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JP2020506698A - α−アミラーゼ変異体 - Google Patents

α−アミラーゼ変異体 Download PDF

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Abstract

本発明は、親α−アミラーゼと比した場合に向上した洗浄性能を有する親α−アミラーゼの変異体に関する。本発明はまた、この変異体をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞、ならびに、本発明の変異体を生成する方法に関する。

Description

配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
本発明は、α−アミラーゼの変異体、この変異体をコードするポリヌクレオチド、および、この変異体の生成方法に関する。
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプンならびに他の直鎖および分岐１，４−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。
洗剤、製パン、醸造、例えば異性化糖の調製またはデンプンからのエタノール製造の一部におけるデンプン液化および糖化などの数々の公知の用途におけるα−アミラーゼの産業的な使用には長い歴史がある。α−アミラーゼのこれらの用途および他の用途は公知であり、特に細菌性α−アミラーゼといった微生物由来のα−アミラーゼが利用される。
用いられた最初の細菌性α−アミラーゼは、Ｔｅｒｍａｍｙｌとしても知られるＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼであり、これは広範に特徴付けが行われ、この酵素に係る結晶構造が判明している。ＡＡ５６０などのアルカリ性アミラーゼが、洗剤における用途が見出された特定の一群のα−アミラーゼを形成する。これらの公知の細菌性アミラーゼの多くは、特定の用途における機能が改善されるよう修飾されている。
Ｔｅｒｍａｍｙｌ、ＡＡ５６０（国際公開第２０００／０６００６０号パンフレット）およびＳＰ７０７（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５１：２５−３１により記載されている）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼは、洗剤における用途が見出されるα−アミラーゼの特定の群を形成する。これらのアミラーゼは修飾されて、洗剤中における安定性が向上されている。例えば国際公開第９６／２３８７３号パンフレットには、ＳＰ７０７のアミノ酸１８１＋１８２またはアミノ酸１８３＋１８４を欠失させて（国際公開第９６／２３８７３号パンフレットの配列番号７）、このアミラーゼの安定性を向上することが開示されている。国際公開第９６／２３８７３号パンフレットにはさらに、Ｍ２０２を例えばロイシンで置換することによりＳＰ７０７アミラーゼを修飾して、分子を酸化に対して安定化させることが開示されている。それ故、アミラーゼを修飾して一定の特性を向上させることは公知である。
環境保護のために、洗浄、皿洗いおよび／またはクリーニングプロセス中の温度を下げることがますます重要となっている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常用いられる温度よりも高い。α−アミラーゼは洗剤組成物において用いられる重要な酵素であり、その使用は、ランドリーの洗濯または皿洗いの最中におけるデンプン質の汚れを除去するためにますます重要となっている。従って、温度が低い場合であっても洗浄性能、汚れ除去効果および／または活性が保持されるα−アミラーゼ変異体を見出すことが重要である。しかしながら、現在の洗剤酵素組成物の効率にも関わらず、多くの汚れは完全に除去することが困難である。これらの問題は、低い洗浄温度（例えば冷水）および短期間の洗浄サイクルの使用増加により悪化している。それ故、低温下で機能することが可能であり、同時に特異活性（デンプン分解活性）、安定性および／または洗浄性能などの他の望ましい特性が維持または増加可能であるデンプン分解酵素を得ることが望ましい。
それ故、本発明は、５〜４０℃の温度などの低温での洗浄、皿洗いおよび／またはクリーニングプロセスにおいて用いられることが可能であるα−アミラーゼ変異体を提供することを目的とする。さらに、本発明はまた、親α−アミラーゼと比して、または、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかのα−アミラーゼと比して向上した洗浄性能を低温で有するα−アミラーゼ変異体を提供することを目的とする。
本発明は親α−アミラーゼの変異体に関し、ここで、（ｉ）変異体は、配列番号１に係るアミノ酸配列の１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、（ｉｉ）変異体は、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９７％などの少なくとも８０％であるが、１００％未満の配列同一性を、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に係るアミノ酸配列に対して有し、ならびに、（ｉｉｉ）変異体は、α−アミラーゼ活性を有する。
本発明はまた、本発明に係る変異体をコードするポリヌクレオチド、本発明に係る変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物、本発明に係る変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および、本発明に係る変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
本発明はまた、α−アミラーゼ変異体を生成する方法であって、（ａ）変異体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ、および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む方法に関する。
本発明はさらに、α−アミラーゼ変異体を入手する方法であって、親α−アミラーゼに、配列番号１に係るアミノ酸配列の１０９、７、１、３９１、２８０、２８４、３２０および３２３に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を導入するステップであって、各修飾が独立して置換または欠失であり、および、変異体がα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、変異体を回収するステップを含む方法に関する。
本発明は親α−アミラーゼの変異体に関し、ここで、（ｉ）変異体は、配列番号１に係るアミノ酸配列の１０９、７、１、３９１、２８０、２８４、３２０および３２３に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、（ｉｉ）変異体は、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９７％などの少なくとも８０％であるが、１００％未満の配列同一性を、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に係るアミノ酸配列に対して有し、ならびに、（ｉｉｉ）変異体はα−アミラーゼ活性を有する。
一態様において、本発明は親α−アミラーゼの変異体に関し、ここで、（ｉ）変異体は、配列番号１に係るアミノ酸配列の１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１からなる群から選択される位置に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６からなる群から選択される位置に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、（ｉｉ）変異体は、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９７％などの少なくとも８０％であるが、１００％未満の配列同一性を、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に係るアミノ酸配列に対して有し、ならびに、（ｉｉｉ）変異体はα−アミラーゼ活性を有する。
定義
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を介して自然に生じ、また、個体群中の多型性によりもたらされ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化無し）であることが可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
「α−アミラーゼ」（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）という用語は、デンプンならびに他の直鎖および分岐１，４−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。本発明の目的のために、α−アミラーゼ活性は、実施例の項に記載の手法に従って判定される。一態様において、本発明の変異体は、配列番号１の成熟型ポリペプチドのα−アミラーゼ活性の、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％といった、少なくとも２０％を有する。
本明細書において用いられるところ、「アミノ酸」という用語は、標準的な２０種の遺伝的にコードされたアミノ酸、および、これらの対応する「Ｄ型」の立体異性体（天然の「Ｌ型」と比較）、ω−アミノ酸、他の天然に生じるアミノ酸、通常のものではないアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸等）、ならびに、化学的に誘導体化されたアミノ酸を含む。１種以上のアミノ酸の化学誘導体は、官能側基との反応により達成され得る。このような誘導体化された分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステル、または、他のタイプのエステルおよびヒドラジドを形成し得る。遊離水酸基は、誘導体化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。また、化学誘導体としては、２０種の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドが挙げられる。例えば：４−ヒドロキシプロリンはプロリンについて置換され得；５−ヒドロキシリシンはリシンについて置換され得；３−メチルヒスチジンはヒスチジンについて置換され得；ホモセリンはセリンについて置換され得、および、オルニチンはリシンについて置換され得る。誘導体はまた、要求される活性が維持される限りにおいて１種以上の付加または欠失を含有するペプチドを含む。他の包含される修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えばアセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンによる）等の末端修飾である。
アミノ酸が特定的に列挙されている場合（「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」など）、この用語は、別段の記載がない限り、ｌ−アラニンおよびｄ−アラニンの両方を指す。他の通常のものではないアミノ酸はまた、所望される機能的特性がポリペプチドによって保持される限りにおいて、本発明のポリペプチドに係る好適なコンポーネントであり得る。示されているペプチドについて、コードされているアミノ酸残基の各々は、適切な場合、従来のアミノ酸の慣用名に対応して１文字の記号で表記されている。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むか、または、Ｌ−アミノ酸から構成されている。
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核または原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
「コード配列」という用語は、変異体のアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは通常、ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧなどの開始コドンで開始され、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはこれらの組み合わせであり得る。
「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要とされる核酸配列を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対してネイティブ（すなわち、同一の遺伝子に由来）もしくは外来（すなわち、異なる遺伝子に由来）であっても、または、相互にネイティブもしくは外来であってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。
「増強された洗浄性能」または「向上した洗浄性能」という用語は、配列番号１の親α−アミラーゼと比して向上したクリーニング効果（例えば汚れの除去）を洗濯または食器洗浄などの洗浄プロセスにおいてもたらす、本発明のポリペプチドの能力を意味する。洗浄性能は、自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を用いるなど、技術分野において周知である方法を用いて、判定され得る。増強された洗浄性能は、例えば２０℃以上（４０℃など）の洗浄温度といった、洗浄条件の一部のみ、または、おそらくはそのすべての下で達成され得ることが当業者には認識されるであろう。
本明細書において用いられるところ、「酵素洗浄力による有益性」という用語は、酵素が洗剤に対して付加し得る、同一であるが酵素を含まない洗剤と比した場合における有利な効果を指す。酵素によりもたらされることが可能である重要な洗浄力による有益性は、洗浄および／またはクリーニング後に視認可能な汚染物がないかほとんどない汚れの除去；洗浄プロセスで遊離した汚染物の再付着の防止または低減（再付着防止とも呼ばれる効果）；元々は白色であったが反復的な使用および洗浄の後に灰色がかったもしくは黄色がかった外観となってしまった生地の白色度の完全なまたは部分的な回復（白色化とも呼ばれる効果）である。触媒による汚れの除去または汚染物の再付着の防止とは直接関連しないが生地の取り扱いによる有益性（Ｔｅｘｔｉｌｅ ｃａｒｅ ｂｅｎｅｆｉｔ）もまた、酵素洗浄力による有益性について重要である。このような生地の取り扱いによる有益性の例は、一の布地から他の布地へ、もしくは、同一の布地の他の部分への移染の防止または低減（移染防止または逆汚染防止とも呼ばれる効果）；ピル性を低減するための布地表面からの突出繊維もしくは破断繊維の除去、または、既に存在しているピルもしくは毛羽の除去（抗ピルとも呼ばれる効果）；布地柔軟性の向上；布地の色の清澄化；および、布地もしくは衣服の繊維中に詰まった粒状の汚染物の除去である。酵素漂白は、さらなる酵素洗浄力による有益性であり、ここで、触媒活性は一般に、過酸化水素または他の過酸化物などの漂白成分の形成を触媒するために用いられる。
「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌物を含む変異体の生成に関与するいずれかのステップを含む。
「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を含む。
「断片」という用語は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８のポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル終端で１つ以上（例えば複数）のアミノ酸を欠くポリペプチドを意味し；ここで、断片はα−アミラーゼ活性を有する。一態様において、断片は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８の少なくとも２００連続アミノ酸残基、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８の、少なくとも３００連続アミノ酸残基、または、少なくとも３５０連続アミノ酸残基、または、少なくとも４００連続アミノ酸残基、または、少なくとも４５０連続アミノ酸残基を含有する。
「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞タイプを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞とは等しくない親細胞の子孫のいずれかを包含する。
本明細書において用いられるところ、「強度値」という用語は、洗浄性能の計測値を指す。これは、白色光を照射した際におけるサンプルから反射した光の強度として表される輝度として計測される。サンプルが汚れている場合、反射光の強度はきれいなサンプルからのものよりも低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能であり、ここで、より高い強度値がより高い洗浄性能と相関している。色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（Ｋｏｄａｋ ｉＱｓｍａｒｔ、Ｋｏｄａｋ）で行われる。スキャンしたイメージから光強度の値を抽出するために、イメージからの２４−ビットピクセル値が、レッド、グリーンおよびブルー（ＲＧＢ）の値に変換される。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
Figure 2020506698
「Δ強度」または「Δ強度値」という用語は、本明細書において、例えば布きれＣＳ−２８（Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）または硬質面といったテスト材料の強度計測の結果として定義されている。布きれは、バックグラウンドとして同等の条件下で洗浄した布きれの一部と共に、計測される。Δ強度は、アミラーゼで洗浄したテスト材料の強度値から、アミラーゼを伴わずに洗浄したテスト材料の強度値を差し引いたものである。
本明細書において用いられるところ、「向上した特性」という用語は、親と比して向上した変異体に関する特徴を指す。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、洗浄性能、熱活性、耐熱性、ならびに、保管条件下における安定性、および、化学的安定性が挙げられる。向上した特性は、本明細書において定義および記載されている安定性などのもののいずれかであり得る。
「向上した洗浄性能」という用語は、本明細書において、配列番号２または１のアミラーゼの洗浄性能を基準とした本発明のアミラーゼの洗浄性能の改変を示すと定義されており、この改変は、例えば汚れの除去の向上として示され得る。向上した洗浄性能は、実施例１に従って判定される。実施例１において列挙されている条件の１つ以上において、α−アミラーゼ変異体濃度が０．２ｍｇ／Ｌである場合にモデル洗剤Ａにおいて２０℃において、または、α−アミラーゼ変異体濃度が０．０５ｍｇ／Ｌである場合にモデル洗剤Ａにおいて４０℃において、または、α−アミラーゼ変異体濃度が０．２ｍｇ／Ｌである場合にモデル洗剤Ｊにおいて２０℃において、または、α−アミラーゼ変異体濃度が０．０５ｍｇ／Ｌである場合にモデル洗剤Ｊにおいて３０℃において、または、α−アミラーゼ変異体濃度が０．２ｍｇ／Ｌである場合に洗剤Ｋにおいて２０℃において、改善度（ＩＦ）が１．０超、好ましくは１．０５超であれば、洗浄性能は向上している。洗浄条件は実施例の項において記載されている。
「洗浄性能」という用語は、普通、例えば皿洗浄などにおける硬質面クリーニングといったクリーニングを含むが、また、洗濯などの生地における洗浄性能、ならびに、産業上および組織的なクリーニングをも含む。向上した洗浄性能は、本明細書における定義において記載されているΔ強度を比較することにより計測し得る。
「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）特にこれらに限定されないが、自然界において関連している天然構成成分の１種以上もしくはすべてが少なくとも部分的に除去されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補助因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質と相対的に人工的に修飾されたいずれかの物質；または、（４）自然界においては関連している他の成分に対する物質の量を増やすことにより修飾されたいずれかの物質（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連しているプロモータより強力なプロモータの使用）が挙げられる。単離された物質は、発酵液体培地サンプルに存在し得る。一態様において、本発明は単離されたα−アミラーゼ変異体に関する。
単離されたポリヌクレオチド：「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、人工的に修飾されたポリヌクレオチドを意味する。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動による測定で、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度、少なくとも９０％の純度および少なくとも９５％の純度である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来、または、これらのいずれかの組み合わせであり得る。
単離された変異体：「単離された変異体」という用語は、人工的に修飾された変異体を意味する。一態様において、この変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも１０％の純度、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、少なくとも６０％の純度、少なくとも８０％の純度および少なくとも９０％の純度といった、少なくとも１％の純度である。
低温：「低温」は、５〜４０℃、好ましくは５〜３５℃、好ましくは５〜３０℃、より好ましくは５〜２５℃、より好ましくは５〜２０℃、最も好ましくは５〜１５℃、および、特に５〜１０℃の温度である。好ましい実施形態において、「低温」は、１０〜３５℃、好ましくは１０〜３０℃、または、１０〜２５℃、または、１０〜２０℃、または、１０〜１５℃の温度である。
「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾に続くその最終形態にあるポリペプチドを意味する。宿主細胞が、同一のポリヌクレオチドによって発現されるさらなる異なる成熟型ポリペプチドの２種（すなわち、異なるＣ−末端および／またはＮ−末端アミノ酸を有するもの）の混合物をもたらし得ることは技術分野において公知である。
「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、α−アミラーゼ活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
「変異体」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
「突然変異」という用語は、本発明のポリペプチドに係る文脈において、基準アミノ酸配列（すなわち配列番号１）中における１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸による置換または欠失によって改変されることを意味する。さらに、突然変異は、基準アミノ酸配列中への１つ以上の余剰アミノ酸の挿入に相当し得る。
「核酸構築物」という用語は一重鎖または二重鎖の核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されているか、または、そうでなければ自然には存在しないように核酸のセグメントを含有するよう修飾されているか、または、１つ以上の制御配列を含む合成物である。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要とされる制御配列を含む場合には、用語「発現カセット」と同義である。
「作動的にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列を発現させるよう、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。
「親」または「親α−アミラーゼ」という用語は、本発明の酵素変異体をもたらすために改変が行われたα−アミラーゼを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチドまたはその変異体であり得る。例えば、親は、配列番号１のα−アミラーゼ（ＳＰ７２２として公知である）であり得る。あるいは、親は、配列番号２のα−アミラーゼを意味していてもよい。親α−アミラーゼは、本明細書において、配列番号：３、４、５、６、７および８と列挙されているものなどのいずれかの好適なα−アミラーゼであり得る。
２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメータによって記載される。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）、好ましくはバージョン５．０．０以降のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスであり得る。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
あるいは、用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスであり得る。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
デンプン除去プロセス：「デンプン除去プロセス」という表現は、ランドリーなどの例えば生地クリーニングといったデンプンが生地から除去される洗浄プロセスにおけるものなどの、デンプンが除去（または転化）されるいずれかの種類のプロセスに関する。デンプン除去プロセスはまた、皿洗浄などの硬質面クリーニングであることが可能であり、または、産業上もしくは組織的なクリーニングなどの一般的なクリーニングプロセスであることが可能である。この表現はまた、一般的に、他のデンプン除去プロセスまたはデンプン転化、エタノール製造、デンプン液化、生地糊抜き、紙およびパルプ製造、ビール製造、ならびに、洗剤を含む。
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、他の外来性または不要なヌクレオチドを含まず、および、遺伝的に操作されたポリペプチド産生系における使用に好適な形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。それ故、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、元々または組換え的に関連している他のポリヌクレオチド材料を、最大で１０％、最大で８％、最大で６％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％、最大で１％および最大で０．５ｗｔ％含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータおよびターミネータなどの天然の５’−および３’−非翻訳領域を含み得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量基準で、少なくとも９０％の純度、例えば、少なくとも９２％の純度、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度および少なくとも９９．５％の純度であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。
実質的に純粋な変異体：「実質的に純粋な変異体」という用語は、元々関連しているかまたは組換えにより関連している他のポリペプチド材料を、最大で１０％、最大で８％、最大で６％、最大で５％、最大で４％、最大で３％、最大で２％、最大で１％および最大で０．５ｗｔ％で含有する調製物を意味する。好ましくは、変異体は、調製物中に存在するポリペプチド材料の総重量を基準として、少なくとも９２％の純度、例えば、少なくとも９４％の純度、少なくとも９５％の純度、少なくとも９６％の純度、少なくとも９７％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の純度および１００％の純度である。本発明の変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは、例えば、周知の組換え方法によって、または、古典的な精製方法によって変異体を調製することにより達成が可能である。
「サブ配列」という用語は、成熟型ポリペプチドコード配列の５’および／または３’末端で１つ以上（例えば複数）のヌクレオチドを欠くポリヌクレオチドを意味し；ここで、サブ配列はα−アミラーゼ活性を有する断片をコードする。
生地：生地サンプルＣＳ−２８（綿上の米デンプン）は、Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手する。
本明細書において用いられるところ、「生地の取り扱いによる有益性」という用語は、触媒による汚れの除去または汚染物の再付着の防止とは直接関連しないが、酵素洗浄力による有益性に重要であると定義されている。このような生地の取り扱いによる有益性の例は、一の布地から他の布地へ、もしくは、同一の布地の他の部分への移染の防止または低減（移染防止または逆汚染防止とも呼ばれる効果）；ピル性を低減するための生地表面からの突出繊維もしくは破断繊維の除去、または、既に存在しているピルもしくは毛羽の除去（抗ピルとも呼ばれる効果）；生地柔軟性の向上；生地の色の清澄化；および、生地の繊維中に詰まった粒状の汚染物の除去である。酵素漂白は、さらなる酵素洗浄力による有益性であり、ここで、触媒活性は一般に、過酸化水素または他の過酸化物または他の漂白種などの漂白成分の形成を触媒するために用いられる。
「変異体」という用語は、突然変異（すなわち、置換、挿入および／または欠失）を、配列番号１または配列番号：２、３、４、５、６、７もしくは８の「親」α−アミラーゼに関連する１つ以上（例えば複数）の位置で含む、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換は、ある位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し；欠失は、ある位置にあるアミノ酸の除去を意味し；および、挿入は、ある位置にあるアミノ酸に隣接して、直接連続するようアミノ酸を付加することを意味する。本発明の変異体は、配列番号１または配列番号２の成熟型ポリペプチドのα−アミラーゼ活性の、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％といった少なくとも２０％を有する。
「野生型」α−アミラーゼという用語は、自然界において見出されるバクテリア、イースト菌または糸状真菌などの天然微生物によって発現されるα−アミラーゼを意味する。
従来の変異体の決定
α−アミラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に示されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から誘導されたα−アミラーゼの変異体に相当する。
Figure 2020506698
本発明の目的のために、配列番号１において開示されているポリペプチドは、他のα−アミラーゼポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基の判定に用いられる。しかしながら、配列番号２の配列もまた、他のα−アミラーゼポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基の判定に用いられ得ることを当業者は認識するであろう。他のα−アミラーゼのアミノ酸配列が配列番号１において開示されている成熟型ポリペプチドとアラインされ、このアラインメントに基づいて、配列番号２に開示されている成熟型ポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）において実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
他のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、特にこれらに限定されないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｙ ｌｏｇ−ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２−１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：１８９９−１９００）、および、ＣｌｕｓｔａｌＷを採用するＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）を含む数々のコンピュータプログラムを用い、これらのそれぞれのデフォルトパラメータを用いることで、複数のポリペプチド配列のアラインメントによって判定可能である。
配列番号１の成熟型ポリペプチドから他のα−アミラーゼが分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つまたは複数の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６−５６７）。
本発明のα−アミラーゼ変異体の記載において、以下の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
置換．アミノ酸置換に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、例えば位置２２６でのスレオニンのアラニンでの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と示される。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」とされ、それぞれ、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による位置２０５および４１１での置換が表されている。
欠失．アミノ酸の欠失に関して以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、＊。従って、位置１８１でのグリシンの欠失は「Ｓｅｒ１８１＊」または「Ｓ１８１＊」と示される。複数の欠失は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば「Ｓｅｒ１８１＊＋Ｔｈｒ１８２＊」または「Ｓ１８１＊＋Ｔ１８２＊」とされる。
挿入．アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、例えば位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］と示される。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
このような事例において、挿入されたアミノ酸残基には、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基に下付文字を付与することにより番号が付される。それ故、上記の例において配列は以下のとおりとなる。
Figure 2020506698
複数の修飾．複数の修飾を含む変異体は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、アルギニンおよびグリシンに対する位置１７０および１９５のチロシンおよびグルタミン酸での置換を表す。
異なる修飾．１つの位置で異なる改変を導入可能である場合、異なる改変はコンマによって分けられ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、アルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による位置１７０での置換を表す。それ故、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を示す。
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
親α−アミラーゼ
親α−アミラーゼはまた、配列番号１に記載のポリペプチドに対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドでもあり得る。
一態様において、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１のポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９または１００％などの少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１のポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親α−アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号１のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号２に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する配列番号２のポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９または１００％などの少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２のポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親α−アミラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号２のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号３に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する配列番号３のポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９または１００％などの少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号３のポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親α−アミラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号３のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号４に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する配列番号４のポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９または１００％などの少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号４のポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親α−アミラーゼは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号４のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号５に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する配列番号５のポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９または１００％などの少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号５のポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親α−アミラーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号５のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号６に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する配列番号６のポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９または１００％などの少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号６のポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親α−アミラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号６のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号７に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する配列番号７のポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９または１００％などの少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号７のポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親α−アミラーゼは、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号７のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号８に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する配列番号８のポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９または１００％などの少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号８のポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった１０個以下のアミノ酸が異なっている。
親α−アミラーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号８のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列またはその断片は、技術分野において周知である方法に従って、異なる属もしくは種の系統から親をコードするＤＮＡを同定およびクローン化するために核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的なサザンブロッティング法の後に、対象の属もしくは種のゲノムもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いられることが可能である。このようなプローブは配列全体よりもかなり短いことが可能であるが、例えば、長さが少なくとも２５、少なくとも３５または少なくとも７０ヌクレオチドといった少なくとも１４ヌクレオチドであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドの長さといった、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの両方が用いられることが可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
このような他の生体から調製したゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の生体由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され固定化され得、これがサザンブロッティングにおいて用いられる。
本発明の目的に関して、ハイブリダイゼーションとは、低度〜きわめて高度の緊縮条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはそのサブ配列をコードするポリヌクレオチドに対応する標識化ヌクレオチドプローブにポリヌクレオチドがハイブリダイズすることを表す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは技術分野において公知であるいずれかの他の検出手段を用いて検出可能である。
一態様において、核酸プローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはその断片のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長鎖プローブに関して、きわめて低度〜きわめて高度の緊縮条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃での、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および変性済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、きわめて低度および低度の緊縮性に対しては２５％ホルムアミド、中度および中度−高度の緊縮性に対しては３５％ホルムアミド、または、高度およびきわめて高度の緊縮性に対しては５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、４５℃（きわめて低度の緊縮性）、５０℃（低度の緊縮性）、５５℃（中度の緊縮性）、６０℃（中度−高度の緊縮性）、６５℃（高度の緊縮性）または７０℃（きわめて高度の緊縮性）で、１５分間、３回洗浄される。
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短い短鎖プローブに関して、緊縮条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、Ｂｏｌｔｏｎ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：１３９０）に従う計算を用いて算出したＴｍよりも約５℃〜約１０℃低い温度で、０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハート溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭナトリウム一塩基性リン酸、０．１ｍＭ ＡＴＰおよび０．２ｍｇのイースト菌ＲＮＡ／ｍｌでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、６Ｘ ＳＣＣ中で１度、また、０．１％ＳＤＳ中で１５分間、および、算出したＴｍより５℃〜１０℃低い温度で６×ＳＳＣを用いて１５分間ずつ２回洗浄される。
親は、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された細胞によって生成されることを意味することとする。一態様において、親は、細胞外に分泌される。
親は細菌性α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）α−アミラーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）α−アミラーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
一態様において、親は、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）またはストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）またはストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のα−アミラーゼといったバチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）α−アミラーゼである。
前述の種について、本発明は、知られている種の名称に関わらず、完全および不完全世代、ならびに、例えば無性世代といった他の分類学上の均等物の両方を含むことが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることによりもたらされ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化され得る。
親は、一のポリペプチドの一部分が、他のポリペプチドの一部分のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
親はまた、１個のポリペプチドが他のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合タンパク質はまた、翻訳後に融合が形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
変異体の調製
本発明は、α−アミラーゼ活性を有する変異体を入手する方法であって、（ａ）親α−アミラーゼに、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を導入するステップであって、各修飾が独立して置換または欠失であり、および、前記変異体がα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、（ｂ）前記変異体を回収するステップを含む方法に関する。
一態様において、本発明は、α−アミラーゼ活性を有する変異体を入手する方法であって、（ａ）親α−アミラーゼに、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、ならびに、任意選択により、配列番号：２、３、４、５、６、７および８に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を導入するステップであって、番号が配列番号１に従い、および、各修飾が独立して置換または欠失であり、および、前記変異体がα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、（ｂ）前記変異体を回収するステップを含む方法に関する。
一実施形態において、修飾は置換である。一実施形態において、修飾は欠失である。
他の実施形態において、本発明は、α−アミラーゼ活性を有する変異体を入手する方法であって、（ａ）親α−アミラーゼに１つ以上の位置で置換を導入するステップであって、置換が、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８のポリペプチドのＨ１Ａ、Ｇ７Ａ、Ｇ１０９Ａ、Ｎ２８０Ｓ、Ｗ２８４Ｈ、Ｋ３２０Ａ、Ｍ３２３ＮおよびＥ３９１Ａから選択され、番号が配列番号１に従うステップ、ならびに、（ｂ）変異体を回収するステップを含む方法に関する。
一実施形態において、この方法はさらに、親α−アミラーゼに１つ以上の位置で欠失を導入するステップであって、欠失が：配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８のポリペプチドのＨ１＊、Ｒ１８１＊、Ｇ１８２＊、Ｄ１８３＊およびＧ１８４＊から選択され、番号が配列番号１に従うステップ、ならびに、変異体を回収するステップを含む。
一実施形態において、この方法はさらに、親α−アミラーゼに１つ以上の位置で置換を導入するステップであって、置換が：配列番号：１、３、４、５、６、７または８のポリペプチドのＷ１４０Ｙ、Ｎ１９５Ｆ、Ｖ２０６Ｙ、Ｙ２４３Ｆ、Ｅ２６０Ｇ、Ｇ３０４ＲおよびＧ４７６Ｋから選択されるステップ、ならびに、変異体を回収するステップを含む。
変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、無作為突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の規定の部位で１つまたは複数（いくつか）の突然変異を形成する技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用されるＰＣＲによってインビトロで達成されることが可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける部位が制限酵素により切断され、および、その後、ポリヌクレオチドに突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが連結されるカセット式突然変異誘発によってインビトロで行われることが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドで消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と挿入断片とを互いに連結させる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発はまた、技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において用いられることが可能である。変異体の調製に用いられることが可能である多くの市販のキットが入手可能である。
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
変異体
本発明はまた、（ｉ）配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、ならびに、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、（ｉｉ）変異体が、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９７％などの少なくとも８０％であるが、１００％未満の配列同一性を、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に係るアミノ酸配列に対して有し、ならびに、（ｉｉｉ）変異体がα−アミラーゼ活性を有する、親α−アミラーゼの変異体を提供する。これにより、親α−アミラーゼと比して、または、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８のα−アミラーゼと比して、低温で向上した洗浄性能を有する変異体が提供される。
実施形態において、変異体は、親α−アミラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、ならびに、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、（ｉｉ）変異体が、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９７％などの少なくとも８０％であるが、１００％未満の配列同一性を、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に係るアミノ酸配列に対して有し、ならびに、（ｉｉｉ）変異体がα−アミラーゼ活性を有する、単離された親α−アミラーゼの変異体に関する。
他の実施形態において、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を配列番号１の成熟型ポリペプチドに対して有する。
他の実施形態において、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して有する。
他の実施形態において、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を配列番号３の成熟型ポリペプチドに対して有する。
他の実施形態において、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して有する。
他の実施形態において、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を配列番号５の成熟型ポリペプチドに対して有する。
他の実施形態において、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して有する。
他の実施形態において、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を配列番号７の成熟型ポリペプチドに対して有する。
他の実施形態において、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％など、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を配列番号８の成熟型ポリペプチドに対して有する。
一実施形態において、本発明の変異体中の修飾の番号は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０などの、例えば、１〜１０および１〜５といった１〜２０の修飾である。
一実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、任意選択により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する２つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、任意選択により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する３つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、任意選択により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する４つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、任意選択により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する５つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、任意選択により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する６つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、任意選択により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する７つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、任意選択により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する８つの位置に置換などの修飾、ならびに、任意選択により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
一実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する２つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する３つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する４つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する５つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する６つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する７つ以上の位置に置換などの修飾、ならびに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
他の実施形態において、変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する８つの位置に置換などの修飾、ならびに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
好ましい実施形態において、変異体は、１、７、１０９、２８０および３９１からなる群から選択される１、２、３、４または５つの位置に修飾を含む。
一実施形態において、変異体は、１、７、１０９、２８０および３９１からなる群から選択される２、３、４または５つの位置に、少なくとも１つの欠失および少なくとも１つの置換を含む。
一実施形態において、変異体は、７、１０９、２８０および３９１から選択される１、２、３または４つの位置に置換を含む。
一実施形態において、変異体は：Ｘ１＋Ｘ７；Ｘ１＋Ｘ１０９；Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１；Ｘ７＋Ｘ１０９；Ｘ７＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１；Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ２８０＋Ｘ３９１；Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ２８４＋Ｘ３９１；Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３２０＋Ｘ３９１；および、Ｘ３２３＋Ｘ３９１からなる位置の群から選択される位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
一実施形態において、変異体は：Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；および、Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３からなる位置の群から選択される位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
一実施形態において、変異体は：Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；および、Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３からなる位置の群から選択される位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
一実施形態において、変異体は、Ｘ１＊、Ｘ１Ａ、Ｘ７Ａ、Ｘ７Ｋ、Ｘ７Ｅ、Ｘ７Ｎ、Ｘ７Ｑ、Ｘ７Ｌ、Ｘ７Ｄ、Ｘ１０９Ａ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１４０Ｙ、Ｘ１８１＊、Ｘ１８２＊、Ｘ１８３＊、Ｘ１８４＊、Ｘ１９５Ｆ、Ｘ２０６Ｙ、Ｘ２４３Ｆ、Ｘ２６０Ｇ、Ｘ２８０Ｓ、Ｘ２８４Ｈ、Ｘ２８４Ｒ、Ｘ２８４Ｆ、Ｘ３０４Ｒ、Ｘ３２０Ａ、Ｘ３２０Ｍ、Ｘ３２０Ｔ、Ｘ３２０Ｖ、Ｘ３２０Ｓ、Ｘ３２３Ｎ、Ｘ３２３Ｒ、Ｘ３２３Ｓ、Ｘ３２３Ｋ、Ｘ３９１Ａ、Ｘ３９１ＶおよびＸ４７６Ｋからなる群から選択される１つ以上の修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
特定の一実施形態において、変異体は：Ｘ１＊＋Ｘ１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１＊＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１＊＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
一実施形態において、変異体は：Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う。
好ましい一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に記載のアミラーゼのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号１に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号２に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号２に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好ましい一実施形態において、変異体は：
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ｅ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ｎ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ｑ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ｌ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ｄ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｍ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｔ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｖ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ｖ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｋ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ｓ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｇ７Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ；Ｇ７Ａ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ；Ｋ３２０Ａ；Ｇ７Ａ＋Ｋ３２０Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号２に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含む。
一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号３に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号３に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号４に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号４に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号５に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号５に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号６に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号６に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号７に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号７に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、変異体は：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；および、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号８に係るアミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、および、変異体は、配列番号８に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
本発明に係る変異体は、Ｘ１＊、Ｘ１Ａ、Ｘ７Ａ、Ｘ１０９Ａ、Ｘ２８０ＳおよびＸ３９１Ａの群から選択される１、２、３、４または５つの位置に修飾を含んでいることが好ましい。さらに好ましい実施形態において、１、２、３、４または５つの位置における修飾は、Ｘ１＊、Ｘ７Ａ、Ｘ１０９Ａ、Ｘ２８０ＳおよびＸ３９１Ａから選択される。
一態様において、本発明は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ、Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ、Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１ＡおよびＸ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａに対応する位置に修飾を含む変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する位置に修飾を含む配列番号１の変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応するものを含む配列番号２の変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応するものを含む配列番号３の変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応するものを含む配列番号４の変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応するものを含む配列番号５の変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応するものを含む配列番号６の変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応するものを含む配列番号７の変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；および、Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応するものを含む配列番号８の変異体に関し、ここで、番号は配列番号１に従い、および、ここで、変異体は、配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態において、本発明の変異体はさらに、１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６の群から選択される１つ以上の位置に修飾を含む。特定の実施形態において、本発明の変異体は、Ｗ１４０Ｙ／Ｆ、Ｒ１８１＊、Ｇ１８２＊、Ｄ１８３＊、Ｇ１８４＊、Ｎ１９５Ｆ／Ｙ、Ｉ２０６Ｙ／Ｆ、Ｙ２４３Ｆ、Ｅ２６０Ａ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、Ｇ３０４Ｒ／Ｋ／Ｅ／ＱおよびＧ４７６Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｋの群から選択される１つ以上のさらなる修飾を含む。好ましい一実施形態において、本発明に係る変異体はさらに、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｅ２６０ＧＨＩＫＮＰＲＴＹおよびＧ４７６ＥＱＲＫからなる群から選択される２、３または４つの位置に置換を含む。さらに好ましい実施形態において、２、３または４つの位置における置換は、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０Ｙ、Ｅ２６０ＧおよびＧ４７６Ｋからなる群から選択される。
一実施形態において、本発明の変異体は、
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、および
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、
に対応する修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従い、変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有すると共に、配列番号１の変異体である。
親における必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにα−アミラーゼ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。α−アミラーゼの活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、親に関連するポリペプチドによるアイデンティティの分析から推測されることも可能である。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドに関連する。従って、本発明は、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置：１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、ならびに、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含む変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、変異体は、少なくとも８０％、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９５％など、少なくとも９７％などであるが、１００％未満の配列同一性を、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に係るアミノ酸配列に対して有し、ならびに、ここで、変異体はα−アミラーゼ活性を有する。
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。従って、本発明は、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置：１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、ならびに、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、ここで、ポリヌクレオチドは、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞においてコード配列を発現させる１つ以上の制御配列に作動的にリンクされている。
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるプロモータ配列であり得る。プロモータ配列は、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギリ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギリ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られたプロモータ；ならびに、そのミュータント、切断およびハイブリッドプロモータである。
イースト菌宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞に対する他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８により記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる好適な転写ターミネータ配列であり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の好ましいターミネータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２に記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である好適なリーダー配列であり得る。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのリーダー配列が用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
制御配列はまた、変異体をコードする配列の３’−末端に作動可能にリンクする配列であるポリアデニル化配列であり得、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される。宿主細胞において機能するいずれかのポリアデニル化配列が用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード領域のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード領域を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード領域を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード領域を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード領域が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード領域は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード領域を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード領域がもちいられてもよい。
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７に記載されている。
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２により記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード領域は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が変異体のＮ−末端に存在する場合、プロペプチド領域は変異体のＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のＮ−末端に隣接して位置されている。
宿主細胞の増殖に対した変異体の発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、変異体をコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。従って、本発明は、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置における修飾、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え型ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数（いくつか）の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数（いくつか）の選択マーカーを有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
細菌性選択マーカーの例は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。イースト菌宿主細胞の好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を有することが好ましい。
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のヌクレオチド配列を有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングヌクレオチド配列であり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするヌクレオチド配列を意味する。
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
実質的に純粋な変異体を得るために、上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体の生成をもたらす１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。従って、本発明は、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、ならびに、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え型宿主細胞に関し、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、ならびに、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含む変異体を産生させる１つ以上の制御配列に作動的にリンクされている。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、変異体の組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換および電気穿孔法により（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合により（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、電気穿孔法により（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、天然コンピテンスにより（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換により（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９−２０７０を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）行われ得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いることが可能である。
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物または真菌細胞などの真核生物であり得る。
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書およびＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；および、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０に記載の手法を用いて形質転換され得る。
生成方法
本発明はまた：（ａ）本発明の宿主細胞を変異体の発現に好適な条件下で培養するステップ；および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体を生成する方法に関する。従って、本発明は、（ａ）配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含む変異体をコードする発現ベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、変異体の発現に好適な条件下で培養するステップ；ならびに、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体を生成する方法に関する。
一態様において、本発明は、親α−アミラーゼに、配列番号１に係るアミノ酸配列の１０９、７、１、３９１、２８０、２８４、３２０および３２３からなる群から選択される位置に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６からなる群から選択される位置に対応する１つ以上の位置に修飾を導入するステップであって、各修飾が独立して置換または欠失であり、および、変異体がα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、変異体を回収するステップを含むα−アミラーゼ変異体を入手する方法に関する。
宿主細胞は、技術分野において公知である方法を用いて変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、または、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
変異体は、変異体に特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産生物の形成、または、酵素基質の消失を含み得る。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定してもよい。
変異体は技術分野において公知である方法により回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
変異体は、実質的に純粋な変異体を得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
代替的な態様においては、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体のソースとして用いられ得る。
組成物
本発明はまた、本発明の変異体を含む組成物に関する。従って、本発明は、変配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、ならびに、任意選択により、配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含む異体を含む組成物に関する。好ましくは、組成物はこのような変異体が富化されている。「富化」という用語は、組成物のα−アミラーゼ活性が、例えば１．１の富化因子で高められることを意味する。
組成物は、主な酵素成分として変異体を含み得る例えば単成分組成物である。または、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解性酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解性酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼなどの複数の酵素活性を含み得る。追加の酵素が、例えば、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）といったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）；例えば、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）といったアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；例えば、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｅｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）もしくはフザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）といったフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）；フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、例えば、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）もしくはフミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）；または、例えば、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）といったトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する微生物または他の任意の本明細書の宿主細胞によって例えば生成され得る。
組成物は、技術分野において公知である方法に従って調製され得、また、液体または乾燥組成物の形態であり得る。例えば、組成物は、粒質物または微粒剤の形態であり得る。変異体は、技術分野において公知である方法に従って安定化され得る。
本発明によれば、上記のα−アミラーゼ変異体は、典型的には、例えばランドリー洗剤組成物または皿洗い洗剤組成物といった洗剤組成物などのクリーニング組成物中の成分であり得る。液体ランドリー洗剤組成物が特に好ましい。
このようなクリーニング組成物は、クリーニング／洗剤補助剤、好ましくは成分の混合物を含む。典型的には、クリーニング補助剤は、０．００１〜９９．９ｗｔ％、さらに典型的には０．０１〜８０ｗｔ％の量のクリーニング補助剤で組成物中に存在するであろう。
他の好ましい態様において、組成物は、半極性および／またはアニオン性および／またはカチオン性および／または両性イオン性および／または両性および／または半極性ノニオン性および／またはこれらの混合物を含むノニオン性であり得る１種または複数種の界面活性剤を含む。界面活性剤は、典型的には、組成物の０．１％〜６０ｗｔ％または０．５〜５０ｗｔ％または１〜４０ｗｔ％のレベルで存在する。
使用
本発明はまた、α−アミラーゼ変異体の使用方法に関する。
本発明のα−アミラーゼ変異体は、低温で、洗剤組成物、ランドリーの洗濯、皿洗いおよび／またはクリーニングプロセスにおいて有用である。
使用方法
本発明はまた、ある場所（とりわけ表面または布地）をクリーニングおよび／または処理するための方法に関する。一態様において、このような方法であって、任意選択により、前記表面または布地を洗浄および／またはすすぐステップ、前記表面または布地とこの明細書に開示されているいずれかの消費者製品とを接触させるステップ、次いで、任意選択により、前記表面または布地を洗浄および／またはすすぐステップを含む方法が開示されている。
本明細書において用いられるところ、洗浄としては、特に限定されないが、こすり洗いおよび機械的撹拌が挙げられる。このような表面または布の乾燥は、家庭または工業環境において採用される一般的な手段のいずれか一つによって達成され得る。このような手段としては、これらに限定されないが、周囲温度または高温、５〜０．０１気圧の圧力下、太陽光、赤外線、紫外線およびマイクロ波の照射を含む電磁波の存在下または不在下における強制空気乾燥または静止空気乾燥が挙げられる。一態様において、前記乾燥は、アイロンを利用することにより周囲温度を超える温度で温度達成されてもよく、ここで、例えば、前記布地は、比較的短時間、または、さらには長時間の間前記アイロンと直接接触させられてもよく、また、ここで、重力によって通常存在する圧力を超えて圧力が印加されてもよい。他の態様において、前記乾燥は、乾燥機を利用することにより周囲温度を超える温度で達成されてもよい。布地を乾燥させるための装置は周知であり、頻繁に衣類乾燥機と称される。衣類に追加して、このような電気器具はタオル、敷布、枕カバー、オムツ等を含む多くの他の物品の乾燥に用いられ、このような器具は、世界の多くの国々において、布地を乾燥させるための物干し用のロープの使用を実質的に置き換える標準的な有用品として受け入れられている。今日用いられているほとんどの乾燥機では、布地が乾燥機中において回転されるに伴って、布地の上および／またはその中を通過する加熱された空気が用いられる。空気は、例えば、電気的に、ガス炎により、または、さらにはマイクロ波放射線で加熱され得る。このような空気は、約１５℃から約４００℃、約２５℃から約２００℃、約３５℃から約１００℃、または、約４０℃から約８５℃に加熱され得、乾燥機において表面および／または布地を乾燥させるために用いられる。当業者には理解されるであろうとおり、本発明のクリーニング組成物は、理想的には、洗濯用途での使用に好適である。従って、本発明は、布地を洗濯するための方法を含む。この方法は、洗濯されるべき布地と、本出願人によるクリーニング組成物、クリーニング添加剤またはこれらの混合物の少なくとも一実施形態を含む前記クリーニング洗濯溶液とを接触させるステップを含む。布地は、通常の消費者における使用条件または組織的な使用条件において洗濯が可能であるほとんどの布地を含み得る。溶液は、約８〜約１０．５のｐＨを有することが好ましい。組成物は、溶液中において約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で利用され得る。水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃の範囲である。水対布地の比は、典型的には、約１：１〜約３０：１である。
以下は洗剤組成物の例示である。
Figure 2020506698
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組成物実施例１〜２１の原料および注釈
Ｃ１１〜Ｃ１８の平均脂肪族炭素鎖長を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩
Ｃ１２−１８ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド
ＡＥ３ＳはＣ１２−１５アルキルエトキシ（３）スルフェート
ＡＥ７は、７の平均エトキシル化度を有するＣ１２−１５アルコールエトキシレート
ＡＥ９は、９の平均エトキシル化度を有するＣ１２−１６アルコールエトキシレート
ＨＳＡＳは、米国特許第６，０２０，３０３号明細書および米国特許第６，０６０，４４３号明細書に開示されている約１６〜１７の炭素鎖長を有する中鎖分岐第一級アルキルスルフェート
ポリアクリレートＭＷ４５００はＢＡＳＦ製
カルボキシメチルセルロースは、ＣＰ Ｋｅｌｃｏ，Ａｒｎｈｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製Ｆｉｎｎｆｉｘ（登録商標）Ｖ
ＣＨＥＣは、カチオン性変性ヒドロキシエチルセルロースポリマー。
ホスホネートキレート剤は、例えば、ジエチレンテトラアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ヒドロキシエタンジホスホネート（ＨＥＤＰ）、
Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（登録商標）、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（商標）、Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）およびＷｈｉｔｅｚｙｍｅ（登録商標）はすべて、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋの製品。
Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）は、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡの製品
蛍光増白剤１はＴｉｎｏｐａｌ（登録商標）ＡＭＳであり、蛍光増白剤２はＴｉｎｏｐａｌ（登録商標）ＣＢＳ−Ｘであり、Ｄｉｒｅｃｔ Ｖｉｏｌｅｔ ９はＰｅｒｇａｓｏｌ（登録商標）Ｖｉｏｌｅｔ ＢＮ−Ｚであり、ＮＯＢＳはノナノイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウム
ＴＡＥＤはテトラアセチルエチレンジアミン
Ｓ−ＡＣＭＣは、Ｃ．Ｉ．ＲｅａｃｔｉｖｅＢｌｕｅ１９（製品名ＡＺＯ−ＣＭ−ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ）と共役されたカルボキシメチルセルロース
汚染物剥離剤はＲｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ（登録商標）ＰＦ
アクリル酸／マレイン酸コポリマーは、分子量７０，０００であり、および、７０：３０のアクリレート：マレエート比
ＥＤＤＳは、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸のナトリウム塩、（Ｓ，Ｓ）異性体泡抑制剤凝集体はＤｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ製
ＨＳＡＳは中鎖分岐アルキルスルフェート
Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）Ｖｉｏｌｅｔ ＣＴは、Ｍｉｌｌｉｋｅｎ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ製
１ ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖および複数のポリ酢酸ビニル側鎖を有するポリ酢酸ビニルグラフトポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシド対ポリ酢酸ビニルの重量比は約４０〜６０であり、５０のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１つ以下である。
２ −ＮＨ当たり２０個のエトキシレート基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３ 両親媒性アルコキシル化ポリマーは、−ＮＨ当たり２４個のエトキシレート基および−ＮＨ当たり１６個のプロポキシレート基を含有するよう誘導体化されたポリマーから調製されたポリエチレンイミン（ＭＷ６００）。
アミラーゼ４は、本明細書におけるａ）〜ｋ）のいずれか（ｍｇ活性タンパク質）。
Figure 2020506698
Figure 2020506698
Figure 2020506698
本明細書に開示の寸法および値は、言及されている厳密な数値に狭義に限定されると理解されるべきではない。代わりに、別段の規定がある場合を除き、このような寸法の各々は、言及されている値と、その値の上下における機能的に同等な範囲との両方を意味することが意図されている。例えば、「４０ｍｍ」と開示されている寸法は「約４０ｍｍ」を意味することが意図されている。
α−アミラーゼ活性判定用のｐＮＰ−Ｇ７アッセイ
α−アミラーゼ活性は、Ｇ７−ｐＮＰ基質を利用する方法により判定し得る。Ｇ７−ｐＮＰは、α−アミラーゼなどのエンド−アミラーゼにより切断されることが可能であるブロックオリゴ糖（ｂｌｏｃｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）である４，６−エチリデン（Ｇ７）−ｐ−ニトロフェニル（Ｇ１）−α，Ｄ−マルトヘプタオシドに対する略記である。切断の後、キット中のα−グルコシダーゼが加水分解された基質をさらに消化して、黄色の遊離ｐＮＰ分子を遊離させ、これにより、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ）での可視分光法による計測が可能である。Ｇ７−ｐＮＰ基質およびα−グルコシダーゼを含有するキットは、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ（カタログ番号１１８７６４７３）により製造されている。
試薬：
このキットのＧ７−ｐＮＰ基質は、２２ｍＭの４，６−エチリデン−Ｇ７−ｐＮＰおよび５２．４ｍＭ ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、ｐＨ７．０）を含有する。
α−グルコシダーゼ試薬は、５２．４ｍＭのＨＥＰＥＳ、８７ｍＭのＮａＣｌ、１２．６ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０７５ｍＭのＣａＣｌ２、≧４ｋＵ／Ｌのα−グルコシダーゼ）を含有する。
基質処理溶液は、１ｍＬのα−グルコシダーゼ試薬を０．２ｍＬのＧ７−ｐＮＰ基質と混合することにより形成される。この基質処理溶液は、使用直前に形成される。
希釈緩衝剤：５０ｍＭのＭＯＰＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（ｎ＝９〜１０）））、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０。
手法：
分析されるアミラーゼサンプルを希釈緩衝剤中に希釈して、確実に希釈サンプル中のｐＨを７とした。アッセイを、２０μｌの希釈酵素サンプルを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、８０μｌの基質処理溶液を添加することにより行った。溶液を混合し、室温で１分プレインキュベートし、ＯＤ４０５ｎｍで５分間にわたって２０秒毎に吸収を計測する。
時間依存吸収曲線の傾斜（吸光度／分）は、所与の一連の条件下で、対象のα−アミラーゼの特異活性（活性／ｍｇ酵素）と直接的に比例する。アミラーゼサンプルは、傾斜が０．４吸光度単位／分未満であるレベルまで希釈するべきである。
ランドリー用自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）
ランドリーにおける洗浄性能を評価するために、自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を用いて洗濯実験を実施する。ＡＭＳＡでは、大量の小容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験可能である。ＡＭＳＡプレートは、テスト溶液用の多数のスロットと、洗浄されるランドリーサンプルである生地をすべてのスロット開口部に対してしっかりと押し込む蓋とを有する。洗浄時間の間、プレート、テスト溶液、生地および蓋を激しく振盪してテスト溶液と生地とを接触させ、規則正しい周期的な振動で機械的応力を加える。さらなる説明については、国際公開第０２／４２７４０号パンフレット、特に第２３〜２４頁の段落「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照のこと。
一般的な洗浄性能の説明
水（１０°ｄＨ）、洗剤（例えば、以下に記載の欧州製の液体洗剤５．１ｇ／Ｌ）および本発明の酵素（例えば０、０．８および／または１．２ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度）を含むテスト溶液を調製する。デンプン（例えば、Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製のＣＳ−２８）で汚れた布地を加え、および、２０℃で２０分間洗浄した。水道からの流水で完全にすすぎ、暗中で乾燥させた後、洗浄性能の尺度として、汚れた布地の光強度または反射率値をその後に計測する。０ｍｇ酵素タンパク質／Ｌでのテストをブランクとして用いてΔレミッション値を得た。洗浄ステップの最中には、例えば洗浄溶液を布地と振盪、回転または攪拌する形態で機械的作用が加えられることが好ましい。
ＡＭＳＡ洗浄性能実験を以下に特定した実験条件下で実施した。
Figure 2020506698
アミラーゼ希釈緩衝剤：アミラーゼは、保管中のアミラーゼを安定化させる低濃度のカルシウム（０．１ｍＭ）、ならびに、容器およびピペットに酵素タンパク質が吸着する恐れを低減させる０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）で希釈した。
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３ −＝３：１：４．５）をテスト系に添加することにより水硬度を１０°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
洗浄性能は、洗浄した生地の色の輝度として計測される。輝度はまた、白色の光を照射した際のサンプルからの反射光の強度として表されることが可能である。サンプルが汚れている場合、きれいなサンプルのものよりも反射光の強度は低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能である。
色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（Ｋｏｄａｋ ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ，Ｍｉｄｔａｇｅｒ ２９，ＤＫ−２６０５ Ｂｒｏｎｄｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で行われる。
スキャンしたイメージからの光強度の値を抽出するために、イメージからの２４ビットピクセル値をレッド、グリーンおよびブルー（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
Figure 2020506698
異なる変異体のＡＭＳＡランドリーテストの結果が表１および２に示されている。結果において、指数は１００である。親α−アミラーゼの性能結果が１００の値とされ、変異体の結果がこの値と比較される。
ＴＯＭ洗浄性能
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＮＡＨＣＯ３の添加により、以下に記載の強度に水硬度を調節した。洗浄溶液を、以下に記載のとおり、バケツ中に、所望の量の洗剤、温度および水硬度で調製した。洗剤を１０分間の磁気攪拌の最中に溶解させた。（洗浄溶液は、調製後３０〜６０分以内に用いた）。
Ｔｅｒｇ−Ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ中の水浴中の温度および回転（ｒｐｍ）は、以下の表２の設定に従って設定した。設定に従って温度を調節した場合（許容誤差は＋／−０．５℃）、洗浄溶液は以下に記載した量に従ってＴＯＭビーカに添加した。
ビーカ中における撹拌は２００ｒｐｍであった。２枚の手製の米デンプン布きれ（ＨＭ ＣＳ−２８）、２枚の手製のタピオカデンプン布きれ（ＨＭ ＣＳ−２９）およびバラストをビーカの各々に加え、以下に示す時間に従って洗浄を行った。布きれを冷たい水道水で５分間すすぎ、洗浄バッグ中に入れ、洗濯機（ＡＥＧ ＯＥＫＯ ＬＡＶＡＭＡＴ ８６８２０）中において「ＳＴＩＶＮ」プログラムですすいだ。布きれを仕分けし、フィルタ紙に挟んで乾燥器中において、一晩、加熱をせずに静置して乾燥させた。
生地サンプルＨＭ ＣＳ−２８（綿上の米デンプン、５×５ｃｍ、デンプン直径２．５ｃｍの円形に適用した）およびＨＭ ＣＳ−２９（綿上のタピオカデンプン、５×５ｃｍ、デンプン直径２．５ｃｍの円形に適用した）を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手した。
白色の綿メリヤスをバラストとして用い、これは、Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ Ｌｔｄ，Ｕｎｉｔ ５５，Ｃｏｎｓｅｔｔ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｃｏｎｓｅｔｔ，Ｃｏｕｎｔｙ Ｄｕｒｈａｍ，ＤＨ８ ６ＢＮ ＵＫから入手した。
Figure 2020506698
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洗浄性能を、レミッション値で表した洗浄した生地の色の輝度として計測した（ＲＥＭ）。レミッション計測は、Ｍａｃｂｅｔｈ ７０００ Ｃｏｌｏｒ Ｅｙｅ分光測光計を用いて行った。乾燥した布きれの各々を計測した。バックグラウンドからの干渉の恐れがあるため、レミッションの計測中は、２層の布地の上に布きれを置いた。レミッションは４６０ｎｍで計測した。ＵＶフィルタは用いなかった。布きれに対するレミッションの平均結果を算出した。
異なる変異体の洗浄性能は表５において改善度（ＩＦ）として示し、これは以下に示すとおり算出される。
Figure 2020506698
実施例１
自動機械式応力アッセイを用いるα−アミラーゼの洗浄性能
洗剤ベース組成物中のα−アミラーゼの洗浄性能を評価するために、自動機械式応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を用いて洗浄実験を行ってもよい。ＡＭＳＡテストでは、大量の小容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験可能である。ＡＭＳＡプレートは、テスト溶液用の多数のスロットと、洗浄されるランドリーサンプルである生地の布きれをすべてのスロット開口部に対してしっかりと押し込む蓋とを有する。洗浄時間の間、プレート、テスト溶液、生地および蓋を激しく振盪してテスト溶液と生地とを接触させ、規則正しい周期的な振動で機械的応力を加える。さらなる記載については、国際公開第０２／４２７４０号パンフレット（特に、第２３〜２４ページの段落「特別な方法の実施形態」）を参照のこと。
一般的な洗浄性能の説明
水（６°ｄＨまたは１５°ｄＨ）、０．７９ｇ／Ｌの洗剤（例えば、以下に記載のとおりモデル洗剤Ｊ）、および、０または０．２ｍｇ酵素タンパク質／Ｌの濃度の本発明の酵素を含むテスト溶液を調製する。デンプンで汚れた布（Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製のＣＳ−２８）を加え、２０℃および４０℃で１０分間洗浄し、または、代わりに、実施例に記載されているとおり、２０℃および３０℃で１０分間洗浄する。水道からの流水で完全にすすぎ、暗中で乾燥させた後、洗浄性能の尺度として、汚れた布地の光強度値をその後に計測する。０ｍｇ酵素タンパク質／Ｌでのテストをブランクとして用い、洗剤による寄与と相関させる。洗浄ステップの最中には、例えば洗浄溶液を布地と振盪、回転または攪拌する形態で機械的作用が加えられることが好ましい。ＡＭＳＡ洗浄性能実験は以下に特定されている実験条件下で実施し得る。
Figure 2020506698
Figure 2020506698
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３−＝２：１：４．５）をテスト系に添加することにより、水硬度を６°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
Figure 2020506698
Figure 2020506698
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３−＝４：１：７．５）をテスト系に添加することにより、水硬度を１５°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
Figure 2020506698
Figure 2020506698
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３−＝４：１：７．５）をテスト系に添加することにより、水硬度を１５°ｄＨに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
洗浄性能は、白色光を照射した際におけるサンプルから反射した光の強度として表される輝度として計測される。サンプルが汚れている場合、きれいなサンプルからのものよりも反射光の強度は低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能である。
色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（ＥＰＳＯＮ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ１００００ＸＬ、ＥＰＳＯＮ）で行われる。
スキャンしたイメージから光強度の値を抽出するために、イメージからの４８→２４ビットカラーピクセル値が、レッド、グリーンおよびブルー（ＲＧＢ）の値に変換される。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
Figure 2020506698
本発明に係る変異体の洗浄性能を以下の表に示す。表３は、異なる濃度（０．０５ｍｇ酵素／Ｌの洗剤および０．２ｍｇ酵素／Ｌの洗剤）および異なる温度（２０℃および４０℃）における、モデル洗剤Ａ（表Ｄ）およびＪ（表Ｂ）の洗浄性能を評価するための実験から得られた結果を示す。表４は、異なる濃度（０．０５ｍｇ酵素／Ｌの洗剤および０．２ｍｇ酵素／Ｌの洗剤）および異なる温度（２０℃および４０℃）における、洗剤Ｋ（表Ｆ）の洗浄性能を評価するための実験から得られた結果を示す。
Figure 2020506698
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表１０および表１１から分かるとおり、テストを行った変異体はすべて、テスト条件の少なくとも１つにおいて、基準（配列番号２）と比して向上した洗浄性能を有する。
実施例２−液体洗剤Ｋ中のα−アミラーゼのＴＯＭにおける洗浄性能
テストした変異体および対応する親α−アミラーゼ（配列番号２）の洗浄性能を、上記のとおりＴＯＭスケール洗浄についてテストした。用いた洗剤は洗剤Ｋであった。結果は、（変異体の性能−ブランクの性能）を（親の性能−ブランクの性能）で除したものとして示す。
Figure 2020506698
Figure 2020506698
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本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書に開示されている特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、これは、これらの態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているためである。いずれかの同等の態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本発明の種々の改変形態が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような改変形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。

Claims (21)

  1. 親α−アミラーゼの変異体であって、
    （ｉ）配列番号１に係るアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係る前記アミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を含み、
    （ｉｉ）少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９７％などの少なくとも８０％であるが、１００％未満の配列同一性を、配列番号：１、２、３、４、５、６、７または８に係るアミノ酸配列に対して有し、ならびに
    （ｉｉｉ）α−アミラーゼ活性を有する、
    親α−アミラーゼの変異体。
  2. 前記修飾が欠失または置換である、請求項１に記載の変異体。
  3. 前記変異体が、配列番号１に係る前記アミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する少なくとも１つの位置に修飾を含む、請求項１または２に記載の変異体。
  4. 前記変異体が、配列番号１に係る前記アミノ酸配列の位置１０９、１、７、１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、２８０、２８４、３０４、３２０、３２３、３９１および４７６に対応する少なくとも１つの位置に修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
  5. 前記１つ以上の修飾が置換である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
  6. 前記１つ以上の修飾の少なくとも１つが欠失である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
  7. 前記変異体が、１、１０９および３９１からなる群から選択される少なくとも２つの位置に修飾を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体。
  8. 前記修飾が：Ｘ１＊、Ｘ１Ａ、Ｘ７Ａ、Ｘ７Ｋ、Ｘ７Ｅ、Ｘ７Ｎ、Ｘ７Ｑ、Ｘ７Ｌ、Ｘ７Ｄ、Ｘ１０９Ａ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１４０Ｙ、Ｘ１８１＊、Ｘ１８２＊、Ｘ１８３＊、Ｘ１８４＊、Ｘ１９５Ｆ、Ｘ２０６Ｙ、Ｘ２４３Ｆ、Ｘ２６０Ｇ、Ｘ２８０Ｓ、Ｘ２８４Ｈ、Ｘ２８４Ｒ、Ｘ２８４Ｆ、Ｘ３０４Ｒ、Ｘ３２０Ａ、Ｘ３２０Ｍ、Ｘ３２０Ｔ、Ｘ３２０Ｖ、Ｘ３２０Ｓ、Ｘ３２３Ｎ、Ｘ３２３Ｒ、Ｘ３２３Ｓ、Ｘ３２３Ｋ、Ｘ３９１Ａ、Ｘ３９１ＶおよびＸ４７６Ｋからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
  9. 前記変異体が、向上した洗浄性能などの向上した性能を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異体。
  10. 前記変異体が、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を、前記親α−アミラーゼの前記アミノ酸配列に対して有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異体。
  11. 修飾の数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の修飾など、例えば１〜２０、例えば１〜１０および１〜５といった１〜３０の修飾である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体。
  12. 前記変異体が：Ｘ１＋Ｘ７；Ｘ１＋Ｘ１０９；Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１；Ｘ７＋Ｘ１０９；Ｘ７＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１；Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ２８０＋Ｘ３９１；Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ２８４＋Ｘ３９１；Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３２０＋Ｘ３９１；および、Ｘ３２３＋Ｘ３９１からなる位置の群から選択される位置に修飾を含み、ここで、番号は配列番号１に従う、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異体。
  13. 前記変異体が：
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｅ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｎ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｑ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｌ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｄ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｍ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｔ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｖ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ｖ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｋ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ｓ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｇ７Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ；
    Ｇ７Ａ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ；
    Ｋ３２０Ａ；
    Ｇ７Ａ＋Ｋ３２０Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；および
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ
    からなる群から選択される、配列番号２に係る前記アミノ酸配列の位置に対応する位置に修飾を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体。
  14. 前記親α−アミラーゼが、配列番号：１、２、３、４、５、６、７および８に係る前記アミノ酸配列から選択されるか、または、配列番号：１および２に係る前記アミノ酸配列のいずれかに対して、少なくとも９０％、少なくとも９２％など、少なくとも９５％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、もしくは、１００％の配列同一性を有するいずれかのα−アミラーゼから選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の変異体。
  15. 前記親α−アミラーゼが、配列番号１および２に係る前記アミノ酸配列を含むか、または、これらからなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体。
  16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記変異体をコードするポリヌクレオチド。
  17. 請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
  18. 請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  19. 請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  20. α−アミラーゼ変異体を生成する方法であって：
    ａ．前記変異体の発現に好適な条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養するステップ；および
    ｂ．前記変異体を回収するステップ
    を含む方法。
  21. α−アミラーゼ変異体を入手する方法であって、親α−アミラーゼに、配列番号１に係る前記アミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３および３９１に対応する１つ以上の位置、および、任意選択により、配列番号１に係る前記アミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６に対応する１つ以上の位置に修飾を導入するステップであって、各修飾が独立して置換または欠失であり、および、前記変異体がα−アミラーゼ活性を有するステップ；ならびに、前記変異体を回収するステップを含む方法。
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