JP2017511373A

JP2017511373A - 脂肪肝疾患の予防又は治療用組成物

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Publication number: JP2017511373A
Application number: JP2016563061A
Authority: JP
Inventors: キム・スンハ; キム・ヒョンジン; パク・ヒスル; アン・ソヒョン; ソン・ミンホ; チョン・ヒョギョン
Original assignee: LG Life Sciences Ltd
Current assignee: LG Chem Ltd
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2017-04-20
Anticipated expiration: 2035-04-17
Also published as: RU2664696C2; RU2016145066A3; US9814726B2; MX369571B; CN113967215A; RU2016145066A; KR102006247B1; BR112016024020A8; EP3132795A1; KR20150120877A; MX2016013575A; WO2015160213A1; EP3132795B1; CN106659722A; EP3132795A4; BR112016024020A2; ES2851006T3; US20170035776A1; JP6490097B2

Abstract

本発明は、有効成分として、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩を含有する脂肪肝疾患の予防又は治療用医薬組成物に関し、本発明に係る（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩は脂肪肝、肝炎症及び肝繊維化を効果的に抑制することができ、ＮＡＦＬＤ、特に、ＮＡＳＨの予防又は治療に適切に使用することができる。

Description

本発明は、有効成分として、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩を含む脂肪肝疾患、特に非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用組成物に関するものである。

非飲酒者から発生するアルコール性肝臓障害と類似の脂肪肝を包括する全ての脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ：non-alcoholic fatty liver disease）と称される。ＮＡＦＬＤ患者では、肝の脂肪酸合成が常に活性化されており、脂肪酸合成の活性化は、代謝症候群に起因する脂肪肝形成に関与する重要な因子である。

ＮＡＦＬＤは、一般に予後良好と思われる単純性脂肪肝と、単純性脂肪肝に持続的に炎症や繊維化が同伴し、予後不良と判断されている非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ：non-alcoholic steatohepatitis）とに大別され、ＮＡＳＨはＮＡＦＬＤ重症型の一つの形態とされている。

現在まで、２ヒット理論（Two hit theory）は、ＮＡＳＨの発病及び進展の主要病理機序として知られている。２ヒット理論とは、生活習慣や遺伝的な要因などの１次ヒット（First hit）によって優先的に単純性脂肪肝が生成され、脂肪肝状態で主に誘導される酸化ストレスや炎症性サイトカインなどの様々な要因が２次ヒット（Second hit）として作用して、ＮＡＳＨへと更に病気が進展するという理論である。

ＮＡＳＨ発病に関与する要因の一つとして知らされた代謝症候群に対する治療は大変重要であり、このような側面でインスリン抵抗性改善剤、抗酸化剤、高脂血症治療剤、肝保護剤、そしてアンジオテンシンＩＩ受容体の拮抗剤など代謝症候群に対する抑制効果のある薬剤が臨床的に試みられた。

しかし、現在までＮＡＳＨ治療のための臨床的証拠を有した薬物に対する開発はほとんどなされていないのが実状である。例えば、インスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾン（Pioglitazone）は、ＮＡＳＨ治療薬として非常に有望であったが、臨床三相で肝繊維化に対する実際的な改善効果が示されなかっただけでなく、骨折リスク、体重増加、心不全悪化及び発症などの副作用問題点によって治療薬としての判定基準を明確に満たすことができなかった。

したがって、非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療に対する研究の必要性が切実に求められている。

一方、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、ミトコンドリアに特異的な細胞壊死抑制剤であり、毒素やストレスによる細胞死の抑制効果、細胞生存能力の増大効果、坑酸化及び抗炎症効果を同時に示す物質である。

即ち、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、細胞壊死と関連した多様な疾患に効果的と知られているが、脂肪肝疾患の予防及び治療、そして、代謝症候群と関連しては全く知られていなく、これに対する研究も皆無の状態である。

本発明者は、ＮＡＳＨ動物モデルで、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン処理時、ＮＡＳＨの主な病理形態である脂肪肝、肝炎症、そして肝繊維化を効果的に改善させることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、ＮＡＦＬＤ、特にＮＡＳＨと関連して、有効成分として、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩を含む脂肪肝疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。

前述のような目的を達成するために、本発明では、有効成分として、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩を含有する脂肪肝疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。

ここで、脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患、特に非アルコール性脂肪肝炎又は単純性脂肪肝であってもよく、本発明に係る組成物は、肝脂肪蓄積を抑制して、脂肪肝から由来する酸化ストレス又は炎症性サイトカインを抑制して、肝炎症及び肝繊維化を抑制する効果がある。

本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、ＴＧ及びコレステロール含量の減少効果を示す写真及びグラフである（ｎ＝１０、ｐ＜０．００１ｖｓ溶媒）。本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、酸化ストレス及び脂肪酸化抑制効果を示す写真及びグラフである。本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、減少したミトコンドリア呼吸鎖の活性を向上させる効果を示す写真及びグラフである。本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、増加した炎症性サイトカインの発現及び大食細胞の活性を減少させる効果を示す写真及びグラフである。メチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ：Methionine choline-deficient）飼料を与えたｏｂ／ｏｂマウスにおいて、本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、肝繊維化が阻害される効果を示す写真及びグラフである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の脂肪肝疾患の予防又は治療剤は、有効成分として、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩を含有する。

本発明において、「脂肪肝疾患」とは、肝細胞に中性脂肪が沈着して、肝臓障害を招く疾患を総称であり、アルコール性肝臓障害及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が含まれる。

本発明において、「非アルコール性脂肪肝疾患」とは、非アルコール性脂肪肝及び非アルコール性肝脂肪症と同じ意味である。非アルコール性脂肪肝疾患には、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）及び単純性脂肪肝が含まれる。

非アルコール性脂肪肝疾患は、例えば、明らかな飲酒力がないにも関わらず、肝組織所見はアルコール性肝臓障害と類似した主に大滴性の肝脂肪沈着を特徴とする肝臓障害であり、予後良好な単純性脂肪肝と進行性のＮＡＳＨを含む概念として定義される。また、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、以下のような特徴が挙げられる：
１．明らかな飲酒力がない（アルコール量：２０ｇ以下／日）。
２．ウイルス性（ＨＣＶ、ＨＢＶ）、自己免疫性のような成因が明確な慢性肝疾患は認めない。
３．代謝症候群、肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、高尿酸血症、睡眠時無呼吸症候群などはリスク因子である。多重リスク因子を有する例では、単純性脂肪肝及びＮＡＳＨの可能性が高くなる。
４．脂質代謝やミトコンドリア機能の異常を招く多様な疾患や薬剤も含まれる。

非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、例えば、以下のように定義される：
１．Ｍａｔｔｅｏｎｉら（Matteoni, C.A., et al., 1999, Gastroenterology, 116：1413-1419）は、ＮＡＦＬＤを４段階に分類した。クラス１は単純性脂肪肝、クラス２は脂肪性肝炎、クラス３は脂肪肝壊死（風船様変性を伴う）、そして、クラス４はマロリー小体乃至は繊維化を伴う肝細胞壊死（風船様変性を伴う）を意味する。長期予後の検討から肝硬変への進展や肝関連死の頻度が有意に高いクラス３及びクラス４を非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）とする。

２.米国肝臓学会のシングルトピックカンファレンス２００２（Single Topic Conference 2002, Neuschwander-Tetri, B.A. et al., 2003, Hepatology, 37：1202-1219）では、ＮＡＳＨの必須所見として脂肪化（大滴性＞小滴性、小葉中心部に多い）、小葉内炎症（軽症、好中球や単核球浸潤）、肝細胞の風船様変性（脂肪化周辺、小葉中心部に多い）を考慮して、ＮＡＦＬＤのクラス３、クラス４（Matteoni分類）をＮＡＳＨとしている。

３．Ｂｒｕｎｔら(Brunt, E.M., et al., 1999, Am. J. Gastroenterol., 94： 2467-2474）は、ＮＡＳＨの進展経過を繊維化の程度により４段階に分類した。段階１：小葉中心部（区域３）、段階２：１＋門脈域、段階３：架橋形成、段階４：肝硬変。

本発明において「単純性脂肪肝」とは、脂肪性肝疾患のうち肝細胞の脂肪沈着だけが示され、肝細胞の壊死・炎症や繊維化を伴わない症例を示す。

本発明に係る予防又は治療剤を適用する脂肪肝疾患としては、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が好ましく、単純性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）が特に好ましい。

前述のように、ＮＡＳＨの発生・進展機序として２ヒット理論が多くの支持を受けている。２ヒット理論とは、以下のような発病及び発展機序によってＮＡＳＨがさらに進展するという仮設である。まず、１次ヒットとして、肝脂肪の蓄積（脂肪肝）が発生し、２次ヒットとして脂肪肝から由来する酸化ストレスや炎症性サイトカインなどによる肝炎症及び肝繊維化が発病することによって、ＮＡＳＨがさらに発症、進展する。

本発明に係る（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン及びその薬学的に許容される塩は、１次ヒットに対して、肝脂肪合成活性と肝トリグリセリド含量を抑制することで、肝脂肪の蓄積を抑制することによって、優先的に脂肪肝を制御する。また、２次ヒットに対して、肝臓における脂肪滴と炎症細胞の浸潤を抑制し、酸化ストレス及び炎症性サイトカインを抑制すると同時に、肝炎症関連遺伝子及び肝繊維化関連遺伝子の発現を抑制することによって、肝炎症及び肝繊維化を抑制する。このような作用機序によって、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン及びその薬学的に許容される塩は、ＮＡＳＨの発病・発展機序を効果的に遮断することができる可能性が高いと判断される。

本発明に係る脂肪肝疾患の予防又は治療剤は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩を含み、必要に応じて、薬理学的に許容される公知された添加剤を配合することができる。任意に配合できる添加剤としては、剤形や投与形態などにより変わるが、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、ファルテクチェ、矯味剤、香料剤、着色剤又は甘味剤などを使用することができる。

また、本発明に係る脂肪肝疾患の予防又は治療剤は、薬理学的に許容される各種製剤形態で使用することができる。このような形態では、例えば、カプセル剤、散剤、錠剤、細粒剤、顆粒剤、注射剤、液剤、軟こう剤又は貼付剤などが好ましい。従って、本発明の脂肪肝疾患の予防又は治療剤は、経口投与や非経口投与の形態で患者に投与することができる。その中でも、患者が利用しやすい点を考慮して、経口剤が好ましい。

本発明に係る脂肪肝疾患の予防又は治療剤において、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩の投与量は患者の年齢や、体重、症状、投与経路などにより適切に変更することが可能である。例えば、１日投与量は成人（６０ｋｇ）当たり、経口投与では、約１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは、約１０ｍｇ〜７５０ｍｇであり、注射形態では約０．３ｍｇ〜２００ｍｇであり、一日１回〜数回に分けて投与することができる。

本発明に係る（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩は、脂肪肝、肝炎症及び肝繊維化を効果的に抑制することができ、ＮＡＦＬＤ、特にＮＡＳＨの予防又は治療に適切に使用することができる。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明を簡単に理解するために提供されるものであり、これら実施例によって本発明の範囲が限定されるものではない。

実施例１：（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンの脂肪肝抑制作用（肥満を伴う脂肪肝モデルを用いた評価）
実験動物は、６週齢の雄ｏｂ／＋対照用マウスと６週齢Ｃ５７ＢＬ／６ＪＬｅｐ（−/−）雄（ｏｂ／ｏｂ）マウスを、Ｈａｒｌａｎ（Indianapolis, IN）から購入した。購入したマウスは、全部標準条件（２５℃、５５％湿度、そして１２時間明暗サイクル）下で維持されており、正常なｃｈｏｗｄｉｅｔをした。３０匹のマウスを３群に分離し、１群当たり１０匹ずつ割り当てた。第１群は１０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ｏｂ／＋対照群）マウスを含み、第２群は食塩水を処理した１０匹のｏｂ／ｏｂマウスにビヒクルを処理した群であり、第３群は（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン（(LG Life Sciences Ltd., Daejeon, Korea）を１日１回２０ｍｇ／ｋｇ容量で処理した群である。食塩水と（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン溶液は４週間経口投与した。処理後に動物を麻酔して犠牲にした後、次の分析のために早く採集して、保管した。

実施例１−１：肥満脂肪肝モデルで肝細胞内に蓄積されるＴＧ、コレステロール量の蓄積及び肝の損傷について、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンが及ぼす影響
図１は、本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、ｏｂ／ｏｂマウスでＴＧ及びコレステロール含量の減少効果を示す写真及びグラフである（ｎ＝１０、ｐ＜０．００１ｖｓ溶媒）。

図１に示されるように、対照群マウス（ｏｂ／＋）での肝と比較時、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスは、肝細胞のうち６０％程度の脂肪組織と大小の脂肪滴が多量蓄積されていることを確認した。これと対照的に、２０ｍｇ／ｋｇで、１日１回、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン（Comp.）を経口投与した肥満マウスでは、Ｈ＆Ｅ染色法で確認した結果、脂肪組織が顕著に減ったことが観察された。また、オイルレッドＯが染色された面積は、ビヒクル（vehicle）を処理した群に比べて、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを処理したマウスで顕著に減少したことを確認することができた。

血清（serum）内ＴＧレベルは、２群間に大きな差が現れなかった反面（データ未記載）、肝ＴＧとコレステロール量は、本発明の化合物を処理した群で有意に減少した。血清内のＡＬＴ及びＡＳＴ数値も本発明の化合物を処理した群が、ビヒクルを処理した群に比べて、減少したことを確認した。

実施例１−２：肥満脂肪肝モデルで（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンが肝での酸化ストレス及び脂肪酸化に及ぼす影響評価
図２は、本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、酸化ストレス及び脂肪酸化抑制効果を示す写真及びグラフである。

図２に示されるように、酸化ストレスによるＤＮＡ損傷を代弁する８−ＯＨｄＧの量がＡＬＴの量と有意的相関性を示しており、本発明の化合物を処理したｏｂ／ｏｂマウスの場合、８−ＯＨｄＧ陽性肝細胞の数字がビヒクル処理した群に比べて、顕著に低い数値を示した。また、ミトコンドリアの機能障害で重要な役割を果たす３−ＮＴ（ニトロチロシン）レベルの場合、ｏｂ／ｏｂマウスでは相当多く増加している反面、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン処理時には、非常に減少することが明らかになった。そして、ＮＡＳＨの発病に重要な役割を果たすもとして知られた酸化ストレスの影響を調べてみるために、ＴＢＡＲＳの量を測定した結果、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン処理時、有意な減少が観察された。

即ち、図２に示される結果は、本発明に係る（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンが酸化ストレスとタンパク質のニトロ化（nitration）を効果的に遮断する効果があるといえる。

実施例１−３：（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンがミトコンドリア呼吸鎖に及ぼす影響評価
（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンがミトコンドリアの活性酸素種及び活性酸素種による酸化損傷を阻害するという以前の結果に基づいて、ビヒクルと（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンとを処理したｏｂ／ｏｂマウスの肝でミトコンドリア呼吸複合体の発現とＯＸＰＨＯＳ複合体に対する（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンの影響を調べた。

図３は、本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、減少したミトコンドリア呼吸鎖の活性を向上させる効果を示す写真及びグラフである。

図３のＡから確認されるように、ｏｂ／＋対照群対比ｏｂ／ｏｂマウスの肝ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ発現が顕著に減少した。しかし、これらミトコンドリア複合体の発現は、本発明の化合物を処理したｏｂ／ｏｂマウスの場合には、対照群水準に回復した。また、ＯＸＰＨＯＳ複合体をＢＮ−ＰＡＧＥにより分析した結果、ＯＸＰＨＯＳ複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶがｏｂ／＋対照群マウスと比較して、ｏｂ／ｏｂマウスで顕著に減少していることを確認した。しかし、４週間、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを処理したｏｂ／ｏｂマウスの場合には、複合体の結合が向上されたことを確認した。特徴的に、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン処理時、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶの活性は有意に増加したが、複合体ＩＩの活性には大きな変化がなかった。

即ち、図３に示される結果は、本発明に係る（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンがミトコンドリア呼吸鎖活性及びミトコンドリア活性を向上させることを提示している。

実施例１−４：ｏｂ／ｏｂマウス間で（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンが炎症性サイトカイン及びクッパー細胞（Kupffer cell）活性に及ぼす影響評価
炎症及び酸化ストレスは、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨの発病及び進行の決定的要因として知られている。本発明者は、炎症性信号に関連したＮＦ−κＢ、ｐ３８そしてＪＮＫ１／２のリン酸化を免疫ブロット分析した。

図４は、本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、増加した炎症性サイトカインの発現及び大食細胞の活性を減少させる効果を示す写真及びグラフである。

図４のＡに示されるように、ビヒクルを処理したｏｂ／ｏｂマウスの肝ではリン酸化されたＮＦ−κＢ、ｐ６５及びｐ１０５の発現が増加しており、また、炎症マーカーであるｐ３８とＪＮＫ１／２のリン酸化程度も増加した。反面、本発明の化合物を処理したｏｂ／ｏｂマウスの場合には、ＮＦ−κＢｐ６５、ＮＦ−κＢｐ１０５、ｐ３８、及びＪＮＫ１／２のリン酸化が有意に減少した。このような結果は、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンがＮＡＦＬＤ発病の重要な機序である炎症に関与する信号伝達系を効果的に阻害することを示すものである。

また、ビヒクル処理したｏｂ／ｏｂマウスは肝でＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現が顕著に増加した反面、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを処理したマウスではＴＮＦ−αの発現が抑制された。肝を擦り砕いて採取したサンプルをＥＬＩＳＡ分析した結果、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを処理したマウスの場合、有意に低い量のＴＮＦ−αが測定された（図４のＢ）。

興味深いことに、ＩＬ−６ｍＲＮＡの量は、ビヒクルと本発明の化合物を処理した群間に差が現れなかった。また、Ｆ４／８０（図４のＣ）とＣＤ６８（図４のＤ）免疫染色結果、ビヒクル処理したｏｂ／ｏｂマウスの肝で活性化された多数のマクロファージの浸潤が観察されたが、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを処理した場合には、炎症反応が減少することが確認された。

実施例２：（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンの肝炎症及び肝繊維化抑制効能（肥満を伴う脂肪肝炎モデルを利用した評価）
肝繊維化の程度を測定するために、トリクローム染色とコラーゲンＩの発現を測定、分析した。

図５は、メチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ：Methionine choline-deficient）飼料を与えたｏｂ／ｏｂマウスにおいて、本発明の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ／日）投与時肝繊維化が阻害される効果を示す写真及びグラフである。

図５のＡ及びＢに示されるように、メチオニンとコリンが欠乏したＭＣＤ飼料を与えた場合、ｏｂ／ｏｂマウスで肝繊維化進行に多くの影響を与えるということが確認された。反面、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンを処理したグンではビヒクル処理群対比、トリクローム染色強度及びコラーゲンＩの発現が阻害された。

図５のＣから確認されるように、ＭＣＤ飼料ｏｂ／ｏｂマウスは、正常食を取ったｏｂ／ｏｂマウスに比べて多い量の肝ＴＧを含有することが確認された反面、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン処理群の肝ＴＧの量は５０％程度の減少を示した（ｏｂ／ｏｂＭＣＤ−ビヒクル４００＋／−８０ｍｇ／ｇ肝、ｏｂ／ｏｂＭＣＤ−Ｃｏｍｐ２１０＋／−２０）。また、血清ＡＬＴ及びＡＳＴ量も本発明の化合物処理群で顕著に減少した。

そして、図５のＤでは、正常食を取ったｏｂ／ｏｂマウス対比、ＭＣＤ飼料ｏｂ／ｏｂマウスでは、ＮＦ−κＢｐ６５、ＮＦ−κＢｐ１０５、ｐ３８及びＪＮＫ１／２のリン酸化が多く増加したことを示した。反面、本発明の化合物処理時、このような繊維化マーカーのリン酸化が抑制されたことが確認された。

このような実験結果は、ｏｂ／ｏｂマウスでＭＣＤ飼料を通じて肝での炎症信号及び肝繊維化が顕著に増加するが、本発明の化合物は、このような肝繊維化での進行を効果的に遮断することによって、肝機能向上を促進させることができるＮＡＳＨに対する暫定的な治療薬剤として使われる可能性があることを暗示する。

以上のように、本発明に係る（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、肥満脂肪肝モデルで肝細胞内に蓄積されるＴＧ、コレステロール量の蓄積及び肝の損傷を抑制し、肝での酸化ストレス及び脂肪酸化を遮断し、ミトコンドリア呼吸鎖活性及びミトコンドリア活性を向上させ、炎症性サイトカイン及びクッパー細胞（Kupffer cell）活性を抑制するだけでなく、肥満を伴う脂肪肝炎モデルで肝炎症及び肝繊維化を抑制する効能があるとことが確認された。これにより、本発明の（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩は、脂肪肝、肝炎症及び肝繊維化を効果的に抑制することができ、ＮＡＦＬＤ、特にＮＡＳＨの予防又は治療に適切に使用することができると期待される。

Claims

有効成分として、（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン又はその薬学的に許容される塩を含有する脂肪肝疾患の予防又は治療用医薬組成物。
脂肪肝疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
非アルコール性脂肪肝疾患が、非アルコール性脂肪肝炎であることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
非アルコール性脂肪肝疾患が、単純性脂肪肝であることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
肝脂肪の蓄積を抑制することを特徴とする請求項１に記載の脂肪肝疾患の予防又は治療用医薬組成物。
脂肪肝から由来する酸化ストレス又は炎症性サイトカインを抑制し、肝炎症及び肝繊維化を抑制することを特徴とする請求項１に記載の脂肪肝疾患の予防又は治療用医薬組成物。