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JP2018523471A - システイン置換免疫グロブリン - Google Patents

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Abstract

本開示は、システイン置換免疫グロブリン、たとえばポリペプチド、抗体、そのようなポリペプチドおよび抗体をコードする核酸、それらを作製するための宿主細胞、ベクターおよび方法、抗体のコンジュゲート誘導体、そのような抗体およびコンジュゲート誘導体を作製するための組成物および方法、ならびに抗体およびコンジュゲート変異体を使用してがんを検出し、処置し、病変細胞を死滅させる方法を提供する。特定の態様において、置換は、重鎖中のV266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436CおよびL441C（EUナンバリング）またはS156（Kabatナンバリング）から選択される。

Description

関連特許出願の相互参照
本特許出願は、あらゆる意味で参照により本明細書に組み入れられる米国特許仮出願第62/193,531号の優先権の恩典を主張する。
テキストファイルとしての配列リストの提出物の参照
2016年7月15日に作製されたファイル1014170_ST25.txt（10,366バイト、機械フォーマットIBM-PC、MS-Windowsオペレーティングシステム）に書き込まれた配列リストがあらゆる意味で全体として参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
モノクローナル抗体（mAb）は、標的抗原に対するその高い特異性および親和性が理由で、研究および治療における必須ツールである。1990代以来、治療用mAbは、炎症性障害およびがんをはじめとする広い範囲の疾患の医療的ケアに対して実質的な影響を及ぼしてきた。mAbの決定的な特徴は、高度に特異的なやり方で標的抗原に結合して、宿主免疫クリアランス法、たとえば補体依存性細胞傷害性（CDC）または抗体依存性細胞傷害性（ADCC）による除去のためにそれらをマーキングするその能力である。抗体はまた、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））およびセツキシマブ（Erbitux（登録商標））の場合のように、標的抗原に結合し、その機能を阻害することにより、治療有益性を付与することができる。
CLL-1は、白血病（たとえば急性骨髄性白血病（AML））のような血液悪性疾患に見られる骨髄細胞中に主に発現する細胞表面糖タンパク質である。血液悪性疾患のために現在利用可能な治療法は有害かつしばしば重篤な副作用を伴う。たとえば、MYLOTARG（登録商標）投与から生じる合併症は、肝毒性、静脈閉塞性疾患、重度の骨髄抑制（患者の-98％）、腫瘍溶解症候群、免疫過敏症候群および呼吸器障害を含む。したがって、副作用を減らしながらも有効である、血液悪性疾患のための新規な治療法を特定する必要がある。CLL-1は骨髄細胞上で選択的に発現するため、CLL-1を認識しそれに結合する組成物は、血液悪性疾患、特に骨髄由来の悪性疾患のそのような治療に有用であり得る。
細胞傷害性薬物または放射性核種へのコンジュゲーションは、mAb利用可能性を拡張し、それらの効力および有効性を改善することができる。これが達成されるのは、抗体が、細胞傷害性ペイロードを、特異的に患部組織を標的指向して送達するためである。抗体は、様々なリンカーケミストリーによって多数の細胞傷害性薬物にコンジュゲーションされており、これらの抗体薬物コンジュゲート（ADC）は、抗原発現性腫瘍細胞を選択的かつ強力に死滅させる能力を有する。ADCはクリニックにおいて成功が実証されており、2つのそのような薬物、アドトラスツズマブエムタンシン（Kadcyla（登録商標））およびブレンツキシマブベドチン（Adcetris（登録商標））が市販されている。
ADC開発の成功は、抗体選択の最適化、リンカー安定性、細胞傷害性薬物の効力および抗体へのリンカー−薬物コンジュゲーション形式に依存する。
従来のADCにおいて、薬物コンジュゲーションは、薬物と抗体との様々なモル比を有する種の混合物を含有する不均一な産物を生み出す。抗体へのコンジュゲーション部位は、溶媒アクセス可能な反応性アミノ酸残基、たとえばリジンまたはシステインで起こる。不均一性は、各ADC種が薬物負荷およびコンジュゲーション部位の両方において異なるという点で、2つのレベルで生じる。Panowski et al., mAbs 6:1, 31-45 (2014)（非特許文献1）。したがって、各種が異なる性質を有して、広い範囲のインビボ薬物動態学的（PK）性質およびバッチ間可変性を生じさせ得る。加えて、可変性の薬物抗体比（DAR）が、高い薬物負荷、高い疎水性、速やかなクリアランス、より低い忍容性および狭い治療濃度域を生じさせる。Junutula et al., Nat. Biotech. 26(8), 925-932 (2008)（非特許文献2）。
既知の数のリンカー−薬物が一貫して所定の部位にコンジュゲートされる、部位特異的コンジュゲーションが、これらの課題を解決するための1つの方法である。不均一性は最小化され、ADC性質はより予測可能であり、コンジュゲート作製はバッチ間で一貫している。
アミノ酸のシステインは反応性チオール基を提供する。この基は、タンパク質を標識するための位置として、また、ADCの生成のために、長らく使用されてきた。システインはタンパク質中で改変することができるが、この手法は難題を伴わないわけではない。たとえば、改変された遊離システインは、他の分子上のシステインとコンジュゲートして、タンパク質ダイマーを形成することができる。また、天然システイン残基と分子内でペアを形成して、タンパク質機能を損なうかまたは阻害する、不適当なフォールディングをもたらすこともあり得る。したがって、導入されたシステイン残基を部位特異的コンジュゲーションに使用する成否は、システイン導入置換が抗体構造または機能を変化させない正しい部位を選択する能力に依存する。Junutula et al., Nat. Biotech. 30(2): 184-191 (2012)（非特許文献3）。
さらなる複雑な問題は、置換部位における溶媒アクセス可能性および電荷がADC安定性にとって重要であるということである。システイン、改変された抗Her2/neuマレイミドリンカーADCの安定性の研究において、高い溶媒アクセス可能性は、血漿中、アルブミン、遊離システインまたはグルタチオン中の反応性チオールとのマレイミド交換の結果として、コンジュゲートされたチオール反応性リンカーを失った。Shen et al., Nat. Biotech. 30(2): 184-191 (2012)（非特許文献4）。したがって、一貫した薬物負荷、低い疎水性、緩やかなクリアランス、高い忍容性およびより大きな治療指数を有する、安定な部位特異的ADCを特定する大きな必要性が存在する。さらには、CLL-1を標的とする安定な部位特異的ADCを創製する、さらに大きな必要性もまた存在する。
この発明の背景における記載は、従来技術を承認するものでもないし、引用された参考文献を裏書きするものでもない。
Panowski et al., mAbs 6:1, 31-45 (2014) Junutula et al., Nat. Biotech. 26(8), 925-932 (2008) Junutula et al., Nat. Biotech. 30(2): 184-191 (2012) Shen et al., Nat. Biotech. 30(2): 184-191 (2012)
本開示は、システイン置換免疫グロブリン、たとえばポリペプチド、抗体、そのようなポリペプチドおよび抗体をコードする核酸、それらを作製するための宿主細胞、ベクターおよび方法、抗体のコンジュゲート誘導体、そのような抗体およびコンジュゲート誘導体を作製するための組成物および方法、ならびに抗体およびコンジュゲート変異体を使用してがんを検出し、処置し、病変細胞を死滅させる方法を提供する。
1つの態様において、本開示は、置換残基が、V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436CおよびL441C（EUナンバリング）からなる群より選択される1つまたは複数の残基である、システイン置換免疫グロブリンポリペプチドを提供する。1つの局面において、免疫グロブリンポリペプチドはヒトIgG重鎖定常領域に由来する。別の局面において、IgGはアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である。
別の態様において、本開示は、置換残基が、V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436CおよびL441C（EUナンバリング）からなる群より選択される1つまたは複数の残基である、システイン置換免疫グロブリンポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供する。1つの局面において、核酸は発現制御配列と機能的に連結されている。別の局面において、機能的に連結された核酸はさらに、発現ベクターに含まれる。さらに別の局面において、本開示は、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに別の態様において、本開示は、システイン置換免疫グロブリンポリペプチドを作製する方法であって、システイン置換免疫グロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む核酸分子を含む組換え細胞を培養する工程を含み、置換残基が、V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436CおよびL441C（EUナンバリング）からなる群より選択される1つまたは複数の残基である、方法を提供する。
さらなる態様において、本開示は、重鎖定常領域中のV266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436CおよびL441C（EUナンバリング）からなる群より選択される置換アミノ酸残基をさらに含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドを含むシステイン置換抗体を提供する。1つの局面において、重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGアイソタイプに由来する。
別の局面において、抗体はさらに軽鎖を含む。さらなる局面において、軽鎖は、κおよびλからなる群より選択される。
さらに別の局面において、抗体は、CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、チロシナーゼ、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、テロメラーゼ、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGEおよびMAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、ネクチン-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、組織因子（TF）、CanAg、EGFR、αv-インテグリン、CD37、葉酸受容体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4またはエンドシアリン／CD248に結合する。さらなる局面において、抗体はCLL-1に結合し、可変軽鎖および可変重鎖を含み、
（a）可変軽鎖がCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3をさらに含み、さらに
a.CDR-L1が
Figure 2018523471
であり、
b.CDR-L2がLAS（SEQ ID NO:2）であり、
c.CDR-L3が
Figure 2018523471
であり、
（b）可変重鎖がCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3をさらに含み、さらに
a.CDR-H1が
Figure 2018523471
であり、
b.CDR-H2が
Figure 2018523471
であり、
c.CDR-H3が
Figure 2018523471
である。
さらなる局面において、抗体はCLL-1に結合し、可変軽鎖および可変重鎖を含み、
（c）可変軽鎖がCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3をさらに含み、さらに
a.CDR-L1が
Figure 2018523471
であり、
b.CDR-L2が
Figure 2018523471
であり、
c.CDR-L3が
Figure 2018523471
であり、
（d）可変重鎖がCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3をさらに含み、さらに
a.CDR-H1が
Figure 2018523471
であり、
b.CDR-H2が
Figure 2018523471
であり、
CDR-H3が
Figure 2018523471
である。
いくつかの態様において、抗-CLL-1抗体は、
Figure 2018523471
を含む軽鎖可変領域配列、
Figure 2018523471
を含む重鎖可変領域配列、または上記軽鎖配列および重鎖配列の両方を含む。
さらなる局面において、本開示は、システイン置換抗体をコードする単離された核酸配列を提供する。1つの局面において、核酸は発現制御配列と機能的に連結されている。別の局面において、機能的に連結された核酸はさらに発現ベクターを構成する。さらなる局面において、本開示は、発現ベクターを含む宿主細胞およびそのような宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を作製する方法を提供する。さらなる局面において、本開示は抗体を単離することを提供する。
さらに別の態様において、本開示は、置換システインがリンカーを介してコンジュゲート部分に接続されている、システイン置換抗体を提供する。1つの局面において、コンジュゲート部分は、薬物、放射性核種、蛍光体、ビオチン、RNA、抗生物質、タンパク質および検出可能な部分からなる群より選択される。
別の局面において、コンジュゲート部分は、薬物、ビオチン（BMCCまたはHPDP）または蛍光体（Alexa488）である。さらに別の局面において、薬物は、モノマーまたはダイマー形態（たとえばヘテロダイマーまたはホモダイマー、たとえばピロロベンゾジアゼピン（PBD）ダイマー、インドリノベンゾジアゼピンダイマー、イソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー（以下に記すD202を含むが、それに限定されない）にあることができるベンゾジアゼピン誘導体（ピロロベンゾジアゼピン類、インドリノベンゾジアゼピン類またはイソキノリジノベンゾジアゼピン類を含むが、それらに限定されない）、ドラスタチン類、アウリスタチン類、メイタンシノイド、チューブリシン、クリプトフィシン、α-アマニチン、トリコテン、SN-38、デュオカルマイシン、CC1065、カリケアミシン、エンジイン系抗生物質、タキサン、ドキソルビシン誘導体、アントラサイクリン、アザノフィド（azanofide）、およびそれらの立体異性体、同配体、類似体または誘導体からなる群より選択される。
さらなる局面において、リンカーは薬物に共有結合されている。別の局面において、リンカーは、チオールとチオール反応性基、たとえばマレイミド、ハライドおよびスルホニルとの間の反応を介して抗体に結合されている。さらに別の局面において、リンカーは、ジスルフィド結合を介して薬物に接続されている。さらなる局面において、ジスルフィド結合はピリジルジスルフィド部分である。さらなる局面において、リンカーは標的の微小環境中で切断可能である。
さらなる局面において、コンジュゲート部分は、検出可能な部分である。さらなる局面において、検出可能な部分は、発光体、たとえばA488またはビオチン（たとえばBMCC-ビオチンまたはHPDP-ビオチン）である。
さらなる態様において、本開示は、システイン置換抗体と、アジュバントとを含む組成物を提供する。1つの局面において、アジュバントは、薬学的に許容可能な担体または希釈剤である。
さらなる態様において、本開示は、関心対象の細胞の存在を検出する方法であって、細胞と、細胞に結合することができる少なくとも有効量のシステイン置換抗体とを、接触させる工程、および細胞への抗体の結合を検出する工程を含み、前記結合が関心対象の細胞を示す、方法を提供する。1つの局面において、関心対象の細胞は、CLL-1を発現する細胞である。別の局面において、システイン置換抗体は、検出可能な部分にコンジュゲートされている。
さらなる態様において、本開示は、疾患を診断する方法であって、（i）個体からの生物学的試料を、病変細胞に結合することができる少なくとも有効量のシステイン置換抗体と接触させる工程、および（ii）病変細胞への抗体の結合を検出する工程を含み、結合が疾患の存在を示す、方法を提供する。1つの局面において、置換システイン抗体（CYSMAB）は検出可能な部分にコンジュゲートされている。別の局面において、疾患はがんであり、抗体は腫瘍関連抗原またはがん幹細胞関連抗原に結合する。さらに別の局面において、疾患は骨髄増殖性疾患である。さらなる局面において、骨髄増殖性疾患は、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫および骨髄線維症からなる群より選択される。さらなる局面において、腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原は、CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、チロシナーゼ、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、テロメラーゼ、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGEおよびMAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、ネクチン-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、組織因子（TF）、CanAg、EGFR、αv-インテグリン、CD37、葉酸受容体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4またはエンドシアリン／CD248である。
さらなる態様において、本開示は、細胞分裂を阻害する方法であって、細胞と、細胞にとって細胞傷害性である薬物にコンジュゲートされている、細胞に結合することができる少なくとも有効量のシステイン置換コンジュゲート（CYSMAB）とを、接触させる工程、を含む方法を提供する。1つの局面において、細胞分裂の阻害は細胞死を生じさせる。別の局面において、細胞は腫瘍またはがん幹細胞であり、抗体は腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原に結合する。別の局面において、腫瘍またはがん幹細胞は骨髄増殖性疾患に由来する。さらに別の局面において、骨髄増殖性疾患は、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫および骨髄線維症からなる群より選択される。さらなる局面において、腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原は、CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、チロシナーゼ、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、テロメラーゼ、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGEおよびMAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、ネクチン-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、組織因子（TF）、CanAg、EGFR、αv-インテグリン、CD37、葉酸受容体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4またはエンドシアリン／CD248である。
さらなる態様において、本開示は、がんを処置する方法であって、治療有効量のシステイン置換抗体コンジュゲート（たとえば、システイン置換抗体を使用して生成される抗体−薬物コンジュゲート（ADC））を患者に投与する工程を含み、抗体コンジュゲートが、腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原に結合することができる、方法を提供する。1つの局面において、がんは骨髄増殖性疾患である。別の局面において、骨髄増殖性疾患は、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫および骨髄線維症からなる群より選択される。さらに別のさらなる局面において、腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原は、CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、チロシナーゼ、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、テロメラーゼ、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGEおよびMAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、ネクチン-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、組織因子（TF）、CanAg、EGFR、αv-インテグリン、CD37、葉酸受容体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4またはエンドシアリン／CD248である。
同じく提供されるものは、インドリノベンゾジアゼピンダイマーまたはイソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー（以下に記すD202を含むが、それに限定されない）にシステインを介して連結された抗体重鎖（抗体部分は重鎖および軽鎖を有する）中のKabatナンバリングでS156（EUナンバリングで157）に置換アミノ酸残基を含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体コンジュゲートである。いくつかの態様において、インドリノベンゾジアゼピンダイマーまたはイソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー（以下に記すD202を含むが、それに限定されない）はリンカーを介して抗体に結合し、リンカーはジスルフィド結合を介して薬物に接続されている。いくつかの態様において、ジスルフィド結合はピリジルジスルフィド部分である。いくつかの態様において、リンカーは標的の微小環境中で切断可能である。
同じく提供されるものは、インドリノベンゾジアゼピンダイマーまたはイソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー（以下に記すD202を含むが、それに限定されない）にシステインを介して連結された抗体重鎖中のKabatナンバリングでS156（EUナンバリングで157）に置換アミノ酸残基を含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体コンジュゲートと、アジュバントとを含む組成物である。いくつかの態様において、組成物は薬学的に許容可能である。
同じく提供されるものは、細胞分裂を阻害する方法であって、細胞と、インドリノベンゾジアゼピンダイマーまたはイソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー（以下に記すD202を含むが、それに限定されない）にシステインを介して連結された抗体重鎖中のKabatナンバリングでS156（EUナンバリングで157）に置換アミノ酸残基を含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドを含む、少なくとも有効量の抗体コンジュゲートとを、接触させる工程、を含む方法である。いくつかの態様において、細胞分裂の阻害は細胞死を生じさせる。いくつかの態様において、細胞は腫瘍またはがん幹細胞であり、抗体は腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原に結合する。いくつかの態様において、腫瘍またはがん幹細胞は骨髄増殖性疾患に由来する。いくつかの態様において、骨髄増殖性疾患は、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫および骨髄線維症からなる群より選択される。いくつかの態様において、腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原は、CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、チロシナーゼ、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、テロメラーゼ、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGEおよびMAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、ネクチン-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、組織因子（TF）、CanAg、EGFR、αv-インテグリン、CD37、葉酸受容体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4またはエンドシアリン／CD248である。
同じく提供されるものは、がんを処置する方法であって、インドリノベンゾジアゼピンダイマーまたはイソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー（以下に記すD202を含むが、それに限定されない）にシステインを介して連結された抗体重鎖中のKabatナンバリングでS156（EUナンバリングで157）に置換アミノ酸残基を含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドを含む治療有効量の抗体コンジュゲートを患者に投与する工程を含み、抗体コンジュゲートが腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原に結合することができる、方法である。いくつかの態様において、がんは骨髄増殖性疾患である。いくつかの態様において、骨髄増殖性疾患は、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫および骨髄線維症からなる群より選択される。いくつかの態様において、腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原は、CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、チロシナーゼ、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、テロメラーゼ、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGEおよびMAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、ネクチン-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、組織因子（TF）、CanAg、EGFR、αv-インテグリン、CD37、葉酸受容体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4またはエンドシアリン／CD248である。
以下の詳細な説明および特許請求の範囲を読むことにより、本開示の他の目的が当業者に明らかになり得る。
本開示の抗体−蛍光体コンジュゲート（AFC）の特異性を比較する3つの異なるELISAアッセイを示す。フォーマット1は、CLL-1細胞外ドメイン（ECD）が固定され、それにAFCが結合したのち、抗蛍光体抗体（ウサギ抗A488）および検出試薬（抗ウサギFc-HRP）によって検出する、直接型ELISAである。フォーマット2は、抗蛍光体抗体（抗A488抗体（Ab））が結合され、AFCおよびビオチン化CLL-1 ECDが検出試薬（SA-HRP）の間に挟まれるELISAである。フォーマット3は、抗CLL-1抗体が固定化され、CLL-1 ECDおよびAFCならびに抗A488抗体および検出試薬（抗ウサギFc-HRP）を挟む代替ELISAである。 アッセイELISA特異性アッセイフォーマット1を示す。図2Aは、IgG、トラスツズマブ、裸のHuM31および対照標識されたIgGに対する、標識されたAFCおよびWT抗蛍光体抗体に関するアッセイの類似した特異性を示す。結果は、標識されたHuM31とWTとの間の類似した特異性を示す。図2Bは、ヒト血漿およびPBSによる干渉の影響を示す。 安定性ELISAアッセイのフォーマットを示す画である。このフォーマットにおいて、AFCは、固定化CLL-1 ECDと検出試薬（SA-HRP）との間に挟まれる。 HuM31重鎖抗体定常鎖と、Kabat、EUインデックスおよび連番で同定される残基を有する他のIgGl、IgG2、IgG3およびIgG4アイソタイプとのアライメントを示す。軽鎖配列（図4A）：M31（SEQ ID N0:7）、HuM31（SEQ ID N0:8）、κ（SEQ ID N0:9）およびλ（SEQ ID NO: 10）。 HuM31重鎖抗体定常鎖と、Kabat、EUインデックスおよび連番で同定される残基を有する他のIgGl、IgG2、IgG3およびIgG4アイソタイプとのアライメントを示す。重鎖配列（図4B）：M31（SEQ ID NO: 11）およびHuM31（SEQ ID NO: 12）。 様々な抗体コンジュゲートの場合の蛍光体−抗体比（FAR）を示す。 様々な抗体コンジュゲートの場合の薬物−抗体比（DAR）を示す。 様々な抗体コンジュゲートの場合の、アミノ酸残基および蛍光体−抗体比（「FAR」）を含むコンジュゲーションの結果を提供する。 様々な抗体コンジュゲートの場合の、アミノ酸残基および蛍光体−抗体比（「FAR」）を含むコンジュゲーションの結果を提供する。 様々な抗体コンジュゲートの場合の、アミノ酸残基および蛍光体−抗体比（「FAR」）を含むコンジュゲーションの結果を提供する。 様々な抗体コンジュゲートの場合の、アミノ酸残基および蛍光体−抗体比（「FAR」）を含むコンジュゲーションの結果を提供する。 様々な抗体コンジュゲートの安定性を示す。 C6-CYSMAB-ADCのFACS結合データのグラフを提供する。●、C6-S156C-D202；■、C6-A118C-D202；▲、C6-G316C-D202；○、C6-V266C-D202；□、C6-S239C-D202；△、C0-D202。 C6-CYSMAB-ADCのFACS結合データのグラフを提供する。●、C6-S156C-D202；■、C6-A118C-D202；▲、C6-G316C-D202；○、C6-V266C-D202；□、C6-S239C-D202；△、C0-D202。 C6-CYSMAB-ADCのFACS結合データのグラフを提供する。●、C6-S156C-D202；■、C6-A118C-D202；▲、C6-G316C-D202；○、C6-V266C-D202；□、C6-S239C-D202；△、C0-D202。
発明の詳細な説明
記載される特定の方法または特定の組成は変化し得るものであるため、本出願は、そのような特定の方法または特定の組成に限定されない。また、本出願の範囲は特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ制限されるため、本明細書に使用される専門用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、限定的であることを意図したものではないことが理解されよう。
別段定義されない限り、本明細書の中で使用されるすべての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。提唱される方法および材料が記載されるが、以後、本明細書に記載されるものに類似する、またはそれらと均等な任意の方法および材料を本出願の実施または試験に使用することができる。
I.定義
本明細書の中で使用される「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンポリペプチドまたは抗体をいう。
用語「免疫グロブリンポリペプチド」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされたポリペプチドをいう。
用語「抗体」とは、抗体を作製する動物の遺伝子をコードする免疫グロブリンのフレームワーク領域からの、またはそれに由来するアミノ酸配列を有する、抗原結合活性を有するタンパク質をいう。この用語は、天然または遺伝子改変形態、たとえばヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、移植およびインビトロ産生抗体を含む、ヒトまたは他の哺乳動物細胞に由来するアイソタイプクラスIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMのポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含むが、それに限定されない。この用語は、コンジュゲート、たとえば非限定的に、免疫グロブリン部分を含有する融合タンパク質（たとえばキメラまたは二重特異性抗体またはscFv）およびフラグメント、たとえばFab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、シングルドメイン（dAb）および他の組成物を包含する。
本明細書の中で使用される用語「システイン置換免疫グロブリン」とは、システイン置換免疫グロブリンポリペプチドまたはシステイン置換抗体をいう。
本明細書の中で使用される用語「システイン置換免疫グロブリンポリペプチド」とは、システインで置換されている少なくとも1つの非天然由来の定常領域免疫グロブリンアミノ酸残基を含むポリペプチドをいう。非天然由来の置換とは、アイソタイプではない置換である。1つの態様において、置換残基は、重鎖定常領域残基V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436CおよびL441Cである。別の態様において、定常領域はアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である。
用語「システイン置換抗体」（「CYSMAB」）とは、システイン置換免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体をいう。
本明細書の中で使用される用語「免疫グロブリンコンジュゲート」とは、機能的部分にコンジュゲートされている、免疫グロブリンポリペプチドまたは抗体、すなわち「抗体コンジュゲート」をいう。
本明細書の中で使用される用語「免疫グロブリン薬物コンジュゲート」とは、機能的部分、たとえば薬物部分または放射能標識または検出試薬にコンジュゲートされている、免疫グロブリンポリペプチドまたは抗体（「抗体−薬物コンジュゲート」（「ADC」））をいう。
用語「システイン置換免疫グロブリン薬物コンジュゲート」とは、薬物部分にコンジュゲートされている、システイン置換免疫グロブリンポリペプチドまたはシステイン置換抗体（「CYSMAB」）、たとえばシステイン置換抗体−薬物コンジュゲート（「CYSMAB ADC」）をいう。
例示的な抗体免疫グロブリン構造単位はテトラマーを含む。各テトラマーは、2つの同一対のポリペプチド鎖で構成され、各対が、1つの「軽鎖」（約25kD）および1つの「重鎖」（約50〜70kD）を有する。各鎖のN末端が、主に抗原認識を担う、約100〜110またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を画定する。用語「可変軽鎖（VL）」および「可変重鎖（VH）」とは、それぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。可変領域は、抗体の抗原結合領域（またはその機能的等価物）を含有し、結合の特異性および親和性においてきわめて重要である。Paul, Fundamental Immunology (2003)を参照すること。
抗体は、完全な免疫グロブリンとして存在することもできるし、特定の抗原結合活性を含む十分に特性決定された数多くのフラグメントのいずれかとして存在することもできる。わかりやすくするために、重鎖および軽鎖を有する四量体抗体が、本明細書の中では「完全な免疫グロブリン」と呼ばれ、天然由来、ポリクローナル、モノクローナル、または組換え的に産生されることができる。フラグメントは、様々なペプチダーゼによる消化によって作製することができる。ペプシンは、ヒンジ領域中、ジスルフィド結合よりも下で抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によってVH-CH1に連結された軽鎖であるFabのダイマー、F(ab)'2を生じる。F(ab)'2は、穏やかな条件下で還元されると、ヒンジ領域のジスルフィド結合が分断され、それにより、F(ab)'2ダイマーがFab'モノマーに転換され得る。Fab'モノマーは、本質的には、ヒンジ領域の一部を有するFabである。完全な抗体の消化に関して様々な抗体フラグメントが定義されるが、当業者は、そのようなフラグメントを化学的に、または組換えDNA法を使用することによって新規に合成し得ることを理解するであろう。したがって、本明細書の中で使用される用語「抗体」はまた、完全な抗体の改変によって作製される抗体フラグメントまたは組換えDNA法を使用して新規に合成される抗体フラグメントまたはファージディスプレイライブラリーを使用して同定される抗体フラグメントを含む（たとえば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照）。
本明細書の中で使用される用語「Fv」とは、一価または二価の可変領域フラグメントをいい、可変領域（たとえばVLおよび／またはVH）のみを包含してもよく、CLおよび／またはCH1をも含むより長いフラグメント、たとえばFab、Fab'またはF(ab')2を包含してもよい。別段指定されない限り、用語「Fc」は、CH2およびCH3領域を含む重鎖モノマーまたはダイマーをいう。
単鎖Fv（scFv）とは、リンカー、たとえばペプチドリンカーによって連結されたVLおよびVHを含むポリペプチドをいう。ScFvはまた、タンデム（または二価）ScFvまたはダイアボディを形成するために使用することもできる。タンデムScFvおよびダイアボディの作製および性質は、たとえば、Asano et al. (2011) J Biol. Chem. 286:1812；Kenanova et al. (2010) Prot Eng Design Sel 23:789；Asano et al. (2008) Prot Eng Design Sel 21:597に記載されている。
本明細書の中で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、抗原上の所与のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を有する抗体のクローン調製物をいう。「ポリクローナル抗体」とは、単一の抗原に対して産生されるが、様々な結合特異性および親和性を有する抗体の調製物をいう。
本明細書の中で使用される「可変領域」または「V領域」とは、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2およびフレームワーク3、CDR3およびフレームワーク4のセグメントを含む抗体可変領域ドメインをいい、これらのセグメントは、B細胞分化中に重鎖および軽鎖V領域遺伝子の再配列の結果としてVセグメントに加えられる。
本明細書の中で使用される用語「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基をいう。可変ドメインのFRは概して4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3およびFR4からなる。したがって、HVRおよびFR配列は概して、VH（またはVL）中、以下の配列：FR1-HVR1(L1)-FR2-HVR2(L2)-FR3-HVR3(L3)-FR4で見られる。
本明細書の中で使用される「相補性決定領域（CDR）」とは、軽鎖および重鎖可変領域によって確立された4つの「フレームワーク」領域を中断する、各鎖中の3つの超可変領域をいう。CDRは主として抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のCDRは一般に、N末端から出発して順にCDR1、CDR2およびCDR3と呼ばれ、また、一般に、特定のCDRが位置する鎖によって識別される。たとえば、VHCDR3は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、VLCDR1は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメインからのCDR1である。
CDRおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、当技術分野における様々な周知の定義、たとえばKabat、Chothia、国際ImMunoGeneTicsデータベース（IMGT）およびAbMを使用して決定することができる（たとえば、上記Johnson et al.；Chothia & Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917；Chothia et al. (1989) Nature 342, 877-883；Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 799-817；Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol 1997, 273(4)を参照）。Kabatシステムを使用してCDRを見つけるのに役立つガイドを、bioinf.org.uk/absで利用可能なウェブサイトで見いだすことができる。抗原結合部位の定義はまた、以下に記載されている：Ruiz et al. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000)；およびLefranc Nucleic Acids Res. January 1; 29(1):207-9 (2001)；MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996)；およびMartin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989)；Martin, et al, Methods Enzymol., 203: 121-153, (1991)；Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992)；およびRees et al, In Sternberg M. J. E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996）。例示的なCDRが、US2013/0295118の図7のCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3として記載されている。
用語「超可変領域」、「HVR」は、本明細書の中で使用されるとき、配列において超可変性である、および／または構造的に画定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域をいう。概して、抗体は、6つの超可変領域：VH中の3つ（H1、H2、H3）およびVL中の3つ（L1、L2、L3）を含む。数多くの超可変領域描写が使用されており、本明細書に包含される。Kabat相補性決定領域（CDR）は配列可変性に基づき、もっとも一般に使用されているが（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）、Chothiaは、構造ループの位置を参照している（Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917）。「接触」超可変領域は、利用可能な複合結晶構造の分析に基づく。これらの超可変領域それぞれからの残基を以下に記す。別段示されない限り、整列したタンパク質配列のKabat Databaseに準じるKabatナンバリングが用いられる（Wu and Kabat (1970) J. Exp. Med. 132:211-250；Johnson and Wu (2000) Nuc. Acids Res. 28(1):214-218）。超可変領域位置は概して以下のとおりである：アミノ酸24〜34（HVR-L1）、アミノ酸49〜56（HVR-L2）、アミノ酸89〜97（HVR-L3）、アミノ酸26〜35A（HVR-H1）、アミノ酸49〜65（HVR-H2）およびアミノ酸93〜102（HVR-H3）。超可変領域はまた、以下のような「拡張超可変領域」を含み得る：VL中、アミノ酸24〜36（L1）およびアミノ酸46〜56（L2）。可変ドメイン残基は、これらの定義それぞれに関し、上記Kabat et al.にしたがってナンバリングされている。本明細書における意味の「変更可変領域」とは、1つまたは複数の（たとえば1〜約16の）アミノ酸置換をその中に含む超可変領域である。本明細書における意味の「非改変超可変領域」とは、それが由来する非ヒト抗体、すなわち1つまたは複数のアミノ酸置換をその中に有しない非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有する超可変領域である。
本明細書の中で使用される用語「キメラ抗体」とは、（a）抗原結合部位（可変領域、CDRまたはその一部）が、異なるかまたは改変されたクラス、エフェクタ機能および／または種の定常領域に連結されるように定常領域またはその一部が改変、置換または交換されている抗体；または（b）可変領域またはその一部が、異なるかまたは改変された抗原特異性を有する可変領域（たとえば、異なる種からのCDRおよびフレームワーク領域）によって改変、置換または交換されている抗体をいう。キメラ抗体は、可変領域フラグメント、たとえば2つのFabもしくはFv領域またはscFvを含む組換え抗体を含むことができる。キメラはまた、上記のように、結合したFv領域とは異なるソースからのFc領域を含むことができる。いくつかの場合、キメラ抗体はFv領域内にキメリズムを含む。そのようなキメラ抗体の例は、FRおよびCDRが異なるソースからのものであるヒト化抗体であろう。
本明細書の中で使用される用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体のVHおよびVL領域から得られる抗原結合ループ、すなわちCDRがヒトフレームワーク配列に移植されている抗体をいう。ヒト化、すなわちヒト抗体の対応する配列のための非ヒトCDR配列の置換は、たとえば米国特許第5,545,806号；第5,569,825号；第5,633,425号；第5,661,016号；Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)に記載されている方法にしたがって実施することができる。米国特許第6,673,986号に開示されているように、トランスジェニックマウスまたは他の生物、たとえば他の哺乳動物を使用して、ヒト化またはヒト抗体を発現させてもよい。
用語「〜に特異的」、「特異的に結合する」および類似の用語は、非標的化合物の少なくとも2倍の大きさの親和性、たとえば4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍または100倍の大きさの親和性の少なくともいずれかで標的に結合する分子（たとえば抗体または抗体フラグメント）をいう。たとえば、一次標的に特異的に結合する抗体は一般に、非一次抗体標的（たとえば、異なる種からの、または異なるアイソタイプの抗体、すなわち非抗体標的）の少なくとも2倍の大きさの親和性で一次標的に結合する。
抗体標的（たとえば抗原、分析対象物、免疫複合体）に関し、用語「結合する」とは一般に、抗体が純粋な集団中の抗体標的の大部分に結合することを示す（適切なモル比を仮定する）。たとえば、所与の抗体標的に結合する抗体は一般に、溶液中の抗体標的の少なくとも2/3（たとえば、少なくとも、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％のいずれか）に結合する。当業者は、結合を測定する方法および／またはしきい値に依存していくらかの変動が生じることを理解するであろう。
用語「標識」、「検出可能な部分」および類似の用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の物理的手段によって検出可能な組成物をいう。たとえば、有用な標識は、蛍光色素、発光剤、放射性同位体（たとえば32P、3H）、高電子密度試薬、酵素（たとえば、ELISAにおいて一般に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン類およびタンパク質または、たとえば、標的分析対象物と特異的に反応するペプチドまたは抗体に放射能標識を組み込むことによって検出可能にし得る他の実体を含む。抗体を標識にコンジュゲートするための当技術分野において公知の任意の方法、たとえば、Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diegoに記載されている方法を用い得る。用語「タグ」は、用語「標識」と同義に使用することができるが、一般には、親和性ベースの部分、たとえば精製のための「Hisタグ」またはビオチンと相互作用する「ストレプトアビジンタグ」を指す。
本明細書の中で使用される用語「標識された」分子（たとえば核酸、タンパク質または抗体）は、リンカーもしくは化学結合によって共有結合的に、またはイオン、ファンデルワールス、静電もしくは水素結合によって非共有結合的に標識と結合している、分子に結合した標識の存在を検出することによって分子の存在を検出し得るような分子である。
用語「Cタイプレクチン様分子1（CLL-1）」は、CLEC12A、DCAL-2およびMICLとも知られ、タイプII膜タンパク質（ITIMドメイン―TMドメイン−ストークドメイン−レクチン様ドメイン）である。CLL-1の細胞外ドメインは高度にグリコシル化されており、排他的に骨髄系細胞中で発現する。CLL-1はまた、AML、MDSおよびCML細胞上でも発現する。CLL-1発現を使用して、CLL-1を発現しない正常な造血幹細胞（HSC）と、CLL-1を発現する白血病幹細胞（LSC）とを区別することができる。LSCは、がん細胞の産生およびがんの再発をもたらす白血病患者中のCD34+細胞である。Bakker et al. (2004) Cancer Res. 64:8443を参照すること。
CLL-1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は多くの種に関して知られている。たとえば、ヒト配列は、US2013/0295118中のSEQ ID NO:2ならびにGenBankアクセッション番号AF247788.1およびUniProtアクセッション番号Q5QGZ9（SEQ ID NO:2）として見いだすことができる。SEQ ID NO:2として示されるヒトCLL-1タンパク質の場合、細胞外ドメインは概ねアミノ酸65〜265を含み、膜貫通ドメインは概ねアミノ酸44〜64を含み、細胞質ドメインは概ねアミノ酸1〜43を含む。ヒトCLL-1のストークドメインはアミノ酸65〜139に及び、Cレクチンドメインはアミノ酸140〜249に及ぶ。
本明細書の中で使用される用語「CLL-1関連障害」とは、標準対照（たとえば正常、非疾患、非がん細胞）におけるCLL-1発現と比べて、非病原性レベル（たとえばCLL-1の上昇または低下した細胞表面発現）と相関する状態および疾患をいう。上昇したCLL-1レベルはがん細胞、特に白血病、たとえばAML（急性骨髄性白血病）、MDS（脊髄異形成症候群）およびCML（慢性骨髄性白血病）ならびに造血CSC（たとえばLSC）と関連している。
「がん幹細胞」説は、腫瘍の小さな部分だけが「がん幹細胞」によって表され、それが、腫瘍が増殖し、自己複製し、最終的には表現型的に多様かつ不均一な腫瘍細胞集団へと分化することを可能にする、と提唱している（Bjerkvig et al., Nat. Rev. Cancer, 5:899-904, 2005）。がん幹細胞は、任意のタイプのがん、たとえば白血病、乳がん、結腸がんおよび脳腫瘍、結腸がんから単離することができる。がん幹細胞は、自己複製して増殖する能力を特徴とし、親腫瘍からの分化を通して反復発生する。例示的ながん幹細胞抗原は、CD133、Bmi-1、Notch、ソニックヘッジホッグおよびWntを含む。加えて、神経がん幹細胞の例示的な分子マーカーは、CD90、CD44、CXCR4、Nestin、Musashi-1（Msi 1）、母体胚性ロイシンジッパーキナーゼ（MELK）、GLI1、PTCH1、Bmi-1、ホスホセリンホスファターゼ（PSP）、Snail、OCT4、BCRP1、MGMT、Bcl-2、FLIP、BCL-XL、XIAP、cIAP1、cIAP2、NAIPおよびサバイビンを含む。1つの有用ながん幹細胞抗原がCLL-1である。
用語「細胞傷害性」とは、薬剤が細胞に対して及ぼす阻害効果、たとえば壊死（膜の完全性の損失および細胞溶解の結果としての急死）；生存率の低下（細胞が増殖を停止する）、およびアポトーシス（制御された細胞死の遺伝的プログラム）をいう。
細胞傷害性はまた、3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド（MTT）またはMTSアッセイを使用してモニターすることもできる。このアッセイは、比色反応を使用して細胞の還元電位を計測する。生細胞は、MTS試薬を有色ホルマザン生成物に還元する。また、蛍光色素レサズリンを使用する類似のレドックスベースのアッセイが開発されている。研究者らは、生存度をモニターするために色素を使用して細胞の酸化還元電位を示すことに加えて、生存度のマーカーとしてアデノシン三リン酸（ATP）含量を使用するアッセイを開発した。このようなATPベースのアッセイは、ATPがルシフェラーゼ反応のための制限試薬である生物発光アッセイ（たとえばCellTiter-Glo Luminescent Cell Viabilityアッセイ、Promega）を含む。細胞傷害性はまた、スルホローダミンB（SRB）アッセイ、WSTアッセイおよびクロノジェニックアッセイによって計測することもできる。接着動物細胞の細胞傷害性応答にリアルタイムで従うラベルフリーの手法は、細胞が金膜電極上で増殖するときの電気インピーダンス計測に基づく。この技術は、電気的細胞−基質インピーダンスセンシング（ECIS）と呼ばれている。ラベルフリーのリアルタイム技術は、多くの比色エンドポイントアッセイにおけるような単なるスナップショットではなく、細胞傷害性応答の動態を提供する。
本明細書中、用語「CLL-1特異抗体」、「抗CLL-1抗体」、「CLL-1抗体」および「抗CLL-1」は、CLL-1の様々なグリコシル化形態を含むCLL-1に特異的に結合する抗体を指すために同義に使用される。本明細書に記載されるCLL-1抗体は、たとえば特定のがん細胞の表面に発現するCLL-1ポリペプチドに特異的に結合するが、造血幹細胞（HSC）には特異的に結合しない。以下さらに詳細に説明するように、本抗CLL-1抗体は、CLL-1発現細胞に結合し、他のAML標的指向抗体と比べて、より大きな割合のAML細胞に結合し、AML細胞増殖を阻害し、それらの破壊を媒介する。本開示のシステイン置換抗体（CYSMAB）としての使用に適した抗CLL抗体の例は、2013年11月7日に公開されたUS2013/0295118に記載されている。抗CLL-1抗体は、その公開公報に開示されているCDR、特に抗体M31およびM26のためのCDRを有することができる。
用語「差次的に発現」または「差次的に制御」とは、概して、1つの試料中で、少なくとも1つの他の試料と比べて過剰発現（上方制御）または過小発現（下方制御）するタンパク質または核酸バイオマーカーをいう。本開示に関連して、この用語は概して、正常な非がん細胞と比べて、がん細胞（たとえばAML細胞またはAML CSC）上でのCLL-1の過剰発現を指す。
たとえば、用語「過剰発現」または「上方制御」は、互換可能に、対照よりも検出可能に大きいレベルで転写または翻訳される、タンパク質または核酸、概してバイオマーカーを指す。この用語は、転写、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、細胞局在化（たとえばオルガネラ、細胞質、核、細胞表面）ならびにRNAおよびタンパク質安定性による過剰発現を含む。過剰発現は、バイオマーカーを検出するための従来技術を使用して、mRNA（すなわちRT-PCR、ハイブリダイゼーション）であろうとタンパク質（すなわち、フローサイトメトリー、画像診断、ELISA、免疫組織化学技術）であろうと、検出することができる。過剰発現は、少なくとも、正常な細胞と比べて10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または90％超のいずれかであることができる。
本明細書の中で使用される用語「対照」試料または値とは、試験試料との比較のための参照（通常は既知の参照）として働く試料をいう。たとえば、試験試料を、たとえば試験化合物の存在下、試験条件から採取し、たとえば試験化合物（負の対照）の非存在下または既知の化合物（正の対照）の存在下、既知の条件からの試料と比較することができる。本開示に関して、負の対照の例は、既知の健康な（非がん）個体からの生物学的試料であり、正の対照の例は、既知のAML患者からの生物学的試料であろう。対照はまた、多数の試験または結果から集められた平均値または範囲を表すこともできる。当業者は、任意の数のパラメータの評価のために対照を設計することができることを理解するであろう。たとえば、薬理学的データ（たとえば半減期）または治療の尺度（たとえば有益性および／または副作用の比較）に基づいて治療有益性を比較するための対照を考案することができる。対照は、インビトロ用途のために設計することができる。当業者は、所与の状況においてどの対照が貴重であるかを理解し、対照値との比較に基づいてデータを分析することができるであろう。対照はまた、データの有意性を判定する場合にも貴重である。たとえば、所与のパラメータの値が対照において広く変動する場合、試験試料における変動は有意とはみなされない。
用語「診断」とは、対象ががんのような障害を有する相対的確率をいう。同様に、用語「予後」とは、ある特定の将来の転帰が対象において起こり得る相対的確率をいう。たとえば、本開示に関連して、予後は、個体ががんを発症し、再発または疾患の起こり得る重症度（たとえば、症候の重症度、機能低下率、生存率など）を有する見込みを指すことができる。これらの用語は、医療診断の分野の当業者によって理解されるように、絶対的であることを意図したものではない。
本明細書の中で使用される「生検材料」または「対象からの生物学的試料」とは、疾患、たとえばCLL-1関連障害を有する、または有することが疑われる対象から得られる試料をいう。試料はまた、血液試料または血液画分、たとえば白血球画分、血清または血漿であることができる。いくつかの態様において、試料は、組織生検材料、たとえば針生検材料、細針生検材料、外科生検材料などであってもよい。試料は、病変または疑われる病変を有する組織試料を含むことができるが、生物学的試料は、別の部位、たとえば、転移が疑われる部位、リンパ節または血液に由来するものであってもよい。いくつかの場合、生物学的試料は、病変または疑われる病変に隣接する領域からのものであってもよい。
「生物学的試料」は、対象から得られるもの、たとえば、動物、たとえば動物モデルまたは培養細胞からの生検材料、たとえば、対象から取り出し、観察のために培養して増殖させた細胞株または細胞であることができる。生物学的試料は、組織および体液、たとえば血液、血液分画、リンパ液、唾液、尿、糞便などを含む。
EUナンバリングスキームとは、US抗体の番号をいう（Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 78-85 (1969)）。Kabat相補性決定領域（CDR）は、配列可変性に基づき、もっとも一般に使用されている（Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。本明細書の中で使用されるEU番号とは、本明細書に記載される抗体の定常鎖名称を指すが、Kabatは、可変領域のCDRおよびHVRを引き出すために使用される。
「機能的に連結された」とは、そのように記載された成分が、それらが所期のやり方で機能することを可能にする関係にある、2つ以上の成分の並置をいう。たとえば、プロモータは、連結配列の転写を制御または変調するためにシスで作用するならば、コード配列に機能的に連結されている。一般に、必ずしもとはいえないが、「機能的に連結」されているDNA配列は隣接し、2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合または分泌リーダーの場合、隣接し、かつ読み枠内にある。しかし、機能的に連結されたプロモータは概してコード配列より上流に位置するが、必ずしもそれと隣接しているわけではない。
本明細書の中で使用される用語「プロモータ」とは、それが機能的に連結されている遺伝子または配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列をいう。プロモータは、RNAポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモータは、選択された配列の発現が予想される宿主細胞の細胞型の中で機能する。
本明細書の中で使用される用語「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターの1つのタイプが「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターがファージベクターである。別のタイプのベクターが、さらなるDNAセグメントをウイルスゲノム中にライゲートし得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製することができる（たとえば、細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時、宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。そのうえ、特定のベクターは、それらが作用的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書中、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。
本明細書の中で使用される用語「宿主細胞」（または「組換え宿主細胞」）とは、遺伝子改変されている、または外来性ポリヌクレオチド、たとえば組換えプラスミドまたはベクターの導入によって遺伝子改変されることができる細胞をいう。この用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、その子孫をも指すことが理解されるべきである。
用語「治療」、「処置」および「改善」とは、症候の重症度の任意の低下をいう。がん（たとえばAML）を処置する場合、処置は、たとえば、腫瘍サイズ、がん細胞数、増殖速度、転移活性、非がん細胞の細胞死、悪心および他の化学療法または放射線療法の副作用などを減らすことを指すことができる。用語「処置する」および「予防する」は、絶対的な語であることを意図したものではない。処置および予防は、発症の任意の遅延、症候の改善、患者生存率の改善、生存期間または率の増加などを指すことができる。処置および予防は、完全であってもよく（新生細胞のレベルが検出不可能）、部分的であってもよい（本発明なしで生まれたであろうよりも少ない新生細胞が患者に見いだされる）。処置の効果は、処置を受けていない個体もしくは個体のプールとで、または処置前もしくは処置中の異なる時点での同じ患者とで、比較することができる。いくつかの局面において、疾患の重症度は、たとえば投与前の個体または処置を受けていない対照個体と比べて、少なくとも10％低下する。いくつかの局面において、疾患の重症度は、少なくとも25％、50％、75％、80％または90％低下する、または場合によっては、標準的な診断技術によってはもはや検出不可能になる。
薬剤、たとえば薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投与量および期間で所望の細胞応答、治療的または予防的結果を達成するのに有効な量をいう。たとえば、細胞増殖を阻害する方法において、システイン置換免疫グロブリン薬物コンジュゲート（たとえばCYSMAB ADC）の有効量は、対照細胞と比べて、細胞における細胞分裂を顕著に減衰、阻害または阻止する濃度である。
用語「治療有効量」は、（i）特定の疾患、状態または障害を処置または予防する、（ii）特定の疾患、状態または障害の1つまたは複数の症候を減衰、改善または解消する、または（iii）本明細書に記載される特定の疾患、状態または障害の1つまたは複数の症候の発症を防ぐ、または遅らせる、本発明の化合物の量を意味する。1つの態様において、治療有効量は、CLL-1の変調に応答する障害の症候を減らす、または緩和するのに十分な量である。がんの場合、薬物の治療有効量は、がん細胞の数を減らす；腫瘍のサイズを減らす；末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度は遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度は遅らせ、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度は阻害する；および／またはがんに関連する1つまたは複数の症候をある程度は緩和し得る。薬物は、増殖を阻止し得る、および／または存在するがん細胞を死滅させ得る程度で、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。がん治療の場合、効能は、たとえば、疾患進行までの時間（TTP）を評価することにより、および／または奏効率（RR）を測定することにより、計測することができる。1つの態様において、治療有効量は、CLL-1の変調に応答する障害の症状を軽減または緩和するのに十分な量である。免疫障害の場合、治療有効量は、アレルギー性障害、自己免疫および／または炎症性疾患の症候または急性炎症反応の症候を軽減または緩和するのに十分な量である。いくつかの態様において、治療有効量は、骨髄増殖性がん幹細胞の活性または数を有意に減少させるのに十分な、本明細書に記載される化学的実体の量である。
本明細書の中で使用される場合、用語「薬学的に許容可能」は、生理学的に許容可能および薬理学的に許容可能と同義に使用される。薬学的組成物は概して、貯蔵中の緩衝および保存のための薬剤を含み、投与経路に依存して、適切な送達のための緩衝剤および担体を含むことができる。
本明細書の中で使用される語句「薬学的に許容可能な塩」とは、ADCの薬学的に許容可能な有機または無機塩をいう。例示的な塩は、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、1,1'-メチレン-ビス−（2-ヒドロキシ-3-ナフトエート））塩を含むが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンのような別の分子を包含してもよい。対イオンは、化合物上の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容可能な塩は、その構造中に1つよりも多い荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である例は、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容可能な塩は、1つまたは複数の荷電原子および／または1つまたは複数の対イオンを有することができる。
「薬学的に許容可能な溶媒和物」とは、1つまたは複数の溶媒分子とADCとの会合をいう。薬学的に許容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例は、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、DMSO、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンを含むが、これらに限定されない。
本明細書の中で使用される「担体」は、使用される用量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤を含む。多くの場合、生理学的に許容可能な担体はpH緩衝水溶液である。生理学的に許容可能な担体の例は、緩衝剤、たとえばリン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸をはじめとする酸化防止剤；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、たとえばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤、たとえばEDTA；糖アルコール、たとえばマンニトールまたはソルビトール；塩形成性対イオン、たとえばナトリウム；および／または非イオン界面活性剤、たとえばTWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（PEG）およびPLURONICS（登録商標）を含む。用語「用量」および「投与量」は本明細書の中で互換可能に使用される。用量とは、投与ごとに個体に与えられる有効成分の量をいう。本発明の場合、用量は、抗体または関連成分の濃度、たとえば治療剤の量または放射能標識の投与量を指すことができる。用量は、投与の頻度；個体の体格および忍容性；状態の重症度；副作用のリスク；投与経路；ならびに検出可能な部分（存在する場合）の画像化モダリティを含む多くの要因に依存して異なる。当業者は、上記要因に依存して、または治療の進歩に基づいて、用量を変更することができることを理解するであろう。用語「剤形」とは、医薬品の特定の形態をいい、投与経路に依存する。たとえば、剤形は、液剤、たとえば注射用の食塩水であることができる。
「対象」、「患者」、「個体」および類似の用語は互換可能に使用され、指示されている場合を除き、哺乳動物、たとえばヒトおよび非ヒト霊長類ならびにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタおよび他の哺乳動物種を指す。この用語は、必ずしも、対象が特定の疾患を有すると診断されたことを示すものではない。用語「患者」とは、医学的監督下にある対象をいう。患者は、既存の治療レジメンなどの処置、モニタリング、調節または変更を求める個体であることができる。「がん患者」または「AML患者」は、がんと診断されている個体、現在、治療レジメンに従っている個体または、たとえば腫瘍を除去するための手術ののち、再発のリスクにある個体を指すことができる。いくつかの態様において、がん患者はがんと診断されており、治療の候補である。がん患者は、処置を受けたことがない個体、現在処置を受けている個体、手術を受けたことがある個体および処置を中止した個体を含むことができる。
がんの処置に関連して、処置の必要がある対象とは、がんまたは前がん状態を有する個体、がんを罹患したことがあり、再発のリスクにある個体、がんを有することが疑われている個体、がんのための標準的な処置、たとえば放射線療法または化学療法を受けている個体などを指すことができる。
「がん」、「腫瘍」および類似の用語は、前がん性、新生物性およびがん性の細胞を含み、固形腫瘍または非固形がんを指すことができる（たとえば、Edge et al. AJCC Cancer Staging Manual (7th ed. 2009)；Cibas and Ducatman Cytology: Diagnostic principles and clinical correlates (3rd ed. 2009)を参照）。がんは、良性および悪性新生物（異常増殖）の両方を含む。
用語「がん」とは、白血病、がん腫、肉腫、腺がん、リンパ腫、固形がんおよびリンパがんなどをいうことができる。様々なタイプのがんの例は、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小細胞リンパ腫、大細胞リンパ腫、単球性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、肺がん（たとえば非小細胞肺がんまたはNSCLC）、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肝臓がん（すなわち肝細胞がん）、腎臓がん（すなわち腎細胞がん）、膀胱がん、乳がん、甲状腺がん、胸膜がん、膵臓がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、肛門がん、膵臓がん、胆管がん、胃腸カルチノイド腫瘍、食道がん、胆嚢がん、虫垂がん、小腸がん、胃がん、中枢神経系のがん、皮膚がん、絨毛がん、頭頸部がん、骨形成肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および黒色腫を含むが、これらに限定されない。
「がん標的」または「がんマーカー」とは、がんにおいて、たとえばがん細胞上またはがん環境中で差次的に発現またはプロセシングされる分子である。例示的ながん標的は、細胞表面タンパク質、たとえばCLL-1（また、たとえば、細胞接着分子および受容体）、細胞内受容体、ホルモンおよび細胞によってがん環境中に分泌される分子、たとえばプロテアーゼである。特定のがんのためのマーカー、たとえばAMLのためのCD45、AML CSCのためのCD34+CD38-、結腸および結腸直腸がんにおけるMUC1発現、肺がんにおけるボンベシン受容体ならびに前立腺がんにおける前立腺特異的膜抗原（PSMA）が当技術分野において公知である。
いくつかの態様において、がん標的は、特定のタイプのがん細胞、たとえばAML、白血病、骨髄腫、リンパ腫、非小細胞肺がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がんまたは卵巣がん細胞と会合していることができる。細胞型特異的標的は一般に、その細胞型中で、参照細胞集団中よりも少なくとも2倍高いレベルで発現する。いくつかの態様において、細胞型特異的マーカーは、参照集団中のその平均発現よりも少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100または1000倍高いレベルで存在する。したがって、標的を検出または計測すると、関心対象の細胞型を他の細胞から区別することができる。たとえば、AMLがん標的は、CLL-1、Ly86、LILRA1およびCD180を含む。
がん幹細胞（CSC）は、がんの大部分を構成する細胞を生じさせることができる、腫瘍または血液がんに見られる細胞である。CSCはまた、正常な（非がん）幹細胞と同様に、自己複製性であることができる。したがって、CSCは、個体中の非腫瘍組織に移動し、「新たな」腫瘍を発生させることにより、転移を媒介することができる。CSCは、がんが検出されるステージに依存して、任意の所与のがんの非常に小さな割合しか構成しない。たとえば、AML細胞の試料中のCSCの平均出現率は約1：10,000であると考えられている。造血CSCは、正常な造血幹細胞（HSC）と同様に、CD34+と同定することができる。
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいう。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が大部分のタンパク質をコードする。たとえば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるすべての位置で、コードされたポリペプチドを変えることなく、コドンを、記載された対応するコドンの別のものに変えることができる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の1種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書におけるすべての核酸配列はまた、核酸のサイレント変異を表す。当業者は、特定の状況において、核酸中の各コドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるAUGおよび通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して機能的に同一の分子を得ることができることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関して記述された配列においては暗黙的であるが、実際のプローブ配列に関しては暗黙的ではない。
用語「組換え」は、たとえば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターを参照しながら使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、たとえば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内には見られない遺伝子を発現する、または他のやり方では異常に発現する、発現不足である、または全く発現しない天然遺伝子を発現する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する用語「異種」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、本来は互いに同じ関係では見られない2つまたはより多くの部分配列を含むことを示す。たとえば、新たな機能単位を作製するために配置された無関係な遺伝子からの2つまたはより多くの配列、たとえば1つのソースからのプロモータおよび別のソースからのコード領域を有する異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは一般に、組換え的に作製される。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、本来は互いに同じ関係では見られない2つまたはより多くの部分配列を含む（たとえば融合タンパク質）ことを示す。
「チオール反応性試薬」とは、チオールと反応して共有結合を形成する部分を有する試薬である。チオール反応性試薬は、ハライド、マレイミドおよびスルホニルから選択される基を有することができる。非限定的な例は、ビオチン-PEO-マレイミド（(+)-ビオチニル-3-マレイミドプロピオンアミジル-3,6-ジオキサオクタンジアミン（Oda et al (2001) Nature Biotechnology 19:379-382, Pierce Biotechnology, Inc.）、ビオチン-BMCC、PEO-ヨードアセチルビオチン、ヨードアセチル-LC-ビオチンおよびビオチン-HPDP（Pierce Biotechnology, Inc.）およびNα-(3-マレイミジルプロピオニル）ビオシチン（MPB, Molecular Probes, Eugene, OR）を含む。ビオチン化二官能性および多官能性リンカー試薬の他の製造元は、Molecular Probes（Eugene, Oreg.）およびSigma（St. Louis, Mo）を含む。
II.システイン置換免疫グロブリン（たとえばCYSMAB）をコードするポリヌクレオチド
同じく提供されるものは、本明細書に記載されるシステイン置換免疫グロブリンまたはシステイン置換を有するその定常ドメインをコードするポリヌクレオチド（たとえばDNA）である。システイン置換免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、免疫グロブリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド上での部位特異的突然変異誘発によって調製することができる。部位特異的突然変異誘発を実施するためのキットは様々な販売元から市販されている。これらは、たとえば、Life Technologiesから市販されているPhusion、Agilent Technologiesから市販されているQuikChangeおよびNew England Biolabsから市販されているQ5を含む。概して、部位特異的突然変異誘発は、所望の部位にcysコドンを挿入する変異体を含むプライマーを使用する、標的免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドのプライマー伸長を含む。
同じく提供されるものは、本明細書に記載されるシステイン置換免疫グロブリン、またはシステイン置換を有するその定常ドメインをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモータを含む発現カセットである。いくつかの態様において、プロモータは異種である、すなわち、本来、コード配列に機能的に連結された状態では見られない。いくつかの態様において、本明細書に記載されるシステイン置換免疫グロブリン、またはシステイン置換を有するその定常ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクター（発現ベクターまたはシャトルベクターを含むが、それに限定されない）。同じく提供されるものは、本明細書に記載されるシステイン置換免疫グロブリン、またはシステイン置換を有するその定常ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、任意で、それを発現する細胞である。例示的な細胞は、原核生物細胞、たとえば非限定的に大腸菌および真核生物細胞、たとえば非限定的に哺乳動物（たとえばヒト、ハムスター、ラット、マウスなど）、真菌（たとえば酵母）または植物細胞を含む。
III.抗体作製方法
本明細書に記載される免疫グロブリン、たとえば組換え、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製のために、当技術分野において公知の多くの技術を使用することができる（たとえば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)；Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983)；Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)；Coligan, Current Protocols in Immunology (1991)；Harlow & Lane, Antibodies, A laboratory Manual (1988)；およびGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)を参照）。関心対象の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングすることができる。たとえば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を作製するために使用することができる。また、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーをハイブリドーマまたは形質細胞から作製することもできる。重鎖および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせが、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（たとえばKuby, Immunology (3rd ed. 1997)を参照）。一本鎖抗体または組換え抗体の作製技術（米国特許第4,946,778号、米国特許第4,816,567号）を、本開示のポリペプチドに対する抗体を作製するために適合させることができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物、たとえば他の哺乳動物を使用して、ヒト化またはヒト抗体を発現させることもできる（たとえば、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)；およびLonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照）。または、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーFabフラグメントを同定することもできる（たとえば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)；Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照）。抗体はまた、二重特異性に、すなわち、2つの異なる抗原を認識することができるように作製することもできる（たとえば、WO 93/08829、Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991)；およびSuresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)を参照）。抗体はまた、ヘテロコンジュゲート、たとえば2つの共有結合した抗体または免疫毒素であることもできる（たとえば、米国特許第4,676,980号、WO 91/00360；WO 92/200373；およびEP 03089を参照）。
抗体は、原核生物および真核生物発現系を含む任意の数の発現系を使用して作製することができる。いくつかの態様において、発現系は、哺乳動物細胞発現系、たとえばハイブリドーマまたはCHO細胞発現系である。多くのそのような系が販売元から広く市販されている。抗体がVHおよびVL領域の両方を含む態様において、VHおよびVL領域は、たとえば、ジシストロン性発現単位で、または様々なプロモータの制御下、単一のベクターを使用して発現させ得る。他の態様において、VHおよびVL領域は、別々のベクターを使用して発現させ得る。本明細書に記載されるVHまたはVL領域は、任意で、N末端にメチオニンを含んでもよい。
本開示の抗体はまた、Fab、Fab'、F(ab')2、scFvまたはdAbを含む様々なフォーマットで作製することができる。抗体フラグメントは、酵素、たとえばペプシン（(Fab')2フラグメントを生成する場合）またはパパイン（Fabフラグメントを生成する場合）を用いる完全な抗体の消化；または新規合成をはじめとする多様な方法によって得ることができる。抗体フラグメントはまた、組換えDNA方法を使用して合成することもできる。いくつかの態様において、CLL-1抗体は、CLL-1に特異的に結合するF(ab')2フラグメントを含む。本開示の抗体はまた、ヒト定常領域を含むこともできる。たとえば、Fundamental Immunology (Paul ed., 4d ed. 1999)；Bird, et al., Science 242:423 (1988)；およびHuston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 (1988)を参照すること。
また、非ヒト抗体をヒト化する（すなわち、非ヒト抗体からのCDRを使用する）方法が当技術分野において公知である。概して、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースからの1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、インポート残基と呼ばれ、一般にはインポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Winterらの方法（たとえば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照）にしたがって、げっ歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって実施することができる。このようなヒト化抗体は、実質的に完全未満のヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第4,816,567号）である。実際には、ヒト化抗体は一般に、いくつかのCDR残基およびおそらくはいくつかのFR残基がげっ歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
いくつかの場合、抗体または抗体フラグメントは、インビボで延長された半減期を提供するために、別の分子、たとえばポリエチレングリコール（PEG化）または血清アルブミンにコンジュゲートさせることができる。抗体フラグメントのPEG化の例が、Knight et al. Platelets 15:409, 2004（アブシキシマブの場合）；Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994（抗CEA抗体の場合）；Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999；およびHumphreys, et al., Protein Eng. Des. 20: 227 2007に提供されている。抗体または抗体フラグメントはまた、以下に記載されるように、標識されることもできるし、治療剤にコンジュゲートされることもできる。
IV.システイン置換免疫グロブリン（たとえばCYSMAB）薬物コンジュゲートの調製
本開示のシステイン置換免疫グロブリン（CYSMAB）から調製される抗体−薬物コンジュゲートは、当業者に公知の有機化学反応、条件および試薬を使用して、いくつかの経路、たとえば（1）システイン改変抗体のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合によって抗体−リンカー中間体Ab-Lを形成したのち、活性化された薬物部分Dと反応させる経路；および（2）薬物部分の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合によって薬物−リンカー中間体D-Lを形成したのち、システイン改変抗体（CYSMAB）のシステイン基と反応させる経路によって調製することができる。コンジュゲーション法（1）および（2）は、多様なシステイン改変抗体（CYSMAB）、薬物部分およびリンカーとともに用いられて、抗体−薬物コンジュゲート（ADC）を調製し得る。
抗体システインチオール基は求核性であり、反応すると、リンカー試薬および薬物−リンカー中間体上の求電子性基、たとえば（i）活性エステル、たとえばNHSエステル、HOBtエステル、ハロホルメートおよび酸ハライド；（ii）アルキルおよびベンジルハライド、たとえばハロアセトアミド；（iii）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基；（iv）ジスルフィド、たとえばピリジルジスルフィド（スルフィド交換を介する）とで共有結合を形成することができる。薬物部分上の求核性基は、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基とで共有結合を形成するように反応することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジド基を含むが、これらに限定されない。
システイン改変抗体は、還元剤、たとえばDTT（Cleland試薬、ジチオトレイトール）またはTCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド；Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80；Soltec Ventures, Beverly, Mass.）で処理したのち、たとえばDHAAによって再酸化させて鎖間および鎖内ジスルフィド結合を再形成することにより、リンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性にし得る（実施例2）。
A.リンカー
「リンカー」、「リンカー単位」または「リンク」とは、抗体を薬物部分に共有結合させる共有結合または原子鎖を含む化学的部分を意味する。様々な態様において、リンカーはLと指定される。「リンカー」（L）は、抗体−薬物コンジュゲート（ADC）を形成するために1つまたは複数の薬物部分（D）と抗体単位（Ab）とを連結するために使用することができる二官能性または多官能性部分である。抗体−薬物コンジュゲート（ADC）は、薬物および抗体に結合するための反応性官能価を有するリンカーを使用して簡便に調製することができる。システイン改変抗体（CYSMAB）のシステインチオールは、リンカー試薬、薬物部分または薬物−リンカー中間体の求電子性官能基とで結合を形成することができる。
1つの局面において、リンカーは、抗体上に存在する求核性システインに反応性である求電子性基を有する反応性部位を有する。抗体のシステインチオールは、リンカー上の求電子性基と反応し、リンカーへの共有結合を形成する。有用な求電子性基はマレイミドおよびハロアセトアミド基を含むが、これらに限定されない。
リンカーは、二価ラジカル、たとえばアルキルジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、-(CR2)nO(CR2)n-のような部分、アルキルオキシ（たとえばポリエチレンオキシ、PEG、ポリメチレンオキシ）およびアルキルアミノ（たとえばポリエチレンアミノ、Jeffamine（商標））の繰り返し単位；ならびに二酸エステルおよびアミド、たとえばスクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネートおよびカプロアミドを含む。
システイン改変抗体（CYSMAB）は、Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773の766頁のコンジュゲーション法にしたがって、リンカー試薬または薬物−リンカー中間体、求電子性官能基、たとえばマレイミドまたはα-ハロカルボニルと反応する。
リンカーは1つまたは複数のリンカー成分で構成され得る。例示的なリンカー成分は、6-マレイミドカプロイル（「MC」）、マレイミドプロパノイル（「MP」）、バリン−シトルリン（「val-cit」または「vc」）、アラニン−フェニルアラニン（「ala-phe」または「af」）、p-アミノベンジルオキシカルボニル（「PAB」）、N-スクシンイミジル 4-（2-ピリジルチオ）ペンタノエート（「SPP」）、N-スクシンイミジル 4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1カルボキシレート（「SMCC」）、N-スクシンイミジル（4-ヨードアセチル）アミノベンゾエート（「SIAB」）、1つまたは複数の繰り返し単位（「EO」または「PEO」）としてのエチレンオキシ-CH2CH2O-を含む。さらなるリンカー成分が当技術分野において公知であり、いくつかは本明細書に記載されている。
別の態様において、リンカーは、抗体上に存在する求電子性基に対して反応性である求核性基を有する反応性官能基を有する。抗体上の有用な求電子性基は、アルデヒドおよびケトンカルボニル基を含むが、これらに限定されない。リンカーの求核性基のヘテロ原子が、抗体上の求電子性基と反応し、抗体単位への共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核性基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジドを含むが、これらに限定されない。抗体上の求電子性基は、リンカーへの結合のための好都合な部位を提供する。
一般に、ペプチド型リンカーは、2つまたはより多くのアミノ酸および／またはペプチドフラグメント間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。このようなペプチド結合は、たとえば、ペプチド化学の分野において周知である液相合成法（E. Schroder and K. Lubke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136、Academic Press）にしたがって調製することができる。リンカー中間体は、スペーサ、ストレッチャおよびアミノ酸ユニットを含む反応の任意の組み合わせまたは順序で組み立てられ得る。スペーサ、ストレッチャおよびアミノ酸単位は、本来は求電子性、求核性または遊離基である反応性官能基を用い得る。反応性官能基は、カルボキシル、ヒドロキシル、パラ-ニトロフェニルカーボネート、イソチオシアネートおよび脱離基、たとえばO-メシル、O-トシル、-Cl、-Br、-I；またはマレイミドを含むが、これらに限定されない。
別の態様において、リンカーは、溶解度または反応性を変調させる基で置換されていてもよい。たとえば、荷電置換基、たとえばスルホネート（-S03-）またはアンモニウムは、試薬の水溶性を増加させ、リンカー試薬と抗体または薬物部分とのカップリング反応を促進し、または、ADCを調製するために用いられる合成経路に依存して、Ab-L（抗体−リンカー中間体）とDとの、もしくはD-L（薬物−リンカー中間体）とAbとのカップリング反応を促進し得る。
マレイミド部分およびPAB自己犠牲的部分を含む例示的なphe-lys（Mtr、モノ-4-メトキシトリチル）ジペプチドリンカー試薬を、Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60にしたがって調製することができる。
B.リンカー試薬
抗体とアウリスタチンとのコンジュゲートは、多様な二官能性リンカー試薬、たとえばN-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル-4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、イミノチオラン（IT）、イミドエステル類の二官能性誘導体（たとえばジメチルアジピミデートHCl）、活性エステル類（たとえばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド類（たとえばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（たとえばビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（たとえばビス−（p-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（たとえばトルエン2,6-ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（たとえば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）を使用して作製し得る。
本開示の抗体薬物コンジュゲート（ADC）に有用なリンカー試薬は、BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホEMCS、スルホGMBS、スルホKMUS、スルホMBS、スルホSIAB、スルホSMCCおよびスルホSMPBおよびSVSB（スクシンイミジル-（4-ビニルスルホネート）ベンゾエート）を含み、Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific、Rockford, Illおよび他の試薬販売元から市販されているビス−マレイミド試薬：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1,8-ビス−マレイミドジエチレングリコール（BM（PEO）2）および1,11-ビス−マレイミドトリエチレングリコール（BM（PEO）3）を含むが、これらに限定されない。ビスマレイミド試薬は、抗体のシステイン残基の遊離チオール基をチオール含有薬物部分、標識またはリンカー中間体に順次または同時並行に結合することができる。抗体、ネモルビシン代謝産物および類似薬物部分またはリンカー中間体のチオール基と反応性である、マレイミド以外の他の官能基は、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネートおよびイソチオシアネートを含む。
V.使用方法
本開示のシステイン置換免疫グロブリンは、とりわけ、検出可能な部分または薬物、たとえば細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた分子を含むシステイン置換免疫グロブリンコンジュゲートの調製において有用である。
A.疾患の処置
システイン置換免疫グロブリン薬物コンジュゲート（たとえばCYSMAB ADC）は、そのようなコンジュゲートが結合する細胞を標的とすることによって処置可能な任意の疾患の処置に有用である。これは、任意の形態のがんを含む。
システイン置換免疫グロブリン薬物コンジュゲートは、たとえば腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする様々な疾患または障害を処置するために使用され得る。例示的な状態または過剰増殖性障害は、良性または悪性の腫瘍；白血病およびリンパ性悪性疾患を含む。他には、神経、神経膠、星状細胞、視床下部、腺、マクロファージ、上皮、間質、胞胚腔、炎症、血管新生および免疫学的障害、たとえば自己免疫障害がある。
システイン置換免疫グロブリン薬物コンジュゲートはさらに、腫瘍を有する高等霊長類およびヒトの治験において試験することができる。ヒト治験は、Baselga et al. (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744によって報告されているような、以前に広範な抗がん治療を受けたことがある、HER2を過剰発現する転移性乳がんの患者における抗HER2モノクローナル抗体HERCEPTIN（登録商標）の効能を試験する治験と同様に設計されることができる。治験は、公知の治療レジメン、たとえば、公知の化学療法および／または細胞傷害性薬剤を用いる放射線および／または化学療法と組み合わせてADCの効能を評価するように設計されてもよい。
概して、処置される疾患または障害は、過剰増殖性疾患、たとえばがんである。本明細書の中で処置されるがんの例は、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ性悪性疾患を含むが、これらに限定されない。このようながんのより具体的な例は、扁平上皮がん（たとえば上皮扁平上皮がん）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がんおよび肺扁平上皮がんを含む肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がんを含む胃がん、膵臓がん、グリア芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん（liver cancer）、膀胱がん、肝がん(hepatoma)、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん腫、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん（hepatic carcinoma）、肛門がん、陰茎がんならびに頭頸部がんを含むが、これらに限定されない。
がんは、本発明のADCががん細胞に結合することができるようなHER2発現細胞を含み得る。がんにおけるErbB2発現を測定するために、様々な診断／予後アッセイが利用可能である。1つの態様においては、IHCによって、たとえばHERCEPTEST（Dako）を使用してErbB2発現を分析し得る。腫瘍生検材料からのパラフィン包埋組織切片をIHCアッセイに付し、以下のようなErbB2タンパク質染色強度基準を与え得る。スコア0、染色が認められない、または膜染色が腫瘍細胞の10％未満でしか認められない；スコア1＋、淡い／かろうじて認められる膜染色が腫瘍細胞の10％超において検出され、細胞はその膜の一部でのみ染色されている；スコア2＋、弱〜中程度の膜全体の染色が腫瘍細胞の10％超において認められる；スコア3＋、中程度〜強の膜全体の染色が腫瘍細胞の10％超において認められる。ErbB2過剰発現評価で0または1＋スコアのこれらの腫瘍は、ErbB2を過剰発現していないものと特性決定され得、2＋または3＋スコアのこれらの腫瘍は、ErbB2を過剰発現しているものと特性決定され得る。
代替的または追加的に、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍細胞に対してFISHアッセイ、たとえばINFORM（商標）（Ventana Co., Ariz.）またはPATHVISION（商標）（Vysis, Ill.）を実施して、腫瘍におけるErbB2過剰発現の程度（あるならば）を決定してもよい。
ADC化合物が処置に使用され得る自己免疫疾患は、リウマチ性障害（たとえば慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、狼瘡、たとえばSLEおよびループス腎炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群および乾せん性関節炎）、変形性関節症、自己免疫性胃腸障害および肝臓障害（たとえば炎症性腸疾患（たとえば潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫性胃炎および悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎およびセリアック病）、血管炎（たとえば、チャーグ・ストラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症および多発動脈炎を含むANCA関連血管炎）、自己免疫性神経障害（たとえば多発性硬化症、オプソクロナスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、オプソニクス神経炎、パーキンソン病、アルツハイマー病および自己免疫性多発神経障害）、腎障害（たとえば糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群およびバーガー病）、自己免疫性皮膚障害（たとえば乾せん、蕁麻疹（urticaria）、皮疹（hives）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および皮膚エリテマトーデス）、血液障害（たとえば血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病および自己免疫性溶血性貧血）、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性難聴（たとえば内耳疾患および難聴）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植および自己免疫性内分泌障害（たとえば糖尿病関連自己免疫疾患、たとえばインスリン依存性糖尿病（IDDM）、アジソン病および自己免疫性甲状腺疾患（たとえばグレーブス病および甲状腺炎））を含む。より好ましいそのような疾患は、たとえば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ANCA関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、IDDM、悪性貧血、甲状腺炎および糸球体腎炎を含む。
本明細書に記載されるシステイン置換免疫グロブリンコンジュゲートはまた、CLL-1関連障害、すなわち、標準対照（たとえば正常、非疾患、非がん細胞）におけるCLL-1発現と比べてCLL-1の細胞表面発現の増加または減少と相関する疾患を検出および処置するために使用することもできる。CLL-1発現は通常、骨髄系列細胞、たとえば末梢血および脾臓中の樹状細胞、顆粒球および単球に限定される。高められたCLL-1レベルは、がん、特に造血CSC（たとえばLSC）および骨髄増殖性疾患、たとえば、AML（急性骨髄性または骨髄増殖性白血病）、MDS（骨髄異形成症候群）、骨髄線維症、CMML（慢性骨髄単球性白血病）、多発性骨髄腫、形質細胞腫およびCML（慢性骨髄性または骨髄増殖性白血病）をはじめとする白血病に関連する。Bakker et al. (2004) Cancer Res. 64:8443；Van Rhenen et al. (2007) Blood 110:2659-66；Zhao et al. (2010) Haematologica (2010) 95:71；Van Rhenen et al. (2007) Leukemia 21:1700；およびHerrmann et al. (2012) Haematologica 97:219を参照すること。
AML細胞は、細胞表面マーカー発現を検出することによって特性決定され、他の細胞から区別されることができる。AML細胞は、CLL-1+であることの他に、CD33+（いくつかはCD33-であるが）、CD45+およびCDw52+であることができる。AML芽球（LSCを含む）は一般にCD34+CD38-である。HSCおよびLSCはCD34の発現を特徴とすることができるが、前者はCLL-1を発現しない。MDS細胞はCD5、CD7、CD13およびCD34の発現を特徴とすることができる。CML細胞は7-ADD、CD33、CD34およびCD38の発現を特徴とすることができる。
骨髄異形成症候群（MDS）は、骨髄が、前白血病過程を示唆する質的および量的変化を示すが、必ずしも急性白血病として終結しない慢性的な経過を有する、密接に関連する血液形成障害の群を含む。前白血病、難治性貧血、難治性甲状腺機能不全貧血、くすぶり型または亜急性白血病、骨髄異形成症候群（DMPS）および骨髄異形成をはじめとする多様な用語は、すべてMDSを表すために使用される。これらの状態はすべて、成熟障害（骨髄発生不全）および血球数の減少を伴う細胞骨髄を特徴とする。DMPSは、増強された顆粒球成熟過程を反映する、巨芽球様細胞の存在、巨核球形成異常および異常な芽細胞数の増加を特徴とする。DMPS患者は、急性骨髄性白血病に見られるものに類似した染色体異常を示し、患者の一定の割合においては急性骨髄性白血病まで進行する。
慢性骨髄増殖性疾患は、成熟および未熟な顆粒球、赤血球および血小板の数の増加を特徴とする状態の集合である。慢性骨髄増殖性疾患は、この群の中で他の形態に移行することができ、最終的に急性骨髄性白血病に至る傾向を有する。この群の中の具体的な疾患は、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病、原因不明骨髄性白血病、本態性血小板血症および慢性好中球性白血病を含む。
骨髄線維症は、赤血球および白血球ならびに血小板の数の減少をもたらす骨髄の瘢痕を特徴とする。骨髄線維化性瘢痕は、白血病から生じることができるが、他の原因、たとえば血小板増加症または薬の副作用を有することもある。
B.CDC、ADCCおよびADCアッセイ
本開示のシステイン置換免疫グロブリン薬物コンジュゲート（たとえばCYSMAB ADC）の有効性は、補体依存性細胞傷害性（CDC）、標的抗原、たとえばCLL-1を発現する細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ADCC）アッセイによって評価することができる。CLL-1を発現する例示的な細胞は、異種の組換えCLL-1（たとえばヒトCLL-1）を発現する細胞株；ヒトAML細胞株、たとえばHL60、THP1、TF1-α、U937およびOCI AML-5（最初4つはATCCから入手可能である）；1人または複数のAML患者からの初代細胞（たとえばPBMCまたは移植された腫瘍細胞）；ヒトCML細胞株、たとえばK562およびKU812（ATCCから入手可能）；ならびに1つまたは複数のCMLまたはMDS患者からの初代細胞を含む。
抗体は、抗体標的を発現する細胞の補体依存的死滅を生じさせるならば、CDC活性を有し、CDCを媒介するものと記される。CDCアッセイは当技術分野において公知であり、たとえば、Gazzano-Santoro et al. (1997) J. Immunol. Methods 202:163；Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178；および以下の実施例6に記載されている。CDCキットおよびサービスは、たとえば、GeneScript（登録商標）およびCell Technology Inc.から市販されている。
簡潔にいうと、アッセイは一般にインビトロで実施され、その表面に抗体標的を発現する細胞への抗体結合を含む。抗体のCh領域に結合する、Clq,22をはじめとする補体成分を加える。すると、補体成分は相互作用して、標的化細胞を死滅させる。CDCは、概して4〜24時間のインキュベーション期間ののち、たとえば、標的化細胞中に存在することが知られる細胞内酵素または顆粒の放出を測定すること、開始時の標的細胞集団と終了時の標的細胞集団とを比較すること、などによって計測される。
抗体は、エフェクタ細胞による抗体結合細胞（たとえばCLL-1発現細胞）の死滅を生じさせるならば、ADCC活性を有し、ADCCを媒介するものと記される。エフェクタ細胞は、一般にはナチュラルキラー細胞であるが、マクロファージ、好中球または好酸球であることもできる。
また、遺伝子改変されたエフェクタ細胞株が、ADCCアッセイにおける使用のために開発されている（たとえば、Schnueriger et al. (2011) Mol. Immunol. 48:1512を参照）。ADCCアッセイは、当技術分野において公知であり、たとえば、Perussia and Loza (2000) Methods in Mol. Biol. 121:179；Bretaudeau and Bonnaudet (2011) BMC Proceedings 5 (Suppl 8):P63；ならびに以下の実施例に記載されている。ADCCキットおよびサービスはGeneScript（登録商標）およびPromega（登録商標）から市販されている。
簡潔にいうと、アッセイは一般にインビトロで実施され、その表面に抗体標的を発現する細胞への抗体結合を含む。一般にはFc受容体、たとえばCD16を介して抗体結合細胞を認識するエフェクタ細胞を加える。エフェクタ細胞は、たとえば、アポトーシスを生じさせる細胞毒を放出することによって抗体結合細胞を死滅させる。細胞死は、標的細胞（たとえばCr51）内の検出可能な要素の放出によって、または細胞媒介毒性（たとえば、エフェクタ細胞中のNFATシグナル伝達の活性化）に関与する要素の検出によって検出される。
抗体が、細胞傷害性薬剤（薬物）とコンジュゲートされたとき、抗体の標的（この場合、CLL-1）を発現する細胞を死滅させる（生存を阻害する）ならば、その抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ADC）活性を有する（またはADCを媒介する）ものと記される。適切な細胞傷害性薬剤、たとえばサポリン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、ビンカアルカロイド類、タキソイド類、チューブリン剤（たとえばメイタンシン、アウリスタチン）およびDNA剤（たとえばカリケアミシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピンダイマー）などが当技術分野において公知である。ADCアッセイは、たとえばGerber et al. (2009) 3:247および以下の実施例に記載されているように、当技術分野において公知である。
C.診断用途
たとえば、システイン置換免疫グロブリンコンジュゲートは、がん細胞を検出するためのインビトロおよびインビボ診断アッセイに使用することができる。これは、CLL-1発現細胞（たとえばAML細胞およびAML CSC）の検出のための、CLL-1発現細胞に特異的に結合する、本明細書に記載されるCLL-1に特異的な抗体（このセクションでのみ「CLL-1抗体」）を含む。たとえば、試料（たとえば血液試料または組織生検材料）を患者から取得し、CLL-1抗体と接触させることができ、抗体結合を検出することによって患者試料中のCLL-1発現細胞の存在を決定することができる。抗体結合は、直接的に検出することもできるし（たとえば、抗体そのものが標識されている場合）、または第二の検出剤、たとえば二次抗体を使用することによって検出することもできる。検出可能な標識は、直接的、あるいはたとえばキレート剤もしくはリンカーを介して間接的に、本開示の抗体と会合することができる。
いくつかの態様において、CLL-1抗体は、CLL-1関連障害を有する、または有することが疑われる個体からの生物学的試料と接触させられ、試料中の細胞への抗体結合が測定されて、通常よりも高いかまたはより低い抗体結合が、その個体がCLL-1関連障害を有することを示す。いくつかの態様において、生物学的試料は血液試料または血液画分（たとえば血清、血漿、血小板、赤血球、白血球、PBMC）である。いくつかの態様において、生物学的試料は、たとえば既知の腫瘍の境界を決定するために、たとえば疑われる腫瘍部位または罹患していることが知られている組織からの組織試料（生検材料）である。
生検は一般に、組織、すなわち非流体細胞型から試料を得るために実施される。適用される生検技術は、評価される組織タイプ（たとえば乳房、皮膚、結腸、前立腺、腎臓、肺、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、気道または肺）に依存する。がんの場合、技術はまた、とりわけ、腫瘍のサイズおよびタイプ（たとえば固形、懸濁状態または血液）にも依存する。代表的な生検技術は、切除生検、切開生検、針生検、外科生検および骨髄生検を含むが、これらに限定されない。「切除生検」とは、腫瘍塊全体を、それを取り囲む正常組織の小さな縁とともに除去することをいう。「切開生検」とは、腫瘍の断面直径を含むくさび状の組織を除去することをいう。内視鏡検査または蛍光透視法によって実施される診断または予後が、腫瘍塊の「コア針生検」または概して腫瘍塊内から細胞の懸濁液を得る「細針吸引生検」を要することができる。生検技術は、たとえば、Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70およびパートV全体に記載されている。
試料中の細胞への抗体結合を検出する任意の方法を本診断アッセイに使用することができる。抗体結合を検出する方法は、たとえばフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、ELISAなど、当技術分野において周知である。いくつかの態様において、方法は、測定工程の前に、検出に備えて生物学的試料を準備する工程を含む。たとえば、細胞（たとえば白血球、CD34+細胞、CD45+細胞など）の亜集団を個体からの試料の残り（たとえば他の血液成分）から分離することもできるし、またはより簡単な検出のために組織中の細胞を懸濁させることもできる。
いくつかの態様においては、試料中のCLL-1発現細胞の割合を測定し、対照、たとえばCLL-1関連障害を有することが知られている個体もしくは個体群からの試料（正の対照）またはCLL-1関連障害を有しないことが知られている個体もしくは個体群からの試料（正常、健康、非疾患、または負の対照）と比較する。いくつかの態様において、対照は、所与の組織に関して確立されたCLL-1発現の標準範囲である。CLL-1発現細胞の正常な割合よりも高いまたは低い、すなわち、より高いまたは低い発現レベルが、個体がCLL-1関連障害を有することを示す。
いくつかの態様においては、所期の治療の適用可能性を決定するために、標識されたCLL-1抗体を個体に提供（投与）することができる。たとえば、標識された抗体を使用して患部区域内のCLL-1密度を検出し得、その密度は非患部組織に比べて一般に高い。標識された抗体はまた、治療のために患部区域にアクセス可能であることを示すこともできる。したがって、画像診断結果に基づいて、治療のために患者を選択することができる。解剖学的特性決定、たとえばがんの正確な境界の決定は、標準的な画像診断技術（たとえばCTスキャン、MRI、PETスキャンなど）を使用して達成することができる。
いくつかの態様においては、本明細書に記載される標識されたCLL-1抗体をさらに治療化合物と会合させて、たとえば「セラノーシス」組成物を形成することができる。たとえば、CLL-1抗体を、検出可能な標識と、治療剤、たとえばCLL-1発現がん細胞を死滅させるための細胞傷害性薬剤との両方に連結（直接または間接的に）させることができる。いくつかの態様において、標識されたCLL-1抗体は、CLL-1発現がん細胞の診断および／または限局化に使用され、その場合、CLL-1発現がん細胞は、別個の治療用CLL-1特異的抗体で標的指向される。いくつかの態様において、診断用CLL-1特異的抗体は、CLL-1発現細胞中に高い率または割合で内部移行しないものである。いくつかの態様において、治療用CLL-1抗体は、CLL-1発現細胞中に高い率または割合で内部移行する。
1.標識
関心対象の標的に結合することができる抗体を含む診断剤は、たとえば以下の参考文献に提供されているような、当技術分野において公知の任意の診断剤を含むことができる：Armstrong et al., Diagnostic Imaging, 5th Ed., Blackwell Publishing (2004)；Torchilin, V. P., Ed., Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press (1995)；Vallabhajosula, S., Molecular Imaging: Radiopharmaceuticals for PET and SPECT, Springer (2009)。診断剤は、検出可能なシグナルを提供および／または増強する薬剤を含む多様な方法によって検出することができる。検出可能なシグナルは、ガンマ線放出性、放射性、エコー源性、光学、蛍光、吸収性、磁気またはトモグラフィシグナルを含むが、これらに限定されない。診断剤を画像診断するための技術は、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（SPECT）、磁気共鳴画像診断法（MRI）、光学画像診断法、陽電子放射断層撮影法（PET）、コンピュータ断層撮影法（CT）、X線画像診断法、ガンマ線画像診断法などを含むが、これらに限定されない。用語「検出可能な薬剤」、「検出可能な部分」、「標識」、「画像診断剤」および類似の用語は本明細書の中で同義に使用される。
いくつかの態様において、標識は、蛍光剤、リン光剤、化学発光剤などのような光学薬剤を含むことができる。多くの薬剤（たとえば色素、プローブ、標識または指示薬）が当技術分野において公知であり、本開示において使用することができる（たとえば、Invitrogen, The Handbook−A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Tenth Edition (2005)を参照）。蛍光剤は、多様な有機および／または無機小分子または多様な蛍光タンパク質およびその誘導体を含むことができる。たとえば、蛍光剤は、シアニン類、フタロシアニン類、ポルフィリン類、インドシアニン類、ローダミン類、フェノキサジン類、フェニルキサンテン類、フェノチアジン類、フェノセレナジン類、フルオレセイン類、ベンゾポルフィリン類、スクアライン類、ジピロロピリミドン類、テトラセン類、キノリン類、ピラジン類、コリン類、クロコニウム類、アクリドン類、フェナントリジン類、ローダミン類、アクリジン類、アントラキノン類、カルコゲノピリリウム類似体、クロリン類、ナフタロシアニン類、メチン色素、インドレニウム色素、アゾ化合物、アズレン類、アザアズレン類、トリフェニルメタン色素、インドール類、ベンゾインドール類、インドカルボシアニン類、ベンゾインドカルボシアニン類（benzoindocarbocyanines）およびBODIPY（商標）誘導体を含むことができるが、これらに限定されない。蛍光色素は、たとえば米国特許第4,452,720号、米国特許第5,227,487号および米国特許第5,543,295号に記載されている。
標識はまた、放射性同位体、たとえば、ガンマ線、陽電子、ベータおよびアルファ粒子ならびにX線を放出する放射性核種であることができる。適当な放射性核種は、225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、2Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Yおよび90Yを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、放射性薬剤は、111In-DTPA、99mTc(CO)3-DTPA、99mTc(CO)3-ENPy2、62/64/67Cu-TETA、99mTc(CO)3-IDAおよび99mTc(CO)3-トリアミン類（環式または直鎖状）を含むことができる。いくつかの態様において、薬剤は、DOTAおよび111In、177Lu、153Sm、62/64/67Cuまたは67/68Gaとのその様々な類似体を含むことができる。いくつかの態様において、ナノ粒子は、以下の参考文献に提供されているように、キレートに結合した脂質、たとえばDTPA-脂質の組み込みによって標識することができる：Phillips et al., Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, 1(1): 69-83 (2008)；Torchilin, V. P. & Weissig, V., Eds. Liposomes 2nd Ed.: Oxford Univ. Press (2003)；Elbayoumi, T. A. & Torchilin, V. P., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 33:1196-1205 (2006)；Mougin-Degraef, M. et al., Int'l J. Pharmaceutics 344:110-117 (2007)。
いくつかの態様において、診断剤は、二次結合リガンドと、または色素産生性基質と接触すると有色生成物を生成する酵素（酵素タグ）と会合することができる。適当な酵素の例は、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼを含む。二次結合リガンドは、たとえば、当技術分野において公知のビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物を含む。
いくつかの態様において、以下さらに詳細に説明するように、標識された抗体はさらに、インビボでの安定性を改善する組成物、たとえばPEGまたはナノ粒子、たとえばリポソームに会合していることができる。
2.標識の方法
検出可能な治療薬剤を抗体にコンジュゲートするための技術は周知である（たとえば、Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；およびThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照）。
一般に、抗体は、エピトープへの結合を妨げない区域において検出可能な部分に付着される。したがって、いくつかの場合、検出可能な部分は、定常領域に、すなわち可変領域のCDRの外で付着される。当業者は、検出可能な部分が抗体上の他の場所に位置することができ、検出可能な部分の位置を相応に調節することができることを理解するであろう。いくつかの態様においては、抗体がエピトープと会合する能力を、検出可能な部分への結合の前後で比較して、付着が結合を過度に妨害しないことを保証する。
いくつかの態様において、抗体はさらなる標的指向部分と会合していることができる。たとえば、標的分子または標的細胞上の異なる部位に結合する抗体フラグメント、ペプチドまたはアプタマーを抗体にコンジュゲートさせて、たとえばがん細胞への標的結合を最適化することができる。
D.治療応用
CLL-1発現細胞、たとえばAML細胞は、本明細書に記載されるシステイン置換CLL-1 ADC抗体（このセクションでのみ「CLL-1抗体」）を使用して標的とすることができる。CLL-1発現は、AML細胞およびCSC（たとえばAML CSC）で増加する。CLL-1は、正常なCD34+造血幹細胞（HSC）上では有意に発現せず、したがって、本CLL-1抗体を使用してCSCをHSCから区別することができる。AMLは非常に高い再発率を有するため、AML細胞に一般的なCLL-1エピトープを認識し、したがってAML細胞に普遍的に結合することができる高親和性CLL-1抗体が特に貴重である。上記のように、CLL-1抗体を含む治療組成物はさらに、たとえば、CLL-1発現細胞の検出および限局化ならびに治療効果のモニタリングのために、セラノーシス組成物を形成するための検出可能な標識をさらに含むことができる。CLL-1に結合する抗体の配列は、全体として参照により組み入れられる、2015年11月24日出願のUSSN 62/259,100（Jiang et al., "Humanized Anti-"）および2013年11月7日に公開されたUS 2013/0295118（Jiang et al., "Antibodies Specific For CLL-1）に記載されている。
また、CLL-1以外の標的に結合する抗体を、本明細書に記載されるシステイン置換抗体および抗体コンジュゲートに使用することもできる。いくつかの態様において、抗体標的は、GPR114、CLL-1、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、チロシナーゼ、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、テロメラーゼ、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGEおよびMAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、ネクチン-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、組織因子（TF）、CanAg、EGFR、αv-インテグリン、CD37、葉酸受容体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4またはエンドシアリン／CD248から選択することができる。
本明細書において実証されるように、本CLL-1抗体は、がん細胞成長（増殖および／または移植）を阻害することができ、したがって、単独で化学療法剤とみなされることができる。以下の開示は、CLL-1発現細胞に対するさらなる効果のためにCLL-1抗体に連結されることができる化学療法および細胞傷害性薬剤の例を提供する。
化学療法（抗がん）剤は、がん増殖を減らす、がん細胞複製を妨害する、がん細胞を直接または間接的に死滅させる、転移を減らす、腫瘍血液供給を減らす、などができる任意の薬剤であることができる。したがって、化学療法剤は細胞傷害性薬剤を含む。細胞傷害性薬剤は、サポリン、タキサン類、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリンおよび白金系薬剤を含むが、これらに限定されない。化学療法剤のクラスは、アルキル化剤、代謝拮抗剤、たとえばメトトレキセート、植物アルカロイド類、たとえばビンクリスチンおよび抗生物質、たとえばドキソルビシンならびに特定のクラスに属しない雑多な薬剤、たとえばヒドロキシ尿素を含むが、これらに限定されない。シスプラチンおよびオキサリプラチンによって例示される白金系薬物が化学療法剤の主要なクラスを代表する。これらの薬物はDNAに結合し、複製を妨害する。タキソールによって例示されるタキサン類が化学療法剤の別の主要なクラスを代表する。これらの化合物は、細胞骨格および紡錘体形成を妨害して細胞分裂を阻害し、それにより、急速に分裂するがん細胞の増殖を阻止することによって作用する。他の化学療法薬はホルモン療法を含む。薬物部分は、細胞傷害性薬剤、たとえば単量体または二量体のベンゾジアゼピン誘導体（たとえば、参照により組み入れられる米国特許出願第15/048,865号を参照）、ドラスタチン類、アウリスタチン類、メイタンシノイド、ドラスタチン、チューブリシン、クリプトフィシン、ピロロベンゾジアゼピン（PBD）ダイマー、インドリノベンゾジアゼピンダイマー、イソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー（以下に記すD202を含むが、それに限定されない）、α-アマニチン、トリコテン、SN-38、デュオカルマイシン、CC1065、カリケアミシン、エンジイン系抗生物質、タキサン、ドキソルビシン誘導体、アントラサイクリン、アザノフィド、およびそれらの立体異性体、同配体、類似体または誘導体を含むことができる。
1つよりも多い治療剤を同じ組成物中または別々の組成物中のいずれかに組み合わせることができる。治療剤はまた、特定の個体に適切なさらなる治療剤と組み合わせることもできる。がん患者に提供される一般的な治療剤は、痛み、悪心、貧血、感染、炎症およびがん患者が一般に経験する他の症候に対処するための薬を含む。
抗体は、多様な公知の架橋剤を使用して、治療剤、検出可能な薬剤またはナノキャリアに結合させることができる。ポリペプチドの共有結合または非共有結合的結合のための方法は当技術分野において周知である。そのような方法は、化学的架橋剤、光活性化架橋剤および／または二官能性架橋試薬の使用を含み得るが、これらに限定されない。分子を架橋させる例示的な方法が米国特許第5,603,872号および米国特許第5,401,511号に開示されている。架橋試薬の非限定的な例は、グルタルアルデヒド、二官能性オキシラン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、カルボジイミド類、たとえば1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミド、ビスイミデート類、ジニトロベンゼン、スベリン酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、酒石酸ジスクシンイミジル、ジメチル-3,3'-ジチオ-ビスプロピオンイミデート、アジドグリオキサール、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネートおよび4-（ブロモアミノエチル）-2-ニトロフェニルアジドを含む。
いくつかの態様において、CLL-1抗体はナノキャリアと会合している。ナノキャリア（たとえばリポソーム）にコンジュゲートされた抗体の場合、一定の数の抗体が表面上に、すなわち所与の表面密度で存在するであろう。いくつかの態様において、ナノキャリアは、ナノキャリア1つあたり少なくとも5つの抗体、たとえば、ナノキャリア1つあたり少なくとも10、30、40、50、75、100またはより多くの抗体を有するであろう。ナノキャリア1つあたりの抗体の数は集団の全メンバーで絶対的に均一にはならないため、当業者は、表面密度が平均範囲を表すということを理解するであろう。
ナノキャリアは、小胞、たとえばリポソームおよびミセルならびにポリマーナノ粒子などを含む。ナノキャリアは、治療剤および診断剤の送達に有用であるが、がんを処置するために使用される細胞傷害性薬剤を遮蔽するのに特に有用であり得る。ナノキャリアは、脂質（たとえばリン脂質）、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、両親媒性化合物、架橋ポリマーおよびポリマーマトリックスを含み得る（たとえばWO2009/110939を参照）。用途に応じて、ナノキャリアは、特定のサイズ、半減期、貯蔵寿命および漏出速度を有するように設計することができる。
ナノキャリア、たとえば抗体を標的とするリポソーム、高分子ナノ粒子または貯蔵寿命延長リポソームの調製は、たとえば、米国特許第6,465,188号、第7,122,202号、第7462603号および第7550441号に記載されている。
いくつかの態様において、抗体は、安定化部分、たとえばPEGまたはリポソームもしくは他のナノキャリアに連結される。米国特許第4,732,863号および第7,892,554号ならびにChattopadhyay et al. (2010) Mol Pharm 7:2194は、選択された抗体をPEG、PEG誘導体およびナノ粒子（たとえばリポソーム）に結合する方法を記載している。ホスファチジル−エタノールアミン（PE）を含有するリポソームは、本明細書に記載される確立された手順によって調製することができる。PEの包含は、結合のための、リポソーム表面上の活性機能部位を提供する。
抗体コンジュゲートはまた、1つよりも多い活性化合物、たとえばさらなる化学療法剤または細胞傷害剤、サイトカインまたは成長阻害剤を提供するように製剤化されることもできる。有効成分はまた、徐放性製剤（たとえば、固体疎水性ポリマー（たとえばポリエステル類、ハイドロゲル（たとえばポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）の半透過性マトリックス）、ポリラクチドとして調製されてもよい。抗体および免疫コンジュゲートは、たとえばコアセルベーション技術または界面重合によって調製されたナノ粒子、たとえばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中に閉じ込められることができる。
本明細書に記載されるCLL-1抗体は、単独で、または細胞傷害性薬剤と組み合わさって、CLL-1発現細胞を死滅させることができる。いくつかの態様において、処置の方法は、有効量の治療用CLL-1抗体またはCLL-1抗体コンジュゲート、たとえば治療剤に結合したCLL-1抗体を個体に投与する工程を含む。いくつかの態様において、個体はがん、たとえばAMLと診断されている。いくつかの態様において、個体は、がん治療、たとえば手術、放射線療法または化学療法を受けている、または受けたことがある。いくつかの態様において、個体はがんと診断されているが、がんは緩解期にある。
いくつかの態様において、方法はさらに、がんの進行に関して個体をモニターする工程を含む。いくつかの態様において、投与ごとのCLL-1抗体またはCLL-1抗体コンジュゲートの用量は、個体の治療進行に基づいて決定され、たとえば、個体が治療に十分に応答していないならば、より高い用量の化学療法剤が投与される。
いくつかの態様において、本開示は、抗体または抗体-標的指向組成物および生理学的に（すなわち、薬学的に）許容可能な担体を含むことができる。用語「担体」とは、診断剤または治療剤のための希釈剤またはビヒクルとして使用される一般に不活性な物質をいう。この用語はまた、組成物に凝集性を付与する一般に不活性な物質を包含する。生理学的に許容可能な担体は、液体、たとえば生理食塩水、リン酸緩衝液、規定濃度の緩衝食塩水（135〜150mM NaCl）、水、緩衝水、0.4％食塩水、0.3％グリシン、安定性を高めるための糖タンパク質（たとえばアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）などであることができる。生理学的に許容可能な担体は、一部には、投与される特定の組成物および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決まるため、本開示の薬学的組成物の適当な製剤は多種多様に存在する（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照）。
本開示の組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌されてもよいし、または無菌条件下で作製されてもよい。水溶液は、使用のためにパッケージングし、または無菌条件下でろ過し、凍結乾燥させることができ、凍結乾燥製剤は、投与前に無菌水溶液と合わされる。組成物は、生理学的条件を近似するために必要とされる薬学的に許容可能な補助物質、たとえばpH調節剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレートおよびトリエタノールアミンオレエートを含有することができる。また、組成物を安定化するために、たとえば凍結乾燥された抗体組成物の安定剤として、糖が含まれることもできる。
剤形は、患者への粘膜投与（たとえば鼻、舌下、膣、頬または直腸）、非経口投与（たとえば皮下、静脈内、筋肉内または動脈内注射、ボーラスまたは注入のいずれか）、経口投与または経皮投与のために調製されることができる。剤形の例は、分散剤；座剤；軟膏；パップ剤（パップ）；ペースト；粉剤；包帯剤；クリーム；硬膏剤；液剤；パッチ；エアゾール（たとえば、スプレー式点鼻薬または吸入器）；ゲル；患者への経口または粘膜投与に適した液体剤形、たとえば懸濁剤（たとえば、水性または非水性懸濁液、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルション）、液剤およびエリキシル剤；患者への非経口投与に適した液体剤形；ならびに患者への非経口投与に適した液体剤形を提供するために再構成することができる無菌固体（たとえば結晶質または非晶質固体）を含むが、これらに限定されない。
注射可能（たとえば静脈内）組成物は、許容可能な担体、たとえば水性担体中に懸濁した抗体または抗体-標的指向組成物の溶液を含むことができる。多様な水性担体のいずれか、たとえば水、緩衝水、0.4％食塩水、0.9％等張食塩水、0.3％グリシン、5％デキストロースなどを使用することができ、安定性を高めるための糖タンパク質、たとえばアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含んでもよい。多くの場合、規定濃度の緩衝食塩水（135〜150mM NaCl）が使用される。組成物は、生理学的条件を近似するための薬学的に許容可能な補助物質、たとえばpH調節剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレートおよびトリエタノールアミンオレエートなどを含有することができる。いくつかの態様において、抗体-標的指向組成物は、静脈内投与のためのキットとして製剤化されることができる。
たとえば関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内および皮下経路による非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を所期のレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができる水性および非水性の等張無菌注射液ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁液を含む。
薬学的製剤は、単位剤形でパッケージングまたは調製することができる。そのような形態において、製剤は、たとえば治療剤の用量または抗体の濃度にしたがって、適切な量の有効成分を含有する単位用量へと細分される。単位剤形は、パッケージングされた製剤であることができ、パッケージは、別々の量の製剤を単一用量または複数用量の密封容器、たとえばアンプルおよびバイアル中に含有する。組成物はまた、望むならば、他の適合性の治療剤を含有することもできる。
抗体（または抗体-標的指向組成物）は、静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内経路を含むがこれらに限定されない任意の適当な経路による注射または注入によって投与することができる。薬学的組成物の投与の例は、抗体を、4℃の注射用の無菌等張性食塩水溶液中10mg/mLで貯蔵し、患者への投与の前に、注射のために100mLまたは200mLいずれかの0.9％塩化ナトリウム中に希釈することを含む。抗体は、静脈内注入により、0.2〜10mg/kgの用量で1時間かけて投与される。他の態様において、抗体は、静脈内注入により、15分〜2時間の期間をかけて投与される。さらに他の態様において、投与手法は皮下ボーラス注射による。
抗体の用量は、患者に効果的な治療を提供するように選択され、体重1kgあたり0.1mg未満〜体重1kgあたり約25mgの範囲または患者1人あたり1mg〜2gの範囲である。いくつかの場合、用量は1〜100mg/kgまたは約50mg〜8000mg/患者の範囲である。投与は、抗体の薬物動態（たとえば、循環中の抗体の半減期）および薬力学応答（たとえば、抗体の治療効果の持続時間）に依存して、1日1回〜3ヶ月に1回の範囲であり得る適切な頻度で繰り返され得る。いくつかの態様において、インビボ半減期は約7〜約25日であり、抗体投与は週1回〜3ヶ月に1回の間で繰り返される。
投与は定期的であることができる。投与経路に依存して、用量は、たとえば、1、3、5、7、10、14、21または28日に1回もしくはより長い期間に1回（たとえば、2、3、4または6ヶ月に1回）投与することができる。いくつかの場合、投与はより頻繁、たとえば1日2または3回である。当業者によって理解されるように、治療の進行および任意の有害な副作用に依存して投与の量および頻度を調節するために、患者をモニターすることができる。
したがって、いくつかの態様において、さらなる投与は患者の進行に依存する。たとえば、患者は、投与と投与の間、モニターされる。たとえば、最初の投与または投与期ののち、腫瘍成長の速度、再発（たとえば術後患者の場合）または全身性の疾患関連症候、たとえば衰弱、痛み、悪心などに関して患者をモニターすることができる。
がんの処置の場合、抗体または抗体-標的指向組成物（たとえば、治療剤および／または診断剤を含む）は、1日約0.001mg/kg〜約1000mg/kgの初期投与量で投与し、時間とともに調節することができる。約0.01mg/kg〜約500mg/kgまたは約0.1mg/kg〜約200mg/kgまたは約1mg/kg〜約100mg/kg、約5〜約10mg/kgまたは約10mg/kg〜約50mg/kgの範囲の1日用量範囲を使用することができる。本明細書に記載されるインビボ異種移植の結果は、体重1kgあたり抗体5〜20mgの用量が腫瘍成長の劇的な減少に有効であることを示す。
投与量は、患者の要求、処置される状態の重症度、および用いられる標的指向組成物に依存して変化する。たとえば、投与量は、特定の患者において診断されたがんのタイプおよびステージを考慮して、経験的に決定することができる。本開示に関連して、患者に投与される用量は、時間とともに患者における有益な治療応答に影響を及ぼすのに十分であるべきである。用量の大きさはまた、当業者によって理解されるように、特定の患者における特定の標的指向組成物の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質および程度によっても決まる。
本明細書に記載される例および態様は、例示のためだけのものであり、それらを考慮して様々な変更または改変が当業者に示唆され、本出願の精神および趣旨ならびに特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。本明細書の中で引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる意味で参照により全体として本明細書に組み入れられる。
本明細書中で挙げられるすべての刊行物および特許出願は、各個の刊行物または特許出願が参照により本明細書に組み入れられることが明確かつ個別に示される場合と同じ程度に、参照により全体として本明細書に明示的に組み入れられる。
前記から、本発明の特定の態様が例示のために本明細書に記載されたが、発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変更を加え得ることが理解されよう。したがって、本発明は、特許請求の範囲による以外、限定されない。
以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定のために提供されるものではない。
VI.実施例
QuickChange II部位特異的突然変異誘発キット（Agilent）を使用して、CLL-1抗体（HuM31）重鎖の選択された位置（EUナンバリング）でシステイン残基を改変して、対応するCYSMAB変異体を作製した。システイン置換の確実性をDNA配列決定によって確認した。CYSMAB軽鎖および重鎖構築物をHEK-293細胞中に一過的にトランスフェクトした。発現したCYSMAB変異体を、MabSelectsuReビーズを使用して精製し、様々なCLL-1機能アッセイによってさらに特性決定した。
実施例1―コンジュゲーション
重鎖定常領域の選択された残基でのコンジュゲーションを実証するために、抗体−蛍光体コンジュゲートを創製した。以下の手順を使用した：精製したHuM31またはCYSMAB変異体（それぞれ1.5mg）をPBSに対して4℃で一晩透析した。抗体をMabSelectsuReビーズ200μLとともに室温で1時間インキュベートした。各回2mL PBSでビーズを3回洗浄したのち、2mM DTT中の抗体を、150mM NaCl-50mM Tris（pH8.0）緩衝剤中、室温で一晩還元した。ビーズを3回洗浄したのち、抗体を、1mMデヒドロアスコルビン酸（DHAA）中、室温で3時間再酸化させた。抗体を3回洗浄し、10モル過剰のAlexa488-C5-マレイミドと室温で2時間コンジュゲートさせた。ビーズを3回洗浄し、Alexa488コンジュゲート抗体を0.1Mグリシン（pH2.7）500μLで溶出した。NanoDrop 2000を使用することにより、抗体濃度およびAlexa488コンジュゲーション効率（抗体1つあたりAlexa488の数）を測定した。
コンジュゲーションが日付または蛍光体の量によって変化しなかったことを実証するために、コンジュゲーション手順を異なる日付および異なる濃度で繰り返した。結果（それぞれ図5および図6）は、コンジュゲーション比（たとえばDAR、FAR）がいずれも手順においてあまり変化しないことを示す。
アミノ酸残基および蛍光体−抗体比（「FAR」）を含むコンジュゲーションの結果が図7〜9に報告されている。
図7は、全部で45のコンジュゲーションのうち、21（47％）が高いコンジュゲーション（＞2）を示し、7つ（16％）が中程度のコンジュゲーション（1〜2）を示し、17（38％）が低いコンジュゲーション（＜1）を示したことを示す。
図8は、全部で20のコンジュゲーションのうち、10（50％）が高いコンジュゲーション（＞2）を示し、1つ（5％）が中程度のコンジュゲーション（1〜2）を示し、9つ（45％）が低いコンジュゲーション（＜1）を示したことを示す。
実施例2―特異性ELISA
図1：HuM31にコンジュゲートされたAlexa488（A488）（HuM31-A488 AFC）を特異的に検出するためのELISAアッセイを開発した。ヒト血漿中のHuM31にコンジュゲートされたA488を検出するために、3つの異なるフォーマットのELISAを設計した。非コンジュゲートHuM31、HuM31-A488およびIgG-A488をこれらの3つのELISA法で試験した。結果は、ELISAフォーマット＃1が最良のSN比（信号対雑音比）を有することを示した。そして、フォーマット＃2および＃3は、より高いバックグラウンド結合を示した。フォーマット＃1 ELISAをさらに使用してHuM31-A488を検出した。
図2a：ELISAアッセイの特異性。フォーマット＃1のELISA法を使用して、使用した対照試料（IgG（アイソタイプ対照）、IgG-A488 AFC、トラスツズマブおよび非コンジュゲートHuM31に対する）の代わりに、HuM31-A488および部位特異的CYSMAB-A488コンジュゲートを特異的に検出した。結果は、このELISA法だけがHuM31-A488および部位特異的CYSMAB-A488コンジュゲートを検出することを実証した。対照的に、対照：アイソタイプヒトIgG、トラスツズマブ、HuM31またはIgG-A488コンジュゲートは結合を示さなかった。
図2b：ELISAアッセイにおけるヒト血漿干渉の試験。最適なELISA条件下、1％ヒト血漿の存在は、抗A488抗体へのHuM31-A488コンジュゲートの結合をわずかに増強しただけであった。したがって、ELISA法は、ヒト血漿に事前に曝露された抗体コンジュゲート試料を分析するためにも使用することができる。
実施例3―HuM31-A488コンジュゲート（AFC）の安定性
本開示のAFCのヒト血漿中の安定性をヒト血漿中でのインキュベーションによって試験した。AFC（50μg/mL）を、プールされたヒト血漿またはPBS中0.5％BSAに添加した。次いで、各試料を5％CO2とともに37℃でインキュベートしたのち、0、24、48、72および96時間の時点で-80℃に移した。試料を試料希釈剤（0.5％BSA、0.05％Tween 20、5mM EDTA、0.35M NaCl、0.25％CHAPSおよび0.2％BGGを含有するPBS緩衝剤）中、1：5000に希釈した。次いで、様々な時点で試料をELISAによってアッセイした。
ELISA手順：PBS中のCLL-1細胞外ドメインタンパク質（1μg/mL）を96ウェルプレートにコートし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを0.1％Tween 20 PBSで3回洗浄したのち、0.1％Tween 20 PBS中1％BSAによって室温で1時間ブロックした。PBS中0.1％Tween 20で6回洗浄したのち、連続希釈されたAlexa488コンジュゲートヒトM31およびその対照をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS中0.1％Tween 20で洗浄した。ウサギ抗Alexa488二次抗体（1μg/mL）をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。0.1％Tween 20 PBSで6回洗浄したのち、プレートをHRPコンジュゲートヤギ抗ウサギFcポリクローナル抗体によって1：50,000希釈で検出した。次いで、各時点のOD値を時間0でのOD値と比較することによってパーセント（％）値を評価した。
試験した試料の5日後の安定性が図9および10に示されている。
図9および10は、試料58、64、73、81、86および206が、5日間のインキュベーション後に＞85％の安定性を有することを示す。
実施例4―HuM31-ビオチンコンジュゲートの安定性
CYSMABをHPDP-ビオチンおよびBMCC-ビオチンとコンジュゲートさせることによってHuM31-ビオチンコンジュゲートを作製した。
精製ヒトM31またはCYSMAB変異体（それぞれ1.5mg）をPBSに対して4℃で一晩透析した。抗体をMabSelectsuReビーズ200μLとともに室温で1時間インキュベートした。各回2mL PBSでビーズを3回洗浄したのち、2mM DTT中の抗体を、150mM NaCl-50mM Tris（pH8.0）緩衝剤中、室温で一晩還元した。ビーズを3回洗浄したのち、抗体を、1mM DHAA中、室温で3時間再酸化させた。抗体を3回洗浄し、10モル過剰のHPDP-ビオチンまたはBMCCビオチンと室温で2時間コンジュゲートさせた。ビーズを3回洗浄し、ビオチンコンジュゲート抗体を0.1Mグリシン（pH2.7）500μLで溶出した。抗体濃度およびビオチンコンジュゲーション効率を、それぞれNanoDrop 2000およびELISAベースのアッセイを使用することによって測定した。
ヒト血漿中のADCの安定性を測定するためのELISAアッセイを開発した：PBS中のCLL-1細胞外ドメイン（1μg/mL）を96ウェルプレートにコートし、4℃で一晩インキュベートした。ELISAプレートを洗浄緩衝剤（PBS中0.1％Tween 20）で3回洗浄したのち、PBS中0.1％Tween 20中1％BSAで室温で1時間ブロックした。プレートを洗浄緩衝剤で6回洗浄したのち、連続希釈されたHuM31-ビオチンおよびその対応する対照試料をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝剤で6回洗浄したのち、ストレプトアビジン-HRPコンジュゲート（1：100,000希釈で使用）を使用して検出した。
5日後のHPDPおよびBMCC連結抗体コンジュゲートの安定性が図11に報告されている。
ヒト血漿中のビオチン-BMCCコンジュゲート試料の安定性
図11は、試料V266、V303、T307、G316、Y436、L441、H285、R301、Q295が、5日間のインキュベーション後、＞80％の安定性を有することを示す。
実施例5―親和性試験
システイン置換CLL-1 CYSMABに対する結合親和性は、それらの裸の非コンジュゲート相対物に対する比較結合親和性に関して試験することができる。簡潔にいうと、ビオチン化CLL-1（25μg/mL）をストレプトアビジンセンサーチップ上に22℃で2時間ロードする。グローバル1：1カーブフィッティングを使用するFortebioまたはBIAcore分析（10、30および90μg/mL）のいずれかにより、抗体ごとに3つの異なる濃度でAb-Ag解離曲線を生成した。
実施例6―AML細胞株およびAML患者試料への結合
システイン置換CYSMABは、ヒトCLL-1を発現する組換え293細胞および2つのAML細胞株、HL60およびOCI AML-5への比較結合に関して試験することができる。抗体結合を有する生細胞の割合は、任意の適当な手段、たとえばFACSによって検出することができる。また、結合の一貫性、すなわち患者間の変動を評価することもできる。
実施例7―抗体−薬物コンジュゲート（ADC）アッセイ
抗体−薬物コンジュゲート（ADC）アッセイは、適当なAML細胞株（たとえばHL60およびOCI AML-5）およびCLL-1を発現する組換え293細胞に対して実施することができる。簡潔にいうと、細胞を様々な濃度のADCとともに37℃で72〜120時間インキュベートする。細胞生存率は、IC50値を決定するためのCellTiter-Glo（Promega）発光細胞生存率アッセイによって測定される。
実施例8―AML腫瘍成長のインビボ阻害
CLL-1 CYSMAB ADCをインビボ効能に関して評価することができる。適当な研究は、（1）マウスにおけるCLL-1陽性HL60 AMLヒト細胞株を利用する皮下（SC）腫瘍移植および成長モデル、ならびに（2）CLL-1陽性HL60またはOCI AML-5ヒトAML細胞株を利用する同所（骨髄、血液、脾臓およびリンパ節）腫瘍移植および増殖モデルを含む。
確立されたSC HL60研究は、以下のように実施することができる。動物（nu/nuマウス）に5×106個または107個のHL60細胞を接種した。腫瘍を有するマウスを、各群（8匹／群）中、100〜150mm3の平均腫瘍体積に無作為化した。CLL-1 CYSMAB ADCまたはIgG対照ADCを1匹あたり5〜200μgの用量で腹腔内投与する。平均腫瘍体積を時間（投与後）とともにプロットした。
OCI AML-5細胞同所研究は以下のように実施することができる。免疫不全NSGマウスを5つの群（1群あたり8匹）に分割する。5×106個または107個のOCI AML-5細胞の静脈内接種後（6日目）、CLL-1 CYSMAB ADCまたはIgG対照ADCを動物1匹あたり5〜200μgの用量で腹腔内投与する。次いで、次の2週間、週に1回、さらなる抗体用量をマウスに投与する。研究は、OCI AML-5細胞の投与から4週間後に終了する。
実施例9―ADCアッセイにおけるAML幹細胞に対する特異性
本開示にしたがって調製されたCLL-1 CYSMAB ADCの特異性は、ADCアッセイにおける特異的死滅に関して試験することができる。初代患者AML細胞または正常なCD34陽性造血幹細胞をヒト対象の骨髄から単離し、軟寒天コロニー形成アッセイ用に播種する（細胞100,000個／プレート）。次いで、CLL-1 CYSMAB ADCの存在下、細胞を14日間インキュベートする。ADCは、AML幹細胞のクローン原性増殖の選択的な特異的阻害を生じさせることができるが、正常なHSCが影響を受けるべきではない。コンジュゲーションの効果を裸の親抗体とで比較することができる。負の対照は、処理されない、または無関係のIgG-ADCで処理される。
実施例10―様々な薬物コンジュゲートの安定性
以下のような多様な抗体−薬物コンジュゲートを作製した。
Figure 2018523471
すべてのコンジュゲートは、以下の可変領域：
Figure 2018523471
を含む軽鎖可変領域配列、および以下：
Figure 2018523471
を含む重鎖可変領域配列を有する抗CLL-1抗体とで作製した。以下のようなイソキノリジノベンゾジアゼピンダイマーへのシステイン反応性リンカーを介して、抗体を表記システイン置換にコンジュゲートさせた。
Figure 2018523471
（「D202」と称す。）
PBS中のヒト化cys置換抗CLL1抗体を、Millipore 15mL、30kDa装置を使用する分子量カットオフろ過（MWCO）2サイクルを介して、ホウ酸緩衝剤（50mM、pH8.5、1mMジエチレントリアミン五酢酸（DTPA））中に交換した。抗体（5.0mg/mL、ホウ酸緩衝剤（50mM、pH8.5、1mM DTPA））の新たな溶液にジチオトレイトール（DTT）（33μL、50.0当量、50mM）の溶液を加え、得られた溶液を一晩静かに振とうした。
鎖間ジスルフィド架橋の完全な還元および置換システインシステイン／グルタチオン付加物の除去を、以前に記載されているrp-LCMS（Junutula et al., 2008, Nature Biotech, 26, 925-932）によって確認した。交換緩衝剤としてPBSを使用して、Millipore 15mL、30kDa装置を使用する分子量カットオフろ過（MWCO）3サイクルを介してDTTを溶液から除去した。完全に還元された抗体の5mg/ml溶液にデヒドロアスコルビン酸（dhAA）の溶液（33μL、50.0当量、50mM）を添加した。得られた溶液を3時間静かに振とうした。再酸化をrp-LCMSによってモニターした。ひとたび再酸化が完了したとみなされたならば、反応混合物をプロピレングリコールで50％v/vまで希釈し、D202をDMSO中の溶液（10.0当量、DMSO中10mM）として添加した。
反応物を周囲温度で1時間かく拌した。次いで、混合物を活性炭によって周囲温度で1時間処理した。活性炭をろ過によって除去した。次いで、コンジュゲートを、Millipore 15mL、30kDa装置を使用する分子量カットオフろ過（MWCO）複数サイクルを介してPBS中に交換した。次いで、溶液を無菌ろ過に付して所望のコンジュゲートを得た。
30μg/mLから出発して、C6-CYSMAB-D202 ADCおよびC0-D202を、細胞結合緩衝剤（2％ウシ胎仔血清を含むPBS）を使用する8ポイント分の6倍連続希釈に付した。HL60、OCI-AML5およびOCI-AML5-CLL1ノックアウト細胞を染色培地によって洗浄し、5％正常マウス血清とともに氷上で30分間インキュベートしてFcγ受容体をブロックした。次いで、細胞を、96ウェルプレート中、1ウェルあたり0.le6細胞の密度で分与し、培地を遠心分離によって除去した。細胞プレートを100μL ADC試料希釈物とともに氷上で30分間インキュベートし、その後3回洗浄し、氷上で30分間、二次抗体としてのAlexa-488コンジュゲートヤギ抗ヒトIgGでさらに染色した。次いで、細胞を3回洗浄し、細胞生存性色素としてヨウ化プロピジウムを使用して、100μL細胞結合緩衝剤中に再懸濁させた。細胞試料へのADC結合をFlowjoによるフローサイトメトリーおよびデータ分析によって分析した。Graphpad Prizm 6を使用してFITCシグナルのMFI（Geom. Mean）をプロットした。図12A〜Cを参照すること。
コンジュゲートの安定性を以下のように測定した。0日目に、C6-CYSMAB-D202 ADC試料をヒト血漿中に200mg/mLまで希釈する。ヒト血漿を希釈剤として使用して9ポイント分の6倍連続希釈を実施する。試料希釈プレートを密封し、試料D5として、CO2インキュベータ中、37℃で5日間インキュベートする。この血漿希釈および37℃インキュベーション手順を2、4、5日目に繰り返すことにより、試料D3、D1およびD0を調製する。5日目に、5mLの試料DO、D1、D3およびD5を95mLのOCI-AML2およびHL60細胞に加えることによって細胞死滅アッセイをセットアップし、37℃で5日間インキュベートし、Cell-Titer-Gloによって細胞生存率を定量する。
C6-CYSMAB-D202 ADC試料希釈を、96ウェルプレート中、ヒト血漿を希釈剤として使用して実施し、血漿安定性試験のためにCO2インキュベータ中、37℃でインキュベートした。200μg/mL ADCから出発する9ポイント分の6倍連続希釈を0日目、2日目、4日目および5日目に実施し、密封された試料希釈プレートおよびADCなし血漿のみの対照を、5％CO2インキュベータ中37℃で5、3、1および0日間、それぞれ試料D5、D3、D1およびDOとしてインキュベートした。5日目に、OCI-AML2およびHL60細胞を、20％ウシ胎仔血清（FBS）で補足された95μL Alpha-MEMおよびIMDM細胞培地中、細胞2,000個の密度で96ウェルプレートに播種し、DO、D1、D3、D5試料希釈プレートからの5μL試料で三重反復で処理した。次いで、アッセイプレートを、5％CO2インキュベータ中、37℃で5日間インキュベートした。CellTiter-Gloキット（Promega）を使用して生細胞（生存細胞の割合）をアッセイし、プレートリーダー（Molecular Device Spetramax M5）によって発光を計測した。結果を、ADCなし血漿のみの対照細胞に対する生存細胞の割合で表した。Graphpad Prizm 6を使用する非線形回帰によって個々の用量応答曲線および阻害薬物濃度（IC50）を導出した。
AML2、HL60細胞死滅に対するC6-CYSMAB-D202 ADCの安定性試験を以下の表に例示する。
Figure 2018523471

Claims (70)

  1. EUナンバリングでV266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436CおよびL441Cからなる群より選択される置換アミノ酸残基を含む、システイン置換免疫グロブリンポリペプチド。
  2. 免疫グロブリンポリペプチドがヒトIgG重鎖定常領域に由来する、請求項1記載のポリペプチド。
  3. IgGが、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4からなる群より選択されるアイソタイプである、請求項2記載のポリペプチド。
  4. アイソタイプがIgG1である、請求項3記載のポリペプチド。
  5. システイン置換をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  6. EUナンバリングでV266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436CおよびL441Cからなる群より選択される置換アミノ酸残基を含む、免疫グロブリンポリペプチド。
  7. 前記ヌクレオチド配列と機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項5記載の核酸分子。
  8. 発現ベクターに含まれる、請求項6記載の核酸分子。
  9. EUナンバリングでV266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436CおよびL441Cからなる群より選択される置換アミノ酸残基を含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、組換え細胞。
  10. システイン置換ポリペプチドを作製する方法であって、EUナンバリングでV266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436CおよびL441Cからなる群より選択される置換アミノ酸残基を含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組換え細胞を培養する工程を含む、方法。
  11. 重鎖定常領域中、EUナンバリングでV266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436CおよびL441Cからなる群より選択される置換アミノ酸残基を含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドを含む、システイン置換抗体。
  12. 重鎖定常領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgGアイソタイプに由来する、請求項10記載の抗体。
  13. κおよびλからなる群より選択される免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項10記載の抗体。
  14. 軽鎖がκである、請求項12記載の抗体。
  15. CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、チロシナーゼ、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、テロメラーゼ、HPV E6、HPV E7、EBNA1、BAGE、GAGEおよびMAGE A3 TCRSLITRK6、ENPP3、ネクチン-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、組織因子（TF）、CanAg、EGFR、αv-インテグリン、CD37、葉酸受容体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap 1、Napi2b、Lewis Y抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4またはエンドシアリン／CD248に結合する、請求項10記載の抗体。
  16. 可変軽鎖および可変重鎖を含み、
    （a）可変軽鎖がCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含み、さらに
    CDR-L1が
    Figure 2018523471
    であり、
    CDR-L2がLAS（SEQ ID NO:2）であり、
    CDR-L3が
    Figure 2018523471
    であり、
    （b）可変重鎖がCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含み、さらに
    CDR-H1が
    Figure 2018523471
    であり、
    CDR-H2が
    Figure 2018523471
    であり、
    CDR-H3が
    Figure 2018523471
    である、または
    （c）可変軽鎖がCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3をさらに含み、さらに
    CDR-L1が
    Figure 2018523471
    であり、
    CDR-L2が
    Figure 2018523471
    であり、
    CDR-L3が
    Figure 2018523471
    であり、
    （d）可変重鎖がCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3をさらに含み、さらに
    CDR-H1が
    Figure 2018523471
    であり、
    CDR-H2が
    Figure 2018523471
    であり、
    CDR-H3が
    Figure 2018523471
    である、請求項14記載の抗体。
  17. 請求項10〜17記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  18. 発現制御配列と機能的に連結されている、請求項17記載の核酸分子。
  19. 発現ベクターをさらに構成する、請求項18記載の核酸分子。
  20. 請求項19記載の核酸分子を含む、組換え細胞。
  21. 請求項1記載の組換え細胞を培養する工程を含む、抗体を作製する方法。
  22. 抗体を単離する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  23. 抗体中の置換アミノ酸残基（システイン）からリンカーを介して、薬物、放射性核種、蛍光体、ビオチン、RNA、抗生物質、タンパク質および検出可能な部分からなる群より選択される部分にコンジュゲートされている請求項1〜4または10〜15のいずれか1項記載の抗体を含む、抗体コンジュゲート。
  24. 薬物にコンジュゲートされている、請求項1記載の抗体コンジュゲート。
  25. 薬物が、単量体または二量体のベンゾジアゼピン誘導体、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、チューブリシン、クリプトフィシン、ピロロベンゾジアゼピン（PBD）ダイマー、インドリノベンゾジアゼピンダイマー、イソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー、α-アマニチン、トリコテン、SN-38、デュオカルマイシン、CC1065、カリケアミシン、エンジイン系抗生物質、タキサン、ドキソルビシン誘導体、アントラサイクリン、アザノフィド（azanofide）、およびそれらの立体異性体、同配体、類似体または誘導体からなる群より選択される、請求項1記載の抗体コンジュゲート。
  26. 薬物がイソキノリジノベンゾジアゼピンダイマーである、請求項1記載の抗体コンジュゲート。
  27. リンカーが薬物と共有結合されている、請求項22〜25のいずれか1項記載の抗体コンジュゲート。
  28. リンカーが、チオールと、マレイミド、ハライドおよびスルホニルから選択されるチオール反応性基との間の反応を介して抗体と結合されている、請求項22〜25のいずれか1項記載の抗体コンジュゲート。
  29. リンカーがジスルフィド結合を介して薬物と接続されている、請求項23〜25のいずれか1項記載の抗体コンジュゲート。
  30. ジスルフィド結合がピリジルジスルフィド部分である、請求項28記載の抗体コンジュゲート。
  31. リンカーが標的の微小環境中で切断可能である、請求項22〜25のいずれか1項記載の抗体コンジュゲート。
  32. 検出可能な部分にコンジュゲートされている、請求項22記載の抗体コンジュゲート。
  33. 検出可能な部分が、A488、BMCC-ビオチンおよびHPDP-ビオチンからなる群より選択される、請求項31記載の抗体コンジュゲート。
  34. 請求項10〜32のいずれか1項記載の抗体またはコンジュゲート抗体と、アジュバントとを含む、組成物。
  35. 薬学的に許容可能である、請求項1記載の組成物。
  36. 関心対象の細胞の存在を検出する方法であって、
    （a）細胞と、該細胞に結合することができる有効量の、請求項1〜4または10〜15のいずれか1項記載の抗体とを、接触させる工程、および
    （b）該細胞への該抗体の結合を検出する工程
    を含み、該結合が該関心対象の細胞を示す、方法。
  37. 関心対象の細胞がCLL-1を発現する、請求項1記載の方法。
  38. 抗体が検出可能な部分にコンジュゲートされている、請求項1記載の方法。
  39. 疾患を診断する方法であって、
    （a）個体からの生物学的試料を、病変細胞に結合することができる有効量の、請求項1〜4または10〜15のいずれか1項記載の抗体と接触させる工程；および
    （b）病変細胞への該抗体の結合を検出する工程
    を含み、結合が該疾患の存在を示す、方法。
  40. 抗体が検出可能な部分にコンジュゲートされている、請求項1記載の方法。
  41. 疾患ががんであり、抗体が腫瘍関連抗原またはがん幹細胞関連抗原に結合する、請求項1記載の方法。
  42. 腫瘍関連抗原またはがん幹細胞関連抗原がCLL-1である、請求項1記載の方法。
  43. 疾患が骨髄増殖性疾患である、請求項1記載の方法。
  44. 骨髄増殖性疾患が、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫および骨髄線維症からなる群より選択される、請求項42記載の方法。
  45. 細胞分裂を阻害する方法であって、細胞と、該細胞にとって細胞傷害性である薬物にコンジュゲートされている、該細胞に結合することができる少なくとも有効量の、請求項22〜32のいずれか1項記載の抗体コンジュゲートとを、接触させる工程を含む、方法。
  46. 細胞分裂の阻害が細胞死を生じさせる、請求項1記載の方法。
  47. 細胞が腫瘍またはがん幹細胞であり、抗体が腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原に結合する、請求項1記載の方法。
  48. 腫瘍またはがん幹細胞が骨髄増殖性疾患に由来する、請求項1記載の方法。
  49. 骨髄増殖性疾患が、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫、骨髄線維症からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  50. 腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原がCLL-1である、請求項1記載の方法。
  51. がんを処置する方法であって、治療有効量の、請求項22〜32のいずれか1項記載の抗体コンジュゲートを患者に投与する工程を含み、該抗体コンジュゲートが腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原に結合することができる、方法。
  52. がんが骨髄増殖性疾患である、請求項1記載の方法。
  53. 骨髄増殖性疾患が、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫および骨髄線維症からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  54. 腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原がCLL-1である、請求項1記載の方法。
  55. 単量体または二量体のベンゾジアゼピン誘導体、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、チューブリシン、クリプトフィシン、ピロロベンゾジアゼピン（PBD）ダイマー、インドリノベンゾジアゼピンダイマー、イソキノリジノベンゾジアゼピンダイマー、α-アマニチン、トリコテン、SN-38、デュオカルマイシン、CC1065、カリケアミシン、エンジイン系抗生物質、タキサン、ドキソルビシン誘導体、アントラサイクリン、アザノフィド、およびそれらの立体異性体、同配体、類似体または誘導体にシステインを介して連結された重鎖中のS156（Kabatナンバリング）に置換アミノ酸残基を含むシステイン置換免疫グロブリンポリペプチドを含む、抗体コンジュゲート。
  56. インドリノベンゾジアゼピンダイマーまたはイソキノリジノベンゾジアゼピンダイマーがリンカーを介して抗体に結合し、該リンカーがジスルフィド結合を介して薬物に接続されている、請求項54記載の抗体コンジュゲート。
  57. ジスルフィド結合がピリジルジスルフィド部分である、請求項54記載の抗体コンジュゲート。
  58. リンカーが標的の微小環境中で切断可能である、請求項54記載の抗体コンジュゲート。
  59. 請求項54〜57のいずれか1項記載の抗体またはコンジュゲート抗体と、アジュバントとを含む、組成物。
  60. 薬学的に許容可能である、請求項58記載の組成物。
  61. 細胞分裂を阻害する方法であって、細胞と、少なくとも有効量の、請求項54〜57のいずれか1項記載の抗体コンジュゲートとを、接触させる工程を含む、方法。
  62. 細胞分裂の阻害が細胞死を生じさせる、請求項60記載の方法。
  63. 細胞が腫瘍またはがん幹細胞であり、抗体が腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原に結合する、請求項60記載の方法。
  64. 腫瘍またはがん幹細胞が骨髄増殖性疾患に由来する、請求項62記載の方法。
  65. 骨髄増殖性疾患が、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫、骨髄線維症からなる群より選択される、請求項63記載の方法。
  66. 腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原がCLL-1である、請求項62記載の方法。
  67. がんを処置する方法であって、治療有効量の、請求項54〜57のいずれか1項記載の抗体コンジュゲートを患者に投与する工程を含み、該抗体コンジュゲートが腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原に結合することができる、方法。
  68. がんが骨髄増殖性疾患である、請求項66記載の方法。
  69. 骨髄増殖性疾患が、AML、CML、CMML、多発性骨髄腫、形質細胞腫および骨髄線維症からなる群より選択される、請求項67記載の方法。
  70. 腫瘍関連抗原またはがん幹細胞抗原がCLL-1である、請求項66記載の方法。
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