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JP2018529340A - 核酸のエキソソームパッケージング - Google Patents

核酸のエキソソームパッケージング Download PDF

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JP2018529340A JP2018514870A JP2018514870A JP2018529340A JP 2018529340 A JP2018529340 A JP 2018529340A JP 2018514870 A JP2018514870 A JP 2018514870A JP 2018514870 A JP2018514870 A JP 2018514870A JP 2018529340 A JP2018529340 A JP 2018529340A
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アンドリュー テイラー，ジェームス
アンドリュー テイラー，ジェームス
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Abstract

目的の核酸をパッケージングしたエキソソームまたはエキソソーム様小胞を調製するための方法が提供される。特定の実施形態では、この方法は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた目的の核酸配列を含む核酸構築物をエキソソーム産生細胞に導入すること、細胞にエキソソームを産生させることを包含し得る。核酸構築物、組成物及びそれらの使用もまた提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般に、エキソソームパッケージングに関する。より具体的には、本発明は、目的の核酸で濃縮されたエキソソームを生成するための方法及び核酸構築物に関する。
発明の背景
２００６年、ノーベル医学賞が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見に関して授与された。初期の研究は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡｉトリガーが、特異的かつ強力な方法で、事実上あらゆる遺伝子をサイレンシングするように容易に設計できることが示された。これによって、ｓｉＲＮＡなどの遺伝子サイレンシング核酸が、多種多様な疾患を処置するために使用できることが示唆された。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）遺伝子サイレンシング経路の発見によって、目的の遺伝子の発現をサイレンシングするためのツールが研究者に提供された。これらの経路は、両方とも小型の核酸分子の細胞への導入によって引き起こされる。これらの小型の核酸分子は、典型的には、目的の遺伝子（複数可）から転写されたｍＲＮＡに少なくとも部分的に相補的であるように設計され、小型の核酸分子（すなわち、遺伝子サイレンシング核酸）によるｍＲＮＡの認識／結合は一般に、立体的なブロッキング／翻訳の阻止、またはｍＲＮＡの酵素的分解もしくは切断のいずれかを通じてｍＲＮＡの分解を誘発する。
一般に、ＲＮＡ干渉とは、約２１ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子が、相補的なｍＲＮＡ配列を有する特定の遺伝子の発現を強力にサイレンシングまたは抑制し得る機構である。植物から虫及びヒトにおよぶ生物は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＡＧＯ）タンパク質が小型のＲＮＡに結合して遺伝子発現をサイレンシングさせる内因性ＲＮＡサイレンシングシステムを有する。ヒトでは、遺伝子サイレンシング核酸（すなわち、ｓｉＲＮＡガイド鎖）に完全に相補的なＲＮＡを切断及び分解するか、または不完全に相補的なｍＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ遺伝子サイレンシング核酸の場合など）の翻訳を抑制することにより、遺伝子発現が低減される。ヒトにおいて、小型のＲＮＡ遺伝子サイレンサーの主要クラスは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、これは、部分的に相補的な結合部位を有するｍＲＮＡの翻訳を抑制することによって大きな遺伝子ネットワークを調節する（Ｆａｂｉａｎ、２０１０、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、７９：３５１）。ｍｉＲＮＡは、発達、腫瘍形成及び神経変性疾患の必須の調節因子である（Ｐｅｎｃｈｅｖａ、２０１３、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１５：５４６；Ｃｒｏｃｅ、２００９、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、１０：７０４；Ａｂｅ、２０１３、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２３：３０）。これらのｍｉＲＮＡの重要な役割により、いくつかの企業は、ｍｉＲＮＡを阻害または置換するＲＮＡ系薬物を開発した。例えば、Ｃ型肝炎の第ＩＩ相臨床試験におけるｍｉＲＮＡベースの治療薬は、明らかな臨床的利点を示している。他のｍｉＲＮＡ治療剤は、癌、心疾患、及び炎症性腸疾患及び関節炎などの炎症性障害に関して開発中である。
完全に相補的なｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡの酵素的切断及び分解を誘発し、単一の遺伝子の徹底的で迅速かつ特異的なサイレンシングを誘発する。これらの完全に相補的な小型ＲＮＡ（しばしばｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉと呼ばれる）は、特定の遺伝子の機能を研究するために研究で頻繁に使用され、患者の治療的処置のために開発中である。例えば、前臨床試験では、ｓｉＲＮＡの単回投与は、ごくわずかなオフターゲット効果で肝臓において６週間、遺伝子発現の８０％超を排除し得る（Ｃｏｅｌｈｏ、２０１３、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６９：８１９；Ｋａｎａｓｔｙ，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１２：９６７）。単一のｓｉＲＮＡを有する特定の遺伝子、またはｓｉＲＮＡのプールを有する遺伝子の選択された群の発現をほぼ完全に排除する能力は、病態を引き起こすウイルスまたは遺伝的に変異したタンパク質によって引き起こされるものから始まる多くの疾患について、例えば、ハンチントン病及びがんにおいて、多数の治療能力を有する。ウイルスＲＮＡ、または細胞ＲＮＡが、疾病を引き起こすタンパク質を生成する前にほぼ完全に排除されることは、これらの疾患に対する強力な治療戦略となり得る。ＲＮＡｉはまた、細胞応答を調整すること、または所与の経路もしくは生理学的プロセスに対するコンビナトリアル効果を増強することによって、既存の薬物の有効性を増大させるために使用されてもよい。
ＲＮＡサイレンシングの強力な可能性は、いくつかの大規模なＲＮＡｉ治療プログラムの急速な発展をもたらした。しかしながら、これらの治療剤の薬物送達は、重要な課題を提示している（Ｋａｎａｓｔｙ、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１２：９６７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、２００９、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、８：１２９）。肝臓への送達は、現在、臨床的に頑強であるようである。肝臓を標的とするｍｉＲＮＡ及びＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ治療剤は、いくつかの第ＩＩ相臨床試験中である。しかし、他の臓器や細胞種への送達にともなう課題によって、がん、心疾患、炎症性疾患及び神経変性疾患のための他の有望な小分子ＲＮＡ治療薬の進歩が遅れている（Ｋａｎａｓｔｙ、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１２：９６７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、２００９ 、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、８：１２９）。
脂質粒子、ｓｉＲＮＡ修飾、ナノ粒子、及びアプタマーを含む、ＲＮＡｉ治療薬を送達するための多くの戦略が試験されている（Ｋａｎａｓｔｙ、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１２：９６７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、２００９、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、８：１２９）。大型の帯電した薬物は、その有窓内皮によって肝臓に容易に浸透する。肝臓への効率的な送達は、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）及び次世代リポソーム技術（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、２００６、Ｎａｔｕｒｅ、４４１：１１１；Ｈａｕｓｓｅｃｋｅｒ、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、１：ｅ８）のような進歩したリポソーム技術を用いて達成された。肝臓送達はまた、ＧａｌＮＡｃで化学的に修飾されたｍｉＲＮＡ分子、または複合ポリマーを用いて臨床的に達成され得る。同様のアプローチを用いて他の組織に送達することは、あまり成功しておらず、他のＲＮＡｉ治療剤を臨床試験及び治療用途に導く障害となっている（Ｃｏｅｌｈｏ、２０１３、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６９：８１９；Ｋａｎａｓｔｙ、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１２：９６７；Ｈａｕｓｓｅｃｋｅｒ、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、１：ｅ８）。
最近の研究によって、細胞間で大きな分子を輸送する内因性システムが、ｓｉＲＮＡ（Ｒａｐｏｓｏ、２０１３、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００：３７３；Ｖａｌｉｄｉ、２００７、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、９：６５４）のような特定の治療剤のための薬物送達ビヒクルとして適切であり得ることが実証された。小さい小胞（４０〜１２０ｎｍ）であるエキソソームと呼ばれる細胞外小胞は、細胞間でＲＮＡを含む分子を伝達し、ＲＮＡｉ治療剤などの薬物をエキソソームにパッケージングできれば、エキソソームは、それらを複数の組織、例としては、心臓、肝臓、及び肺に送達し、さらには血液脳関門を横切って神経へ送達することが一連の研究によって実証されている（Ｚｈｕａｎｇ，２０１１、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１９：１７６９；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ、２０１１、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２９：３４１）。例えば、エキソソームは、マウスに鼻腔内注射された場合、クルクミンのような薬物を脳に送達した（Ｔｈｅｒｙ、２００６、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、ｃｈａｐｔｅｒ ３、Ｕｎｉｔ ３ ２２）。末梢に静脈注射されたエキソソームは、ＲＮＡｉ治療剤を脳内に送達し、脳内の標的の発現の６０％低下を達成し得る（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ、２０１１、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９：３４１）。これらの知見は、ＲＮＡｉ治療剤及び他の薬物に対する薬物送達ビヒクルとしてのエキソソームの強力な可能性を実証している。しかし、遺伝子サイレンシング核酸をエキソソームへパッケージングすることは、依然として特に困難な課題である。
これまでにＧＭＰ臨床等級のエキソソームのスケールアップされた生産が研究されている（Ｌａｍｐａｒｓｋｉ、２００２、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２７０：２１１）。エキソソームは、潜在的に抗原提示及び免疫応答を変化させる能力に最初は基づいて、潜在的な癌治療剤として研究されてきた。しかしながら、エキソソームの免疫原性を最大にする試みは、いくつかの臨床試験においては癌患者における腫瘍応答に最小限の影響しかもたらさなかった（Ｖｌａｕｄ、２０１１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３４：６５）。この証拠によって、臨床等級のエキソソームが製造され得ること、及びエキソソームが一般に非毒性であり、免疫原性が最小であるこが示される。これらのプロセスの確立から得られた知識は、薬物送達のための臨床等級のエキソソームの産生を促進し得る。実際に、高度に免疫原性の樹状細胞由来のエキソソームでさえ、いくつかの臨床治験において癌患者における腫瘍応答に無視できる影響しか及ぼさなかったので、他の細胞種由来のエキソソームは、薬物送達に用いられる場合、免疫原性が最小限であり得る。適切なエキソソームの臨床的使用は、薬物送達ビヒクルとして実行可能かつ安全であり得ることが証拠によって示唆されている。
エキソソームは、その表面に原形質膜受容体のサブセットを有し、その内部に細胞質の内容物を有する４０〜１２０ｎｍの小胞である。エキソソームは、小胞の多胞性エンドソームと呼ばれるエンドソームの内腔への出芽によって産生される。多膜性エンドソームと原形質膜との融合は、封入された小胞、エキソソームを細胞外空間に放出する（Ｃｏｌｏｍｂｏ、２０１４、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、３０：２５５）。この固有の生合成的なプロセスに起因して、エキソソームは、その表面に原形質膜受容体の独特なサブセットを含む。エキソソームに強力な濃縮を生じ得る原形質膜受容体のいくつかの特性が明らかにされている。この知識によって、特定の細胞及び組織を標的とするためにエキソソームを設計し得、かつ、これを使用してきた。エキソソームに富む受容体の特性（例えば、ミリストイル化（Ｆａｎｇ、２００７、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ、５：ｅ１５８）、Ｃ１Ｃ２ドメイン（Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ、２００８、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６８：１２２８）、ＬＡＭＰ２細胞質ドメイン（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ、２０１１、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２９：３４１）を使用して、エキソソーム表面上の新しい受容体の濃縮を操作して、脳または乳癌のような特定の組織を標的としてもよい（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ、２０１１、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９：３４１；Ｏｈｎｏ、２０１３、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２１：１８５）。実際に、特定のドメイン（例えば、Ｃ１Ｃ２、ＬＡＭＰ２細胞質ドメイン）は、それらがエキソソーム上で選択的に選別される、原形質膜受容体上に付着され得る。したがって、薬物送達ビヒクルとしてエキソソームを用いる主な障害のうちの２つ（大量産生及び組織特異的標的化）には、そのような方法で取り組んでもよい。
しかし、遺伝子サイレンシング核酸のような治療用核酸のための薬物送達ビヒクルとしてエキソソームまたはエキソソーム様小胞を使用する主な残りの主な障害は、おそらく、エキソソームにｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ／ｍｉＲＮＡ、または他の目的の核酸をパッケージする能力であり得る。エキソソームは、それらを産生する細胞と比較して、タンパク質及びＲＮＡの両方の高度に選択的な内容物を有する。例えば、いくつかのｍｉＲＮＡは、細胞内で事実上検出されず、エキソソームには豊富である。残念なことに、細胞性ｍｉＲＮＡが、そこから生成されたエキソソームにおいて検出されない場合、その逆が真実である場合が多い。したがって、遺伝子サイレンシング核酸などの所望の核酸配列をエキソソームにパッケージングするための技術戦略、ならびにエキソソーム内でのそれらの濃縮が望ましい。
エキソソーム中でｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡを濃縮するための戦略を同定するためのいくつかの試みがなされている。エキソソームにおけるＲＮＡの濃縮を引き起こす配列モチーフの検索は、結果が混在している。最初の検索では、推定上の短いモチーフがいくつか判明したが、これらのモチーフがエキソソームにＲＮＡをソートする能力は試験されなかった（Ｂａｔａｇｏｖ、２０１１、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１２（３）：Ｓ８；Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ−Ｂｅｌｔｒｉ、２０１３、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，４：２９８０）。最近の論文では、ｍｉＲＮＡのヘキサヌクレオチドモチーフが、エキソソームで２〜５倍濃縮を促進し得ることが示唆されている（Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ−Ｂｅｌｔｒｉ、２０１３、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ、４：２９８０）。この比較的穏やかな効果が他の細胞種で維持されているか否かは、試験されていない。臨床等級のエキソソームの産生に最も適合したような異なる細胞種によって産生されたエキソソームは、生合成機構及び他の特性を一貫して共有し得ないことが新しい証拠によって示唆されているので、これは特に重要である。いくつかの研究では、エキソソームにＲＮＡｉ治療剤を推定的に導入するためのエレクトロポレーションまたは関連する方法が用いられている（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９：３４１（２０１１））。臨床使用のための大量生産における一貫したエキソソーム機能を保持する方式で、１００ｎｍの直径を有する小胞の膜において５−１０ｎｍ（ＲＮＡｉ治療剤〜５ｎｍ）の孔を一貫して生成する能力に関して、多くの疑念が提起された。事実、その後の検討により、同一の技術を用いてエレクトロポレーションされたときに大部分のＲＮＡｉ治療剤が沈殿することが実証された（Ｋｏｏｉｊｍａｎｓ、２０１３、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、１７２：２２９）。これによって、エキソソームへのＲＮＡｉ治療剤の物理的導入が、一貫した純粋なエキソソーム生成物を生成する可能性は低いことが示唆される。現在までに、記載されたエキソソーム内に目的の核酸をパッケージングするための広く適用可能でかつ堅強な機構は存在していない。
目的の核酸をエキソソームにパッケージングするため、及び／または目的の核酸を細胞に送達するための代替、追加及び／または改良された方法が望ましい。
一実施形態では、本明細書において、遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、またはその前駆体を含むエキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生するための方法が提供され、この方法は：
− ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた、遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、またはその前駆体を含む核酸構築物をエキソソーム産生細胞に導入すること、またはエキソソーム産生細胞内で発現させること；ならびに
− この細胞からエキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生すること、
を包含する。
上記方法の別の実施形態では、本方法は、生成されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞を回収または濃縮する任意のステップをさらに包含し得る。
上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、平滑末端、５’オーバーハング、３’オーバーハング、または５’及び３’ルース（ｌｏｏｓｅ）末端を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約２５〜５４ヌクレオチド（ｎｔ）の全長を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、または５２ヌクレオチド（ｎｔ）の全長を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約４、５、６、７または８ｎｔのループ全長を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ステム内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチを有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、Ｄｒｏｓｈａ切断部位に隣接する最初の３つの塩基対内に位置するステム内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチを有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記方法（複数可）の別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、５’オーバーハング部分及び３’塩基対部分を含むように、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、Ａｇｏ２切断位置まで、またはＡｇｏ２切断位置の前または後に伸長する３’末端を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。一例として、特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、全長から短くなっており、かつ全長マイナス１（−１）ヌクレオチドと成熟長との間におさまるか、またはそれらの間にあり得る、５’オーバーハング部分及び３’塩基対（または実質的に塩基対、または部分的に塩基対合した）部分を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、成熟ｍｉＲ−４５１を模倣する必要に応じてループ由来配列である３’部分を含む一本鎖構造を含み得る。特定のさらなる実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、長さが約２２〜３５ｎｔであり得る。特定のさらなる実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、長さが約２３〜２４ｎｔであり得る。
上記方法（複数可）の別の実施形態では、細胞は、ｍｉＲ−４５１で濃縮されたエキソソームを天然に産生する細胞であり得る。
上記方法（複数可）のさらに別の実施形態では、細胞は、初代ヒト間葉系幹細胞、初代マウスマクロファージ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などのヒト乳癌細胞株、マウスもしくはヒトの神経細胞株、例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａもしくはＳＨＳＹ、Ｃ８ＤａもしくはＳＩＭなどのマウス星状細胞株、ＢＶ２などのマウスミクログリア細胞株、ＮＳＣ−３４もしくはＭＮ−１などのマウス運動ニューロン細胞株、ＨｅＬａ、マウス胚線維芽細胞、またはマウスＪＡＷＳ ＩＩのような樹状細胞であってもよい。特定の実施形態では、細胞は、ＭＥＦまたはＪＡＷＳＩＩ細胞であってもよい。
上記の方法（複数可）のある実施形態において、遺伝子サイレンシング核酸は、成熟ｍｉＲ−４５１ではない遺伝子サイレンシング核酸であってもよい。
上記の任意の方法のさらなる実施形態において、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１もしくはＨ９細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または低いＡｇｏ２の発現もしくは活性レベルを有する細胞であってもよい。例として、低Ａｇｏ２発現または活性レベルを有する細胞としては、Ｃｒｉｓｐｒ、ＴＡＬＥＮジンクフィンガー、または当業者に公知の他の方法のような技術を用いて、黒色腫細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、ＭＣＦ−７細胞株、レナリドマイドで処理された細胞、またはＡｇｏ２の遺伝子欠失のある由来細胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞は、Ａｇｏ２ノックアウト細胞であってもよい。
上記のような任意の方法のなおさらなる実施形態において、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ９細胞であってもよい。
上記のような任意の方法のさらに別の実施形態において、遺伝子サイレンシング核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、Ｃｒｉｓｐｒ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡであってもよく、またはそれらの前駆体であってもよく、またはそれら由来であってもよい。
上記の任意の方法のさらなる実施形態において、細胞は、無血清培地中で培養されても、もしくは血清の非存在下で培養されてもよいし、または一方でエキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生しながら、エキソソーム及び／もしくはエキソソーム様小胞を除去もしくは取り除くために特異的に処理された血清（すなわち、エキソソームが枯渇した血清培地）中で培養されてもよい。
上記の任意の方法のさらに別の実施形態において、本方法は、細胞によって産生されたエキソソームを精製または濃縮することをさらに包含し得る。
上記の任意の方法のさらに別の実施形態において、エキソソームまたはエキソソーム様小胞は、無血清培地から、または血清培地（エキソソーム内容物及び／もしくはエキソソーム様小胞内容物を除去または減少させるために事前に処理または加工された）（すなわち、エキソソームが枯渇した血清培地）から精製されてもまたは濃縮されてもよい。
上記の任意の方法（複数可）のさらに別の実施形態において、本方法は、リソソームまたは自食作用阻害剤でエキソソーム産生細胞を処理するステップをさらに包含し得る。非限定的な例として、このような阻害剤は、例えば、バフィロマイシンＡ１、コンカナマイシンまたはクロロキンを含んでもよい。
上記の任意の方法（複数可）のさらに別の実施形態において、本方法は、エキソソーム産生細胞におけるＡｇｏ２の発現または活性を阻害するステップをさらに包含し得る。特定の実施形態において、Ａｇｏ２は、例えば、限定するものではないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの遺伝子サイレンシング核酸を使用して阻害してもよい。特定の実施形態において、Ａｇｏ２は、例えば、ＢＣＩ−１３７または別の適切なＡｇｏ２阻害剤を用いて阻害されてもよい。
別の実施形態では、本明細書において、
−エキソソームまたはエキソソーム様小胞；及び
−ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸、またはその前駆体もしくは切断断片（酵素切断断片などであるがこれに限定されない）を含む核酸構築物；
を含む組成物が提供され、
ここで、この核酸構築物、またはその前駆体もしくは酵素的切断断片は、エキソソームもしくはエキソソーム様小胞の内側、エキソソームもしくはエキソソーム様小胞の外側、またはそれらの組み合わせである。
上記の組成物のある実施形態において、遺伝子サイレンシング核酸は、成熟ｍｉＲ−４５１ではない遺伝子サイレンシング核酸であってもよい。
上記の任意の組成物のさらなる実施形態では、組成物は、１つ以上のエキソソーム産生細胞をさらに含んでもよい。
上記の任意の組成物のさらに別の実施形態において、組成物はさらに、エキソソーム及び／もしくはエキソソーム様小胞を含まない無血清培地、またはエキソソーム内容物及び／もしくはエキソソーム様小胞内容物を除去もしくは低減するために事前に処理もしくは加工された血清培地、例えば、エキソソームが枯渇した血清培地を含んでもよい。
上記の任意の組成物（複数可）のさらに別の実施形態において、上記組成物は、リソソーム阻害剤、自食作用阻害剤、またはＡｇｏ２の発現もしくは活性の阻害剤のうち少なくとも１つをさらに含んでもよい。
別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物の使用であって、上記遺伝子サイレンシング核酸を、エキソソーム産生細胞によって産生される、エキソソームまたはエキソソーム様小胞にパッケージングするための使用（ここで、この核酸構築物は、上記細胞への導入またはそのような細胞における発現のためである）が本明細書で提供される。
上記の使用のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の使用（複数可）のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約２５〜５２ヌクレオチド（ｎｔ）の全長を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の使用（複数可）のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、または５２ヌクレオチド（ｎｔ）の全長を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の使用（複数可）のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約４、５、６、７または８ｎｔのループ全長を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の使用（複数可）のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ステム内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチを有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の使用（複数可）のさらに別の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、Ｄｒｏｓｈａ切断部位に隣接する最初の３つの塩基対内に位置する少なくとも１つの塩基対ミスマッチを有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の使用（複数可）のさらに別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、５’オーバーハング部分及び３’塩基対形成部分を含むように、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、Ａｇｏ２切断位置まで、またはＡｇｏ２切断位置の前または後に伸長する３’末端を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
上記の使用（複数可）の別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、成熟ｍｉＲ−４５１を模倣する、必要に応じてループ由来配列である３’部分を含む一本鎖構造を含んでもよい。特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、長さが約２２〜３５ｎｔであってもよいし、または長さが２２ｎｔ、長さが３５ｎｔ、またはそれらの間の任意の個々の整数値であってもよい。特定の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、長さが約２３〜２４ｎｔであってもよい。
上記の使用（複数可）の別の実施形態において、細胞は、ｍｉＲ−４５１で濃縮されたエキソソームを天然に産生する細胞であってもよい。
上記の使用（複数可）のさらに別の実施形態では、細胞は、初代ヒト間葉系幹細胞、初代マウスマクロファージ、ヒト乳癌細胞株、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、マウスもしくはヒト神経細胞株、例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａもしくはＳＨＳＹ、マウス星状細胞株、例えば、Ｃ８ＤａもしくはＳＩＭ、マウスミクログリア細胞株、例えば、ＢＶ２、マウス運動ニューロン細胞株、例えば、ＮＳＣ−３４もしくはＭＮ−１、ＨｅＬａ、マウス胚線維芽細胞、またはマウス樹状細胞、例えば、ＪＡＷＳ ＩＩであってもよい。特定の実施形態では、細胞は、ＭＥＦまたはＪＡＷＳＩＩ細胞であってもよい。
上記のような任意の使用のある実施形態において、遺伝子サイレンシング核酸は、成熟ｍｉＲ−４５１ではない遺伝子サイレンシング核酸であってもよい。
上記の任意の使用のさらなる実施形態では、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１もしくはＨ９細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または低いＡｇｏ２の発現もしくは活性レベルを有する細胞であってもよい。
上記の任意の使用のなおさらなる実施形態において、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ９細胞であってもよい。
上記のような任意の使用のさらに別の実施形態において、遺伝子サイレンシング核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡであってもよいし、またはそれらに由来してもよい。
上記のような任意の使用のさらなる実施形態において、細胞は、無血清培地中で培養されてもよく、またはエキソソーム内容物及び／もしくはエキソソーム様小胞内容物を除去もしくは減少させるために事前に処理もしくは加工された血清培地（すなわち、エキソソーム枯渇血清培地）中で培養されてもよい。
上記の使用（複数可）のいずれかのさらに別の実施形態において、核酸構築物は、リソソーム阻害剤、自食作用阻害剤、またはＡｇｏ２の発現もしくは活性の阻害剤のうち少なくとも１つと組み合わせて使用されてもよい。
別の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物が本明細書に提供される。
上記のような核酸構築物のさらなる実施形態では、核酸構築物は、遺伝子サイレンシング核酸またはその前駆体を、エキソソーム産生細胞によって産生されるエキソソームまたはエキソソーム様小胞にパッケージングするためのものであってもよい（ここで、核酸構築物は、細胞への導入または細胞における発現のためのものである）。
上記の任意の核酸構築物のさらなる実施形態において、遺伝子サイレンシング核酸は、成熟ｍｉＲ−４５１ではない遺伝子サイレンシング核酸であってもよい。
別の実施形態では、目的の核酸配列またはその前駆体で濃縮されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞を調製するための方法であって：
−ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた目的の核酸配列を含む核酸構築物をエキソソーム産生細胞に導入すること、またはエキソソーム産生細胞中で発現させること；ならびに
−この細胞がエキソソームまたはエキソソーム様小胞を生成することを可能にすること、
を包含する方法が提供される。
上記方法の別の実施形態では、本方法は、生成されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞を回収または濃縮する任意のステップをさらに含んでもよい。
上記方法（複数可）のさらに別の実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸は、成熟ｍｉＲ−４５１ではない遺伝子サイレンシング核酸であり得る。
一実施形態では、核酸送達組成物であって、
− エキソソームまたはエキソソーム様小胞；及び
− ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体、またはその前駆体もしくは切断断片に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物；
を含み、ここで上記核酸構築物またはその前駆体もしくは切断断片は、エキソソームまたはエキソソーム様小胞の内側に含まれるかもしくはパッケージングされるか、エキソソームまたはエキソソーム様小胞の外側に保持されるか、またはそれらの組み合わせ内である、核酸送達組成物が本明細書で提供される。
上記のような核酸送達組成物のある実施形態において、遺伝子サイレンシング核酸は、成熟ｍｉＲ−４５１ではない遺伝子サイレンシング核酸であってもよい。
上記のような核酸送達組成物のさらなる実施形態では、エキソソームまたはエキソソーム様小胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１もしくはＨ９細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または別の細胞によって本明細書に記載のとおり産生され得る。
上記の核酸送達組成物のさらに別の実施形態では、エキソソームまたはエキソソーム様小胞は、無血清培地中で、またはエキソソーム内容物及び／もしくはエキソソーム様小胞内容物を除去もしくは低減するために事前に処理もしくは加工された血清培地（すなわち、エキソソーム枯渇血清培地）で培養された細胞によって産生され得る。
別の実施形態では、本明細書において、遺伝子サイレンシング核酸によって標的される遺伝子の細胞発現をサイレンシングするための上記の核酸送達組成物の使用が提供される。
別の実施形態では、候補となるエキソソーム産生細胞が、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた、遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、またはその前駆体を含む核酸構築物を使用して、濃縮されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生するのに適したエキソソーム産生細胞であるか否かを同定する方法であって：
上記候補エキソソーム産生細胞によって産生されたエキソソームのｍｉＲ−４５１含量を定量し、ｍｉＲ−４５１がエキソソームで濃縮されているか否かを決定すること；
を包含し、
ここでｍｉＲ−４５１のエキソソーム濃縮は、候補のエキソソーム産生細胞が、濃縮されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞の産生に適していることを示す、方法が提供される。
上記方法のさらに別の実施形態において、ｍｉＲ−４５１のエキソソーム濃縮は、ｍｉＲ−４５１ではない参照内在発現ｍｉＲＮＡのエキソソームレベルと、ｍｉＲ−４５１のエキソソームレベルとを比較することによって決定してもよい。
上記方法のさらに別の実施形態において、参照内在発現ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１６もしくはｌｅｔ−７ａ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
エキソソームを産生するための上記方法（複数可）のいずれかの別の実施形態において、この方法は、エキソソーム産生細胞をリソソームまたは自食作用阻害剤で処理するステップをさらに包含し得る。
エキソソームを産生するための任意の上記の方法（複数可）のさらに別の実施形態において、上記方法は、エキソソーム産生細胞におけるＡｇｏ２の発現または活性を阻害するステップをさらに包含し得る。特定の実施形態において、Ａｇｏ２は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または他の遺伝子サイレンシング核酸を用いて阻害され得る。
実施形態は、当業者に意図された例示的な目的のために提供されており、決して限定することを意味しないことは理解されよう。
図１Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌上皮系）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の培地からのエキソソーム濃縮の実証を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＥＦ細胞からのエキソソーム調製物のサイズ（ｘ軸）の動的光散乱解析。図１Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌上皮系）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の培地からのエキソソーム濃縮の実証を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＥＦ細胞からのエキソソーム調製物中の小胞のサイズのナノサイト粒子追跡解析。図１Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌上皮系）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の培地からのエキソソーム濃縮の実証を示す。エキソソームマーカー（Ｆｌｏｔｔｉｌｉｎ２、Ｔｓｇ１０１、Ａｌｉｘ）、他の区画のマーカー（Ｔｏｍ２０、ミトコンドリア）についての、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＥＦ細胞からの等量（μｇタンパク質）の全細胞溶解物及びエキソソーム調製物のウエスタンブロット解析。図１Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌上皮系）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の培地からのエキソソーム濃縮の実証を示す。（Ｄ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＥＦ細胞からのエキソソーム調製物の代表的な電子顕微鏡画像。 図２Ａは、ｍｉＲ−４５１の固有の生合成経路を示す。Ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１は、ＤＩＣＥＲ非依存性及びＡＧＯ２依存性の様式で切断される、さらに短いヘアピン構造である。Ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１は、Ｄｉｃｅｒによる切断を必要としないｍｉＲＮＡの固有の例である。Ｄｒｏｓｈａによる最初の切断後、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ２（ＡＧＯ２）によって、ほとんどのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡよりも短いヘアピン構造へ切断される。得られたＲＮＡの３’末端のその後のトリミングは、成熟ｍｉＲ−４５１を生成する。いくつかの研究によって、様々な他のｍｉＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡが、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格に挿入され、有効な成熟サイレンシングＲＮＡになるためにＤｉｃｅｒ非依存性、ＡＧＯ２依存的方式でやはり処理されることが実証されている（Ｃｈｅｌｏｕｆｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０；Ｃｉｆｅｎｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０；Ｙａｎｇ、ＰＮＡＳ、２０１０、Ｙａｎｇ ＲＮＡ ２０１２）。実際に、成熟ｍｉＲ−４５１の配列（図２Ａの項目４）は、事実上任意の他の適切なＲＮＡ配列で置換されてもよく、プロセシングは一般的に同じ方法で行ってもよい。例として、本明細書に提供されるデータによって、成熟ｍｉＲ−４５１が、例えば、ｍｉＲ−１０６またはｍｉＲ−１５５で置き換えられ得ることが示される。図２Ｂは、ｍｉＲ−４５１の固有の生合成経路を示す。標準的なｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（典型的には約７０−１２０ヌクレオチド及び二本鎖ヘアピンループ構造を有する）は、ＤＲＯＳＨＡによる初期プロセシング後に、ＤＩＣＥＲによって切断される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲによって切断されて、短い約２１ヌクレオチド二本鎖ＲＮＡを生成する。１つの鎖を除去した後、ここに示したｍｉＲ−１６などの成熟ｍｉＲＮＡが生成される。ｍｉＲＮＡの各タイプの生合成の逐次的なステップに番号付けしている。 図３Ａによって、ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１骨格に挿入すると、ｍｉＲＮＡがエキソソームに強く濃縮されることが示される。内在性ｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−４５１）の比率を、ＲＴ−ｑＰＣＲによりエキソソーム及びエキソソーム産生細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において測定した。ｙ軸はｌｏｇ１０である。ｍｉＲ−４５１は、エキソソーム中で非常に濃縮されている。図３Ｂによって、ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１骨格に挿入すると、ｍｉＲＮＡがエキソソームに強く濃縮されることが示される。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格中へのｍｉＲ−１０６またはｍｉＲ−１５５の挿入により、それらはエキソソーム中で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から、ｍｉＲ−４５１に匹敵するレベルまで濃縮される。図３Ｃによって、ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１骨格に挿入すると、ｍｉＲＮＡがエキソソームに強く濃縮されることが示される。エキソソーム及びエキソソーム産生細胞（ＭＥＦ、マウス胚線維芽細胞）において、内因性ｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−１５５）の比率を、ＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した。ｙ軸は、ｌｏｇ１０である。ｍｉＲ−４５１は、これらの細胞において内因的に発現されない。図３Ｄによって、ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１骨格に挿入すると、ｍｉＲＮＡがエキソソームに強く濃縮されることが示される。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格にｍｉＲ−１０６またはｍｉＲ−１５５を挿入すると、ＭＥＦ細胞由来のエキソソーム中で高度に濃縮される。 図４では、特定の条件下では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格へのｍｉＲＮＡの挿入は、エキソソームにおいて１０００倍までのｍｉＲＮＡの濃縮を引き起こし得ることが示される。ＭＥＦ細胞を、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−１５５またはｍｉＲ−１０６を含むｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１発現プラスミドでトランスフェクトし（「技術」）、エキソソームを精製し、エキソソーム及び細胞でＲＴ−ｑＰＣＲを行った。Ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１は、細胞内の挿入されたｍｉＲＮＡのレベルへの影響は無視できたが、エキソソームではｍｉＲＮＡの１００〜１０００倍の増大が生じた。 図５Ａは、胚性幹細胞（ＥＳ）が豊富なエキソソームを産生することを示す。エキソソームマーカーＡｌｉｘ、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ２及びＣＤ６３を用いたヒト胚性幹細胞からのエキソソーム調製物のウエスタンブロット。ＥＳ１は、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１である。ＥＳ２は、ヒトＥＳ細胞株ＥＳ２である。ＭＳＣ１−３は、Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙから得られた間葉系幹細胞の３つの調製物である。文献によると、ＭＳＣは、多くの細胞種より多くのエキソソームを産生する。ＥＳ細胞は、大量のエキソソームを放出するようであり、治療剤としてのエキソソームの大量生産に極めて有用であり得る。図５Ｂは、胚性幹細胞（ＥＳ）が豊富なエキソソームを産生することを示す。エキソソームマーカーＡｌｉｘ、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ２及びＣＤ６３を用いたヒト胚性幹細胞からのエキソソーム調製物のウエスタンブロット。ＥＳ１は、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１である。ＥＳ２は、ヒトＥＳ細胞株ＥＳ２である。ＭＳＣ１−３は、Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙから得られた間葉系幹細胞の３つの調製物である。文献によると、ＭＳＣは、多くの細胞種より多くのエキソソームを産生する。ＥＳ細胞は、大量のエキソソームを放出するようであり、治療剤としてのエキソソームの大量生産に極めて有用であり得る。図５Ｃは、胚性幹細胞（ＥＳ）が豊富なエキソソームを産生することを示す。ＥＳ細胞由来のエキソソームは、成熟ｍｉＲ−４５１へのｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のプロセシングに関与するタンパク質であるＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（ＡＧＯ２）も含む。結果によって、ＥＳ細胞エキソソームが、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格を用いるｓｉＲＮＡのローディングにとって特に興味深い候補であり得ることが示される。 図６Ａは、豊富なエキソソームを産生する幹細胞の選択を示す。相対的なエキソソーム量は、分画遠心分離によって調製したエキソソーム調製物の動的光散乱強度を用いて測定した。胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ９及び４つの遺伝的に異なる誘導多能性細胞（ｉＰｓ）のうちの１つが、検出可能なレベルのエキソソームを産生した。図６Ｂは、豊富なエキソソームを産生する幹細胞の選択を示す。エキソソームサイズは、同じエキソソーム調製物について動的光散乱によって測定した。ＥＳＣクローンＨ９由来のエキソソームは、小さい（６０ｎｍ）が、正常範囲（４０ｎｍ〜１２０ｎｍ）内に存在するエキソソームを産生することに留意されたい。図６Ｃは、豊富なエキソソームを産生する幹細胞の選択を示す。ＥＳＣクローンＨ１及び２つのバッチの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に対する動的光散乱によるエキソソームサイズ測定。図６Ｄは、豊富なエキソソームを産生する幹細胞の選択を示す。これらの細胞種からのエキソソーム調製物中のエキソソームマーカーＦｌｏｔｉｌｌｉｎ２のウエスタンブロットによって、エキソソームの存在及び相対存在量が示される。図６Ｅは、豊富なエキソソームを産生する幹細胞の選択を示す。相対エキソソーム量は、（Ｄ）と同様に細胞からのエキソソーム調製物の動的光散乱強度を用いて測定した；ウエスタンブロットと動的光散乱による豊富さとは密接に関連している。ＥＳＣクローンＨ１は、多数のエキソソームを産生すると広く見なされる、クローンＨ９よりも１０倍多くのエキソソーム、ＭＳＣよりも数倍多くのエキソソームを産生することに留意のこと。したがって、ＥＳＣクローンＨ１及びＭＳＣは、リード候補物として同定され得る。 図７によって、ｍｉＲ−４５１がヒト胚性幹細胞（Ｈ９株）由来のエキソソーム中で強力に濃縮されていることが示される。これによって、ヒト胚性幹細胞、特にこの細胞株がｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格を用いてエキソソームへのｓｉＲＮＡのパッケージングに特に興味深い場合があることが示唆される。 図８によって、核酸ステム−ループの骨格が、全長、ステム塩基対形成、及び／またはループ長さを変更し得る一方で、試験された条件下でエキソソーム中の目的の核酸（この例では、ｓｉＲＮＡ）の濃縮を依然として可能にすることが示される。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを挿入したｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１ステム−ループ骨格をコードするプラスミドを、示したとおり、野生型（ＷＴ）（Ａに示す）から変異させて、ステム（Ｂ）、ループ（Ｄ）を延長し、ステム（Ｃ）中での塩基対合を遮断した。これらのプラスミドを細胞にトランスフェクトして、エキソソームを２〜３日後に精製し、ＲＴ−ｑＰＣＲを行った。エキソソーム中のｍｉＲ−１６及びｌｅｔ−７ａに対して標準化したＧＦＰ ｓｉＲＮＡの量を定量し（濃縮倍数）、結果を（Ｅ）に示す。 図９では、様々なプロセシング段階を模倣するｍｉＲ−４５１のＲＮＡ誘導体が、３’オーバーハングを有する伝統的な二本鎖ｓｉＲＮＡよりも効率的にエキソソーム中で目的の組み込まれた核酸（この例ではｓｉＲＮＡ）を濃縮させ得ることが示される。様々なプロセシング段階で、ＷＴ ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１を模倣する合成ＲＮＡ構築物を、エキソソーム濃縮について試験した。構築物を細胞にトランスフェクトし、エキソソーム濃縮を、分画遠心分離によるエキソソーム精製後のＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。エキソソーム対細胞中のｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１６のレベルに対して、ｍｉＲ−４５１由来の成熟ｓｉＲＮＡを正規化した。試験した構築物としては、Ｄｒｏｓｈａプロセッシング後のＷＴｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１構築物（Ａ）、Ａｇｏ２切断バージョンの構築物（Ｂ）、及び成熟２２ｎｔ ｍｉＲ−４５１（エキソヌクレアーゼ活性後、ループ領域の一部を含む５’標的化部位を有する）（Ｃ）が挙げられる。比較のために、３’オーバーハング（Ｄ）を有する標準的な２１ｎｔ ｄｓＲＮＡ ｓｉＲＮＡも試験した。エキソソーム濃縮の結果を（Ｅ）に示す。 図１０は、Ａｇｏ２が、ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１構造模倣体に基づくｓｉＲＮＡ含有構築物のエキソソームへのパッケージングをある程度まで阻害することを示す。これらの実験では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれたＧＦＰまたはＴｅｔＲを標的にするｓｉＲＮＡ配列を含むプラスミドを、細胞にトランスフェクトし、エキソソーム対細胞中のＧＦＰまたはＴｅｔＲのｓｉＲＮＡのレベル（対ｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１６（エキソソーム細胞中））を、２〜３日後にｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。エキソソーム中のｍｉＲ−４５１由来配列の濃縮を、野生型エキソソームについて１に正規化した。Ｘ軸は、試験した細胞種（ＭＥＦ［マウス胚線維芽細胞］、Ａｇｏ２ノックアウトＭＥＦ、ＷＴＲ［野生型Ａｇｏ２でレスキューされたＡｇｏ２ノックアウトＭＥＦ］及びＣＤＲ（触媒的に失活したＡｇｏ２でレスキューされたＡｇｏ２ノックアウトＭＥＦ）を示す。 図１１Ａは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を用いて生成されたＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡをロードされたエキソソームによるマウス脳における遺伝子サイレンシングを示す。ＮＳＣ−３４マウス運動ニューロン細胞株に、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格に組み込まれたＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。５μｇのエキソソームを、ヒトＧ９３Ａ ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの脳室内空間に注射し、２日後にマウスを安楽死させた。組織を急速冷凍し、ＲＴ−ｑＰＣＲ及びＦＩＳＨのために処理した。皮質及び小脳における対照（β−アクチン及びＴＢＰ）と比較してＳＯＤ１を定量するために、Ｔａｑｍａｎプローブを用いるＲＴ−ｑＰＣＲ分析。図１１Ｂは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を用いて生成されたＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡをロードされたエキソソームによるマウス脳における遺伝子サイレンシングを示す。ＮＳＣ−３４マウス運動ニューロン細胞株に、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格に組み込まれたＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。５μｇのエキソソームを、ヒトＧ９３Ａ ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの脳室内空間に注射し、２日後にマウスを安楽死させた。組織を急速冷凍し、ＲＴ−ｑＰＣＲ及びＦＩＳＨのために処理した。マウス由来の皮質組織を、ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡ（ＥｘｉｑｏｎマイクロＲＮＡ ＩＳＨ、ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡ（ＳｔｅｌｌａｒｉｓプローブＱｕａｓａｒ ６７０）、ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（ＳｔｅｌｌａｒｉｓプローブＱｕａｓａｒ ５７０））のＦＩＳＨ分析のために処理した。代表的な落射蛍光画像を示す。図１１Ｃは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を用いて生成されたＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡをロードされたエキソソームによるマウス脳における遺伝子サイレンシングを示す。ＮＳＣ−３４マウス運動ニューロン細胞株に、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格に組み込まれたＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。５μｇのエキソソームを、ヒトＧ９３Ａ ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの脳室内空間に注射し、２日後にマウスを安楽死させた。組織を急速冷凍し、ＲＴ−ｑＰＣＲ及びＦＩＳＨのために処理した。ＳＯＤ１を標的とするサイレンシングＲＮＡでパッケージされたエキソソームを注射したマウス由来の皮質の４〜８画像にわたるＧＡＰＤＨシグナル強度に対するＳＯＤ１ ｍＲＮＡシグナル強度の定量。 図１２は、ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１構造模倣体を用いて生成したＧＦＰ標的化ｓｉＲＮＡをロードされたエキソソームが、選択された標的細胞におけるＧＦＰの発現を減少させたデータを示す。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれたＧＦＰ ｓｉＲＮＡを発現する構築物でトランスフェクトまたは形質導入されたエキソソーム産生ドナー細胞由来のエキソソームを、ＧＦＰ発現エキソソーム標的細胞（ＨｅＬａ、ＮＳＣ−３４またはＮｅｕｒｏ２ａ［Ｎ２Ａ］）と４８時間インキュベートし、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現を分析した。ＧＦＰ発現は、複数の異なるエキソソームドナー細胞から産生されたＧＦＰ ｓｉＲＮＡを含有するエキソソームによってＨｅＬａ細胞において減少した。 図１３は、本明細書に記載の選択核酸の核酸配列を示す。
好ましい実施形態の詳細な説明
上記の図は、当業者に意図された例示的な目的のために提供されており、決して限定することを意味しないことが理解されよう。
本明細書には、化合物、組成物、核酸構築物、核酸骨格、タグ、核酸構造模倣体、及び目的の核酸、例えば（限定はしないが）遺伝子サイレンシング核酸をエキソソームにパッケージングする方法が記載されている。非限定的な例として、本発明は、送達ビヒクルとしての使用のために、遺伝子サイレンシング核酸（例えば、限定はしないが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）をエキソソームにパッケージングする方法、核酸パッケージングされたエキソソーム、及びこのようなパッケージングされたエキソソームを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、目的の核酸を上記の核酸構築物に組み込むことによって、エキソソーム内の目的の核酸のパッケージングを行うために使用され得る核酸構築物が提供される。
実施形態及び実施例は、当業者にとって意図された例示的な目的のために提供され、決して限定することを意味しないことが理解されるであろう。
特定の実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、もしくはその前駆体で濃縮されるか、またはそれらを含むエキソソームを産生もしくは調製するための方法であって：
−ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた、遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、もしくはその前駆体を含む核酸構築物をエキソソーム産生細胞に導入すること、またはエキソソーム産生細胞内で発現させること；ならびに
−この細胞からエキソソームを産生すること、
を包含する方法が本明細書において提供される。
特定の実施形態では、上記の方法は、必要に応じて、産生されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞を回収または濃縮するさらなるステップを包含し得る。理解されるように、エキソソームまたはエキソソーム様小胞は、本明細書で提供される教示に関して当業者に公知の任意のいくつかの適切な方法によって精製され得る。例えば、エキソソームは、細胞及びより大きな小胞または細胞片が、１０〜２０，０００ｇまでの予備遠心分離ステップで排除される分別遠心分離によって精製されてもよく、そしてエキソソームは、結果として得られる上清から、ＳＷ２８またはＳＷ３２ローター（または他のロータータイプの等価物）で１時間、７０，０００ｇ以上の遠心分離によって、引き続いて濃縮され得る。エキソソームはまた、Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｘｏｑｕｉｃｋ、Ｅｘｉｑｏｎ ｍｉＲＣＵＲＹエキソソーム単離キット、もしくはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒの全エキソソーム単離キット（Ｔｏｔａｌ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）などの試薬を使用して沈殿させること、または同様の技術によって、精製してもよい。エキソソームはまた、真空ポンプ、タンジェンシャルフロー濾過または遠心濾過を用いたサイズに基づく濾過を使用して濃縮してもよい。このような方法では、細胞及びより大きな小胞または細胞片を、１００ｎｍより大きく、典型的には０．２２μｍの孔を有するフィルターを通すことによって除去してもよい。次いで、接線流濾過または他の濾過方法によって、１００ｎｍより小さい細孔を有するフィルターを用いてエキソソームを濃縮してもよい。エキソソームは、またアフィニティー精製によって精製してもよい。そのような方法では、エキソソームに結合する抗体または他のリガンドを、ビーズまたは他の固定された支持体に結合させて、液体からのエキソソームの捕捉、精製及び濃縮を可能にし得る。当業者は、本明細書の教示を考慮すれば、特定の用途に適した適切な収集または濃縮の技術を選択することができるであろう。
特定の実施形態では、核酸構築物とは、任意の適切なＲＮＡに基づく（または部分的にＲＮＡに基づく）核酸配列、またはその適切なＤＮＡ修飾及び／もしくは化学的に修飾されたアナログであって、核酸構築物の少なくとも一部が、遺伝子サイレンシング核酸／目的の核酸／またはその前駆体を含み、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のものを実質的に構造的に模倣する二次構造をとるように、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体配列内に組み込まれている、遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、またはその前駆体を含む核酸構築物を指し得る。特定の非限定的な実施形態では、本明細書に記載の核酸構築物は、構造的にｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１またはｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１の二次構造に類似し得ることが理解される。さらなる非限定的な実施形態では、適切な核酸構築物としては、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１二次構造を構造的に模倣する核酸の前駆体である、核酸構築物（すなわち、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１二次構造模倣体を産生するために酵素的にプロセシングされ得る核酸）が挙げられる。
ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１によって採用されると予測される二次構造は、以下のようなステム−ループ構造である：
（配列番号１）
この予測された二次構造は、非限定的な説明目的のために提供される。他の同様の二次構造も可能であり得ることが理解されよう。非限定的な例として、Ｙａｎｇ及びＬａｉ、ＲＮＡ、２０１２は、２−ｎｔループ（Ｙａｎｇ、Ｍａｕｒｉｎ、Ｌａｉ、ＲＮＡ、１８，９４５、２０１２）を予測するが、Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０は、４ ｎｔのループセクションを予測する。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｏｈｎｏら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｓｍａｌｌ Ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡｓ ｔｈａｔ ｄｏ ｎｏｔ Ｒｅｑｕｉｒｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ Ｄｉｃｅｒ ｏｒ Ａｇｏ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１６．８１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、さらに、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造の改変（これはｍｉＲＮＡへのプロセシングを可能にする）を記載しており、かつｍｉＲ−４５１プロセシング経路は依然として機能しているループを維持したままの約１４〜１５ｎｔまでのステムの短縮を記載する。
ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、上記に示されるか、または本明細書においてさらに詳細に記載されるような、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のものと実質的に構造的及び／または機能的に類似している二次構造を採用する配列を含む、任意の適切な核酸であってもよい。特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、１２〜２１ｎｔ長のステム、及び２〜１２ｎｔ長のループを有するステム−ループ構造を含む核酸であり得る。ある実施形態では、ステム−ループは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ｎｔ長のステム、及び２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ｎｔ長のループの任意の個々の組合せを含んでもよい。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１一次配列のいずれかを含む必要はないが、これは非限定的な実施形態において可能であり得る。
特定の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ステム−ループ二次構造を含んでもよい。特定のさらなる実施形態において、ステム−ループ二次構造は、例えば、平滑末端、５’オーバーハング、３’オーバーハング、または５’及び３’ルース末端を有してもよい。特定の非限定的な実施形態では、オーバーハングは、ステム−ループの一方のアームの他方のアームに対する延長であってもよい。特定の非限定的な実施形態において、オーバーハングは、例えば、約３ｎｔまでの長さであってもよい。
特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約２５〜５４ヌクレオチド（ｎｔ）の全長を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。特定の実施形態において、ステム−ループ二次構造は、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１または５２ヌクレオチド（ｎｔ）の全長を有し得る。特定の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約４、５、６、７または８ヌクレオチドの全体的なループ長を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ステム内に１つ以上の塩基対ミスマッチ（複数可）を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１ Ｄｒｏｓｈａ切断部位に隣接する最初の３塩基対内に位置する１つ以上の塩基対ミスマッチ（複数可）を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
以下にさらに論じるように、特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣配列のステム−ループ構造は、遺伝子サイレンシング核酸／目的の核酸／その前駆体、または少なくともその実質的な部分、またはそれに由来する適切な核酸配列を含んでもよい。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に、以下のように組み込まれてもよい：ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の５’ステム部分（及び必要に応じて、ループ領域及び／または３’ステムの一部）は、ｓｉＲＮＡ由来のガイド鎖によって置換されても、またはｓｉＲＮＡ由来であってもよく、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の構造模倣体のままであるために、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の３’ステム部分は適宜、少なくとも５’ステム部分の少なくとも実質的に逆相補配列である配列によって置換され、遺伝子サイレンシング核酸が組み込まれたｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体をもたらす。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の一次配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のものと似ていない場合もあるが、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の二次構造は、上記のようにステム−ループ構造を維持する。
特定の非限定的な実施形態では、適切な核酸構築物は、約４０〜６５ｎｔの配列長（作製された改変体次第で、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の長さにほぼ相当する）または最大で３００ｎｔまたはそれより大きい配列長（ｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１の長さにほぼ相当する）を有し得る。これらの核酸構築物またはその切断断片（限定されるものではないが、長さが１８〜３５ｎｔの酵素切断断片など）は、エキソソームにパッケージングされてもよく、及び、例えばｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡパッケージングを含む特定の実施形態では、エキソソーム内でのパッケージングの前、最中もしくはその後、またはその後に標的細胞内で、成熟ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡにプロセシングされてもよい。
さらなる非限定的な実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれ得る核酸の例としては、約１２〜３２ｎｔの長さを有するもの、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２ｎｔの長さの核酸が挙げられる。
上記及び下記の目的の核酸に加えて、目的の核酸としてはさらに、特定の実施形態では、活性化ＲＮＡ（例えば、プロモーター関連）、スプライシングに影響を与えるＲＮＡ、エピジェネティック状態に影響を与えるＲＮＡ、または他の適切なＲＮＡ、ＤＮＡもしくはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に収容され得る約１２〜３２ｎｔの長さを有する目的の化学的に修飾された核酸が挙げられる。
ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１ステム−ループ二次構造が実質的に保持される限り、及び／またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１機能が実質的に保持される限り、本明細書中に記載されるようなｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、内因性ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の配列由来の重要な配列バリエーションを有し得ることが理解される。非限定的な例として、適切な構造模倣体ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１と類似の長さを有するステム−ループ配列、及びｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格のものと類似のステム−ループ型構造を含んでよい（ここでこのステムは、約１２〜２１ｎｔ長であり、かつループは約４〜１２ｎｔ長である）。特定の非限定的な例では、より小さいループ、例えば２−３ｎｔループが可能である場合がある。
Ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体はまた、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の内因性の特性／機能、例えば酵素切断プロフィール及び／またはエキソソームパッケージング特徴を実質的に保持するｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１変異体及び改変体を構造的に模倣する核酸を含んでもよい。適切なｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１模倣体の例は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２７３，８７１号に記載されるような適切なｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を含んでもよい。
ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体はまた、特定の非限定的な実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１、またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１前駆体、またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の部分的にプロセシングされた中間体を構造的または機能的に模倣する核酸を、含み得る。特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、Ｄｒｏｓｈａ切断、Ａｇｏ２切断、及び／または３’エキソヌクレアーゼ切断産物を含む下流ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１プロセシングから生じる核酸の模倣体を含んでもよい。
特定の実施形態において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が５’オーバーハング部分及び３’塩基対合部分を含むように、Ａｇｏ２切断位置まで、またはその前に伸長する３’末端を有するステム−ループ二次構造を含んでもよい。
特定の他の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、成熟ｍｉＲ−４５１を模倣する、必要に応じてループ由来配列である３’部分を含む一本鎖構造を含んでもよい。一例として、そのようなｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、約２２〜３５ｎｔ長の一本鎖核酸、例えば、約２３〜２４ｎｔ長の一本鎖核酸を含んでもよい。
特定の非限定的な実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１模倣体は、ｍｉＲ−４５１前駆体を模倣する配列／構造を有する、任意の適切な核酸配列であってもよいことが理解される。非限定的な例として、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１模倣体は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のものと同様のＤｉｃｅｒ−非依存性のＡＧＯ−２依存的な様式でプロセシングされるか、及び／または内在性のｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の特性／機能、例えば、エキソソームパッケージング特徴を保持する核酸配列であってもよい。非限定的な実施形態では、その中に組み込まれる、遺伝子サイレンシング核酸などの目的の核酸を有するｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、目的の核酸またはその前駆体を産生するために、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のものと類似のＤｉｃｅｒ−非依存性のＡＧＯ−２依存性の方式でプロセシングされる任意の適切な核酸配列であり得る。特定の実施形態では、適切なｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の非限定的な例としては、ＡＧＯ２によって許容される適切な配列及び／または構造変化またはバリエーションを有し、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１型酵素プロセシングを損なわないｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が挙げられる。
全ての種類の細胞がエキソソームを産生／放出するわけではない。また、理解されるように、エキソソーム産生細胞とは、エキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生／放出する任意の細胞を指し得る。特定の実施形態では、エキソソーム産生細胞とは、他のエキソソーム産生細胞、またはＡｇｏ２が他のエキソソーム産生細胞に対して不足したエキソーム産生細胞と比較して、ｍｉＲ−４５１またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１が自然に濃縮されたエキソソーム産生細胞であり得る。さらなる実施形態では、エキソソーム産生細胞は、限定するものではないが、ヒト胚性幹細胞Ｈ９もしくはＨ１細胞、間葉系幹細胞、原発性樹状細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、形質細胞（Ｃｈｅｎｇ、２０１４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，３）、血清細胞（Ｃｈｅｎｇ、２０１４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、３）、肥満細胞（Ｖａｌａｄｉ、２００７、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、９：６５４）、グリア芽細胞腫細胞、Ｂ細胞、心臓前駆細胞、またはＭＳＣ細胞（Ｃｏｌｌｉｎｏ、２０１０、ＰＬｏｓ Ｏｎｅ、５：ｅ１１８０３）などの内因性ｍｉＲ−４５１が濃縮されているエキソソームまたはエキソソーム様小胞を天然に産生する細胞であってもよい。さらに別の実施形態では、エキソソーム産生細胞は、限定するものではないが、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、または２つの元の幹細胞の任意の分化型、樹状細胞、マクロファージ、単球、Ｔ細胞もしくはＢ細胞、線維芽細胞、または限定するものではないが、ＨｅＬａ、２９３ＴもしくはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株などの細胞株であってもよい。
特定の実施形態では、エキソソーム産生細胞は、ｍｉＲ−４５１で濃縮されたエキソソームを天然に産生する細胞であってもよい。特定のさらなる実施形態では、細胞は、初代ヒト間葉系幹細胞、初代マウスマクロファージ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などのヒト乳癌細胞株、マウスもしくはヒトの神経細胞株、例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａもしくはＳＨＳＹ、マウス星状細胞株、例えば、Ｃ８ＤａもしくはＳＩＭ、マウスミクログリア細胞株、例えば、ＢＶ２、マウス運動ニューロン細胞株、例えば、ＮＳＣ−３４もしくはＭＮ−１、ＨｅＬａ、マウス胚線維芽細胞、またはマウス樹状細胞、例えばＪＡＷＳ ＩＩであってもよい。例として、細胞は、ＭＥＦまたはＪＡＷＳＩＩ細胞であってもよい。
さらなる実施形態では、エキソソーム産生細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１もしくはＨ９細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または低いＡｇｏ２発現もしくは活性レベルを有する細胞、またはＡｇｏ２がノックアウトもしくは安定してサイレンシングされている細胞であってもよい。例として、低いＡｇｏ２発現または活性レベルを有する細胞としては、黒色腫細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、ＭＣＦ−７細胞株、レナリドマイドで処理した細胞、またはＣｒｉｓｐｒ、ＴＡＬＥＮジンクフィンガー、もしくは当業者に公知の他の方法などの技術を用いてＡｇｏ２が遺伝子欠損している由来細胞が挙げられる。低いＡｇｏ２発現または活性レベルを有する細胞についてのさらなる考察は、Ｖｏｌｌｅｒら、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ、ＰＬＯＳ Ｏｎｅ、２０１６，１１（８）：ｅ０１６１１６５；及びＸｕ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｌｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｇｏｎａｕｔｅ ２ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２０１６，１６：２９７，（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
特定の実施形態では、Ａｇｏ２は、例えば、ＢＣＩ−１３７または別の適切なＡｇｏ２阻害剤を用いて阻害され得る（例えば、Ｍａｓｃｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ａ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ２ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｕｔｅ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＮＢ４， ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，９（８），１６７４−１６７９；及びＳｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．、ＭｉｃｒｏＲＮＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｒｇｏｎａｕｔｅ ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ，２０１３，８（１０），２１２２−２１２６；及びＸｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５，７６（７），３７５−３８１にさらに記載されており；これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
特定の非限定的な実施形態では、エキソソーム産生細胞またはエキソソーム産生細胞によって産生されるエキソソームの特徴を改善するために、ｓｉＲＮＡまたは遺伝子発現ベクターのような遺伝子サイレンシング因子を使用することが可能であり得ることが理解されよう。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ剤を使用して、細胞エキソソーム産生を増大させるか、またはエキソソーム産生細胞またはそれから産生されるエキソソームの特徴を、具体化して、例えば、免疫原性、発癌性、毒性、またはそうでなければ望ましくない特性を低減することが可能である場合もある。特定の非限定的な実施形態では、細胞またはエキソソームの特性に影響を及ぼす別のｓｉＲＮＡがｐｒｉ−ｍｉＲ−１４４配列に挿入される、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１４４及びｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１（または本明細書に記載されるようなその構造模倣体）を含む転写物を使用することが可能である場合がある。
エキソソームを産生する細胞の例は、標準的な細胞培養条件における、最小から最大までのエキソソーム産生のおおよその順序で以下が挙げられ得る（ただし、これに限定されない）：
−グリア芽細胞腫細胞株Ｕ２５１−ＭＧ；
−ＨｅＬａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及びＨＣＴ−１１６細胞（中程度の量のエキソソームを産生する）のような上皮及び線維芽細胞；ならびに
−ニューロン、免疫及び血液細胞（樹状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、網状赤血球を含む）、間葉系幹細胞、及び胚性幹細胞（豊富なエキソソームを産生する）。
特定の非限定的な実施形態では、エキソソーム産生細胞はヒト細胞であってもよい。ヒト細胞によって産生されたエキソソームは、ヒト患者に導入された場合、マウス細胞由来のエキソソームと比較して免疫原性が低下する可能性があり、これは組織適合性複合体における差異の減少によるものである可能性がある（Ｂａｃｈ、１９８７、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３１７：４８９）。
別の非限定的な実施形態では、エキソソーム産生細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１もしくはＨ９細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であってもよい。
別の非限定的な実施形態では、エキソソーム産生細胞は、処置される患者から誘導された多能性幹細胞のような、誘導された多能性幹細胞であってもよい。
特定の非限定的な実施形態では、エキソソーム産生細胞は、無血清培地中で培養されてもよいし、または、エキソソームもしくはエキソソーム様の小胞を産生しながら、エキソソーム内容物を除去もしくは減少させるために予め処理もしくは加工された血清培地（すなわち、エキソソーム枯渇血清培地）中で培養され、それによって、典型的な血清含有培地中に典型的に存在するエキソソームによる産生されたエキソソームの混入を防止または低減してもよい。
増殖のために血清含有培地を必要とする細胞に関与する特定の非限定的な実施形態では、血清培地を除去して、血清なしの培地に放出される、産生されたエキソソームの産生／回収中に血清を含まない培地中で一時的に細胞を培養することが可能であり得る。しかしながら、特定の場合、血清培地の急激な除去は、特定の細胞におけるエキソソーム産生を減少し得る。
一般的に、エキソソームは、典型的には、様々な細胞種によって放出される４０〜１５０ｎｍの小胞である。エキソソームは、脂質二重層及び内腔（ｌｕｍｉｎａｌ ｓｐａｃｅ）から構成され得、これは種々のタンパク質、ＲＮＡ及びエキソソーム産生細胞の細胞質に由来する他の分子を含む。エキソソームの膜と管腔の両方の内容物は、エキソソームを産生する細胞からの脂質、タンパク質及びＲＮＡの亜集団において選択的に濃縮され得る。エキソソーム膜は、コレステロール及びスフィンゴミエリンを含む脂質が濃縮されていることが多いが、必須ではなく、ホスファチジルコリンをほとんど含まない。エキソソームの膜は、特に、テトラスパン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１ ＣＤ９）、ＰｒＰ及びＭＨＣクラスＩ、ＩＩなどの細胞の原形質膜に由来する特定のタンパク質が濃縮され得る。エキソソーム管腔は、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ１及び２、アネキシン１及び２、熱ショックタンパク質、Ａｌｉｘ及びＴｓｇ１０１などのタンパク質が濃縮されている場合がある。エキソソームは、ｍｉＲ−４５１またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１に濃縮されている場合が多い。
本明細書に記載のエキソソームは、特定の非限定的な実施形態では、エキソソーム様小胞も包含し得ることが理解されるであろう。当業者は、本明細書のエキソソームへの言及は、典型的なエキソソームから幾分変化し得るが、なお機能的及び／または構造的に類似または関連する他の適切なエキソソーム様小胞を含み得ることを認識するであろう。
本明細書に記載のエキソソーム産生細胞は、特定の非限定的な実施形態において、エキソソーム様小胞産生細胞も包含し得ることもまた理解される。当業者は、本明細書のエキソソーム産生細胞への言及は、典型的なエキソソームから幾分変化し得るが、依然として機能的及び／または構造的に類似または関連しているエキソソーム様小胞を産生する他の適切なエキソソーム様小胞産生細胞を含み得ることを認識するであろう。
当業者に理解されるように、本明細書に記載のエキソソームは、特定の非限定的な実施形態において、５０〜１５０ｎｍの間の他の適切なエキソソーム様小胞（エキソソームマーカーを含む）、及び／または１００〜６００ｎｍというより大きなエキソソーム様小胞を含んでもよい。
遺伝子サイレンシング核酸は、標的遺伝子の発現を減少、防止、またはサイレンシングする任意の核酸であり得ることが理解されるであろう。限定は望まないが、適切な遺伝子サイレンシング核酸としては、とりわけ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または他のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）遺伝子サイレンシングトリガーが挙げられる。例えば、遺伝子サイレンシング核酸は、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖、または標的ｍＲＮＡと完全に、実質的に、もしくは部分的に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを誘発することによってサイレンシングされる遺伝子発現ｍＲＮＡ配列の領域に対して、完全に、実質的に、または部分的に相補的であり得る（すなわち、ヌクレオチド２〜７にシード領域相補性を有する）。
遺伝子サイレンシング核酸は、遺伝子発現の転写速度またはエピジェネティックな制御に影響する核酸であり得ることがさらに理解されるであろう。遺伝子サイレンシング核酸としては、非限定的な例として、遺伝子発現調節特性を有する小型ＲＮＡが挙げられる。さらなる非限定的な例として、遺伝子サイレンシング核酸は、ＣＲＩＳＰＲ核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ）を含んでもよい。
本明細書で概説した様々な実施例及び／または実施形態を検討する場合、当業者は、遺伝子サイレンシング核酸が、細胞内の特定の遺伝子の発現を減少させるか、妨げるか、または「サイレンシングさせる」任意の核酸であり得ることを認識するであろう。非限定的な例として、遺伝子サイレンシング核酸は、とりわけ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または別のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）もしくはアンチセンス遺伝子サイレンシングトリガーであってもよいし、またはそれらに由来してもよい（例えば、Ｇａｙｎｏｒ ｅｔ ａｌ．、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ａ ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（２０１０）３９，４１９６−４１８４；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，５０，２５９−２９３を参照のこと）。遺伝子サイレンシング核酸は、任意の機序、例えば、限定されるものではないが、当技術分野で知られているような転写前または転写後の遺伝子サイレンシング技術によって遺伝子発現を低下し得る。特定の遺伝子配列を考慮すれば、当業者は、このような遺伝子配列を標的し、遺伝子の発現（転写、翻訳、またはその両方）を低減し得る遺伝子サイレンシング核酸を設計することができる。Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｒｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）から入手可能なもの、またはｓｉＲＮＡ及びＡＯＮの商業的供給業者から入手可能なものを含む、特定の遺伝子を標的とするためのｓｉＲＮＡまたはＡＯＮを設計するための様々なソフトウェアベースのツールが利用可能である。遺伝子サイレンシング核酸は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｉｌｅｙが出版）に記載されているように調製してもよい。
特定の非限定的な実施形態において、ｍｉＲＮＡは、天然に発現されるｍｉＲＮＡ配列、及びｍｉＲＮＡ様作用機序を有するが、天然に発現されるｍｉＲＮＡ配列と一致しない核酸配列を有する核酸を含み得ることが理解されよう。
特定の非限定的な実施形態では、本明細書に記載の核酸は、当業者に知られているように、核酸骨格、糖、または核酸塩基に対する１つ以上の化学修飾を含み得ることも理解されよう。非限定的な例として、本明細書に記載の核酸は、標的結合親和性、特異性、安定性、Ａｇｏタンパク質へのロード、及び／もしくはヌクレアーゼ分解耐性を増大させるか、ならびに／またはオフターゲット効果を低減させる、１つ以上の化学修飾を含む修飾核酸であり得る。核酸に対する化学的修飾の例は、当技術分野で周知であり、その例は、例えば、Ｇａｙｎｏｒ ｅｔ ａｌ．、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ａ ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（２０１０）３９，４１９６−４１８４及びＢｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，５０，２５９−２９３に記載される。
特定の非限定的な実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸、例えば、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）−もしくはｓｉＲＮＡ−型核酸、または別のｍｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉ型核酸、またはそれに由来する適切な核酸を用いてもよい。遺伝子サイレンシング核酸は、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡ標的に対する完全な配列相補性、部分配列相補性、またはシード領域相補性を有し得る。配列は、非限定的な例として、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔまたは２４ｎｔの配列相補性を有してもよく、この核酸配列の長さにわたって構成的に配置されてももしくは広がってもよく、またはこれらの値の任意の２つにまたがるものとして定義される任意の範囲、またはこれらの値のいずれか２つにまたがり、これらの値の１つ以上を排除するものとして定義される任意の範囲であってもよい。非限定的な例として、配列は、完全相補性、例えば２４ｎｔの完全相補性、または１７−１９ｎｔの相補性を有してもよい。さらなる非限定的な実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸（例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）とｍＲＮＡまたはＲＮＡ標的との間の配列非相補性または配列ミスマッチは、１つ以上の部位、例えば、成熟遺伝子サイレンシング核酸の５’末端から数えて３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位もしくは２３位、またはこれらの値の任意の２つに及ぶと定義される任意の範囲、またはこれらの値のいずれか２つにまたがり、これらの値のうちの１つ以上を排除するものとして定義される任意の範囲のうちの１つ以上で生じ得る。
また、遺伝子サイレンシング核酸の前駆体は、遺伝子サイレンシング核酸を細胞に提供し得る任意の核酸配列であり得ることも理解されよう。非限定的な例として、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡを産生するために細胞によって酵素的にプロセシングされるので、遺伝子サイレンシング核酸の前駆体とみなされ得る。同様に、より長いｄｓＲＮＡを細胞によってプロセシングしてｓｉＲＮＡを産生してもよい。特定の非限定的な実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸の前駆体は、以下にさらに詳細に記載されるｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１ヌクレオチド骨格配列内に組み込まれたｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ、またはそれらの酵素的切断産物であってもよいし、またはそれらを含んでもよい。
ｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１核酸配列を図２Ａに示し、本明細書では配列番号２と呼ぶ。図２Ａに示すように、ｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１を、ＤＲＯＳＨＡによってプロセシングしてｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１（その配列は以下の配列番号２に下線が引かれており、配列番号３に示されている）を生成する。次いで、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１を、Ａｇｏ２によって切断して、配列番号４を生成する。次いで、このＲＮＡを、その３’末端でトリミングして、短いＲＮＡ、最も一般的には配列番号５をプロセシングで生成する（Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０）。



配列番号２：５’−ＣＵＵ ＧＧＧ ＡＡＵ ＧＧＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＣＣ ＧＵＵ ＡＣＣ ＡＵＵ ＡＣＵ ＧＡＧ ＵＵＵ ＡＧＵ ＡＡＵ ＧＧＵ ＡＡＵ ＧＧＵ ＵＣＵ ＣＵＵ ＧＣＵ ＡＵＡ ＣＣＣ ＡＧＡ−３’（ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１ ｍｉＲＮＡ領域に下線）
配列番号３：５’−ＡＡ ＡＣＣ ＧＵＵ ＡＣＣ ＡＵＵ ＡＣＵ ＧＡＧ ＵＵＵ ＡＧＵ ＡＡＵ ＧＧＵ ＡＡＵ ＧＧＵ ＵＣＵ Ｃ−３’（ループ領域に下線）
配列番号４：５’−ＡＡ ＡＣＣ ＧＵＵ ＡＣＣ ＡＵＵ ＡＣＵ ＧＡＧ ＵＵＵ ＡＧＵ ＡＡＵ ＧＧ−３’
配列番号５：５’−ＡＡ ＡＣＣ ＧＵＵ ＡＣＣ ＡＵＵ ＡＣＵ ＧＡＧ ＵＵＵ−３’

特定の非限定的な実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸のような目的の核酸を組み込むｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の構造模倣体は、上で概説したｍｉＲ−４５１酵素処理経路の知識に基づいて設計してもよい。例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡガイド鎖が標的遺伝子の発現をサイレンシングする目的で標的細胞に送達するためにエキソソームにパッケージングされるならば、この適用のためのｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、限定しない例示的な例として、以下のように設計され得る：
●目的のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡガイド鎖配列を特定する；
●ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１模倣体の５’ステム部分を形成する際に、及び必要に応じてｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１模倣ループ領域の全部または一部を形成し、必要に応じて５’側の３’のステム部分に部分的に伸長する際に、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡガイド鎖配列を使用する；
●ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１模倣体の５’ステム部分に存在する、目的の同定されたｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡガイド鎖配列の部分に相補的または実質的に相補的な配列を同定する；
●ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１模倣体の３’ステム部分を形成する際に、同定された相補的配列を使用する；ならびに
●必要に応じて、設計されたｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１模倣体が、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のものと同様のＤｉｃｅｒ非依存性、ＡＧＯ−２依存性の様式で、必要に応じて適切な方法を、例えば、Ｙａｎｇら、ＰＮＡＳ、２０１０，１０７（３４）：１５１６３−１５１６８に記載の方法などを用いてプロセシングされることを確実にする。
他の遺伝子を標的とするためのｍｉＲ−４５１模倣体の「リプログラミング」のさらなる例は、両方ともその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、２０１０，１０７（３４）：１５１６３−１５１６８及び米国特許第８，２７３，８７１号に見い出され得る。
本明細書に記載の核酸構築物は、例えば、固相合成、または当該分野で公知の他の方法を用いて化学的に合成され得ることが理解されるであろう。核酸構築物はまた、当該分野で公知であるように、適切な発現ベクターからの細胞発現またはインビトロ発現によって調製されてもよい。本明細書に記載の核酸構築物の改変体、化学修飾アナログ、及び構造模倣体もまた可能であり得る。例として、ｐｒｉ及び／またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のいくつかの改変体及び構造模倣体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２７３，８７１号に記載されている。
核酸構築物は、多数の周知の方法のいずれかを用いて、細胞に導入されてもよいし、細胞で発現されてもよいし、または細胞によって産生されるようにされてもよいことが理解されるであろう。細胞への核酸構築物の導入は、本明細書に記載の方法を用いるか、もしくは当該分野で公知の適切な方法を用いる、細胞内での核酸構築物の発現を包含してもよいし、及び／または例えば、トランスフェクションを介した細胞への核酸構築物の直接導入を包含してもよい。
発現ベクター（ウイルス、プラスミドまたは他のいずれか）は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の方法で細胞に導入されてもよく、次いで細胞は核酸構築物（複数可）を発現し得る。あるいは、核酸構築物自体を、例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを介して（すなわち、限定はしないが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅなどのトランスフェクション試薬、または当技術分野で公知の任意の他の適切な送達剤を使用して）、または当該分野で公知の標的化された遺伝子もしくは核酸送達ビヒクルを介して、細胞に直接導入されてもよい。多くの送達ビヒクル及び／または薬剤が当該分野で周知であり、そのいくつかは市販されている。核酸の送達戦略は、例えば、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．（２０１１）８：５２１−５３６；Ｊｕｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．、（２０１２）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４５：１０６７−１０７６；及びＲｅｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１２）２０：４８３−５１２に記載されている。トランスフェクション方法の例は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。発現ベクターの例は、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．、１９８５、Ｓｕｐｐ．１９８７）に記載されている。さらなる例は、以下の実施例１１において考察される。
細胞への核酸構築物の導入は、細胞内に導入された外来遺伝子のような遺伝子からの細胞内の核酸の産生（すなわち転写）を指し得ることが理解されよう。
より一般的には、サイレンシング遺伝子の発現に関して、遺伝子発現は、転写及び翻訳プロセスの両方を含み得ることが理解され、したがって遺伝子発現とは、核酸配列の産生、例えば、ｍＲＮＡ（すなわち転写）、タンパク質の産生（すなわち翻訳）、またはその両方などを指してもよい。
遺伝子または転写された配列の細胞への導入は、当技術分野で公知の任意のいくつかの方法を用いて達成され得る。例として、適切なプロモーター配列（例えば、構成的または誘導性プロモーター）によって各々が駆動される特定の遺伝子の１つ以上のコピーを含むベクター（ウイルス、プラスミドまたは他のいずれか）を、トランスフェクション、エレクトロポレーションもしくはウイルス感染、または当技術分野で公知の別の適切な方法によって細胞に導入してもよい。特定の遺伝子を過剰発現または細胞に導入するための適切な発現ベクター技術は、当該分野で公知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ Ｅｄ．）、２０１２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
核酸配列を細胞に挿入することに関して、遺伝子（または転写された配列／領域）の導入とは、「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入」を指し、これには、核酸配列が細胞のゲノムに必要に応じて取り込まれ得るか、または一過性に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）真核細胞への核酸配列の取り込みまたは導入を包含する。
本明細書に記載の核酸及び／もしくはエキソソームの１つ以上を含むかまたはそれらからなる化合物及び／または組成物が使用され得ることが理解される。組成物は、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、または緩衝剤をさらに含んでもよい。
本明細書中で参照されるように、特定の配列またはその特定の部分に関するパーセント（％）同一性または％配列同一性とは、デフォルト値に設定された検索パラメータを用いてプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３−４１０；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌのウェブサイト）によって生成される、最大パーセント配列同一性を達成するために必要な場合に、配列を整列させ、ギャップを導入した後、該当の配列（またはその特定の一部）中のヌクレオチドまたはアミノ酸と同一の候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージとして定義され得る。
例として、同一性％値は、一致する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、同一性パーセントが報告されている配列長で除して決定され得る。パーセント（％）アミノ酸配列類似性は、アミノ酸配列同一性％を決定するために使用されるのと同じ計算によって決定され得るが、例えば、計算において同一のアミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含んでもよい。例えば、ＢＬＡＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ；デフォルトパラメーターを用いる）などのオリゴヌクレオチドアラインメントアルゴリズムを用いて、配列同一性％を算出してもよい。
２つの核酸配列が実質的に同一であり得るという別の示唆は、２つの配列が、中程度にストリンジェントな、または好ましくはストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズすることである。中程度にストリンジェントな条件下でのフィルター結合配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２．１０．３に従って行ってもよい。あるいは、ストリンジェントな条件下でのフィルター結合配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、１９８９（上掲）に従って行ってもよい。ハイブリダイゼーション条件は、目的の配列に応じて公知の方法に従って改変してもよい（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ、１９９３、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．を参照のこと）。一般に、非限定的な例として、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点より約５℃低い場合がある。
当業者には公知であるように、特定の遺伝子または転写された配列／領域を発現するためのヌクレオチド配列は、「遺伝子ＶＩＩ」、Ｌｅｗｉｎ、Ｂ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）に記載されているように特徴をコードしてもまたは特徴を含んでもよい。特定の核酸構築物をコードするヌクレオチド配列は、市販のベクターなどの適切なベクターに組み込まれてもよい。ベクターはまた、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に概説されているように、標準的な分子生物学技術を用いて個別に構築または改変されてもよい（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１））。当業者は、ベクターが、核酸構築物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る所望のエレメントをコードするヌクレオチド配列を含み得ることを認識するであろう。所望のエレメントをコードするそのようなヌクレオチド配列は、転写プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーター、及び／または複製起点を含んでもよい。適切なベクターの選択は、限定はしないが、そのベクターに組み込まれるべき核酸のサイズ、所望の転写及び翻訳制御エレメントのタイプ、所望の発現レベル、所望のコピー数、染色体組み込みが所望されるか否か、所望される選択プロセスのタイプ、または形質転換されることを意図している宿主細胞もしくは宿主の範囲を含むいくつかの要因に依存し得る。
本明細書で意図されるのは、以下の配列を含む核酸であることが理解されるであろう：
ａ）本明細書で定義される核酸またはその断片をコードする配列；
ｂ）本明細書で定義される核酸をコードする配列、またはその断片の相補体である配列；
ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で定義される核酸またはその断片にハイブリダイズすることができる配列；または
ｄ）ａ）もしくはｂ）で定義された核酸または本明細書に記載の別の核酸配列と約７０％以上、または約８５％以上の配列同一性、例えば、限定はしないが８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を示す、配列。この核酸はまた、ある範囲の同一性、例えば上で概説したパーセンテージの任意の２つによって特徴づけされ得る。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、ｐＨ、ならびにハイブリダイゼーション及び洗浄中のホルムアミドなどの変性剤の存在によって制御され得る。慣用的に使用される条件は、当業者に周知であろう（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｃｈａｐ．２．１０、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９４）を参照のこと）。
当業者であれば、本明細書に記載の生体分子及び／または化合物は、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに、及び／または１つ以上の別個の活性剤または薬物と共に、または薬学的な併用もしくは薬学的組成物の一部として、薬学的組成物中で提供されてもよいことを理解するであろう。特定の実施形態では、生体分子、化合物及び／または医薬組成物は、治療レジメンにおいて、同時に、連続して、または他の薬物もしくは医薬組成物と組み合わせて、別々に、もしくは組み合わせた製剤、または組み合わせとしてのいずれかで、投与されてもよい。
本明細書に記載の生体分子、化合物及び／または組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤及び／または担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤は、当業者に公知の任意の適切な担体、希釈剤または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤の例としては、限定するものではないが、セルロース誘導体、スクロース、及びデンプンが挙げられる。当業者は、薬学的に許容される賦形剤が、当該分野で公知の適切な充填剤、結合剤、潤滑剤、緩衝剤、流動促進剤、及び崩壊剤を含み得ることを認識するであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００６））。薬学的に許容される担体、希釈剤及び賦形剤の例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０００−２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）及び１９９９年に発行された米国薬局方：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）に見出され得る。
本明細書に記載の方法の特定の実施形態において、本方法は、リソソームまたは自食作用阻害剤でエキソソーム産生細胞を処理するステップをさらに包含し得る。例として、エキソソーム産生細胞を、リソソーム酸性化の阻害剤またはＶ１Ｖ０ ＡＴＰアーゼを用いて２〜７２時間処理して、エキソソームの産生を増大させてもよい。そのような阻害剤の例としては、バフィロマイシンＡ１、コンカナマイシン、及び／またはクロロキンが挙げられる。リソソームに対して同様の効果を有する（すなわち、ｐＨまたはＣａ２＋バランスに影響を及ぼす）他の化合物は、例えば、ＮＡＡＤＰのような同様の効果を有し得ることが企図される。
本明細書に記載の方法の特定のさらなる実施形態では、本方法は、エキソソーム産生細胞におけるＡｇｏ２の発現または活性を阻害するステップをさらに含んでもよい。Ａｇｏ２は、例えば、すでに上記されているとおり、阻害されている場合、低下され得る。特定の実施形態において、Ａｇｏ２は、例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または他の遺伝子サイレンシング核酸を用いて阻害され得る。
さらなる実施形態では、エキソソーム産生細胞によって産生されるエキソソーム内の（またはそれと関連する）遺伝子サイレンシング核酸またはその前駆体のレベルを増大させる方法であって：
− ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物を細胞に導入すること、または細胞内で発現させること；及び
− 細胞がエキソソームを産生することを可能にすること、
を包含する、方法が本明細書で提供される。
エキソソーム内の遺伝子サイレンシング核酸またはその前駆体のレベルを濃縮または増大させることについての言及は、対応する未処理細胞または対照細胞に見出される遺伝子サイレンシング核酸のレベルと比較して、細胞によって産生されるエキソソーム内に存在する遺伝子サイレンシング核酸（これは、より大きな配列内に組み込まれても組み込まれなくてもよい）の量の任意の増大を指す場合があることが理解される。
さらに別の実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸またはその前駆体をエキソソームと共にまたはエキソソーム内にパッケージングする方法であって：
− ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物をエキソソーム産生細胞に導入すること；及び
− この細胞がエキソソームを産生することを可能にすること、
を包含する方法が本明細書で提供される。
さらなる実施形態では、上記方法で使用される細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１もしくはＨ９細胞、または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であってもよい。さらに別の実施形態において、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１細胞であってもよい。さらに別の実施形態では、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ９細胞であってもよい。細胞のさらなる例は、既に上に記載されており、以下の実施例８においてさらに考察される。以下にさらに詳細に記載する結果は、そのような細胞が多数のエキソソームを産生することができることを示している。さらに別の実施形態では、上記の方法で使用される細胞は、無血清培地で、またはエキソソームを生成しながらエキソソーム内容物を除去もしくは減少させるために事前に処理もしくは加工された血清培地で培養され、それによって典型的な血清含有培地中に存在するエキソソームの汚染を回避もしくは低減するため、または産生されたエキソソームの精製を容易にする細胞であり得る。実際、エキソソームは、ほとんどの細胞を培養するために使用されるウシ胎仔血清中に非常に豊富であり、したがって、特定の実施形態では、エキソソーム内容物を除去もしくは減少させるために事前に処理もしくは加工された無血清培地または血清培地中で細胞を増殖させることが有益であり得る。
超遠心分離または他の方法によってエキソソームが枯渇したウシ胎仔血清を用いて培地中の細胞を増殖させることは可能であるが、特定の実施形態及び実施例では、残りのエキソソームの汚染を避けるために、無血清培地で増殖する細胞を使用することが有利であり得る。さらに、特定の実施形態では、他の細胞を成長させる必要のない細胞（例えば、フィーダー層）及び／または細胞培養表面（例えば、マトリゲル）のコーティングとは独立して増殖する細胞（特定の条件下ではエキソソーム調製物を汚染し得る）を使用することが有利であり得る。Ｈ１及びＨ９ヒト胚性幹細胞を含む幹細胞は、一般に、無血清培地中に豊富なエキソソームを具体的には産生する。
さらなる実施形態では、上記の方法は、必要に応じて、細胞によって産生されたエキソソームを精製または濃縮するステップをさらに包含し得る。説明目的のための非限定的な例として、エキソソームは、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）において詳細である方法を含む多数の方法によって精製され得る。これらの方法は、種々の遠心分離を包含し得、これには、低速（例えば、２００〜２０００ｇ）で細胞から培地を遠心分離して、細胞及びより大きい細胞片を除去し、上清を回収し、約１００００ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収し、１００ ０００ｇで１〜２時間遠心分離することを包含する。あるいは、第２または第１及び第２の遠心分離ステップを置換するために、０．４５μｍまたは０．２２μｍフィルター（または同様のもの）を用いて、上清をろ過してもよい。エキソソームを精製するための代替方法としては、Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＥｘｏｑｕｉｃｋキットまたはＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓもしくはＱｉａｇｅｎなどの会社によって販売される類似のキットで使用されるものなどの沈降法が挙げられる。エキソソームはまた、エキソソームの要素を認識する抗体で被覆されたビーズなどの親和性精製を使用して精製されてもよい。エキソソームはまた、それらの異常な密度に基づいて密度勾配（例えば、ショ糖密度勾配）を用いて精製され得る（Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．、上記のＬａｍｐａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００２；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、エキソソームは、当業者に知られているように、サイズ排除クロマトグラフィーまたはフィールドフロー分画などのクロマトグラフィーによって精製され得る。
さらに別の実施形態において、本明細書において、
− エキソソームまたはエキソソーム様小胞；及び
− ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸またはその前駆体もしくは酵素切断断片を含む核酸構築物；
を含む組成物であって、
ここで、この核酸構築物もしくはその前駆体または酵素切断断片が、エキソソーム内に含まれるか、エキソソームの外部に担持されているか、またはそれらの組み合わせである、組成物が提供される。
特定の非限定的な実施形態において、適切な前駆体は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体、または酵素的に切断されてｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を形成し得る別の核酸配列を含み得ることが理解される。
特定の非限定的な実施形態では、適切な酵素切断産物は、成熟ｍｉＲ−４５１構造模倣体、またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の成熟プロセスにおいて生じる介在配列を含んでもよいことがさらに理解される。
特定の非限定的な実施形態において、ｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、エキソソーム産生細胞によるエキソソームパッケージングの間に完全にまたは部分的にプロセシングされ得ることがさらに理解される。そのようなものとして、特定の非限定的な例において、パッケージ化されたエキソソームは、ｐｒｉ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体、成熟（すなわち、完全にプロセシングされた）ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の生成物（すなわち、例えば成熟ｍｉＲＮＡ）、またはそれらの間のプロセシング中に起こる介在中間配列を含む核酸を（内部に、外部に、またはそれらの組み合わせのいずれかで）含み得る。
組成物は、特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体、またはその前駆体もしくは酵素切断断片に組み込まれた別の遺伝子サイレンシング核酸を含む１つ以上のさらなる核酸構築物をエキソソーム内にさらに含んでもよく、その結果、このエキソソームは、２つ以上の遺伝子、またはその同じ遺伝子の２つ以上の領域を標的とする遺伝子サイレンシング核酸を含む。
この組成物は、特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた別の遺伝子サイレンシング核酸、またはその前駆体もしくは酵素切断断片を含む別の核酸構築物を含む１つ以上のさらなるエキソソームをさらに含み、その結果この組成物は、２つ以上の遺伝子またはその同じ遺伝子の２つ以上の領域を標的とする遺伝子サイレンシング核酸を含むエキソソームを含む。
この組成物は、なおさらなる実施形態において、１つ以上のエキソソーム産生細胞をさらに含んでもよい。
さらに別の実施形態では、組成物は、血清を含まない無血清培地、またはエキソソーム内容物を除去もしくは低減するために事前に処理もしくは加工された血清培地をさらに含んでもよい。
さらに別の実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸（場合によっては、より大きな核酸内に組み込まれている）、またはその前駆体を、細胞によって産生されたエキソソームにパッケージングするためのｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物の使用であって、この核酸構築物が、同じ細胞または異なる細胞に導入するためのものである使用が本明細書で提供される。
さらに別の実施形態では、遺伝子サイレンシング核酸またはその前駆体を細胞によって産生されたエキソソームにパッケージングするために、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物であって、細胞への導入または細胞における発現のためのものである核酸構築物が本明細書で提供される。
さらなる実施形態では、目的の核酸配列またはその前駆体で濃縮されたエキソソームを調製するための方法であって：
− ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の中に組み込まれた目的の核酸配列を含む核酸構築物をエキソソーム産生細胞に導入すること；及び
− 細胞がエキソソームを産生することを可能にすること、
を包含する方法が本明細書で提供される。
目的の核酸配列は、任意の適切な小型核酸配列、例えば、限定されるものではないが、細胞に送達された場合に利益をもたらす核酸配列であり得ることが理解されるであろう。例としては、本明細書中で前に記載されたような遺伝子サイレンシング核酸配列、または当技術分野で公知の三重鎖形成核酸または他の非コードＲＮＡまたは目的の小型の核酸が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、目的の核酸配列は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１４、Ｃｅｌｌ、１５８：６０７−６１９及びＫｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．、２０１３、ＰＬＯＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、９（５）：ｅ１００３４９８に記載されているような、遺伝子発現の転写速度またはエピジェネティックな制御に影響を及ぼす適切な核酸であってもよい。さらなる非限定的な例として、目的の核酸配列は、リボスイッチ、リボザイム、アプタマー、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、もしくはスプライススイッチング核酸、または当該分野で公知の目的の任意の他の適切な核酸配列である適切な核酸を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、本明細書においては、核酸送達組成物であって：
−エキソソームまたはエキソソーム様小胞、及び
−ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸またはその前駆体もしくは酵素切断断片を含む核酸構築物；を含み、
ここで、この核酸構築物は、エキソソームもしくはエキソソーム様小胞内に含まれるか、またはエキソソームもしくはエキソソーム様小胞の外面上に担持されるか、またはそれらの組み合わせである、核酸送達組成物が提供される。
核酸送達組成物のさらなる実施形態では、エキソソームは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１もしくはＨ９細胞または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または本明細書に記載の別の細胞によって産生されるエキソソームであってもよい。
核酸送達組成物のなおさらなる実施形態において、エキソソームは、無血清培地中で培養された細胞によって産生されたエキソソームであっても、またはエキソソーム内容物を除去もしくは減少させるために事前に処理もしくは加工された血清培地で培養された細胞によって産生されたエキソソームであってもよい。
さらに別の実施形態では、核酸送達組成物は、遺伝子サイレンシング核酸によって標的される遺伝子の細胞発現をサイレンシングするためのものであり得る。
さらに別の実施形態では、核酸送達組成物は、バイオ治療剤を産生するために使用されている細胞にサイレンシングＲＮＡを送達するためのものであってもよい。非限定的な例として、抗体、ワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスを産生するために細胞を使用する場合、サイレンシングＲＮＡを送達して細胞からの産生もしくは純度を向上させてもよいし、または産物の安全性を改善してもよい。
別の実施形態では、候補となるエキソソーム産生細胞が、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた、遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、またはその前駆体を含む核酸構築物を使用して、濃縮エキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生するのに適したエキソソーム産生細胞であるか否かを同定する方法であって：
上記候補エキソソーム産生細胞によって産生されたエキソソームのｍｉＲ−４５１含量を定量し、ｍｉＲ−４５１がエキソソームで濃縮されているか否かを決定すること；を包含し、
ここでｍｉＲ−４５１のエキソソーム濃縮は、候補のエキソソーム産生細胞が、濃縮エキソソームまたはエキソソーム様小胞の産生に適していることを示す、方法が本明細書で提供される。
さらなる実施形態では、ｍｉＲ−４５１のエキソソーム濃縮は、ｍｉＲ−４５１でない参照の内因的に発現されるｍｉＲＮＡのエキソソームレベルとｍｉＲ−４５１エキソソームレベルとを比較することによって決定され得る。特定の実施形態では、参照の内因的に発現されるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１６もしくはｌｅｔ−７ａ、または別の適切なＲＮＡまたは他の成分（ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体とは独立してエキソソームにパッケージングされることが期待され得る）であってもよい。
特定の実施形態では、本明細書中に記載されるようなパッケージ化されたエキソソームが、例えば、生物学的製剤の製造において使用され得ることが、本明細書においてさらに企図される。例えば、そのようなエキソソームは、組換え成長因子、抗体、またはワクチンを産生するために使用される細胞にｓｉＲＮＡを送達するために使用され得、このｓｉＲＮＡは、そのような生物学的製剤の収量または品質を向上させるように設計されている。例えば、ＥＲストレスの耐性を増大させるｓｉＲＮＡは、抗体の収量もしくは品質を改善してもよいし、または細胞の抗ウイルス応答を阻害するｓｉＲＮＡは、例えば、ワクチンの収量もしくは品質を増大し得る。本明細書に記載されているようなエキソソームは、特定の実施形態では、例えば、細胞及び／または動物モデルにおける薬物開発及び／または標的確認研究において使用してもよい。
（細胞内送達のためのエキソソーム内の核酸のパッケージング）
エキソソームは、遺伝子サイレンシング核酸にとって特に興味深い送達選択肢である。遺伝子サイレンシング核酸の効率的なインビボ送達が達成され得るならば、種々の疾患についての処置の選択肢が利用可能となり得る。同様に、目的の遺伝子のインビボでのサイレンシングが、低分子薬物阻害剤の開発を必要とせずに、表現型の結果を決定するために使用され得るので、遺伝子サイレンシング核酸の効率的なインビボの送達によって、薬物開発過程における治療剤標的確認が容易になり得る。
エキソソーム媒介送達アプローチが、脳のような困難な組織における実証された送達を伴う細胞間連絡のための内因性システムを利用し、再利用し得ることが証明されている。同様に、エキソソームは、種々の特定の細胞種及び組織を標的とするように修飾されてもよく、エキソソームは最小限の毒性及び免疫原性を有することが証明されている。ＭＳＣ及び未成熟樹状細胞由来のエキソソームは、肝臓、免疫系、肺及び心臓を標的としている（Ｌａｉ、２０１０、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、４：２１４；Ｔａｋａｈａｓｈｉ、２０１３、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１６５：７７；Ｗｉｋｌａｎｄｅｒ、２０１５、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、４：２６３１６）。エキソソームはまた、甲状腺または有窓の脈管構造を有する他の臓器も標的とし得る（Ｋｏｍａｒｏｖａ、２０１０、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、７２：４６３）。
一般に、異なる細胞種由来のエキソソームは、その表面に異なる受容体を有する（エキソソーム産生細胞の原形質膜に由来する）。これによって、マウスまたはヒトではっきりと行き来が生じ、異なる範囲の細胞種に取り込まれることが生じ得る。それらはまた、ＲＮＡ及び脂質カーゴの別個のプロファイルを含んでもよい。
特定の非限定的な実施形態では、エキソソームが化学的に、共有結合的に、または吸着によって、エキソソーム表面に付加された標的化リガンドを用いて、特定の細胞または組織に標的化されることが可能であり得る。受容体はまた、受容体に特異的なドメインを付加することによって、エキソソーム表面に付加されてもよく、エキソソーム内でそれらが濃縮される。そのようなエキソソーム標的化の例は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｏｈｎｏ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１３、２１：１８５及びＡｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１１、２９：３４１−３４５に見出され得る。
エキソソームは、タンパク質及びＲＮＡのサブセットを、それらを産生する細胞と比較して非常に選択的にパッケージングする。例えば、多くのｍｉＲＮＡは、細胞内に豊富に存在するにもかかわらず、エキソソームでは事実上検出されず、その逆である（Ｖａｌａｄｉ、２００７、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、９：６５４；Ｃｈｅｎｇ、２０１４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、３；Ｃｏｌｌｉｎｏ、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５：ｅ１１８０９３）。従って、核酸の薬物送達のためにエキソソームを使用することの大きな障害は、エキソソームの生物学的構造及び活性を物理的に破壊しない方法で、遺伝子サイレンシング核酸をエキソソームにパッケージングするための適切な方法の開発である。
エキソソーム中のｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡを濃縮する戦略を特定するための多くの試みがなされてきた。我々はこれまで、ｍＲＮＡのエキソソームへのパッケージングを制御する機構を発見したが（Ｇｉｂｂｉｎｇｓ、２００９、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１１：１１４３）、これはＲＮＡｉには適用できなかった。エキソソームが濃縮された配列モチーフについてのバイオインフォマティクス検索によって、濃縮が劣る候補物が２〜３発見された（Ｂａｔａｇｏｖ、２０１１、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１２（３）：Ｓ１８；Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ−Ｂｅｌｔｒｉ、２０１３、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ、４：２９８０）。最良の配列モチーフは、１つの細胞種でエキソソームにおいてＲＮＡを２〜５倍濃縮しただけであった（Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ−Ｂｅｌｔｒｉ、２０１３、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ、４：２９８０）。この控えめな効果が、他の細胞種で維持されているか否かは不明である。また、標的との完全な相補性に依存するＲＮＡｉ（２１ｎｔ）の標的化及び有効性を保持しながら、エキソソーム濃縮のための６ｎｔのモチーフをも含むことは困難であろう。エレクトロポレーションは、おそらくエキソソームにＲＮＡｉ治療剤を導入する（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ、２０１１、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９：３４１）。しかしながら、その後の検討では、同一の技術を用いてエレクトロポレーションされたときに大部分のＲＮＡｉ治療剤は沈殿することが実証された（Ｋｏｏｉｊｍａｎｓ、２０１３、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、１７２：２２９）。さらに、臨床使用のためのエキソソームの大量生産において、１００ｎｍのエキソソームの膜において一貫して５〜１０ｎｍ（ＲＮＡｉ約５ｎｍ）の孔を生成し、それらの生物学的機能を一貫して保持することができるという多くの疑問が提起された。要するに、広く適用可能で堅調な機構はこれまでに特定されていない。
研究を通してエキソソームのＲＮＡ含量を分析すると、多数の細胞種及び細胞源、例としては、血漿及び血清（Ｃｈｅｎｇ、２０１４、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ、３）、肥満細胞（Ｖａｌａｄｉ、２００７、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、９：６５４）、神経膠芽細胞腫、Ｂ細胞、心臓前駆細胞、及びＭＳＣ（Ｃｏｌｌｉｎｏ、２０１０、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５：ｅ１１８０３）由来のエキソソームのいくつかの研究では、１つの注目すべきｍｉＲＮＡはエキソソーム中で強力に濃縮される（１０〜１００００倍）ことが本明細書で実現された。このｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４５１である。魅力的なことに、このｍｉＲ−４５１は、他の全てのｍｉＲＮＡと比較して独自の生合成機構を有する（図２を参照のこと）。ｍｉＲ−４５１は、ＲＮＡｓｅＩＩＩ酵素Ｄｉｃｅｒによって切断されることなく生成される、唯一の公知のｍｉＲＮＡである。Ｄｉｃｅｒは、全ての他のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム−ループ構造を成熟の約２２ｎｔのｍｉＲＮＡに切断する。対照的に、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１は、ｍｉＲＮＡ前駆体の間で唯一の短いステム−ループを有し（５１ｎｔ対７０〜１２０ｎｔ）、Ｄｉｃｅｒ−よりも遍在性のｍｉＲＮＡ結合タンパク質であるＡｇｏ２に直接結合する（Ｃｈｅｌｏｕｆｉ、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ、４６５：５８４；Ｙａｎｇ、２０１２、ＲＮＡ、１８：９４５）。Ａｇｏ２はそれ自体、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１を切断し、その後、他の偏在性の酵素によるトリミングによって、成熟ｍｉＲ−４５１を生成する。理論に拘束されることを望むものではないが、それはその独自の生合成を提供するｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のステム−ループ構造であり得る。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１ステム−ループの骨格に実質的に任意の成熟ｍｉＲＮＡ配列を置換し得、それは同じ方法で処理されることが研究によって実証された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１０、ＰＮＡＳ、１０７（３４）：１５１６３−１５１６８；Ｃｈｅｌｏｕｆｉ、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ、４６５：５８４；Ｙａｎｇ、２０１２、ＲＮＡ、１８：９４５）。
米国特許第８，２７３，８７１号は、ｍｉＲ−４５１生合成に影響を及ぼすｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格におけるヌクレオチド及び二次構造のいくつかの例、ならびにＣｈｅｌｏｕｆｉ、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ、４６５：５８４及びＹａｎｇ、２０１２、ＲＮＡ、１８：９４５を概説している（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
エキソソームにおける遺伝子サイレンシング核酸のパッケージングに適した核酸構築物の例は、本明細書に詳細に記載されている。さらに、遺伝子サイレンシング核酸をエキソソームにパッケージングするための他の適切な核酸構築物は、本明細書で提供される方法を用いて同定され得ることが理解される。例として、構築物は、エキソソームの臨床的産生のために、ＭＥＦ及び／または別の候補細胞にトランスフェクトされ得る。次いで、細胞及びエキソソーム中のＲＮＡｉの絶対レベルを、デジタルＰＣＲによって測定してもよい。遺伝子サイレンシング核酸のエキソソーム存在量の有意な変化をもたらす試験された核酸構築物は、ノーザンブロットを用いてさらに試験して、核酸構築物からの遺伝子サイレンシング核酸切除及び成熟の変化を試験してもよい。これらの研究は、ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ、または他の遺伝子サイレンシング核酸、または目的の他の核酸配列をエキソソーム中にパッケージングするのに適した核酸構築物を同定するために使用してもよい。特定の実施形態では、研究のためにＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９を用いて候補細胞の安全な遺伝子座にベクターを挿入してもよい。
エキソソームは、核酸配列を内部的に、外部的に、またはその両方で保持し得ることが理解されよう。エキソソームは、例えば外部付着または吸着を介して核酸を外部に運ぶことができる。そのようなものとして、特定の非限定的な実施形態では、特定の核酸配列で濃縮されるか、それを含むか、またはパッケージングされたエキソソームに対する本明細書の言及は、核酸配列を内部的に、外部的に、またはそれらの組み合わせで保持するエキソソームを指す場合があることは、当業者によって理解されるであろう。
実施例１：遺伝子サイレンシング核酸のエキソソームパッケージングのための核酸構築物
特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物が本明細書において提供される。図において、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０６及びｍｉＲ−１９９は、そのような核酸構築物に置換されており、エキソソーム内の遺伝子サイレンシング核酸のパッケージングが可能になる。
実際に、５つの異なるｍｉＲＮＡのいずれかが、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体にそれらを挿入することにより、エキソソームにおいて１０００倍まで濃縮され得ることを示すデータが本明細書で提供される。さらに、この濃縮は、少なくとも２つの異なる細胞種で起こり、多種多様な細胞に適用可能であり得ることが示唆される。
乳房上皮細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）由来のエキソソームを精製し、複数の技術を用いてエキソソーム調製物の同一性及び純度を確認した（図１Ａ〜Ｄ参照）。動的光散乱及びナノサイト粒子追跡を用いて、精製されたエキソソームが、エキソソームに関して予想されるように、１００ｎｍの直径を有する高純度の粒子集団であることを確実にした。エキソソームの確立されたマーカーにおける１００ｎｍの小胞のこれらの調製物の濃縮を実証するためにウエスタンブロットを使用した（図１Ｄ、Ｅを参照のこと）。これらのエキソソーム及びそれらを産生する細胞からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いてｍｉＲＮＡの相対的存在量を特徴付けた。
乳房上皮細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）では、エキソソーム中の４つの異なるｍｉＲＮＡの濃縮の程度が対数いくつかにわたって変化した。ｍｉＲ−４５１は、細胞と比較してエキソソームにおいて最も高度に濃縮されたｍｉＲＮＡであった（図３Ａを参照のこと）。他のｍｉＲＮＡは、エキソソームにおいては、かなり濃縮が少なかった（例えば、ｌｅｔ−７ａは３０８倍未満、ｍｉＲ−１０６は１１４倍未満）。実際、他のｍｉＲＮＡと比較して、ｍｉＲ−４５１は、エキソソームでは細胞内のレベルと比較して３０８倍まで濃縮され（図３Ａを参照のこと）、ｍｉＲ−４５１がエキソソームで高度に濃縮されていることが確認された。
ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１を発現するプラスミド、または他のｍｉＲＮＡの配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を、２つの細胞種にトランスフェクトした。ｍｉＲ−１０６またはｍｉＲ−１５５を、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体中で発現させると、ＭＥＦまたは乳癌細胞のいずれかによって産生されるエキソソームでは、それらが３９倍まで濃縮された（図３Ｂ、Ｄを参照のこと）。試験した特定の条件下では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体がエキソソーム中のｍｉＲＮＡを最大１０００倍まで濃縮し、細胞中に余分なｍｉＲＮＡをほとんど残さないことが結果で実証されている（図４を参照のこと）。ＭＥＦ細胞では、内因性ｍｉＲ−４５１は、細胞またはエキソソームのいずれにおいても検出されなかった（図３Ｃを参照のこと）。それにもかかわらず、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体からのｍｉＲ−１０６またはｍｉＲ−１５５の発現は、エキソソームにおいて最大２０倍までそれらの濃縮を生じた。これらの結果は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、異なる細胞種、異なる種由来のエキソソーム中で、及び内因性ｍｉＲ−４５１（ＭＥＦ）の非存在下でさえ、ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ治療剤を強固にパッケージングするために使用され得ることを示す。
これらの実験では、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０６、及びｍｉＲ−１９９の標的配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を調製し、試験した。
ｍｉＲ−１５５標的配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、以下のような一次配列を有した：


５’−ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧＧＣＡＡＧＧＵＵＡＡＵＧＣＵＡＡＵＣＧＵＧＡＵＡＧＧＧＧＵＡＵＣＡＣＧＡＵＵＡＧＣ ＡＵＵＡＣＵＣＵＵＧＣＵＡＵＡＣＣＣＡＧＡ−３’
（配列番号６；ｍｉＲ−１５５標的化配列は下線で示す；ループは太字で示す）。


ｍｉＲ−１０６標的配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、以下のような一次配列を有した：



５’−ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＵＧＣＡＣＵＧＵＡＡＧＣＡ ＣＵＵＵＣＵＣＵＵＧＣＵＡＵＡＣＣＣＡＧＡ−３’
（配列番号７；ｍｉＲ−１０６標的化配列は下線で示す；ループは太字で示す）。
ｍｉＲ−１９９標的配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、以下のような一次配列を有した：

５’−ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＵＡＧＵＣＵＧＣＡＣＡＵＵＧＧＵＵＡＡＵＧＵＧＣＡＧＡＣＵＡ ＣＵＧＵＣＵＣＵＵＧＣＵＡＵＡＣＣＣＡＧＡ−３’
（配列番号８；ｍｉＲ−１９９標的化配列は下線で示す；ループは太字で示す）。

この分野の他の刊行物は、試験した１つの細胞種において、エキソソーム中のｍｉＲＮＡを適度に濃縮し得るか、またはｍｉＲＮＡの過剰発現がエキソソームにおけるそのレベルを増大させると予想されたように、６ヌクレオチドモチーフを同定した。多くの場合、２１−２２ヌクレオチドのサイレンシングＲＮＡに特定の６ヌクレオチドモチーフを含め、その特異性及び活性を依然として保持することは困難である。さらに、このモチーフのエキソソームへの局在化の影響は比較的わずかである（２〜８倍）。本明細書において詳細に考察されるように、エキソソーム中の所定のサイレンシングＲＮＡの強力な濃縮をもたらす特定のヌクレオチド二次構造が本明細書で提供される。さらに、この技術は、２つの独立した細胞種で実証されており、より広範に適用可能であるという証拠が得られる。したがって、より大きな効果を提供し、かつ多様なエキソソーム産生細胞種及びサイレンシングＲＮＡに対してより適用可能であり得る技術が本明細書において提供される。
（実施例２：遺伝子サイレンシング核酸を含むエキソソームの産生のための細胞株の同定）
乳癌細胞及びＭＥＦにおいて、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に挿入することにより、ｍｉＲＮＡがエキソソーム内に堅強にパッケージングされることが本明細書で実証される。これらの結果によって、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格が、異なる細胞種、異なる種由来のエキソソーム中、及び内因性ｍｉＲ−４５１（ＭＥＦ）の非存在下でさえも、ＲＮＡｉまたはｍｉＲＮＡ治療剤を堅強にパッケージングするために使用され得ることが示される。大規模生産を必要とし得るエキソソームの臨床的生産のためには、遺伝子サイレンシング核酸を含むエキソソームの産生に特に適した細胞株を使用することが重要であり得る。これに関して、関連する細胞株の特徴としては以下が挙げられる：（１）豊富なエキソソーム産生、（２）免疫原性及び発癌性因子、または好都合な免疫原性因子のリスクの最小化、ならびに（３）異種非含有培地における再現性のある大量培養。いくつかの細胞種由来のエキソソームは、これらの基準を満たし得、固有の疾患の治療を可能にする明確なインビボ分布を示し得る。さらに、エキソソーム産生細胞は、各患者について新たに産生されるのではなく、バルク産生のために安定して遺伝子操作され得、それに伴う固有の変動性が低減され得る。例えば、原発性樹状細胞を使用する場合、これは異なるドナーから血液を採取し、エキソソームの新しいバッチごとに細胞を分化させることを必要とする場合がある。ＥＳＣ細胞またはＭＳＣ細胞では、望まれるならば、同じ細胞を連続的に使用し、そのような変動性を低減するために高度に制御された条件下でそれらの細胞を培養することが可能であり得る。
ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体から同様にプロセシングされることがデータで示される。したがって、ｍｉＲ−４５１構造模倣体に挿入されたサイレンシングＲＮＡがその標的ＲＮＡに対して完全に相補的であるか否かは、その技術へのその使用に影響を与えないようである。
ヒト胚性幹細胞（ＥＳ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及び自家血単球に由来する初代未熟樹状細胞を、目的の３つの候補細胞種類として選択した。特定のＥＳクローンとＭＳＣ（ｉＰＳ細胞ではない）は豊富なエキソソームを産生することがデータで示される（図５参照）。初代樹状細胞は、これまで臨床試験のためのエキソソーム源として使用されてきた（Ｖｌａｕｄ、２０１１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３４：６５）。
図５では、胚性幹細胞（ＥＳ）が豊富なエキソソームを産生することが示される。文献によると、ＭＳＣは多くの細胞種より多くのエキソソームを産生する。ＥＳ細胞は、大量のエキソソームを放出するようであり、これによって、治療用途におけるエキソソームの大量生産にも有用であり得ることが示唆される。データによってまた、ＥＳ細胞由来のエキソソームが、成熟ｍｉＲ−４５１へのｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１のプロセシングに関与するタンパク質であるＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（ＡＧＯ２）も含むことが示される。結果によって、ＥＳ細胞エキソソームがｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を用いてエキソソームに遺伝子サイレンシング核酸をロードする興味深い候補であり得ることが示される。
図６は、豊富なエキソソームを産生する幹細胞の選択を示す。胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ９及び４つの遺伝的に異なる誘導多能性細胞（ｉＰｓ）のうちの１つが、検出可能なレベルのエキソソームを産生した。ＥＳＣクローンＨ１は、多数のエキソソームを産生すると広く見なされている、クローンＨ９よりも１０倍多くのエキソソームを産生し、ＭＳＣよりも数倍多くのエキソソームを産生した。そのようなものとして、エキソソームの臨床的生産のためのリード候補は、ＥＳＣクローンＨ１、Ｈ９、及びＭＳＣを含んでもよい。特定の非限定的な実施形態では、ＥＳＣクローンＨ９は、ｍｉＲ−４５１が非常に濃縮されているエキソソームを一般に産生するので、好ましい細胞株であり得、特に本明細書に記載の技術に適合し得る。
図７はさらに、ｍｉＲ−４５１がヒト胚性幹細胞（Ｈ９株）からのエキソソームにおいて強く濃縮されていることを示している。これによって、ヒト胚性幹細胞、特にこの細胞株も、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を用いるエキソソームへのｓｉＲＮＡのパッケージングに特に興味深い場合があることが示唆される。そのようなものとして、特定の非限定的な実施形態では、Ｈ９細胞株は、特定の適用に好ましい場合がある。Ｈ９細胞株は、いくつかの例では、Ｈ１よりわずかに少ないエキソソームを産生する可能性があるが、ＧＭＰ臨床使用のために検証されているＨ９のバージョンが利用可能である。
実施例３：マウスにおけるＲＮＡｉをロードされたエキソソームの分布
ＲＮＡｉの、肝臓以外の組織への送達の実現によって、その細胞種または組織に関連するいくつかの疾患の治療が可能になり得る。したがって、候補細胞種（例えば、ＥＳ、ＭＳＣ、及び樹状細胞）から生成されたエキソソームは、静脈内または腹腔内注射後のマウスにおける分布について試験され得る。他の研究で使用されているように、粒子数（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）またはタンパク質量によって決定されるエキソソーム用量を試験してもよい（Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９，１７６９（２０１１）、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９、３４１（２０１１）。非限定的な例として、エキソソームが濃縮されているホタルルシフェラーゼ（例えば、Ｃ１Ｃ２ドメインまたはＬＡＭＰ２ｂの細胞質ドメインでタグ化された）を安定に発現する細胞を作製してもよい（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，３４１（２０１１）、Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８、１２２８（２００８））。これにより、ＩＶＩＳ技術を使用する高感度及び最小限のバックグラウンドで、動物全体のエキソソーム分布を画像化することができる（ルシフェラーゼのＣｙｃＬｕｃ１基質もまた脳内での画像化を可能にする）。非限定的な例として、１群あたり３匹のマウスを使用してもよく、いくつかの身体領域において約４倍のｌｕｃの増大が期待され得る（σ＝１、α＝０．０５、検出力＝０．９９）。
全ての組織においてｌａｃリプレッサーによって構成的に抑制されるホタルルシフェラーゼを有する、この目的のために開発されたマウスを用いて、上記に概説したエキソソームの分布の可視化、及びエキソソーム送達ＲＮＡｉの活性のマウス全体にわたる視覚化を行ってもよい（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ２、ｅ１３３（２０１３））。ｌａｃリプレッサーを標的とするＲＮＡｉを用いて、ＲＮＡｉが活性である場合はいつでもルシフェラーゼの出現に基づく結果を得ることができる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ２、ｅ１３３（２０１３））。
非サイレンシングＲＮＡｉを含む、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１もしくはｐｒｅ−ｍｉＲ−１６（対照）、またはｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１に組み込まれた、ｌａｃリプレッサーを標的とするＲＮＡｉを安定に発現する細胞（例えば、ＥＳ、ＭＳＣ及び／または樹状細胞）を、例えば、研究してもよい。追加の対照として、マウスを、ＲＮＡｉロードされたエキソソームの送達前にＩＶＩＳシステムで画像化してもよい（例えば、４匹のマウス／群、推定３倍増大、σ＝１、α＝０．０５、検出力＝０．９９）。ＩＶＩＳシステムは、マウスを数回画像化することを可能にし得、エキソソームによって送達されたＲＮＡｉ活性の薬物動態の分析を可能にする。ＲＮＡｉ分子は、細胞内で長く存在している：５日以上では、それらの存在量に対する唯一の測定可能な影響は、細胞分裂による希釈（Ｇａｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９、５６９２（２０１１））であり、ヌクレアーゼ分解を防ぐための化学修飾はこれを変化し得ない（Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｄａｖｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９７、９０９（２００７））。したがって、エキソソームによって送達される単回用量のＲＮＡｉの活性は、リポソーム送達ＲＮＡｉの動物試験のように、５日以上、潜在的には６〜８週まで持続され得る（Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６９、８１９（２０１３）、Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｄａｖｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９７，９０９（２００７））。ＲＮＡｉ活性を受ける細胞種を決定し、ＲＮＡｉ誘導性ｍＲＮＡの減少を定量してもよい。線形の定量を可能にするために、ヒトＳＯＤ１を標的とするＲＮＡｉ（ヒト野生型ＳＯＤ１マウスにおける遍在性の中低度の発現）をｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格において使用してもよい。エキソソームを注入してもよく、ｌａｃ−リプレッサールシフェラーゼマウス及びエキソソーム分布（上記）のデータによって誘導される時点で回収した組織を得てもよい。切片化されたホルマリン／パラフィン組織では、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡは、定量的ＲＮＡ ＦＩＳＨを用いて定量してもよく、細胞種は、細胞特異的マーカーに対する形態学及び抗体に基づいて同定され得る。
特定の実施形態において、エキソソームは、関節炎及びループスのような多くの炎症性疾患の根底にある免疫細胞によって取り込まれ得ることが決定され得る。したがって、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（ＳｍａｒｔＦｌａｒｅｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びタンパク質（抗体、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を、血液Ｔ細胞（ＴＣＲα）、Ｔ調節性細胞（ＣＤ２５）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１１ｂ）、ＮＫ細胞（Ｎｋｐ４６）、及び顆粒球（Ｇｒ−１／Ｌｙ６Ｇ）において分析してもよい。ＳＯＤ１レベルは、ＳＯＤ１ ＲＮＡｉまたは対照で処置した５匹の動物の血液で分析してもよい（いくつかの細胞ではＳＯＤ１の２倍の減少が予想される、σ＝１、α＝０．０５、検出力＝０．９９）。細胞のサブセットでＲＮＡｉ活性が同定されている組織または血液では、細胞特異的マーカーを、フローサイトメトリーソーティングを用いて単離して、ｍＲＮＡ及びタンパク質を定量してもよい。これらの実験は、どの組織及び細胞種エキソソームが効果的にＲＮＡｉを送達するかを同定するため、ならびにＲＮＡｉ媒介性のノックダウンを定量化するために使用してもよい。
ＲＮＡｉ活性は、ｌａｃリプレッサーのＲＮＡｉ切断がルシフェラーゼの発現を可能にする、本明細書に記載のｌａｃ抑制ルシフェラーゼマウスモデルを用いて評価してもよい。この効果がＲＮＡｉ活性によって媒介されることを保証し、及びエキソソームによって送達されるＲＮＡｉ活性を定量化するために、標的ｍＲＮＡの消失（ルシフェラーゼ及びＳＯＤ１対３つの参照ｍＲＮＡ）を、ＲＴ−ｑＰＣＲ、及び組織切片上で定量的ＲＮＡ ＩＳＨを用いることによって測定してもよい。マウスの結果におけるＲＮＡｉ活性をさらに証明するために５’ＲＡＣＥを行って、ＲＮＡｉ特異的切断ｍＲＮＡを半定量的に同定してもよい。
上記のような方法を使用して、遺伝子サイレンシング核酸運搬エキソソームの体内分布を決定し、どの組織をその提示によって標的とすることができるか、したがって、どの疾患が治療に対応できるかについての情報を得てもよい。
実施例４：パッケージ化されたエキソソームの免疫原性及び発癌性の試験
臨床使用のためのエキソソームの毒性及び免疫原性もまた評価してもよい。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｍＲＮＡシークエンシング（ポリＡ選択ライブラリー）及びプロテオミクスを用いて、可能性のある発癌因子を検出してもよい。エキソソームは、末梢血単核細胞と共にインキュベートしてもよく、上清は、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）２９サイトカイン／ケモカインパネル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてアッセイしてもよい。
エキソソームは、通常、身体によって産生される。エキソソームによる第Ｉ相試験では、毒性の問題が特定されなかった（Ｖｉａｕｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３４、６５（２０１１））。第Ｉ相試験では、エキソソームの最小限の免疫原性（免疫原性が目標であった場合）が示され、発癌性は示されなかった（Ｖｉａｕｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３４、６５（２０１１））。したがって、ＥＳ及びＭＳＣ供給源から生成されたエキソソームは、最小の免疫原性であり得る。エキソソームの有害な影響が注目される場合、これらは、起源細胞（例えば、ＭＨＣ）における発現のためにＲＮＡｉを操作することによって、またはエキソソームにさらなるＲＮＡｉを含めることによって排除され得る。
エキソソームは、他の免疫抑制または刺激分子を含む場合があり、非自己供給源から生成されたエキソソームは、ＭＨＣ非適合性として認識される危険性があり得る。潜在的な免疫原性に取り組むために、特定の実施形態では、エキソソームは、最も免疫耐性の細胞の中にある幹細胞及びＭＨＣ不適合性を回避する自己の患者由来の樹状細胞に由来し得る。誘導された多能性幹細胞は、自己エキソソームを産生するために各患者に対して作製され得るが、例えばＥＳまたはＭＳＣ細胞を使用して、大量の一貫したエキソソームの構成バッチを産生する能力は、特定の例においては好ましい場合がある。ＭＳＣまたは未成熟樹状細胞由来のエキソソームは、文献または患者において免疫応答を示さない。それにもかかわらず免疫原性応答が検出される場合、特定の実施形態では、免疫原性応答を制限または形成するために、起源細胞中の重要な免疫原性タンパク質を標的とするＲＮＡｉを追加してもよい。エキソソームの発癌性のリスクを低減するために、非形質転換細胞を使用してもよい。
エキソソーム、特にＥＳ及びＭＳＣ由来のものは、幹様の特性を促進する因子を含む場合があるが、これらはＥＳまたはＭＳＣよりもはるかに低用量で患者に一時的に存在する可能性があるため、そのリスクは、したがって、かなり低い場合がある。
実施例５：エキソソームを特定の組織に標的する
エキソソームは、内因性の標的を有する。例えば、シュワン及びオリゴデンドロサイトエキソソームは、ニューロンを標的とし、ニューロンエキソソームは星状細胞を標的とし、肥満細胞エキソソームは肥満細胞を標的とし、マクロファージエキソソームはマクロファージを標的とし、Ｂ細胞エキソソームはＴ細胞を標的とする。これに基づいて、異なる細胞種由来のエキソソームは、明瞭に移動し得る。分布は、例えば、代替細胞種の使用、精製後のエキソソームへのリガンドの結合、またはエキソソームを標的とする細胞質ドメイン（ＬＡＭＰ２ｂ、Ｃ１Ｃ２、ミリストイル化）に結合させることによってエキソソームの表面上にタンパク質受容体を配置することによって変えてもよい。
エキソソームを新しい組織に標的化するための受容体の使用は、マウスにおいて示されている（Ｏｈｎｏ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１３，２１：１８５；及びＡｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１１，２９：３４１−３４５、全体として参照によって本明細書に組み込まれる）。標的エキソソームは、例えば、エキソソームを脳に標的させ得るＲＶＧペプチドを用いて操作してもよい（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，３４１（２０１１））。ＲＶＤモチーフは、免疫細胞を標的し得る。内皮逸脱及び組織透過性を変化し得るので、疾患状態（例えば、脳虚血または心臓再灌流）を模倣する損傷後のエキソソーム分布も試験してもよい（Ｋａｎａｓｔｙ、Ｄｏｒｋｉｎ、Ｖｅｇａｓ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ １２、９６７（２０１３））。
特定の実施形態では、ＲＶＧペプチド、ドーパミン（パーキンソン病に冒されたドーパミン作動性細胞に対する）、または運動ニューロンを標的化するためのボツリヌス毒素の重鎖のような異なる受容体でエキソソームの表面を修飾することが可能であり得る。これらは、エキソソームの表面に吸着されてもよいし、またはエキソソーム表面上のタンパク質に結合するための活性な化学基を有するバージョンを生成することによって、共有結合されてもよい。
実施例６：遺伝子サイレンシング核酸のエキソソームパッケージングのためのさらなる核酸構築物設計
特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた目的の遺伝子サイレンシング核酸または他の核酸配列を含む核酸構築物が本明細書で提供される。理解されるように、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、エキソソームパッケージングが維持されている限り、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１とは配列、長さ、及び／もしくは二次構造、または他の特性（複数可）に関して、変化し得る任意の種々の適切な核酸構築物を含んでもよい。
以下の研究では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣設計の様々な異なる態様が検討された。研究されたパラメータとしては、全体のステム長、ループ長、及びステム中のミスマッチヌクレオチド（複数可）の存在が挙げられる。エキソソーム濃縮を依然として提供しながら、様々な修飾がなされ得ることが結果によって示される。
以下の実験において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構築物は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格の種々の特性を試験する１０の突然変異／修飾を用いて設計された。重要なことに、これらの研究では、エキソソームへの堅調なパッケージングを依然として提供しながら、骨格構造のいくつかの変化が適応され得ることが示される。骨格ループ長の拡張、及びステム−ループ部分の全体長の延長は、両方とも許容された。試験したいくつかの改変は、ＷＴ ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構築物よりも使用された実験条件下でいくらか効率的に劣ってパッケージングされたが、エキソソーム濃縮倍数は、依然として多くの場合約２００倍の範囲にあった。いくつかの例では、ＷＴのそれを超える濃縮倍数が観察された（図８）。
試験した構築物及びそこから得られたエキソソーム濃縮倍数を図８に示す．ＷＴ構築物を図８（Ａ）に図示する。
ステムの全長（図８（Ｂ））：ＷＴ構造のステム部分は、４６、５０、または５２ｎｔの全長を提供するように伸長された（ＷＴは４０ｎｔ、ステム及びループを組み合わせた）。図８（Ｅ）に示すように、これらのステム伸長構築物は、ＷＴ ｍｉＲ−４５１構築物と同様の挿入されたｓｉＲＮＡの濃縮を示した。試験した条件下で、４６及び５２ｎｔのステム伸長構築物は、ＷＴよりも濃縮が少なく、やはり堅調なエキソソーム濃縮をもたらした。５０ｎｔのステム伸長構築物は、試験した条件下でＷＴより大きいエキソソーム濃縮をもたらした。
ループの長さ（図８Ｄ）：ＷＴ構築物のループ部分は、ＷＴの４ｎｔから最大８ｎｔまで拡大された（すなわち、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ及び８ｎｔのループ長を試験した）。図８（Ｅ）に示されるとおり、これらのループ伸長構築物は、ＷＴ ｍｉＲ−４５１構築物と同様の挿入されたｓｉＲＮＡの濃縮を示した。試験した条件下で、５ｎｔ、６ｎｔ、及び８ｎｔのループ伸長は、ＷＴよりも幾分少ない濃縮をもたらしたが、依然として堅調なエキソソーム濃縮をもたらした。７ｎｔのループ伸長の結果によって、この構築物が、試験された条件下でＷＴに対して匹敵するかまたはおそらくより良好なエキソソーム濃縮を提供したことが示唆されている。まとめると、これらの結果によって、最大で少なくとも８ｎｔまでのループの伸長は、やはり優れたエキソソームパッケージングを生じることが示される。
ステム−ループ内のミスマッチヌクレオチド（図８（Ｃ））：ＷＴ構築物のステム−ループ部分は、ＷＴ ｍｉＲ−４５１構築物のステム部分に３つの異なる塩基対ミスマッチを含むように改変された。示されるように、ステムの成熟領域の最初の３つの塩基対（位置「１」、「２」、及び「３」と表示されている）のうちの１つに単一のｂｐミスマッチを各々が含む３つの異なる構築物が開発された。突然変異は、成熟標的配列が設計によって変化されないように、ＡＧＯ２切断後に除去された鎖上に配置した。図８（Ｅ）に示すように、これらのミスマッチ構築物は、ＷＴ ｍｉＲ−４５１構築物と同様の、挿入されたｓｉＲＮＡの濃縮を示した。試験した条件下で、位置「２」及び「３」でのミスマッチが、ＷＴに匹敵するかまたはおそらくより良好なエキソソーム濃縮を提供し、「１」でのミスマッチが、試験された条件下で依然として強力な濃縮をもたらした。
実施例７：エキソソームパッケージングのための核酸構築物のさらなる構造改変
特定の実施形態では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体内に組み込まれた、目的の遺伝子サイレンシング核酸または他の核酸配列を含む核酸構築物が本明細書で提供される。理解されるように、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１とは、配列、長さ、及び／もしくは二次構造、または他の特性（複数可）に関して、エキソソームパッケージングが維持されている限り異なってもよい、任意の種々の適切な核酸構築物を含み得る。
理論に束縛されることは望まないが、成熟ｍｉＲ−４５１の形成は、Ｄｒｏｓｈａ切断、Ａｇｏ２切断、及びエキソヌクレアーゼによる切断（３’末端から最終ヌクレオチドを除去する）を含むと考えられる。従って、これらのプロセシング事象の様々な段階を模倣する構築物のエキソソームパッケージングをさらに検討し、具体的にはエキソソーム濃縮がＡＧＯ２結合及び／または切断に依存するか否かを決定する実験を行った。得られた結果によって、エキソソーム濃縮がＡｇｏ２ノックアウト細胞において依然として観察され得るので、エキソソーム濃縮がＡＧＯ２とは無関係であり得ることが示される。
したがって、様々なプロセシング段階でＷＴ ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１を模倣する構築物を設計して、エキソソーム濃縮について試験した。試験した構築物は、図９にグラフ表示する。Ｄｒｏｓｈａ処理後のＷＴ ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１構築物を、図９（Ａ）に示し、構築物のＡｇｏ２切断バージョンを、図９（Ｂ）に示し、成熟２２ｎｔ ｍｉＲ−４５１（ループ領域の一部を含む５’標的化部分を有するポストエキソヌクレアーゼ活性）を、図９（Ｃ）に示す。比較のために、３’オーバーハングを有する標準的な２１ｎｔ ｄｓＲＮＡ ｓｉＲＮＡ（図９（Ｄ））も試験した。エキソソーム濃縮の結果を図９（Ｅ）に示す。
その結果、試験した条件下で、ループ由来配列が２２ｎｔの一本鎖ＲＮＡ上に残っている成熟段階に似ているＲＮＡ核酸（図９（Ｃ））（図８（Ｅ）の完全に成熟したｓｓと標識されている）は、最も強力なエキソソーム濃縮構築物であったことが示される。注目すべきことに、ループ（図９（Ｃ）構築物）を有するｓｓＲＮＡの濃縮は、３’オーバーハングを有する古典的ｓｉＲＮＡに似たｄｓＲＮＡよりも高かった。これらの結果によって、エキソソームへのパッケージングのために、特にわずかに長い長さ（すなわち、例えば、２２〜３５ｎｔ、対１９〜２１ｎｔ）で、一本鎖ＲＮＡが好ましい場合があることが示唆される。さらに、結果によって、ｓｓＲＮＡの３’末端に塩基対形成が存在すると、エキソソームへのパッケージングが好ましい場合があることが示唆される。理論によって束縛されることを望むものではないが、３’末端上のこのような塩基対形成によって、標的ＲＮＡ配列への相補的ＲＮＡの結合を遮断することによってエキソソームへのパッケージングが容易になり得る。この相補的核酸は、標的ｍＲＮＡ、または任意の他の相補的核酸、例えば、古典的ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖であってもよい。
実施例８：目的の核酸を含むエキソソームを産生するためのさらなる細胞株
目的の核酸が濃縮されたエキソソームを提供するためにｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１ベースの構築物を使用し得る、細胞種のさらなる例を同定するための研究を行った。２つの方法を用いてｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体構築物を用いて、エキソソーム中でｓｉＲＮＡを濃縮する能力について細胞種を試験した。
第１に、エキソソーム中での内在的に発現されたｍｉＲ−４５１の濃縮を、他の内因的に発現されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１６、ｌｅｔ−７ａ）と比較した。実施された全ての試験において、エキソソーム中のｍｉＲ−４５１濃縮を実証するとして特定された細胞株はまた、目的の核酸を保有するｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体構築物のエキソソーム濃縮も示した。これらの結果によって、ｍｉＲ−４５１濃縮エキソソームを産生する細胞株が、本明細書に記載の方法を用いて目的の核酸配列で濃縮されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生する目的でエキソソーム産生細胞として役立ち得ることが示唆される。
第二に、外来ｓｉＲＮＡ（典型的にはＧＦＰまたはＳＯＤ１を標的とする）を、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に挿入し、エキソソームで濃縮する能力を試験し、比較のためにｐｒｅ−ｍｉＲ−１６構造模倣体に挿入した同じｓｉＲＮＡと比較した。
結果によって、多種多様な初代細胞及び細胞株が、本明細書に記載の方法を用いてエキソソーム中のｓｉＲＮＡを濃縮するように働くことが示される。エキソソームにおけるｍｉＲ−４５１濃縮について試験した細胞株としては、以下が挙げられる：初代ヒト間葉系幹細胞、初代マウスマクロファージ、ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、マウス及びヒト神経細胞株（Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＳＨＳＹ）、マウス星状細胞株（Ｃ８Ｄａ、ＳＩＭ）、マウスミクログリア細胞株（ＢＶ２）、マウス運動ニューロン細胞株（ＮＳＣ−３４、ＭＮ−１）、ＨｅＬａ、マウス胚線維芽細胞、及びマウス樹状細胞（ＪＡＷＳ ＩＩ）。試験した各細胞株において、ｍｉＲ−４５１がエキソソーム内で内在的に濃縮されたならば、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体構築物に挿入されたｓｉＲＮＡもエキソソーム濃縮をもたらした。これらの結果、エキソソーム中の内因性ｍｉＲ−４５１の濃縮は、本明細書に記載の方法を用いてエキソソーム中のｓｉＲＮＡを濃縮するのに有効な候補細胞株の診断または指標であり得ることが示される。
ヒト胚性幹細胞を除いて、試験した全ての細胞種は、強力なエキソソーム濃縮を生じた。結果を以下の表１に示す。
表１：様々な細胞種におけるｍｉＲ−４５１のエキソソーム濃縮。エキソソーム枯渇培地または無血清培地中で増殖したことが示された細胞株由来のエキソソームを精製し、ＲＴ−ｑＰＣＲによりｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１６及びｌｅｔ−７ａを、エキソソーム及びエキソソーム産生細胞中で定量した。
実施例９：エキソソーム濃縮に影響を与える細胞因子
本明細書に記載の方法を用いてエキソソーム中の核酸構築物のパッケージングに影響を及ぼし得る種々の細胞因子を研究した。具体的には、変異体Ｒａｓ、変異体Ｍｙｃ、野生型Ａｇｏ２の過剰発現及びトランスリンのｓｉＲＮＡ枯渇の影響を研究した。得られた結果において、これらの因子のいずれも、エキソソームにおける構築物（この実施例では、ｓｉＲＮＡ含有構築物）の濃縮に有意な効果を有さず、このシステムは発癌性因子に依存しないことが示唆された。臨床的に使用されるｍＴＯＲ阻害剤及びリソソーム／自食作用阻害剤のようないくつかの薬物の効果もまた試験した。結果によって、ｍＴＯＲ阻害剤が、エキソソーム中のｍｉＲ−４５１濃縮に影響を及ぼさないことが示され、一方で、リソソーム／自食作用阻害剤は、エキソソーム数を増大させ、これによって、このような阻害剤が薬剤送達のためのエキソソームの製造を増強するために使用され得ることが示唆された。試験したリソソーム／自食作用阻害剤としては、バフィロマイシンＡ１、コンカナマイシン及びＮＡＡＤＰ−ＡＭが挙げられる。
本明細書に記載のｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を用いたエキソソーム中のｓｉＲＮＡ含有構築物の濃縮に対するＡｇｏ２の効果の試験も行った。結果によって、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構築物模倣体中に挿入されたＴｅｔＲを標的するｓｉＲＮＡは依然として（野生型細胞、または野生型のＡｇｏ２もしくは触媒的に失活されたＡｇｏ２でレスキューされたのＡｇｏ２ノックアウト細胞と比較して）Ａｇｏ２ノックアウトマウス胚線維芽細胞におけるエキソソームが濃縮されていたことが示される。さらに、結果によって、Ａｇｏ２が枯渇されるか、または触媒的に不活性化された場合に、構築物がエキソソームにおいてさらに濃縮されたことが示される。これらの結果、本明細書中に記載されるエキソソームパッケージング方法が、Ａｇｏ２の発現もしくは活性の阻害によって、及び／またはＡｇｏ２が少ないかもしくは活性がより低いエキソソーム産生細胞の利用によって増強され得ることが示唆される。
この試験の実験結果を図１０に示す。このデータによって、Ａｇｏ２がエキソソームへのｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１構造模倣体に基づくｓｉＲＮＡ含有構築物のパッケージングをある程度まで阻害し得ることが示唆されている。これらの実験では、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれたＧＦＰまたはＴｅｔＲを標的とするｓｉＲＮＡ配列を含むプラスミドを細胞にトランスフェクトし、エキソソーム対細胞中のＧＦＰまたはＴｅｔＲ ｓｉＲＮＡのレベル（対ｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１６（エキソソーム／細胞の中））を２〜３日後にｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。エキソソーム中のｍｉＲ−４５１由来配列の濃縮を、野生型エキソソームについて１に正規化した。Ｘ軸は、試験した細胞種（ＭＥＦ［マウス胚線維芽細胞］、Ａｇｏ２ノックアウトＭＥＦ、ＷＴＲ［野生型のＡｇｏ２でレスキューされたＡｇｏ２ノックアウトＭＥＦ］、及びＣＤＲ（酵素的に失活されたＡｇｏ２でレスキューされたＡｇｏ２ノックアウトＭＥＦ）を示す。
実施例１０：目的の様々な異なる核酸配列のエキソソーム濃縮
本明細書に記載の研究では、ＧＦＰ、ＳＯＤ１、及びＴｅｔレプレッサー（Ｔｅｔ Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）（それぞれがｍｉＲ−４５１とは無関係の異なる配列を有する）を標的する種々の異なるｓｉＲＮＡを、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体中に組み込んで、続いて本明細書に記載される方法を用いて、エキソソーム中で濃縮した。これらの結果、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−１９９−５ｐ及びｍｉＲ−１５５を含むｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体中に組み込まれた複数の独立したマイクロＲＮＡを用いる前の試験（本明細書において上記ですでに記載）に加えて、本明細書に記載の方法及び構築物が配列のバリエーションに対して高度に耐性であることが実証され、これらの構築物及び方法は、目的の広範な種々の核酸配列に適合するように用いられ得ることが示される。
実施例１１：ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の発現ベクター
本明細書で提供される結果によって、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体構築物が、濃縮されたエキソソームパッケージングを依然として提供しながら、様々な異なる技術を用いて細胞に送達されてもよいし、または発現されてもよいことが示される。
特定の実施例において、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体構築物は、発現ベクターを用いて細胞内で発現され得る。これに関して、種々の異なるプロモーター及びベクター（すなわち、ニワトリβ−アクチンエンハンサー−ＣＭＶ［ＣＡＧ］、ＣＭＶ、Ｕ６、ＩＲＥＳ、プラスミドまたはレンチウイルス構築物）が試験されている。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体構築物がＤＮＡ発現ベクター（上記参照）ではなくＲＮＡとして送達された場合に、目的の核酸配列（この例では、ｓｉＲＮＡ）がエキソソームで濃縮されているか否かを調べるためにも試験を行った。さらに、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１様配列、Ｄｒｏｓｈａプロセシング、Ａｇｏ２プロセシングまたは成熟ｍｉＲ−４５１様配列（少量の塩基対形成もしくはステム構造を３’末端に有するか、または正常なｓｉＲＮＡ（２２〜３５ｎｔ）よりもわずかに長い）を含む長いＲＮＡを含有するｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１の誘導体を産生するＲＮＡ模倣体（及びおそらくＤＮＡ発現構築物）の試験によって、そのような構築物が、全て、試験された条件下でエキソソームに堅調にパッケージングされることが示唆される。これらの知見によって、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体構築物またはその誘導体が、広範な状況において発現または送達され得るが、依然として目的の挿入された核酸配列をエキソソームに濃縮させることが示唆される。
実施例１２：ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１構造模倣体を用いて生成されたＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡがロードされたエキソソームによるマウス脳における遺伝子サイレンシング
本明細書に記載の方法に従ってｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体を使用して生成されたＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡをロードされたエキソソームを、インビボマウス系においてＳＯＤ１の発現を抑制するために使用した。これらの実験において、試験された条件下で、ＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡをロードされたエキソソームは、ＲＴ−ｑＰＣＲまたは定量的ＦＩＳＨによって測定される場合、マウス脳におけるＳＯＤ１の発現を、ある場合には約３０〜５０％低下させることが観察された。
これらの研究の結果を図１１に示す．ＮＳＣ−３４マウス運動ニューロン細胞株に、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格に組み込まれた、ＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。５μｇのエキソソームを、ヒトＧ９３Ａ ＳＯＤ１トランスジェニックマウスの脳室内空間に注射し、２日後にマウスを安楽死させた。組織を急速冷凍し、ＲＴ−ｑＰＣＲ及びＦＩＳＨのために加工した。
図１１（Ａ）は、皮質及び小脳における対照（β−アクチン及びＴＢＰ）と比較してＳＯＤ１を定量するためにＴａｑｍａｎプローブを使用するＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す。皮質及び小脳の両方において、ＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡをロードされたエキソソームを、対照エキソソームと比較して使用して、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルの低下が観察された。
図１１（Ｂ）では、マウスの皮質組織を、ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡ（ＥｘｉｑｏｎマイクロＲＮＡ ＩＳＨ、ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡ（ＳｔｅｌｌａｒｉｓプローブＱｕａｓａｒ ６７０）、ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（ＳｔｅｌｌａｒｉｓプローブＱｕａｓａｒ ５７０））のＦＩＳＨ分析のために加工した。代表的な落射蛍光画像を、図１１（Ｂ）に示す。ＤＡＰＩ（青色）を第一列に示し、ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡ（緑色）を二列目に示し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ（紫色）を３列目に示し、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（赤色）を４列目に示す。
図１１（Ｃ）は、ＳＯＤ１を標的とするサイレンシングＲＮＡと共にパッケージングされたエキソソームを注射したマウス由来の皮質の４〜８画像にわたるＧＡＰＤＨシグナル強度に対するＳＯＤ１ ｍＲＮＡシグナル強度の定量を提供する。示されるように、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルの減少が、コントロールエキソソームと比較してＳＯＤ１サイレンシングＲＮＡをロードされたエキソソームを用いて観察された。
ＳＯＤ１を標的とするｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の配列は以下のとおりであった：


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これらの配列は、ｐｒｅ−ｍｉｒ−４５１の配列をｄｒｏｓｈａ切断部位まで含む。それらは、ＩＲＥＳの下流、ｓｈＲＮＡの位置でＧＩＰＺベクターに挿入された。ＧＩＰＺ配列は、配列番号１８として図１３に示される。ｐＧＩＰＺ配列は以下である：
＞ｐＧＩＰＺ
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実施例１３：ｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１構造模倣体を使用して生成されたＧＦＰ標的化ｓｉＲＮＡをロードされたエキソソームによる選択標的細胞培養モデルにおける遺伝子サイレンシング
本明細書に記載の方法に従ってｐｒｅ−ｍＩＲ−４５１構造模倣体を使用して生成したＧＦＰ標的化ｓｉＲＮＡをロードされたエキソソームを用いて、選択された標的細胞におけるＧＦＰ遺伝子発現をサイレンシングした。これらの実験では、試験した条件下で、複数の異なるエキソソーム産生ドナー細胞から産生されたＧＦＰ標的化ｓｉＲＮＡをロードされたエキソソームが、ＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰの発現を減少させることが観察された。
これらの研究の結果を図１２に示す。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれたＧＦＰ ｓｉＲＮＡを発現する構築物でトランスフェクトされるか、または形質導入されたエキソソーム産生ドナー細胞由来のエキソソームを、ＧＦＰ発現エキソソーム標的細胞（ＨｅＬａ細胞、青色、左カラム；ＮＳＣ−３４細胞、オレンジ色、中間のカラム；またはＮｅｕｒｏ２ａ［Ｎ２Ａ］細胞、灰色、右側カラム）で４８時間インキュベートし、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで分析した。示されるように、ＧＦＰ発現は、複数の異なるエキソソームドナー細胞から産生されたＧＦＰ標的化ｓｉＲＮＡを含むエキソソームによってＨｅＬａ細胞において減少した。結果より、これらの実験で試験された特定のエキソソームはＨｅＬａ標的細胞に対して少なくとも部分的に選択的であったことが示唆される。
ｅＧＦＰを標的とするｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の配列は、以下のとおりであった：


５’−ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧＧＣＡＡＧＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧ ＵＵＣＡＵＵＣＵＵＧＣＵＡＵＡＣＣＣＡＧＡ（配列番号１９）
ＴｅｔＲを標的するｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の配列は以下のとおりであった：



５’−ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧＧＣＡＡＧＧＵＣＵＵＧＡＵＣＵＵＣＣＡＡＵＡＣＧＣＡＡＣＣＧＵＡＵＵＧＧＡＡＧＡＵ ＣＡＡＧＡＵＣＵＵＧＣＵＡＵＡＣＣＣＡＧＡ （配列番号２０）

ｑＰＣＲによるｍｉＲＮＡレベルを測定するためのプライマー（すべてのｑＰＣＲ反応がまた、ｍｉＳｃｒｉｐｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）における「ユニバーサル」プライマーを使用することに注意のこと）：
ｅＧＦＰプライマー：
５’−ａｔｇａａｃｔｔｃａｇｇｇｔｃａｇｃｔｔｇｃ （配列番号２１）
ＴｅｔＲプライマー：
５’−ｔｃｔｔｇａｔｃｔｔｃｃａａｔａｃｇｃａａｃ （配列番号２２）
ＳＯＤ１プライマー：
５’−ｔｔｃａｇｔｃａｇｔｃｃｔｔｔａａｔｇｃｔｔ （配列番号２３）
実験方法
（核酸設計）
ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１０６、またはｍｉＲ−１９９遺伝子サイレンシングガイド鎖配列を組み込んだＰｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、本明細書に記載される特定の研究において使用された。これらの核酸は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、２０１０，１０７（３４）：１５１６３−１５１６８に公開されているように、Ｅｒｉｃ Ｌａｉの研究室によって作成された。
（細胞内でのｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体の導入／発現）
細胞を、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてプラスミドでトランスフェクトした。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）による超遠心分離によってエキソソームを除去した１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭとともにインキュベートした。２４時間後、培地を回収し、エキソソームを示差的超遠心分離によって精製した。ＲＮＡを、エキソソーム及びエキソソーム産生細胞から、製造者の指示に従ってＴｒｉｚｏｌを用いて精製した。
使用されたプラスミドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、２０１０，１０７（３４）：１５１６３−１５１６８のとおり生成された。
（エキソソーム濃縮）
エキソソームは、前に記載されているように分画遠心分離によって濃縮された（Ｔｈｅｒｙ、２００６、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ ３、Ｕｎｉｔ ３ ２２）。要するに、ＭＥＦまたはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１００，０００ｇで１６時間遠心分離することによってエキソソームを枯渇した、ＦＢＳを含む培地中で培養した（Ｔｈｅｒｙ、２００６、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ ３、Ｕｎｉｔ ３ ２２）。エキソソームを精製するために、細胞培養物由来の上清を、４００ｇ（７分）、２０００ｇ（１０分）及び１０，０００ｇ（３０分、ＳＷ３２ローター）で遠心分離した。各段階で、上清を回収した。１０００００ｇ（１時間１０分、ＳＷ３２ローター）での遠心分離の後、上清を除去し、ペレットを再懸濁した。１０００００ｇ（２０分、ＴＬＡ１００．３ローター）での最終遠心分離によってペレットをＰＢＳで洗浄した。エキソソーム濃縮ペレットを、さらなる分析のためにＰＢＳに再懸濁した。
（動的光散乱）
濃縮されたエキソソームの調製は、ダイナミクスＶ６ソフトウェアを用いたＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｄｙｎａｐｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔでの動的光散乱によって分析した。データは、サンプルあたり少なくとも２００秒間、４℃及び１０％レーザー出力で１０秒ごとに収集した。強度（Ｃｎｔ／ｓ）及びサイズ（ｎｍ）は、装置によって自動的に生成した。
（ナノサイト粒子追跡分析）
濃縮されたエキソソームの調製を、ナノ粒子追跡分析ソフトウェアバージョン２．３を備えたＮａｎｏｓｉｇｈｔ ＬＭ１０装置を用いて分析した。測定温度は２２℃であり、時間設定は９０秒であった。分析条件は、以下のとおり設定した：Ｂｌｕｒ３×３、検出閾値３、最小トラック長９、及び最小予想サイズ３０ｎｍ。粒子サイズ（ｎｍ）及び濃度（粒子／ｍｌ）を含む分析レポートを自動的に生成した。
（電子顕微鏡）
エキソソーム調製物は、４℃のカコジル酸緩衝液中の１％四酸化オスミウム（ＥＭＳ、ＰＡ、ＵＳＡ）中に後固定した包埋のための加工まで、２％グルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍカコジル酸緩衝液を用いてその場で固定した。緩衝液中で洗浄した後、エキソソームを、記載したように（Ｌｕｆｔ、１９６１、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、９：４０９）、段階的エタノール中で脱水し、浸潤させ、Ｅｐｏｎ ８１２（ＭＥＣＡＬＡＢ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）中に包埋した。
切片を、酢酸ウラニルで染色し、検査はＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１００電子顕微鏡で行った。
（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
ＲＴ−ｑＰＣＲは、逆転写酵素ステップで産生されたＤＮＡの増幅を可能にするプライマーを用いて、ＭｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素系（Ｑｉａｇｅｎ）及びＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ａ６００２）を用いて行った。結果は、普遍的なｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７ａ及びｍｉＲ−１６に対して標準化された。
使用したプライマーは以下のとおりであった：
ｍｉＲ−４５１：ＡＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＡＴＴＡＣＴＧＡＧＴＴ（配列番号９）；
ｍｉＲ−１５５：ＡＣＣＣＣＴＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ（配列番号１０）；
ｍｉＲ−１９９：ＴＡＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＧＴ（配列番号１１）；
ｍｉＲ−１０６ａ：ＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＣＡＣＴＴＴＴ（配列番号１２）；
ｌｅｔ−７ａ：ＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴ（配列番号１３）；及び
ｍｉＲ−１６：ｔａｇｃａｇｃａｃｇｔａａａｔａｔｔｇｇｃｇ（配列番号２４）。
（脳室内注射）
ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格またはコントロールエキソソームからのヒトＳＯＤ１標的化サイレンシングＲＮＡを発現するＮＳＣ−３４細胞から分画遠心分離によって精製した１０μｇのエキソソームを、ヒトＳＯＤ１ Ｇ９３Ａトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）の脳室内腔に、５μＬの容積で注射した。４８時間後、マウスを屠殺して、脳を急速冷凍し、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）またはＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ定量のいずれかのために分割した。
（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）
マウスから組織を採取し、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ中に４８時間置いた。組織が底に沈むまで、ＰＦＡを、３０％スクロースを含むＰＢＳで置換した。組織をＯＣＴに入れ、液体窒素で凍結させた。６μｍの組織切片をスライド上に集め、−８０℃に置いた。スライドを室温（ＲＴ）まで加温した後に染色した。スライドをＲＴで１０分間、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡに入れた。それらをＰＢＳ（ＲＴ）で洗浄し、透過性緩衝液（１０μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００がＰＢＳに含有される）中に３７℃で２０分間置いた。スライドを、ＰＢＳ（ＲＴ）で洗浄し、ＰＢＳ（ＲＴ）中の１％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ及び２５０μｇ／ｍＬの酵母抽出ＲＮＡで１時間ブロックした。スライドを、ＰＢＳ（ＲＴ）で洗浄し、ＮａＢＨ４の０．１％水溶液（ＲＴ）を用いて１時間、自家蛍光低減のために処理した。スライドを、Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ洗浄Ａ緩衝液（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｅｔａｌｕｍａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で洗浄し（ＲＴ）、Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ蛍光ｍＲＮＡプローブ（ＳＯＤ１、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン）及びＩＤＴ ＤＩＧ結合ｓｉＲＮＡプローブ（ｓｉＳＯＤ１、陰性対照ｓｉＲＮＡ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）をハイブリダイゼーション緩衝液（９０％Ｓｔｅｌｌａｒｉｓハイブリダイゼーション緩衝液、１０％ホルムアミド）に入れた。スライドを暗所で、３７℃で一晩プローブとともにインキュベートした。スライドを洗浄Ａ緩衝液（ＲＴ）で洗浄し、ブロッキング溶液中の１：１００のヒツジ抗ＤＩＧ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）とＲＴで１時間インキュベートした。スライドを、洗浄Ａ緩衝液（ＲＴ）で洗浄し、ロバ抗ヒツジＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の１：５００のブロッキング溶液とＲＴで１時間インキュベートした。スライドを、洗浄Ａ緩衝液（ＲＴ）で洗浄し、ＰＢＳ中のＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１：１００００と共にＲＴで５分間インキュベートした。最終の洗浄は、ＲＴでＳｔｅｌｌａｒｉｓ洗浄Ｂ緩衝液で行い、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ ＡＦ３抗退色（ａｎｔｉｆａｄｅｎｔ）溶液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いてスライドをマウントし、マニキュア液で密封した。
（画像解析）
ＦＩＳＨ画像解析には、ＩｍａｇｅＪ解析ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／）を用いた。要するに、６３×Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ１．４オイルレンズ（倍率１０００倍）を用いて、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ．Ｍ２、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって画像を取得した。取得後に色を加えた（ＤＡＰＩ用の青、ｓｉＲＮＡ ＳＯＤ１用の緑、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ用の赤、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ用の紫）。コントラスト及び閾値は、対照画像上で調整し、実験画像についても同様に維持した。全体像及び目的領域の平均強度及び共局在化をソフトウェアで測定した。平均強度平均値及びＳＥＭを、Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。
（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
ＲＴ−ｑＰＣＲは、以下のプライマーｍｉｒ−４５１：ａａａｃｃｇｔｔａｃｃａｔｔａｃｔｇａｇｔｔ（配列番号１４）、ｌｅｔ−７ａ：ｔｇａｇｇｔａｇｔａｇｇｔｔｇｔａｔａｇｔｔ（配列番号１５）、ｍｉｒ−１６：ｔａｇｃａｇｃａｃｇｔａａａｔａｔｔｇｇｃｇ（配列番号１６）を用いる逆転写酵素ステップで産生されたＤＮＡの増幅を可能にするプライマーを用いて、（Ｐｒｏｍｅｇａ Ａ６００２）またはＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ ｑＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。
（プラスミド構築物及びレンチウイルスベクター）
ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格に組み込まれたＧＦＰ ｓｉＲＮＡ、ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡまたはＴｅｔＲ ｓｉＲＮＡを、レンチウイルスｐＧＩＰＺベクターから発現させた。ｐｒｅ−ｍｉＲ−１６骨格に挿入された同様のＲＮＡを、いくつかの実験で使用した。ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１骨格からのＧＦＰ ｓｉＲＮＡまたはＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡを安定に発現するＮＳＣ−３４を含む細胞株を、プロマイシンで選択することによって生成した。
（合成的ＲＮＡ）
挿入されたＧＦＰ ｓｉＲＮＡを有する４２ｎｔのｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１に対応するＲＮＡ、またはＡｇｏ２切断部位までの同じ構築物、または完全成熟型のｍｉＲ−４５１産生のＧＦＰ ｓｉＲＮＡ（一本鎖２２ｎｔ ＲＮＡ）、または２ｎｔの３’オーバーハングを有する二本鎖ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを、ＩＤＴにより合成した。これらを、Ａｇｏ２を遺伝的に欠失した野生型、安定に再発現された野生型Ａｇｏ２を有する野性型、またはＲＮＡｉＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で安定に再発現させた触媒的に失活された変異体Ａｇｏ２のいずれかを用いてマウス胚線維芽細胞にトランスフェクトした。２日後、エキソソームを精製し、エキソソーム中の成熟ＧＦＰ ｓｉＲＮＡのレベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって定量した。
Ａｇｏ２プロセシングされた模倣体の配列：
ａｕｇａａｃｕｕｃａｇｇｇｕｃａｇｕｕｇｃｇｃｕｇａｃｃｃ（配列番号２５）
Ｄｒｏｓｈａプロセシングされた模倣体配列：
ＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＵＣ（配列番号２６）
完全に成熟した模倣体配列：
ＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣ（配列番号２７）
完全に成熟した模倣体を二本鎖にするための相補鎖配列：
ＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＵＣ（配列番号２８）
細胞培養モデルにおけるｍＩＲ−４５１由来ｓｉＲＮＡのエキソソーム媒介性の送達
いくつかの細胞種（ＭＳＣ、ＭＥＦ、ＨｅＬａ、Ｎ２Ａ、Ｃ８−Ｄ１Ａ、ＢＶ２及びＲＡＷ２６７）由来のエキソソームを分画遠心分離によって精製した。ＧＦＰを安定的に発現するＨｅＬａ、ＮＳＣ−３４またはＮ２Ａ細胞を含む６ウェルプレートの各ウェルに１μｇのエキソソームを添加した。４８時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＧＦＰを定量した。細胞をＦＳＣ及びＳＳＣ上でゲーティングし、ＧＦＰ発現の幾何平均をＫａｌｕｚａソフトウェアを用いて得た。同じ細胞に由来する野生型エキソソームで処理した細胞におけるＧＦＰレベルの幾何平均を１００％に設定した。
１つ以上の例示的な実施形態及び実施例を非限定的な例として記載してきた。当業者であれば、特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変形及び修正を行い得ることを理解されるであろう。
引用文献
１．Ｋａｎａｓｔｙ、Ｄｏｒｋｉｎ、Ｖｅｇａｓ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ １２、９６７（２０１３）．
２．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、Ｌａｎｇｅｒ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ８、１２９（２００９）．
３．Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６９、８１９（２０１３）．
４．Ｈａｕｓｓｅｃｋｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ １、ｅ８（２０１２）．
５．Ｆａｂｉａｎ、Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９、５８６（２０１２）．
６．Ｋａｓｉｎｓｋｉ、Ｓｌａｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ １１、８４９（２０１１）．
７．Ｅｍｄｅ、Ｈｏｒｎｓｔｅｉｎ、ＥＭＢＯ Ｊ ３３、１４２８（２０１４）．
８．Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９、６４８（２０１４）．
９．Ｋａｎａｓｔｙ、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、Ｖｅｇａｓ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０、５１３（２０１２）．
１０．Ｋｌｅｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ４５２、５９１（２００８）．
１１．Ｒａｐｏｓｏ、Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００、３７３（２０１３）．
１２．Ｖａｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９、６５４（２００７）．
１３．Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９、１７６９（２０１１）．
１４．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９、３４１（２０１１）．
１５．Ｓ、Ｍａｇｅｒ、Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ、Ｗｏｏｄ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １２、３４７（２０１３）．
１６．Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ５、ｅ１５８（２００７）．
１７．Ｚｅｅｌｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８、１２２８（２００８）．
１８．Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２１、１８５（２０１３）．
１９．Ｌａｍｐａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７０、２１１（２００２）．
２０．Ｖｉａｕｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３４、６５（２０１１）．
２１．Ｃｈｅｎｇ、Ｓｈａｒｐｌｅｓ、Ｓｃｉｃｌｕｎａ、Ｈｉｌｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ３、（２０１４）．
２２．Ｃｏｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５、ｅ１１８０３（２０１０）．
２３．Ｇｉｂｂｉｎｇｓ、Ｃｉａｕｄｏ、Ｅｒｈａｒｄｔ、Ｖｏｉｎｎｅｔ、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１、１１４３（２００９）．
２４．Ｂａｔａｇｏｖ、Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ、Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎ、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２ Ｓｕｐｐｌ ３、Ｓ１８（２０１１）．
２５．Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ−Ｂｅｌｔｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４、２９８０（２０１３）．
２６．Ｋｏｏｉｊｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １７２、２２９（２０１３）．
２７．Ｃｈｅｌｏｕｆｉ、Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ、Ｃｈｏｎｇ、Ｈａｎｎｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ４６５、５８４（２０１０）．
２８．Ｙａｎｇ、Ｍａｕｒｉｎ、Ｌａｉ、ＲＮＡ １８、９４５（２０１２）．
２９．Ｔｈｅｒｙ、Ａｍｉｇｏｒｅｎａ、Ｒａｐｏｓｏ、Ｃｌａｙｔｏｎ、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ３、Ｕｎｉｔ ３ ２２（２００６）．
３０．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ２、ｅ１３３（２０１３）．
３１．Ｇａｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９、５６９２（２０１１）．
３２．Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｄａｖｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９７、９０９（２００７）．
３３．Ｆａｂｉａｎ、Ｍ．Ｒ．、Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎ．＆ Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、Ｗ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７９、３５１−３７９、（２０１０）．
３４．Ｐｅｎｃｈｅｖａ、Ｎ．＆ Ｔａｖａｚｏｉｅ、Ｓ．Ｆ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５、５４６−５５４、（２０１３）．
３５．Ｃｒｏｃｅ、Ｃ．Ｍ．Ｃａｕｓｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １０、７０４−７１４、（２００９）．
３６．Ａｂｅ、Ｍ．＆ Ｂｏｎｉｎｉ、Ｎ．Ｍ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２３、３０−３６、（２０１３）．
３７．Ｃｏｅｌｈｏ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＲＮＡｉ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６９、８１９−８２９、（２０１３）．
３８．Ｋａｎａｓｔｙ、Ｒ．、Ｄｏｒｋｉｎ、Ｊ．Ｒ．、Ｖｅｇａｓ、Ａ．＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ １２、９６７−９７７、（２０１３）．
３９．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、Ｋ．Ａ．、Ｌａｎｇｅｒ、Ｒ．＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｇ．Ｋｎｏｃｋｉｎｇ ｄｏｗｎ ｂａｒｒｉｅｒｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ８、１２９−１３８、（２００９）．
４０．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｔ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４４１、１１１−１１４、（２００６）．
４１．Ｈａｕｓｓｅｃｋｅｒ、Ｄ．Ｔｈｅ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ ２０１２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ １、ｅ８、（２０１２）．
４２．Ｒａｐｏｓｏ、Ｇ．＆ Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ、Ｗ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｅｘｏｓｏｍｅｓ、ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ、ａｎｄ ｆｒｉｅｎｄｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００、３７３−３８３、（２０１３）．
４３．Ｖａｌａｄｉ、Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９、６５４−６５９、（２００７）．
４４．Ｚｈｕａｎｇ、Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｂｙ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｅｘｏｓｏｍｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎａｓａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９、１７６９−１７７９、（２０１１）．
４５．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ、Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９、３４１−３４５、（２０１１）．
４６．Ｃｏｌｏｍｂｏ、Ｍ．、Ｒａｐｏｓｏ、Ｇ．＆ Ｔｈｅｒｙ、Ｃ．Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３０、２５５−２８９、（２０１４）．
４７．Ｂａｔａｇｏｖ、Ａ．Ｏ．、Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ、Ｖ．Ａ．＆ Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎ、Ｉ．Ｖ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＲＮＡｓ ａｓ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅｍ ｔｏ ｅｘｏｓｏｍｅ ｎａｎｏ−ｖｅｓｉｃｌｅｓ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １２ Ｓｕｐｐｌ ３、Ｓ１８、（２０１１）．
４８．Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ−Ｂｅｌｔｒｉ、Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｕｍｏｙｌａｔｅｄ ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎｔｏ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｔｉｆｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４、２９８０、（２０１３）．
４９．Ｋｏｏｉｊｍａｎｓ、Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉＲＮＡ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｂｓｃｕｒｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｌｏａｄｉｎｇ ｉｎｔｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １７２、２２９−２３８、（２０１３）．
５０．Ｃｈｅｎｇ、Ｌ．、Ｓｈａｒｐｌｅｓ、Ｒ．Ａ．、Ｓｃｉｃｌｕｎａ、Ｂ．Ｊ．＆ Ｈｉｌｌ、Ａ．Ｆ．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍｉＲＮＡ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｂｌｏｏｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ３、（２０１４）．
５１．Ｃｏｌｌｉｎｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｓｈｕｔｔｌｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５、ｅ１１８０３、（２０１０）．
５２．Ｂａｃｈ、Ｆ．Ｈ．＆ Ｓａｃｈｓ、Ｄ．Ｈ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｐｔｓ：ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３１７、４８９−４９２、（１９８７）．
５３．Ｌａｉ、Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ＭＳＣ ｒｅｄｕｃｅｓ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ４、２１４−２２２、（２０１０）．
５４．Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｅｌａｎｏｍａ Ｂ１６−ＢＬ６ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６５、７７−８４、（２０１３）．
５５．Ｗｉｋｌａｎｄｅｒ、Ｏ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ、ｒｏｕｔｅ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ４、２６３１６、（２０１５）．
５６．Ｋｏｍａｒｏｖａ、Ｙ．＆ Ｍａｌｉｋ、Ａ．Ｂ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｖｉａ ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ７２、４６３−４９３、（２０１０）．
５７．Ｔｈｅｒｙ、Ｃ．、Ａｍｉｇｏｒｅｎａ、Ｓ．、Ｒａｐｏｓｏ、Ｇ．＆ Ｃｌａｙｔｏｎ、Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ３、Ｕｎｉｔ ３ ２２、（２００６）．
５８．Ｌｕｆｔ、Ｊ．Ｈ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｅｐｏｘｙ ｒｅｓｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｙｔｏｌｏｇｙ ９、４０９−４１４、（１９６１）．
る。
このセクション、及び本明細書のいずれかに引用されている全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

  1. 遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、またはその前駆体を含むエキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生するための方法であって、
    −ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた、遺伝子サイレンシング核酸、目的の核酸、またはその前駆体を含む核酸構築物をエキソソーム産生細胞に導入すること、またはエキソソーム産生細胞内で発現させること；
    −細胞からエキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生すること；ならびに
    −必要に応じて、産生されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞を回収または濃縮すること、
    を包含する、前記方法。
  2. 前記ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、平滑末端、５’オーバーハング、３’オーバーハング、または５’及び３’ルース末端を有し、かつ約２５〜５４ヌクレオチド（ｎｔ）、例えば約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、または５２ｎｔの全長を有する、ステム−ループ二次構造を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、約４、５、６、７または８ｎｔのループ全長を有するステム−ループ二次構造を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、前記ステム内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチ、例えば、少なくとも１つの塩基対ミスマッチを、Ｄｒｏｓｈａ切断部位に隣接する最初の３つの塩基対内に位置するステム内に有するステム−ループ二次構造を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、Ａｇｏ２切断位置まで、またはＡｇｏ２切断位置の前または後に伸長する３’末端を有するステム−ループ二次構造を含み、その結果、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、５’オーバーハング部分及び３’塩基対部分を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体が、成熟ｍｉＲ−４５１を模倣する必要に応じてループ由来の配列である、３’部分を含む一本鎖構造を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体は、長さが約２２〜３５ｎｔ、例えば約２３〜２４ｎｔである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）クローンＨ１もしくはＨ９細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、低いＡｇｏ２発現もしくは活性レベルを有する細胞、初代ヒト間葉系幹細胞、初代マウスマクロファージ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などのヒト乳癌細胞株、Ｎｅｕｒｏ２ａまたはＳＨＳＹなどのマウスもしくはヒト神経細胞株、Ｃ８ＤａもしくはＳＩＭなどのマウス星状細胞株、ＢＶ２などのマウスミクログリア細胞株、ＮＳＣ−３４もしくはＭＮ−１などのマウス運動ニューロン細胞株、ＨｅＬａ、マウス胚線維芽細胞、またはＪＡＷＳ ＩＩなどのマウス樹状細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記遺伝子サイレンシング核酸が、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣｒｉｓｐｒガイドＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡであるか、またはそれらに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. エキソソームまたはエキソソーム様小胞を生成しながら、細胞を無血清培地中でまたはエキソソーム枯渇血清培地中で培養する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記方法が、エキソソーム産生細胞をリソソームまたは自食作用阻害剤で処理するステップをさらに包含する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 組成物であって、
    −エキソソームまたはエキソソーム様小胞；及び
    −ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体、またはその前駆体もしくは切断断片に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物；を含み
    前記核酸構築物、またはその前駆体もしくは切断断片が、エキソソームまたはエキソソーム様小胞の内部にある、前記組成物。
  13. エキソソーム産生細胞によって産生されたエキソソームまたはエキソソーム様小胞に前記遺伝子サイレンシング核酸をパッケージングするためのｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物の使用であって、前記核酸構築物が前記細胞に導入されるか、または前記細胞で発現される、前記使用。
  14. 核酸送達組成物であって：
    −エキソソームまたはエキソソーム様小胞；及び
    −ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体、またはその前駆体もしくは切断断片に組み込まれた遺伝子サイレンシング核酸を含む核酸構築物；
    を含み、
    ここで、この核酸構築物またはその前駆体もしくは切断断片がエキソソームまたはエキソソーム様小胞に含まれている、前記核酸送達組成物。
  15. 候補のエキソソーム産生細胞が、ｐｒｅ−ｍｉＲ−４５１構造模倣体に組み込まれた、遺伝子サイレンシング核酸含む核酸構築物、目的の核酸、またはその前駆体を用いる濃縮エキソソームまたはエキソソーム様小胞を産生するのに適したエキソソーム産生細胞であるか否かを同定する方法であって：
    前記候補エキソソーム産生細胞によって産生されたエキソソームのｍｉＲ−４５１含量を定量すること、ｍｉＲ−４５１がエキソソームで濃縮されているか否かを決定すること；
    を包含し、
    ここでｍｉＲ−４５１のエキソソーム濃縮によって、候補エキソソーム産生細胞が、濃縮エキソソームまたはエキソソーム様小胞の産生に適していることが示される、前記方法。
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3733856A1 (en) * 2014-04-18 2020-11-04 University of Massachusetts Exosomal loading using hydrophobically modified oligonucleotides
US11993787B2 (en) 2015-11-18 2024-05-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Neural cell extracellular vesicles
TWI704923B (zh) * 2017-06-26 2020-09-21 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院 包含胞外囊泡之製劑、用以製備該製劑之方法及其用途
GB2597623A (en) 2017-08-07 2022-02-02 Univ California Platform for generating safe cell therapeutics
US10709797B2 (en) 2017-08-16 2020-07-14 City University Of Hong Kong Isolation of extracellular vesicles (EVs) from red blood cells for gene therapy
CN109666629A (zh) * 2017-10-13 2019-04-23 上海睿泰生物科技股份有限公司 人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及用途
WO2019113711A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 University Of Ottawa Exosome packaging and targeted autophagy
WO2019195936A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Ilkow Carolina Solange Microrna-based compositions and methods used in disease treatment
US20210369789A1 (en) * 2018-10-04 2021-12-02 Exogenus Therapeutics, Sa Compositions comprising small extracellular vesicles derived from umbilical cord blood mononuclear cells with anti-inflammatory and immunomodulatory properties and process for obtaining them
AU2019382824A1 (en) * 2018-11-19 2021-06-03 Uniqure Ip B.V. Method and means to deliver miRNA to target cells
CN112891365B (zh) * 2019-11-19 2022-09-27 广州溯原生物科技股份有限公司 一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体的制备及其应用
GB201919021D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Reneuron Ltd Nucleic acid constructs for delivering polynucleotides into exosomes
KR20220127851A (ko) 2020-01-13 2022-09-20 카민 테라퓨틱스 피티이. 엘티디. 핵산 로딩된 적혈구 세포외 소포
CN113444742A (zh) * 2020-03-10 2021-09-28 路宝特（南京）环保科技有限公司 一种药物靶向递送用工程化外泌体的制备方法及其应用
CN111424017B (zh) * 2020-03-27 2022-08-09 暨南大学 一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用
EP4240858A1 (en) * 2020-11-06 2023-09-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compositions and methods for enhancing nucleic acid therapeutics
GB2603454A (en) 2020-12-09 2022-08-10 Ucl Business Ltd Novel therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
CN113684130B (zh) * 2021-08-17 2024-04-26 深圳高性能医疗器械国家研究院有限公司 一种刺激细胞外泌体分泌的设备、方法及得到的外泌体和其应用
GB202117758D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Ucl Business Ltd Therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
CN114306621B (zh) * 2021-12-20 2023-10-20 苏州大学 一种携带核酸药物的细胞外泌体及其制备方法与在免疫治疗中的应用
WO2024192091A1 (en) * 2023-03-16 2024-09-19 Lonza Sales Ag Methods for producing extracellular vesicles

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080256435A1 (en) * 2007-01-26 2008-10-16 Citation Technologies, Inc. Interconnection of Document Preparation, Document Viewing, and Alert Processing in Structured Documents
CA2795815C (en) * 2010-04-23 2018-06-26 Cold Spring Harbor Laboratory Novel structurally designed shrnas
CA2910802A1 (en) * 2013-04-12 2014-10-16 Samir El Andaloussi Therapeutic delivery vesicles
WO2015002956A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 Ohio State Innovation Foundation Exosome delivery system

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