JP2017521084A - 微細藻類バイオマスから可溶性タンパク質を抽出する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、クロレラ属の微細藻類のバイオマスのタンパク質分離物を調製するための方法であって、次の工程：発酵により生産された微細藻類バイオマスを供給すること；間隙可溶性化合物を除去するためにこのバイオマスを洗浄し、このバイオマスを濃縮すること；エマルジョンを生成させるために、水平式ボールミル機型システムにおいて、洗浄され、濃縮されたバイオマスを機械的に粉砕すること；このようにして生成されるエマルジョンを破壊すること；脂質および細胞残屑を含有する画分から可溶性画分を分離するために三相分離を行うこと；可溶性タンパク質分離物を生成させるために、このようにして生成された可溶性画分の回収を行うこと；次いで前記タンパク質分離物のエバポレーション、低温殺菌および微粒子化を行うことを含むことを特徴とする、方法に関する。

Description

本発明は、微細藻類バイオマスから可溶性タンパク質を抽出する方法に関する。

本発明はまた、このようにして得られた微細藻類タンパク質分離物に関する。

クロレラはタンパク質および他の必須栄養素が豊富であることから、食物源となる可能性があることは当業者にとって周知である。

これらは、タンパク質を４５％、脂肪を２０％、炭水化物を２０％、繊維を５％および無機質およびビタミンを１０％含有するものとして記載されている。

このように、それらの存在量およびそれらのアミノ酸プロファイルを考えると、微細藻類タンパク質は、食品中のダイズまたはエンドウタンパク質に対する代替供給源と考えられている。

このタンパク質画分は、化粧品または医薬、工業においても機能性物質としても活用される。

しかし、前記画分中に望ましくない化合物（クロロフィルなど）が存在し、それらを含有する食品組成物の色、風味および構造の望ましくない変化につながるため、微細藻類タンパク質の食品用途における開発は重要なものではなかった。

食品用途におけるそれらの可能性を向上させるため、およびまたそれらの商業的価値を向上させるために、これらのタンパク質を、その分子構造に影響を及ぼすことなく、微細藻類から抽出しなければならない。

したがって、溶解性が高く、良好な技術的および機能的特性を有するタンパク質を分離するために「ソフトな」抽出技術が必要であるが、微細藻類の細胞壁、特に緑色微細藻類の細胞壁が硬いことにより、細胞内タンパク質の抽出および完全性が妨げられるため、基本的に、「ソフトな」抽出技術とは相容れないものである。

それどころか、このように、微細藻類の細胞壁を破壊するために、慣習的に「ハードな」物理学的または化学的条件が使用される。

したがって、多くの研究によって、有機溶媒型または高圧ホモジナイズ型の抽出技術が提案されている。

しかし、これらの技術的選択において、これらの方法の殆どが分析目的のために開発されたものであるか、またはタンパク質加水分解物を生成する酵素消化の基質を提供することが意図されたものであるため、タンパク質の変性が厄介なものであるとは考えられなかった。

しかし、細胞成分の完全性を保持する有効な崩壊方法は、収率だけでなく、抽出される生成物の品質も最大化すべきである。

言い換えると、細胞壁の最適化された崩壊のための方法は、例えば：
− 標的生成物の化学的汚染、
− 使用する破壊エネルギーが高すぎること
を回避しなければならず、後者は対象の細胞内分子の不可逆的変性または分解を引き起こす可能性がある。

さらに、大規模生産に対して、この規模に転換可能であるプロセスを選択することが重要である。

最終的に、この細胞崩壊工程の導入は容易でなければならず、後続の方法／処理工程に対して負の影響を与えてはならない。

これらの制限は全て、崩壊方法の効率および、さらにそのエネルギー消費に影響を与える。

これは、ビーズミル技術が好ましい理由であるが、それは、ビーズミル技術が、細胞内タンパク質をそれらの天然型で放出するのに効率的であると考えられるからである。

ビーズミルでは、細胞を小さな球状粒子とともに懸濁液中で撹拌する。細胞の破壊はせん断力、ビーズ間のミリングおよびビーズとの衝突により生じる。

適切なビーズミルの記載は、例えば、米国特許第５３３０９１３号明細書により与えられる。これらのビーズは、細胞の内容物が細胞から放出されるように細胞を破壊する。次に、元の細胞より小さな大きさの粒子の懸濁液が「水中油型」エマルジョンの形態で得られる。

このエマルジョンは、一般に微粒子化され、水が除去されるが、しかし、細胞残屑、間隙可溶性化合物および油状物質から構成される不均一な混合物を含有する乾燥粉末が残る。

これらの細胞崩壊技術の使用において解決が困難であるのは、（膜残屑、糖、繊維および脂肪の排除に対して）細胞内の内容物を単独で単離すること、および特にタンパク質負荷の品質の保全である。

テトラセルミスｓｐ属（ｇｅｎｕｓ Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ）の微細藻類の場合、Ａｎｊａ Ｓｃｈｗｅｎｚｆｅｉｅｒら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１０２，９１２１−９１２７）は、次の工程：
− ビーズミルによる細胞崩壊、
− 粉砕された微細藻類懸濁液の遠心分離、
− 上清の透析、
− イオン交換樹脂の通過、
− 溶出物の透析、
− 変色、次いで
− 洗浄および再懸濁
を含む、単離され、汚染物質（着色物質など）が除去された、タンパク質のアミノグラムの溶解度および品質を保証する方法を提案した。

しかし、（２４ｇのバイオマスを処理するための）この実験室レベルの方法は、工業的規模にスケールアップすることができず、完全なバイオマスを回収するためには、むしろビーズミル法が使用される。

さらに、この方法は、それらのバイオマス中に僅かではない脂質含量を含有する微細藻類（例えばクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）中の脂質含量は１５％超である）に適していない。

実際に、細胞壁のこの「比較的ソフトな」破壊の後でさえも、粉砕された細胞物質は比較的安定な複合型「水中油型」エマルジョンの形態である。

したがって、細胞成分は、溶媒によるかまたは機械的に、この段階でむしろ慣習的に抽出されるが、それらの完全性は損なわれている。

先行研究により提案され、さらに出願会社により試験された第１の解決策は、エマルジョンの不安定化を試みるために、エバポレーションと機械的粉砕を組み合わせ、次いで遠心分離により脂肪画分を分離することにある。

しかし、分離工程（基本的なクリーム化）の質が低いことにより、この相分離法は非常に非効率である。

しかし、この段階で推奨されるエタノールの添加（２０〜３０％／原料）によってエマルジョンの不安定化が促進されるにもかかわらず、低収率でも、５０％のオーダーの脱脂が可能になるだけである。

さらに、機械的方法は、脂質画分がタンパク質／多糖類マトリクスに結合している場合は、特に困難であるかまたは実施不可能でさえある。

別の解決策は中性溶媒の使用を提案する。しかし厳しい制約がある（品質、安全性、規制など）。

本発明の課題
この結果、機械的粉砕により放出される、対象の微細藻類の細胞成分を抽出して安定化するための技術が不十分であるということである。

出願会社は、微細藻類細胞を機械的に粉砕する方法を、アルカリ処理および酵素処理の群から選択される処理により生成された脂質画分を破壊するための工程と組み合わせ、続いて、遠心分離工程を行うことにより、先行技術から知られている方法に代わる方法を提案することによってこの要求が満たされることを見出した。

次に、精密ろ過によって脱脂した可溶性画分を清澄化し、続いて限外ろ過を行ってタンパク質分離物を得る。

したがって、本発明は、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｇｅｎｕｓ）の微細藻類のバイオマスからタンパク質分離物を調製するための方法であって、次の工程：
− 発酵により産生された微細藻類バイオマスを提供すること、
− 間隙可溶性化合物を除去するためにこのバイオマスを洗浄し、濃縮すること、
− エマルジョンを得るために、水平式ビーズミル型システムにおいて、洗浄され濃縮されたバイオマスの機械的粉砕を行うこと、
− このようにして得られたエマルジョンを破壊すること、
− 脂質および細胞残屑を含有する画分から可溶性画分を分離するために三相分離を行
うこと、
− 可溶性タンパク質分離物を得るために、特に精密ろ過によって、可溶性画分から残留不溶性物質を除去することにより、このようにして得られた可溶性画分の回収、および任意選択により清澄化を行うこと、
− 可溶性タンパク質分離物を得るために、５ｋＤａ未満、好ましくは１〜５ｋＤａのカットオフ閾値を有する膜上で、清澄化可溶性画分の任意の限外ろ過を行うこと、
− 任意選択によりｐＨ７で中和すること、
− このタンパク質分離物のエバポレーション、低温殺菌および微粒子化を行うこと
を含む、方法に関する。

微細藻類バイオマスの選択
好ましくは、クロレラ属の微細藻類は、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、具体的にはクロレラ・プロトセコイデスである。

ある特定の実施形態において、株は、クロレラ・プロトセコイデス（株ＵＴＥＸ ２５０−Ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｔ ｔｈｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ａｔ Ａｕｓｔｉｎ−ＵＳＡ）である。

別の特定の実施形態において、株は、クロレラ・ソロキニアナ（株ＵＴＥＸ１６６３−Ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ａｔ Ａｕｓｔｉｎ−ＵＳＡ）である。

従属栄養条件下および光がない状態での培養の結果、従来、乾燥細胞の４５〜７０重量％のタンパク質含量（窒素含有量Ｎ×６．２５を測定することにより評価）を有するクロレラバイオマスが生産される。

以下に例示するように、この培養は２段階で実施される：
− 撹拌しながら２８℃で７２時間、グルコースおよび酵母抽出物を含有する培地中で前培養を行うこと、次いで
− 撹拌しながら、アンモニア水でｐＨ６．５に調整して、２８℃で３６時間超、グルコースおよび酵母抽出物中でバイオマスそれ自身の生産のために培養を行うこと
で行われ、この結果、乾燥細胞の５２重量％程度のタンパク質含量（Ｎ×６．２５で評価）を有する８０ｇ／Ｌのバイオマスが得られる。

次いで、固液分離により、フロントまたはタンジェンシャルろ過により、またはさらに当業者にとって公知の任意の手段により、バイオマスを回収する。

次いで、有利に、出願会社は、間隙可溶性化合物を除去するために、バイオマスの連続的な（遠心分離による）濃縮／希釈によって、バイオマスを洗浄し、濃縮することを推奨する。

工業的規模で、１段階または２段階での遠心分離によるインライン希釈および分離が有利に選択される。

本発明の目的のために、「間隙可溶性化合物」という用語は、発酵培地の可溶性の有機汚染物質全て、例えば、塩、残留グルコース、重合度（またはＤＰ）が２または３のオリゴ糖またはペプチドなどの水溶性化合物を意味するものとする。

次いで、間隙可溶性化合物がこのようにして精製されたこのバイオマスを、１５〜３０重量％の乾燥物質、好ましくは２０〜３０％の乾燥物質になるように選択的に調整する。

本発明の方法の残りの部分については、このようにして得られたバイオマスをそのまま使用してもよいし、または、可溶性ペプチドの内容物をそこから放出させるために、熱透過性処理してもよい（高温短時間またはＨＴＳＴ法による−出願会社によっても開発され、そのまだ公開されていない出願の１つで保護されている）。

続く次の工程によって、このバイオマスの残留タンパク質を抽出することができる。

バイオマス粉砕
出願会社は、（水平式）ビーズミル技術を使用することを推奨する。

とりわけ、粉砕は、有利に、出願会社が開発し、その、まだ未審査の出願の１つにおいて保護されている方法に従い行うことができ、この方法において、
− ケイ酸ジルコニウムビーズは２〜３．５ｋｇ／Ｌの見かけ密度を有し、
− 粉砕チャンバーの充填率は８０％以上である。

粉砕は、例えば一連の連続したパスによって、連続モードで行う。

粉砕しようとする微細藻類の密度は、２５０ｇ／Ｌ未満のレベルで選択される。

粉砕が終了すると、エマルジョンが得られる。

エマルジョンの破壊およびその成分の分離
対象のペプチドまたはポリペプチド画分をそこから抽出するためのエマルジョンの成分の分離は、細胞粉砕により生じるエマルジョン（脂質、タンパク質−ペプチドおよびポリペプチド−および細胞残屑の複合混合物）の破壊／不安定化を必要とする。

エマルジョンのこの破壊／不安定化は、
− 酵素を用いた前消化による、特に特異的なプロテアーゼよる、極性溶媒を用いた処理による、および／またはエマルジョンのタンパク質画分を標的とする制御されたアルカリ処理によるかの何れかで、
− またはｐＨおよび温度を調整することにより、極性溶媒を用いた処理により、および／またはエマルジョンの脂質画分との境界面を標的とする酵素、特にセルラーゼ型酵素を用いた消化により、
促進される。

したがって、選択された特定の処理（ｐＨの設定、溶解酵素の作用など）を促進する均一混合を可能にしながら乳化を制限するために、低せん断撹拌モジュールを備えた撹拌反応容器中で、粉砕された細胞物質を適切な状態に調整する。

例えば、酵素的手段によって混合物中のタンパク質画分を処理することにより、例えば塩基性プロテアーゼにより、エマルジョンを不安定化することを目的とする処理の場合、エマルジョンの温度およびｐＨをそのプロテアーゼに対する反応条件に調整する：
− 温度は、３０℃超、好ましくは６０℃程度の値に調整し、
− ｐＨは、７より大きい値、好ましくは８程度（または、ｐＨの作用のみ利用する場合、さらに任意選択により１０程度）に調整する。

反応の持続時間は２〜８時間である。

溶解の終わりに、エマルジョンの不安定化剤として５％（ｖ／ｖ）を超えるエタノールを反応混合物に添加することができる（水中油エマルジョンの場合）。

このようにして不安定化されたエマルジョンを三相分離によって、例えば、遠心分離によって、（部分的に）分割することができる。

したがって、３つの相：
− 上部の脂質クリーム、
− 水性／中間体（＝「未加工」の可溶性物質）可溶性化合物（および残留不溶性物質）相および
− 細胞残屑を濃縮しているペレット
が得られる。

可溶性画分は、基本的に、主要なタンパク質画分、可溶性糖、塩および残留脂質小球から構成される。

膜分離
ペプチドおよびポリペプチドを放出させるために、本発明の方法は、次に、好ましくは膜分画によって、対象のタンパク質を分離する。

したがって、出願会社は、３つの工程：
− このようにして得られた可溶性画分から残留不溶性物質を除去するために、精密ろ過によって、このようにして得られた可溶性画分の回収および清澄化を行うこと、
− カットオフ閾値が５ｋＤａ未満、好ましくは１〜５ｋＤａを有する膜上で清澄化された可溶性画分の限外ろ過を行うこと、
− 任意選択により、ｐＨを６〜８、好ましくは７に中和すること
でこのプロセスを行うことを推奨する。

これらの経路を利用することによって、可溶性ペプチドおよびポリペプチドの残留塩および糖を精製することが可能になる。

ｐＩでの沈殿
あるいは、対象のペプチドおよびポリペプチドを分離するために、３つの工程：
− 媒地のｐＨを４〜５の値に調整することによって、タンパク質をそれらのｐＩで沈殿させ、
− 沈殿したタンパク質を回収するために、遠心分離または精密ろ過を行い、
− ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７で水に溶解すること
でこのプロセスを実施する選択を行うことができる。

本発明の方法に従い、後の２つの工程により、８０％超、好ましくは９０重量％超のタンパク質含量を有するタンパク質分離物を得ることが可能になるものの、これらは、それらの実施方法によって、性質が異なる組成物をもたらすことに注目すべきである。

粉末形態の分離物の取得
このようにして得られた可溶性形態のタンパク質分離物は、
− エバポレーションにより濃縮し、
− 低温殺菌し、最終的に、
− 微粒子化することができる。

本発明は、例示的であり非限定的であるものとされる次の実施例からより明確に理解されよう。

実施例１：流加発酵によるクロレラ・プロトセコイデスの産生
使用株はクロレラ・プロトセコイデスＵＴＥＸ２５０である。
前培養：
− ２Ｌ三角フラスコ中の５００ｍＬの培地；
− 培地の組成（ｇ／Ｌ）：

培養は次の条件下で行う：持続時間：７２時間；温度：２８℃；撹拌：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）。

次に前培養物を３０Ｌのザルトリウス型発酵槽に移す。

バイオマス生産のための培養：
培地は次のとおりである：

接種後、発酵槽の初期体積（Ｖｉ）を１７Ｌに調整する。これを最終的におよそ２０〜２５Ｌの体積にする。

発酵を実施するためのパラメーターは、次の通りである。

グルコースの残存濃度が１０ｇ／Ｌを下回ったときに、発酵槽中でグルコース含量を０〜２０ｇ／Ｌに維持するために、およそ８００ｇ／Ｌの濃縮溶液形態のグルコースを導入する。

結果
４０時間後に、５２％のタンパク質を含有する８０ｇ／Ｌのバイオマスが得られる。

実施例２．クロレラ・プロトセコイデスバイオマスの粉砕および可溶性画分の回収−ペプチドおよびポリペプチド画分の処理によるエマルジョンの破壊
実施例１に従って得られたバイオマスを洗浄し、乾燥物質含量が２２０ｇ／Ｌになり、
９０％超の純度（総乾燥物質に対するバイオマスの乾燥物質の比率によって定義される純度）になるように遠心分離によって濃縮する。

次いでケイ酸ジルコニウムビーズ（直径０．６ｍｍ、見かけ密度２．４）を用いてビーズミル（水平型ビーズミル）によってこれを粉砕する。

次いで、粉砕されたバイオマスをマリン・インペラー（ｍａｒｉｎｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）およびバッフルを備えた反応器中で撹拌する。温度を６０℃に調整し、水酸化カリウムでｐＨを８に調整する。これらの反応条件を６時間の持続時間にわたり維持しながら、セルラーゼと組み合わせた塩基性プロテアーゼを添加する。

次いで、３つの相：上部脂質クリーム、水性／中間体（＝「未加工」可溶性物質）可溶性化合物（および残留不溶性物質）相および細胞残屑を濃縮しているペレットを得ることが可能になる三相遠心分離でエマルジョンを遠心分離する。

精密ろ過によって未加工可溶性物質の画分を清澄化する。精密ろ過透過物「Ｐ１」は、５５％〜７０％の、ペプチドおよびタンパク質（総アミノ酸として表す）の力価を有し、次いで＜５ｋＤａカットオフ閾値を有する膜上で限外ろ過する。

このようにして得られた限外ろ過残余物「Ｒ２」は、８０％超の、５ｋＤａ以上の分子量を有するペプチドを含有する。

透過物「Ｐ２」は、分子量が５ｋＤａ未満のペプチドおよびオリゴ糖および残留塩を含有する。

次いで、次のものを得るために、（９３％のＮａＣｌ拒絶率を有する）逆浸透膜上でこの透過物「Ｐ２」を特にろ過することができる：
〇分子量が５ｋＤａ未満のペプチドおよびＤＰ２のオリゴ糖、例えばスクロースなどを含有する、残余物「Ｒ３」；および
〇ＤＰ１のオリゴ糖、塩、遊離アミノ酸および有機酸を含有する、透過物「Ｒ３」。

次いでタンパク質分離物「Ｒ２」を：
− 水酸化カリウムでｐＨ７に中和し、
− エバポレーションによって３５％乾燥物（ＤＭ）に濃縮し、
− 低温殺菌し、次いで
− 微粒子化する。

実施例３．クロレラ・プロトセコイデスバイオマスの粉砕および可溶性画分の回収−脂質画分の処理によるエマルジョンの破壊
実施例２におけるものと同じ順序に従い、マリン・インペラー（ｍａｒｉｎｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）およびバッフルを備えた反応器中で、粉砕バイオマスを撹拌する。ｐＨを調整せずに（自然には５〜６）、温度を５０℃に調整する。

これらの反応条件を６時間の持続時間にわたり維持しながら、このｐＨおよび温度範囲で最適な活性を有するセルラーゼを添加する。

反応終了時に、ｐＨを８に調整した後、三相に分離する。

操作の残りの部分は実施例２に記載する。

Claims (7)

1. クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｇｅｎｕｓ）の微細藻類のバイオマスからタンパク質分離物を調製するための方法であって、次の工程：
   − 発酵により生産された微細藻類バイオマスを提供すること、
   − 間隙可溶性化合物を除去するために前記バイオマスを洗浄し、濃縮すること、
   − エマルジョンを得るために、水平式ビーズミル型システムにおいて洗浄され濃縮されたバイオマスの機械的粉砕を行うこと、
   − このようにして得られた前記エマルジョンを破壊すること、
   − 脂質および細胞残屑を含有する画分から可溶性画分を分離するための三相分離を行うこと、
   − 可溶性タンパク質分離物を得るために、このようにして得られた前記可溶性画分を回収すること、次いで、
   − 前記タンパク質分離物のエバポレーション、低温殺菌および微粒子化を行うこと
   を含むことを特徴とする、方法。
2. 前記クロレラ属の微細藻類が、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、とりわけクロレラ・プロトセコイデスであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記エマルジョンが、酵素による前消化によって、極性溶媒で処理することによって、および／または前記エマルジョンのタンパク質画分を標的とする制御されたアルカリ処理によって破壊されることを特徴とする、請求項１および２の何れか１項に記載の方法。
4. 前記エマルジョンが、ｐＨおよび温度を調整することによって、極性溶媒で処理することによって、および／または前記エマルジョンの脂質画分との境界面を標的とする酵素消化によって破壊されることを特徴とする、請求項１および２の何れか１項に記載の方法。
5. 破壊されたエマルジョンの三相分離が遠心分離によって行われることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
6. 前記可溶性タンパク質分離物が、
   − 前記可溶性画分から残留不溶性物質を除去するために、精密ろ過により前記可溶性画分を清澄化すること、
   − ５ｋＤａ未満のカットオフ閾値を有する膜上で清澄化可溶性画分を限外ろ過すること、
   − 任意選択により、ｐＨ値を６〜８、好ましくは７に中和すること
   によって、前記可溶性画分から得られたことを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
7. 前記可溶性タンパク質分離物が、
   − 培地中のｐＨを４〜５の値に調整することによって、前記タンパク質をそれらのｐＩで沈殿させること、
   − 沈殿したタンパク質を回収するために、遠心分離または精密ろ過すること、
   − ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７で水に溶解すること
   によって、前記可溶性画分から得られたことを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。