JP2017502677A - Sporolactobacillus terae and its use - Google Patents
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Abstract
本発明は、スポロラクトバチルス・テラエHKM-1、及びそれを用いた発酵によるＤ-乳酸の製造方法に関する。本発明に係るスポロラクトバチルス・テラエ（Sporolactobacillus terrae）HKM-1は、受託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１３３８９で中国典型培養物保蔵センターに寄託され、また受託番号ＤＳＭ Ｎｏ.２７５５５でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託されている。HKM-1は安価のコーンスティープリカーパウダーを窒素源としてＤ-乳酸の発酵生産を行うことができ、それを用いた発酵によるＤ-乳酸の最大生産量が１９７ｇ/Ｌであることに対して、発酵サイクルが僅か４７ｈであり、発酵生産能力が４．１９ｇ/Ｌ/ｈまで達しているため、現時点までに開示された数値より大幅に上回っている。本発明で用いた菌株HKM-1は、安定した高生産性および高光学純度を有するＤ-乳酸を製造できるという特徴を備え、製造されたＤ-乳酸の光学純度は９９．９％に達している。発酵に使われる原料は幅広い種類の安価なものであり、発酵状態が嫌気状態と微好気状態の間にある。本発明の方法を用いてＤ-乳酸の発酵生産を行うことで、コスト削減や生産性向上を実現することができ、工業上における重要な利用価値がある。The present invention relates to Sporolactobacillus terae HKM-1, and a method for producing D-lactic acid by fermentation using the same. Sporolactobacillus terrae HKM-1 according to the present invention has been deposited with the Chinese Traditional Culture Storage Center under the accession number CCTCC NO: M2013389, and is also included in the German Microbial Cell Culture Collection under the accession number DSM No. 27555. It has been deposited. HKM-1 can perform fermentative production of D-lactic acid using inexpensive corn steep liquor powder as a nitrogen source. The fermentation cycle is only 47 h and the fermentation production capacity has reached 4.19 g / L / h, which is significantly higher than the figures disclosed so far. The strain HKM-1 used in the present invention is characterized by the ability to produce D-lactic acid having stable high productivity and high optical purity, and the optical purity of the produced D-lactic acid reaches 99.9%. Yes. The raw materials used for fermentation are a wide variety of inexpensive materials, and the fermentation state is between an anaerobic state and a microaerobic state. By carrying out the fermentative production of D-lactic acid using the method of the present invention, cost reduction and productivity improvement can be realized, and there is an important industrial utility value.
Description
本発明はD-乳酸の製造技術分野における菌株及びその使用方法に関する。具体的には、安価の窒素源であるコーンスティープリカーパウダーを有機窒素源とした、高光学純度で高濃度のD-乳酸のスポロラクトバチルス・テラエの製造及びその使用方法である。 The present invention relates to a strain in the technical field of production of D-lactic acid and a method for using the same. Specifically, it is a method of producing Sporolactobacillus terae with high optical purity and high concentration of D-lactic acid using corn steep liquor powder, which is an inexpensive nitrogen source, as an organic nitrogen source and a method for using the same.
乳酸（lactic acid）は、α-ヒドロキシプロピオン酸（α-hydroxypropionic acid）ともいい、光学活性によってD-乳酸、L-乳酸とDL-乳酸に分けられる。その製造方法は、主として化学合成法と微生物発酵法がある。化学法では、L-乳酸のみが合成されるが、発酵法では、採用する菌株によって単一のL-乳酸、D-乳酸またはDL-乳酸の合成が可能である。現時点では、約90％の乳酸が微生物発酵法で製造されたものである。人体には、L-乳酸を代謝できるL-乳酸脱水素酵素しか存在していないため、L-乳酸は食品添加剤等として広く使われている。その上、L-乳酸のポリ乳酸における使用や、L-乳酸高収率菌の選択培養及び効率的な製造プロセスが大いに開発されているが、それに比べてD-乳酸に関する研究は比較的少ない。 Lactic acid (lactic acid) is also called α-hydroxypropionic acid and is divided into D-lactic acid, L-lactic acid and DL-lactic acid according to optical activity. The manufacturing method mainly includes a chemical synthesis method and a microbial fermentation method. In the chemical method, only L-lactic acid is synthesized, but in the fermentation method, a single L-lactic acid, D-lactic acid or DL-lactic acid can be synthesized depending on the strain employed. At present, about 90% of lactic acid is produced by microbial fermentation. Since the human body contains only L-lactic acid dehydrogenase capable of metabolizing L-lactic acid, L-lactic acid is widely used as a food additive. In addition, the use of L-lactic acid in polylactic acid, selective culture of L-lactic acid high-yielding bacteria and an efficient production process have been greatly developed, but there are relatively few studies on D-lactic acid.
D-乳酸は重要なキラル中間体として、医薬、農薬及び化学工業などの分野における複数のキラル物質の合成に広く使われている。特に、D-乳酸が次世代の高強度生分解性プラスチックであるポリ乳酸のモノマーとなりうることが、世界中の大手会社や科学家に大いに注目されている。D-乳酸のグローバル需要が毎年6〜8％のスピードで増えている。現在、全世界のD-乳酸生産量が1.6万トンであることに対し、その需要量が約2.6万トンであることから、D-乳酸の市場に幅広い将来性を有することが分かる。 D-lactic acid is an important chiral intermediate and is widely used for the synthesis of multiple chiral substances in fields such as medicine, agricultural chemicals and chemical industry. Particularly, D-lactic acid can be a monomer of polylactic acid, which is a next-generation high-strength biodegradable plastic, and has attracted much attention from major companies and scientists all over the world. Global demand for D-lactic acid is increasing at a rate of 6-8% annually. Currently, the global production volume of D-lactic acid is 16,000 tons, while the demand is about 26,000 tons, indicating that the D-lactic acid market has a wide range of potential.
ここ数年以来、アリールオキシプロピオン酸系除草剤の農業における使用がますます広くなり、この種の除草剤は世界で一番最初に工業化生産が実現された光学活性除草剤であり、その中にはキラル炭素原子が１つ含まれている。そのうち、D(-)型はL(+)型に比べて、薬性が6〜12倍高くなる。この種の除草剤の合成で最も重要な原料がR-(+)-2-クロロプロピオン酸である。D-乳酸を原料にすることで、光学活性のR-(+)-2-クロロプロピオン酸が得られ、即ち、D-乳酸が前記除草剤を製造するための光学活性前駆体である。 Since the last few years, the use of aryloxypropionic acid herbicides in agriculture has become increasingly widespread, and this type of herbicide is the first optically active herbicide in the world that has been industrialized. Contains one chiral carbon atom. Among them, the D (−) type has 6 to 12 times higher drug properties than the L (+) type. The most important raw material in the synthesis of this type of herbicide is R-(+)-2-chloropropionic acid. By using D-lactic acid as a raw material, optically active R-(+)-2-chloropropionic acid is obtained, that is, D-lactic acid is an optically active precursor for producing the herbicide.
新型の生物材料の普及に伴い、L-乳酸、D-乳酸は新規な材料の応用面で大きな発展があった。例えば、乳酸を原料にしてポリ乳酸系（PLA）の生分解性プラスチックを製造することが挙げられる。ポリ乳酸は良い生分解性と優れた使用特性（透明性、熱可塑性、製品安全性など）を有するため、従来のプラスチックの代わりになる理想的な生物材料の１つとされている。ポリ乳酸（PLA）は、ポリD-乳酸（PDLA）、ポリL-乳酸（PLLA）とポリDL-乳酸（PDLLA）に分けられる。純粋なD-乳酸、L-乳酸又はDL-乳酸を重合して得られるポリ乳酸は、より優れた安定性を有する。そのうち、PDLAはより優れた熱安定性を備える。ポリ乳酸は良い生分解性を持ち、使用した後に自然界の微生物によって完全に分解され、環境を汚染することなく、環境保護という点で非常に有利である。 With the spread of new biological materials, L-lactic acid and D-lactic acid have developed greatly in terms of application of new materials. For example, a polylactic acid (PLA) biodegradable plastic can be produced using lactic acid as a raw material. Since polylactic acid has good biodegradability and excellent usage characteristics (transparency, thermoplasticity, product safety, etc.), it is regarded as one of the ideal biological materials that can replace conventional plastics. Polylactic acid (PLA) is divided into poly D-lactic acid (PDLA), poly L-lactic acid (PLLA) and poly DL-lactic acid (PDLLA). Polylactic acid obtained by polymerizing pure D-lactic acid, L-lactic acid or DL-lactic acid has better stability. Among them, PDLA has better thermal stability. Polylactic acid has good biodegradability and is completely decomposed by natural microorganisms after use, and is very advantageous in terms of environmental protection without polluting the environment.
南京工業大学の丁子建氏等が2004年に、スポロラクトバチルス(Sporolactobacillus sp.)を用いたブドウ糖から発酵させてD-乳酸を製造するプロセス、発酵72ｈ後の酸生成量が40.7 g/Lであり、光学純度が96％であることを初めて開示した。南京工業大学の楊文革氏等が2006年に、組合せ発酵によるD-乳酸の製造プロセス（中国特許出願番号CN200610097453.6）において、ラクトバシラス菌(Lactobacillus)で好気性・微好気性・嫌気性の３段組合せ発酵を行う技術を発表し、発酵時間25〜38 h、乳酸生成量が75〜131 g/Lに達したこと開示した。出願番号がCN201010101421.5である中国発明特許では、大腸菌の組み換えを利用してグリセリンを原料とした発酵によるD-乳酸の製造方法が開示されているが、菌株の耐酸性が悪く、生産率が低いことにより、D-乳酸の製造における大腸菌の実際利用に限界があった。出願番号がCN201010247826.Xである中国発明特許では、遺伝子工程手段を利用して高光学純度のD-乳酸の遺伝子工程菌の構築に成功したとともに、それを乳酸の発酵生産に用いた場合におけるD-乳酸の生成量が40 g/L以上に達し、純度が99％以上であることが開示されている。出願番号がCN201010235511.3である中国発明特許では、同源組み換えの方法により、純粋なD-乳酸を生成する遺伝子工程菌を得てから、それを乳酸の発酵生産に用いた場合におけるD-乳酸の生成量が僅か20 g/L以上で、純度が99％以上であることが開示されている。上記の従来技術におけるD-乳酸の生成量は全体的に高くない。さらに検索して、出願番号がCN200810098908.5である中国発明特許では、高光学純度のD-乳酸生成菌及びそれを発酵させてD-乳酸を製造するプロセスが開示され、出願番号であるCN201210472413.0である中国発明特許では、ラクトバシラス菌及びそれを用いた発酵によるD-乳酸の製造方法が開示され、出願番号がCN201010208148.6である中国発明特許では、ピーナッツミールを用いた同時糖化発酵による高濃度D-乳酸の製造方法及びその専用培地が開示されていることが分かった。前記従来技術の発酵時間が長すぎ、いずれも70 h 以上である。これらの公開技術を、L-乳酸を生成する菌株及びその製造方法と比較させた結果、D-乳酸を生成する菌株及びその製造方法には、発酵時間が長すぎ、又は生成されるD-乳酸の濃度が比較的低いであるという欠点が存在しているため、高効率のD-乳酸に基づく菌株の製造方法をさらに開発することが必要とされている。 In 2004, Ken Chome of Nanjing Institute of Technology, etc. produced a D-lactic acid fermented from glucose using Sporolactobacillus sp., And the acid production after fermentation for 72 h was 40.7 g / L. It was first disclosed that the optical purity was 96%. In 2006, Nanjing Institute of Technology, Dr. Wen Bun Leather, etc. in the process of producing D-lactic acid by combined fermentation (Chinese patent application number CN200610097453.6) is aerobic, microaerobic and anaerobic with Lactobacillus 3 A technology for performing multi-stage fermentation was disclosed, and it was disclosed that fermentation time was 25 to 38 h and lactic acid production amount reached 75 to 131 g / L. In the Chinese invention patent whose application number is CN201010101421.5, a method for producing D-lactic acid by fermentation using glycerin as a raw material using recombination of E. coli is disclosed, but the acid resistance of the strain is poor and the production rate is low. The low value limited the practical use of E. coli in the production of D-lactic acid. In the Chinese invention patent whose application number is CN201010247826.X, we have succeeded in constructing a high-optical purity D-lactic acid gene process bacterium using genetic process means, and using it for fermentation production of lactic acid. -It is disclosed that the production amount of lactic acid reaches 40 g / L or more and the purity is 99% or more. In the Chinese invention patent whose application number is CN201010235511.3, a genetically-processed bacterium that produces pure D-lactic acid is obtained by the method of homogenous recombination and then used for the fermentation production of lactic acid. It is disclosed that the production amount is only 20 g / L or more and the purity is 99% or more. The amount of D-lactic acid produced in the above prior art is not high overall. Further searching, in the Chinese invention patent whose application number is CN200810098908.5, a high optical purity D-lactic acid producing bacterium and a process for fermenting it to produce D-lactic acid are disclosed, and the application number is CN201210472413. A Chinese invention patent of 0 discloses Lactobacillus and a method for producing D-lactic acid by fermentation using the same, and a Chinese invention patent having an application number of CN201010208148.6 has a high saccharification fermentation using peanut meal. It was found that a method for producing a concentration D-lactic acid and a dedicated medium thereof were disclosed. The prior art fermentation times are too long, both of which are 70 h or longer. As a result of comparing these published technologies with strains that produce L-lactic acid and methods for producing the same, the fermentation time is too long or produced for strains that produce D-lactic acid and methods for producing the same. Therefore, it is necessary to further develop a method for producing strains based on highly efficient D-lactic acid.
本発明は、従来技術に存在する上記の不足に対し、D-乳酸を製造するスポロラクトバチルス及びその使用方法を提供しており、ヘキソース（例えば、ブドウ糖、麦芽糖、乳糖、ショ糖など）を炭素源とし、イースト、ペプトン、ピーナッツミール、コーンスティープリカーパウダーを窒素源として用いて、D-乳酸の発酵生産を行い、高濃度で高化学純度のD-乳酸を直接製造することができ、コストの削減とともに生産性の向上が可能になり、工業生産における活用の推進に向いている。前記スポロラクトバチルスは、スポロラクトバチルス・テラエ(Sporolactobacillus terrae) HKM-1であり、中国典型培養物保蔵センター（CCTCC）に寄託されている（受託番号：CCTCC NO: M 2013389、寄託日：2013年９月２日、寄託機関の住所：中国 武漢 武漢大学、分類名：スポロラクトバチルス・テラエ Sporolactobacillus terrae）。 The present invention provides a sporolactobacillus for producing D-lactic acid and a method for using the same against the above deficiencies existing in the prior art, and provides hexose (eg, glucose, maltose, lactose, sucrose, etc.). By using yeast, peptone, peanut meal and corn steep liquor powder as a nitrogen source as a carbon source, fermentative production of D-lactic acid can be made directly to produce high concentration and high chemical purity D-lactic acid at a low cost This makes it possible to improve productivity as well as reduce production, and is suitable for promoting utilization in industrial production. The Sporolactobacillus is Sporolactobacillus terrae HKM-1, which has been deposited with the Chinese Traditional Culture Storage Center (CCTCC) (Accession Number: CCTCC NO: M 2013389, Deposit Date: On September 2, 2013, the address of the depository institution: Wuhan, China Wuhan University, classification name: Sporolactobacillus terrae).
本発明は、下記の技術方案で実現される。本発明は上記のD-乳酸を製造するためのスポロラクトバチルスの使用方法に関する。まずは、スポロラクトバチルスに対する種培養を行って種培養液を得てから、ブドウ糖、麦芽糖、乳糖、及びショ糖を炭素源とし、イースト、ペプトン、ピーナッツミール、及びコーンスティープリカーパウダー窒素源とした発酵培地にて発酵培養を行い、D-乳酸を得る。 The present invention is realized by the following technical scheme. The present invention relates to a method of using Sporolactobacillus for producing the above-mentioned D-lactic acid. First, seed culture is performed on Sporolactobacillus to obtain a seed culture solution, then glucose, maltose, lactose, and sucrose are used as carbon sources, and yeast, peptone, peanut meal, and corn steep liquor powder nitrogen sources are used. Fermentation culture is performed in a fermentation medium to obtain D-lactic acid.
具体的には、下記のステップが含まれる。
1）斜面培養
スポロラクトバチルス・テラエ（HKM-1）の菌種を20ｇ/Ｌの寒天培地を含有する固体斜面培地に接種し、40〜45℃の条件下で24〜48ｈ培養する。
Specifically, the following steps are included.
1) Slope culture Sporalactobacillus terae (HKM-1) is inoculated into a solid slope medium containing 20 g / L agar medium and cultured at 40-45 ° C. for 24-48 hours.
2）種培養
斜面培養をしたスポロラクトバチルスを無菌条件下で種培地に接種し、35〜45℃の条件下で24〜36ｈ静置培養後、中和剤を投入して発酵液のpHを制御し、種培養液を調製する。
2) Seed culture Slope Lactobacillus cultured on a slope is inoculated into a seed medium under aseptic conditions, left to stand at 35 to 45 ° C for 24 to 36 hours, and then neutralized and added to the pH of the fermentation broth To prepare a seed culture solution.
3）発酵培養
接種量を5〜20％の体積比で発酵培地に移し、35℃〜45℃の環境下において48〜72ｈ培養する。42℃の温度が好ましい。
3) Fermentation culture The inoculum is transferred to the fermentation medium at a volume ratio of 5 to 20%, and cultured in an environment of 35 ° C to 45 ° C for 48 to 72 hours. A temperature of 42 ° C is preferred.
ステップ2）に記載の前記種培地は1Lあたり、ブドウ糖100〜120 g、イースト8〜12 g、ペプトン 3〜8 g、炭酸カルシウム50 gを含有し、残りが水であることが好ましく、ブドウ糖100 g、イースト10 g、ペプトン5 g、炭酸カルシウム50 g、残りが水であることが好ましい。当該種培地のpHが6.0であり、115℃の条件下で15 min滅菌し、中和剤にはNaOH、NH4OHとCa(OH)2の中の一種又は多種が含まれる。 The seed medium described in step 2) contains 100 to 120 g of glucose, 8 to 12 g of yeast, 3 to 8 g of peptone, 50 g of calcium carbonate per liter, and the rest is preferably water. g, yeast 10 g, peptone 5 g, calcium carbonate 50 g, and the rest preferably water. The seed medium has a pH of 6.0 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min. The neutralizing agent includes one or more of NaOH, NH 4 OH and Ca (OH) 2 .
ステップ3）に記載の発酵培地の組成及びその含有量は、炭素源40〜120 g/L、窒素源添加量5〜20 g/Lであることが好ましい。 The composition and content of the fermentation medium described in Step 3) are preferably a carbon source of 40 to 120 g / L and a nitrogen source addition amount of 5 to 20 g / L.
ステップ3）に記載の発酵培地の組成及びその含有量は、ブドウ糖/ショ糖/麦芽糖/果糖 40〜120 g/L、コーンスティープリカーパウダー10〜20 g/L、イースト3〜10 g/L、ペプトン3〜10 g/L、ピーナッツミール5〜20 g/L、培地のpHを調整・制御する中和剤(NH4OH、NaOH、Ca(OH)2)を含有し、残りは水であることが好ましい。115℃の条件下で15 min滅菌する。 The composition and content of the fermentation medium described in Step 3) are glucose / sucrose / maltose / fructose 40-120 g / L, corn steep liquor powder 10-20 g / L, yeast 3-10 g / L, Contains 3-10 g / L of peptone, 5-20 g / L of peanut meal, neutralizing agents (NH 4 OH, NaOH, Ca (OH) 2 ) that adjust and control the pH of the medium, the rest being water It is preferable. Sterilize at 115 ° C for 15 min.
ステップ3）に記載の発酵プロセスは流加式工程であって、当該流加式工程とは、発酵液における総還元糖の含有量が20〜30g/Lより低い時に、総還元糖の含有量を30〜70 g/Lに維持させ、或いは50〜70 g/Lになるように炭素源を添加する工程であることが好ましい。 The fermentation process described in step 3) is a fed-batch process, which is a content of total reducing sugar when the content of total reducing sugar in the fermentation broth is lower than 20-30 g / L. Is preferably maintained at 30 to 70 g / L, or a step of adding a carbon source so as to be 50 to 70 g / L.
前記発酵培地のpHが5.0〜7.0であることが好ましい。
ブドウ糖、ショ糖、果糖、及び麦芽糖を炭素源とし、イースト、ペプトン、ピーナッツミール、及びコーンスティープリカーパウダーを窒素源とする。前記原料は市販ルートから入手可能である。
It is preferable that the fermentation medium has a pH of 5.0 to 7.0.
Glucose, sucrose, fructose, and maltose are used as carbon sources, and yeast, peptone, peanut meal, and corn steep liquor powder are used as nitrogen sources. The raw material is available from a commercial route.
本発明は、ブドウ糖、ショ糖、麦芽糖、及び果糖を炭素源とし、イースト、ペプトン、ピーナッツミール、及びコーンスティープリカーパウダーを窒素源として選択し、それに対応する発酵プロセスの条件を提供することにより、当該D-乳酸の製造プロセスの原料が得られやすくなり、低コストでD-乳酸の生成量が最大197 g/Lまでに、光学純度が99.9%以上、糖から酸への変換率が最大0.94 g/gに、発酵生産力が4.19 g/L/hになることを可能にした。よって、本発明の方法を用いてD-乳酸の製造を行う場合、コストの削減や作業フローの簡略化を実現することができ、工業上における幅広い活用の将来性がある。 The present invention provides glucose, sucrose, maltose, and fructose as carbon sources, yeast, peptone, peanut meal, and corn steep liquor powder as nitrogen sources, and providing corresponding fermentation process conditions, It is easy to obtain raw materials for the production process of D-lactic acid, the optical purity is 99.9% or more, and the conversion rate from sugar to acid is 0.94 at maximum, with low cost and up to 197 g / L of D-lactic acid production. Fermentation productivity was allowed to be 4.19 g / L / h at g / g. Therefore, when producing D-lactic acid using the method of the present invention, cost reduction and simplification of the work flow can be realized, and there is a wide range of industrial potential.
以下に本発明の実施例を具体的に説明する。本実施例は、本発明の技術方案を前提として実施され、詳細な実施形態と具体的な操作過程が示されているが、本発明の保護範囲は下記の実施例に限定されるものではない。 Examples of the present invention will be specifically described below. The present embodiment is carried out on the premise of the technical solution of the present invention, and a detailed embodiment and a specific operation process are shown. However, the protection scope of the present invention is not limited to the following embodiment. .
下記の実施例にかかるスポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)の分離、スクリーニング及び同定方法は下記の通りである。 Separation, screening and identification methods of Sporolactobacillus terae (HKM-1) according to the following examples are as follows.
一、菌株の分離・スクリーニング
当該実施例で用いられた培地の組成は下記のとおりである。
1. Isolation / screening of strains The composition of the medium used in the examples is as follows.
栄養液体培地：ブドウ糖80 g/L、イースト8 g/L、ペプトン3 g/L、炭酸カルシウム35 g/L、pH 6。 Nutrient liquid medium: glucose 80 g / L, yeast 8 g / L, peptone 3 g / L, calcium carbonate 35 g / L, pH 6.
栄養寒天培地：ブドウ糖 40 g/L、イースト10 g/L、ペプトン5%、炭酸カルシウム2 g/L、寒天粉20 g/L、pH 6、115℃で15 min滅菌。 Nutrient agar: Glucose 40 g / L, yeast 10 g / L, peptone 5%, calcium carbonate 2 g / L, agar powder 20 g / L, pH 6, sterilized at 115 ° C for 15 min.
菌株スクリーニング培地：ブドウ糖 120 g/L、イースト10 g/L、ペプトン5g/L、炭酸カルシウム50 g/L、pH 6、115℃で15 min滅菌。 Strain screening medium: Glucose 120 g / L, yeast 10 g / L, peptone 5 g / L, calcium carbonate 50 g / L, pH 6, sterilized at 115 ° C. for 15 min.
当該実施例の具体的な操作過程は下記の通りである。
雲南から採取した土壌から2gを測り、40 mLの栄養液体培地に溶解させ、42℃で24ｈ集積培養をする。その後、無菌の生理食塩水で培養液の希釈を行い、培養液をそれぞれ10倍、100倍、1000倍、10000倍に希釈した後に栄養寒天培地を含有する培養プレードに塗布し、42℃で48ｈ培養する。シングルコロニーが生えた後に、コロニーの面積が大きいもの、及びコロニーの周りの透明斑の面積が大きいものを選んで、発酵培地に接種し、42℃で48ｈ静置培養を行い、D-乳酸の生成量を測定し、複数回のスクリーニングを経て、D-乳酸の生成量が比較的高い菌株を１株選出する。
The specific operation process of the embodiment is as follows.
Weigh 2 g from soil collected from Yunnan, dissolve in 40 mL of nutrient liquid medium, and culture for 24 h at 42 ° C. Then, dilute the culture solution with sterile physiological saline, dilute the culture solution 10 times, 100 times, 1000 times, and 10000 times, respectively, and apply to the culture plate containing nutrient agar medium at 42 ° C for 48 hours. Incubate. After a single colony grows, select one with a large colony area and one with a large transparent spot around the colony, inoculate it into the fermentation medium, and perform static culture at 42 ° C for 48 hours. The production amount is measured, and a strain having a relatively high production amount of D-lactic acid is selected through multiple screening.
前記の菌株を栄養寒天プレード上に画線塗抹することを数回繰り返して分離、純化させた後、発酵テストのサイクルを10回行い、10回の発酵サイクルで生成されたD-乳酸生成量及び変換率は、ほとんど元のレベルを維持していることから前記菌株はHKM-1という名称のターゲット菌株であることが証明されている。 After separating and purifying the above-mentioned strain on the nutrient agar plate several times, separation and purification were performed, and the fermentation test cycle was performed 10 times, and the amount of D-lactic acid produced in 10 fermentation cycles and Since the conversion rate almost maintains the original level, it is proved that the strain is a target strain named HKM-1.
二、菌株の同定
1. 菌株HKM-1の生理学的同定：
生理学的同定は中国典型培養物保蔵センター（CCTCC）にて完成され、具体的には表1、表2に示す通りである。
2. Identification of strains
1. Physiological identification of strain HKM-1:
Physiological identification has been completed at the Chinese Traditional Culture Storage Center (CCTCC), and is specifically shown in Tables 1 and 2.
2. 菌株HKM-1 16S rRNA進化系統樹解析
菌株HKM-1を培養し、OD600が2〜5である時に、菌株HKM-1の全ての遺伝子群を抽出し、菌株HKM-1の16S rRNAのDNA配列を増やす。選ばれる参照菌は、本発明で提供する菌株と、近縁関係が比較的近い合計10株の菌株である。菌株HKM-1の進化系統樹解析図を図１に示す。
2. Strain HKM-1 16S rRNA evolutionary phylogenetic analysis When strain HKM-1 is cultured and OD 600 is 2-5, all gene groups of strain HKM-1 are extracted and 16S rRNA of strain HKM-1 is extracted. Increase the DNA sequence. The selected reference bacteria are a total of 10 strains that are relatively closely related to the strains provided in the present invention. An evolutionary tree analysis diagram of strain HKM-1 is shown in FIG.
前述の測定結果に基づき、16S rRNAシーケンス解析を踏まえ、菌株HKM-1をスポロラクトバチルス・テラエ（Sporolactobacillus terrae）と同定し、受託番号DSM No.27555でドイツ微生物細胞培養コレクションに寄託し、また受託番号CCTCC NO: M 2013389で中国典型培養物保蔵センターに寄託した。 Based on the above measurement results, based on 16S rRNA sequencing analysis, the strain HKM-1 was identified as Sporolactobacillus terrae, deposited with the German microbial cell culture collection under the accession number DSM No. 27555, and Deposited at the Chinese Traditional Culture Storage Center under the deposit number CCTCC NO: M 2013389.
3. スポロラクトバチルス・テラエHKM-1と公開菌株DSM11697との比較
スポロラクトバチルス・テラエHKM-1とDSM11697の2つの菌株を16SrRNAのDNA配列で比較した結果、類似性は100％である。しかしながら、Yanagida F, Suzuki K I, Kozaki M, et al. Proposal of Sporolactobacillus nakayamae subsp. nakayamae sp. nov., subsp. nov., Sporolactobacillus nakayamae subsp. racemicus subsp. nov., Sporolactobacillus terrae sp. nov., Sporolactobacillus kofuensis sp. nov., and Sporolactobacillus lactosus sp. nov[J]. International journal of systematic bacteriology, 1997, 47(2): 499-504.という文献で報告された情報によると、表1「スポロラクトバチルス・テラエHKM-1の生理学的性質―炭素源を用いた酸生成」という部分と比較した結果、表3で示したように、これら２つの菌株はヘキソースの使用に明らかな相違が存在していることが分かった。
3. Comparison between Sporactobacillus terae HKM-1 and public strain DSM11697 Comparison of two strains of Sporactobacillus terae HKM-1 and DSM11697 with the DNA sequence of 16S rRNA shows 100% similarity . However, Yanagida F, Suzuki KI, Kozaki M, et al. Proposal of Sporolactobacillus nakayamae subsp.nakayamae sp. Nov., Subsp. Nov., Sporolactobacillus nakayamae subsp.racemicus subsp. nov., and Sporolactobacillus lactosus sp. nov [J]. According to the information reported in the literature, International journal of systematic bacteriology, 1997, 47 (2): 499-504. As shown in Table 3, there is a clear difference in the use of hexose as shown in Table 3 as a result of comparison with the section “Physiological properties of terrae HKM-1-acid generation using carbon source”. I understood.
gyrB遺伝子は、DNAジャイレースのサブユニットＢタンパク質における遺伝子である。その遺伝子配列は、細菌の近縁菌種の鑑別や同定において、ノンコーディング遺伝子16S rDNAよりも高い解像度を有する。スポロラクトバチルス・テラエHKM-1のgyrB保守遺伝子配列は、配列表（二）に示したように、長さが1,920 bpであり、DSM 11697のgyrB遺伝子配列と比べて、２つの塩基の差がある。
The gyrB gene is a gene in the subunit B protein of DNA gyrase. The gene sequence has a higher resolution than the non-coding gene 16S rDNA in the identification and identification of bacterial relatives. As shown in Sequence Listing (2), the gyroB conserved gene sequence of Sporactobacillus terae HKM-1 is 1,920 bp in length, which is a difference of two bases compared to the GSM sequence of
上述によって、スポロラクトバチルス・テラエHKM-1は、これまで開示されたスポロラクトバチルス・テラエの基準株であるDSM 11697と異なり、1株の新規なスポロラクトバチルス・テラエであると考えてもよい。
Based on the above, Sporactobacillus terrae HKM-1 is considered to be one new Sporolactobacillus terae, unlike
本実施例は、コーンスティープリカーパウダーを窒素源として用いてD-乳酸を生成できる菌株を１株提供するものである。 This example provides one strain capable of producing D-lactic acid using corn steep liquor powder as a nitrogen source.
前記菌株はグラム陽性菌であり、棒状桿菌の細胞形態を有し、栄養細胞の菌体のサイズが（0.8〜0.9）μm ×（3.0〜5.0）μmであり、内生胞子を形成する。前記菌株はブドウ糖、イースト及びペプトンを含有する寒天プレート上において、表面が滑らかで、クリーム色を呈し、外縁が規則正しく縁取られている円形コロニーを形成している。当該菌株は、細くて小さい形状で、薄いクリーム色を呈し、外縁が規則正しく縁取られている円形コロニーを形成している。 The strain is a gram-positive bacterium, has a rod-shaped rod-shaped cell form, has a vegetative cell size of (0.8 to 0.9) μm × (3.0 to 5.0) μm, and forms endospores. On the agar plate containing glucose, yeast, and peptone, the strain forms a round colony with a smooth surface, a cream color, and regularly trimmed outer edges. The strain has a thin and small shape, has a light cream color, and forms a circular colony with regular outer edges.
下記の実施例にかかるスポロラクトバチルス・テラエHKM-1を用いた、発酵によるD-乳酸の製造方法のステップは、下記の通りである。 The steps of the method for producing D-lactic acid by fermentation using Sporolactocillus terae HKM-1 according to the following examples are as follows.
(1）斜面培養：スポロラクトバチルス・テラエHKM-1菌株を20 g/Lの寒天を含有する固体斜面培地に接種し、40〜45℃の条件下で、24〜48 h培養する。 (1) Slope culture: Sporalactobacillus terae HKM-1 strain is inoculated into a solid slope medium containing 20 g / L agar and cultured at 40-45 ° C. for 24-48 h.
(2）種培養：ステップ(1）の斜面培養物を、無菌条件下で40 mLの種培地に接種し、35〜45℃の条件下で、24〜36 h静置培養を行い、中和剤を投入して発酵液のpHを制御して、種培養液を調製する。 (2) Seed culture: Inoculate the slant culture from step (1) into 40 mL of seed medium under aseptic conditions, and perform static culture for 24 to 36 h under conditions of 35 to 45 ° C to neutralize. The seed culture solution is prepared by adding the agent and controlling the pH of the fermentation broth.
(3）発酵培養：接種量を5〜20％の体積比で、種培養液を発酵培地に接種し、35〜45℃の条件下で、48〜72 h培養する。 (3) Fermentation culture: The seed culture solution is inoculated into the fermentation medium at a volume ratio of 5 to 20%, and cultured at 35 to 45 ° C. for 48 to 72 hours.
そのうち、ステップ(1）、(2）、(3）に記載の菌体培養温度は42℃が好ましい。
そのうち、ステップ(2）、(3）に記載の培養過程において投入する中和剤は、炭酸カルシウムであり、pHを制御するものである。
Among them, the cell culture temperature described in Steps (1), (2) and (3) is preferably 42 ° C.
Among them, the neutralizing agent added in the culture process described in steps (2) and (3) is calcium carbonate, and controls pH.
上記の発酵培養過程中に、5ｈ毎に発酵液を1回抽出して、まずは、12,000 rpmで5 min遠心分離した後に、上澄み液を採取して、沸騰水浴中で10 min加熱する。そして、12,000 rpmで5 min遠心分離した後に、上澄み液を採取して、発酵液の中のL-乳酸濃度、D-乳酸濃度、及びブドウ糖濃度を測定し、糖から酸への変換率、発酵によるD-乳酸生産速度及びD-乳酸光学純度を算出する。 During the above fermentation culture process, the fermentation broth is extracted once every 5 h, and first centrifuged at 12,000 rpm for 5 min, and then the supernatant is collected and heated in a boiling water bath for 10 min. Then, after centrifugation at 12,000 rpm for 5 min, the supernatant is collected and the L-lactic acid concentration, D-lactic acid concentration, and glucose concentration in the fermentation liquid are measured, and the sugar-to-acid conversion rate, fermentation Calculate D-lactic acid production rate and optical purity of D-lactic acid.
総還元糖の測定方法はDNS法である。ブドウ糖の測定方法は、発酵液を希釈した後に遠心分離して、バイオセンサ解析装置SBA-40D（山東省科学院）を利用して測定を行う。バイオセンサ解析装置SBA-40Dは、固定化酵素をセンサーとする解析装置である。ブドウ糖、酸素と水は、酵素の触媒作用の下でオキシドールを生成する。反応により放出されるオキシドールは、白金-銀電極と接触し、電流信号が発生する。当該電流信号がブドウ糖濃度と線形比例関係にあり、電流信号の強度を測定することで、ブドウ糖濃度が得られる。 The method for measuring total reducing sugar is the DNS method. As a method for measuring glucose, the fermentation broth is diluted and then centrifuged, and measurement is performed using a biosensor analyzer SBA-40D (Shandong Academy of Sciences). The biosensor analyzer SBA-40D is an analyzer that uses an immobilized enzyme as a sensor. Glucose, oxygen and water produce oxidol under enzyme catalysis. The oxidol released by the reaction comes into contact with the platinum-silver electrode and generates a current signal. The current signal is linearly proportional to the glucose concentration, and the glucose concentration can be obtained by measuring the intensity of the current signal.
L-乳酸の測定方法は、下記の通りである。バイオセンサ解析装置SBA-40Dを採用し、発酵液を100倍に希釈し、注射器で25 μLの希釈液を吸い取ってから、ハイスピードでバイオセンサ解析装置SBA-40Dに注入すれば、L-乳酸の含有量を直接読み取ることができる。 The measuring method of L-lactic acid is as follows. Using the biosensor analyzer SBA-40D, diluting the fermentation solution 100 times, sucking up 25 μL of the diluted solution with a syringe, and then injecting it into the biosensor analyzer SBA-40D at high speed, L-lactic acid The content of can be read directly.
D-乳酸の測定は、キラルカラム（日本三菱化学株式会社、MCI GEL-CRS10W(3μ)4.6 ID × 50mm、光学異性体分離用）付きの、Agilent 1100高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用した。具体的な操作条件は、移動相を0.005 mol/Lの硫酸銅、流量を0.7 mL/min、注入量を5 μl、UV検出器、検出波長を254 nm、操作温度を25℃とした。D-乳酸標準品を使用して標準曲線を作成し、さらに標準曲線に基づいて発酵液に含まれるD-乳酸の含有量を算出した。 For the measurement of D-lactic acid, an Agilent 1100 high-performance liquid chromatography (HPLC) equipped with a chiral column (Mitsubishi Chemical Corporation, MCI GEL-CRS10W (3 μ) 4.6 ID × 50 mm, for optical isomer separation) was used. Specific operating conditions were a mobile phase of 0.005 mol / L copper sulfate, a flow rate of 0.7 mL / min, an injection volume of 5 μl, a UV detector, a detection wavelength of 254 nm, and an operating temperature of 25 ° C. A standard curve was prepared using a D-lactic acid standard product, and the content of D-lactic acid contained in the fermentation broth was calculated based on the standard curve.
本発明において、標準品として用いたD-乳酸は、ドイツSigma−Aldrich社製の製品（品番：L0625-25MG）である。前記のクロマトグラフ条件下でのD-乳酸の保持時間は6.5 minである。 In the present invention, D-lactic acid used as a standard product is a product (product number: L0625-25MG) manufactured by Sigma-Aldrich, Germany. The retention time of D-lactic acid under the above-mentioned chromatographic conditions is 6.5 min.
光学純度（optical purity）は、光学活性試料に含まれる一方のエナンチオマーが、他方のエナンチオマーより多く存在している量を測るものであり、エナンチオマー過剰率（enantiomeric excess，ee）で示すことができる。本発明において、L-乳酸の光学純度（ee）は、下記の計算式により算出する。 The optical purity is a measure of the amount of one enantiomer contained in an optically active sample present more than the other enantiomer, and can be indicated by an enantiomeric excess (ee). In the present invention, the optical purity (ee) of L-lactic acid is calculated by the following formula.
[(D-乳酸生成量（g/L）− L-乳酸生成量（g/L）) ÷ (D-乳酸生成量＋L-乳酸生成量)]× 100％。 [(D-lactic acid production amount (g / L) −L-lactic acid production amount (g / L)) ÷ (D-lactic acid production amount + L-lactic acid production amount)] × 100%.
糖から酸への変換率（g/g）の定義を、D-乳酸生成量（g） ÷ 基質消費量（g）とした。 The conversion rate from sugar to acid (g / g) was defined as D-lactic acid production (g) ÷ substrate consumption (g).
D-乳酸生産速度（g/L/h）を：L-乳酸生成量（g/L）÷ 発酵時間（h）とした。 D-lactic acid production rate (g / L / h) was defined as: L-lactic acid production amount (g / L) ÷ fermentation time (h).
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を用いた、三角フラスコにおいて、ブドウ糖を炭素源とし、コーンスティープリカーパウダーを窒素源とする、回分式発酵によるD-乳酸の製造方法である。 This is a method for producing D-lactic acid by batch fermentation, using glucose as a carbon source and corn steep liquor powder as a nitrogen source in an Erlenmeyer flask using Sporolactocillus terae (HKM-1).
本実施例に使用した各培地の組成は、下記の通りである。
斜面培地1Lあたり、ブドウ糖30〜50 g、イースト5〜10g、ペプトン2〜8 g、炭酸カルシウム50 g、及び寒天粉15〜25 gを含有し、残りは水である。前記種培地のpHが6.0であり、115℃で15 min滅菌する。
The composition of each medium used in this example is as follows.
It contains 30-50 g of glucose, 5-10 g of yeast, 2-8 g of peptone, 50 g of calcium carbonate, and 15-25 g of agar flour per liter of slant medium, and the rest is water. The seed medium has a pH of 6.0 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
種培地1Lあたり、ブドウ糖40〜120 g、イースト5〜10g、ペプトン2〜8 g、及び炭酸カルシウム50 gを含有し、残りは水である。前記種培地のpHが5.0〜7.0であり、115℃で15 min滅菌する。 Each liter of seed medium contains 40-120 g glucose, 5-10 g yeast, 2-8 g peptone, and 50 g calcium carbonate, the rest being water. The seed medium has a pH of 5.0 to 7.0 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
発酵培地1Lあたり、ブドウ糖60〜120 g、コーンスティープリカーパウダー20g、及び炭酸カルシウム50 gを含有し、残りは水である。前記発酵培地のpHが5.5〜6.5であり、115℃の条件下で15 min滅菌する。 Each liter of fermentation medium contains 60 to 120 g of glucose, 20 g of corn steep liquor powder, and 50 g of calcium carbonate, with the remainder being water. The fermentation medium has a pH of 5.5 to 6.5 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
本実施例でいう発酵によるD-乳酸の製造方法は、次のステップを含む。
(1）斜面培養：スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を斜面培地に接種し、42℃で24ｈ培養する。
The method for producing D-lactic acid by fermentation referred to in this example includes the following steps.
(1) Slope culture: Slope Lactobacillus terae (HKM-1) is inoculated into a slope medium and cultured at 42 ° C. for 24 hours.
(2）種培養：種培地40 mLを入れた100 mLの三角フラスコに、ステップ(1）で培養した菌株を、無菌条件下で接種用ループを使用して2回接種し、42℃で24ｈ静置培養して、種培養液を得る。 (2) Seed culture: A 100 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of seed medium is inoculated with the strain cultured in step (1) twice under aseptic conditions using an inoculation loop, and at 24 ° C for 24 hours. The seed culture is obtained by stationary culture.
(3）発酵培養：ステップ(2）で得られた5 mLの種培養液を、40 mLの発酵培地を入れた100 mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。 (3) Fermentation culture: Transfer the 5 mL seed culture solution obtained in step (2) to a 100 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of fermentation medium and perform static culture at 42 ° C. When the rate of change becomes zero, the fermentation is considered to be complete.
発酵終了後、前記具体的な実施形態に記載の測定方法及び算出方法に基づき、発酵液におけるD-乳酸濃度と総還元糖濃度を測定し、糖から酸への変換率及び生産速度を算出する。 After completion of fermentation, based on the measurement method and calculation method described in the specific embodiment, the D-lactic acid concentration and the total reducing sugar concentration in the fermentation broth are measured, and the sugar-to-acid conversion rate and production rate are calculated. .
当該発酵実験を3回繰り返すように設けられ、結果を表4に示す。 The fermentation experiment is provided to be repeated three times, and the results are shown in Table 4.
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を用いた、三角フラスコにおいて、ショ糖を炭素源とし、コーンスティープリカーパウダーを窒素源とする、回分式発酵によるD-乳酸の製造方法である。 This is a method for producing D-lactic acid by batch fermentation, using sucrose as a carbon source and corn steep liquor powder as a nitrogen source in an Erlenmeyer flask using Sporolactocillus terae (HKM-1).
本実施例に使用した各培地の組成は、下記の通りである。
斜面培地と種培地は実施例１と同様である。
The composition of each medium used in this example is as follows.
The slope medium and seed medium are the same as in Example 1.
発酵培地1Lあたり、ショ糖60〜120 g、コーンスティープリカーパウダー20 g、及び炭酸カルシウム50 gを含有し、残りは水である。前記発酵培地のpHが5.0〜7.0であり、115℃の条件下で15 min滅菌する。 Each liter of fermentation medium contains 60 to 120 g of sucrose, 20 g of corn steep liquor powder, and 50 g of calcium carbonate, and the rest is water. The fermentation medium has a pH of 5.0 to 7.0 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
当該発酵によるD-乳酸の製造方法は次のステップを含む。
(1）斜面培養：実施例１と同様である。
The method for producing D-lactic acid by the fermentation includes the following steps.
(1) Slope culture: The same as in Example 1.
(2）種培養：実施例１と同様である。
(3）発酵培養：ステップ(2）で得られた5 mLの種培養液を、40 mLの発酵培地を入れた100 mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。
(2) Seed culture: The same as in Example 1.
(3) Fermentation culture: Transfer the 5 mL seed culture solution obtained in step (2) to a 100 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of fermentation medium and perform static culture at 42 ° C. When the rate of change becomes zero, the fermentation is considered to be complete.
発酵終了後、前記具体的な実施形態に記載の測定方法及び算出方法に基づき、発酵液におけるD-乳酸濃度と総還元糖濃度を測定し、糖から酸への変換率及び生産速度を算出する。 After completion of fermentation, based on the measurement method and calculation method described in the specific embodiment, the D-lactic acid concentration and the total reducing sugar concentration in the fermentation broth are measured, and the sugar-to-acid conversion rate and production rate are calculated. .
当該発酵実験を3回繰り返すように設けられ、結果を表5に示す。 The fermentation experiment is provided to be repeated three times, and the results are shown in Table 5.
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を用いた、三角フラスコにおいて、麦芽糖を炭素源とし、コーンスティープリカーパウダーを窒素源とし、42℃で振とう静置して、発酵によるD-乳酸の製造方法である。ブドウ糖とD-乳酸の含有量が安定的に維持されている時点で、発酵を終了させる。 In an Erlenmeyer flask using Sporolactobacillus terae (HKM-1), maltose is used as a carbon source, corn steep liquor powder is used as a nitrogen source, and the mixture is left to shake at 42 ° C. It is a manufacturing method. The fermentation is terminated when the glucose and D-lactic acid contents are stably maintained.
本実施例に使用した各培地の組成は、下記の通りである。
斜面培地と種培地は実施例１と同様である。
The composition of each medium used in this example is as follows.
The slope medium and seed medium are the same as in Example 1.
発酵培地1Lあたり、麦芽糖60〜120 g、コーンスティープリカーパウダー20 g、及び炭酸カルシウム100 gを含有し、残りは水である。前記発酵培地のpHが5.0〜7.0であり、115℃の条件下で15 min滅菌する。 Each liter of fermentation medium contains 60-120 g of maltose, 20 g of corn steep liquor powder, and 100 g of calcium carbonate, and the rest is water. The fermentation medium has a pH of 5.0 to 7.0 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
当該発酵によるD-乳酸の製造方法は次のステップを含む。
(1）斜面培養：実施例１と同様である。
The method for producing D-lactic acid by the fermentation includes the following steps.
(1) Slope culture: The same as in Example 1.
(2）種培養：実施例１と同様である。
(3）発酵培養：ステップ(2）で得られた5mLの種培養液を、40mLの発酵培地を入れた100mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。
(2) Seed culture: The same as in Example 1.
(3) Fermentation culture: Transfer 5 mL of seed culture solution obtained in step (2) to a 100 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of fermentation medium, perform static culture at 42 ° C, and change rate of D-lactic acid When the value becomes zero, the fermentation is considered to be complete.
発酵終了後、前記具体的な実施形態に記載の測定方法及び算出方法に基づき、発酵液におけるD-乳酸濃度と総還元糖濃度を測定し、糖から酸への変換率及び生産速度を算出する。 After completion of fermentation, based on the measurement method and calculation method described in the specific embodiment, the D-lactic acid concentration and the total reducing sugar concentration in the fermentation broth are measured, and the sugar-to-acid conversion rate and production rate are calculated. .
当該発酵実験を3回繰り返すように設けられ、結果を表6に示す。 The fermentation experiment is provided to be repeated three times, and the results are shown in Table 6.
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を用いた、三角フラスコにおいて、果糖を炭素源とし、コーンスティープリカーパウダーを窒素源とし、42℃で振とう静置して、発酵によるD-乳酸の製造方法である。ブドウ糖とD-乳酸の含有量が安定的に維持されている時点で、発酵を終了させる。 In an Erlenmeyer flask using Sporolactocillus terae (HKM-1), fructose is used as a carbon source, corn steep liquor powder is used as a nitrogen source, and shaken at 42 ° C. It is a manufacturing method. The fermentation is terminated when the glucose and D-lactic acid contents are stably maintained.
本実施例に使用した各培地の組成は、下記の通りである。
斜面培地と種培地は実施例１と同様である。
The composition of each medium used in this example is as follows.
The slope medium and seed medium are the same as in Example 1.
発酵培地1Lあたり、アラビノース60〜120 g、コーンスティープリカーパウダー20 g、及び炭酸カルシウム100 gを含有し、残りは水である。前記発酵培地のpHが5.0〜7.0であり、115℃の条件下で15 min滅菌する。 Each liter of fermentation medium contains 60 to 120 g of arabinose, 20 g of corn steep liquor powder, and 100 g of calcium carbonate, with the remainder being water. The fermentation medium has a pH of 5.0 to 7.0 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
当該発酵によるD-乳酸の製造方法は次のステップを含む。
(1）斜面培養：実施例１と同様である。
The method for producing D-lactic acid by the fermentation includes the following steps.
(1) Slope culture: The same as in Example 1.
(2）種培養：実施例１と同様である。
(3）発酵培養：ステップ(2）で得られた5mLの種培養液を、40mLの発酵培地を入れた100mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。
(2) Seed culture: The same as in Example 1.
(3) Fermentation culture: Transfer 5 mL of seed culture solution obtained in step (2) to a 100 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of fermentation medium, perform static culture at 42 ° C, and change rate of D-lactic acid When the value becomes zero, the fermentation is considered to be complete.
発酵終了後、前記具体的な実施形態に記載の測定方法及び算出方法に基づき、発酵液におけるD-乳酸濃度と総還元糖濃度を測定し、糖から酸への変換率及び生産速度を算出する。 After completion of fermentation, based on the measurement method and calculation method described in the specific embodiment, the D-lactic acid concentration and the total reducing sugar concentration in the fermentation broth are measured, and the sugar-to-acid conversion rate and production rate are calculated. .
当該発酵実験を3回繰り返すように設けられ、結果を表7に示す。 The fermentation experiment is provided to be repeated three times, and the results are shown in Table 7.
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を用いた、三角フラスコにおいて、ブドウ糖、ショ糖、麦芽糖、及び果糖をそれぞれ炭素源として選び、イースト、ペプトン、ピーナッツミールパウダー、及びコーンスティープリカーパウダーを窒素源とし、42℃で振とう静置して、発酵によるD-乳酸の製造方法である。D-乳酸の含有量が安定的に維持されている時点で、発酵を終了させる。 Glucose, sucrose, maltose, and fructose are selected as carbon sources in Erlenmeyer flasks using Sporolactobacillus terae (HKM-1), and yeast, peptone, peanut meal powder, and corn steep liquor powder are nitrogen. This is a method for producing D-lactic acid by fermentation using a source and shaking at 42 ° C. When the D-lactic acid content is stably maintained, the fermentation is terminated.
本実施例に使用した各培地の組成は、下記の通りである。
斜面培地と種培地は実施例１と同様である。
The composition of each medium used in this example is as follows.
The slope medium and seed medium are the same as in Example 1.
発酵培地1Lあたり、ブドウ糖、ショ糖、麦芽糖、及び果糖60〜120 g、イースト3〜10 g、ペプトン3〜10 g、ピーナッツミールパウダー5〜20 g、コーンスティープリカーパウダー5〜20 g、炭酸カルシウム100 gを含有し、残りは水である。前記発酵培地のpHが5.0〜7.0であり、115℃の条件下で15 min滅菌する。 Per liter of fermentation medium, glucose, sucrose, maltose, and fructose 60-120 g, yeast 3-10 g, peptone 3-10 g, peanut meal powder 5-20 g, corn steep liquor powder 5-20 g, calcium carbonate Contains 100 g, the rest is water. The fermentation medium has a pH of 5.0 to 7.0 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
当該発酵によるD-乳酸の製造方法は次のステップを含む。
(1）斜面培養：実施例１と同様である。
The method for producing D-lactic acid by the fermentation includes the following steps.
(1) Slope culture: The same as in Example 1.
(2）種培養：実施例１と同様である。
(3）発酵培養：ステップ(2）で得られた5mLの種培養液を、40mLの発酵培地を入れた100mLの三角フラスコに移し、42℃で静置培養を行い、D-乳酸の変化速度がゼロになった時点で、発酵終了と見なす。
(2) Seed culture: The same as in Example 1.
(3) Fermentation culture: Transfer 5 mL of seed culture solution obtained in step (2) to a 100 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of fermentation medium, perform static culture at 42 ° C, and change rate of D-lactic acid When the value becomes zero, the fermentation is considered to be complete.
発酵終了後、前記具体的な実施形態に記載の測定方法及び算出方法に基づき、発酵液におけるD-乳酸濃度を測定する。 After completion of fermentation, the D-lactic acid concentration in the fermentation broth is measured based on the measurement method and calculation method described in the specific embodiment.
当該発酵実験を3回繰り返すように設けられ、結果を表8に示す。 The fermentation experiment is provided to be repeated three times, and the results are shown in Table 8.
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を用いた、5Ｌの全自動発酵槽において、120 g/Lのブドウ糖を炭素源とし、20g/Lのコーンスティープリカーパウダー、10 g/Lのイースト、10 g/Lのペプトン、40 g/Lのピーナッツミールパウダーを窒素源とする、試料（糖）を添加して流加発酵によるD-乳酸の製造方法である。 In a 5 L fully automatic fermenter using Sporolactocillus terrae (HKM-1), 120 g / L glucose as a carbon source, 20 g / L corn steep liquor powder, 10 g / L yeast, This is a method for producing D-lactic acid by fed-batch fermentation using 10 g / L peptone and 40 g / L peanut meal powder as a nitrogen source and adding a sample (sugar).
本実施例に使用した各培地の組成は、下記の通りである。
斜面培地と種培地は実施例１と同様である。
The composition of each medium used in this example is as follows.
The slope medium and seed medium are the same as in Example 1.
発酵培地1Ｌあたり、ブドウ糖120 g、コーンスティープリカーパウダー20 g、イースト10 g、ペプトン10 g、ピーナッツミールパウダー40 gを含有し、残りは水である。前記発酵培地のpHが5.5〜6.5であり、115℃の条件下で15 min滅菌する。 Each liter of fermentation medium contains 120 g of glucose, 20 g of corn steep liquor powder, 10 g of yeast, 10 g of peptone, and 40 g of peanut meal powder, and the rest is water. The fermentation medium has a pH of 5.5 to 6.5 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
当該発酵によるD-乳酸の製造方法は次のステップを含む。
(1）斜面培養：実施例１と同様である。
The method for producing D-lactic acid by the fermentation includes the following steps.
(1) Slope culture: The same as in Example 1.
(2）種培養：種培地40mLを入れた40 mLの三角フラスコに、ステップ(1）で培養した菌株を、無菌条件下で接種用ループを使用して2回接種し、42℃で24ｈ静置培養して、種培養液１を得る。5mLの種培養液1を、無菌条件下で種培地100 mLを入れた500 mLの三角フラスコに移し、42℃で24ｈ静置培養して、種培養液2を得る。
(2) Seed culture: A 40 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of seed medium is inoculated with the strain cultured in step (1) twice using an inoculation loop under aseptic conditions, and statically incubated at 42 ° C for 24 hours. The
(3）発酵培養：ステップ(2）で得られた400 mLの種培養液2を、無菌条件下で3.6 Lの発酵培地が入っている発酵槽に移し、42℃の温度で、70 rpmで攪拌培養を行い、10ｈ毎にサンプリング抽出を1回行って、発酵液における残存糖の含有量を測定し、ブドウ糖の濃度が20〜30 g/Lに下げた時に、ブドウ糖を流加して、ブドウ糖の濃度が50〜70 g/Lになるように糖添加を合計2回行う。発酵過程において、ブドウ糖消費速度がゼロに近づいた時点で、発酵を終了させる。 (3) Fermentation culture: 400 mL of seed culture solution 2 obtained in step (2) is transferred to a fermentor containing 3.6 L of fermentation medium under aseptic conditions and at a temperature of 42 ° C. and 70 rpm. Perform agitation culture, perform sampling once every 10 h, measure the residual sugar content in the fermentation broth, and when the glucose concentration is lowered to 20-30 g / L, add glucose. Sugar is added twice in total so that the glucose concentration is 50 to 70 g / L. In the fermentation process, the fermentation is terminated when the glucose consumption rate approaches zero.
発酵終了後、前記具体的な実施形態に記載の測定方法及び算出方法に基づき、発酵液におけるD-乳酸濃度を測定する。 After completion of fermentation, the D-lactic acid concentration in the fermentation broth is measured based on the measurement method and calculation method described in the specific embodiment.
当該発酵実験を3回繰り返すように設けられ、結果を表9に示す。 The fermentation experiment is provided to be repeated three times, and the results are shown in Table 9.
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を用いた、5Ｌの全自動発酵槽において、120 g/Lのブドウ糖を炭素源とし、5g/Lのコーンスティープリカーパウダー、0.9 g/Lのリン酸水素ニカリウム、3.5 g/Lのクエン酸アンモニウムで、接種量を20％とした、試料（糖）を添加して流加発酵によるD-乳酸の製造方法である。 In a 5 L fully automatic fermenter using Sporolactocillus terae (HKM-1), 120 g / L glucose as a carbon source, 5 g / L corn steep liquor powder, 0.9 g / L phosphoric acid This is a method for producing D-lactic acid by fed-batch fermentation with a sample (sugar) added with dipotassium hydrogen, 3.5 g / L ammonium citrate and an inoculum of 20%.
本実施例に使用した各培地の組成は、下記の通りである。
斜面培地と種培地は実施例１と同様である。
The composition of each medium used in this example is as follows.
The slope medium and seed medium are the same as in Example 1.
発酵培地1Ｌあたり、ブドウ糖120 g、コーンスティープリカーパウダー5 g、リン酸水素ニカリウム0.9 g、クエン酸アンモニウム3.5 gを含有し、残りは水である。前記発酵培地のpHが5.5〜6.5であり、115℃の条件下で15 min滅菌する。 1 L of fermentation medium contains 120 g of glucose, 5 g of corn steep liquor powder, 0.9 g of dipotassium hydrogen phosphate, 3.5 g of ammonium citrate, and the rest is water. The fermentation medium has a pH of 5.5 to 6.5 and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
当該発酵によるD-乳酸の製造方法は下記のステップを含む。
(1）斜面培養：実施例１と同様である。
The method for producing D-lactic acid by the fermentation includes the following steps.
(1) Slope culture: The same as in Example 1.
(2）種培養：種培地40mLを入れた40 mLの三角フラスコに、ステップ(1）で培養した菌株を、無菌条件下で接種用ループを使用して2回接種し、42℃で24ｈ静置培養して、種培養液１を得る。5mLの種培養液1を、無菌条件下で種培地100 mLを入れた500 mLの三角フラスコに移し、42℃で24ｈ静置培養して、種培養液2を得る。
(2) Seed culture: A 40 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of seed medium is inoculated with the strain cultured in step (1) twice using an inoculation loop under aseptic conditions, and statically incubated at 42 ° C for 24 hours. The
(3）発酵培養：ステップ(2）で得られた800 mLの種培養液2を、無菌条件下で3.2 Lの発酵培地を入れた発酵槽に移し、42℃の温度で、70 rpmで攪拌培養を行い、10ｈ毎にサンプリング抽出を1回行って、発酵液における残存糖の含有量を測定し、ブドウ糖の濃度が20〜30 g/Lに下げた時に、ブドウ糖を流加して、ブドウ糖の濃度が50〜70 g/Lになるように糖添加を合計2回行う。発酵過程において、ブドウ糖消費速度がゼロに近づいた時点で、発酵を終了させる。 (3) Fermentation culture: 800 mL of seed culture solution 2 obtained in step (2) is transferred to a fermentor containing 3.2 L of fermentation medium under aseptic conditions, and stirred at 70 rpm at a temperature of 42 ° C. Incubate and sample once every 10 h to measure the residual sugar content in the fermentation broth. When the glucose concentration is lowered to 20-30 g / L, add glucose and dextrose. The sugar is added twice in total so that the concentration of the solution becomes 50 to 70 g / L. In the fermentation process, the fermentation is terminated when the glucose consumption rate approaches zero.
発酵終了後、前記具体的な実施形態に記載の測定方法及び算出方法に基づき、発酵液におけるD-乳酸濃度を測定する。 After completion of fermentation, the D-lactic acid concentration in the fermentation broth is measured based on the measurement method and calculation method described in the specific embodiment.
当該発酵実験を3回繰り返すように設けられ、72ｈで発酵終了。D-乳酸生成量が152 ± 3 g/Lであり、生産速度が2.05 g/L/hで、糖から酸への変換率が0.79 g/gである。 It is provided to repeat the fermentation experiment three times, and the fermentation is completed in 72 hours. The production amount of D-lactic acid is 152 ± 3 g / L, the production rate is 2.05 g / L / h, and the conversion rate from sugar to acid is 0.79 g / g.
スポロラクトバチルス・テラエ(HKM-1)を用いた、5Ｌの全自動発酵槽において、初糖濃度が120 g/Lであるブドウ糖、ショ糖、キシロース、アラビノース、乳糖、及び麦芽糖を炭素源とし、20 g/Lのコーンスティープリカーパウダーを窒素源とし、10 mol/LのNaOH、250 g/Lの NH4OH、及び250 g/Lの炭酸カルシウムを中和剤とした、試料（糖）を添加して流加発酵によるD-乳酸の製造方法である。 Glucose, sucrose, xylose, arabinose, lactose, and maltose with an initial sugar concentration of 120 g / L are used as carbon sources in a 5 L fully automatic fermentor using Sporolactocillus terae (HKM-1). , Sample (sugar) using 20 g / L corn steep liquor powder as nitrogen source, 10 mol / L NaOH, 250 g / L NH 4 OH, and 250 g / L calcium carbonate as neutralizer Is a method for producing D-lactic acid by fed-batch fermentation.
本実施例に使用した各培地の組成は、下記の通りである。
斜面培地と種培地は実施例１と同様である。
The composition of each medium used in this example is as follows.
The slope medium and seed medium are the same as in Example 1.
発酵培地1Ｌあたり、ブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽糖120 g、コーンスティープリカーパウダー20 gを含有し、残りは水である。20 g/Lのコーンスティープリカーパウダーは窒素源であり、前記発酵培地のpHが5.0〜7.0であり、115℃の条件下で15 min滅菌する。 Each liter of fermentation medium contains glucose, sucrose, fructose, maltose 120 g, corn steep liquor powder 20 g, and the rest is water. 20 g / L corn steep liquor powder is a nitrogen source, the fermentation medium has a pH of 5.0 to 7.0, and is sterilized at 115 ° C. for 15 min.
当該発酵によるD-乳酸の製造方法は次のステップを含む。
(1）斜面培養：実施例1と同様である。
The method for producing D-lactic acid by the fermentation includes the following steps.
(1) Slope culture: The same as in Example 1.
(2）種培養：種培地40mLを入れた100 mLの三角フラスコに、ステップ(1）で培養した菌株を、無菌条件下で接種用ループを使用して2回接種し、42℃で24ｈ静置培養して、種培養液１を得る。40mLの種培養液1を無菌条件下で、種培地100 mLを入れた500 mLの三角フラスコに移し、42℃で24ｈ静置培養して、種培養液2を得る。引き続き同じ方法で拡大培養して、400 mLの種培養液3を得る。
(2) Seed culture: A 100 mL Erlenmeyer flask containing 40 mL of seed medium is inoculated with the strain cultured in step (1) twice using an inoculation loop under aseptic conditions, and statically incubated at 42 ° C for 24 hours. The
(3）発酵培養：ステップ(2）で得られた4 mLの種培養液3を、無菌条件下で3.6Lの発酵培地を入れた5Ｌの全自動発酵槽（上海百倫製）に移し、42℃の温度で、50〜100 rpmで攪拌培養を行う。10ｈ毎にサンプリング抽出を1回行って、発酵液における残存糖の含有量及びD-乳酸の濃度を測定し、炭素源の濃度が20〜30 g/Lに下げた時に、糖の濃度が50〜70 g/Lになるように流加式による糖の添加を行う。48ｈの時点で発酵を終了させ、D-乳酸濃度を測定する。 (3) Fermentation culture: Transfer 4 mL of seed culture solution 3 obtained in step (2) to a 5 L fully automatic fermenter (manufactured by Shanghai Bairin) containing 3.6 L of fermentation medium under aseptic conditions. Stir culture at a temperature of 42 ° C. and 50-100 rpm. Sampling is performed once every 10 h to measure the residual sugar content and D-lactic acid concentration in the fermentation broth. When the carbon source concentration is lowered to 20-30 g / L, the sugar concentration is 50 Add the sugar by the fed-batch method so that it is ~ 70 g / L. At 48 hours, the fermentation is terminated and the D-lactic acid concentration is measured.
発酵終了後、前記具体的な実施形態に記載の測定方法及び算出方法に基づき、発酵液におけるD-乳酸濃度を測定する。 After completion of fermentation, the D-lactic acid concentration in the fermentation broth is measured based on the measurement method and calculation method described in the specific embodiment.
当該発酵実験を3回繰り返すように設けられ、結果を表10に示す。 The fermentation experiment is provided to be repeated three times, and the results are shown in Table 10.
上記にて本発明のより好ましい具体的な実施例を詳細に述べている。当業者ならば、創造的な労力を費やすことなく、本発明の構想に基づき複数の改変や変型を生み出すことが可能であると解されるべきである。そのため、当業者が本発明の構想に基づいて従来技術をベースに論理的な分析、推理または限られた実験を通じて得られる技術方案については、すべて特許請求の範囲で定められた保護範囲内に含まれるもとのされなければならない。 The foregoing describes in more detail specific preferred embodiments of the invention. It should be understood that those skilled in the art can create multiple modifications and variations based on the concepts of the present invention without spending creative effort. For this reason, all technical methods obtained by a person skilled in the art based on the concept of the present invention through logical analysis, reasoning, or limited experiments based on the prior art are included in the protection scope defined by the claims. Must be the original.
Claims (10)
１）斜面培養
スポロラクトバチルス・テラエ（ＨＫＭ−１）の菌種を２０ｇ／Ｌの寒天培地を含有する固体斜面培地に接種し、４０〜４５℃の条件下で２４〜４８ｈ培養する。
２）種培養
斜面培養をしたスポロラクトバチルスを無菌条件下で種培地に接種し、３５〜４５℃の条件下で２４〜３６ｈ静置培養後、中和剤を投入して発酵液のｐＨを制御し、種培養液を調製する。
３）発酵培養
接種量を５〜２０％の体積比で発酵培地に移し、３５℃〜４５℃の環境下で４８〜７２ｈ培養する。 A method for producing D-lactic acid, which comprises the following steps.
1) Slope culture Inoculate a strain of Sporalactobacillus terae (HKM-1) on a solid slope medium containing 20 g / L of agar medium, and culture it at 40 to 45 ° C for 24 to 48 hours.
2) Seed culture Slope Lactobacillus cultured on a slope is inoculated into a seed medium under aseptic conditions, left to stand for 24 to 36 hours under conditions of 35 to 45 ° C, and then a neutralizer is added to adjust the pH of the fermentation broth. To prepare a seed culture solution.
3) Fermentation culture The inoculum is transferred to the fermentation medium at a volume ratio of 5 to 20% and cultured for 48 to 72 hours in an environment of 35 ° C to 45 ° C.
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