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JP2017505104A - インビボにおける薬剤送達のための核酸ナノ構造体 - Google Patents

インビボにおける薬剤送達のための核酸ナノ構造体 Download PDF

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Abstract

本開示は、態様によって、ポリアミンポリマーにより亜飽和された核酸ナノ構造体を提供する。本開示はまた、態様によって、ｐＨ感受性の接触部分によって第２の核酸ナノ構造体に結合された第１の核酸ナノ構造体を含み、それによって、外部表面および内部表面を有する内部コンパートメントを有するナノカプセルを形成する核酸ナノカプセルをも提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１３年１１月８日に提出された米国仮特許出願第６１／９０１，８２０号、２０１４年７月７日に提出された米国仮特許出願第６２／０２１，２５６号、および２０１４年７月７日に提出された米国仮特許出願第６２／０２１，２５７号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張し、これらのそれぞれの教示は、本明細書において参照によって組み込まれる。
政府の助成による研究
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって与えられた助成金１ ＤＰ２ ＯＤ００４６４１−０１の下で、米国国立科学財団（National Science Foundation）によって与えられた助成金ＣＣＦ−１３１７２９１の下で、および学際的大学研究イニシアチブ（Multidisciplinary University Research Initiative）、米国陸軍研究所（U.S.Army Research Office）によって与えられたＷ９１１ＮＦ−１２−１−０４２０の下で、政府の助成によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本開示は、核酸ナノテクノロジーの分野に関する。本開示のいくつかの実施形態は、ポリアミンポリマーに連結された核酸ナノ構造体に関する。
発明の背景
核酸ナノ構造体は、たとえば医薬物質ビヒクルとしての生物医学的な適用において大きな可能性を有する。構造体は、生分解性であり、部位特異的に官能性をもたせることができ、アロステリックな立体構造的変化を受けるように操作することができ、標的分子および細胞との正確な相互作用を可能にする。現在、しかしながら、核酸ナノ構造体の生物医学的な適用は、生理学的条件下での核酸分解および構成的な不安定性により妨げられている。たとえば、癌ワクチン送達などのようなワクチン送達のための核酸ナノ構造体の使用は、特に問題である。癌ワクチンは、腫瘍関連抗原を認識するヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を駆動するように、樹状細胞（ＤＣ）を活性化することによって腫瘍退縮を促す。腫瘍の免疫抑制性の微小環境を克服するために、有効なワクチンは、ＤＣおよびＴ細胞の持続性で効力のある誘発をもたらさなければならない。単純な抗原のみでは、多くの完全な病原体とは対照的に、とりわけ、活発な細胞性免疫応答に必要とされるＴｈ１応答を生成するための、頑健な（robust）または特異的な樹状細胞活性化を引き起こさないことが多い。したがって、いくつかのワクチンまたはワクチン送達ビヒクルは、頑健なまたは特異的なＤＣ活性化を引き起こす特性を持つものまたは他の薬剤と共に、生成されるまたは製剤される。核酸分解および構成的な不安定性により、ワクチンとしてのまたはワクチン送達ビヒクルとしての核酸ナノ構造体の使用は、それらがＤＣおよびＴ細胞の持続性で効力のある誘発を生成することができないので、制限されてきた。
発明の概要
本開示は、いくつかの実施形態では、中でも低塩環境の副作用からナノ構造体を「保護する」ポリアミンポリマーに連結された核酸ナノ構造体を提供する。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体がまた、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コポリマー（「ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマー）にも連結されている。本発明のいくつかの実施形態は、核酸ナノ構造体の構造の完全性を、ポリアミンポリマーまたはポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせに構造体を連結することによって、生理学的条件（たとえば低塩条件を含む）下でさえ維持することができるという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づく。予想外にも、核酸ナノ構造体がポリアミンポリマーにより「亜飽和される」場合（いくつかの実施形態ではポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせにより）、ナノ構造体の構成は、より安定性となり、核酸は、ポリアミンポリマーなしのナノ構造体に比べて、ヌクレアーゼ分解に対してより抵抗性となる。ポリアミンポリマーの飽和の程度またはその代わりにナノ構造体に対するポリアミンポリマーの比は、ナノ構造体安定性に影響を与える。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの飽和の程度またはその代わりにナノ構造体に対するポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの比が、ナノ構造体安定性に影響を与える。
したがって、本開示の様々な態様は、ポリアミンポリマーにより亜飽和された核酸ナノ構造体（たとえばカプセル様の形状を有するナノカプセル）を提供する。核酸ナノ構造体は、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の１００％未満がポリアミンポリマーのアミンに連結されている（たとえば共有結合でまたは非共有結合で）場合、ポリアミンポリマーにより「亜飽和されている」と本明細書において考えられる。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体のリン酸の９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、または６０％未満が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている（たとえば共有結合でまたは非共有結合で）。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の５％〜９５％または１０％〜９５％が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている（たとえば共有結合でまたは非共有結合で）。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の５％〜９５％、５％〜９０％、５％〜８５％、５％〜８０％、５％〜７５％、５％〜７０％、５％〜６５％、５％〜６０％、５％〜５５％、５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、５％〜２５％、１０％〜９５％、１０％〜９０％、１０％〜８５％、１０％〜８０％、１０％〜７５％、１０％〜７０％、１０％〜６５％、１０％〜６０％、１０％〜５５％、１０％〜５０％、１０％〜４５％、１０％〜４０％、１０％〜３５％、１０％〜３０％、または１０％〜２５％が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている（たとえば共有結合でまたは非共有結合で）。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、ポリ（エチレンイミン）−ポリエチレングリコール（ＰＥＩ−ＰＥＧ）コポリマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、ポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせにより亜飽和されている。核酸ナノ構造体は、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の１００％未満がポリアミンポリマーのアミンおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている（たとえば共有結合でまたは非共有結合で）場合、ポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせにより「亜飽和されている」と本明細書において考えられる。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体のリン酸の９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、または６０％未満が、ポリアミンポリマーのアミンおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている（たとえば共有結合でまたは非共有結合で）。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の５％〜９５％または１０％〜９５％が、ポリアミンポリマーのアミンおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている（たとえば共有結合でまたは非共有結合で）。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の５％〜９５％、５％〜９０％、５％〜８５％、５％〜８０％、５％〜７５％、５％〜７０％、５％〜６５％、５％〜６０％、５％〜５５％、５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、５％〜２５％、１０％〜９５％、１０％〜９０％、１０％〜８５％、１０％〜８０％、１０％〜７５％、１０％〜７０％、１０％〜６５％、１０％〜６０％、１０％〜５５％、１０％〜５０％、１０％〜４５％、１０％〜４０％、１０％〜３５％、１０％〜３０％、または１０％〜２５％が、ポリアミンポリマーのアミンおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている（たとえば共有結合でまたは非共有結合で）。
いくつかの実施形態では、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーに対するポリアミンポリマー（たとえばポリリシンポリマー）の比が、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１である。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマー（たとえばポリリシンポリマー）に対するＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの比が、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１である。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、ポリアミンポリマーおよびコポリマーの組み合わせを含む（たとえば、それにより亜飽和されている）。
核酸ナノ構造体は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、一本鎖プラスミドＤＮＡ（たとえば一本鎖Ｍ１３プラスミドＤＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、二次元または三次元である。たとえば、核酸ナノ構造体は、たとえば立方形の形状、円筒形の形状、不規則な形状、または抽象的な形状などのような多くの定められた所定の形状のうちの１つであってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、合理的にデザインされる。核酸ナノ構造体は、ナノ構造体を形成する核酸が核酸ハイブリダイゼーションを誘導する所定の予測可能なヌクレオチド塩基対相互作用に基づいて選択される場合、「合理的にデザインされる」と本明細書において考えられる。（ＤＮＡナノ構造体の合理的なデザインの概説については、たとえば、参照によって本明細書に援用されるFeldkamp U.,et al.Angew Chem Int Ed Engl.2006 Mar 13;45(12):1856-76を参照されたい）。いくつかの事例では、核酸ナノ構造体は、核酸ナノ構成体（たとえばＤＮＡナノ構成体）と呼ばれてもよい。カプセルの形状に似るように合理的にデザインされたナノカプセルは、特定の核酸ナノ構成体の１つの例である。
本開示の核酸ナノ構造体が、いくつかの実施形態では、凝縮された核酸を含まないことが十分に理解されたい。
本開示の核酸ナノ構造体が、いくつかの実施形態では、コード核酸を含まないことが十分に理解されたい。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の核酸ナノ構造体が、「非コード」核酸ナノ構造体である（すなわち、コード核酸を含まない）。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体中の核酸配列の５０％未満が、コード核酸を含む。たとえば、核酸ナノ構造体の４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が、コード核酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、環状プラスミドＤＮＡを含まない。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体中の核酸配列の５０％未満が、環状プラスミドＤＮＡを含む。たとえば、核酸の長さまたは質量に関して、核酸ナノ構造体を形成するために使用されるまたはそれに寄与する核酸配列の少なくとも５０％は、環状プラスミドＤＮＡとして存在する。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体の４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が、環状プラスミドＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、脂質によってカプセル化されないまたはコーティングされない（たとえば連結されない）。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体中のヌクレオチドの５０％未満が、脂質に連結されている。たとえば、核酸ナノ構造体中のヌクレオチドの４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が、脂質に連結されてもよい。
ポリアミンポリマーは、いくつかの実施形態では、アミノ酸を含む。アミノ酸は、たとえばアミン含有側鎖を含んでいてもよい（そのようなアミノ酸は、本明細書において「アミン含有アミノ酸」と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、リシンを含む。
いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、ペプチドを含むまたはそれからなる。ペプチドが、いくつかの実施形態では、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％のリシンまたは他のアミン含有アミノ酸を含む。ポリアミンポリマーのリシン（つまりリシンアミノ酸）が、いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれ以上の非リシンアミノ酸または非アミン含有アミノ酸によって互いに分離される。
いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、ポリリシンホモポリマー（たとえばリシンからなるペプチド）である。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、ポリアルギニンホモポリマー（たとえばアルギニンからなるペプチド）である。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、ポリヒスチジンホモポリマー（たとえばヒスチジンからなるペプチド）である。
いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、分岐している。
ポリアミンポリマーが、いくつかの実施形態では、アミン含有アミノ酸などのような、４〜１００のアミノ酸、５〜７５のアミノ酸、４〜５０のアミノ酸、４〜２５のアミノ酸、または４〜１５のアミノ酸を含むまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、アミン含有アミノ酸などのような６、８、１０、または１２のアミノ酸を含むまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、スペルミンを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸ナノ構造体が、それに共有結合で付加された式（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩および／もしくは四級塩の１つ以上の基
またはそれと非共有結合した式（ＩＩ）またはその薬学的に許容される塩および／もしくは四級の１つ以上の化合物を含み、
Ｌ１が、直接的な共有結合であるまたは任意選択で置換されるアルキレン、任意選択で置換されるアルケニレン、任意選択で置換されるアルキニレン、任意選択で置換されるヘテロアルキレン、任意選択で置換されるヘテロアルケニレン、任意選択で置換されるヘテロアルキニレン、任意選択で置換されるカルボシクリレン（carbocyclylene）、任意選択で置換されるヘテロシクリレン（heterocyclylene）、任意選択で置換されるアリーレン、および任意選択で置換されるヘテロアリーレンのいずれか１つもしくは組み合わせを含むリンカー基であり、
それぞれのＲ１が、独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニル、任意選択で置換されるヘテロアルキル、任意選択で置換されるヘテロアルケニル、任意選択で置換されるヘテロアルキニル、任意選択で置換されるカルボシクリル（carbocyclyl）、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるヘテロアリール、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、もしくは窒素保護基でありまたは
Ｒ１が、式
の基であり、
それぞれのＲ２が、独立して、任意選択で置換されるアルキレン、任意選択で置換されるアルケニレン、任意選択で置換されるアルキニレン、任意選択で置換されるヘテロアルキレン、任意選択で置換されるヘテロアルケニレン、任意選択で置換されるヘテロアルキニレン、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、および任意選択で置換されるヘテロアリーレンのいずれか１つもしくは組み合わせから選択されるリンカーであり、
それぞれのＲｚが、独立して、水素、−Ｎ（ＲＡ）２、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニル、任意選択で置換されるヘテロアルキル、任意選択で置換されるヘテロアルケニル、任意選択で置換されるヘテロアルキニル、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるヘテロアリール、窒素原子に付加される場合、窒素保護基、酸素原子に付加される場合、酸素保護基、または硫黄原子に付加される場合、硫黄保護基であり、
それぞれのＲＡが、独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニル、任意選択で置換されるヘテロアルキル、任意選択で置換されるヘテロアルケニル、任意選択で置換されるヘテロアルキニル、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるヘテロアリール、窒素原子に付加される場合、窒素保護基、酸素原子に付加される場合、酸素保護基、もしくは硫黄原子に付加される場合、硫黄保護基でありまたは窒素原子に付加される２つのＲＡ基が、任意選択で置換される複素環式環もしくは任意選択で置換されるヘテロアリール環を形成するようにつながれ、
ｎが、１および１００，０００を含む１〜１００，０００の整数であり、
ｍが、１および１００，０００を含む１〜１００，０００の整数である。
いくつかの実施形態では、Ｌ２が、任意選択で置換されたアルキレン、任意選択で置換されるアルケニレン、または任意選択で置換されるアルキニレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２が、式−（ＣＨ２）ｐ−の任意選択で置換されるアルキレンであり、ｐが、１および１０を含む１〜１０の整数である。
いくつかの実施形態では、Ｌ２が、−Ｃ（ＲＡ）−Ｃ（＝Ｏ）−である。
いくつかの実施形態では、−Ｃ（ＲＡ）−Ｃ（＝Ｏ）−のＲＡが、リシン側鎖などのような、任意選択で置換されるアルキルである。
本開示の様々な他の態様は、先の核酸ナノ構造体のいずれかおよび１０ｍＭ未満のマグネシウム（Ｍｇ２＋）を含む溶液を含む核酸組成物を提供する。たとえば、溶液が、０．１ｍＭ〜０．９ｍＭ Ｍｇ２＋または０．６ｍＭ Ｍｇ２＋を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、溶液が、ナノモル濃度のＭｇ２＋を含んでいてもよい。たとえば、溶液は、１ｎＭ〜１００ｎＭ Ｍｇ２＋を含んでいてもよい。そのような低い塩濃度は、たとえば、高度な塩が金属粒子の凝集に導き得る物質科学の分野で使用するのに、特に有利である。
いくつかの実施形態では、溶液が、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭカルシウム（Ｃａ２＋）をさらに含む。たとえば、溶液が、０．９ｍＭ Ｃａ２＋を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、溶液が、１．２ｍＭ Ｃａ２＋を含む。
本開示の他の態様は、たとえば、薬剤のインビボにおける送達のためのキャリヤとして機能する、ナノカプセルなどのようなｐＨ感受性核酸（たとえばＤＮＡ）ナノ構造体を提供する。簡潔さのために「ナノカプセル」と本明細書において呼ばれる「核酸ナノカプセル」は、たとえば薬剤のカプセル化のための、外部表面および内部コンパートメントを有する合成三次元核酸ナノ構造体である（たとえば、２つ以上の核酸ナノ構造体を含む）。いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、ワクチン接種のための、アジュバントを含む薬剤のキャリヤである。本明細書において提供されるナノカプセルは、「カーゴ」と本明細書において呼ばれる、少なくとも１つの薬剤（たとえば抗原性ペプチド、ＲＮＡ干渉分子、アジュバント、および／または追跡用色素）を添加することができ、たとえば樹状細胞などのような特定の細胞型を標的にすることができる。細胞のエンドソームへの侵入（たとえばカプセルの細胞エンドサイトーシスによって）と同時に、ｐＨ感受性ナノカプセルは、そのカーゴを放出するように環境ｐＨの変化によって誘因される。他の核酸ナノ構造体と異なり、本開示のナノカプセルが、いくつかの実施形態では、ナノカプセルがその標的細胞の方へ移動する時に、ナノカプセルの密封コンパートメントの内側にカーゴを隔離することによって、分解からそのカーゴを保護する。そのうえ、いくつかの実施形態では、ナノカプセルがそれ自体、保護コーティング（たとえばポリアミンポリマーまたはポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせ）によってカプセル化される。
本開示のナノカプセルが、いくつかの実施形態では、他の核酸ナノ構造体技術に比べて、インビボにおける細胞へのより高度な濃度の薬剤送達を可能にする。このより高度な濃度の送達が、いくつかの実施形態では、薬剤によるナノカプセルの内部の高密度の装飾（たとえば６５ｎｍ２当たり１つの薬剤）およびナノカプセルの内部コンパートメントへの薬剤のカプセル化を可能にする、核酸ナノカプセルの「ペグボード（peg board）」立体構造の結果である。ナノカプセルは、薬剤がナノカプセルの内部表面または外部表面に関連する（たとえば共有結合でまたは非共有結合で連結されている）場合、薬剤（たとえば抗原および／またはターゲティング分子）により「装飾される」と考えられる。
ナノカプセルのターゲティングが、いくつかの実施形態では、細胞型特異的抗原および／または受容体に特異的に結合するターゲティング分子（たとえば抗体または抗体断片）によるそれらの外部表面の高密度装飾によって実現される。たとえば、ナノカプセルは、標的樹状細胞上で豊富なＤＥＣ２０５に特異的に結合する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）により装飾されてもよい。
細胞中の（たとえばエンドソームコンパートメント中の）カーゴのｐＨ感受性の開口および放出は、いくつかのナノカプセルの中に構築された２つの異なるメカニズムに依存する。第１のメカニズムは、ナノカプセルの少なくとも一部を互いに形成する、２つの核酸ナノ構造体の接触部分に存在する、部分的に相補的なｐＨ応答性の一本鎖核酸「ハンドル」および「反対のハンドル」の存在に依存する。第２のメカニズムは、薬剤をナノカプセルの表面（たとえば内部および／または外部）表面に連結するリンカーとして機能するｐＨ応答性の核酸の存在に依存する。
本開示の態様は、ｐＨ感受性の接触部分によって第２の核酸ナノ構造体に連結された第１の核酸ナノ構造体および第２の核酸ナノ構造体への第１の核酸ナノ構造体の連結によって形成される内部コンパートメントを含む核酸ナノカプセルを提供する。
いくつかの実施形態では、第１の核酸ナノ構造体が、ｐＨ感受性の一本鎖核酸ハンドルを含み、第２の核酸ナノ構造体が、ｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的な一本鎖核酸の反対のハンドルを含み、第１の核酸ナノ構造体が、反対のハンドルへのｐＨ感受性のハンドルのハイブリダイゼーションによって第２の核酸ナノ構造体に連結されている。ハンドルおよび反対のハンドルの間の相互作用は、ハンドルのｐＨ感受性の性質によりｐＨ感受性となることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性のハンドルが、配列番号１の配列を含む。
いくつかの実施形態では、反対のハンドルが、配列番号２または配列番号３の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、２つの末端部を有し、ナノカプセルのそれぞれの末端部が、直径が１０ｎｍ未満の開口を有する。いくつかの実施形態では、ナノカプセルのそれぞれの末端部が、直径が２ｎｍ〜１０ｎｍ（たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎｍ）の開口を有する。
いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、ナノカプセルの内部表面および／または外部表面に連結された（たとえば少なくとも１つの）薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、ナノカプセルの内部表面および／または外部表面に連結された少なくとも２つの薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤が、相補的な一本鎖核酸のハイブリダイゼーションによってナノカプセルの内部表面および／または外部表面に連結されている。いくつかの実施形態では、薬剤が、部分的に相補的なｐＨ感受性のハンドルおよび反対のハンドルのハイブリダイゼーションによってナノカプセルの内部表面および／または外部表面に結合される。
いくつかの実施形態では、薬剤が、ナノカプセルの外部表面に連結されたターゲティング分子である。ターゲティング分子は、たとえば抗体、抗体断片、またはリガンドであってもよい。
いくつかの実施形態では、薬剤が、治療剤、予防剤、診断剤、および／またはアジュバントである。抗原は、たとえばペプチド抗原であってもよい。
いくつかの実施形態では、薬剤が、アジュバントである。アジュバントは、たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチドであってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、ポリアミンポリマーならびに／またはカチオンポリ（エチレンイミン）およびポリエチレングリコールのコポリマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、ポリアミンポリマーならびに／またはカチオンポリ（エチレンイミン）およびポリエチレングリコールのコポリマーにより亜飽和されている。いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、ポリアミンポリマーならびにカチオンポリ（エチレンイミン）およびポリエチレングリコールのコポリマーの組み合わせにより亜飽和されている。
いくつかの実施形態では、第１の核酸ナノ構造体および／または第２の核酸ナノ構造体が、円筒の形態をしている。
本開示の態様は、本明細書において提供されるように、核酸ナノカプセルを含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物が、送達ビヒクルをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルが、ポリマーゲルである。
本開示の態様は、本明細書において提供されるように、核酸ナノカプセルまたはナノカプセルを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本開示の態様は、本明細書において提供されるように、細胞（たとえば樹状細胞）に核酸ナノカプセルを送達するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、インビボにおいて細胞（たとえば樹状細胞）に送達される。
本開示の態様は、ｐＨ感受性の一本鎖核酸ハンドルを含む第１の核酸ナノ構造体およびｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的な一本鎖核酸の反対のハンドルを含む第２の核酸ナノ構造体を含むキットであって、６を超えるｐＨ（たとえば６．５を超える、７を超える、７．５を超えるｐＨ）を有する水溶液において、第１の核酸ナノ構造体が、反対のハンドルへのｐＨ感受性のハンドルのハイブリダイゼーションによって第２の核酸ナノ構造体に付加され、それによって、内側のコンパートメントを有する核酸ナノカプセルを形成するキットを提供する。
いくつかの実施形態では、キットが、６を超えるｐＨ（たとえば６．５を超える、７を超える、７．５を超えるｐＨ）を有する水溶液をさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２の核酸ナノ構造体が、ｐＨ感受性のハンドルを含む。
いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性のハンドルが、配列番号１の配列または配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、キットが、ｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的な（たとえば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な）反対のハンドルに連結された薬剤を含む。
いくつかの実施形態では、キットが、ｐＨ感受性のハンドルおよびｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的な（たとえば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な）反対のハンドルに連結された薬剤をさらに含む。
本開示の態様は、ワクチンを対象に送達するための方法であって、樹状細胞を活性化するまたは刺激する抗原を含むナノカプセルを対象に送達するステップ（たとえば投与するステップ）を含む方法を提供する（たとえば、ヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を駆動するように）。いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、ターゲティング剤（たとえば抗体もしくは抗体断片）および／またはアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、ターゲティング剤が、ＤＥＣ２０５または樹状細胞の他の細胞表面マーカー／受容体に結合する（たとえば特異的に結合する）抗体または抗体断片である。
図１は、低マグネシウムバッファーにおけるＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するスペルミン分子の効果の非限定的な例を示す図である。 図２は、マグネシウムなしのバッファーにおけるＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するポリリシンポリマーの効果の非限定的な例を示す図である。 図３は、様々な寸法のＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するポリリシンポリマーの効果の非限定的な例を示す図である（サンプルはマグネシウムを有するゲル上を流れる）。 図４は、様々な寸法のＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するポリリシンポリマーの効果の非限定的な例を示す図である（サンプルはマグネシウムなしのゲル上を流れる）。 図５は、低マグネシウムバッファーにおけるＤＮＡナノ構造体のポリリシンポリマー誘発性の安定性についての透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）分析の非限定的な例を示す図である。 図６は、ＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するポリリシンポリマーおよびポリアルギニンポリマーの効果を比較する非限定的な例を示す図である。 図７は、ＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対する様々な長さのポリリシンポリマーの効果を比較する非限定的な例を示す図である。 図８は、ＤＮＡナノ構造体の構造の完全性を維持するために必要とされるそれぞれのポリリシンポリマー濃度に対するポリリシンポリマーの長さの効果を比較する非限定的な例を示す図である。 図９は、ＤＮＡナノ構造体の熱的安定性に関してポリリシンポリマーの長さの効果を比較する非限定的な例を示す図である。 図１０は、ＤＮＡナノ構造体のヌクレアーゼ安定性に関してポリリシンポリマーの長さの効果を比較する非限定的な例を示す図である。 図１１は、新鮮な細胞培養培地におけるＤＮＡナノ構造体のヌクレアーゼ安定性に関してポリリシンポリマー長さの効果を比較する非限定的な例を示す図である。 図１２Ａは、本開示に従う使用のためのポリアミンポリマーの非限定的な例を示す図である。 図１２Ｂは、本開示に従う使用のためのポリアミンポリマーの非限定的な例を示す図である。 図１２Ｃは、本開示に従う使用のためのポリアミンポリマーの非限定的な例を示す図である。 図１３Ａは、ネガティブ／ポジティブ比に対するオリゴリシンの長さの効果を示す図である。図１３Ａ：５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６ｍＭ Ｍｇ ＋／−ｘμＭオリゴリシン（Ｋｎ；ｎ＝６、８、１０、１２、２０）における１００μＬの１ｎＭ ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、１Ｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．２において透析した。オリゴリシンが長いほど、ＤＮＡへの結合親和性は高く、よって、高いネガティブ／ポジティブ比でＤＮＡナノ構造体を安定化することができる。 図１３Ｂは、ネガティブ／ポジティブ比に対するオリゴリシンの長さの効果を示す図である。図１３Ｂ：様々な長さのオリゴリシンによりコートし、２％ギ酸ウラニルにより染色したＤＮＡナノ構造体のＴＥＭ画像。 図１４Ａは、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリシン誘発性の抵抗性を示す図である。図１４Ａ：ＲＰＭＩ−１６４０中の１０μＬの新たに調製した細胞培地を、ＤＮＡナノ構造体（１ｎＭ）に追加し、様々な時間間隔で３７℃でインキュベートした。サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇから構成される２％アガロースゲルに添加した。 図１４Ｂは、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリシン誘発性の抵抗性を示す図である。図１４Ｂ：分でのヌクレアーゼ分解に対する抵抗性に対するオリゴリシンの長さの効果。オリゴリシンによるコーティングは、ネイキッドorigamiと比較して、ヌクレアーゼ分解に対するより高い抵抗性を与える。さらに、オリゴリシンが短いほど、それらが高い（−）／（＋）比をもたらすことができるので、より高いヌクレアーゼ抵抗性を与えることができる。 図１５Ａは、樹状細胞に対するオリゴリシン誘発性の毒性を示す図である。図１５Ａ：新たに回収した樹状細胞を、様々な時間間隔で、１．５μｇ／ｍＬ Ｋ２０とインキュベートした。細胞は、顕微鏡下で観察すると、健康に見えた。 図１５Ｂは、樹状細胞に対するオリゴリシン誘発性の毒性を示す図である。図１５Ｂ：オリゴリシン（Ｋ２０）ペプチドによりコートしたｃｙ５標識ＤＮＡナノ構造体とインキュベートした樹状細胞の共焦点画像。細胞の中への取込みが観察されたが、数時間後、細胞は破裂し始め、２４時間で、観察された成熟細胞はほとんどなかった。 図１６Ａは、ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体の合成およびキャラクタリゼーションを示す図である。図１６Ａ：ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体の合成を示す反応手法。様々なモル比のＮＨＳ活性化ＰＥＧを、ＰＥＩと反応させて、様々な量の第一級アミンを有するＰＥＩ−ＰＥＧ複合体を形成した。 図１６Ｂは、ＰＥＩ−ＰＥＧ複合体の合成およびキャラクタリゼーションを示す図である。図１６Ｂ：様々なパーセンテージのＰＥＧカップリングに関してのサイズ（平均径）の分布。複合体の平均径は、動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して測定した。 図１７は、ＤＮＡナノ構造体の多層コーティングの略図を示す図である。オリゴリシン（Ｋ２０）ペプチドは、灰色のねじれた線によって示し、ＤＮＡナノ構造体（円筒）との相互作用と同時に、均一なコーティングを形成する。ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０複合体は、円内の灰色の円として示し、ＤＮＡナノ構造体との相互作用と同時に、それらは、均一なコーティングを形成する。 図１８Ａ〜１８Ｄは、多層ＤＮＡナノ構造体のＴＥＭ分析を示す図である。（図１８Ａ）ネイキッドＤＮＡナノ構造体、（図１８Ｂ）Ｋ２０によりコートしたＤＮＡナノ構造体、（図１８Ｃ）ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０のみによりコートしたＤＮＡナノ構造体、ならびに（図１８Ｄ）Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０の両方によりコートしたＤＮＡナノ構造体のＴＥＭ画像。サンプルは、２％ギ酸ウラニルにより染色した。Ｋ２０のみによるコーティングは、構造体を保存し、ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０のみによるコーティングは、ＤＮＡナノ構造体を変化させる。しかしながら、Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０の両方によるコーティングは、ＤＮＡナノ構造体の構造の完全性を維持した。 図１９Ａは、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリシン誘発性の抵抗性を示す図である。ＲＰＭＩ−１６４０中の１０μＬの新たに調製した細胞培地を、ＤＮＡナノ構造体に追加し、様々な時間間隔で３７℃でインキュベートした。サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇから構成される２％アガロースゲルに添加した。（図１９Ａ）ネイキッドorigami、（図１９Ｂ）Ｋ２０によりコートしたorigami、（図１９Ｃ）ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０のみによりコートしたorigami、ならびに（図１９Ｄ）Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０の両方によりコートしたorigami。オリゴリシンコーティングは、適度なヌクレアーゼ保護を提供する。Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０によるコーティングの組み合わせは、強いＤＮＡバンドから考えられるように、有意なヌクレアーゼ保護を提供する。 図１９Ｂは、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリシン誘発性の抵抗性を示す図である。ＲＰＭＩ−１６４０中の１０μＬの新たに調製した細胞培地を、ＤＮＡナノ構造体に追加し、様々な時間間隔で３７℃でインキュベートした。サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇから構成される２％アガロースゲルに添加した。（図１９Ａ）ネイキッドorigami、（図１９Ｂ）Ｋ２０によりコートしたorigami、（図１９Ｃ）ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０のみによりコートしたorigami、ならびに（図１９Ｄ）Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０の両方によりコートしたorigami。オリゴリシンコーティングは、適度なヌクレアーゼ保護を提供する。Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０によるコーティングの組み合わせは、強いＤＮＡバンドから考えられるように、有意なヌクレアーゼ保護を提供する。 図１９Ｃは、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリシン誘発性の抵抗性を示す図である。ＲＰＭＩ−１６４０中の１０μＬの新たに調製した細胞培地を、ＤＮＡナノ構造体に追加し、様々な時間間隔で３７℃でインキュベートした。サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇから構成される２％アガロースゲルに添加した。（図１９Ａ）ネイキッドorigami、（図１９Ｂ）Ｋ２０によりコートしたorigami、（図１９Ｃ）ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０のみによりコートしたorigami、ならびに（図１９Ｄ）Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０の両方によりコートしたorigami。オリゴリシンコーティングは、適度なヌクレアーゼ保護を提供する。Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０によるコーティングの組み合わせは、強いＤＮＡバンドから考えられるように、有意なヌクレアーゼ保護を提供する。 図１９Ｄは、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリシン誘発性の抵抗性を示す図である。ＲＰＭＩ−１６４０中の１０μＬの新たに調製した細胞培地を、ＤＮＡナノ構造体に追加し、様々な時間間隔で３７℃でインキュベートした。サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇから構成される２％アガロースゲルに添加した。（図１９Ａ）ネイキッドorigami、（図１９Ｂ）Ｋ２０によりコートしたorigami、（図１９Ｃ）ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０のみによりコートしたorigami、ならびに（図１９Ｄ）Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０の両方によりコートしたorigami。オリゴリシンコーティングは、適度なヌクレアーゼ保護を提供する。Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０によるコーティングの組み合わせは、強いＤＮＡバンドから考えられるように、有意なヌクレアーゼ保護を提供する。 図２０Ａ〜２０Ｄは、新たに回収された樹状細胞の中へのｃｙ５標識ＤＮＡナノ構造体の細胞の取込みの共焦点画像を示す図である。（図２０Ａ）ネイキッドＤＮＡナノ構造体、（図２０Ｂ）Ｋ２０によりコートしたＤＮＡナノ構造体、（図２０Ｃ）ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０のみによりコートしたＤＮＡナノ構造体、ならびに（図２０Ｄ）Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０の両方によりコートしたＤＮＡナノ構造体。ネイキッドＤＮＡナノ構造体およびＫ２０によりコートしたＤＮＡナノ構造体の取込みは低かった。ＰＥＩ−ＰＥＧ ５０のみによりコートしたＤＮＡナノ構造体は、速やかに分解され、細胞から放出された。Ｋ２０およびＰＥＩ−ＰＥＧ ５０の組み合わせによりコートしたＤＮＡナノ構造体は、よりいっそうの細胞取込みおよび細胞におけるより長い滞在時間をもたらした。 図２１Ａ（ｉ）〜２１Ａ（ｖｉ）は、本開示の核酸ナノカプセルの一実施形態の概略図を示す図である。図２１Ｂは、３０ｎｍ「Genghis Khan」ナノ構造体および６０ｎｍ「Bungalow」ナノ構造体の概略図（上）ならびに水溶液中のナノ構造体の対応する画像（下）を示す図である。左の概略図は、構造体における二重らせんの配列を示す、ナノ円筒構造体（たとえばGenghis KhanまたはBungalow）の壁の断面図の例を示す。 図２１Ａ（ｉ）〜２１Ａ（ｖｉ）は、本開示の核酸ナノカプセルの一実施形態の概略図を示す図である。図２１Ｂは、３０ｎｍ「Genghis Khan」ナノ構造体および６０ｎｍ「Bungalow」ナノ構造体の概略図（上）ならびに水溶液中のナノ構造体の対応する画像（下）を示す図である。左の概略図は、構造体における二重らせんの配列を示す、ナノ円筒構造体（たとえばGenghis KhanまたはBungalow）の壁の断面図の例を示す。 図２２Ａは、核酸ナノカプセルに連結された一本鎖核酸ハンドルの例（左）およびナノカプセルのハンドルに相補的な一本鎖核酸の反対のハンドルに連結された薬剤の様々な例（右）の概略図を示す図である。 図２２Ｂは、その外部表面上でＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびｓｃＦＶターゲティング分子に連結された核酸ナノ構造体（左）ならびにその内部表面上で色素および抗原に連結された核酸ナノ構造体（右）の例の概略図を示す図である。 図２２Ｃは、本開示の核酸ナノカプセルの内部表面および／または外部表面に連結された薬剤の様々な例の概略図を示す図である。 図２３Ａは、ＰＥＩ第一級アミンにＰＥＧ−ＮＨＳをカップルするためのライゲーション手法の例を示す図である。下のパネルは、血清活性細胞培地において様々な期間、インキュベートした場合のＤＮＡナノ構造体の安定性についてのアガロースゲル分析を示す。Ｃ＝コントロール、１−２−４−８−ｏ／ｎ 時間。４つの異なる保護の程度について試験した：裸、Ｎ／Ｐ＝０．１、Ｎ／Ｐ＝１、Ｎ／Ｐ＝１０。 図２３Ｂは、０分、３０分、６０分、９０分、１２０分、および１５０分での骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）におけるＰＥＩ−ＰＥＧによりコートしたＤＮＡナノ構造体の取込みを示す図である。ＢＭＤＣによる、ＰＥＩ−ＰＥＧによりコートしたＤＮＡナノ構造体の取込みの量は、次第に増加する。 図２４Ａは、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）活性化実験の図式的な概要を示す図である。 図２４Ｂは、ＴＬＲ９刺激を評価するためのインターロイキン１２（ＩＬ１２）サイトカイン酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイを示す図である。 図２５Ａは、本開示のｐＨ感受性のメカニズムの一例の概略図を示す図である。ペプチド抗原カーゴは、ｐＨ感受性のハンドル／反対のハンドルの相互作用によってナノカプセルに連結されている。抗原カーゴを有するナノカプセルが低ｐＨ（たとえばｐＨ＜６）環境にある場合、抗原カーゴは、放出され、細胞に送達される。 図２５Ｂは、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、および１２０分での生細胞におけるペプチド抗原放出の共焦点画像を示す図である。 図２６Ａは、フローサイトメトリーによる蛍光強度プロファイリングによって測定されるＴ細胞活性化アッセイ結果を示す図である。 図２６Ｂは、Ｔ細胞活性化実験の漫画による概要を示す図である。 図２６Ｃは、ＦｌｏｗＪｏ分析を使用する、Ｔ細胞実験の定量化を示す図である（上、細胞増殖パーセント；下、細胞分裂の相対量）。 図２７Ａ〜２７Ｆは、ＤＮＡ円筒の例を示す図である。上、目的のデザインを漫画で表現したもの、ここで、それぞれの構成成分の環（灰色のカリエス性の陰）は、個々の二重らせんを示す。右上、切り開いた円筒の略図。図２７Ａ（ｉ）、２７Ｂ（ｉ）、２７Ｃ（ｉ）、２７Ｄ（ｉ）、２７Ｅ（ｉ）、および２７Ｆは、軸方向に方向づけられた粒子のネガティブ染色ＴＥＭを示す。図２７Ａ（ｉｉ）、２７Ｂ（ｉｉ）、２７Ｃ（ｉｉ）、２７Ｄ（ｉｉ）、および２７Ｅ（ｉｉ）は、横に方向づけられた粒子のネガティブ染色ＴＥＭを示す。図２７Ａ（ｉ）、（ｉｉ）および２７Ｂ（ｉ）、（ｉｉ）は、それぞれ、直径３１ｎｍならびに３０ｎｍおよび６５ｎｍの高さを有するナノ構造体を示す。図２７Ｃ（ｉ）、（ｉｉ）および２７Ｄ（ｉ）、（ｉｉ）は、それぞれ、直径６０ｎｍならびに３０ｎｍおよび３５ｎｍの高さを有するナノ構造体を示す。図２７Ｅ（ｉ）、（ｉｉ）は、直径８７ｎｍおよび２６ｎｍの高さを有するナノ構造体を示す。図２７Ｆは、直径１１３ｎｍおよび３０ｎｍの高さを有するナノ構造体を示す。 図２８Ａは、核酸ナノ構造体の円筒ドメインの表面上の斜方格子点の概略図を示す図である。それぞれの点は、ｓｓＤＮＡハンドルにより官能性をもたせることができる。それぞれの点は、最近傍のものが６つあり、それぞれ８．７ｎｍ離れている。明るい灰色の点は、抗ＤＥＣ２０５付加部を示し、黒色の点は、抗ＣＤ４０付加部を示す。 図２８Ｂは、６×Ｈｉｓタグ付き抗ＤＥＣ２０５ ｓｃＦｖの組換え発現およびＩＭＡＣ精製を示す図である。 図２９Ａは、血清中に存在するＤＮアーゼＩによる消化からのヘキサリシン（Ｋ６）によるＤＮＡ origamiの保護を実証するヌクレアーゼ分解についてのアガロースゲルアッセイを示す図である。１０μＬの１ｎＭナノ円筒（ゲルの左半分：−Ｋ６；ゲルの右半分；＋Ｋ６）を、様々な時点について、３７℃で、１０μＬの新鮮な細胞培地（ＲＰＭＩ−１６４０中１０％ＦＢＳ）とインキュベートした。「インキュベーション前のサンプル」と標識されたレーンは、血清による処置前のＤＮＡナノ円筒を保持し、そのため、非消化コントロールを示す。 図２９Ｂは、ドーム型の核酸ナノ構造体の上の穴についての６ヘリックスバンドル充填物の概略図を示す図である。 図３０Ａは、ＤＮＡ円筒ドメインの酸性ｐＨにより誘因される解離の概略図を示す図である。明るい灰色の鎖は、中性のｐＨで濃い灰色の鎖とｄｓＤＮＡを優先的に形成するＣに富む配列であるが、ｐＨ５．５以下で、ｓｓＤＮＡ ｉモチーフ自己構造体を優先的に形成し、そのため、酸性ｐＨで濃い灰色の鎖から解離する。 図３０Ｂは、ｐＨ５．５でのある期間にわたる２つの円筒形のドメインの解離を実証するアガロースゲルアッセイを示す図である。 図３１Ａ〜３１Ｅは、インビトロにおけるＢＭＤＣの活性化およびＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＯＴ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞の下流の活性化を示す図である。図３１Ａは、ナノ円筒の外側または内側のＣｐＧ危険シグナルにより装飾されたＤＮＡ origamiナノ円筒とのインキュベーション後のＢＭＤＣによるＩＬ−１２分泌の誘発を示す。外側表面ＣｐＧ提示は、「ｏｕｔ」によって表し、内側表面ＣｐＧ提示は、「ｉｎ」によって表し、数（たとえば１００、５０、１０）は、ナノモルでのＣｐＧの最終濃度を示す。ＩＬ−１２の誘発は、円筒ドメインで製剤したオリゴアミンシェルの存在によって抑制され、ＣｐＧが円筒の外側上に表示された場合にのみ観察されたが、円筒の内側に表示された場合は観察されなかった。 図３１Ｂは、１０ｎＭの最終濃度でＯＶＡ１ペプチドを持つナノ円筒により処置したＢＭＤＣによるＯＴ１ ＣＤ８＋Ｔ−細胞増殖の誘発を示す（ＣＦＳＥ希釈液により判断）。 図３１Ｃは、ＯＶＡＩペプチドコントロールを示す。 図３１Ｄは、１０ｎＭの最終濃度でＯＶＡ２ペプチドを持つナノ円筒により処置したＢＭＤＣによるＯＴ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の誘発を示す。 図３１Ｅは、ＯＶＡＩＩペプチドコントロールを示す。灰色のバーは、ピーク幅を示す。 図３２は、Ｔｆｒ細胞の排除が抗腫瘍Ｂ細胞応答の増強を可能にすることを示す図である。野生型（ＷＴ）マウスを、ＢＲＡＦ／ＰＴＥＮ抗原により免疫化し、７日後、Ｔｆｈおよび／またはＴｆｒ細胞を分類し、ＢＲＡＦ／ＰＴＥＮ腫瘍を受けたＴｃｒα−／−マウスに移した。血清を、８日後、ＩｇＧ２ｂ発現について分析した。
発明の詳細な説明
核酸（たとえばＤＮＡ）は、たとえばサイズが数メガダルトンの三次元ナノ構造体として製造することができる。ＤＮＡナノ構造体製造のそのような１つの方法は、ＤＮＡ origamiと呼ばれ、これは、任意のあらかじめ定められた形状およびサイズの三次元核酸構造体を生成するステップを含む（たとえば国際公開第２０１３１４８１８６ Ａ１号を参照されたい）。核酸ナノ構造体は、特にそれらが生分解性であり、部位特異的な方式で官能性をもたせることができ、アロステリックな立体構造的変化を受けるように操作することができ、標的分子および細胞との正確な相互作用を可能にするので、生物医学的な適用において大きな可能性を有する。
実際に、しかしながら、核酸ナノ構造体は、部分的に、生理学的条件下での不良な構造の完全性および急速な分解により、生物医学的な分野において使用が制限される。核酸ナノ構造体は、静電反発力を中和し、かつそれによってそれらの形状を安定化するために、１０ｍＭ以下のマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を典型的に必要とする。したがって、核酸ナノ構造体は、生物学的バッファー（たとえば、生理学的レベルのＭｇ２＋（たとえば０．６ｍＭ）およびＣａ２＋（たとえば１．２ｍＭ）を含有するバッファー）では不良な構造の完全性を示す。そのうえ、生物医学的な適用において典型的に使用される１０％ウシ胎児血清を含有する、新たに調製された細胞培地におけるＤＮアーゼＩの活性は、核酸ナノ構造体の急速な分解を引き起こす。
様々な態様および実施形態では、マグネシウムが枯渇し、ヌクレアーゼ活性がある生理学的条件下でさえ、それらの構造の完全性を維持し、かつヌクレアーゼ分解に抵抗するように操作される核酸ナノ構造体が、本明細書において提供される。本明細書における核酸ナノ構造体は、静電反発力を中和し、かつヌクレアーゼ分解に対する核酸抵抗性を増強し、それによって、ナノ構造体の形状を安定化する正に荷電しているポリアミンポリマー（たとえばポリリシンペプチド）またはポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせにより、典型的に亜飽和されている。いかなる特定の理論によっても拘束されないが、ポリアミンポリマーおよび核酸ナノ構造体の間の主要な相互作用は、静電気であり、正に荷電しているポリマーは、ナノ構造体の中に織り込むことができ、核酸の負に荷電しているリン酸骨格を覆い、したがって、核酸ヘリックスの厳重なパッキングを促すことができる。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーをさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、ポリアミンポリマー（たとえばポリリシンポリマー）およびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせを含む。
癌に対する免疫応答を増強するために使用される現在のワクチン接種アプローチは、たとえば、エクスビボにおいて樹状細胞を単離し、活性化し、次いで、これらのプログラムされた樹状細胞を患者の中に導入して戻すことを含む。これらの活性化された樹状細胞は、リンパ節に向かい、ナイーブＴ細胞に抗原を提示し、抗腫瘍応答を誘起する特異的なＴ細胞集団を刺激し、増やし得る。そのようなアプローチは、細胞単離およびインビトロにおける樹状細胞の修飾を必要とし、複数回の患者の処置、高コスト、および規制に関する問題に至る。９０％を超える移植された樹状細胞が死滅し、ほとんどリンパ節に向かわない。さらに、エクスビボにおける樹状細胞の修飾は、培養条件に依存性で、一過性で、したがって、インビボにおける移植の際に有効性を失い得る。
インビボにおいて直接、樹状細胞を活性化するための技術は、部分的に、薬剤および送達ビヒクルの分解に至る厳しい生理学的条件に耐えることができる薬剤および送達ビヒクルの不足により、制限されている。
態様によって、厳しい生理学的条件から薬剤を保護する、「ｐＨ感受性の核酸ナノカプセル」と本明細書において呼ばれるキャリヤ中に添加された（たとえばそれによってカプセル化された）薬剤の、樹状細胞などのような細胞へのインビボにおける送達のための方法が、本明細書において提供される。そのようなナノカプセルの内部コンパートメントは、薬剤が添加され、外部核酸「シェル」は、インビボにおける条件に関連する低塩条件およびヌクレアーゼ消化から薬剤を保護する。ターゲティング分子により典型的に装飾されるナノカプセルは、特定の細胞型（たとえば樹状細胞）に誘導することができる。細胞への侵入に際して、ナノカプセルは、開口し、薬剤を放出するように、ｐＨの変化によって誘因される。したがって、本開示のｐＨ感受性の核酸ナノカプセルは、既存の送達技術に比べて、インビボにおいて細胞に直接、より高用量の薬剤を送達するのを可能にする。
核酸ナノ構造体
本明細書において使用される「核酸ナノ構造体」は、二次元（２Ｄ）または三次元（３Ｄ）形状を形成する（たとえば自己組織化する）核酸を指す（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるW.M.Shih,C.Lin,Curr.Opin.Struct.Biol.20,276(2010)において概説される）。ナノ構造体は、任意の核酸フォールディングまたはハイブリダイゼーション方法論を使用して形成されてもよい。そのような１つの方法論は、ＤＮＡ origamiである（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるRothmund,P.W.K.Nature 440(7082):297-302(2006)を参照されたい）。ＤＮＡ origamiアプローチでは、ナノ構造体は、より長い「スキャフォールド」核酸鎖のフォールディングによって、それぞれがスキャフォールド鎖内の２つ以上の非隣接領域にハイブリダイズする複数のより短い「ステープル（staple）」オリゴヌクレオチドへのそのハイブリダイゼーションを通して生成される。いくつかの実施形態では、スキャフォールド鎖が、長さが少なくとも１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スキャフォールド鎖が、長さが少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、または少なくとも８０００ヌクレオチドである。スキャフォールド鎖は、天然に存在してもよいまたは天然に存在しなくてもよい。ステープル鎖は、長さが典型的に１００未満のヌクレオチドであるが、しかしながら、それらは、適用に依存してかつスキャフォールド鎖の長さに依存して、より長くてもより短くてもよい。いくつかの実施形態では、ステープル鎖が、長さが１５〜１００ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、ステープル鎖が、長さが２５〜５０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、スキャフォールド鎖の非存在下において組み立てられてもよい（たとえばスキャフォールドなしの構造体）。たとえば、多くのオリゴヌクレオチド（たとえば長さが２００未満のヌクレオチドまたは１００未満のヌクレオチド）は、核酸ナノ構造体を形成するように組み立てられてもよい。
核酸ナノ構造体を組み立てる他の方法は、当技術分野において知られており、それらのいずれか１つが本明細書において使用されてもよい。そのような方法は、たとえばBellot G.et al.,Nature Methods,8:192-194(2011);Liedl T.et al,Nature Nanotechnology,5:520-524(2010);Shih W.M.et al,Curr.Opin.Struct.Biol.,20:276-282(2010);Ke Y.et al,J.Am.Chem.Soc,131:15903-08(2009);Dietz H.et al,Science,325:725-30(2009);Hogberg B.et al,J.Am.Chem.Soc,131:9154-55(2009);Douglas S.M.et al,Nature,459:414-418(2009);Jungmann R.et al,J.Am.Chem.Soc,130:10062-63(2008);Shih W.M.,Nature Materials,7:98-100(2008);およびShih W.M.,Nature,All:618-21(2004)によって記載され、これらのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に援用される。
核酸ナノ構造体は、限定を伴うことなく、カプセル、半球体、立方体、立方形、四面体、円筒、錐体、八面体、角柱、球体、角錐、十二面体、チューブ、不規則な形状、および抽象的な形状を含む多くの定められた所定の形状のうちの１つに組み立てられてもよい。ナノ構造体は、空隙容量を有していてもよい（たとえば、空隙容量は、部分的にまたは全体として中空であってもよい）。いくつかの実施形態では、空隙容量が、ナノ構造体の容量の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、固体のコアを含まない。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、形状が環状でも、ほぼ環状でもない。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、コアが固体の球体ではない。意図される使用に依存して、核酸ナノ構造体は、二次元シートと同じくらい単純なまたは三次元カプセルもしくは格子と同じくらい複雑な（またはさらにより複雑な）形状に組み立てられてもよい。
核酸ナノ構造体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはその組み合わせから作製されてもよいまたはそれを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）が、合理的にデザインされる。核酸ナノ構造体は、ナノ構造体を形成する核酸が核酸ハイブリダイゼーションを誘導する所定の予測可能なヌクレオチド塩基対相互作用に基づいて選択される場合、「合理的にデザインされる」と本明細書において考えられる。たとえば、核酸ナノ構造体は、それらの合成に先立ってデザインされてもよく、それらのサイズ、形状、複雑性、および修飾は、合成プロセスにおいてある選択したヌクレオチド（たとえばオリゴヌクレオチド）を使用して、決められ、コントロールされてもよい。構造体におけるそれぞれの核酸の配置は、特定の形状のナノ構造体を合成する前にわかっており、提供されていてもよい。たとえば、自己組織化された核酸ナノ構造体をデザインするための基本原理は、相補的なセグメントを対にすることによって、核酸鎖が、適切な物理的条件下で、あらかじめ定められたナノ構造体に自己組織化するように、核酸鎖におけるその配列相補性が選択されることである。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、自己組織化核酸ナノ構造体である。同様に、ハンドルおよび反対のハンドルの核酸（たとえば薬剤またはターゲティング分子に連結される核酸）は、ナノ構造体の内部または外部表面に特異的に付加するように合理的にデザインされてもよく、いくつかの実施形態では、ナノ構造体のボディを形成する核酸とのインターカレーションもハイブリダイゼーションも伴わない。
本開示に従う使用のための核酸ナノ構造体の例は、限定を伴うことなく、カプセル、格子（E.Winfree,et al.Nature 394,539(1998);H.Yan,et al.Science 301,1882(2003);H.Yan,et al.Proc.Natl.Acad.of Sci.USA 100,8103(2003);D.Liu,et al.J.Am.Chem.Soc.126,2324(2004);P.W.K.Rothemund,et al.PLoS Biology 2,2041(2004)）、リボン（S.H.Park,et al.Nano Lett.5,729(2005);P.Yin,et al.Science 321,824(2008)）、チューブ（H.Yan Science(2003);P.Yin(2008)）、定められた形状を有する有限の二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）オブジェクト（J.Chen,N.C.Seeman,Nature 350,631(1991);P.W.K.Rothemund,Nature 440,297(2006);Y.He,et al.Nature 452,198(2008);Y.Ke,et al.Nano.Lett.9,2445(2009);S.M.Douglas,et al.Nature 459,414(2009);H.Dietz,et al.Science 325,725(2009);E.S.Andersen,et al.Nature 459,73(2009);T.Liedl,et al.Nature Nanotech.5,520(2010);D.Han,et al.Science 332,342(2011)）、ならびに巨視的結晶（J.P.Meng,et al.Nature 461,74(2009)）を含む。他の核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）が、本明細書において提供されるように使用されてもよい。
ポリリシン、カチオンポリマーは、たとえば治療用ＤＮＡの送達のために、コンパクトな粒子にプラスミドＤＮＡを凝縮することにおいて効率的であることが知られている。ＤＮＡは、ポリマー骨格に沿った繰り返しのリン酸基により非常に負に荷電しているポリマーである。ポリリシンなどのようなカチオンポリマーとの相互作用は、そのため、静電気による相互作用である。ＤＮＡ凝縮は、カチオンポリリシンポリマーとのその相互作用によるＤＮＡ上の負電荷の中和、その後に続く、水がＤＮＡ構造体から追い出される時の疎水性崩壊によって生じることが一般に認められている。一般に、ＤＮＡは、ポリリシンポリマーの重量ならびに凝縮条件（たとえば、ポリマーおよびＤＮＡの間の電荷比、塩濃度、ならびに温度）に依存して、ＤＮＡの負電荷の大部分またはすべてが、中和され、かつＤＮＡが、直径１２ｎｍ〜３００ｎｍのコンパクトな粒子に凝縮するように、ポリリシンポリマーにより過飽和される。いくつかの実施形態では、用語「凝縮された核酸」が、その非凝縮状態（たとえばポリリシンにより飽和されていないまたは過飽和されていない）の直径および／または容量の８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、または４０％未満である直径および／または容量を有する核酸粒子を指す。上記に記載される、凝縮され、コンパクトにされたＤＮＡ粒子と異なり、本開示の核酸ナノ構造体は、本開示に従ってポリアミンポリマーと複合体を形成する場合、コンパクトな粒子に凝縮されない。正確に言うと、本明細書において提供される核酸のナノ構造体は、構造体の構成が損なわれないように、ポリアミンポリマーにより「亜飽和される」。すなわち、本開示の核酸ナノ構造体は、正に荷電しているポリアミンポリマーのさらなる重量およびそれとの相互作用にもかかわらず、２Ｄまたは３Ｄ形状を有する。
したがって、本明細書において提供される核酸ナノ構造体が、いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーまたはポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせにより亜飽和される。上記に議論されるように、核酸ナノ構造体は、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の１００％未満がポリアミンポリマーのアミンおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている場合、ポリアミンポリマーおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより「亜飽和されている」と本明細書において考えられる。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体のリン酸の９８％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、または１０％未満が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の１０％〜９０％、１０％〜８０％、１０％〜５０％、２０％〜９０％、または２０％〜８０％が、ポリアミンポリマーのアミンおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている。そのような亜飽和レベルで、核酸ナノ構造体はなお、ポリアミンポリマーおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーとの相互作用にもかかわらず、それらの構造の完全性を維持する（たとえば、それらの本来の形状を保つ）。ポリアミンポリマーおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより亜飽和された核酸ナノ構造体は、ナノ構造体の形状が、同じ環境条件下で、コントロール核酸ナノ構造体（たとえばポリアミンポリマーおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより亜飽和されていない類似する核酸ナノ構造体）よりも長い期間、区別する／識別することができる場合、「その構造の完全性を維持する」と本明細書において考えられることを理解されたい。たとえば、図５において示されるように、ポリリシンホモポリマーにより亜飽和された核酸ナノ構造体は、環状形状として区別することができる（右手のカラム）が、ポリリシンホモポリマーなしのコントロール構造は、不規則な塊として現われる（中央のカラム）。したがって、図５のポリリシンホモポリマーにより亜飽和された核酸ナノ構造体は、それらの構造の完全性を維持していると考えられる。
ポリアミンポリマーのアミンおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンならびに核酸ナノ構造体のリン酸の関係はまた、リン酸に対するアミンの比に関して記載されてもよい。本明細書における「Ｎ／Ｐ比」は、核酸骨格のリン酸が構造体に寄与する負の（−）電荷に対する、プロトン化することができる（たとえばペプチドの側鎖で）第一級、第二級、または第三級アミンが構造体に寄与する正の（＋）電荷の比である。たとえば、ペプチドの真中のリシンは、１つの＋電荷を与えるが、ペプチドのＮ−末端のリシンは、２つの＋電荷を与える。したがって、「亜飽和された」は、０．９：１またはそれ以下のＮ：Ｐ比を指す（つまり、リン酸と比較してアミンの数が少ない）。「飽和された」は、比較すると、１：１のＮ：Ｐ比を指す。「過飽和された」は、１．１：１またはそれ以上のＮ：Ｐ比を指す（つまり、リン酸と比較して、アミンの数が多い）。したがって、いくつかの実施形態では、リン酸に対するアミンの比が（たとえば、核酸ナノ構造体骨格のリン酸と相互作用する（たとえば連結される）ポリアミンポリマーのアミンまたはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミン）が、１：１未満である。たとえば、アミンとリン酸の比が、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１であってもよい。いくつかの実施形態では、リン酸に対するアミンの比が、０．９：１〜０．１：１、０．９：１〜５：１、０．８：１〜０．１：１、または０．５：１〜０．１：１である。
本明細書において使用されるように、用語「核酸」および／または「オリゴヌクレオチド」は、共有結合で互いに連結された少なくとも２つのヌクレオチドを指してもよい。本開示の核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有してもよいが、ある場合には、たとえばホスホラミド（Beaucage et al.,Tetrahedron 49(10):1925(1993)およびその中の参考文献；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970);Sprinzl et al.,Eur.J.Biochem.81:579(1977);Letsinger et al.,Nucl.Acids Res.14:3487(1986);Sawai et al,Chem.Lett.805(1984)、Letsinger et al.,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988);ならびにPauwels et al.,Chemica Scripta 26:141 91986)）、ホスホロチオエート（Mag et al.,Nucleic Acids Res.19:1437(1991)；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al.,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989)、Ｏ−メチルホスホロアミダイト（O-methylphosphoroamidite)連結(Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Pressを参照されたい）、ならびにペプチド核酸骨格および連結（すべて参照によって組み込まれるEgholm,J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992);Meier et al.,Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992);Nielsen,Nature,365:566(1993);Carlsson et al.,Nature 380:207(1996)を参照されたい）を含む、他の骨格を有してもよい核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸は、正の骨格（Denpcy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097(1995)；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、米国特許第５，６３７，６８４号、米国特許第５，６０２，２４０号、米国特許第５，２１６，１４１号、および米国特許第４，４６９，８６３号；Kiedrowshi et al.,Angew.Chem.Inti.Ed.English 30:423(1991);Letsinger et al.,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988);Letsinger et al.,Nucleoside & Nucleotide 13:1597(1994);Chapters 2 and 3,ASC Symposium Series 580,“ Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook;Mesmaeker et al.,Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4:395(1994);Jeffs et al.,J.Biomolecular NMR 34:17(1994);Tetrahedron Lett.37:743(1996)）、ならびに米国特許第５，２３５，０３３号および米国特許第５，０３４，５０６号ならびにChapters 6 and 7,ASC Symposium Series 580,“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cookにおいて記載されるものを含む非リボース骨格を有するものを含む。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の定義内に含まれる（Jenkins et al.,Chem.Soc.Rev.(1995)pp169-176を参照されたい）。いくつかの核酸アナログは、Rawls,C & E News Jun.2,1997 page 35において記載される。これらの参考文献はすべて、参照によってこれによって明確に組み込まれる。核酸は、同種の骨格（たとえば全体的にホスホジエステルもしくは全体的にホスホロチオエート）または異種の（もしくはキメラ）骨格を有していてもよい。ホスホロチオエート骨格修飾は、ある条件下で、核酸を、ヌクレアーゼに対してそれほど感受性ではなくし、したがって、より安定性にする（未変性ホスホジエステル骨格核酸と比較して）。より高い安定性を核酸に提供してもよい他の連結は、限定を伴うことなく、ホスホロジチオエート連結、メチルホスホネート連結、メチルホスホロチオエート連結、ボラノホスホネート連結、ペプチド連結、アルキル連結、デホスホ型連結、およびその他同種のものを含む。したがって、いくつかの事例では、核酸は、天然に存在しない骨格を有する。リボースリン酸骨格の修飾は、たとえば、標識の追加を容易にするためにまたは生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるために行われてもよい。
核酸は、明記されるように、一本鎖（ｓｓ）もしくは二本鎖（ｄｓ）であってもよいまたは一本鎖および二本鎖配列の両方の一部を含有してもよい（たとえば、部分的に二本鎖である）。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キササニン（xathanine）、ヒポキササニン（hypoxathanine）、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の任意の組み合わせを含有する。本明細書において使用されるように、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログおよびアミノ修飾ヌクレオシドなどのような修飾ヌクレオシドを含む。そのうえ、「ヌクレオシド」は、天然に存在しないアナログ構造体を含む。したがって、たとえば、それぞれが塩基を含有するペプチド核酸の個々の単位は、本明細書においてヌクレオシドと呼ばれる。
核酸は、Ｂ型ＤＮＡ、Ｄ型ＤＮＡ、およびＬ型ＤＮＡなどのようなＤＮＡならびにＲＮＡならびにその様々な修飾体を含む。修飾体は、塩基修飾体、糖修飾体、および骨格修飾体を含む。これらの非限定的な例は、下記に提供される。
本明細書において提供されるように、使用されてもよいＤＮＡ変異体の非限定的な例は、Ｌ−ＤＮＡ（文献において知られているＤＮＡの骨格鏡像異性体）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ｂｉｓＰＮＡクランプ、偽相補的（pseudocomplementary）ＰＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはＤＮＡ−ＬＮＡ共核酸などのような上記の共核酸（co-nucleic acid）である。本明細書において提供されるように使用される核酸は、本質的に均一であっても、異種であってもよいことを理解されたい。例として、それらは、本質的に完全にＤＮＡであってもよいまたはそれらは、ＤＮＡおよび非ＤＮＡ（たとえばＬＮＡ）の単量体または配列を含んでいてもよい。したがって、核酸エレメントの任意の組み合わせが、使用されてもよい。核酸修飾体は、ある条件下で、核酸を、分解に対して、より安定性にしてもよいおよび／またはそれほど感受性でなくしてもよい。たとえば、いくつかの事例では、核酸は、ヌクレアーゼ抵抗性である。
核酸（たとえばｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡ）を合成する方法は、当技術分野において知られており、たとえば、それらの全体が本明細書に援用される米国特許第５，１４３，８５４号および米国特許第５，４４５，９３４号に記載される。
核酸は、インビトロにおいて合成されてもよい。自動化核酸合成を含む核酸を合成する方法もまた、当技術分野において知られている。ホスホロチオエート連結を含む骨格などのような修飾骨格を有するおよびキメラ修飾骨格を含む、骨格を含む核酸は、ホスホロアミデートまたはＨ−ホスホネート化学反応を用いる自動化技術を使用して合成されてもよい（F.E.Eckstein,“ Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach” IRL Press,Oxford,UK,1991およびM.D.Matteucci and M.H.Caruthers,Tetrahedron Lett.21,719(1980)）。アリールおよびアルキルホスホネート連結は、たとえば米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように作製することができ、たとえば米国特許第５，０２３，２４３番号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されるアルキルホスホトリエステル連結（荷電酸素成分がアルキル化される）は、市販で入手可能な試薬を使用して自動化固相合成法によって調製することができる。他のＤＮＡ骨格修飾体および置換体を作製する方法は、記載されている。Uhlmann E et al.(1990)Chem Rev 90:544;Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1:165;Crooke ST et al.(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129;およびHunziker J et al.(1995)Mod Synth Methods 7:331-417。
核酸は、そのうえまたはその代わりに、それらの糖の中に修飾を含んでいてもよい。たとえば、β−リボース単位またはβ−Ｄ−２’デオキシリボース単位は、修飾糖単位と交換することができ、修飾糖単位は、たとえば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、アラビノース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボース、好ましくは、２’−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボースである、２’−Ｏ−（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２、４−ジデオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ヘキソ−ピラノースならびに炭素環式（たとえばFroehler J(1992)Am Chem Soc 114:8320において記載される）および／または開鎖糖アナログ（たとえばVandendriessche et al.(1993)Tetrahedron 49:7223において記載される）および／またはビシクロ糖（bicyclosugar）アナログ（たとえばTarkov M et al.(1993)Helv Chim Acta 76:481において記載される）から選択される。
核酸は、それらの塩基において修飾を含んでいてもよい。修飾塩基は、修飾シトシン（５−置換シトシンなど（たとえば５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および非置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（たとえばＮ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン（pseudo-isocytosine）、縮合環系を有するシトシンアナログ（たとえばＮ、Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびその誘導体（たとえば５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニンなど）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２置換グアニン（たとえばＮ２メチルグアニン）などのような修飾グアニン、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（たとえばＮ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８−置換グアニン（たとえば８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、ならびに６−チオグアニンを含む。核酸は、一般的な塩基（たとえば３−ニトロピロール、Ｐ−塩基、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、およびＫ−塩基）ならびに／または芳香族環系（たとえばフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、ベンゾイミダゾールもしくはジクロロ−ベンゾイミダゾール、１−メチル−１Ｈ［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）を含んでいてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドの中に組み込まれてもよい特定の塩基対は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＮＡＲ，２００６，３４（２１）：６０９５−６１０１によって報告されるｄＺおよびｄＰ非標準核酸塩基対である。ｄＺ、ピリミジンアナログは、６−アミノ−５−ニトロ−３−（１’−β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）−２（１Ｈ）−ピリドンであり、そのワトソン−クリック相補体ｄＰ、プリンアナログは、２−アミノ−８−（１’−β−Ｄ−１’−デオキシリボフラノシル）−イミドアゾ［１，２−ａ］−１，３，５−トリアジン−４（８Ｈ）−オン］である。
例示的な実施形態では、核酸ナノ構造体が、一本鎖ゲノムＤＮＡを含む。たとえば、核酸ナノ構造体が、直鎖または環状一本鎖Ｍ１３プラスミドＤＮＡを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、プラスミドＤＮＡを含まない。
本開示の核酸ナノ構造体が、いくつかの実施形態では、凝縮された核酸を含まないことが十分に理解されたい。本明細書において使用されるように、「凝縮された核酸」は、たとえば、それ自体ねじられ、巻き上がり、コンパクトにされた核酸を指す（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるTeif VB,et al.Progress in Biophysics and Molecular Biology 105(3):208- 222を参照されたい）。用語「凝縮された核酸」は、別個の２Ｄまたは３Ｄ構成体を有する核酸ナノ構造体を除外する。
本開示の核酸ナノ構造体が、いくつかの実施形態では、コード核酸を含まないこともまた十分に理解されたい。すなわち、いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、非コード核酸（たとえば、タンパク質をコードしない核酸）を含む。本明細書において使用されるように、「コード核酸」は、タンパク質（たとえば治療用タンパク質）のアミノ酸の配列を特定するヌクレオチド配列を含有する核酸を指す。したがって、「非コード核酸」は、タンパク質のアミノ酸の配列を特定せず、したがって、ＲＮＡに転写されないまたはタンパク質に翻訳されない核酸である。他の実施形態では、核酸ナノ構造体が、１つ以上のコード核酸を含有してもよいことを理解されたい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体を作製するために使用される核酸が、いかなるアミノ酸をもコードしない。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体を作製するために使用される核酸が、１、２、３、４、または５つを超える連続するアミノ酸をコードしない。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体を作製するために使用される核酸が、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列、および／またはリボソーム結合部位配列などのような当技術分野に認識される調節エレメント／配列を含まない。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体を作製するために使用される核酸が、プラスミドではない。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体を作製するために使用される核酸が、１つを超える核酸を含有し、核酸が、互いに異なる。すなわち、核酸ナノ構造体の核酸は、複数の異なる核酸を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、脂質によってカプセル化されないまたはコーティングされない（たとえば連結されない）。たとえば、先行技術の様々な遺伝子送達方法は、疎水性成分に連結されたおよび／または脂質（たとえば脂質二重層など）によってカバーされた核酸ナノ構造体を利用し、これらは、ヌクレアーゼ分解を予防するように機能する（たとえば国際公開第２０１３１４８１８６ Ａ１号を参照されたい）。本開示は、いくつかの実施形態では、疎水性成分に連結されたおよび／または脂質によってカバーされた核酸ナノ構造体を除外する。他の実施形態では、しかしながら、核酸ナノ構造体が、１つ以上の疎水性成分および／または脂質に連結された１つ以上の核酸を含有してもよい。
核酸ナノカプセル
「核酸ナノカプセル」は、「シェル」と呼ばれる、外部表面および薬剤のカプセル化のための内部コンパートメントを有する核酸ナノ構造体を指す。「核酸ナノ構造体」は、より広くは、上記に記載されるように、二次元（２Ｄ）または三次元（３Ｄ）形状を形成する（たとえば自己組織化する）核酸を指す（たとえば、W.M.Shih,C.Lin,Curr.Opin.Struct.Biol.20,276(2010)において概説される）。薬剤は、薬剤が、ナノ粒子のコンパートメント内にあり、ナノカプセルの内部表面に直接または間接的に連結されているまたはそうでなければコンパートメント内に含有されている場合、核酸ナノカプセルによって「カプセル化されている」と考えられる。すなわち、薬剤は、いくつかの実施形態では、ナノ構造体を形成する核酸によりインターカレートされるのではなく、核酸ナノ構造体によってカプセル化される。たとえば、ナノカプセルの構成に関して、薬剤は、ナノカプセルの核酸「壁」の中にインターカレートされるのではなく、ナノカプセルの内部表面に付加されてもよい（たとえばハンドル／反対のハンドルの立体構造を介して）。インターカレーションは、ＤＮＡの平面の塩基の間での非共有結合による薬剤の挿入を指す。ナノ構造体を形成する核酸によりインターカレートされた薬剤は、典型的に、周囲の環境から保護されるのではなく、暴露され、したがって、分解をより受けやすい。
核酸ナノカプセルは、内部コンパートメントを有するカプセル様の構造体を形成するように、それぞれの末端部で「キャップされてもよい」。したがって、いくつかの実施形態では、核酸カプセルのそれぞれの末端部に、直径が２０ｎｍ未満の開口がある。いくつかの実施形態では、核酸カプセルのそれぞれの末端部に、直径が１５ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、９ｎｍ未満、８ｎｍ未満、７ｎｍ未満、６ｎｍ未満、５ｎｍ未満、４ｎｍ未満、または３ｎｍ未満の直径の開口がある。いくつかの実施形態では、核酸カプセルのそれぞれの末端部に、直径が２ｎｍ〜２０ｎｍ、２ｎｍ〜１５ｎｍ、または２ｎｍ〜１０ｎｍの開口がある。いくつかの実施形態では、ナノカプセルのそれぞれの末端部が、図１Ａにおいて示されるように、同心性の環から形成される核酸ナノ構造体によりキャップされる。図１Ａにおいて示される例示的なナノカプセルでは、同心性の環によりナノカプセルをキャップした後でさえ、ナノカプセルのそれぞれの末端部に小さな開口（たとえば直径１０ｎｍ未満）がなお残る。これは、核酸が曲がることができる程度についての制約の結果である。いくつかの実施形態では、この小さな開口が、１０ｎｍ未満（たとえば９ｎｍ未満、８ｎｍ未満、７ｎｍ未満、６ｎｍ未満、５ｎｍ未満、４ｎｍ未満、３ｎｍ未満、または２ｎｍ未満）の直径（または寸法）を有する核酸ナノ構造体により密封されるまたは「塞がれる」。たとえば、核酸ナノカプセルの開口端は、１つ以上の束の核酸ヘリックスにより密封されてもよい。たとえば、核酸ナノカプセルの開口端は、１つ以上のｎ−ヘリックスの束により密封されてもよく、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。本開示は、核酸ナノカプセルの開口端を密封する他の手段を企図する。
いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、スキャフォールド鎖の非存在下において組み立てられてもよい（たとえばスキャフォールドなしの構造体）。たとえば、多くの短い核酸（たとえば長さが２００未満のヌクレオチドまたは１００未満のヌクレオチド）は、核酸ナノカプセルを形成するように組み立てられてもよい。
核酸ナノ構造体の１つの利点は、それらが、限定を伴うことなく、半球体、立方体、立方形、四面体、円筒、錐体、八面体、角柱、球体、角錐、十二面体、チューブ、不規則な形状、および抽象的な形状を含む多くの定められた所定の形状のうちの１つに正確でコントロールされた方式で組み立てるられるよう合理的にデザインすることができることである。したがって、簡潔さのために、用語「カプセル」が、ナノ構造体を記載するために本明細書において使用されるが、本開示のナノカプセルは、構造体が外部表面および内部コンパートメントを含有する限り、図１Ａにおいて示されるように球状や長方形だけではなく、任意の形状をしていてもよいことを理解されたい。すなわち、本開示のナノカプセルは、空隙容量を有する（たとえば、部分的にまたは全体として中空である）。したがって、核酸ナノカプセルは、固体のコアを含まない。いくつかの実施形態では、空隙容量が、ナノカプセルの容量の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上であってもよい。
本開示の核酸ナノカプセルは、直径（またはカプセルの形状に依存して幅、高さ、もしくは長さ）が５ナノメーター（ｎｍ）ほどの小さなものおよび１０マイクロメートル（μｍ）ほどの大きなものであってもよい。したがって、用語「ナノカプセル」は、１０μｍ以下の直径を有する、マイクロメートルサイズのカプセルまたは「マイクロカプセル」を包含する。いくつかの実施形態では、本開示のナノカプセルが、５ｎｍ〜１μｍ、５ｎｍ〜９００ｎｍ、５ｎｍ〜８００ｎｍ、５ｎｍ〜７００ｎｍ、５ｎｍ〜６００ｎｍ、５ｎｍ〜５００ｎｍ、５ｎｍ〜４００ｎｍ、５ｎｍ〜３００ｎｍ、５ｎｍ〜２００ｎｍ、５ｎｍ〜１５０ｎｍ、５ｎｍ〜１００ｎｍ、５ｎｍ〜９０ｎｍ、５ｎｍ〜８０ｎｍ、５ｎｍ〜７０ｎｍ、５ｎｍ〜６０ｎｍ、５ｎｍ〜５０ｎｍ、５ｎｍ〜４０ｎｍ、または５ｎｍ〜３０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、本開示のナノカプセルが、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、本開示のナノカプセルが、６０ｎｍの直径を有する。
いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、図１Ａにおいて示されるように、カプセルの形状で形成される。たとえば、ナノカプセルは、ナノ構造体の間で接触部分を形成するようにつながれた複数のナノ構造体の集合体によって形成されてもよい。いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、複数の接触部分を形成するように互いにつながれた、２、３、４、またはそれ以上のナノ構造体を含有する。図１Ａは、２つの円筒状の（樽状とも呼ばれる）ナノ構造体が互いにつながれ、次いで、カプセルのそれぞれの末端部が「キャップ」の形態をした核酸の同心性の環により「キャップされる」、本開示の例示的な実施形態を示す。それぞれの円筒状のナノ構造体および／またはキャップ状のナノ構造体の高さ（Ｙ軸に沿って）が、いくつかの実施形態では、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、または５０ｎｍ〜６０ｎｍである。いくつかの実施形態では、それぞれの円筒状のナノ構造体の高さが、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、または８０ｎｍである。それぞれの円筒状のナノ構造体および／またはキャップ状のナノ構造体の直径または幅（Ｙ軸に沿って）が、いくつかの実施形態では、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、または５０ｎｍ〜６０ｎｍである。いくつかの実施形態では、それぞれの円筒状のナノ構造体の直径が、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、または８０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノカプセルの全高が、たとえば、図１Ａにおいて示されるように方向づけられる場合、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、１０ｎｍ〜３００ｎｍ、１０ｎｍ〜２００ｎｍ、１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、１０ｎｍ〜９０ｎｍ、１０ｎｍ〜８０ｎｍ、１０ｎｍ〜１０ｎｍ、または１０ｎｍ〜１０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ナノカプセルの全高が、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、または１５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、一本鎖ゲノムＤＮＡを含む。たとえば、いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、核酸ナノ構造体を形成するように短い核酸「ステープル」鎖によって誘導される、自己組織化する一本鎖ゲノムＤＮＡを含む。たとえば、核酸ナノカプセルを形成する核酸ナノ構造体は、直鎖または環状一本鎖Ｍ１３プラスミドＤＮＡを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、プラスミドＤＮＡを含まない。
保護コーティング
本開示の態様は、たとえば、マグネシウムおよび／またはカルシウムが枯渇し、ヌクレアーゼ活性がある生理学的条件下で、分解からナノカプセルを保護するポリアミンポリマー（たとえばポリリシンポリマー）ならびに／またはカチオンポリ（エチレンイミン）およびポリエチレングリコールのコポリマー（「ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマー」と呼ばれる）により「コーティングされた」核酸ナノカプセルを提供する。核酸ナノ構造体は、一般に、静電反発力を中和し、かつそれによってそれらの形状を安定化するために、１０ｍＭ以下のマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を典型的に必要とする。したがって、そのような構造体は、生物学的バッファー（たとえば、生理学的レベルのＭｇ２＋（たとえば０．６ｍＭ）およびＣａ２＋（たとえば１．２ｍＭ）を含有するバッファー）では不良な構造の完全性を示す。さらに、１０％ウシ胎児血清（それは生物医学的な適用では典型的に使用される）を含有する、新たに調製された細胞培地におけるＤＮアーゼＩの活性は、核酸ナノ構造体の急速な分解を引き起こす。核酸ナノカプセルの構造の完全性は、静電反発力を中和し、ヌクレアーゼ分解に対する核酸抵抗性を増強し、それによってナノカプセルの形状を安定化する正に荷電しているポリアミンポリマー（たとえばポリリシンペプチド）および／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにナノカプセルを連結することによって、生理学的条件（たとえば低塩条件を含む）下でさえ維持することができる。
簡潔さのために、ポリアミンポリマーおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより亜飽和された核酸ナノカプセルは、ポリアミンポリマーおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより「コーティングされる」と表される。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、ポリアミン（たとえばポリリシン）ポリマーによりコーティングされる。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーによりコーティングされる。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、ポリアミン（たとえばポリリシン）ポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせによりコーティングされる。
いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、ポリアミンポリマーおよび／またはＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーによりコーティングされない（たとえば連結されない）。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、疎水性成分に連結されおよび／または脂質（たとえば脂質二重層など）によってカバーされ、これらは、ヌクレアーゼ分解を予防するよう機能する（たとえば国際公開第２０１３１４８１８６ Ａ１号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示は、疎水性成分に連結されたおよび／または脂質によってカバーされた核酸ナノカプセルを除外する。
ポリアミンポリマー
本発明のポリアミンポリマーは、一般に、カチオンポリマーであり、これは、いかなる特定の理論によっても拘束されないが、核酸の負に荷電しているリン酸骨格を覆うために使用されてもよく、それによって、核酸ヘリックスの厳重なパッキングを促し、ナノ構造体の形状を安定化し、ヌクレアーゼ分解を遅らせる。本明細書において使用される「ポリアミンポリマー」は、２つ以上の第一級アミン基を有する化合物を包含する。ポリアミンポリマーはまた、第二級（たとえばＲ２ＮＨ）および第三級（たとえばＲ３Ｎ）アミンを有する化合物をも包含する。第二級および第三級アミンは、第一級アミンと同様の方法でプロトン化され、核酸骨格におけるリン酸と静電気的に相互作用してもよい。ポリアミンポリマーはまた、ポリカチオンポリマーをも包含する。ポリアミンポリマーは、いくつかの実施形態では、存在する、いくつかの実施形態では規則的な間隔で存在するカチオンを含む。
カチオンとして、ポリアミンポリマーは、静電気（たとえば非共有結合）相互作用によって核酸に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるポリアミンポリマーが、核酸ナノ構造体に非共有結合で連結される（たとえば静電的相互作用を介して）。他の実施形態では、しかしながら、ポリアミンポリマーが、核酸ナノ構造体に共有結合で連結されてもよい（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるEskelinen et.al.small 2012,8(13):2016-2020を参照されたい）。
ポリアミンポリマーは、その第一級アミン基に加えて、任意の１つ以上の官能基を含んでいてもよい。本明細書において使用されるように、「官能基」は、有機化合物中の水素と交換され、化合物の化学的作用を決定する原子またはカルボキシル基などのような原子団を指す。一般的な官能基の例は、限定を伴うことなく、アルカン、ケトン、アルケン、アルデヒド、アルキン、イミン、カルボン酸、ハロゲン化アルキル、エステル、アルコール、チオエステル、チオール、アミド、アシルリン酸、酸塩化物、チオエーテル、リン酸モノエステル、フェノール、およびリン酸ジエステルを含む。本開示のポリアミンポリマーは、直鎖（たとえばスペルミン、ペトナミン（petnamine）、ヘキサミン）ポリマー、分岐およびデンドリマーポリマーを含み、これらの非限定的な例は、図１２Ａ〜１２Ｃにおいて示される。本明細書において提供されるポリアミンポリマーはまた、キトサン、ポリ（２−メタクリロキシエチルトリメチル−塩化アンモニウム）、およびポリ（アリルアミン）を含む（たとえば図１２Ｃを参照されたい）。本明細書において提供されるような使用のためのポリアミンポリマーの他の非限定的な例は、表Ｉに示される。本開示のポリアミンポリマーは、いくつかの実施形態では、ポリマーの長さによって制限されない。たとえば、いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、少なくとも４つの官能基または単量体または単位を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５の官能基または単量体または単位を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の官能基または単量体または単位を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、４〜１５０、４〜１００、４〜５０、４〜２５、６〜１５０、６〜１００、６〜５０、６〜２５、８〜１５０、８〜１００、８〜５０、８〜２５、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１０〜２５、１２〜１５０、１２〜１００、１２〜５０、または１２〜２５の官能基または単量体または単位を含む。ポリマーがペプチドである場合、単量体または単位は、アミノ酸であってもよい。用語「単位」、「サブユニット」、および「単量体」は、区別なく使用されてもよい。ポリマーの単量体の例は、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、たとえば図１２Ａ〜１２Ｃにおいて示されるように、分岐ポリアミンポリマーである。
本開示の態様は、アミノ酸（たとえばアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）、および／またはそのアナログを含むポリアミンポリマーに関する。したがって、ポリアミンポリマーは、ペプチド（たとえばペプチド（たとえばアミド）結合によって連結されたアミノ酸単量体の短い鎖）を含んでいてもよいまたはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、リシンおよび／またはアルギニンなどのような正に荷電しているアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、ヒスチジンを含む。アミノ酸ベースのポリアミンポリマーは、ホモポリマーであってもよく、これらは、たとえば、連続したリシンアミノ酸の鎖（たとえばポリリシン）、連続したアルギニンアミノ酸の鎖（たとえばポリアルギニン）、または連続したヒスチジンアミノ酸の鎖（たとえばポリヒスチジン）などのような、複数の連続した同一のアミノ酸を含んでいてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ポリリシンポリマー（たとえばＫＫＫ（Ｋ）ｎ、ここでｎ≧１）を含む（たとえば亜飽和された）核酸ナノ構造体が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、ポリリシンポリマーが、ポリ−Ｌ−リシンポリマーであってもよい。他の実施形態では、ポリアルギニンポリマー（たとえばＲＲＲ（Ｒ）ｎ、ここでｎ≧１）を含む（たとえば亜飽和された）核酸ナノ構造体が、本明細書において提供される。他の実施形態では、ポリヒスチジンポリマー（たとえばＨＨＨ（Ｈ）ｎ、ここでｎ≧１）を含む（たとえば亜飽和された）核酸ナノ構造体が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、ヒスチジンタグを含まない。
上記に議論されるように、本開示のポリアミンポリマーは、いくつかの実施形態では、ポリマーの長さによって制限されない。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸ベースのポリマーが、少なくとも４つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、４〜１５０、４〜１００、４〜５０、４〜２５、４〜１５、６〜１５０、６〜１００、６〜５０、６〜２５、６〜１５、８〜１５０、８〜１００、８〜５０、８〜２５、８〜１５、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１０〜２５、１２〜１５０、１２〜１００、１２〜５０、または１２〜２５のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、ペプチドを含むまたはそれからなる。ペプチドの成分パーセントが、いくつかの実施形態では、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％のリシンである。いくつかの実施形態では、ペプチドの成分パーセントが、５０％〜１００％、５５％〜１００％、６０％〜１００％、６５％〜１００％、７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、または９０％〜１００％のリシンである。
ポリアミンポリマーのリシンが、いくつかの実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上の、非リシンアミノ酸などのような非アミン含有アミノ酸によって互いに分離される。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーのリシンが、１〜５または１〜１０の、非リシンアミノ酸などのような非アミン含有アミノ酸によって互いに分離される。いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーのリシンが、規則的に間を置いて配置される。以下のものは、規則的に間を置いて配置されたリシン（Ｋ）を有する直鎖ポリアミンポリマーの非限定的な例であり、ここで、Ｘが、非リシンアミノ酸または官能基であり、ｎが、１以上の任意の整数である：
（ｉ）Ｋ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−）ｎ−ＫもしくはＸ−（Ｋ−Ｘ−）ｎ、Ｋ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−）ｎもしくはＸ−（Ｋ−Ｘ−）ｎ−Ｋ；
（ｉｉ）Ｋ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−Ｘ−）ｎ−ＫもしくはＸ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−Ｘ−）ｎもしくはＫ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−Ｘ−）ｎもしくはＸ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−Ｘ−）ｎ−Ｋ；または
（ｉｉｉ）Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−）ｎ−ＫもしくはＸ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎもしくはＫ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−）ｎもしくはＸ−Ｘ−Ｘ−（Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）ｎ−Ｋ。
いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、分岐している。
ＰＥＩ−ＰＥＧポリマー
カチオンポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコポリマーは、本明細書において企図される。ポリアミンポリマーと組み合わせたＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーが、いくつかの実施形態では、核酸の負に荷電しているリン酸骨格を覆い、それによって、核酸ヘリックスの厳重なパッキングを促し、ナノ構造体の形状を安定化し、ヌクレアーゼ分解を遅らせるために使用されてもよい。カチオンとして、ＰＥＧ−ＰＥＩコポリマーは、静電気（たとえば非共有結合）相互作用によって核酸に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＰＥＧ−ＰＥＩコポリマーが、核酸ナノ構造体に非共有結合で連結されている（たとえば静電的相互作用を介して）。他の実施形態では、しかしながら、ＰＥＧ−ＰＥＩコポリマーが、核酸ナノ構造体に共有結合で連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧをＰＥＩと反応させることによって合成される。いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにおけるＰＥＧに対するＰＥＩのモル比が、１：５（約５０の第一級アミン）〜１：５０（約０の第一級アミン）である。たとえば、ＰＥＧに対するＰＥＩのモル比が、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５（約２５の第一級アミン）、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、または１：５０であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーが、１：５０のＰＥＧに対するＰＥＩのモル比を有する。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸ナノ構造体が、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより亜飽和されている（たとえば、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーおよびポリアミンポリマーの組み合わせにより亜飽和されている）。核酸ナノ構造体は、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の１００％未満がＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている場合、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより「亜飽和されている」と本明細書において考えられる。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体のリン酸の９８％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、または１０％未満が、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体骨格のリン酸の１０％〜９０％、１０％〜８０％、１０％〜５０％、２０％〜９０％、または２０％〜８０％が、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーのアミンに連結されている。そのような亜飽和レベルで、核酸ナノ構造体はなお、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーとの相互作用にもかかわらず、それらの構造の完全性を維持する（たとえば、それらの本来の形状を保つ）。ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより亜飽和された核酸ナノ構造体は、ナノ構造体の形状が、同じ環境条件下で、コントロール核酸ナノ構造体（たとえばＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより亜飽和されていない類似する核酸ナノ構造体）よりも長い期間、区別する／識別することができる場合、「その構造の完全性を維持する」と本明細書において考えられることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーおよびポリアミンポリマーが、核酸ナノ構造体に連続して追加される。たとえば、いくつかの実施形態では、ポリアミンポリマーが、核酸ナノ構造体に連結され、次いで、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーが、核酸ナノ構造体に連結されている。反対に、いくつかの実施形態では、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーが、核酸ナノ構造体に連結され、次いで、ポリアミンポリマーが、核酸ナノ構造体に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体へのポリマーおよびコポリマーの追加が、同時である。たとえば、ポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの混合物が、核酸ナノ構造体に追加されてもよい。
ｐＨ感受性
本開示の核酸ナノカプセルは、環境ｐＨにおける変化に感受性である。核酸ナノカプセルは、それがｐＨにおける変化に応じて構造変化を受ける場合、ｐＨに感受性であると考えられる。たとえば、本明細書において提供されるような核酸ナノカプセルの「開口」は、ｐＨ依存性である。図１Ａは、本開示の核酸ナノカプセルの例証となる例を示す。ナノカプセルは、２つの円筒状の核酸ナノ構造体および２つの核酸「キャップ」（たとえば核酸の同心性の環）から組み立てられる（図１Ａ（ｉ））。１つの円筒状のナノ構造体は、「ハンドル」と呼ばれる、ｐＨ感受性の一本鎖核酸が並ぶ（図１Ａ（ｉｖ）、上、ハンドルの位置を示す白色の点線）。他方の円筒状のナノ構造体は、「反対のハンドル」と呼ばれる、部分的に相補的の一本鎖核酸が並ぶ（図１Ａ（ｉｖ）、下、反対のハンドルの位置を示す白色の点線）。したがって、２つの円筒状のナノ構造体の接触部分は、ｐＨ感受性の一本鎖核酸が並ぶ。６未満のｐＨを有する水性環境では、核酸ナノカプセルは、ナノカプセル（図１Ａ（ｉｉ））を形成する２つのナノ構造体の間の接触部分に位置するｐＨ感受性の核酸の二量体化／ハイブリダイゼーションにより「密封された」立体構造のままである（図１Ａ（ｉｉ））。水性環境のｐＨが６未満まで減少する場合、核酸ナノカプセルは、「開口する」（たとえばその内部コンパートメントの内容物を放出させる）（図１Ａ（ｉｉｉ））。ナノカプセルの開口は、ｐＨ感受性のハンドルおよび反対のハンドルの解離による。
核酸ナノカプセルは、ナノカプセルの一方のナノ構造体の連結が、ナノカプセルの別のナノ構造体から分離するまたは部分的に分離する場合、「開口する」と考えられる。ナノカプセルの開口は、ナノカプセルの内部コンパートメント中に存在するカーゴを放出させるのを可能にする。例として、図１Ａ（ｉｖ）に関して、ナノカプセルを形成する２つのナノ構造体は、互いに部分的に分離している。したがって、ナノカプセルは、開いている。いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、ナノカプセルを形成する２つのナノ構造体の部分的な分離によって開口する。いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、ナノカプセルを形成する２つのナノ構造体の完全な分離によって開口する。
本開示のハンドルおよび反対のハンドル（たとえばｐＨ感受性のハンドルおよび反対のハンドル）は、互いに部分的に相補的であっても、互いに全体として相補的であってもよく、ハンドルおよび反対のハンドルが、６を超えるｐＨで二量体化し／ハイブリダイズし、６未満のｐＨで解離するように、それぞれの一本鎖核酸が、互いに部分的にまたは全体として相補的である領域を含有することを意味する。本明細書において使用されるように、より包括的な用語「相補的な」は、全体として相補的なおよび部分的に相補的な配列を包含する。２つの間で１００％の塩基対相補性がある場合、２つの一本鎖核酸または２つの一本鎖核酸の領域は、互いに全体として相補的であると考えられる。反対に、２つの間で１００％未満の塩基対相補性があり、２つの核酸が適した条件下で互いにハイブリダイズする場合、２つの一本鎖核酸または２つの一本鎖核酸の領域は、互いに部分的に相補的であると考えられる。たとえば、２つの一本鎖核酸は、２つの核酸の間でまたは核酸の２つの領域の間で５０％〜９９％、５０％〜９８％、５０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜８５％、５０％〜８０％、５０％〜７５％、５０％〜７０％、５０％〜６５％、または５０％〜６０％の塩基対相補性があり、２つの核酸が適した条件下で互いにハイブリダイズする場合、部分的に相補的であると考えられる。いくつかの実施形態では、適した条件が、６を超えるｐＨ（たとえば７の中性のｐＨ）を有する水溶液を含む。いくつかの実施形態では、適した条件が、６を超えるｐＨ（たとえば７の中性のｐＨ）および約２５℃〜３７℃の温度を有する水溶液を含む。
いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性のハンドルが、以下の配列を含むまたはそれからなる：「ｉ−モチーフ」と呼ばれる５’−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣ−３’（配列番号１）。ｉ−モチーフＤＮＡは、６未満へのｐＨの減少と同時に、Ｂ−ＤＮＡ二重らせん配列から一本鎖配列に変形する。６を超えるｐＨでは、ｉモチーフのハンドルおよび反対のハンドルは、二量体化し、６未満のｐＨ（たとえば５．５のｐＨ）では、ｉモチーフのハンドルおよび反対のハンドルは、解離する。
いくつかの実施形態では、反対のハンドルが、配列番号１の配列を含むまたはそれからなるｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、反対のハンドルが、配列番号１の配列を含むｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的であり、１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する。たとえば、いくつかの実施形態では、反対のハンドルが、以下の配列を含み：
、これは、配列番号１の配列を含むｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的であり、４つのヌクレオチドミスマッチを有する。いくつかの実施形態では、反対のハンドルが、以下の配列を含み：
、これは、配列番号１の配列を含むｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的であり、６つのヌクレオチドミスマッチを有する。
ｐＨ感受性のハンドルおよび反対のハンドルの間のヌクレオチドミスマッチの数は、ナノカプセルを開口する反応速度を微調整するために使用することができる。したがって、ｐＨ感受性のハンドルおよび反対のハンドルの間のミスマッチの数は、変動してもよい。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性のハンドルおよび反対のハンドルの間のヌクレオチドミスマッチの数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性のハンドルおよび部分的に相補的な反対のハンドルの間の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％のヌクレオチド塩基対が、ミスマッチである。「ミスマッチ」は、互いに相補的ではない１対のヌクレオチドを指す。すなわち、それらは、通常、互いにハイブリダイズしない。ヌクレオチドミスマッチの例は、Ａ−Ｃ、Ａ−Ｇ、Ｔ−Ｃ、およびＴ−Ｇを含む。
ハンドルおよび／または反対のハンドルは、長さが１５〜５０ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、ハンドルおよび／または反対のハンドルが、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または６０ヌクレオチドである。適用に依存して、ハンドルおよび／または反対のハンドルは、長さが５０を超えるヌクレオチドであってもよい。したがって、ハンドルおよび／または反対のハンドルの長さは、変動してもよい。
ハンドルおよび／または反対のハンドルが特定のｐＨで解離する度合いおよび割合は、合理的にデザインすることができる。考慮するべき因子は、一本鎖核酸の長さおよびヌクレオチドミスマッチの数を含む。いくつかの実施形態では、ハンドルおよび反対のハンドルが、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、または５．０のｐＨで解離するようにデザインされる。
いくつかの実施形態では、ハンドルおよび反対のハンドルが、細胞への侵入（たとえば細胞による取込み）の２０秒（ｓ）〜５分間（ｍｉｎ）以内に、解離して、ナノカプセルの開口をもたらすようにデザインされる。いくつかの実施形態では、ナノカプセルが、２０ｓ、３０ｓ、４０ｓ、５０ｓ、６０ｓ、７０ｓ、８０ｓ、９０ｓ、１００ｓ、１１０ｓ、２ｍｉｎ、３ｍｉｎ、４ｍｉｎ、または５ｍｉｎ以内に開口する。
本開示のハンドルは、共有結合または非共有結合によって核酸ナノカプセルに連結されてもよい。同様に、本開示の反対のハンドルは、共有結合または非共有結合によって薬剤に連結されてもよい。
非共有結合の例は、限定を伴うことなく、たとえばビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジンなどのようなタンパク質結合パートナー間の結合ならびにワトソン−クリックヌクレオチド塩基対相互作用とも呼ばれる核酸ハイブリダイゼーション相互作用を含む。いくつかの実施形態では、ハンドルが、ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジンを使用して、ナノカプセルに非共有結合で連結されてもよい。他の結合対は、当業者らに明らかになるであろう、また、ナノカプセルにハンドルをおよび／または薬剤に反対のハンドルを連結するための使用されてもよく、抗体／抗原およびリガンド／受容体結合対などのような高親和性タンパク質／タンパク質結合対を含む。ハンドルは、核酸ナノカプセルに部分的にハイブリダイズするようにデザインされてもよい。たとえば、ハンドルの一部分は、それがナノ構造体にハイブリダイズするように、ナノ構造体の領域に相補的であってもよく、ハンドルの別の部分は、反対のハンドルに部分的に相補的であってもよい。
共有結合の例は、限定を伴うことなく、チオール−マレイミド架橋剤化学反応（たとえば、チオール、たとえば、薬剤上のシステインおよび反対のハンドル上のマレイミドの間の共有結合）（たとえば、中程度の長さのシクロヘキサン安定化スペーサーアームの両端にＮＨＳ−エステルおよびマレイミド反応基を含有する、アミンとスルフヒドリル間の架橋剤であるスクシンイミジル−４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）とアミノ−ＤＮＡを反応させることによって生成される）、酵素によってトランスで触媒される共有結合、ＤＮＡへのタンパク質の連結（たとえば、タンパク質上のｙｂｂＲタグは、ＣｏＡ修飾核酸に連結されている）（たとえばYin,J.et al.Nat.Protoc.1(1):280-5,2006を参照されたい）、および核酸への修飾ＮＴＰの酵素的追加（たとえばSorensen,R.S.et al.ACS Nano 7(9):8098-104,2013を参照されたい）を含む。
ハンドルおよび反対のハンドルは、ナノカプセルを形成する２つの核酸ナノ構造体の接触部分に位置する。いくつかの実施形態では、ハンドルおよび反対のハンドルが、２つの核酸ナノ構造体の間で、接触部分の内側の表面および／または外部表面に沿って規則的に間を置いて配置される。たとえば、６０ｎｍの直径のナノ構造体について（円周の合計は、ｐｉ＊直径＝３．１４＊６０ｎｍ＝１９０ｎｍ）、１２対のハンドル／反対のハンドルが、接触部分の内側または外側で規則的に間を置いて配置されてもよい。いくつかの実施形態では、６０ｎｍの直径のナノ構造体について、２４対のハンドル／反対のハンドルが、接触部分の内側または外側で規則的に間を置いて配置されてもよい。いくつかの実施形態では、ハンドル／反対のハンドルが、規則的に間を置いて配置されず、そのため、不規則的に間を置いて配置される。本開示は、細胞への侵入と同時に（たとえば２０秒〜５分以内に）、ナノカプセルの開口を可能にする様々なハンドル／反対のハンドル立体構造を企図することを理解されたい。
その内部コンパートメントからの（および／またはその外部表面からの）核酸ナノカプセルによる薬剤の放出は、ｐＨにおける変化に依存性である。たとえば、図５Ａにおいて示されるように、薬剤は、ｐＨ感受性のハンドル／反対のハンドルの相互作用によってナノカプセルに間接的に連結される。図５Ａにおいて示されるナノカプセルは、ｐＨ感受性のハンドルにより装飾され、薬剤は、部分的に相補的な反対のハンドルにコンジュゲートされる（たとえば共有結合でコンジュゲートされる）。中性のｐＨ（生理学的条件のｐＨなど）で、たとえば、ハンドルおよび反対のハンドルは、二量体化し、それによって、薬剤をナノカプセルに連結する。ｐＨが６未満まで下がるにつれて（たとえば、ナノカプセルが細胞のエンドソームコンパートメントに入るにつれて）、ハンドルは、それ自体フォールドし、反対のハンドルから解離し、それによって反対のハンドル−薬剤コンジュゲートを「放出させ」、最終結果として、ハンドルおよび反対のハンドルはもはや互いにハイブリダイズせず、２つの（またはそれ以上の）ナノ構造体は、もはや互いに連結されず、密封されたカプセルを形成しない。
使用
本開示の核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）は、様々なインビトロにおけるおよびインビボにおける使用を有する。いくつかの実施形態では、インビボにおけるおよび／またはインビトロにおける使用に意図される薬剤（たとえば治療剤）を送達するためのスキャフォールド、ケージ、または多機能性キャリヤとして使用されてもよい。核酸ナノ構造体は、任意の適した送達方法によって、たとえば、静脈内にまたは経口的に送達されてもよい。本明細書において使用されるように、薬剤は、対象に利益（限定を伴うことなく、予防的なもしくは治療上の利益を含む）を提供するために使用することができるまたはインビボにおいて診断および／もしくは検出（たとえば画像化）に使用することができるまたはインビトロ設定において効果があるように使用されてもよい（たとえば組織もしくは器官培養、クリーンアッププロセス、およびその他同種のもの）任意の原子、分子、または化合物である。薬剤は、限定を伴うことなく、治療剤および／または診断剤であってもよい。いくつかの実施形態では、薬剤が、治療剤、予防剤、および／または診断剤である。いくつかの実施形態では、薬剤が、ターゲティング分子である。本明細書において記載される実施形態のいずれか１つとの使用のための薬剤の例は、下記に記載される。
本開示は、核酸ナノ構造体にアドレス可能度を与えることを企図する。たとえば、核酸ナノ構造体は、タンパク質、リガンド、または他の小さな生体分子などのようなターゲティング成分の部位特異的な付加によって修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、構造体上にまたは構造体内に、事実上任意の位置に、アクセサリー分子（たとえばビオチン／ストレプトアビジン）のナノメーター単位の具体的な配置のためのハンドルとして役立つ上記に記載される核酸「ステープル」鎖を含んでいてもよい（たとえば、それぞれが本明細書において参照によって組み込まれるStein et al.Chemphyschem.12(3),689-695(2011);Steinhauer et al.Angew Chem.Int.Ed.Engl.48(47),8870-8873(2009);Stein et al.J.Am.Chem.Soc.133(12),4193-4195(2011);Kuzyk et al.Nature 483(7389),311-314(2012);およびDing et al.J.Am.Chem.Soc.132(10),3248-3249(2010);Yan et al.Science 301(5641),1882-1884(2003);およびKuzuya et al.Chembiochem.10(11),1811-1815(2009)を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるナノ構造体の核酸が、合成の間にリンカー（たとえばビオチンリンカー）によりまたは酵素的手段を介して修飾されてもよい（たとえば共有結合で修飾されてもよい）（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるJahn et al.Bioconjug.Chem.22(4),819-823(2011)を参照されたい）。そのような方法はまた、酵素分子の化学的なビオチン化によって核酸ナノ構造体に反応系を置くために使用されてもよい（たとえばVoigt et al.Nat.Nanotechnol.5(3),200-203(2010)を参照されたい）。
より一般化された抗体ベースの結合アプローチもまた、定められた距離で標的タンパク質を核酸ナノ構造体に連結するために使用されてもよい（たとえば、それぞれが本明細書において参照によって組み込まれるWilliams et al.Angew Chem.Int.Ed.Engl.46(17),3051-3054(2007);およびHe Y et al.J.Am.Chem.Soc.128(39),12664-12665(2006)を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、１つ以上の抗体に連結されてもよい。
他の実施形態では、特定の分子標的に対する高い結合親和性と共に特異的な二次構造の形をとるＤＮＡアプタマーが、リンカーとして使用され、それによって、タンパク質リンカーの必要性をなくしてもよい（たとえば、それぞれが本明細書において参照によって組み込まれるEllington et al.Nature 346(6287),818-822(1990);Chhabra et al.J.Am.Chem.Soc.129(34),10304-10305(2007);およびRinker et al.Nat.Nanotechnol.3(7),418-422(2008)を参照されたい）。
本開示はまた、核酸ナノ構造体に、アフィニティータグまたは他のペプチドリンカーを選択的に追加する組換え遺伝子工学方法の使用をも企図する。たとえば、標的タンパク質のＣ−またはＮ−末端の末端部上の複数のヒスチジン残基からなるポリヒスチジン配列は、親和性ベースの精製のためによく使用されるタグである。これは、さらには、アミン（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるGoodman et al.Chembiochem.10(9),1551-1557(2009)を参照されたい）またはチオール修飾（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるShen et al.J.Am.Chem.Soc.131(19),6660-6661(2009)を参照されたい）核酸に共有結合でコンジュゲートされたニトリロ三酢酸分子にニッケル媒介性の相互作用を介して連結することができる。この方法によって、蛍光タンパク質は、核酸ナノ構造体に一定間隔をあけてまた特異的に置かれてもよい（Goodman et al.(2009);およびShen et al.(2009)）。同様に、組換えタンパク質のアフィニティー精製にも使用されるＳＮＡＰおよびＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ペプチド配列は、様々なタンパク質または酵素種による核酸ナノ構造体の直交性の装飾のために利用されてもよい（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるSacca et al.Angew Chem.Int.Ed.Engl.49(49),9378-9383(2010)を参照されたい）。ＤＮＡ結合ドメインにコンジュゲートされたキメラタンパク質の生成に関する関係するアプローチは、多くの場合複雑な化学合成技術およびオリゴヌクレオチド鎖にアフィニティータグ結合パートナーを安定してコンジュゲートするのに必要である毒性化合物（たとえばニッケル）を排除することができる。さらに、特異的な二本鎖配列を認識するジンクフィンガードメインは、本開示の核酸ナノ構造体上の特異的な位置に蛍光タンパク質を配置するために使用されてもよい（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるNakata et al.Angew Chem.Int.Ed.Engl.51(10),2421-2424(2012)を参照されたい）。
薬剤は、核酸ナノ構造体に共有結合でまたは非共有結合で付加されてもよい。薬剤および核酸ナノ構造体の間の連結の位置および性質は、薬剤の官能基に依存するであろう。例として、薬剤は、ナノ構造体から放出される（持続放出を含む）ことが意図されてもよく、その場合、薬剤およびナノ構造体の間の連結は、所望の放出プロファイルを実現するように選ばれてもよい。
いくつかの実施形態では、薬剤が、その結合形態で不活性であり、放出された場合だけ活性化されてもよい。
いくつかの実施形態では、薬剤が、ナノ構造体の集合（たとえば自己集合）の間に核酸と組み合わせられてもよいまたは薬剤が、あらかじめ形成された核酸ナノ構造体と組み合わせられてもよい。
薬剤は、ナノ構造体（たとえばナノカプセル）の内部表面（内部コンパートメント中の）または外部表面に連結されてもよい。薬剤は、様々な立体構造で配置されてもよい。図１４Ａは、両方の表面に連結されたハンドルを有する本開示の核酸ナノカプセルのあるセグメントの断面図の内部表面および外部接触部分を示す（左）。反対のハンドルに連結された薬剤（たとえば抗体、「危険」シグナル、造影剤、抗原）の例もまた、図１４Ａにおいて示される。反対のハンドルへのハンドルのハイブリダイゼーションに際して、薬剤は、核酸ナノカプセルに間接的に連結されるようになる。いくつかの実施形態で、図１４Ｂにおいて示されるように、ナノカプセルの外部表面（左）が、アジュバント分子（たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびターゲティング分子（たとえばｓｃＦＶ断片などのような抗体断片）の組み合わせを含有し、ナノカプセルの内部表面（右）が、追跡用色素および抗原の組み合わせを含有する。本開示のナノ構造体（たとえばナノカプセル）は、ナノ構造体（たとえばナノカプセル）の内部および／または外部表面で薬剤または１つを超える薬剤（たとえば異なる薬剤の組み合わせ）の正確な配置を可能にすることを理解されたい（たとえば図１４Ｃを参照されたい）。
本開示の核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）は、ナノカプセル上へのおよびその中への薬剤の高密度「パッキング」を可能にする。いくつかの実施形態で、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）が、５０ｎｍ２〜７５ｎｍ２当たりに１つの薬剤により装飾される。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、５０ｎｍ２、５５ｎｍ２、６０ｎｍ２、６５ｎｍ２、７０ｎｍ２、または７５ｎｍ２当たりに１つの薬剤により装飾される。たとえば、図１４Ｂにおいて示されるように、斜方格子の間隔を使用して、３０ｎｍの高さで、６０ｎｍの直径の円筒形のナノ構造体について、ナノ構造体の外部上の７２の位置および内部上の８４の位置が、薬剤によって占められてもよい。より大きなナノ構造体（たとえばナノカプセル）、たとえば、２つの３０ｎｍ×６０ｎｍの円筒形のナノ構造体を有するものについては、薬剤によって占められる位置の数が、２倍になる。さらにより大きなナノ構造体（たとえばナノカプセル）、たとえば、３つの３０ｎｍ×６０ｎｍの円筒形のナノ構造体を有するものについては、薬剤によって占められる位置の数が、３倍になる、などである。
本開示は、態様によって、全身的なまたは局所的な領域、組織、もしくは細胞への、核酸ナノ構造体または薬剤が添加された核酸ナノ構造体の送達を企図する。任意の薬剤が、本開示の方法を使用して送達されてもよい、ただし、それが、核酸ナノ構造体上にまたはその中に添加することができることを条件とする。そのようなプロセスが比較的無害であるので、事実上、任意の薬剤が使用されてもよいことが期待される。
本開示に従う使用のための薬剤は、タンパク質ベースの薬剤（タンパク質を含む）、核酸ベースの薬剤（核酸を含む）、化学物質ベースの薬剤（化学化合物を含む）、または前述のものの任意の２つ以上の組み合わせであってもよい。たとえば、薬剤は、抗体−医薬物質コンジュゲートであってもよい。「抗体−医薬物質コンジュゲート」は、抗体の複合体である（たとえば、生物学的に活性な小分子（たとえば小分子医薬物質）に連結されたモノクローナル抗体全体（ｍＡｈ）または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などのような抗体断片）。
本開示に従う使用のためのタンパク質ベースおよびペプチドベースの薬剤（たとえば治療用の、予防的な、および／または診断のタンパク質ベースの薬剤）の例は、限定を伴うことなく、抗体（たとえばモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体）、抗体断片（たとえば単鎖または多重鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片などのような抗体断片）、酵素、補助因子、受容体、リガンド、転写因子および他の調節因子、抗原、サイトカイン、ケモカイン、ならびにホルモンを含む。
本開示に従う使用のための核酸ベースの薬剤（たとえば治療用の、予防的な、および／または診断の核酸ベースの薬剤）の例は、限定を伴うことなく、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子などのようなＲＮＡ干渉分子を含む。核酸ベースの薬剤は、組換え（たとえば、２つの異なる核酸をつなぐことによって生成される天然に存在しない分子）または合成（たとえば、化学的にもしくは他の方法で合成された）であってもよい。
本開示に従う使用のための化学物質ベースの薬剤（たとえば治療用の、予防的な、および／または診断の化学物質ベースの薬剤）の例は、限定を伴うことなく、小分子（たとえば小分子医薬物質）を含む。「小分子」は、低分子量（たとえば＜９００ダルトン）有機化合物である。
「治療剤」は、対象（たとえばヒトまたは非ヒト対象）における状態を治療するために使用される薬剤である。「予防剤」は、対象（たとえばヒトまたは非ヒト対象）における状態を予防するために使用される薬剤である。本開示に従う使用のための治療剤および予防剤の例は、限定を伴うことなく、抗体、抗体断片、他のタンパク質およびペプチド、脂質、炭水化物、小分子、ポリマー、金属ナノ粒子、ＲＮＡ干渉分子（たとえばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス分子、抗原（たとえばペプチド抗原）、アジュバント（たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチド）、抗悪性腫瘍剤、抗癌、抗感染剤（たとえば抗菌物質、抗菌剤）、抗真菌剤、抗ウイルス剤（たとえば抗レトロウイルス剤）、抗炎症剤、代謝剤、免疫調節剤（たとえば免疫賦活性剤、免疫抑制剤）、抗高血圧剤、抗アルツハイマー剤、ならびに抗パーキンソン剤を含む。
「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する薬剤である。いくつかの実施形態では、アジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、シトシントリホスフェートデオキシヌクレオチド（「Ｃ」）、その後に続くグアニントリホスフェートデオキシヌクレオチド（「Ｇ」）を含有する短い一本鎖合成ＤＮＡ分子である。「ｐ」は、連続するヌクレオチドの間のホスホジエステルまたは修飾ホスホロチオエート（ＰＳ）連結を指す。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、典型的に、核酸ナノ構造体の免疫賦活性効果を増強する（Li,J.et al.ACS NANO,5(11):8783-8789,2011;Schuller,V.et al.ACS NANO,5(12):9696-9702,2011）。たとえば、それらが細胞によって取込まれた後、微生物のＤＮＡの特徴であるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫賦活性効果を誘発するために下流の経路を活性化するエンドソームＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識され、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターロイキン（ＩＬ）−６、およびＩＬ−１２を含む様々な炎症促進性サイトカインの高レベルの分泌をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、核酸ナノカプセルの内部表面に連結されている。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、核酸ナノカプセルの外部表面に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、内部および外部表面の両方に連結されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを有する。アジュバントの他の例は、限定を伴うことなく、リポ多糖およびポリＬＣ（ｄｓＲＮＡ模倣物）を含む。
「診断剤」は、対象（たとえばヒトまたは非ヒト対象）における状態を診断するために使用される薬剤である。本開示に従う使用のための治療剤および予防剤の例は、限定を伴うことなく、造影剤（たとえばコントラスト剤、放射性剤、追跡用色素（たとえば蛍光色素））を含む。「造影剤」は、シグナルを直接または間接的に発する薬剤であり、それによって、インビボにおいてその検出を可能にする。コントラスト剤および放射性剤などのような造影剤は、核医学検査および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などのような医学的画像処理技術を使用して検出することができる。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）のための造影剤は、Ｇｄ（ＤＯＴＡ）、酸化鉄、または金ナノ粒子を含み、核医学のための造影剤は、２０１ Ｔｌ、ガンマ線を放射する放射性核種９９ ｍＴｃを含み、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）のための造影剤は、ポジトロンを放射する同位体、（１８）Ｆ−フルオロデオキシグルコース（（１８）ＦＤＧ）、（１８）Ｆ−フッ化物、銅−６４、ガドアミド（ｇａｄｏａｍｉｄｅ）、および２０３ＰｂなどのようなＰｂ（ＩＩ）の放射性同位体、ならびに１ ｌｌｎ；蛍光色素または色素コンジュゲートナノ粒子などのようなインビボにおける蛍光画像化のための造影剤を含む。いくつかの実施形態では、送達されることになっている薬剤が、造影剤にコンジュゲートされるまたは融合されるまたは混合されるまたは組み合わせられる。
薬剤は、天然に存在してもよいまたは天然に存在しなくてもよい（たとえば天然に存在しない化学化合物）。天然に存在する薬剤は、核酸ナノ構造体が投与される対象によって合成することができるものを含む。天然に存在しないものは、植物、動物、微生物、または他の生物によって生成されるかどうかにかかわらず、通常、本質的に存在しないものである。天然に存在する薬剤を含む核酸ナノカプセルが、全体として、天然に存在しないものと考えられることを理解されたい。
薬剤は、限定を伴うことなく、小分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（たとえばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、ウイルス様粒子、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、炭水化物、およびアナログ、誘導体、混合物、融合物、その組み合わせまたはコンジュゲートを含む化学化合物であってもよい。薬剤は、代謝され、したがって、その活性の（および／または安定性の）形態にインビボにおいて変換されるプロドラッグであってもよい。本開示は、核酸ナノ構造体における１つを超えるタイプの薬剤の添加および／または様々な薬剤を含むナノ構造体の使用の組み合わせをさらに企図する。
治療上のまたは診断の目的に現在使用されている様々な薬剤は、本開示によって送達することができ、これらは、限定を伴うことなく、造影剤、免疫賦活性剤および免疫阻害剤（たとえばシクロスポリン）などのような免疫調節剤、抗原、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、抗癌剤、抗感染剤、核酸、抗体またはその断片、サイトカイン−抗体融合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質などのような融合タンパク質、鎮痛剤、オピオイド、酵素阻害剤、神経毒、睡眠薬、抗ヒスタミン、潤滑剤、精神安定剤、抗痙攣薬、筋弛緩剤、抗パーキンソン剤、鎮痙薬、チャネルブロッカー、縮瞳薬、および抗コリン薬を含む筋収縮薬（muscle contractant）、抗緑内障化合物、細胞成長阻害剤および抗接着分子を含む細胞−細胞外マトリックス相互作用の修飾因子、血管拡張剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質合成の阻害剤、抗高血圧剤、解熱剤、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症剤、抗血管新生薬因子、抗分泌性因子、抗凝固薬、および／または抗血栓剤、局所麻酔薬、点眼薬（ophthalmic）、プロスタグランジン、ターゲティング剤、神経伝達物質、タンパク質、細胞応答モディファイヤー、ならびにワクチンを含む。任意の１つ以上の前述の薬剤が本開示の核酸ナノ構造体から明確に除外されてもよいことを理解されたい。
「ターゲティング分子」は、関心のある標的細胞に核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する分子である。たとえば樹状細胞、腫瘍細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのような細胞型を標的にするターゲティング分子が、本明細書において企図される。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、標的細胞上に存在する細胞外の関連する分子に特異的に結合する。本開示に従う使用のためのターゲティング分子の例は、限定を伴うことなく、抗体、抗体断片、およびリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、樹状細胞（ＤＣ）に特異的に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、標的樹状細胞上で豊富なＤＥＣ２０５に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、ＤＥＣ２０５に特異的に結合する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえばＢＤＣＡ３＋細胞、ランゲルハンス細胞、皮膚ＣＤ１ａ＋細胞、ＢＤＣＡ１＋細胞、ｍｏＤＣ細胞、またはｐＤＣ細胞などのようなＤＣのサブセットに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、ＤＣＡＲ１、デクチン１、デクチン２、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ランゲリン、ＭＧＬ、ＭＲ、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｈ、ＢＳＴ−２、またはＢＤＣＡ−２に特異的に結合する（Kreutz,M.et al.Blood,121(15):2836,2013）。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に腫瘍細胞に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、腫瘍細胞の表面に存在するアルファ（ｖ）ベータ（３）インテグリン、葉酸受容体、および／または上皮成長因子受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチド（たとえばｃＲＧＤペプチド）である。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に幹細胞に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、幹細胞（たとえばＣＤ３４＋、ＣＤ３１−、ＣＤ１１７＋幹細胞）の表面に存在するＣＤ３４またはＣＤ１１７に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に白血球に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、白血球（たとえば顆粒球、単球、Ｔリンパ球、調節性Ｔ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、Ｂリンパ球、血小板、および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）の表面に存在するＣＤ４５＋に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に顆粒球に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、顆粒球（たとえばＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１５＋、ＣＤ２４＋、ＣＤ１１４＋＋、ＣＤ１８２＋顆粒球）の表面に存在するＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ２４、ＣＤ１１４、またはＣＤ１８２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に単球に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、単球（たとえばＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１４＋、ＣＤ１１ａ＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ９１＋、またはＣＤ１６＋単球）の表面に存在するＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１１４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ９１、またはＣＤ１６に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的にＴリンパ球に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、Ｔリンパ球（たとえばＣＤ４５＋、ＣＤ３＋Ｔリンパ球）の表面に存在するＣＤ４５またはＣＤ３に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的にＴヘルパー細胞に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、Ｔヘルパー細胞（たとえばＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞）の表面に存在するＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ４＋に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に調節性Ｔ細胞に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、調節性Ｔ細胞（たとえばＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞）の表面に存在するＣＤ４、ＣＤ２５、またはＦｏｘｐ３に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に細胞障害性Ｔ細胞に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、細胞障害性Ｔ細胞（たとえばＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞）の表面に存在するＣＤ４５、ＣＤ３、またはＣＤ８に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的にＢリンパ球に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、Ｂリンパ球（たとえばＣＤ４５＋、ＣＤ１９＋またはＣＤ４５＋、ＣＤ２０＋、ＣＤ２４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ２２＋Ｂリンパ球）の表面に存在するＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ３８、またはＣＤ２２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に血小板に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、血小板（たとえばＣＤ４５＋、ＣＤ６１＋血小板）の表面に存在するＣＤ４５またはＣＤ６１に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的にＮＫ細胞に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、ＮＫ細胞（たとえばＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、ＣＤ３１＋、ＣＤ３０＋、ＣＤ３８＋ＮＫ細胞）の表面に存在するＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３１、ＣＤ３０、またはＣＤ３８に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に神経幹細胞に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、神経幹細胞の表面に存在するＡＢＣＧ２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＡＳＣＬ１／Ｍａｓｈ１、ノギン、ベータ−カテニン、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｂｒｇ１、Ｎｒｆ２、Ｎ−カドヘリン、Nucleostemin、カルシトニン Ｒ、Ｎｕｍｂ、ＣＤ１５／Lewis X、Ｏｔｘ２、ＣＤＣＰ１、Ｐａｘ３、ＣＯＵＰ−ＴＦ Ｉ／ＮＲ２Ｆ１、Ｐａｘ６、ＣＸＣＲ４、ＰＤＧＦ Ｒアルファ、ＦＡＢＰ７／Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＫＣゼータ、ＦＡＢＰ ８／Ｍ−ＦＡＢＰ、Prominin−２、ＦＧＦＲ２、ＲＯＲ２、ＦＧＦＲ４、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＦｏｘＤ３、ＲＸＲアルファ／ＮＲ２Ｂ１、Frizzled-9、ｓＦＲＰ−２、ＧＡＴＡ−２、ＳＬＡＩＮ １、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、ＳＯＸ１、ＧＦＡＰ、ＳＯＸ２、Ｇｌｕｔ１、ＳＯＸ９、ＨＯＸＢ１、ＳＯＸ１１、ＩＤ２、ＳＯＸ２１、Meteorin、ＳＳＥＡ−１、ＭＳＸ１、ＴＲＡＦ−４、Musashi-1、ビメンチン、Musashi-2、ＺＩＣ１、またはネスチンに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に神経前駆細胞に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、神経前駆細胞の表面に存在するＡ２Ｂ５、ＡＰ−２アルファ、ＡＴＰアーゼＮａ＋／Ｋ＋輸送アルファ１、アクチビン ＲＩＩＡ、Ｂｒｇ１、ＣＤ１６８／ＲＨＡＭＭ、ＣＤ４、ダブルコルチン／ＤＣＸ、Frizzled 4／ＣＤ３４４、ＧＡＰ４３、Jagged1、ラミニン、ＭＳＸ１／ＨＯＸ７、Ｍａｓｈ１、Musashi-1、ネスチン、ネトリン−１、ネトリン−４、Neuritin、ＮｅｕｒｏＤ１、神経フィラメントアルファ−インターネキシン／ＮＦ６６、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Nucleostemin、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ３、Ｓ１００Ｂ、ＳＯＸ２、セマフォリン ３Ｃ、セマフォリン ６Ａ、セマフォリン ６Ｂ、セマフォリン ７Ａ、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、チューブリン βＩＩ、Ｔｕｊ １、またはビメンチンに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に初期のニューロンに、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、初期のニューロンの表面に存在するＡＴＨ１／ＭＡＴＨ１、ＡＳＨ１／ＭＡＳＨ１、ＨＥＳ５、ＨｕＣ／Ｈｕ、ＨｕＤ、Ｉｎｔｅｒｎｅｘｉｎ α、Ｌ１神経接着分子、ＭＡＰ１Ｂ／ＭＡＰ５、ＭＡＰ２Ａ、ＭＡＰ２Ｂ、神経成長因子 Ｒｅｃ／ＮＧＦＲ）、ネスチン、ＮｅｕｒｏＤ、神経フィラメントＬ ６８ｋＤａ、神経特異的エノラーゼ／ＮＳＥ、ＮｅｕＮ、Ｎｋｘ−２．２／ＮＫ−２、ノギン、Ｐａｘ−６、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、Ｔｂｒ１、Ｔｂｒ２、チューブリン βＩＩＩ、ＴＵＣ−４、またはチロシンヒドロキシラーゼ／ＴＨに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に未成熟ニューロンおよび／または成長円錐に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、未成熟ニューロンおよび／または成長円錐の表面に存在するコラプシン応答媒介性タンパク質１／ＣＲＭＰ１、コラプシン応答媒介性タンパク質２／ＣＲＭＰ２、コラプシン応答媒介性タンパク質５／ＣＲＭＰ５、コンタクチン−１、システインリッチ運動ニューロン１／ＣＲＩＭ１、ｃ−Ｒｅｔ蛍光体セリン６９６、ダブルコルチン／ＤＣＸ、エフリンＡ２、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、ＧＡＰ−４３、ＨｕＣ、ＨｕＤ、Internexinアルファ、ラミニン−１、ＬＩＮＧＯ−１、ＭＡＰ１Ｂ／ＭＡＰ５、Ｍｉｃａｌ−３、ＮＡＰ−２２、ＮＧＦＲ、ネスチン、ネトリン−１、ニューロピリン、プレキシン−Ａ１、ＲａｎＢＰＭ、セマフォリン３Ａ、セマフォリン３Ｆ、セマフォリン４Ｄ、Ｓｌｉｔ２、Ｓｌｉｔ３、Staufen、Ｔｂｒ１、Ｔｂｒ２、Ｔｒｋ Ａ、チューブリンβＩＩＩ、またはＴＵＣ−４に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に、分化した有糸分裂後のニューロンに、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、分化した有糸分裂後のニューロンの表面に存在するＮｅｕＮ、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、ＧＡＤ、ＴＨ、ＰＳＤ−９５、シナプトフィジン、ＶＡＭＰ、またはＺＥＮＯＮに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に運動ニューロンに、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、運動ニューロンの表面に存在するＣｈＡＴ／コリンアセチルトランスフェラーゼＣｈｏｘ１０、Ｅｎ１、Ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄ／Ｅｖｅ、Ｅｖｘ１、Ｅｖｘ２、線維芽細胞増殖因子−１／ＦＧＦ１、ＨＢ９、Ｉｓｌ１、Ｉｓｌ２、Ｌｉｍ３、Ｎｋｘ６、ｐ７５ニューロトロフィン受容体、ＲＥＧ２、Ｓｉｍ１、ＳＭＩ３２、またはＺｆｈ１に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的に、ニューロンのシナプス周囲の領域に、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、ニューロンのシナプス周囲の領域の表面に存在する４．１Ｇ、アセチルコリンエステラーゼ、Ａｃｋ１、ＡＭＰＡ受容体結合タンパク質／ＡＢＰ、ＡＲＧ３．１、Ａｒｐ２、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、Calcyon、カテニンアルファおよびベータ、カベオリン、ＣＨＡＰＳＹＮ−１１０／ＰＳＤ９３、クロモグラニンＡ、クラスリン軽鎖、コフィリン、コンプレキシン１／ＣＰＬＸ１／Synaphin 2、コンタクチン−１、ＣＲＩＰＴ、システインストリングタンパク質／ＣＳＰ、ダイナミン１、ダイナミン２、フロチリン−１、フォドリン、ＧＲＡＳＰ、ＧＲＩＰ１、ホーマー、Ｍｉｎｔ−１、Ｍｕｎｃ−１８、ＮＳＦ、ＰＩＣＫ１、ＰＳＤ−９５、ＲＡＢ４、Rabphillin 3A、ＳＡＤ Ａ、ＳＡＤ Ｂ、ＳＡＰ−１０２、ＳＨＡＮＫ１ａ、ＳＮＡＰ−２５、Snapin、スピノフィリン／ニューラビン−１、Stargazin、Striatin、ＳＹＧ−１、シナプス小胞タンパク質２Ａ、シナプス小胞タンパク質２Ｂ、シナプシン１、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ、シナプトジャニン１、シナプトフィジン、シナプトタグミン、ｓｙｎＧＡＰ、Synphilin-1、シンタキシン１、シンタキシン２、シンタキシン３、シンタキシン４、シヌクレインアルファ、ＶＡＭＰ−２、小胞アセチルコリン輸送体／ＶＡＣｈＴ、小胞ＧＡＢＡ輸送体／ＶＧＡＴ／ＶＩＡＡＴ、小胞グルタミン酸輸送体１、２、３／ＶＧＬＵＴ、小胞モノアミン輸送体１、または小胞モノアミン輸送体１２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的にコリン作動性ニューロンに、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、コリン作動性ニューロンの表面に存在するアセチルコリン／Ａｃｈ、アセチルコリンエステラーゼ、コリンアセチルトランスフェラーゼ／ＣｈＡＴ、コリン輸送体、または小胞アセチルコリン輸送体／ＶＡＣｈＴに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、特異的にドーパミン作動性ニューロンに、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、ドーパミン作動性ニューロンの表面に存在するアドレナリン、ドーパミン、ドーパミンベータヒドロキシラーゼ／ＤＢＨ、ドーパミン輸送体／ＤＡＴ、Ｌ−ＤＯＰＡ、一酸化窒素ドーパミン、ノルエピネフリン、ノルエピネフリン輸送体／ＮＥＴ、パーキン、チロシンヒドロキシラーゼ／ＴＨ、またはトーシンＡに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子は特異的にセロトニン作動性のニューロンに核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、セロトニン作動性ニューロンの表面に存在するＤＬ−５−ヒドロキシトリプトファン、セロトニン、セロトニン輸送体／ＳＥＲＴ、またはトリプトファンヒドロキシラーゼに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を特異的に誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの表面に存在するＤＡＲＰＰ−３２、ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ輸送体１、ＧＡＢＡ輸送体２、ＧＡＢＡ輸送体３、グルタミン酸デカルボキシラーゼ／ＧＡＤ、または小胞ＧＡＢＡ輸送体／ＶＧＡＴ／ＶＩＡＡＴに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、グルタミン酸作動性ニューロンに、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）を特異的に誘導する。いくつかの実施形態では、ターゲティング分子が、たとえば、グルタミン酸作動性ニューロンの表面に存在するグルタミン酸、グルタミン酸輸送体、グルタミン、グルタミンシンテターゼ、小胞グルタミン酸輸送体１、小胞グルタミン酸輸送体２、および／または小胞グルタミン酸輸送体３に特異的に結合する。
本開示の核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）が、１つのまたは１つを超えるターゲティング分子（たとえば様々なターゲティング分子の組み合わせ）を有していてもよいことを理解されたい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）が、ターゲティング分子、抗原、およびアジュバントを含む。たとえば、核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）は、ＤＥＣ２０５、抗原（たとえばペプチド抗原）、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドに特異的に結合する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含んでいてもよい。
本開示の核酸ナノ構造体がインビボにおいて使用される場合、それらは、本明細書において企図される核酸ナノ構造体の送達から予防的に、治療的に、または予後におそらく利益を得るであろう、事実上任意の対象のタイプに投与することができる。
投与が企図される「対象」は、ヒト（たとえば任意の年齢グループの男性もしくは女性、たとえば、小児の対象（たとえば乳児、子供、青年）、または成人の対象（たとえば若年の成人、中年の成人、もしくは年輩の成人））ならびに／または他の非ヒト動物、たとえば、哺乳動物（たとえば霊長動物（たとえばカニクイザル、アカゲザル）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、および／またはイヌなどのような市販で適切な哺乳動物を含む）、鳥（たとえば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなどのような市販で適切な鳥）、爬虫類動物、両生動物、ならびに魚を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ヒト動物が、哺乳動物である。非ヒト動物は、オスまたはメスで、発生の任意の段階であってもよい。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が投与される対象が、１つ以上の特定の薬剤の全身性のまたは局所的な送達から診断することができるまたは利益を得ることができるまたは予防することができる状態を有していてもよいまたはそれを発症する危険性があってもよい。そのような状態は、癌（たとえば固形腫瘍癌）、感染症（たとえば、特に、身体における特定の領域もしくは組織に局所的な感染症）、自己免疫性障害、アレルギー、もしくはアレルギー性の状態、喘息、移植拒絶反応、糖尿病、および／または心疾患を含む。
いくつかの実施形態では、そのような状態が障害と考えられるかどうかにかかわらず、薬剤が、状態の発病を予防するために送達される。
いくつかの実施形態では、対象が、移植を必要としてもよくまたは既に移植を受けていてもよく、本開示の核酸ナノ構造体は、そのような移植療法と共に使用されることになっている。
核酸ナノ構造体（たとえばナノカプセル）および核酸ナノカプセルを含有する組成物は、皮下にまたは静脈内に（たとえば単一の／複数の注射もしくは連続注入）または他の手段によって、対象（たとえばヒトまたは非ヒト対象）に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、核酸ナノカプセルが、ポリマーゲル組成物の構成成分として対象に投与される。ポリマーゲル組成物は、生分解性および／または生体適合性であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリマーゲル組成物が、少なくとも１つのポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡポリマー、アルギン酸およびアルギン酸誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、天然および合成多糖、ポリペプチド、特にポリ（リシン）などのようなポリアミノ酸、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ−イプシロン−カプロラクトンなどのようなポリエステル、ポリ酸無水物；ポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、特にポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＭ）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４−アミノメチルスチレン）などのような修飾スチレンポリマー、プルロニックポリオール、ポリオキサマー（polyoxamer）、ポリ（ウロン酸）、ポリ（ビニルピロリドン）、ならびにグラフトコポリマーを含む上記のコポリマーから形成されるならびに／またはを含む（たとえば国際公開第２００９１０２４６５号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、直接、身体において、樹状細胞動員および活性化を操作するための方法を提供する。未成熟樹状細胞は、末梢組織をパトロールしており、異物（たとえば抗原）の取込みと同時に、それらは、成熟して、それらの表面に分子（たとえば受容体ＣＣＲ７および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原）を発現し、リンパ節ホーミングおよび続くＴ細胞への抗原提示をそれぞれ促進する。樹状細胞を動員し、活性化する感染症のエレメントは、炎症性サイトカインおよび特に感染病原体と関係する「危険シグナル」を含む。シトシン−グアノシンオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）配列は、細菌ＤＮＡにおいて独自に発現され、哺乳動物の樹状細胞活性化および樹状細胞情報交換を刺激する、効力のある危険シグナルである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、抗原（たとえば癌抗原）および危険シグナル（たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチド）を含む核酸ナノカプセルを対象に投与するための方法を提供する。
本開示のいくつかの態様は、ポリアミンポリマーまたはポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせにより亜飽和された、任意の１つ以上の核酸ナノ構造体を含む組成物を提供する。本明細書において提供される組成物は、いくつかの実施形態では、生理学的レベルの塩を含有する溶液を含む。たとえば、溶液は、０．１ｍＭ〜０．９ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）（たとえば０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、または０．９ｍＭのＭｇ２＋）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、溶液が、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウム（Ｃａ２＋）を含む（またはさらに含む）。たとえば、溶液は、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、または１．５ｍＭ Ｃａ２＋を含んでいてもよい。
本開示は、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ポリアミンポリマーまたはポリアミンポリマーおよびＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの組み合わせならびにいくつかの実施形態では薬剤を含む（たとえば、それにより亜飽和された）核酸ナノ構造体を含む滅菌組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物が、薬学的に許容されるキャリヤを含む。薬学的に許容されるキャリヤは、核酸ナノ構造体の投与を促進する。
核酸ナノ構造体は、全身的に送達される場合、注射による、たとえばボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤されてもよい。注射のための製剤は、単位剤形で、たとえばアンプルまたは複数回用量の容器で与えられてもよい。薬学的非経口製剤は、成分の水溶液を含む。
本開示の核酸ナノ構造体（ナノ構造体を含む組成物を含む）は、ナノ医療などのような生物医学的な適用を含む様々な適用において使用されてもよい。たとえば、核酸ナノ構造体は、薬剤送達（たとえば標的薬剤送達）、免疫療法、診断学、および分子生物学に使用されてもよい（概説については、たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるSmith D.et al.Nanomedicine(Lond).2013 Jan;8(l):105-21を参照されたい）。いくつかの実施形態では、核酸ナノ構造体が、スキャフォールドベースのバイオセンサーとして使用されてもよい（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるPei H.et al.NPG Asia Materials(2013)5,1-8を参照されたい）。
本開示の核酸ナノ構造体は、細胞のメカニズムを調査するために使用されてもよいまたはそれらは、物質科学の分野において使用されてもよい。たとえば、本開示は、光学応答の調整によるキラルプラズモニックナノ構造体の集合（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるLiedl et al.2012 Nature,483,311を参照されたい）、異方性プラズモニックナノ構造体の集合（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるPal et al.2011.J.Am.Chem.Soc.133,17606-17609を参照されたい）、ならびに超常磁性蛍光バーコード付きナノ構造体の層状成長（たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるWang et al.2007 Nanotechnology 18,40,405026を参照されたい）を企図する。
実施例１
低マグネシウムバッファーにおけるＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するスペルミンポリマーの効果を調査するために、ＤＮＡナノ構造体（図１に図式化）を、以下のように、スペルミンポリマーとインキュベートし、透析し、ゲル電気泳動法によって分析した。６ｍＭ Ｍｇ２＋＋／−６０マイクロモル（μＭ）スペルミンポリマーを補足した０．５×ＴＥバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４）中１００μＬの１ナノモル（ｎＭ）ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、０または０．６ミリモル（ｍＭ）Ｍｇ２＋を含有する１Ｌの０．５×ＴＥバッファーにおいて透析した。透析後、サンプルを、０．５×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ／ボレート／ＥＤＴＡ）および１１ｍＭ Ｍｇ２＋のみから構成される２％アガロースゲルに添加した。図１に示されるように、顕著な差異は、コントロールおよびスペルミンインキュベートサンプルの間でゲルにおいて観察されなかったが、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ；２％ギ酸ウラニルにより染色）分析は、コントロール構造が、０および０．６ｍＭ Ｍｇ２＋濃度の両方で変性したが、スペルミンポリマーとインキュベートしたナノ構造体が、０．６ｍＭ Ｍｇ２＋を含有するバッファーにおいて構造の完全性を維持したことを示す。
実施例２
マグネシウムなしのバッファーにおけるＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するポリリシンポリマーの効果を調査するために、ＤＮＡナノ構造体を、以下のように、ポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、ゲル電気泳動法によって分析した。６ｍＭ Ｍｇ２＋＋／−６０μＭポリリシンポリマー（Ｋ６＝ＫＫＫＫＫＫ）を補足した０．５×ＴＥバッファー中１００μＬの１ｎＭ ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、０ Ｍｇ２＋を含有する１Ｌの１×ＰＢＳ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）において透析した。透析後、サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇ２＋のみから構成される２％アガロースゲルに添加した。図２に示されるように、顕著な差異は、コントロールおよびポリリシンポリマーインキュベートサンプルの間でゲルにおいて観察されなかったが、ＴＥＭ分析は、コントロール構造が、０ｍＭ Ｍｇ２＋濃度で完全に変性したが、ポリリシンポリマーとインキュベートした構造体が、構造の完全性を維持したことを示す。
実施例３
マグネシウムの存在下における様々な寸法のＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するポリリシンポリマーの効果を調査するために、様々な長さおよび直径のＤＮＡナノ構造体（図３における代表的な概略図１〜４）を、以下のように、ポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、ゲル電気泳動法によって分析した。６ｍＭ Ｍｇ２＋＋／−６０μＭポリリシン（ＫＫＫＫＫＫ＝Ｋ６）を補足した０．５×ＴＥバッファー中１００μＬの１ｎＭ ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、１Ｌの０．５×ＴＥにおいて透析した。透析後、サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇ２＋を含む２％アガロースゲルに添加した。図３において、破線は、ゲルにおけるネイキッドＤＮＡスキャフォールドの移動性を示す。コントロールサンプルは、すべての場合において、透析に際して、フォールドせず、ネイキッドスキャフォールドになった。対照的に、ポリリシンによりコートした構造体は、それらの完全性および移動性を維持した。
実施例４
マグネシウムの非存在下における様々な寸法のＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するポリリシンポリマーの効果を調査するために、様々な長さおよび直径のＤＮＡナノ構造体（図４における代表的な概略図１〜４）を、以下のように、ポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、ゲル電気泳動法によって分析した。６ｍＭ Ｍｇ２＋＋／−６０μＭポリリシン（ＫＫＫＫＫＫ＝Ｋ６）を補足した０．５×ＴＥバッファー中１００μＬの１ｎＭ ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、１Ｌの０．５×ＴＥにおいて透析した。透析後、サンプルを、Ｍｇ２＋なしの０．５×ＴＢＥのみを含む２％アガロースゲルに添加した。図４に示されるように、ポリリシンポリマーによりコートしたナノ構造体だけが、このゲル上で移動性を示した。
実施例５
低マグネシウムバッファーにおけるＤＮＡナノ構造体のポリリシンポリマー誘発性の安定性を判断するために、様々な寸法のＤＮＡナノ構造体（図５における代表的な概略図１〜４）を、ポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、ＴＥＭによって画像化した。６ｍＭ Ｍｇ２＋＋／−６０μＭポリリシンポリマー（ＫＫＫＫＫＫ＝Ｋ６）を補足した０．５×ＴＥバッファー中１００μＬの１ｎＭ ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、１Ｌの０．５×ＴＥバッファーにおいて透析した。図５は、２％ギ酸ウラニルにより染色した未加工のサンプルのＴＥＭ画像を示す。コントロールサンプルは、すべての場合において、透析に際して、フォールドせず、ネイキッドスキャフォールドになった。対照的に、ポリリシンポリマーによりコートした構造体は、それらの構造の完全性および移動性を維持した。
実施例６
ＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対するポリリシンポリマーおよびポリアルギニンポリマーの効果を比較するために、ＤＮＡナノ構造体（図６に図式化）を、以下のように、ポリリシンまたはポリアルギニンポリマーとインキュベートし、透析し、ＴＥＭによって画像化した。６ｍＭ Ｍｇ２＋および６０μＭポリリシンポリマー（ＫＫＫＫＫＫ＝Ｋ６）または６０μＭポリアルギニンポリマー（ＲＲＲＲＲＲ＝Ｒ６）を補足した０．５×ＴＥバッファー中１００μＬの１ｎＭ ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、１Ｌの１×ＰＢＳにおいて透析した。透析後、サンプルを、ＴＥＭによって画像化した。図６に示されるように、ポリリシンポリマーとインキュベートしたＤＮＡナノ構造体は、ポリアルギニンポリマーとインキュベートしたものに比べて、それほど凝集せず、よい良好な構造の完全性を示した。
実施例７
ＤＮＡナノ構造体の構造の完全性に対する様々な長さのポリリシンポリマーの効果を比較するために、ＤＮＡナノ構造体（図７に図式化）を、以下のように、ポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、ゲル電気泳動法によって分析した。６ｍＭ Ｍｇ２＋ならびに様々な長さの６０μＭポリリシンポリマー（たとえばＫ３、Ｋ４、Ｋ５、およびＫ６）を補足した０．５×ＴＥバッファー中１００μＬの１ｎＭ ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、１Ｌの１×ＰＢＳにおいて透析した。透析後、サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇ２＋のみを含む２％アガロースゲルに添加した。図７に示されるように、５つのリシン（Ｋ５）を有するポリリシンポリマーおよび６つのリシンＫ６を有するポリリシンポリマーによりコートした構造体は、より良好なフォールディングを示すゲル上でのわずかに速い移動性を示した。ナノ構造体はまた、ＴＥＭで画像化した場合、より高い構造の完全性をも示した（図示せず）。
実施例８
ＤＮＡナノ構造体の構造の完全性を維持するために必要とされるそれぞれのポリリシンポリマー濃度に対するポリリシンポリマーの長さの効果を比較するために、ＤＮＡナノ構造体（図８に図式化）を、以下のように、様々な長さおよび濃度のポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、ＴＥＭによって画像化した。６ｍＭ Ｍｇ２＋ならびに様々な濃度の様々な長さのポリリシンポリマー（たとえばＫ５、Ｋ６、Ｋ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｋ１０、Ｋ１１、およびＫ１２）を補足した０．５×ＴＥバッファー中１００μＬの１ｎＭ ＤＮＡナノ構造体を、１８時間、１Ｌの１×ＰＢＳにおいて透析した。図８に示されるように、より低濃度のより長いポリリシンポリマーがＤＮＡナノ構造体を安定化した。
実施例９
ＤＮＡナノ構造体の熱的安定性に関してポリリシンポリマーの長さの効果を比較するために、ＤＮＡナノ構造体（図９に図式化）を、以下のように、様々な長さのポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、様々な温度でインキュベートし、ゲル電気泳動法によって分析した。２０μＬのポリリシンポリマー（たとえばＫ６、Ｋ８、Ｋ１１、Ｋ１２）によりコートしたＤＮＡナノ構造体を、１８時間、１×ＰＢＳにおいて透析し、次いで、２４時間、様々な温度（たとえば３０℃、４０℃、または５０℃）でインキュベートした。次いで、サンプルを、Ｍｇ２＋なしの０．５×ＴＢＥを含む２％アガロースゲルに添加した。図９は、ＤＮＡバンドの移動性の減少を示し、これは、ナノ構造体の変性を示す。移動性の減少は、Ｋ６について４０℃で観察されたが、移動性における変化は、Ｋ１２によりコートした構造体について５０℃でさえ観察されなかった。したがって、より長いポリリシンポリマーは、より短いポリマーに比べて、熱的安定性の増強をもたらすように思われる。
実施例１０
ＤＮＡナノ構造体のヌクレアーゼ安定性に関してポリリシンポリマーの効果を比較するために、ＤＮＡナノ構造体（図１０に図式化）を、以下のように、ポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、様々な期間、新鮮な細胞培地中でインキュベートし、ゲル電気泳動法によって分析した。１８時間、１×ＰＢＳの中に透析した、２０μＬのポリリシンポリマー（Ｋ６）によりコートしたＤＮＡナノ構造体を、様々な期間、３７℃で、１０μＬの新鮮な細胞培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＲＰＭＩ−１６４０培地中１０％ ＦＢＳ）とインキュベートした。次いで、サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇ２＋を含む２％アガロースゲルに添加した。図１０は、ゲルバンドの強度の減少を示し、これは、ヌクレアーゼによるＤＮＡナノ構造体の分解を示す。コントロールサンプルは、インキュベーションの１時間以内に分解されたが、６つのリシン（Ｋ６）を有するポリリシンポリマーによりコートしたサンプルの構造の完全性は、新鮮な細胞培地との８時間のインキュベーションの間、維持された。
実施例１１
新鮮な細胞培養培地におけるＤＮＡナノ構造体のヌクレアーゼ安定性に関してポリリシンポリマー長さの効果を比較するために、ＤＮＡナノ構造体（図１１に図式化）を、以下のように、様々な長さのポリリシンポリマーとインキュベートし、透析し、様々な期間、新鮮な細胞培地中でインキュベートし、ゲル電気泳動法によって分析した。１８時間、１×ＰＢＳの中に透析した、２０μＬのポリリシンポリマー（たとえばＫ６、Ｋ８、Ｋ１２）によりコートしたＤＮＡナノ構造体を、様々な期間、３７℃で、１０μＬの新鮮な細胞培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＲＰＭＩ−１６４０培地中１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））とインキュベートした。次いで、サンプルを、０．５×ＴＢＥおよび１１ｍＭ Ｍｇ２＋を含む２％アガロースゲルに添加した。図１１は、ゲルバンドの強度の減少を示し、これは、ヌクレアーゼによるＤＮＡナノ構造体の分解を示す。コントロールサンプルは、インキュベーションの１時間以内に分解されたが、１２のリシンを有するポリリシンポリマー（Ｋ１２）によりコートしたサンプルの構造の完全性は、新鮮な細胞培地との２４時間のインキュベーションの間、維持された。血清とインキュベートしたナノ構造体のＴＥＭ画像は、完全なＤＮＡナノ構造体を示した。より長いポリリシンポリマーは、新鮮な細胞培地においてＤＮＡナノ構造体に対して、より高度な／より長い安定性を与えるように思われた。
実施例１２
ＤＮＡナノ構造体を、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーによりコートした。図２３Ａは、ＰＥＩ第一級アミンへのＰＥＧ−ＮＨＳカップリングのライゲーション手法を示す。反応条件は、ＰＢＳ ｐＨ８および室温での一晩のインキュベーションとした。図２３Ａはまた、血清活性細胞培地において様々な期間、インキュベートした場合のＤＮＡナノ構造体の安定性についてのアガロースゲル分析をも示す。図２３Ｂは、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）におけるＰＥＩ−ＰＥＧコートＤＮＡナノ構造体の取込みを示す。パネルは、３０分間隔であり、細胞の内側へのＣｙ５標識ＤＮＡナノ構造体の取込みを示す。
実施例１３
図２４Ａは、ＴＬＲ９活性化実験の図式的な概要を示す。ＤＮＡ origami構造体に、様々な位置、たとえばナノカプセルの内部および／または外部においてＣｐＧ危険シグナルを添加した。未成熟樹状細胞をＣｐＧ添加ナノ構造体により刺激し、一晩成熟させた。ＴＬＲ９をＣｐＧによって刺激すると、ＩＬ１２サイトカインが、生成され、分泌された。図２４Ｂは、ＴＬＲ９刺激を評価するためのＩＬ１２サイトカインＥＬＩＳＡアッセイを示す。ＣｐＧ危険シグナルをＤＮＡナノ構造体の外側に置いた場合に、大きな活性化が観察された。しかしながら、保護コーティングが存在した場合、免疫原性の活性は、覆い隠された。これは、保護的なシェルがない場合でさえ、取込みおよびエンドソームが持続する時間的経過にわたってＤＮＡナノ構造体の構造の完全性を実証する。
実施例１４
図２５Ｂは、生細胞におけるペプチド抗原放出の共焦点画像を示す。ＢＭＤＣは、抗原カーゴを添加したＤＮＡナノ構造体とインキュベートした。パネルは、１５分間隔であり、取込みプロセスの間の最初の共存、その後に続く２つの経路の明確な分離を示し、抗原ペプチドは、細胞中に残り、細胞膜に移動し、ここで、抗原ペプチドは、ＭＨＣ受容体上に提示され、ＤＮＡナノ構造体は、細胞から分泌される。
実施例１５
図２６Ａは、フローサイトメトリーによる蛍光強度プロファイリングによって測定されるＴ細胞活性化アッセイの結果を示す。ＢＭＤＣを、様々な用量の抗原−ＤＮＡナノ構造体またはコントロールとして抗原のみとインキュベートした。３日間のＯＴ−１由来Ｔ細胞との共培養は、Ｔ細胞集団の刺激および分裂をもたらした。ＤＮＡナノ構造体による抗原の１ｎＭの送達は、遊離抗原取込みに対して優れており、本明細書において提供される方法の長所および利点を実証した。
図２６Ｂは、Ｔ細胞活性化実験の図式的な概要を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＯＴ−１トランスジェニックマウスの脾臓から回収し、緑色に染色した。Ｔ細胞は、ＢＭＤＣおよびペプチド抗原を添加したＤＮＡナノ構造体または抗原単独と共培養した。抗原がＭＨＣ−ＩによってＤＣによって提示された場合にのみ、Ｔ細胞が増殖した。
図２６Ｃは、ＦｌｏｗＪｏ分析を使用する、Ｔ細胞実験の定量化を示す。高度なおよび中位の投薬について、過度の刺激により誘発された細胞死があった。最も低い濃度の１ｎＭでは、増殖％（上のグラフ）および分裂の量（下のグラフ）の両方が、遊離ペプチド送達と比較して、本開示のＤＮＡ送達方法により増加した。ＭＨＣ−ＩＩ提示およびＯＴ−２ Ｔ細胞活性化について同様の結果は示されない。
実施例１６
この実施例の目的は、ＤＮＡ origamiナノカプセルを構築し、どの構造的な特徴が樹状細胞への抗原および危険シグナルの効率的な送達にとって重要であるかを調査することである。ナノカプセルを一連のサイズ、カーゴ、および表面装飾により構築し、樹状細胞（ＤＣ）を刺激して、Ｔ細胞を活性化するこれらの粒子の能力を調査する。インビトロにおけるおよびインビボにおける活性化Ｔ細胞を最も強力に導くナノカプセルを、インビボにおける抗原特異的抗腫瘍免疫を誘発するそれらの能力について試験する。実施例１７に記載される免疫学的アッセイを、この実施例に記載されるナノ粒子を試験するために使用する。
ナノ粒子のサイズおよび形状は、一般に、樹状細胞（ＤＣ）への取込みおよび分類に効果を有する。ナノカプセルのサイズを変化させることは、ナノ構造体当たりに添加するカーゴ分子の数の調節を可能にする。この実施例において、ＤＮＡ origamiは、核酸ナノカプセルを構築するために使用する。ＤＮＡ origamiでは、長いスキャフォールド鎖が、短いステープル鎖と共に、ヘリックス間の多数の鎖の交差によって相互に保持される二重らせんの平行配列から構成されるシートに組み立てられる。曲がって円筒になるシートを生成するために、３つの層（図２７、右上の中程度の灰色、濃い灰色、および明るい灰色）を有するシートを構築し、内側の層（中程度の灰色）は、より短いヘリックスを有するようにプログラムし（たとえば合理的にデザインし）、外側の層（明るい灰色）は、より長いヘリックスを有するようにプログラムした（本明細書において参照によって組み込まれるDietz,H.,et al.Science 325,725-730(2009);Douglas,S.M.et al.Nature 459,414-418(2009);およびHan,D.et al.Science 332,342-346(2011)）。この構造体は、内側の層上で収縮をおよび外側の層上で拡張をもたらす。そのうえ、シートの末端部は、閉じられるようにデザインされ、これは所望の屈曲を強化する。円筒の壁は、厚さ約６ｎｍであり、単層のＤＮＡ origamiシート（厚さ２．５ｎｍ）よりもはるかに強固である。
ナノカプセル構造体の一例を、図２１Ａ（ｉ）に示す、また、２つのドーム構成成分（明るい灰色）および決められた数の円筒形の構成成分（中程度の灰色）を含有する。ドーム構成成分の構成体は、円筒形の構成成分と同様の、３つの層のヘリックス（外側、中央、内側）を保有する。定められた数の円筒ドメインの同軸性の積み重ねのための頑健な戦略が、本明細書において提供される。それぞれが６０ｎｍの直径を有する２つのナノカプセルを構築した：一方は、２つの円筒ドメインを組み込むようにプログラムし、（１２０ｎｍのナノカプセル長）（図２１Ａ（ｖｉ）、左のパネル）、一方は、４つの円筒ドメインを組み込むようにプログラムした（１８０ｎｍのナノカプセル長）（図２１Ａ（ｖｉ）、右のパネル）。
さらに、３１ｎｍ、６０ｎｍ、または８７ｎｍの直径および６０ｎｍ、１２０ｎｍ、１８０ｎｍ、２４０ｎｍ、３００ｎｍ、または３６０ｎｍの長さを有するナノカプセルを構築する。ナノカプセルのそれぞれのバージョンは、取込みが依存する相対的な形状／サイズが、ターゲティング剤の包含対除外によって変化するかどうかを決定するために、下記に記載されるようにターゲティング剤により装飾する。内部の空洞は、粒子当たり３ダースのＣｙ５フルオロフォアにより装飾し、実施例１７において記載されるようにＢＭＤＣの中への取込みを追跡する。
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の粒子当たりの効力のある活性化は、抗ＤＥＣ２０５のまばらな均一な格子および抗ＣＤ４０による高密度の均一な装飾の表示によって調査する。抗ＤＥＣ２０５親和性薬剤の表示は、ＢＭＤＣターゲティングを促進することが予想されるが、ＤＥＣ２０５クラスタリングの誘発は、ＢＭＤＣ不活性化を回避するために最小限にする。反対に、ＣＤ４０架橋は、ＢＭＤＣ活性化に至り、そのため、最大限の密度の抗ＣＤ４０親和性薬剤を、ナノカプセルの外側表面上に表示し、ＣＤ４０架橋およびシグナル伝達を誘因する。ナノカプセルの外側表面を装飾するための基本的なフレームワークの一例は、６つの最近傍のものと８．７ｎｍの間隔を有する斜方格子であり（図２８、黒色および灰色のドット）、それぞれの６０ｎｍの直径の円筒は、８４の外側の格子位置を持つ。それぞれの格子位置は、特化されたｓｓＤＮＡ「ハンドル」により独立して装飾する。次いで、これらの格子ハンドルは、それ、関連するハンドルに対して相補的配列を有するｓｓＤＮＡの「反対のハンドル」に共有結合されるリガンドと、配列特異的な様式でパートナーとなる。８．７ｎｍの倍数増加する抗ＤＥＣ２０５の間隔について試験し、残った格子スポットを抗ＣＤ４０で充填する。図２８（灰色のドット）は、３５ｎｍの間を置いて配置される抗ＤＥＣ２０５格子点を有する実施例のパターンを示す。
親和性薬剤は、斜方格子編成の表面上の選択された位置に置かれた相補的ｓｓＤＮＡハンドル鎖へのハイブリダイゼーション後に、方向づけられた提示のために、ｓｓＤＮＡの反対のハンドルの部位特異的なタグ付けに使用する。大腸菌（E.coli）において発現される単鎖抗体断片を使用して、様々なタグ（たとえば特有のシステイン、アルデヒド（Rabuka,D.,et al.Nat Protoc 7,1052-1067(2012)）、ソルターゼ（Popp,M.W.et al.Nat Chem Biol 3,707-708(2007)）、ｙｂｂＲ（Yin,J.,et al.Nat Protoc 1,280-285(2006)）、ＳＮＡＰ（Hussain,A.F.,et al.Curr Pharm Des 19,5437-5442(2013)）、および／またはアミノ末端（Scheck,R.A.,et al.J Am Chem Soc 130,11762-11770(2008))）を部位特異的突然変異誘発を介して取り付け、次いで、評価する。ＲＮＡについては、ＤＥＣ２０５に結合する２’フルオロピリミジンの組み込みのために最適化されたアプタマーのバージョン（たとえば２’フルオロピリミジン置換ＲＮＡアプタマー（Wengerter,B.C.et al.Mol Ther 22,1375-1387(2014)）を、未修飾ＲＮＡに比べて安定性を増加させるのに使用する。個々のｓｃＦｖまたはアプタマーの親和性は、高くない場合もある（ナノモル〜マイクロモル）が、多くのコピーが、多価の結合活性を実現するために決められた間隔で表面上に表示される。
ナノカプセルの内側を装飾するための基本的なフレームワークは、６０ｎｍの直径の円筒ドメイン当たり８４の格子位置を有するナノカプセルの外側上に見つけられるものと同様の間隔を有する斜方格子である。同様に、それぞれの位置は、所望のカーゴ分子に共有結合された相補的ｓｓＤＮＡの反対のハンドルによって扱うことができるｓｓＤＮＡハンドルにより装飾する。ＣｐＧおよびポリＩ：Ｃは、危険シグナルとして、ＯＶＡ１およびＯＶＡ２は、モデル抗原として使用する。ＴＬＲの二量体化の誘発の重要性を調査し、ナノカプセル当たりの添加能力を２倍にするために、つながれた１対の危険シグナルを、マレイミドを持つ危険シグナルにコンジュゲートすることができる内側のチオールを有する反対のハンドル−危険シグナルを介してそれぞれの格子位置に付加し、分岐分子を作る。これらの危険シグナルは、一旦、ハンドルのシトシンがシトシンのＮ−３上でプロトン化されたら、ハンドルが優先的にｉモチーフｓｓＤＮＡ構造体を形成するように、シトシンが豊富になるようにハンドルの配列をコードすることによって、酸性ｐＨ（たとえば５．５未満）に応じてナノカプセルの内壁から放出されるようにプログラムされる（Dong,Y.,et al.Acc Chem Res 47,1853-1860(2014)）。
ナノカプセルは、エンドソームコンパートメントの中への到着前に分解からカーゴを保護するようにデザインされる。ナノカプセルの壁は、１ｎｍ以下の固く圧縮された二重らせんの隙間を含有する。ドームのトップは、８ｎｍの穴を含有し、これは、自己組織化されたＤＮＡ ６ヘリックスバンドル充填物により充填され、その結果として、１ｎｍよりも大きな高分子は、中にも外にも拡散することができない（図２９、右）。ヌクレアーゼまたは低塩変性による分解からナノカプセル自体を保護するために、ナノカプセルは、オリゴリシンから構成されるシェルによりコートされる（図２９、左）。
５．５以下のｐＨ−未成熟ＢＭＤＣにおけるエンドソームのｐＨ−の感知と同時に、ナノカプセルが開口する。さらに、ナノカプセルの内壁にカーゴを接続するアンカーは、ｐＨ５．５未満で放出する。この酸性ｐＨによる誘因を実現するために、シトシン環のＮ−３のプロトン化と同時にワトソン−クリック塩基対パートナー鎖から解離し、次いで、それ自体がフォールドする、シトシンが豊富な配列であるｉモチーフを使用する（Dong,Y.,et al.Acc Chem Res 47,1853-1860(2014)）。２つの円筒ドメインを保持する鎖の間の塩基対合が、シトシンが豊富な配列内でのｓｓＤＮＡ ｉモチーフ構造体の形成によってｐＨ５．５で破壊されるようにプログラムされるこの戦略の例を、図３０に示す。他のｐＨによる誘因は、ナノカプセルの内側に向いている接続ヘリックスによりプログラムされ、ヌクレアーゼがこれらを切断し、あまりにも早くナノカプセル開口が誘因されるのをより難しくする。
本開示のＤＮＡナノカプセルは、ＢＭＤＣの耐性が十分にあり、毒作用も、生存率の変化もなく、ナノカプセルによって提示された抗原に対して特異的な様式でＩＬ−１２分泌を誘発し、Ｔ細胞を活性化するようＢＭＤＣを誘発することができる。ＢＭＤＣを、Ｃｙ５レポーター色素により標識した５ｎＭ ＤＮＡナノ円筒とインキュベートし、１時間後に画像化した。細胞の内側のＤＮＡ origamiの蓄積物が、目に見えた。核をヘキストにより染色し、明視野画像は、細胞表現型の変化を示さず、よって、細胞に対するＤＮＡサンプルの毒作用はなかった。
いくつかの事例では、ナノカプセルを保護するために適用されたオリゴアミンコーティングは、表示されたＣｐＧ危険シグナルがＴＬＲ９を活性化する能力をある程度まで阻害し得る。理論によって拘束されないが、これは、オリゴアミンが、ナノカプセルの壁に危険シグナルをあまりにもしっかりと非共有結合で架橋するためであり得る。さらに、オリゴアミンは、ｐＨ５．５でのｉモチーフ放出の平衡状態の挙動を変化させ得る。これについて検討するために、非荷電のＰＮＡまたは他の中性スペーサーが、リガンドおよびｉモチーフドメインをナノカプセルの壁から出っ張らせるために使用されてもよく、ｉモチーフの配列が、オリゴアミンの存在下において効率的な放出を得るために修飾されてもよい。中性スペーサーは、ナノカプセルの壁からカーゴを引き離すのに十分な力を加えることができ、そのため、低ｐＨでの効率的な放出を促進する。他の事例では、ナノカプセルの外側に表示された親和性薬剤は、たとえばオリゴアミンによるコーティング後にナノカプセル壁との相互作用により活性が低下し得る。これについて検討するために、中性スペーサーエレメントが、出っ張って、ナノカプセル壁との望まれない相互作用を弱めるように含まれてもよい。
実施例１７
この実施例の目的は、操作されたＤＮＡナノカプセルが、Ｔ細胞を活性化するように樹状細胞（ＤＣ）を指示する能力を調査することである。ＤＣは、Ａｇ特異的なＴ細胞応答を開始し、コントロールする最も効力のある専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＤＣは、抗原を受容し、処理し、ナイーブＴ細胞に提示し、それらの増殖およびエフェクターＴ細胞への分化を刺激することができる。ここで、ＤＣ活性化、成熟、および抗原提示に対する操作されたナノカプセルの効果ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および分化を促すこれらのＤＣの能力を調査する。明確な免疫原性エピトープならびにそれぞれＯＶＡ２５７−２６４およびＯＶＡ３２３−３３９に対応するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープであるペプチドに対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するトランスジェニックＯＴ１およびＯＴ２マウスがあるので、十分に確立されたモデル抗原オバルブミン（ＯＶＡ）を使用する（Barnden,M.J.,et al.Immunology and Cell Biology 76,34-40(1998);およびHogquist,K.A.,et al.Immunity 3,79-86(1995)。したがって、ＯＴ１ Ｔ細胞へのＤＣによるＯＴ１ペプチドの提示は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および分化をもたらし、それに対して、ＯＴ２細胞へのＯＴ２ペプチドの提示は、ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖および分化に至る。この実施例の１つの目標は、ＣＴＬおよびＴｈ１および濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞が抗腫瘍性細胞溶解および抗体応答を促すので、これらの細胞型の生成および機能を増強する操作されたナノ粒子を提供することである。インビトロアッセイは、培養中のＢＭＤＣを活性化する、実施例１６において記載されるナノカプセルの能力を試験するために、次いで、これらのＢＭＤＣがＴ細胞を活性化する能力を試験するために使用する。次に、活性化されたＢＭＤＣまたは活性化されたＴ細胞は、インビボにおいてそれらの機能性を確認するためにマウスの中に移す。次いで、最も有効なナノ粒子を、インビボにおいて直接送達し、Ｔ細胞の抗原特異的活性化について試験する。
Ａｇ特異的なＴ細胞応答を誘発するために、タンパク質抗原は、貪食され、処理され、ＭＨＣ／ペプチド複合体としてＤＣ表面上に提示される必要がある。操作されたナノカプセルの取込みは、Ｃｙ５フルオロフォアを使用して比較する。ナノカプセルを、Ｃｙ５により標識し、４または３７℃で数時間ＤＣとインキュベートする。ＤＣを洗浄し、蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定する。蛍光強度のレベルは、取込みの効率を示す。ＢＭＤＣ成熟および活性化は、ナノカプセルがＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩ、およびＣＤ４０の細胞表面発現を誘発するかどうかを決定することによって判断する。ＤＣの活性化の別の特徴は、炎症促進性サイトカインの分泌の増強である。ＤＣ活性化の方法により、生成されたサイトカインのタイプ（炎症促進性および抗炎症性）を決定する。ＣＤ４０刺激は、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２ ｐ４０を誘発し、それに対して、ＬＰＳによるＴＬＲの刺激は、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１α／βを誘発し、ポリＩ：ＣおよびＣｐＧは、ＩＦＮ−γを誘発する。特に、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γは、ＤＣワクチンへの抗腫瘍応答を生成する際に重要な役割を果たす。これらのサイトカインおよび抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）の分泌は、サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）によって培養上清において判断する。そのうえ、炎症促進性シグナル伝達経路は、リン酸化についての細胞溶解物Ｉｋｋα／β、ｐ３８、およびＪＮＫ（ＩＬ−１２分泌に関連する）ならびに生存促進性の分子Ａｋｔを評価することによってこれらのＤＣにおいて評価する。図３１（左のパネル）に示されるように、ＤＮＡナノ粒子は、ＢＭＤＣによるＩＬ−１２分泌を誘発することができる。
ＯＴ１またはＯＴ２ペプチドを処理し、Ｔ細胞に提示し、かつＴ細胞応答を刺激するＢＭＤＣ能力を判断するために、ＯＴ１またはＯＴ２の細胞を、数時間、操作されたナノカプセルと前培養されたＤＣと共培養する。ＣＤ８＋ＯＴ１細胞活性化および細胞分裂を、ＤＣのプライミングの２４、４８、７２、および９６時間後に分析する。図３１（右のパネル）に示されるように、ＯＶＡ１またはＯＶＡ２を持つＤＮＡナノ粒子は、Ｔ細胞増殖を刺激することができる。細胞分裂は、ＣＦＳＥ色素希釈液対活性化および分化のマーカー（たとえばＣＤ４４、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１２７）の発現、細胞内サイトカイン染色によってサイトカイン（ＩＦＮ−α、ＴＮＦ、ＩＬ−２、Ｍｉｐ１α）を評価することによるエフェクター機能の開始、ならびに細胞内染色による細胞傷害性（グランザイムＢ、パーフォリン）ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞分化にとって重要な転写因子（Ｔ−ｂｅｔおよびＥｏｍｅｓ）によって検査する。Ｔ細胞の生存（たとえばｂｃｌ−２ポジティブ）を、それぞれの時点でのＴ細胞のパーセンテージ／数と比較する。これらのＴ細胞の細胞傷害性の機能性について試験するために、Ｂ１６−Ｏｖａ細胞およびＢ１６細胞を、様々な細胞表面色素により標識し、これらの２つの細胞株を、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養する。細胞傷害性能力および特異性を定量的に判断するために、生細胞を、４８時間または７２時間後に数え、ＣＤ８＋Ｔ細胞なしのコントロールウェルと比較する。同様に、ナイーブＯＴ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化およびエフェクター細胞サブセットへの分化を刺激する操作されたナノカプセルの能力を比較する。ＯＴ２細胞活性化および分裂は、ＯＴ１細胞について詳述されるアプローチを使用して判断する。ＣＤ４＋細胞は、細胞表面分子、転写因子、およびサイトカインの別個の発現によって定義される、エフェクター細胞の様々なサブクラスに分化することができる。Ｔｈ１（ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、ｔ−ｂｅｔ、ｓｔａｔ１，４）、Ｔｈ２（ＩＬ−４、５、１０、１３、ｇａｔａ−３、ｓｔａｔ６）、Ｔｈ１７（ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ｓｔａｔ３、ｒｏｒｃ）、およびＴｆｈ（ＩＬ−２１、ｂｃｌ−６）細胞を特徴付けるサイトカインおよび転写因子を測定する。そのうえ、これらのＢＭＤＣが、ナイーブＴ細胞からの抗炎症性調節性Ｔ細胞の誘発を促す能力を判断する。ＯＴ１もしくはＯＴ２ペプチド、ＯＶＡタンパク質、またはコントロールタンパク質（雌鳥卵リゾチーム）を添加した操作された粒子を比較する。
ＯＴ１およびＯＴ２細胞増殖およびＴｈ１応答をインビトロにおいて刺激する操作されたナノカプセルのサブセットを選択する。ＣＦＳＥ標識ＯＴ１またはＯＴ２細胞を、ナイーブマウスに静脈内に移し、マウスを、操作されたナノカプセル（ＯＶＡペプチド抗原またはコントロールを含有する）により皮下で免疫化する。ＤＣのエクスビボ対インビボにおける活性化を比較し、ＣＦＳＥ色素希釈液によるＴ細胞増殖を評価する。インビボＣＴＬアッセイは、活性化されたＯＴ１細胞が、有効なＣＴＬに分化し、Ａｇ特異的な標的細胞（ＯＴ１ペプチドパルス脾細胞）を死滅させることができるかどうかを調査するために使用する。マウスは、ＯＶＡペプチドもしくはコントロールペプチドを含有するナノカプセルまたはアジュバント中のＯＶＡタンパク質（ポジティブコントロールとして）により免疫化し、ＯＴ１ペプチドにより（ＣＦＳＥ）またはＯＴ１ペプチドなしで（Ｃｅｌｌ−Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）パルスした標識同系脾細胞の死滅を比較する。
ナノカプセルの外側表面に表示された親和性薬剤の結合強度が、ナノカプセルにつなぐことによって低下し得る事例では、親和性薬剤は、硬い（たとえばｄｓＤＮＡ、ＰＮＡ）または可動性の（たとえばＰＥＧ）リンカーを含むことによって表面からさらに出っ張らせることができる。タンパク質リガンドは、ナノカプセル表面からのある程度の間隔を実現するために、ＳＮＡＰタグドメインへの共有結合コンジュゲートとして発現することができる。
ナノカプセルが、たとえばそれぞれの環境における差異により、無細胞性の実験において観察されるほど効率的に開口せず、エンドソーム細胞コンパートメント内のそのカーゴを放出させない場合がある事例では、上半分および下半分の間でのナノカプセルの細胞内開口は、ＦＲＥＴによって分析することができる。その代わりに、穴のｐＨ５．５により誘因される開口を、ドームの上にプログラムすることができ、これを通して、放出されたカーゴが、拡散することができる。これは、ナノカプセルの内壁に充填物をつなぐｉモチーフ配列を導入することによって実現することができる。低ｐＨへの暴露に際して、ｉ−モチーフのつなぎ鎖が巻き上がり、その穴から充填物を引っ込める力を生成するであろう。
実施例１８
この実施例の目的は、腫瘍ワクチンとして操作されたナノカプセルの選択されたサブセットの効能を試験することである。ナノカプセルは、腫瘍移植の前または後にワクチン接種することによって予防および治療用ワクチンとして試験する。治療の効能は、Ｂ１６ ＯＶＡメラノーマにおいて最初に判断し、次いで、Ｈｅｒ２ ｎｅｕおよび４Ｔ１乳癌モデルまで拡張する。結果を、従来のワクチン（たとえばＣＦＡにおける標的ペプチド）と比較する。インビボにおける有効性についてアッセイするために、腫瘍成長および免疫浸潤物の組成をモニターし、腫瘍微小環境ならびに流入領域リンパ節および脾臓における抗原特異的なＴ細胞活性化、増殖、およびエフェクター機能を分析する。
ワクチン接種．予防ワクチン接種のために、操作されたナノカプセルを、一方の脇腹に皮下に移植し、他方の脇腹に１０５〜１０６腫瘍細胞の皮下注射により２週間後に攻撃する（challenge）。治療用ワクチン接種の効能を判断するために、マウスに、一方の脇腹に皮下に１０５〜１０６腫瘍細胞を移植する。腫瘍の容量が約１００ｍｍ３に達したら、操作されたナノカプセルを他方の脇腹に皮下にまたは腫瘍内に与える。マウスのサブセットは、３週間以内の間、ワクチン接種を毎週受ける。両方の場合のポジティブコントロールとして、腫瘍ペプチド（たとえばＯＴＩペプチド）を、最初のナノ粒子ワクチン接種と同じ時間にコントロールの腫瘍を持っているマウスにナノ粒子の代わりにＣＦＡで注射する。
腫瘍成長の分析．Ｂ１６ ＯＶＡ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下に移植し、Ｈｅｒ２／ｎｅｕまたは４Ｔ１細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下に移植する。腫瘍成長および生存を比較する。腫瘍容量を、毎週３回測定する。マウスを、腫瘍潰瘍化および毒性のサイン、特に＞２０％の体重減少および処置誘発性のストレスの他のサインについてモニターする。生存研究についてのエンドポイントは、発明者らのＩＡＣＵＣ規則に従って、腫瘍サイズ（１ｃｍ３の限度）または潰瘍化した腫瘍／壊死の腫瘍とする。マウスの以下のコホート（グループ当たりｎ＝８〜１０匹のマウス）を比較する：（１）ニセの処置、（２）適切なＡｇを有するナノカプセルワクチン、（３）Ａｇなしのナノカプセルワクチン；（４）ポジティブコントロールワクチン。
細胞の免疫学的分析．免疫応答に対するナノカプセルの効果は、ある期間にわたって、ワクチン部位で局部的に、流入領域リンパ節において、および腫瘍内で検査する。細胞免疫学的アプローチ、分子アプローチ、および免疫組織的アプローチを、ＤＣおよびＴ細胞の両方を分析するために使用する。
樹状細胞サブセットを、フローサイトメトリーによって最初に比較する：ＣＤ１０３、ＣＤ８α（たとえば交差提示）、ＰＤＣＡ（たとえば形質細胞様）、またはＣＤ１１ｂ（たとえば単球由来）を発現するＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣクラスＩＩｈｉ細胞。ＤＣ成熟ステータス（たとえばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ１３７Ｌ）ならびに阻害性リガンド（たとえばＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）の発現を検査し、単球／マクロファージを含む他の骨髄系細胞、好中球、および骨髄由来抑制細胞を、適切なマーカー（たとえばＭｅｒ、ＣＤ３２、Ｆ４／８０、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ）を使用して特徴付け、免疫調節マーカー（たとえばアルギナーゼ、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ、ＣＤ３９／ＣＤ７３）の発現を判断する。組織抽出物において発現されるサイトカインを検査し、腫瘍保護的（たとえばＩＦＮｙ、ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８）、腫瘍促進性（たとえばＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３）、ならびに免疫抑制性（たとえばＩＬ−１０およびＴＧＦβ）サイトカインを、ｌｕｍｉｎｅｘベースのアッセイおよびｑＲＴＰＣＲを使用して検査する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するナノカプセルワクチン接種の効果を決定するために、実施例１７に記載される方法を使用する。そのうえ、抗原特異的Ｔ細胞（たとえばＢ１６ Ｏｖａ腫瘍を有するＯＴ１ Ｔ細胞）および四量体の養子移入を、内因的に生成される抗原特異的Ｔ細胞をプローブするために使用する。実施例１７において議論される活性化マーカーおよびサイトカインに加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ／数、阻害性受容体（たとえばＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ１６０）の発現、および増殖（たとえばＫｉ−６７発現またはＢｒＤｕ組み込み）を判断する。エクスビボアッセイ（細胞傷害性アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ）は、機能性を評価するために使用する。
抗腫瘍性免疫を阻害するＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇもまた、判断する。以下のものもまた、フローサイトメトリーによって判断する：１）パーセンテージ／数、２）増殖（Ｋｉ６７、ＢｒＤＵ）および生存（Ｂｃｌ２）、３）機能（たとえばＩＬ−１０、ＩＲＦ４）および／またはさらなるエフェクター表現型（たとえばＴｂｅｔ、ＩＦＮα）への分化のマーカー、ならびに４）安定性のマーカー（たとえば、阻止されたｐＡｋｔまたは増加したニューロピリン、Ｈｅｌｉｏｓ、およびＢｃｌ２）。ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比は、増加が抗腫瘍免疫の増強と相関するので、決定する。
液性免疫の分析．ますます増えつつある証拠により、抗腫瘍療法の成功が、ＣＴＬおよび液性免疫の両方を促し、なぜ腫瘍ワクチンが一般に効力のある持続する抗体応答を誘起しないのかを理解するための研究が必要であることが示唆される。Ｂ細胞は、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）によって防御抗体を生成するように刺激され、濾胞性調節性Ｔ細胞（Ｔｆｒ）によって阻害されるが、Ｔｆｒ細胞が腫瘍に対するＢ細胞応答を抑制するかどうかはまだ明確ではない。Ｔｆｒ細胞の排除がメラノーマ抗原に対するＢ細胞応答の強化に至るかどうか試験するために、マウスを、ＣＦＡ中に乳化したＢＲＡＦ／ＰＴＥＮ（メラノーマ細胞株）（Cooper,Z.A.et al.Cancer Immunol Res 2,643-654(2014)））腫瘍溶解物により免疫化し、７日後、これらのマウス由来のＴｆｈおよびＴｆｒ細胞を分類し、Ｔｆｈおよび／またはＴｆｒ細胞を、Ｔｃｒα−／−レシピエント（ＴｆｈおよびＴｆｒ細胞を欠く）に移した。これらのレシピエントにＢＲＡＦ／ＰＴＥＮ腫瘍を与え、８日後、抗体レベルを測定した。図３２に示されるように、Ｔｆｈ細胞は、抗体産生を刺激したが、Ｔｆｒ細胞の追加は、抗体産生を強力に抑制した。これらの研究は、Ｔｆｒ細胞がインビボにおいて腫瘍免疫を阻害することができることを示す。
ナノカプセルワクチンが液性免疫応答ならびにＴｆｈおよびＴｆｒ細胞をどのように調整するかを調査するために、Ｔｆｈ、Ｔｆｒ、およびＢ細胞応答を、モデル抗原（ＯＶＡ）、この抗原のみを発現する腫瘍細胞（Ｂ１６ ＯＶＡ）、またはＢ１６ ＯＶＡおよびナノカプセルワクチンと比較する。Ｂ１６ ＯＶＡ細胞を皮下に移植し、上記のようにナノカプセルワクチンによりワクチン接種する。７日または１４日後、以下のものについて判断する：（１）Ｔｆｈ、Ｔｆｒ、およびＢ細胞数ならびに絶対的な細胞数ではなく比としてのＴｆｈ／Ｔｆｒ比は、抗体産生ならびにＴｆｈ、Ｔｆｒ、およびＢ細胞増殖に影響を与える（Ｋｉ６７発現またはＢｒｄＵ取込みによって）；（２）ＴｆｈおよびＴｆｒ細胞上のＣＸＣＲ５（Ｂ細胞ゾーンにこれらの細胞を誘導するケモカイン）、Ｂｃｌ６（Ｔｆｈ細胞についての主転写因子）、Ｂｌｉｍｐ−１（Ｔｆｈ細胞の転写リプレッサー）、ならびにＴｆｈ細胞におけるサイトカイン（Ｂ細胞の機能を刺激するＩＬ−２１およびＩＬ−４）の発現；（３）Ｂ細胞応答を決定するための胚中心Ｂ細胞、形質細胞、記憶Ｂ細胞、および血清抗体レベル（ＥＬＩＳＡおよび腫瘍溶解物を使用して、全体的なおよび腫瘍特異的な）；ならびに（４）自己抗体が腫瘍によって誘起されるかどうか。
同様の研究は、抗腫瘍液性およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対する治療戦略の効果を研究するための価値のあるツールを提供する、ＴおよびＢ細胞応答の両方を誘起するＨｅｒ２／ｎｅｕ細胞株を使用して行う。Ｔｆｈ、Ｔｆｒ、およびＢ細胞応答を、Ｂ１６ ＯＶＡ研究について記載されるように評価し、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対する血清抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ全体およびサブタイプ、ＩｇＡ）を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現細胞株を使用して分析する。４Ｔ１細胞株を使用する同様の研究もまた行う。
チェックポイント遮断との組み合わせ．腫瘍ワクチンの根底にある基本概念は、腫瘍が存在する場合に、内因性のＤＣが十分な抗腫瘍性Ｔ細胞応答を刺激しないことである。しかしながら、ＤＣによって十分なＴ細胞プライミングがなされても、Ｔ細胞は、腫瘍微小環境の中および外の両方で抑制され得る。チェックポイント遮断は、この抑制のノードのうちの１つを除去することを目指し、現在の典型は、抗腫瘍性の免疫応答が処置の開始時に不十分である場合、それが失敗してしまうことである。したがって、理論によって拘束されないが、チェックポイント遮断とのナノカプセルワクチン接種アプローチの組み合わせが、最初に、強い抗腫瘍性の免疫応答を誘発し（ナノカプセルワクチン接種）、次いで、Ｔ細胞の抑制を予防すること（チェックポイント遮断）によって、相乗効果に至るであろうと考えられる。ナノカプセルワクチン接種アプローチを、抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４遮断抗体と組み合わせる。ワクチン接種およびチェックポイント遮断の相対的なタイミング（チェックポイント遮断が後続する同時または連続したワクチン接種）を、これが治療応答に影響を与えるかどうかを調査するために試験する。併用療法がどのように腫瘍成長およびマウス生存に影響を与えるかならびにＴ細胞応答（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇに注目して）についての分析を、上記に記載されるアプローチを使用して行う。
有害事象の分析．抗腫瘍性の免疫を阻害する経路の多くはまた、Ｔ細胞寛容にとって重要であり、自己免疫を予防している。ＣＴＬＡ−４（ｉｐｉｌｕｍｉｍａｂ）などのようないくつかの経路の遮断は、重篤な自己免疫反応に至る。したがって、それぞれのワクチンアプローチの安全性を判断することは重要である。これらの理由で、処置されたマウスは、自己免疫および免疫病理の証拠について評価する。消化管、肝臓、および肺などのような非腫瘍組織もまた、炎症浸潤物（たとえば大腸炎）の証拠について分析する。高用量ＴＬＲリガンドの全身性の適用は、ＤＣ成熟を誘発し得るだけではなく、高レベルの血清サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８、１型インターフェロン）をも誘発し得、これは毒性のショックのような効果に至り得る。そのため、これらのサイトカインの血清レベルもまた、評価する。
Ｂ１６メラノーマおよびＨｅｒ２／ｎｅｕ乳がんなどのようないくつかの腫瘍が、免疫原性の弱い腫瘍であるので、ナノカプセルワクチンのみでは、いくつかの事例において、強い抗腫瘍応答を誘起しない場合がある。しかしながら、ＴＬＲアゴニスト（ＣｐＧ−ＯＮ、ＭＰＬＡ、およびポリＩ：Ｃ）と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦを有する抗原添加マトリックスは、Ｂ１６メラノーマモデルにおいて著しい保護に至った。いくつかの実施形態では、最も効力のある抗腫瘍性の免疫（腫瘍成長の遅延および／または腫瘍内Ｔ細胞応答の増強）を促すナノカプセルが、相乗効果研究のためにチェックポイント遮断と組み合わせられる。
材料および方法
ＤＮＡナノ構造体のフォールディング
一本鎖スキャフォールドＤＮＡを、社内で標準的なプラスミド発現プロトコールを使用して調製した。ステープルＤＮＡ鎖は、Integrated ＤＮＡ Technologyからのものとした。構造体を組み立てるために、非精製ＤＮＡステープル鎖を、６〜１８ｍＭ ＭｇＣｌ２を補足した０．５×ＴＥバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中１０ｎＭの濃度でスキャフォールドと１０倍の過剰量で混合した。
アニーリング勾配
次いで、鎖混合物を、１５分間にわたる６５℃での変性ステップ、次いで、５０℃から２４℃までの２４時間または７２時間の直線的な冷却勾配によって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）サーモサイクラーにおいてアニールした。アニーリングはまた、フォールドされている構造体に対して特異的な所与の温度で等温で行うこともできる。
アガロースゲル分析：次いで、アニールしたサンプルを、氷水浴槽において２時間７０ボルトで２％未変性アガロースゲル電気泳動法（１１ｍＭ ＭｇＣｌ２を補足した０．５×ＴＢＥバッファーおよび０．００５％（ｖ／ｖ）エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）中で調製したゲル）にかけた。次いで、標的ゲルバンドを切除し、Freeze ’N Squeeze column（Bio-Rad Laboratories,Inc.）の中に置いた。ゲル片を、カラム中でマイクロチューブ乳棒によって砕いて、小さな片にし、次いで、カラムを５分間７０００ｇで遠心分離した。カラムによって抽出したサンプルを、ＴＥＭまたは原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像処理のために収集した。
画像処理
画像処理のために、３．５μＬのアガロースゲル精製または非精製サンプルを、グロー放電カーボンコートＴＥＭグリッド上に１分間吸着させた。次いで、グリッドは、２５ｍＭ ＮａＯＨを含有する２％水性ギ酸ウラニル溶液を使用して２０秒間染色した。画像処理は、８０ｋＶで作動させたＪＥＯＬ ＪＥＭ−１４００顕微鏡を使用して実行した。
ポリリシンポリマーとのインキュベーション
ポリリシンペプチドは、Peptide 2.0からのものとした。それらを、０．５×ＴＥバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ Ｍｇを含有する１ｍＭ ＥＤＴＡ）において可溶化し、様々な濃度で等分し、−２０℃で保存した。０．５×ＴＥバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｍｇ）中２ｎＭ濃度の１００μＬの精製ＤＮＡナノ構造体を、１時間、ｘｎＭ量のポリリシン（ｘは、使用されるポリリシンの長さに依存する）とインキュベートした。次いで、サンプルは、Thermo Scientific(Slide-A-Lyzer)から購入したマイクロ透析ユニットに移した。透析ユニットを、１Ｌの０．５×ＴＥバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に置き、２４時間透析した。透析バッファー中にマグネシウムはなかった。
次いで、透析したサンプルを、氷水浴槽において２時間７０ボルトで２％未変性アガロースゲル電気泳動法（０．５×ＴＢＥバッファーおよび０．００５％（ｖ／ｖ）エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）中で調製したゲル）にかけた。透析で残存するＤＮＡナノ構造体のみが無マグネシウムゲル上を移動する。
透析したサンプルはまたは、画像処理によっても特徴付けた。画像処理のために、３．５μＬの透析サンプルを、グロー放電カーボンコートＴＥＭグリッド上に１分間吸着させた。次いで、グリッドは、２５ｍＭ ＮａＯＨを含有する２％水性ギ酸ウラニル溶液を使用して２０秒間染色した。画像処理は、８０ｋＶで作動させたＪＥＯＬ ＪＥＭ−１４００を使用して実行した。
動物モデルの選択．
実施例１８における実験は、腫瘍細胞を同系免疫応答性マウスに皮下に移植した３つの移植可能なメラノーマおよび乳がん腫瘍モデルを用いる。移植可能な腫瘍モデルは、癌免疫療法のための有益な洞察を提供し、複雑さのために、検査することができる実験パラメーターの数が制限される遺伝子操作トランスジェニック腫瘍モデルと比較して、使用するのがより容易である。腫瘍細胞ワクチンの臨床開発に（Dranoff,G.Nat Rev Immunol 12,61-66(2012);Quezada,S.A.,et al.J Clin Invest 116,1935-1945(2006)）ならびに免疫阻害経路遮断（たとえばＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１に対する抗体）の結果を評価するために（Dranoff,G.Nat Rev Immunol 12,61-66(2012)）、広範囲に使用されてきたＢ１６メラノーマ細胞株を使用する。Ｂ１６メラノーマモデルのトランスレーショナルな実用性は、進行型メラノーマを処置するための抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体の最近のＦＤＡの承認によって例証される。そのうえ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ乳癌のトランスジェニックモデル由来の新規なＨｅｒ２／ｎｅｕ乳癌細胞株（Black,C.M.,et al.Cancer Immunol Res 2,307-319(2014)）を使用する。このＨｅｒ２／ｎｅｕ細胞株は、同系Ｂａｌｂ／ｃマウスへの移植と同時に腫瘍を形成し、ＴおよびＢ細胞応答の両方を誘起し、免疫療法に対して応答する。したがって、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ細胞株は、抗腫瘍液性およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対する治療戦略の効果を研究するための価値のあるツールを提供する。４Ｔ−１乳癌細胞株もまた、この株がチェックポイント遮断および癌ワクチン接種に対して少なくとも部分的に感受性であるので、最も効力のあるワクチン戦略を試験するために使用する（Kim,K.et al.Proc Natl Acad Sci U SA 111,11774-11779(2014)）。
定義
特定の官能基および化学用語の定義を、下記により詳細に記載する。化学元素は、元素周期表、ＣＡＳ version、Handbook of Chemistry and Physics,75th Ed.、内表紙に従って同定され、特定の官能基は、そこに記載されるように、概して定義される。そのうえ、有機化学の一般的な原理ならびに特定の官能成分および反応性は、Organic Chemistry,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito,1999;Smith and March March’s Advanced Organic Chemistry,5thEdition,John Wiley & Sons,Inc.,New York,2001;Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers,Inc.,New York,1989;およびCarruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,3rd Edition,Cambridge University Press,Cambridge,1987において記載される。
本明細書において記載される化合物は、１つ以上の不斉中心を含むことができ、したがって、様々な立体異性形態、たとえば鏡像異性体および／またはジアステレオマーで存在することができる。たとえば、本明細書において記載される化合物は、個々の鏡像異性体、ジアステレオマー、もしくは幾何異性体の形態をとることができるまたはラセミ混合物および１つ以上の立体異性体が豊富な混合物を含む立体異性体の混合物の形態をとることができる。異性体は、キラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびにキラル塩の形成および結晶化を含む、当業者らに知られている方法によって混合物から単離することができるまたは好ましい異性体を不斉合成によって調製することができる。たとえばJacques et al.,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981);Wilen et al.,Tetrahedron 33:2725(1977);Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962);およびWilen,S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p.268(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)を参照されたい。本発明は、そのうえ、他の異性体が実質的にない個々の異性体としてのおよびその代わりに、様々な異性体の混合物としての化合物を包含する。
特に指定のない限り、本明細書において示される構造体はまた、１つ以上の同位体が豊富な原子の存在においてのみ異なる化合物を含むこともまた意図される。たとえば、重水素もしくはトリチウムによる水素の置換、１９Ｆの１８Ｆとの置換、または１３Ｃもしくは１４Ｃが豊富な炭素による炭素の置換を除いて、本発明の構造体を有する化合物は、本開示の範囲内にある。そのような化合物は、たとえば、バイオアッセイにおける分析ツールまたはプローブとして有用である。
一連の値が列挙される場合、範囲内のそれぞれの値および部分範囲を包含することが意図される。たとえば、「Ｃ１〜６アルキル」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１〜６、Ｃ１〜５、Ｃ１〜４、Ｃ１〜３、Ｃ１〜２、Ｃ２〜６、Ｃ２〜５、Ｃ２〜４、Ｃ２〜３、Ｃ３〜６、Ｃ３〜５、Ｃ３〜４、Ｃ４〜６、Ｃ４〜５、およびＣ５〜６アルキルを包含することが意図される。
本明細書において使用されるように、「アルキル」は、１〜１０の炭素原子を有する直鎖または分岐飽和炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ１〜１０アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１〜９の炭素原子を有する（「Ｃ１〜９アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１〜８の炭素原子を有する（「Ｃ１〜８アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１〜７の炭素原子を有する（「Ｃ１〜７アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１〜６の炭素原子を有する（「Ｃ１〜６アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１〜５の炭素原子を有する（「Ｃ１〜５アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１〜４の炭素原子を有する（「Ｃ１〜４アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１〜３の炭素原子を有する（「Ｃ１〜３アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１〜２の炭素原子を有する（「Ｃ１〜２アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、１つの炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基が、２〜６の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルキル」）。Ｃ１〜６アルキル基の例は、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ−プロピル（Ｃ３）、イソプロピル（Ｃ３）、ｎ−ブチル（Ｃ４）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｃ４）、ｓｅｃ−ブチル（Ｃ４）、イソブチル（Ｃ４）、ｎ−ペンチル（Ｃ５）、３−ペンタニル（Ｃ５）、アミル（Ｃ５）、ネオペンチル（Ｃ５）、３−メチル−２−ブタニル（Ｃ５）、第三級アミル（Ｃ５）、およびｎ−ヘキシル（Ｃ６）を含む。アルキル基のさらなる例は、ｎ−ヘプチル（Ｃ７）、ｎ−オクチル（Ｃ８）、およびその他同種のものを含む。別段の定めがない限り、アルキル基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換アルキル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換アルキル」）。ある実施形態では、アルキル基が、非置換Ｃ１〜１０アルキル（たとえば−ＣＨ３）である。ある実施形態では、アルキル基が、置換Ｃ１〜１０アルキルである。
本明細書において使用されるように、「ハロアルキル」は、１つ以上の水素原子がハロゲン、たとえばフルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードによって独立して交換される、本明細書において定義される置換アルキル基である。「ペルハロアルキル」は、ハロアルキルのサブセットであり、すべての水素原子がハロゲン、たとえばフルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードによって独立して交換されるアルキル基を指す。いくつかの実施形態では、ハロアルキル成分が、１〜８の炭素原子を有する（「Ｃ１〜８ハロアルキル」）。いくつかの実施形態では、ハロアルキル成分が、１〜６の炭素原子を有する（「Ｃ１〜６ハロアルキル」）。いくつかの実施形態では、ハロアルキル成分が、１〜４の炭素原子を有する（「Ｃ１〜４ハロアルキル」）。いくつかの実施形態では、ハロアルキル成分が、１〜３の炭素原子を有する（「Ｃ１〜３ハロアルキル」）。いくつかの実施形態では、ハロアルキル成分が、１〜２の炭素原子を有する（「Ｃ１〜２ハロアルキル」）。いくつかの実施形態では、すべてのハロアルキル水素原子が、ペルフルオロアルキル基をもたらすためにフルオロと交換される。いくつかの実施形態では、すべてのハロアルキル水素原子が、「ペルクロロアルキル」基をもたらすためにクロロと交換される。ハロアルキル基の例は、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＣｌ３、−ＣＦＣｌ２、−ＣＦ２Ｃｌ、およびその他同種のものを含む。
本明細書において使用されるように、「ヘテロアルキル」は、親鎖内に（つまり、隣接した炭素原子の間に挿入された）および／または親鎖の１つ以上の末端の位置に置かれた、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（たとえば１、２、３、または４つのヘテロ原子）をさらに含む、本明細書において定義されるアルキル基を指す。ある実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜１０の炭素原子および１つ以上のヘテロ原子を有する飽和基を指す（「ヘテロＣ１〜１０アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜９の炭素原子および１つ以上のヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１〜９アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜８の炭素原子および１つ以上のヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１〜８アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜７の炭素原子および１つ以上のヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１〜７アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜６の炭素原子および１つ以上のヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１〜６アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜５の炭素原子および１または２つのヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１〜５アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜４の炭素原子および１または２つのヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１〜４アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜３の炭素原子および１つのヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１〜３アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、１〜２の炭素原子および１つのヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１〜２アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、１つの炭素原子および１つのヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ１アルキル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基が、親鎖内に、２〜６の炭素原子および１または２つのヘテロ原子を有する飽和基である（「ヘテロＣ２〜６アルキル」）。別段の定めがない限り、ヘテロアルキル基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換ヘテロアルキル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換ヘテロアルキル」）。ある実施形態では、ヘテロアルキル基が、非置換ヘテロＣ１〜１０アルキルである。ある実施形態では、ヘテロアルキル基が、置換ヘテロＣ１〜１０アルキルである。
本明細書において使用されるように、「アルケニル」は、２〜１０の炭素原子および１つ以上の炭素−炭素二重結合（たとえば１、２、３、または４つの二重結合）を有する直鎖または分岐炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態では、アルケニル基が、２〜９の炭素原子を有する（「Ｃ２〜９アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基が、２〜８の炭素原子を有する（「Ｃ２〜８アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基が、２〜７の炭素原子を有する（「Ｃ２〜７アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基が、２〜６の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基が、２〜５の炭素原子を有する（「Ｃ２〜５アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基が、２〜４の炭素原子を有する（「Ｃ２〜４アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基が、２〜３の炭素原子を有する（「Ｃ２〜３アルケニル」）。いくつかの実施形態では、アルケニル基が、２つの炭素原子（「Ｃ２アルケニル」）を有する。１つ以上の炭素−炭素二重結合は、内側にあってもよい（２−ブテニルにおいてなどのように）または末端にあってもよい（１−ブテニルにおいてなどのように）。Ｃ２〜４アルケニル基の例は、エテニル（Ｃ２）、１−プロペニル（Ｃ３）、２−プロペニル（Ｃ３）、１−ブテニル（Ｃ４）、２−ブテニル（Ｃ４）、ブタジエニル（Ｃ４）、およびその他同種のものを含む。Ｃ２〜６アルケニル基の例は、前述のＣ２〜４アルケニル基ならびにペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、ヘキセニル（Ｃ６）、およびその他同種のものを含む。アルケニルのさらなる例は、ヘプテニル（Ｃ７）、オクテニル（Ｃ８）、オクタトリエニル（Ｃ８）、およびその他同種のものを含む。別段の定めがない限り、アルケニル基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換アルケニル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換アルケニル」）。ある実施形態では、アルケニル基が、非置換Ｃ２〜１０アルケニルである。ある実施形態では、アルケニル基が、置換Ｃ２〜１０アルケニルである。
本明細書において使用されるように、「ヘテロアルケニル」は、親鎖内に（つまり、隣接した炭素原子の間に挿入された）および／または親鎖の１つ以上の末端の位置に置かれた、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（たとえば１、２、３、または４つのヘテロ原子）をさらに含む、本明細書において定義されるアルケニル基を指す。ある実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜１０の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する基を指す（「ヘテロＣ２〜１０アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜９の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜９アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜８の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜８アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜７の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜７アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜６の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜６アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜５の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１または２つのヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜５アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜４の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１または２つのヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜４アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜３の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１つのヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜３アルケニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基が、親鎖内に、２〜６の炭素原子、少なくとも１つの二重結合、および１または２つのヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜６アルケニル」）。別段の定めがない限り、ヘテロアルケニル基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換ヘテロアルケニル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換ヘテロアルケニル」）。ある実施形態では、ヘテロアルケニル基が、非置換ヘテロＣ２〜１０アルケニルである。ある実施形態では、ヘテロアルケニル基が、置換ヘテロＣ２〜１０アルケニルである。
本明細書において使用されるように、「アルキニル」は、２〜１０の炭素原子および１つ以上の炭素−炭素三重結合（たとえば１、２、３、または４つの三重結合）を有する直鎖または分岐炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ２〜１０アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基が、２〜９の炭素原子を有する（「Ｃ２〜９アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基が、２〜８の炭素原子を有する（「Ｃ２〜８アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基が、２〜７の炭素原子を有する（「Ｃ２〜７アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基が、２〜６の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基が、２〜５の炭素原子を有する（「Ｃ２〜５アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基が、２〜４の炭素原子を有する（「Ｃ２〜４アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基が、２〜３の炭素原子を有する（「Ｃ２〜３アルキニル」）。いくつかの実施形態では、アルキニル基が、２つの炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１つ以上の炭素−炭素三重結合は、内側にあってもよい（２−ブチニルにおいてなどのように）または末端にあってもよい（１−ブチニルにおいてなどのように）。Ｃ２〜４アルキニル基の例は、限定を伴うことなく、エチニル（Ｃ２）、１−プロピニル（Ｃ３）、２−プロピニル（Ｃ３）、１−ブチニル（Ｃ４）、２−ブチニル（Ｃ４）、およびその他同種のものを含む。Ｃ２〜６アルケニル基の例は、前述のＣ２〜４アルキニル基ならびにペンチニル（Ｃ５）、ヘキシニル（Ｃ６）、およびその他同種のものを含む。アルキニルのさらなる例は、ヘプチニル（Ｃ７）、オクチニル（Ｃ８）、およびその他同種のものを含む。別段の定めがない限り、アルキニル基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換アルキニル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換アルキニル」）。ある実施形態では、アルキニル基が、非置換Ｃ２〜１０アルキニルである。ある実施形態では、アルキニル基が、置換Ｃ２〜１０アルキニルである。
本明細書において使用されるように、「ヘテロアルキニル」は、親鎖内に（つまり、隣接した炭素原子の間に挿入された）および／または親鎖の１つ以上の末端の位置に置かれた、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（たとえば１、２、３、または４つのヘテロ原子）をさらに含む、本明細書において定義されるアルキニル基を指す。ある実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜１０の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する基を指す（「ヘテロＣ２〜１０アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜９の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜９アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜８の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜８アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜７の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜７アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜６の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１つ以上のヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜６アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜５の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１または２つのヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜５アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜４の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１または２つのヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜４アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜３の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１つのヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜３アルキニル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキニル基が、親鎖内に、２〜６の炭素原子、少なくとも１つの三重結合、および１または２つのヘテロ原子を有する（「ヘテロＣ２〜６アルキニル」）。別段の定めがない限り、ヘテロアルキニル基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換ヘテロアルキニル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換ヘテロアルキニル」）。ある実施形態では、ヘテロアルキニル基が、非置換ヘテロＣ２〜１０アルキニルである。ある実施形態では、ヘテロアルキニル基が、置換ヘテロＣ２〜１０アルキニルである。
本明細書において使用されるように、「カルボシクリル」または「炭素環式」は、非芳香族環系中に３〜１０の環炭素原子（「Ｃ３〜１０カルボシクリル」）および０のヘテロ原子を有する非芳香族環式炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基が、３〜８の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜８カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基が、３〜７の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜７カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基が、３〜６の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基が、４〜６の環炭素原子を有する（「Ｃ４〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基が、５〜６の環炭素原子を有する（「Ｃ５〜６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態では、カルボシクリル基が、５〜１０の環炭素原子を有する（「Ｃ５〜１０カルボシクリル」）。例示的なＣ３〜１０カルボシクリル基は、限定を伴うことなく、シクロプロピル（Ｃ３）、シクロプロペニル（Ｃ３）、シクロブチル（Ｃ４）、シクロブテニル（Ｃ４）、シクロペンチル（Ｃ５）、シクロペンテニル（Ｃ５）、シクロヘキシル（Ｃ６）、シクロヘキセニル（Ｃ６）、シクロヘキサジエニル（Ｃ６）、およびその他同種のものを含む。例示的なＣ３〜８カルボシクリル基は、限定を伴うことなく、前述のＣ３〜６カルボシクリル基ならびにシクロヘプチル（Ｃ７）、シクロヘプテニル（Ｃ７）、シクロヘプタジエニル（Ｃ７）、シクロヘプタトリエニル（Ｃ７）、シクロオクチル（Ｃ８）、シクロオクテニル（Ｃ８）、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル（Ｃ７）、ビシクロ［２．２．２］オクタニル（Ｃ８）、およびその他同種のものを含む。例示的なＣ３〜１０カルボシクリル基は、限定を伴うことなく、前述のＣ３〜８カルボシクリル基ならびにシクロノニル（Ｃ９）、シクロノネニル（Ｃ９）、シクロデシル（Ｃ１０）、シクロデケニル（Ｃ１０）、オクタヒドロ−１Ｈ−インデニル（Ｃ９）、デカヒドロナフタレニル（Ｃ１０）、スピロ［４．５］デカニル（Ｃ１０）、およびその他同種のものを含む。前述の実施例が例証するように、ある実施形態では、カルボシクリル基が、単環式（「単環式カルボシクリル」）または多環式（たとえば、二環式系（「二環式カルボシクリル」）もしくは三環式系（「三環式カルボシクリル」）などのような融合、架橋、もしくはスピロ環系を含有する）であり、飽和することができるまたは１つ以上の炭素−炭素二重もしくは三重結合を含有することができる。「カルボシクリル」はまた、上記に定義されるカルボシクリル環が１つ以上のアリールまたはヘテロアリール基と融合された環系をも含み、付加の場所が、カルボシクリル環上にあり、そのような事例では、炭素の数は、炭素環式環系中の炭素の数をそのまま示す。別段の定めがない限り、カルボシクリル基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換カルボシクリル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換カルボシクリル」）。ある実施形態では、カルボシクリル基が、非置換Ｃ３〜１０カルボシクリルである。ある実施形態では、カルボシクリル基が、置換Ｃ３〜１０カルボシクリルである。
いくつかの実施形態では、「カルボシクリル」が、３〜１０の環炭素原子を有する単環式飽和カルボシクリル基である（「Ｃ３〜１０シクロアルキル」）。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基が、３〜８の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜８シクロアルキル」）。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基が、３〜６の環炭素原子を有する（「Ｃ３〜６シクロアルキル」）。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基が、４〜６の環炭素原子を有する（「Ｃ４〜６シクロアルキル」）。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基が、５〜６の環炭素原子を有する（「Ｃ５〜６シクロアルキル」）。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基が、５〜１０の環炭素原子を有する（「Ｃ５〜１０シクロアルキル」）。Ｃ５〜６シクロアルキル基の例は、シクロペンチル（Ｃ５）およびシクロヘキシル（Ｃ５）を含む。Ｃ３〜６シクロアルキル基の例は、前述のＣ５〜６シクロアルキル基ならびにシクロプロピル（Ｃ３）およびシクロブチル（Ｃ４）を含む。Ｃ３〜８シクロアルキル基の例は、前述のＣ３〜６シクロアルキル基ならびにシクロヘプチル（Ｃ７）およびシクロオクチル（Ｃ８）を含む。別段の定めがない限り、シクロアルキル基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換シクロアルキル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換シクロアルキル」）。ある実施形態では、シクロアルキル基が、非置換Ｃ３〜１０シクロアルキルである。ある実施形態では、シクロアルキル基が、置換Ｃ３〜１０シクロアルキルである。
本明細書において使用されるように、「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、環炭素原子および１〜４の環ヘテロ原子を有する３〜１４員非芳香族環系のラジカルを指し、それぞれのヘテロ原子が、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される（「３〜１４員ヘテロシクリル」）。１つ以上の窒素原子を含有するヘテロシクリル基では、付加の場所は、結合価が可能にするように、炭素または窒素原子とすることができる。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）または多環式（たとえば、二環式系（「二環式ヘテロシクリル」）もしくは三環式系（「三環式ヘテロシクリル」）などのような融合、架橋、もしくはスピロ環系）であり、飽和することができるまたは１つ以上の炭素−炭素二重もしくは三重結合を含有することができる。ヘテロシクリルの多環式環系は、一方または両方の環に１つ以上のヘテロ原子を含むことができる。「ヘテロシクリル」はまた、上記に定義されるヘテロシクリル環が１つ以上のカルボシクリル基と融合された環系をも含み、付加の場所が、カルボシクリルまたはヘテロシクリル環または環系上にあり、上記に定義されるヘテロシクリル環が、１つ以上のアリールまたはヘテロアリール基と融合され、付加の場所が、ヘテロシクリル環上にあり、そのような事例では、環員原子（ring member）の数は、ヘテロシクリル環系中の環員原子の数をそのまま示す。別段の定めがない限り、ヘテロシクリルのそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換ヘテロシクリル」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換ヘテロシクリル」）。ある実施形態では、ヘテロシクリル基が、非置換３〜１４員ヘテロシクリルである。ある実施形態では、ヘテロシクリル基が、置換３〜１４員ヘテロシクリルである。
いくつかの実施形態では、ヘテロシクリル基が、環炭素原子および１〜４の環ヘテロ原子を有する５〜１０員非芳香族環系であり、それぞれのヘテロ原子が、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される（「５〜１０員ヘテロシクリル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロシクリル基が、環炭素原子および１〜４の環ヘテロ原子を有する５〜８員非芳香族環系であり、それぞれのヘテロ原子が、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される（「５〜８員ヘテロシクリル」）。いくつかの実施形態では、ヘテロシクリル基が、環炭素原子および１〜４の環ヘテロ原子を有する５〜６員非芳香族環系であり、それぞれのヘテロ原子が、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される（「５〜６員ヘテロシクリル」）。いくつかの実施形態では、５〜６員ヘテロシクリルが、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜３の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態では、５〜６員ヘテロシクリルが、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜２の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態では、５〜６員ヘテロシクリルが、窒素、酸素、および硫黄から選択される１つの環ヘテロ原子を有する。
１つのヘテロ原子を含有する例示的な３員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、アジルジニル（azirdinyl）、オキシラニル、チオレニル（thiorenyl）を含む。１つのヘテロ原子を含有する例示的な４員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、アゼチジニル、オキセタニル、およびチエタニル（thietanyl）を含む。１つのヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ジヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ジヒドロピロリル、およびピロリル−２，５−ジオンを含む。２つのヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、ジオキソラニル、オキサチオラニル、およびジチオラニル（dithiolanyl）を含む。３つのヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、トリアゾリニル（triazolinyl）、オキサジアゾリニル（oxadiazolinyl）、およびチアジアゾリニル（thiadiazolinyl）を含む。１つのヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピリジニル、およびチアニルを含む。２つのヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、ピペラジニル、モルホリニル、ジチアニル（dithianyl）、ジオキサニルを含む。２つのヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、トリアジナニル（triazinanyl）を含む。１つのヘテロ原子を含有する例示的な７員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、アゼパニル、オキセパニル、およびチエパニル（thiepanyl）を含む。１つのヘテロ原子を含有する例示的な８員ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、アゾカニル（azocanyl）、オキセカニル（oxecanyl）、およびチオカニル（thiocanyl）を含む。例示的な二環式ヘテロシクリル基は、限定を伴うことなく、インドリニル、イソインドリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチエニル（dihydrobenzothienyl）、テトラヒドロベンゾチエニル（tetrahydrobenzothienyl）、テトラヒドロベンゾフラニル、テトラヒドロインドリル（tetrahydroindolyl）、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、オクタヒドロクロメニル（octahydrochromenyl）、オクタヒドロイソクロメニル（octahydroisochromenyl）、デカヒドロナフチリジニル（decahydronaphthyridinyl）、デカヒドロ−１，８−ナフチリジニル（naphthyridinyl）、オクタヒドロピロロ［３，２−ｂ］ピロール、インドリニル、フタルイミジル、ナフタルイミジル、クロマニル、クロメニル、１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピニル、１，４，５，７−テトラヒドロピラノ［３，４−ｂ］ピロリル、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロリル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピラニル、５，７−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラニル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル、２，３−ジヒドロフロ［２，３−ｂ］ピリジニル、４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル、４，５，６，７−テトラヒドロフロ［３，２−ｃ］ピリジニル、４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［３，２−ｂ］ピリジニル、１，２，３，４−テトラヒドロ−１，６−ナフチリジニル、およびその他同種のものを含む。
本明細書において使用されるように、「アリール」は、芳香族環系中に提供される６〜１４の環炭素原子および０のヘテロ原子を有する単環式または多環式（たとえば二環式もしくは三環式）４ｎ＋２芳香族環系（たとえば、環状の配列中で共有される６、１０、または１４のπ電子を有する）のラジカルを指す（「Ｃ６〜１４アリール」）。いくつかの実施形態では、アリール基が、６つの環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；たとえばフェニル）。いくつかの実施形態では、アリール基が、１０の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；たとえば、１−ナフチルおよび２−ナフチルなどのようなナフチル）。いくつかの実施形態では、アリール基が、１４の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；たとえばアントラシル）。「アリール」はまた、上記に定義されるアリール環が１つ以上のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基と融合された環系をも含み、ラジカルまたは付加の場所が、アリール環上にあり、そのような事例では、炭素原子の数は、アリール環系中の炭素原子の数をそのまま示す。別段の定めがない限り、アリール基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換アリール」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換アリール」）。ある実施形態では、アリール基が、非置換Ｃ６〜１４アリールである。ある実施形態では、アリール基が、置換Ｃ６〜１４アリールである。
「アラルキル」は、「アルキル」のサブセットであり、本明細書において定義されるアリール基によって置換された、本明細書において定義されるアルキル基を指し、付加の場所が、アルキル成分上にある。
本明細書において使用されるように、「ヘテロアリール」は、芳香族環系中に提供される環炭素原子および１〜４の環ヘテロ原子を有する５〜１４員単環式または多環式（たとえば二環式もしくは三環式）４ｎ＋２芳香族環系（たとえば、環状の配列中で共有される６、１０、または１４のπ電子を有する）のラジカルを指し、それぞれのヘテロ原子が、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される（「５〜１４員ヘテロアリール」）。１つ以上の窒素原子を含有するヘテロアリール基では、付加の場所は、結合価が可能にするように、炭素または窒素原子とすることができる。ヘテロアリールの多環式環系は、一方または両方の環に１つ以上のヘテロ原子を含むことができる。「ヘテロアリール」はまた、上記に定義されるヘテロアリール環が１つ以上のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基と融合された環系をも含み、付加の場所が、ヘテロアリール環上にあり、そのような事例では、環員原子の数は、ヘテロアリール環系中の環員原子の数をそのまま示す。「ヘテロアリール」はまた、上記に定義されるヘテロアリール環が１つ以上のアリール基と融合された環系をも含み、付加の場所が、アリールまたはヘテロアリール環上にあり、そのような事例では、環員原子の数は、融合多環式（アリール／ヘテロアリール）環系中の環員原子の数をそのまま示す。一方の環がヘテロ原子を含有しない多環式ヘテロアリール基（たとえばインドリル、キノリニル、カルバゾリル、およびその他同種のもの）は、付加の場所が、一方の環上とすることができる、つまり、ヘテロ原子を持つ環（たとえば２−インドリル）またはヘテロ原子を含有しない環（たとえば５−インドリル）にある。
いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基が、芳香族環系中に提供される環炭素原子および１〜４の環ヘテロ原子を有する５〜１０員芳香族環系であり、それぞれのヘテロ原子が、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される（「５〜１０員ヘテロアリール」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基が、芳香族環系中に提供される環炭素原子および１〜４の環ヘテロ原子を有する５〜８員芳香族環系であり、それぞれのヘテロ原子が、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される（「５〜８員ヘテロアリール」）。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基が、芳香族環系中に提供される環炭素原子および１〜４の環ヘテロ原子を有する５〜６員芳香族環系であり、それぞれのヘテロ原子が、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される（「５〜６員ヘテロアリール」）。いくつかの実施形態では、５〜６員ヘテロアリールが、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜３の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態では、５〜６員ヘテロアリールが、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜２の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態では、５〜６員ヘテロアリールが、窒素、酸素、および硫黄から選択される１つの環ヘテロ原子を有する。別段の定めがない限り、ヘテロアリール基のそれぞれの事例は、独立して、非置換（「非置換ヘテロアリール」）であるまたは１つ以上の置換基により置換される（「置換ヘテロアリール」）。ある実施形態では、ヘテロアリール基が、非置換５〜１４員ヘテロアリールである。ある実施形態では、ヘテロアリール基が、置換５〜１４員ヘテロアリールである。
１つのヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、ピロリル、フラニル、およびチオフェニルを含む。２つのヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、およびイソチアゾリルを含む。３つのヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、トリアゾリル、オキサジアゾリル、およびチアジアゾリルを含む。４つのヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、テトラゾリルを含む。１つのヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、ピリジニルを含む。２つのヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、ピリダジニル、ピリミジニル、およびピラジニルを含む。３または４つのヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、それぞれ、トリアジニルおよびテトラジニル（tetrazinyl）を含む。１つのヘテロ原子を含有する例示的な７員ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、アゼピニル、オキセピニル、およびチエピニルを含む。例示的な５，６−二環式ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、イソベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイソフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル（benzisoxazolyl）、ベンズオキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル（benzthiazolyl）、ベンゾイソチアゾリル、ベンズチアジアゾリル（benzthiadiazolyl）、インドリジニル、およびプリニルを含む。例示的な６，６−二環式ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、ナフチリジニル、プテリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キノキサリニル、フタラジニル、およびキナゾリニルを含む。例示的な三環式ヘテロアリール基は、限定を伴うことなく、フェナントリジニル（phenanthridinyl）、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、およびフェナジニルを含む。
「ヘテロアラルキル」は、「アルキル」のサブセットであり、本明細書において定義されるヘテロアリール基によって置換された、本明細書において定義されるアルキル基を指し、付加の場所が、アルキル成分上にある。
本明細書において使用されるように、用語「部分的に不飽和の」は、少なくとも１つの二重または三重結合を含む環成分を指す。用語「部分的に不飽和の」は、不飽和の複数の部位を有する環を包含することが意図されるが、本明細書において定義される芳香族基（たとえばアリールまたはヘテロアリール成分）を含むようには意図されない。
本明細書において使用されるように、用語「飽和された」は、二重または三重結合を含有しない環成分を指す、すなわち、環は単結合だけを含有する。
基に接尾語「−エン」を付けることは、基が二価の成分であることを示す、たとえば、アルキレンは、アルキルの二価の成分であり、アルケニレンは、アルケニルの二価の成分であり、アルキニレンは、アルキニルの二価の成分であり、ヘテロアルキレンは、ヘテロアルキルの二価の成分であり、ヘテロアルケニレンは、ヘテロアルケニルの二価の成分であり、ヘテロアルキニレンは、ヘテロアルキニルの二価の成分であり、カルボシクリレンは、カルボシクリルの二価の成分であり、ヘテロシクリレンは、ヘテロシクリルの二価の成分であり、アリーレンは、アリールの二価の成分であり、ヘテロアリーレンは、ヘテロアリールの二価の成分である。
上記から理解されるように、本明細書において定義されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール基は、ある実施形態では、任意選択で置換される。任意選択で置換されるは、置換されても、非置換であってもよい基を指す（たとえば「置換」もしくは「非置換」アルキル、「置換」もしくは「非置換」アルケニル、「置換」もしくは「非置換」アルキニル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルキル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルケニル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロアルキニル、「置換」もしくは「非置換」カルボシクリル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロシクリル、「置換」もしくは「非置換」アリール、または「置換」もしくは「非置換」ヘテロアリール基）。一般に、用語「置換された」は、基に存在する少なくとも１つの水素が許容される置換基、たとえば、置換に際して安定性の化合物、たとえば、転位、環化、脱離、または他の反応によってなどのような変化を自発的に受けない化合物をもたらす置換基と交換されることを意味する。別段の指示がない限り、「置換された」基は、基の１つ以上の置換可能な（substitutable）位置に置換基を有し、任意の所与の構造体における１つを超える位置が置換される場合、置換基は、それぞれの位置で同じものであるまたは異なるものである。本発明は、安定性の化合物を得るために、任意のおよびすべてのそのような組み合わせを企図する。本発明の目的のために、窒素などのようなヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の結合価に適合し、安定性の成分の形成をもたらす本明細書において記載される任意の適した置換基を有していてもよい。
例示的な炭素原子置換基は、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−ＯＮ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）３ ＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＲｃｃ）Ｒｂｂ、−ＳＨ、−ＳＲａａ、−ＳＳＲＣＣ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨＯ、−Ｃ（ＯＲｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２ＯＲａａ、−ＯＳＯ２Ｒａａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−ＯＳｉ（Ｒａａ）３−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−ＯＰ（Ｒｃｃ）２、−ＯＰ（Ｒｃｃ）３、−Ｂ（Ｒａａ）２、−Ｂ（ＯＲｃｃ）２、−ＢＲａａ（ＯＲｃｃ）、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ヘテロＣ１〜１０アルキル、ヘテロＣ２〜１０アルケニル、ヘテロＣ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールを含むが、これらに限定されず、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、もしくは５つのＲｄｄ基により独立して置換され
または炭素原子上の２つのジェミナルな水素が、基＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮ（Ｒｂｂ）２、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、＝ＮＮＲｂｂＳ（＝Ｏ）２Ｒａａ、＝ＮＲｂｂ、もしくは＝ＮＯＲｃｃと交換され、
Ｒａａのそれぞれの事例が、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ヘテロＣ１〜１０アルキル、ヘテロＣ２〜１０アルケニル、ヘテロＣ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから独立して選択されまたは２つのＲａａ基が、つながれて、３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、または５つのＲｄｄ基により独立して置換され、
Ｒｂｂのそれぞれの事例が、水素、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ヘテロＣ１〜１０アルキル、ヘテロＣ２〜１０アルケニル、ヘテロＣ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから独立して選択されまたは２つのＲｂｂ基が、つながれて、３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、または５つのＲｄｄ基により独立して置換され、
Ｒｃｃのそれぞれの事例が、水素、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ヘテロＣ１〜１０アルキル、ヘテロＣ２〜１０アルケニル、ヘテロＣ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから独立して選択されまたは２つのＲｃｃ基が、つながれて、３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、または５つのＲｄｄ基により独立して置換され、
Ｒｄｄのそれぞれの事例が、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲｅｅ、−ＯＮ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）３ ＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＲｅｅ）Ｒｆｆ、−ＳＨ、−ＳＲｅｅ、−ＳＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＯＣＯ２Ｒｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣＯ２Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２ＯＲｅｅ、−ＯＳＯ２Ｒｅｅ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−Ｓｉ（Ｒｅｅ）３、−ＯＳｉ（Ｒｅｅ）３、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｅｅ）２、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ヘテロＣ１〜６アルキル、ヘテロＣ２〜６アルケニル、ヘテロＣ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１０員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、５〜１０員ヘテロアリールから独立して選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、もしくは５つのＲｇｇ基により独立して置換されまたは２つのジェミナルなＲｄｄ置換基が、つながれて、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成することができ、
Ｒｅｅのそれぞれの事例は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ヘテロＣ１〜６アルキル、ヘテロＣ２〜６アルケニル、ヘテロＣ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、３〜１０員ヘテロシクリル、および３〜１０員ヘテロアリールから独立して選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、もしくは５つのＲｇｇ基により独立して置換され、
Ｒｆｆのそれぞれの事例が、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ヘテロＣ１〜６アルキル、ヘテロＣ２〜６アルケニル、ヘテロＣ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１０員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１０アリール、および５〜１０員ヘテロアリールから独立して選択されまたは２つのＲｆｆ基が、つながれて、３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、または５つのＲｇｇ基により独立して置換され、
Ｒｇｇのそれぞれの事例が、独立して、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣ１〜６アルキル、−ＯＮ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）３ ＋Ｘ−、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）２ ＋Ｘ−、−ＮＨ２（Ｃ１〜６アルキル）＋Ｘ−、−ＮＨ３ ＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＣ１〜６アルキル）（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（ＯＨ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ（ＯＨ）、−ＳＨ、−ＳＣ１〜６アルキル、−ＳＳ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝ＮＨ）（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（＝ＮＨ）ＯＣ１〜６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯ２ＯＣ１〜６アルキル、−ＯＳＯ２Ｃ１〜６アルキル、−ＳＯＣ１〜６アルキル、−Ｓｉ（Ｃ１〜６アルキル）３、−ＯＳｉ（Ｃ１〜６アルキル）３−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＣ１〜６アルキル、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＣ１〜６アルキル、−Ｐ（＝Ｏ）２（Ｃ１〜６アルキル）、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｃ１〜６アルキル）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＣ１〜６アルキル）２、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６ペルハロアルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ヘテロＣ１〜６アルキル、ヘテロＣ２〜６アルケニル、ヘテロＣ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、Ｃ６〜１０アリール、３〜１０員ヘテロシクリル、５〜１０員ヘテロアリールでありまたは２つのジェミナルなＲｇｇ置換基が、つながれて、＝Ｏもしくは＝Ｓを形成することができ、Ｘ−が、対イオンである。
本明細書において使用されるように、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−Ｃｌ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）、またはヨウ素（ヨード、−Ｉ）を指す。
本明細書において使用されるように、「対イオン」は、電子的な中性を維持するために正に荷電している第四級アミンに関連する負に荷電している基である。例示的な対イオンは、ハロゲン化物イオン（たとえばＦ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−）、ＮＯ３ −、ＣｌＯ４ −、ＯＨ−、Ｈ２ＰＯ４ −、ＨＳＯ４ −、スルホン酸イオン（たとえばメタンスルホナート、トリフルオロメタンスルホナート、ｐ−トルエンスルホナート、ベンゼンスルホナート、１０−カンファスルホナート、ナフタリン−２−スルホナート、ナフタリン−１−スルホン酸−５−スルホナート、エタン−１−スルホン酸−２−スルホナート、およびその他同種のもの）、ならびにカルボン酸イオン（たとえばアセタート、エタノアート、プロパノアート、ベンゾアート、グリセラート、ラクテート、タルトラート、グリコレート、およびその他同種のもの）を含む。
窒素原子は、結合価が可能にするように、置換されてもよくまたは非置換であってもよく、第一級、第二級、第三級、および第四級窒素原子を含む。例示的な窒素原子置換基は、水素、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜１０ペルハロアルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ヘテロＣ１〜１０アルキル、ヘテロＣ２〜１０アルケニル、ヘテロＣ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールを含むが、これらに限定されず、またはＮ原子に付加された２つのＲｃｃ基が、つながれて、３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、または５つのＲｄｄ基により独立して置換され、Ｒａａ、Ｒｂｂ、Ｒｃｃ、およびＲｄｄは、上記に定義されるとおりである。
ある実施形態では、窒素原子に存在する置換基が、窒素保護基である（「アミノ保護基」とも本明細書において呼ばれる）。窒素保護基は、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、Ｃ１〜１０アルキル（たとえばアラルキル、ヘテロアラルキル）、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、ヘテロＣ１〜１０アルキル、ヘテロＣ２〜１０アルケニル、ヘテロＣ２〜１０アルキニル、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリール基を含むが、これらに限定されず、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、およびヘテロアリールが、０、１、２、３、４、または５つのＲｄｄ基により独立して置換され、Ｒａａ、Ｒｂｂ、Ｒｃｃ、およびＲｄｄは、本明細書において定義されるとおりである。窒素保護基は、当技術分野においてよく知られており、参照によって本明細書に援用されるProtecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene and P.G.M.Wuts,3rdedition,John Wiley & Sons,1999において詳細に記載されるものを含む。
たとえば、アミド基（たとえば−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ）などのような窒素保護基は、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド（nitophenylacetamide）、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシアシルアミノ（dithiobenzyloxyacylamino））アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド（nitrocinnamide）、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、およびｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミドを含むが、これらに限定されない。
カルバメート基（たとえば−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａａ）などのような窒素保護基は、カルバミン酸メチル、カルバミン酸エチル、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル（tetrahydrothioxanthyl））］カルバミン酸メチル（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）カルバミン酸エチル（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）カルバミン酸エチル（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド（dicyclohexylcarboxamido））カルバミン酸エチル、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニル（hydroxypiperidinyl）カルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトベンジル（nitobenzyl）カルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）カルバミン酸エチル、［２−（１，３−ジチアニル）］カルバミン酸メチル（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチル（phosphonioethyl）カルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピル（triphenylphosphonioisopropyl）カルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジル（acyloxybenzyl）カルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンジソキサゾリルメチル（benzisoxazolylmethyl）カルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチル（chromonylmethyl）カルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）カルバミン酸メチル、ｔ−アミルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシアシルビニル（dimethoxyacylvinyl）カルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド（dimethylcarboxamido））ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）カルバミン酸メチル、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニル（isoborynl）カルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）カルバミン酸エチル、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）カルバミン酸エチル、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、ｌ−メチル−１−（４−ピリジル）カルバミン酸エチル、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、および２，４，６−トリメチルベンジルカルバメートを含むが、これらに限定されない。
スルホンアミド基（たとえば−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａａ）などのような窒素保護基は、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル（dimethoxynaphthylmethyl））ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、およびフェナンシルスルホンアミド（phenacylsulfonamide）を含むが、これらに限定されない。
他の窒素保護基は、フェノチアジニル−（１０）−アシル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノアシル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオアシル誘導体、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加生成物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン（pyroolin）−３−イル）アミン、第四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタアシルクロミウム−またはタングステン）アシル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホロアミデート、ジベンジルホスホロアミデート、ジフェニルホスホロアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、および３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）を含むが、これらに限定されない。
ある実施形態では、酸素原子に存在する置換基が、酸素保護基である（「ヒドロキシル保護基」とも本明細書において呼ばれる）。酸素保護基は、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２を含むが、これらに限定されず、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは、本明細書において定義されるとおりである。酸素保護基は、当技術分野においてよく知られており、参照によって本明細書に援用されるProtecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene and P.G.M.Wuts,3rdedition,John Wiley & Sons,1999において詳細に記載されるものを含む。
例示的な酸素保護基は、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、グアイアコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４’’−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４’’−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−ｌ−イル）ビス（４’，４’’−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンゾイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルマート、ベンゾイルホルマート、アセタート、クロロアセタート、ジクロロアセタート、トリクロロアセタート、トリフルオロアセタート、メトキシアセタート、トリフェニルメトキシアセタート、フェノキシアセタート、ｐ−クロロフェノキシアセタート、３−フェニルプロピオナート、４−オキソペンタノアート（レブリナート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノアート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロアート、アダマントエート（adamantoate）、クロトナート、４−メトキシクロトナート、ベンゾアート、ｐ−フェニルベンゾアート、２，４，６−トリメチルベンゾアート（メシトエート）、メチルカルボナート、９−フルオレニルメチルカルボナート（Ｆｍｏｃ）、炭酸エチル、２，２，２−トリクロロエチルカルボナート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）炭酸エチル（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）炭酸エチル（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）炭酸エチル（Ｐｅｏｃ）、イソブチルカルボナート、ビニルカルボナート、アリルカーボネート、ｔ−ブチルカルボナート（ＢＯＣ）、ｐ−ニトロフェニルカルボナート、ベンジルカルボナート、ｐ−メトキシベンジルカルボナート、３，４−ジメトキシベンジルカルボナート、ｏ−ニトロベンジルカルボナート、ｐ−ニトロベンジルカルボナート、Ｓ−ベンジルチオカルボナート、４−エトキシ−１−ナフチルカルボナート、メチルジチオカルボナート、２−ヨードベンゾアート、４−アジドブチラート、４−ニトロ−４−メチルペンタノアート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾアート、２−ホルミルベンゼンスルホナート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチラート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾアート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセタート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセタート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセタート、クロロジフェニルアセタート、イソブチラート、モノスクシノアート（monosuccinoate）、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノアート、ｏ−（メトキシアシル）ベンゾアート、α−ナフトアート、ニトラート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバマート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェナート、スルファート、メタンスルホナート（メシラート）、ベンジルスルホナート、およびトシレート（Ｔｓ）を含むが、これらに限定されない。
ある実施形態では、硫黄原子に存在する置換基が、硫黄保護基である（「チオール保護基」とも呼ばれる）。硫黄保護基は、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２を含むが、これらに限定されず、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは、本明細書において定義されるとおりである。硫黄保護基は、当技術分野においてよく知られており、参照によって本明細書に援用されるProtecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene and P.G.M.Wuts,3rdedition,John Wiley & Sons,1999において詳細に記載されるものを含む。
これらおよび他の例示的な置換基は、詳細な説明、実施例、および請求項においてより詳細に記載される。本発明は、置換基の上記の例示的なリストによっていかなる方法によっても限定されるようには意図されない。
用語「薬学的に許容される塩」は、正しい医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答、およびその他同種のものを伴うことなくヒトおよび下等動物の組織に接する使用に適しており、妥当なベネフィット／リスク比と釣り合っている塩を指す。薬学的に許容される塩は、当技術分野においてよく知られている。たとえば、Bergeらは、J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19において薬学的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、適した無機および有機酸および塩基に由来するものを含む。薬学的に許容される無毒な酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などのような無機酸によりまたは酢酸、蓚酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などのような有機酸によりまたはイオン交換などのような当技術分野において使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコビル酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、硼酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヒドロヨージド（hydroiodide）、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸、蓚酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩、およびその他同種のものを含む。適切な塩基に由来する薬学的に許容される塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムおよびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩を含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびその他同種のものを含む。さらに薬学的に許容される塩は、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボキシレート、スルファート、ホスフェート、ニトラート、低級アルキルスルホナート、およびアリールスルホナートなどのような対イオンを使用して形成される、無毒なアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンを含む。
「第四級塩」は、窒素が４つの結合価を有するので、付加される２〜４つの置換基または基を含む親化合物もしくは親鎖にまたはその一部に直接付加される窒素原子を指し、窒素原子は、陽性に荷電し、電荷は、対アニオンによりバランスを保たれる。例示的な第四級塩は、親化合物に付加された置換基アミンまたは鎖−Ｎ（Ｒｂｂ）３ ＋Ｘ−または親鎖−Ｎ（Ｒｂｂ）２−＋Ｘ−のアミン部分を含むが、これらに限定されず、ＲｂｂおよびＸ−は、本明細書において定義されるとおりである。
いくつかの本発明の実施形態が、本明細書において記載され、例証されたが、当業者らは、機能を実行するならびに／または本明細書において記載される結果および／もしくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段ならびに／または構造体を容易に想定するであろう、また、そのような変形および／または修飾のそれぞれは、本明細書において記載される本発明の実施形態の範囲内であると考えられる。より一般には、当業者らは、本明細書において記載されるパラメーター、寸法、材料、および立体構造がすべて、例示的であることが意図され、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または立体構造が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存するであろうということを容易に理解するであろう。当業者らは、ルーチン的な実験のみを使用して、本明細書において記載される特定の本発明の実施形態に対する多くの等価物について認識するであろうまたは確認することができるであろう。そのため、前述の実施形態が、単なる例として示され、添付の請求項およびその等価物の範囲内で、本発明の実施形態が、詳細に記載され主張される以外の他の方法で実行されてもよいことが理解される。本開示の本発明の実施形態は、本明細書において記載されるそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関する。そのうえ、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾していない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
すべての定義は、本明細書において定義され、使用されるように、辞書の定義、参照によって組み込まれる文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味よりも優先されることを理解すべきである。
本明細書において開示される参考文献、特許、および特許出願はすべて、それぞれが引用される主題に関して参照によって組み込まれ、これは、ある場合には文書の全体を包含してもよい。
本明細書および請求項において、本明細書において使用される不定冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、他に明確な指定のない限り、「少なくとも１つ」を意味することを理解されたい。
明細書および請求項において本明細書において使用される句「および／または」は、そのように合わせられたエレメントの「どちらかまたは両方」、つまり、ある場合では関連して存在し、他の場合では関連性がなく存在するエレメントを意味することを理解されたい。「および／または」と共に列挙される複数のエレメントは、同じ様式で、つまり、そのように合わせられた「１つ以上の」エレメントと解釈されるべきである。他のエレメントは、明確に同定されるエレメントに関係するか関係しないかにかかわらず、「および／または」という節によって明確に同定されるエレメント以外に任意選択で存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのようなオープンエンドの（open ended）言語と共に使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択でＢ以外のエレメントを含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択でＡ以外のエレメントを含む）、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意選択で他のエレメントを含む）を指すことができる、などとなる。
明細書および請求項において本明細書において使用されるように、「または」は、上記に定義される「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。たとえば、リスト中のアイテムを分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的なもの、すなわち、多くのエレメントまたはエレメントのリストのうちの少なくとも１つの包含のみならず、１つを超えるエレメントおよび任意選択で、さらなるリストされていないアイテムを含むとして解釈されたい。用語が、「のうちの１つのみ」もしくは「のうちのまさに１つ」などのように、それと反対に、明らかに示されるまたは請求項において使用される場合のみ、「からなる」は、多くのエレメントまたはエレメントのリストのうちのまさに１つのエレメントの包含を指すであろう。一般に、本明細書において使用される用語「または」は、「どちらか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちのまさに１つ」などのような排他性の用語が先行する場合、単に、排他的な代替物を示すと解釈されるものとする（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）。「から本質的になる」は、請求項において使用される場合、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
明細書および請求項において本明細書において使用されるように、句「少なくとも１つ」は、１つ以上のエレメントのリストに関して、エレメントのリストにおける任意の１つ以上のエレメントから選択される少なくとも１つのエレメントを意味するが、エレメントのリスト内に詳細に列挙されるそれぞれのおよびすべてのエレメントのうちの少なくとも１つを必ずしも含むわけではなく、エレメントのリストにおけるエレメントの任意の組み合わせを除外しないことが理解されたい。この定義はまた、エレメントが、詳細に同定されるエレメントに関係するか関係しないかにかかわらず、句「少なくとも１つ」が言及されるエレメントのリスト内に詳細に同定されるエレメント以外に任意選択で存在してもよいことをも許可する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または言い換えると、「ＡもしくはＢの少なくとも１つ」または言い換えると「Ａおよび／もしくはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つのＡ、任意選択で１つを超えるＡを含み、Ｂは存在しない（および任意選択でＢ以外のエレメントを含む）；別の実施形態では少なくとも１つのＢ、任意選択で１つを超えるＢを含み、Ａは存在しない（および任意選択でＡ以外のエレメントを含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ、任意選択で１つを超えるＡを含み、少なくとも１つのＢ、任意選択で１つを超えるＢを含み、（および任意選択で他のエレメントを含む）；などを指し得る。
他に明確な指定のない限り、１つを超えるステップまたは行為を含む、本明細書において主張される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順は、必ずしも、方法のステップまたは行為が列挙される順に限定されないこともまた、理解されたい。
請求項および上記の明細書において、「〜を含む（comprising）」、「〜を含む（ｉncluding）」、「〜を持つ」、「〜を有する」、「〜を含有する」、「〜を含む（involving）」、「〜を保持する」、「〜から構成される」、およびその他同種のものなどのようなすべての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、〜を含むが、限定されないを意味することを理解されたい。移行句「〜からなる」および「〜から本質的になる」のみが、United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures,Section 2111.03において記載されるように、それぞれクローズド（closed）またはセミクローズド（semi-closed）移行句となるものとする。

Claims (81)

  1. ポリアミンポリマーにより亜飽和された核酸ナノ構造体。
  2. 前記核酸ナノ構造体が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む、請求項１に記載の核酸ナノ構造体。
  3. 前記ＤＮＡが、直鎖一本鎖プラスミドＤＮＡである、請求項２に記載の核酸ナノ構造体。
  4. 前記直鎖一本鎖プラスミドＤＮＡが、直鎖一本鎖Ｍ１３プラスミドＤＮＡである、請求項３に記載の核酸ナノ構造体。
  5. 前記核酸ナノ構造体が、三次元核酸ナノ構造体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  6. 前記核酸ナノ構造体が、合理的にデザインされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  7. 前記核酸ナノ構造体が、凝縮された核酸を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  8. 前記核酸ナノ構造体が、環状プラスミドＤＮＡを含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  9. 前記核酸ナノ構造体が、非コード核酸ナノ構造体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  10. 前記核酸ナノ構造体が、カプセル化も脂質によるコートもされていない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  11. 前記核酸ナノ構造体のリン酸の９５％未満が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  12. 前記核酸ナノ構造体のリン酸の９０％未満が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている、請求項１１に記載の核酸ナノ構造体。
  13. 前記核酸ナノ構造体のリン酸の８０％未満が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている、請求項１２に記載の核酸ナノ構造体。
  14. 前記核酸ナノ構造体のリン酸の７０％未満が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている、請求項１３に記載の核酸ナノ構造体。
  15. 前記核酸ナノ構造体のリン酸の６０％未満が、ポリアミンポリマーのアミンに連結されている、請求項１４に記載の核酸ナノ構造体。
  16. 前記ポリアミンポリマーが、アミノ酸を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  17. 前記アミノ酸が、アミン含有側鎖を含有する、請求項１６に記載の核酸ナノ構造体。
  18. 前記アミノ酸が、リシンを含む、請求項１７に記載の核酸ナノ構造体。
  19. 前記ポリアミンポリマーが、ペプチドを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  20. 前記ペプチドが、少なくとも１０％のリシンを含む、請求項１９に記載の核酸ナノ構造体。
  21. 前記ペプチドが、少なくとも２５％のリシンを含む、請求項２０に記載の核酸ナノ構造体。
  22. 前記ペプチドが、少なくとも５０％のリシンを含む、請求項２１に記載の核酸ナノ構造体。
  23. 前記ペプチドが、少なくとも７５％のリシンを含む、請求項２２に記載の核酸ナノ構造体。
  24. 前記ペプチドが、少なくとも９０％のリシンを含む、請求項２３に記載の核酸ナノ構造体。
  25. 前記ポリアミンポリマーのリシンが、少なくとも１つの非リシンアミノ酸によって互いに分離される、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  26. 前記ポリアミンポリマーのリシンが、少なくとも２つの非リシンアミノ酸によって互いに分離される、請求項２５に記載の核酸ナノ構造体。
  27. 前記ポリアミンポリマーのリシンが、少なくとも３つの非リシンアミノ酸によって互いに分離される、請求項２６に記載の核酸ナノ構造体。
  28. 前記ポリアミンポリマーが、ポリリシンホモポリマーである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  29. 前記ポリアミンポリマーが、分岐である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  30. 前記ポリアミンポリマーが、４〜１００のアミノ酸を含む、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  31. 前記ポリアミンポリマーが、４〜７５のアミノ酸を含む、請求項３０に記載の核酸ナノ構造体。
  32. 前記ポリアミンポリマーが、４〜５０のアミノ酸を含む、請求項３１に記載の核酸ナノ構造体。
  33. 前記ポリアミンポリマーが、４〜２５のアミノ酸を含む、請求項３２に記載の核酸ナノ構造体。
  34. 前記ポリアミンポリマーが、４〜１５のアミノ酸を含む、請求項３３に記載の核酸ナノ構造体。
  35. 前記ポリアミンポリマーが、６つのアミノ酸を含む、請求項３４に記載の核酸ナノ構造体。
  36. 前記ポリアミンポリマーが、８つのアミノ酸を含む、請求項３４に記載の核酸ナノ構造体。
  37. 前記ポリアミンポリマーが、１０のアミノ酸を含む、請求項３４に記載の核酸ナノ構造体。
  38. 前記ポリアミンポリマーが、１２のアミノ酸を含む、請求項３４に記載の核酸ナノ構造体。
  39. 前記ポリアミンポリマーが、
    前記核酸ナノ構造体に共有結合で付加された式（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩および／もしくは四級塩の１つ以上の基

    または前記核酸ナノ構造体と非共有結合した式（ＩＩ）またはその薬学的に許容される塩および／もしくは四級の１つ以上の化合物を含み、

    Ｌ１が、直接的な共有結合であるまたは任意選択で置換されるアルキレン、任意選択で置換されるアルケニレン、任意選択で置換されるアルキニレン、任意選択で置換されるヘテロアルキレン、任意選択で置換されるヘテロアルケニレン、任意選択で置換されるヘテロアルキニレン、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、および任意選択で置換されるヘテロアリーレンのいずれか１つもしくは組み合わせを含むリンカー基であり、
    それぞれのＲ１が、独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニル、任意選択で置換されるヘテロアルキル、任意選択で置換されるヘテロアルケニル、任意選択で置換されるヘテロアルキニル、任意選択で置換されるカルボシクリル（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｙｌ）、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるヘテロアリール、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、もしくは窒素保護基でありまたは
    Ｒ１が、式

    それぞれのＲ２が、独立して、任意選択で置換されるアルキレン、任意選択で置換されるアルケニレン、任意選択で置換されるアルキニレン、任意選択で置換されるヘテロアルキレン、任意選択で置換されるヘテロアルケニレン、任意選択で置換されるヘテロアルキニレン、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、および任意選択で置換されるヘテロアリーレンのいずれか１つもしくは組み合わせから選択されるリンカーであり、
    それぞれのＲｚが、独立して、水素、−Ｎ（ＲＡ）２、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニル、任意選択で置換されるヘテロアルキル、任意選択で置換されるヘテロアルケニル、任意選択で置換されるヘテロアルキニル、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるヘテロアリール、窒素原子に付加される場合、窒素保護基、酸素原子に付加される場合、酸素保護基、または硫黄原子に付加される場合、硫黄保護基であり、
    それぞれのＲＡが、独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニル、任意選択で置換されるヘテロアルキル、任意選択で置換されるヘテロアルケニル、任意選択で置換されるヘテロアルキニル、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるヘテロアリール、窒素原子に付加される場合、窒素保護基、酸素原子に付加される場合、酸素保護基、または硫黄原子に付加される場合、硫黄保護基でありまたは窒素原子に付加される２つのＲＡ基が、任意選択で置換される複素環式環もしくは任意選択で置換されるヘテロアリール環を形成するようにつながれ、ｎが、１および１００，０００を含む１〜１００，０００の整数であり、ｍが、１および１００，０００を含む１〜１００，０００の整数である、請求項１〜２７または２９〜３８いずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  40. Ｌ２が、任意選択で置換されたアルキレン、任意選択で置換されるアルケニレン、または任意選択で置換されるアルキニレンである、請求項３９に記載の核酸ナノ構造体。
  41. Ｌ２が、式−（ＣＨ２）ｐ−の任意選択で置換されるアルキレンであり、ｐが、１および１０を含む１〜１０の整数である、請求項４０に記載の核酸ナノ構造体。
  42. Ｌ２が、−Ｃ（ＲＡ）−Ｃ（＝Ｏ）−である、請求項３９に記載の核酸ナノ構造体。
  43. −Ｃ（ＲＡ）−Ｃ（＝Ｏ）−のＲＡが、任意選択で置換されるアルキルである、請求項４２に記載の核酸ナノ構造体。
  44. 請求項１〜４３、４９、および５０のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体ならびに
    １０ｍＭ未満のマグネシウム（Ｍｇ２＋）を含む溶液
    を含む核酸組成物。
  45. 前記溶液が、０．１ｍＭ〜０．９ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）を含む、請求項４４に記載の核酸組成物。
  46. 前記溶液が、０．６ｍＭ（Ｍｇ２＋）を含む、請求項４４または４５に記載の核酸組成物。
  47. 前記溶液が、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウム（Ｃａ２＋）をさらに含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の核酸組成物。
  48. 前記溶液が、０．９ｍＭ Ｃａ２＋をさらに含む、請求項４７に記載の核酸組成物。
  49. ポリ（エチレンイミン）−ポリエチレングリコール（ＰＥＩ−ＰＥＧ）コポリマーをさらに含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の核酸ナノ構造体。
  50. 前記核酸ナノ構造体が、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーにより亜飽和されている、請求項４９に記載の核酸ナノ構造体。
  51. ｐＨ感受性の接触部分によって第２の核酸ナノ構造体に連結された第１の核酸ナノ構造体および
    前記第２の核酸ナノ構造体への前記第１の核酸ナノ構造体の連結によって形成される内部コンパートメント
    を含む核酸ナノカプセル。
  52. 前記第１の核酸ナノ構造体が、ｐＨ感受性の一本鎖核酸ハンドルを含み、前記第２の核酸ナノ構造体が、前記ｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的な一本鎖核酸の反対のハンドルを含み、前記第１の核酸ナノ構造体が、前記反対のハンドルへの前記ｐＨ感受性のハンドルのハイブリダイゼーションによって前記第２の核酸ナノ構造体に連結されている、請求項５１に記載の核酸ナノカプセル。
  53. 前記ｐＨ感受性のハンドルが、配列番号１の配列を含む、請求項５２に記載の核酸ナノカプセル。
  54. 前記反対のハンドルが、配列番号２または配列番号３の配列を含む、請求項５２または５３に記載の核酸ナノカプセル。
  55. 前記ナノカプセルが、２つの末端部を有し、前記ナノカプセルのそれぞれの末端部が、直径が１０ｎｍ未満の開口を有する、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセル。
  56. 前記ナノカプセルのそれぞれの末端部が、直径が２ｎｍ〜１０ｎｍの開口を有する、請求項５５に記載の核酸ナノカプセル。
  57. 前記ナノカプセルの内部表面および／または外部表面に連結された薬剤をさらに含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセル。
  58. 前記ナノカプセルの内部表面および／または外部表面に連結された少なくとも２つの薬剤をさらに含む、請求項５７に記載の核酸ナノカプセル。
  59. 前記薬剤が、相補的な一本鎖核酸のハイブリダイゼーションによってナノカプセルの内部表面および／または外部表面に連結されている、請求項５６または５７に記載の核酸ナノカプセル。
  60. 前記薬剤が、部分的に相補的なｐＨ感受性のハンドルおよび反対のハンドルのハイブリダイゼーションによってナノカプセルの内部表面および／または外部表面に結合される、請求項５９に記載の核酸ナノカプセル。
  61. 前記薬剤が、外部表面に連結されたターゲティング分子である、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセル。
  62. 前記ターゲティング分子が、抗体、抗体断片、またはリガンドである、請求項６１に記載の核酸ナノカプセル。
  63. 前記薬剤が、治療剤、予防剤、診断剤、および／またはアジュバントである、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセル。
  64. 前記薬剤が、抗原である、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセル。
  65. 前記抗原が、ペプチド抗原である、請求項６４に記載の核酸ナノカプセル。
  66. 前記薬剤が、アジュバントである、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセル。
  67. 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項６６に記載の核酸ナノカプセル。
  68. ポリアミンポリマーおよび／またはカチオンポリ（エチレンイミン）およびポリエチレングリコールのコポリマーをさらに含む、請求項５１〜６７のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセル。
  69. 前記ナノカプセルが、ポリアミンポリマーならびに／またはカチオンポリ（エチレンイミン）およびポリエチレングリコールのコポリマーにより亜飽和されている、請求項６８に記載の核酸ナノカプセル。
  70. 前記第１の核酸ナノ構造体および／または前記第２の核酸ナノ構造体が、円筒の形態をしている、請求項５１〜６９のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセル。
  71. 請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセルを含む組成物。
  72. 送達ビヒクルをさらに含む、請求項７１に記載の組成物。
  73. 前記送達ビヒクルが、ポリマーゲルである、請求項７２に記載の組成物。
  74. 請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセルまたは請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む方法。
  75. 請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の核酸ナノカプセルを細胞に送達するステップを含む方法。
  76. ｐＨ感受性の一本鎖核酸ハンドルを含む第１の核酸ナノ構造体および
    前記ｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的な一本鎖核酸の反対のハンドルを含む第２の核酸ナノ構造体を含むキットであって、
    ６を超えるｐＨを有する水溶液において、前記第１の核酸ナノ構造体が、前記反対のハンドルへの前記ｐＨ感受性のハンドルのハイブリダイゼーションによって前記第２の核酸ナノ構造体に付加され、それによって、内側のコンパートメントを有する核酸ナノカプセルを形成するキット。
  77. ６を超えるｐＨを有する水溶液をさらに含む、請求項７６に記載のキット。
  78. 前記第１および第２の核酸ナノ構造体が、ｐＨ感受性のハンドルを含む、請求項７６または７７に記載のキット。
  79. 前記ｐＨ感受性のハンドルが、配列番号１の配列を含む、請求項７６〜７８のいずれか一項に記載のキット。
  80. 前記ｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的である反対のハンドルに連結された薬剤をさらに含む、請求項７８または７９に記載のキット。
  81. ｐＨ感受性のハンドルおよび前記ｐＨ感受性のハンドルに部分的に相補的である反対のハンドルに連結された薬剤をさらに含む、請求項７６または７７に記載のキット。
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