む可変軽鎖とを含むとして特徴付けられる。
上記に指定される相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及びフレームワーク領域（ＦＲ）の配列をＫａｂａｔナンバリングスキームに従って規定した。
エピトープマッピングの結果から、抗体６、抗体７、抗体８及び抗体９が配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）及びアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）の領域でヒトＣＤ２５に結合し、ヒトＣＤ２５細胞外タンパク質配列に１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍの範囲のＫｄ値で結合することが示された。
抗体６、抗体７、抗体８及び抗体９を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して評価した。ｒｈＣＤ２５への結合の結果を図６３に示す。ＳＴＡＴ５アッセイにより、抗体が試験したＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、ＩＬ−２シグナル伝達が抗体ダクリズマブによって完全に遮断されることが示された（図６５）。競合アッセイにより、抗体７がＩＬ−２シグナル遮断剤であるダクリズマブ又はバシリキシマブと競合しないことが示された（図６４（Ａ）及び（Ｂ））。最後に、抗体７は、抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図６６）及びＡＤＣＰ（図６７）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。
結論として、抗体６、抗体７、抗体８及び抗体９を特性評価したが、これらは、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、これらの抗体は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
抗体１０、抗体１１、抗体１２、抗体１２、抗体１３、抗体１４、抗体１５、抗体１６、抗体１７、抗体１８、抗体１９、抗体２０、抗体２１抗体は、以下の配列を含む重鎖可変領域を含むとして特徴付けられる：
上記に指定される相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及びフレームワーク領域（ＦＲ）の配列をＫａｂａｔナンバリングスキームに従って規定した。
エピトープマッピングの結果から、抗体１０、抗体１１、抗体１２、抗体１２、抗体１３、抗体１４、抗体１５、抗体１６、抗体１７、抗体１８、抗体１９、抗体２０、抗体２１が配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）及びアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）の領域でヒトＣＤ２５に結合し、ヒトＣＤ２５細胞外タンパク質配列に１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍの範囲のＫｄ値で結合することが示された。
抗体を、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して評価した。ｒｈＣＤ２５への結合の結果を図６８に示す。ＳＴＡＴ５アッセイにより、抗体が試験したＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、ＩＬ−２シグナル伝達が抗体ダクリズマブによって完全に遮断されることが示された（図７０）。競合アッセイにより、抗体１９がＩＬ−２シグナル遮断剤であるダクリズマブ又はバシリキシマブと競合しないことが示された（図６９（Ａ）及び（Ｂ））。最後に、抗体１２、抗体１９及び抗体２０は、抗ヒトＣＤ２５ Ｆｃ ｓｉｌｅｎｔ対照抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図７１）及びＡＤＣＰ（図７２及び図７３）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。
結論として、抗体１０、抗体１１、抗体１２、抗体１２、抗体１３、抗体１４、抗体１５、抗体１６、抗体１７、抗体１８、抗体１９、抗体２０、抗体２１を特性評価したが、これらは、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ−２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、これらの抗体は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
実施例１２：癌ワクチンと組み合わせた治療分析
Ｂ１６Ｂｌ６免疫療法耐性マウスモデルにおけるＧＶＡＸと組み合わせた非ＩＬ−２遮断抗ＣＤ２５抗体である７Ｄ４マウスＩｇＧ２ａの治療活性を決定した。０日目に、５０×１０３個のＢ１６Ｂｌ６細胞をｉ．ｄ．移植した。５日目に、２００μｇの非ＩＬ−２遮断抗ＣＤ２５抗体をｉ．ｐ．投与するか又は投与しなかった。６日目、９日目及び１２日目に、マウスをＧＭ−ＣＳＦ（ＧＶＡＸ）により免疫賦活（adjuvanted）した１×１０６個の照射（１５０Ｇｙ）Ｂ１６Ｂｌ６細胞で処理するか又は処理しなかった。腫瘍成長及びマウス生存を３３日目までモニタリングした。結果を図７４に示す。
相乗効果がＢ１６Ｂｌ６モデルにおいてＧＶＡＸと７Ｄ４非遮断抗ＣＤ２５抗体との組合せで見られた。したがって、癌ワクチンと併せた７Ｄ４の投与は、ワクチン誘導抗腫瘍応答を強化した。これらの結果から、非ＩＬ２遮断抗ＣＤ２５枯渇抗体をヒトにおける癌の治療に癌ワクチンと組み合わせて用いることができることが示される。さらに、このデータから、非ＩＬ２遮断枯渇抗体が、ワクチン誘導免疫応答を増強することができ、潜在的に癌よりも適用範囲が広いことが示される。
上記の明細書で言及される全ての文献は、引用することにより本明細書の一部をなす。記載される本発明の方法及びシステムの様々な変更形態及び変形形態が、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明がかかる特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解されたい。実際に、分子生物学、細胞免疫学又は関連分野の当業者に明白な記載の本発明を実施するための形態の様々な変更形態が添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

Claims (63)

  1. 癌を有するヒト被験体を治療する方法であって、抗ＣＤ２５抗体を被験体に投与する工程を含み、該被験体が固形腫瘍を有し、該抗体がＣＤ２５へのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の結合を阻害しない、方法。
  2. 前記抗ＣＤ２５抗体がヒトＣＤ２５への結合について抗体７Ｇ７Ｂ６と競合し、及び／又はヒトＣＤ２５への結合について抗体ＭＡ２５１と競合する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗ＣＤ２５抗体が、抗体７Ｇ７Ｂ６によって認識されるものと同じエピトープ及び／又は抗体ＭＡ２５１によって認識されるエピトープに結合する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記抗ＣＤ２５抗体がヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８６（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７０〜８８（ＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）から選択されるアミノ酸ストレッチの１つ以上に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記抗ＣＤ２５抗体がヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）、配列番号１のアミノ酸１７６〜１８０（ＲＷＴＱＰ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記抗ＣＤ２５抗体がヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）、配列番号１のアミノ酸１７６〜１８６（ＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項４に記載の方法。
  7. 前記抗ＣＤ２５抗体がヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、該エピトープが配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）、配列番号１のアミノ酸７０〜８４（ＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）及び配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項４に記載の方法。
  8. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  9. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸１５０〜１６０（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  10. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  11. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）、配列番号１のアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）、配列番号１のアミノ酸４２〜５６（ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ）及び配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳＳＡＴＲ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  12. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）及び配列番号１のアミノ酸１７６〜１８０（ＲＷＴＱＰ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  13. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸１５０〜１５８（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡ）及び配列番号１のアミノ酸１７６〜１８６（ＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  14. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸１５０〜１６３（ＹＱＣＶＱＧＹＲＡＬＨＲＧＰ）及び配列番号１のアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  15. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸７４〜８４（ＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  16. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸７０〜８４（ＮＳＳＨＳＳＷＤＮＱＣＱＣＴＳ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  17. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸１７６〜１８０（ＲＷＴＱＰ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  18. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸１６６〜１８０（ＳＶＣＫＭＴＨＧＫＴＲＷＴＱＰ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  19. 前記抗ＣＤ２５抗体が配列番号１のアミノ酸１７６〜１８６（ＲＷＴＱＰＱＬＩＣＴＧ）の配列を含むエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
  20. 前記抗ＣＤ２５抗体がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及び／又はＦｃγＲＩＩＩａから選択される少なくとも１つの活性化Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合し、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させるＩｇＧ１抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記抗ＣＤ２５抗体が、
    （ａ）１を上回る活性化型対抑制型比（Ａ／Ｉ）でＦｃγ受容体に結合し、及び／又は、
    （ｂ）ＦｃγＲＩＩｂに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及び／又はＦｃγＲＩＩＩａに結合する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記抗体が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｄ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｆ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｇ）配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｈ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｊ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｋ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｌ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｍ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｎ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｏ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｐ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｑ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    （ｒ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、及び、
    （ｓ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体、
    からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記抗ＣＤ２５抗体がヒトＩｇＧ２抗体である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５に対して１０−７Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記抗ＣＤ２５抗体がＩＬ−２シグナル伝達を５０％未満阻害する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記抗ＣＤ２５抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記抗ＣＤ２５抗体がヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記抗体がその親和性成熟変異体である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記抗体が７Ｇ７Ｂ６又はＭＡ２５１のヒト化及び／又は親和性成熟変異体である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記抗ＣＤ２５抗体がＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ応答の増強、好ましくはＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ応答の増大、より好ましくはＡＤＣＣ応答の増大を誘発する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記抗ＣＤ２５抗体を、定着腫瘍を有する被験体に投与する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 固形腫瘍を有する被験体を特定する工程を更に含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 免疫チェックポイント阻害剤を前記被験体に投与することを更に含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ＰＤ−１アンタゴニストが抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項３４に記載の方法。
  36. 癌ワクチンを投与することを更に含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記癌ワクチンがＧＶＡＸ癌ワクチンである、請求項３６に記載の方法。
  38. 請求項１〜３０のいずれか一項に規定される抗ＣＤ２５抗体。
  39. 薬剤に使用される、請求項３８に記載の抗ＣＤ２５抗体。
  40. ヒト被験体における癌の治療に使用される、請求項１〜３０のいずれか一項に規定される抗ＣＤ２５抗体であって、前記被験体が固形腫瘍を有する、抗ＣＤ２５抗体。
  41. ヒト被験体における癌の治療のための薬剤の製造への請求項１〜３０のいずれか一項に規定される抗ＣＤ２５抗体の使用であって、前記被験体が固形腫瘍を有する、使用。
  42. 前記抗体が更なる治療剤と組み合わせた投与のためのものである、請求項４０に記載の使用のための抗ＣＤ２５抗体又は請求項４１に記載の抗ＣＤ２５抗体の使用。
  43. 前記更なる治療剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項４２に記載の使用のための抗ＣＤ２５抗体又は請求項４２に記載の抗ＣＤ２５抗体の使用。
  44. 前記免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項４３に記載の使用のための抗ＣＤ２５抗体又は請求項４３に記載の使用。
  45. 前記更なる治療剤が癌ワクチンである、請求項４２に記載の使用のための抗ＣＤ２５抗体又は請求項４１に記載の抗ＣＤ２５抗体の使用。
  46. ヒト被験体における癌の治療に使用される請求項１〜３０のいずれか一項に規定される抗ＣＤ２５抗体と更なる治療剤との組合せであって、前記被験体が固形腫瘍を有し、前記抗ＣＤ２５抗体及び前記更なる治療剤が同時、別個又は順次に投与される、組合せ。
  47. 請求項１〜３０のいずれか一項に規定される抗ＣＤ２５抗体と更なる治療剤とを含む、癌の治療に使用されるキット。
  48. 薬学的に許容可能な媒体中の請求項１〜３０のいずれか一項に規定される抗ＣＤ２５抗体を含む医薬組成物。
  49. 更なる治療剤を更に含む、請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 前記更なる治療剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項４６に記載の使用のための組合せ、請求項４７に記載のキット又は請求項４９に記載の医薬組成物。
  51. 前記免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１アンタゴニストである、請求項４６に記載の使用のための組合せ、請求項４７に記載のキット又は請求項４９に記載の医薬組成物。
  52. 前記更なる治療剤が癌ワクチンである、請求項４６に記載の使用のための組合せ、請求項４７に記載のキット又は請求項４９に記載の医薬組成物。
  53. （ａ）ＣＤ２５に結合する第１の抗原結合部分と、
    （ｂ）免疫チェックポイントタンパク質に結合する第２の抗原結合部分と、
    を含む二重特異性抗体であって、前記ＣＤ２５結合部分がＣＤ２５へのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の結合を阻害せず、好ましくは前記二重特異性抗体がＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩＩから選択される少なくとも１つの活性化Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合し、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させるＩｇＧ１抗体である、二重特異性抗体。
  54. 前記免疫チェックポイントタンパク質がＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ、ＬＬＴ１、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７及びＩＣＯＳからなる群から選択される、請求項５３に記載の二重特異性抗体。
  55. 前記免疫チェックポイントタンパク質が腫瘍細胞上で発現される、請求項５３又は５４に記載の二重特異性抗体。
  56. 前記免疫チェックポイントタンパク質がＰＤ−Ｌ１である、請求項５３又は５４に記載の二重特異性抗体。
  57. ＰＤ−Ｌ１に結合する前記第２の抗原結合部分がアテゾリズマブに含まれる、請求項５３に記載の二重特異性抗体。
  58. 癌を治療する方法であって、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を被験体に投与する工程を含む、方法。
  59. 前記被験体が固形腫瘍を有する、請求項５７に記載の方法。
  60. 被験体における癌の治療に使用される、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  61. 前記被験体が固形腫瘍を有する、請求項６０に記載の使用のための二重特異性抗体。
  62. 被験体において制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法であって、抗ＣＤ２５抗体を前記被験体に投与する工程を含み、前記抗体が請求項１〜３０のいずれか一項に規定される、方法。
  63. 前記被験体が固形腫瘍を有する、請求項６２に記載の方法。
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