JP2020036547A - Euglena, method for producing wax ester, and wax ester composition - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明は、ワックスエステルを含有するユーグレナ、ワックスエステルの製造方法及びワックスエステル組成物に関する。 The present invention relates to an euglena containing a wax ester, a method for producing a wax ester, and a wax ester composition.
微細藻類の一種であるユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）は、高濃度のＣＯ２が存在する環境でも光合成によって良好に生育する生物である。ユーグレナは好気状態において、光合成や培地成分から獲得した余剰の炭素を、貯蔵多糖パラミロンとして細胞内に蓄積する。パラミロンを蓄積したユーグレナ細胞を、低酸素状態もしくは嫌気状態にさらすと、ユーグレナは、細胞内に貯めたパラミロンを分解して、脂肪酸脂肪アルコールエステルであるワックスエステルを発酵生産する（図１）。 Euglena, a kind of microalgae, is an organism that grows well by photosynthesis even in an environment where a high concentration of CO 2 is present. In an aerobic state, Euglena accumulates extra carbon obtained from photosynthesis and medium components in cells as a storage polysaccharide paramylon. When the Euglena cells that have accumulated paramylon are exposed to hypoxic or anaerobic conditions, Euglena decomposes the paramylon stored in the cells and fermentatively produces wax esters that are fatty acid fatty alcohol esters (FIG. 1).
ワックスエステルの利用法として、現在は主に燃料用途が想定されており、水素化や異性化の後ジェット燃料として使用することや、バイオディーゼル燃料に変換して使用することが期待されている。実用化に向けた研究開発が進められる中で、ワックスエステル生産能力の増強や、用途に合った性質を持つワックスエステルの生産が重要な課題となっている。 Currently, the use of wax esters is mainly expected to be used for fuels, and is expected to be used as jet fuel after hydrogenation or isomerization, or to be converted to biodiesel fuel for use. In the course of research and development for practical use, enhancement of the production capacity of wax esters and production of wax esters having properties suitable for applications have become important issues.
図１の低酸素状態でのユーグレナワックスエステル生産経路において生産されるワックスエステルの構成脂肪酸・脂肪アルコールの主成分は、Ｃ１４のミリスチン酸−ミリスチルアルコール（Ｃ１４：０−Ｃ１４：０）であり（非特許文献１）、Ｃ１０−Ｃ１６程度の構成成分が含まれている。また、炭素数が奇数のワックスエステルも多く存在する。 The main component of the fatty acid / fatty alcohol constituting the wax ester produced in the euglena wax ester production route in the low oxygen state in FIG. 1 is myristic acid-myristyl alcohol of C14 (C14: 0-C14: 0) (non Patent Document 1), and about C10-C16 constituent components are included. Also, there are many wax esters having an odd number of carbon atoms.
ワックスエステルを構成する脂質の組成を、自在に変化させることができれば、従来想定されてきた燃料用途のみならず、化成品や化粧品等、新たな用途を創出できる可能性がある。しかし、ユーグレナがワックスエステルを作るメカニズムには未だ不明な点が多く、全体像は知られているものの、具体的に機能する酵素の分子情報はほとんど明らかになっていない。 If the composition of the lipid constituting the wax ester can be freely changed, there is a possibility that new applications such as chemical products and cosmetics can be created in addition to fuel applications conventionally assumed. However, there are still many unknowns about the mechanism by which Euglena makes wax esters, and although the overall picture is known, the molecular information of enzymes that specifically function is hardly clear.
特許文献１及び非特許文献２には、脂肪酸を伸長する反応を触媒する３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）のうち、中・長鎖脂肪酸を伸長するＫＡＴ（ＥｇＫＡＴ１、ＥｇＫＡＴ２）の発現を抑制することで、細胞内のワックスエステル量をほとんど変化させずに、構成炭素長の短いワックスエステルを生産するユーグレナを作りだすことができたことが記載されている。ワックスエステルを構成する脂肪酸の主成分が、通常のユーグレナで炭素長１４のミリスチン酸であるのに対して、ＥｇＫＡＴ１の発現を抑制したユーグレナでは炭素長１２のラウリン酸および１３のトリデカン酸であった。 Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 2 disclose that among 3-ketoacyl-CoA thiolases (KAT) that catalyze a reaction for elongating fatty acids, the expression of KAT (EgKAT1, EgKAT2) that elongates middle- and long-chain fatty acids is suppressed. It is described that Euglena capable of producing a wax ester having a short constituent carbon length could be produced with almost no change in the amount of the wax ester in the cell. The main components of the fatty acid constituting the wax ester are myristic acid having a carbon length of 14 in ordinary euglena, whereas lauric acid having a carbon length of 12 and tridecanoic acid having a carbon length of 13 were obtained in Euglena in which the expression of EgKAT1 was suppressed. .
従来の方法では、脂質の炭素数の偶数・奇数の制御や、脂質の短鎖化についての検討が行われてきたが、ワックスエステルの長鎖化は困難であった。燃料用途のみならず、化成品や化粧品等、新たな用途を創出のためにも、ユーグレナが生産するワックスエステルを構成する脂質の組成を効果的、且つ、自在に変化させることが望まれる。 In the conventional method, control of the even number and odd number of the carbon number of the lipid and study on shortening of the lipid chain have been studied, but it has been difficult to increase the chain length of the wax ester. It is desired that the composition of the lipid constituting the wax ester produced by Euglena is effectively and freely changed not only for fuel use but also for new uses such as chemical products and cosmetics.
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、鎖長が伸長又は短縮されたワックスエステルを含有するユーグレナ、ワックスエステルの製造方法及びワックスエステル組成物を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide an euglena containing a wax ester having an elongated or shortened chain length, a method for producing a wax ester, and a wax ester composition. It is in.
前記課題は、本発明のユーグレナによれば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されていること、により解決される。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルの鎖長を伸長又は短縮することが可能となる。
The above object is achieved by the euglena of the present invention, in which the expression of an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is suppressed.
Thus, by suppressing the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene, it becomes possible to extend or shorten the chain length of the wax ester contained in Euglena.
このとき、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）又はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であるとよい。
また、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）であり、前記ユーグレナは、ワックスエステルを含有し、該ワックスエステルは、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ないとよい。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子の発現が抑制されているため、ユーグレナのワックスエステルの合成において、より長鎖のワックスエステルを得ることが可能となる。
At this time, the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene may be an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1) or an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3).
Further, the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1), and the euglena contains a wax ester, and the wax ester contains the acyl-CoA dehydrogenase. Compared with wax esters produced by Euglena in which the expression of the (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1) is not suppressed, there are more wax ester compounds having a chain length of 29 to 32 carbon atoms, and 22 to 27 carbon atoms. It is preferred that the wax ester compound having a chain length of
As described above, since the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene is suppressed, a longer-chain wax ester can be obtained in the synthesis of Euglena wax ester.
また、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であり、前記ユーグレナは、ワックスエステルを含有し、該ワックスエステルは、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少なく、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多いとよい。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子の発現が抑制されているため、ユーグレナのワックスエステルの合成において、より短鎖長のワックスエステルを得ることが可能となる。
Further, the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3), the euglena contains a wax ester, and the wax ester contains the acyl-CoA dehydrogenase. Compared with the wax ester produced by Euglena in which the expression of the (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3) is not suppressed, the number of wax ester compounds having a chain length of 29 to 32 is smaller, and the chain length is 22 to 27 carbon atoms. It is good to have many wax ester compounds.
As described above, since the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene is suppressed, it is possible to obtain a wax ester having a shorter chain length in the synthesis of Euglena wax ester.
また、さらに、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）の発現が抑制されているとよい。
また、前記ワックスエステルは、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするとよい。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子及び３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子の発現が抑制されているため、ユーグレナのワックスエステルの合成において、より短鎖長のワックスエステルを得ることが可能となる。
Further, the expression of the 3-ketoacyl CoA thiolase (KAT) 1 gene (SEQ ID NO: 5) may be further suppressed.
Further, the wax ester is preferably composed mainly of a wax ester compound having a chain length of any of 24 to 26 carbon atoms.
Thus, since the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene and the 3-ketoacyl CoA thiolase (KAT) 1 gene is suppressed, a shorter chain-length wax ester is obtained in the synthesis of Euglena wax ester. It becomes possible.
前記課題は、本発明のワックスエステルの製造方法によれば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されたＡＣＤノックダウンユーグレナを培養する培養工程と、前記ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出する抽出工程と、を行うことにより解決される。
このように、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現を抑制して、ユーグレナが含有するワックスエステルの鎖長を伸長又は短縮することで、燃料用途のみならず、化成品や化粧品等に利用できるワックスエステルを製造することが可能となる。
According to the method for producing a wax ester of the present invention, the object is to culture an ACD knockdown euglena in which the expression of an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is suppressed, and to obtain a wax ester from the ACD knockdown euglena. And an extraction step of extracting.
Thus, by suppressing the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene and extending or shortening the chain length of the wax ester contained in Euglena, it can be used not only for fuels but also for chemical products and cosmetics. It becomes possible to produce wax esters.
このとき、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）又はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であるとよい。
また、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）であり、前記抽出工程では、炭素原子数２８〜３０のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出するとよい。
At this time, the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene may be an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1) or an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3).
In addition, the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1), and in the extraction step, a wax having a chain length of any one of 28 to 30 carbon atoms. It is preferable to extract the wax ester containing an ester compound as a main component.
また、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子が、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）であり、前記抽出工程では、炭素原子数２２〜２７のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出するとよい。
また、さらに、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）の発現が抑制されており、前記抽出工程では、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出するとよい。
Further, the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3), and in the extraction step, a wax having a chain length of any one of 22 to 27 carbon atoms. It is preferable to extract the wax ester containing an ester compound as a main component.
Further, the expression of the 3-ketoacyl-CoA thiolase (KAT) 1 gene (SEQ ID NO: 5) is suppressed, and in the extraction step, a wax ester compound having any chain length of 24 to 26 carbon atoms is used. It is preferable to extract the wax ester as a main component.
前記課題は、本発明のワックスエステル組成物によれば、ユーグレナ由来であって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ないこと、により解決される。
前記課題は、本発明のワックスエステル組成物によれば、ユーグレナ由来であって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少なく、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多いこと、により解決される。
The object is, according to the wax ester composition of the present invention, as compared with a wax ester produced by Euglena, which is derived from Euglena and whose expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1) is not suppressed. This is solved by the fact that there are many wax ester compounds having a chain length of 29 to 32 carbon atoms and few wax ester compounds having a chain length of 22 to 27 carbon atoms.
The object is, according to the wax ester composition of the present invention, as compared with a wax ester produced by Euglena, which is derived from Euglena and whose expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3) is not suppressed. This is solved by the fact that the wax ester compound having a chain length of 29 to 32 carbon atoms is small and the wax ester compound having a chain length of 22 to 27 carbon atoms is large.
前記課題は、本発明のユーグレナにおける炭素原子数２９〜３２の長鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法によれば、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うこと、により解決される。 According to the method of the present invention for increasing the content of a long-chain wax ester having 29 to 32 carbon atoms in Euglena according to the present invention, there is provided an EgACD expression level control step of suppressing Euglena acyl-CoA dehydrogenase (EgACD) expression level. Is solved by doing.
前記課題は、本発明のユーグレナにおける炭素原子数２２〜２７の短鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法によれば、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うこと、により解決される。 According to the method of the present invention for increasing the content of a short-chain wax ester having 22 to 27 carbon atoms in Euglena of the present invention, there is provided an EgACD expression level control step for suppressing Euglena acyl-CoA dehydrogenase (EgACD) expression level. Is solved by doing.
前記課題は、本発明のユーグレナにおける炭素原子数２９〜３２の長鎖ワックスエステルを増加させる方法によれば、ユーグレナにおける下記（ａ）又は（ｂ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うこと、により解決される。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
According to the method of the present invention for increasing the number of long-chain wax esters having 29 to 32 carbon atoms in Euglena, an acyl-CoA dehydrogenase having the following amino acid sequence of (a) or (b) in Euglena is provided. The problem is solved by performing an EgACD expression level control step of suppressing the expression level of (EgACD).
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(B) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which has dehydrogenation activity on acyl-CoA
前記課題は、本発明のユーグレナにおける炭素原子数２２〜２７の短鎖ワックスエステルを増加させる方法によれば、ユーグレナにおける下記（ｃ）又は（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うこと、により解決される。
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
According to the method of the present invention for increasing the number of short-chain wax esters having 22 to 27 carbon atoms in Euglena, an acyl-CoA dehydrogenase having the following amino acid sequence (c) or (d) in Euglena is provided. The problem is solved by performing an EgACD expression level control step of suppressing the expression level of (EgACD).
(C) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(D) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, which has dehydrogenation activity on acyl-CoA
本発明によれば、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルの鎖長を伸長又は短縮することができるため、ワックスエステルの組成を効果的、且つ、自在に変化させることが可能となる。その結果、燃料用途のみならず、化成品や化粧品等に利用できるワックスエステルを製造することが可能となる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, since the chain length of the wax ester which Euglena contains can be lengthened or shortened by suppressing the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene of Euglena, the composition of a wax ester is made effective. , And can be changed freely. As a result, it is possible to produce a wax ester that can be used not only for fuels but also for chemical products and cosmetics.
本発明は、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ワックスエステルの製造方法及びワックスエステル組成物に関する。以下、本発明に係るユーグレナ、ワックスエステルの製造方法及びワックスエステル組成物について、詳細に説明する。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
The present invention relates to Euglena, a method for producing a wax ester, and a wax ester composition. Hereinafter, the euglena and the wax ester production method and the wax ester composition according to the present invention will be described in detail.
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are described below.
本明細書において、ワックスエステルとは、脂肪酸と脂肪アルコールがエステル結合した化合物の総称をいう。
また、本明細書において、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、二本鎖ＲＮＡにより配列特異的に遺伝子発現が抑制される現象をいう。
In this specification, the wax ester is a general term for compounds in which a fatty acid and a fatty alcohol are ester-bonded.
In this specification, RNAi (RNA interference) refers to a phenomenon in which gene expression is suppressed in a sequence-specific manner by double-stranded RNA.
＜ユーグレナ＞
本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
<Euglena>
In the present embodiment, “Euglena” includes microorganisms classified in the genus Euglena (Euglena), variants thereof, variants thereof, and closely related species of the Euglenaceae (Euglenaceae).
Here, the genus Euglena is a group of eukaryotes that belong to the species Excavata, Euglenozoa, Euglena Algae, Euglena, Euglena.
ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis
var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astasia longa等のその他のユーグレナ類であってもよい。
Specific examples of the species contained in the genus Euglena include Euglena chadefaudii, Euglena deses, Euglena gracilis, Euglena granulata, Euglena mutabilis, Euglena proxima, Euglena spirogyra, Euglena viridis, and the like.
As Euglena, Euglena gracilis (E. gracilis), in particular, Euglena gracilis Z strain can be used. In addition, Euglena gracilis Z mutant strain SM-ZK strain can be used. (Chloroplast-deficient strain) and a variant of E. gracilis
var. bacillaris, gene mutants such as mutants of chloroplasts of these species, and other euglena species such as Astasia longa.
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
ユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。
The genus Euglena is widely distributed in fresh water such as ponds and swamps, and may be used separately from them, or any genus Euglena that has already been isolated may be used.
Euglena includes all its mutants. These mutants also include those obtained by genetic methods, for example, recombination, transduction, transformation and the like.
＜ユーグレナの低酸素状態におけるワックスエステル生産経路＞
ユーグレナは、図１に示すように、低酸素状態では蓄積したパラミロンを出発物質として、ワックスエステルを発酵生産する。微生物は嫌気状態に曝されると、解糖系から生じる還元力を消費するため発酵を行う。低酸素状態のユーグレナにおいては、ワックスエステル発酵が還元力を消費する役割を担っている。
<Wax ester production route in Euglena in low oxygen condition>
As shown in FIG. 1, Euglena fermentatively produces wax esters using paramylon accumulated in a low oxygen state as a starting material. When microorganisms are exposed to anaerobic conditions, they undergo fermentation to consume the reducing power generated by the glycolysis system. In Euglena in a low oxygen state, wax ester fermentation plays a role of consuming reducing power.
図１に示すように、低酸素状態に曝露されたユーグレナは、パラミロンを分解し、グルコース単位に分解する。その後、解糖を経て生産したピルビン酸はミトコンドリアでアセチルＣｏＡに変換された後ＡＴＰを消費しない図２のｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸合成系を経て、アシルＣｏＡを合成する。アシルＣｏＡはミクロソームに輸送されワックスエステルへと合成されると考えられている。 As shown in FIG. 1, Euglena exposed to hypoxia degrades paramylon and breaks it down into glucose units. After that, pyruvate produced through glycolysis is converted to acetyl-CoA in mitochondria, and then acyl-CoA is synthesized via the de novo fatty acid synthesis system of FIG. 2 which does not consume ATP. Acyl CoA is believed to be transported to microsomes and synthesized into wax esters.
ワックスエステル発酵はユーグレナの持つ独特な代謝系の一つであり、脂肪酸β酸化の逆行反応によるアセチル−ＣｏＡからのｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸合成が含まれている（Inui
et al.,,FEBS LETERS , vol.150, no.1, pp.89-93 (1982)）。この経路はＡＴＰ消費を伴わない反応により構成されており、解糖より生じた還元力を消費することができる。これにより、ユーグレナは低酸素状態においても、ワックスエステル発酵によりＡＴＰを獲得しながら酸化還元バランスを維持し生存する。
Wax ester fermentation is one of the unique metabolic systems possessed by Euglena, including the synthesis of de novo fatty acids from acetyl-CoA by the reverse reaction of fatty acid β-oxidation (Inui).
et al. ,, FEBS LETERS, vol.150, no.1, pp.89-93 (1982)). This pathway is constituted by a reaction without ATP consumption, and can consume the reducing power generated by glycolysis. As a result, even in a low oxygen state, Euglena maintains the redox balance and survives while obtaining ATP by wax ester fermentation.
＜ユーグレナのｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸伸長酵素＞
ユーグレナのミトコンドリアには、低酸素下で機能する脂肪酸合成系が存在する。本合成系は３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＥｇＫＡＴ）によるアセチルＣｏＡ２分子の縮合から開始するため、ＡＴＰの消費を伴わずにアシル鎖伸長反応を進行する。
<Euglena's de novo fatty acid elongation enzyme>
Euglena mitochondria contain fatty acid synthesis systems that function under hypoxia. Since the synthesis system starts with the condensation of two acetyl-CoA molecules by 3-ketoacyl-CoA thiolase (EgKAT), the acyl chain elongation reaction proceeds without consuming ATP.
従来ユーグレナのワックスエステル発酵における予想ワックスエステル合成経路では、解糖系を通じてアセチル−ＣｏＡを合成し、アセチル−ＣｏＡ（および、プロピオニル−ＣｏＡ）をミトコンドリアの脂肪酸β酸化の逆行経路を経てアシル−ＣｏＡを合成すると考えられてきた。図２に示すように、この経路はエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）という４つの酵素から成り立っている。 Conventionally, in the expected wax ester synthesis route in wax ester fermentation of Euglena, acetyl-CoA is synthesized through a glycolysis system, and acetyl-CoA (and propionyl-CoA) is converted into acyl-CoA via a retrograde pathway of fatty acid β-oxidation of mitochondria. It has been considered to be synthesized. As shown in FIG. 2, this pathway is composed of four enzymes: enoyl-CoA reductase (TER), enoyl-CoA hydratase, hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, and 3-ketoacyl-CoA thiolase (KAT).
β酸化とは、アシル−ＣｏＡを原料としてアセチル−ＣｏＡを遊離する代謝経路のことであり、β酸化反応は以下の４ステップの反応の繰り返しからなる（図２）。 β-oxidation is a metabolic pathway that releases acetyl-CoA using acyl-CoA as a raw material, and the β-oxidation reaction consists of repeating the following four steps (FIG. 2).
１ステップ目の反応ではアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）からエノイル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）が生成される。１ステップ目の反応では、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＣＤ）が関与する。
ＡＣＤは、ＦＡＤを補因子として、アシル−ＣｏＡをエノイル−ＣｏＡに変換する反応を触媒する酵素である。ＡＣＤによる反応は一般的に不可逆であると考えられている。
In the first step reaction, enoyl-CoA (Cn + 2 ) is generated from acyl-CoA (Cn + 2 ). In the reaction of the first step, acyl-CoA dehydrogenase (ACD) is involved.
ACD is an enzyme that catalyzes a reaction for converting acyl-CoA to enoyl-CoA using FAD as a cofactor. The reaction with ACD is generally considered to be irreversible.
２ステップ目の反応では、１ステップ目の反応で生成したエノイル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）から、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）が生成される。この２ステップ目の反応では、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ ｈｙｄｒａｔａｓｅ）が関与する。
エノイルＣｏＡヒドラターゼは、エノイル−ＣｏＡ（ｔｒａｎｓ−２，３−デヒドロアシルＣｏＡ）にＨ２Ｏを付加し、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ）に変換する反応を触媒する酵素である。
In the second step reaction, 3-hydroxyacyl-CoA (Cn + 2 ) is generated from enoyl-CoA (Cn + 2 ) generated in the first step reaction. In this second step reaction, enoyl-CoA hydratase is involved.
Enoyl-CoA hydratase is an enzyme that catalyzes the reaction of adding H 2 O to enoyl-CoA (trans-2,3-dehydroacyl-CoA) and converting it to 3-hydroxyacyl-CoA (β-hydroxyacyl-CoA). is there.
３ステップ目の反応では、２ステップ目の反応で生成した３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）から、３−ケトアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）が生成される。この３ステップ目の反応では、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）などが関与する。
３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ＋を補因子として、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを酸化し、３−ケトアシル−ＣｏＡ（β−ケトアシル−ＣｏＡ）に変換する反応を触媒する酵素である。
In the third step reaction, 3-ketoacyl-CoA (C n + 2 ) is generated from 3-hydroxyacyl-CoA (C n + 2 ) generated in the second step reaction. In this third step reaction, 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and the like are involved.
3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase is an enzyme that catalyzes a reaction of oxidizing 3-hydroxyacyl-CoA and converting it to 3-ketoacyl-CoA (β-ketoacyl-CoA) using NAD + as a cofactor.
４ステップ目の反応では、３ステップ目の反応で生成した３−ケトアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）から、炭素原子が２個分短くなったアシル−ＣｏＡ（Ｃｎ）と、アセチル−ＣｏＡ（Ｃ２）が生成される。この４ステップ目の反応では、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）が関与する。
３−ケトアシルＣｏＡ−チオラーゼ（ＫＡＴ）は、ＣｏＡとともにチオール開裂を起こし、３−ケトアシル−ＣｏＡから炭素原子が２個分短くなったアシル−ＣｏＡと、アセチルＣｏＡを産生する反応を触媒する酵素である。
In the reaction of the fourth step, from the 3-ketoacyl-CoA (C n + 2 ) generated in the reaction of the third step, acyl-CoA (C n ) having two shorter carbon atoms and acetyl-CoA (C 2 ) Is generated. In this fourth step reaction, 3-ketoacyl CoA thiolase (KAT) is involved.
3-Ketoacyl-CoA-thiolase (KAT) is an enzyme that cleaves thiol together with CoA and catalyzes a reaction to produce acetyl-CoA and acyl-CoA whose carbon atom is shortened by two carbon atoms from 3-ketoacyl-CoA. .
一般的に脂肪酸の分解過程であるβ酸化において、アシル−ＣｏＡからトランスエノイル−ＣｏＡへの脱水素反応はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）による不可逆反応であり、生体内での脂質合成には寄与していないと考えられてきた。さらにユーグレナは、トランスエノイル−ＣｏＡからアシル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素としてトランスエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）を有しており、ＴＥＲがワックスエステル合成において機能すると考えられてきた。 Generally, in β-oxidation, which is a process of decomposing fatty acids, the dehydrogenation reaction from acyl-CoA to transenoyl-CoA is an irreversible reaction by acyl-CoA dehydrogenase (ACD) and contributes to lipid synthesis in vivo. Have been considered not. In addition, Euglena has transenoyl-CoA reductase (TER) as an enzyme that catalyzes the conversion of transenoyl-CoA to acyl-CoA, and it has been thought that TER functions in wax ester synthesis.
本発明では、以下に詳述するように、遺伝子発現抑制の手法を用いて、各ＡＣＤ遺伝子の発現抑制がワックスエステル合成に及ぼす影響を詳細に検討したところ、ＡＣＤ１遺伝子及びＡＣＤ２遺伝子の発現抑制が、予想外に、ワックスエステルの組成に大きく変化を及ぼすことを見出した。 In the present invention, as described in detail below, the effect of the suppression of the expression of each ACD gene on wax ester synthesis was examined in detail by using the method of suppressing gene expression. It was unexpectedly found that the composition of the wax ester was greatly changed.
＜ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現が抑制されたＥｇＡＣＤノックダウンユーグレナ＞
本発明のユーグレナは、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子（ＥｇＡＣＤ遺伝子）の発現が抑制されたユーグレナである。
ここで、「ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現が抑制された」とは、通常のユーグレナと比較してＥｇＡＣＤ遺伝子の発現が抑制されている状態を意味する。より詳細には、ユーグレナにおいて、ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現を抑制した場合であっても発現量が変化しない特定の遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）を基準として、ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現量が１／２以下、好ましくは１／３以下、１／４以下、より好ましくは、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、更により好ましくは、１／２０以下、１／３０以下、１／４０以下、１／５０以下、特に好ましくは、１／６０以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、１／１００以下となっている状態を意味する。
<EgACD knockdown Euglena with suppressed expression of EgACD gene>
The Euglena of the present invention is an Euglena in which the expression of an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene (EgACD gene) is suppressed.
Here, "the expression of the EgACD gene is suppressed" means a state in which the expression of the EgACD gene is suppressed as compared with normal Euglena. More specifically, in Euglena, the expression level of the EgACD gene is １ ／ or less, based on a specific gene (eg, a housekeeping gene) whose expression level does not change even when the expression of the EgACD gene is suppressed, Preferably 1/3 or less, 1/4 or less, more preferably 1/5 or less, 1/6 or less, 1/7 or less, 1/8 or less, 1/9 or less, 1/10 or less, still more preferably , 1/20 or less, 1/30 or less, 1/40 or less, 1/50 or less, particularly preferably 1/60 or less, 1/70 or less, 1/80 or less, 1/90 or less, 1/100 or less. Means that it has become.
（ＥｇＡＣＤ遺伝子）
本実施形態のＥｇＡＣＤ遺伝子の例としては、配列番号１のヌクレオチド番号１から１８６０に示されるヌクレオチド配列であり、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードするＤＮＡ（ＥｇＡＣＤ１遺伝子）、配列番号３のヌクレオチド番号１から１８５４に示されるヌクレオチド配列であり、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードするＤＮＡ（ＥｇＡＣＤ２遺伝子）が挙げられる。
(EgACD gene)
Examples of the EgACD gene of the present embodiment include a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 1860 of SEQ ID NO: 1, DNA encoding an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) (EgACD1 gene), and nucleotide number of SEQ ID NO: 3. 1 to 1854, and includes a DNA encoding the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) (EgACD2 gene).
本実施形態のＥｇＡＣＤ遺伝子の別の例としては、配列番号１のヌクレオチド番号１から１８６０に示されるヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド番号１から１８５４に示されるヌクレオチド配列と、それぞれ、４０％以上、より好ましくは５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のヌクレオチド配列相同性、同一性又は類似性を有し、且つ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードするＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡ、同一ＤＮＡ又は類似ＤＮＡなどが含まれる。 As another example of the EgACD gene of the present embodiment, a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 1860 of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 1854 of SEQ ID NO: 3 are respectively 40% or more, More preferably 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, still more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, particularly preferably 95% or more, 96% or more % Or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more nucleotide sequence homology, identity or similarity, and DNA encoding acyl-CoA dehydrogenase (ACD). Such DNAs include mutant DNAs found in nature, artificially modified mutant DNAs, homologous DNAs derived from heterologous organisms, identical DNAs or similar DNAs.
本実施形態のＥｇＡＣＤ遺伝子の別の例としては、配列番号１のヌクレオチド番号１から１８６０に示されるヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド番号１から１８５４に示されるヌクレオチド配列と、それぞれ、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードするＤＮＡが挙げられる。
また、配列番号１のヌクレオチド番号１から１８６０に示されるヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド番号１から１８５４に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）をコードする領域を含む限り、本実施形態のＥｇＡＣＤ遺伝子に含まれるものである。
As another example of the EgACD gene of the present embodiment, a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 1860 of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 1854 of SEQ ID NO: 3, respectively, under stringent conditions DNA that hybridizes underneath and encodes acyl-CoA dehydrogenase (ACD).
Also, a polynucleotide comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by nucleotide numbers 1 to 1860 of SEQ ID NO: 1 and the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by nucleotide numbers 1 to 1854 of SEQ ID NO: 3 also encodes acyl-CoA dehydrogenase (ACD). The EgACD gene of the present embodiment is included in the EgACD gene as long as the region includes the region of interest.
（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）
本実施形態のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）としては、配列表の配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、本明細書においてＥｇＡＣＤ１と命名したものである。配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列は、配列番号１（ＥｇＡＣＤ１遺伝子）の通りである。
配列番号４で表されるアミノ酸配列は、本明細書においてＥｇＡＣＤ２と命名したものである。配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列は、配列番号３（ＥｇＡＣＤ２遺伝子）の通りである。
(Acyl-CoA dehydrogenase)
Examples of the acyl-CoA dehydrogenase (EgACD) of the present embodiment include a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing.
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is named EgACD1 in this specification. The nucleotide sequence containing the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is as shown in SEQ ID NO: 1 (EgACD1 gene).
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is named EgACD2 in this specification. The nucleotide sequence containing the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is as shown in SEQ ID NO: 3 (EgACD2 gene).
また、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において、１個または数個の部位に、１個または数個のアミノ酸残基が、置換、欠失、挿入および／または付加したタンパク質も、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしての活性を有する限り、本実施形態のタンパク質に含まれる。数個とは６０個を超えない個数を意味し、好適には３０個、さらに好適には１５個、さらに好適には１０個を超えない個数（１個以上９個以下）をいう。 Further, in the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, one or several amino acid residues may be substituted, deleted, inserted and / or added at one or several sites. As long as it has an activity as an acyl-CoA dehydrogenase, it is included in the protein of the present embodiment. The term “several” means a number not exceeding 60, preferably 30, more preferably 15, more preferably not more than 10 (1 or more and 9 or less).
タンパク質の別の例としては、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と４０％以上、より好ましくは５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、特に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のヌクレオチド配列相同性、同一性又は類似性を有するタンパク質も、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしての活性を有する限り、本実施形態のタンパク質に含まれる。 As another example of the protein, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 and 40% or more, more preferably 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, further preferably 90% or more Or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, particularly preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more nucleotide sequence homology, identity or similarity A protein having a property is also included in the protein of the present embodiment as long as it has an activity as an acyl-CoA dehydrogenase.
（ＥｇＡＣＤ遺伝子の発現抑制とワックスエステルの炭素鎖長）
通常、ユーグレナは、ワックスエステルの構成脂肪酸・脂肪アルコールの主成分は、Ｃ１４のミリスチン酸−ミリスチルアルコール（Ｃ１４：０−Ｃ１４：０）であり、炭素原子数２８の鎖長のワックスエステル化合物が主成分である。
(EgACD gene expression suppression and wax ester carbon chain length)
Generally, Euglena is a wax ester whose fatty acid and fatty alcohol are mainly composed of C14 myristic acid-myristyl alcohol (C14: 0-C14: 0), and a wax ester compound having a chain length of 28 carbon atoms. Component.
（ＥｇＡＣＤ１遺伝子の発現抑制）
実施例にて示すように、ＥｇＡＣＤ１遺伝子（配列番号１）の発現を抑制すると、同一の培養条件で培養した場合、ユーグレナは、ＥｇＡＣＤ１遺伝子を抑制していないものと比較して炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ない組成のワックスエステルを含有するようになる。つまり、ＥｇＡＣＤ１遺伝子（配列番号１）の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルを長鎖化することができる。
(Suppression of EgACD1 gene expression)
As shown in the examples, when the expression of the EgACD1 gene (SEQ ID NO: 1) is suppressed, when cultured under the same culture conditions, Euglena has a carbon atom number of 29 to 29 compared to the case where the EgACD1 gene is not suppressed. A wax ester compound having a chain length of 32 is large, and a wax ester compound having a chain length of 22 to 27 carbon atoms is contained in a small amount. That is, by suppressing the expression of the EgACD1 gene (SEQ ID NO: 1), the wax ester contained in Euglena can be lengthened.
（ＥｇＡＣＤ２遺伝子の発現抑制）
実施例にて示すように、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）の発現を抑制すると、同一の培養条件で培養した場合、ユーグレナは、ＥｇＡＣＤ２遺伝子を抑制していないものと比較して炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少ないワックスエステルを含有するようになる。つまり、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルを短鎖化することができる。
(Suppression of EgACD2 gene expression)
As shown in the examples, when the expression of the EgACD2 gene (SEQ ID NO: 3) is suppressed, when cultured under the same culture conditions, Euglena has a carbon number of 22 to 22 compared to the case where the EgACD2 gene is not suppressed. The wax ester compound having a chain length of 27 is large, and the wax ester compound having a chain length of 29 to 32 carbon atoms contains a small amount of wax ester compound. That is, by suppressing the expression of the EgACD2 gene (SEQ ID NO: 3), the wax ester contained in Euglena can be shortened.
（ＥｇＡＣＤ２遺伝子及びＥｇＫＡＴ遺伝子の発現抑制）
ここで、ユーグレナにおいて、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルを短鎖化できることが報告されている（特許文献１及び非特許文献２）。なお、ＥｇＫＡＴ１遺伝子（配列番号５）は、ＥｇＫＡＴ１酵素（配列番号６）をコードする遺伝子である。
(Suppression of EgACD2 gene and EgKAT gene expression)
Here, it has been reported that in Euglena, the wax ester contained in Euglena can be shortened by suppressing the expression of the 3-ketoacyl CoA thiolase (KAT) 1 gene (SEQ ID NO: 5) (Patent Document 1 and Non-patent document 2). The EgKAT1 gene (SEQ ID NO: 5) is a gene encoding the EgKAT1 enzyme (SEQ ID NO: 6).
ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）を、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＫＡＴ）１遺伝子（配列番号５）とともに発現を抑制すると、ユーグレナは、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするワックスエステルを含有するようになる。つまり、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）及びＥｇＫＡＴ１遺伝子（配列番号５）の発現を同時に抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルをより一層短鎖化することができる。 When the expression of the EgACD2 gene (SEQ ID NO: 3) is suppressed together with the 3-ketoacyl-CoA thiolase (KAT) 1 gene (SEQ ID NO: 5), Euglena becomes a wax ester compound having a chain length of any one of 24-26 carbon atoms. A wax ester whose main component is. That is, by simultaneously suppressing the expression of the EgACD2 gene (SEQ ID NO: 3) and the EgKAT1 gene (SEQ ID NO: 5), the wax ester contained in Euglena can be further shortened.
＜ワックスエステルの製造方法＞
本発明のワックスエステルの製造方法は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子の発現が抑制されたＡＣＤノックダウンユーグレナを培養する培養工程と、前記ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出する抽出工程と、を行うことを特徴とするワックスエステルの製造方法である。
<Production method of wax ester>
The method for producing a wax ester of the present invention includes a culturing step of culturing an ACD knockdown Euglena in which the expression of an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is suppressed, and an extraction step of extracting a wax ester from the ACD knockdown Euglena. And a method for producing a wax ester.
（培養工程）
本発明のワックスエステルの製造方法では、まず、ＡＣＤ遺伝子の発現が抑制されたＡＣＤノックダウンユーグレナを、該ユーグレナが増殖可能な増殖至適温度で培養する培養工程を行う。
ＡＣＤノックダウンユーグレナとしては、ＥｇＡＣＤ１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されたＥｇＡＣＤ１ノックダウンユーグレナ、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されたＥｇＡＣＤ２ノックダウンユーグレナ、ＥｇＡＣＤ２遺伝子（配列番号３）及びＥｇＫＡＴ１遺伝子（配列番号５）の両方の発現が抑制されたＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンユーグレナが例として挙げられる。
(Culture process)
In the method for producing a wax ester of the present invention, first, a culturing step of culturing an ACD knockdown Euglena in which the expression of an ACD gene is suppressed at an optimal growth temperature at which the Euglena can grow is performed.
Examples of the ACD knockdown euglena include an EgACD1 knockdown euglena whose expression of the EgACD1 gene (SEQ ID NO: 1) is suppressed, an EgACD2 knockdown Euglena whose expression of the EgACD2 gene (SEQ ID NO: 3) is suppressed, and an EgACD2 gene (SEQ ID NO: 3). And EgACD2-EgKAT1 knockdown euglena in which both the expression of both EgKAT1 and EgKAT1 genes (SEQ ID NO: 5) are suppressed.
培養工程では、ユーグレナの増殖至適温度である２５〜２８℃の範囲内の温度で培養を行う。
培地中には、酸素を含む気体、例えば、空気の通気を行う。
また、培地中に酸素を含む気体の通気をしていたものを、停止させ、ユーグレナを沈降させることにより、培地を低酸素又は酸素欠乏状態とする。このとき、酸素を含まない気体（例えば、アルゴンガスや窒素ガス）の通気を行っても良い。
In the culturing step, the cultivation is performed at a temperature within the range of 25 to 28 ° C., which is the optimal growth temperature of Euglena.
A gas containing oxygen, for example, air is passed through the medium.
In addition, the medium that has been ventilated with oxygen-containing gas is stopped, and the euglena is allowed to settle, thereby bringing the medium into a low oxygen or oxygen deficient state. At this time, a gas containing no oxygen (for example, an argon gas or a nitrogen gas) may be ventilated.
（抽出工程）
その後、公知の方法により、ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出し、回収する。
ＥｇＡＣＤ１ノックダウンユーグレナを用いた場合、抽出工程では、炭素原子数２８〜３０のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするワックスエステルを抽出すると好適である。
また、ＥｇＡＣＤ２ノックダウンユーグレナを用いた場合、抽出工程では、炭素原子数２２〜２７のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするワックスエステルを抽出すると好適である。
さらに、ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンユーグレナを用いた場合、抽出工程では、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とするワックスエステルを抽出すると好適である。
(Extraction process)
Thereafter, the wax ester is extracted and recovered from the ACD knockdown euglena by a known method.
When EgACD1 knockdown euglena is used, it is preferable to extract a wax ester mainly composed of a wax ester compound having any chain length of 28 to 30 carbon atoms in the extraction step.
When EgACD2 knockdown euglena is used, it is preferable to extract a wax ester mainly composed of a wax ester compound having any chain length of 22 to 27 carbon atoms in the extraction step.
Furthermore, when EgACD2-EgKAT1 knockdown euglena is used, it is preferable to extract a wax ester mainly composed of a wax ester compound having a chain length of any of 24 to 26 carbon atoms in the extraction step.
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）遺伝子（ＥｇＡＣＤ１遺伝子又はＥｇＡＣＤ２遺伝子）の発現を抑制することで、ユーグレナが含有するワックスエステルの鎖長を伸長したり、短縮したりすることで、バイオ燃料用途のみならず、化成品や化粧品等に利用できるワックスエステルを製造することが可能となる。 By suppressing the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene (EgACD1 gene or EgACD2 gene), the chain length of the wax ester contained in Euglena can be extended or shortened, so that it can be used not only for biofuels. In addition, it is possible to produce a wax ester that can be used for chemical products, cosmetics, and the like.
（ワックスエステル組成物）
回収したワックスエステルは、バイオ燃料、化成品、化粧品等として用いることのできるワックスエステル組成物である。ワックスエステル組成物は、バイオ燃料組成物として用いる場合、単独でバイオ燃料として用いてもよいし、他の燃料に混合して用いてもよい。また、ワックスエステル組成物は、単独で化成品、化粧品等として用いてもよいし、他の成分と混合して用いてもよい。
(Wax ester composition)
The recovered wax ester is a wax ester composition that can be used as biofuels, chemical products, cosmetics, and the like. When used as a biofuel composition, the wax ester composition may be used alone as a biofuel, or may be used as a mixture with another fuel. Further, the wax ester composition may be used alone as a chemical product, a cosmetic product, or the like, or may be used as a mixture with other components.
（長鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法）
本発明の長鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法は、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とする方法である。
(Method of increasing long-chain wax ester content)
The method of increasing the long-chain wax ester content of the present invention is a method characterized by performing an EgACD expression level control step of suppressing the expression level of Euglena acyl-CoA dehydrogenase (EgACD).
具体的には、ユーグレナにおける下記（ａ）又は（ｂ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とするユーグレナにおける炭素原子数２９〜３２の長鎖ワックスエステルを増加させる方法である。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＥｇＡＣＤ１）；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
Specifically, the Euglena characterized in that an EgACD expression level control step of suppressing the expression level of an acyl-CoA dehydrogenase (EgACD) having the amino acid sequence of any of the following (a) or (b) is performed. This is a method for increasing the number of long-chain wax esters having 29 to 32 carbon atoms.
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (EgACD1);
(B) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which has dehydrogenation activity on acyl-CoA
（短鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法）
本発明の短鎖ワックスエステル含有量を増加させる方法は、ユーグレナのアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とする方法である。
(Method of increasing short-chain wax ester content)
The method for increasing the content of the short-chain wax ester of the present invention is a method characterized by performing an EgACD expression level control step of suppressing the expression level of Euglena acyl-CoA dehydrogenase (EgACD).
具体的には、ユーグレナにおける下記（ｃ）又は（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥｇＡＣＤ）の発現量を抑制するＥｇＡＣＤ発現量制御工程を行うことを特徴とするユーグレナにおける炭素原子数２２〜２７の短鎖ワックスエステルを増加させる方法である。
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＥｇＡＣＤ２）；
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列
Specifically, an EgACD expression level controlling step of suppressing the expression level of an acyl-CoA dehydrogenase (EgACD) having the amino acid sequence of any of the following (c) or (d) is performed in Euglena. This is a method for increasing short-chain wax esters having 22 to 27 carbon atoms.
(C) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (EgACD2);
(D) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, which has dehydrogenation activity on acyl-CoA
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
各実験において、試薬は特に記載の無い限り、市販の特級試薬を用い、その他の材料及び装置は、文中に記載した。
Hereinafter, the present invention will be specifically described based on specific examples, but the present invention is not limited thereto.
In each experiment, unless otherwise specified, commercially available special-grade reagents were used, and other materials and devices were described in the text.
＜実験１ ＥｇＡＣＤ遺伝子のノックダウンがワックスエステル発酵に及ぼす影響＞
本実験では、ＥｇＡＣＤ１遺伝子又はＥｇＡＣＤ２遺伝子のノックダウンを行い、ユーグレナのワックスエステル合成におよぼす影響について調べた。
<Experiment 1 Effect of knockdown of EgACD gene on wax ester fermentation>
In this experiment, the EgACD1 gene or the EgACD2 gene was knocked down, and the effect of Euglena on wax ester synthesis was examined.
（（実験１の方法））
（材料及び試薬）
本実験では、葉緑体を有するEuglena gracilis Z株(以下ユーグレナ野生株)をstreptomycin処理で人工的に葉緑体を永久欠損させた変異体Euglena gracilis SM-ZK株(以下ユーグレナ葉緑体欠損株)(Oda Y. et. al., (1982) : J Gen Microbiol, 128, 853-858.)を使用した。
((Method of Experiment 1))
(Materials and reagents)
In this experiment, a mutant Euglena gracilis SM-ZK strain (hereinafter referred to as Euglena chloroplast-deficient strain) in which Euglena gracilis Z strain having chloroplasts (hereinafter referred to as Euglena wild strain) was artificially permanently deleted from chloroplasts by streptomycin treatment. ) (Oda Y. et. Al., (1982): J Gen Microbiol, 128, 853-858.).
（ユーグレナの培養方法）
従属栄養培地として表１のＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地（ＫＨ培地）を用いた。
(Euglena culture method)
The Koren-Hutner medium (KH medium) shown in Table 1 was used as a heterotrophic medium.
５００ｍｌ容坂口フラスコに、ｐＨを５．０に調整した１５０ｍｌの表１のＫＨ培地を分注し、１２１℃、１５分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、４〜５日間程度の培養で定常期に達したユーグレナ（１５〜２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１ｍｌ接種し、２４時間の連続光照射条件下、２７℃で振盪培養した。 150 ml of the KH medium of Table 1 adjusted to pH 5.0 was dispensed into a 500 ml Sakaguchi flask, and sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes. 1 ml of Euglena (15-20 × 10 6 cells / ml), which reached the stationary phase by culturing for about 4 to 5 days, was inoculated into this medium, and cultured with shaking at 27 ° C. under continuous light irradiation for 24 hours.
細胞数計測には、粒子計数分析装置（ＣＤＡ−１０００）を用いた。１０倍ルゴール液を、ヨウ素１ｇ，ヨウ化カリウム２ｇにＨ２Ｏを全量が３００ｍｌになるよう添加して調製した。
ユーグレナの培養液とルゴール液を１：１の割合で混合することで細胞を固定し、この細胞液を適宜希釈して使用した。
A particle counting analyzer (CDA-1000) was used for cell count measurement. A 10-fold Lugol's solution was prepared by adding H 2 O to 1 g of iodine and 2 g of potassium iodide so that the total amount became 300 ml.
The cells were fixed by mixing the Euglena culture solution and Lugol's solution at a ratio of 1: 1 and the cell solution was appropriately diluted and used.
（ユーグレナ低酸素曝露方法）
本実験で原料ユーグレナ細胞として用いたユーグレナ葉緑体欠損株は、静置すると培養容器の底へ沈む性質があった。静置して沈降した条件では、通気が悪く、さらに溶存酸素は自らの呼吸によって消費されることから、細胞は低酸素状態にあると考えられる。そこで、本実験では、低酸素状態とは、ユーグレナ細胞を静置した状態と規定した。
(Euglena hypoxia exposure method)
The Euglena chloroplast-deficient strain used as the raw material Euglena cells in this experiment had the property of sinking to the bottom of the culture vessel when left standing. Under the condition of sedimentation by standing still, the ventilation is poor and the dissolved oxygen is consumed by its own respiration. Therefore, it is considered that the cells are in a hypoxic state. Therefore, in this experiment, the hypoxic state was defined as a state in which the Euglena cells were left still.
好気状態で対数増殖期後期まで生育させたユーグレナ細胞１．５ｍｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、温度を２７℃（通常時の培養温度）に設定したインキュベーター内で静置することにより低酸素処理を行った。 1.5 ml of Euglena cells grown under aerobic conditions until the late logarithmic growth phase were transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube, and left in an incubator set at a temperature of 27 ° C. (normal culture temperature) for hypoxia. Processing was performed.
（ワックスエステル抽出分析法）
１．５ｍｌエッペンドルフチューブにユーグレナ培養液１．５ｍｌを移し、２４ｈ静置して低酸素処理を行った。その後遠心分離（１７４００×ｇ，１分，４℃）し上清を除去した後、蒸留水で洗浄し、完全に上清を除去した。ワックスエステル抽出及び定量は、Ｉｎｕｉらの方法（Inui, H et.al.,(1982)）に従って行った。ガスクロマトグラフィーはＧＣ−２０１４を用い、２．５％ Ｔｈｅｒｍｏｎ−３０００カラムで、２４０℃の恒温分析により測定した。スタンダードには、既知濃度のＣ１４：０−Ｃ１４：０Ａｌｃを用いた。
(Wax ester extraction analysis method)
1.5 ml of the Euglena culture solution was transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube, and left standing for 24 hours to perform a low oxygen treatment. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation (17400 × g, 1 minute, 4 ° C.), washed with distilled water, and the supernatant was completely removed. The wax ester extraction and quantification were performed according to the method of Inui et al. (Inui, He et al., (1982)). Gas chromatography was performed by using a GC-2014 and constant temperature analysis at 240 ° C. on a 2.5% Thermon-3000 column. As a standard, a known concentration of C14: 0-C14: 0Alc was used.
アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）は脂肪酸β酸化で機能する酵素であり、図２の１ステップ目の反応において、アシル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）とＦＡＤの反応を触媒し、トランスエノイル−ＣｏＡ（Ｃｎ＋２）が生成される。 Acyl-CoA dehydrogenase (ACD) is an enzyme that functions in fatty acid β-oxidation, and catalyzes the reaction between acyl-CoA (C n + 2 ) and FAD in the first step of FIG. 2 to produce transenoyl-CoA (C n + 2 ) is generated.
本発明では、従来、ワックスエステル合成には寄与しないと考えられてきた、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）に着目した。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）は、広い生物種においてアシル−ＣｏＡからトランスエノイル−ＣｏＡへの不可逆反応を触媒することが知られている。さらに、各生物内に多種のアイソザイムが存在しており、基質特異性や局在の違いを通じて機能分担をしていると考えられているが、各酵素の詳細が明らかになっている例は少なく、また相同性のみでは機能を推定することが困難である。 In the present invention, attention has been focused on acyl-CoA dehydrogenase (ACD), which has conventionally been considered not to contribute to the synthesis of wax esters. Acyl-CoA dehydrogenase (ACD) is known to catalyze the irreversible reaction of acyl-CoA to transenoyl-CoA in a wide variety of organisms. Furthermore, there are many types of isozymes in each organism, and it is thought that their functions are shared through differences in substrate specificity and localization. Further, it is difficult to estimate the function only by homology.
本発明者らは、調査を行ったところ、ユーグレナＥＳＴデータ上で７種のＥｇＡＣＤアイソザイム（ＥｇＡＣＤ１〜７）の存在を見出し、さらに少なくともＥｇＡＣＤ１とＥｇＡＣＤ２がワックスエステル生産において機能することをＲＮＡｉによる遺伝子ノックダウン実験により見出した。 The present inventors have investigated and found the presence of seven types of EgACD isozymes (EgACD1 to 7) on Euglena EST data, and further confirmed that at least EgACD1 and EgACD2 function in wax ester production by RNAi gene knockout. Found by down experiment.
（（ＥｇＡＣＤ１遺伝子およびＥｇＡＣＤ２遺伝子のノックダウン））
（半定量ＲＴ−ＰＣＲ）
好気状態で３日間培養したユーグレナからｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写によりｃＤＮＡを獲得した。半定量ＲＴ−ＰＣＲによって各遺伝子の発現量を調べた。
以下、半定量ＲＴ−ＰＣＲについて説明する。
−ユーグレナ細胞からのｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
ＲＮＡの抽出にはＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）を用いた。試薬は、原則としてＲＮａｓｅ ｆｒｅｅのものを用い、水はＤＥＰＣ処理したものを使用した。
５００μｌのユーグレナ培養液から遠心によりユーグレナ細胞ペレットを回収し、５００μｌのＩＳＯＧＥＮ ＩＩを加えて完全に懸濁した。２００μｌのＤＥＰＣ水を加え、１５秒間激しく攪拌し、室温で１５分静置した。遠心分離（１７４００×ｇ、１５℃、１５分）を行った後、沈殿付近を取らないように上清画分から５００μｌ回収した。これに２．５μｌのｐ−ブロモアニソールを加え、１５秒間激しく撹拌し、室温で５分静置した。遠心分離（１７４００×ｇ、１５℃、１０分）を行った後、沈殿付近を取らないように上清画分から３００μｌ回収した。回収した液量と同量のイソプロパノールを添加し、転倒混和後、室温で１０分静置した。遠心分離（１７４００×ｇ、１５℃、１０分）後、上清を捨て、沈殿に対して５００μｌの７５％エタノールを加え、遠心分離した（７７００×ｇ，１５℃，３分）。７５％エタノールで再度沈殿を洗浄し、遠心分離した（７７００×ｇ，１５℃，３分）。上清を完全に取り除き、１２μｌのＤＥＰＣ水で溶解した。ＲＮＡ濃度は分光光度計によって、Ａ２６０値を測定することで求めた。
((Knockdown of EgACD1 gene and EgACD2 gene))
(Semi-quantitative RT-PCR)
Total RNA was extracted from Euglena cultured for 3 days in an aerobic state, and cDNA was obtained by reverse transcription. The expression level of each gene was examined by semi-quantitative RT-PCR.
Hereinafter, the semi-quantitative RT-PCR will be described.
-Extraction of total RNA from Euglena cells ISOGEN II (NIPPON GENE) was used for RNA extraction. The reagent used was RNase free in principle, and the water used was DEPC-treated water.
The euglena cell pellet was recovered from 500 μl of the Euglena culture by centrifugation, and completely suspended by adding 500 μl of ISOGEN II. 200 μl of DEPC water was added, and the mixture was vigorously stirred for 15 seconds and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After centrifugation (17400 × g, 15 ° C., 15 minutes), 500 μl of the supernatant fraction was collected so as not to take the vicinity of the precipitate. To this was added 2.5 μl of p-bromoanisole, stirred vigorously for 15 seconds, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After centrifugation (17400 × g, 15 ° C., 10 minutes), 300 μl of the supernatant fraction was collected so as not to take the vicinity of the precipitate. The same amount of isopropanol as the amount of the collected liquid was added, and the mixture was inverted and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After centrifugation (17400 × g, 15 ° C., 10 minutes), the supernatant was discarded, and 500 μl of 75% ethanol was added to the precipitate, followed by centrifugation (7700 × g, 15 ° C., 3 minutes). The precipitate was washed again with 75% ethanol and centrifuged (7700 × g, 15 ° C., 3 minutes). The supernatant was completely removed and dissolved with 12 μl of DEPC water. RNA concentration was determined by measuring the A260 value with a spectrophotometer.
−逆転写反応
ｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）により逆転写反応を行った。
表２の反応液（１）を４２℃で２分インキュベートし、氷上で急冷した。
-Reverse Transcription Reaction Using total RNA as a template, reverse transcription reaction was performed by PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time).
The reaction solution (1) in Table 2 was incubated at 42 ° C. for 2 minutes and quenched on ice.
反応液（１）に、表３の反応液（２）を加え混合後、３７℃で１５分、８５℃で５秒インキュベートすることで、ｃＤＮＡを得た。 The reaction solution (2) shown in Table 3 was added to the reaction solution (1), mixed, and incubated at 37 ° C. for 15 minutes and at 85 ° C. for 5 seconds to obtain cDNA.
−半定量ＰＣＲ
合成したｃＤＮＡを鋳型として、表４〜表６の条件で半定量ＰＣＲを行った。半定量用ＰＣＲプライマーとして、表６に示すプライマー（上の行から順に配列番号７〜１０）を用いた。また、反応後の確認は１％ゲルを用いたアガロースゲル電気泳動により行った。
-Semi-quantitative PCR
Semi-quantitative PCR was performed using the synthesized cDNA as a template under the conditions shown in Tables 4 to 6. As semi-quantitative PCR primers, the primers shown in Table 6 (SEQ ID NOS: 7 to 10 in order from the top row) were used. Confirmation after the reaction was performed by agarose gel electrophoresis using 1% gel.
また、ハウスキーピング遺伝子としてα−チューブリンを採用した。α−チューブリンｃＤＮＡ断片の増幅には表７のプライマー（上の行から順に配列番号１１，１２）を用い、１８サイクルの反応により行った。 Further, α-tubulin was employed as a housekeeping gene. Amplification of the α-tubulin cDNA fragment was carried out by using the primers in Table 7 (SEQ ID NOS: 11 and 12 in order from the top row) by a reaction of 18 cycles.
−二本鎖ＲＮＡ（以下ｄｓＲＮＡ）の作製
逆転写により獲得したｃＤＮＡを用い、両端にＴ７配列を付加したＥｇＡＣＤ ｃＤＮＡ部分断片をＰＣＲにより増幅、精製した。精製後のｃＤＮＡ断片５００ｎｇもしくは１μｇをＴ７転写反応に用いた。Ｔ７転写反応以降はＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて各ＥｇＫＡＴに対応するｄｓＲＮＡを作製した。
ｄｓＲＮＡ用プライマー（上の行から順に配列番号１３〜１６）を、表８に示す。
-Preparation of double-stranded RNA (hereinafter referred to as dsRNA) Using cDNA obtained by reverse transcription, an EgACD cDNA partial fragment having a T7 sequence added to both ends was amplified and purified by PCR. 500 ng or 1 μg of the purified cDNA fragment was used for a T7 transcription reaction. After the T7 transcription reaction, dsRNA corresponding to each EgKAT was prepared using MEGAscript (registered trademark) RNAi Kit (manufactured by Thermo).
Table 8 shows the dsRNA primers (SEQ ID NOS: 13 to 16 in order from the top row).
−エレクトロポレーション法を用いたＲＮＡｉ
ＰＢＳ（＋）で二度洗浄した１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのユーグレナ細胞４００μｌ、１５μｇ分の二本鎖ＲＮＡをキュベットに入れ、軽くピペッティングした。ＰＢＳ（＋）の組成は、表９の通りである。
-RNAi using electroporation
400 μl of 10 × 10 6 cells / ml Euglena cells washed twice with PBS (+), and 15 μg of double-stranded RNA for 15 μg were put into a cuvette and pipetted lightly. Table 9 shows the composition of PBS (+).
その後、装置にＢＴＸ−ＥＣＭ６３０を用い、二本鎖ＲＮＡ３０μｇについて、電圧０．５ｋＶ、抵抗５０Ω、電気容量２００μＦの条件で、エレクトロポレーションを行った。この際、ネガティブコントロールにはｄｓＲＮＡの代わりにＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を１５μｌ使用した。 Thereafter, electroporation was performed on 30 μg of the double-stranded RNA under the conditions of a voltage of 0.5 kV, a resistance of 50 Ω, and a capacitance of 200 μF using BTX-ECM630 as an apparatus. At this time, 15 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) was used as a negative control instead of dsRNA.
キュベットはＧａｐ長が２ｍｍのものを用いた。パルス後の細胞を回収し、ＫＨ培地１ｍｌが入った５ｍｌプラスチックチューブに移した後、蓋をパラフィルムで固定し、ローテーターで旋回培養した。２７℃で、３ｈ旋回培養した後、ＫＨ培地３ｍｌが入った試験管に４００μｌ移すことで継代し、２７℃で振盪培養した。 A cuvette having a Gap length of 2 mm was used. After the cells after the pulse were collected and transferred to a 5 ml plastic tube containing 1 ml of KH medium, the lid was fixed with parafilm, and the cells were swirled with a rotator. After culturing at 27 ° C. for 3 hours, the cells were subcultured by transferring 400 μl to a test tube containing 3 ml of KH medium, and cultured at 27 ° C. with shaking.
（（結果））
（ＲＮＡｉによるＥｇＡＣＤ ｍＲＮＡ発現抑制効果の確認）
（（方法））の「二本鎖ＲＮＡ（以下ｄｓＲＮＡ）の作製」「エレクトロポレーション法を用いたＲＮＡｉ」により、ＥｇＡＣＤ ＲＮＡｉを行った細胞およびコントロール細胞を対数増殖期後期まで振盪培養した。（（方法））の「ユーグレナ細胞からのｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出」により、培養後の細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、「逆転写反応」により逆転写を行った後、半定量ＲＴ−ＰＣＲによってＥｇＡＣＤ ｍＲＮＡ発現量を調べた。
結果を、図３に示す。図３のように、ＥｇＡＣＤノックダウン細胞が得られていた。
((result))
(Confirmation of EgACD mRNA expression suppression effect by RNAi)
According to ((Method)) “Preparation of double-stranded RNA (hereinafter, dsRNA)” and “RNAi using electroporation method”, cells subjected to EgACD RNAi and control cells were cultured with shaking until the late logarithmic growth phase. After extracting the total RNA from the cultured cells by “extraction of total RNA from Euglena cells” in ((Method)) and performing reverse transcription by “reverse transcription reaction”, EgACD mRNA was obtained by semi-quantitative RT-PCR. The expression level was examined.
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 3, EgACD knockdown cells were obtained.
（ＥｇＡＣＤ遺伝子のノックダウンがワックスエステル総量におよぼす影響）
ＥｇＡＣＤ１ ＲＮＡｉ又はＥｇＡＣＤ２ ＲＮＡｉを行った細胞およびコントロール細胞を好気状態で４日間生育させた細胞を２７℃で低酸素処理し、２４時間後の細胞内に存在するワックスエステルを上述の「ワックスエステル抽出分析法」に従い抽出し、分析した。
図４（ＥｇＡＣＤ１ノックダウン）及び図５（ＥｇＡＣＤ２ノックダウン）に炭素鎖長別のワックスエステル量を示す。
(Effect of knockdown of EgACD gene on total amount of wax ester)
Cells obtained by growing cells subjected to EgACD1 RNAi or EgACD2 RNAi and control cells for 4 days in an aerobic state are subjected to hypoxic treatment at 27 ° C., and after 24 hours, the wax ester present in the cells is extracted by the above-mentioned “Wax ester extraction”. Extracted according to "Analysis method" and analyzed.
FIG. 4 (EgACD1 knockdown) and FIG. 5 (EgACD2 knockdown) show the amount of wax ester by carbon chain length.
（ＥｇＡＣＤ１ノックダウン）
図４に示すように、ワックスエステル組成ピークはコントロール細胞（対比例１：Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＥｇＡＣＤ１ノックダウン細胞（実施例１：ＡＣＤ１ ＲＮＡｉ）の両方でＣ２８であった。
ＥｇＡＣＤ１ノックダウン細胞（実施例１）において、Ｃ２９〜Ｃ３２の割合が高くなり、Ｃ２９〜Ｃ３２の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて高くなった。
また、ＥｇＡＣＤ１ノックダウン細胞（実施例１）において、Ｃ２２〜Ｃ２７の割合が低くなり、Ｃ２２〜Ｃ２７の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて低くなった。
(EgACD1 knockdown)
As shown in FIG. 4, the wax ester composition peak was C28 in both control cells (Comparative Example 1: Control) and EgACD1 knockdown cells (Example 1: ACD1 RNAi).
In the EgACD1 knockdown cells (Example 1), the ratio of C29 to C32 was increased, and the absolute amount of C29 to C32 was also increased as compared to the control cells (Comparative Example 1).
In the EgACD1 knockdown cells (Example 1), the ratio of C22 to C27 was low, and the absolute amount of C22 to C27 was also lower than that in the control cells (Comparative Example 1).
（ＥｇＡＣＤ２ノックダウン）
図５に示すように、ＥｇＡＣＤ２ノックダウン細胞（実施例２：ＡＣＤ２ ＲＮＡｉ）でワックスエステル組成ピークはＣ２７であった。
ＥｇＡＣＤ２ノックダウン細胞（実施例２）において、Ｃ２２〜Ｃ２７の割合が高くなり、Ｃ２２〜Ｃ２７の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて高くなった。
また、ＥｇＡＣＤ２ノックダウン細胞（実施例２）において、Ｃ２８〜Ｃ３２の割合が低くなり、Ｃ２８〜Ｃ３２の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて低くなった。
(EgACD2 knockdown)
As shown in FIG. 5, the wax ester composition peak was C27 in the EgACD2 knockdown cells (Example 2: ACD2 RNAi).
In the EgACD2 knockdown cells (Example 2), the ratio of C22 to C27 was increased, and the absolute amount of C22 to C27 was also increased as compared with the control cells (Comparative Example 1).
In the EgACD2 knockdown cells (Example 2), the ratio of C28 to C32 was low, and the absolute amount of C28 to C32 was also lower than that in the control cells (Comparative Example 1).
（実験１まとめ）
ユーグレナのワックスエステル合成経路においてトランスエノイルＣｏＡからアシルＣｏＡへの変換はトランスエノイルＣｏＡレダクターゼ（ＴＥＲ）により触媒されると考えられてきた。ユーグレナのＡＣＤに関し、ワックスエステル合成経路における寄与は全く不明であった。本発明者らは、ワックスエステル合成系でＡＣＤが機能する可能性を明らかにするために研究を進めた。さらにＲＮＡｉを用いたノックダウンによりワックスエステルの組成制御を行い、ユーグレナが生産するワックスエステルを改変することを目指した。
その結果、ユーグレナＥＳＴデータ上で見出した７種のＡＣＤアイソザイム（ＥｇＡＣＤ１〜７）のうち、２種がワックスエステル合成系で機能していることを見出した。
(Summary of Experiment 1)
It has been believed that the conversion of transenoyl-CoA to acyl-CoA in the Euglena wax ester synthesis pathway is catalyzed by transenoyl-CoA reductase (TER). For Euglena ACD, the contribution in the wax ester synthesis pathway was completely unknown. The present inventors have conducted research to clarify the possibility that ACD functions in a wax ester synthesis system. Furthermore, the composition of the wax ester was controlled by knockdown using RNAi, and the aim was to modify the wax ester produced by Euglena.
As a result, among the seven ACD isozymes (EgACD1 to 7) found on the Euglena EST data, two were found to function in the wax ester synthesis system.
ＥｇＡＣＤ１の発現抑制は、ワックスエステルの長鎖化に寄与した。ワックスエステルの長鎖化は、従来の技術では達成されなかった結果である。
ＥｇＡＣＤ２の発現抑制はワックスエステルの短鎖化に寄与した。ワックスエステルの短鎖化は、従来の技術におけるＥｇＫＡＴ１およびＥｇＫＡＴ２の発現抑制と同様の傾向であった。
The suppression of the expression of EgACD1 contributed to the longer chain of the wax ester. Long chain wax esters are a result not achieved by the prior art.
The suppression of the expression of EgACD2 contributed to the shortening of the wax ester chain. The shortening of the chain of the wax ester had the same tendency as the suppression of the expression of EgKAT1 and EgKAT2 in the prior art.
このことから、ＥｇＡＣＤ１が短鎖アシルＣｏＡ合成に関与し、ＥｇＡＣＤ２が中鎖から長鎖のアシルＣｏＡ合成に関与することが分かった。
脂質代謝酵素の代謝制御によるワックスエステル組成の改変というアプローチから、実験１ではＥｇＡＣＤ１の発現抑制がワックスエステルの高分子化（長鎖化）に有効であり、ＥｇＡＣＤ２の発現抑制がワックスエステルの低分子化（短鎖化）に有効であることを明らかとした。
This indicates that EgACD1 is involved in the synthesis of short-chain acyl-CoA, and that EgACD2 is involved in the synthesis of medium- to long-chain acyl-CoA.
From the approach of modifying the wax ester composition by controlling the metabolism of lipid metabolizing enzymes, in Experiment 1, suppression of the expression of EgACD1 is effective in increasing the molecular weight of the wax ester (lengthening the chain), and suppression of the expression of EgACD2 is controlled by the low molecular weight of the wax ester. It was clarified that it was effective for shortening (shortening).
＜実験２ ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンの検討＞
実験１にて、ＥｇＡＣＤ２遺伝子の発現を抑制すると、低分子化したワックスエステルが得られた。そこで、本実験では、ＥｇＡＣＤ２ノックダウンと、ＥｇＫＡＴ１ノックダウン（特許文献１及び非特許文献２）の組み合わせがワックスエステル発酵に及ぼす影響を解析した。
<Experiment 2 Examination of EgACD2-EgKAT1 knockdown>
In Experiment 1, when the expression of the EgACD2 gene was suppressed, a low molecular weight wax ester was obtained. Thus, in this experiment, the effect of a combination of EgACD2 knockdown and EgKAT1 knockdown (Patent Document 1 and Non-Patent Document 2) on wax ester fermentation was analyzed.
ＥｇＫＡＴ１遺伝子のノックダウンは、特許文献１及び非特許文献２に記載の方法を採用し、実験１と同様の手順で、ＥｇＡＣＤ２遺伝子と同時にノックダウンを行った。
実験１と同様の手順で、培養を行った後に、ワックスエステルを抽出した。
図６にＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウンを行った場合の、炭素鎖長別のワックスエステル量を示す。
For the knockdown of the EgKAT1 gene, the methods described in Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 2 were adopted, and the knockdown was performed simultaneously with the EgACD2 gene in the same procedure as in Experiment 1.
After culturing in the same procedure as in Experiment 1, wax esters were extracted.
FIG. 6 shows the amount of wax ester by carbon chain length when EgACD2-EgKAT1 knockdown was performed.
図６に示すようにＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウン細胞（実施例３：ＡＣＤ２ ａｎｄ ＫＡＴ１ ＲＮＡｉ）でワックスエステル組成ピークはＣ２６であり、主成分はＣ２４〜２６であった。
ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウン細胞（実施例３）において、Ｃ２１〜Ｃ２６の割合が高くなり、Ｃ２１〜Ｃ２６の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて高くなった。
また、ＥｇＡＣＤ２−ＥｇＫＡＴ１ノックダウン細胞（実施例３）において、Ｃ２７〜Ｃ３２の割合が低くなり、Ｃ２７〜Ｃ３２の絶対量もコントロール細胞（対比例１）と比べて低くなった。
As shown in FIG. 6, in the EgACD2-EgKAT1 knockdown cells (Example 3: ACD2 and KAT1 RNAi), the wax ester composition peak was C26, and the main component was C24-26.
In the EgACD2-EgKAT1 knockdown cells (Example 3), the ratio of C21 to C26 was increased, and the absolute amount of C21 to C26 was also increased as compared to the control cells (Comparative Example 1).
Moreover, in the EgACD2-EgKAT1 knockdown cells (Example 3), the ratio of C27 to C32 was reduced, and the absolute amount of C27 to C32 was also lower than in the control cells (Comparative Example 1).
（実験２まとめ）
ＥｇＡＣＤ２とＥｇＫＡＴ１を同時に発現抑制すると、それぞれを単独で発現抑制した場合と比較して、さらにワックスエステルの短鎖化が顕著になった。
(Summary of Experiment 2)
When the expression of EgACD2 and EgKAT1 was suppressed simultaneously, the shortening of the wax ester chain became more remarkable as compared with the case where the expression was suppressed alone.
Claims (17)
前記ユーグレナは、ワックスエステルを含有し、
該ワックスエステルは、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）１遺伝子（配列番号１）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が多く、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が少ないことを特徴とする請求項１に記載のユーグレナ。 The acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1),
The euglena contains a wax ester,
The wax ester has a chain length of 29 to 32 carbon atoms compared to a wax ester produced by Euglena in which the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1) is not suppressed. The euglena according to claim 1, wherein the amount of the compound is large and the amount of the wax ester compound having a chain length of 22 to 27 carbon atoms is small.
前記ユーグレナは、ワックスエステルを含有し、
該ワックスエステルは、前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤ）２遺伝子（配列番号３）の発現が抑制されていないユーグレナが生産するワックスエステルと比較して、炭素原子数２９〜３２の鎖長のワックスエステル化合物が少なく、炭素原子数２２〜２７の鎖長のワックスエステル化合物が多いことを特徴とする請求項１に記載のユーグレナ。 The acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3),
The euglena contains a wax ester,
The wax ester has a chain length of 29 to 32 carbon atoms as compared to a wax ester produced by Euglena in which the expression of the acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3) is not suppressed. 2. The euglena according to claim 1, wherein the amount of the compound is small and the amount of the wax ester compound having a chain length of 22 to 27 carbon atoms is large.
前記ＡＣＤノックダウンユーグレナからワックスエステルを抽出する抽出工程と、を行うことを特徴とするワックスエステルの製造方法。 Culturing an ACD knockdown euglena in which the expression of an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is suppressed;
An extraction step of extracting a wax ester from the ACD knockdown euglena.
前記抽出工程では、炭素原子数２８〜３０のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出することを特徴とする請求項７に記載のワックスエステルの製造方法。 The acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 1 gene (SEQ ID NO: 1),
The method for producing a wax ester according to claim 7, wherein in the extraction step, the wax ester containing a wax ester compound having a chain length of any of 28 to 30 carbon atoms as a main component is extracted.
前記抽出工程では、炭素原子数２２〜２７のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出することを特徴とする請求項７に記載のワックスエステルの製造方法。 The acyl-CoA dehydrogenase (ACD) gene is an acyl-CoA dehydrogenase (ACD) 2 gene (SEQ ID NO: 3),
The method for producing a wax ester according to claim 7, wherein, in the extracting step, the wax ester mainly containing a wax ester compound having a chain length of any of 22 to 27 carbon atoms is extracted.
前記抽出工程では、炭素原子数２４〜２６のうちいずれかの鎖長のワックスエステル化合物を主成分とする前記ワックスエステルを抽出することを特徴とする請求項１０に記載のワックスエステルの製造方法。 Furthermore, the expression of the 3-ketoacyl CoA thiolase (KAT) 1 gene (SEQ ID NO: 5) is suppressed,
The method for producing a wax ester according to claim 10, wherein in the extraction step, the wax ester mainly containing a wax ester compound having a chain length of any of 24 to 26 carbon atoms is extracted.
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列 Performing an EgACD expression level control step of suppressing the expression level of an acyl-CoA dehydrogenase (EgACD) having the amino acid sequence of any of the following (a) or (b) in Euglena: 32. A method of increasing long chain wax esters.
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(B) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which has dehydrogenation activity on acyl-CoA
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であって、アシル−ＣｏＡに対する脱水素活性を有するアミノ酸配列 Performing an EgACD expression level control step of suppressing an expression level of an acyl-CoA dehydrogenase (EgACD) having the amino acid sequence of any of the following (c) or (d) in Euglena: 27. A process for increasing short chain wax esters of 27.
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and which has dehydrogenation activity on acyl-CoA
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