JP2020503892A - 三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデル、該モデルの作製方法、並びに、吸入可能製品の感作作用を測定及び／又は予測するためのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、本質的に、以下の４つの細胞型を含む三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルに関する：（肺産生）表面活性物質を分泌できる肺胞ＩＩ型上皮細胞；透過性障壁を提供する毛細血管の内壁を形成する内皮細胞；自然免疫と適応免疫を結び付ける未分化ＴＨＰ−１などの樹状様細胞；及び、食作用による異物の摂取により防御機構に関与できるマクロファージ様細胞。また本発明は、前記モデルを作製する方法に関し、さらに、肺の肺胞障壁における粒子又は分子などの吸入可能製品の刺激性又は毒性を評価するための、並びに肺の肺胞障壁における粒子又は分子などの吸入可能製品の感作作用を測定及び／又は予測するためのその使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデル及び該モデルの作製方法に関する。

また本発明は、肺の肺胞障壁（ａｌｖｅｏｌａｒ ｂａｒｒｉｅｒ）における粒子又は分子などの吸入可能製品の刺激性又は毒性を評価するための、並びに、肺の肺胞障壁における粒子又は分子などの吸入可能製品の感作作用を測定及び／又は予測するためのその使用及び方法に関する。

化学製品への曝露の結果として、呼吸器感作は過去数十年にわたって増加しており、罹患率の増加をもたらしている。合成化合物のより広範な用途、例えば、香料や工業用溶剤は、我々が日常的にさらされる可能性のある物質の飛躍的な増加をもたらす結果となった。これらの物質のいくつかは、呼吸器感作を誘発することが知られており、これは、それらが時間の経過とともに、有害な全身作用の可能性を有するアレルギーの発症を引き起こし得ることを意味する。

これは、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻結膜炎及び副鼻腔炎などの呼吸器疾患を引き起こし得る。

これらの化学物質の潜在的なリスクを明らかにするために、肺感作に関与するメカニズムを十分に理解することが必要である。

以前は、動物実験は呼吸器アレルギーの発症に関与するメカニズムの理解に有用な結果を提供していた。しかし、関与する細胞作用の機構的理解はまだ限られている。アレルゲンの機能的及び構造的特徴を識別及び同定するいくつかの方法が提案されているが、これらの研究のいずれも、主に生体及び環境を混乱させる補因子のために決定的な結果をもたらさなかった。この知識の欠如は、予測的ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの開発を妨げ、ｉｎ ｖｉｖｏモデルを、呼吸器アレルゲンを明らかにするための唯一の手段として残す。しかしながら、呼吸器感作物質を同定し明らかにするための有効な方法がないにもかかわらず、ＲＥＡＣＨ（登録、評価、認可及び化学物質の制限）などの規制は、毒性学的評価のために動物を使用しない方法の使用を要求し奨励する。

現在、呼吸器感作物質として作用する化学物質の可能性を特定し、明らかにすることができるｉｎ ｖｉｖｏ試験の代替として使用できる有効なｉｎ ｖｉｔｒｏ法はない。

２０１３年の刊行物（非特許文献１）では、著者らは、肺胞ＩＩ型上皮細胞株（Ａ４５９）、分化マクロファージ様細胞（ＴＨＰ−１）、肥満細胞（ＨＭＣ−１）及び内皮細胞（ＥＡ．ｈｙ９２６）から成る四者培養モデル（ｔｅｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ）を提案した。これにより、モデルを気液界面（ＡＬＩ）で曝露することが可能になった。しかしながら、細胞は浸漬条件（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の下で不均質なコロニーを形成することが観察された。これは、例えばＲＯＳ（活性酸素種）産生及びＩＬ−８分泌についての結果において観察された作用の過大評価をもたらす。さらに、Ｋｌｅｉｎのモデルは、関連するコンピテント細胞がないため、感作作用の評価に使用できない。また孔のサイズが小さいため、膜を通過する細胞移動ができない。ＡＬＩでの曝露は培養においてプライミング効果を有し、インキュベーター制御と比較して、より高い基本レベルの酸化ストレスを示す。これにより、外的課題に対するより生理学的な回答が得られる。これは毒物学的影響のより現実的な予測を提供する。さらに、ＡＬＩでの曝露は、調査している化学物質と相互作用する多くの生体分子を含む細胞培地中で事前に希釈することなく、外因性化合物への実際的な曝露を可能にする。したがって、予測できないほどの生物学的影響の過小評価又は過大評価につながる生物学的作用の情報を変更する可能性がある。

これまでに呼吸毒物学について提案されている以前の全てのモデルは、通常、気管支細胞株を使用しており、呼吸器感作の事情とは無関係である。したがって、呼吸器感作を研究し、吸入可能な化学物質と小粒子の呼吸に関する潜在性を予測するための関連する方法が必要である。

Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎｄ Ｆｉｂｒｅ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１３，１０：３１

本発明の第１の目的は、吸入可能製品、化学物質並びに粒子の呼吸器感作性を評価するために、肺の肺胞表面を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを提供することである。

本発明は、以下の４つの細胞型を主に含む三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルに関する：
ａ）（肺産生）表面活性物質を分泌できる肺胞ＩＩ型上皮細胞；
ｂ）透過性障壁を提供する毛細血管の内壁を形成する内皮細胞；
ｃ）（自然免疫と適応免疫を結び付ける）樹状様細胞；
ｄ）食作用による異物の摂取により防御機構に関与できるマクロファージ様細胞。

ここで、前記三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルは、気液界面に曝露された頂端部コンパートメント（ａｐｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）と培地に浸漬された側底部コンパートメント（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）にウェルを分離する多孔質膜を備えた培養ウェルの形態であり；前記上皮細胞及び前記マクロファージ様細胞は頂端部コンパートメントに存在し；前記内皮細胞及び前記樹状様細胞は側底部コンパートメントに存在し、培地に浸漬され；前記多孔質膜は２〜１０μｍに含まれる孔を有し、側底部コンパートメントから頂端部コンパートメントへの樹状様細胞の移動を可能にする。

本明細書では、「主に」とは、前記肺胞モデルが本質的に上記の４つの細胞型を含むこと、特に前記肺胞モデルが誤った結果をもたらし得る肥満細胞を含まないことを意味する。

「本質的に」とは、特に前記モデルが肥満細胞を含まないことを意味する。これは吸入可能製品の毒性又は感作作用の評価において誤った結果をもたらす可能性がある。

より具体的には、マクロファージ様細胞は、ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート）又は１，２５ジヒドロキシビタミン Ｄ３で分化した、好ましくはＰＭＡで分化したＴＨＰ−１細胞である。この分化は、好ましくは数日間（有利には３〜１０日間、また好適には５日間）の間に行われる。

本発明のモデルにおいて、全ての細胞は初代細胞よりも安定な細胞である不死化哺乳動物細胞株であり、そして好ましくは不死化ヒト細胞株である。

「好ましくは」、前記肺胞ＩＩ型上皮細胞はＡ５４９細胞である。

また「好ましくは」、前記内皮細胞はＥＡ．ｈｙ９２６細胞である。

また「好ましくは」、前記樹状様細胞は、未分化ＴＨＰ−１細胞である。これはヒト樹状細胞について十分に確立されたモデルである。

樹状細胞は、感作過程において中心的に重要である。これらの細胞は、免疫応答を引き起こす抗原の認識と捕獲が委ねられているからである。

有利には、本発明の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルは以下を含み：
ａ）肺胞ＩＩ型上皮細胞としてのＡ５４９細胞；
ｂ）内皮細胞としてのＥＡ．ｈｙ９２６細胞；
ｃ）樹状様細胞としての未分化ＴＨＰ−１細胞；
ｄ）マクロファージ様細胞としての、ＰＭＡで分化したＴＨＰ−１細胞；
そして、肥満細胞を含まない。

本発明の好ましい実施形態では、本発明の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルは、もっぱら以下の四者培養から成る；
ａ）肺胞ＩＩ型上皮細胞としてのＡ５４９細胞；
ｂ）内皮細胞としてのＥＡ．ｈｙ９２６細胞；
ｃ）樹状様細胞としての未分化ＴＨＰ−１細胞。；
ｄ）マクロファージ様細胞としての、ＰＭＡで分化したＴＨＰ−１細胞。

Ｋｌｅｉｎ ２０１３の四者培養モデルと比較すると、本モデルは局所的な微小環境を変化させ、樹状様細胞の応答に影響する可能性がある肥満細胞を除外する。したがって、本モデルは、肥満細胞がアレルギー性炎症の段階（誘導相）の間にのみ存在し、アレルギー性炎症に先行する感作相の間には存在しないｉｎ ｖｉｖｏの状況をより正確に模倣する。肥満細胞は様々な生物学的刺激に反応しており、そのうち最も重要なものはＢリンパ球による免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の放出である。Ｂリンパ球は本発明のモデルには存在せず、さらにＨＭＣ−１細胞はＩｇＥに対する機能的受容体を供さないので、本モデルに肥満細胞を含めると、付加的な価値はもたらさずに、不必要な複雑さが増すのみである。

頂端部コンパートメントと側底部コンパートメントを分離する多孔質膜は、例えばＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）インサートの一部であってもよい。

有利には、多孔質膜は、３〜８μｍ、より好ましくは４〜６μｍに含まれる孔を有する。Ｋｌｅｉｎのモデルでは、樹状細胞は四者培養には存在せず、そして当然に頂端部コンパートメントには存在できなかった。Ｋｌｅｉｎのモデルにおける樹状細胞の非存在は、そのモデルが呼吸器感作を予測することを不可能とした。樹状細胞は、感作プロセスの誘導相において極めて重要であり、それらが存在しない場合、プロセス全体を研究することはできない。

樹状様細胞が側底部コンパートメントから頂端部コンパートメントへ移動する能力もまた当該モデルの重要な特徴である（これはＫｌｅｉｎのモデルでは不可能であった）。樹状細胞は肺胞には本来存在しないため、外因性の刺激の結果としてのみ採用される。また、感作性の実際的な予測を得るためには、最初に上皮及び常在マクロファージと接触して入るべき感作物質に、樹状様細胞が直接曝露されないことが重要である。この接触は、上皮細胞又はマクロファージによる代謝過程のために、吸入された物質の感作性を増強又は低下させる可能性がある。

また本発明は、多孔質膜を有するインサート中で細胞ａ）〜ｄ）を共培養することを含む、上記の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルを以下の工程順で作製する方法に関する：
ｉ）２〜１０μｍに含まれる孔を有する膜インサートの下面（側底側となる）に、内皮細胞を０．２４×１０^５〜０．６×１０^５細胞／ｃｍ^２で播種する工程；
ｉｉ）少なくとも４時間後、該膜インサートの反対側（頂端側）に、肺胞ＩＩ型上皮細胞を好ましくは０．１２×１０^５〜１．２×１０^５、好ましくは０．５×１０^５〜１．０×１０^５細胞／ｃｍ^２で播種する工程；
ｉｉｉ）約４日後、０．１〜１００万個の樹状様細胞／ｍＬを含有する細胞懸濁液を膜インサートの側底側に添加する工程；次いで、
ｉｖ）該肺胞ＩＩ型上皮細胞種の上に、マクロファージ様細胞を好ましくは０．１２×１０^５〜１．２×１０^５マクロファージ様細胞／ｃｍ^２で添加する工程；最後に、
ｖ）前記内皮細胞及び前記樹状様細胞が（側底部コンパートメントに存在して）共培養培地に浸漬するように、そして前記上皮細胞及び前記マクロファージ様細胞が気液界面（ＡＬＩ）の頂端部コンパートメントに存在するように、培地に膜インサートを導入する工程。

好ましくは、上記方法において、前記マクロファージ様細胞はＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート）で分化したＴＨＰ−１細胞であり、及び／又は前記肺胞ＩＩ型上皮細胞はＡ５４９細胞であり、及び／又は前記内皮細胞はＥＡ．ｈｙ９２６細胞であり、及び／又は前記樹状様細胞は未分化ＴＨＰ−１細胞である。

本発明の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルは、特に以下の興味深い用途を見出す：
−肺の肺胞障壁における粒子又は分子などの吸入可能製品の刺激性又は毒性を評価するための使用；
−肺の肺胞障壁における粒子又は分子などの吸入可能製品の感作作用を測定及び／又は予測するための使用。

また本発明は、肺の肺胞障壁における粒子又は分子などの吸入可能製品の感作作用及び／又は刺激性もしくは毒性を測定及び／又は予測するための方法に関し、以下を含む：
Ａ）２〜１０μｍに含まれる孔を有する多孔質膜を備えた培養ウェルの形態の請求項１〜８のいずれか一項に記載の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルの頂端部コンパートメント上で試験される吸入可能製品を粉砕／噴霧することにより曝露する工程（前記上皮細胞及び前記マクロファージ様細胞は膜の頂端側に存在し、前記内皮細胞及び前記樹状様細胞は膜の側底側に存在し、前記内皮細胞及び前記樹状様細胞は共培養培地に浸漬されており、前記曝露は樹状様細胞の活性化をもたらす）；
Ｂ）前記活性化樹状様細胞をＴリンパ芽球細胞株と共培養する工程。

好ましくは、試験される製品が呼吸器感作物質と疑われる場合、Ｔ細胞は２型ヘルパー（ＴＨ２）プロファイルを示すべきである。

呼吸器感作性のマーカーは、ＦＡＣＳ（例えば、ＣＤ４０，ＣＤ５４，ＣＤ８６，ＴＳＬＰｒ，ＩＬ−１ｒａ，ＯＸ４０Ｌなど）及び／又はＥＬＩＳＡ（ＴＳＬＰ，ＩＬ−３３，ＩＬ−２５，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＣＰ−１，ＭＩＰ−３ａ，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−１０及びＧＭ−ＣＳＦ）によって測定することができる。

さらなる生物学的評価項目、例えば、インターロイキンの放出、遺伝毒性、感作のバイオマーカー、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、代謝活性化も測定することができる。

本発明の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルは、以下の主な利点を示す：
−誤った結果を引き起こす可能性がある肥満細胞の非存在；
−試験される材料として気体、液体又は粉末を用いた、気液界面（ＡＬＩ）での曝露の実現性；
−刺激性のみに使用できるＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１３モデルとは逆に、それらの炎症性又は感作性の両特性についての化学物質と粒子の試験の実現性；
−多数の生物学的評価項目（例えば、インターロイキンの放出、遺伝毒性、感作のバイオマーカー、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、代謝活性化の測定など）の実現性。

本発明の肺モデルのさらなる利点及び態様は、添付の図面を参照しながら、後述の実施例の部に提示される実施形態の説明から推論することができる。

図１は、肺モデルに相当する本発明の四者培養とＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）インサートの概略図である。 図２Ａ〜２Ｅは、ＨＤＭに２４時間曝露した後の四者培養肺モデルにおけるＴＨＰ−１細胞の細胞表面上のそれぞれの細胞表面マーカーＣＤ８６，ＣＤ４０，ＩＬ７ｒａ，ＣＤ５４及びＯＸ４０Ｌの発現を示すヒストグラムである。 図３Ａ及び３Ｂは、様々な濃度の化学的呼吸器感作物質、無水トリメリット酸（ＴＭＡ）及び無水フタル酸（ＰＡ）にそれぞれ２４時間及び４８時間曝露した後の生存率％を表す図である。 図４Ａ，４Ｂ及び４Ｃは、様々な濃度の化学的呼吸器刺激物質、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アクロレイン（Ａｃｒ）及びサリチル酸メチル（ＭｅＳａ）にそれぞれ２４時間及び４８時間曝露した後の生存率％を示す図である。 図５Ａ及び５Ｂは、感作物質及び刺激物質に２４時間曝露した後の、本発明による四者培養ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺モデル（Ａ）及び本発明の一部を形成していない単一培養モデル（Ｂ）におけるＴＨＰ−１細胞上のＣＤ５４の細胞表面マーカー発現を示す図である（平均値±標準誤差）。 図６Ａ及び６Ｂは、感作物質及び刺激物質に２４時間曝露した後の、本発明による四者培養ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺モデル（Ａ）及び本発明の一部を形成していない単一培養モデル（Ｂ）におけるＴＨＰ−１細胞上のＣＤ８６の細胞表面マーカー発現を示す図である（平均値±標準誤差）。 図７は、感作物質及び刺激物質に２４時間曝露した後の、本発明による四者培養ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺モデルにおけるＴＨＰ−１細胞上のＩＬｒａの細胞表面マーカー発現を示す図である（平均値±標準誤差）。 図８は、感作物質及び刺激物質に２４時間曝露した後の、本発明による四者培養ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺モデルにおけるＴＨＰ−１細胞上のＯＸ４０Ｌの細胞表面マーカー発現を示す図である（平均値±標準誤差）。 図９は、感作物質及び刺激物質に２４時間曝露した後の、本発明による四者培養ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺モデルにおけるＴＨＰ−１細胞上のＴＳＬＰｒの細胞表面マーカー発現を示す図である（平均値±標準誤差）。 図１０Ａ及び１０Ｂは、化学的感作物質及び刺激物質に２４時間及び４８時間曝露した後の、本発明による四者培養ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺モデルにおいて放出されたサイトカインを示す図である。（Ａ）：ＩＬ−７基礎レベル値：ＤＭＳＯ基礎レベル値２４時間：１８．２±０．０ｐｇ／ｍＬ；４８時間：１９．５±１．２ｐｇ／ｍＬ；水２４時間：１８．６±０．３ｐｇ／ｍＬ；４８時間：１８．２±０．０ｐｇ／ｍＬ（Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ基礎レベル値：ＤＭＳＯ基礎レベル値：ＤＭＳＯ：２４時間：３２．４±６．０ｐｇ／ｍＬ；４８時間：３１．０±３．７ｐｇ／ｍＬ；水：２４時間：４７．０±９．２ｐｇ／ｍＬ；４８時間：４３．１±５．４ｐｇ／ｍＬ（平均値±ＳＥ）（文字は有意差を示す（有意水準Ｐ＜０．０５，ｎ＝６での要因分散分析（Ｆａｃｔｏｒｉａｌ ＡＮＯＶＡ）＋Ｆｉｓｈｅｒ ＬＳＤ事後検定） 図１１Ａ及び１１Ｂは、浸漬条件下での単一培養におけるＰＡ（図１１Ａ）及びＴＭＡ（図１１Ｂ）への２４時間の曝露後のＴＨ−１細胞の生存率を示す図である。この図において、最も高い試験濃度は、０．２％のＤＭＳＯを含有する培地中の化合物の最大溶解度を表す。

実施例１
当該実施例において、以下の細胞株を使用する：Ａ５４９、ＥＡ．ｈｙ９２６、ＴＨＰ−１及びＭΦ−ＴＨＰ−１。これらの各々の特徴は以下の通りである：
細胞株Ａ５４９は、表面活性物質を産生する能力を有するヒト気管支上皮細胞に相当する；
細胞株ＥＡ．ｈｙ９２６は、内皮の特徴を有する体細胞雑種である；
ＴＨＰ−１はヒト単球性白血病細胞株である；そして、
ＭΦ−ＴＨＰ−１は、ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート）又は１，２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３で分化した、ＴＨＰ−１細胞由来のマクロファージである。

様々な培地の作製：
使用されたプロトコルは以下の通りである：
ＥＡ．ｈｙ９２６培地：
−新しいボトル（５００ｍＬ）から６０ｍＬのＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）を取り出し、５０ｍＬのＦＢＳ（１０％）を加え、次に５ｍＬのＨＥＰＥＳストック溶液（２５０ｍＭ；滅菌済み、ろ過済み）を加え、ＨＥＰＥＳ緩衝培地（２５ｍＭ）を得る；
−５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）と共に保存する。

共培養１０％培地（Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ １０％ ｍｅｄｉｕｍ）：
−新しいボトル（５００ｍＬ）から５ｍＬのＤＭＥＭ培地を取り出し、５ｍＬのＨＥＰＥＳストック溶液（２５０ｍＭ；滅菌済み、ろ過済み）を加え、ＨＥＰＥＳ緩衝培地（２５ｍＭ）を得る；
−混合し、１２５ｍＬを取り出す；
−５０ｍＬのＩＭＤＭを加え、次に７５ｍＬのＲＰＭＩ培地を加える；
−混合し、５５ｍＬを取り出す；
−その後、培地に５０ｍＬのＦＢＳ（１０％）と５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加える。

共培養１％培地（Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ １％ ｍｅｄｉｕｍ）：
−新しいボトルから５ｍＬのＤＭＥＭ培地を取り出し、５ｍＬのＨＥＰＥＳストック溶液（２５０ｍＭ；滅菌済み、ろ過済み）を加え、ＨＥＰＥＳ緩衝培地（２５ｍＭ）を得る；
−混合し、１２５ｍＬを取り出す；
−５０ｍＬのＩＭＤＭを加え、次に７５ｍＬのＲＰＭＩを加える；
−混合し、１０ｍＬを取り出す；
−培地に５ｍＬのＦＢＳ（１％）と５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加える。

ＴＨＰ−１完全培地：
−新しいボトル（５００ｍＬ）から５７．５ｍＬのＲＰＭＩ培地を取り出す。これらの５２．５ｍＬから、１０ｍＬをファルコンチューブに移し、残りの培地を破棄する；
−市販の溶液７μＬを１０ｍＬのＲＰＭＩに加えて、ＲＰＭＩ培地中の１０ｍＭ β−メルカプトエタノールの希釈標準溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を調製し、混合し、２．５ｍＬを培地のボトルに移す；
−培地に５０ｍＬのＦＢＳ（１０％）を加え、次に５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加える。

三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルの作製：
当該実施例において、様々な工程の時系列は以下の通りである：

１．２日前（Ｄａｙ −２）
マクロファージ細胞の分化（オーバーナイト）：
−ＴＨＰ−１細胞をＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート）又は１，２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３を用いてオーバーナイトで分化させ（フラスコＴ１２５当たりＰＭＡ８０μＬ＋培地４０ｍＬ＋細胞１６００万個）、次に、培地を一晩で取り換えながら１〜５日間フラスコ内に保持する。

２．０日目：インサートの播種
ＥＡ．ｈｙ９２６細胞の作製：
−インサート当たり１１万〜５４万個の細胞（０．２４×１０^５〜０．６×１０^５細胞／ｃｍ^２、好ましくは０．２４×１０^５細胞／ｃｍ^２）を加える；
−ここではインサートの播種に必要な量は７００μＬである；
−最初に全てのインサート用の細胞懸濁液を調製し（ピペッティングミスのために、インサート＋２の追加）、細胞懸濁液をよくホモジナイズするために混合する；
−インサートをプレートのウェルの中に正しく置く；
−プレートを戻し、７００μＬのＥＡ．ｈｙ９２６をインサートの下に静かに置く；
−次に、プレートをインキュベーターに入れる。

少なくとも４時間後：
Ａ５４９細胞の作製：
−ここではインサートの播種に必要な量は２ｍＬである；
−Ａ５４９細胞のペレットをＥＡ．ｈｙ９２６培地に再懸濁する：インサート当たり２７万〜５４万個の細胞（０．１２×１０^５〜１．２×１０^５細胞／ｃｍ^２、好ましくは０．６×１０^５細胞／ｃｍ^２）；
−最初に全てのインサート用のＡ５４９細胞の細胞懸濁液を調製する（ＥＡ．ｈｙ９２６培地中に；ピペッティングミスのために、インサート＋２を数に入れる）。細胞懸濁液をよく混合／ホモジナイズする。

播種用のインサートを備えたプレートを作製し、細胞がチューブに沈下するのを防ぐために、細胞をインサートに播種する際に、細胞懸濁液を時々ホモジナイズする：
−プレートを戻し、１．５ｍＬのＥＡ．ｈｙ９２６培地をウェルに加える；
−顕微鏡下で内皮細胞層を確認する；
−インサートに２ｍＬのＡ５４９細胞を添加する。

３．３日目：
インサートプレートの培地の交換：
−インサートの古い培地を取り除き、２ｍＬの共培養１０％培地を加える；
−ウェルの古い培地を取り除き、２ｍＬの共培養１０％培地を加える。

４．４日目：
６ウェルプレート中のＤＣ−ＴＨＰ−１の作製：
−本実施例におけるＤＣ−ＴＨＰ−１細胞 １００万個／ｍＬ（１ｍＬあたり細胞１０万個〜細胞１００万個）の細胞懸濁液を調製する；
−新しいプレートを取り、該新しいプレートの６つのウェルに１ｍＬのＤＣ−ＴＨＰ−１細胞懸濁液を加え（すなわち、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞を回収するのに十分な量）、インサートを古いプレートから新しいプレートに移す。

分化したＴＨＰ−１細胞（ＭΦ−ＴＨＰ−１）：
−細胞をＰＢＳで洗浄する；
−分化したＴＨＰ−１細胞にアクターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）を加えて細胞を剥がし、フラスコを１５分間インキュベーターに入れる；
−３００ｇで５分間遠心し、上清を破棄する；
−ペレットを共培養１％に溶解する；
−細胞をカウントし、本実施例におけるインサート当たり、７００μＬの共培養１％培地中の２７〜５４万個のＭΦ−ＴＨＰ−１細胞（０．１２〜１．２×１０^５細胞／ｃｍ^２、好ましくは０．６×１０^５細胞／ｃｍ^２）をインサートに加える。

少なくとも４時間後：インサートから培地を破棄し、ＡＬＩに切り替える。オーバーナイトのインキュベーション。

上記プロトコルの下で作製した本発明の三次元モデルで試験される吸入可能製品（粒子又は分子）へのインサートの曝露は、図１に示すようにｉｎ ｖｉｔｒｏ肺モデルを用いて１０〜１２時間後（細胞が表面活性物質を産生するのに必要な時間）に行うことができる。

５．５日目：
インサートの曝露の実施例は、予め無菌条件下で洗浄し、３７℃に維持したＶｉｔｒｏｃｅｌｌ（商標）Ｃｌｏｕｄ装置（ヴァルトキルヒ、ドイツ）中で行われる。インサートを装置に入れる。次に、試験する製品の２００〜５００μＬの雲（ｃｌｏｕｄ）がチャンバー内に均一に分布し、表面に沈降し始める。約１０〜３０分後（投入した製品に依存する）、雲は小滴沈降により沈降する。インサート上に堆積する濃度は、ｇ／ｃｍ^２で算出できる。

曝露後、インサートをそれらのプレートに戻し、インキュベーション後（試験する化合物に応じて通常２４時間又は４８時間）、以下の測定を実施することができる。

６．５、６又は７日目：測定
予想される時間と終了点に応じて、曝露後０〜４８時間の生物学的評価項目を実行することができる。

測定される可能性のある生物学的評価項目は、例えば：細胞生存率もしくは細胞毒性、サイトカイン分泌、ＤＣ移動、ＤＣ活性化、マクロファージ食作用、ＥＣ活性化、マクロファージ食作用、免疫細胞化学もしくは免疫蛍光のための染色又はＲＮＡ抽出である。当該リストは限定的なものではない。

７．５日目：ＤＣ単離及びＴ細胞との共培養の実施例
以下を用いたＤＣ単離：
−（活性化ＴＨＰ−１細胞を回収するための）ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ５４及び（ＥＡ．ｈｙ．９２６細胞から細胞を単離するための）ＣＤ１１ａなどのＴ細胞活性化に必要な様々なマーカーを利用し、ＦＡＣＳ（例えばＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）を用いた細胞選別（Ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）。Ｔ細胞との共培養のための十分な細胞を得るために様々なウェルを集める必要があり得る。
−ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ５４及びＣＤ１１ａなどの様々な表面マーカーを利用した磁気ビーズ（例えばダイナビーズ）を用いたポジティブ単離又はネガティブ単離。

Ｔ細胞と活性化ＤＣの共培養：
−Ｔ細胞は、細胞活性化（ＴＣＲ及びＣＤ４）、生存（ＣＤ２８結合Ｂ７．１又はＣＤ８０及びＢ７．２又はＣＤ８６）及び分化を可能にする表面マーカーを示すはずである。

−培地中の共培養細胞：
●１％ＦＢＳを含む共培養（四者培養ＤＣの曝露に使用）
●又は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０（ＴＨＰ−１及びＴ細胞株の両者に使用）
●二次リンパ器官の複雑な組織環境を模倣するために、いくつかの化合物（Ｔ細胞の分化に必要なサイトカインなど）の添加を考慮する必要がある。

−細胞比：わずかなナイーブＴ細胞のみが任意の規定のエピトープを認識することができるので、いくつかの細胞比を試験した（１／１０^６）。表面の抗原を認識するＴ細胞によって発見されることを望んで、ＤＣは多くのＴ細胞と相互作用するはずである。
●Ｔ細胞１０万個に対して１万個のＤＣ（１／１０）
●Ｔ細胞１００万個に対して１万個のＤＣ（１／１００）
●Ｔ細胞１０００万個に対して１万個のＤＣ（１／１０００）

−選択したＴ細胞株に応じて、ＡＴＣＣ／供給業者の継代培養の推奨事項に従って、培地を交換するか、新鮮な培地を添加する（２〜３日ごとに２０〜３０％の量）ことによって培地を補充する必要がある。

評価項目の測定：
サイトカイン分泌（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）と表面マーカーの発現は、２４時間（１日）目の共培養から１２０時間（５日）目の共培養まで、２４時間ごとに測定する必要がある。化合物が呼吸器感作物質である場合、Ｔ細胞は２型ヘルパー（ＴＨ２）プロファイルを示すはずである。

実施例２
実施例１に従って作製したインサートを、Ｖｉｔｒｏｃｅｌｌ（商標）Ｃｌｏｕｄシステム（Ｖｉｔｒｏｃｅｌｌ、ヴァルトキルヒ、ドイツ）を用いて化学化合物及びポジティブコントロールに曝露した。全ての化合物を滅菌生理食塩水及びＰＢＳの１／１（ｖ／ｖ）溶液で希釈した。

ＨＤＭ（ハウスダストダニ）への曝露：
イエダニは喘息及びアレルギー性鼻炎に関連する非常に一般的なアレルゲンである。ｉｎ ｖｉｔｒｏの曝露についてのデータが見つからなかったので、本発明の肺モデルの細胞を曝露する濃度はｉｎ ｖｉｖｏの研究に基づいて決定した。ｉｎ ｖｉｖｏでは、マウスは通常、１μｇのＤｅｒ ｐ１（ＨＤＭの主要タンパク質アレルゲン）を鼻腔内に曝露される。マウスの肺胞表面は８２．２ｃｍ^２であることが分かっていたので、インサートに曝露される濃度は、０．０１μｇ／ｃｍ^２と計算した（４５μｇ／インサート）。

化学物質への曝露：
最初にアラマーブルーアッセイを使用して組織の生存率を測定するために、インサートを化学的呼吸器刺激物質及び感作物質に対するある範囲の濃度に曝露した。アラマーブルーアッセイ（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ａｓｓａｙ）の有効成分であるレサズリンは、細胞透過性の青色の非蛍光化合物である。細胞に入ると、レサズリンはピンク色の高蛍光性のレゾルフィンに還元される。生存細胞はレサズリンをレゾルフィンに連続的に変換する。蛍光は細胞生存率に比例する。

Ｖｉｔｒｏｃｅｌｌ Ｃｌｏｕｄを用いて２４時間及び４８時間化合物に曝露した後、細胞を、共培養１％培地で希釈した４００μＭのアラマーブルーと１時間インキュベートした。

各化合物について細胞生存率を測定した時点で、ＴＨＰ−１ ＤＣの細胞表面マーカーの発現を測定するために約７５％の生存率の濃度を選択した。

四者培養肺モデルを２種類の既知の化学的呼吸器感作物質：無水フタル酸（ＰＡ）又は無水トリメリット酸（ＴＭＡ）及び２種類の既知の呼吸器刺激物質：アクロレイン（Ａｃｒ）、サリチル酸メチル（ＭｅＳａ）又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のいくつかの濃度に曝露した。

フローサイトメトリー測定：
Ｖｉｔｒｏｃｅｌｌ Ｃｌｏｕｄへの曝露の２４時間後及び４８時間後に、ＴＨＰ−１ ＤＣをウェル中の培地中に回収した。３００ｇで５分間遠心分離した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、下記の表１に記載の抗体及び対応するアイソタイプコントロールを用いて染色を行うことにより（製造元の推奨希釈に従った）、抗体の非特異的結合を測定して、観察された染色が人為的な結果（ａｒｔｉｆａｃｔ）ではなく特異的結合によるものであることを確実にした。

細胞毒性について：
ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅの場合、励起波長は４４４ｎｍであり、発光波長は４８０ｎｍである。

相対蛍光強度（ＲＦＩ）をＯＸ４０Ｌ、ＩＬ７ｒａ、ＣＤ４０及びＣＤ８６及びＣＤ５４の発光の指標として使用し、以下の式Ｉによって計算した。

図２Ａ〜２Ｅは、それぞれ、２４時間のＨＤＭへの曝露後の四者培養肺モデルにおけるＴＨＰ−１細胞の細胞表面上の細胞表面マーカーＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＬ７ｒａ、ＣＤ５４及びＯＸ４０Ｌの発現を示す。生細胞上の細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーを用いて測定した。

コントロールと比較して、２４時間のＨＤＭへの曝露後に全てのマーカーが上方制御されることが観察される。したがって、四者培養肺モデルにおけるＴＨＰ−１細胞の細胞表面上のマーカーＩＬ７ｒａ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＣＤ４０、及びＣＤ５４を使用して、化合物の呼吸器感作性を測定することができた。

図３Ａ及び３Ｂの図は、様々な濃度の化学的呼吸器感作物質、無水トリメリット酸（ＴＭＡ）及び無水フタル酸（ＰＡ）にそれぞれ２４時間及び４８時間曝露した後の生存率を示す。

肺胞組織モデルの細胞生存率について用量反応が観察される。

図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃの図は、様々な濃度の化学的呼吸器刺激物質、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びアクロレイン（Ａｃｒ）及びサリチル酸メチル（ＭｅＳａ）にそれぞれ２４時間及び４８時間曝露した後の生存率を示す。

同様に、肺胞組織モデルの細胞生存率について用量反応が観察される。

実施例３
ＰＢＳ、及び、ビヒクルコントロールに応じて滅菌水又は滅菌水＋ＤＭＳＯで希釈した化合物を噴霧するための細胞の送達と曝露には、Ｖｉｔｒｏｃｅｌｌ（商標）Ｃｌｏｕｄシステム（Ｖｉｔｒｏｃｅｌｌ、ヴァルトキルヒ、ドイツ）を用いた。

ハウスダストダニ（ＨＤＭ）、タンパク質Ｂｅｔ ｖ１（追加の既知タンパク質感作物質）及びアクロレイン（Ａｃｒ）は滅菌水で希釈した。無水フタル酸（ＰＡ）、無水トリメリット酸（ＴＭＡ）及びサリチル酸メチル（ＭｅＳａ）はＤＭＳＯで希釈した。

生存率は、上記の実施例２に詳述したプロトコルに従って、曝露の２４時間後及び４８時間後にアラマーブルーアッセイを用いて評価した。

ビヒクルコントロールと比較して相対的に２５％の細胞毒性（７５％の生存率を意味する：ＣＶ７５）をもたらす濃度を、実施例２に示すグラフを用いて決定した。

細胞表面マーカーの発現及び様々なサイトカインの放出を測定するために、上記の実施例１に従って作製したインサートの細胞をＣＶ７５に曝露した。又は生存率が７５％に達することができなかった場合、細胞を化合物の最大溶解度に曝露した。

Ｂｅｔ ｖ１曝露
ｉｎ ｖｉｔｒｏの曝露についてのデータが見つからなかったので、本発明の肺モデルの細胞を曝露する濃度はｉｎ ｖｉｖｏの研究に基づいて決定した。ｉｎ ｖｉｖｏで、マウスを２μｇのｂｅｔ ｖ１（花粉の重要なタンパク質アレルゲン）に曝露した。マウスの肺胞表面は８２．２ｃｍ^２であることが分かっていたので、濃度は、０．０２４μｇ／ｃｍ^２と計算した。

２４時間後及び４８時間後に、ＴＨＰ−１細胞を回収し、染色し、上記実施例２に詳述したプロトコルに従ってフローサイトメーターを用いて分析した。上清をサイトカイン測定用に回収した。

ＨＤＭ及びＢｅｔ ｖ１への曝露後に生存率への影響は観察されなかった。

コントロールと比較して、相対的にＢｅｔ ｖ１への曝露は、２４時間で１００．７％±１．２％、４８時間で８９．５％±４．２％の生存率となった。コントロールと比較して、相対的にＨＤＭへの曝露は、２４時間で１００．０％±０．０３％、４８時間で９５．７％±０．０３％の生存率となった。

同時に、ｈ−ＣＬＡＴ（ヒト細胞株活性化試験）アッセイを用いて得られたデータを再現するために、ＴＨＰ−１細胞を単一培養の浸漬条件下で曝露した。ｈ−ＣＬＡＴアッセイは、樹状細胞を活性化するための化学物質の特性に基づく。該特性は、皮膚感作性及び呼吸器感作性の両方に共通である。ｈ−ＣＬＡＴはヨーロッパレベルで検証されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルである（ＥＣＶＡＭ検証）。

比較の目的で、同様にＣＤ８６及びＣＤ５４細胞表面マーカーの発現もｈ−ＣＬＡＴで評価した。現在、化学物質の皮膚感作性を評価するためにｈ−ＣＬＡＴを使用することが推奨されている。皮膚と肺はＤＣ活性化特性を共有するので、ｈ−ＣＬＡＴは化学物質の呼吸器感作性を評価するためにも使用することが考えられる。念のため、市場で入手可能な呼吸器感作性を評価するための検証されたモデルはまだない。

様々な抗体、蛍光色素及び装置を用いてＣＤ発現を測定したため、ｈ−ＣＬＡＴに関する文献で得られた閾値レベルは、この実施例で測定されたものと比較することはできなかった。

しかしながら、図５は、四者培養（Ａ）及び単一培養（Ｂ）におけるＴＨＰ−１細胞上のＣＤ５４の発現を示す。化学的呼吸器刺激物質（ＰＡ及びＴＭＡ）への曝露後に増加が観察されたが、一方、ビヒクルコントロール（水及びＤＭＳＯ）及び化学的刺激物質（アクロレイン）については、増加は観察されなかった（図５Ａ）。これとは反対に、図５Ｂでは、呼吸器感作物質への曝露後の単一培養では増加は観察されず、刺激物質への曝露後にＣＤ５４発現の増加が測定された。刺激性化学物質アクロレインは感作物質として誤分類された。

図６は、四者培養（Ａ）及び単一培養（Ｂ）におけるＴＨＰ−１細胞上のＣＤ８６の発現を示す。化学的呼吸器刺激物質（ＰＡ及びＴＭＡ）への曝露後に増加が観察されたが、一方、ビヒクルコントロール（水及びＤＭＳＯ）及び化学的刺激物質（アクロレイン）については、増加は観察されなかった（図６Ａ）。これとは反対に、呼吸器感作物質への曝露後の単一培養では増加は観察されず、ＴＭＡ曝露後のＣＤ８６発現はビヒクルコントロールよりもさらに低い（図６Ｂ）。

本発明による三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデル（四者培養）は、化学的呼吸器感作物質及び刺激物質の識別の改善を示す。システムの識別特性を強化するために、追加のマーカーを使用し、呼吸器タンパク質感作物質も試験する化合物のセットに加えた。

図７は、感作物質及び刺激物質に２４時間曝露した後の四者培養におけるＴＨＰ−１細胞上のＩＬ７ｒａの細胞表面マーカー発現を示す。アクロレイン曝露後のＩＬ７ｒａ発現の減少は、刺激物質と感作物質との間の識別マーカーとして使用することができる（種類、化学物質又はタンパク質を問わず）。

図８は、感作物質及び刺激物質に２４時間曝露した後の四者培養におけるＴＨＰ−１細胞上のＯＸ４０Ｌの細胞表面マーカー発現を示す。タンパク質感作物質曝露後のＯＸ４０Ｌ発現の増加は、タンパク質感作物質と化学的刺激物質／感作物質の間の識別マーカーとして使用することができる。

図９は、感作物質及び刺激物質に２４時間曝露した後の四者培養におけるＴＨＰ−１細胞上のＴＳＬＰｒの細胞表面マーカー発現を示す。化学的感作物質曝露後のＴＳＬＰｒ発現の増加は、化学的感作物質と化学的刺激物質／タンパク質感作物質の間の識別マーカーとして使用することができる。

他のパラメータはアクロレインと化学的呼吸器感作物質ＰＡ及びＴＭＡの両方の曝露後にシステムで評価された。

下記の表２は、測定された全てのサイトカインについて得られた結果の概要を示す。表中、「右下方向を指す矢印」はビヒクルコントロールと比較したサイトカイン放出の減少を示し、「右上方向を指す矢印」はビヒクルコントロールと比較したサイトカイン放出の増加を示す。そして「＝」は、曝露とビヒクルコントロールの間に変化が観察されないことを示す。

これらの結果は図１０にも示されており、ビヒクルコントロールと相対的に比較したＩＬ−７（図１０Ａ）とＧＭ−ＣＳＦ（図１０Ｂ）の濃度について、より多くの理解を与える。ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３ａ、ＩＬ−６ ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−１０の放出の増加は、呼吸器感作物質のマーカーとして使用できる。ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−３ａ、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１０の放出の減少は、ＩＬ−７サイトカインの放出の増加と併せて、呼吸器刺激物のマーカーとして使用することができる。

最後に、図１１に示されるように、ＴＭＡ及びＰＡは溶解度が低いために、浸漬条件下での単一培養においてＴＨＰ−１細胞のいかなる細胞毒性にも達することは不可能であることに留意すべきである（図１１Ａ及び１１Ｂ）。一方、これらの化合物に曝露した後、四者培養システムにおいて生存率の低下が観察される（図３Ａ及び３Ｂ）。

本明細書では本発明の特定の特徴のみを図示し説明してきたが、当業者は多くの修正、置換、変更又は均等物に気が付くであろう。すなわち本出願は、本発明の真の精神の範囲内にあるそれらの全ての修正形態及び変更形態を網羅することを意図していることが理解される。

Claims (15)

1. 以下の４つの細胞型：
   ａ）表面活性物質を分泌できる肺胞ＩＩ型上皮細胞；
   ｂ）透過性障壁を提供する毛細血管の内壁を形成する内皮細胞；
   ｃ）樹状様細胞；
   ｄ）食作用による異物の摂取により防御機構に関与できるマクロファージ様細胞；
   を主に含む三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルであって、
   気液界面に曝露された頂端部コンパートメント（ａｐｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）と培地に浸漬された側底部コンパートメント（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）にウェルを分離する多孔質膜を備えた培養ウェルの形態であり、
   前記上皮細胞及び前記マクロファージ様細胞は頂端部コンパートメントに存在し、
   前記内皮細胞及び前記樹状様細胞は側底部コンパートメントに存在し、培地に浸漬され、
   前記多孔質膜は２〜１０μｍに含まれる孔を有し、側底部コンパートメントから頂端部コンパートメントへの樹状様細胞の移動を可能にする、三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデル。
2. マクロファージ様細胞が、ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート）又は１，２５ジヒドロキシビタミン Ｄ３で分化した、好ましくはＰＭＡで分化したＴＨＰ−１細胞である、請求項１に記載のモデル。
3. 全ての細胞が不死化ヒト細胞株である、請求項１又は２に記載のモデル。
4. 前記肺胞ＩＩ型上皮細胞がＡ５４９細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモデル。
5. 前記内皮細胞がＥＡ．ｈｙ９２６細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモデル。
6. 前記樹状様細胞が未分化ＴＨＰ−１細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のモデル。
7. 多孔質膜が３〜８μｍに含まれる孔を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモデル。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルを以下の工程順で作製する方法であって、多孔質膜を有するインサート中で細胞ａ）〜ｄ）を共培養することを含む方法：
   ｉ）２〜１０μｍに含まれる孔を有する膜インサートの下面（側底側となる）に、内皮細胞を０．２４×１０^５〜０．６×１０^５細胞／ｃｍ^２で播種する工程；
   ｉｉ）少なくとも４時間後、該膜インサートの反対側（頂端側）に、肺胞ＩＩ型上皮細胞を好ましくは０．１２×１０^５〜１．２×１０^５、好ましくは０．５×１０^５〜１．０×１０^５細胞／ｃｍ^２で播種する工程；
   ｉｉｉ）約４日後、０．１〜１００万個の樹状様細胞／ｍＬを含有する細胞懸濁液を膜インサートの側底側に添加する工程；次いで、
   ｉｖ）該肺胞ＩＩ型上皮細胞種の上に、マクロファージ様細胞を好ましくは０．１２×１０^５〜１．２×１０^５マクロファージ様細胞／ｃｍ^２で添加する工程；最後に、
   ｖ）前記内皮細胞及び前記樹状様細胞が（側底部コンパートメントに存在して）共培養培地に浸漬するように、そして前記上皮細胞及び前記マクロファージ様細胞が気液界面の頂端部コンパートメントに存在するように、培地に膜インサートを導入する工程。
9. 前記マクロファージ様細胞がＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート）で分化したＴＨＰ−１細胞であり、及び／又は前記肺胞ＩＩ型上皮細胞がＡ５４９細胞であり、及び／又は前記内皮細胞がＥＡ．ｈｙ９２６細胞であり、及び／又は前記樹状様細胞が未分化ＴＨＰ−１細胞である、請求項８に記載の方法。
10. 肺の肺胞障壁における吸入可能製品の刺激性又は毒性を評価するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルの使用。
11. 肺の肺胞障壁における吸入可能製品の感作作用を測定及び／又は予測するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルの使用。
12. 肺の肺胞障壁における吸入可能製品の感作作用及び／又は刺激性もしくは毒性を測定及び／又は予測するための方法であって、以下を含む方法：
    Ａ）２〜１０μｍに含まれる孔を有する多孔質膜を備えた培養ウェルの形態の請求項１〜７のいずれか一項に記載の三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ肺胞モデルの頂端部コンパートメント上で試験される吸入可能製品を粉砕／噴霧することにより曝露する工程であって、
    前記上皮細胞及び前記マクロファージ様細胞は膜の頂端側に存在し、前記内皮細胞及び前記樹状様細胞は膜の側底側に存在し、前記内皮細胞及び前記樹状様細胞は共培養培地に浸漬されており、前記曝露が樹状様細胞の活性化をもたらす工程；
    Ｂ）前記活性化樹状様細胞をＴリンパ芽球細胞株と共培養する工程。
13. 試験される製品が呼吸器感作物質と疑われる場合、Ｔ細胞が２型ヘルパー（ＴＨ２）プロファイルを示す、請求項１２に記載の方法。
14. 呼吸器感作性のマーカーが、ＦＡＣＳ（ＣＤ４０，ＣＤ５４，ＣＤ８６，ＴＳＬＰｒ，ＩＬ−１ｒａ，ＯＸ４０Ｌ）及び／又はＥＬＩＳＡ（ＴＳＬＰ，ＩＬ−３３，ＩＬ−２５，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＣＰ−１，ＭＩＰ−３ａ，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−１０及びＧＭ−ＣＳＦ）によって測定される、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. インターロイキンの放出、遺伝毒性、感作のバイオマーカー、プロテオミクス、トランスクリプトミクス及び代謝活性化を含むさらなる生物学的評価項目が測定される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。