JP2019523010A - 核酸配列決定調製物からアダプター二量体を除去する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)複数の配列決定アダプターを提供する工程であって、前記アダプターのそれぞれが、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含み、二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、2つのアダプターの二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる工程と;
(b)平滑末端化した複数の標的DNA二重鎖の第1および第2末端に前記配列決定アダプターの二重鎖領域を共有結合し、それにより標的DNA二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含むアダプターに連結された標的DNA二重鎖を複数作製する工程と、
(c)もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く1つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程とを含む。
(d)プライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせる工程と、DNAポリメラーゼ酵素により前記プライマーを伸長する工程と、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程とをさらに含む。この場合、プライマーを伸張して、標的DNA二重鎖の一方の鎖の相補的コピーを作製することができ、コピーは、ポリメラーゼにより合成されるように、配列決定される。
(d)プライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせる工程と、DNAポリメラーゼ酵素により前記プライマーを伸長する工程と、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程とをさらに含む。この場合、プライマーを伸張して、標的DNA二重鎖の一方の鎖の相補的コピーを作製することができ、コピーは、ポリメラーゼにより合成されるように、配列決定される。
(a)請求項23に記載の複数のアダプター;および
(b)配列決定用の標的DNA二重鎖を調製するための説明書
を含むポリヌクレオチド配列決定用のキットをさらに提供する。
そのようなキットは:
(c)リガーゼ酵素;
(d)メチル依存的エンドヌクレアーゼ酵素;
(e)1つ以上のエキソヌクレアーゼ酵素;および
(f)1つ以上の配列決定プライマー
のうち1つ以上をさらに含むことができる。
(a)平滑末端化した複数の標的DNA二重鎖の第1および第2末端に複数の配列決定アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を共有結合し、それにより標的DNA二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含むアダプターに連結された標的DNA二重鎖を複数作製する工程であって、各アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、2つのアダプターの二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる工程と;
(b)もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く1つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程とを含む。
「A」、「an」および「the」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の参照を含む。
ポリヌクレオチド配列決定のためのアダプターが、本明細書に提供される。アダプターは、その末端にメチル依存的制限エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を有する二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖(例えば、DNA二重鎖)領域を含有する。それぞれのポリヌクレオチド二重鎖領域(すなわち、アダプター二量体を形成している)の末端で共に共有結合する(例えば、ライゲートする)2つのアダプターは、メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な配列を形成することになり、エンドヌクレアーゼの存在下で切断を受けることになる。配列決定される標的ポリヌクレオチド二重鎖の末端に共有結合するアダプターは、標的ポリヌクレオチドの末端がエンドヌクレアーゼ認識部位の残りの配列を含有するというまれな例を除いて、エンドヌクレアーゼによる切断を受けないことになる。
本明細書に記述される方法が適用され得る核酸サンプルは、組織サンプル、生体液サンプルまたは細胞サンプルなどの生体サンプル、およびその加工画分から得ることができる。生体液サンプルには、非限定的な例として、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、耳漏、リンパ液、間質液、唾液、脳脊髄液、洗浄液(ravages)、骨髄懸濁液、膣流出液(vaginal flow)、経頸管洗浄液、脳液、腹水、乳、呼吸の分泌物、腸および尿生殖器管、羊水ならびに白血球除去サンプル(leukophoresis sample)がある。一部の実施形態において、供給源サンプルは、非侵襲的手順により容易に入手できるサンプル、例えば、血液、血漿、血清、汗、涙、痰、尿、耳漏および唾液である。一部の実施形態において、生体サンプルは、末梢血サンプルまたは血漿および血清画分である。他の実施形態において、生体サンプルは、綿棒で採取した標本または塗布標本、生検標本または細胞培養である。別の実施形態において、サンプルは2つ以上の生体サンプルの混合物、例えば、生体液サンプル、組織サンプルおよび細胞培養サンプルのうち2つ以上を含む生体サンプルである。本明細書では、用語「血液」、「血漿」および「血清」は、その画分または加工部分を包含する。同様に、サンプルが、生検、綿棒で採取した標本、塗布標本、等から採取される場合、「サンプル」は、生検、綿棒で採取した標本、塗布標本、等から得られる加工画分または部分を包含することができる。
配列決定用の標的ポリヌクレオチド二重鎖を調製する方法が本明細書に提供される。標的ポリヌクレオチド二重鎖の各末端は、本明細書に記載される配列決定アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域に共有結合される。アダプターに連結された標的ポリヌクレオチド二重鎖は、各末端における配列決定アダプターにより作製される。アダプター二量体は、図3に図式的に示した通り作製され得る。図3において点線34として図式的に示される通り、アダプター二量体は、各アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域の末端で共にライゲートされた2つのアダプター31および32を含む。2つのアダプターのライゲーションは、メチル依存的エンドヌクレアーゼの制限部位33を作製する。サンプル混合物は、メチル依存的エンドヌクレアーゼで次いで処理され、上記の通り、エンドヌクレアーゼの制限配列を含むアダプター二量体は切断される。サンプル混合物は、切断されたアダプターをその5’および/または3’自由末端から脱重合する1つ以上のエキソヌクレアーゼで次いで処理され、したがって、配列決定されるポリヌクレオチドの混合物からアダプター二量体およびライゲートしていない任意の遊離アダプターが除去される。標的ポリヌクレオチド二重鎖の末端にライゲートされたアダプターは、エキソヌクレアーゼ消化の影響を受ける自由末端を持たない。上記の通り、アダプターは、エキソヌクレアーゼにより消化されないように、ヘアピンループ、または直鎖アダプターの場合、そのライゲートされていない末端に修飾ヌクレオチド、例えば、チオネート化ヌクレオチドのいずれかを有する。
多数のメチル依存的エンドヌクレアーゼ酵素が公知である。一実施形態において、メチル依存的エンドヌクレアーゼは、MspIまたはMspIIであり、パリンドローム制限配列CCMeGGで二本鎖DNAを切断する。別の実施形態において、メチル依存的エンドヌクレアーゼは、DpnIまたはDpnIIであり、パリンドローム制限配列GAMeTCで二本鎖DNAを切断する。少なくとも1つのメチル化ヌクレオチドを含み、本明細書に記載のアダプターの二重鎖領域の末端でヌクレオチド配列をライゲーションして酵素の完全な認識配列を得ることにより作製できる認識配列において任意のメチル依存的エンドヌクレアーゼが切断する場合、その酵素が、本明細書に記述される方法に有用であり得ることはいうまでもない。
本方法は、配列決定ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチド二重鎖は、各末端で本明細書に記載のアダプターを共有結合することにより配列決定用として調製される。アダプター二量体は、本明細書に記載の通り除去され、約1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、または0.01%未満のアダプター二量体を含有する配列決定混合物が得られる。
本明細書に記述される方法に使用するキットが提供される。キットは、本明細書に記載の配列決定アダプターを含む。任意選択で、例えば、配列決定用の標的ポリヌクレオチド二重鎖を調製するための使用説明書が提供される。説明書は、印刷された形態、またはCD、DVDもしくはUSBなどの電子媒体の形態、またはそのような説明書を入手できるウェブサイトアドレスの形態で提供され得る。任意選択で、配列決定用の標的ポリヌクレオチド二重鎖を調製するための他の成分および/または配列決定試薬が含まれ得る。例えば、キットは:リガーゼ酵素;メチル依存的エンドヌクレアーゼ酵素;1つ以上のエキソヌクレアーゼ酵素;および1つ以上の配列決定プライマーのうち1つ以上を含み得る。
Claims (15)
- 配列決定用の標的DNA二重鎖を調製する方法であって:
(a)複数の配列決定アダプターを提供する工程であり、
前記アダプターのそれぞれが二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含み、前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域がその末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、ここで2つのアダプターの前記二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、前記メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成される、前記工程;
(b)平滑末端化した複数の標的DNA二重鎖の第1および第2末端に前記配列決定アダプターの二重鎖領域を共有結合し、それにより前記標的DNA二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含む、アダプターに連結した標的DNA二重鎖を複数作製する工程、ならびに、
(c)もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く1つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程、
を含む、前記方法。 - 前記アダプターのそれぞれが一本鎖ポリヌクレオチドヘアピン領域および前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプターのそれぞれが第1および第2のポリヌクレオチド鎖を含む直鎖ポリヌクレオチドであり、各アダプターが前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含む第1の末端、ならびに前記第1の鎖の3’末端および前記第2の鎖の5’末端を含む第2の末端を含み、前記第1の鎖が前記3’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む一本鎖3’突出領域を含み、前記第2の鎖が5’末端またはその近傍にチオネート化ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプターのそれぞれにある前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が3’末端を含む第2の鎖にハイブリダイズする5’末端を含む第1の鎖を含み、前記第1の鎖が前記第2の鎖の前記3’末端にある配列CCMeにハイブリダイズする配列GGを5’末端に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アダプターのそれぞれにある前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が3’末端を含む第2の鎖にハイブリダイズする5’末端を含む第1の鎖を含み、前記第1の鎖が前記3’末端にある配列GAMeにハイブリダイズする配列TCを5’末端に含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)がリガーゼ酵素で共有結合する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的DNAが非メチル化ヌクレオチドを用いて合成されたゲノムDNAの断片のコピーを含む、請求項1に記載の方法。
- 配列決定される標的DNA二重鎖に配列決定アダプターを共有結合的に付加する工程を含む、配列決定用のポリヌクレオチドサンプルを調製する方法であって、配列決定用の前記ポリヌクレオチドサンプルが請求項1に記載の方法にしたがって調製され、約1%未満のアダプター二量体を含む、前記方法。
- 請求項2に記載の配列決定用の標的DNA二重鎖を調製する工程を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、各アダプターの前記一本鎖ヘアピン領域がプライマー結合配列を含み、前記方法が:
(d)前記プライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせる工程、DNAポリメラーゼ酵素により前記プライマーを伸長する工程、および、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程をさらに含む、前記方法。 - 請求項3に記載の配列決定用の標的DNA二重鎖を調製する工程を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、前記一本鎖3’突出領域がプライマー結合配列を含み、前記方法が:
(d)前記プライマー結合配列にプライマーをハイブリダイズさせる工程、DNAポリメラーゼ酵素により前記プライマーを伸長する工程、および、それにより配列決定用のプライマー伸長産物を調製する工程をさらに含む、前記方法。 - 二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を含むポリヌクレオチド配列決定用のアダプターであって、前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域がその末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、2つのアダプターの前記二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、前記メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる、前記ポリヌクレオチド配列決定用のアダプター。
- 標的DNA二重鎖の各末端で共有結合された請求項11に記載の配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたDNA二重鎖を複数含むポリヌクレオチドサンプルを配列決定する工程を含み、前記ポリヌクレオチドサンプルが、約1%未満のアダプター二量体を含む、ポリヌクレオチドを配列決定する方法。
- 標的DNA二重鎖の各末端で共有結合された請求項11に記載の配列決定アダプターを含むアダプターに連結されたDNA二重鎖を複数含み、約1%未満のアダプター二量体を含む、配列決定用のポリヌクレオチドサンプル。
- (a)請求項11に記載の複数のアダプター;および
(b)配列決定用の標的DNA二重鎖を調製するための説明書、
を含む、ポリヌクレオチド配列決定のためのキット。 - 配列決定用の標的DNA二重鎖を調製する方法であって:
(a)平滑末端化した複数の標的DNA二重鎖の第1および第2末端に複数の配列決定アダプターの二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域を共有結合し、それにより前記標的DNA二重鎖の各末端で共有結合した配列決定アダプターを含むアダプターに連結された標的DNA二重鎖を複数作製する工程であり、
各アダプターの前記二本鎖ポリヌクレオチド二重鎖領域が、その末端にメチル依存的エンドヌクレアーゼの認識配列の一部を含み、2つのアダプターの前記二重鎖領域が共に共有結合されてアダプター二量体が作製された場合に、前記メチル依存的エンドヌクレアーゼの完全な認識配列が形成されることになる前記工程;ならびに、
(b)もしあれば、メチル依存的エンドヌクレアーゼによる消化に続く1つ以上のエキソヌクレアーゼによる消化によりアダプター二量体を除去する工程、
を含む、前記方法。
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