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JP2016517441A - 抗ＣＲＴｈ２抗体及び使用方法 - Google Patents

抗ＣＲＴｈ２抗体及び使用方法 Download PDF

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JP2016517441A JP2016503102A JP2016503102A JP2016517441A JP 2016517441 A JP2016517441 A JP 2016517441A JP 2016503102 A JP2016503102 A JP 2016503102A JP 2016503102 A JP2016503102 A JP 2016503102A JP 2016517441 A JP2016517441 A JP 2016517441A
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Abstract

本発明は、抗ＣＲＴｈ２抗体及びその使用方法を提供する。【選択図】図１８Ａ

Description

関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、その全内容が本明細書に参照により援用される、２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７８６３７０号の優先権の利益を主張する。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全内容が本明細書に参照により援用される：配列表のコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：１４６３９２０１７３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１４年３月６日、サイズ：１１５ＫＢ）。
本発明は、抗ＣＲＴｈ２抗体及びその使用方法に関する。
Ｔヘルパー２細胞（ＣＲＴｈ２）上で発現される化学誘引物質受容体相同分子は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーの一員である。ＣＲＴｈ２は、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）に応答して、好酸球、好塩基球及びＴヘルパー２型（Ｔｈ２）細胞の化学遊走を媒介する。これらの細胞型、特にＴｈ２細胞は、喘息のようなアレルギー性疾患の病態形成に寄与すると考えられている。ＣＲＴｈ２阻害が動物モデルにおける気道反応亢進及び炎症の減弱を導くことが示されている。Ｌｕｋａｃｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｌ７６７−７７９、２００８。例えば、２重トロンボキサンＡ２受容体及びＣＲＴｈ２受容体アンタゴニストであるラマトロバンは、好酸球化学遊走をインビトロ及びインビボで抑制し、日本においてアレルギー性鼻炎の治療のために承認されている。Ｂｏｓｎｊａｋ，Ｂら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：１１４、２０１１。４−アミノテトラヒロチノリン（ａｍｉｎｏｔｅｔｒａｈｙｒｏｃｈｉｎｏｌｉｎｅ）誘導体又はインドール酢酸誘導体のような多数の他のＣＲＴｈ２アンタゴニストは、現在、開発中である。Ｐｅｔｔｉｐｈｅｒ；Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５３（Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ１９１−１９９、２００８；Ｒｏｙｅｒら；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３８：６６３−６７１、２００８；Ｓｔｅｂｂｉｎｓら；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３８：１４２−１４９、２０１０。
本発明は、抗ＣＲＴｈ２抗体及びその使用方法を提供する。
一態様では、ヒトＣＲＴｈ２に結合し、治療有効量がヒト対象に投与された場合に、ＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる単離抗体が本明細書で提供される。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、操作された抗体である。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、組換え法によって（例えば、抗体をコードする１つ又は複数の核酸でインビトロで（例えば細胞培養物において）トランスフェクトされた、又は形質転換された宿主細胞によって）産生される。幾つかの実施態様では、宿主細胞は、原核生物細胞（例えば細菌細胞）又は真核生物細胞（例えばＣＨＯ細胞、リンパ系細胞）である。
幾つかの実施態様では、抗体は、１つ又は複数の以下の型のＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる：Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球又は自然２型（innate type 2、ＩＴ２）細胞。幾つかの実施態様では、抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善するように操作されている。幾つかの実施態様では、抗体は、ＡＤＣＣ活性を改善する、及び／又はＣＤＣ活性を低減するように操作されている。幾つかの実施態様では、抗体は、脱フコシル化されている。幾つかの実施態様では、抗体は、アルファ１，６−フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株で産生される。幾つかの実施態様では、抗体は、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株で産生される。幾つかの実施態様では、細胞株は、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をさらに過剰発現する。幾つかの実施態様では、抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善する少なくとも１つのアミノ酸置換をＦｃ領域に含む。幾つかの実施態様では、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａである。
幾つかの実施態様では、抗体は、裸抗体である。幾つかの実施態様では、抗体は、キメラである。幾つかの実施態様では、抗体は、ヒト化されている。幾つかの実施態様では、抗体は、ヒトである。幾つかの実施態様では、抗体は、二重特異性抗体である。幾つかの実施態様では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。
幾つかの実施態様では、抗体は、非ヒト霊長類のＣＲＴｈ２に結合する。幾つかの実施態様では、抗体は、アカゲザル及び／又はカニクイザルのＣＲＴｈ２に結合する。
幾つかの実施態様では、抗体は、ヒトＣＲＴｈ２への以下の抗体のうちの少なくとも１つの結合を競合的に阻害する：１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５、３Ｃ１２、及び本明細書に記載の何れかのヒト化抗体。幾つかの実施態様では、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、競合的結合を決定する。幾つかの実施態様では、抗体は、少なくとも１つの以下の抗ＣＲＴｈ２抗体が結合するＣＲＴｈ２エピトープと同じ又はオーバーラップするヒトＣＲＴｈ２のエピトープに結合する：１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５、３Ｃ１２、及び本明細書に記載の何れかのヒト化抗体。幾つかの実施態様では、抗体は、以下の抗ＣＲＴｈ２抗体：１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５、３Ｃ１２、及び本明細書に記載の何れかのヒト化抗体のうちの１つからの６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は、ＣＲＴｈ２シグナル伝達をさらにブロックする。幾つかの実施態様では、抗体は、プロスタグランジンＤ２に応答したＣＲＴｈ２発現細胞の動員を妨げる。幾つかの実施態様では、抗体は、ＣＲＴｈ２発現細胞におけるＣａ２＋フラックスを阻害する。幾つかの実施態様では、抗体は、約１００ｎＭ以下のＫｄでヒトＣＲＴｈ２に結合する。
幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及びＸ１ＩＳＮＧＧＳＴＴＸ２ＹＰＧＴＶＥＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ１はＹ又はＲであり、Ｘ２はＹ又はＤである）を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。
別の態様では、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体であって、軽鎖及び重鎖可変領域が、６つの超可変領域（ＨＶＲ）配列：（ｉ）ＲＡＳＥＮＩＹＸＮＬＡ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、ＸはＳ、Ｗ又はＹである）、（ｉｉ）ＡＡＴＱＬＡＸ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、ＸはＤ、Ｅ又はＳである）、（ｉｉｉ）ＱＨＦＷＩＴＰＷＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３、（ｉｖ）Ｘ１ＹＸ２ＭＳ（配列番号４）を含むＨＶＲ−Ｈ１（式中、Ｘ１はＳ又はＦであり、Ｘ２はＳ、Ｌ又はＫである）、（ｖ）Ｘ１ＩＳＮＧＧＳＴＴＸ２ＹＰＧＴＶＥＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ１はＹ又はＲであり、Ｘ２はＹ又はＤである）、（ｖｉ）ＨＲＴＮＷＤＦＤＹ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体が本明細書で提供される。
別の態様では、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体であって、軽鎖可変領域が、配列番号７、８又は９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０、１１又は１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体が本明細書で提供される。幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号１３、１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域をさらに含む。
別の態様では、配列番号１３、１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体が本明細書で提供される。
幾つかの実施態様では、抗体は、（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、（ｉｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｖ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様では、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体であって、軽鎖可変領域が、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体が本明細書で提供される。別の態様では、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体が本明細書で提供される。幾つかの実施態様では、抗体は、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｖ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様では、配列番号３８−５３からなる群から選択されるＶＬ配列を含む、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体が本明細書で提供される。幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号５４−６５からなる群から選択されるＶＨ配列をさらに含む。別の態様では、配列番号５４−６５からなる群から選択されるＶＨ配列を含む、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、配列番号３８−４８からなる群から選択されるＶＬ配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号５４−６０からなる群から選択されるＶＨ配列を含む重鎖可変領域を含む、単離抗ＣＲＴｈ２抗体が本明細書で提供される。
幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号４０のＶＬ配列及び配列番号５７のＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号３９のＶＬ配列及び配列番号５５のＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号４１のＶＬ配列及び配列番号５７のＶＨ配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。幾つかの実施態様では、抗体は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。幾つかの実施態様では、抗体のフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である。幾つかの実施態様では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｃ又は（Ｆａｂ’）２断片から選択される抗体断片である。
別の態様では、本明細書に記載の何れかの抗体をコードする単離核酸が本明細書で提供される。別の態様では、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞が本明細書で提供される。別の態様では、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法が本明細書で提供される。幾つかの実施態様では、方法は、宿主細胞によって産生された抗体を回収することをさらに含む。
別の態様では、本明細書に記載の何れかの抗体及び細胞傷害剤を含むイムノコンジュゲートが本明細書で提供される。幾つかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、薬学的組成物にある。イムノコンジュゲートは、本明細書に記載の何れかの方法で用いてよい。
別の態様では、本明細書に記載の何れかの抗ＣＲＴｈ２抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、喘息を治療するための方法であって、有効量の抗ＣＲＴｈ２抗体を対象に投与することを含み、抗体が、対象におけるＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる方法が本明細書で提供される。
幾つかの実施態様では、抗体は、１つ又は複数の以下の型のＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる：Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球又は自然２型（ＩＴ２）細胞。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、ＣＲＴｈ２発現細胞を肺組織から枯渇させる。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、ＣＲＴｈ２発現細胞を気管支肺胞洗浄液から枯渇させる。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、抗体の投与前のベースラインと比較して、少なくとも５０％の少なくとも１つの型のＣＲＴｈ２発現細胞を肺から枯渇させる。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、抗体の投与前のベースラインと比較して、少なくとも８０％の少なくとも１つの型のＣＲＴｈ２発現細胞を肺から枯渇させる。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、抗体の投与前のベースラインと比較して、少なくとも９０％の少なくとも１つの型のＣＲＴｈ２発現細胞を肺から枯渇させる。幾つかの実施態様では、対象は、微量顆粒球性喘息（Pauci granulocytic asthma）に罹患している。幾つかの実施態様では、１種又は複数のサイトカインのレベルは、抗ＣＲＴｈ２抗体の投与後に対象において低下する。幾つかの実施態様では、少なくとも１つの以下の細胞型により産生される１種又は複数のサイトカインのレベルは低下する：Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球又は自然２型（ＩＴ２）細胞。幾つかの実施態様では、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン又はロイコトリエンの１種又は複数のレベルは、対象において低下する。幾つかの実施態様では、対象は、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト又はそれらの組み合わせにより適切に制御されない喘息に罹患している。幾つかの実施態様では、対象は、ヒトである。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、本明細書に記載の抗体である。
別の態様では、ＣＲＴｈ２発現細胞により媒介される障害を治療するための方法であって、有効量の抗ＣＲＴｈ２抗体を対象に投与することを含み、抗体が、対象におけるＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる方法が本明細書で提供される。
幾つかの実施態様では、障害は、喘息、微量顆粒球性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、急性又は慢性気道過敏症、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−ストラウス症候群、特発性肺線維症、サイトカインに関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する悪性腫瘍、慢性特発性じん麻疹、慢性自発性じん麻疹、物理的じん麻疹、寒冷じん麻疹、圧迫じん麻疹、水疱性類天疱瘡、鼻腔ポリポーシス、食物アレルギー及びアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、本明細書に記載の抗体である。
別の態様では、対象におけるサイトカインのレベルを低減するための方法であって、有効量の抗ＣＲＴｈ２抗体を対象に投与することを含み、抗体が、対象におけるＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる方法が本明細書で提供される。幾つかの実施態様では、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン、及びロイコトリエンの１種又は複数が、対象において低減する。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、本明細書に記載の抗体である。
本明細書に記載の様々な実施態様の特性の１つ、いくつか又はすべてを組み合わせて、本発明の他の実施態様を形成してよいことが理解されよう。本発明のこれら及び他の態様は、当業者に明らかになる。本発明のこれら及び他の実施態様は、以下の詳細な説明によりさらに説明される。
ＣＲＴｈ２がヒト「Ｔｈ２」生物細胞で発現されることを示す図である。ＣＲＴｈ２発現は、示すように、ヒトＰＢＭＣ集団又は培養ヒト細胞上で抗ヒトＣＲＴｈ２ Ａｂ（ＢＭ１６）を使用してフローサイトメトリーにより評価した。 ＣＲＴｈ２＋メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＲＴｈ２−メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞と比較した場合に、９５％を超えるメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞Ｔｈ２サイトカイン（Ｉｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ１３及びＩＬ−９）を産生することを示す図である。ＣＲＴｈ２＋ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＲＴｈ２−ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を、ヒトＰＢＭＣからフローサイトメトリーにより単離し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で４８時間３７℃で刺激した。上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘにより示されるサイトカイン定量に供した。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２又は初代好塩基球及び好酸球とのマウス又はヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図３Ａは、コントロールＡｂ（２０ｕｇ／ｍｌにて、着色したヒストグラム）と比較した、２９３細胞で発現されたヒト、アカゲザル又はカニクイザルのＣＲＴｈ２、及びＣＲＴｈ２を発現しない野生型２９３細胞とのマウス抗ＣＲＴｈ２ハイブリドーマ抗体（クローン１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５及び３Ｃ１２）のフローサイトメトリーによる反応性を示す。使用した１次抗体濃度は、２０ｕｇ／ｍｌ（黒色の線）、２ｕｇ／ｍｌ（灰色の線）及び０．２ｕｇ／ｍｌ（薄い灰色の線）であった。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２又は初代好塩基球及び好酸球とのマウス又はヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図３Ｂは、アイソタイプコントロールＡｂ（着色したヒストグラム）と比較した、３００．１９細胞で発現されたヒト、アカゲザル又はカニクイザルのアミノ末端フラグタグ化ＣＲＴｈ２、及びＣＲＴｈ２を発現しない野生型３００．１９細胞とのマウス抗ＣＲＴｈ２抗体（ｍＩｇＧ２ａでクローニングした１９Ａ２及び８Ｂ１）のフローサイトメトリーによる反応性を示す。使用した１次抗体濃度は、１ｕｇ／ｍｌ（ヒト、カニクイザル；黒色の線）又は５ｕｇ／ｍｌ（アカゲザル、野生型；黒色の線）及び０．５ｕｇ／ｍｌ（アカゲザル、野生型；灰色の線）であった。抗フラグＡｂは、０．７ｕｇ／ｍｌで使用した。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２又は初代好塩基球及び好酸球とのマウス又はヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図３Ｃは、ヒトＰＢＭＣ上の好塩基球及び好酸球に対するマウス抗ヒトＣＲＴｈ２抗体（１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５、３Ｃ１２）のフローサイトメトリーによる反応性を示す。ＰＢＭＣは、５ｕｇ／ｍｌ（黒色の線）、０．５ｕｇ／ｍｌ（灰色の線）で抗ＣＲＴｈ２抗体と、又は５ｕｇ／ｍｌ（薄い灰色の線）、０．５ｕｇ／ｍｌ（着色したヒストグラム）でアイソタイプコントロールＡｂとインキュベートした後に、蛍光性標識された２次抗マウスＩｇＧ、抗ＣＤ１６、抗ＨＬＡＤＲ及び抗ＣＤ１２３とインキュベートした。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２又は初代好塩基球及び好酸球とのマウス又はヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図３Ｄは、ＣＲＴｈ２を発現しない野生型２９３細胞と比較した、２９３細胞で発現されたアミノ末端ｇＤ−タグ化又はフラグタグ化ヒト、アカゲザル又はカニクイザルＣＲＴｈ２とのヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ１及び操作したヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ１２抗ＣＲＴｈ２抗体の反応性を示す。使用した１次抗ＣＲＴｈ２ Ａｂ濃度は、１０ｕｇ／ｍｌ（黒色の線）、１ｕｇ／ｍｌ（灰色の線）及び０．１ｕｇ／ｍｌ（薄い灰色の線）であった。アイソタイプコントロールＡｂ（２Ｈ７、着色したヒストグラム）は、１０ｕｇ／ｍｌで使用し、抗ｇＤ抗体は、２ｕｇ／ｍｌで使用し、抗フラグＡｂは、０．７ｕｇ／ｍｌで使用した。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２又は初代好塩基球及び好酸球とのマウス又はヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図３Ｅは、ＣＲＴｈ２を発現しない野生型３００．１９細胞と比較した、３００．１９細胞で発現されたアミノ末端ｇＤ−タグ化又はフラグタグ化ヒト、アカゲザル又はカニクイザルＣＲＴｈ２とのヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ１及び操作したヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ１２抗ＣＲＴｈ２抗体の反応性を示す。使用した１次抗ＣＲＴｈ２ Ａｂ濃度は、１０ｕｇ／ｍｌ（黒色の線）、１ｕｇ／ｍｌ（灰色の線）及び０．１ｕｇ／ｍｌ（薄い灰色の線）であった。アイソタイプコントロールＡｂ（２Ｈ７、着色したヒストグラム）は、１０ｕｇ／ｍｌで使用し、抗ｇＤ抗体は、２ｕｇ／ｍｌで使用し、抗フラグＡｂは、０．７ｕｇ／ｍｌで使用した。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２又は初代好塩基球及び好酸球とのマウス又はヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図３Ｆは、アイソタイプコントロールＡｂ（着色したヒストグラム）と比較した、初代ヒト、カニクイザル及びアカゲザル好塩基球、並びに末梢血からの初代ヒト好酸球に対する１０ｕｇ／ｍｌ（黒色の線）の抗ＣＲＴｈ２抗体ｈ１９Ａ２．ｖ１及びｈ１９Ａ２．ｖ１２のＦＡＣＳ結合を示す。 ２９３細胞又は３００．１９細胞の表面で発現されたＣＲＴｈ２に対する抗ＣＲＴｈ２抗体（ｍＩｇＧ又はｈＦａｂ）の結合親和性のスキャッチャード解析を示す図である。図４Ａは、示すように、２９３細胞又は３００．１９細胞上で発現されたヒトＣＲＴｈ２に対するマウス抗ＣＲＴｈ２全抗体１９Ａ２及び８Ｂ１の放射性リガンド細胞結合アッセイを示す。抗ＣＲＴｈ２ Ａｂについての解離定数（Ｋｄ）をグラフ中に示す。結合／合計は、結合した１２５Ｉ−標識された抗体及び抗体の合計の濃度の比を示し、合計は、１２５Ｉ−標識された抗体及び標識されていない抗体の濃度を示す。 ２９３細胞又は３００．１９細胞の表面で発現されたＣＲＴｈ２に対する抗ＣＲＴｈ２抗体（ｍＩｇＧ又はｈＦａｂ）の結合親和性のスキャッチャード解析を示す図である。図４Ｂは、２９３細胞上で発現されたヒト又はカニクイザルＣＲＴｈ２に対するヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ１２又はｈ１９Ａ２．ｖ６０ Ｆａｂ断片の放射性リガンド細胞結合アッセイを示す。抗ＣＲＴｈ２ Ａｂについての解離定数（Ｋｄ）をグラフ中に示す。結合／合計は、結合した１２５Ｉ−標識された抗体及び抗体の合計の濃度の比を示し、合計は、１２５Ｉ−標識された抗体及び標識されていない抗体の濃度を示す。 抗ＣＲＴｈ２抗体８Ｂ１及び３Ｃ１２がＰＧＤ２誘導カルシウム動員を妨げることを示す図である。ＰＧＤ２刺激に応答したインビトロ極性化Ｔｈ２細胞からのＴｈ２細胞部分集合（ＣＤ４＋ＣＣＲ４＋ＣＣＲ６−ＣＸＣＲ３−）のカルシウムフラックスを、抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体の存在下でフローサイトメトリーによりモニタリングした。ＣＲＴｈ２受容体アンタゴニストＣＡＹ１０４７１は、ポジティブコントロールとして含める。 ヒトＣＲＴｈ２ ＢＡＣトランスジェニックマウスの設計及び特徴づけを示す図である。図６Ａは、第１１染色体上にヒトＣＲＴｈ２遺伝子を含有する１７１ｋｂゲノム領域を示し、これをＣ５７ＢＬ／６マウスに導入して、ｈＣＲＴｈ２ ＢＡＣトランスジェニックマウスを作製した。 ヒトＣＲＴｈ２ ＢＡＣトランスジェニックマウスの設計及び特徴づけを示す図である。図６Ｂは、ｈＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇ系統８５における血液好塩基球（ＣＤ１２３＋ＦｃｅＲＩ＋）、血液好酸球（ＣＣＲ３＋）、腹腔肥満細胞（ＦｃｅＲＩ＋ＣＤ１１７＋）、膝窩リンパ節ＣＤ４＋ＣＤ４４ｈｉ Ｔ細胞（Ｔｈ２極性化剤であるパパインにより誘導）、及び腸間膜リンパ節自然Ｔヘルパー２型細胞（マウスＩＬ−１７Ｅプラスミドのハイドロダイナミクス尾静脈注射によりＬｉｎ−ＣＤ１１７＋追加免疫）での、フローサイトメトリーによるヒトＣＲＴｈ２発現（抗体ＢＭ１６）を示す。比較のために、ヒト細胞でのヒトＣＲＴｈ２発現のフローサイトメトリー解析を示す。好塩基球、好酸球及びＩＴ２細胞は、ＰＢＭＣから染色し、肥満細胞は、ヒト骨髄由来肥満細胞から染色し、Ｔｈ２細胞（ＣＣＲ４＋ＣＸＣＲ３−）は、ヒトＰＢＭＣから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２極性化条件下で区別した。 抗ＣＲＴｈ２抗体が血液好塩基球及び好酸球をインビボでヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて枯渇させることを示す図である。ＣＲＴｈ２＋好塩基球（ＣＤ１２３＋ＦｃｅＲＩ＋）及び好酸球（ＣＣＲ３＋）のベースライン数は、抗ＣＲＴｈ２ Ａｂ（示すように、１９Ａ２、３Ｃ１２又は８Ｂ１）での処置前の−４日目（図７Ａ）に血液からフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスは、２００ｕｇ／マウスｉ．ｖ．（図７Ａ）で抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体で処置した。血液好塩基球及び好酸球枯渇は、示すように、３日目、６日目又は７日目に評価した。 抗ＣＲＴｈ２抗体が血液好塩基球及び好酸球をインビボでヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて枯渇させることを示す図である。ＣＲＴｈ２＋好塩基球（ＣＤ１２３＋ＦｃｅＲＩ＋）及び好酸球（ＣＣＲ３＋）のベースライン数は、抗ＣＲＴｈ２ Ａｂ（示すように、１９Ａ２、３Ｃ１２又は８Ｂ１）での処置の４時間前（図７Ｂ）に血液からフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスは、１５０ｕｇ／マウスｉ．ｖ．（図７Ｂ）で抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体を使用して処置した。血液好塩基球及び好酸球枯渇は、示すように、３日目、６日目又は７日目に評価した。抗ブタクサアイソタイプコントロール抗体と比較した抗ＣＲＴｈ２によるパーセント枯渇を、図７Ｂに示す。 抗ＣＲＴｈ２抗体１９Ａ２処置が自然免疫細胞を枯渇させ、ｈＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．ＴｇマウスにおけるＴＮＰ−ＯＶＡ誘導慢性喘息モデルにおいてＴｈ２気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）サイトカイン産生を低減させたことを示す図である。図８Ａは、フローサイトメトリーにより評価した肺組織中、及びフローサイトメトリーと組み合わせた示差細胞カウントにより評価したＢＡＬ中の好塩基球、好酸球及び肥満細胞の数を示す（図８Ａ）。抗ブタクサアイソタイプコントロール抗体と比較した抗ＣＲＴｈ２によるパーセント枯渇を、グラフに示す。図８Ｂは、ＢＡＬ中のＥＬＩＳＡにより決定したＩＬ−４及びＩＬ−１３の濃度を示す。アイソタイプコントロール抗体と比較した抗ＣＲＴｈ２処置によるパーセント低減を、グラフに示す。 抗ＣＲＴｈ２抗体１９Ａ２が、ＳＣＩＤマウスにおいてヒトＩＬ−４産生Ｔｈ２細胞を、又はヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて自然ヘルパー２型（ＩＴ２）細胞を枯渇させることを示す図である。図９Ａ：ＰＢＭＣからのインビトロ極性化ヒトＴｈ２細胞を、ＳＣＩＤマウスに移行し、脱フコシル化抗ＣＲＴｈ２ １９Ａ２抗体又はアイソタイプコントロール抗体の存在下でｒｈＩＬ−４と抗ＩＦＮ−ｇ及び抗ＩＬ−１２ ｍＡｂを注射することにより、インビボで７日間さらに極性化させた。７日後に、ＩＬ−４又はＩＦＮ−ｇ産生ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージを決定した。この目的のために、脾細胞を収集し、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を刺激の最後の３時間の間に加えながらＰｄＢｕ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）で４．５時間エクスビボで刺激した。細胞を、抗ｈＣＤ４で表面染色し、系列細胞を、抗ｍＣＤ４５、抗ｍＴｅｒ１１９及び抗ｈＣＤ１９で染色した。細胞を固定し、抗ｈＩＦＮｇ及び抗ｈＩＬ−４で染色して、サイトカイン陽性細胞を検出した。 抗ＣＲＴｈ２抗体１９Ａ２が、ＳＣＩＤマウスにおいてヒトＩＬ−４産生Ｔｈ２細胞を、又はヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて自然ヘルパー２型（ＩＴ２）細胞を枯渇させることを示す図である。図９Ｂ：ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスに、５０ｕｇマウスＩＬ−１７Ｅをコードするプラスミドを注射した後に、抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロールＡｂを注射した。処置後３日目に、腸間膜リンパ節におけるＩＴ２細胞のパーセンテージ及び総数をフローサイトメトリーにより決定した。抗ブタクサアイソタイプコントロール抗体と比較した抗ＣＲＴｈ２によるパーセント枯渇を、グラフに示す。 マウスの抗ＣＲＴｈ２抗体１９Ａ２の軽鎖（配列番号４９）及び重鎖（配列番号６１）可変領域のアミノ酸配列を示す図である。重鎖及び軽鎖のＫａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ及びＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を示す。 抗体１９Ａ２に由来するヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列アライメントを示す図である。図１１Ａは、軽鎖可変領域配列アライメントを示す。各抗体の軽鎖Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ及びＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を示す（ｈｕ１９Ａ２．ｖ１（配列番号３８）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ１２（配列番号３９）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ４６（配列番号３９）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ５２（配列番号４０）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ５８（配列番号４２）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６０（配列番号４１）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６１（配列番号４２）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６２（配列番号４１）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６３（配列番号４３）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６４（配列番号４２）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６５（配列番号４３）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６６（配列番号４４）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６７（配列番号４５）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６８（配列番号４４）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６９（配列番号４５）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ７０（配列番号４６）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ７１（配列番号４７）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ７２（配列番号４８））。 抗体１９Ａ２に由来するヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列アライメントを示す図である。図１１Ｂは、重鎖可変領域配列アライメントを示す。各抗体の重鎖Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ及びＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を示す（ｈｕ１９Ａ２．ｖ１（配列番号５４）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ１２（配列番号５５）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ４６（配列番号５７）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ５２（配列番号５７）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ５８（配列番号５７）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６０（配列番号５７）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６１（配列番号５５）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６２（配列番号５５）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６３（配列番号５５）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６４（配列番号６０）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６５（配列番号６０）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６６（配列番号５５）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６７（配列番号５５）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６８（配列番号６０）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ６９（配列番号６０）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ７０（配列番号５４）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ７１（配列番号５４）、ｈｕ１９Ａ２．ｖ７２（配列番号５４））。 マウスの抗ＣＲＴｈ２抗体８Ｂ１及び３Ｃ１２、並びにヒト化抗ＣＲＴｈ２ ｈｕ８Ｂ１．ｖ１（ｍｕ８Ｂ１−軽鎖可変領域（配列番号５０）、ｍｕ８Ｂ１−重鎖可変領域（配列番号６２）；ｍｕ３Ｃ１２−軽鎖可変領域（配列番号５１）、ｍｕ３Ｃ１２−重鎖可変領域（配列番号６３）；ｈｕ８Ｂ１．ｖ１−軽鎖可変領域（配列番号５２）、ｈｕ８Ｂ１．ｖ１−重鎖可変領域（配列番号６４））の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列アライメントを示す図である。各抗体の軽鎖及び重鎖のＫａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ及びＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を示す。 マウスの抗ＣＲＴｈ２抗体３１Ａ５のアミノ酸配列を示す図である。抗体３１Ａ５の軽鎖及び重鎖のＫａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ及びＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を示す（ｍｕ３１Ａ５−軽鎖可変配列（配列番号５３）、ｍｕ３１Ａ５−重鎖可変配列（配列番号６５））。 ヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体ｈｕ１９Ａ２．ｖ１及びｈｕ１９Ａ２．ｖ５２の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列アライメントを示す図である。図１４Ａは、軽鎖可変領域配列アライメントを示す（ｈｕ１９Ａ２．ｖ１−軽鎖可変領域（配列番号３８）；ｈｕ１９Ａ２．ｖ５２−軽鎖可変領域（配列番号４０））。各抗体の軽鎖Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ及びＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を示す。図１４Ｂは、重鎖可変領域配列アライメントを示す（ｈｕ１９Ａ２．ｖ１−重鎖可変領域（配列番号５４）；ｈｕ１９Ａ２．ｖ５２−重鎖可変領域（配列番号５７））。各抗体の重鎖Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ及びＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を示す。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２、又は初代好塩基球及び好酸球とのヒト化及びヒト化親和性成熟抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図１５Ａは、コントロールＡｂ（１ｕｇ／ｍｌ、着色したヒストグラム）と比較した、２９３細胞で発現されたヒトＣＲＴｈ２及びＣＲＴｈ２を発現しない野生型２９３細胞との１ｕｇ／ｍｌ（黒色の線）及び０．１ｕｇ／ｍｌ（灰色の線）の１９Ａ２ヒト化（ｈ１９Ａ２．ｖ１）及びヒト化親和性成熟（ｈ１９Ａ２．ｖ４６、ｈ１９Ａ２．ｖ５２）抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２、又は初代好塩基球及び好酸球とのヒト化及びヒト化親和性成熟抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図１５Ｂは、コントロールＡｂ（０．５５ｕｇ／ｍｌ、着色したヒストグラム）と比較した、２９３細胞で発現されたヒト、カニクイザル又はアカゲザルＣＲＴｈ２及びＣＲＴｈ２を発現しない野生型２９３細胞とのヒト化及びヒト化親和性成熟１９Ａ２抗ＣＲＴｈ２抗体（ｈ１９Ａ２．ｖ１、ｈ１９Ａ２．ｖ１２、ｈ１９Ａ２．ｖ４６、ｈ１９Ａ２．ｖ５２）のフローサイトメトリーによる反応性を示す。使用した１次抗体濃度は、０．５５ｕｇ／ｍｌ（黒色の線）、０．１８ｕｇ／ｍｌ（非常に濃い灰色の線）、０．０６ｕｇ／ｍｌ（濃い灰色の線）、０．０２ｕｇ／ｍｌ（灰色の線）及び０．００６ｕｇ／ｍｌ（薄い灰色の線）であった。 細胞株で発現されたＣＲＴｈ２、又は初代好塩基球及び好酸球とのヒト化及びヒト化親和性成熟抗ＣＲＴｈ２抗体のフローサイトメトリーによる反応性を示す図である。図１５Ｃは、ヒト、カニクイザル又はアカゲザルＰＢＭＣ上の好塩基球及び好酸球に対するヒト化親和性成熟抗ヒトＣＲＴｈ２抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２のフローサイトメトリーによる反応性を示す。１５ｕｇ／ｍｌ（黒色の線）、５ｕｇ／ｍｌ（非常に濃い灰色の線）、１．７ｕｇ／ｍｌ（濃い灰色の線）、０．６ｕｇ／ｍｌ（灰色の線）若しくは０．２ｕｇ／ｍｌ（薄い灰色の線）の蛍光性標識された抗ＣＲＴｈ２抗体、又は１５ｕｇ／ｍｌのアイソタイプコントロールＡｂ（着色したヒストグラム）と、系列特異的抗体との組み合わせでＰＢＭＣをインキュベートして、材料及び方法に記載するようにして好塩基球及び好酸球を検出した。 ２９３細胞の表面で発現されたＣＲＴｈ２に対する抗ＣＲＴｈ２抗体（Ｆａｂ断片）の結合親和性のスキャッチャード解析を示す図である。図１６Ａ−Ｂは、２９３細胞上で発現されたヒト又はカニクイザルＣＲＴｈ２に対するヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ５２ Ｆａｂ断片の相同競合放射性リガンド細胞結合アッセイを示す。図１６Ｃ−Ｄは、２９３細胞で発現されたヒト又はカニクイザルＣＲＴｈ２に対するヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ４６ Ｆａｂ断片の相同競合放射性リガンド細胞結合アッセイを示す。抗ＣＲＴｈ２ Ａｂについての解離定数（ＫＤ）を、グラフに示す。結合／合計は、各アッセイで使用した、結合した１２５Ｉ−標識された抗体及び１２５Ｉ−標識された抗体の合計の比を示す。 ヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞における、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルのＰＧＤ２媒介性阻害に対する又はフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルに対する抗ＣＲＴｈ２抗体の作用を示す図である。図１７Ａは、抗ＣＲＴｈ２抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２がヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞におけるフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルのＰＧＤ２媒介性阻害に影響しないことを示す。これに対して、ヒト化ｈ８Ｂ１抗体は、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルのＰＧＤ２媒介性阻害を、用量依存的様式で阻害した。図１７Ｂは、抗ＣＲＴｈ２抗体ｈ８Ｂ１及びｈ１９Ａ２．ｖ５２がヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞においてＰＧＤ２の非存在下でフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルに影響しないことを示す。これに対して、リガンドＰＧＤ２は、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルを、用量依存的様式で低減した。 マウスの抗ＣＲＴｈ２抗体１９Ａ２（ｍＩｇＧ２ａ）が、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて、血液、脾臓及び骨髄においてインビボで好塩基球及び好酸球を枯渇させることを示す図である。ＣＲＴｈ２＋好塩基球（ＣＤ１２３＋ＦｃｅＲＩ＋）及び好酸球（ＣＣＲ３＋）のベースライン数は、示すように、抗ＣＲＴｈ２ Ａｂ １９Ａ２での処置前の−７日目（図１８Ａ及び図１８Ｂ）に血液からフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスは、２０ｕｇ／マウス又は１００ｕｇ／マウスｉ．ｖ．で抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体で処置した。好塩基球及び好酸球枯渇は、示すように、３日目及び７日目に血液において（図１８Ａ及び図１８Ｂ）フローサイトメトリーにより評価した。記号は、個体マウスからのデータを表す。 マウスの抗ＣＲＴｈ２抗体１９Ａ２（ｍＩｇＧ２ａ）が、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて、血液、脾臓及び骨髄においてインビボで好塩基球及び好酸球を枯渇させることを示す図である。ＣＲＴｈ２＋好塩基球（ＣＤ１２３＋ＦｃｅＲＩ＋）及び好酸球（ＣＣＲ３＋）のベースライン数は、示すように、抗ＣＲＴｈ２ Ａｂ １９Ａ２での処置前の−７日目（図１８Ａ及び図１８Ｂ）に血液からフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスは、２０ｕｇ／マウス又は１００ｕｇ／マウスｉ．ｖ．で抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体で処置した。好塩基球及び好酸球枯渇は、示すように、３日目及び７日目に血液において（図１８Ａ及び図１８Ｂ）フローサイトメトリーにより評価した。記号は、個体マウスからのデータを表す。 マウスの抗ＣＲＴｈ２抗体１９Ａ２（ｍＩｇＧ２ａ）が、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて、血液、脾臓及び骨髄においてインビボで好塩基球及び好酸球を枯渇させることを示す図である。ＣＲＴｈ２＋好塩基球（ＣＤ１２３＋ＦｃｅＲＩ＋）及び好酸球（ＣＣＲ３＋）のベースライン数は、示すように、抗ＣＲＴｈ２ Ａｂ １９Ａ２での処置前の−７日目（図１８Ａ及び図１８Ｂ）に血液からフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスは、２０ｕｇ／マウス又は１００ｕｇ／マウスｉ．ｖ．で抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体で処置した。好塩基球及び好酸球枯渇は、示すように、７日目に脾臓及び骨髄（ＢＭ）において（図１８Ｃ）フローサイトメトリーにより評価した。記号は、個体マウスからのデータを表す。 ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて、血液、脾臓及び骨髄における、ヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２（ｈＩｇＧ１）の単回投与後の好塩基球又は好酸球の枯渇の用量応答性及び期間を示す。ＣＲＴｈ２＋好酸球（ＣＣＲ３＋）のベースライン数は、示すように、ｈ１９Ａ２．ｖ５２での処置前の−３日目（図１９Ａ）に血液からフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスは、１０ｕｇ／マウス又は２００ｕｇ／マウスｉ．ｖ．で抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体で処置した。好塩基球及び好酸球枯渇は、血液（図１９Ａ）において、示すように、２日目、７日目及び１４日目にフローサイトメトリーにより評価した。記号は、個体マウスからのデータを表す。 ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて、血液、脾臓及び骨髄における、ヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２（ｈＩｇＧ１）の単回投与後の好塩基球又は好酸球の枯渇の用量応答性及び期間を示す。ＣＲＴｈ２＋好酸球（ＣＣＲ３＋）のベースライン数は、示すように、ｈ１９Ａ２．ｖ５２での処置前の−３日目（図１９Ａ）に血液からフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスは、１０ｕｇ／マウス又は２００ｕｇ／マウスｉ．ｖ．で抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体で処置した。好塩基球及び好酸球枯渇は、脾臓（図１９Ｂ）において、示すように、２日目、７日目及び１４日目にフローサイトメトリーにより評価した。記号は、個体マウスからのデータを表す。 ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて、血液、脾臓及び骨髄における、ヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２（ｈＩｇＧ１）の単回投与後の好塩基球又は好酸球の枯渇の用量応答性及び期間を示す。ＣＲＴｈ２＋好酸球（ＣＣＲ３＋）のベースライン数は、示すように、ｈ１９Ａ２．ｖ５２での処置前の−３日目（図１９Ａ）に血液からフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスは、１０ｕｇ／マウス又は２００ｕｇ／マウスｉ．ｖ．で抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体で処置した。好塩基球及び好酸球枯渇は、骨髄（ＢＭ）（図１９Ｃ）において、示すように、２日目、７日目及び１４日目にフローサイトメトリーにより評価した。記号は、個体マウスからのデータを表す。 エフェクター機能を有する枯渇性抗ＣＲＴｈ２ １９Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ抗体が、ｈＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．ＴｇマウスでのＴＮＰ−ＯＶＡ誘導慢性喘息モデルにおける自然免疫細胞枯渇及びＴｈ２ ＢＡＬサイトカイン産生の減少において、非枯渇性抗ＣＲＴｈ２ １９Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ＿ＤＡＮＡ Ｆｃ変異抗体よりも効果的であることを示す図である。図２０Ａは、フローサイトメトリーにより評価した肺組織中、及びフローサイトメトリーと組み合わせた示差細胞カウントにより評価したＢＡＬ中の好塩基球、好酸球及び肥満細胞の数を示す（図２０Ａ）。抗ブタクサアイソタイプコントロール抗体と比較した、抗ＣＲＴｈ２ １９Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ抗体及びＦｃ変異１９Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ＿ＤＡＮＡ抗体によるパーセント枯渇を、グラフに示す。図２０Ｂは、ＥＬＩＳＡにより決定したＢＡＬ中のＩＬ−４の濃度を示す。抗ブタクサアイソタイプコントロール抗体と比較した、抗ＣＲＴｈ２ １９Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ抗体及びＦｃ変異１９Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ＿ＤＡＮＡ抗体によるパーセント低減を、グラフに示す。
Ｉ．定義
本明細書において、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下で定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含んでいてもよいし、アミノ酸配列変化を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）の間の非共有相互作用を合計した力を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体と抗原）の間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含めた、当該技術分野で知られている慣用法によって測定することができる。結合親和性の測定に関する具体的な例示的及び代表的な実施態様を以下に記載する。
「親和性成熟」抗体は、変更を有さない親抗体と比較して、１つ又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）中に１つ又は複数の変更を有し、そうした変更が抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、抗体を指す。
用語「ＣＲＴｈ２」は、本明細書で使用する場合、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト、アカゲザル、カニクイザルＣＲＴｈ２）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）のような任意の哺乳動物からの任意の天然ＣＲＴｈ２を指す。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないＣＲＴｈ２、及び細胞におけるプロセシングにより得られる任意の形態のＣＲＴｈ２を包含する。この用語は、ＣＲＴｈ２の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＣＲＴｈ２のアミノ酸配列を、配列番号８４に示す。例示的アカゲザルＣＲＴｈ２のアミノ酸配列を、配列番号８５に示す。例示的カニクイザルＣＲＴｈ２のアミノ酸配列を、配列番号８６に示す。例えば、Ｌ．Ｃｏｓｍｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（１０）：２９７２−９（２０００）；Ｋ．Ｎａｇａｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５９（２）：１９５−９（１９９９）、及びＫ．Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（３）：１２７８−８６（１９９９）を参照されたい。
ヒトＣＲＴｈ２配列（配列番号８４）
アカゲザルＣＲＴｈ２配列（ＮＣＢＩ参照番号ＸＭ＿００１０８４７４６）（配列番号８５）
カニクイザルＣＲＴｈ２配列（配列番号８６）
用語「抗ＣＲＴｈ２抗体」及び「ＣＲＴｈ２に結合する抗体」は、抗体が、ＣＲＴｈ２のターゲティングにおいて、診断剤及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性を有してＣＲＴｈ２を結合することができる抗体を指す。一実施態様では、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される無関係の非ＣＲＴｈ２タンパク質への抗ＣＲＴｈ２抗体の結合の程度は、ＣＲＴｈ２に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある種の実施態様では、ＣＲＴｈ２に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある種の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、様々な種のＣＲＴｈ２の間で保存されている、ＣＲＴｈ２のエピトープに結合する。
本明細書では、用語「抗体」は、広義で使用され、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を含めた様々な抗体構造を、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、包含する。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
基準抗体として「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、その抗原への基準抗体の結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に、競合アッセイにおいて、基準抗体は、その抗原への抗体の結合を５０％以上ブロックする。例示的な競合アッセイを本明細書で提供する。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部は特定の供給源又は種に由来するが、重鎖及び／又は軽鎖の残部は異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
本明細書で使用する場合、用語「細胞傷害剤」は、細胞機能を阻害若しくは妨害する及び／又は細胞死若しくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害剤としては、これらに限定されないが、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素）；化学療法剤又は化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）；並びに以下に開示する様々な抗腫瘍性又は抗がん性の薬剤が挙げられる。
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因し得る生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
本明細書では、用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域が含まれる。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書で別途断りのない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン、すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４から成る。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中の次の配列、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に出現する。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書では、互換的に使用されて、天然の抗体構造と実質的に類似している構造を有する、又は本明細書で定義したＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用されて、外来性の核酸が導入された細胞（そうした細胞の後代を含む）を指す。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これには、初代形質転換細胞、及び継代数とは関係なく、それに由来する後代が含まれる。後代は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異後代は、本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒトの供給源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体の本定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨのフレームワーク配列の選択において、最も一般的に存在するアミノ酸残基に相当するフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、１−３巻と同様のサブグループである。一実施態様では、ＶＬについては、サブグループは、上述のＫａｂａｔらと同様のサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについては、サブグループは、上述のＫａｂａｔらと同様のサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある種の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、及び典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、すべて又は実質的にすべてのＨＶＲ（例えばＣＤＲ）は、非ヒト抗体のものに対応し、すべて又は実質的にすべのＦＲは、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化された抗体を指す。
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変性である、及び／又は構造的に定められたループ（「超可変ループ」）を形成する、各抗体可変ドメイン領域を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、６つのＨＶＲ、すなわちＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、一般に、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、配列変動性が最も高く、及び／又は抗原の認識に関与する。ＨＶＲ領域は、本明細書で使用する場合、位置２４−３６（Ｌ１について）、４６−５６（Ｌ２について）、８９−９７（Ｌ３について）、２６−３５Ｂ（Ｈ１について）、４７−６５（Ｈ２について）、及び９３−１０２（Ｈ３について）内にある任意の数の残基を含む。よって、ＨＶＲは、以前に記載した位置中の残基を含む：
Ａ）２４−３４（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）（Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。
Ｂ）Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２（Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。
Ｃ）３０−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、９３−１００ａ−ｊ（Ｈ３）（MacCallumらJ. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)）。
ＶＨ中のＣＤＲ１を除いては、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である、「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲ領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８及びＨ３の９５−１０２で生じる（Almagro及びFransson、Front.Biosci.13:1619-1633(2008)を参照されたい）。別途指示がない限り、可変ドメインのＨＶＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書では、上述のＫａｂａｔらに従って番号付けする。
「イムノコンジュゲート」は、これに限定されないが、細胞傷害剤を含めた、１つ又は複数の異種分子（複数可）にコンジュゲートした抗体である。
「個体」又は「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。ある種の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
「単離」抗体は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。幾つかの実施態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって測定した時に９５％を超える又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
「単離」核酸は、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸としては、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子が挙げられるが、核酸分子は、染色体外に、又はその天然の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置にも存在する。
「抗ＣＲＴｈ２抗体をコードする単離核酸」は、抗体の軽鎖及び重鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指す。これには、単一のベクター又は別々のベクター中のそうした核酸分子（複数可）が含まれ、そうした核酸分子（複数可）は、宿主細胞の１か所又は複数の位置に存在する。
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、例えば天然に存在する変異を含む又はモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる、あり得る変異体抗体（そうした変異体は、一般に少量存在している）を除いては、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一である及び／又は同じエピトープに結合する）から得られる抗体を指す。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、これらに限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン座の全体又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含めた種々の手法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそうした方法及び他の例示的方法は、本明細書に記載されている。
「裸抗体」は、異種部分（例えば細胞傷害性部分）又は放射標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。裸抗体は、薬学的製剤に存在してもよい。
「天然の抗体」は、多様な構造を有する、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様にＮ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに帰属させることができる。
用語「添付文書」は、治療用製品の商業的なパッケージに慣例上含まれ、そうした治療用製品の使用に関する、適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は注意についての情報を含む、説明書を指すのに使用される。
基準ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部としてみなさない、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当該技術分野の範囲内の様々な方法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者なら、比較する配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかし、本明細書においては、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作製され、ソースコードは、米国著作権庁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に利用可能であり、又はソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、使用するために、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムでコンパイルする必要がある。すべての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更しない。
ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列の比較に用いる場合は、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいはこれは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、以下のように計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍、式中、Ｘは、ＡとＢのプログラムのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、同一一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合は、ＢへのＡのアミノ酸配列同一性％は、ＡへのＢのアミノ酸配列同一性％に等しくないであろうことが理解されよう。特に具体的に明記しない限り、本明細書で使用するすべてのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載されているように得られる。
用語「薬学的製剤」は、その中に含まれる活性成分の生物活性を有効にするような形態であって、製剤を投与することになる対象にとって許容されない毒性を有する追加的な構成成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象に非中毒性である、薬学的製剤中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、これらに限定はされないが、バッファー、賦形剤、安定化剤又は防腐剤が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「治療」は、臨床病理の過程において治療される個体又は細胞の自然経過を変化させるように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい作用としては、疾患進行速度の低下、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。幾つかの実施態様では、治療は、喘息の制御を改善し、喘息の増悪を低減し、肺機能を改善し、及び／又は患者が報告する症状を改善する。障害に付随する１つ又は複数の症状が軽減される又は解消するならば、個体の「治療」は成功している。
本明細書で使用する場合、「と併せて」は、別の治療モダリティーに加えてのある治療モダリティーの投与を指す。よって、「と併せて」は、個体への他の治療モダリティーの投与の前、最中又は後のある治療モダリティーの投与を指す。
本明細書で使用する場合、用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、個体における疾患の出現又は再発に関する予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）を提供することを含む。個体は、障害にかかりやすい、障害に感受性である、又は障害を発生する危険性があるが、その障害についてまだ診断されていなくてもよい。幾つかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＣＲＴｈ２抗体は、障害の発生を遅延させるために使用される。幾つかの実施態様では、本明細書に記載の抗ＣＲＴｈ２抗体は、喘息の増悪及び／又は肺機能若しくは喘息状態の減退を予防する。
本明細書で使用する場合、障害を発生する「危険性がある」個体は、検出可能な疾患又は疾患の症状を有していてもいなくてもよく、本明細書に記載の治療方法の前に検出可能な疾患又は疾患の症状を示していてもいなくてもよい。「危険性がある」とは、当該技術分野で知られるように、障害の発生に相関する測定可能なパラメーターである、１つ又は複数の危険因子を個体が有することを表示する。これらの１つ又は複数の危険因子を有する個体は、これらの１つ又は複数の危険因子を有さない個体よりも障害を発生する確率が高い。
「有効量」は、治療的又は予防的結果を含んで、所望の又は示される効果を達成するために少なくとも効果的な投薬量及び必要期間についての量を指す。有効量は、１回又は複数回の投与で提供できる。
「治療有効量」は、特定の障害の測定可能な改善をもたらすために必要な少なくとも最小限の濃度である。治療有効量は、本明細書では、患者の病状、年齢、性別及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発するための抗体の能力のような因子によって異なってよい。治療有効量は、治療的に有利な作用が抗体の任意の毒性又は有害な作用を凌ぐものでもある。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために効果的な投薬量及び必要期間についての量を指す。典型的に、しかし必須ではないが、予防的用量は疾患の前又は早期段階で対象において用いられるので、予防的有効量は、治療有効量より少ないことがあり得る。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般に、各ドメインが、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、類似した構造を有する（例えば、Kindtら、Kuby Immunology第６版、W.H.Freeman and Co.、ｐ９１(2007)を参照されたい）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、抗原に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを使用して、それぞれ相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングし、特定の抗原を結合する抗体を単離することができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、それに結合した別の核酸を伝搬することができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造物としてのベクター及びそれが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある種のベクターは、動作可能に連結された核酸の発現を指令することができる。そうしたベクターを、本明細書では、「発現ベクター」と称する。
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合し、その後、標的細胞を細胞毒で殺すことができるようにすることができる形態の細胞傷害性のことをいう。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」させ、この機構により標的細胞を殺すために必要である。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施してよい。そうしたアッセイのために有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは又はさらに、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えばＣｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価してよい。
「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の、同族抗原に結合した（適当なサブクラスの）抗体への結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを実施してよい。
用語「喘息」は、様々な再発する症状、可逆的気流閉塞（例えば気管支拡張剤による）及び根底にある炎症に付随するか又はしないことがある気管支過感受性により特徴づけられる複合障害である。喘息の例としては、アスピリン感受性／増悪喘息、アトピー性喘息、重症喘息、軽症喘息、中度から重症の喘息、コルチコステロイドナイーブ喘息、慢性喘息、コルチコステロイド抵抗性喘息、コルチコステロイド難治性喘息、新しく診断され治療されていない喘息、喫煙による喘息、コルチコステロイドで制御されない喘息、及びＪ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１０）１２６（５）：９２６−９３８に言及される他の喘息が挙げられる。喘息の症状としては、息切れ、咳（痰の産生及び／又は痰の質及び／又は咳の頻度の変化）、喘鳴、胸部絞扼感、気管支収縮及び上記の症状の１つに起因する夜間中途覚醒、あるいはこれらの症状の組み合わせが挙げられる（Juniperら(2000)Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162(4), 1330-1334.）。
用語「軽症喘息」は、一般的に、症状又は増悪を週２回未満、夜間の症状を月２回未満経験し、増悪と増悪の間には無症状である患者を指す。軽症間欠性喘息は、以下のものを使用して必要に応じて治療される：吸入気管支拡張剤（短時間作用型吸入ベータ２−アゴニスト）；既知のトリガーの回避；年１回のインフルエンザワクチン接種；６−１０年ごとの肺炎球菌ワクチン接種、及び幾つかの場合では、同定されたトリガーへの曝露の前に吸入ベータ２−アゴニストであるクロモリン又はネドクロミル。患者の短時間作用型ベータ２−アゴニストに対する必要性が増えるならば（例えば短時間作用型ベータ２−アゴニストを急性の増悪のために１日３−４回より多く使用する、又は症状のために１月に１つより多い缶を用いる）、患者は、治療のステップアップを必要とすることがある。
用語「中度喘息」は、一般的に、患者が週２回より多くの増悪を経験し、増悪が睡眠及び活動に影響し、患者が月２回より多く喘息のために夜間中途覚醒し、患者が短時間作用型吸入ベータ２−アゴニストを毎日又は１日おきに必要とする慢性喘息症状を有し、患者の治療前ベースライン最大呼気流量（ＰＥＦ）又は１秒間の強制呼気容量（ＦＥＶ１）が予測の６０−８０パーセントであり、ＰＥＦ変動が２０−３０パーセントである喘息を指す。
用語「重症喘息」は、一般的に、患者がほぼ連続的な症状、頻繁な増悪、喘息による頻繁な夜間中途覚醒、活動の制限、予測の６０パーセント未満のＰＥＦ又はＦＥＶ１ベースライン、及び２０−３０パーセントのＰＥＦ変動を有する喘息を指す。
用語「ＦＥＶ１」は、強制呼息の最初の１秒に吐き出された空気の容量を指す。これは、気道閉塞の尺度である。ＦＥＶ１は、他の同様の様式、例えばＦＥＶとして示されることがあり、そうした類似の変動はすべて同じ意味を有すると理解されよう。
用語「コルチコステロイド」は、グルココルチコイド及びミネラロコルチコイドを含む。例えば、コルチコステロイドとしては、これらに限定されないが、フルチカゾン（プロピオン酸フルチカゾン（ＦＰ）を含む）、ベクロメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、モメタゾン、フルニソリド、ベタメサゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、及びトリアムシノロンが挙げられる。「吸入コルチコステロイド」は、吸入による送達に適するコルチコステロイドを意味する。例示的吸入コルチコステロイドは、フルチカゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、フランカルボン酸モメタゾン、シクレソニド、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド及び現在入手可能又は将来入手可能になる他の何れかのコルチコステロイドである。吸入でき、長時間作用型ベータ２−アゴニストと混合されるコルチコステロイドとしては、これらに限定されないが、ブデソニド／フォルモテロール及びフルチカゾン／サルメテロールが挙げられる。
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に対して作用するある細胞集団により放出されるタンパク質の包括的な用語である。そうしたサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２を含むＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子β、並びにＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で使用する場合、用語サイトカインは、天然の供給元から又は組換え細胞培養物からのタンパク質、並びに合成的に産生された小分子並びにそれらの薬学的に許容される誘導体及び塩を含む、天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に示さない限り、複数の言及を含む。例えば、「抗体」への言及は、モル量のような１つから多くの抗体までへの言及であり、当業者に既知のそれらの等価物を含む、などである。
本明細書に記載の本発明の態様及び実施態様は、「含む」、「からなる」及び「本質的にからなる」態様及び実施態様を含むと理解されよう。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、ＣＲＴｈ２に結合する抗体が本明細書で提供される。ある種の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２は、ヒトＣＲＴｈ２に結合し、有効量が対象（例えばヒト対象）に投与された場合に、ＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、非ヒト霊長類のＣＲＴｈ２（例えば、アカゲザル又はカニクイザルＣＲＴｈ２）にも結合する。本発明の抗体は、例えば、ＣＲＴｈ２発現細胞により媒介される障害の診断又は治療のために有用である。
例示的抗ＣＲＴｈ２抗体
一態様では、本発明は、ＣＲＴｈ２に結合する単離抗体を提供する。ある種の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、１つ又は複数の以下の特性を有する：（１）ＣＲＴｈ２（例えばヒトＣＲＴｈ２）に結合し、有効量が対象に投与された場合に、ＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球及び／又は自然２型（ＩＴ２）細胞）を枯渇させる、（２）ＡＤＣＣを改善するように操作されている、（３）脱フコシル化されている、又はフコシル化が低減されている、（４）少なくとも１つの以下の抗体のヒトＣＲＴｈ２への結合を競合的に阻害する：１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５、３Ｃ１２及び本明細書に記載の何れかのヒト化抗体、（５）少なくとも１つの以下の抗ＣＲＴｈ２抗体が結合するＣＲＴｈ２エピトープと同じ又はオーバーラップするヒトＣＲＴｈ２のエピトープに結合する：１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５、３Ｃ１２及び本明細書に記載の何れかのヒト化抗体、（６）ヒト及び非ヒト霊長類のＣＲＴｈ２（例えば、アカゲザル及び／又はカニクイザルＣＲＴｈ２）に結合する、（７）ＣＲＴｈ２シグナル伝達をブロックする、（８）プロスタグランジンＤ２に応答したＣＲＴｈ２発現細胞の動員を妨げる、（９）ＣＲＴｈ２発現細胞におけるＣａ２＋フラックスをブロックする、（１０）アゴニスト活性を示さない、（１１）ＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、ヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞）において、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルを低減しない、及び（１２）ＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、ヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞）において、プロスタグランジンＤ２により誘発されるフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルの阻害をブロックする。
別の態様では、本発明は、（ａ）マウス抗体１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５及び３Ｃ１２、並びに本明細書に記載のヒト化抗体（例えば、ｈｕ８Ｂ１．ｖ１、ｈｕ１９Ａ２．ｖ１、ｖ１２、ｖ３８、ｖ４６、ｖ４７、ｖ５１−ｖ５３、ｖ５７、ｖ５８及びｖ６０−ｖ７２）の何れか１つのＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ若しくは３つのＨＶＲを含む軽鎖可変領域、並びに／又は（ｂ）マウス抗体１９Ａ２、８Ｂ１、３Ｃ１２及び３１Ａ５、並びに本明細書に記載のヒト化抗体（例えば、ｈｕ８Ｂ１．ｖ１、ｈｕ１９Ａ２．ｖ１、ｖ１２、ｖ３８、ｖ４６、ｖ４７、ｖ５１−ｖ５３、ｖ５７、ｖ５８及びｖ６０−ｖ７２）の何れか１つのＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、２つ若しくは３つのＨＶＲを含む重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体を提供する。幾つかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２及びＨＶＲ−Ｈ３は、図１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、１３及び１４に示すように、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ又はＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を含む。
別の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号２２又は２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、（ｉｖ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｖ）配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｖｉ）配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＣＲＴｈ２抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｖｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＣＲＴｈ２抗体を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）ＲＡＳＥＮＩＹＸＮＬＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、ＸはＳ、Ｗ又はＹである）、（ｉｉ）ＡＡＴＱＬＡＸ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、ＸはＤ、Ｅ又はＳである）、（ｉｉｉ）ＱＨＦＷＩＴＰＷＴ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、（ｉｖ）Ｘ１ＹＸ２ＭＳ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１（式中、Ｘ１はＳ又はＦであり、Ｘ２はＳ、Ｌ又はＫである）、（ｖ）Ｘ１ＩＳＮＧＧＳＴＴＸ２ＹＰＧＴＶＥＧ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ１はＹ又はＲであり、Ｘ２はＹ又はＤである）、（ｖｉ）ＨＲＴＮＷＤＦＤＹ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＨＶＲを含む抗ＣＲＴｈ２抗体を提供する。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施態様では、抗体は、配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号２２又は２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号２２又は２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施態様では、抗体は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１３、１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施態様では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１３、１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号７、８又は９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０、１１又は１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号７、８又は９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０、１１又は１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３５又は３６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２２又は２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号２２又は２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号７、８又は９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０、１１又は１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１３、１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号７、８又は９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０、１１、１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
上記の実施態様のうちの何れかでは、抗ＣＲＴｈ２抗体は、単離抗体である。上記の実施態様のうちの何れかでは、抗ＣＲＴｈ２抗体は、ヒト化されている。一実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、上記の実施態様のうちの何れかと同様のＨＶＲ、並びに図１０、１１、１２、１３及び１４で示すＨＶＲ（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ又はＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を含むＨＶＲを含む）を含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。別の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、上記の実施態様のうちの何れかと同様のＨＶＲを含み、図１１Ａ、１２及び１４Ａで示すＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４）配列を含むＶＬをさらに含む。別の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、上記の実施態様のうちの何れかと同様のＨＶＲ、並びに図１０、１１、１２、１３及び１４で示すＨＶＲ（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ又はＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列を含むＨＶＲを含む）を含み、図１１Ｂ、１２及び１４Ｂで示すＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ）配列を含むＶＨをさらに含む。
ある種の実施態様では、本明細書に記載の抗ＣＲＴｈ２抗体は、Ｋａｂａｔによって定義されるＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＣＲＴｈ２抗体であって、各ＣＤＲが、本明細書でさらに記載するようにＫａｂａｔによって定義される抗ＣＲＴｈ２抗体を含む。ある種の実施態様では、本明細書に記載の抗ＣＲＴｈ２抗体は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義されるＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＣＲＴｈ２抗体であって、各ＣＤＲが、本明細書でさらに記載するようにＣｈｏｔｈｉａによって定義される抗ＣＲＴｈ２抗体を含む。ある種の実施態様では、本明細書に記載の抗ＣＲＴｈ２抗体は、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列により定義されるＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３を含む抗ＣＲＴｈ２抗体であって、各ＣＤＲが、本明細書でさらに記載するようにＣｏｎｔａｃｔ ＣＤＲ配列によって定義される抗ＣＲＴｈ２抗体を含む。
別の態様では、配列番号３８−５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗ＣＲＴｈ２抗体が提供される。ある種の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列に対して、置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＣＲＴｈ２抗体は、ＣＲＴｈ２に結合する能力を保持する。ある種の実施態様では、配列番号３８−５３の何れかにおいて、合計で１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失する。ある種の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域（すなわちＦＲ内）で生じる。任意選択的に、抗ＣＲＴｈ２抗体は、配列の翻訳後修飾を含めた、配列番号３８−５３からなる群から選択されるＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号７−９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０−１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号２２又は２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
別の態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、配列番号５４−６５からなる群から選択されるのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある種の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列に対して、置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＣＲＴｈ２抗体は、ＣＲＴｈ２に結合する能力を保持する。ある種の実施態様では、配列番号５４−６５の何れかにおいて、合計で１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸が、置換され、挿入され、及び／又は欠失する。ある種の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の領域（すなわちＦＲ内）で生じる。任意選択的に、抗ＣＲＴｈ２抗体は、配列の翻訳後修飾を含めた、配列番号５４−６５の何れかのＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号１３−１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１８−２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号２９又は３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。特定の実施態様では、ＶＨは、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲを含む。
別の態様では、上記の実施態様のうちの何れかと同様のＶＨ、及び上記の実施態様のうちの何れかと同様のＶＬを含む、抗ＣＲＴｈ２抗体が提供される。幾つかの実施態様では、抗体は、マウス抗体８Ｂ１、３Ｃ１２、３１Ａ５及び１９Ａ２、並びにヒト化抗体ｈｕ１９Ａ２（ｖ１、ｖ１２、ｖ３８、ｖ４６、ｖ４７、ｖ５１−ｖ５３、ｖ５７、ｖ５８及びｖ６０−ｖ７２を含む）の何れかのＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は、マウス抗体８Ｂ１、３Ｃ１２、３１Ａ５及び１９Ａ２、並びにヒト化抗体ｈｕ１９Ａ２（ｖ１、ｖ１２、ｖ３８、ｖ４６、ｖ４７、ｖ５１−ｖ５３、ｖ５７、ｖ５８及びｖ６０−ｖ７２を含む）の何れかのＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号５４−６０からなる群から選択されるＶＨ配列及び配列番号３８−４８からなる群から選択されるＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号５５のＶＨ配列及び配列番号３９のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号５７のＶＨ配列及び配列番号４１のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号６１のＶＨ配列及び配列番号４９のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号６２のＶＨ配列及び配列番号５０のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号６３のＶＨ配列及び配列番号５１のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号６４のＶＨ配列及び配列番号５２のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号６５のＶＨ配列及び配列番号５３のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号５７のＶＨ配列及び配列番号４０のＶＬ配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供する抗ＣＲＴｈ２抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある種の実施態様では、マウス抗体８Ｂ１、３Ｃ１２、３１Ａ５及び１９Ａ２、並びにヒト化抗体ｈｕ１９Ａ２（ｖ１、ｖ１２、ｖ３８、ｖ４６、ｖ４７、ｖ５１−ｖ５３、ｖ５７、ｖ５８及びｖ６０−ｖ７２を含む）と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
さらなる態様では、ヒトＣＲＴｈ２及び少なくとも１つの非ヒト霊長類ＣＲＴｈ２に結合する抗ＣＲＴｈ２抗体が提供される。ある種の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、ヒトＣＲＴｈ２及びカニクイザルＣＲＴｈ２に結合する。ある種の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、ヒトＣＲＴｈ２及びアカゲザルＣＲＴｈ２に結合する。ある種の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、ヒトＣＲＴｈ２、アカゲザルＣＲＴｈ２及びカニクイザルＣＲＴｈ２に結合する。ある種の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、１００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＲＴｈ２及び少なくとも１つの非ヒト霊長類ＣＲＴｈ２の両方に結合する（例えば、抗ＣＲＴｈ２抗体は、１００ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＲＴｈ２に結合し、１００ｎＭ未満のＫＤで少なくとも１つの非ヒト霊長類に結合する）。ある種の実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、７５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ又は１０ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＲＴｈ２及び少なくとも１つの非ヒト霊長類ＣＲＴｈ２の両方に結合する。ある種の実施態様では、ヒトＣＲＴｈ２及び少なくとも１つの非ヒト霊長類ＣＲＴｈ２の両方に結合する抗ＣＲＴｈ２抗体は、枯渇性抗体、例えば本明細書にさらに記載するようにＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる抗体である。
本発明のさらなる態様では、上記の実施態様の何れかに記載の抗ＣＲＴｈ２抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を含めた、モノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ＢＣＲＴｈ２抗体は、抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ又はＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施態様では、抗体は、完全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書で定義する他の抗体クラス若しくはアイソタイプ（例えばＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）である。幾つかの実施態様では、抗体は、配列番号７７−８３からなる群から選択される重鎖配列、及び／又は配列番号６６−７６からなる群から選択される軽鎖配列を含む。
さらなる態様では、上記の実施態様の何れかに記載の抗ＣＲＴｈ２抗体は、以下のセクションに記載されるような特色のうちの何れかを、単独で又は組み合わせて含むことができる。
抗体親和性
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗体は、≦１μＭ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
一実施態様では、Ｋｄは、以下のアッセイに記載されるように、目的のＦａｂ型抗体及びその抗原を用いて実施する放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定する。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、滴定系列の非標識抗原の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原を用いてＦａｂを平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体をコーティングしたプレートを用いて結合した抗原を捕獲することによって測定する（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイ条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）に入れた５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、続いて、ＰＢＳに入れた２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを用いて、２から５時間、室温（約２３℃）でブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を目的のＦａｂの段階希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致している）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートする。しかしインキュベーションは、確実に平衡状態に達するように、より長期間（例えば約６５時間）続けてもよい。その後、この混合物を捕獲プレートに移して、室温で（例えば、１時間）インキュベートする。次いで溶液を除去し、０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））のＰＢＳ溶液でプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを１０分間カウントする。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を選んで、競合的結合アッセイで使用する。幾つかの実施態様では、Ｋｄは、細胞表面で発現されるＣＲＴｈ２への抗体の結合について測定してもよい。
別の実施態様によれば、Ｋｄは、〜１０反応単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いるＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を２５℃で使用して、表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する。簡単に述べると、供給業者の指示書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を用いて、５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈してから、５μｌ／分の流速で注入して、約１０反応単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。抗原の注入に続いて、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。反応速度論的な測定のため、Ｆａｂの２倍段階希釈物（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、約２５μｌ／分の流速で２５℃で注入する。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェア３．２版）を使用して、結合センサーグラムと解離センサーグラムを同時に適合することによって計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって、会合速度が１０６Ｍ−１ Ｓ −１を超える場合は、流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００−シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下において、ＰＢＳ、ｐＨ７．２に入れた２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増大又は低下を測定する蛍光消光技術を使用することによって、会合速度を決定することができる。
抗体断片
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗体は抗体断片である。抗体断片としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片並びに以下に記載する他の断片が挙げられる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２６９−３１５頁（１９９４）を参照されたい。国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期が増大したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。
ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体若しくは一部分、又は軽鎖可変ドメインの全体若しくは一部分を含む抗体断片である。ある種の実施態様では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照されたい）である。
抗体断片は、これらに限定されないが、本明細書に記載のように、インタクトな抗体のタンパク質消化並びに組換え宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生を含めた様々な手法によって作製することができる。
キメラ抗体及びヒト化抗体
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。一例を挙げれば、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例を挙げれば、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合性断片を含む。
ある種の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化されるが、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持する。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。幾つかの実施態様では、例えば、抗体特異性又は親和性を回復する又は改善するために、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基が、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」手法を記載）に記載されている。
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、これらに限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Simsら、J.Immunol.151:2296(1993)を参照されたい）、軽鎖又は重鎖可変領域の特定サブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:4285(1992)；及びPrestaら、J.Immunol.、151:2623(1993)を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro及びFransson、Front.Biosci.13:1619-1633(2008)を参照されたい）、並びにＦＲライブラリーのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Bacaら、J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)；及びRosokら、J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996)を参照されたい）が挙げられる。
ヒト抗体
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な手法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）、並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、抗原負荷に反応してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。そうした動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン座の全体又は一部分を含み、ヒト免疫グロブリン座は、内因性の免疫グロブリン座に置き換わるか、又は染色体外に存在するか、若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれる。そうしたトランスジェニックマウスでは、内因性の免疫グロブリン座は、一般に不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６０７５１８１号及び第６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７０４１８７０号、並びにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そうした動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変することができる。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている（例えば、Kozbor J.Immunol.、133:3001(1984)；Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51-63頁(Marcel Dekker,Inc.、New York、1987）；及びBoernerら、J.Immunol.、147:86(1991)を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体も、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）及びＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載する）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７−９３７（２００５）、並びにＶｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。次いで、そうした可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。ヒト抗体を抗体ライブラリーから選択する技法を以下に記載する。
ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性（１又は複数）を有する抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成するための、及び所望の結合特性を有する抗体についてそうしたライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当該技術分野で知られている。そうした方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）に概説されており、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ及びＢｒａｄｂｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。
ある種のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているように、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組換え、次いでこれを、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片の何れかとして、抗体断片を提示する。免疫化された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要無しで、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ、１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されているように、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングし、いかなる免疫化もせずに、幅広い非自己及び自己抗原に対して抗体の単一供給源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８（１９９２）によって記載されているように、再配列していないＶ−遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし且つインビトロで再配列を達成するためのランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ナイーブライブラリーも合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報としては、例えば、米国特許第５７５０３７３号、並びに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書で、ヒト抗体又はヒト抗体断片とみなす。
多重特異性抗体
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施態様では、結合特異性の１つはＣＲＴｈ２に対してであり、他は、任意の他の抗原に対してである。ある種の実施態様では、二重特異性抗体は、ＣＲＴｈ２の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体は、ＣＲＴｈ２を発現する細胞に細胞傷害剤を局在させるのに使用することもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技法としては、これらに限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組換え共発現（Milstein及びCuello、Nature 305:537(1983)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTrauneckerら、EMBO J.10:3655(1991)を参照されたい）、並びに「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照されたい）が挙げられる。多重特異性抗体は、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング作用を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋結合すること（例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びBrennanら、Science、229:81(1985)を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Kostelnyら、J.Immunol.、148(5):1547-1553(1992）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体断片を作製すること（例えば、Hollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:6444-6448(1993)を参照されたい）、及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruberら、J.Immunol.、152:5368(1994)を参照されたい）、及び例えば、ＴｕｔｔらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているような三重特異性抗体を調製することによって、作製することもできる。
「オクトパス抗体」を含めて、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照されたい）。
本明細書の抗体又は断片には、ＣＲＴｈ２及び別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含まれる（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０を参照されたい）。
抗体変異体
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的な特性を改善することが望ましい場合もある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入すること、又はペプチド合成によって調製することができる。そうした修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はその残基への挿入、及び／又はその残基の置換が挙げられる。最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有することを条件として、最終的なコンストラクトを得るために、欠失、挿入及び置換を任意に組み合わせることができる。
置換、挿入及び欠失変異体
ある種の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の目的の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換を、表１において「保存的置換」の項目の下に示す。より実質的な変化を、表１おいて「例示的置換」の項目の下に提供し、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下にさらに記載するように提供する。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
表1
アミノ酸は、共通の側鎖特性によってグループ化することができる。
ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
ｂ．中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
ｅ．鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
ｆ．芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とするであろう。
置換変異体の１タイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られた変異体（複数可）は、親抗体と比較して、特定の生物学的な特性（例えば親和性の増大、免疫原性の低減）における改変（例えば改善）を有する、及び／又は実質的に保持された、親抗体の特定の生物学的な特性を有する。例示的置換変異体は親和性成熟抗体であり、これは、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技法、例えば本明細書に記載のものを使用して、簡便に生成することができる。簡単に述べると、１つ又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージ上に提示し、特定の生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。
変更（例えば置換）は、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて行うことができる。そうした変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程の間に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury、Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)を参照されたい）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬは、結合親和性について試験される。２次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（O’Brienら編、Human Press、Totowa、NJ、(2001)）に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様では、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）のうちの何れかによって、成熟のために選ばれた可変遺伝子中に多様性を導入する。次いで２次ライブラリーを作出する。次いで、このライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４−６残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向性手法を含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング変異誘発又はモデル化を使用して、具体的に特定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が標的にされることが多い。
ある種の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、そうした変更が、抗体が抗原に結合する能力を実質的に低減しない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内に生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供する保存的置換）は、ＨＶＲ内で行うことができる。そうした変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記の変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある種の実施態様では、各ＨＶＲは、不変であるか、又は１つ、２つ若しくは３つ以下のアミノ酸置換を含むかの何れかである。
突然変異誘発の標的にされ得る抗体の残基又は領域を同定するのに有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５によって記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は集団（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性の又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置き換えて、抗原との抗体の相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換を、最初の置換に機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入することができる。あるいは、又はさらに、抗体と抗原の間の接触点を同定するための抗原抗体複合体の結晶構造。そうした接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にされてもよいし、排除されてもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体の血清半減期を増大させる（例えばＡＤＥＰＴについての）酵素又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が挙げられる。
グリコシル化変異体
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大又は低減するように変化させる。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作出される又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成することができる。
抗体がＦｃ領域を含む場合は、それに結合する炭水化物を変化させることができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、一般に、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって結合した、分枝した二分岐オリゴ糖を典型的には含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐のオリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。幾つかの実施態様では、特定の改善した特性を有する抗体変異体を作出するために、本発明の抗体のオリゴ糖を修飾することができる。
一実施態様では、Ｆｃ領域に結合した炭水化物構造のフコースが低減している、又はフコースを欠くＦｃ領域を含む抗体変異体であって、ＡＤＣＣ機能を改善し得る抗体変異体が提供される。具体的に、野生型ＣＨＯ細胞で産生される同じ抗体上のフコースの量と比べてフコースが低減している抗体が本明細書で企図される。つまり、これらは、天然ＣＨＯ細胞（例えば、天然ＦＵＴ８遺伝子を含むＣＨＯ細胞のような、天然グリコシル化パターンを産生するＣＨＯ細胞）により産生されるならばそれらが有していたであろうよりも少ない量のフコースを有することにより特徴づけられる。ある種の実施態様では、抗体は、抗体上のＮ−結合グリカンの約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％未満がフコースを含むものである。例えば、そうした抗体のフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であり得る。ある種の実施態様では、抗体は、抗体上のＮ−結合グリカンが何れもフコースを含まないもの、すなわち抗体がフコースを完全に含まない、又はフコースを有さない、又は脱フコシル化されているものである。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるような、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖構造体（例えば複合、ハイブリッド及び高マンノース構造体）の合計に対して、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定する。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、抗体の軽微な配列バリエーションが原因で、Ａｓｎ２９７は、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち２９４位と３００位の間に位置する可能性もある。そうしたフコシル化変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質のフコシル化を欠いたＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ripkaら Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、並びにノックアウト細胞株、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８のノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnukiら、Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.ら、Biotechnol.Bioeng.、94(4):680-688(2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）が挙げられる。
抗体変異体は、二分されたオリゴ糖をさらに備えており、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐のオリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている。そうした抗体変異体は、フコシル化が低減されている、及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている可能性がある。そうした抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）及びＦｅｒｒａｒａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９３（５）：８５１−８６１（２００６）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そうした抗体変異体は、ＣＤＣ機能が改善されている可能性がある。そうした抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
ある種の実施態様では、本明細書に記載のＦｃ領域を含む抗体変異体は、ＦｃγＲＩＩＩに結合できる。ある種の実施態様では、本明細書に記載のＦｃ領域を含む抗体変異体は、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ活性を有する、又はヒト野生型ＩｇＧ１Ｆｃ領域を含む抗体とそうでなければ同じ抗体と比較して、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ活性が増加している。
Ｆｃ領域変異体
ある種の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供する抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによって、Ｆｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸の位置に、アミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含むことができる。
ある種の実施態様では、本発明は、インビボでの抗体半減期が重要であるけれども、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）は不要又は有害である適用にとって望ましい候補とする、すべてではないが、いくらかのエフェクター機能を有する抗体変異体を企図する。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／喪失を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持するということを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現するが、一方、単球はＦｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に概説されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第５５００３６２号（例えばHellstrom,I.ら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986)を参照されたい）及びHellstrom,Iら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；第５８２１３３７号（Bruggemann,M.ら、J.Exp.Med.166:1351-1361(1987)を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることもできる（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリー用の非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。そうしたアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又はさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、ＣｌｙｎｅｓらＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoroら、J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.ら、Blood 101:1045-1052(2003);並びにCragg,M.S.及びM.J.Glennie、Blood 103:2738-2743(2004)を参照されたい）。当該技術分野で知られている方法を使用して、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の測定も行うことができる（例えば、Petkova,S.B.ら、Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)を参照されたい）。
エフェクター機能が低減した抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有する抗体（米国特許第６７３７０５６）が挙げられる。そうしたＦｃ突然変異体としては、残基２６５及び２９７からアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７３３２５８１号）を含めて、アミノ酸の位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上の置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられる。
ＦｃＲへの結合が改善又は減弱された特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShieldsら, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照されたい）。
ある種の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。例示的な実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、Ｆｃ領域中に以下のアミノ酸置換を含む：Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ及びＫ３３４Ａ。
幾つかの実施態様では、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、変化した（すなわち、改善又は減弱した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変更が、Ｆｃ領域中で行われる。
半減期が延び、母性ＩｇＧを胎児へ移行させるのに関与する（Guyerら, J. Immunol. 117:587 (1976)、及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994)）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ又は複数の置換を有する、Ｆｃ領域を含む。そうしたＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ又は複数での置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４での置換（米国特許第７３７１８２６号）を有する変異体が挙げられる。
Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
システイン操作抗体変異体
ある種の実施態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「チオＭＡｂ」を作出することが望ましい場合もある。特定の実施態様では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。そのような残基をシステインで置換することにより、反応性のチオール基は、それによって、抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書でさらに記載するように、薬物部分又はリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを作出するのに使用することができる。ある種の実施態様では、以下の残基の任意の１つ又は複数をシステインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成することができる。
抗体誘導体
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗体は、当該技術分野で知られており且つ容易に利用可能な付加的な非タンパク質性部分を含むように、さらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、これに限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定例としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダム共重合体の何れか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造における利点を有し得る。ポリマーは、いかなる分子量のものでもよく、分枝でも非分枝でもよい。抗体に結合したポリマーの数は変動する可能性があり、１ポリマーより多くが結合する場合は、それらは、同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、これらに限定されないが、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定められた条件下などで療法に使用されるかどうかなどを含めた考慮に基づいて決定することができる。
別の実施態様では、照射曝露によって選択的に加熱することができる抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブ（Kamら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605(2005)）である。照射はいかなる波長でもよく、これに限定はされないが、通常の細胞を害さないが、抗体−非タンパク質性部分の近位細胞が死滅する温度に非タンパク質性部分を加熱する波長が挙げられる。
組換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え法及び組成物を使用して産生することができる。一実施態様では、本明細書に記載の抗ＣＲＴｈ２抗体をコードする単離核酸が提供される。そうした核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。さらなる実施態様では、そうした核酸を含む１つ又は複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、そうした核酸を含む宿主細胞が提供される。そうした実施態様の１つでは、宿主細胞は、以下のものを含む（例えば、以下のもので形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター。一実施態様では、宿主細胞は、真核性であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体を作製する方法が提供され、この方法は、上記の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び任意選択的に、宿主細胞（又は宿主細胞の培養培地）から抗体を回収することを含む。
抗ＣＲＴｈ２抗体を組換え産生するために、例えば上記のように、抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、１つ又は複数のベクターに挿入する。そうした核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し、配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核生物細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合は、細菌で産生することができる。抗体断片及びポリペプチドの細菌での発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照されたい（大腸菌での抗体断片の発現を記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）２４５−２５４頁も参照されたい）。発現させた後に、抗体を、可溶性画分の細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターにとってクローニング又は発現の適切な宿主であり、これには、グリコシル化経路が「ヒト化され」、その結果、部分的に又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物体（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて使用することができる、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために使用することができる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）を参照されたい。
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胎児性腎臓株（例えば、Grahamら、J.Gen Virol.36:59(1977)に記載されているような２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されているようなＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaubら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980)）を含めたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、２５５−２６８頁（２００３）を参照されたい。
アッセイ
本明細書で提供する抗ＣＲＴｈ２抗体は、当該技術分野で知られている様々なアッセイによって、その物理的／化学的特性及び／若しくは生物活性を同定することができ、それらについてスクリーニングすることができ、又はそれらについて特徴を明らかにすることができる。
結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの既知の方法によって、本発明の抗体をその抗原結合活性について試験する。
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＣＲＴｈ２への結合についてマウス抗体８Ｂ１、３Ｃ１２、３１Ａ５及び１９Ａ２、並びにヒト化抗体ｈｕ１９Ａ２（ｖ１、ｖ１２、ｖ３８、ｖ４６、ｖ４７、ｖ５１−ｖ５３、ｖ５７、ｖ５８及びｖ６０−ｖ７２を含む）と競合する抗体を同定することができる。ある種の実施態様では、そうした競合抗体は、マウス抗体８Ｂ１、３Ｃ１２、３１Ａ５及び１９Ａ２、並びにヒト化抗体ｈｕ１９Ａ２（ｖ１、ｖ１２、ｖ３８、ｖ４６、ｖ４７、ｖ５１−ｖ５３、ｖ５７、ｖ５８及びｖ６０−ｖ７２を含む）が結合するのと同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６６巻（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に提供されている。
例示的競合アッセイでは、固定化されているＣＲＴｈ２又は細胞表面でＣＲＴｈ２を発現する細胞を、ＣＲＴｈ２（例えば、ヒト又は非ヒト霊長類）に結合する第１の標識された抗体と、ＣＲＴｈ２への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験される第２の標識されていない抗体とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化されたＣＲＴｈ２又はＣＲＴｈ２を発現する細胞を、第１の標識抗体を含むが、第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体がＣＲＴｈ２に結合可能な条件下でインキュベーションした後、過剰な未結合抗体を除去し、固定化されたＣＲＴｈ２又はＣＲＴｈ２を発現する細胞に結合した標識の量を測定する。固定化されたＣＲＴｈ２又はＣＲＴｈ２を発現する細胞に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に低減する場合は、ＣＲＴｈ２への結合について、第２の抗体が第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第１４章（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。
活性アッセイ
当該技術分野で知られ、本明細書に記載（例えば、実施例１）のアッセイを使用して、抗ＣＲＴｈ２抗体の生物活性を同定して試験できる。幾つかの実施態様では、ＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球及び／又は自然２型（ＩＴ２）細胞）の枯渇について抗ＣＲＴｈ２抗体を試験するためのアッセイが提供される。生物活性についての例示的試験は、例えば、好塩基球及び好酸球のような免疫細胞上でヒトＣＲＴｈ２を発現するトランスジェニックマウスを準備することと、抗ＣＲＴｈ２抗体をトランスジェニックマウスに投与することと、マウスの血液若しくは組織中のヒトＣＲＴｈ２陽性細胞のレベル（例えば、数又はパーセンテージ）、又はマウスの血液若しくは組織中のＣＲＴｈ２を発現することが知られている細胞型のレベル（例えば、数又はパーセンテージ）を測定することとを含むことができる。別の例示的試験は、例えば、ヒトＣＲＴｈ２を発現するマウスを準備することと、既知の方法を使用してＴＮＰ−ＯＶＡでマウスを感作／負荷した後に、抗ＣＲＴｈ２抗体を投与することとを含むことができる。ＴＮＰ−ＯＶＡ負荷マウス肺組織、血液、ＢＡＬ及びＢＡＬＦを、ＣＲＴｈ２陽性細胞の存在又はＣＲＴｈ２を発現することが知られている細胞型の存在について評価してよい。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体によるＴｈ２サイトカイン産生細胞の枯渇を検出するためのアッセイが提供される。例えば、インビトロ極性化ヒトＴｈ２細胞をＳＣＩＤマウスに腹腔内注射でき、抗ＣＲＴｈ２抗体をマウスに投与する。サイトカイン産生細胞のレベルは、ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いるエクスビボ刺激の後に評価できる。幾つかの実施態様では、抗ＣＲＴｈ２抗体は、これらのアッセイの何れかにおいて、ＣＲＴｈ２発現細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％及び１００％の何れかを枯渇させることができる。
ＣＲＴｈ２シグナル伝達のブロッキングについて抗ＣＲＴｈ２抗体を試験するためのアッセイも提供される。ＣＲＴｈ２シグナル伝達を評価するための例示的方法は、ＣＲＴｈ２陽性細胞を準備することと、細胞を抗ＣＲＴｈ２抗体とインキュベートした後に、ＰＧＤ２のようなリガンドで（フォルスコリンの存在又は非存在下で）刺激することと、最後に、当該技術分野で既知の任意の方法によって細胞内ｃＡＭＰ又はＣａ２＋含有量の変化を測定することとを含むことができる。
ＴＮＰ−ＯＶＡ、パパイン又はプロスタグランジンＤ２に応答したＣＲＴｈ２発現細胞の動員の防止について抗ＣＲＴｈ２抗体を試験するためのアッセイも提供される。ＰＧＤ２に応答したＣＲＴｈ２発現細胞の動員についての例示的試験は、免疫細胞（例えば、好塩基球及び好酸球）上でヒトＣＲＴｈ２を発現するトランスジェニックマウスの気道に、抗ＣＲＴｈ２抗体の存在又は非存在下でＰＧＤ２を投与することと、肺組織及び気管支肺胞洗浄液へのＣＲＴｈ２陽性細胞のその後の流入を評価することとを含むことができる。評価は、切除組織をＣＲＴｈ２について染色すること、及びフローサイトメトリーによって細胞流入を決定すること、又は当該技術分野で既知の任意の他の方法を含む幾つかの方法で達成できる。
ＣＲＴｈ２発現細胞におけるＣａ２＋フラックスのブロッキングについて抗ＣＲＴｈ２抗体を試験するためのアッセイも提供される。例示的試験は、ＰＧＤ２のようなリガンドに応答したＣａ２＋フラックスについてフローサイトメトリーを使用して細胞をモニタリングすることと、ｉｎｄｏ−１／ＡＭ色素及び抗ＣＲＴｈ２モノクローナル抗体とその後インキュベートすることとを含むことができる。
イムノコンジュゲート
本発明は、１種又は複数の細胞傷害剤、例えば、化学療法剤又は化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）又は放射性同位体にコンジュゲートした、本明細書における抗ＣＲＴｈ２抗体を含むイムノコンジュゲートも提供する。
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、これらに限定されないが、マイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）のようなオーリスタチン（米国特許第５６３５４８３号及び第５７８０５８８号及び第７４９８２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、第５７１４５８６号、第５７３９１１６号、第５７６７２８５号、第５７７０７０１号、第５７７０７１０号、第５７７３００１号及び第５８７７２９６号；Hinmanら, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)、並びにLodeら, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)を参照されたい）；ダウノマイシン又はドキソルビシンのようなアントラサイクリン（Kratzら, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffreyら, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgovら, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchikら, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); Kingら, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)及び米国特許第６６３０５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル及びオルタタキセルのようなタキサン；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５を含む１種又は複数の薬物に抗体がコンジュゲートされた、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、これらに限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを含む、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成した、本明細書に記載の抗体を含む。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートを産生するのに利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。検出に放射性コンジュゲートが使用される場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー研究用に放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３を含むことができ、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化、ｍｒｉとしても知られる）用にスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン若しくは鉄を含むことができる。
抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるようにして調製できる。炭素−１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの、抗体へのコンジュゲーションについての例示的キレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞において細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chariら, Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）を使用できる。
本明細書でのイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、これらに限定されないが、市販である（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含む架橋剤を使用して調製されるそうしたコンジュゲートを特に意図するが、これらに限定されない。
診断及び検出のための方法及び組成物
ある種の実施態様では、本明細書で提供する抗ＣＲＴｈ２抗体のうちの何れかは、生体試料におけるＣＲＴｈ２の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する場合、用語「検出」は、定量的又は定性的検出を包含する。ある種の実施態様では、生体試料は、細胞又は組織、例えば、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球又は自然２型（ＩＴ２）細胞を含む。
一実施態様では、診断又は検出の方法で使用するための抗ＣＲＴｈ２抗体が提供される。さらなる態様では、生体試料におけるＣＲＴｈ２の存在を検出する方法が提供される。ある種の実施態様では、方法は、抗ＣＲＴｈ２抗体がＣＲＴｈ２に結合可能な条件下で、本明細書に記載のように、抗ＣＲＴｈ２抗体に生体試料を接触させること、及び抗ＣＲＴｈ２抗体及びＣＲＴｈ２の間で複合体が形成されているかどうかを検出することを含む。そうした方法は、インビトロの方法でもよいし、インビボの方法でもよい。一実施態様では、例えば、ＣＲＴｈ２が患者を選択するためのバイオマーカーである場合、抗ＣＲＴｈ２抗体は、抗ＣＲＴｈ２抗体を用いる療法に好適な対象を選択するのに使用される。
本発明の抗体を使用して診断することができる例示的障害としては、喘息、微量顆粒球性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、急性又は慢性気道過敏症、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−ストラウス症候群、特発性肺線維症、サイトカインに関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する炎症又は悪性腫瘍、慢性特発性じん麻疹、慢性自発性じん麻疹、寒冷じん麻疹及び圧迫じん麻疹を含む物理的じん麻疹、水疱性類天疱瘡、鼻腔ポリポーシス、食物アレルギー、及び嚢胞性線維症随伴性又は非随伴性のアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）が挙げられる。
ある種の実施態様では、標識抗ＣＲＴｈ２抗体が提供される。標識には、これらに限定されないが、（蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識などの）直接的に検出される標識又は部分、並びに例えば、酵素反応又は分子の相互作用を介して間接的に検出される、酵素又はリガンドなどの部分が挙げられる。例示的標識としては、これらに限定されないが、放射性同位体の３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセインなどのフルオロフォア及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はミクロペルオキシダーゼとの結合、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどが挙げられる。
薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＣＲＴｈ２抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有するそうした抗体を１つ又は複数の任意選択的な薬学的に許容される担体（Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版, Osol, A.編(1980)）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水性液剤の形で調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、用いる投薬量及び濃度においてレシピエントに対して非中毒性であり、これらに限定されないが、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含めた、単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば亜鉛−タンパク質錯体）；並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性の界面活性剤が挙げられる。本明細書において例示的な薬学的に許容される担体としては、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの間質薬物分散剤、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含めて、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加的なグルコサミノグリカナーゼと組み合わせる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸バッファーを含む。
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症に必要である場合、１種より多い活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含むこともできる。例えば、これらに限定されないが、以下のものをさらに提供することが望ましい：ＩＬ４阻害剤（例えば、ＡＥＲ−００１、ＩＬ４／ＩＬ１３ｔｒａｐ又は抗ＩＬ４抗体）、ＩＬ５阻害剤（例えば、メポリズマブ、ＣＡＳ Ｎｏ．１９６０７８−２９−２；レシリズマブ又は別の抗ＩＬ５抗体）、ＩＬ９阻害剤（例えば、ＭＥＤＩ−５２８又は別の抗ＩＬ９抗体）、ＩＬ１３阻害剤（例えば、ＩＭＡ−０２６、ＩＭＡ−６３８（アンルキンズマブとも呼ばれる、ＩＮＮ Ｎｏ．９１０６４９−３２−０；ＱＡＸ−５７６；ＩＬ４／ＩＬ１３ ｔｒａｐ）、トラロキヌマブ（ＣＡＴ−３５４とも呼ばれる、ＣＡＳ Ｎｏ．１０４４５１５−８８−９）；ＡＥＲ−００１、ＡＢＴ−３０８（ヒト化１３Ｃ５．５抗体とも呼ばれる）又は別の抗ＩＬ１３抗体）、抗ＩＬ１７抗体、抗ＩＬ２５抗体、抗ＩＬ３３抗体、抗ＴＳＬＰ抗体、抗ＯＸ４０Ｌ抗体、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ−４−受容体アルファ−阻害剤（例えば、ＡＭＧ−３１７、ＡＩＲ−６４５又は別の抗ＩＬ４Ｒａ抗体）、抗ＩＬ５Ｒａ抗体、抗１７ＲＡ抗体、あるいは抗ＣＣＲ４抗体。そうした活性成分は、意図する目的のために効果的な量で組み合わせて適切に存在する。
活性成分は、コロイド薬物配送システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション技法又は界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに封入することができる。そうした技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ編（１９８０）に開示されている。
持続性放出調製物を調製することができる。持続性放出調製物の適切な例としては、マトリックスが成形品の形、例えばフィルム又はマイクロカプセルである、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。
インビボ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。
治療方法及び組成物
本明細書で提供する抗ＣＲＴｈ２抗体のうちの何れかを、治療方法において使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための抗ＣＲＴｈ２抗体が提供される。さらなる態様では、ＣＲＴｈ２により媒介される障害の治療において使用するための抗ＣＲＴｈ２抗体が提供される。ある種の実施態様では、治療方法において使用するための抗ＣＲＴｈ２抗体が提供される。ある種の実施態様では、本発明は、有効量の抗ＣＲＴｈ２抗体を個体に投与することを含むＣＲＴｈ２により媒介される障害を有する個体の治療の方法において使用するための抗ＣＲＴｈ２抗体を提供する。そうした実施態様の１つでは、方法は、例えば以下に記載するような、有効量の少なくとも１つの追加的な治療剤を個体に投与することをさらに含む。幾つかの実施態様では、障害は、喘息、微量顆粒球性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、急性又は慢性気道過敏症、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−ストラウス症候群、特発性肺線維症、サイトカインに関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する炎症又は悪性腫瘍、慢性特発性じん麻疹、慢性自発性じん麻疹、寒冷じん麻疹及び圧迫じん麻疹を含む物理的じん麻疹、水疱性類天疱瘡、鼻腔ポリポーシス、食物アレルギー、及び嚢胞性線維症随伴性又は非随伴性のアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される。さらなる実施態様では、本発明は、個体におけるＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球及び／又は自然２型（ＩＴ２）細胞）の枯渇、又は個体における１種若しくは複数のサイトカイン、酵素若しくは他の炎症メディエーター（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン、トリプターゼ及び／又はロイコトリエン）のレベルの低減において使用するための抗ＣＲＴｈ２抗体を提供する。幾つかの実施態様では、少なくとも１つの以下の細胞型により産生される１種又は複数のサイトカインが低減される：Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、又は自然２型（ＩＴ２）細胞。ある種の実施態様では、本発明は、有効量の抗ＣＲＴｈ２抗体を個体に投与して、ＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる、及び／又は１種若しくは複数のサイトカインを低減することを含む個体におけるＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球及び／又は自然２型（ＩＴ２）細胞）の枯渇、及び／又は個体における１種若しくは複数のサイトカイン、酵素若しくは他の炎症メディエーター（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン、トリプターゼ及び／又はロイコトリエン）のレベルの低減の方法において使用するための抗ＣＲＴｈ２抗体を提供する。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＣＲＴｈ２抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、ＣＲＴｈ２により媒介される障害を治療するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、ＣＲＴｈ２により媒介される障害を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、その障害を治療する方法において使用するためのものである。そうした実施態様の１つでは、方法は、例えば以下に記載するような、有効量の少なくとも１つの追加的な治療剤を個体に投与することをさらに含む。幾つかの実施態様では、障害は、喘息、微量顆粒球性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、急性又は慢性気道過敏症、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−ストラウス症候群、特発性肺線維症、サイトカインに関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する炎症又は悪性腫瘍、慢性特発性じん麻疹、慢性自発性じん麻疹、寒冷じん麻疹及び圧迫じん麻疹を含む物理的じん麻疹、水疱性類天疱瘡、鼻腔ポリポーシス、食物アレルギー、及び嚢胞性線維症随伴性又は非随伴性のアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される。さらなる実施態様では、医薬は、個体におけるＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球及び／又は自然２型（ＩＴ２）細胞）の枯渇、及び／又は個体における１種若しくは複数のサイトカイン、酵素若しくは他の炎症メディエーター（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン、トリプターゼ及び／又はロイコトリエン）の低減のためである。さらなる実施態様では、医薬は、有効量の医薬を個体に投与して、ＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる、及び／又は１種若しくは複数のサイトカインを低減することを含む、個体におけるＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球及び／又は自然２型（ＩＴ２）細胞）の枯渇、及び／又は個体における１種若しくは複数のサイトカイン、酵素若しくは他の炎症メディエーター（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン、トリプターゼ及び／又はロイコトリエン）のレベルの低減の方法で使用するためである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」はヒトでもよい。
さらなる態様では、本発明は、ＣＲＴｈ２により媒介される障害の治療方法を提供する。一実施態様では、方法は、そうした障害を有する個体に、有効量の抗ＣＲＴｈ２抗体を投与することを含む。そうした実施態様の１つでは、方法は、以下に記載するような、有効量の少なくとも１つの追加的な治療剤を個体に投与することをさらに含む。幾つかの実施態様では、障害は、喘息、微量顆粒球性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、急性又は慢性気道過敏症、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−ストラウス症候群、特発性肺線維症、サイトカインに関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する炎症又は悪性腫瘍、慢性特発性じん麻疹、慢性自発性じん麻疹、寒冷じん麻疹及び圧迫じん麻疹を含む物理的じん麻疹、水疱性類天疱瘡、鼻腔ポリポーシス、食物アレルギー、及び嚢胞性線維症随伴性又は非随伴性のアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される。上記実施態様の何れかに記載の「個体」はヒトでもよい。
さらなる態様では、本発明は、個体におけるＣＲＴｈ２発現細胞（例えば、Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球及び／又は自然２型（ＩＴ２）細胞）の枯渇、及び／又は個体における１種若しくは複数のサイトカイン、酵素若しくは他の炎症メディエーター（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン、トリプターゼ及び／又はロイコトリエン）のレベルの低減の方法を提供する。一実施態様では、方法は、有効量の抗ＣＲＴｈ２抗体を個体に投与して、ＣＲＴｈ２発現細胞を低減する、及び／又は１種若しくは複数のサイトカインを低減することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。幾つかの実施態様では、個体は、喘息、微量顆粒球性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、急性又は慢性気道過敏症、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−ストラウス症候群、特発性肺線維症、サイトカインに関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する炎症又は悪性腫瘍、慢性特発性じん麻疹、慢性自発性じん麻疹、寒冷じん麻疹及び圧迫じん麻疹を含む物理的じん麻疹、水疱性類天疱瘡、鼻腔ポリポーシス、食物アレルギー、及び嚢胞性線維症随伴性又は非随伴性のアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される障害を有する。
ある種の実施態様では、本明細書に記載の方法を使用して、喘息に罹患している個体であって、米国特許出願第２０１２／０１５６１９４号で定義されるように好酸球性炎症陽性（ＥＩＰ）である個体を治療できる。ある種の実施態様では、本明細書に記載の方法を使用して、喘息に罹患している個体であって、米国特許出願第２０１２／０１５６１９４号で定義されるように好酸球性炎症陰性（ＥＩＮ）である個体を治療できる。ＤＦ Ｃｈｏｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６（３）：１８６１−９（２０１１）；Ａｒｒｏｎら（２０１３）Ａｄｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６６：１−４９、及びＧ．Ｊｉａら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０（３）：６４７−６５４（２０１２）も参照されたい。
ある種の実施態様では、喘息に罹患している患者は、高レベルの血清又は血漿総ペリオスチンを示す。ある種の実施態様では、ＥＩＰ患者は、血清又は血漿ペリオスチンレベルについて試験され、血清又は血漿ペリオスチンレベルが、患者集団の中央又は平均血清又は血漿ペリオスチンレベル以上である（高ペリオスチンとも呼ばれる）患者を指す。ある種の実施態様では、例えば、本明細書に記載のようにＥＬＩＳＡ又はサンドイッチイムノアッセイを使用して血清又は血漿ペリオスチンについて試験された患者は、２０ｎｇ／ｍｌ以上（好酸球陽性）の総ペリオスチンレベルを有することがある。ある種の実施態様によると、ＥＩＰである患者における総ペリオスチンレベルは、血清又は血漿において、２１ｎｇ／ｍｌ以上、２２ｎｇ／ｍｌ以上、２３ｎｇ／ｍｌ以上、２４ｎｇ／ｍｌ以上、２５ｎｇ／ｍｌ以上、２６ｎｇ／ｍｌ以上、２７ｎｇ／ｍｌ以上、２８ｎｇ／ｍｌ以上、２９ｎｇ／ｍｌ以上、３０ｎｇ／ｍｌ以上、３１ｎｇ／ｍｌ以上、３２ｎｇ／ｍｌ以上、３３ｎｇ／ｍｌ以上、３４ｎｇ／ｍｌ以上、３５ｎｇ／ｍｌ以上、３６ｎｇ／ｍｌ以上、３７ｎｇ／ｍｌ以上、３８ｎｇ／ｍｌ以上、３９ｎｇ／ｍｌ以上、４０ｎｇ／ｍｌ以上、４１ｎｇ／ｍｌ以上、４２ｎｇ／ｍｌ以上、４３ｎｇ／ｍｌ以上、４４ｎｇ／ｍｌ以上、４５ｎｇ／ｍｌ以上、４６ｎｇ／ｍｌ以上、４７ｎｇ／ｍｌ以上、４８ｎｇ／ｍｌ以上、４９ｎｇ／ｍｌ以上、５０ｎｇ／ｍｌ以上、５１ｎｇ／ｍｌ以上、５２ｎｇ／ｍｌ以上、５３ｎｇ／ｍｌ以上、５４ｎｇ／ｍｌ以上、５５ｎｇ／ｍｌ以上、５６ｎｇ／ｍｌ以上、５７ｎｇ／ｍｌ以上、５８ｎｇ／ｍｌ以上、５９ｎｇ／ｍｌ以上、６０ｎｇ／ｍｌ以上、６１ｎｇ／ｍｌ以上、６２ｎｇ／ｍｌ以上、６３ｎｇ／ｍｌ以上、６４ｎｇ／ｍｌ以上、６５ｎｇ／ｍｌ以上、６６ｎｇ／ｍｌ以上、６７ｎｇ／ｍｌ以上、６８ｎｇ／ｍｌ以上、６９ｎｇ／ｍｌ以上及び７０ｎｇ／ｍｌ以上からなる群から選択できる。
ある種の実施態様では、喘息に罹患している患者は、低レベルの血清又は血漿総ペリオスチンを示す。ある種の実施態様では、ＥＩＮ患者は、血清又は血漿ペリオスチンレベルについて試験され、血清又は血漿ペリオスチンレベルが２０ｎｇ／ｍｌ未満の患者を指す。
ＥＩＰ状態は、患者の状態を表し、その状態を決定するために使用したアッセイの種類に依存しないことが理解されよう。よって、ＥＬＩＳＡアッセイ及び米国特許出願第２０１２／０１５６１９４号に示されるＥＬＥＣＳＹＳ（登録商標）ペリオスチンアッセイのような他のペリオスチンアッセイを含む他の好酸球性炎症診断アッセイを使用又は開発して、好酸球性炎症状態について試験し、総ペリオスチンレベルを測定するために用いることができる。それらの全内容が本明細書に参照により援用されるＪｉａら、２０１２、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：６４７−６５４、及び米国特許出願第２０１２／０１５６１９４号も参照されたい。
用語「総ペリオスチン」は、本明細書で使用する場合、ペリオスチンの少なくともアイソフォーム１、２、３及び４を指す。ヒトペリオスチンアイソフォーム１、２、３及び４は、ＮＣＢＩデータベースに従って、それぞれ以下のアミノ酸配列を含むことが当該技術分野で既知であり：ＮＰ＿００６４６６（配列番号８７）、ＮＰ＿００１１２９４０６（配列番号８８）、ＮＰ＿００１１２９４０７（配列番号８９）、及びＮＰ＿００１１２９４０８（配列番号９０）、アイソフォーム５は、部分的に配列決定されている。アイソフォーム５は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、ペリオスチンのアイソフォームは、ヒトペリオスチンである。さらなる実施態様では、用語総ペリオスチンは、アイソフォーム１−４に加えてヒトペリオスチンのアイソフォーム５を含む。別の実施態様では、総ペリオスチンは、血清総ペリオスチン又は血漿総ペリオスチン（すなわち、それぞれ、全血から得られた血清試料又は全血から得られた血漿試料から（全血は、患者から得られた）の総ペリオスチン）である。
幾つかの実施態様では、個体に投与された抗ＣＲＴｈ２抗体は、個体においてＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる。幾つかの実施態様では、抗体は、肺組織から、及び／又は気管支肺胞洗浄液からＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる。幾つかの実施態様では、個体において少なくとも１種のＣＲＴｈ２発現細胞（肺からなど）は、抗体の投与前のベースラインと比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の何れか枯渇される。幾つかの実施態様では、個体において少なくとも１種のサイトカインＴｈ２産生細胞（肺からなど）は、抗体の投与前のベースラインと比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の何れか枯渇される。本明細書で使用する場合、「ベースライン」は、個体への本明細書に記載の抗ＣＲＴｈ２抗体の投与前のレベルを指す。抗体の投与前後のＣＲＴｈ２発現細胞のレベルは、当該技術分野で知られ、本明細書に記載の方法を使用して試験できる。
さらなる態様では、本発明は、例えば、上記の何れかの治療方法において使用するための、本明細書で提供する抗ＣＲＴｈ２抗体のうちの何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供する抗ＣＲＴｈ２抗体のうちの何れか、及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供する抗ＣＲＴｈ２抗体のうちの何れか、及び例えば以下に記載するような少なくとも１つの追加的な治療剤を含む。
本発明の抗体は、療法において単独又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば本発明の抗体は、少なくとも１つの追加的な治療剤と共投与することができる。ある種の実施態様では、追加的な治療剤は、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型ムスカリンアゴニスト、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、肥満細胞阻害剤（例えばクロモリンなど）、ＣＲＴｈ２小分子阻害剤、又はそれらの組み合わせである。
上記のそうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別々の製剤に含まれる）、及び分離投与（本発明の抗体の投与が、追加的な治療剤及び／又はアジュバントの投与より前に、その投与と同時に、及び／又はその投与に続いて生じ得る）を包含する。
本発明の抗体（及び任意の追加的な治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、その手段には、非経口、肺内及び鼻腔内が含まれ、並びに局所治療が望まれる場合、病変内の投与が含まれる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。投与が短期であるか長期であるかどうかにある程度応じて、任意の適切な経路、例えば静脈内又は皮下注射などの注射によって投薬することができる。これらに限定されないが、様々な時間点にわたる単回又は複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含めた様々な投薬計画が、本明細書で企図される。
本発明の抗体は、医学行動規範と一致した様式で、製剤化され、用量決定され、投与されることになる。これに関連して考慮する要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に知られている他の要因が挙げられる。抗体は、必要ではないが、任意選択的に、問題になっている障害を予防又は治療するのに現在使用されている１つ又は複数の薬剤と製剤化される。そうした他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療のタイプ、及び上で論じた他の要因によって決まる。これらは、一般に、本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投薬量の約１から９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると決定された任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防又は治療のために、（単独又は１つ又は複数の他の追加的な治療剤と組み合わせて使用する場合の）本発明の抗体の適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるか、以前の療法、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量によって決まる。抗体は、単回、又は一連の治療に適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回又は複数回の分離投与によるか、連続的注入によるかに関わらず、患者に投与するための最初の候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲に及び得る。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、治療は、一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されることになる。抗体の１つの例示的投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ又は複数の用量が、患者に投与される得る。そうした用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎に投与することができる（例えばその結果、患者は、約２から約２０、又は例えば約６用量の抗体が与えられる）。最初の高負荷用量に続いて、１つ又は複数の低用量を投与することができる。しかし、他の薬物投与法も有用であり得る。この療法の進捗は、従来の技法及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
上記の製剤又は治療方法の何れかが、抗ＣＲＴｈ２抗体の代わりに又は抗ＣＲＴｈ２抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを使用して実施され得ることが理解されよう。
製造品及びキット
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な抗ＣＲＴｈ２抗体の１つ又は複数のを含む製造品又はキットが提供される。製造品又はキットは、容器、及び容器上の若しくは容器に付随するラベル又は添付文書をさらに含み得る。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、単独で、又は別の組成物と組み合わせて、状態を治療、予防及び／若しくは診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するのに使用されることを示す。さらに、製造品又はキットは、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に含まれる第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又は治療剤を含む組成物が中に含まれる第２の容器を含むことができる。本発明の本実施態様における製造品又はキットは、組成物が特定の状態を治療するのに使用ができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、又はさらに、製造品又はキットは、薬学的に許容されるバッファー、例えば静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器をさらに含むことができる。他のバッファー、希釈剤、濾過器、針及び注射器を含めた、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
上記の製造品又はキットの何れかが、抗ＣＲＴｈ２抗体の代わりに又は抗ＣＲＴｈ２抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解されよう。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記の概説を考えると、様々な他の実施態様が実施され得ることが理解されよう。
実施例１．マウスの抗ヒトＣＲＴｈ２抗体の生成
材料及び方法
クローニング及び細胞株
アカゲザル及びカニクイザルＣＲＴｈ２ ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって、アカゲザル及びカニクイザルの血液から抽出したトータルＲＮＡから得て、アミノ末端フラグタグであるｇＤタグを含有する、又はタグを有さない哺乳動物発現ベクターｐＲＫ５ベクターにクローニングした。Ｏｒｉｇｅｎｅからのヒト完全長ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ＮＭ＿００４７７８）を、アミノ末端フラグタグであるｇＤタグを含有する、又はタグを有さないベクターｐＲＫ５にクローニングした。配列確認の際に、ＣＲＴｈ２クローンは、位置２０４にＧｅｎｅ Ｂａｎｋ ＮＭ＿００４７７８により示されるバリンではなくアラニンを含有した（例えば、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ基準配列に対してＶ２０４Ａ置換を有する配列番号８４）。
ＣＲＴｈ２含有プラスミドを、２９３細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してトランスフェクトし、タグ化又は非タグ化ＣＲＴｈ２の表面発現を、モノクローナル抗フラグ抗体（クローンＭ２、Ｓｉｇｍａ）、抗ｇＤ Ａｂ（クローン９５２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）又はヒトＣＲＴｈ２に対するラット抗ＣＲＴｈ２抗体ＢＭ１６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含む特異的抗ＣＲＴｈ２ Ａｂを使用して確認した。ＣＲＴｈ２含有プラスミドも、エレクトロポレーションによりマウスプレＢ細胞株である３００．１９細胞に導入し、表面ＣＲＴｈ２発現を、フラグタグ発現によって確認した。３００．１９細胞の表面上のＣＲＴｈ２発現も、ヒトＣＲＴｈ２に対するクローンＢＭ１６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含む抗ＣＲＴｈ２モノクローナル抗体によって決定した。
抗ヒトＣＲＴｈ２抗体の生成
抗ヒトＣＲＴｈ２抗体を生成するために、２つの方法：ＤＮＡ免疫化及び細胞免疫化のうちの一方でＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を免疫化した。ＤＮＡ免疫化のために、５０ｕｇのｐＲＫ５ベクタープラスマウスＦｌｔ３−Ｌ中のヒトＣＲＴｈ２ ＤＮＡ及びアジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦのハイドロダイナミクス尾静脈注射により毎週、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。細胞免疫化のために、ＰＢＳで希釈したヒトＣＲＴｈ２で安定にトランスフェクトされた５００万の３００．１９細胞で週２回、ｉ．ｐ．注射により、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）を腹腔内免疫化した。マウスは１０回の用量を受けた後に、２０００万の細胞のｉ．ｖ．での融合前追加免疫とともに、融合の３日前に４０００万の細胞をｉ．ｐ．で受けた。
ハイブリドーマを、標準的な方法によって生成した。脾細胞を、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）と、電気融合（ＢＴＸ、Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ、ＮＹ）によって融合し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／Ｌグルコース、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１５ｍｇ／ｍｌオキサロ酢酸、１００μｇ／ｍｌピルビン酸、０．２Ｕ／ｍｌインスリン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＮＣＴＣ−１０９（Ｌｏｎｚａ）、ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で一晩３７℃、７％ＣＯ２でインキュベートした後に、５．７μＭアザセリン及び１００μＭヒポキサンチン（ＨＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補った、記載したのと同様の培地中で９６ウェルプレートに播種した。細胞を１０日間培養した後に、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳによってマウスＩｇＧの発現を示し、強い特異的結合を示すウェルからの細胞を増殖させ、限界希釈によりサブクローニングした。２回目のサブクローニングの後に最高のＦＡＣＳ結合を示す最終クローンを、バイオリアクター（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｕｒ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）での大規模産生のために増殖させた。上清を、次いで、以前に記載されたようにして（Hongoら, Hybridoma 19:303, 2000）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ハイブリドーマからの精製抗体を、 ２９３細胞又は３００．１９細胞で発現されるヒトＣＲＴｈ２に結合する能力について、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。ヒト末梢血からの好塩基球及び好酸球に対して、結合反応性も試験した。クローン１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５及び３Ｃ１２の軽鎖及び重鎖を、ｐＲＫ５ベクターにサブクローニングした。すべての重鎖は、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域を含むようにクローニングした。抗ＣＲＴｈ２抗体を、標準的な手順を使用してＣＨＯ細胞において産生した。脱フコシル化１９Ａ２及び８Ｂ１抗体は、ＦＵＴ８−／−ＣＨＯ細胞株から産生した。
フローサイトメトリー
ヒト全血を健常ドナーから得て、ＥＬバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する赤血球細胞溶解の後に、染色手順のために末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。血液細胞を、様々な濃度のＡ４６７−コンジュゲート抗ＣＲＴｈ２抗体又は抗ＣＲＴｈ２抗体と２次抗マウスＩｇＧ−ＰＥ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）とインキュベートした。白血球集団を染色するために使用した抗体は、以下であった：ＦＩＴＣ−抗ヒトＣＤ１５、ＣＤ１６、ＰｅｒＣＰ−抗ヒトＨＬＡＤＲ及びＣＤ４、ＡＰＣ−抗ヒトＣＤ１２３、ＣＸＣＲ３、ＣＤ１４、ＢＤＣＡ１、ビオチン−抗ヒトＣＣＲ６、並びにＰＥ−抗ヒトＣＣＲ４。使用したＡｂはＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。制御性Ｔ細胞でのＣＲＴｈ２発現を決定するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞をＭＡＣＳ単離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によりヒトＰＢＭＣから濃縮し、抗ＣＲＴｈ２（抗体ＢＭ１６）で表面染色した後に、抗ＦｏｘＰ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で細胞内染色した。ヒト肥満細胞でのＣＲＴｈ２発現を評価するために、２００ｎｇ／ｍＬ ｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍＬ ｒｈＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び３０ｎｇ／ｍＬ ｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ−３４ ＳＦＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ）中で新鮮ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）を３−４週間培養することにより肥満細胞を生成した。肥満細胞を、抗ＣＤ１１７、抗ＣＤ１２３及び抗ＦｃｅＲＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．ＴｇマウスにおけるＴｈ２細胞上のヒトＣＲＴｈ２発現を決定するために、５０ｕｌ ＰＢＳ中の５０ｕｇパパインをマウスの右後足蹠に注射し、膝窩リンパ節細胞を３日後に回収し、抗ｍＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、抗ｍＣＤ４４−ＦＩＴＣ及びＢＭ１６−Ａ６４７で染色した。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおける自然Ｔヘルパー（ＩＴ）２型細胞でのヒトＣＲＴｈ２発現を調べるために、ｐＲＫ５ベクター中の５０ｕｇのマウスＩＬ−１７Ｅをハイドロダイナミクスにより尾静脈に注射した。３日後に、腸間膜リンパ節細胞を回収し、抗ｍＣＤ１１７−ＰＥ、ＢＭ１６−Ａ６４７、ヨウ化プロピジウム及び系列マーカー（ＦＩＴＣ標識された：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＦｃｅＲＩ、ＣＤ１１ｃ、Ｇｒ１、ＮＫ１．１、Ｆ４／８０、ＤＸ５並びにＰｅｒＣＰ−標識された：ＣＣＲ３）で染色した。ＦＩＴＣ−抗ヒトＣＤ１５、ＣＤ１６、ＰｅｒＣＰ−抗ヒトＨＬＡＤＲ及びＣＤ４、ＡＰＣ−抗ヒトＣＤ１２３、ＣＸＣＲ３、ＣＤ１４、ＢＤＣＡ１、ビオチン−抗ヒトＣＣＲ６、並びにＰＥ−抗ヒトＣＣＲ４は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。カニクイザル及びアカゲザルの血液を健常サルから得て、ＥＬバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する赤血球細胞溶解の後に、染色手順のために末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。血液細胞を、様々な濃度のＡ４６７−コンジュゲート抗ＣＲＴｈ２抗体とインキュベートした。白血球集団を染色するために使用した抗体は、以下であった：ＦＩＴＣ−抗ヒトＣＤ１２３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＥ−抗ヒトＣＤ１２５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ７１０抗ヒトＦｃｅＲＩ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。試料は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで獲得し、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を使用してデータ解析を実施した。
ＣＲＴｈ２＋メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞単離及びサイトカイン産生の定量
手を付けていないメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を、アトピー性のドナーからのヒトＰＢＭＣからＭＡＣＳ単離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により単離した後に、ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＢＭ１６−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）抗体を３７℃で２０分間使用して染色した。ＣＲＴｈ２＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋及びＣＲＴｈ２−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋メモリーＴ細胞を、ＦａｃｓＡｒｉａ選別機（ＢＤ）で選別した。ＣＲＴｈ２＋及びＣＲＴｈ２−メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の純度は、９８％を超えていた。同数の選別細胞を、１０ｕｇ／ｍＬのプレート結合型抗ｈＣＤ３ ｍＡｂ及び１ｕｇ／ｍＬの可溶型抗ｈＣＤ２８で４８時間、３７℃で刺激した。上清を回収し、ヒトＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）抗体−固定化ビーズ、及び製造業者の手順に従ってＬｕｍｉｎｅｘ１００装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用するプレート読み取りを使用して、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＧＭ−ＣＳＦについて解析した。
放射性リガンド細胞結合アッセイ（スキャッチャード解析）
組換えＣＲＴｈ２受容体を発現する細胞に結合する抗ＣＲＴＨ２抗体についての平衡解離定数（ＫＤ）を、放射性リガンド細胞結合アッセイを使用して決定した。Ｉｏｄｏｇｅｎ法を使用して抗ＣＲＴｈ２抗体をヨウ素化し、放射性標識された抗体は、Ｆａｂ抗体について１９−２２μＣＩ／μｇ及びＩｇＧ抗体について１０−１４μＣＩ／μｇの比活性範囲を有していた。ＣＲＴｈ２受容体を発現する細胞を２時間室温で、漸増濃度の標識されていない抗ＣＲＴｈ２抗体と混合した固定濃度のヨウ素化抗ＣＲＴｈ２抗体とインキュベートし、ゼロ添加のバッファーのみの試料を含めた。２時間のインキュベーションの後に、競合反応をＭｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレートに移し、結合バッファーで４回洗浄して、結合したヨウ素化された抗体から遊離抗体を分離した。Ｗａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄ １４７０ガンマカウンターでフィルターをカウントした。結合データは、抗ＣＲＴｈ２抗体の結合親和性を決定するのにＭｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄ（Munson及びRodbard, Anal. Biochem, 1980; 107: 220-239）の適合アルゴリズムを使用するＮｅｗＬｉｇａｎｄソフトウェア（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を使用して評価した。
エピトープマッピング
精製マウス抗ＣＲＴｈ２モノクローナル抗体１９Ａ２及びラット抗ＣＲＴｈ２モノクローナル抗体ＢＭ１６を、ＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ビオチンキット（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してビオチン化する。活性は、ヒトＣＲＴｈ２又はアカゲザルＣＲＴｈ２で安定にトランスフェクトされた２９３細胞でＦＡＣＳ滴定により確認する。１０００万細胞／ｍｌの濃度で、１％ＦＢＳを含むＰＢＳに懸濁された５０ｕｌのトランスフェクトされた２９３細胞を９６ウェルＵ字底型プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に加えた後に、２０ｕｇ／ｍｌの濃度の５０μｌの標識されていない抗体を加え、プレートを３０分間４℃でインキュベートする。以前のＦＡＣＳ滴定実験により決定される、２ｕｇ／ｍｌ（１９Ａ２及びＢＭ１６）の濃度でビオチン化抗体をプレートに加え、プレートを３０分間４℃でインキュベートする。細胞を遠心分離によりペレットにした後に１％ＦＢＳを含む２００μｌのＰＢＳを加えて、細胞を２回洗浄する。次いで、フィコエリスリンコンジュゲートストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）と３０分間４℃で細胞をインキュベートする。細胞を洗浄し、１％ホルマリンを含むＰＢＳで固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でのフローサイトメトリーによって解析した。
ヒトＴ細胞極性化
手を付けていないナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、健常ドナーからのＰＢＭＣからＭＡＣＳ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により単離した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０ｕＭ ２−ＭＥ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１ｍＭ非必須アミノ酸を補った完全ＤＭＥＭ培地中、１０ｕｇ／ｍＬのプレート結合型抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び１ｕｇ／ｍＬの可溶型抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で細胞を培養した。ヒトＴｈ部分集合極性化条件は、以下の通りであった：Ｔｈ１：１０ｎｇ／ｍＬ ｒｈＩＬ１２及び２ｕｇ／ｍＬ抗ｈＩＬ−４；Ｔｈ２：２０ｎｇ／ｍＬ ｒｈＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）、２ｕｇ／ｍＬ抗ｈＩＬ−１２及び５ｕｇ／ｍＬ抗ｈＩＦＮγ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。２回の極性化を実施し、各回は、活性化段階と、その後の休止段階とからなり、２回目の再刺激は、１ｕｇ／ｍＬのプレート結合型抗ＣＤ３ ｍＡｂ及び１ｕｇ／ｍｌ可溶型抗ＣＤ２８ ｍＡｂの存在下で実施した。
カルシウム動員アッセイ
インビトロ極性化Ｔｈ２細胞を、５μＭ ｉｎｄｏ−１／ＡＭ及び０．２％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）と３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、その後、抗ＣＣＲ６、抗ＣＣＲ４、抗ＣＤ４及び抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂで３７℃で１５分間染色した。洗浄後に、細胞を、１ｕＭの抗ＣＲＴｈ２ ｍＡｂ又はアイソタイプコントロール抗体と３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、１００ｎＭ ＰＧＤ２（Ｓｉｇｍａ）で刺激した。カルシウム放出を、フローサイトメトリーによってモニタリングした。
ＣＲＴｈ２機能的ｃＡＭＰブロッキングアッセイ
ＰＧＤ２−ＣＲＴｈ２シグナル伝達における抗ＣＲＴｈ２抗体のブロッキング活性を、フォルスコリン及びＰＧＤ２（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下での抗ＣＲＴｈ２と組換え細胞株ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ＣＨＯ−Ｋ１ ＣＲＴｈ２ Ｇｉ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ；Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）とのインキュベーションの後に細胞性ｃＡＭＰレベルを測定することによって解析した。簡単に述べると、３８４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ＃ ３７０７；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中で、１０，０００細胞／ウェルで細胞を一晩培養した。培養培地を除去した後に、１０μＬの試験抗体（ＰＢＳで系列希釈）を各ウェルに加え、３０分間３７℃でインキュベートした。次いで、それぞれ１２．５μＭ及び４ｎＭの最終濃度に達するように、各ウェルにフォルスコリン及びＰＧＤ２を加えた。３７℃でさらに３０分間のインキュベーションの後に、化学発光リーダーとしてＥｎｖｉｓｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、製造業者の手順に従ってＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｃＡＭＰ ＸＳ＋キット（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）を使用するｃＡＭＰ解析に、プレートを供した。データを、次いで、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して解析してプロットした。
ヒトＣＲＴｈ２ ＢＡＣトランスジェニックマウスの生成
ＢＡＣベクター骨格（ＲＰＣＩヒトＢＡＣライブラリー１１；クローンＩＤ ＲＰ１１−６８Ｈ２０）中にヒトＣＲＴｈ２遺伝子を含む１７１Ｋｂの断片を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。２８Ｋｂのより短いバージョンを、リコンビニアリングにより得た。１７１Ｋｂ又は２８ＫｂのＢＡＣコンストラクトを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから収集した受精卵母細胞にマイクロインジェクションした。ヒトＣＲＴｈ２導入遺伝子の存在は、マウス尾部ＤＮＡからのＲＴ−ＰＣＲにより決定した。同定した９匹の創始体のうち、７匹が、フローサイトメトリーにより試験して、免疫細胞型上で同様のヒトＣＲＴｈ２発現パターンを生じさせた。これらの系統のうち、系統８５は、ヒトＰＢＭＣからの初代ヒト好塩基球及び好酸球上でのヒトＣＲＴｈ２レベルと比較して、フローサイトメトリーにより、マウス好塩基球及び好酸球上で同様のヒトＣＲＴｈ２発現量を示した。
ヒトＣＲＴｈ２ ＢＡＣトランスジェニックマウスにおける抗ＣＲＴｈ２抗体での血液好塩基球及び好酸球枯渇の測定
６−８週齢のヒトＣＲＴｈ２ ＢＡＣ ｔｇマウスに、０日目に、マウス若しくはヒト化抗ヒトＣＲＴｈ２抗体又はアイソタイプコントロール抗体（ｍＩｇＧ１：ａｎｔ−ｇｐ１２０抗体；ｍＩｇＧ２ａ：抗ブタクサ抗体；ｈＩｇＧ１：抗ｇＤ抗体）を、示す用量で静脈内注射した。目出血を３、６又は７日後に行って、示すように、フローサイトメトリーにより好塩基球及び好酸球の数を解析した。あるいは、マウスのグループを２、３、７又は１４日目に屠殺し、血液、脾臓及び骨髄を収集し、フローサイトメトリーによる好酸球及び好塩基球の計数のために処理した。赤血球細胞を、ＥＬバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶解した。白血球細胞、脾細胞又は骨髄細胞は、抗ＣＤ１２３−ＦＩＴＣ、抗ＦｃεＲＩ−ＰＥ及び抗ＣＣＲ３−ＰｅｒＣＰで染色して、好塩基球及び好酸球を検出した。細胞の絶対数を、ＣａｌｉＢＲＩＴＥ ＦＩＴＣビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フローサイトメトリーにより決定した。
ヒトＣＲＴｈ２ ＢＡＣトランスジェニックマウスにおけるＴＮＰ−ＯＶＡ誘導肺炎症
ヒトＣＲＴｈ２ ＢＡＣ ｔｇマウスを、１００ｕｌの滅菌ＰＢＳ中の２ｍｇ水酸化アルミニウム中の５０ｕｇのＴＮＰ−ＯＶＡ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の腹腔内注射により０日目に感作した。感作後の３５日目に開始して、ＰＢＳ中のエアゾール化１％ＴＮＰ−ＯＶＡを３０分間、ネブライザーにより、７日間連続でマウスに負荷した。３８−４１日目に、１００ｕＬの生理食塩水中の２００ｕｇの抗ヒトＣＲＴｈ２抗体クローン１９Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ（脱フコシル化又はｗｔ）、Ｆｃ突然変異体Ａｂ １９Ａ２ ｍＩｇＧ２ａ＿ＤＡＮＡ、又は抗ブタクサコントロール抗体（ｍＩｇＧ２ａ）を使用して、マウスを１日１回腹腔内処置した。すべてのマウスは、４２日目に安楽死させた。２０ｍｌのＰＢＳをマウスの右心室に潅流して、肺から末梢血を一掃し、肺全体をフローサイトメトリーのために除去した。血液は、フローサイトメトリーによる評価のために、心穿刺により回収した。ＢＡＬは、細胞カウント及びサイトカイン解析のために回収した。ＢＡＬ液ＩＬ−４及びＩＬ−１３サイトカイン濃度は、製造業者の手順に従うＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）により決定した。エフェクター機能欠損バージョンの１９Ａ２抗体である１９Ａ２＿ＤＡＮＡは、２残基（Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ）を突然変異させることにより作出し、これは、Ｆｃγ受容体結合が排除されていた。
抗ヒトＣＲＴｈ２ ＡｂがＴｈ２細胞を枯渇させる可能性について評価するためのヒトＳＣＩＤモデル
−７日目に、３１５ｎｇ／ｍＬの血清ＩｇＥレベルを有するアトピー性ドナーから、白血球フェレーシス及びＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ヒトＰＢＭＣを単離した。マウスに後で移行するために、同じドナーからのＰＢＭＣの分割量を凍結した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０−０９４−１３１）を使用する非ＣＤ４＋Ｔ細胞及びメモリーＴ細胞の枯渇により、ＰＢＭＣから手を付けていないナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞をさらに単離した。精製ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ２に偏った条件下：５ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＩＦＮｇ（ＢＤ ５５４６９８）、２ｕｇ／ｍＬの抗ＩＬ１２（ＢＤ ５５４６５９）、及び２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２０４−ＩＬ）で、１０ｕｇ／ｍＬのプレート結合型抗ＣＤ３（ＢＤ ５５５３２９）及び１ｕｇ／ｍＬの可溶型抗ＣＤ２８（ＢＤ ５５５７２５）で３日間刺激した。Ｔｈ２条件下で刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＳＣＩＤベージュマウスへの移行実験のために使用した。
０日目に、セシウム１３７源からＳＣＩＤベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に致死量以下の３．５Ｇｙを照射した。１００ｕｌのＰＢＳ中のヒトＴ細胞を、以下の混合物：６×１０７の極性化Ｔ細胞（上記のとおり）及び同じドナーからの４×１０７の予め凍結した生存ヒトＰＢＭＣにおいて、腹腔内注射によりマウスに移行した。１００ｕｌのＰＢＳ中の１００ｕｇの抗ヒトＩＦＮｇ及び１００ｕｇの抗ヒトＩＬ−１２抗体を、０日目及び３日目にマウスに腹腔内注射した。１００ｎｇの組換えヒトＩＬ−４を、１、２及び３日目にマウスに腹腔内注射した。細胞移行前の０日目及び３日目に、１００ｕＬのＰＢＳ中の２００ｕｇの抗ヒトＣＲＴｈ２抗体（クローン１９Ａ２、脱フコシル化）又は抗ブタクサアイソタイプコントロール抗体でマウスを処置した。すべてのマウスを７日目に安楽死させ、脾臓を収集した。ＦＡＣＳによる細胞内サイトカインレベルの評価のために、ＰｄＢｕ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）で３７℃で４．５時間、エクスビボで脾細胞を刺激した。抗ｈＣＤ４で細胞を表面染色し、同じチャネルにて抗ｍＣＤ４５、抗ｍＴｅｒ１１９及び抗ｈＣＤ１９で染色して、これらの系列陽性細胞を排除した。抗ｈＩＦＮｇ及び抗ｈＩＬ−４を使用して細胞を固定して染色した。
ＩＴ２細胞枯渇についてのモデル
ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおける自然Ｔヘルパー（ＩＴ）２型細胞の数を増やすために、５０μｇ／マウスのｐＲＫ５ベクター中のＩＬ−１７Ｅを、１．６ｍｌリンゲル液中で、ハイドロダイナミクスにより尾静脈に注射した。３日後に、腸間膜リンパ節細胞を収集し、抗ｍＣＤ１１７−ＰＥ、ＢＭ１６−Ａ６４７での染色によるフローサイトメトリーにより、系列陽性及び死細胞（ｌｉｎ：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＦｃｅＲＩ、ＣＤ１１ｃ、Ｇｒ１、ＮＫ１．１、Ｆ４／８０、ＤＸ５及びＣＣＲ３）を排除して、ＩＴ２細胞のパーセンテージ及び数を決定した。
結果
ＣＲＴｈ２は、喘息に付随する細胞上で発現される
ヒトＰＢＭＣからの細胞又は培養ヒト細胞上でのＣＲＴｈ２発現を、抗ヒトＣＲＴｈ２抗体（クローンＢＭ１６）を使用してフローサイトメトリーによって評価した（図１）。ＣＲＴｈ２は、最近報告されたように（Mjosberg, Nat. Imm. 12(11):1055-62 (2011)）、ヒト血液好塩基球、好酸球、極性化Ｔｈ２細胞、骨髄由来肥満細胞及び自然Ｔヘルパー２型（ＩＴ２）細胞上で選択的に発現される。ＣＲＴｈ２は、極性化Ｔｈ１細胞、好中球、樹状細胞、単球及び制御性Ｔ細胞上で発現されない。ＣＲＴｈ２発現は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞及び血小板上で検出されない（データは示さず）。
ＣＲＴｈ２細胞は、Ｔｈ２サイトカイン産生に付随する
Ｔｈ２サイトカイン産生に付随するＴ細胞部分集合上でＣＲＴｈ２が発現されることを評価するために、ＣＲＴｈ２＋及びＣＲＴｈ２−メモリーＣＤ４ Ｔ細胞をＦＡＣＳ選別し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体で刺激して、Ｔｈ２サイトカイン産生を評価した。ＣＲＴｈ２＋メモリーＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＲＴｈ２−メモリーＣＤ４ Ｔ細胞集団と比較した場合に、９５％を超えるメモリーＴ細胞Ｔｈ２サイトカインを産生した（図２）。試験した追加的なドナーは、同様の結果を示した。
抗ヒトＣＲＴｈ２抗体の生成及びインビトロ特徴づけ
抗ヒトＣＲＴｈ２抗体を、ヒトＣＲＴｈ２を過剰発現する３００．１９細胞でアジュバントを使用せずに免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスから生成した。
上記のように生成した抗ＣＲＴｈ２抗体は、ヒトＣＲＴｈ２を過剰発現する２９３細胞又は３００．１９細胞に用量依存的様式で結合したが、２９３又は３００．１９野生型細胞には結合しなかった（図３Ａ及び３Ｂ）。抗ヒトＣＲＴｈ２ Ａｂも、２９３又は３００．１９細胞において過剰発現されたカニクイザル又はアカゲザルＣＲＴｈ２との交差反応性について試験した。Ａｂはいずれも、２９３細胞で発現されたカニクイザルＣＲＴｈ２に対してわずかな交差反応性を示したクローン１９Ａ２以外はカニクイザル又はアカゲザルＣＲＴｈ２との反応性を示さなかった。抗ヒトＣＲＴｈ２抗体は、ヒト全血からの初代ヒト好塩基球及び好酸球とも用量依存的様式で反応した。２９３細胞又は３００．１９細胞の表面で過剰発現されたヒトＣＲＴｈ２と結合する能力、及びヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの初代好塩基球及び好酸球との相対的反応性に基づいて、候補抗ヒトＣＲＴｈ２抗体を選択した（図３）。上記の免疫化から生成された追加的な抗体はすべてヒトＣＲＴｈ２に結合したが、アカゲザル又はカニクイザルＣＲＴｈ２と交差反応しなかった（データは示さず）。ヒト化クローンｈ１９Ａ２．ｖ１及びクローンｈ１９Ａ２．ｖ１２も、２９３細胞又は３００．１９細胞で発現されたＣＲＴｈ２、並びに初代血液好塩基球及び好酸球上のＣＲＴｈ２との反応性について試験した。１９Ａ２と同様に、ヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ１は、２９３細胞（図３Ｄ）、３００．１９細胞（図３Ｅ）で発現されたヒトＣＲＴｈ２並びに初代血液好塩基球及び好酸球上のＣＲＴｈ２（図３Ｆ）と反応し、２９３又は３００．１９細胞で過剰発現されたカニクイザルＣＲＴｈ２とわずかな交差反応性を有した。ヒト化ｈ１９Ａ２．ｖ１は、過剰発現する２９３又は３００．１９細胞株上のアカゲザルＣＲＴｈ２、及び初代アカゲザル血液好塩基球と反応しなかった。対照的に、ヒト化及び操作抗体ｈ１９Ａ２．ｖ１２は、２９３細胞（図３Ｄ）又は３００．１９細胞（図３Ｅ）で発現されたヒト、カニクイザル及びアカゲザルＣＲＴｈ２、並びに初代血液好塩基球（図３Ｆ）上のヒト、カニクイザル及びアカゲザルＣＲＴｈ２と用量依存的様式で反応した。さらに、抗体ｈ１９Ａ２．ｖ１２は、初代ヒト血液好酸球上のＣＲＴｈ２も検出した。
相同の競合を使用する放射性標識されたリガンド解析を実施して、２９３細胞及び３００．１９細胞の表面で発現されたヒトＣＲＴｈ２に対する抗ＣＲＴｈ２抗体の解離定数（Ｋｄ）を評価した。ヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞に対するマウス抗ヒトＣＲＴｈ２クローン１９Ａ２及び８Ｂ１（ＩｇＧ全体）についてのＫＤ値は、それぞれ２ｎＭ及び２．６ｎＭであった。３００．１９細胞に対する抗体１９Ａ２のＫＤ値は、１０．２ｎＭであった（図４Ａ）。ヒト化抗体ｈ１９Ａ２．ｖ１２及びｈ１９Ａ２．ｖ６０のＫＤ値の直接的測定値を得るために、これらの抗体のＦａｂ断片を生成し、放射性リガンド細胞結合アッセイに供した（図４Ｂ）。ヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞に対するｈ１９Ａ２．ｖ１２及びｈ１９Ａ２．ｖ６０（ＩｇＧのＦａｂ断片）についてのＫＤ値は、それぞれ５１ｎＭ及び５６ｎＭであった。カニクイザルＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞に対するｈ１９Ａ２．ｖ１２及びｈ１９Ａ２．ｖ６０（ＩｇＧのＦａｂ断片）についてのＫＤ値は、それぞれ１５２ｎＭ及び３９ｎＭであった。これらの測定値に基づいて、ヒト対カニクイザルＣＲＴｈ２についての相対的結合親和性は、ｈ１９Ａ２．１２について３倍以内であり、ｈ１９Ａ２．ｖ６０について能力がほぼ等しいと見られた（図４Ｂ）。
ヒト化抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２及びｈ１９Ａ２．ｖ４６のＫＤ値の直接的測定値を得るために、これらの抗体のＦａｂ断片を生成し、放射性リガンド細胞結合アッセイに供した（図１５）。ヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞に対するｈ１９Ａ２．ｖ５２及びｈ１９Ａ２．ｖ４６（ＩｇＧのＦａｂ断片）についてのＫＤ値は、それぞれ１３．７ｎＭ及び６．４ｎＭであった。カニクイザルＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞に対するｈ１９Ａ２．ｖ５２及びｈ１９Ａ２．ｖ４６（ＩｇＧのＦａｂ断片）についてのＫＤ値は、それぞれ２１．３ｎＭ及び８．６ｎＭであった。
抗ＣＲＴｈ２抗体のブロッキング機能を評価するために、抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体の存在下で、リガンドプロスタグランジン（ＰＧＤ２）へのインビトロ極性化Ｔｈ２細胞のカルシウム動員を調べた。ＰＧＤ２へのカルシウムフラックスは、８Ｂ１及び３Ｃ１２との細胞のプレインキュベーションにより完全に妨げられたが、３１Ａ５は部分的作用を示した。抗ＣＲＴｈ２ １９Ａ２抗体とのインキュベーションは、ＣＡ２＋フラックスに顕著に影響せず（図５）、１９Ａ２が、ＣＲＴｈ２の機能をブロックできる８Ｂ１及び３Ｃ１２とは対照的に、ＣＲＴｈ２に対する非ブロッキング抗体であることを示す。
ヒトＣＲＴｈ２のトランスジェニックマウスモデルの生成
抗ＣＲＴｈ２抗体のインビボ枯渇能力の特徴を明らかにするために、ＢＡＣベクター上のヒトＣＲＴｈ２遺伝子をＣ５７ＢＬ／６受精卵母細胞に導入することによって、トランスジェニックマウスモデル（ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウス）を生成した（図６Ａ）。血液好塩基球及び好酸球上のヒトＣＲＴｈ２発現が７つの創始体で確認されたが、ｈＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．ｔｇ系統におけるマウスＴｈ２細胞上のｈＣＲＴｈ２発現は検出できなかった。３つの代表的な創始系統を、より詳細な解析に供した（データは示さず）。ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスの創始系統８５は、初代ヒト血液好塩基球及び好酸球並びに骨髄由来ヒト肥満細胞と比較した場合に、それぞれマウス血液好塩基球及び好酸球並びに腹腔肥満細胞上のヒトＣＲＴｈ２の同様の発現量を示した（図６Ｂ）。よって、創始８５ ｈＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスを、その後のすべてのインビボ枯渇研究において使用した。さらに、創始系統８５は、ＰＢＭＣからのヒトＩＴ２細胞上での発現と比較した場合に発現量がより低いように見られたが、マウス自然Ｔヘルパー（ＩＴ）２型細胞上でヒトＣＲＴｈ２を発現した（図６Ｂ）。
抗ＣＲＴｈ２抗体は、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて血液好塩基球及び好酸球を枯渇させた
抗ＣＲＴｈ２抗体がＣＲＴｈ２＋好塩基球及び好酸球をインビボで枯渇させることができるかどうかを試験するために、１９Ａ２又は３Ｃ１２抗体の何れかを１回、示すようにＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスに投与した（図７Ａ）。単回用量の１９Ａ２又は３Ｃ１２は、処置後３日目に、フローサイトメトリーによって決定される、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおける末梢血中の好塩基球及び好酸球を完全に枯渇させた（図７Ａ）。好塩基球及び好酸球の顕著な枯渇は、処置後７日目でまだ観察された。８Ｂ１及び１９Ａ２抗体も、処置後６日目に評価して、単回用量の抗体の後に血液からの好塩基球及び好酸球を枯渇させた（図７Ｂ）。
抗ＣＲＴｈ２抗体は、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．ＴｇマウスにおけるＴＮＰ−ＯＶＡ誘導慢性喘息モデルにおいて肺中の好酸球及び好塩基球を枯渇させる
抗ＣＲＴｈ２抗体が組織中のＣＲＴｈ２＋細胞を枯渇させることができるかどうかを評価するために、抗ＣＲＴｈ２抗体処置の効果をＴＮＰ−ＯＶＡ誘導慢性喘息モデルにおいて調べた。ｉ．ｐ．２００ｕｇ／マウスの治療レジメンでの４回の抗体１９Ａ２の投与は、肺好酸球及び好塩基球を完全に枯渇させ、肺肥満細胞も８０％枯渇させた（図８）。さらに、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球は、１００％枯渇された。さらに、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＴｈ２サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１３は、それぞれ１００％及び４８％低減した（図８Ｂ）。
抗ＣＲＴｈ２抗体は、ＳＣＩＤマウスにおけるＴｈ２サイトカイン産生細胞を枯渇させる
ヒトＣＲＴｈ２発現はヒトＣＲＴｈ２．ＴｇマウスにおけるＴｈ２細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４４ｈｉ）上で検出されないので、Ｔｈ２細胞枯渇は、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて評価できなかった。抗ＣＲＴｈ２抗体がＴｈ２サイトカイン産生細胞をインビボで枯渇させることができるかどうかを評価するために、インビトロ極性化ヒトＴｈ２細胞をＳＣＩＤマウスに移行し、抗ＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロールＡｂで週２回処置し、ＩＬ−４産生細胞を、投与開始後７日目のＰＭＡ及びイオノマイシンでのエクスビボ刺激の後に評価した。細胞内ＩＬ−４染色は、９２％のＩＬ−４産生細胞が１９Ａ２抗ＣＲＴｈ２抗体処置で枯渇されたが、ＩＦＮｇ産生細胞は低減しなかったことを示した（図９Ａ）。
抗ＣＲＴｈ２は、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて自然２型細胞を枯渇させる
自然２型（ＩＴ２）細胞（自然リンパ性２型細胞又はＩＬＣ２細胞とも称する）を枯渇させる抗ＣＲＴｈ２抗体の能力を評価するために、ｈＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．ＴｇマウスへのＩＬ−１７Ｅ含有プラスミドの注射により、ＩＴ２細胞数を増加させた。単回用量の抗ｈＣＲＴｈ２又はアイソタイプコントロール抗体でマウスをｉ．ｖ．処置し、腸間膜リンパ節において、フローサイトメトリーによって、処置後３日目にＩＴ２細胞のパーセンテージ及び数を検出した。抗ｈＣＲＴｈ２処置は、ｈＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおける腸間膜リンパ節ＩＴ２細胞のパーセンテージ及び数を５０％を超えて顕著に低減した。
実施例２．抗体ヒト化及び親和性成熟
哺乳動物細胞におけるビオチン化ＣＲＴｈ２の発現
ヒト、カニクイザル及びアカゲザルＣＲＴｈ２ ｃＤＮＡ並びにＱ１６Ｅ又はＲ１９Ｈ変異を有するヒトＣＲＴｈ２を、哺乳動物発現ベクターｐＲＫ５に、リンカー及びＡｖｉタグ配列（ＧＳＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨ）をコードする配列に対して３’端にインフレームで融合してクローニングした。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＢｉｒＡビオチンリガーゼ遺伝子も哺乳動物発現ベクターｐＲＫ５にクローニングした。それぞれの種からのＣＲＴｈ２をコードするプラスミドを、９：１の比でＢｉｒＡ発現プラスミドと混合し、１０％胎児ウシ血清を含有し、１０μＭビオチンを補ったダルベッコ改変イーグル培地中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後２４時間で収集し、ビオチン化ＣＲＴｈ２を含有する細胞膜画分を精製した。
細胞膜画分の精製
トランスフェクトされた細胞（２．５×１０８）を、プロテアーゼ阻害剤カクテルミックス（Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中で２回洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。細胞を解凍し、４ｍｌの溶解バッファー（プロテアーゼ阻害剤ミックスを含む１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４）に再懸濁し、ぴったり密着する乳棒を使用して８回の動作でＤｏｕｎｃｅホモジナイザーにおいて溶解した。最初の溶解の後に、５００ｍＭスクロースを含む４ｍｌの溶解バッファーを加え、ぴったり密着する乳棒を使用して８回の動作でさらにホモジナイズした。１０分間７７０×ｇの遠心分離によって細胞破片を除去し、１７，０００×ｇの遠心分離によって上清中の膜物質をペレットにした。ペレットにした膜を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーにおいて緩く密着する乳棒を使用して８回の動作で２５０ｍＭスクロースを含む６ｍｌの溶解バッファーに再懸濁した。７７０×ｇで１０分間の遠心分離により大きい破片を除去した。半透明のＳＷ４０遠心管中の１．１２Ｍスクロースを含む４ｍｌの溶解バッファーに上清を注意して載せ、ＳＷ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で２５，０００ｒｐｍで１時間４℃で回転させた。高濃度及び低濃度スクロース画分の間の接触面の物質をピペットで回収し、スクロースを含まない等容量の溶解バッファーと混合し、１６，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によってペレットにした。ペレットにした細胞膜を、１ｍｌの溶解バッファーに再懸濁し、−８０℃で貯蔵した。すべてのホモジナイゼーションステップは、氷上で実施した。
昆虫細胞からのＣＲＴｈ２の発現及び精製
タンパク質発現：ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＣＲＴｈ２のＡｌａ３−Ａｓｐ３３０をコードするＤＮＡを、Ｃ末端Ａｖｉタグ及びＨｉｓ８タグを含む改変ｐＡｃＧＰ６７バキュロウイルス移行ベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。組換えバキュロウイルスは、ＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ発現系（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｐＡｃＧＰ６７コンストラクト及び直線化バキュロウイルスＤＮＡでＳｆ９細胞をコトランスフェクトすることによって生成した。ウイルスは、３回の増幅によって得た。タグ化していない大腸菌ＢｉｒＡ（Ｍｅｔ１−Ｌｙｓ３２１）を発現する組換えバキュロウイルスを、同様にして得た。４０ｍＬの両方のウイルス（ＣＲＴｈ２及びＢｉｒＡ）を使用して、２×１０６細胞／ｍＬの密度の１０ＬのＴｎｉ．ＰＲＯ細胞に同時感染させた。細胞を４８時間２７℃でさらに増殖させ、遠心分離によって培地から除去した。
タンパク質精製：収集した細胞ペレットをマイクロフルイダイザーに３回通すことにより、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２００ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）に再懸濁して溶解した。溶解物を清澄化した後に、４５Ｔｉ超遠心ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で２時間４℃で４０Ｋの遠心分離によって、膜を収集した。３０グラムの膜ペレットをＴＢＳ（１０ｇ／Ｌ）に再懸濁し、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して２時間４℃で可溶化した。清澄化の後に、試料をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）に一括結合させ、１５ｍＭイミダゾールを含む０．１２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ジギトニン（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＴＢＳで洗浄した。３００ｍＭイミダゾールを含む同じバッファーでタンパク質を溶出し、イミダゾールを含まないＴＢＳ−ジギトニン（０．１２％）バッファー中で、１００ＭＷＫＯスピン濃縮器を４℃（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で使用して、５回濃縮及び希釈した。ビオチン化ＣＲＴｈ２タンパク質濃度は、タンパク質標準物質との比較によって見積もった。試料を分割し、液体窒素中で瞬間凍結した。
可溶化ＣＲＴｈ２を使用するＥＬＩＳＡ
ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）で一晩４℃で９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（１０ｍＭ炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中で２μｇ／ｍｌ、ウェルあたり１００μｌ）を被覆し、０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ブロッキングバッファー）でブロックした。ＣＲＴｈ２を含む細胞膜又はコントロール膜タンパク質又は精製ＣＲＴｈ２をブロッキングバッファーで希釈し、１％ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）中に１５分間氷上で溶解し、１６，０００×ｇ、４℃で３０分間の遠心分離によって、不溶性物質を除去した。可溶化ＣＲＴｈ２又はコントロール膜タンパク質を、０．２％ＤＤＭを含むブロッキングバッファーで希釈し、ニュートラアビジン被覆プレートに加えた。タンパク質を１０分間インキュベートし、プレートを０．０５％ＤＤＭを含むＰＢＳで洗浄した。０．２％ＤＤＭを含むブロッキングバッファーで抗体を系列希釈し、捕捉抗原と１時間４℃でインキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、０．２％ＤＤＭを含むブロッキングバッファーで希釈したペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ヒト又は抗マウスＩｇＧをプレートに加えた。３０分間４℃でのインキュベーションの後に、プレートを上記のように洗浄し、ＴＭＢ基質をプレートに加えた。等容量の１Ｍリン酸でペルオキシダーゼ反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。使用したＣＲＴｈ２タンパク質の量は、組換えヒト、カニクイザル及びアカゲザルＣＲＴｈ２に結合する抗ＣＲＴｈ２ Ｍａｂを使用するＥＬＩＳＡにより決定される、ウェルの飽和を達成するために十分であった。
抗体ヒト化
Ｍａｂ １９Ａ２のＣＤＲ配列（図１０）を、オリゴヌクレオチド指向性部位突然変異誘発により、コンセンサスカッパ１（コンセンサスＫ１）及びコンセンサスＶＨ３（コンセンサスＨ３）フレームワークにグラフト化した（Dennis, M.S. (2010). CDR repair: A novel approach to antibody humanization. In Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, S.J. Shire, W. Gombotz, K. Bechtold-Peters及びJ. Andya編(Springer, New York), pp. 9-28）。親のマウスの１９Ａ２抗体に存在する軽鎖（カバット番号付け系）の位置７１及び重鎖の位置４９のフレームワーク残基も、ヒト化抗体ｈｕ１９Ａ２．ｖ１のフレームワーク位置に組み込んだ（図１１Ａ及び１１Ｂ）。Ｍａｂ ８Ｂ１のＣＤＲ配列（図１２）を、オリゴヌクレオチド指向性部位突然変異誘発により、コンセンサスＫ１及びコンセンサスＶＨ１（コンセンサスＨ１）フレームワークにグラフト化した。親のマウスの８Ｂ１抗体に存在する軽鎖の位置４６、６６、６９及び７１並びに重鎖の位置３７、６７、６９、７１及び９１のフレームワーク残基も、ヒト化抗体ｈｕ８Ｂ１．ｖ１のフレームワーク位置に組み込んだ（図１２）。すべての抗体をｐＲＫ５ベクターにクローニングした。ヒト化抗体を２９３Ｔ細胞においてヒトＩｇＧ１と同様に発現させ、プロテインＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅでアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Ｍａｂの結合は、ヒト、カニクイザル及びアカゲザルＣＲＴｈ２を使用してＥＬＩＳＡにより決定した。
親和性成熟
バクテリオファージＭ１３のｐ３タンパク質に融合したＦａｂ断片を提示するファージディスプレイベクターに、ｈｕ１９Ａ２．ｖ１の重鎖及び軽鎖可変領域をクローニングした。軽鎖又は重鎖の３つのＣＤＲすべてが除去され、停止コドンをコードする配列で置き換えられた、２セットの「停止」鋳型ベクターを準備した。オリゴヌクレオチド指向性部位突然変異誘発により、無作為重鎖又は軽鎖ＣＤＲを有するライブラリーを作出した。各オリゴヌクレオチドがＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ、Ｋ＝Ｔ又はＧ）として無作為化された１コドンを有するオリゴヌクレオチドを各ＣＤＲについて合成した。軽鎖のＫａｂａｔ位置２７−３４、５０−５６及び８９−９７を２４オリゴヌクレオチドのセットで無作為化し、Ｋａｂａｔ位置２６−３５、４９−５８及び９５−１００ａを２８オリゴヌクレオチドのセットで無作為化した。無作為化ライブラリーを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にエレクトロポレーションし、細胞あたり１０粒子形成単位の感染多重度で突然変異体ヘルパーファージＫＯ７＋（Lamboyら, ChemBioChem 9: 2846-2852 (2008））に感染させ、回復させ、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン及び１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ＹＴブロスで３７℃で一晩増殖させた。細胞を遠心分離によって除去し、上清中のＦａｂを提示するファージを濃縮し、ＰＥＧ沈殿（ｒｅｆ）によって精製した。ファージを４回の選択に供した。各回では、０．２％ＤＤＭを含むブロッキングバッファー中のファージを、野生型配列又はＱ１６Ｅ若しくはＲ１９Ｈ変異を有し、ニュートラアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合したＤＤＭ可溶化ヒトＣＲＴｈ２と１時間４℃でインキュベートした。０．０５％ＤＤＭを含むＰＢＳでプレートを洗浄し、１００μｌの０．１Ｎ ＨＣｌで１０分間ファージを溶出した。ファージを回収し、１／８容量の１Ｍ Ｔｒｉｓベースを加えることによりｐＨを中性にした。ファージは、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させるために使用し、上記のようにして増やした。４回目からのファージを使用して、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させ、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢに播種して、単離クローンを得た。クローンは、色素デオキシ鎖ターミネーター法によって配列決定し、各位置での変異を表にした。好ましい変異をヒト化ｈｕ１９Ａ２．ｖ１ヒトＩｇＧ１クローンに導入し、ＩｇＧをヒト２９３Ｔ細胞で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ヒト、アカゲザル及びカニクイザルＣＲＴｈ２へのＩｇＧの結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した。軽鎖変異Ｓ３１Ｗ及び重鎖変異Ｙ５８Ｄを含むｈｕ１９Ａ２．ｖ１２に基づいて、第２世代のライブラリーを作出した。この第２世代のライブラリーは、Ｓｆ９細胞で発現された精製ヒト及びカニクイザルＣＲＴｈ２抗原、及びＤＤＭの代わりに０．１２％ジギトニンを選択において使用した以外は上記と同様にして選択した。さらに、重鎖の位置３１を、その位置に、組み合わせでトリプトファン及びシステイン以外のすべてのアミノ酸をコードする縮重コドンＮＨＫ及びＶＮＫを有する２つのオリゴヌクレオチドで無作為化した。軽鎖の位置３１のトリプトファンは、ヒト化１９Ａ２．ｖ５８、１９Ａ２．ｖ６０及び１９Ａ２．ｖ５２においてチロシンに変えた。１９Ａ２．ｖ４６は、位置３１にチロシンでなくトリプトファンを含む以外は、１９Ａ２．５２と同一の配列である。位置５６のアスパラギン酸は、１９Ａ２．ｖ６０及び他のクローンにおいてグルタミン酸に変化させ、異性化部位を除去した。
マウス及びヒト化抗ヒトＣＲＴｈ２抗体の生成及びインビトロ特徴づけ
２９３細胞で発現されたヒトＣＲＴｈ２との反応性について、ヒト化クローンｈ１９Ａ２．ｖ１、ｈ１９Ａ２．ｖ４６及びｈ１９Ａ２．ｖ５２を試験した。１９Ａ２と同様に、ヒト化抗ＣＲＴｈ２抗体は、２９３細胞で発現されたヒトＣＲＴｈ２と用量依存的様式で反応した（図１５Ａ）。さらに、ヒト化親和性成熟クローンｈ１９Ａ２．ｖ１２、ｈ１９Ａ２．ｖ４６及びｈ１９Ａ２．ｖ５２も、２９３細胞で発現されたカニクイザル及びアカゲザルＣＲＴｈ２と用量依存的反応性を示したが、ヒト化抗体ｈ１９Ａ２．ｖ１は、２９３細胞で発現されたカニクイザル及びアカゲザルＣＲＴｈ２と反応性を示さなかった（図１５Ｂ）。さらに、ヒト化及び親和性成熟抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２は、全血からのヒト、カニクイザル及びアカゲザル好塩基球及び好酸球と用量依存的様式で反応した（図１５Ｃ）。
相同の競合を使用する放射性標識されたリガンド解析を実施して、２９３細胞の表面で発現されたヒト及びカニクイザルＣＲＴｈ２に対する抗ＣＲＴｈ２抗体の解離定数（ＫＤ）を評価した。ヒト化抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２及びｈ１９Ａ２．ｖ４６のＫＤ値の直接的測定値を得るために、これらの抗体のＦａｂ断片を生成した（図１６）。ヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞に対するヒト化抗ＣＲＴｈ２クローン１９Ａ２．ｖ５２及び１９Ａ２．ｖ４６（ＩｇＧのＦａｂ断片）についてのＫＤ値は、それぞれ１３．７ｎＭ及び６．４ｎＭであった。カニクイザルＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞に対する１９Ａ２．ｖ５２及び１９Ａ２．ｖ４６（ＩｇＧのＦａｂ断片）についてのＫＤ値は、それぞれ２１．３ｎＭ及び８．６ｎＭであった。これらの測定値に基づいて、ヒト対カニクイザルＣＲＴｈ２についての相対的結合親和性は、ｈ１９Ａ２．５２について２倍以内であり（図１６Ａ及びＢ）、ｈ１９Ａ２．ｖ４６について能力がほぼ等しいと見られた（図１６Ｃ及びＤ）。
ヒト化及び親和性成熟抗ＣＲＴｈ２抗体のブロッキング機能を評価するために、ヒトＣＲＴｈ２を発現する２９３細胞におけるフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルのＰＧＤ２媒介阻害に対する抗ＣＲＴｈ２抗体の効果を試験した。フォルスコリンとＰＧＤ２とで刺激したｈＣＲＴｈ２発現２９３細胞を８Ｂ１抗体で処理すると、ｃＡＭＰレベルが用量依存的様式で増加した（図１７Ａ）。よって、８Ｂ１抗体は、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルのＰＧＤ２媒介減少を用量依存的様式でブロックしたが、このことは、ＰＧＤ２に応答したＴｈ２細胞中のカルシウムフラックスを阻害するその能力と同様に、８Ｂ１がＰＧＤ２機能ブロッキング能力を有することを示した。これに対して、ｈ１９Ａ２．ｖ５２は、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰヒトＣＲＴｈ２ ２９３細胞アッセイにおいてＰＧＤ２ブロッキング能力を示さなかった。抗ＣＲＴｈ２抗体がＰＧＤ２の非存在下でフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルに対して直接的な効果を有するかどうかも試験した。図１７Ｂに示すように、様々な濃度の抗ＣＲＴｈ２抗体は、ヒトＣＲＴｈ２ ２９３細胞におけるフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルに対して効果を示さず、このことは、これらの抗体がこのアッセイにおいてアゴニスト活性を示さないことを示した。これに対して、ＰＧＤ２は、フォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルを低減した。
抗ＣＲＴｈ２抗体１９Ａ２が血液、脾臓及び骨髄においてインビボでＣＲＴｈ２＋好塩基球及び好酸球を枯渇させることができるかどうかを試験するために、単回用量の１９Ａ２抗体を、示すように、ＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスに投与した（図１８Ａ及びＢ）。単回用量の２０ｕｇ／マウス又は１００ｕｇ／マウスの１９Ａ２は、フローサイトメトリーによって決定される、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて末梢血及び脾臓中の好塩基球及び好酸球を３日目に、並びに血液、脾臓及び骨髄中の好酸球を処置後７日目に完全に枯渇させた（図１８Ａ、Ｂ及びＣ）。好塩基球の顕著な枯渇も脾臓において処置後７日目に両方の用量レベルで観察されたが、骨髄における好塩基球枯渇は、１００ｕｇ／マウス用量を使用してより明白であった。血液中の好塩基球の枯渇は、処置後７日目に変動的であった。
ヒト化及び親和性成熟抗ＣＲＴｈ２抗体ｈ１９Ａ２．ｖ５２が血液、脾臓及び骨髄においてインビボでＣＲＴｈ２＋好塩基球及び好酸球を枯渇させることができるかどうかを試験するために、単回用量の０．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１９Ａ２．ｖ５２ ｈＩｇＧ１抗体をヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスに投与した（図１９Ａ）。単回用量の０．５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのｈ１９Ａ２．ｖ５２は、フローサイトメトリーによって決定される、ヒトＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．Ｔｇマウスにおいて末梢血、脾臓又は骨髄中の好酸球を２日目に完全に枯渇させた。７日目及び１４日目に、好酸球は、１０ｍｇ／ｋｇ用量で、脾臓（図１９Ｂ）及び骨髄（図１９Ｃ）において、並びに血液（図１９Ａ）において大量に、枯渇されたままであった。これに対して、０．５ｍｇ／ｋｇ用量では、好酸球は、血液、脾臓及び骨髄において、７日目に部分的に、及び１４日目に完全にベースラインに戻った。さらに、好塩基球の顕著な枯渇が、両方の用量レベルで脾臓において２日目に、及び１０ｍｇ／ｋｇ用量で７日目に観察されたが、骨髄における好塩基球枯渇は、両方の用量で２日目及び７日目にあまり明白でなかった。好塩基球のレベルは、０．５ｍｇ／ｋｇ用量で脾臓において７日目に、及び両方の用量で脾臓及び骨髄において１４日目にベースラインに戻った。
抗ＣＲＴｈ２抗体のエフェクター機能が組織内のＣＲＴｈ２＋細胞の効率的な枯渇のために必要であるかどうかを評価するために、自然免疫細胞枯渇、及びｈＣＲＴｈ２．Ｂａｃ．ＴｇマウスでのＴＮＰ−ＯＶＡ誘導慢性喘息モデルにおけるＴｈ２ ＢＡＬサイトカイン産生の低減に対するＦｃ突然変異体抗ＣＲＴｈ２ １９Ａ２＿ＤＡＮＡ抗体の効果を抗ＣＲＴｈ２ １９Ａ２と比較した。ｉ．ｐ．２００ｕｇ／マウスの治療レジメンでの４回の抗体１９Ａ２の投与は、肺好酸球、好塩基球及び肥満細胞をそれぞれ９６％、８６％及び７２％枯渇させた（図２０Ａ）。これに対して、１９Ａ２＿ＤＡＮＡ処置は、肺においてそれぞれ２６％、３４％及び３１％、好酸球、好塩基球及び肥満細胞を部分的にだけ低減した（図２０Ａ）。さらに、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の好酸球は、１９Ａ２処置で９９％枯渇されたが、１９Ａ２＿ＤＡＮＡ処置で１６％だけ枯渇された。さらに、ＢＡＬ液中のＴｈ２サイトカインＩＬ−４は、１９Ａ処置の後に１００％低減したが、１９Ａ２＿ＤＡＮＡ処置は、ＢＡＬ ＩＬ−４の２０％の低減だけを導いた（図２０Ｂ）。
表2.ヒト化19A2変異体のKabat CDR配列
表3.抗体mu8B1、hu8B1.v1、mu3C12及びmu31A5のKabat CDR配列
マウス抗体可変配列
ｍｕ１９Ａ２−軽鎖可変領域（配列番号４９）
ｍｕ１９Ａ２−重鎖可変領域（配列番号６１）
ｍｕ８Ｂ１−軽鎖可変領域（配列番号５０）
ｍｕ８Ｂ１−重鎖可変領域（配列番号６２）
ｍｕ３Ｃ１２−軽鎖可変領域（配列番号５１）
ｍｕ３Ｃ１２−重鎖可変領域（配列番号６３）
ｍｕ３１Ａ５−軽鎖可変配列（配列番号５３）
ｍｕ３１Ａ５−重鎖可変配列（配列番号６５）
ヒト化８Ｂ１可変領域配列
ｈｕ８Ｂ１．ｖ１−軽鎖可変領域（配列番号５２）
ｈｕ８Ｂ１．ｖ１−重鎖可変領域（配列番号６４）
ヒト化１９Ａ２可変領域配列
ｈｕ１９Ａ２．ｖ１−軽鎖可変領域（配列番号３８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ１２−軽鎖可変領域（配列番号３９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ３８−軽鎖可変領域（配列番号３９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ４６−軽鎖可変領域（配列番号３９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ４７−軽鎖可変領域（配列番号３９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５１−軽鎖可変領域（配列番号３９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５２−軽鎖可変領域（配列番号４０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５３−軽鎖可変領域（配列番号４０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５７−軽鎖可変領域（配列番号４１）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５８−軽鎖可変領域（配列番号４２）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６０−軽鎖可変領域（配列番号４１）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６１−軽鎖可変領域（配列番号４２）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６２−軽鎖可変領域（配列番号４１）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６３−軽鎖可変領域（配列番号４３）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６４−軽鎖可変領域（配列番号４２）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６５−軽鎖可変領域（配列番号４３）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６６−軽鎖可変領域（配列番号４４）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６７−軽鎖可変領域（配列番号４５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６８−軽鎖可変領域（配列番号４４）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６９−軽鎖可変領域（配列番号４５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７０−軽鎖可変領域（配列番号４６）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７１−軽鎖可変領域（配列番号４７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７２−軽鎖可変領域（配列番号４８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ１−重鎖可変領域（配列番号５４）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ１２−重鎖可変領域（配列番号５５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ３８−重鎖可変領域（配列番号５６）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ４６−重鎖可変領域（配列番号５７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ４７−重鎖可変領域（配列番号５８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５１−重鎖可変領域（配列番号５９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５２−重鎖可変領域（配列番号５７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５３−重鎖可変領域（配列番号５９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５７−重鎖可変領域（配列番号５９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５８−重鎖可変領域（配列番号５７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６０−重鎖可変領域（配列番号５７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６１−重鎖可変領域（配列番号５５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６２−重鎖可変領域（配列番号５５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６３−重鎖可変領域（配列番号５５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６４−重鎖可変領域（配列番号６０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６５−重鎖可変領域（配列番号６０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６６−重鎖可変領域（配列番号５５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６７−重鎖可変領域（配列番号５５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６８（配列番号６０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６９（配列番号６０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７０−重鎖可変領域（配列番号５４）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７１−重鎖可変領域（配列番号５４）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７２−重鎖可変領域（配列番号５４）
ヒト化１９Ａ２完全長配列
ｈｕ１９Ａ２．ｖ１−軽鎖（配列番号６６）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ１２−軽鎖（配列番号６７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ３８−軽鎖（配列番号６７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ４６−軽鎖（配列番号６７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ４７−軽鎖（配列番号６７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５１−軽鎖（配列番号６７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５２−軽鎖（配列番号６８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５３−軽鎖（配列番号６８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５７−軽鎖（配列番号６９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５８−軽鎖（配列番号７０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６０−軽鎖（配列番号６９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６１−軽鎖（配列番号７０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６２−軽鎖（配列番号６９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６３−軽鎖（配列番号７１）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６４−軽鎖（配列番号７０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６５−軽鎖（配列番号７１）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６６−軽鎖（配列番号７２）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６７−軽鎖（配列番号７３）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６８−軽鎖（配列番号７２）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６９−軽鎖（配列番号７３）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７０−軽鎖（配列番号７４）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７１−軽鎖（配列番号７５）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７２−軽鎖（配列番号７６）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ１−重鎖（配列番号７７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ１２−重鎖（配列番号７８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ３８−重鎖（配列番号７９）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ４６−重鎖（配列番号８０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ４７−重鎖（配列番号８１）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５１−重鎖（配列番号８２）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５２−重鎖（配列番号８０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５３−重鎖（配列番号８２）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５７−重鎖（配列番号８２）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ５８−重鎖（配列番号８０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６０−重鎖（配列番号８０）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６１−重鎖（配列番号７８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６２−重鎖（配列番号７８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６３−重鎖（配列番号７８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６４−重鎖（配列番号８３）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６５−重鎖（配列番号８３）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６６−重鎖（配列番号７８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６７−重鎖（配列番号７８）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６８−重鎖（配列番号８３）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ６９−重鎖（配列番号８３）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７０−重鎖（配列番号７７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７１−重鎖（配列番号７７）
ｈｕ１９Ａ２．ｖ７２−重鎖（配列番号７７）
ペリオスチン配列
ヒトペリオスチンアイソフォーム１ ＮＰ＿００６４６６（配列番号８７）
ヒトペリオスチンアイソフォーム２ ＮＰ＿００１１２９４０６（配列番号８８）
ヒトペリオスチンアイソフォーム３ ＮＰ＿００１１２９４０７（配列番号８９）
ヒトペリオスチンアイソフォーム４ ＮＰ＿００１１２９４０８（配列番号９０）
ヒトペリオスチンアイソフォーム５（配列番号９１）
理解を明瞭にする目的で、前述の発明を、例示及び例としてある程度詳細に記載したが、説明及び例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。本明細書で引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、その全内容が本明細書に参照により明確に援用される。

Claims (72)

  1. ヒトＣＲＴｈ２に結合し、治療有効量がヒト対象に投与された場合に、ＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる単離抗体。
  2. 以下の型のＣＲＴｈ２発現細胞：Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球又は自然２型（ＩＴ２）細胞のうち１つ又は複数を枯渇させる、請求項１に記載の抗体。
  3. ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善するように操作されている、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. ＡＤＣＣ活性を改善する、及び／又はＣＤＣ活性を低減するように操作されている、請求項１又は２に記載の抗体。
  5. 脱フコシル化されている、請求項１から４の何れか一項に記載の抗体。
  6. アルファ１，６−フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株で産生される、請求項５に記載の抗体。
  7. β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株で産生される、請求項５に記載の抗体。
  8. 細胞株が、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をさらに過剰発現する、請求項７に記載の抗体。
  9. ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善する少なくとも１つのアミノ酸置換をＦｃ領域に含む、請求項３に記載の抗体。
  10. アミノ酸置換が、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａである、請求項９に記載の抗体。
  11. 裸抗体である、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
  12. キメラである、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
  13. ヒト化されている、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
  14. ヒトである、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体。
  15. 二重特異性抗体である、請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体。
  16. ＩｇＧ１抗体である、請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体。
  17. 以下の抗体：１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５及び３Ｃ１２のうちの少なくとも１つのヒトＣＲＴｈ２への結合を競合的に阻害する、請求項１から１６の何れか一項に記載の抗体。
  18. ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、競合結合を決定する、請求項１７に記載の抗体。
  19. 以下の抗ＣＲＴｈ２抗体：１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５及び３Ｃ１２のうちの少なくとも１つが結合するＣＲＴｈ２エピトープと同じ又はオーバーラップするヒトＣＲＴｈ２のエピトープに結合する、請求項１から１８の何れか一項に記載の抗体。
  20. 以下の抗ＣＲＴｈ２抗体：１９Ａ２、８Ｂ１、３１Ａ５及び３Ｃ１２のうちの１つからの６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、請求項１から１９の何れか一項に記載の抗体。
  21. 非ヒト霊長類のＣＲＴｈ２に結合する、請求項１から１６の何れか一項に記載の抗体。
  22. アカゲザル及び／又はカニクイザルＣＲＴｈ２に結合する、請求項２１に記載の抗体。
  23. ＣＲＴｈ２シグナル伝達をさらにブロックする、請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体。
  24. プロスタグランジンＤ２に応答したＣＲＴｈ２発現細胞の動員を妨げる、請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体。
  25. ＣＲＴｈ２発現細胞におけるＣａ２＋フラックスをブロックする、請求項１から２２の何れか一項に記載の抗体。
  26. 約１００ｎＭ以下のＫｄ値でヒトＣＲＴｈ２に結合する、請求項１から２５の何れか一項に記載の抗体。
  27. 配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及びＸ１ＩＳＮＧＧＳＴＴＸ２ＹＰＧＴＶＥＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ１はＹ又はＲであり、Ｘ２はＹ又はＤである）を含む、請求項１に記載の抗体。
  28. 配列番号３５又は３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号３２又は３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項１に記載の抗体。
  29. 軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体であって、軽鎖及び重鎖可変領域が、６つの超可変領域（ＨＶＲ）配列：
    （ｉ）ＲＡＳＥＮＩＹＸＮＬＡ（配列番号１）を含むＨＶＲ−Ｌ１（式中、ＸはＳ、Ｗ又はＹである）、
    （ｉｉ）ＡＡＴＱＬＡＸ（配列番号２）を含むＨＶＲ−Ｌ２（式中、ＸはＤ、Ｅ又はＳである）、
    （ｉｉｉ）ＱＨＦＷＩＴＰＷＴ（配列番号３）を含むＨＶＲ−Ｌ３、
    （ｉｖ）Ｘ１ＹＸ２ＭＳ（配列番号４）を含むＨＶＲ−Ｈ１（式中、Ｘ１はＳ又はＦであり、Ｘ２はＳ、Ｌ又はＫである）、
    （ｖ）Ｘ１ＩＳＮＧＧＳＴＴＸ２ＹＰＧＴＶＥＧ（配列番号５）を含むＨＶＲ−Ｈ２（式中、Ｘ１はＹ又はＲであり、Ｘ２はＹ又はＤである）、及び
    （ｖｉ）ＨＲＴＮＷＤＦＤＹ（配列番号６）を含むＨＶＲ−Ｈ３
    を含む抗体。
  30. 軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体であって、軽鎖可変領域が、配列番号７、８又は９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０、１１又は１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体。
  31. 配列番号１３、１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域をさらに含む、請求項２９に記載の抗体。
  32. 配列番号１３、１４、１５、１６又は１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１８、１９、２０又は２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体。
  33. （ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
    （ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
    （ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
    （ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
    （ｖ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
    （ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
    を含む、請求項２９から３２の何れか一項に記載の抗体。
  34. （ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
    （ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
    （ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
    （ｉｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
    （ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
    （ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
    を含む、請求項２９から３２の何れか一項に記載の抗体。
  35. （ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
    （ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
    （ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
    （ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
    （ｖ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
    （ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
    を含む、請求項２９から３２の何れか一項に記載の抗体。
  36. 配列番号３８−５３からなる群から選択されるＶＬ配列を含む、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体。
  37. 配列番号５４−６５からなる群から選択されるＶＨ配列をさらに含む、請求項３６に記載の抗体。
  38. 配列番号５４−６５からなる群から選択されるＶＨ配列を含む、軽鎖及び重鎖可変領域を含む単離抗ＣＲＴｈ２抗体。
  39. 配列番号４０のＶＬ配列及び配列番号５７のＶＨ配列を含む、請求項３６から３８の何れか一項に記載の抗体。
  40. 配列番号３９のＶＬ配列及び配列番号５５のＶＨ配列を含む、請求項３６から３８の何れか一項に記載の抗体。
  41. 配列番号４１のＶＬ配列及び配列番号５７のＶＬ配列を含む、請求項３６から３８の何れか一項に記載の抗体。
  42. モノクローナル抗体である、請求項２９から４１の何れか一項に記載の抗体。
  43. ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項２９から４１の何れか一項に記載の抗体。
  44. フレームワーク配列の少なくとも一部が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である、請求項２９から４１の何れか一項に記載の抗体。
  45. Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｃ又は（Ｆａｂ’）２断片から選択される抗体断片である、請求項２９から４４の何れか一項に記載の抗体。
  46. 請求項１から４４の何れか一項に記載の抗体の抗原結合断片。
  47. 請求項１から４５の何れか一項に記載の抗体及び請求項４６に記載の抗原結合断片をコードする単離核酸。
  48. 請求項４７に記載の核酸を含む宿主細胞。
  49. 抗体が産生されるように請求項４８に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
  50. 宿主細胞によって産生された抗体を回収することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 請求項１から４５の何れか一項に記載の抗体又は請求項４６に記載の抗原結合断片及び細胞傷害剤を含むイムノコンジュゲート。
  52. 請求項１から４５の何れか一項に記載の抗体又は請求項４６に記載の抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  53. 喘息を治療するための方法であって、抗ＣＲＴｈ２抗体の有効量を対象に投与することを含み、抗体が、対象におけるＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる方法。
  54. 抗体が、以下の型のＣＲＴｈ２発現細胞：Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球又は自然２型（ＩＴ２）細胞のうちの１つ又は複数を枯渇させる、請求項５３に記載の方法。
  55. 抗ＣＲＴｈ２抗体が、ＣＲＴｈ２発現細胞を肺組織から枯渇させる、請求項５３又は５４に記載の方法。
  56. 抗ＣＲＴｈ２抗体が、ＣＲＴｈ２発現細胞を気管支肺胞洗浄液から枯渇させる、請求項５３から５５の何れか一項に記載の方法。
  57. 抗ＣＲＴｈ２抗体が、抗体の投与前のベースラインと比較して、少なくとも５０％の少なくとも１つの型のＣＲＴｈ２発現細胞を肺から枯渇させる、請求項５３から５５の何れか一項に記載の方法。
  58. 抗ＣＲＴｈ２抗体が、抗体の投与前のベースラインと比較して、少なくとも８０％の少なくとも１つの型のＣＲＴｈ２発現細胞を肺から枯渇させる、請求項５７に記載の方法。
  59. 抗ＣＲＴｈ２抗体が、抗体の投与前のベースラインと比較して、少なくとも９０％の少なくとも１つの型のＣＲＴｈ２発現細胞を肺から枯渇させる、請求項５７に記載の方法。
  60. 対象が、微量顆粒球性喘息に罹患している、請求項５３から５９の何れか一項に記載の方法。
  61. １種又は複数のサイトカインのレベルが、抗ＣＲＴｈ２抗体の投与後に対象において低下する、請求項５３から６０の何れか一項に記載の方法。
  62. 以下の細胞型：Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球又は自然２型（ＩＴ２）細胞のうちの少なくとも１つにより産生される１種又は複数のサイトカインのレベルが低下する、請求項６１に記載の方法。
  63. ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン又はロイコトリエンのうちの１種又は複数のレベルが、対象において低下する、請求項６１に記載の方法。
  64. 対象が、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト又はそれらの組み合わせにより適切に制御されない喘息に罹患している、請求項５３から５９の何れか一項に記載の方法。
  65. 対象が、ヒトである、請求項５３から６４の何れか一項に記載の方法。
  66. 抗ＣＲＴｈ２抗体が、請求項１から４５の何れか一項に記載の抗体又は請求項４６に記載の抗原結合断片である、請求項５３から６５の何れか一項に記載の方法。
  67. ＣＲＴｈ２発現細胞により媒介される障害を治療するための方法であって、抗ＣＲＴｈ２抗体の有効量を対象に投与することを含み、抗体が、対象におけるＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる方法。
  68. 障害が、喘息、微量顆粒球性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、急性又は慢性気道過敏症、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−ストラウス症候群、特発性肺線維症、サイトカインに関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する炎症、ＣＲＴｈ２発現細胞に関連する悪性腫瘍、慢性特発性じん麻疹、慢性自発性じん麻疹、物理的じん麻疹、寒冷じん麻疹、圧迫じん麻疹、水疱性類天疱瘡、鼻腔ポリポーシス、食物アレルギー及びアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
  69. 抗ＣＲＴｈ２抗体が、請求項１から４５の何れか一項に記載の抗体又は請求項４６に記載の抗原結合断片である、請求項６７又は６８に記載の方法。
  70. 対象におけるサイトカインのレベルを低減するための方法であって、抗ＣＲＴｈ２抗体の有効量を対象に投与することを含み、抗体が、対象におけるＣＲＴｈ２発現細胞を枯渇させる方法。
  71. ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ヒスタミン、及びロイコトリエンの１種又は複数のレベルが、対象において低下する、請求項７０に記載の方法。
  72. 抗ＣＲＴｈ２抗体が、請求項１から４５の何れか一項に記載の抗体又は請求項４６に記載の抗原結合断片である、請求項７０又は７１に記載の方法。
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