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JP2016500250A - 改変された分泌タンパク質及び方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書は栄養タンパク質を提供する。更に、タンパク質をコードする核酸、それらのタンパク質を生産する組換え型微生物、それらのタンパク質を発現するためのベクター、組換え型微生物を用いてそれらのタンパク質を作製する方法、それらのタンパク質を含む組成物、及びそれらのタンパク質の使用法を含む種々のその他の実施形態を提供する。栄養タンパク質は改変タンパク質を含み、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質のアミノ酸配列と比べて変化したアミノ酸配列を含む少なくとも２０アミノ酸の配列を含み、改変タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合が、参照分泌タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合より高い。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の少なくとも１つの必須アミノ酸残基置換を含む。

Description

関連出願の相互参照
本願は２０１３年１１月２０日付で提出された米国特許出願第６１／７２８，４２７号の優先権を主張するものであり、２０１３年３月１５日付で提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２３２号、２０１３年３月１５日付で提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２１８０号、２０１３年３月１５日付で提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２２５号、２０１３年３月１５日付で提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１８号、２０１３年３月１５日付で提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１２号、２０１３年３月１５日付で提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２０６号、及び２０１３年４月２９日付で提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３８６８２号に関連する。これらの開示全体を、ここであらゆる目的のために参照により援用する。
天然のタンパク質は異なる２０種類のアミノ酸、すなわちアラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、及びバリン（Ｖ）で構成される。消化中、摂取されたタンパク質はアミノ酸へと分解される。ほとんどの哺乳動物は必要とするアミノ酸の全ては合成できず、必須アミノ酸を食物から得る必要があるので、タンパク質はヒトの食事の重要な成分である。必須であるとされるアミノ酸はヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、及びバリン（Ｖ）である。
世界保健機関は、エネルギーが平衡状態にあり、体重が安定している時、食事性タンパク質がエネルギー摂取の約１０〜１５％に寄与することを推奨している。種々の国における平均１日タンパク質摂取量は、これらの推奨が世界中で消費されているタンパク質の量と一致していることを示している。エネルギー平衡状態で消費される時、平均２０〜３０％のエネルギーがタンパク質によるものである食事が典型的な高タンパク質食である。
植物性及び動物性の食物はどちらもタンパク質を含む。全ての必須アミノ酸を提供するタンパク質は「上質」タンパク質と呼ばれる。動物性食物、例えば肉、魚、鳥肉、卵、及び乳製品は全て上質タンパク質源である。これらの食物は、良好なバランスの必須アミノ酸を提供する。良好なバランスの必須アミノ酸を提供しないタンパク質は「低品質」タンパク質と呼ばれる。ほとんどの果物及び野菜は不十分なタンパク質源である。豆、エンドウマメ、レンズマメ、ナッツ等の一部の植物性食物及びコムギ等の穀物はより良いタンパク質源である。
カゼイン、乳清、及び大豆は主要なタンパク質源である。カゼインは哺乳動物の乳中に一般的に見られ、牛乳のタンパク質の８０％を構成し、人乳のタンパク質の２０〜４０％を構成する。カゼインはチーズの主成分でもある。乳清は、乳を凝固させて漉した後に残る液体であり、チーズ又はカゼインの製造の副産物でもある。大豆製品は、大豆から製造される植物性タンパク質である。大部分の植物性タンパク質は低品質タンパク質であるとみなされるが、大豆タンパク質は一部に上質タンパク質であると考えられており、多くの動物／乳清タンパク質に匹敵する。
ヒトにおいて多量のタンパク質を消費することの急性効果の研究により、食事にタンパク質を含めること及び場合により食事中のタンパク質含有量を増やすことが有益な効果を示し得ることが示されている。例えば、研究により、タンパク質は食後の満腹感を誘導できること（空腹を抑制することによるものを含む）、タンパク質食が熱産生を誘導すること、及びタンパク質食によって血糖反応が低減することが示されている。
減量のための高タンパク質食の慢性的利用の研究により、タンパク質はエネルギー消費及び除脂肪体重に良い影響を与えること、タンパク質に由来するエネルギーを少なくとも５％含む食事で過食による体重増加が有意に少なくなること、及び高タンパク質食がエネルギー摂取量を低減することが示されている。
臨床研究により、加齢又はベッド上療養による筋肉タンパク質喪失をタンパク質が防止することの証拠が示された。具体的には、長期のベッド上療養中、タンパク質補充後に筋線維合成速度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｒａｔｅ：ＦＳＲ）が上がり、タンパク質補充は、長期ベッド上療養中の脚の質量及び強度を維持し、タンパク質補充は除脂肪体重を増加させ、タンパク質補充は歩行及び平衡の機能的測定値を改善し、必須アミノ酸補充は、動けないこと又は長期ベッド上療養によりサルコペニアのリスクがある個人への実行可能な介入となり得る。
運動選手における筋肉タンパク質同化の増強に関する研究により、運動後に提供されたタンパク質が、運動のみによって達成されるよりも大幅に筋肥大を促進することが示された。更に、運動後に提供されたタンパク質が、タンパク質分解の増加なしにタンパク質合成を助け、その結果、正味で正のタンパク質平衡及び筋肉成長となることが示された。筋肉タンパク質合成は必須アミノ酸補充に用量反応的に反応するようであるが、全てのタンパク質が筋肉構築において同等であるわけではない。例えば、乳タンパク質は、レジスタンストレーニングによる筋肉成長の補助において大豆よりも優れているようであり、一方、どちらも炭水化物のみより優れている。アミノ酸ロイシンは筋肉タンパク質合成の刺激に重要な因子である。
食物中に一般的に見られる全タンパク質は必ずしもヒト等の哺乳動物のアミノ酸必要量に適合するアミノ酸組成を効率的に提供しない。したがって、各必須アミノ酸の最小必要量を得るために、食事性タンパク質の質がより高い場合に必要とされるよりも多量の総タンパク質を食事で消費しなければならない。食事中のタンパク質の質を向上させることにより、より低い質のタンパク質を含む食事と比べて、消費されなければならないタンパク質の総量を低減することができる。
一般的に、より高いタンパク質品質のタンパク質は、そうでない他のタンパク質よりも哺乳動物の食事において有益であるとされている。そのようなタンパク質は、例えば哺乳動物の食事の構成要素として、有用である。状況によっては、そのようなタンパク質は、とりわけ、筋肉量、健康的な肥満度指数、及び血糖バランスの維持を促進する。したがって、タンパク質品質の高いタンパク質源に対するニーズがある。
一般的に、より高いタンパク質品質のタンパク質は、そうでない他のタンパク質よりも哺乳動物の食事において有益であるとされている。そのようなタンパク質は、例えば哺乳動物の食事の構成要素として、有用である。状況によっては、そのようなタンパク質は、とりわけ、筋肉量、健康的な肥満度指数、及び血糖バランスの維持を促進する。したがって、タンパク質品質の高いタンパク質源に対するニーズがある。
理論的に、分岐鎖アミノ酸のうちの少なくとも１つ、及び必須アミノ酸を高い比率で含むポリペプチドを完全にインシリコで設計することができる。次いで、合成タンパク質をコードする核酸を合成することができ、核酸を含む組換え型微生物を、組換え型タンパク質の生産のために作製することができる。しかし、このアプローチには複数の潜在的欠点がある。例えば、当業者は、そのような合成配列の可溶性バージョン生産を高レベルで実現することが非常に困難であることを知っている。
一態様では、栄養ポリペプチド、及び栄養ポリペプチドを含む製剤が提供される。例えば、単離された栄養ポリペプチドであって、栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質における全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高く、栄養ポリペプチドが製剤中に栄養的量で存在し、製剤が、非食用生産物を実質的に含まない、栄養ポリペプチドが提供される。一実施形態では、１又は複数の必須アミノ酸は、栄養的量で製剤中に存在する。別の実施形態では、 栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する全必須アミノ酸の割合は、参照分泌タンパク質の全アミノ酸に対する全必須アミノ酸の割合よりも高い。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する単一の必須アミノ酸の割合が、参照分泌タンパク質における全アミノ酸に対する単一の必須アミノ酸の割合より高い。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する２つの必須アミノ酸の割合が、参照分泌タンパク質における全アミノ酸に対する２つの必須アミノ酸の割合より高い。別の実施形態では、参照分泌タンパク質は分泌酵素ポリペプチドを含む。例えば、単離された栄養ポリペプチドは、分泌酵素ポリペプチドの主な酵素活性のレベルが低減することができる。別の実施形態では、単離された栄養ポリペプチドは宿主細胞から実質的に精製されている。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの溶解度はｐＨ７で約１０ｇ／ｌを超える。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの溶解度は参照分泌タンパク質の溶解度より高い。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの消化率は、６０分未満の人工胃液消化半減期を有する。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの消化率は参照分泌タンパク質の消化率を超える。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの熱安定性は参照分泌タンパク質の熱安定性を超える。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの計算溶媒和スコアは−２０以下である。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの計算凝集スコアは０．７５以下である。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの溶解度及び消化率は参照分泌タンパク質の溶解度及び消化率を超える。別の実施形態では、栄養ポリペプチドは公知のアレルゲンに対する相同性が約５０％未満である。代表的な製剤は、製剤１ｋｇ当たり少なくとも１００ｇの濃度で少なくとも１．０ｇの栄養ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約５００ｍｌを超えない体積で液体、半液体、若しくはゲルとして又は約２００ｇを超えない質量で固体若しくは半固体として存在する。別の実施形態では、栄養ポリペプチドは組換え型生物中で生産される。別の実施形態では、栄養ポリペプチドは、栄養ポリペプチドをコードする組換え型核酸配列を含む単細胞生物によって生産される。別の実施形態では、製剤は、ヒト対象に消費された時に、タンパク質の基準１日摂取値の少なくとも約２％の栄養的利益を提供するか、満腹感を与えるのに充分な量で存在する。別の実施形態では、製剤は、１又は複数の必須アミノ酸の基準１日摂取値の少なくとも約２％の栄養的利益を提供する。別の実施形態では、製剤は、全必須アミノ酸の基準１日摂取値の少なくとも約２％の栄養的利益を提供する。別の実施形態では、製剤は少なくとも１０グラムの栄養ポリペプチドを提供する。製剤は好ましくは経腸投与用に製剤化される。別の実施形態では、（ｉ）栄養ポリペプチドは、栄養ポリペプチド又は参照分泌タンパク質の全長にわたって参照分泌タンパク質と少なくとも約９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の全体的配列同一性を有するか、（ｉｉ）栄養ポリペプチドは、参照分泌タンパク質のオルソログを含み、オルソログは、栄養ポリペプチド又は参照分泌タンパク質の全長にわたって参照分泌タンパク質と少なくとも約７０％の全体的配列同一性を有する。更に、本明細書中で提供される製剤を少なくとも約１グラム含む食品が提供される。別の実施形態では、製剤は、１００ｇ当たり、タンパク質の基準１日摂取値の少なくとも約２％以上の栄養的利益を提供する。別の実施形態では、栄養ポリペプチドの有効量は、ヒト対象に投与された時、参照分泌タンパク質の有効量より少ない。好ましい製剤は、界面活性剤、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、非食用のポリ酸若しくはポリオール、脂肪アルコール、アルキルベンジルスルホナート、アルキルグルコシド、又はメチルパラベンを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、味覚物質、ビタミン、ミネラル、若しくはその組合せ、香味剤若しくは非栄養ポリオール、又は栄養炭水化物及び／若しくは栄養脂質を更に含む。
別の態様では、単離された栄養ポリペプチドをコードする組換え型核酸配列を個々に含む組換え型単細胞生物であって、栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質の全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高い、組換え型単細胞生物が提供される。いくつかの実施形態では、栄養ポリペプチドは単細胞生物から分泌される。
更に、栄養生産物を製剤化する方法であって、有効量の単離された栄養ポリペプチドを含む組成物を用意するステップであって、栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質中の全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高く、栄養ポリペプチドが、組成物１グラム当たり少なくとも１ｍｇの栄養ポリペプチドの濃度で組成物中に存在するステップ及び組成物を少なくとも１つの食品成分と組み合わせることにより栄養生産物を製剤化するステップを含む、方法が提供される。例えば、食品成分は、香味剤、味覚物質、農業由来食品、ビタミン、ミネラル、栄養炭水化物、栄養脂質、結合剤、充填剤、又はその組合せを含み、栄養生産物は食用であり、栄養生産物は、栄養生産物１ｋｇ当たり少なくとも１００ｇの濃度で少なくとも１．０ｇの栄養ポリペプチドを含み、栄養生産物は、約５００ｍｌ超えない体積で液体、半液体、若しくはゲルとして又は約２００ｇ以下の質量で固体若しくは半固体として存在する。
更に、栄養組成物の利益を受け得るヒト対象に投与するための栄養組成物を選択する方法であって、対象における最小必須アミノ酸栄養必要量を特定すること、最小必須アミノ酸栄養必要量を満たすために必要な必須アミノ酸含有量スコアを計算すること、及び有効量の栄養ポリペプチドを含む、少なくとも必要な必須アミノ酸含有量スコアを有する栄養組成物を用意することを含む方法が提供される。
更に、栄養組成物の利益を受け得るヒト対象に投与するための栄養組成物を選択する方法であって、対象における最大必須アミノ酸栄養必要量を特定すること、最大必須アミノ酸栄養必要量を超えないために必要な必須アミノ酸含有量スコアを計算すること、及び有効量の栄養ポリペプチドを含み、必要な必須アミノ酸含有量スコアを超えることがない栄養組成物を用意することを含む、方法が提供される。
別の態様では、処置を必要とするヒト対象におけるタンパク質栄養不良を特徴とする又はこれにより悪化する疾患、障害、又は状態を処置する方法であって、そのような疾患、障害、又は状態を処置するのに充分な量で栄養製剤をヒト対象に投与するステップを含み、栄養製剤が、栄養ポリペプチド及び農業由来食品を含み、栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質中の全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高い、方法が提供される。一実施形態では、ヒト対象は高齢の対象である。別の実施形態では、ヒト対象は１８歳未満の子供である。別の実施形態では、ヒト対象は妊娠対象又は授乳中の女性対象である。別の実施形態では、ヒト対象は１８歳から約６５歳の成人である。別の実施形態では、ヒト対象は、肥満、糖尿病、又は循環器疾患に苦しむ又はそれを発症するリスクがある成人である。
更に、ヒト対象の栄養状態を改善する方法であって、農業由来食品及び単離された栄養ポリペプチドを含む有効量の栄養製剤を対象に投与することを含み、栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質中の全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高い、方法が提供される。
別の態様では、改変タンパク質を含む栄養ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質のアミノ酸配列と比べて変化したアミノ酸配列を含む少なくとも２０アミノ酸の配列を含み、改変タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合が参照分泌タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合より高い。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の少なくとも１つの必須アミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非分岐鎖アミノ酸残基の少なくとも１つの分岐鎖アミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非アルギニン（Ａｒｇ）又は非グルタミン（Ｇｌｕ）アミノ酸残基の少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）又はグルタミン（Ｇｌｕ）アミノ酸残基置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質の非ロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、Ｌｅｕ頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換はＬｅｕ頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は疎水性アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、アミノ酸１個当たりの位置エントロピーが少なくとも１．５のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。
改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも２つの非ロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸残基が、改変タンパク質においてＬｅｕアミノ酸残基で置換されており、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、位置エントロピーが少なくとも１．５の位置で参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも１つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも２つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＬｅｕアミノ酸残基置換のそれぞれに由来する参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｌｅｕ置換により生じる全自由フォールディングエネルギーが０．５以下の位置で参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも１つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも２つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＬｅｕアミノ酸残基置換のそれぞれに由来する参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非バリン（Ｖａｌ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＶａｌアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、Ｖａｌ頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、Ｖａｌ頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、アミノ酸１個当たりの位置エントロピーが少なくとも１．５のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質の間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。
改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも２つの非バリン（Ｖａｌ）アミノ酸残基が、改変タンパク質中ではＶａｌアミノ酸残基により置換されており、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、位置エントロピーが少なくとも１．５の位置で参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも１つのＶａｌアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質の間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも２つのＶａｌアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＶａｌアミノ酸残基置換のそれぞれに由来する参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｖａｌ置換による全自由フォールディングエネルギーが０．５以下である位置で参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも１つのＶａｌアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも２つのＶａｌアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＶａｌアミノ酸残基置換のそれぞれに由来する参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非イソロイシンＩｌｅアミノ酸残基の少なくとも１つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、Ｉｌｅ頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、Ｉｌｅ頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、アミノ酸１個当たりの位置エントロピーが少なくとも１．５のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。
改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも２つの非イソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基が改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基で置換されており、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下であり、各アミノ酸について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、位置エントロピーが少なくとも１．５の位置で参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも１つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも２つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＩｌｅアミノ酸残基置換のそれぞれに由来する参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｉｌｅ置換による全自由フォールディングエネルギーが０．５以下の位置で参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも１つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも２つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＩｌｅアミノ酸残基置換のそれぞれに由来する参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は天然タンパク質である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、適合微生物中で発現された時にその微生物から分泌される。いくつかの実施形態では、適合微生物は、参照分泌タンパク質を天然に生じる微生物と同じ属である。いくつかの実施形態では、微生物は従属栄養生物である。いくつかの実施形態では、微生物は光合成微生物である。いくつかの実施形態では、光合成微生物はシアノバクテリアである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質のアミノ酸配列は、参照分泌タンパク質と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％相同である。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非必須アミノ酸残基が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非分岐鎖アミノ酸残基が、改変タンパク質で分岐鎖アミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非Ｌｅｕアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非Ｖａｌアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非Ｉｌｅアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基により置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非分岐鎖アミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の５〜５０％、例えば、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、５〜４０％、５〜４５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１０〜３０％、１０〜３５％、１０〜４０％、１０〜４５％、１５〜２０％、１５〜２５％、１５〜３０％、１５〜３５％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜２５％、２０〜３０％、２０〜３５％、２０〜４０％、２０〜４５％、２５〜３０％、２５〜３５％、２５〜４０％、２５〜４５％、３０〜３５％、３０〜４０％、３０〜４５％、３５〜４０％、３５〜４５％、又は４０〜４５％が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基により置換されている。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、（ａ）改変栄養性タンパク質配列中に存在する全アミノ酸残基に対する分岐鎖アミノ酸残基の割合が少なくとも２６．３％であるか、（ｂ）改変栄養性タンパク質配列中に存在する全アミノ酸に対するＬｅｕ残基の割合が少なくとも１１．８％であるか、（ｃ）改変栄養性タンパク質配列中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸残基の割合が少なくとも５５．５％である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は各必須アミノ酸を含む。改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、及びＲｈｉｚｏｐｕｓから選択される属のメンバーに由来する。改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの種、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓの種、及びＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓの種から選択される微生物に由来する。改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、付録Ａに記載のタンパク質から選択されるタンパク質である。改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は配列番号１〜９から選択される。改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、セルロース結合ドメイン、炭水化物結合モジュール（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、及びヒドロホビンから選択されるフォールドのコンセンサス配列を含む。改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｑ４ＷＢＷ４、Ｑ９９０３４、Ａ１ＤＢＰ９、Ｑ８ＮＪＰ６、Ａ１ＣＵ４４、Ｂ０Ｙ８Ｋ２、Ｑ４ＷＭ０８、Ｑ０ＣＭＴ２、Ｑ８ＮＫ０２、Ａ１ＤＮＬ０、Ａ１ＣＣＮ４、Ｂ０ＸＷＬ３、Ｑ４ＷＦＫ４、Ａ２ＱＹＲ９、Ｑ０ＣＦＰ１、Ｑ５Ｂ２Ｅ８、Ａ１ＤＪＱ７、Ａ１Ｃ４Ｈ２、Ｂ０Ｙ９Ｇ４、Ｂ８ＭＸＪ７、Ｑ４ＷＢＵ０、Ｑ９６ＷＱ９、Ａ２Ｒ５Ｎ０、Ｑ２ＵＳ８３、Ｑ０ＣＥＵ４、Ｑ５ＢＣＸ８、Ａ１ＤＢＳ６、Ｑ９ＨＥ１８、Ｏ１４４０５、Ｐ６２６９４、Ｑ０６８８６、Ｐ１３８６０、Ｑ９Ｐ８Ｐ３、Ｐ６２６９５、Ｐ０７９８７、Ａ１Ｃ８Ｕ０、Ｂ０Ｙ９Ｅ７、Ｂ８ＮＩＶ９、Ｑ４ＷＢＳ１、Ｑ２Ｕ２Ｉ３、Ｑ５ＡＲ０４、Ａ１ＤＢＶ１、Ｂ０ＹＥＫ２、Ｂ８Ｎ７Ｚ０、Ａ４ＤＡ７０、Ａ２Ｒ２Ｓ６、Ｑ２ＵＩ８７、Ｑ０ＣＶＸ４、Ｑ５ＡＸ２８、Ａ１Ｄ９Ｓ３、Ａ１ＣＣ１２、Ｂ０Ｙ２Ｋ１、Ｑ４ＷＷ４５、Ｑ５ＡＱＺ４、Ｑ９９０２４、Ｐ２９０２６、Ｐ２９０２７、Ｐ６９３２８、Ｐ６９３２７、Ｐ３６９１４、Ｐ２３１７６、Ｐ２２８３２、Ａ２ＱＨＥ１、Ａ１ＣＲ８５、 Ｂ０ＸＰＥ１、Ｂ８ＮＲＸ２、Ｑ４ＷＪＪ３ 、Ｐ８７０７６、Ａ２ＲＡＬ４、Ｑ２ＵＵＤ６、Ｄ０ＶＫＦ５、Ｑ０ＣＴＤ７、Ｑ５Ｂ５Ｓ８、Ａ１Ｄ４５１、Ｂ８ＮＪＦ４、Ａ２ＱＰＫ４、Ｑ２ＵＮＲ０、Ｑ５ＡＵＷ５、Ｂ０Ｙ７Ｑ８、Ｂ８ＮＰ６５、Ｑ４ＷＭＵ３、Ｑ２ＵＮ１２、Ｑ０ＣＩ６７、Ｑ５Ｂ６Ｃ６、Ａ１ＤＭＲ８、Ｂ８ＮＭＲ５、Ｑ２Ｕ３２５、Ｑ０ＣＵＣ１、Ｑ５Ｂ０Ｆ４、Ａ１ＤＣ１６、Ａ１ＣＵＲ８、Ｂ０ＸＭ９４、Ｂ８ＮＰＬ７、Ｑ４ＷＬ７９、Ｑ２Ｕ９Ｍ７、Ｑ５Ｂ６Ｃ７、Ａ１ＤＰＧ０、Ａ１ＣＡ５１、Ｂ０Ｙ３Ｍ６、Ｂ８ＮＤＥ２、Ｑ４ＷＵ４９、Ａ２Ｒ９８９、Ｑ２Ｕ８Ｙ５、Ｑ０ＣＡＦ５、Ｑ５ＢＢ５３、Ａ１ＤＦＡ８、Ｂ０Ｙ８Ｍ８、Ｑ４ＷＬＹ１、Ｑ５ＡＶ１５、Ａ１ＤＮＮ８、Ｑ５ＢＡ１８、Ｂ０ＹＢ６５、Ｑ４ＷＧＴ３、Ｑ０ＣＥＦ３、Ｑ５Ｂ９Ｆ２、Ａ１ＤＣＶ５、Ｂ０ＸＰＢ８、Ｂ８Ｎ５Ｓ６、Ｑ４ＷＲ６２、Ａ５ＡＢＦ５、Ｑ２ＵＤＫ７、Ｑ０Ｃ７Ｌ４、Ｑ５ＡＷＤ４、Ａ１Ｄ１２２、Ｑ５Ｂ６８１、Ｑ５ＢＧ５１、Ａ１ＣＣＬ９、Ｑ０ＣＢ８２、Ｑ５ＡＴＨ９、Ｑ４ＡＥＧ８、Ｂ０ＸＰ７１、Ｂ８ＭＹＶ０、Ｑ４ＷＲＢ０、Ａ２ＱＡ２７、Ｏ０００８９、Ｑ２ＵＲ３８、Ｑ０ＣＭＨ８、Ｑ５ＢＡＳ１、Ｐ２９０２６、Ｐ２９０２７、Ｐ４８８２７、Ａ１ＣＩＡ７、Ｂ０Ｙ７０８、Ｐ３５２１１、Ｂ８Ｎ１０６、Ｐ２８２９６、Ｐ１２５４７、Ｑ００２０８、Ａ１ＣＷＦ３、Ｐ５２７５０、Ｐ５２７５４、Ｐ７９０７３、Ｐ５２７５５、Ｐ４１７４６、及びＰ２８３４６により識別されるタンパク質から選択される。本明細書中で提供される受け入れ番号により示される配列は、本願の出願日時点におけるデータベース中の配列である。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は配列番号１０〜１３から選択される。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、アフィニティー精製のためのポリペプチドタグを更に含む。いくつかの実施形態では、アフィニティー精製のためのタグはポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、アミノ酸１個当たりの正味の絶対電荷がｐＨ７で少なくとも０．０５である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、アミノ酸当たりの正味の絶対電荷がｐＨ７で少なくとも０．１０である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、アミノ酸当たりの正味の絶対電荷がｐＨ７で少なくとも０．１５である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、アミノ酸当たりの正味の絶対電荷がｐＨ７で少なくとも０．２０である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、アミノ酸当たりの正味の絶対電荷がｐＨ７で少なくとも０．２５である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質はｐＨ７で正味の正の電荷を有する。いくつかの実施形態では、改変タンパク質はｐＨ７で正味の負の電荷を有する。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は消化可能である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、ペプシン認識部位、トリプシン認識部位、及びキモトリプシン認識部位から選択されるプロテアーゼ認識部位を含む。
更なる態様では、本開示は、核酸（いくつかの実施形態では単離された核酸を含む）を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、本開示の改変タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、改変タンパク質をコードする核酸配列に機能可能に連結した発現調節配列を更に含む。
更なる態様では、本開示はベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示の改変タンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、改変タンパク質をコードする核酸配列に機能可能に連結した発現調節配列を更に含む。
更なる態様では、本開示は組換え型微生物を提供する。いくつかの実施形態では、組換え型微生物は、（ａ）本開示の改変タンパク質をコードする核酸及び（ｂ）本開示の改変タンパク質をコードする核酸を含むベクター、のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、組換え型微生物は原核生物である。いくつかの実施形態では、原核生物は従属栄養性である。いくつかの実施形態では、原核生物は独立栄養性である。いくつかの実施形態では、原核生物は細菌である。
更なる態様では、本開示は、本開示の組換え型改変タンパク質の製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、組換え型微生物による組換え型改変タンパク質の生産に充分な条件下で本開示の組換え型微生物を培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、培養から組換え型改変タンパク質を単離することを更に含む。いくつかの実施形態では、組換え型タンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態では、組換え型改変タンパク質は、培養された組換え型微生物により分泌され、分泌されたタンパク質は、培養培地から単離される。
更なる態様では、本開示は栄養組成物を提供する。いくつかの実施形態では、栄養組成物は、本開示の改変タンパク質及び少なくとも１つの第２の成分を含む。いくつかの実施形態では、第２の成分は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、遊離アミノ酸、炭水化物、脂肪、ミネラル又はミネラル源、ビタミン、及び賦形剤から選択される。いくつかの実施形態では、第２の成分はタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は改変タンパク質である。いくつかの実施形態では、第２の成分は、必須アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である。いくつかの実施形態では、第２の成分は、分岐鎖アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である。いくつかの実施形態では、第２の成分はＬｅｕである。いくつかの実施形態では、第２の成分はＶａｌである。いくつかの実施形態では、第２の成分はＩｌｅである。いくつかの実施形態では、第２の成分は賦形剤である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、滑沢剤、分散助剤、崩壊剤、香味剤、甘味剤、着色剤から選択される。いくつかの実施形態では、栄養組成物は、液体溶液、スラリー、懸濁液、ゲル、ペースト、粉末、又は固体として製剤化される。
更なる態様では、本開示は、栄養組成物の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、本開示の改変タンパク質を用意すること及び改変タンパク質を第２の成分と組み合わせることを含む。いくつかの実施形態では、第２の成分は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、遊離アミノ酸、炭水化物、脂肪、ミネラル又はミネラル源、ビタミン、及び賦形剤から選択される。いくつかの実施形態では、第２の成分はタンパク質である。いくつかの実施形態では、第２の成分は、必須アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である。いくつかの実施形態では、第２の成分は、分岐鎖アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である。いくつかの実施形態では、第２の成分はＬｅｕである。いくつかの実施形態では、第２の成分はＶａｌである。いくつかの実施形態では、第２の成分はＩｌｅである。いくつかの実施形態では、第２の成分は賦形剤である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、分散助剤、崩壊剤、香味剤、甘味剤、着色剤から選択される。いくつかの実施形態では、栄養組成物は、液体溶液、スラリー、懸濁液、ゲル、ペースト、粉末、又は固体として製剤化される。
更なる態様では、本開示は、対象における筋肉量、筋力、及び機能的能力のうちの少なくとも１つを維持又は増強する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、充分な量の本開示に係る改変タンパク質、本開示に係る栄養組成物、又は本開示に係る方法により作製された栄養組成物を対象に与えることを含む。いくつかの実施形態では、対象は、高齢者、医学的危篤状態（ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ−ｍｅｄｉｃａｌｌｙ ｉｌｌ）、及びタンパク質エネルギー栄養不良に苦しんでいるうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、本開示に係る改変タンパク質、本開示に係る栄養組成物、又は本開示に係る方法により作製された栄養組成物は、運動の実行とともに対象によって消費される。いくつかの実施形態では、本開示に係る改変タンパク質、本開示に係る栄養組成物、又は本開示に係る方法により作製された栄養組成物は、経口、経腸、又は非経口経路により対象によって消費される。
更なる態様では、本開示は、対象において望ましい肥満度指数を維持又は実現する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、充分な量の本開示の改変タンパク質、本開示の栄養組成物、又は本開示の方法により作製された栄養組成物を対象に与えることを含む。いくつかの実施形態では、対象は、高齢者、医学的危篤状態、及びタンパク質エネルギー栄養不良に苦しんでいるうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、本開示に係る改変タンパク質、本開示に係る栄養組成物、又は本開示に係る方法により作製された栄養組成物は、運動の実行とともに対象によって消費される。いくつかの実施形態では、本開示に係る改変タンパク質、本開示に係る栄養組成物、又は本開示に係る方法により作製された栄養組成物は、経口、経腸、又は非経口経路により対象によって消費される。
更なる態様では、本開示は、タンパク質エネルギー栄養不良である対象にタンパク質を与える方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、充分な量の本開示の改変タンパク質、本開示の栄養組成物、又は本開示の栄養組成物を対象に与えることを含む。いくつかの実施形態では、本開示に係る改変タンパク質、本開示に係る栄養組成物、又は本開示に係る方法により作製された栄養組成物は、経口、経腸、又は非経口経路により対象によって消費される。
更なる態様では、本開示は、改変タンパク質の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）参照分泌タンパク質を用意すること、（ｂ）タンパク質の栄養含有量を向上させるための変異のための参照分泌タンパク質のアミノ酸位置のセットを特定すること、及び（ｃ）標的アミノ酸置換を含む改変タンパク質を合成することを含む。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、及びＲｈｉｚｏｐｕｓから選択される属のメンバーに由来する。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの種、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓの種、及びＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓの種から選択される微生物に由来する。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は付録Ａに記載のタンパク質である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｑ４ＷＢＷ４、Ｑ９９０３４、Ａ１ＤＢＰ９、Ｑ８ＮＪＰ６、Ａ１ＣＵ４４、Ｂ０Ｙ８Ｋ２、Ｑ４ＷＭ０８、Ｑ０ＣＭＴ２、Ｑ８ＮＫ０２、Ａ１ＤＮＬ０、Ａ１ＣＣＮ４、Ｂ０ＸＷＬ３、Ｑ４ＷＦＫ４、Ａ２ＱＹＲ９、Ｑ０ＣＦＰ１、Ｑ５Ｂ２Ｅ８、Ａ１ＤＪＱ７、Ａ１Ｃ４Ｈ２、Ｂ０Ｙ９Ｇ４、Ｂ８ＭＸＪ７、Ｑ４ＷＢＵ０、Ｑ９６ＷＱ９、Ａ２Ｒ５Ｎ０、Ｑ２ＵＳ８３、Ｑ０ＣＥＵ４、Ｑ５ＢＣＸ８、Ａ１ＤＢＳ６、Ｑ９ＨＥ１８、Ｏ１４４０５、Ｐ６２６９４、Ｑ０６８８６、Ｐ１３８６０、Ｑ９Ｐ８Ｐ３、Ｐ６２６９５、Ｐ０７９８７、Ａ１Ｃ８Ｕ０、Ｂ０Ｙ９Ｅ７、Ｂ８ＮＩＶ９、Ｑ４ＷＢＳ１、Ｑ２Ｕ２Ｉ３、Ｑ５ＡＲ０４、Ａ１ＤＢＶ１、Ｂ０ＹＥＫ２、Ｂ８Ｎ７Ｚ０、Ａ４ＤＡ７０、Ａ２Ｒ２Ｓ６、Ｑ２ＵＩ８７、Ｑ０ＣＶＸ４、Ｑ５ＡＸ２８、Ａ１Ｄ９Ｓ３、Ａ１ＣＣ１２、Ｂ０Ｙ２Ｋ１、Ｑ４ＷＷ４５、Ｑ５ＡＱＺ４、Ｑ９９０２４、Ｐ２９０２６、Ｐ２９０２７、Ｐ６９３２８、Ｐ６９３２７、Ｐ３６９１４、Ｐ２３１７６、Ｐ２２８３２、Ａ２ＱＨＥ１、Ａ１ＣＲ８５、 Ｂ０ＸＰＥ１、Ｂ８ＮＲＸ２、Ｑ４ＷＪＪ３ 、Ｐ８７０７６、Ａ２ＲＡＬ４、Ｑ２ＵＵＤ６、Ｄ０ＶＫＦ５、Ｑ０ＣＴＤ７、Ｑ５Ｂ５Ｓ８、Ａ１Ｄ４５１、Ｂ８ＮＪＦ４、Ａ２ＱＰＫ４、Ｑ２ＵＮＲ０、Ｑ５ＡＵＷ５、Ｂ０Ｙ７Ｑ８、Ｂ８ＮＰ６５、Ｑ４ＷＭＵ３、Ｑ２ＵＮ１２、Ｑ０ＣＩ６７、Ｑ５Ｂ６Ｃ６、Ａ１ＤＭＲ８、Ｂ８ＮＭＲ５、Ｑ２Ｕ３２５、Ｑ０ＣＵＣ１、Ｑ５Ｂ０Ｆ４、Ａ１ＤＣ１６、Ａ１ＣＵＲ８、Ｂ０ＸＭ９４、Ｂ８ＮＰＬ７、Ｑ４ＷＬ７９、Ｑ２Ｕ９Ｍ７、Ｑ５Ｂ６Ｃ７、Ａ１ＤＰＧ０、Ａ１ＣＡ５１、Ｂ０Ｙ３Ｍ６、Ｂ８ＮＤＥ２、Ｑ４ＷＵ４９、Ａ２Ｒ９８９、Ｑ２Ｕ８Ｙ５、Ｑ０ＣＡＦ５、Ｑ５ＢＢ５３、Ａ１ＤＦＡ８、Ｂ０Ｙ８Ｍ８、Ｑ４ＷＬＹ１、Ｑ５ＡＶ１５、Ａ１ＤＮＮ８、Ｑ５ＢＡ１８、Ｂ０ＹＢ６５、Ｑ４ＷＧＴ３、Ｑ０ＣＥＦ３、Ｑ５Ｂ９Ｆ２、Ａ１ＤＣＶ５、Ｂ０ＸＰＢ８、Ｂ８Ｎ５Ｓ６、Ｑ４ＷＲ６２、Ａ５ＡＢＦ５、Ｑ２ＵＤＫ７、Ｑ０Ｃ７Ｌ４、Ｑ５ＡＷＤ４、Ａ１Ｄ１２２、Ｑ５Ｂ６８１、Ｑ５ＢＧ５１、Ａ１ＣＣＬ９、Ｑ０ＣＢ８２、Ｑ５ＡＴＨ９、Ｑ４ＡＥＧ８、Ｂ０ＸＰ７１、Ｂ８ＭＹＶ０、Ｑ４ＷＲＢ０、Ａ２ＱＡ２７、Ｏ０００８９、Ｑ２ＵＲ３８、Ｑ０ＣＭＨ８、Ｑ５ＢＡＳ１、Ｐ２９０２６、Ｐ２９０２７、Ｐ４８８２７、Ａ１ＣＩＡ７、Ｂ０Ｙ７０８、Ｐ３５２１１、Ｂ８Ｎ１０６、Ｐ２８２９６、Ｐ１２５４７、Ｑ００２０８、Ａ１ＣＷＦ３、Ｐ５２７５０、Ｐ５２７５４、Ｐ７９０７３、Ｐ５２７５５、Ｐ４１７４６、及びＰ２８３４６により識別されるタンパク質から選択されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は配列番号１〜９から選択される。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質は、セルロース結合ドメイン、炭水化物結合モジュール、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、及びヒドロホビンから選択されるフォールドのためのコンセンサス配列を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質の栄養含有量を向上させるための変異のための参照分泌タンパク質のアミノ酸位置の組を特定するステップは、参照分泌タンパク質の複数のアミノ酸位置についてのアミノ酸尤度（ＡＡＬｉｋｅ）、アミノ酸タイプ尤度（ＡＡＴＬｉｋｅ）、位置エントロピー（Ｓｐｏｓ）、アミノ酸タイプ位置エントロピー（ＳＡＡＴｐｏｓ）、フォールディングの相対的自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）、及び二次構造アイデンティティー（ＬｏｏｐＩＤ）から選択される少なくとも１つのパラメーターを決定することを含む。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質の複数のアミノ酸位置について２つ以上のパラメーターの組合せを決定し、パラメーターの組合せは以下から選択される：（Ａ）ＡＡｌｉｋｅ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｂ）ＡＡＴｌｉｋｅ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｃ）ＡＡｌｉｋｅ、ＡＡＴｌｉｋｅ、及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｄ）Ｓｐｏｓ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｅ）ＳＡＡＴｐｏｓ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｆ）ＬｏｏｐＩＤ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｇ）ＡＡｌｉｋｅ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ、（Ｈ）ＡＡｌｉｋｅ、ＡＡＴｌｉｋｅ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ、（Ｉ）ＡＡＴｌｉｋｅ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ、（Ｊ）Ｓｐｏｓ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ、並びに（Ｋ）ＳＡＡＴｐｏｓ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ。いくつかの実施形態では、方法は、それらのパラメーターに基づいて参照分泌タンパク質の複数のアミノ酸位置をランク付けすること及び少なくとも閾値のパラメーター値を有する位置のアミノ酸を変異させることを更に含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質はインビボで合成される。いくつかの実施形態では、改変タンパク質はインビトロで合成される。
Ａ． ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼタンパク質（配列番号１）中におけるアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図１Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図１Ｂは、図１Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図１Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図１Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼタンパク質（配列番号１）中における位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図２Ａでは、位置エントロピーは２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図２Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ａ． ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼタンパク質（配列番号１）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−β−１，４−グルカナーゼタンパク質（配列番号２）中におけるアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図４Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図４Ｂは、図４Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図４Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図４Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−β−１，４−グルカナーゼタンパク質（配列番号２）中の位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図５Ａでは、位置エントロピーは２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図５Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−β−１，４−グルカナーゼタンパク質（配列番号２）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒの１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼタンパク質（配列番号３）中におけるアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図７Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図７Ｂは、図７Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図７Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図７Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒの１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼタンパク質（配列番号３）中の位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図８Ａでは、位置エントロピーは２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図８Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ａ． ｎｉｇｅｒの１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼタンパク質（配列番号３）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−１，４−β−キシラナーゼタンパク質（配列番号４）中におけるアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図１０Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図１０Ｂは、図１０Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図１０Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図１０Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−１，４−β−キシラナーゼタンパク質（配列番号４）中の位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図１１Ａでは、位置エントロピーは２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図１１Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−１，４−β−キシラナーゼタンパク質（配列番号４）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒのセルロース結合ドメイン１（配列番号５）中のアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図１３Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図１３Ｂは、図１３Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図１３Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図１３Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒのセルロース結合ドメイン１（配列番号５）中の位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図１４Ａでは、位置エントロピーは２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図１４Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ａ． ｎｉｇｅｒのセルロース結合ドメイン１（配列番号５）中の各アミノ酸位置について野生型と比べたロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０（配列番号６）中のアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図１６Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図１６Ｂは、図１６Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図１６Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図１６Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０（配列番号６）中のアミノ酸尤度に基づくイソロイシン置換を示す図である。図１７Ａは、イソロイシン尤度に基づくイソロイシン置換を示しており、図１７Ｂは、図１７Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図１７Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくイソロイシン置換を示しており、図１７Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくイソロイシン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０（配列番号６）中のアミノ酸尤度に基づくバリン置換を示す図である。図１８Ａは、バリン尤度に基づくバリン置換を示しており、図１８Ｂは、図１８Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図１８Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくバリン置換を示しており、図１８Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくバリン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０（配列番号６）中の位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図１９Ａでは、位置エントロピーは２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図１９Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０（配列番号６）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０（配列番号６）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するイソロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０（配列番号６）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するバリン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０（配列番号６）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するアルギニン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ａ． ｎｉｇｅｒのグルコシダーゼフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号７）中におけるアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図２４Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図２４Ｂは、図２４Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図２４Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図２４Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ａ． ｎｉｇｅｒのグルコシダーゼフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号７）中の位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図２５Ａでは、位置エントロピーは２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図２５Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ａ． ｎｉｇｅｒのグルコシダーゼフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号７）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するロイシン置換変異自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩタンパク質（配列番号８）中のアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図２７Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図２７Ｂは、図２７Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図２７Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図２７Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩタンパク質（配列番号８）中における位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図２８Ａでは、位置エントロピーは、２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図２８Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩタンパク質（配列番号８）中の各アミノ酸位置の、野生型に対するロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩＩタンパク質（配列番号９）中におけるアミノ酸尤度に基づくロイシン置換を示す図である。図３０Ａは、ロイシン尤度に基づくロイシン置換を示しており、図３０Ｂは、図３０Ａのグラフの左端の拡大図を示している。図３０Ｃは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度に基づくロイシン置換を示しており、図３０Ｄは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ）尤度に基づくロイシン置換を示している。
Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩＩタンパク質（配列番号９）中における位置エントロピーに基づくロイシン置換を示す図である。図３１Ａでは、位置エントロピーは２０アミノ酸の完全なセットに基づいて計算されており、一方、図３１Ｂでは、位置エントロピーは同様な生物物理学的性質を有する５グループのアミノ酸、すなわち疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、その他［Ｇ、Ｐ、Ｃ］に基づいて計算されている。
Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩＩタンパク質（配列番号９）中の各アミノ酸位置の野生型に対するロイシン置換変異の自由フォールディングエネルギーを示す図である。
ＳＥＱＩＤ−４５００１及びＳＥＱＩＤ−４５０２９変異体の作製に用いたライブラリー構築戦略の模式図を示す図である。
図３４Ａ及び３４Ｂは、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩを用いた分泌スクリーニングの結果を示す図である。（Ａ）ヒット（目的のタンパク質ピークを矢印で示す）、陰性対照、及びタンパク質ラダーを示す電気泳動図。（Ｂ）タンパク質変異体の分泌を示す電気泳動図から作製されたシミュレートされたゲルイメージ（目的のタンパク質ピークが四角で囲まれている）。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ培養上清の抗ＦＬＡＧドットブロット分析の結果を示す図である。（Ａ）ＳＥＱＩＤ−４５０２９の特異的変異体をコードする発現ベクターで形質転換された単離物。四角は標準曲線を示す。（Ｂ）（Ａ）の陽性ウェルの定量化。ＳＥＱＩＤ−４５０２９は野生型分泌の陽性対照である。（Ｃ）ＳＥＱＩＤ−４５０２９変異体ライブラリーをコードする発現ベクターで形質転換された単離物。（Ｄ）標準曲線（四角）に基づく（Ｃ）の陽性ウェルの定量化。
単離物１８及び２７の発現カセットの配列多様性を示す図である。ダッシュの後の数字は特異的なサブクローンを示す。四角は、同一配列を示す。可変領域の外側に欠失が存在することを示唆するクローンをアスタリスクで示す。
付録の説明
本願は付録Ａ〜Ｄを含む。
付録Ａに参照分泌タンパク質の例を列挙する。
付録Ｂに、アンキリンリピート、ロイシンリッチリピート、テトラトリコペプチドリピート、アルマジロリピート、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、リポカリン様ドメイン、ノッチン、セルロース結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、プロテインＺのフォールド、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＷＷドメイン、チオレドキシン、ロイシンジッパー、植物ホメオドメイン、ｔｕｄｏｒドメイン、及びヒドロホビンから選択されるフォールド／ドメインを含む代表的タンパク質を記載する。
付録Ｃに、アミノ酸尤度を分析するためのマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）に用いたタンパク質を記載する。
付録Ｄに、実施例で分析したタンパク質及びポリペプチド配列の生理化学的性質の分析を示す。
詳細な説明
本明細書中で特に断りのない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は当業者に一般的に理解される意味を有する。更に、文脈から要求されない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。一般的に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法並びに技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられているものである。本明細書に引用されるある特定の参照文献及び他の文献は明示的に参照により本明細書に援用される。更に、本明細書に引用される全てのＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔの記録を参照により本明細書に援用する。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。材料、方法、及び実施例は説明のみを目的とし、限定的することを意図しない。
特に断りのない限り、本開示の方法及び技術は一般的に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って並びに種々の一般的な及び本明細書中に引用及び記載されているより具体的な参照文献に説明されているように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （２００１）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （１９９２， ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）； Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ （２００３）； Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ， Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．， Ｆｒｅｅｈｏｌｄ， Ｎ．Ｊ．； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ Ｉ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９７６）； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ ＩＩ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９７６）； Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９９）． Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （１８ｔｈ ｅｄ．） （１９９０）を参照されたい。シアノバクテリアに適用できる多くの分子生物学的及び遺伝学的技術が、参照により本明細書に援用するＨｅｉｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４９７， Ｃｈ． ２４ （２０１１）に記載されている。
本開示は、インターネット上に公開されている特定のタンパク質及び遺伝子の配列について、配列データベースエントリー（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔの記録）及び他のインターネット上の情報を参照する。当業者は、配列データベースのエントリーを含むインターネット上の情報が時々更新されること及び例えば特定の配列を参照するために用いられる参照番号が変わり得ることを理解している。インターネット上の配列情報又は他の情報の公開データベースを参照する場合、そのような変化が起こり得、インターネット上の情報の特定の実施形態は移り変わり得ると理解される。当業者はインターネット上でのサーチにより、等価な情報を見つけることができるので、インターネットウェブページアドレス又は配列データベースエントリーへの参照は、問題の情報が利用可能であり一般に広まっていることの証拠となる。全ての場合において、本明細書中で参照される配列データベースエントリーに含まれる配列情報は参照により本明細書に援用される。
本発明のタンパク質、組成物、方法、及び別の実施形態を開示及び説明する前に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないと理解されるべきである。明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈から明らかに否定されない限り、単数形は複数の参照対象を包含すると理解されることに留意しなければならない。
本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であり、包括的又は開放式（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、追加の記載されていないメンバー、要素、又は方法ステップを排除しない。
本開示はアミノ酸に言及する。アミノ酸の完全な名称は、それぞれの標準的な３文字及び１文字の略語と交換可能に使用される。疑いが生じないように、それらは以下の通りである：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
本明細書において、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、又は微生物）内でなく、人工的環境、例えば試験管又は反応容器中、細胞培養液中、ペトリ皿中等で起こる事象を指す。
本明細書において、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、又は微生物）内で起こる事象を指す。
本明細書において、「単離された」という用語は、（１）それが（自然の中で又は実験環境で）最初に生産された時に付随していた成分の少なくとも一部から分離された、並びに／又は（２）人の手によって生産、調製、及び／若しくは製造された、物質又は実体を指す。単離された物質及び／又は実体は、それらに最初に付随していたその他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書において、他の成分を実質的に含まない場合、物質は「純粋」である。
本明細書において、「分岐鎖アミノ酸」とは、ロイシン、イソロイシン、及びバリンから選択されるアミノ酸である。
本明細書において、「必須アミノ酸」とは、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、及びバリンから選択されるアミノ酸である。
本明細書において、「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば典型的には約５０個未満のアミノ酸、より典型的には約３０個未満のアミノ酸を含むものを指す。本明細書において、この用語は、構造的、したがって生物学的機能を模倣するアナログ及び模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を包含する。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は交換可能であり、これらの用語は、天然及び非天然のポリペプチドの両方並びに本明細書で示されるように又は当該技術分野で一般的に知られているように、その断片、変異体、誘導体、及びアナログを包含する。ポリペプチドは、単量体であってもよく、すなわち単鎖を有してもよく、多量体であってもよく、すなわち共有的又は非共有的に結合することができる２個以上の鎖で構成されてもよい。更に、ポリペプチドは、それぞれが１又は複数の別個の活性を有する複数の異なるドメインを含み得る。明確にするために記すと、ポリペプチドは、２アミノ酸以上の任意の長さであり得る。
「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源又は由来する源に基づいて、（１）天然状態のいずれかにおいてそれに伴う天然に付随する成分が付随していないポリペプチド、（２）天然には見出されない純度で存在するポリペプチドであって、純度は他の細胞材料の存在に関連して決定され得る、ポリペプチド（例えば、同じ種に由来する他のポリペプチド又はポリペプチドが生産された宿主に由来する他のポリペプチドを含まない）、（３）異なる種の細胞から発現されるポリペプチド、（４）細胞によって組換え的に発現されるポリペプチド（例えば、宿主細胞中に存在する組換え型核酸から生産されて、生産する宿主細胞から分離されている場合、ポリペプチドは「単離されたポリペプチド」である）、（５）天然に生じないポリペプチド（例えば、これは、天然に見出されるポリペプチドのドメイン又は他の断片であるか、天然には見出されないアミノ酸のアナログ若しくは誘導体又は標準的ペプチド結合以外の結合を含む）、又は（６）その他の方法で人の手によって生産、調製、及び／又は製造されるポリペプチドである。したがって、「単離されたポリペプチド」は、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを宿主細胞が天然で生産するかどうかに関係なく、宿主細胞中で組換え型核酸（例えばベクター）から生産されるポリペプチドを含む。「ポリペプチド」は、変化させたプロモーターの非存在下における宿主細胞中でのその通常の発現レベルより高いレベルに発現が増大するようにポリペプチドのプロモーターを変化させること等による宿主細胞からのポリペプチドの過剰発現、例えば相同的過剰発現により宿主細胞によって生産されるポリペプチドを含む。化学的に合成される又はそれが天然に生じる細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然の付随成分から「単離され」ている。ポリペプチドは更に、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いた単離により、天然付随成分を実質的に含まないようにすることができる。これらの定義から、「単離された」とは、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はオリゴペプチドが、それが合成された細胞から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。
「精製する」、「精製すること」、及び「精製（された）」という用語は、（自然中又は実験状況下のいずれであれ）それが最初に生産された時又はその最初の生産後の任意の時間中にそれに付随する成分の少なくとも一部から分離されている物質（又は実体、組成物、生産物、又は材料）を指す。栄養ポリペプチド等の物質は、生産時に又は最終生産物を含むそれまでの任意のレベル若しくは段階でそれが単離されている場合、精製されていると見なされるが、最終生産物は約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９０％超までその他の材料を含んでよく、それでも「単離され」ていると見なされ得る。精製された物質又は実体は、それらに最初に付随していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、精製された物質は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超、純粋である。本明細書中に提供されるポリペプチド及び他のポリペプチドの場合、そのようなポリペプチドは、ポリペプチドを分泌する単細胞生物から分泌され得る１又は複数の他のポリペプチドから精製され得る。本明細書において、ポリペプチド物質は、他の成分又は他のポリペプチド成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。
本明細書において、「ポリペプチド断片」又は「タンパク質断片」という用語は、参照ポリペプチド（例えば天然タンパク質の全長ポリペプチド又はポリペプチドドメイン）より少ないアミノ酸を有するポリペプチド又はそのドメインを指す。「天然タンパク質」又は「天然ポリペプチド」は、非組み換え型の細胞又は生物により生産されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、ポリペプチド断片は、断片のアミノ酸配列が天然配列の対応する位置と同一である連続配列である。断片は通常、少なくとも５、６、７、８、９、若しくは１０アミノ酸長、少なくとも１２、１４、１６、若しくは１８アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５、３０、３５、４０、若しくは４５アミノ酸、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００アミノ酸長、少なくとも１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、若しくは２００アミノ酸長、又は２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、若しくは６００超のアミノ酸長である。断片は、細胞の内側又は外側で消化される、より大きなポリペプチド配列の一部であり得る。したがって、長さが５０アミノ酸のポリペプチドが細胞内で生産されてもよいが、細胞の内側又は外側でタンパク分解されて長さが５０アミノ酸未満のポリペプチドが生産されてもよい。これは、より大きなポリペプチドよりも組換え的に生産すること又は組換え的に生産した後に精製することが困難であり得る、約２５アミノ酸より短いポリペプチドで特に重要である。本明細書において、「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド又はオリゴペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸未満、より典型的には約３０アミノ酸未満、又はより典型的には約１５アミノ酸未満、例えば約１０、９、８、７、６、５、４、若しくは３アミノ酸未満を含むものを指す。本明細書において、この用語は、構造的したがって生物学的機能を模倣するアナログ及び模倣物を包含する。
「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチド又は断片を含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２つ以上の異なるタンパク質に由来し得る２つ以上の所望の機能的要素を含むように構築できるので有用である。融合タンパク質は、目的のポリペプチドに由来する少なくとも１０連続アミノ酸、少なくとも２０若しくは３０アミノ酸、少なくとも４０、５０、若しくは６０アミノ酸、又は少なくとも７５、１００、若しくは１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質中に含まれる異種ポリペプチドは通常、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、又は少なくとも１５、２０、若しくは２５アミノ酸長である。ＩｇＧ Ｆｃ領域等のより大きなポリペプチド及び更には緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質等のタンパク質全体を含む融合物は特に有用である。融合タンパク質は、異なるタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列とインフレームでポリペプチド又はその断片をコードする核酸配列を構築し、次いで融合タンパク質を発現させることにより、組換え的に生産することができる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチド又はその断片を別のタンパク質に架橋結合することにより化学的に生産することができる。
組成物、製剤、又は生産物は、意図される消費者にかなりの量の栄養分を与える場合、「栄養性」又は「栄養（的）」であり、すなわち消費者は組成物又は製剤の全部又は一部を細胞、器官、及び／又は組織に同化する。一般的に、そのような細胞、器官、及び／又は組織への同化は、例えば前記細胞、器官、及び／又は組織の健康及び／又は自然の機能を維持する又は向上させるので、消費者に有益又は有用である。本発明では、同化される栄養性組成物又は製剤を「栄養」と呼ぶ。非限定的な例として、ポリペプチドは、かなりの量のポリペプチド栄養分をその意図される消費者に与える場合、すなわち消費者がタンパク質の全部又は一部を、典型的には単一アミノ酸又は小ペプチドの形態で細胞、器官、及び／又は組織に同化する場合、栄養性である。「栄養」はまた、ヒト又は他の哺乳動物等の対象に栄養性の組成物、製剤、生産物、又は他の材料を提供するプロセスを意味する。栄養性生産物は「栄養的に完全」である必要はなく、すなわち、充分な量が消費された場合に、生産物が消費者の健康に必要な全ての炭水化物、脂質、必須脂肪酸、必須アミノ酸、条件付き必須アミノ酸、ビタミン、及びミネラルを提供する必要はない。更に、「栄養的に完全なタンパク質」は、必要な全タンパク質栄養（すなわち、生物が生理学的に正常な状態で必要とする量）を含むが、ビタミン及びミネラル等の微量栄養素、炭水化物、又は脂質は必ずしも含まない。
好ましい実施形態では、組成物又は製剤は、「栄養的利益」を提供するのに充分な量の単一アミノ酸及び／又は小ペプチド（例えば、２アミノ酸、３アミノ酸、又は４アミノ酸、場合により最大１０アミノ酸）へと分解（すなわち、しばしばタンパク質消化と呼ばれる、ペプチド結合の切断）可能なポリペプチドを提供する点で栄養性である。更に、ある特定の実施形態では、小ペプチド（例えば、単一アミノ酸より大きいが約１０アミノ酸より小さい）又はより大きなペプチド、オリゴペプチド、若しくはポリペプチド（例えば、１１アミノ酸超）として胃腸壁を通過して血流中に吸収される栄養性ポリペプチドが提供される。ポリペプチド含有組成物の栄養的利益は、複数の測定基準により実証及び場合により定量することができる。例えば、栄養的利益は、タンパク質の基準１日摂取値の少なくとも約０．５％以上、例えば基準１日摂取値の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、又は約１００％超の、消費生物にとっての利益である。あるいは、栄養的利益は、消費者による満腹の感覚及び／又は認識によって示される。別の実施形態では、栄養的利益は、消費者の細胞、器官、及び／又は組織中に組成物又は製剤のかなりの量のポリペプチド成分が取り込まれることにより示され、そのような取込みは通常、細胞内での新規ポリペプチド生産に単一アミノ酸又は短いペプチドが用いられることを意味する。「消費者」又は「消費生物」とは、栄養的利益を有する生産物を摂取できる任意の動物を意味する。典型的には、消費者は、健康なヒト、例えば健康な乳児、子供、成人、又は高齢者等の哺乳動物である。あるいは、消費者は、（ｉ）適切な栄養の不足及び／又は（ｉｉ）本発明の栄養生産物によるその軽減を特徴とする疾患、障害、又は状態を発症するリスクがある又はそれに苦しむヒト（例えば、乳児、子供、成人、又は高齢者）等の哺乳動物である。「乳児（ｉｎｆａｎｔ）」とは一般的に約１又は２歳未満のヒトであり、「子供」とは一般的に約１８歳未満のヒトであり、「高齢者」とは約６５歳以上のヒトである。
本発明の一態様は、本明細書中で提供されるポリペプチドが、ポリペプチド中に含まれるペプチドが固有のアミノ酸組成を有することの実証を含む、分解可能なポリペプチドの提供を超える機能的利益を有することである。更に、天然全長ポリペプチド又はポリペプチドの混合物には見られないアミノ酸比率を有するポリペプチドが提供され、そのような比率は、単一アミノ酸及び小ペプチドを介して起こる代謝シグナル伝達を調節するポリペプチドの能力並びに消費生物の健康にとって重要な特異的な代謝反応を刺激するポリペプチド（及びそのアミノ酸成分）の能力の両方において有益である。本明細書において、アミノ酸の比率は、単一アミノ酸又は２以上のアミノ酸のポリペプチド中の組成を参照ポリペプチド又は参照ポリペプチド混合物のいずれかと比較することにより示すことができる。いくつかの実施形態では、そのような比較は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の含有量対参照ポリペプチド又は参照ポリペプチド混合物中の同じアミノ酸の含有量を含み得る。別の実施形態では、そのような比較は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の相対含有量対参照ポリペプチド又は参照ポリペプチド混合物中に存在するその他の全アミノ酸の含有量を含み得る。
別の好ましい実施形態では、組成物又は製剤は、意図される消費者が加水分解可能な炭水化物を提供する点で栄養性である（「栄養性炭水化物」と呼ぶ）。炭水化物含有組成物の栄養的利益は複数の測定基準により実証及び場合により定量化することができる。例えば、栄養的利益は、消費生物にとって、炭水化物の基準１日摂取値の少なくとも約２％以上の利益である。
別の好ましい実施形態では、組成物又は製剤は、意図される消費者による消化、取込み、変換、又は他の細胞的使用が可能な脂質を提供する点で栄養性である（「栄養性脂質」と呼ぶ）。脂質含有組成物における栄養的利益は複数の測定基準により実証及び場合により定量化することができる。例えば、栄養的利益は、消費生物にとって、脂質（すなわち、脂肪）の基準１日摂取値の少なくとも約２％以上の利益である。
「農業由来食品」とは、土壌の耕作又は動物の飼育から得られる食品である。
本明細書において、タンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、タンパク質は第２のタンパク質に対して「相同性」を有する又はそれに「相同」である。あるいは、２つのタンパク質が類似するアミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第２のタンパク質に対する相同性を有する（したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似したアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。本明細書において、（特に予想される構造的類似性に関連する）アミノ酸配列の２つの領域間の相同性は機能の類似性を意味すると解釈される。
タンパク質又はペプチドに関して「相同な」が用いられる場合、同一でない残基位置が多くの場合保存的アミノ酸置換によって異なっていると認識される。「保存的アミノ酸置換」とは、同様な化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換されているものである。一般的に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質について補正するために上方にパーセント配列同一性又は相同性の程度が調整され得る。この調整をするための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９４， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４：３０７−３１及び２５：３６５−８９を参照されたい。
以下の６グループのそれぞれは、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：（１）セリン、スレオニン；（２）アスパラギン酸、グルタミン酸；（３）アスパラギン、グルタミン；（４）アルギニン、リジン；（５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、及び（６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
ポリペプチドの配列相同性は、パーセント配列同一性ともいい、通常、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ． ５３７０５のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅを参照されたい。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられた相同性の尺度を用いて類似の配列を整合する。例えば、ＧＣＧは、異なる生物種の相同なポリペプチド等の密接に関連するポリペプチド間又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定するためにデフォルトのパラメーターで用いることができる「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」等のプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照されたい。
種々の生物の多数の配列を含むデータベースと特定のポリペプチド配列を比較する時のアルゴリズムの例としては、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）； Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６−２７２ （１９９３）； Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１−１４１ （１９９６）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７）； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９−６５６ （１９９７））、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７））が挙げられる。
ＢＬＡＳＴｐのパラメーターの例は以下の通りである：Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ：１０（デフォルト）；Ｆｉｌｔｅｒ：ｓｅｇ（デフォルト）；Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ：１１（デフォルト）；Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ａ ｇａｐ：１（デフォルト）；Ｍａｘ．Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：１００（デフォルト）；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１（デフォルト）；Ｎｏ． ｏｆ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ：１００（デフォルト）；Ｐｅｎａｌｔｙ Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは通常、少なくとも約１６アミノ酸残基、少なくとも約２０残基、少なくとも約２４残基、少なくとも約２８残基、又は約３５残基超である。多数の異なる生物の配列を含むデータベースをサーチする場合、アミノ酸配列の比較が有用であり得る。アミノ酸配列を用いたデータベースサーチは、当該技術分野で公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムで測定することができる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを用いてポリペプチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列とサーチ配列との間で最も重複する領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：６３−９８ （１９９０）。例えば、アミノ酸配列間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に援用するＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１に提供されるデフォルトのパラメーター（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：２及びＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）でＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。
いくつかの実施形態では、重合体分子（例えば、ポリペプチド配列又は核酸配列）は、配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である場合に互いに「相同」であると見なされる。いくつかの実施形態では、重合体分子は、配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％類似している場合に互いに「相同」であると見なされる。「相同な」という用語は、必然的に少なくとも２つの配列（ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列）間の比較を指す。いくつかの実施形態では、２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一続き（ｓｔｒｅｔｃｈ）について少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、又は少なくとも約９０％同一である場合、相同であると見なされる。いくつかの実施形態では、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の固有な特異的アミノ酸の一続きをコードする能力を特徴とする。ヌクレオチド配列が相同であると見なされるには、これらのアミノ酸の互いに対する近似的配置（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｓｐａｃｉｎｇ）及び同一性の両方が考慮される必要がある。長さが６０ヌクレオチド未満のヌクレオチド配列のいくつかの実施形態では、少なくとも４〜５個の固有な特定のアミノ酸の一続きをコードする能力によって相同性が決定される。いくつかの実施形態では、２つのタンパク質配列は、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一続きについて少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、又は少なくとも約９０％同一である場合、相同であると見なされる。
本明細書において、「修飾誘導体」とは、参照ポリペプチド配列と一次構造配列が実質的に相同であるが、例えばインビボ又はインビトロで化学的及び生化学的修飾を含むか参照ポリペプチド中に見られないアミノ酸を取り込んでいるポリペプチド又はその断片を指す。そのような修飾としては、当業者に容易に理解されるように、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種を用いた標識、及び種々の酵素的修飾が含まれる。ポリペプチドを標識するための種々の方法及びそのような目的に有用な種々の置換基又は標識が当該技術分野で周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、及び３Ｈ等の放射性同位元素、標識されたアンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）（例えば抗体）に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、及び標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとなり得るアンチリガンドが含まれる。標識の選択は、必要な感度、プライマーとのコンジュゲーションのし易さ、要求される安定性、及び利用可能な計測設備によって決まる。ポリペプチドを標識化する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （１９９２， ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）を参照されたい。
本明細書において、「ポリペプチド変異体」又は「ムテイン」とは、天然又は野生型タンパク質等の参照タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列と比べて１又は複数のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再編成、又は置換を配列が含むポリペプチドを指す。ムテインは、参照タンパク質の配列中で、ある位置の１個のアミノ酸が別のアミノ酸に変化している１若しくは複数のアミノ酸点置換、１若しくは複数のアミノ酸が挿入若しくは欠失しているそれぞれ１若しくは複数の挿入及び／若しくは欠失、並びに／又はアミノ末端若しくはカルボキシ末端のいずれか若しくは両方におけるアミノ酸配列の切断を有し得る。ムテインは、参照タンパク質と比較して、同じ生物学的活性を有してもよく、異なる生物学的活性を有してもよい。
いくつかの実施形態では、ムテインは、例えば、対応する参照タンパク質に対して少なくとも８５％の全体的配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、ムテインは、野生型タンパク質に対して少なくとも９０％の全体的配列相同性を有する。別の実施形態では、ムテインは、少なくとも９５％の配列同一性又は９８％、９９％、９９．５％、若しくは９９．９％の全体的配列同一性を示す。
本明細書において、「アフィニティー精製のためのポリペプチドタグ」とは、第１の「タグ」ポリペプチドに融合した目的の第２のタンパク質又はポリペプチド配列を単離又は精製するために用いることができる結合相手を有する任意のポリペプチドである。いくつかの例が当該技術分野で周知であり、Ｈｉｓ−６タグ、ＦＬＡＧエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、Ｓｔｒｅｐ−ＴＡＧＩＩ、ビオチンタグ、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、又は金属親和性タグが含まれる。
本明細書において、「ポリペプチド電荷」又は「タンパク質電荷」は、式１を用いてｐＨ７でポリペプチド又はタンパク質について計算される。
式１：
電荷Ｐ＝−０．００２−Ｃ＊０．０４５−Ｄ＊０．９９９−Ｅ＊０．９９８＋Ｈ＊０．０９１＋Ｋ＊１．０＋Ｒ＊１．０−Ｙ＊−０．００１
電荷Ｐは、ポリペプチド又はタンパク質の実効電荷である。
Ｃは、ポリペプチド又はタンパク質中のシステイン残基の数である。
Ｄは、ポリペプチド又はタンパク質中のアスパラギン酸残基の数である。
Ｅは、ポリペプチド又はタンパク質中のグルタミン酸残基の数である。
Ｈは、ポリペプチド又はタンパク質中のヒスチジン残基の数である。
Ｋは、ポリペプチド又はタンパク質中のリジン残基の数である。
Ｒは、ポリペプチド又はタンパク質中のアルギニン残基の数である。
Ｙは、ポリペプチド又はタンパク質中のチロシン残基の数である。
本明細書において、「アミノ酸１個当たりの電荷」は、式２を用いてｐＨ７のポリペプチド又はタンパク質について計算される。
式２：
電荷Ａ＝（−０．００２−Ｃ＊０．０４５−Ｄ＊０．９９９−Ｅ＊０．９９８＋Ｈ＊０．０９１＋Ｋ＊１．０＋Ｒ＊１．０−Ｙ＊−０．００１）／Ｎ
電荷Ａは、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸１個当たりの実効電荷である。
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、及びＹは式１におけるのと同じである。
Ｎは、ポリペプチド又はタンパク質中のアミノ酸の数である。
本明細書において、「組換え型」とは、（１）天然環境から取り出されている、（２）自然界で遺伝子が見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部が付随していない、（３）天然にはそれが連結していないポリヌクレオチドに機能可能に連結している、又は（４）天然に生じない生体分子、例えば遺伝子又はポリペプチドを指す。更に、「組換え型」は、組換え型生体分子又は非組換え型生体分子であり得る生体分子を含有、生産、及び／又は分泌する本明細書中で「組換え型単細胞生物」、「組換え型宿主」、又は「組換え型細胞」と呼ぶ単細胞生物等の細胞又は生物を指す。例えば、組換え型単細胞生物は、組換え型ポリペプチド又は非組み換え型ポリペプチドの生産及び／又は分泌を増強する組換え型核酸を含み得る。組換え型の細胞又は生物は更に、組換え型ベクター等の組換え型核酸が導入された細胞を指すことが意図される。「組換え型単細胞生物」は、組換え型微生物宿主細胞を含み、特定の対象細胞だけを指すだけでなく、そのような細胞の子孫も指す。変異又は環境の影響により次の世代で特定の修飾が起こり得るので、そのような子孫は事実上、親細胞と同一でないことがあるが、それでも本明細書中の用語の範囲に含まれる。
「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「核酸」、又は「核酸配列」という用語は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの重合体形態を指す。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノム若しくは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ又は合成ＲＮＡ）、並びに非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオシド間結合、又は両方を含むＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含む。核酸は任意の形態的コンホメーションであり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的二本鎖、分岐鎖、ヘアピン、環状、又は錠型（ｐａｄｌｏｃｋｅｄ）コンホメーションであり得る。
「合成」ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合重合体とは、細胞の外側で作成されたもの、例えば化学的に合成されたものである。
本明細書において、「核酸断片」という用語は、全長参照ヌクレオチド配列と比べて欠失、例えば５’末端又は３’末端の欠失を有する核酸配列を指す。一実施形態では、核酸断片は、断片のヌクレオチド配列が天然配列中の対応する位置と同一である連続配列である。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも１０、１５、２０、若しくは２５ヌクレオチド長、又は少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、若しくは１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、核酸配列の断片はオープンリーディングフレーム配列の断片である。いくつかの実施形態では、そのような断片は、オープンリーディングフレームヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のポリペプチド断片（本明細書で定義）をコードする。
本明細書において、生物のゲノム中の内因性核酸配列（又はその配列にコードされるタンパク質生産物）は、異種配列が内因性核酸配列に隣接して配置され、その結果この内因性核酸配列の発現が変化している場合、本明細書中で「組換え型」と見なされる。この文脈で、異種配列とは、内因性核酸配列に天然には隣接していない配列であり、異種配列自体は内因性（同じ宿主細胞又はその子孫を起源とする）であってもよく、外因性（異なる宿主細胞又はその子孫を起源とする）であってもよい。例えば、宿主細胞のゲノム中の遺伝子の天然プロモーターを（例えば相同組換えにより）あるプロモーター配列に置換して、この遺伝子の発現パターンが変わるようにしてよい。この時、この遺伝子は、それに天然で隣接する配列の少なくとも一部から分離されているので、「組換え型」になる。
核酸は更に、ゲノム中の対応する核酸に天然に起こらない任意の修飾を含む場合、「組換え型」と見なされる。例えば、内因性コード配列は、例えばヒトの介入により、人為的に導入された挿入、欠失、又は点変異を含む場合、「組換え型」と見なされる。「組換え型核酸」は更に、異種部位の宿主細胞染色体中に組み込まれた核酸及びエピソームとして存在する核酸コンストラクトを含む。「組換え型」という用語は更に、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチドアナログ、又は異種の系により生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、並びにそのような核酸にコードされるポリペプチド及び／又はｍＲＮＡに言及しても用いられ得る。したがって、例えば、微生物に合成されるポリペプチドは、例えば細胞中に存在する組換え型の遺伝子又は他の核酸配列から転写されたｍＲＮＡからそれが生産される場合、組換え型である。
本明細書において、参照核酸配列の「縮重変異体」という語句は、標準的な遺伝暗号に従って翻訳されて、参照核酸配列から翻訳されるのと同じアミノ酸配列を提供できる核酸配列を包含する。「縮重オリゴヌクレオチド」又は「縮重プライマー」という用語は、必ずしも配列が同一ではないが１又は複数の特定のセグメント内で互いに相同である標的核酸配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを示すために使用される。
核酸配列の文脈における「パーセント配列同一性」又は「同一」という用語は、対応が最大となるようにアラインメントした時に同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、一般的に少なくとも約２０ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２、更により典型的には少なくとも約３６以上のヌクレオチドの一続きにわたり得る。ヌクレオチド配列同一性の測定に用いることができる複数の異なるアルゴリズムが当該技術分野で知られている。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ）に含まれるプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、又はＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列とサーチ配列の間で最も重複する領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：６３−９８ （１９９０）。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に援用するＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１に提供されているように、ＦＡＳＴＡをデフォルトのパラメーター（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：６、スコアリングマトリックスにＮＯＰＡＭファクター）で用いて又はＧａｐをデフォルトのパラメーターで用いて決定することができる。あるいは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）； Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３：２６６−２７２ （１９９３）； Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：１３１−１４１ （１９９６）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７）； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７：６４９−６５６ （１９９７））、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて配列を比較することができる。
核酸又はその断片に言及する時の「実質的相同性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」又は「実質的類似性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」という用語は、適切なヌクレオチドの挿入又は欠失と共に別の核酸（又はその相補鎖）とアラインした時に、前述したようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＧａｐ等の任意の周知の配列同一性のアルゴリズムによる測定で少なくとも約７６％、８０％、８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性があることを示している。
あるいは、核酸又はその断片が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、別の核酸、別の核酸の鎖、又はその相補鎖にハイブリダイズする時、実質的な相同性又は類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントな洗浄条件」は、複数の異なる物理的パラメーターに依存する。当業者に容易に理解されるように、核酸ハイブリダイゼーションは、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする分子種の塩基組成、相補的領域の長さ、及びハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数等の条件に影響される。当業者は、特定のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを実現するためのこれらのパラメーターの変更方法を知っている。
一般的に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定の組の条件下で特異的ＤＮＡハイブリッドの熱融点（Ｔｍ）より約２５℃低い温度で行われる。「ストリンジェントな洗浄」は、特定の組の条件下で特異的ＤＮＡハイブリッドのＴｍより約５℃低い温度で行われる。Ｔｍは、完全にマッチするプローブと標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。参照により本明細書に援用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ｐａｇｅ ９．５１を参照されたい。本明細書中での目的のために、「ストリンジェントな条件」は、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％ＳＤＳ中、６５℃で８〜１２時間の水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミドを含まない）、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄２回としての液相ハイブリダイゼーションについて定義される。ハイブリダイズしている配列の長さ及びパーセント同一性を含む複数の因子に応じて６５℃でのハイブリダイゼーションは異なる速度で起こることが当業者には理解されよう。
本明細書において、「発現調節配列」とは、それらが機能可能に連結されているコード配列の発現に影響を与えるのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現調節配列は、核酸配列の転写、転写後事象、及び翻訳を調節する配列である。発現調節配列としては、適切な転写の開始配列、終結配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を高める配列；及び、所望される場合、タンパク質の分泌を増大させる配列が含まれる。そのような調節配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物では、そのような調節配列としては通常、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列が含まれる。「調節配列」という用語は、最低限、発現にその存在が必須であるあらゆる成分を包含することが意図され、その存在が好ましい付加的成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を更に包含し得る。
本明細書において、「機能的に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」又は「作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」発現調節配列とは、目的の遺伝子を調節するための目的の遺伝子に発現調節配列が隣接している結合及び目的の遺伝子を調節するためにトランスに又は離れて作用する発現調節配列を指す。
本明細書において、「ベクター」とは、それに連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの１種が「プラスミド」であり、これは通常、付加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指すが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅により又は環状プラスミドの制限酵素処理により得られるもの等の線状二本鎖分子も含む。他のベクターとしては、コスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。別の種類のベクターは、付加的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである（以下に更に詳細に説明）。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的に複製できる（例えば、宿主細胞中で機能する複製起源を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが機能可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを本明細書中では「組換え型発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ぶ。
本明細書において、「組換え型宿主細胞」（又は単に「組換え型細胞」又は「宿主細胞」）という用語は、組換え型ベクター等の組換え型核酸が導入された細胞を指すことが意図される。場合によっては、「細胞」という語は、細胞の種類を特定する名前で置き換えられる。例えば、「組換え型微生物」とは、微生物宿主細胞である組換え型宿主細胞である。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されると理解されるべきである。変異又は環境の影響のために次の世代で特定の修飾が起こり得るので、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一でないことがあるが、それでも本明細書において、用語「組換え型宿主細胞」、「組換え型細胞」、及び「宿主細胞」の範囲に含まれる。組換え型宿主細胞は、培養中で成長させた単離された細胞又は細胞株であってもよく、生きた組織又は生物中にある細胞であってもよい。
本明細書において、「従属栄養性」という用語は、炭素を固定できず、成長に有機炭素を利用する生物を指す。
本明細書において、「独立栄養性」という用語は、（光合成により）光からのエネルギーを用いて又は無機化学反応（化学合成）を用いて単純な無機分子から複雑な有機化合物（例えば炭水化物、脂肪、及びタンパク質）を生産する生物を指す。
本明細書において、「筋肉量」とは、対象の身体における筋肉の重量を指す。筋肉量は、骨格筋、平滑筋（例えば心筋及び消化筋肉）及びこれらの筋肉に含まれる水分を含む。特定の筋肉の筋肉量は、二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ）（Ｐａｄｄｅｎ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を用いて測定することができる。全除脂肪体重（脂肪を除く）、全体重、及び骨塩量（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ）もＤＥＸＡで測定することができる。いくつかの実施形態では、対象の特定の筋肉の筋肉量の変化を例えばＤＥＸＡにより測定し、この変化を、対象の筋肉量の全変化の代わりとして用いる。したがって、例えば、対象が本明細書に開示の栄養タンパク質を消費して、期間中、特定の筋肉又は筋肉群における筋肉量の増加を経験した場合、対象は筋肉量の増加を経験したと結論付けることができる。筋肉量の変化は、タンパク質合成、筋線維合成速度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｒａｔｅ）、及びｍＴｏｒ／ｍＴｏｒｃ等の特定の主要活性を含む種々の方法で測定することができる。一般的に、「除脂肪筋肉量（ｌｅａｎ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ）」とは、脂肪等のその他の組織が存在しない筋肉組織の質量を指す。
本明細書において、「筋力」とは、１回の最大限の努力で筋肉が生み出すことができる力の量を指す。静的筋力及び動的筋力の２種類の筋力がある。静的筋力とは筋肉の等尺性収縮を指し、筋肉の長さが一定のまま且つ／又は関節を動かさずに筋肉が力を生み出す。例としては、物体の保持若しくは運搬又は壁を押すことが含まれる。動的筋力とは、運動を生じさせる力を生み出す筋肉を指す。動的筋力は等張性収縮であり得、筋肉は一定の負荷又は等運動性収縮下で短縮し、筋肉は一定の速度で収縮及び短縮する。動的強度には等慣性強度も含まれ得る。
特に断りのない限り、「筋力」とは、最大動的筋力を指す。最大筋力は、「１最大反復回数（ｏｎｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｕｍ）」（１ＲＭ）と呼ばれる。これは、失敗又は怪我なしに１回完全に動かす（持ち上げる、押す、又は引く）ことができる最大負荷（キログラム）の測定値である。この値は、直接測定することができるが、そのためには、対象が活動の完了に失敗するまで重量を増やしていく必要がある。あるいは、１ＲＭは、対象が動かせる最大量より少ない負荷を用いて対象が行うことができる運動反復の最大数を数えることにより推定される。レッグエクステンション及びレッグフレクションがしばしば臨床試験で測定される（Ｂｏｒｓｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ， ｓｔｒｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ，” Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００８；２７：１８９−１９５； Ｐａｄｄｏｎ−Ｊｏｎｅｓ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ２８ ｄａｙｓ ｂｅｄ ｒｅｓｔ，” Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００４；８９：４３５１−４３５８）。
本明細書において、「機能的パフォーマンス」とは、日常の活動をシミュレートする機能試験を指す。「機能的パフォーマンス」は、任意の好適な認められている試験、例えば、時間測定踏み台試験（ｔｉｍｅｄ−ｓｔｅｐ ｔｅｓｔ）（４インチ（約１０．２センチメートル）のベンチをできるだけ速く５回昇降する）、時間測定フロア移動試験（ｔｉｍｅｄ ｆｌｏｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｅｓｔ）（できるだけ早く１回、床の上で立位から仰臥位になり、その後再度立ち上がって立位になる）、及び身体能力バッテリー試験（静的バランス試験、椅子試験、及び歩行試験）（Ｂｏｒｓｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ， ｓｔｒｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ，” Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００８；２７：１８９−１９５）により測定される。
本明細書において、「肥満度指数（ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ）」又は「ＢＭＩ」又は「ケトレー指数」とは、メートルで表した対象の身長の２乗で割った、キログラムで表した対象の体重である（ｋｇ／ｍ２）。
成人では、個人の体重がその身長の人の正常な又は望ましい体重からどれだけ離れているかを評価するためにＢＭＩは頻繁に使用される。筋肉質等のその他の要因も有意にＢＭＩに影響するが、体重の過多又は不足は、一部、体脂肪で説明され得る。世界保健機関は、１８．５未満のＢＭＩを低体重として、栄養不良、摂食障害、又は他の健康上の問題を示し得るものと見なしており、一方２５を超えるＢＭＩは過体重、３０超は肥満と見なされる。（世界保健機関。ＢＭＩの分類）。本明細書において、「望ましい肥満度指数」は、約１８．５〜約２５の肥満度指数である。したがって、対象のＢＭＩが約１８．５より低い場合、対象のＢＭＩの増加が対象のＢＭＩの望ましさの上昇である。逆に、対象のＢＭＩが約２５を超える場合、対象のＢＭＩの減少が対象のＢＭＩの望ましさの上昇である。
本明細書において、「高齢」哺乳動物とは、肥満度指数及び筋肉量のうちの少なくとも１つの加齢性変化（例えば、加齢性サルコペニア）を経験するものである。いくつかの実施形態では、「高齢」のヒトとは、少なくとも５０歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳、少なくとも８０歳、少なくとも８５歳、少なくとも９０歳、少なくとも９５歳、又は少なくとも１００歳である。いくつかの実施形態では、高齢の動物、哺乳動物、又はヒトは、一生のピークの筋肉量から少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％の筋肉量の喪失を経験したヒトである。肥満度指数及び筋肉量のうちの少なくとも１つの加齢性変化は加齢に関連することが知られているので、いくつかの実施形態では、高齢哺乳動物は単純に年齢に基づいて特定又は定義される。したがって、いくつかの実施形態では、「高齢」のヒトは、肥満度指数及び筋肉量の少なくとも１つの測定値に頼らず、単純に年齢が少なくとも６０、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳、少なくとも８０歳、少なくとも８５歳、少なくとも９０歳、少なくとも９５歳、又は少なくとも１００歳であるという事実によって特定又は定義される。
本明細書において、「サルコペニア」とは、加齢に関連する骨格筋の量（典型的には２５歳を過ぎて１年に０．５〜１％の喪失）、質、及び強度の変性損失（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｌｏｓｓ）を指す。サルコペニアは虚弱症候群の構成要素である。高齢者のサルコペニアに関する欧州ワーキンググループ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ ｉｎ Ｏｌｄｅｒ Ｐｅｏｐｌｅ：ＥＷＧＳＯＰ）により、加齢性サルコペニアの実用的な臨床定義及びコンセンサス診断基準が作成された。ワーキンググループは、サルコペニアの診断に低い筋肉量及び低い筋肉機能（強度又はパフォーマンス）の両方の存在を用いることを提唱している。サルコペニアは第１に、筋肉組織の「質」の低下に加えて、脂肪による筋線維の置換、線維症の増加、筋肉代謝の変化、酸化ストレス、及び神経筋接合部の変性等の因子により生じる筋萎縮（筋肉サイズの減少）を特徴とする。合わさると、これらの変化は、筋肉機能を漸進的に喪失させ、最終的に虚弱にする。虚弱は、高齢者の健康及び機能が破局的に低下するリスクの上昇が具体化した一般的な老年性症候群である。虚弱の一因となるものとしては、サルコペニア、骨粗しょう症、及び筋力低下（ｍｕｓｃｌｅ ｗｅａｋｎｅｓｓ）が含まれ得る。筋力低下は、筋疲労（又は「強度の不足」）としても知られ、骨格筋を用いて力を行使できないことを指す。低下はしばしば、病気の結果としての長期間の床上安静後等の活動の減少及び筋萎縮に続いて起こる。サルコペニアの結果として筋力低下が徐々に始まることもある。
本明細書において、患者は、患者が医学的病気のために肥満度指数及び筋肉量のうちの少なくとも１つの変化（例えば、サルコペニア）を経験する場合、「医学的危篤状態」である。いくつかの実施形態では、患者は、起きている時間の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％ベッドに拘束される。いくつかの実施形態では、患者は意識不明である。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、２週間、３週間、４週間、５週間、１０週間、又はそれより長く、本段落に記載されているようにベッドに拘束されている。
本明細書において、「タンパク質エネルギー栄養不良」とは、不適切なタンパク質摂取がある栄養不良の形態を指す。種類としては、クワシオルコル（タンパク質の栄養不良が主）、消耗症（カロリー及びタンパク質栄養の両方の欠乏、）及び消耗性クワシオルコル（顕著なタンパク質欠乏及び顕著なカロリー不足の兆候の存在、最も重度な形態の栄養不良といわれることもある）が含まれる。
本明細書において、「運動」とは、最も広義には、身体フィットネス並びに全体的な健康及びウェルネスを高める又は維持する任意の身体活動である。運動は、筋肉及び心血管系の強化、運動競技能力を磨くこと、体重の減少又は維持、及び楽しみ目的を含む種々の理由により行われる。
本明細書において、「充分な量」とは、所望の効果を引き起こすのに充分な、本明細書に開示されているタンパク質又はポリペプチドの量である。例えば、筋肉量の増加が望まれる場合、充分な量は、ある期間にわたって対象の筋肉量の増加を引き起こす量である。充分な量のタンパク質又はポリペプチド断片は、直接、すなわちタンパク質又はポリペプチド断片を対象に投与することにより提供されてもよく、タンパク質又はポリペプチド断片を含む組成物の一部として提供されてもよい。投与形態については本明細書中で別に説明する。
本明細書において、「哺乳動物」という用語は、分類学的クラス哺乳動物の任意のメンバー、例えば胎盤性哺乳動物及び有袋類哺乳動物を指す。したがって、「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、家畜、及び実験哺乳動物を含む。哺乳動物の例としては、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ラマ、ウシ、霊長類、ブタ、及び任意の他の哺乳動物が含まれる。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、トランスジェニック哺乳動物、遺伝子操作された哺乳動物、及びクローン化された動物の少なくとも１つである。
本明細書において、「飽和」とは、食べている間に一杯になること又は食べたい願望の低減である。これにより食事が停止又は減少する。
本明細書において、「満腹（感）」とは、食後の食べない期間として現れる、食後に一杯のままであることである。
本明細書において、「運動」とは、最も広義には、身体フィットネス並びに全体的な健康及びウェルネスを高める又は維持する任意の身体活動である。運動は、筋肉及び心血管系の強化、運動競技能力を磨くこと、体重の減少又は維持、及び楽しみ目的を含む種々の理由により行われる。
「改善」という用語は、疾患状態の処置における任意の治療的に有益な結果を指し、例えばその予防、重症度若しくは進行の低下、寛解、又は治癒を含む。
本明細書において、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、又は微生物）内でなく、人工的環境、例えば試験管又は反応容器中、細胞培養液中、ペトリ皿中等で起こる事象を指す。本明細書において、「エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）」という用語は、生物外部の環境中の組織中又は組織上で行われる実験を指す。
「インサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）」という用語は、生きた生物から離れて成長している、例えば組織培養物で成長している生きた細胞中で起こるプロセスを指す。
「インビボ」という用語は、生きた生物中で起こるプロセスを指す。
「充分な量」という用語は、所望の効果をもたらすのに充分な量、例えば、細胞中でのタンパク質凝集を調節するのに充分な量を意味する。
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善させるのに有効な量である。治療有効量は、予防を治療と見なすことができるので、「予防有効量」であり得る。
本明細書において、「アミノ酸尤度」（「ＡＡＬｉｋｅ」と略される）とは、参照タンパク質に関連して作成されたマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）の所与の位置に所与のアミノ酸が現れる頻度の尺度である。位置は、参照タンパク質のアミノ酸配列に対して定義される。参照タンパク質は、参照分泌タンパク質等の任意のタンパク質であり得る。ＭＳＡを作成した後、ＭＳＡ中でタンパク質配列の各位置に各アミノ酸が現れる頻度を計算して、各位置のアミノ酸尤度が得られる。したがって、参照タンパク質の各アミノ酸位置について、最大２０個の異なるアミノ酸尤度の値が計算され得る。
所与のクエリータンパク質配列について、相同なタンパク質を用いてＭＳＡが作成される。相同なタンパク質は、当該技術分野で公知の複数の方法のいずれかを用いて特定することができる。例えば、相同なタンパク質は、非重複タンパク質のＮＣＢＩライブラリーとのクエリーのローカル配列アラインメントを行うことにより特定され得る。最初のローカルアラインメントは、ＮＣＢＩツールキット ｖ．２．２．２６＋のｂｌａｓｔｐプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．， Ｇｉｓｈ Ｗ．， Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ．， Ｍｙｅｒｓ Ｅ．Ｗ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ． ”Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９０） ２１５： ４０３−４１０）を以下から選択されるパラメーターで用いて行われ得る：
ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝１、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１１、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１、及びＢＬＯＳＵＭ６２ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ；
ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝１、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１５、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−２、及びＢＬＯＳＵＭ４５ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ；
ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝１、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１、及びＢＬＯＳＵＭ８０ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ；
ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝１、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１、及びＰＡＭ７０ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ；並びに
ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝１、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−９、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１、及びＰＡＭ３０ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ。
得られたライブラリーのマルチプル配列アラインメントは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ３．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｒｅｌｅａｓｅ ３．１， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， ２０１２）に実装されているＡｌｉｇｎ１２３アルゴリズムを用いて行った。ＤＳＣアルゴリズム（Ｋｉｎｇ Ｒ． Ｄ．， Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ． Ｊ． Ｅ． ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ”． Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． （１９９６） ５： ２２９８−２３１０）をｗｅｉｇｈｔ＝１で用いて残基二次構造を割り当てた。Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ ＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムをＧａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１０及びｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−０．１、並びにＢＬＯＳＵＭ３０スコアリングマトリックスで用いてペアワイズアラインメントを行った。高次のアラインメントでは、ＢＬＯＳＵＭ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｓｅｔ、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝ −０．５、及びａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｄｅｌａｙ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｃｕｔｏｆｆ（ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）＝４０％を用いた。
ローカルアラインメントの期待値が１未満の全タンパク質（７５〜１０００の固有のヒット）を特定し、アラインメントして、マルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）を作成した。各ＭＳＡに用いたタンパク質を付録Ｃに示す。
本明細書において、「アミノ酸タイプ尤度」（「ＡＡＴＬｉｋｅ」と略す）とは、参照タンパク質に関連して作成されたマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）の所与の位置に所与の種類のアミノ酸が現れる頻度の尺度である。アミノ酸タイプは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、及びＶａｌ）、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌ）、正電荷アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）、負電荷アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、電荷アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、及び芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）から選択される。位置は、参照タンパク質のアミノ酸配列に対して定義される。参照タンパク質は、参照分泌タンパク質等の任意のタンパク質であり得る。ＭＳＡを作成した後、ＭＳＡ中のタンパク質配列の各位置に各種類のアミノ酸が現れる頻度を計算して、各位置のアミノ酸タイプ尤度を得る。
本明細書において、「位置エントロピー」（「Ｓｐｏｓ」と略す）とは、ＭＳＡ中の位置におけるアミノ酸分布の広がりの指標である。ＭＳＡは、全アミノ酸アルファベット、ＡＡ＝［Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ］を用いて所与の参照アミノ酸配列中の各アミノ酸位置のエントロピーを計算するために用いられる：
Figure 2016500250
式中、ｐｊは、アミノ酸ｊをその位置で見る確率である。高度に可変性の位置はエントロピーが大きく（ある位置での最大エントロピーは、各アミノ酸が等しく可能性があることに相当し、この時のエントロピーは２．９９６となる）、高度に保存された位置のエントロピーは０に近い。
本明細書において、「アミノ酸タイプ位置エントロピー」（ＳＡＡＴｐｏｓと略される）とは位置エントロピーの変動であり、位置エントロピーの計算に全アミノ酸アルファベットを用いる代わりに、以下のように生理化学的性質に基づいてアミノ酸がグループ化されている： 疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、及び非分類［Ｇ、Ｐ、Ｃ］。この生理化学的アルファベットを用いると、ｐｊは今度は、位置ｊに各アミノ酸タイプ（疎水性、芳香族、極性、荷電、又は非分類）を見る確率に相当する。これらのアミノ酸タイプ（ＡＡＴｙｐｅ）の確率は、その種の各アミノ酸を見る確率の和である。位置エントロピーの方程式は、理論的最大値が今回は１．６０９であるが、同じままである。
Ａ．改変タンパク質
いくつかの実施形態では、タンパク質は、食用生産物中で天然に生じるタンパク質の断片又はタンパク質の誘導体若しくはムテインを含む又はからなる。そのようなタンパク質は「改変タンパク質」と呼ぶことができる。そのような実施形態では、天然タンパク質又はその断片は、「参照」タンパク質又はポリペプチドであり、改変タンパク質又はその第１のポリペプチド配列は、参照タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも１つの配列修飾を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変タンパク質又はその第１のポリペプチド配列は、少なくとも１つの参照タンパク質アミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一である。典型的には、改変タンパク質又はその第１のポリペプチド配列中に存在する全アミノ酸残基に対する分岐鎖アミノ酸残基、全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基、及び全アミノ酸残基に対するロイシン残基の少なくとも１つの割合は、対応する参照タンパク質又はポリペプチド配列中に存在する全アミノ酸残基に対する分岐鎖アミノ酸残基、必須アミノ酸残基、及び全アミノ酸残基に対するロイシン残基の少なくとも１つの割合より大きい。
いくつかの態様では、栄養ポリペプチドは、哺乳動物対象による消費後に実質的に消化可能である。好ましくは、栄養ポリペプチドは、少なくとも参照ポリペプチド若しくは参照ポリペプチド混合物又は消費対象の食事中にあるその他のポリペプチドの一部より消化され易い。本明細書において、「実質的に消化可能である」ことは、消費後の栄養ポリペプチドの半減期を測定することにより実証することができる。例えば、栄養ポリペプチドは、ヒト対象の胃腸管中での半減期が６０分未満、又は５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２分、若しくは１分未満である場合、より消化され易い。ある特定の実施形態では、栄養ポリペプチドは、向上した消化を提供する製剤中に提供され、例えば、栄養ポリペプチドは、他のポリペプチド又は他の材料を含まないで提供される。いくつかの実施形態では、栄養ポリペプチドは、１又は複数のエンドペプチダーゼの１又は複数の認識部位を含む。具体的な実施形態では、栄養ポリペプチドは、分泌リーダー（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ又はｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅａｄｅｒ）配列を含み、これは後で栄養ポリペプチドから切断される。本明細書において、栄養ポリペプチドは、シグナルペプチド及び／又は分泌リーダー配列を有する又は有さないポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態では、栄養ポリペプチドは、１又は複数のエキソペプチダーゼによる切断を受け易い。
いくつかの態様では、栄養ポリペプチドは、所望の密度の１又は複数の必須アミノ酸（ＥＡＡ）を有するように選択される。対象の食事中に存在しない又は充分な量で存在しない１又は複数の必須アミノ酸の効果的な投与により、必須アミノ酸の欠乏を処置又は防止することができる。例えば、ＥＡＡ密度は、全長参照栄養性ポリペプチド中に存在する必須アミノ酸の密度とほぼ同じであるか、それより高く、例えば、栄養ポリペプチド中のＥＡＡ密度は、農業由来食品中に存在するポリペプチド又は参照栄養性ポリペプチドより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又は５００％超高い。
いくつかの態様では、栄養ポリペプチドは、所望の密度の芳香族アミノ酸（「ＡＡＡ」、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、及びチロキシンを含む）を有するように選択される。ＡＡＡは、例えば神経発達及び運動による疲労の防止に有用である。例えば、ＡＡＡ密度は、全長参照栄養性ポリペプチド中に存在する必須アミノ酸の密度とほぼ同じであるかそれより高く、例えば、栄養ポリペプチド中のＡＡＡ密度は、農業由来食品中に存在するポリペプチド又は参照栄養性ポリペプチドより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又は５００％超高い。
いくつかの態様では、栄養ポリペプチドは、所望の密度の分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を有するように選択される。例えば、ＢＣＡＡ密度は、個々のＢＣＡＡ又は全ＢＣＡＡの含有量のいずれであれ、全長参照栄養性ポリペプチド中に存在する分岐鎖アミノ酸の密度とほぼ同じであるかそれより高く、例えば、栄養ポリペプチド中のＢＣＡＡ密度は、農業由来食品中に存在するポリペプチド又は参照栄養性ポリペプチドより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又は５００％超高い。栄養ポリペプチド中のＢＣＡＡ密度は、ＥＡＡ密度等の１又は複数の属性と組み合わせて選択することもできる。
いくつかの態様では、栄養ポリペプチドは、所望の密度のアミノ酸アルギニン、グルタミン、及び／又はロイシン（ＲＱＬアミノ酸）を有するように選択される。例えば、ＲＱＬアミノ酸密度は、全長参照栄養性ポリペプチド中に存在する必須アミノ酸の密度とほぼ同じであるかそれより高く、例えば、栄養ポリペプチド中のＲＱＬアミノ酸密度は、農業由来食品中に存在するポリペプチド又は参照栄養性ポリペプチドより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又は５００％超高い。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非スレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＴｈｒアミノ酸残基置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非アルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＡｒｇアミノ酸残基置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非ヒスチジン（Ｈｉｓ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＨｉｓアミノ酸残基置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は参照分泌タンパク質中の非リジン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＬｙｓアミノ酸残基置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非ロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非イソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非バリン（Ｖａｌ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＶａｌアミノ酸残基置換を含む。
別の態様では、単細胞生物から分泌されるように改変されており、それから精製された、天然ポリペプチド又はその変異体に相同なアミノ酸配列を含む栄養ポリペプチドが提供される。そのような相同なポリペプチドは、天然ポリペプチド又はその変異体と、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超類似していてよく、又は７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超同一であってよい。そのような栄養ポリペプチドは、宿主細胞に内因性であっても外因性であってもよく、宿主細胞中に天然で分泌型であってもよく、その両方であってもよく、分泌されるように改変されていてもよい。
本明細書中のいくつかの実施形態では、天然タンパク質の断片が選択され、場合により単離される。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも２５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも２５アミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも５０アミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、単離された組換え型タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、第１のポリペプチド配列を含み、第１のポリペプチド配列は、天然タンパク質の少なくとも２５又は少なくとも５０アミノ酸の断片を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は単離されている。いくつかの実施形態では、タンパク質は組換え型である。いくつかの実施形態では、タンパク質は天然タンパク質の少なくとも５０アミノ酸の断片を含む第１のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は単離された組換え型タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離された組換え型タンパク質は、単離されていない且つ／又は非組換え型の形態で提供される。
本明細書中、場合によっては、ポリペプチド、タンパク質、又は組成物中の特定の種類のアミノ酸部分が、対象となるポリペプチド、タンパク質、又は組成物中に存在するアミノ酸の総重量に対するその種類のアミノ酸の重量比に基づいて定量化される。この値は、ポリペプチド、タンパク質、又は組成物中の特定のアミノ酸の重量をポリペプチド、タンパク質、又は組成物中に存在する全アミノ酸の重量で割ることにより計算される。
別の場合には、目的のポリペプチド又はタンパク質中に存在するアミノ酸の総数に対するポリペプチド又はタンパク質中に存在する特定の種類のアミノ酸残基の割合が用いられる。この値は、ポリペプチド又はタンパク質の各分子中に存在する問題のアミノ酸の数をポリペプチド又はタンパク質の各分子中に存在するアミノ酸残基の総数で割ることにより計算される。当業者には、これら２つの方法に互換性があること及びポリペプチド又はタンパク質中に存在するある種類のアミノ酸の重量比をその特定のアミノ酸の割合に変換すること及びその逆が可能であることが理解される。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、１０〜５，０００アミノ酸、２０〜２，０００アミノ酸、２０〜１，０００アミノ酸、２０〜５００アミノ酸、２０〜２５０アミノ酸、２０〜２００アミノ酸、２０〜１５０アミノ酸、２０〜１００アミノ酸、２０〜４０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、５０〜７０アミノ酸、６０〜８０アミノ酸、７０〜９０アミノ酸、８０〜１００アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１１アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１３アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも１６アミノ酸、少なくとも１７アミノ酸、少なくとも１８アミノ酸、少なくとも１９アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２１アミノ酸、少なくとも２２アミノ酸、少なくとも２３アミノ酸、少なくとも２４アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも４５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも５５アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも６５アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも８５アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも９５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１０５アミノ酸、少なくとも１１０アミノ酸、少なくとも１１５アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１２５アミノ酸、少なくとも１３０アミノ酸、少なくとも１３５アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１４５アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１５５アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１６５アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、少なくとも１７５アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも１８５アミノ酸、少なくとも１９０アミノ酸、少なくとも１９５アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２０５アミノ酸、少なくとも２１０アミノ酸、少なくとも２１５アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２３０アミノ酸、少なくとも２３５アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２４５アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、２０〜５，０００アミノ酸、２０〜２，０００アミノ酸、２０〜１，０００アミノ酸、２０〜５００アミノ酸、２０〜２５０アミノ酸、２０〜２００アミノ酸、２０〜１５０アミノ酸、２０〜１００アミノ酸、２０〜４０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、５０〜７０アミノ酸、６０〜８０アミノ酸、７０〜９０アミノ酸、８０〜１００アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも２４５５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも５５アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも６５アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも８５アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも９５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１０５アミノ酸、少なくとも１１０アミノ酸、少なくとも１１５アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１２５アミノ酸、少なくとも１３０アミノ酸、少なくとも１３５アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１４５アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１５５アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１６５アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、少なくとも１７５アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも１８５アミノ酸、少なくとも１９０アミノ酸、少なくとも１９５アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２０５アミノ酸、少なくとも２１０アミノ酸、少なくとも２１５アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２３０アミノ酸、少なくとも２３５アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２４５アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸からなる。いくつかの態様では、タンパク質又はその断片は、第１のドメイン及び第２のドメインの少なくとも２つのドメインを含む。２つのドメインの１つはタグドメインを含み得、これは所望であれば除去することができる。各ドメインの長さは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２５超のアミノ酸であり得る。例えば、第１のドメインは、長さ１８アミノ酸の目的のポリペプチドであり得、第２のドメインは、長さ７アミノ酸のタグドメインであり得る。別の例として、第１のドメインは、長さ１７アミノ酸の目的のポリペプチドであり得、第２のドメインは、長さ８アミノ酸のタグドメインであり得る。
本明細書中のいくつかの実施形態では、天然タンパク質の断片が選択され、場合により単離される。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも２５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも２５アミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも５０アミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、単離された組換え型タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、タンパク質は第１のポリエプチド配列を含み、第１のポリエプチド配列は、天然タンパク質の少なくとも２５又は少なくとも５０アミノ酸の断片を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は単離されている。いくつかの実施形態では、タンパク質は組換え型である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然タンパク質の少なくとも５０アミノ酸の断片を含む第１のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は単離された組換え型タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離された組換え型タンパク質は、単離されていない且つ／又は非組換え型の形態で提供される。
本開示は、参照分泌タンパク質のアミノ酸配列と比べて変化したアミノ酸配列を含む少なくとも２０アミノ酸の配列を含む改変タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質のアミノ酸配列と比べて変化したアミノ酸配列を含む少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも４５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも８５アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも９５アミノ酸、又は少なくとも１００アミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質のアミノ酸配列と比べて変化したアミノ酸配列を含む少なくとも２０〜３０アミノ酸、少なくとも２０〜４０アミノ酸、少なくとも２５〜５０アミノ酸、又は少なくとも５０〜１００アミノ酸の配列を含む。本明細書において、「参照分泌タンパク質」とは、適合微生物中で発現した時にその微生物から分泌されるタンパク質である。「適合微生物」とは、分泌のためのタンパク質を合成及び処理するために必須の機構を含むものである。参照分泌タンパク質は、天然タンパク質（すなわち、生物中で天然に生じるタンパク質）であってもよく、非天然タンパク質（すなわち、生物中で天然に生じないタンパク質）であってもよい。天然の特定の参照分泌タンパク質のための適合微生物には、その中で参照分泌タンパク質が天然に生じる微生物が必ず含まれる。
参照分泌タンパク質と改変タンパク質の配列間の変化は、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間で配列アラインメントを行い、異なっているアミノ酸位置を特定することにより定めることができる。いくつかの実施形態では、改変タンパク質中の変化したアミノ酸配列を含む少なくとも２０アミノ酸の配列が、参照分泌タンパク質中の相同な配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％相同である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質のアミノ酸配列は、参照分泌タンパク質と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％相同である。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合は、参照分泌タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合より高い。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の少なくとも１つの必須アミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非分岐鎖アミノ酸残基の少なくとも１つの分岐鎖アミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非アルギニン（Ａｒｇ）又は非グルタミン（Ｇｌｕ）アミノ酸残基の少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）又はグルタミン（Ｇｌｕ）アミノ酸残基置換を含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕ（Ｌｅｕ）アミノ酸残基の少なくとも１つのロイシンアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、Ｌｅｕ頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、Ｌｅｕ頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが０より大きいアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｌｅｕアミノ酸残基置換はアミノ酸１個当たりの位置エントロピーが少なくとも１．５のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。
改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも２つの非ロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸残基が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基で置換されており、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下であり、各アミノ酸置換の全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、位置エントロピーが少なくとも１．５の位置において参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも１つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも２つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含み、Ｌｅｕアミノ酸残基置換それぞれからの、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への独立して考慮される寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｌｅｕ置換による全自由フォールディングエネルギーが０．５以下の位置において参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも１つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも２つのＬｅｕアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＬｅｕアミノ酸残基置換それぞれからの、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換の全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非バリン（Ｖａｌ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＶａｌアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、Ｖａｌ頻度スコアが０より高いアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、Ｖａｌ頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが０より大きいアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが０より大きいアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｖａｌアミノ酸残基置換は、アミノ酸１個当たりの位置エントロピーが少なくとも１．５のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。
改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも２つの非バリン（Ｖａｌ）アミノ酸残基が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基により置換されており、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、位置エントロピーが少なくとも１．５の位置において参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも１つのＶａｌアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも２つのＶａｌアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮される各Ｖａｌアミノ酸残基置換の、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換で全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｖａｌ置換による全自由フォールディングエネルギーが０．５以下の位置において参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも１つのＶａｌアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも２つのＶａｌアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＶａｌアミノ酸残基置換のそれぞれに由来する参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換で全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非イソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、Ｉｌｅ頻度スコアが０より大きいアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、Ｉｌｅ頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが０より大きいアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが０より大きいアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、疎水性アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、Ｉｌｅアミノ酸残基置換は、アミノ酸１個当たりの位置エントロピーが少なくとも１．５のアミノ酸位置である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質の間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。
改変タンパク質のいくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも２つの非イソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基により置換されており、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下であり、各アミノ酸置換について全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、位置エントロピーが少なくとも１．５の位置において参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも１つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差は０．５以下である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも２つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＩｌｅアミノ酸残基置換のそれぞれによる参照分泌タンパク質と改変タンパク質の間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換で全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｉｌｅ置換による全自由フォールディングエネルギーが０．５以下である位置において参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも１つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも２つのＩｌｅアミノ酸残基置換を含み、独立して考慮されるＩｌｅアミノ酸残基置換のそれぞれに由来する参照分泌タンパク質と改変タンパク質の間の全フォールディング自由エネルギーの差への寄与は０．５以下であり、各アミノ酸置換で全フォールディング自由エネルギーの主要エネルギー成分は異なる。
本明細書において、「Ｌｅｕ頻度スコア」等の「アミノ酸頻度スコア」は、相同なタンパク質の天然配列間の相同な位置で特定のアミノ酸又はアミノ酸タイプが生じる頻度の尺度である。したがって、参照分泌タンパク質について、マルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）を用いて相同な配列のセットが特定され、配列がアラインメントされた場合、ＭＳＡ中の全ての配列にわたり各位置で各アミノ酸が現れる頻度を決定することができ、頻度スコアを各位置の各アミノ酸に割り当てることができる。あるいは、アミノ酸は、分岐鎖アミノ酸、必須アミノ酸、又は疎水性アミノ酸等の種類でグループ化され得、頻度スコアは、各位置での各種類の任意のメンバーの出現率に基づいて計算することができる（本明細書中では「アミノ酸タイプ頻度スコア」と呼ぶ）。アミノ酸頻度スコア及びアミノ酸タイプ頻度スコアを用いて、参照分泌タンパク質配列中のその位置に現れるアミノ酸と異なるアミノ酸による置換に耐性のある参照分泌タンパク質配列中のアミノ酸位置を特定することができる。例えば、Ｌｅｕ以外のアミノ酸を有するが比較的高いＬｅｕ頻度スコアを有する参照配列中の位置をＬｅｕで置換して、Ｌｅｕ含有量が高められた改変タンパク質を作製することができる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎ（「Ｎ」は任意のアミノ酸を意味する）アミノ酸頻度スコアが０より高い位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０１の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０２の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０３の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０４の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０６の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０７の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０８の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０９の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１１の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１２の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１３の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１４の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１６の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１７の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１８の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１９の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．２０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．２５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．３０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．３５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．４０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．４５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、Ｎアミノ酸頻度スコアが少なくとも０．５０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸ＮはＬｅｕ、Ｉｌｅ、及びＶａｌから選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸ＮはＡｒｇ及びＧｌｕから選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸Ｎは必須アミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸Ｎは疎水性アミノ酸から選択される。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが０より高い位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換（「Ｎ」は任意のアミノ酸を意味する）を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０１の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０２の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０３の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０４の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０６の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０７の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０８の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０９の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１１の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１２の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１３の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１４の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１６の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１７の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１８の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１９の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．２０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．２５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．３０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．３５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．４０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．４５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、分岐鎖アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．５０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸ＮはＬｅｕ、Ｉｌｅ、及びＶａｌから選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸Ｎは必須アミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸Ｎは疎水性アミノ酸から選択される。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが０より高い位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換（「Ｎ」は任意のアミノ酸を意味する）を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０１の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０２の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０３の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０４の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０６の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０７の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０８の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．０９の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１１の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１２の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１３の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１４の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１６の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１７の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１８の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．１９の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．２０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．２５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．３０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．３５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．４０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．４５の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、必須アミノ酸頻度スコアが少なくとも０．５０の位置に少なくとも１つのアミノ酸Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、アミノ酸ＮはＬｅｕ、Ｉｌｅ、及びＶａｌから選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸Ｎは必須アミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸Ｎは疎水性アミノ酸から選択される。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質になされるアミノ酸置換は、置換の少なくとも１つについて、参照分泌タンパク質（置換なし）と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差が−０．５、−０．４、−０．３、−．０．２、−０．１、０、０．１、０．２、０．３、０．４、又は０．５以下であるように選択される。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質になされるアミノ酸置換は、参照分泌タンパク質と改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差が−０．５、−０．４、−０．３、−．０．２、−０．１、０、０．１、０．２、０．３、０．４、又は０．５以下であるように選択される。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質になされるアミノ酸置換は、置換の少なくとも１つについて、位置エントロピーが少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２．０、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、又は少なくとも３．０であるように選択される。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非必須アミノ酸残基が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の１０〜５０個の非必須アミノ酸残基が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の２５〜５０個の非必須アミノ酸残基が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個の非必須アミノ酸残基が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非分岐鎖アミノ酸残基が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の１０〜５０個の非分岐鎖アミノ酸残基が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の２５〜５０個の非分岐鎖アミノ酸残基が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個の非分岐鎖アミノ酸残基が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非Ｌｅｕアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の１０〜５０個の非Ｌｅｕアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の２５〜５０個の非Ｌｅｕアミノ酸残基が、改変タンパク質中で置換されたＬｅｕアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個の非Ｌｅｕアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非Ｖａｌアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の１０〜５０個の非Ｖａｌアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の２５〜５０個の非Ｖａｌアミノ酸残基が、改変タンパク質中で、置換されたＶａｌアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個の非Ｖａｌアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の５〜５０個の非Ｉｌｅアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の１０〜５０個の非Ｉｌｅアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の２５〜５０個の非Ｉｌｅアミノ酸残基が、改変タンパク質中で、置換されたＩｌｅアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個の非Ｉｌｅアミノ酸残基が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の１０〜５０％が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の２５〜５０％が、改変タンパク質中で必須アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％が、改変タンパク質で必須アミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非分岐鎖アミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非分岐鎖アミノ酸残基の１０〜５０％が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非分岐鎖アミノ酸残基の２５〜５０％が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非分岐鎖アミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％が、改変タンパク質中で分岐鎖アミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の１０〜５０％が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の２５〜５０％が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％が、改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の１０〜５０％が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の２５〜５０％が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｖａｌアミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％が、改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の１０〜５０％が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の２５〜５０％が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ｉｌｅアミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％が、改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ａｒｇアミノ酸残基の５〜５０％が、改変タンパク質中でＡｒｇアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ａｒｇアミノ酸残基の１０〜５０％が、改変タンパク質中でＡｒｇアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ａｒｇアミノ酸残基の２５〜５０％が、改変タンパク質中でＡｒｇアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質中の非Ａｒｇアミノ酸残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％が、改変タンパク質中でＡｒｇアミノ酸残基によって置換されている。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、又は少なくとも５０個のアミノ酸残基の挿入を含む少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸挿入は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の必須アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸挿入は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の分岐鎖アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸挿入は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％の疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸挿入は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％のＬｅｕを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸挿入は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％のＩｌｅを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸挿入は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％のＶａｌを含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸配列挿入は、改変タンパク質の末端に位置する。
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、肝臓酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を非機能性にするその遺伝子中の変異を特徴とする常染色体劣性遺伝性の代謝性遺伝子性障害である。この酵素は、フェニルアラニンをチロシンに代謝するのに必要である。ＰＡＨ活性が低下すると、フェニルアラニンが蓄積し、ピルビン酸フェニル（フェニルケトンとしても知られる）に変換され、尿中に検出される。非処置の子供は、出生時には正常であるが、発達初期の重要な段階を獲得できず、小頭症を発症し、脳機能の進行性の障害を示す。活動過多、ＥＥＧの異常及び痙攣、並びに重度の学習障害が人生でその後の主な臨床的問題となる。皮膚、髪、汗、及び尿の特徴的匂い（酢酸フェニルの蓄積による）；並びに色素脱失及び湿疹の傾向も観察される。全てのＰＫＵ患者はＰｈｅの少ない特別食を守らなければならない。したがって、ＰＫＵ患者による利用が意図される改変タンパク質はＰｈｅ残基が少ない又はこれを含まないべきである。これは、Ｐｈｅ残基をほとんど又は全く有さない参照分泌タンパク質を選択することによりなされ得る。あるいは、参照分泌タンパク質は１又は複数のＰｈｅ残基を含んでよく、そのようなＰｈｅ残基が、改変タンパク質中で非Ｐｈｅ残基に置換されてもよい。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質配列中に存在するＰｈｅ残基が、Ｔｙｒ等の非Ｐｈｅ残基で置換される。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質及び／又は改変タンパク質は、全アミノ酸残基に対するＰｈｅ残基の割合が５％、４％、３％、２％、又は１％以下である。いくつかの実施形態では、参照分泌タンパク質及び／又は改変タンパク質は、１０個以下のＰｈｅ残基、９個以下のＰｈｅ残基、８個以下のＰｈｅ残基、７個以下のＰｈｅ残基、６個以下のＰｈｅ残基、５個以下のＰｈｅ残基、４個以下のＰｈｅ残基、３個以下のＰｈｅ残基、２個以下のＰｈｅ残基、又は１個のＰｈｅ残基を含むか、Ｐｈｅ残基を含まない。
アルギニンは条件付き非必須アミノ酸であり、すなわち、ほとんどの場合、ヒトの体が生産でき、食事から直接得る必要がない。栄養不良の人、高齢者、又はある特定の健康状態（例えば、敗血症）の人は充分な量のアルギニンを生産しないことがあるので、アルギニンを含む食物の摂取を増やす必要がある。アルギニンは、傷害の治癒時間の短縮（特に骨）及び血圧、特にハイリスク妊娠（子癇前症）中の高血圧の低下を含む健康に有益な特性を有すると考えられている。更に、研究により、自然の子宮内発育遅延を患うブタの生殖能力の強化、乳で育った子ブタのタンパク質沈着及び出生後の成長の改善、ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットにおける血漿グルコースレベルの正常化、肥満のズッカー糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラットの脂肪量の減少、並びに糖尿病ラットにおける血管機能の向上にＬ−アルギニンの食事補充が有益であることが示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている改変タンパク質は、改変タンパク質中の全アミノ酸残基に対するアルギニン残基の割合が、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、又は１２％以上である。
消化率は、改変タンパク質の栄養的利点及び有用性に関連するパラメーターである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている改変タンパク質は、消化率を評価するためにスクリーニングされる。タンパク質の消化率は、当該技術分野で公知の任意の好適な方法で評価することができる。いくつかの実施形態では、Ｍｏｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．に記載されている生理学的に関連する二相系を用いたインビトロでの胃及び十二指腸消化アッセイがこのために用いられる。Ｍｏｒｅｎｏ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ Ｂｒａｚｉｌ ｎｕｔ ２Ｓ ａｌｂｕｍｉｎ （Ｂｅｒ ｅ １） ｔｏ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．” ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ， ３４１−３５２ （２００５）。簡潔に述べると、実験タンパク質を順番に、人工胃液（ＳＧＦ）に１２０分間曝した後、人工十二指腸液（ＳＤＦ）に移して更に１２０分間消化する。消化の種々の段階のタンパク質試料（例えば、２、５、１５、３０、６０及び１２０分）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により消化について分析する。各試料（２０μＬ）を１０μＬの超純水及び１０μＬの４×ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅバッファーに加え、９５℃で１０分間加熱する。試料（１０μＬ）を１５レーンの１２％ポリアクリルアミド ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにローディングし、２００Ｖで３５分間流した後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎを用いて染色する。アッセイ中、経時的なタンパク質の消失はタンパク質が消化される速度を示している。このアッセイを用いて、相対的消化率又は絶対的消化率を評価することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている改変タンパク質の消化率は、乳清タンパク質より高い（すなわち、より速くアッセイの検出限界より低くまで消化される）。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は２分、５分、１５分、３０分、６０分、又は１２０分までにアッセイで検出不能になる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質の消化率は、タンパク質アミノ酸配列中の消化プロテアーゼ認識部位の特定及び定量化により評価される。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、ペプシン認識部位、トリプシン認識部位、及びキモトリプシン認識部位から選択される少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質に少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を付加するために参照分泌タンパク質アミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸変異がなされる。
本明細書において、「ペプシン認識部位」とは、ペプシンにより切断されることが実験的に示されているポリペプチド配列中の任意の部位である。いくつかの実施形態では、これは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基の後（すなわち下流）のペプチド結合であり、但し、続く残基は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基ではない。
本明細書において、「トリプシン認識部位」とは、トリプシンにより切断されることが実験的に示されているポリペプチド配列中の任意の部位である。いくつかの実施形態では、これは、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選択されるアミノ酸残基の後のペプチド結合であり、但し、続く残基はプロリンではない。
本明細書において、「キモトリプシン認識部位」とは、キモトリプシンにより切断されることが実験的に示されているポリペプチド配列中の任意の部位である。いくつかの実施形態では、これは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基の後のペプチド結合である。
タンパク質中のジスルフィド結合されたシステイン残基は、ジスルフィド結合がない場合と比べてタンパク質の消化速度を低下させる傾向がある。したがって、ジスルフィド結合のより少ないタンパク質の消化率は、より多くのジスルフィド結合を有する同様なタンパク質より高い傾向がある。したがって、いくつかの実施形態では、存在するシステイン残基の数を特定して比較的少数のシステイン残基を含む改変タンパク質を選択できるように、本明細書中に開示されている改変タンパク質をスクリーニングする。いくつかの実施形態では、改変タンパク質中の少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を除去するために参照分泌タンパク質アミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸置換がなされる。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、全アミノ酸残基に対するＣｙｓ残基の割合が５％、４％、３％、２％、又は１％以下である。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、１０個以下のＣｙｓ残基、９個以下のＣｙｓ残基、８個以下のＣｙｓ残基、７個以下のＣｙｓ残基、６個以下のＣｙｓ残基、５個以下のＣｙｓ残基、４個以下のＣｙｓ残基、３個以下のＣｙｓ残基、２個以下のＣｙｓ残基、又は１個のＣｙｓ残基を含むか、Ｃｙｓ残基を含まない。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は可溶性である。溶解度は、当該技術分野で公知の任意の方法により測定することができる。いくつかの実施形態では、遠心濃縮及びその後のタンパク質濃度アッセイにより溶解度が調べられる。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中のタンパク質試料のタンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（サーモサイエンティフィック社）及びＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＣＡ） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（シグマ アルドリッチ社）の２つの方法を用いてプロトコールに従いタンパク質濃度について試験する。これらの測定値に基づき、１０ｍｇのタンパク質をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３ｋＤａ遠心フィルター（ミリポア社）に加える。１０，０００×ｇで３０分間の遠心により試料を濃縮する。この濃縮された最終試料を沈殿タンパク質について調べた後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ及びＢＣＡの２つの方法を用いて上記のようにタンパク質濃度について試験する。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質の最終的な溶解限度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｌｉｍｉｔ）は、生理学的ｐＨで少なくとも５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、又は１００ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、改変タンパク質の溶解度は５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、又は９９．５％超であり、生理学的ｐＨで５ｇ／Ｌ、又は１０ｇ／Ｌ、又は２０ｇ／Ｌ、又は３０ｇ／Ｌ、又は４０ｇ／Ｌ、又は５０ｇ／Ｌ、又は１００ｇ／Ｌより高い濃度で沈殿タンパク質は観察されなかった。いくつかの実施形態では、改変タンパク質の溶解度は、乳清及びソイの溶解限度を調べた研究で通常報告されている溶解度（それぞれ、１２．５ｇ／Ｌ；Ｐｅｌｅｇｒｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｂｅｎｓｍ．−Ｗｉｓｓ． Ｕ．−Ｔｅｃｈｎｏｌ． ３８ （２００５） ７７−８０及び１０ｇ／Ｌ；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＯＣＳ ８０（１） （２００３） ８５−９０）より高い。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は安定性の向上を示す。本明細書において、「安定な」タンパク質とは、対象となるタンパク質の生物物理学的特徴（例えば、溶解度）、生物学的特徴（例えば、消化率）、又は組成的特徴（例えば、ロイシンアミノ酸の割合）を変える変化（例えば、アンフォールディング、酸化、凝集、加水分解等）に抵抗するものである。
タンパク質の安定性は、当該技術分野で公知の種々のアッセイを用いて測定することができ、本明細書に開示されている改変タンパク質は閾値より高い安定性を有し得る。いくつかの実施形態では、乳清タンパク質に匹敵するかこれより良い熱安定性を示すタンパク質が選択される。いくつかの実施形態では、改変タンパク質試料の安定性は、極端な温度に曝した後に分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて凝集形成をモニタリングすることにより決定される。試験対象のタンパク質試料は水中に１０ｇ／Ｌのタンパク質で調製され、充分に混合される。タンパク質溶液を９０℃のヒートブロックに置き、０、１、５、１０、３０、及び６０分後にＳＥＣ分析用の試料を取る。
例えば、ＳＥＣ分析は、２０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４及び１３０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７）を移動相としてＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣを用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて行うことができる。加熱後、試料を２ｇ／Ｌに希釈して１０μｌをカラムに注入する。２１４ｎｍの吸光度をモニタリングすることによりタンパク質を検出し、凝集体は、目的のタンパク質よりサイズの大きいピーク（より速く溶出する）を特徴とする。ピーク面積に全体的変化がないことは、熱処理中にタンパク質の沈殿がないことを示している。乳清タンパク質は、このアッセイで９０℃に曝された時、約８０％の凝集体を急速に形成する。いくつかの実施形態では、本開示の改変タンパク質は凝集に対する抵抗性を示し、例えば、８０％未満の凝集、１０％未満の凝集、又は検出不能な凝集を示す。
ほとんどの実施形態で、改変タンパク質は不適切に高いアレルゲン性を示さないことが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、改変タンパク質の潜在的アレルゲン性が評価される。これは、当該技術分野で公知の任意の好適な方法で行うことができる。いくつかの実施形態では、アレルゲン性スコアが計算される。アレルゲン性スコアは、タンパク質が任意の既知のアレルゲンにどれだけ類似しているかを評価するためのＷＨＯの勧告（例えば、ｗｗｗ．ｆａｏ．ｏｒｇ／ａｇ／ａｇｎ／ｆｏｏｄ／ｐｄｆ／ａｌｌｅｒｇｙｇｍ．ｐｄｆ参照）に基づく一次配列に基づく測定基準であり、主な仮定は、標的と既知アレルゲンとの間のパーセント同一性高いと交差反応性の可能性があるというものである。所与のタンパク質について、アレルゲン性スコアは、全ての可能性のある連続８０アミノ酸断片を調べ、ＦＡＳＴＡアルゴリズムをＢＬＯＳＵＭ５０ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ、ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝２で用いて各断片を既知アレルゲン配列のデータベースとローカルアラインメントすることにより見出すことができる。任意の８０アミノ酸窓の任意のアレルゲンとの最大のパーセント同一性を、目的のタンパク質の最終スコアとする。ＷＨＯの指針は３５％の同一性カットオフを用いることを示唆している。いくつかの実施形態では、改変タンパク質のアレルゲン性スコアは３５％未満である。いくつかの実施形態では、３５％未満の同一性がカットオフとして用いられる。いくつかの実施形態では、３０％〜３５％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、２５％〜３０％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、２０％〜２５％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、１５％〜２０％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、１０％〜１５％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、 ５％〜１０％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、０％〜５％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、３５％超の同一性がカットオフとして用いられる。いくつかの実施形態では、３５％〜４０％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、４０％〜４５％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、４５％〜５０％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、５０％〜５５％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、５５％〜６０％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、６５％〜７０％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、７０％〜７５％同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態では、７５％〜８０％同一性のカットオフが用いられる。
当業者は、この目的のために既知アレルゲンの好適なデータベースを特定して利用することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のデータベース源からタンパク質を選択することによりデータベースが作成される。いくつかの実施形態では、カスタムデータベースは、Ｆｏｏｄ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／）、ＵＮＩＰＲＯＴアノテーション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ａｌｌｅｒｇｅｎ）、及びＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＳＤＡＰ、ｈｔｔｐ：／／ｆｅｒｍｉ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ＳＤＡＰ／ｓｄａｐ＿ｌｎｋ．ｈｔｍｌ）に収集されているプールされたアレルゲンリストを含む。このデータベースは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｉｔｉｅｓ（ＩＵＩＳ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇ／）による現在認められている全てのアレルゲン及びまだ正式に命名されていない多数の更なるアレルゲンを含む。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質の様々な長さ（例えば、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、８、又は６アミノ酸窓）の連続アミノ酸窓の全て（又は選択されたサブセット）をアレルゲンデータベースに対して調べ、１００％の同一性、９５％以上の同一性、９０％以上の同一性、８５％以上の同一性、８０％以上の同一性、 ７５％以上の同一性、７０％以上の同一性、６５％以上の同一性、６０％以上の同一性、 ５５％以上の同一性、又は５０％以上の同一性の合致を有するペプチド配列を特定して、潜在的アレルゲン性について更に調べる。
改変タンパク質の有用性を高めることができる特徴の１つは電荷（又はアミノ酸１個当たりの電荷）である。より荷電の大きい改変タンパク質は、いくつかの実施形態において、溶解度の上昇、安定性の向上、凝集への抵抗性、及び望ましい味の特性等の望ましい特徴を示すことができる。例えば、溶解度の上昇を示す荷電した改変タンパク質を、比較的小体積の溶液中に高濃度の改変タンパク質を含む飲料又は液体製剤に製剤化することができ、したがって、単位体積当たり高用量のタンパク質栄養を送達することができる。溶解度の上昇を示す荷電した改変タンパク質は、使用者（例えば、運動選手）が身体活動の前、最中、又は後にタンパク質を摂取したいスポーツドリンク又は回復ドリンクにおいて有用であり得る。溶解度の上昇を示す荷電した改変タンパク質は更に、対象（例えば、患者又は高齢者）がタンパク質栄養を必要とするが固形食物又は大量の液体を摂取できない臨床的状況において特に有用であり得る。
ある特定の遊離アミノ酸及び遊離アミノ酸混合物は、苦い又はその他の不快な味を有することが知られている。更に、一般的なタンパク質（例えば、乳清及びソイ）の加水分解産物はしばしば苦いか不快な味である。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示及び説明されている改変タンパク質は、苦い又はその他の不快な味を有さない。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示及び説明されている改変タンパク質は、遊離アミノ酸、遊離アミノ酸の混合物、及び／又はタンパク質加水分解産物の少なくとも１つより容認できる味を有する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示及び説明されている改変タンパク質は、乳清タンパク質及び乳清タンパク質加水分解産物の少なくとも１つに匹敵するかそれを超える味を有する。
タンパク質は、甘味、酸味、苦味、塩味、及び旨味の５つの確立された味の種類を網羅する味を有することが知られている。特定のタンパク質（又はその不足）の味は、一次構造、荷電側鎖の存在、並びにタンパク質の電子的及びコンホメーション的特徴を含む複数の因子に起因し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示及び説明されている改変タンパク質は、所望の味（例えば、甘味、塩味、旨味）を有するように又は望ましくない味（例えば、苦味、酸味）を有さないように設計される。この文脈において、「設計する」とは、例えば、所望の味特性を実現する特徴が具現化された天然タンパク質の選択及び所望の味プロファイルを有する天然タンパク質のムテインの創出を含む。例えば、改変タンパク質は、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２−Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー）又は旨味受容体（Ｔ１Ｒ１−Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマー、ｍＧｌｕＲ４、及び／又はｍＧｌｕＲ１）等の特異的味受容体と相互作用するように設計され得る。更に、改変タンパク質は、苦味受容体（Ｔ２Ｒ受容体）等のその他の味受容体と相互作用しないように又は相互作用が減少するように設計され得る。
本明細書に開示及び説明されている改変タンパク質は更に、摂取された時に口の中で異なる物理的感覚を生じさせることができ、これは「口当たり」とも呼ばれる。改変タンパク質の口当たりは、一次構造、荷電側鎖の存在、並びにタンパク質の電子的及びコンホメーション的特徴を含む１又は複数の因子によるものであり得る。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は摂取された時にバター又は脂肪の様な口当たりを生じさせる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、２０〜５，０００アミノ酸、２０〜２，０００アミノ酸、２０〜１，０００アミノ酸、２０〜５００アミノ酸、２０〜２５０アミノ酸、２０〜２００アミノ酸、２０〜１５０アミノ酸、２０〜１００アミノ酸、２０〜４０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、５０〜７０アミノ酸、６０〜８０アミノ酸、７０〜９０アミノ酸、８０〜１００アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも２４５５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも５５アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも６５アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも８５アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも９５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１０５アミノ酸、少なくとも１１０アミノ酸、少なくとも１１５アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１２５アミノ酸、少なくとも１３０アミノ酸、少なくとも１３５アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１４５アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１５５アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１６５アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、少なくとも１７５アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも１８５アミノ酸、少なくとも１９０アミノ酸、少なくとも１９５アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２０５アミノ酸、少なくとも２１０アミノ酸、少なくとも２１５アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２３０アミノ酸、少なくとも２３５アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２４５アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、２０〜５，０００アミノ酸、２０〜２，０００アミノ酸、２０〜１，０００アミノ酸、２０〜５００アミノ酸、２０〜２５０アミノ酸、２０〜２００アミノ酸、２０〜１５０アミノ酸、２０〜１００アミノ酸、２０〜４０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、５０〜７０アミノ酸、６０〜８０アミノ酸、７０〜９０アミノ酸、８０〜１００アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも２４５５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも５５アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも６５アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも８５アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、少なくとも９５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１０５アミノ酸、少なくとも１１０アミノ酸、少なくとも１１５アミノ酸、少なくとも１２０アミノ酸、少なくとも１２５アミノ酸、少なくとも１３０アミノ酸、少なくとも１３５アミノ酸、少なくとも１４０アミノ酸、少なくとも１４５アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１５５アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１６５アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、少なくとも１７５アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸、少なくとも１８５アミノ酸、少なくとも１９０アミノ酸、少なくとも１９５アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２０５アミノ酸、少なくとも２１０アミノ酸、少なくとも２１５アミノ酸、少なくとも２２０アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２３０アミノ酸、少なくとも２３５アミノ酸、少なくとも２４０アミノ酸、少なくとも２４５アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸からなる。
１．参照分泌タンパク質の特定方法
如何なる理論にも限定されるものではないが、参照分泌タンパク質のアミノ酸配列を修飾してタンパク質の少なくとも１つの栄養的特徴を改善することは、有用な栄養的アミノ酸組成のタンパク質を作製するための有用な方法であると考えられる。参照分泌タンパク質は生物によって天然に分泌されるので、いくつかの実施形態では、このアプローチを用いて、分泌される有用な栄養含有量のタンパク質を創出することができる。分泌はある特定の応用例における改変タンパク質の製造の助けとなり得るので、分泌栄養タンパク質は特定の実施形態において特に有用であり得る。
この目的のために、いくつかの実施形態では、目的の生物のタンパク質の注釈付きデータベースをスクリーニングして、分泌型として特徴付けられているものを特定する。代替の又は更なる方法は、目的の生物のタンパク質に関する配列情報をスクリーニングして、分泌リーダー配列を含むタンパク質を特定することである。代替の又は更なる方法は、目的の生物のタンパク質をコードするｃＤＮＡを得、それらのｃＤＮＡを機能的にスクリーニングして、分泌タンパク質をコードするものを特定することである。ある生物についてこれらの方法又は任意の同等な方法の１又は複数により特定される得られたタンパク質のセットは、その生物のセクレトームと呼ばれる。いくつかの実施形態では、任意の分泌タンパク質が本開示の方法における参照分泌タンパク質として用いられる。
いくつかの実施形態では、分泌タンパク質をスクリーニングして、タンパク質間結合相互作用を再改変するために以前の研究で用いられている構造的なドメイン及び／又はフォールドを含むものを特定する。ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ．， ａｎｄ Ｂｒｙａｎｔ， Ｓ． Ｈ． ”ＣＤ−Ｓｅａｒｃｈ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｌｙ”． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． （２００４） ３２： Ｗ３２７−Ｗ３３１）にそのようなタンパク質ドメインが含まれている。（Ｂｉｎｚ， ＫＨ， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． ”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ”． Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． （２００５） １６： ４５９−４６９； Ｇｅｂａｕｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， Ａ． ”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”． Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． （２００９） １３： ２４５−２５５； Ｌｅｈｔｉｏ， Ｊ．， Ｔｅｅｒｉ Ｔ． Ｔ．， ａｎｄ Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ． ”Ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ａ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄ”． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔ．， Ｆｕｎｃ．， Ｇｅｎｅ，． （２０００） ４１： ３１６−３２２；及びＯｌｓｏｎ ＣＡ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ ＲＷ． ”Ｄｅｓｉｇｎ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ”． Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． （２００７） １６： ４７６−４８４．）。したがって、データベースを用いて、既知の可変性の位置又は領域を有する強固で安定なフォールドを含むと予想されるタンパク質足場を特定することができ、そのような可変性の位置又は領域は、所望の全体的アミノ酸分布に合致するように調整することができる。いくつかの実施形態では、そのようなドメインを含む天然タンパク質を参照分泌タンパク質として用いる。いくつかの実施形態では、そのようなドメインを含む天然タンパク質の残りの部分の一部又は全部は、ドメインの誘導体を含む改変タンパク質中に含められない。
２．改変タンパク質中で修飾される参照分泌タンパク質中のアミノ酸位置の特定方法
本開示では、別のアミノ酸による置換のための参照分泌タンパク質中のアミノ酸位置、例えば、Ｌｅｕアミノ酸を用いた置換のための参照分泌タンパク質配列中のアミノ酸が非Ｌｅｕである位置、を特定するために用いることができる６つの因子が特定される。６つの因子は、アミノ酸尤度（ＡＡＬｉｋｅ）、アミノ酸タイプ尤度（ＡＡＴＬｉｋｅ）、位置エントロピー（Ｓｐｏｓ）、アミノ酸タイプ位置エントロピー（ＳＡＡＴｐｏｓ）、フォールディングの相対的自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）、及び二次構造アイデンティティー（ＬｏｏｐＩＤ）である。これらの因子は、以下の式３を用いた置換のためのアミノ酸位置の特定に組み合わされ得る。
式３：（（α）ＡＡＬｉｋｅ＋（β）ＡＡＴＬｉｋｅ＋（γ）Ｓｐｏｓ＋（δ）ＳＡＡＴｐｏｓ＋（ε）ΔΔＧｆｏｌｄ＋（ζ）ＬｏｏｐＩＤ）／（α＋β＋γ＋δ＋ε＋ζ）
式３中、係数α、β、γ、δ、ε、及びζは、分泌タンパク質中の位置のセットを順位付ける時の各因子の相対的重要性を示す当業者によって選択されるスケーリング係数である。いくつかの実施形態では１、２、３、４、又は５個の係数が０に設定される。
Ｂ．核酸
本明細書は更に、本明細書に開示される改変タンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は単離されている。いくつかの実施形態では、核酸は精製されている。いくつかの実施形態では、核酸は合成である。
いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に開示される改変タンパク質のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に開示される改変タンパク質のコード配列からなる。いくつかの実施形態では、核酸は、コード配列に作動可能に連結した発現調節配列を更に含む。
核酸のいくつかの実施形態では、核酸は、上記セクションＡに開示されている改変タンパク質をコードする核酸配列を含む。核酸のいくつかの実施形態では、核酸は、上記セクションＡに開示されている改変タンパク質をコードする核酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも９０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、栄養核酸は、１０〜１００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、又は２０〜４０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、栄養ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの全部又は一部を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然タンパク質の断片をコードするオープンリーディングフレームからなり、オープンリーディングフレームは、完全な天然タンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、核酸はｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、天然核酸と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．９％同一の配列を含む核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で少なくとも１つの参照核酸とハイブリダイズする核酸が提供される。
Ｃ．ベクター
更に、本明細書中で更に説明されるように、本明細書に開示されている核酸分子の少なくとも１つを含むベクター、例えば発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に開示されている改変タンパク質をコードする少なくとも１つの単離された核酸分子を含む。別の実施形態では、ベクターは、１又は複数の発現調節配列に作動可能に連結したそのような核酸分子を含む。したがって、ベクターは、組換え型微生物宿主細胞中で少なくとも１つの組換え型タンパク質を発現させるために用いることができる。
微生物中で核酸を発現させるための好適なベクターは当業者に周知である。シアノバクテリア中での使用に好適なベクターが例えばＨｅｉｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４９７， Ｃｈ． ２４ （２０１１）に記載されている。本明細書に開示されているシアノバクテリアの改変に用いることができる複製ベクターの例としてはｐＰＭＱＡＫ１、ｐＳＬ１２１１、ｐＦＣ１、ｐＳＢ２Ａ、ｐＳＣＲ１１９／２０２、ｐＳＵＮ１１９／２０２、ｐＲＬ２６９７、ｐＲＬ２５Ｃ、ｐＲＬ１０５０、ｐＳＧ１１１Ｍ、及びｐＰＢＨ２０１が含まれる。
本明細書に開示されている核酸配列を受けることができるｐＪＢ１６１等のその他のベクターも用いることができる。ｐＪＢ１６１等のベクターは、特定の光合成微生物に内在性のプラスミド（例えば、特定のシネココッカスの種のプラスミドｐＡＱ１、ｐＡＱ３、及びｐＡＱ４）中に存在する配列と相同な配列を含む。そのようなベクター及びその使用方法の例は当該技術分野で公知であり、例えば参照により本明細書に援用するＸｕ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ： Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ ７００２，” Ｃｈａｐｔｅｒ ２１ ｉｎ Ｒｏｂｅｒｔ Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ （ｅｄ．）， ”Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６８４， ２０１１に記載されている。インビボでのｐＪＢ１６１と内在性プラスミドとの間の組換えにより、それらの内在性プラスミドから目的の遺伝子を発現する改変微生物が得られる。あるいは、宿主細胞染色体と組み換えるようにベクターを操作してもよく、あるいは、宿主細胞の内在性プラスミドのいずれか又は宿主細胞染色体とは独立して目的の遺伝子が複製及び発現するようにベクターを改変してもよい。
組換え型タンパク質の生産に適したベクターの更なる例はｐＥＴシステム（ノバジェン社（登録商標））である。このシステムは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及び他の微生物中での使用について広く特徴解析されている。このシステムでは、強力なバクテリオファージＴ７転写及び（場合により）翻訳シグナルの制御下でｐＥＴプラスミドに標的遺伝子をクローニングし、宿主細胞中でのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのソースを提供することにより発現を誘導する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、非常に選択的且つ活性であるので、完全に誘導された場合、ほとんど全ての微生物資源が標的遺伝子発現へと変換され、誘導から数時間後に全細胞タンパク質の５０％超が所望の生産物で構成され得る。更に、単純に誘導物質の濃度を下げることで発現レベルを減弱することができる。発現レベルの低下は、一部の標的タンパク質の可溶性収量を高め得る。いくつかの実施形態では、このシステムは更に、転写的にサイレントな非誘導状態で標的遺伝子を維持することを可能にする。
このシステムを用いるいくつかの実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含まない宿主を用いて標的遺伝子がクローニングされ、したがって、宿主細胞に毒性であり得るタンパク質の生産によるプラスミドの不安定性に関連する潜在的問題が軽減される。非発現宿主中での確立後、λｐＬ及びｐＩプロモーターの制御下にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有するファージであるλＣＥ６を宿主に感染させることにより又はｌａｃＵＶ５制御下にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体性コピーを含む発現宿主中にプラスミドを転移させることにより、標的タンパク質発現を開始させることができる。２番目のケースでは、細菌培養にＩＰＴＧ若しくはラクトースを添加することにより又は自己誘導培地を用いて発現が誘導される。ｌａｃオペレーターにより制御されるが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要とせず、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの天然ＲＮＡポリメラーゼに頼るその他のプラスミド系としてはｐＴｒｃプラスミドスイート（ｐｌａｓｍｉｄ ｓｕｉｔｅ）（インビトロジェン社）又はｐＱＥプラミドスイート（キアゲン社）が含まれる。
別の実施形態では、発現宿主中に直接クローニングすることができる。２種類のＴ７プロモーター及び基底発現レベルの抑制のストリンジェンシーが異なる複数の宿主が利用可能であり、幅広い標的遺伝子の発現を最適化する能力及び大きな柔軟性が提供される。
本明細書に記載の組換え型遺伝子の発現に有用なプロモーターとしては、構成的及び誘導性／抑制性プロモーターの両方が含まれる。誘導性／抑制性プロモーターの例としては、ニッケル誘導性プロモーター（例えば、ＰｎｒｓＡ、ＰｎｒｓＢ；例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｕｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ （２００２） ｖ．４３： ２４７−２５６参照）及び尿素抑制性プロモーター、例えばＰｎｉｒＡ（例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （２００５） ｖ．７１： ５６７８−５６８４に記載）が含まれる。誘導性／抑制性プロモーターの更なる例としては、ＰｎｉｒＡ（硝酸塩によって誘導され、尿素によって抑制されるｎｉｒＡ遺伝子の発現を駆動するプロモーター）及びＰｓｕｆ（鉄ストレスによって誘導されるｓｕｆＢ遺伝子の発現を駆動するプロモーター）が含まれる。
構成的プロモーターの例としては、Ｐｃｐｃ（ｃｐｃオペロンの発現を駆動するプロモーター）、Ｐｒｂｃ（ｒｕｂｉｓｃｏの発現を駆動するプロモーター）、ＰｐｓｂＡＩＩ（光化学系ＩＩ反応中心のＤ１タンパク質の発現を駆動するプロモーター）、Ｐｃｒｏ（ｃｒｏの発現を駆動するラムダファージプロモーター）が含まれる。別の実施形態では、ＰａｐｈＩｌ及び／又はｌａｃｌｑ−Ｐｔｒｃプロモーターを発現制御に用いることができる。改変微生物中で複数の組換え型遺伝子が発現される場合、異なる遺伝子は、異なるプロモーターによって制御されてもよく、別個のオペロン中にある同一のプロモーターによって制御されてもよく、又は２個以上の遺伝子の発現がオペロンの一部として単一のプロモーターによって制御されてもよい。
誘導性プロモーターの更なる非限定的な例としては、限定されるものではないが、外因性タンパク質（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）の発現により、小分子（例えば、ＩＰＴＧ、ガラクトース、テトラサイクリン、ステロイドホルモン、アブシジン酸）の存在により、低濃度の小分子（例えば、ＣＯ２、鉄、窒素）又はその非存在により、金属又は金属イオン（例えば、銅、亜鉛、カドミウム、ニッケル）により、及び環境因子（例えば、熱、低温、ストレス、光、暗黒）により、及び増殖期により誘導されるものが含まれる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、誘導の非存在下でプロモーターを介して転写が実質的に開始されないようにしっかりと制御されている。いくつかの実施形態では、プロモーターの誘導は、他のプロモーターを介した転写を実質的に変化させない。更に、一般的に、誘導性プロモーターを誘導する化合物又は条件は、発現させたい生物又は環境中に天然に存在しないものである。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、シアノバクテリア培養物へのＣＯ２供給の制限により誘導される。非限定的な例として、誘導性プロモーターは、ｃｍｐ遺伝子、ｎｔｐ遺伝子、ｎｄｈ遺伝子、ｓｂｔ遺伝子、ｃｈｐ遺伝子、及びｒｂｃ遺伝子又はその変異体若しくは断片等のＣＯ２制限条件下で上方調節されるＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＰＣＣ ６８０３のプロモーター配列であり得る。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、鉄の飢餓により又は定常期に入ることにより誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ｉｓｉＡ等のＦｅ飢餓条件下で上方調節されるシアノバクテリア遺伝子のプロモーター配列の変異体配列又はｉｓｉＡ、ｐｈｒＡ、ｓｉｇＣ、ｓｉｇＢ、及びｓｉｇＨ遺伝子等の培養が定常期に入った時に上方調節されるシアノバクテリア遺伝子のプロモーター配列の変異体配列又はその変異体若しくは断片であり得る。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは金属又は金属イオンにより誘導される。非限定的な例として、誘導性プロモーターは、銅、亜鉛、カドミウム、水銀、ニッケル、金、銀、コバルト、及びビスマス又はそのイオンにより誘導され得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ニッケル又はニッケルイオンにより誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｎｉ２＋等のニッケルイオンにより誘導される。別の実施形態の例では、誘導性プロモーターはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＰＣＣ ６８０３由来のニッケル誘導性プロモーターである。別の実施形態では、誘導性プロモーターは銅又は銅イオンにより誘導され得る。更に別の実施形態では、誘導性プロモーターは、亜鉛又は亜鉛イオンにより誘導され得る。更に別の実施形態では、誘導性プロモーターは、カドミウム又はカドミウムイオンにより誘導され得る。更にまた別の実施形態では、誘導性プロモーターは水銀又は水銀イオンにより誘導され得る。代替的実施形態では、誘導性プロモーターは金又は金イオンにより誘導され得る。別の代替的実施形態では、誘導性プロモーターは銀又は銀イオンにより誘導され得る。更に別の代替的実施形態では、誘導性プロモーターはコバルト又はコバルトイオンにより誘導され得る。更に別の代替的実施形態では、誘導性プロモーターはビスマス又はビスマスイオンにより誘導され得る。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターを含む細胞を金属又は金属イオンに暴露することにより誘導される。細胞は、微生物成長培地に金属を加えることにより金属又は金属イオンに曝され得る。特定の実施形態では、微生物成長培地に添加される金属又は金属イオンは培地から効率的に回収され得る。別の実施形態では、回収後に培地中に残った金属又は金属イオンは下流での培地又は細菌遺伝子産物の処理を実質的に妨げない。
構成的プロモーターの更なる非限定的な例としては、グラム陰性細菌に由来する又はグラム陰性細菌中で増殖するバクテリオファージに由来する構成的プロモーターが含まれる。例えば、高度に発現されるグラム陰性遺伝子産物をコードする遺伝子のプロモーター、例えばＬｐｐ、ＯｍｐＡ、ｒＲＮＡ、及びリボソームタンパク質のプロモーターが用いられ得る。あるいは、制御可能なプロモーターが、そのプロモーターに対する制御タンパク質を欠いた株において用いられ得る。例えば、Ｐｌａｃ、Ｐｔａｃ、及びＰｔｒｃが、Ｌａｃｌを欠いた株において構成的プロモーターとして用いられ得る。同様に、Ｐ２２のＰＲ及びＰＬが、ラムダＣ２リプレッサータンパク質を欠いた株で用いられ得、ラムダＰＲ及びＰＬが、ラムダＣ１リプレッサータンパク質を欠いた株で用いられ得る。一実施形態では、構成的プロモーターはバクテリオファージに由来する。別の実施形態では、構成的プロモーターはサルモネラバクテリオファージに由来する。更に別の実施形態では、構成的プロモーターは藍藻類ファージに由来する。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターはＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓのプロモーターである。例えば、構成的プロモーターは、ＰｐｓｂＡｌｌプロモーター又はその変異体配列、Ｐｒｂｃプロモーター又はその変異体配列、Ｐｃｐｃプロモーター又はその変異体配列、及びＰｒｎｐＢプロモーター又はその変異体配列であり得る。
Ｄ．宿主微生物
更に、本明細書に開示されている核酸分子又はベクターで形質転換された宿主細胞及びその子孫が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は微生物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベクター上の核酸配列を保有しているが、このベクターは、必ずではないが、自由に複製するベクターであり得る。別の実施形態では、核酸は宿主細胞のゲノム中及び／又は宿主細胞の内在性プラスミド中に組み込まれている。形質転換された宿主細胞は、例えば本明細書に開示されている組換え型改変タンパク質の生産に用いることができる。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、それを発現するために用いられる宿主細胞の内在性タンパク質である。すなわち、宿主細胞の細胞ゲノムが、組換え型タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の発現を上昇させるのに充分な制御配列が、宿主細胞ゲノム中に挿入され、制御配列が組換え型核酸からの組換え型タンパク質の過剰発現を駆動するように内在性オープンリーディングフレームに機能可能に連結する。いくつかの実施形態では、異種核酸配列をタンパク質の内在性オープンリーディングフレームに融合させ、組換え型タンパク質の細胞輸送を変化させる（例えばそれを細胞小器官又は分泌系路へと向ける）異種アミノ酸配列を含むタンパク質を合成させる。いくつかの実施形態では、内在性宿主細胞タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、オープンリーディングフレームに機能可能に連結した制御配列を更に含むプラスミドに乗せて宿主細胞に導入する。いくつかの実施形態では、組換え型宿主細胞は、同様な条件下で成長させた同様な宿主細胞によって生産されるタンパク質の量より少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍多くの組換え型タンパク質を発現する。
「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、古細菌、細菌、及び真核生物のドメインに由来する原核及び真核の微生物種を含み、後者は、酵母及び糸状菌類、原生動物、藻類、又は高等原生生物を含む。「微生物細胞」及び「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）という用語と交換可能に用いられる。
種々の宿主微生物を、本明細書に開示されている核酸配列で形質転換することができ、これはいくつかの実施形態では、本明細書に開示されている組換え型の改変タンパク質を生産することができる。好適な宿主微生物には、独立栄養性及び従属栄養性の微生物の両方が含まれる。いくつかの応用例では、独立栄養微生物により、宿主微生物に導入される組換え型核酸配列にコードされる改変タンパク質を作成するために必要な化石燃料及び／又は電気のインプットを低減することができる。これにより、いくつかの応用例では、改変タンパク質を生産するコスト及び／若しくは環境影響が低減し、且つ／又は乳清、卵、ソイ等の別の栄養タンパク質の製造のコスト及び／若しくは環境影響と比べてコスト及び／又は環境影響が低減する。例えば、本明細書に開示されているように宿主微生物を用いて本明細書に開示されている改変タンパク質を作るコスト及び／又は環境影響は、いくつかの実施形態では、牛乳を加工することによりヒトの消費に適した形態の乳清タンパク質を作るコスト及び／又は環境影響より低い。
光独立栄養微生物としては、真核生物の藻類並びに原核生物のシアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、及び紅色非硫黄細菌が含まれる。
好極限性細菌も好適な生物として企図される。そのような生物は、温度、放射線、圧力、重力、真空、乾燥、塩分、ｐＨ、酸素圧、及び化学物質等の種々の環境パラメーターに耐える。これらには、８０℃以上で成長するＰｙｒｏｌｏｂｕｓ ｆｕｍａｒｉｉ等の超好熱菌；６０〜８０℃で成長するＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄｉｓ等の好熱菌；１５〜６０℃で成長する中温菌；並びにＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ及び一部の昆虫等の１５℃以下で成長する好冷菌が含まれる。放射線耐性生物にはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓが含まれる。圧力耐性生物（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｏｒｇａｎｉｓｍ）には、１３０Ｍｐａの圧力に耐える好圧性生物（ｐｉｅｚｏｐｈｉｌｅ）が含まれる。重量耐性生物（ｗｅｉｇｈｔ−ｔｏｌｅｒａｎｔ ｏｒｇａｎｉｓｍ）には好圧菌が含まれる。過重力（例えば、＞１ｇ）低重力（例えば、＜１ｇ）耐性生物も企図される。真空耐性生物には緩歩動物、昆虫、微生物、及び種子が含まれる。乾燥剤耐性（Ｄｅｓｓｉｃａｎｔ ｔｏｌｅｒａｎｔ）及び無水生物（ａｎｈｙｄｒｏｂｉｏｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）には、Ａｒｔｅｍｉａ ｓａｌｉｎａ等の乾性動物；線形動物、微生物、真菌、及び地衣類が含まれる。耐塩性生物には、好塩菌（例えば、２〜５Ｍ ＮａＣｌ）Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ及びＤｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａが含まれる。ｐＨ耐性生物には、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｐｐ．等の好アルカリ菌（例えば、ｐＨ＞９）及びＣｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ ｓｐ．等の抗酸菌（例えば、低ｐＨ）が含まれる。Ｏ２に耐えられないＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ等の嫌気性菌；いくらかのＯ２に耐えるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ等の微好気性菌；及びＯ２を必要とする好気性菌も企図される。純粋なＣＯ２に耐えるガス耐性生物としてはＣｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍが含まれ、金属耐性生物にはＦｅｒｒｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ（例えば、Ｃｕ、Ａｓ、Ｃｄ、Ｚｎ）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐ． ＣＨ３４（例えば、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ）等の金属耐性菌（ｍｅｔａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ）が含まれる。Ｇｒｏｓｓ， Ｍｉｃｈａｅｌ． Ｌｉｆｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｄｇｅ： Ａｍａｚｉｎｇ Ｃｒｅａｔｕｒｅｓ Ｔｈｒｉｖｉｎｇ ｉｎ Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ （１９９８） ａｎｄ Ｓｅｃｋｂａｃｈ， Ｊ． ”Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｅ ｗｉｔｈ Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｗｈｉｃｈ Ｔｈｒｉｖｅ Ｕｎｄｅｒ Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．” Ｉｎ Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ Ｂａｔａｌｌｉ Ｃｏｓｍｏｖｉｃｉ， Ｓｔｕａｒｔ Ｂｏｗｙｅｒ， ａｎｄ Ｄａｎ Ｗｅｒｔｈｅｉｍｅｒ， ｅｄｓ．， Ａｓｔｒｏｎｏｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｅ， ｐ． ５１１． Ｍｉｌａｎ： Ｅｄｉｔｒｉｃｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｏｒｉ （１９９７）。
藻類及びシアノバクテリアとしては、限定されるものではないが、以下の属が含まれる：Ａｃａｎｔｈｏｃｅｒａｓ、Ａｃａｎｔｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ、Ａｃｈｎａｎｔｈｉｄｉｕｍ、Ａｃｔｉｎａｓｔｒｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｃｙｃｌｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｔａｅｎｉｕｍ、Ａｍｐｈｉｃｈｒｙｓｉｓ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ、Ａｍｐｈｉｋｒｉｋｏｓ、Ａｍｐｈｉｐｌｅｕｒａ、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ、Ａｍｐｈｉｔｈｒｉｘ、Ａｍｐｈｏｒａ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｎｅｕｍａｓｔｕｓ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ａｎｋｙｒａ、Ａｎｏｍｏｅｏｎｅｉｓ、Ａｐａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ、Ａｐｈａｎｏｃｈａｅｔｅ、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ、Ａｐｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｐｉｓｔｏｎｅｍａ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ａｒｔｈｅｒｏｓｐｉｒａ、Ａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ、Ａｓｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｕｄｏｕｉｎｅｌｌａ、Ａｕｌａｃｏｓｅｉｒａ、Ｂａｃｉｌｌａｒｉａ、Ｂａｌｂｉａｎｉａ、Ｂａｍｂｕｓｉｎａ、Ｂａｎｇｉａ、Ｂａｓｉｃｈｌａｍｙｓ、Ｂａｔｒａｃｈｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｂｉｎｕｃｌｅａｒｉａ、Ｂｉｔｒｉｃｈｉａ、Ｂｌｉｄｉｎｇｉａ、Ｂｏｔｒｄｉｏｐｓｉｓ、Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｂｒａｃｈｉｏｍｏｎａｓ、Ｂｒａｃｈｙｓｉｒａ、Ｂｒａｃｈｙｔｒｉｃｈｉａ、Ｂｒｅｂｉｓｓｏｎｉａ、Ｂｕｌｂｏｃｈａｅｔｅ、Ｂｕｍｉｌｌｅｒｉａ、Ｂｕｍｉｌｌｅｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃａｌｏｎｅｉｓ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ、Ｃａｍｐｙｌｏｄｉｓｃｕｓ、Ｃａｐｓｏｓｉｐｈｏｎ、Ｃａｒｔｅｒｉａ、Ｃａｔｅｎａ、Ｃａｖｉｎｕｌａ、Ｃｅｎｔｒｉｔｒａｃｔｕｓ、Ｃｅｎｔｒｏｎｅｌｌａ、Ｃｅｒａｔｉｕｍ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｏｒｐｈａ、Ｃｈａｅｔｏｎｅｌｌａ、Ｃｈａｅｔｏｎｅｍａ、Ｃｈａｅｔｏｐｅｌｔｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｐｈｏｒａ、Ｃｈａｅｔｏｓｐｈａｅｒｉｄｉｕｍ、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈａｒａ、Ｃｈａｒａｃｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｓｉｓ、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ、Ｃｈａｒａｌｅｓ、Ｃｈｉｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌａｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｂｌｅｐｈａｒｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｃａｐｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎｏｐｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｙｘａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｎｅｐｈｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒａｎｇｉｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒａｎｇｉｏｐｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｒａｃｈｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｌｏｂｉｏｎ、Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｓｅｍａ、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｃｈｌｏｒｏｓａｃｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｄａｃｔｙｌｏｎ、Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｏｏｔｈｅｃｅ、Ｃｈｒｙｓａｍｏｅｂａ、Ｃｈｒｙｓａｐｓｉｓ、Ｃｈｒｙｓｉｄｉａｓｔｒｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｃａｐｓａ、Ｃｈｒｙｓｏｃａｐｓｅｌｌａ、Ｃｈｒｙｓｏｃｈａｅｔｅ、Ｃｈｒｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ、Ｃｈｒｙｓｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｃｒｉｎｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｌｅｐｉｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｙｓｏｌｙｋｏｓ、Ｃｈｒｙｓｏｎｅｂｕｌａ、Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ、Ｃｈｒｙｓｏｐｙｘｉｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓａｃｃｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｃｈｒｙｓｏｓｔｅｐｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｌｏｄｏｐｈｏｒａ、Ｃｌａｓｔｉｄｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ、Ｃｏｃｃｏｎｅｉｓ、Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ、Ｃｏｅｌａｓｔｒｕｍ、Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｃｏｅｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｅｎｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｏｌａｃｉｕｍ、Ｃｏｌｅｏｃｈａｅｔｅ、Ｃｏｌｌｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｏｍｐｓｏｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｃｏｍｐｓｏｐｏｇｏｎ、Ｃｏｎｊｕｇａｔｏｐｈｙｔａ、Ｃｏｎｏｃｈａｅｔｅ、Ｃｏｒｏｎａｓｔｒｕｍ、Ｃｏｓｍａｒｉｕｍ、Ｃｏｓｍｉｏｎｅｉｓ、Ｃｏｓｍｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｃｒａｔｅｒｉｐｏｒｔｕｌａ、Ｃｒａｔｉｃｕｌａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ、Ｃｒｕｃｉｇｅｎｉａ、Ｃｒｕｃｉｇｅｎｉｅｌｌａ、Ｃｒｙｐｔｏａｕｌａｘ、Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ、Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ、Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｙａｎｏｎｅｐｈｒｏｎ、Ｃｙａｎｏｐｈｏｒａ、Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｃｙａｎｏｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｃｙｃｌｏｎｅｘｉｓ、Ｃｙｃｌｏｓｔｅｐｈａｎｏｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｐｓａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ、Ｃｙｍａｔｏｐｌｅｕｒａ、Ｃｙｍｂｅｌｌａ、Ｃｙｍｂｅｌｌｏｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｃｙｓｔｏｄｉｎｉｕｍ Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｄｅｂａｒｙａ、Ｄｅｎｔｉｃｕｌａ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐａ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｄｅｓｍａｔｒａｃｔｕｍ、Ｄｅｓｍｉｄｉｕｍ、Ｄｅｓｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｍｏｎｅｍａ、Ｄｅｓｍｏｓｉｐｈｏｎ、Ｄｉａｃａｎｔｈｏｓ、Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ、Ｄｉａｄｅｓｍｉｓ、Ｄｉａｔｏｍａ、Ｄｉａｔｏｍｅｌｌａ、Ｄｉｃｅｌｌｕｌａ、Ｄｉｃｈｏｔｈｒｉｘ、Ｄｉｃｈｏｔｏｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｃｒａｎｏｃｈａｅｔｅ、Ｄｉｃｔｙｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｄｉｃｔｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｄｉｄｙｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｄｉｄｙｍｏｇｅｎｅｓ、Ｄｉｄｙｍｏｓｐｈｅｎｉａ、Ｄｉｌａｂｉｆｉｌｕｍ、Ｄｉｍｏｒｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｎｏｂｒｙｏｎ、Ｄｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｐｌｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｄｉｐｌｏｎｅｉｓ、Ｄｉｐｌｏｓｔａｕｒｏｎ、Ｄｉｓｔｒｉｏｎｅｌｌａ、Ｄｏｃｉｄｉｕｍ、Ｄｒａｐａｒｎａｌｄｉａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｄｙｓｍｏｒｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｃｂａｌｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｅｌａｋａｔｏｔｈｒｉｘ、Ｅｌｌｅｒｂｅｃｋｉａ、Ｅｎｃｙｏｎｅｍａ、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ、Ｅｎｔｏｃｌａｄｉａ、Ｅｎｔｏｍｏｎｅｉｓ、Ｅｎｔｏｐｈｙｓａｌｉｓ、Ｅｐｉｃｈｒｙｓｉｓ、Ｅｐｉｐｙｘｉｓ、Ｅｐｉｔｈｅｍｉａ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ、Ｅｕａｓｔｒｏｐｓｉｓ、Ｅｕａｓｔｒｕｍ、Ｅｕｃａｐｓｉｓ、Ｅｕｃｏｃｃｏｎｅｉｓ、Ｅｕｄｏｒｉｎａ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ、Ｅｕｎｏｔｉａ、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ、Ｅｕｔｒｅｐｔｉａ、Ｆａｌｌａｃｉａ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉｆｏｒｍａ、Ｆｒａｎｃｅｉａ、Ｆｒｕｓｔｕｌｉａ、Ｃｕｒｃｉｌｌａ、Ｇｅｍｉｎｅｌｌａ、Ｇｅｎｉｃｕｌａｒｉａ、Ｇｌａｕｃｏｃｙｓｔｉｓ、Ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ、Ｇｌｅｎｏｄｉｎｉｏｐｓｉｓ、Ｇｌｅｎｏｄｉｎｉｕｍ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｃｈａｅｔｅ、Ｇｌｏｅｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｇｌｏｅｏｄｅｎｄｒｏｎ、Ｇｌｏｅｏｍｏｎａｓ、Ｇｌｏｅｏｐｌａｘ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｇｌｏｅｏｔｉｌａ、Ｇｌｏｅｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｏｉｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉａ、Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉｏｐｓｉｓ、Ｇｏｍｏｎｔｉａ、Ｇｏｍｐｈｏｃｙｍｂｅｌｌａ、Ｇｏｍｐｈｏｎｅｍａ、Ｇｏｍｐｈｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｇｏｎａｔｏｚｙｇｏｎ、Ｇｏｎｇｒｏｓｉａ、Ｇｏｎｇｒｏｓｉｒａ、Ｇｏｎｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｇｏｎｉｕｍ、Ｇｏｎｙｏｓｔｏｍｕｍ、Ｇｒａｎｕｌｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｓｔｏｐｓｉｓ、Ｇｒｏｅｎｂｌａｄｉａ、Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ、Ｇｙｍｎｏｚｙｇａ、Ｇｙｒｏｓｉｇｍａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｆｎｉｏｍｏｎａｓ、Ｈａｌｌａｓｓｉａ、Ｈａｍｍａｔｏｉｄｅａ、Ｈａｎｎａｅａ、Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ、Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｈａｐｌｏｔａｅｎｉｕｍ、Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｈａｓｌｅａ、Ｈｅｍｉｄｉｎｉｕｍ、Ｈｅｍｉｔｏｍａ、Ｈｅｒｉｂａｕｄｉｅｌｌａ、Ｈｅｔｅｒｏｍａｓｔｉｘ、Ｈｅｔｅｒｏｔｈｒｉｘ、Ｈｉｂｂｅｒｄｉａ、Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｉａ、Ｈｉｌｌｅａ、Ｈｏｌｏｐｅｄｉｕｍ、Ｈｏｍｏｅｏｔｈｒｉｘ、Ｈｏｒｍａｎｔｈｏｎｅｍａ、Ｈｏｒｍｏｔｉｌａ、Ｈｙａｌｏｂｒａｃｈｉｏｎ、Ｈｙａｌｏｃａｒｄｉｕｍ、Ｈｙａｌｏｄｉｓｃｕｓ、Ｈｙａｌｏｇｏｎｉｕｍ、Ｈｙａｌｏｔｈｅｃａ、Ｈｙｄｒｉａｎｕｍ、Ｈｙｄｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｙｄｒｏｃｏｌｅｕｍ、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｙｎｅ、Ｈｙｄｒｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｈｙｄｒｏｓｅｒａ、Ｈｙｄｒｕｒｕｓ、Ｈｙｅｌｌａ、Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｉｓｔｈｍｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｊｏｈａｎｎｅｓｂａｐｔｉｓｔｉａ、Ｊｕｒａｎｙｉｅｌｌａ、Ｋａｒａｙｅｖｉａ、Ｋａｔｈａｂｌｅｐｈａｒｉｓ、Ｋａｔｏｄｉｎｉｕｍ、Ｋｅｐｈｙｒｉｏｎ、Ｋｅｒａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｋｏｌｂｅｓｉａ、Ｋｏｌｉｅｌｌａ、Ｋｏｍａｒｅｋｉａ、Ｋｏｒｓｈｉｋｏｖｉｅｌｌａ、Ｋｒａｓｋｅｌｌａ、Ｌａｇｅｒｈｅｉｍｉａ、Ｌａｇｙｎｉｏｎ、Ｌａｍｐｒｏｔｈａｍｎｉｕｍ、Ｌｅｍａｎｅａ、Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｉｒａ、Ｌｏｂｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｏｂｏｃｙｓｔｉｓ、Ｌｏｂｏｍｏｎａｓ、Ｌｕｔｉｃｏｌａ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍａｌｌｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｍａｌｌｏｍｏｎａｓ、Ｍａｎｔｏｎｉｅｌｌａ、Ｍａｒｓｓｏｎｉｅｌｌａ、Ｍａｒｔｙａｎａ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｏｌｅｕｓ、Ｇａｓｔｏｇｌｏｉａ、Ｍｅｌｏｓｉｒａ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａ、Ｍｅｓｏｔａｅｎｉｕｍ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｍｉｃｒａｓｔｅｒｉａｓ、Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｉｃｒｏｇｌｅｎａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｍｉｃｒｏｔｈａｍｎｉｏｎ、Ｍｉｓｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｎｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｍｏｎｏｍａｓｔｉｘ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ、Ｍｏｕｇｅｏｔｉａ、Ｍｏｕｇｅｏｔｉｏｐｓｉｓ、Ｍｙｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｍｙｒｏｍｅｃｉａ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｎａｅｇｅｌｉｅｌｌａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎａｕｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｅｇｌｅｃｔｅｌｌａ、Ｎｅｉｄｉｕｍ、Ｎｅｐｈｒｏｃｌａｍｙｓ、Ｎｅｐｈｒｏｃｙｔｉｕｍ、Ｎｅｐｈｒｏｄｉｅｌｌａ、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ、Ｎｅｔｒｉｕｍ、Ｎｉｔｅｌｌａ、Ｎｉｔｅｌｌｏｐｓｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ、Ｏｌｉｇｏｃｈａｅｔｏｐｈｏｒａ、Ｏｎｙｃｈｏｎｅｍａ、Ｏｏｃａｒｄｉｕｍ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｏｐｅｐｈｏｒａ、Ｏｐｈｉｏｃｙｔｉｕｍ、Ｏｒｔｈｏｓｅｉｒａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｏｘｙｎｅｉｓ、Ｐａｃｈｙｃｌａｄｅｌｌａ、Ｐａｌｍｅｌｌａ、Ｐａｌｍｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｐｎａｄｏｒｉｎａ、Ｐａｎｎｕｓ、Ｐａｒａｌｉａ、Ｐａｓｃｈｅｒｉｎａ、Ｐａｕｌｓｃｈｕｌｚｉａ、Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ、Ｐｅｄｉｎｅｌｌａ、Ｐｅｄｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｐｅｄｉｎｏｐｅｒａ、Ｐｅｌａｇｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｐｅｎｉｕｍ、Ｐｅｒａｎｅｍａ、Ｐｅｒｉｄｉｎｉｏｐｓｉｓ、Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ、Ｐｅｒｏｎｉａ、
Ｐｅｔｒｏｎｅｉｓ、Ｐｈａｃｏｔｕｓ、Ｐｈａｃｕｓ、Ｐｈａｅａｓｔｅｒ、Ｐｈａｅｏｄｅｒｍａｔｉｕｍ、Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒａ、Ｐｈａｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｈｙｃｏｐｅｌｔｉｓ、Ｐｈｙｌｌａｒｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐｈｙｌｌｏｃａｒｄｉｕｍ、Ｐｈｙｌｌｏｍｉｔａｓ、Ｐｉｎｎｕｌａｒｉａ、Ｐｉｔｏｐｈｏｒａ、Ｐｌａｃｏｎｅｉｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｌａｎｋｔｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｐｌａｎｏｔｈｉｄｉｕｍ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｌｅｏｄｏｒｉｎａ、Ｐｌｅｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｐｌｅｕｒｏｃｌａｄｉａ、Ｐｌｅｕｒｏｄｉｓｃｕｓ、Ｐｌｅｕｒｏｓｉｇｍａ、Ｐｌｅｕｒｏｓｉｒａ、Ｐｌｅｕｒｏｔａｅｎｉｕｍ、Ｐｏｃｉｌｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｄｏｈｅｄｒａ、Ｐｏｌｙｂｌｅｐｈａｒｉｄｅｓ、Ｐｏｌｙｃｈａｅｔｏｐｈｏｒａ、Ｐｏｌｙｅｄｒｉｅｌｌａ、Ｐｏｌｙｅｄｒｉｏｐｓｉｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐｏｌｙｅｐｉｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｌｙｔａｅｎｉａ、Ｐｏｌｙｔｏｍａ、Ｐｏｌｙｔｏｍｅｌｌａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ、Ｐｏｓｔｅｒｉｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒａｓｉｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ、Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｔａ、Ｐｒａｓｉｏｌａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｈｙｔａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｐｒｏｔｏｄｅｒｍａ、Ｐｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉｅｌｌａ、Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ、Ｐｓａｍｍｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｐｓａｍｍｏｔｈｉｄｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ、Ｐｓｅｕｄｅｎｏｃｌｏｎｉｕｍ、Ｐｓｕｅｄｏｃａｒｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈａｔｅ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈａｒａｃｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｏｍｙｘａ、Ｐｓｅｕｄｏｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｋｅｐｈｙｒｉｏｎ、Ｐｓｅｕｄｏｎｃｏｂｙｒｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｑｕａｄｒｉｇｕｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｓｐｈａｅｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒｏｓｉｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｔｅｔｒａｓｔｒｕｍ、Ｐｔｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｕｎｃｔａｓｔｒｕａｔａ、Ｐｙｒａｍｉｃｈｌａｍｙｓ、Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ、Ｐｙｒｒｏｐｈｙｔａ、Ｑｕａｄｒｉｃｈｌｏｒｉｓ、Ｑｕａｄｒｉｃｏｃｃｕｓ、Ｑｕａｄｒｉｇｕｌａ、Ｒａｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒａｄｉｏｆｉｌｕｍ、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｒａｐｈｉｄｏｃｅｌｉｓ、Ｒａｐｈｉｄｏｎｅｍａ、Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ、Ｐｅｉｍｅｒｉａ、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ、Ｒｈａｂｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｃｌｏｎｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ、Ｒｈｏｉｃｏｓｐｈｅｎｉａ、Ｒｈｏｐａｌｏｄｉａ、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ、Ｒｏｓｅｎｖｉｎｇｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｓｉｔｈｉｄｉｕｍ、Ｒｏｙａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｓ、Ｓｃｈｉｚｏｍｅｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒｉａ、Ｓｃｏｌｉｏｎｅｉｓ、Ｓｃｏｔｉｅｌｌａ、Ｓｃｏｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓ、Ｓｃｏｕｒｆｉｅｌｄｉａ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ、Ｓｅｌｅｎａｓｔｒｕｍ、Ｓｅｌｅｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｓｅｌｌａｐｈｏｒａ、Ｓｅｍｉｏｒｂｉｓ、Ｓｉｄｅｒｏｃｅｌｉｓ、Ｄｉｄｅｒｏｃｙｓｔｏｐｓｉｓ、Ｄｉｍｏｎｓｅｎｉａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｎｅｍａ、Ｓｉｒｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｓｉｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ、Ｓｏｒａｓｔｒｕｍ、Ｓｐｅｎｎａｔｏｚｏｐｓｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｅｌｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｅｌｌｏｐｓｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｄｉｎｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｌｅａ、Ｓｐｈａｅｒｏｚｏｓｍａ、Ｓｐｉｎｉｆｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｓｐｉｒｏｔａｅｎｉａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｐｏｎｄｙｌｏｍｏｒｕｍ、Ｓｐｏｎｄｙｌｏｓｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｅｔｒａｓ、Ｓｐｕｍｅｌｌａ、Ｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｓｔａｕｅｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔａｕｒｏｎｅｉｓ、Ｓｔａｕｒｏｓｉｒａ、Ｓｔａｕｒｏｓｉｒｅｌｌａ、Ｓｔｅｎｏｐｔｅｒｏｂｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏｃｏｓｔｉｓ、Ｓｔｅｐｈａｎｏｄｉｓｃｕｓ、Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｒｏｓ、Ｓｔｅｐｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｉｃｈｏｇｌｏｅａ、Ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、Ｓｔｉｐｉｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｏｋｅｓｉｅｌｌａ、Ｓｔｒｏｍｂｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｙｌｏｃｈｒｙｓａｌｉｓ、Ｓｔｙｌｏｄｉｎｉｕｍ、Ｓｔｙｌｏｙｘｉｓ、Ｓｔｙｌｏｓｐｈａｅｒｉｄｉｕｍ、Ｓｕｒｉｒｅｌｌａ、Ｓｙｋｉｄｉｏｎ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｄｒａ、Ｓｙｎｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｙｎｕｒａ、Ｔａｂｅｌｌａｒｉａ、Ｔａｂｕｌａｒｉａ、Ｔｅｉｌｉｎｇｉａ、Ｔｅｍｎｏｇａｍｅｔｕｍ、Ｔｅｔｍｅｍｏｒｕｓ、Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｕｓ、Ｔｅｔｒａｄｅｓｍｕｓ、Ｔｅｔｒａｅｄｒｉｅｌｌａ、Ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｔｅｔｒａｓｐｏｒａ、Ｔｅｔｒａｓｔｒｕｍ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、Ｔｈａｍｎｉｏｃｈａｅｔｅ、Ｔｈｏｒａｋｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｔｈｏｒｅａ、Ｔｏｌｙｐｅｌｌａ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ、Ｔｒａｃｈｅｌｏｍｏｎａｓ、Ｔｒａｃｈｙｄｉｓｃｕｓ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉａ、Ｔｒｅｎｔｅｐｈｏｌｉａ、Ｔｒｅｕｂａｒｉａ、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｉｓｃｕｓ、Ｔｒｏｃｈｉｓｃｉａ、Ｔｒｙｂｌｉｏｎｅｌｌａ、Ｕｌｏｔｈｒｉｘ、Ｕｒｏｇｌｅｎａ、Ｕｒｏｎｅｍａ、Ｕｒｏｓｏｌｅｎｉａ、Ｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｕｖａ、Ｖａｃｕｏｌａｒｉａ、Ｖａｕｃｈｅｒｉａ、Ｖｏｌｖｏｘ、Ｖｏｌｖｕｌｉｎａ、Ｗｅｓｔｅｌｌａ、Ｗｏｌｏｓｚｙｎｓｋｉａ、Ｘａｎｔｈｉｄｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｚｙｇｎｅｍａ、Ｚｙｇｎｅｍｏｐｓｉｓ、及びＺｙｇｏｎｉｕｍ。
更なるシアノバクテリアとしては、以下の属のメンバーが含まれる：Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｙａｎｏｃｙｓｔｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｂｏｒｚｉａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍｉａ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｒｏｃｈｉｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｔａｒｒｉａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ、Ｃｙａｎｏｓｐｉｒａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｓｃｙｌｏｎｅｍａ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｇｅｉｔｉｅｒｉａ、Ｉｙｅｎｇａｒｉｅｌｌａ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、及びＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ。
緑色非硫黄細菌としては、限定されるものではないが以下の属が含まれる：Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ、Ｏｓｃｉｌｌｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｈｅｌｉｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ、及びＴｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ。
緑色硫黄細菌としては、限定されるものではないが以下の属が含まれる： Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｃｌａｔｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ、及びＰｒｏｓｔｈｅｃｏｃｈｌｏｒｉｓ。
紅色硫黄細菌としては、限定されるものではないが以下の属が含まれる：Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｈａｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｉｓｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｍａｒｉｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ、Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、及びＴｈｉｏｃｙｓｔｉｓ。
紅色非硫黄細菌としては、限定されるものではないが以下の属が含まれる：Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｏｄｏｖｉｂｒｉｏ、及びＲｏｓｅｏｓｐｉｒａ。
好気性化学合成無機栄養細菌としては、限定されるものではないが、硝化細菌、例えばＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｎａ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｌｏｂｕｓ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．；無色硫黄細菌、例えばＴｈｉｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｔｈｉｏｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．；絶対的化学合成無機栄養水素細菌（ｏｂｌｉｇａｔｅｌｙ ｃｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂａｃｔｅｒｉａ）、例えばＨｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、鉄及びマンガンの酸化及び／又は沈着細菌、例えばＳｉｄｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、並びに磁性細菌、例えばＡｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．が含まれる。
古細菌としては、限定されるものではないが、メタン生成古細菌、例えばＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ ｓｐ．；高度好熱性硫黄代謝細菌（Ｓ−Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒｓ）、例えばＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｐ．、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｓｐ．、並びにその他の微生物、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．、及び油性酵母（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ）が含まれる。
更に別の好適な生物としては、Ｖｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２００７／０２６４６８８号に記載されているような合成細胞又は合成ゲノムにより生成された細胞及びＧｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２００７／０２６９８６２号に記載されているような細胞様の系又は合成細胞が含まれる。
更に別の好適な生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、酵母、及び真菌、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、又はＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓが含まれる。いくつかの実施形態では、これらの生物は、二酸化炭素を固定するように改変され、別の実施形態ではそのように改変されない。
Ｅ．組換え型改変タンパク質の生産
当業者には、本明細書に開示の組換え型改変タンパク質を生産（及び場合により分泌）するための組換え型細胞の培養並びに発現した改変タンパク質の精製及び／又は単離に利用可能な多くの好適な方法が知られている。タンパク質精製に選択される方法は、目的のタンパク質の特性、細胞内におけるその位置及び形態、ベクター、宿主株の背景、及び発現させるタンパク質の応用目的等の多くの変数によって決まる。培養条件も、所与の標的タンパク質の溶解度及び局在に影響を与え得る。本明細書に開示されているように組換え型微生物細胞中で発現させた標的タンパク質を精製するために多くのアプローチが利用でき、そのようなアプローチとしてはイオン交換及びゲル濾過が含まれるが、これらに限定されない。
ほとんど全ての分泌細菌タンパク質及び他の単細胞宿主に由来するそれらのタンパク質は、シグナルペプチドとして知られるＮ末端配列を含むプレタンパク質として合成されることが一般に認識されている。これらのグナルペプチドは、タンパク質の最終目的地及びそれらが輸送されるメカニズムに影響する。ほとんどのシグナルペプチドは、その移行メカニズム（例えば、Ｓｅｃ又はＴａｔが仲介）及びプレタンパク質からシグナルペプチドを切断するために用いられるシグナルペプチダーゼの種類に基づき４つのグループのいずれかに分類することができる。更に、リポタンパク質シグナルペプチドを含むＮ末端シグナルペプチドも提供される。この種のシグナルを保有するタンパク質はＳｅｃトランスロカーゼを介して輸送されるが、それらのペプチドシグナルは通常のＳｅｃシグナルより短い傾向があり、それらは−３から＋１位にリポボックス（ｌｉｐｏ ｂｏｘ）（Ｌ（ＡＳ）（ＧＡ）Ｃ）として知られるＣドメイン中の別個の配列モチープを含む。＋１位のシステインは、移行後に脂質修飾され、そこでＩＩ型シグナルペプチダーゼによりシグナル配列が切断される。更に、ＩＶ型又はプレピリンシグナルペプチドが提供され、ＩＶ型ペプチダーゼ切断ドメインは、他のシグナルペプチドに一般的なＣドメイン中ではなくＮドメインとＨドメインとの間に位置する。
本明細書において、組換え型栄養ポリペプチド配列を作製するために、栄養ポリペプチドを含む異種ポリペプチド配列（すなわち、シグナルペプチドが由来する又はそれが得られるタンパク質とは異なる）にシグナルペプチドを結合させてよい。あるいは、栄養ポリペプチドが宿主生物中で天然に分泌される場合、分泌に導く天然のシグナル配列又は種々のシグナル配列を用いることで充分であり得る。栄養ポリペプチドのいくつかの実施形態では、シグナルペプチドのカルボキシル末端に連結した異種栄養ポリペプチド配列は天然の真核生物タンパク質、そのムテイン若しくは誘導体、又はポリペプチド栄養性ドメインである。ポリペプチドの別の実施形態では、シグナルペプチドのカルボキシル末端に連結した異種栄養ポリペプチド配列は、天然の細胞内タンパク質、そのムテイン若しくは誘導体、又はポリペプチド栄養性ドメインである。
栄養ポリペプチドの精製
更に、培養培地から分泌栄養ポリペプチドを回収する方法を提供する。いくつかの実施形態では、分泌栄養ポリペプチドは、対数増殖期の間又は対数増殖期の後（例えば、プレ定常期又は定常期）に培養培地から回収される。いくつかの実施形態では、分泌栄養ポリペプチドは、定常期に培養培地から回収される。いくつかの実施形態では、第１の時点で培養培地から分泌栄養ポリペプチドを回収し、微生物による組換え型栄養ポリペプチドの生産及び分泌に充分な条件下で培養を続け、第２の時点で培養培地から組換え型栄養ポリペプチドを回収する。いくつかの実施形態では、連続プロセスにより培養培地から分泌栄養ポリペプチドを回収する。いくつかの実施形態では、回分プロセスにより培養培地から分泌栄養ポリペプチドを回収する。いくつかの実施形態では、半連続プロセスにより培養培地から分泌栄養ポリペプチドを回収する。いくつかの実施形態では、流加培養法により培養培地から分泌栄養ポリペプチドを回収する。当業者には、本明細書に開示されているように組換え型栄養ポリペプチドを生産（及び場合により分泌）するための組換え型細胞の培養並びに発現させた組換え型ポリペプチドの精製及び／又は単離に利用可能な多くの好適な方法が知られている。ポリペプチド精製に選択される方法は、目的のポリペプチドの特性等の多くの変数によって決まる。ダイアフィリトレーション、沈殿、及びクロマトグラフィーを含む種々の精製方法が当該技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、ペプチド融合タグが組換え型タンパク質に付加され、ペプチド融合タグを利用する種々のアフィニティー精製法を可能にする。いくつかの実施形態では、アフィニティー法を用いることで、１ステップでほぼ均質な標的タンパク質の精製が可能になる。精製は、例えばエンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、又はＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼを用いた、融合タグの一部又は全部の切断を含み得る。いくつかの実施形態では、発現させた標的タンパク質の精製又は活性測定の前に、標的タンパク質の発現レベル、細胞局在、及び溶解度の予備分析が行われる。標的タンパク質は、以下の画分のいずれか又は全部において見出され得る：可溶性又は不溶性細胞質画分、周辺質（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）、又は培地。意図される応用に応じて、いくつかの実施形態では比較的簡便な方法による迅速な精製のために、封入体、培地、又は細胞膜周辺腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）への優先的局在が好ましいことがある。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが異種タンパク質発現のための強固な宿主と一般的に考えられているが、この宿主中における多くのタンパク質の過剰発現は不溶性封入体の形態での凝集が生じ易いことも広く知られている。封入体形成を救済するため又はタンパク質自体のタイターを向上させるための最も一般的に用いられる方法は、アミノ末端マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含めること［Ａｕｓｔｉｎ ＢＰ， Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙ Ｓ， Ｗａｕｇｈ ＤＳ． Ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；４９８：１５７−７２］又は目的のタンパク質への低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）［Ｓａｉｔｏｈ Ｈ， Ｕｗａｄａ Ｊ， Ａｚｕｓａ Ｋ． Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＵＭＯ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；４９７：２１１−２１； Ｍａｌａｋｈｏｖ ＭＰ， Ｍａｔｔｅｒｎ ＭＲ， Ｍａｌａｋｈｏｖａ ＯＡ， Ｄｒｉｎｋｅｒ Ｍ， Ｗｅｅｋｓ ＳＤ， Ｂｕｔｔ ＴＲ． ＳＵＭＯ ｆｕｓｉｏｎｓ ａｎｄ ＳＵＭＯ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２００４；５（１−２）：７５−８６； Ｐａｎａｖａｓ Ｔ， Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃ， Ｂｕｔｔ ＴＲ． ＳＵＭＯ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；４９７：３０３−１７］融合である。これら２つのタンパク質はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で可溶性の形態で非常によく発現され、その結果、目的のタンパク質も可溶性形態で効率的に生産される。目的のタンパク質は、目的のタンパク質と融合タンパク質との間に部位特異的プロテアーゼ認識配列（例えばタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ）を設計することにより切断することができる［１］。
いくつかの実施形態では、組換え型の改変タンパク質は最初、正しくフォールディングされていないか不溶性である。不溶性タンパク質のリフォールディングのための種々の方法が周知である。ほとんどのプロトコールは、遠心及びその後の変性条件下での可溶化による不溶性封入体の単離を含む。次いで、リフォールディングが起こる非変性バッファー中にタンパク質を透析又は希釈する。全てのタンパク質は固有のフォールディング特性を有するので、任意の所与のタンパク質の好ましいリフォールディングプロトコールは当業者によって実験的に決定され得る。好ましいリフォールディング条件は、例えば、タンパク質濃度、還元剤、酸化還元処理、二価カチオン等の変数を試験するマトリックスアプローチにより小規模で迅速に決定することができる。好ましい濃度が見つかった後、これを目的のタンパク質のより大規模な可溶化及びリフォールディングに応用することができる。
いくつかの実施形態では、Ｎ−ラウロイルサルコシンと組み合わせたアルカリ性ｐＨのＣＡＰＳバッファーを用いて封入体を溶解した後、ＤＴＴ存在下で透析してリフォールディングを促進する。標的タンパク質、発現条件、及び意図される応用に応じて、洗浄した封入体から可溶化したタンパク質は、９０％超均質であり得、更なる精製を必要としないこともある。Ｈｉｓ・Ｔａｇ（登録商標）融合タンパク質及びＨｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Ｎｏｖｏｇｅｎ（登録商標））を用いて、完全変性条件下での精製（リフォールディング前）が可能である。更に、６Ｍ尿素を用いて封入体から可溶化したＳ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７・Ｔａｇ（登録商標）、及びＳｔｒｅｐ・Ｔａｇ（登録商標） ＩＩ融合タンパク質を、２Ｍ尿素（Ｓ・Ｔａｇ及びＴ７・Ｔａｇ）又は１Ｍ尿素（Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｇ ＩＩ）で希釈した後、適切な樹脂を用いてクロマトグラフィーを行うことにより、部分的変性条件下で精製することができる。リフォールディングされた融合タンパク質は、Ｈｉｓ・Ｔａｇ、Ｓ・Ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｇ ＩＩ、及びその他の適切なアフィニティータグ（例えば、ＧＳＴ・Ｔａｇ（商標）及びＴ７・Ｔａｇ）（ノバジェン社（登録商標））を用いた未変性条件下でアフィニティー精製することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質は、組換え生産系を用いずに化学的に合成される。タンパク質合成は、当該技術分野で公知の技術を用いて液相系又は固相系で行われ得る（例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ， Ｅ．， Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｒ．Ｃ． （１９８９）． Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ： ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ．Ｍ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｊ．Ｄ． （１９８４）． Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （２ｎｄ ｅｄ．）． Ｒｏｃｋｆｏｒｄ： Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ参照。ペプチド化学及び合成方法は当該技術分野で周知であり、本開示のタンパク質は当該技術分野で公知の任意の方法で作製することができる。そのような方法の非限定的な例としては、樹脂結合ペプチドの合成（アミノ酸を脱保護する方法、樹脂からペプチドを切断する方法、及びその精製方法を含む）が挙げられる。例えば、ペプチドの合成に用いることができるＦｍｏｃ保護アミノ酸誘導体が、推奨される標準である：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（ＢＯＣ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（例えば、アナスペック社（Ａｎａｓｐｅｃ）、バッケム社（Ｂａｃｈｅｍ）、アイリスバイオテック社（Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、又はノバビオケム社から供給される）。樹脂結合ペプチド合成は、例えば、プロテイン・テクノロジーズ社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｔｕｃｓｏｎ， Ａｒｉｚ． ８５７１４ Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＰｒｅｃｌｕｄｅ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて、Ｆｍｏｃに基づく化学を用いて行われる。Ｃ末端カルボン酸の調製に好適な樹脂は、ノバビオケム社から入手可能なプレローディングされた低負荷（ｌｏｗ−ｌｏａｄ）Ｗａｎｇ樹脂（例えば、低負荷ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂、ＬＬ、０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）である。Ｃ末端アミドを有するペプチドの合成に好適な樹脂は、マトリックス−イノベーション社から入手可能なＰＡＬ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂である。Ｎ末端αアミノ基はＢｏｃで保護される。Ｆｍｏｃ脱保護は、２０％ピペリジンを含むＮＭＰを用いて２×３分で達成することができる。カップリングの化学はＮＭＰ中のＤＩＣ／ＨＯＡｔ／コリジンである。アミノ酸／ＨＯＡｔ溶液（ＮＭＰ中０．３Ｍ／０．３Ｍ、３〜１０倍のモル濃度過剰）を樹脂に加え、次いで同じモル当量のＤＩＣ（ＮＭＰ中３Ｍ）、次いでコリジン（ＮＭＰ中３Ｍ）を加える。例えば、以下のスケールの反応に１カップリング当たり以下の量の０．３Ｍアミノ酸／ＨＯＡｔ溶液が用いられる：スケール／ｍｌ、０．０５ｍｍｏｌ／１．５ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ／３．０ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ／７．５ｍＬ。カップリング時間は２×３０分又は１×２４０分のいずれかである。合成後、樹脂をＤＣＭで洗浄し、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水（９５／２．５／２．５）で２〜３時間処理することによりペプチドを樹脂から切断し、次いでジエチルエーテルで沈殿させる。沈殿をジエチルエーテルで洗浄する。粗ペプチドを、水／ＭｅＣＮ（４：１）等の水及びＭｅＣＮの好適な混合物に溶解し、Ｃ１８シリカゲルを含むカラムを用いた逆相分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａｐｒｅｐ ４０００又はＧｉｌｓｏｎ）により精製する。０．１％ＴＦＡを含むＭｅＣＮ水溶液の上昇グラジエントを用いて溶出を行う。関連画分を分析用ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣによりチェックする。純粋な標的ペプチドを含む画分を混合し、減圧下で濃縮する。得られた溶液を分析し（ＨＰＬＣ、ＬＣＭＳ）、化学発光窒素特異的ＨＰＬＣ検出器（Ａｎｔｅｋ ８０６０ ＨＰＬＣ−ＣＬＮＤ）を用いて又は２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定することにより生産物を定量する。生成物をガラス製バイアルに分注する。バイアルをミリポア社製グラスファイバープレフィルターでキャップする。凍結乾燥により、ペプチドトリフルオロアセタートを白色固体として得る。得られたペプチドは、ＬＣＭＳ及び／又はＵＰＬＣを用いて、例えば当該技術分野で公知の標準的方法を用いて、検出及び特徴解析することができる。ＬＣＭＳは、マイクロマス社（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ製）のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム及びＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ質量分析装置からなる設備を用いて行うことができる。ＵＰＬＣポンプは、（Ａ）０．１％ギ酸を含む水及び（Ｂ）０．１％ギ酸を含むアセトニトリルを含む２つの溶離液リザーバーに連結される。分析は、適切な体積の試料（好ましくは２〜１０μｌ）をカラムに注入してＡ及びＢのグラジエントを用いて溶離させることにより室温で行われる。ＵＰＬＣ条件、検出器の設定、及び質量分析装置の設定は以下の通りである：カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ、Ｃ−１８、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ。グラジエント：リニア５％−９５％アセトニトリル、０．４ｍｌ／ｍｉｎ、４．０分間（あるいは８．０分間）。検出：２１４ｎｍ（ＴＵＶ（チューニング可能なＵＶ検出器）からのアナログアウトプット）。ＭＳイオン化モード：ＡＰＩ−ＥＳ Ｓｃａｎ：１００〜２０００ａｍｕ（あるいは５００〜２０００ａｍｕ）、ステップ０．１ａｍｕ。ＵＰＬＣ法は周知である。使用できる方法の非限定的な例が、例えば２０１３年２月２８日に公開された米国特許出願公開第２０１３／００５３３１０（Ａ１）号の１６〜１７頁に記載されている。
Ｆ．組成物
本明細書に開示されている少なくとも１つの改変タンパク質を少なくとも１つの第２の成分と組み合わせて栄養組成物を形成することができる。いくつかの実施形態では、組成物のアミノ酸の唯一のソースが少なくとも１つの改変タンパク質である。そのような実施形態では、組成物のアミノ酸組成は少なくとも１つの改変タンパク質のアミノ酸組成と同じである。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの改変タンパク質及び少なくとも１つの第２のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２のタンパク質は改変タンパク質であり、一方、別の実施形態では、少なくとも１つの第２のタンパク質は改変タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の改変タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の非改変タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の改変タンパク質を含み、組成物は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の非改変タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、前の段落に記載の栄養組成物は、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのペプチド、及び少なくとも１つの遊離アミノ酸の少なくとも１つを更に含む。いくつかの実施形態では、栄養組成物は、少なくとも１つのポリペプチド及び少なくとも１つのペプチドを含む。いくつかの実施形態では、栄養組成物は、少なくとも１つのポリペプチド及び少なくとも１つの遊離アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、栄養組成物は、少なくとも１つのペプチド及び少なくとも１つの遊離アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのペプチド、及び／又は少なくとも１つの遊離アミノ酸は、（１）分岐鎖アミノ酸、（２）ロイシン、及び（３）必須アミノ酸から選択されるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのペプチド、及び／又は少なくとも１つの遊離アミノ酸は、（１）分岐鎖アミノ酸、（２）ロイシン、及び（３）必須アミノ酸から選択されるアミノ酸からなる。
栄養組成物にポリペプチド、ペプチド、及び遊離アミノ酸のうちの少なくとも１つを加えることにより、組成物中に存在する全アミノ酸に対する分岐鎖アミノ酸、ロイシン、及び必須アミノ酸の少なくとも１つの割合を上昇させることができる。
いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの炭水化物を含む。「炭水化物」とは、糖又は糖の重合体を指す。「サッカライド」、「多糖」、「炭水化物」、及び「オリゴ糖」という用語は交換可能に用いることができる。ほとんどの炭水化物は、多くのヒドロキシル基（通常は分子の各炭素原子に１つ）を有するアルデヒド又はケトンである。炭水化物は通常、分子式ＣｎＨ２ｎＯｎを有する。炭水化物は単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、又は多糖であり得る。ほとんどの基本的な炭水化物は単糖、例えばグルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、及びフルクトースである。二糖は、２つの連結された単糖である。二糖の例としては、スクロース、マルトース、セロビオース、及びラクトースが含まれる。典型的には、オリゴ糖は、３〜６個の単糖単位を含み（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖は、６個以上の単糖単位を含む。多糖の例としては、デンプン、グリコーゲン、及びセルロースが含まれる。炭水化物は、ヒドロキシル基が除去された２’−デオキシリボース、ヒドロキシル基がフッ素で置換された２’−フルオロリボース、グルコースの窒素含有形態であるＮ−アセチルグルコサミン（例えば、２’−フルオロリボース、デオキシリボース、及びヘキソース）等の修飾サッカライド単位を含み得る。炭水化物は、多くの異なる形態、例えば配座異性体、環状形態、非環状形態、立体異性体、互変異性体、アノマー、及び異性体で存在し得る。
いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの脂質を含む。本明細書において、「脂質」は、脂肪、油、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質；遊離脂肪酸等の任意の形態の脂肪酸を含む。脂肪、油、及び脂肪酸は、飽和、不飽和（シス又はトランス）、一部不飽和（シス又はトランス）であり得る。いくつかの実施形態では、脂質は、ラウリン酸（１２：０）、 ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、マルガリン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノレン酸（１８：３）、オクタデカテトラエン酸（１８：４）、アラキン酸（２０：０）、エイコセン酸（２０：１）、エイコサジエン酸（２０：２）、エイコサテトラエン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）（ＥＰＡ）、ドコサン酸（２２：０）、ドコセン酸（２２：１）、ドコサペンタエン酸（２２：５）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）（ＤＨＡ）、及びテトラコサン酸（２４：０）から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの修飾脂質、例えば調理により修飾された脂質を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの補助的なミネラル又はミネラル源を含む。ミネラルの例としてはクロリド、ナトリウム、カルシウム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、及びセレンが含まれるが、これらに限定されない。上記ミネラルのいずれかの好適な形態としては、可溶性ミネラル塩、わずかに可溶性のミネラル塩、不溶性のミネラル塩、キレート化ミネラル、ミネラル複合体、非反応性ミネラル、例えばカルボニルミネラル、及び還元されたミネラル、及びこれらの組合せが含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの補助的なビタミンを含む。少なくとも１つのビタミンは脂溶性又は水溶性ビタミンであり得る。好適なビタミンとしては、限定されるものではないが、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ６、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸、及びビオチンが含まれる。上記のいずれかの好適な形態は、ビタミンの塩、ビタミンの誘導体、ビタミンと同じ又は類似の活性を有する化合物、及びビタミンの代謝物である。
いくつかの実施形態では、組成物は賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含む。好適な賦形剤の非限定的な例としては、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、分散助剤、崩壊剤、香味剤、甘味剤、着色剤が含まれる。
いくつかの実施形態では、賦形剤は緩衝剤である。好適な緩衝剤の非限定的な例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、及び重炭酸カルシウムが含まれる。
いくつかの実施形態では、賦形剤は保存剤を含む。好適な保存剤の非限定的な例としては、抗酸化剤、例えばα−トコフェロール及びアスコルビン酸、並びに抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、及びフェノールが含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物は賦形剤として結合剤を含む。好適な結合剤の非限定的な例としては、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカライド、オリゴ糖、及びその組合せが含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物は賦形剤として滑沢剤を含む。好適な滑沢剤の非限定的な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス（ｓｔｅｒｏｔｅｘ）、ポリオキシエチレンモノステアラート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、及び軽油が含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物は賦形剤として分散助剤を含む。好適な分散剤の非限定的な例としては、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、同形シリケート（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、及び高ＨＬＢ乳化界面活性剤としての微結晶性セルロースが含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物は賦形剤として崩壊剤を含む。いくつかの実施形態では、崩壊剤は非発泡性崩壊剤である。好適な非発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、デンプン、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、そのアルファ化及び加工デンプン、甘味剤、クレイ、例えばベントナイト、微結晶性セルロース、アルギナート、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム、例えば寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン（ｐｅｃｉｔｉｎ）、及びトラガカントが含まれる。いくつかの実施形態では、崩壊剤は発泡性崩壊剤である。好適な発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウム及び酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムが含まれる。
いくつかの実施形態では、賦形剤は香味剤を含む。香味剤は、合成の香味油及び香味芳香族化合物（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ａｒｏｍａｔｉｃｓ）；天然油；植物、葉、花、及び果実の抽出物；及びその組合せから選択することができる。いくつかの実施形態では、香味剤は、シナモン油；ウィンターグリーン油；ペパーミント油；クローバー油；乾草油；アニス油；ユーカリ；バニラ；シトラス油、例えばレモン油、オレンジ油、グレープ及びグレープフルーツ油；並びにりんご、桃、西洋なし、苺、ラズベリー、さくらんぼ、西洋すもも（ｐｌｕｍ）、パイナップル、及び杏を含む果実の精油から選択される。
いくつかの実施形態では、賦形剤は甘味剤を含む。好適な甘味剤の非限定的な例としては、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトース、及びその混合物（担体として用いられない時）；サッカリン及びその種々の塩、例えばナトリウム塩；ジペプチド甘味剤、例えばアスパルテーム；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリジン；ステビア（ステビオシド）；スクロースのクロロ誘導体、例えばスクラロース；及び糖アルコール、例えばソルビトール、マンニトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）等が含まれる。更に、加水分解水添デンプン（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）及び合成甘味剤３，６−ジヒドロ−６−メチル−１，２，３−オキサチアジン−４−オン−２，２−ジオキシド、特にカリウム塩（アセスルファム−Ｋ）、並びにそのナトリウム及びカルシウム塩も企図される。
いくつかの実施形態では、組成物は着色剤を含む。好適な着色剤の非限定的な例としては、食品、医薬品、化粧品の色素（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品及び化粧品の色素（Ｄ＆Ｃ）、並びに外用薬（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｄｒｕｇ）及び化粧品の色素（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が含まれる。着色剤は色素又はその対応するレーキとして用いることができる。
製剤中の賦形剤又は賦形剤の組合せの重量の割合は通常、組成物中のタンパク質の総重量の約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、又は約１％以下である。
本明細書に開示されている改変タンパク質及び栄養組成物は、種々の形態に製剤化して複数の異なる手段で投与することができる。組成物は、所望により従来の許容可能な担体、補助剤、及び賦形剤を含む製剤の形態で、経口、経直腸、又は非経口的に投与することができる。本明細書において、「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、又は胸骨内への注射及び注入技術を含む。代表的な実施形態では、改変タンパク質又は栄養組成物は経口投与される。
経口投与のための固体製剤としては、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、散剤、及び顆粒剤が含まれる。カプセル剤は通常、改変されたタンパク質又は組成物を含むコア材料及びコア材料を包むシェル壁を含む。いくつかの実施形態では、コア材料は、固体、液体、及びエマルションの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、シェルウォールの材料は軟ゼラチン、硬ゼラチン、及び重合体の少なくとも１つを含む。好適な重合体としては、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：セルロース重合体、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、トリメリト酸酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、ヒドロキシプロピルメチルセルローススクシナート、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム；アクリル酸の重合体及びコポリマー、例えばアクリル酸、メタクリル酸、メチルアクリラート、アンモニオメチルアクリラート、エチルアクリラート、メチルメタクリレート、及び／又はエチルメタクリラートから形成されるもの（例えば、商標「オイドラギット」で販売されているコポリマー）；ビニルポリマー及びコポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセタートフタラート、ビニルアセタートクロトン酸コポリマー、及びエチレン−酢酸ビニルコポリマー；及びセラック（精製ラック）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの重合体は味覚マスキング剤として機能する。
錠剤、丸剤等は、圧縮されてよく、複合的に圧縮されてよく、複合的に積層されてよく、且つ／又はコーティングされてよい。コーティングは単一又は複数であり得る。一実施形態では、コーティング材料は、植物、真菌、及び微生物の少なくとも１つから抽出されたサッカライド、多糖、及び糖タンパク質の少なくとも１つを含む。非限定的な例としては、コーンスターチ、小麦デンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、ペクチン、マンナン、アラビアゴム、イナゴマメガム、メスキートゴム、グアーガム、カラヤガム、ガッチゴム、トラガカントゴム、布海苔、カラギーナン、寒天、アルギナート、キトサン、又はジェランガムが含まれる。いくつかの実施形態では、コーティング材料はタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コーティング材料は脂肪及び油の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、脂肪及び油の少なくとも１つは高温で融解する。いくつかの実施形態では、脂肪及び油の少なくとも１つは水素化されているか、部分的に水素化されている。いくつかの実施形態では、脂肪及び油の少なくとも１つは植物由来である。いくつかの実施形態では、脂肪及び油の少なくとも１つは、グリセリド、遊離脂肪酸、及び脂肪酸エステルの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、コーティング材料は少なくとも１つの食用ワックスを含む。食用ワックスは、動物、昆虫、又は植物に由来し得る。非限定的な例としては、蜜蝋、ラノリン、ベーベリ（ｂａｙｂｅｒｒｙ）ワックス、カルナバワックス、及び米ぬかワックスが含まれる。錠剤及び丸剤は更に腸溶性コーティングを用いて調製することができる。
あるいは、本明細書に開示されている改変タンパク質及び栄養組成物を具体化した散剤又は顆粒剤は食品に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、食品は経口投与用の飲み物である。好適な飲み物の非限定的な例としては、フルーツジュース、フルーツドリンク、人工的に風味を付けた飲み物、人工甘味料入りの飲み物、炭酸飲料、スポーツドリンク、液体乳製品、シェーク、アルコール飲料、カフェイン含有飲料、調製粉乳等が含まれる。経口投与のためのその他の好適な手段としては、水性及び非水性の溶液、乳液、懸濁液、及び溶液、並びに／又は好適な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味剤、着色剤、及び香味剤の少なくとも１つを含む非発泡性顆粒から再構成された懸濁液が含まれる。
いくつかの実施形態では、食品は固体の食料品である。固体食料品の好適な例としては、限定されるものではないが、フードバー、スナックバー、クッキー、ブラウニー、マフィン、クラッカー、アイスクリームバー、フローズンヨーグルトバー等が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているタンパク質及び組成物は治療食に組み込まれる。いくつかの実施形態では、治療食は、一部又は全ての必須な主要栄養素及び微量栄養素を場合により含むすぐに食べられる食品である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているタンパク質及び組成物は、既存の食事中に混ぜられるように設計された補助食中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、補助食は、一部又は全ての必須な主要栄養素及び微量栄養素を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているタンパク質及び組成物は、食物のタンパク質栄養を強化するために既存の食物と混合されるかこれに加えられる。例としては、主食（穀物、塩、糖、料理油、マーガリン）、飲料（コーヒー、茶、ソーダ水、ビール、アルコール飲料（ｌｉｑｕｏｒ）、スポーツドリンク）、スナック、スイーツ（ｓｗｅｅｔｓ）、及びその他の食物が含まれる。
本明細書に開示されている組成物は、例えば、筋肉の量、強度、及び身体機能、熱産生、代謝支出、満腹感、ミトコンドリアバイオジェネシス、体重又は脂肪の低減、並びに除脂肪身体組成の少なくとも１つを向上させる方法において利用することができる。
製剤は、製剤中に１００キロカロリー当たり約２５ｇ（２５ｇ／１００ｋｃａｌ）まで栄養ポリペプチドを含み得、これは製剤中に存在するエネルギーの全部又は本質的に全部が栄養ポリペプチドの形態であることを意味する。より典型的には、製剤中に存在するエネルギーの約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は５％未満が栄養ポリペプチドの形態である。他の製剤では、栄養ポリペプチドは、ポリペプチドの基準１日摂取値の少なくとも約０．１％以上の栄養的利益を与えるのに充分な量で存在する。タンパク質の好適な基準１日摂取値は当該技術分野で周知である。例えば、Ｄｉｅｔａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｉｎｔａｋｅｓ ｆｏｒ Ｅｎｅｒｇｙ， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ， Ｆｉｂｅｒ， Ｆａｔ， Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ， Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ， ２００５， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ参照。タンパク質の基準１日摂取値は、タンパク質及び単離されたアミノ酸によって１日のカロリーの１０〜３５％が提供される範囲である。年齢に基づく別の基準１日摂取値が、１日当たりのタンパク質のグラム数として提供される：１〜３歳の子供：１３ｇ、４〜８歳の子供：１９ｇ、９〜１３歳の子供：３４ｇ、１４〜１８歳の少女：４６、１４〜１８歳の少年：５２、１９〜７０歳＋の女性：４６、１９〜７０歳＋の男性：５６。別の製剤では、栄養ポリペプチドは、タンパク質栄養不良又はタンパク質栄養不良を特徴とする疾患、障害、若しくは状態に苦しむヒト対象に栄養的利益を提供するのに充分な量で存在する。タンパク質栄養不良は通常、出生前又は子供の状態である。エネルギー摂取が適切であるタンパク質栄養不良はクワシオルコル又は低アルブミン血症栄養不良と名付けられており、不適切なタンパク質摂取を含む全ての形態の不適切なエネルギー摂取は消耗症と名付けられている。適切に栄養を与えられた個体が、タンパク質消費が少なすぎるか、栄養アミノ酸の不足したタンパク質の消費により、サルコペニアを発症することがある。本明細書に記載の栄養ポリペプチドを妊婦に投与することにより出生前タンパク質栄養不良を防止、処置、又は低減することができ、本明細書に記載の栄養ポリペプチドを授乳中の母親に投与することにより新生児タンパク質栄養不良を防止、処置、又は低減することができる。成人では、タンパク質栄養不良は通常、癌、慢性腎疾患に続発的に及び高齢者で生じる。更に、タンパク質栄養不良は慢性のこともあり、急性のこともある。急性タンパク質栄養不良の例は、敗血症等の急性の病気又は疾患中に又は手術等の外傷、火傷等の熱傷、若しくは実質的な組織再構築を生じる同様な事象からの回復中に生じる。本明細書に記載の方法及び組成物により処置可能なその他の急性の病気としては、サルコペニア、悪液質、糖尿病、インスリン抵抗性、及び肥満が含まれる。
製剤は、ヒト対象によって消費された時に満腹感を提供するのに充分な量の栄養ポリペプチドを含み得、これは、対象の空腹感が低下するか無くなるか、食べることへの要求が低下することを意味する。そのような製剤は通常、同じカロリーベースで高炭水化物食より満腹指数が高い。
製剤は、栄養ポリペプチド濃度（例えば、重量／重量ベース）に基づく量で、栄養ポリペプチドが製剤の重量の最大１００％を占めるように栄養ポリペプチドを含み得、これは、製剤中に存在する物質の全部又は本質的に全部が栄養ポリペプチドの形態であることを意味する。より典型的には、製剤中に存在する重量の約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は５％未満が栄養ポリペプチドの形態である。いくつかの実施形態では、製剤は、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、６０ｇ、７０ｇ、８０ｇ、９０ｇ、１００ｇ、又は１００ｇ超の栄養ポリペプチドを含む。
好ましくは、本明細書で提供される製剤は非食用生産品を実質的に含まない。非食用生産品は、酵母、細菌、藻類、昆虫、哺乳動物、又は他の発現系から生産される先行技術の組換え型タンパク質の製造においてしばしば見られる。非食用生産物の例としては、界面活性剤、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、非食用のポリ酸若しくはポリオール、脂肪アルコール、アルキルベンジルスルホナート、アルキルグルコシド、又はメチルパラベンが含まれる。
態様では、提供される製剤は、味覚物質、栄養性炭水化物、及び／又は栄養性脂質等のその他の材料を含む。更に、製剤は、増量剤、調質剤、及び充填剤を含み得る。
好ましい実施形態では、本明細書で提供される栄養ポリペプチドは、単離されており且つ／又は実質的に精製されている。本明細書で提供される栄養ポリペプチド、組成物、及び製剤は、非タンパク質成分を実質的に含まない。そのような非タンパク質成分は通常、ポリペプチドと複合体を形成して胃腸管中でのタンパク質消化を遅らせ且つ不完全にするかなりの量の炭水化物及び脂質を含む乳清、カゼイン、卵、及びソイ標品等のタンパク質標品中に存在する。そのような非タンパク質成分にはＤＮＡも含まれ得る。したがって、栄養ポリペプチド、組成物、及び製剤は、食物由来のポリペプチド及びポリペプチド混合物と比べた消化率の向上及びアレルゲン性の低下を特徴とする。いくつかの実施形態では、消化率の向上とは、消費されるか別の方法でヒト対象の胃腸管中に投与された時の消化速度がより速いことを意味する。別の実施形態では、例えばヒトがタンパク質吸収能力障害に苦しむ状況において、消化率の向上とは、消費されるか別の方法でヒト対象の胃腸管中に投与された時の消化速度がより遅いことを意味する。更に、これらの製剤及び組成物は、時間に対する消化率及び／又は所与の単位時間ベースでの消化生成物の再現性がより高いことを特徴とする。特定の実施形態では、栄養ポリペプチドは、参照ポリペプチド又は参照ポリペプチド混合物と比べて、脂質及び／又は炭水化物並びに場合により消化率を低下させ且つ／又はアレルゲン性を高める１又は複数のその他の材料が少なくとも１０％低減しており、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は９９％超低減している。特定の実施形態では、栄養製剤は、消化率及び／又はアレルゲン性低下のために選択される栄養性炭水化物及び／又は栄養性脂質を含む。
本明細書に開示される組成物は、例えば、筋肉量、強度、及び身体機能、熱産生、代謝支出、満腹感、ミトコンドリアバイオジェネシス、体重又は脂肪の低減、並びに除脂肪身体組成のうちの少なくとも１つを向上させる方法において利用することができる。
Ｇ．使用方法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているタンパク質及び組成物は、患者又は使用者（まとめて「対象」と呼ぶこともある）に投与される。本明細書において、「投与する」及び「投与」は、１人の人が別の人にタンパク質又は組成物を特定の方法及び／又は特定の目的で消費するように指導する実施形態並びに第２の人から受けた指示とは無関係に又はそれと矛盾するように使用者がタンパク質又は組成物をある特定の方法及び／又は特定の目的で使用する状況も包含する。１人の人が別の人にタンパク質又は組成物を特定の方法及び／又は特定の目的で消費するように指導する実施形態の非限定的な例としては、医師があるコースの行為及び／又は処置を患者に処方する時、トレーナーが使用者（例えば、運動選手）に特定のコースの行為及び／又は処置に従うように助言する時、及び製造者、販売業者、又はマーケティング担当者が、例えば製品の販売又はマーケティングに関連して提供されるパッケージング又はその他の資料上のラベリング又は広告により、末端使用者に使用状態を推奨する時が含まれる。
いくつかの実施形態では、タンパク質又は組成物は投薬形態で提供される。いくつかの実施形態では、投薬形態は、本明細書に開示されている少なくとも１つのタンパク質の投与のために設計され、投与されるタンパク質の総量は、０．１〜１ｇ、１〜５ｇ、２〜１０ｇ、５〜１５ｇ、１０〜２０ｇ、１５〜２５ｇ、２０〜４０ｇ、２５〜５０ｇ、及び３０〜６０ｇから選択される。いくつかの実施形態では、投薬形態は、本明細書に開示されている少なくとも１つのタンパク質の投与のために設計され、投与されるタンパク質の総量は、約０．１ｇ、０．１ｇ〜１ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、５５ｇ、６０ｇ、６５ｇ、７０ｇ、７５ｇ、８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇ、及び１００ｇから選択される。
いくつかの実施形態では、投薬形態は、本明細書に開示されている少なくとも１つのタンパク質の投与のために設計され、投与される必須アミノ酸の総量は、０．１〜１ｇ、１〜５ｇ、２〜１０ｇ、５〜１５ｇ、１０〜２０ｇ、及び１〜３０ｇから選択される。いくつかの実施形態では、投薬形態は、本明細書に開示されている少なくとも１つのタンパク質の投与のために設計され、投与されるタンパク質の総量は、約０．１ｇ、０．１〜１ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、５５ｇ、６０ｇ、６５ｇ、７０ｇ、７５ｇ、８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇ、及び１００ｇから選択される。
いくつかの実施形態では、タンパク質又は組成物は、１日０．１〜１ｇ、１日１〜５ｇ、１日２〜１０ｇ、１日５〜１５ｇ、１日１０〜２０ｇ、１日１５〜３０ｇ、１日２０〜４０ｇ、１日２５〜５０ｇ、１日４０〜８０ｇ、１日５０〜１００ｇ、それ以上の速度で消費される。
いくつかの実施形態では、対象による全タンパク質摂取量のうち、食事期間中に対象による全タンパク質摂取量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は約１００％が、本開示に係る少なくとも１つのタンパク質で構成される。いくつかの実施形態では、対象による全タンパク質摂取量のうち、食事期間中の対象による全タンパク質摂取量の５〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の５〜９０％、対象による全タンパク質摂取量の５〜８０％、対象による全タンパク質摂取量の５〜７０％、対象による全タンパク質摂取量の５〜６０％、対象による全タンパク質摂取量の５〜５０％、対象による全タンパク質摂取量の５〜４０％、対象による全タンパク質摂取量の５〜３０％、対象による全タンパク質摂取量の５〜２０％、対象による全タンパク質摂取量の５〜１０％、対象による全タンパク質摂取量の１０〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の１０〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の２０〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の３０〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の４０〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の５０〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の６０〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の７０〜１００％、対象による全タンパク質摂取量の８０〜１００％、又は対象による全タンパク質摂取量の９０〜１００％が、本開示に係る少なくとも１つのタンパク質で構成される。いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１つのタンパク質は、食事期間中の対象のカロリー摂取量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％を占める。
いくつかの実施形態では、本開示に係る少なくとも１個のタンパク質は、本開示の少なくとも２個のタンパク質、本開示の少なくとも３個のタンパク質、本開示の少なくとも４個のタンパク質、本開示の少なくとも５個のタンパク質、本開示の少なくとも６個のタンパク質、本開示の少なくとも７個のタンパク質、本開示の少なくとも８個のタンパク質、本開示の少なくとも９個のタンパク質、本開示の少なくとも１０個のタンパク質、又はそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、食事期間は、１食、２食、３食、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年である。いくつかの実施形態では、食事期間は、１日〜１週間、１週間〜４週間、１ヶ月〜３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、又は６ヶ月〜１年である。
臨床研究により、タンパク質が加齢又は床上安静による筋肉喪失を防止する証拠が得られている。具体的には、研究により、タンパク質補充が、長期床上安静中の筋線維合成速度（ＦＳＲ）を上昇させること、長期床上安静中の脚の質量及び強度を維持すること、除脂肪体重を増加させること、歩行運動及びバランスの機能的測定値を向上させること、並びに非移動性又は長期床上安静によるサルコペニアのリスクがある個体にとっての実行可能な介入となり得ることが示されている。例えば、Ｐａｄｄｏｎ−Ｊｏｎｅｓ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００４， ８９：４３５１−４３５８； Ｆｅｒｒａｎｄｏ， Ａ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ２００９ １−６； Ｋａｔｓａｎｏｓ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ． ２００６， ２９１： ３８１−３８７参照。
運動選手における筋肉タンパク質同化の増強に関する研究により、タンパク質を運動後に与えると、運動のみにより達成されるよりも大きく筋肥大が促進されることが示されている。更に、運動後に与えられるタンパク質は、タンパク質分解を増加させずにタンパク質合成を助けることが示されており、これにより正味で正のタンパク質バランス及び筋肉量増大が達成される。筋肉タンパク質合成は必須アミノ酸の補充に対して用量反応的に反応するようであるが、全てのタンパク質が筋肉の構築において同等であるわけではない。例えば、アミノ酸ロイシンは、筋肉タンパク質合成の刺激の重要な因子である。例えば、Ｂｏｒｓｃｈｅｉｍ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００２， ２８３： Ｅ６４８−Ｅ６５７； Ｂｏｒｓｈｅｉｍ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ． ２００８， ２７： １８９−９５； Ｅｓｍａｒｃｋ Ｂ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００１， ５３５： ３０１−３１１； Ｍｏｏｒｅ Ｄ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００９， ８９： １６１−８）参照。
別の態様では、本開示は、対象の筋肉量、筋力、及び機能的パフォーマンスのうちの少なくとも１つを維持又は増大する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、充分な量の本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物を対象に提供することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、高齢者、医学的危篤状態、及びタンパク質エネルギー栄養不良に苦しんでいるのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、充分な量の本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物は、運動の実行とともに対象によって消費される。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物は、経口、経腸、又は非経口経路により対象によって消費される。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物は経口経路で対象によって消費される。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物は、経腸経路で対象によって消費される。
別の態様では、本開示は、対象において望ましい肥満度指数を維持又は達成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、充分な量の本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物を対象に提供することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、高齢者、医学的危篤状態、及びタンパク質エネルギー栄養不良に苦しんでいるの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、充分な量の本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物は、運動の実行とともに対象によって消費される。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物は、経口、経腸、又は非経口経路により対象によって消費される。
別の態様では、本開示は、タンパク質エネルギー栄養不良の対象にタンパク質を与える方法を開示する。いくつかの実施形態では、方法は、充分な量の本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物を対象に与えることを含む。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物は経口、経腸、又は非経口経路で対象によって消費される。
癌患者及び悪液質に苦しむ他の患者において必須アミノ酸補充の必要性が示唆されている。マウスにおける食事研究により、必須アミノ酸を用いた食事介入による、悪液質性癌を有するマウスの生存的及び機能的な利益が示されている。癌以外に、必須アミノ酸補充は、慢性閉塞性肺疾患、慢性心不全、ＨＩＶ、及びその他の疾患状態等の運動が困難なその他の疾患に苦しむ、したがって筋肉の劣化に苦しむ患者における筋肉機能の向上及び筋肉増加等の利益も示す。
研究により、悪液質の管理に特定のアミノ酸が有益であることが示されている。食事中の比較的高い含有量のＢＣＡＡ及びＬｅｕは、翻訳増加、インスリン放出増強、及びタンパク質分解阻害のシグナルを伝達することで全タンパク質合成を促進することにより悪液質に良い影響を与えると考えられている。したがって、より多くの食事性ＢＣＡＡ全般及び／又は特にＬｅｕを消費することは、悪液質の影響の低減又は逆転にとって良い方向に寄与する。悪液質の根本的原因に逆らうには窒素バランスが重要であるので、より多くの食事性グルタミン及び／又はアルギニンの消費は悪液質の影響の低減又は逆転に良い方向に寄与すると考えられる。例えば、Ｏｐ ｄｅｎ Ｋａｍｐ Ｃ， Ｌａｎｇｅｎ Ｒ， Ｈａｅｇｅｎｓ Ａ， Ｓｃｈｏｌｓ Ａ． ”Ｍｕｓｃｌｅ ａｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｃａｃｈｅｘｉａ： ｃａｎ ｄｉｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｉｐ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ？” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃａｒｅ ２００９， １２：６１１−６１６； Ｐｏｏｎ ＲＴ−Ｐ， Ｙｕ Ｗ−Ｃ， Ｆａｎ Ｓ−Ｔ， ｅｔ ａｌ． ”Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｏｒａｌ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｃｈｅｍｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ．” Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２００４； １９：７７９−７８８； Ｔａｙｅｋ ＪＡ， Ｂｉｓｔｒｉａｎ ＢＲ， Ｈｅｈｉｒ ＤＪ， Ｍａｒｔｉｎ Ｒ， Ｍｏｌｄａｗｅｒ ＬＬ， Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ＧＬ． ”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｔｏｔａｌ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃａｃｈｅｘｉａ．” Ｃａｎｃｅｒ． １９８６；５８：１４７−５７； Ｘｉ Ｐ， Ｊｉａｎｇ Ｚ， Ｚｈｅｎｇ Ｃ， Ｌｉｎ Ｙ， Ｗｕ Ｇ ”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈ．” Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１１ Ｊａｎ １；１６：５７８−９７参照。
したがって、本発明は更に、対象における悪液質を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、悪液質を有する対象にとっての充分な量の本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物は、人によって摂取される本開示のタンパク質の量が代謝的必要性（しばしば高まっている）を満たす又は超えるような量である。体重１ｋｇ当たり１日１．５ｇ又は全カロリー摂取量の１５〜２０％のタンパク質摂取量が、悪液質を有する人にとっての適切な標的であると考えられる。いくつかの実施形態では、対象によって消費されるタンパク質の全部が本開示に係るタンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示に係るタンパク質は、対象の全タンパク質摂取量を提供するために他のタンパク質及び／又は遊離アミノ酸の源と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、対象は、高齢者、医学的危篤状態、及びタンパク質エネルギー栄養不良に苦しんでいるうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、対象は、運動を困難にする、したがって筋肉劣化を生じさせる疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、慢性心不全、ＨＩＶ、癌、及びその他の疾患状態に苦しんでいる。いくつかの実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、又は本開示に係る方法により作製される組成物は、運動の実行とともに対象によって消費される。いくつかの実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、又は本開示に係る方法により作製された組成物は、経口、経腸、又は非経口経路により対象によって消費される。
サルコペニアとは、加齢に関連した骨格筋の量（典型的には、２５歳を過ぎてから１年に０．５〜１％の減少）、質、及び強度の変性喪失である。サルコペニアは虚弱症候群の１つである。高齢者のサルコペニアに関する欧州ワーキンググループ（ＥＷＧＳＯＰ）により、加齢性サルコペニアの実用的な臨床定義及びコンセンサス診断基準が作成された。ワーキンググループは、サルコペニアの診断に低い筋肉量及び低い筋肉機能（強度又はパフォーマンス）の両方の存在を用いることを提唱している。サルコペニアは第１に、筋肉組織の「質」の低下に加えて、脂肪による筋線維の置換、線維症の増加、筋肉代謝の変化、酸化ストレス、及び神経筋接合部の変性等の因子により生じる筋萎縮（筋肉サイズの減少）を特徴とする。合わさると、これらの変化は、筋肉機能を漸進的に失わせ、最終的に虚弱にする。虚弱は、高齢者の健康及び機能が破局的に低下するリスクの上昇が具体化した一般的な老年性症候群である。虚弱の一因となるものとしては、サルコペニア、骨粗しょう症、及び筋力低下が含まれ得る。筋力低下は、筋疲労（又は「強度の不足」）としても知られ、骨格筋を用いて力を行使できないことを指す。筋力低下はしばしば、病気の結果としての長期間の床上安静等の活動の減少及び筋萎縮に続いて起こる。サルコペニアの結果として筋力低下が徐々に始まることもある。
本開示のタンパク質は、対象において発症した後のサルコペニア又は虚弱の処置又はリスク群のメンバーである対象におけるサルコペニア又は虚弱の発症の防止に有用である。いくつかの実施形態では、対象によって消費される全タンパク質が、本開示に係るタンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示に係るタンパク質は、その他のタンパク質及び／又は遊離アミノ酸のソースと組み合わされて、対象の全タンパク質摂取量を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、高齢者、医学的危篤状態、及びタンパク質エネルギー栄養不良に苦しんでいるうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、又は本開示に係る方法により作製された組成物は、運動の実行とともに消費者に消費される。いくつかの実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、又は本開示に係る方法により作製された組成物は、経口、経腸、又は非経口経路で対象によって消費される。
肥満は、高血圧、２型糖尿病、脂質異常症、冠動脈心疾患、脳卒中、癌（例えば、子宮内膜、乳、及び結腸）、変形性関節症、睡眠時無呼吸、及び呼吸器系の問題を含む多数の共存症と関連する多因子疾患である。肥満度指数＞３０ｋｇ／ｍ２として定義される肥満の発生率は、米国で１５％（１９７６〜１９８０）から３３％（２００３〜２００４）へと劇的に上昇しており、上昇し続けている。肥満の一因となるメカニズムは複雑であり、行動的要素とホルモン的プロセス、遺伝子的プロセス、及び代謝的プロセスとの相互作用を含むが、肥満は主に、過剰なエネルギー摂取及び不十分な身体活動の２つを主な原因とする生活習慣依存的状態と考えられている。エネルギー摂取に関して、全エネルギー摂取量を調節しながら食事中のタンパク質の割合を適度に増やすことで、身体組成が改善され、脂肪減少が促進され、減量後の体重維持が改善され得るという証拠がある。食事性タンパク質の増加に関連する良い結果は主に、満腹感の上昇に関連したより低いエネルギー摂取量、エネルギー効率の低下及び／又は熱産生の増大、身体組成（特に除脂肪筋肉量）への良い効果、並びに血糖コントロールの向上によるものと考えられる。
食事性タンパク質は、等カロリーの炭水化物又は脂肪の摂取より、食後エネルギー消費の増大により効果的である（例えば、Ｄａｕｎｃｅｙ Ｍ， Ｂｉｎｇｈａｍ Ｓ． ”Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ２４ ｈ ｅｎｅｒｇｙ ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ ｉｎ ｍａｎ ｏｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｉｎｔａｋｅ．” Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ １９８３， ５０： １−１３； Ｋａｒｓｔ Ｈ ｅｔ ａｌ． ”Ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍａｎ： ｔｈｅｒｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｆａｔｓ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｅｎｅｒｇｙ ａｍｏｕｎｔ．” Ａｎｎ Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ．１９８４， ２８： ２４５−５２； Ｔａｐｐｙ Ｌ ｅｔ ａｌ “Ｔｈｅｒｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｆｕｓｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．” Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９３， ５７ （６）： ９１２−６参照）。この特性は、他の特性（満腹感の誘導；除脂肪体重の保存）と共に、タンパク質を体重管理のための食事の魅力的な成分にしている。このような食事によるエネルギー消費の増加は、一部、タンパク質の消化及び代謝のエネルギーコストが他のカロリー源より高いことによるものであり得る。タンパク質合成を含むタンパク質の代謝回転はエネルギーを消費するプロセスである。更に、高タンパク質食は、肝臓及び褐色脂肪中での脱共役タンパク質を上方調節し得、これはエネルギー消費の増加に正に相関する。種々のタンパク質がエネルギー消費に固有の影響を与え得ると理論付けられている。
研究により、タンパク質、特に高ＥＡＡ及び／又はＢＣＡＡ含有量のタンパク質の摂取は、熱産生及びエネルギー消費に異なる影響を与えることが示唆されている（例えば、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ． ”Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆａｔ−ｒｅｄｕｃｅｄ ｄｉｅｔｓ ｏｎ ２４ ｈ ｅｎｅｒｇｙ ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．” Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０００， ７２：１１３５−４１； Ａｃｈｅｓｏｎ Ｋ． ｅｔ ａｌ． ”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｉｃｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．” Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０１１， ９３：５２５−３４； Ａｌｆｅｎａｓ Ｒ． ｅｔ ａｌ． ”Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｎ ａｐｐｅｔｉｔｅ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｗｅｉｇｈｔ ｓｕｂｊｅｃｔｓ” Ａｒｇ Ｂｒａｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂｏｌ ２０１０， ５４ （１）： ４５−５１； Ｌｏｒｅｎｚｅｎ Ｊ． ｅｔ ａｌ． ”Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ａｐｐｅｔｉｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ．” Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０１２ ６６ （５）： ６２２−７参照）。更に、Ｌ−チロシンは、熱産生において役割を果たすアミノ酸として特定されている（例えば、Ｂｅｌｚａ Ａ． ｅｔ ａｌ． ”Ｔｈｅ ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ ｐａｒｔｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｆｏｏｄ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．” Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２００９， ５８ （８）：１１３７−４４参照）。更なる研究により、ロイシン及びアルギニン補充が、基質を脂肪組織ではなく除脂肪体重へと導くことによりエネルギー代謝を変えるようであることが示唆されている（Ｄｕｌｌｏｏ Ａ． ”Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ： ｆｒｏｍ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．” Ｏｂｅｓ Ｒｅｖ ２０１１ １２： ８６６−８３）。
総合すると、文献は、異なるタンパク質タイプが熱産生に対して異なる効果をもたらすことを示唆している。Ｔｙｒ、Ａｒｇ、及びＬｅｕのうちの少なくとも１つ、ＥＡＡ、並びに／又はＢＣＡＡが豊富なタンパク質又はペプチドは、熱産生を刺激する効果があると考えられているので、及び熱産生の刺激は体重管理に良い効果をもたらすと考えられているので、本開示は更に、熱産生を刺激し且つ／又は体重管理全般に良い効果をもたらすのに有用な生産物及び方法を提供する。
より具体的には、本開示は、対象において熱産生を増大させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、充分な量の本開示のタンパク質、本開示の組成物、又は本開示の方法により作製された組成物を対象に与えることを含む。いくつかの実施形態では、対象は肥満である。いくつかの実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、又は本開示に係る方法により作製された組成物は、運動の実行とともに対象によって消費される。いくつかの実施形態では、本開示に係るタンパク質、本開示に係る組成物、又は本開示に係る方法により作製された組成物は、経口、経腸、又は非経口経路で対象によって消費される。
基本的に、過体重状態の発生の理由はエネルギー摂取量とエネルギー消費量との不均衡によるものである。任意の特定の機会及び食べる機会の間の食物を減らそう（それぞれ、飽和及び満腹）という試みが近年の研究の主な焦点になっている。食事中に満足を感じるか食事後に満腹であると感じることによるカロリー摂取量の減少は、内部及び外部のシグナルの複雑な相互作用によるものである。種々の栄養研究により、エネルギー密度、含有量、食感、及び味等の食物の特性の変化は飽和及び満腹の両方に影響することが示されている。
エネルギーを届ける３つの主要栄養素、すなわち脂肪、炭水化物、及びタンパク質がある。１グラムのタンパク質又は炭水化物は４カロリーを提供し、１グラムの脂肪は９カロリーを提供する。タンパク質は通常、炭水化物又は脂肪より大きく満腹感を増大させるので、カロリー摂取量の低下を容易にし得る。しかし、満腹感の誘導にタンパク質の種類が問題であることを示すかなりの証拠がある（例えば、Ｗ．Ｌ． Ｈａｌｌ， ｅｔ ａｌ． ”Ｃａｓｅｉｎ ａｎｄ ｗｈｅｙ ｅｘｅｒｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ， ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｅｔｉｔｅ．” Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ． ２００３ Ｆｅｂ， ８９（２）：２３９−４８； Ｒ． Ａｂｏｕ−Ｓａｍｒａ， ｅｔ ａｌ． ”Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｓａｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ｓａｔｉｅｔｙ ｗｈｅｎ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ａｓ ａ ｓｔａｒｔｅｒ．” Ｎｕｔｒ Ｊ． ２０１１ Ｄｅｃ ２３， １０：１３９； Ｔ． Ａｋｈａｖａｎ， ｅｔ ａｌ． ”Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｅｍｅａｌ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｎ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ａｎｄ ｐｏｓｔｍｅａｌ ｇｌｙｃｅｍｉａ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ａｄｕｌｔｓ．” Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ． ２０１０ Ａｐｒ， ９１（４）：９６６−７５， Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｆｅｂ １７； ＭＡ Ｖｅｌｄｈｏｒｓｔ ”Ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓａｔｉａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｗｈｅｙ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ｃａｓｅｉｎ ｏｒ ｓｏｙ” Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｅｈａｖ． ２００９ Ｍａｒ ２３， ９６（４−５）：６７５−８２参照）。証拠は、ロイシンが豊富なタンパク質が満腹感の誘導に特に効果的であることを示している（例えば、Ｆｒｏｍｅｎｔｉｎ Ｇ ｅｔ ａｌ ”Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｎｕｔｒ Ｒｅｓ Ｒｅｖ ２０１２ ２５： ２９−３９参照）。
満腹感の誘導に食事性タンパク質が役割を果たすので、本明細書に開示されている改変タンパク質及び栄養組成物は、ヒト等の哺乳動物において満腹反応を誘導するために用いることができる。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、全アミノ酸残基に対する分岐鎖アミノ酸残基の割合が、乳清タンパク質、卵タンパク質、及びソイタンパク質の少なくとも１つに存在する全アミノ酸残基に対する分岐鎖アミノ酸残基の割合以上である。
いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１つの改変されたタンパク質又は栄養組成物を対象の食事に組み込むことは、食後満腹感の誘導（空腹感の抑制によるものを含む）、熱産生の誘導、血糖反応の低減、エネルギー消費及び除脂肪体重へのプラスの効果、過食により生じる体重増加の低減、並びにエネルギー摂取量の低減から選択される少なくとも１つの効果を有する。いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１つの改変されたタンパク質又は栄養組成物を対象の食事に組み込むことは、より大幅な体脂肪の減少、より少ない除脂肪組織減少、より良好な脂質プロファイル、並びに耐糖性及びインスリン感受性の向上から選択される少なくとも１つの効果を有する。
いくつかの実施形態では、対象は、１日０．１〜１ｇ、１日１〜５ｇ、１日２〜１０ｇ、１日５〜１５ｇ、１日１０〜２０ｇ、１日１５〜３０ｇ、１日２０〜４０ｇ、１日２５〜５０ｇ、１日４０〜８０ｇ、１日５０〜１００ｇ、又はそれ以上の割合で改変タンパク質を消費する。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、１食、１日、２日、３日、４日、５日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、１〜３ヶ月、２〜６ヶ月、６〜１２ヶ月、又はそれ以上の期間にわたる対象のカロリー摂取量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％を占める。
本明細書に記載されている技術及びプロトコールの例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． （ｅｄ）， １９８０に見出すことができる。
以下に本発明を実施するための具体的な実施形態の例を示す。実施例は説明のみを目的として提供されるものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関して正確性を確実にするよう努力したが、当然ながら、いくらかの実験的な誤差及び偏差が考慮されるべきである。
本発明の実施には、特に断りのない限り、当該技術分野の技術に含まれるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は文献に充分に説明されている。例えばＴ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９３）； Ａ．Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９）； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ｓ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ． Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）； Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）参照。
実施例１：タンパク質ライブラリーの構築
ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにより定義される選択された微生物の注釈付きプロテオーム中に参照分泌タンパク質を特定した。具体的には、種々の細胞原形質膜の外側に存在することが観察されている及び／又はそのように注釈されているタンパク質を特定した。この方法を、属Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの全ての種、並びにＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに適用してタンパク質ライブラリーを構築した。各属（種）の選択されたタンパク質をそれらのＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤを用いて付録Ａに記載する。
タンパク質及びタンパク質の断片の非限定的な例を以下の実施例中に示す。
実施例２：改変のための参照分泌タンパク質の選択
ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ．， ａｎｄ Ｂｒｙａｎｔ， Ｓ． Ｈ． ”ＣＤ−Ｓｅａｒｃｈ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｌｙ”． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． （２００４） ３２： Ｗ３２７−Ｗ３３１）には、タンパク質間結合相互作用を再改変するための過去の研究で用いられたタンパク質ドメイン及び／又はフォールドが含まれている。（Ｂｉｎｚ， ＫＨ， ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． ”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ”． Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． （２００５） １６： ４５９−４６９； Ｇｅｂａｕｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， Ａ． ”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”． Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． （２００９） １３： ２４５−２５５； Ｌｅｈｔｉｏ， Ｊ．， Ｔｅｅｒｉ Ｔ． Ｔ．， ａｎｄ Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ． ”Ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ａ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄ”． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔ．， Ｆｕｎｃ．， Ｇｅｎｅ，． （２０００） ４１： ３１６−３２２； ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ ＣＡ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ ＲＷ． ”Ｄｅｓｉｇｎ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ”． Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． （２００７） １６： ４７６−４８４）。したがって、データベースは、公知の可変性の位置又は領域を有する強固で安定なフォールドを含むことが予想されるタンパク質足場の特定に用いることができ、そのような可変性の位置又は領域は、所望の全体的アミノ酸分布に一致するように合わせることができる。
本実験では、この分析に選択されたフォールド／ドメインは、アンキリンリピート、ロイシンリッチリピート、テトラトリコペプチドリピート、アルマジロリピート、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、リポカリン様ドメイン、ノッチン、セルロース結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、プロテインＺフォールド、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＷＷドメイン、チオレドキシン、ロイシンジッパー、植物ホメオドメイン、ｔｕｄｏｒドメイン、及びヒドロホビンであった。
各タイプのフォールド／ドメインを含む代表的タンパク質を付録Ｂに示す。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、及びＲｈｉｚｏｐｕｓ真菌属に属する種によって分泌されると考えられる又は分泌されることが知られているタンパク質中の候補フォールド／ドメインを特定するために、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔツールキットｖ２．２．２６＋（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ２００４， Ａｌｔｓｃｈｕｌ１９９７）に実装されている逆位置特異的ｂｌａｓｔ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｌａｓｔ：ｒｐｓｂｌａｓｔ）アルゴリズムを用いて可能性のある保存ドメインを特定した。以下のデフォルトパラメーターを用いて、付録Ａに記載されている属のセクレトームタンパク質をスクリーニングした：ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１１、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１、ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝１、及びＢＬＯＳＵＭ６２のｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ。
この方法を用いて、目的のフォールド／ドメインの少なくとも１つを含むタンパク質を特定した。ＲＰＳｂｌａｓｔアルゴリズムを用いて配列のデータベースをサーチした時、ヒットは、フォールド／ドメイン及びフォールド／ドメインと最もマッチする配列範囲の両方により定義された。これらの配列ブックエンドはしばしばフォールドの範囲全体をカバーしないことが確認されているので、タンパク質配列をチェックし、フォールドがどこで始まり且つ／又は終わるかについてのよりクリアな画像を通常提供した結晶構造を参照してドメインを拡張又は短縮した。
セルロース結合ドメイン、炭水化物結合モジュール、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、及びヒドロホビンを含む特定されたタンパク質を４つの表に記載する。
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
実施例３：置換のための参照分泌タンパク質のアミノ酸位置の特定：方法
位置アミノ酸尤度、位置エントロピー、相対的フォールディング自由エネルギーに対する変異の影響、及び二次構造の種類を分析することにより、栄養アミノ酸による置換のための参照分泌タンパク質中の位置を特定した。
位置アミノ酸尤度
所与のクエリータンパク質配列について、クエリーとＮＣＢＩの非重複タンパク質ライブラリーとのローカル配列アラインメントを行うことにより、相同なタンパク質を特定した。ＮＣＢＩツールキットｖ．２．２．２６＋のｂｌａｓｔｐプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．， Ｇｉｓｈ Ｗ．， Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ．， Ｍｙｅｒｓ Ｅ．Ｗ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ． ”Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９０） ２１５： ４０３−４１０）を、ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝１、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１１、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１、及びＢＬＯＳＵＭ６２ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘで用いて、最初のローカルアラインメントを行った。得られたライブラリーのマルチプル配列アラインメントを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ３．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｒｅｌｅａｓｅ ３．１， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， ２０１２）に実装されているＡｌｉｇｎ１２３アルゴリズムを用いて行った。ＤＳＣアルゴリズム（Ｋｉｎｇ Ｒ． Ｄ．， Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ． Ｊ． Ｅ． ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ”． Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． （１９９６） ５： ２２９８−２３１０）をｗｅｉｇｈｔ＝１で用いて残基二次構造を帰属させた。Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを、Ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１０及びｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−０．１、並びにＢＬＯＳＵＭ３０ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘで用いて、ペアワイズアラインメントを行った。より高次のアラインメントでは、ＢＬＯＳＵＭ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｓｅｔ、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−０．５、及びａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｄｅｌａｙ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｃｕｔｏｆｆ（ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）＝４０％を用いた。
ローカルアラインメント期待値が１未満の全タンパク質（７５〜１０００の個別ヒット）を特定し、アラインメントしてマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）を作成した。各ＭＳＡに用いたタンパク質を付録Ｃに示す。
このＭＳＡから、タンパク質配列中の各位置に各アミノ酸（又はアミノ酸のグループのメンバー）が観察される確率を、ＭＡＴＬＡＢ ２０１２ａソフトウェアを用いて計算した。所与の位置について、任意の所与のアミノ酸（又はアミノ酸のグループ）の尤度は、ＭＳＡ中の全配列にわたってそのアミノ酸（又はアミノ酸のグループ）が観察される確率に等しい。このデータから、各所与のアミノ酸置換に耐えられることが期待される位置の順位付けされたリストをそのタンパク質について作成した。次いで、順位付けされた表を分析して、栄養アミノ酸含有量の所与の増加を達成するために必要な置換数を評価した。
本明細書に開示されている実施例では、参照タンパク質配列中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕによる置換を調べた。すなわち、参照タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。当業者に理解されるように、このアプローチは任意のアミノ酸又はアミノ酸のグループ（例えば、必須アミノ酸、分岐鎖アミノ酸、又は特定の分岐鎖アミノ酸Ｉｌｅ若しくはＶａｌ）に広く応用することができる。
順位付けされた表を用いて、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも所与の閾値である位置に現れる１又は複数の非Ｌｅｕ残基がＬｅｕアミノ酸で置換された参照タンパク質の改変バージョンを作製することができる。以下に示す実施例では、全ての可能な閾値を調べ、結果をグラフで示している。例えば、Ｌｅｕ尤度閾値０．６に対応する参照タンパク質の改変バージョンを作製するためには、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６である参照タンパク質中の非Ｌｅｕアミノ酸を特定し、Ｌｅｕで置換して、より多くのＬｅｕアミノ酸を含む改変タンパク質配列を作製する。
如何なる特定の理論にも限定されるものではないが、Ｌｅｕアミノ酸を有さないが、相同なタンパク質中でＬｅｕアミノ酸に対応する、参照タンパク質中の位置は、Ｌｅｕアミノ酸を用いた非Ｌｅｕアミノ酸の置換におそらく耐えられると考えられる。あるいは、参照タンパク質中の各アミノ酸位置の分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）尤度スコアを上記のように計算することができ、その後、Ｌｅｕアミノ酸を有さないが相同なタンパク質中で特定の発生頻度の任意のＢＣＡＡに対応する参照タンパク質中の位置を特定してＬｅｕで置換することができる。別の戦略では、参照タンパク質中の各アミノ酸位置の疎水性アミノ酸尤度スコア（疎水性アミノ酸は、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌからなる）を上記のように計算し、その後、Ｌｅｕアミノ酸を有さないが相同なタンパク質中で特定の発生頻度の任意の疎水性アミノ酸に対応する参照タンパク質中の位置を特定してＬｅｕで置換することができる。
位置エントロピー
更に、マルチプル配列アラインメントを用いて、全アミノ酸のアルファベット、ＡＡ＝［Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ］を用いて、所与の参照アミノ酸配列中の各アミノ酸位置のエントロピーを計算した：
Figure 2016500250
式中、ｐｊは、その位置にアミノ酸ｊを見る確率である。上記の等式を用いて、ＭＡＴＬＡＢ２０１２ａ中で実行される組織内部コードを用いて、各位置のエントロピーを計算した。これは、アミノ酸分布の広がりの尺度である。可変性の高い位置ではエントロピーが大きく（ある位置における最大エントロピーは、各アミノ酸の可能性が等しいことに相当し、これは２．９９６のエントロピーとなる）、高度に保存された位置のエントロピーは０に近い。
次いで、計算されたエントロピーに基づいて、タンパク質中の各アミノ酸残基を順位付けして、種々の置換に耐えると考えられる位置を見出した。所望のアミノ酸濃縮のために、重量を基準として所与のアミノ酸の割合又は栄養含有量（例えば、必須アミノ酸含有量又は分岐鎖アミノ酸含有量）を達成するために必要な変異の数及び最も起こりにくい変異の確率を決定した。
この方法の変法では、同じ分析を行うが、位置エントロピーの計算に全アミノ酸アルファベットを用いる代わりに、以下のように生理化学的特性に基づいてアミノ酸をグループ化した：疎水性［Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ］、芳香族［Ｆ、Ｙ、Ｗ］、極性［Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ］、荷電［Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］、及び非分類［Ｇ、Ｐ、Ｃ］。前述のように、その後、計算されたエントロピーに基づいてタンパク質中の各アミノ酸残基を順位付けして種々の置換に耐える可能性が高い位置を見出した。所望のアミノ酸濃縮について、重量を基準として所与のアミノ酸の割合又は栄養含有量（例えば、必須アミノ酸含有量又は分岐鎖アミノ酸含有量）を達成するために必要な変異の数及び最も起こりにくい変異の確率を決定した。この生理化学的アルファベットを用いると、今度はｐｊは位置ｊに各アミノ酸タイプ（疎水性、芳香族、極性、荷電、又は非分類）を見る確率に対応する。これらのアミノ酸タイプ（ＡＡＴｙｐｅ）の確率は、その種類の各アミノ酸を見る確率の和である。位置エントロピーの等式は、理論的最大値がこの場合はｌｎ（５）≒１．６であるが、同じである。
相対的フォールディング自由エネルギー
如何なる特定の理論にも限定されるものではないが、本明細書に記載の方法に従って改変された所与の分泌タンパク質は、それが変異後に機能的な分泌リーダー配列を有しており且つ安定で類似な構造的フォールドを維持している限り、分泌され続けると考えられる。したがって、その栄養特性を修飾するためのアミノ酸置換を参照分泌タンパク質に行うことの相対的フォールディング自由エネルギーの影響を分析するために、既知の構造的ホモログの構造に基づいてタンパク質の全原子構造モデルを構築した。全構造モデル及び自由エネルギーの計算は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ３．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｒｅｌｅａｓｅ ３．１， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， ２０１２）を用いて行った。可能な場合、タンパク質データバンク（Ｈ．Ｍ． Ｂｅｒｍａｎ， Ｋ． Ｈｅｎｒｉｃｋ， Ｈ． Ｎａｋａｍｕｒａ． ”Ａｎｎｏｕｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ”． Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． （２００３） １０： ９８）からタンパク質構造モデルを得た。タンパク質データベースでタンパク質モデルが利用可能でなかった場合、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ３．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｒｅｌｅａｓｅ ３．１， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， ２０１２）に実装されている相同性モデリングソフトウェアＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ｅｓｗａｒ， Ｎ．； Ｅｒａｍｉａｎ， Ｄ．； Ｗｅｂｂ， Ｂ．； Ｓｈｅｎ， Ｍ． Ｙ．； Ｓａｌｉ， Ａ． ”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ＭＯＤＥＬＬＥＲ”． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２００８） ４２６： １４５−１５９）を用いて最も近い利用可能な構造的ホモログを用いてモデルを構築した。全てのエネルギーは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ３．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ２０１２）に実装されているＣＨＡＲＭＭソフトウェアパッケージ（Ｂｒｏｏｋｓ， Ｂ． Ｒ．； Ｂｒｏｏｋｓ， Ｃ． Ｌ． ３ｒｄ； Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ， Ａ． Ｄ． Ｊｒ．； Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｌ．； Ｐｅｔｒｅｌｌａ， Ｒ． Ｊ．； Ｒｏｕｘ， Ｂ．； Ｗｏｎ， Ｙ．； Ａｒｃｈｏｎｔｉｓ， Ｇ．； Ｂａｒｔｅｌｓ， Ｃ．； Ｂｏｒｅｓｃｈ， Ｓ．； Ｃａｆｌｉｓｃｈ， Ａ．； Ｃａｖｅｓ， Ｌ．； Ｃｕｉ， Ｑ．； Ｄｉｎｎｅｒ， Ａ． Ｒ．； Ｆｅｉｇ， Ｍ．； Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｓ．； Ｇａｏ， Ｊ．； Ｈｏｄｏｓｃｅｋ， Ｍ．； Ｉｍ， Ｗ．； Ｋｕｃｚｅｒａ， Ｋ．； Ｌａｚａｒｉｄｉｓ， Ｔ．； Ｍａ， Ｊ．； Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ， Ｖ．； Ｐａｃｉ， Ｅ．； Ｐａｓｔｏｒ， Ｒ． Ｗ．； Ｐｏｓｔ， Ｃ． Ｂ．； Ｐｕ， Ｊ． Ｚ．； Ｓｃｈａｅｆｅｒ， Ｍ．； Ｔｉｄｏｒ， Ｂ．； Ｖｅｎａｂｌｅ， Ｒ． Ｍ．； Ｗｏｏｄｃｏｃｋ， Ｈ． Ｌ．； Ｗｕ， Ｘ．； Ｙａｎｇ， Ｗ．； Ｙｏｒｋ， Ｄ． Ｍ．； Ｋａｒｐｌｕｓ， Ｍ． ”ＣＨＡＲＭＭ： ｔｈｅ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ”． Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． （２００９） ３０： １５４５−１６１４）及びＣＨＡＲＭｍ極性水素力場を用いて、ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｒｎ静電モデル（Ｓｐａｓｓｏｖ Ｖ． Ｚ．， Ｙａｎ Ｌ．， ａｎｄ Ｓｚａｌｍａ Ｓ． ”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎ Ｉｍｐｌｉｃｉｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎ Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ／Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｅｌｓ”． Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ． （２００２） １０６： ８７２６−８７３８）及び経験的配置エントロピーモデル（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ ｅｎｔｒｏｐｙ ｍｏｄｅｌ）（Ａｂａｇｙａｎ Ｒ． ａｎｄ Ｔｏｔｒｏｖ Ｍ． ”Ｂｉａｓｅｄ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｓｅａｒｃｈｅｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９４） ２３５： ９８３−１００２）を用いて計算された。
各位置について、野生型フォールディング自由エネルギーに対する、全ての可能な単一アミノ酸変異のフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。次いで、フォールディングの安定性に与える予想される影響に基づいて各アミノ酸置換を順位付けした。本発明者らは更に各ΔΔＧｆｏｌｄを、ファンデルワールス、静電気的、及び熱力学的エントロピー的自由エネルギーの変化からの寄与に分解した。全ての可能な変異の組合せでΔΔＧｆｏｌｄを有さない場合、各変異が各自由エネルギー成分にどのように影響するかを知ることにより、インシリコ予測を用いてあり得る誤差を低減する方法が得られる。単一タンパク質の作製に複数の変異を選択する場合、考慮すべき事項の１つはΔΔＧｆｏｌｄを最小化することであるが、しかし、場合によっては、ΔΔＧｆｏｌｄの変化が同等である複数の変異が利用可能である。インシリコモデルにおいてあり得る欠点を考えると、所与のタンパク質について、計算されるエネルギー変化の１成分は別の成分より予測性が高くなり得る。したがって、様々な方法で自由エネルギー変化に影響する組合せを選択することにより、成功する変異体の組合せを見出す可能性が上がる。
二次構造の種類
ループ残基は、特定の主鎖水素結合パターンの一部でなく（すなわち、二次構造がない）、しばしばかなりの構造的可変性を示す（Ｓｈｅｈｕ， Ａ．； Ｋａｖｒａｋｉ， Ｌ．Ｅ． Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｏｏｐｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｅｎｔｒｏｐｙ ２０１２， １４， ２５２−２９０）ので、所与のタンパク質の構造モデルを考慮して、ＤＳＣアルゴリズム（Ｋｉｎｇ Ｒ． Ｄ．， Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ． Ｊ． Ｅ． ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ”． Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． （１９９６） ５： ２２９８−２３１０）を用いてこれらの残基を特定した。更に、これらの部位はしばしば、タンパク質間又はタンパク質−リガンド間の相互作用における機能的可変性の原因となり（Ｌｅｈｔｉｏ， Ｊ．， Ｔｅｅｒｉ Ｔ． Ｔ．， ａｎｄ Ｎｙｇｒｅｎ Ｐ．Ａ． ”Ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｆｒｏｍ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ａ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄ”． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔ．， Ｆｕｎｃ．， Ｇｅｎｅ，． （２０００） ４１： ３１６−３２２； Ｂｌｏｏｍ Ｌ． ａｎｄ Ｃａｌａｂｒｏ Ｖ． ”ＦＮ３： ａ ｎｅｗ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｒｅａｃｈｅｓ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ”． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｔｏｄａｙ （１４）： ９４９：９５５； Ｈａｃｋｅｌ Ｂ． Ｊ．， Ｋａｐｉｌａ Ａ．， ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ Ｋ．Ｄ． ”Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｌｏｏｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ａｎｄ Ｌｏｏｐ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２００８） ３８１： １２３８−１２５２； 及びＯｌｓｏｎ ＣＡ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ ＲＷ． ”Ｄｅｓｉｇｎ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ”． Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． （２００７） １６： ４７６−４８４）、これらの残基の部位特異的突然変異誘発は安定性に顕著な影響を与えずに結合特異性を変えることができる。したがって、これらの位置の一次及び三次構造の可塑性のため、これらの位置は栄養含有量を向上させるための配列変化への優先順位が高くなる。
実施例４：Ａ． ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼタンパク質（配列番号１）における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ａ． ｎｉｇｅｒ（配列番号１）のグルコアミラーゼは、７．４重量％のＬｅｕ、１７．４重量％の分岐鎖アミノ酸、及び４２．２重量％の必須アミノ酸を含む。
図１Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置にある全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質の（重量による）アミノ酸含有量を分析している。具体的には、配列番号１中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６である配列番号１中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置を改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸が占めた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図１Ｂの上及び下のパネルは、０〜０．３のＬｅｕ尤度スコアのデータ（すなわち、図１Ａに示すグラフの左側部分）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を計算する代わりにＢＣＡＡ尤度（図１Ｃ）及び疎水性アミノ酸尤度（図１Ｄ）を計算し、特定された位置の全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕで置換される。
次いで、Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けにアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図２Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図２Ｂに示す。
配列番号１における野生型のフォールディングの自由エネルギーに対する、配列番号１中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてのフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。次いで、フォールディング安定性への予想される影響に基づいて各アミノ酸置換を順位付けした。結果を図３Ａ、上のパネルに示す。本発明者らは更に、各ΔΔＧｆｏｌｄを、ファンデルワールス、静電的、及び熱力学的エントロピー的自由エネルギーの変化に由来する寄与に分解した（図３Ａ、下側の３つのパネル）。全ての変異が好ましいフォールディング自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ＜０）をもたらすと予想されるとすると、２１％がＶＤＷエネルギー変化、７６％が静電エネルギー変化、３％がエントロピー的自由エネルギー変化により推進（ｄｒｉｖｅ）される。したがって、変異の大部分は好ましいｖｄｗ変化を介して安定性を向上させると予想されるが、静電変化により多くが推進され、バランスのとれたヘッジングされたアプローチは、ｖｄｗ及び静電エネルギーを向上させる変異体の選択を伴う。
配列番号１中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄエントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表１に示す。
実施例５：Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−β−１，４−グルカナーゼタンパク質（配列番号２）中における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−β−１，４−グルカナーゼ（配列番号２）は、６．２重量％のＬｅｕ、１６．５重量％の分岐鎖アミノ酸、及び４５．６重量％の必須アミノ酸を含む。
図４Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号２中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号２中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換を行った後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図４Ｂの上及び下のパネルは、図４Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＬｅｕ尤度スコア）のクローズアップ図である。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を評価する代わりにＭＳＡデータ中のＢＣＡＡ尤度及び疎水性アミノ酸尤度を用いてアミノ酸位置を特定し、その後、特定された位置の全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。結果を図４Ｃ（ＢＣＡＡ確率）及び図４Ｄ（位置エントロピー）に示す。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕアミノ酸で置換される。
Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けに生のアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて、同じ分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図５Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図５Ｂに示す。
更に、配列番号２における野生型のフォールディングの自由エネルギーに対して、配列番号２中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。次いで、各アミノ酸置換について、フォールディング安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図６に示す。
配列番号２中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表２に示す。
実施例５：Ａ． ｎｉｇｅｒの１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼタンパク質（配列番号３）中における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ａ． ｎｉｇｅｒの１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（配列番号３）は、５．５重量％のＬｅｕ、１３．１重量％の分岐鎖アミノ酸、及び３７．７重量％の必須アミノ酸を含む。
図７Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号３中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号３中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換を行った後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図７Ｂの上及び下のパネルは、図７Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＬｅｕ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を評価する代わりにＭＳＡデータ中のＢＣＡＡ尤度及び疎水性アミノ酸尤度を測定してアミノ酸位置を特定し、その後、特定された位置の全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。結果を図７Ｃ（ＢＣＡＡ尤度）及び図７Ｄ（疎水性アミノ酸尤度））に示す。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕアミノ酸で置換される。
Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けに生のアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて、同じ分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図８Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図８Ｂに示す。
更に、配列番号３における野生型のフォールディングの自由エネルギーと比べた、配列番号３中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、フォールディングの安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図９に示す。
配列番号３中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表３に示す。
実施例６：Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−１，４−β−キシラナーゼタンパク質（配列番号４）中における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ａ． ｎｉｇｅｒのエンド−１，４−β−キシラナーゼ（配列番号４）は、２．２重量％のＬｅｕ、１２．６重量％の分岐鎖アミノ酸、及び３７．４重量％の必須アミノ酸を含む。
図１０Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号４中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号４中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換を行った後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図１０Ｂの上及び下のパネルは、図１０Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＬｅｕ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を評価する代わりにＭＳＡデータ中のＢＣＡＡ尤度及び疎水性アミノ酸尤度を測定してアミノ酸位置を特定し、その後、特定された位置のまさにその非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。結果を図１０Ｃ（ＢＣＡＡ尤度）及び図１０Ｄ（疎水性アミノ酸尤度）に示す。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕで置換される。
Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けに生のアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて、同じ分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図１１Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図１１Ｂに示す。
更に、配列番号４における野生型のフォールディングの自由エネルギーに対して、配列番号４中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、フォールディング安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図１２に示す。
配列番号４中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへのファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの静電自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表４に示す。
実施例７：Ａ． ｎｉｇｅｒのセルロース結合ドメイン１タンパク質（配列番号５）中における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ａ． ｎｉｇｅｒ（配列番号５）のセルロース結合ドメイン１は、３．０重量％のＬｅｕ、５．６重量％の分岐鎖アミノ酸、及び２３．８重量％の必須アミノ酸を含む。
図１３Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号５中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６である配列番号５中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換を行った後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図１３Ｂの上及び下のパネルは、図１３Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＬｅｕ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を評価する代わりにＭＳＡデータ中のＢＣＡＡ尤度及び疎水性アミノ酸尤度を測定してアミノ酸位置を特定し、特定された位置の全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。結果を図１３Ｃ（ＢＣＡＡ尤度）及び図１３Ｄ（疎水性アミノ酸尤度）に示す。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕで置換される。
Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けに生のアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて、同じ分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図１４Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図１４Ｂに示す。
更に、配列番号５における野生型のフォールディングの自由エネルギーと比べた、配列番号５中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、フォールディングの安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図１５に示す。
配列番号５中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表５に示す。
実施例８：Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０タンパク質（配列番号６）中における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ａ． ｎｉｇｅｒの炭水化物結合モジュール２０タンパク質（配列番号６）は、５．７重量％のＬｅｕ、１７．２重量％の分岐鎖アミノ酸、及び４４．６重量％の必須アミノ酸を含む。
図１６Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号６中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号６中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図１６Ｂの上及び下のパネルは、図１６Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＬｅｕ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を評価する代わりにＭＳＡデータ中のＢＣＡＡ尤度及び疎水性アミノ酸尤度を測定してアミノ酸位置を特定し、特定された位置の全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。結果を図１６Ｃ（ＢＣＡＡ尤度）及び図１６Ｄ（疎水性アミノ酸尤度）に示す。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕで置換される。
非Ｌｅｕ残基をＬｅｕ残基で置換すると、参照分泌タンパク質のＬｅｕ含有量並びにＢＣＡＡ及びＥＡＡ含有量が増える。ＢＣＡＡ及びＥＡＡ含有量を同時に増やす別の方法は、参照分泌タンパク質のＶａｌ又はＩｌｅ含有量を増やすことである。Ｖａｌ又はＩｌｅ含有量が増えた改変タンパク質を作製するために、Ｖａｌ尤度又はＩｌｅ尤度に基づいて炭水化物結合モジュール２０タンパク質中のアミノ酸位置を特定した。図１７Ａは、０〜１の種々のＩｌｅ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置にある全非Ｉｌｅアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号６中のＩｌｅ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｉｌｅ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号６中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｉｌｅアミノ酸をＩｌｅアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＩｌｅ置換を行った後のタンパク質中のＩｌｅ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＩｌｅ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＩｌｅアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＩｌｅ置換の総数を示している。図１７Ｂの上及び下のパネルは、図１７Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＩｌｅ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
図１７Ｃ及び１７Ｄは、Ｖａｌ置換の対応する分析を示している。図１７Ｃは、０〜１の種々のＶａｌ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置にある全非Ｖａｌアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号６中のＶａｌ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｖａｌ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号Ｘ中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｖａｌアミノ酸をＶａｌアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＶａｌ置換を行った後のタンパク質中のＶａｌ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＶａｌ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＶａｌアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＶａｌ置換の総数を示している。図１７Ｄの上及び下のパネルは、図１７Ｃに示されているグラフの左端（０〜０．３のＩｌｅ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
一部の使用では、改変分泌タンパク質中で非ＢＣＡＡ及び場合によっては非ＥＡＡの割合を増やすことが望ましいことがある。アルギニンは条件付きの非必須アミノ酸であり、すなわち、ほとんどの場合、これはヒトの体が生産でき、食事から直接得る必要はない。アミノ酸アルギニンは多くの健康上の利点を有することが知られている。Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ”Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｅａｌｔｈ， ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ”． Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ （２００９） ３７：１５３−１６８． ＡＮＤ Ｗｕ， Ｇ． ”Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ， Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ” Ａｄｖ． Ｎｕｔｒ． （２０１０） １： ３１−３７参照。炭水化物結合モジュール２０タンパク質のＡｒｇ含有量を増やすために同様なアプローチを適用した。図１８Ａは、０〜１の種々のＡｒｇ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ａｒｇアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号６中のＡｒｇ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ａｒｇ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号６中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ａｒｇアミノ酸をＡｒｇアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＡｒｇ置換を行った後のタンパク質中のＡｒｇ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＡｒｇ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＡｒｇアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＡｒｇ置換の総数を示している。図１８Ｂの上及び下のパネルは、図１８Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＡｒｇ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＡｒｇ尤度を評価する代わりに、ＭＳＡデータ中の正電荷アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）尤度及び荷電アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、Ｅ）尤度を測定してアミノ酸位置を特定し、その後、特定された位置の全非Ａｒｇアミノ酸をＡｒｇアミノ酸で置換した。結果を図１８Ｃ（正電荷アミノ酸尤度）及び図１８Ｄ（荷電アミノ酸尤度）に示す。予想された通り、これらの２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ａｒｇアミノ酸がＡｒｇアミノ酸で置換される。
Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けに生のアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて、Ｌｅｕ置換分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図１９Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図１９Ｂに示す。
更に、配列番号６における野生型のフォールディングの自由エネルギーに対して、配列番号６中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、フォールディングの安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図２０に示す。
以下のリストは、フォールディングの相対的自由エネルギーに好ましい影響を与えると予想されるロイシン、バリン、イソロイシン、又はアルギニンへの変異のファンデルワールス（ｖｄｗ）、静電的（ｅｌｅｃ）、及びエントロピー的自由エネルギー変化により推進されるパーセンテージを示している：
Ｌｅｕ：７５．０％ｖｄｗ、１１．３％ｅｌｅｃ、１３．７％エントロピー的自由エネルギー；
Ｖａｌ：４５．１％ｖｄｗ、２１．０％ｅｌｅｃ、３３．９％エントロピー自由エネルギー；
Ｉｌｅ：７２．０％ｖｄｗ、１２．０％ｅｌｅｃ、１６．０％エントロピー自由エネルギー；及び
Ａｒｇ：８６．３％ｖｄｗ、１０．０％ｅｌｅｃ、３．７％エントロピー自由エネルギー。
任意の所与のアミノ酸変異で及び種々のアミノ酸への変異間で、主な自由エネルギー成分にかなりの変動性があることは興味深い。ほとんどの変異は、ｖｄｗフォールディングエネルギーが改善されるため好ましいが、特にバリンの場合、少なからぬ数の変異が、静電的及びエントロピー的自由エネルギーの好ましい変化のため、好ましいと予想される。このことは、フォールディングの相対的自由エネルギー成分に異なる影響を与えることにより、より高いバリン濃度への最適化を試みる場合により多くの戦略が利用可能であることを示唆している。この場合、全体的なフォールディングの相対的自由エネルギーへのエントロピー的自由エネルギーの寄与の重要性は、各アミノ酸側鎖中に存在する回転可能な結合の数（Ｌｅｕ＝２、Ｖａｌ＝１、Ｉｌｅ＝２、Ａｒｇ＝４）を考慮して予想されるものと一致する。高度に可動性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）のアミノ酸をより可動性の低いアミノ酸で置換すると、フォールディングのエントロピー的自由エネルギーの好ましい相対的変化が得られる。
更に、配列番号６における野生型のフォールディングの自由エネルギーに対して、配列番号６中の非Ｉｌｅアミノ酸のＩｌｅへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、その後、フォールディング安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図２１に示す。
更に、配列番号６における野生型のフォールディングの自由エネルギーに対して、配列番号６中の非Ｖａｌアミノ酸のＶａｌへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、その後、フォールディング安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図２２に示す。
更に、配列番号６における野生型のフォールディングの自由エネルギーに対して、配列番号６中の非Ａｒｇアミノ酸のＡｒｇへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、その後、フォールディング安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図２３に示す。
配列番号６中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表６Ａに示す。
配列番号６中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｉｌｅ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｉｌｅによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｉｌｅによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｉｌｅによる置換への）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｉｌｅによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表６Ｂに示す。
配列番号６中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｖａｌ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｖａｌによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｖａｌによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｖａｌによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｖａｌによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表６Ｃに示す。
配列番号６中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ａｒｇ尤度、正電荷ＡＡ尤度、荷電ＡＡ尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ａｒｇによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ａｒｇによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ａｒｇによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ａｒｇによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表６Ｄに示す。
実施例９：Ａ． ｎｉｇｅｒのグルコシダーゼフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインタンパク質（配列番号７）中における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ａ． ｎｉｇｅｒのグルコシダーゼフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号７）は、９．９重量％のＬｅｕ、２１．５重量％の分岐鎖アミノ酸、及び４４．５重量％の必須アミノ酸を含む。
図２４Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号７中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号７中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換を行った後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、改変タンパク質中でＸ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置がＬｅｕアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図２４Ｂの上及び下のパネルは、図２４Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＬｅｕ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を評価する代わりにＭＳＡデータ中のＢＣＡＡ尤度及び疎水性アミノ酸尤度を測定してアミノ酸位置を特定し、その後、特定された位置の全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。結果を図２４Ｃ（ＢＣＡＡ尤度）及び図２４Ｄ（疎水性アミノ酸尤度）に示す。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕで置換される。
Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けに生のアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて、同じ分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図２５Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図２５Ｂに示す。
更に、配列番号７における野生型のフォールディングの自由エネルギーと比べた、配列番号７中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、フォールディングの安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図２６に示す。
配列番号７中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表７に示す。
実施例１０：Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩタンパク質（配列番号８）中における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩタンパク質（配列番号８）は、１０．５重量％のＬｅｕ、２２．５重量％の分岐鎖アミノ酸、及び３５．２重量％の必須アミノ酸を含む。
図２７Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号８中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号８中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換を行った後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図２７Ｂの上及び下のパネルは、図２７Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＬｅｕ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を評価する代わりにＭＳＡデータ中のＢＣＡＡ尤度及び疎水性アミノ酸尤度を測定してアミノ酸位置を特定し、その後、特定された位置の全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。結果を図２７Ｃ（ＢＣＡＡ尤度）及び図２７Ｄ（疎水性アミノ酸尤度）に示す。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕで置換される。
Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けに生のアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて、同じ分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図２８Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図２８Ｂに示す。
更に、配列番号８における野生型のフォールディングの自由エネルギーと比べた、配列番号Ｘ中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。次いで、各アミノ酸置換について、フォールディング安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図２９に示す。
配列番号８中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表８に示す。
実施例１１：Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩＩタンパク質（配列番号９）中における置換のためのアミノ酸位置の特定
Ｔ． ＲｅｅｓｅｉのヒドロホビンＩＩタンパク質（配列番号９）は、１１．０重量％のＬｅｕ、２５．６重量％の分岐鎖アミノ酸、及び４９．２重量％の必須アミノ酸を含む。
図３０Ａは、０〜１の種々のＬｅｕ尤度閾値を用いて特定されるアミノ酸位置の全非Ｌｅｕアミノ酸を置換することにより作製される改変タンパク質のアミノ酸含有量（重量を基準）を分析している。具体的には、配列番号９中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量の割合が示されている。上のパネルでは、アミノ酸置換を行う尤度閾値がＸ軸に示されている。したがって、例えば、Ｘ軸上の値０．６は、Ｌｅｕ尤度スコアが少なくとも０．６の配列番号９中の全アミノ酸位置を特定し、それらの位置のいずれかに現れる全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換することにより作製される改変タンパク質配列を表す。上のパネルでは、必要なＬｅｕ置換を行った後のタンパク質中のＬｅｕ、ＢＣＡＡ、及びＥＡＡの重量による割合がＹ軸に示されている。下のパネルでは、Ｙ軸は、Ｘ軸上の所与のＬｅｕ尤度スコアを有する全アミノ酸位置が改変タンパク質中でＬｅｕアミノ酸で占められた場合にタンパク質になされるＬｅｕ置換の総数を示している。図３０Ｂの上及び下のパネルは、図３０Ａに示されているグラフの左端（０〜０．３のＬｅｕ尤度スコア）のクローズアップ図を示している。
この分析を繰り返した。但し、変異のためのアミノ酸位置を特定するためにＬｅｕ尤度を評価する代わりにＭＳＡデータ中のＢＣＡＡ尤度及び疎水性アミノ酸尤度を測定してアミノ酸位置を特定し、その後、特定された位置の全非Ｌｅｕアミノ酸をＬｅｕアミノ酸で置換した。結果を図３０Ｃ（ＢＣＡＡ尤度）及び図３０Ｄ（位置エントロピー）に示す。予想された通り、これら２つのより厳密性の低いスクリーニングでは、各尤度カットオフでより多くの非Ｌｅｕアミノ酸がＬｅｕで置換される。
Ｌｅｕによる置換のためのアミノ酸位置の順位付けに生のアミノ酸尤度の代わりに位置エントロピーを用いて、同じ分析を繰り返した。各位置の各アミノ酸の頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図３１Ａに示し、各位置のアミノ酸タイプの頻度を用いて位置エントロピーを計算した場合に得られた結果を図３１Ｂに示す。
更に、配列番号９における野生型のフォールディングの自由エネルギーと比べた、配列番号９中の非Ｌｅｕアミノ酸のＬｅｕへの全ての可能な単一アミノ酸変異についてフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）を計算した。各アミノ酸置換について、フォールディングの安定性への予想される影響に基づいて位置を順位付けした。結果を図３２に示す。
配列番号９中の各アミノ酸について、ループＩＤ（１＝ループ；０＝非ループ）、Ｌｅｕ尤度、ＢＣＡＡ尤度、ＥＡＡ尤度、疎水性アミノ酸尤度、アミノ酸位置エントロピー、アミノ酸タイプ位置エントロピー、フォールディングの全自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、ファンデルワールス自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ ＶＤＷ）（Ｌｅｕによる置換の）、フォールディングの全自由エネルギーへの、静電的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ Ｅｌｅｃ）（Ｌｅｕによる置換の）、及びフォールディングの全自由エネルギーへの、熱力学的エントロピー的自由エネルギー変化の寄与（ΔΔＧｆｏｌｄ エントロピー）（Ｌｅｕによる置換の）を計算した。結果を付録Ｄの表９に示す。
実施例１２：アミノ酸選択アルゴリズム
位置アミノ酸尤度、位置エントロピー、相対的フォールディング自由エネルギーへの変異の影響、及び二次構造の種類の分析を組み合わせて、Ｌｅｕ等のより栄養的なアミノ酸タイプへと変異させるための参照分泌タンパク質中のアミノ酸をスクリーニング及び特定することができる。事実上、選択及び順位付けの方法は多目的最適化問題である。これらの因子、すなわち高いアミノ酸尤度（ＡＡＬｉｋｅ）、高いアミノ酸タイプ尤度（ＡＡＴＬｉｋｅ）、高い位置エントロピー（Ｓｐｏｓ）、高いアミノ酸タイプ位置エントロピー（ＳＡＡＴｐｏｓ）、低いフォールディングの相対的自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）、及び二次構造アイデンティティー（ＬｏｏｐＩＤ）を用いて改変タンパク質を設計することにより複数の異なる目的を達成することができる。目的の全部又はサブセットを同時に最大化する位置を選択することもできる。その目的のために、個々の目的スコアに基づいて各変異をスコア化する総和目的関数を構築した。所与のタンパク質の可能な変異部位を順位付けする場合、２つの目的関数を直接比較するため及び／又は調整された重み付けを用いてそれらを加え合わせるために、最小値を０にシフトして最大値で全ての値を標準化することにより、範囲［０〜１］上に値の分布をマッピングした。ΔΔＧｆｏｌｄの場合には、最小値を１にマッピングし（負の値が好ましいため）、検討対象をΔΔＧｆｏｌｄ＜１の位置に限定するためのカットオフとして、最大値が１となるように定義したことに留意されたい。全ての単一目的関数に加えて、１１個の代表的な総和目的関数は以下の通りである。
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
最初の６個の関数は、フォールディング安定性への好ましい影響及び高いアミノ酸尤度［（１）、（２）、及び（３）］、高い位置エントロピー［（４）及び（５）］、又は構造的に可塑性のループ位置（６）のいずれかを有する位置を選択する。７〜１１番目の目的関数は、好ましい相対的フォールディングエネルギー及び高いアミノ酸尤度［（７）、（８）、及び（９）］又は位置エントロピー［（１０）及び（１１）］のいずれかを有するループ位置を選択する。特定のアミノ酸を分泌タンパク質中に濃縮するために、所望の目的関数１〜１１に従い高く順位付けられた上位の位置セットを選択し、それらのアミノ酸を変異させて改変タンパク質を作製する。
以下は、標的アミノ酸としてロイシンを、アミノ酸タイプとして分岐鎖アミノ酸を用いて目的関数３に従い全３６個の位置を順位付けしたセルロース結合ドメイン１（ＣＢＤ１）（配列番号５）変異の配列例である。
Figure 2016500250
前述のように共通範囲［０，１］上に全ての値を再度マッピングし、総和目的関数に従い並べて、表１０に示される順位付けされたリスト（ΔΔＧｆｏｌｄ＞１ｋｃａｌ／ｍｏｌの全位置又は分子内ジスルフィド結合に関わるシステイン残基を除く）が得られる。
Figure 2016500250
最上位のヒット（位置３６）は既にロイシンであるので、この部位には変異を行う必要がないことに留意されたい。したがって、ロイシン濃度を約１１％（天然配列は約３％ロイシン）に上昇させるためには、３個の変異が必要であり、この分析は位置Ｅ２８、Ａ４、及びＧ６を示唆している。得られる改変タンパク質は配列番号１０の配列を有する。
ロイシン濃度を約２２％に上昇させるためには、７個の変異が必要であり、この分析は位置Ｅ２８、Ａ４、Ｇ６、Ｖ２０、Ａ３０、Ｙ２７、及びＴ２６を示唆している。得られる改変タンパク質は配列番号１１の配列を有する。
ロイシン濃度を約３１％に上昇させるためには、１０個の変異が必要であり、この分析は位置Ｅ２８、Ａ４、Ｇ６、Ｖ２０、Ａ３０、Ｙ２７、Ｔ２６、Ｎ２９、Ｔ２４、及びＴ１８を示唆している。得られる改変タンパク質は配列番号１２を有する。
最後に、ロイシン濃度を約４２％に上昇させるためには１４個の変異が必要であり、この分析は位置Ｅ２８、Ａ４、Ｇ６、Ｖ２０、Ａ３０、Ｙ２７、Ｔ２６、Ｎ２９、Ｔ２４、Ｔ１８、Ｑ７、Ａ１、Ｙ３１、及びＹ３２を示唆している。得られる改変タンパク質は配列番号１３の配列を有する。
表１１、１２、及び１３に、標的アミノ酸としてロイシン、アミノ酸タイプとして分岐鎖アミノ酸、及び上記の目的関数１〜１１を用いた時に得られる同等な順位付けされたリストを示す。ロイシン濃度を約１１％に上昇させるためには、ＣＢＤ１（配列番号５）中で既にロイシンでない表１１、１２、及び１３の位置リストの上位３個の位置が選択され得る。したがって、好ましいフォールディングの相対的自由エネルギー及び高いアミノ酸尤度を有する位置を選択するには、目的関数１、２、又は３の順位を用いることが適切であると考えられる。好ましいフォールディングの相対的自由エネルギー及び高い位置エントロピー又はループ位置を有する位置を選択するには、目的関数４、５、又は６の順位を用いることが適切であると考えられる。好ましい相対的フォールディングエネルギーと高いアミノ酸尤度又は位置エントロピーのいずれかとを有する位置を選択するためには、それぞれ目的関数７、８、若しくは９の順位又は目的関数１０若しくは１１の順位を用いることが適切であると考えられる。
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
実施例１３．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来する改変分泌タンパク質の選択及び設計
アミノ酸含有量が濃縮された分泌ポリペプチドの改変を実証するために、本発明者らは、高レベルでタンパク質を分泌することが知られている微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを選択した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中での主な分泌タンパク質としてＳＥＱＩＤ−４５００１が特定された。ＳＥＱＩＤ−４５００１の配列保存及び結晶構造データを用いて、タンパク質の構造安定性及び／又は宿主生物がタンパク質を分泌する能力に負の影響を与えない、変異に耐えられると予想された各タンパク質内の連続領域を特定した。
本発明者らは、構造的タンパク質データバンクのエントリー１ＵＡ７に報告されているＳＥＱＩＤ−４５００１の二次構造を分析した。本発明者らは、αヘリックス又はβシートの一部でない、タンパク質配列内の１９個のループ領域を特定した。これらのループ領域は以下のアミノ酸残基により定義される：７３〜７６、１３０〜１３３、１４７〜１５２、１５７〜１６１、１８９〜１９２、２２２〜２２７、２３９〜２４４、２８３〜２８６、２９１〜２９８、３０５〜３０８、３１８〜３２３、３３６〜３４０、３５６〜３６０、３６５〜３６８、３８７〜３９２、４１７〜４２１、４２８〜４３２、４３７〜４４２、及び４６４〜４６６。長さが４アミノ酸未満のループ領域は変異の対象として考慮しなかった。
構造安定性及び分泌能を維持つ改変を受け入れられる位置の特定に、進化空間（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｓｐａｃｅ）での配列の保存も考慮した。相同配列のファミリー内でさほど保存されていない位置は本質的に可変性であり、本質的に構造に関係する活性への影響なしに変異をより受け入れ易い。さほど保存されていない位置を見つけるために、本発明者らは、ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅから、ＳＥＱＩＤ−４５００１触媒ドメインを含む３１個のタンパク質配列を含むｐｆａｍ００１２８のアラインメントをダウンロードした（Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ Ａ．， Ｚｈｅｎｇ Ｃ．， Ｃｈｉｔｓａｚ Ｆ．， Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ Ｍ． Ｋ．， Ｇｅｅｒ Ｌ． Ｙ．， Ｇｅｅｒ Ｒ． Ｃ．， Ｇｏｎｚａｌｅｓ Ｎ． Ｒ．， Ｇｗａｄｚ Ｍ．， Ｈｕｒｗｉｔｚ Ｄ． Ｉ．， Ｌａｎｃｚｙｃｋｉ Ｃ． Ｊ．， Ｌｕ Ｆ．， Ｌｕ Ｓ．， Ｍａｒｃｈｌｅｒ Ｇ． Ｈ．， Ｓｏｎｇ Ｊ． Ｓ．， Ｔｈａｎｋｉ Ｎ．， Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｒ． Ａ．， Ｚｈａｎｇ Ｄ．， ａｎｄ Ｓ． Ｈ． Ｂｒｙａｎｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２０１３） ４１：Ｄ３４８−５２）。本発明者らは更に、ＳＥＱＩＤ−４５００１を用いてＮＣＢＩタンパク質参照配列データベースのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチを行い（Ｐｒｕｉｔｔ Ｋ． Ｄ．， Ｔａｔｕｓｏｖａ Ｔ．， ａｎｄ Ｄ． Ｒ． Ｍａｇｌｏｔｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２００５） ３３：Ｄ５０１−５０４）、ＳＥＱＩＤ−４５００１に相同な５００個の配列を得た。どちらの場合も、ＢＬＯＳＵＭ６２ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１１、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１、及びａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝０．００５を用いて１回実行した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９７） ２５：３３８９−３４０２）。全てのタンパク質配列アラインメントを用いて、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチの一部として、各クエリー配列に特異的な位置特異的重み行列（ＰＳＳＭ）を作成した。ＰＳＳＭから、本発明者らは、各ループ内の各位置で正のＰＳＳＭスコアに関連する異なるアミノ酸の数のカウント並びに各位置の必須アミノ酸置換のためのＰＳＳＭスコアの和及び平均により、変異に耐えられると仮定される領域を特定した。更に、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチから得られた各マルチプル配列アラインメントから、本発明者らは、以下の式で定義される各位置のアミノ酸エントロピーを計算した。
Figure 2016500250
 式中、Ｓｊは位置ｊのエントロピーであり、ｐｉは位置ｊにアミノ酸ｉを観察する確率である。
変異耐性のこれらの測定値を用いて、本発明者らは、必須アミノ酸への変異に耐えられると予想される４個のループ領域を特定した。特定された領域に必須アミノ酸を濃縮するために、本発明者らは、任意の選択された位置がＦ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、若しくはＭ（Ｚと表記）又はＲ、Ｋ、Ｔ、Ｉ、若しくはＭ（Ｘと表記）のいずれかとなり得るコンビナトリアルコドンライブラリーを用いた。必須アミノ酸への変異に選択されたループ領域のそれぞれにおいて、各可変位置に、（各ＰＳＳＭ値に基づいて）疎水性残基への相対的耐性に応じてＺ又はＸを割り当てた。疎水性残基に耐性であった位置にＺを割り当て、これにコドンＮＴＮを用いて遺伝子コードした。親水性残基により耐性の位置にＸを割り当て、これにコドンＡＮＲを用いて遺伝子コードした。ＳＥＱＩＤ−４５００１の特定された可変領域の１つ（１４７〜１５３）において、この領域のコンホメーションの柔軟性を増大させる試みでループの中央にグリシン残基を挿入したことを述べておく。ＳＥＱＩＤ−４５００１で特定された領域の配列を以下の表に要約する。
Figure 2016500250
ライブラリーの設計及び構築
可変領域の特定に基づいて、図３３に示されているように各可変領域を増幅できるプライマーを設計した。例えば、４個の可変領域がある場合、４個の可変性断片を作製するために４対のプライマーが必要である。ステップ１では、鋳型として、ｐＧｒａｃプロモーターの下流でＮ末端ＡｍｙＱシグナルペプチドと融合したＳＥＱＩＤ−４５００１を含むｐＥＳ１２０５を用いた。ｐＥＳ１２０５はベクターｐＨＴ４３（ＭｏＢｉＴｅｃ社）の派生物であり、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のａｍｙＥ遺伝子をコードする１９０５ｂｐのＤＮＡ断片（ＡｍｙＥシグナルペプチドをコードする最初の９３ｂｐが抜けている）及びＣ末端１Ｘ ＦＬＡＧタグを含む。ａｍｙＥ：：１ＸＦＬ：ＡＧ配列を、ｐＨＴ４３上にコードされるＳａｍｙＱ配列とフレームを合わせてクローニングした。断片１、２、３、４では、フォワードＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５３、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５４、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５５、及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５６は可変領域の前の２５塩基の一定配列と、それに続く可変領域を表す縮重配列及び可変領域の下流の２５塩基の一定配列を含む。断片 １、２、３では、逆プライマーＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６１、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６２、及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６３はそれぞれ、次の可変領域の上流に２５塩基の逆方向相補配列を含む。断片４では、逆プライマーのＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６４は可変領域４から任意の距離にある２５塩基の逆方向相補配列を含む。４つの別個のＰＣＲ増幅を、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州）及びメーカー推奨の反応パラメーターを用いて行った。別個の反応として、鋳型としてのＰＥＳ１２０５、並びにＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５７＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６１、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５８＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６２、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５９＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６３、及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６０＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６４のプライマー対を用いて４個の野生型断片、それぞれＷＴ−ｆｒａｇ−１、ＷＴ−ｆｒａｇ−２ 、ＷＴ−ｆｒａｇ−３、及びＷＴ−ｆｒａｇ−４を作製した。全てのＰＣＲ断片をゲル精製した。ステップ２では、２つの別個のＰＣＲ反応を設定した。第１のＰＣＲ反応は、等モル比の断片１及び２を鋳型として、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５７及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６２をプライマーとして含む。第２のＰＣＲ反応は、等モル比の断片３及び４並びにプライマーとしてＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５９及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６４を含む。両方の反応において、各可変断片中に存在するライブラリーメンバーのモル比でそれぞれの野生型断片を加えた。断片５及び６をゲル精製し、ステップ３において等モル比で鋳型として用いる。ＰＣＲ反応で用いるプライマーにはＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０５７及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６４が含まれる。ｐＥＳ１２０５及びプライマー対ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６５及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５０６６を用いてベクターＰＣＲ産物を作製した。断片７及びベクターＰＣＲ産物の両方をゲル精製し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州）を用いて一緒にクローニングし、メーカーの指示書に従いクローニング宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＴｕｒｂｏ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）に形質転換した。５０個のコロニーをシークエンシングしてライブラリーの多様性を決定した。次いで、寒天プレート上のコロニーをＬＢ培地に懸濁し、プラスミド精製のために回収した。同様に、変異体の設計で特定された全部の可変位置で９個の特異的アミノ酸Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｗで変化させたＳＥＱＩＤ−４５００１の９個の特異的変異体を作製した。特異的変異体プライマーをアミノ酸の名称の一文字表記で示す。全てのプライマーを以下の表ＰＲＩＭＥＲＩＤに記載する。
Figure 2016500250
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枯草菌株の構築
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＷＢ８００Ｎ（ＭｏＢｉＴｅｃ社、ゲッティンゲン、ドイツ）を本研究の発現宿主として用いた。ＷＢ８００Ｎはよく研究されている株（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８）の派生物であり、８個の細胞外プロテアーゼ（ｎｐｒＥ、ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｂｐｒ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｖｐｒ及びｗｐｒＡ）をコードする遺伝子の欠失により分泌タンパク質のプロテアーゼ分解が低減するように改変されている。Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓの形質転換をメーカーの指示書に従って行った。ＳＥＱＩＤ−４５００１変異体コンストラクトの約５μｇのライブラリーでＷＢ８００Ｎを形質転換し、５．０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ５）を含むＬＢ寒天上にプレーティングして３７℃でシングルコロニーを選択した。９個の特異的変異体について、１μｇの特異的ＳＥＱＩＤ−４５００１変異体でＷＢ８００Ｎを形質転換し、５．０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ５）を含むＬＢ寒天上にプレーティングして３７℃でシングルコロニーを選択した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓライブラリーのスクリーニング
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＥＱＩＤ−４５００１ライブラリーの約８００個の個々の形質転換体を、深型ウェルブロック（角形９６ウェル）中のＣｍ５を含む２×ＭＡＬ培地（２０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２０ｇ／ｌトリプトン、及び１０ｇ／ｌ酵母エキス、７５ｇ／ｌマルトース）の１ｍｌ培養液に個々に接種した。ライブラリーの株に加えて、ＡｍｙＥ及びＳａｍｙＱリーダーペプチドを有するプラスミドを含む株を陽性対照として接種し、目的の遺伝子を有さないプラスミドを含む株を陰性対照として接種した。培養ブロックを多孔質の接着性プレートシールで覆い、微小発現チャンバー（ｍｉｃｒｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ社、テレホート、インディアナ州）中、３７℃、８８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩培養物を用いて、深型ウェルブロック中の新鮮な２×ＭＡＬ、Ｃｍ５培養液に開始ＯＤ６００＝０．１で接種した。
発現培養物を３７℃、８８０ｒｐｍでＯＤ６００＝１．０まで（約４時間）インキュベートし、この時点でイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭで加えてインキュベートを４時間続けることにより誘導した。４時間後、各培養液の細胞密度を測定し（ＯＤ６００）、遠心（３０００ｒｐｍ、１０分、ＲＴ）により細胞を回収した。遠心後、培養上清を慎重に除去し、新しいブロックに移し、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。分泌タンパク質のレベルを決定するために、最初に０．４５μｍのフィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを用いて、０．５ｍｌ分の培養上清をろ過した。次いで、ろ液をアッセイして、チップ電気泳動システムにより目的の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定し、ベースのコンストラクトの分泌レベルと比較した。簡潔に述べると、２μｌの試料を７μｌの試料バッファーに加え、９５℃で５分間加熱した後、３５μｌの水を加えることにより試料を調製した。ＨＴ Ｌｏｗ ＭＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標） Ｋｉｔ又はＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標） Ｋｉｔ（メーカーのプロトコールに従う）を用いて分析を完了した。分子量決定（ｋＤａ）及び定量化（ｎｇ／μｌ）のためにタンパク質ラダーを１２試料毎に流した。ヒット番号３の分泌を示す電気泳動図の例を図３４（Ａ）に陰性対照及びラダーと共に示す。この方法を用いてライブラリーからスクリーニングしたＳＥＱＩＤ−４５００１の２３個の異なる変異体の分泌の例を図３４（Ｂ）に示す。
目的のゲルバンドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりヒット番号１１及び２７が確認された。選択されたヒットを、５％β−メルカプトエタノールを含むインビトロジェン社のＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒと混合し、沸騰させ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標） ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） １０％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））にローディングした。ランの後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標） ＳａｆｅＳｔａｉｎ（ライフテクノロジーズ社）を用いてゲルを染色し、所望のバンドを切り出し、分析に供した。ゲルバンドを洗浄、還元、及びアルキル化し、次いでトリプシンで４時間消化した後、ギ酸でクエンチした。次いで、サーモフィッシャー社製Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅに接続したウォーターズ社製ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステムを用いたナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより消化物を分析した。ペプチドをトラップカラムにローディングし、３５０ｎＬ／ｍｉｎで７５μｍの分析カラムで溶出した（どちらのカラムにもＪｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ樹脂（フェノメネックス社（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））が充填された）。質量分析装置をデータ依存モード（ｄａｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｅ）で作動させ、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳを、それぞれ７０，０００ＦＷＨＭ分解能及び１７，５００ＦＷＨＭ分解能でＯｒｂｉｔｒａｐを用いて行った。１５個の最も多いイオンをＭＳ／ＭＳに選択した。得られたペプチドデータを、関連する変異体タンパク質配列を付加して、関連宿主データベースに対してＭａｓｃｏｔを用いてサーチした。
希釈した一晩培養物を、Ｃｍ５を含むＬＢブロス培養液への接種に用いた。これらの培養液を３７℃で対数期に達するまで成長させた。これらの培養液の一定分量をグリセロール（２０％終濃度）と混合し、−８０℃で凍結した。次いで、Ｉｎｓｔａｇｅｎｅマトリックス（バイオラッド社、米国）を用いて上位３０ヒットを精製し、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０３ ＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣ及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０４ ＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＣを用いて増幅し、同じプライマーを用いてシークエンシングして、ＳＥＱＩＤ−４５００１変異体配列を特定した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ分泌ライブラリー分析
ＳＥＱＩＤ−４５００１の全ての分泌変異体（ＳＥＱＩＤ４５００２〜４５０２８）を分析して、最初の遺伝子ライブラリー中に存在する予想される位置特異的な偏りと比べて分泌変異体中に存在するアミノ酸中に位置特異的偏りがあるかどうかを決定した。この目的のために、各位置の各アミノ酸について正確二項検定を行い、観察される各アミノ酸の数が偶然により予想されるより有意（ｐ＜０．０５）に多いか少ない可能性を決定した。表１３ａは、この片側検定のｐ値を示しており、強調されている要素はｐ値が０．０５未満である。全てで予想されるより有意に高かった野生型の値は別として、他の全ての有意に異なるアミノ酸頻度は予想されるより低かった。予想される位置特異的なアミノ酸の偏りが表１３ｂに示されており、これらはライブラリーを構築してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに形質転換した後にランダムに選択された４７個の変異体をシークエンシングすることにより見出された。Ｘであるように設計された全ての位置で、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、及びＭコドンの同じ分布から効果的にサンプリングされた（すなわち、全てのＸ位について、位置特異的なアミノ酸の偏りはなかった）と仮定した。したがって、観察された各アミノ酸の数を位置全体で総計し、全てのＸ位について予想されるアミノ酸尤度を決定した。Ｚであるように設計した全ての位置についても同様に仮定した。表１３ａに見られるように、各位置での野生型配列への強い偏りに加え、予想されるより有意に少なく観察された複数の異なるアミノ酸があり、これは、分泌型ライブラリーにおいてその位置でそれらのアミノ酸から離れる偏りを示している。このデータは、各位置に特異的変異を有する特異的な合理的に設計された変異体の設計についての更なる情報を提供する。例えば、分泌変異体でロイシンを濃縮するためには、位置２４１及び２９１はより望ましくない選択であり得る。あるいは、分泌変異体でバリンを濃縮するためには位置１４９、２４１、２４２、２９１、２９４、２９５、及び３８９はより望ましくない選択であり得る。
Figure 2016500250
Figure 2016500250
特異的変異体のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓによる発現試験
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ発現株の３個の別個のコロニーを、深型ウェルブロック（角形９６ウェル）中の１ｍｌのＣｍ５を含む２×ＭＡＬ培地（２０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２０ｇ／ｌトリプトン、及び１０ｇ／ｌ酵母エキス、７５ｇ／ｌマルトース）に接種した。培養ブロックを多孔質の接着性プレートシールで覆い、微小発現チャンバー（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ社、テレホート、インディアナ州）中、３７℃、８８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩培養物を、深型ウェルブロック中の新鮮な２×ＭＡＬ、Ｃｍ５培養液に開始ＯＤ６００＝０．１で接種した。これらの発現培養物を３７℃、８８０ｒｐｍでＯＤ６００＝１．０まで（約４時間）インキュベートし、その時点で、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１Ｍを加え、４時間インキュベートを続けることにより、誘導した。４時間後、各培養液の細胞密度を測定し（ＯＤ６００）、遠心（３０００ｒｐｍ、１０分、ＲＴ）により細胞を回収した。遠心後、培養上清を慎重に除去し、新しいブロックに移し、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。分泌タンパク質のレベルを決定するために、最初に０．４５μｍのフィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを用いて、０．５ｍｌ分の培養上清をろ過した。次いで、ろ液をアッセイして、チップ電気泳動システムにより目的の分泌タンパク質（ＰＯＩ）のレベルを決定した。簡潔に述べると、２μｌの試料を７μｌの試料バッファーに加え、９５℃で５分間加熱した後、３５μｌの水を加えることにより試料を調製した。ＨＴ Ｌｏｗ ＭＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標） Ｋｉｔ又はＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標） Ｋｉｔ（メーカーのプロトコールに従う）を用いて分析を完了した。分子量決定（ｋＤａ）及び定量化（ｎｇ／μｌ）のためにタンパク質ラダーを１２試料毎に流した。それぞれメチオニン、スレオニン、リジン、及びヒスチジンを濃縮したＳＥＱＩＤ−４５００１の変異体の分泌の例を図３４（Ｂ）に示した。
目的のゲルバンドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりＳＥＱＩＤ−４５０２５、ＳＥＱＩＤ−４５０２６、ＳＥＱＩＤ−４５０２７、及びＳＥＱＩＤ−４５０２８が確認された。選択されたヒットを、５％β−メルカプトエタノールを含むインビトロジェン社製ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒと混合し、沸騰させ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標） ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） １０％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ライフテクノロジーズ社）にローディングした。ラン後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標） ＳａｆｅＳｔａｉｎ（ライフテクノロジーズ社）を用いてゲルを染色し、所望のバンドを切り出し、分析に供した。ゲルバンドを洗浄、還元、及びアルキル化し、次いでトリプシンで４時間消化した後、ギ酸でクエンチした。次いで、サーモフィッシャー社製Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅに接続したウォーターズ社製ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステムを用いたナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより消化物を分析した。ペプチドをトラップカラムにローディングし、３５０ｎＬ／ｍｉｎで７５μｍの分析カラムで溶出した。両方のカラムにはＪｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ樹脂（フェノメネックス社製）を充填した。質量分析装置をデータ依存モードで作動させ、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳを、それぞれ７０，０００ＦＷＨＭ分解能及び１７，５００ＦＷＨＭ分解能でＯｒｂｉｔｒａｐを用いて行った。１５個の最も多いイオンをＭＳ／ＭＳに選択した。得られたペプチドデータを、関連する変異体タンパク質配列を付加して、関連する宿主データベースに対してＭａｓｃｏｔを用いてサーチした。
実施例１４．Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに由来する改変分泌タンパク質の選択及び設計
アミノ酸含有量が濃縮された分泌ポリペプチドの改変を実証するために、本発明者らは、産業規模でタンパク質を分泌することが知られている微生物、すなわちＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒを選択した。野生型Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中での主な分泌タンパク質として分泌ポリペプチドＳＥＱＩＤ−４５０２９が特定された。ＳＥＱＩＤ−４５０２９の配列保存及び結晶構造データを用いて、タンパク質の構造安定性及び／又は宿主生物がタンパク質を分泌する能力に負の影響を与えず、変異に耐えられると予想された各タンパク質内の近接領域を特定した。
本発明者らは、構造的タンパク質データバンク３ＥＱＡに報告されているようにＳＥＱＩＤ−４５０２９の二次構造を分析した。本発明者らは、αヘリックス又はβシートの一部でない、タンパク質配列内の１３個のループ領域を特定した。これらのループ領域は以下のアミノ酸残基で定義される：４８〜７６、１１４〜１２５、１３１〜１４８、１９５〜２０９、２５３〜２６８、２８０〜２８６、３０９〜３１２、３１８〜３３３、３６４〜３７０、３８０〜３９０、４１７〜４３８、４５５〜４６１、４６７〜４８６。長さが４アミノ酸未満のループ領域は変異の対象として考慮しなかった。
分泌能を維持しつつ改変を受けられる位置を特定するために進化空間での配列の保存も考慮した。相同配列のファミリー内でさほど保存されていない位置は本質的に可変性であり、本質的に構造に関係する活性への影響なしに、変異をより受け入れ易い。さほど保存されていない位置を見つけるために、本発明者らは、ＳＥＱＩＤ−４５０２９を用いてＮＣＢＩタンパク質参照配列データベースのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチを行い（Ｐｒｕｉｔｔ Ｋ． Ｄ．， Ｔａｔｕｓｏｖａ Ｔ．， ａｎｄ Ｄ． Ｒ． Ｍａｇｌｏｔｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２００５） ３３：Ｄ５０１−５０４）、ＳＥＱＩＤ−４５０２９に相同な５００個の配列を得た。どちらの場合も、ＢＬＯＳＵＭ６２ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１１、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１、及びａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＝０．００５を用いて１回実行した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．， Ｇｉｓｈ Ｗ．， Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ．， Ｍｙｅｒｓ Ｅ． Ｗ．， ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９０） ２１５：４０３−４１０； Ｍａｄｄｅｎ Ｔ．Ｌ．， Ｔａｔｕｓｏｖ Ｒ．Ｌ．， ａｎｄ Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９９６） ２６６：１３１−１４１； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．， Ｍａｄｄｅｎ Ｔ．Ｌ．， Ｓｃｈａｆｆｅｒ Ａ．Ａ．， Ｚｈａｎｇ Ｊ．， Ｚｈａｎｇ Ｚ．， Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９７） ２５：３３８９−３４０２）。全てのタンパク質配列アラインメントを用いて、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチの一部として各クエリー配列に特異的な位置特異的重み行列（ＰＳＳＭ）を作成した。ＰＳＳＭから、本発明者らは、各ループ内の各位置で正のＰＳＳＭスコアに関連する異なるアミノ酸の数のカウント並びに各位置の必須アミノ酸置換のためのＰＳＳＭスコアの和及び平均により、変異に耐えられると仮定される領域を特定した。更に、各ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴから得られたマルチプル配列アラインメントから、本発明者らは、以下の式で定義される各位置のアミノ酸エントロピーを計算した。
Figure 2016500250
 式中、Ｓｊは位置ｊのエントロピーであり、ｐｉは位置ｊにアミノ酸ｉを観察する確率である。
変異耐性のこれらの測定値を用いて、本発明者らは、必須アミノ酸への変異に耐えられると予想される４個のループ領域を特定した。特定された領域に必須アミノ酸を濃縮するために、本発明者らは、任意の選択された位置がＦ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、若しくはＭ（Ｚと表記）又はＲ、Ｋ、Ｔ、Ｉ、若しくはＭ（Ｘと表記）のいずれかとなり得るコンビナトリアルコドンライブラリーを用いた。必須アミノ酸への変異に選択されたループ領域のそれぞれにおいて、各可変位置に、（それらの各ＰＳＳＭ値に基づいて）疎水性残基への相対的耐性に応じてＺ又はＸを割り当てた。疎水性残基に耐性であった位置にＺを割り当て、これをコドンＮＴＮを用いて遺伝子コードした。親水性残基により耐性の位置にＸを割り当て、これをコドンＡＮＲを用いて遺伝子コードした。ＳＥＱＩＤ−４５０２９で特定された領域の配列を以下の表に要約する。
Figure 2016500250
ライブラリーの設計及び構築
可変領域の特定に基づいて、本発明者らは、図３３に示されているように各可変領域を増幅できるプライマーを設計した。例えば、４個の可変領域がある場合、４個の可変性断片を作製するために４対のプライマーが必要である。ステップ１では、本発明者らは、鋳型として、ｇｌａＡプロモーターの下のＳＥＱＩＤ−４５０２９及びＣ末端３Ｘ ＦＬＡＧタグとそれに続くＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのＴｒｐＣターミネーターを含むｐＥＳ１９６２（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ、ゲント大学から得たＨＩＬ６が３×ＦＬＡＧタグで置換されたＬＭＢＰ２２３６の派生物）を用いた。断片１、２、３、４では、順ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０５、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０６、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０７、及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０８は、可変領域の前の２５塩基の一定配列と、それに続く可変領域を表す縮重配列及び可変領域の下流にある２５塩基の一定配列を含む。断片１、２、３では、逆プライマーのＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１３、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１４、及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１５は、それぞれ次の可変領域の上流の２５塩基の逆方向相補配列を含む。断片４では、逆プライマーＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１６は、可変領域４から任意の距離にある２５塩基の逆方向相補配列を含む。４つの別個のＰＣＲ増幅を、推奨されるメーカーのプロトコールを用いてＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州）を用いて行った。別個の反応として、鋳型としてＰＥＳ１２０５ ＰＥＳ１９６２を、プライマー対としてＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０９＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１３、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１０＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１４、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１１＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１５、及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１２＆ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１６をそれぞれ用いて、４つの野生型断片、ＷＴ−ｆｒａｇ−１、ＷＴ−ｆｒａｇ−２ 、ＷＴ−ｆｒａｇ−３、及びＷＴ−ｆｒａｇ−４を作製した。全ての断片をゲル精製した。ステップ２では、２つの別個のＰＣＲ反応を設定した。第１のＰＣＲ反応は、鋳型として等モル比の断片１及び２を、プライマーとしてＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０９及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１４を含む。第２のＰＣＲ反応は、等モル比の断片３及び４並びにプライマーとしてＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１１及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１６を含む。両方の反応において、各可変断片中に存在するライブラリーメンバーのモル比でそれぞれの野生型断片を加えた。断片５及び６をゲル精製し、ステップ３において等モル比で鋳型として用いる。ＰＣＲ反応に用いたプライマーにはＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１０９及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１６が含まれる。ｐＥＳ１２０５ ｐＥＳ１９６２及びプライマー対ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１７及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１１８を用いてベクターＰＣＲ産物を作製した。断片７及びベクターＰＣＲ産物の両方をゲル精製し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社、ビバリー、マサチューセッツ州）を用いて一緒にクローニングし、メーカーの指示書に従いクローニング宿主Ｅ． ｃｏｌｉ Ｔｕｒｂｏ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）に形質転換した。５０個のコロニーをシークエンシングしてライブラリーの多様性を決定した。次いで、寒天プレート上のコロニーをＬＢ培地に懸濁し、プラスミド精製のために回収した。同様に、本発明者らは、変異体の設計で特定された全部の可変位置で９個の特異的アミノ酸Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｗで変化させたＳＥＱＩＤ−４５０２９の９個の特異的変異体を作製した。特異的変異体プライマーをアミノ酸の名称の一文字表記で示す。全てのプライマーを以下の表ＰＲＩＭＥＲＩＤ１に記載する。
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Figure 2016500250
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株の構築
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＭＧＧ０２９のΔａａｍＡ、ｐｙｒＥ派生物（Ｃｏｎｅｓａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０００）を本研究に用いた。標準的なプロトプラスト形質転換法（Ｐｕｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９９２）を用いて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のマーカーｐｙｒＥをコードするベクターと共に発現ベクターを同時形質転換した。プロトプラストを、５μｇの発現ベクター及びｐｙｒＥをコードする１μｇのベクターで形質転換した。１．２Ｍソルビトールを補充した最小培地（１．５％バクトアガー、１０ｇ／ｌグルコース、４ｇ／ｌ硝酸ナトリウム、２０ｍｌ／ｌ塩溶液（２６．２ｇ／ｌ塩化カリウム及び７４．８ｇ／ｌ第１リン酸カリウムをｐＨ５．５で含む）及び１ｍｌ／ｌの金属溶液（２０ｇ／ｌ硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１１ｇ／ｌホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、５ｇ／ｌ塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、５ｇ／ｌ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１．７ｇ／ｌ塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、１．６ｇ／ｌ硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、１．５ｇ／ｌモリブデン酸ナトリウム二水和物（ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）、及び５．０ｇ／ｌ ＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ）をｐＨ６．５で含む）で形質転換体を選択した。プレートを３０℃で４日間、コロニーの大部分が目に見える分生子柄を有するまでインキュベートした。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ発現試験
滅菌した爪楊枝を用いて個々のコロニーから分生子を拾い、４０ｍＭ ＭＥＳでｐＨ７に調整してＳｉｇｍａＦａｓｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ ＥＤＴＡ−Ｆｒｅｅ（１錠／１００ｍＬ、シグマ アルドリッチ社）を補充した８００μＬの完全培地（５．０ｇ／ｌ酵母エキス、２．０ｇ／ｌカザミノ酸、１０ｇ／ｌマルトース、４ｇ／ｌ硝酸ナトリウム、２０ｍｌ／ｌ塩溶液（２６．２ｇ／ｌ塩化カリウム及び７４．８ｇ／ｌ第１リン酸カリウムをｐＨ５．５で含む）、１ｍｌ／ｌの金属溶液（２０ｇ／ｌ硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１１ｇ／ｌホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、５ｇ／ｌ塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、５ｇ／ｌ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、１．７ｇ／ｌ塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、１．６ｇ／ｌ硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、１．５ｇ／ｌモリブデン酸ナトリウム二水和物（ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）、及び５．０ｇ／ｌＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ）をｐＨ６．５１で含む）、及び１ｍｌ／ｌビタミン溶液（１００ｍｇ／ｌ塩酸ピリドキシン、１５０ｍｇ／ｌ塩酸チアミン、７５０ｍｇ／ｌ ４−アミノ安息香酸、２．５ｇ／ｌニコチン酸、２．５ｇ／ｌリボフラビン、２０ｇ／ｌ塩化コリン、及び３０ｍｇ／ｌビオチンを含む）の入った９６ウェル角底深型ウェルブロックに直接接種した。培養ブロックを多孔質の接着性プレートシールで覆い、微小発現チャンバー（ｍｉｃｒｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ社、テレホート、インディアナ州）中、３０℃、１０００ｒｐｍで振盪しながら４８時間インキュベートした。成長期の後、最初に２５μｍ／０．４５μｍの２段階フィルター、次いで０．２２μｍのフィルターを用いて、５００μＬ分の培養上清をろ過した。次いで、ろ液をアッセイして目的の分泌タンパク質のレベルを決定した。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの配列決定分析
９６ウェル深型ウェルブロックの個々のウェルから真菌組織を回収し、先端の細い（ｆｉｎｅ−ｔｉｐｐｅｄ）ゲル充填ピペットチップを用いて残りの上清を吸引した。ＺＲＦｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ザイモリサーチ社（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いてＤＮＡを抽出した。ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１５５（ＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＣ）及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１５６（ＣＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＣ）を用いたＰＣＲの鋳型として約５ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、発現カセット全体を増幅した。ＰＣＲ反応物を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ回収キット（ザイモリサーチ社）を用いて精製し、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１５５、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１５６、及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１５７（ＡＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＣＣＧＣ）を用いて配列決定した。ランダム化された部位で多形を示すゲノムＤＮＡプレップをｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯ（ライフテクノロジーズ社）にサブクローニングし、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１５５、ＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１５６、及びＰＲＩＭＥＲＩＤ−４５１５７を用いて１５個のコロニーを配列決定した。
抗ＦＬＡＧドットブロット分析
ドットブロット法を用いて細胞外タンパク質を定量した。タンパク質結合が正規化されるようにし且つタグが確実に露出するように、０．２μｍのフィルターでろ過した１１０μｌの試料を１１０μｌの８．０Ｍ塩酸グアニジン、０．１Ｍリン酸ナトリウム（変性バッファー）と混合した。アミノ末端ＦＬＡＧ−ＢＡＰ（商標） Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ（シグマ社）の標準曲線を、２μｇから始めて０．０３１３μｇまでの２倍段階希釈で試料と同じマトリックス中に調製した。インビトロジェン社製０．４５μｍニトロセルロースメンブレンを１×ＰＢＳバッファー中で５分間予め濡らした後、バイオ・ラッド社製ドットブロット装置にローディングした。メンブレンを更に濡らすために、３００μｌのＰＢＳを吸引した。次に、２００μｌの１：１＝試料：変性バッファー混合物を各ウェルにローディングし、ドットブロット装置を介して重力により３０分間、徐々に排出させた（ｄｒａｉｎ）。次に、減圧することにより３００μｌＰＢＳで全てのウェルを洗浄し、次いでミリポア社製Ｂｌｏｋ ＣＨ Ｎｏｉｓｅ Ｃａｎｃｅｌｌｉｎｇ試薬をローディングし、６０分間インキュベートした。ブロッキング後、メンブレンを３００μｌの１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。次に、２．４μｌのシグマ社製Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）抗体を１２ｍｌのミリポア社製Ｂｌｏｋ ＣＨ Ｎｏｉｓｅ Ｃａｎｃｅｌｌｉｎｇ試薬に加えることで抗体溶液を調製した（１：５０００希釈）。得られた抗体溶液の１００μｌを各ウェルに加え、重力により３０分間インキュベートした。抗体インキュベート後、３００μｌの１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を用いた減圧による最後の洗浄を３回行った。洗浄後、ニトロセルロースメンブレンを取り出し、試薬トレイの中に置いた。２０ｍｌのミリポア社製Ｌｕｍｉｎａｔａ Ｃｌａｓｓｉｃｏ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質を加え、１分間インキュベートした。インキュベート後、膜をＧｅｌ Ｄｏｃ（商標） ＸＲ＋ Ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド社）のイメージングトレイに入れ、化学発光プロトコールを用いて画像取得した。図３５は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのＳＥＱＩＤ−４５０２９変異体の分泌を示す抗ＦＬＡＧドットブロットとの例を示す図である。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるタンパク質特定
目的のゲルバンドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分泌変異体のタンパク質配列を更に確認する。選択されたヒットを、５％β−メルカプトエタノールを含むインビトロジェン社製ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒと混合し、沸騰し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標） ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） １０％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（ライフテクノロジーズ社）にローディングする。ラン後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標） ＳａｆｅＳｔａｉｎ（ライフテクノロジーズ社）を用いてゲルを染色し、所望のバンドを切り出し、分析に供する。ゲルバンドを洗浄、還元、及びアルキル化した後、トリプシンで４時間消化し、次いでギ酸でクエンチする。次いで、サーモフィッシャー社製Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅに接続したウォーターズ社製ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステムを用いたナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより消化物を分析する。ペプチドをトラップカラムにローディングし、３５０ｎＬ／ｍｉｎで７５μｍの分析カラムで溶出する（どちらのカラムにもＪｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ樹脂（フェノメネックス社製）が充填されている）。質量分析装置をデータ依存モードで作動させ、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳを、それぞれ７０，０００ＦＷＨＭ分解能及び１７，５００ＦＷＨＭ分解能でＯｒｂｉｔｒａｐを用いて行う。１５個の最も多いイオンがＭＳ／ＭＳに選択される。得られたペプチドデータは、関連する変異体タンパク質配列を付加されて、関連する宿主データベースに対してＭａｓｃｏｔを用いてサーチされる。
結果
８個の特異的ＳＥＱＩＤ−４５０２９変異体（ｐＥＳ２００９、ｐＥＳ２０１０、ｐＥＳ２０１２、ｐＥＳ２０１３、ｐＥＳ２０１４、ｐＥＳ２０１５、ｐＥＳ２０１６、ｐＥＳ２０１７、ｐＥＳ１９６２）でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株を形質転換した。初代の形質転換体を最小培地プレート上で選択し、約１０個の個々のコロニーの分生子を、完全培地を含む９６ウェル深型ウェルブロックに接種した。培養物を４８時間インキュベートし、その後、上清を、抗ＦＬＡＧドットブロット分析を用いて目的のタンパク質についてアッセイした。特異的変異体について、野生型ＳＥＱＩＤ−４５０２９をコードするｐＥＳ１９６２及びポリリジン置換ＳＥＱＩＤ−４５０２９配列をコードするｐＥＳ２０１６での形質転換のみが、上清中にＦＬＡＧシグナルを示した（図３５Ａ、Ｂ）。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株（方法参照）をＳＥＱＩＤ−４５０２９発現ベクターライブラリー（表１参照）で形質転換した。初代形質転換体を最小培地プレート上で選択し、４３個の個々のコロニーからの分生子を、完全培地を含む９６ウェル深型ブロックに接種（２連（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ））した。培養物を４８時間インキュベートし、その後、上清を、抗ＦＬＡＧドットブロット分析を用いて目的のタンパク質についてアッセイした。単離株１８及び２７の上清分析が、上清中でバックグラウンドより高いＦＬＡＧシグナルを生じた（図３５Ｃ、Ｄ）。
本発明者らは、単離株１８及び２７からＤＮＡを単離し、ＳＥＱＩＤ−４５０２９発現カセットを増幅した。ＰＣＲ産物を完全に配列決定して、細胞中に見られる特異的ＤＮＡ配列を特定した。単離株１８及び２７のＤＮＡ配列は、４つの可変位置の全てで多形を示し、これは、各単離株が複数の別個の発現ベクターを有することを示している。ＰＣＲ産物をｐＣＲＢｌｕｔＩＩ ＴＯＰＯベクターにサブクローニングし、Ｅ． ｃｏｌｉに形質転換し、１５個のサブクローンを配列決定して、発現ベクターの多様性を決定した（図３６）。単離株１８について、本発明者らは、野生型配列と同一の可変領域を有さない１１個の固有の発現カセットを特定した。単離株１８−１及び１８−３は、エキソン３及びエキソン４にまたがる同じ２４７塩基対の欠失を含んでいた。単離株２７について、本発明者らは１２個の固有の発現カセットを特定し、その１つ、２７−１４は、可変位置２、３、及び４において野生型配列と同一であったが、可変位置１において野生型配列とは異なっていた。１５個の単離株間における多数の固有の発現カセットは、各初代単離株が複数（例えば、１以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１５以上）の組込み事象を有したこと又は各単離株がクローンコロニーでなく複数の初代形質転換体を含んでいたことを示唆している。これらの発現カセットの１又は複数がドットブロットでの陽性ＦＬＡＧシグナルに寄与する可能性がある。上清の質量分析又は特定された全発現カセットの再形質転換を用いて、どのアミノ酸強化変異体が容易に分泌されるか確認する。
実施例１５
１５Ａ．消化プロテアーゼ切断部位が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１４、及びＳＥＱＩＤ−４５０２７は全て、消化プロテアーゼの認識部位が濃縮されている。タンパク質分解の部位を付加することにより、ポリペプチドは、より小さなペプチドへと更に分解されて腸で吸収されるまで連続的にタンパク質分解される。タンパク質消化における３つの主なプロテアーゼはペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンである。ペプシン認識部位は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基の後（すなわち、下流）のポリペプチド配列中の任意の部位であり、但し、後に続く残基はＡｌａ、Ｇｌｙ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基ではない。トリプシン認識部位は、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選択されるアミノ酸残基の後のポリペプチド配列中の任意の部位であり、但し、続く残基はプロリンではない。キモトリプシン認識部位は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基の後のポリペプチド配列中の任意の部位である。
ＳＥＱＩＤ−４５００９は、アルギニンが４．７％から５．３％に濃縮されており、これはアルギニン含有量の１３．８％の増加であり、したがって、ポリペプチドにトリプシン切断部位が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５０１４はロイシンが５．５％から６．３％に濃縮されており、これはロイシン含有量の１４．３％の増加であり、したがって、ポリペプチドにペプシン及びキモトリプシンの両方の切断部位が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５０２７は、リジンが６．２％から８．０％に濃縮されており、これはリジン含有量の２８．９％の増加であり、したがって、ポリペプチドにトリプシン切断部位が濃縮されている。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
改変分泌変異体の消化率は、電気泳動、ＨＰＬＣ、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析と組み合わせた、インビトロでの人工消化アッセイ（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）により測定することができる。インビトロ消化系は、胃及び腸を通過する間の、生物利用可能なペプチド及びアミノ酸へのポリペプチドの分解をシミュレートするために用いられてきた歴史がある（Ｋｏｐｆ−Ｂｏｌａｎｚ， Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ２０１２；１４２： ２４５−２５０， Ｈｕｒ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；１２５： １−１２）。消化率から更に、消化プロテアーゼに対するポリペプチドの抵抗性は腸での吸収及び感作につながり得るので、潜在的にアレルゲン性の配列が予測される（Ａｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６；１４： １２６９−１２７３）。
消化率を測定するために、ポリペプチドを最初に２ｇ／Ｌの濃度で、人工胃液（０．０３Ｍ ＮａＣｌ、ＨＣｌでｐＨ１．５に滴定。最終的なペプシン：ポリペプチドの比率は１：２０（ｗ／ｗ））を用いて３７℃で処理する。種々の時点で反応液からサンプリングし、０．２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を加えることによりクエンチする。人工胃液中で１２０分後、残りの反応液を、人工腸液と５０：５０で混合し（１５ｍＭ ナトリウムグリコデオキシコラート、１５ｍＭタウロコール酸、１８．４ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）。最終的なトリプシン：キモトリプシン：基質の比率は１：４：４００（ｗ／ｗ））、ＮａＯＨでｐＨ６．５に中和する。種々の時点で反応液からサンプリングし、１２０分までトリプシン／キモトリプシン阻害剤溶液を加えることによりクエンチする。その後、サンプリングした時点をチップ電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析することができる。
チップ電気泳動（Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸ ＩＩ）を用いてインタクトなタンパク質の消化速度（半減期）を評価する。ＨＴ Ｌｏｗ ＭＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標） Ｋｉｔ（メーカーのプロトコールに従う）を用いて試料を分析し、分子量決定（ｋＤａ）及び定量化のためにタンパク質ラダーを１２試料毎にローディングする。各時点のポリペプチド濃度（検出された場合）は、消化の半減期を算出するためにプロットされ、タンパク質消化速度を表す。プロテアーゼ認識部位を増やすことにより、インタクトなタンパク質は、インタクトなタンパク質のタンパク質分解における初期のステップを増やす露出された切断配列を有する可能性が高くなる。
逆相ＨＰＬＣによる消化の分析では、アジレント社のアプリケーションノート、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ”Ｒａｐｉｄ， Ａｃｃｕｒａｔｅ， Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ＨＰＬＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ” Ａｇｉｌｅｎｔ （２０００）に従い、試料が、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）で自動的に誘導体化され、ＵＶ−Ｖｉｓ及び蛍光検出を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより直列的（ｉｎ−ｌｉｎｅ）に分析される。標準的なアミノ酸及びペプチドの混合物と比較することによりアミノ酸及び小ペプチドが検出及び定量化される。消化物試料中のアミノ酸の量は、タンパク質が小さな生物利用可能な成分に消化される効率を表す。より多くのプロテアーゼ切断部位を付加することにより、より多くのアミド結合が分解され、タンパク質がアミノ酸に分解される効率が上昇する。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより消化ペプチドを分析するために、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で試料ｐＨをｐＨ３に調整し、ＨＬＢ固相抽出カートリッジ（ウォーターズ社）を用いてペプチドを抽出する。次いで、溶出したペプチドをカラムにローディングし、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析する。Ｍａｓｃｏｔを用いて適切なデータベースに対してデータをサーチしてペプチドを特定する。この方法を用いることで、消化に抵抗性である大きなペプチドを検出することができる。消化に抵抗性である配列スペースにプロテアーゼ認識部位を付加することで、ポリペプチドは更にしっかりと小さなペプチド及びアミノ酸へと分解され得る。
必須アミノ酸含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
必須アミノ酸にはヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、及びバリンが含まれる。これらの炭素骨格は代謝必要量を満たすように体によって新規に合成されないので、これらは食物として取る必要がある。改変分泌ポリペプチドＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１０、ＳＥＱＩＤ−４５０１４、ＳＥＱＩＤ−４５０２４、ＳＥＱＩＤ−４５０２５、ＳＥＱＩＤ−４５０２６、ＳＥＱＩＤ−４５０２８、及びＳＥＱＩＤ−４５０２７は、野生型と比べて必須アミノ酸含有量が１．１〜２．５％増加している。特に、ＳＥＱＩＤ−４５０１４は必須アミノ酸含有量が野生型の４２．１％から４３．７％に増加しており、これは３．８％の増加である。更に、これらの変異体は全て、全ての必須アミノ酸の完全なセットを含む。これらの栄養ポリペプチドの投与により、対象の食事中に存在しない又は必須アミノ酸不足を処置若しくは防止するのに不充分な量で存在する必須アミノ酸を提供することができる。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
ＰＤＣＡＡＳ（タンパク質消化吸収率補正アミノ酸スコア）が上昇するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓに由来する分泌タンパク質
ＰＤＣＡＡＳは、タンパク質含有量の質について主張する際に、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ａｃｔ ｏｆ １９９０ （ＮＬＥＡ）により公表された米国食品医薬品局（ＵＳ−ＦＤＡ）の表示規制によって要求される。方法は、食糧農業機関／世界保健機関（ＦＡＯ／ＷＨＯ）によって１９９１年に説明されており、その使用が推奨されている（ＦＡＯ／ＷＨＯ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ； Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ Ｊｏｉｎｔ ＦＡＯ／ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ； Ｒｏｍｅ， Ｉｔａｌｙ， １９９１）。ＰＤＣＡＡＳは、真の糞便消化率（ｔｒｕｅ ｆｅｃａｌ ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）により標準化した参照タンパク質に対する制限アミノ酸の比率を評価することによる、ヒトの好ましいアミノ酸必要量及びそれらの消化能に基づくタンパク質品質の尺度である。変異体変異体ＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１０、ＳＥＱＩＤ−４５０２４、及びＳＥＱＩＤ−４５０２６は、野生型と比べてＰＤＣＡＡＳスコアが上昇しており、特にＳＥＱＩＤ−４５００９はＰＤＣＡＡＳスコアが０．９２から１．０４に上昇しており、これは１３％の上昇である。より高いＰＤＣＡＡＳスコアのポリペプチドは、優れた比率で重要なアミノ酸を体に送達することができる。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
リジン含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５０２７は野生型タンパク質と比べてリジン含有量が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５０２７では、リジンが６．２％から８．０％に増加しており、これはリジン含有量の２８．９％の増加である。分泌タンパク質にリジンを濃縮することにより、合成できない必須アミノ酸の含有量が増加し、成長及び健康に更なる有用性を有する重要なアミノ酸が付加された。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
メチオニン含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５０１０及びＳＥＱＩＤ−４５０２６は、野生型タンパク質と比べてメチオニン含有量が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５０１０では、メチオニンが１．９％から２．４％に増加しており、これはメチオニン含有量の２９．３％の増加である。ＳＥＱＩＤ−４５０２６では、メチオニンが１．９％から３．５％に増加しており、これはメチオニン含有量の８９．０％の増加である。分泌タンパク質中にメチオニンを濃縮することにより、合成できない必須アミノ酸の含有量が増加し、成長及び健康に更なる有用性を有する重要なアミノ酸が付加された。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
ヒスチジン含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
変異体変異体ＳＥＱＩＤ−４５０２８はヒスチジンアミノ酸含有量が３．１％から４．９％に増加しており、野生型と比べてヒスチジンが５５％増加している。分泌タンパク質にヒスチジンを濃縮することにより、合成できない必須アミノ酸の含有量が増加し、成長及び健康に更なる有用性を有する重要なアミノ酸が付加された。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
アルギニン含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５００９及びＳＥＱＩＤ−４５０１０は、野生型と比べてアルギニン含有量が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５００９では、アルギニンが４．７％から５．３％に増加しており、これは１３．８％のアルギニン含有量の増加である。ＳＥＱＩＤ−４５０１０では、４．７％から５．３％に増加しており、これは１３．７％のアルギニン含有量の増加である。分泌タンパク質にアルギニンを濃縮することにより、成長及び健康に有用性を有する重要な非必須アミノ酸が付加された。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
スレオニン含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５０２５は野生型タンパク質と比べてスレオニン含有量が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５０２５では、スレオニンが６．９％から８．２％に増加しており、これは１８．６％のスレオニン含有量の増加である。分泌タンパク質のスレオニンを濃縮することにより、合成できない必須アミノ酸の含有量が増加し、成長及び健康に更なる有用性を有する重要なアミノ酸が付加された。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
ＢＣＡＡ含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
本発明者らは、ＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１０、ＳＥＱＩＤ−４５０１４、ＳＥＱＩＤ−４５０２４変異体が容易に分泌され、野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１と比べて分岐鎖アミノ酸が増加していることを示した。ＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１０、ＳＥＱＩＤ−４５０１４、ＳＥＱＩＤ−４５０２４は、野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１と比べて分岐鎖アミノ酸が７．２％、６．４％、９．７％、及び８．１％増加している。分泌タンパク質にＢＣＡＡを濃縮することにより、必須アミノ酸の含有量及び重要なファミリーのアミノ酸を増加させた。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
分岐鎖アミノ酸は、休止中のヒト筋肉中でのタンパク質合成速度を速め且つタンパク質分解速度を遅らせることにより、タンパク質代謝に同化的影響を与えることが示されている。更に、ＢＣＡＡは、持久運動後の回復中にヒト筋肉中で同化的な効果を示すことが示されている。これらの作用は、ｍＴＯＲのリン酸化、７０ｋＤ Ｓ６タンパク質キナーゼ（ｐ７０ｋＤ Ｓ６）の連続的活性化、及び真核生物開始因子４Ｅ結合タンパク質１により仲介される。Ｐ７０ｋＤ Ｓ６は、細胞サイクル進行、細胞サイズ、及び細胞生存の調節における役割が知られている。マイトジェン刺激に反応したＰ７０ｋＤ Ｓ６活性化は、リボソーム生合成を上方調節し、細胞の翻訳能力を増大させる（Ｗ−Ｌ Ａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． ２００３ Ａｕｇｕｓｔ； １６３（２）： ５９１−６０７； Ｅ． Ｂｌｏｍｓｔｒａｎｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｔｒ． Ｊａｎｕａｒｙ ２００６ １３６： ２６９Ｓ−２７３Ｓ）。真核生物開始因子４Ｅ結合タンパク質１は、４０ＳリボソームサブユニットをｍＲＮＡの５’末端にリクルートするマルチサブユニット複合体の制限的成分である。ｐ７０ Ｓ６キナーゼの活性化、及びその後のリボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化は、特異的ｍＲＮＡの翻訳増加に関連する。
１セッションの四頭筋抵抗運動の最中及び後に対象に与えられたＢＣＡＡはｍＴＯＲ、ｐ７０ Ｓ６キナーゼの増加を示し、運動後の回復期にＳ６リン酸化が見られた。しかし、ＢＣＡＡはＡｋｔ又はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）に対してはそのような効果を示さなかった。ＢＣＡＡ摂取のない運動では、酵素活性化のないｐ７０ Ｓ６キナーゼの部分的リン酸化が起こり、Ａｋｔリン酸化が低減し、ＧＳＫ−３は変化しない。ＢＣＡＡの注入も、安静時の対象においてＡｋｔ非依存的にｐ７０ Ｓ６キナーゼリン酸化を増加させる。ロイシンは更に、細胞特異的にｍＴＯＲ１リン酸化を刺激する一次シグナル伝達分子であることが知られている。これは、細胞タンパク質代謝回転（代謝回転）を制御し、組織間のタンパク質合成開始のためのインテグリン様成長シグナルを統合する。この生物作用は、骨格筋中の除脂肪組織量の生合成、肥満及びインスリン抵抗性の疾患状態の代謝シフト、並びに加齢に直接関連付けられている。
ロイシン含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１０、ＳＥＱＩＤ−４５０１４、及びＳＥＱＩＤ−４５０２４は、野生型タンパク質と比べてロイシン含有量が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５００９では、ロイシンが５．５％から６．１％に増加しており、これは１１．３％のロイシン含有量の増加である。ＳＥＱＩＤ−４５０１０では、ロイシンが５．５％から６．０％に増加しており、これは８．３％のロイシン含有量の増加である。ＳＥＱＩＤ−４５０１４では、ロイシンが５．５％から６．３％に増加しており、これは１４．３％のロイシン含有量の増加である。ＳＥＱＩＤ−４５０２４では、ロイシンが５．５％から５．８％に増加しており、これは５．６％のロイシン含有量の増加である。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
イソロイシン含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１０、及びＳＥＱＩＤ−４５０１４は野生型と比べてロイシン含有量が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５００９では、ロイシンが５．５％から６．１％に増加しており、これは１１．３％のロイシン含有量の増加である。ＳＥＱＩＤ−４５０１０では、ロイシンが５．５％から６．０％に増加しており、これは８．３％のロイシン含有量の増加である。ＳＥＱＩＤ−４５０１４では、ロイシンが５．５％から６．３％に増加しており、これは１４．３％のロイシン含有量の増加である。ＳＥＱＩＤ−４５０２４では、ロイシンが５．５％から５．８％に増加しており、これは５．６％のロイシン含有量の増加である。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
バリン含有量が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
本発明者らは、ＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１０、ＳＥＱＩＤ−４５０１４、ＳＥＱＩＤ−４５０２４変異体が容易に分泌され、野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１と比べて多くのバリンを含むことを実証した。ＳＥＱＩＤ−４５００９、ＳＥＱＩＤ−４５０１０、ＳＥＱＩＤ−４５０１４、ＳＥＱＩＤ−４５０２４は、野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１と比べて１５．６％、９．１％、９．２％、及び２５．５％多くバリンを含む。野生型ＳＥＱＩＤ−４５００１及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ａに示す。
活性が低減するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
場合によっては、改変分泌タンパク質は酵素であるか、酵素活性を有する。活性は栄養の質に必ずしも重要ではないので、酵素活性を不活性化又は低減することが望ましいことがある。ＳＥＱＩＤ−４５００１の活性部位は、触媒ドメインの中心にある酸性残基である残基Ｄ２１７及びＥ２４９であると予想されている。酵素活性がなく、栄養及び健康に重要なアミノ酸が濃縮されたポリペプチドを作製するために、それら２つの部位を変異させてＳＥＱＩＤ−４５００１の触媒活性を攪乱することができる。ＳＥＱＩＤ−４５００１中のＤ２１７及びＥ２４９は、それらのリガンドと水素結合を形成するための求核剤及びプロトンの供与体又は受容体として働き得るので、両方の残基をアラニン又は必須アミノ酸に変異させして活性を破壊することができる。アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンはその側鎖に酸素又は窒素原子がなく、リガンドとの求核剤又はプロトン供与体として働くことができない。スレオニン、リジン、及びアルギニンは、生理学的ｐＨ下での変化並びにそれらのサイズ及び形状がグルタミン酸及びアスパラギン酸とは異なる。
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消化プロテアーゼ切断部位が増加するように改変されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５０５２は消化プロテアーゼの認識部位が濃縮されている。タンパク質分解の部位を付加することにより、ポリペプチドは腸で吸収されるまで連続的タンパク質分解でより小さなペプチドへと更に分解される。タンパク質消化の３つの主なプロテアーゼはペプシン、トリプシン、及びキモトリプシンである。ペプシン認識部位は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎから選択されるアミノ酸残基の後（すなわち、下流）のポリペプチド配列中の任意の部位であり、但し、それに続く残基はＡｌａ、Ｇｌｙ、及びＶａｌから選択されるアミノ酸残基ではない。トリプシン認識部位は、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選択されるアミノ酸残基の後のポリペプチド配列中の任意の部位であり、但し、それに続く残基はプロリンではない。キモトリプシン認識部位は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＬｅｕから選択されるアミノ酸残基の後のポリペプチド配列中の任意の部位である。ＳＥＱＩＤ−４５０５２はリジンが３．０％が５．８％に濃縮されており、これは９２．４％のリジン含有量の増加であり、したがって、ポリペプチドにトリプシンの切断部位が濃縮されている。野生型ＳＥＱＩＤ−４５０２９及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ｂに示す。改変分泌変異体の消化率は、前述のように（消化プロテアーゼ切断部位が増加するように改変されたＢａｃｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質）、電気泳動、ＨＰＬＣ、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析と組み合わせた、インビトロでの人工消化アッセイにより測定することができる。
必須アミノ酸含有量が増加するように改変されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
必須アミノ酸には、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、及びバリンが含まれる。これらの炭素骨格は代謝必要量を満たすように体によって新規に合成されないので、これらは食物として取る必要がある。改変分泌ポリペプチドＳＥＱＩＤ−４５０２９は必須アミノ酸含有量が野生型の４１．９％から４４．４％に増加しており、これは６．０％の増加である。更に、この変異体は全ての必須アミノ酸の完全なセットを含む。これらの栄養ポリペプチドの投与により、対象の食事中に存在しない又は必須アミノ酸不足を処置若しくは防止するのに不充分な量で存在する必須アミノ酸を提供することができる。野生型ＳＥＱＩＤ−４５０２９及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ｂに示す。
アミノ酸は、正常な細胞機能性に用いられ、単一アミノ酸の利用可能率を変化させることによる代謝のシフトは、体全体の恒常性及び成長に影響し得る。更に、アミノ酸は、維持、成長、生殖、免疫に用いられる主な代謝経路のシグナル伝達分子及び制御因子として機能する。どのように非荷電ｔＲＮＡがアロステリックにＧＣＮ２を活性化し、それにより真核生物における脂質生成、タンパク質合成、及び多くの生合成経路に関係する転写因子（後述するＳＲＥＢＰ−１ｃ、ｅＩＦ２ａ、及びＧＣＮ４ｐ）が下流でリン酸化されるかについての機構が理解されている。必須アミノ酸を欠いた食事は顕著に、食事摂取後数分以内にこのシグナル伝達の引き金を引く（Ｈａｏ ｅｔ． Ａｌ．， ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５）。ＳＴＲＥＢＰ−１ｃを介したシグナル伝達は、脂質生成に関連する遺伝子を抑制することにより脂質貯蔵の動員にインビボで劇的な影響を与えることが示されている。ＳＴＲＥＢＰ−１ｃは、肝臓脂質合成、脂肪肝表現型を生じさせる能力、及び内臓脂肪量の増加に特異的に作用することが示されている（Ｋｎｅｂｅｌ， Ｂ． ｅｔ． Ａｌ． Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ ＳＲＥＢＰ−１ｃ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｖｉｓｃｅｒａｌ Ｆａｔ Ｍａｓｓ． ＰＬｏＳ， ２０１２）。必須アミノ酸の欠乏は、ＧＣＮ２への作用を介して、ＳＲＥＢＰ−１ｃ並びに肝臓重量の生理学的指標（及び脂肪肝表現型）、脂肪組織重量、コレステロール／トリグリセリド含有量、及び食物摂取量の低減に影響を与える。非脂肪量（ｌｅａｎ ｍａｓｓ）を維持しつつ、脂肪量を減少させることで、肥満、糖尿病、及び心血管系の健康等の領域における治療機会が提供される。
タンパク質消化吸収率補正アミノ酸スコアＰＤＣＡＡＳ（タンパク質消化吸収率補正アミノ酸スコア）が上昇するように改変されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
ＰＤＣＡＡＳは、タンパク質含有量の質について主張する際に、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ａｃｔ ｏｆ １９９０ （ＮＬＥＡ）により公表された米国食品医薬品局（ＵＳ−ＦＤＡ）の表示規制によって要求される。方法は、食糧農業機関／世界保健機関（ＦＡＯ／ＷＨＯ）によって１９９１年に説明されており、その使用が推奨されている（ＦＡＯ／ＷＨＯ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ； Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ Ｊｏｉｎｔ ＦＡＯ／ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ； Ｒｏｍｅ， Ｉｔａｌｙ， １９９１）。ＰＤＣＡＡＳは、真の糞便消化率で標準化した参照タンパク質に対する制限アミノ酸の比率を評価することによる、ヒトのアミノ酸必要量及びその消化能に基づくタンパク質品質の尺度である。変異体ＳＥＱＩＤ−４５０５２は野生型と比べてＰＤＣＡＡＳスコアが上昇しており、０．６７から０．７８に上昇しており、これは１６％の上昇である。野生型ＳＥＱＩＤ−４５０２９及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ｂに示す。より高いＰＤＣＡＡＳスコアのポリペプチドは、優れた比率で重要なアミノ酸を体に送達することができる。
リジン含有量が増加するように改変されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
改変分泌変異体ＳＥＱＩＤ−４５０５２は野生型タンパク質と比べてリジン含有量が濃縮されている。ＳＥＱＩＤ−４５０５２では、リジンが３．０％から５．８％に増加しており、これは９２．４％のリジン含有量の増加である。分泌タンパク質にリジンを濃縮することにより、合成できない必須アミノ酸の含有量が増加し、成長及び健康に更なる有用性を有する重要なアミノ酸が付加された。野生型ＳＥＱＩＤ−４５０２９及び変異体のアミノ酸含有量及びＰＤＣＡＡＳスコアを表１５Ｂに示す。
活性が低減するように改変されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の分泌タンパク質
場合によっては、改変分泌タンパク質は酵素であるか、酵素活性を有する。活性は栄養の質に必ずしも重要ではないので、酵素活性を不活性化又は低減することが望ましいことがある。ＳＥＱＩＤ−４５０２９の活性部位は、残基Ｄ２００及びＥ２０３であると予想されており、これらは全て触媒ドメインの中心にある酸性残基である。酵素活性のない栄養性ポリペプチドを作製するために、それら２つの部位を変異させてＳＥＱＩＤ−４５０２９の触媒活性を破壊することができる。ＳＥＱＩＤ−４５０２９中のＤ２００及びＥ２０３は、それらのリガンドと水素結合を形成するための求核剤及びプロトンの供与体又は受容体として働き得るので、両方の残基をアラニン又は必須アミノ酸に変異して活性を破壊することができる。アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンはその側鎖に酸素又は窒素原子がなく、リガンドとの求核剤又はプロトン供与体として働くことができない。スレオニン、リジン、及びアルギニンは、生理学的ｐＨ下での変化並びにそれらのサイズ及び形状がグルタミン酸及びアスパラギン酸とは異なる。
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付録Ａ
Acremoniumセクレトーム
P32470, P82288, O93837, A7WNT9, G2R5G6, G2R8G4, G2RD75, G2QWC4, G2QWI7, G2QXZ3, G2RG80, G2QRD2, G2QWT6, G2R0I7, G2R5V4, G2QZD9, G2R7J8, G2RB73, G2QW39, G2QZK6, G2R286, G2R8A1, G2R1U0, G2RB43, G2RCT3, G2QUW5, G2R1E6, G2REH9, G2QRL1, G2R8K6, G2R087, G2R7N0, G2R5H0, G2QVH7, G2R0M5, G2RAE6, G2R600, G2RCS2, G2REK8, G2QZ90, G2R7W4, G2R5Y0
Aspergillusセクレトーム
P69328, Q9P8F4, Q96X54, B8NKA3, Q8NK90, A2Q7E0, Q2U790, Q0CTV2, Q5BA89, Q9C4B1, A1CGD1, B8N7I7, Q4WL66, Q8NK89, A2R511, Q2UIM2, Q0CEE5, O74288, A1CQC3, B0XQB2, B8NIX4, Q4WTB3, A2QQ94, Q0D1I6, Q5BDV3, Q9HFS9, A1CLG4, B0XZW5, B8NDL1, Q4WYX7, A2QT85, Q2U8C6, Q0CS14, Q5BA96, A1D5W1, B0XTS5, B8N803, Q4X0A5, Q2UI74, Q0CY27, Q5AZC8, A1DHW8, A1CN18, B0YDT3, B8NMD3, Q4W930, A5AAG2, Q2U1X8, Q0CRJ6, Q5AUM3, A1DKY5, Q4WHK3, Q5BBH7, A2R797, Q2USL3, Q5AU81, P17737, C8VJZ7, A1CBW8, B8MWJ5, Q4WVZ3, A2QL72, P28351, Q2UT06, Q0CPK2, A1DDD8, A1C5D3, B0Y224, B8N306, Q4WE86, A2QEJ9, Q9Y865, Q2UJ97, Q5AVQ6, A1D0A3, B8NWY6, Q2TW69, Q0CVH2, Q5AU92, B0YEK2, B8N7Z0, A4DA70, A2R2S6, Q2UI87, Q0CVX4, Q5AX28, A1D9S3, Q0CEF5, Q5ARP5, A1CNK4, B0XNL6, B8MZ41, Q4WRH9, Q2UQV7, Q0CMA7, Q5AWI5, A1D1E6, A1CC12, B0Y2K1, B8NGU1, Q4WW45, A2R3X3, Q96WX9, Q2UFP4, Q0CJP9, O42814, Q5AQZ4, A1DD80, O60022, P79017, O60024, Q8NK92, Q92194, A1CSZ8, Q96W96, A9JPE6, B8NBI2, Q4WBW4, A2QZI3, Q75P26, Q0C8Z1, Q5B037, A1DBP9, Q5B9Z8, Q5AUX2, A2QFV9, P79019, Q2U7D2, Q9UVX6, Q0C8B3, P79021, B0XMP7, B8N6V7, Q4WS33, A2QAN3, Q2UCU3, Q4ZHV7, Q5BFC4, A1D1Z9, B0XNY2, B8NKI4, Q4WRD3, A2QA64, Q2U6P1, Q0CMF3, Q5BEQ0, A1D199, A1CE56, B0Y752, B8N2I5, Q4WNE4, A2QL84, Q2UMD5, A1DM65, B0XXE7, Q4WG05, A1DJ58, A1CR85, B0XPE1, B8NRX2, Q4WJJ3, P87076, A2RAL4, Q2UUD6, D0VKF5, Q0CTD7, Q5B5S8, A1D451, B8NGU6, Q2UFP8, Q5BCC6, B8NJF4, A2QPK4, Q2UNR0, Q5AUW5, B0Y7Q8, B8NP65, Q4WMU3, Q2UN12, Q0CI67, Q5B6C6, A1DMR8, B8NMR5, Q2U325, Q0CUC1, Q5B0F4, A1DC16, A1CUR8, B0XM94, B8NPL7, Q4WL79, Q2U9M7, Q5B6C7, A1DPG0, A1CA51, B0Y3M6, B8NDE2, Q4WU49, A2R989, Q2U8Y5, Q0CAF5, Q5BB53, A1DFA8, B0Y8M8, Q4WLY1, Q5AV15, A1DNN8, B0YBJ3, Q4WA69, Q5BA18, B0YB65, Q4WGT3, Q0CEF3, Q5B9F2, A1DCV5, B0XPB8, B8N5S6, Q4WR62, A5ABF5, Q2UDK7, Q0C7L4, Q5AWD4, A1D122, Q5B681, Q5BG51, A1C499, B0Y9Q9, B8MXP5, Q4WC60, Q2US39, Q0CEX9, Q5BD29, A1DBG6, A1CCL9, B0Y0I4, B8NYD8, Q4WFI6, Q2TYT2, Q0CB82, Q5ATH9, O42630, Q92405, Q877A8, A1CE97, B0Y793, B8N7G5, Q4WNA2, A2QPG2, Q9UVS9, Q2UBM3, Q0CRF7, Q5B2Q4, A1DMA5, O59843, A1CU44, B0Y8K2, Q4WM08, A2QAI7, Q9UVS8, Q0CMT2, Q8NK02, A1DNL0, A1CCN4, B0XWL3, Q4WFK4, A2QYR9, Q0CFP1, Q5B2E8, A1DJQ7, A1CG87, B0YBX0, B8NW70, Q4WAJ6, Q2TX26, Q0CC84, Q5B7R2, A1D932, A1CH57, Q5B4S6, Q8J0P4, A1CSZ4, B0XRY3, B8MVS3, Q4X1N0, A2R2W3, P52956, Q0CD01, Q5B2C1, A1DGN0, B0Y537, B8NBB2, Q4WQV2, A5ABE6, Q2TZY7, Q0CES4, Q5AVY9, A1CVT3, A1C9G0, B0YEP5, B8NCM8, Q4W9Z4, Q2U199, Q0CNE3, Q5AX00, A1D9W1, Q0CW01, Q0CRP4, P52750, A1CHP1, B0Y6C5, B8N970, Q4WPH9, Q2UH35, Q5AZ42, A1CX29, A1CSW4, B0XRV0, B8NBM3, P0C959, A2QZF1, Q3LS63, Q9Y8E3, Q0C8V9, Q5BA58, A1CQP0, B0XPZ4, B8NL00, A2QEP2, Q2U5K2, Q0C7M4, Q5AT95, A1D3K3, Q5BDU5, B8MW97, Q96WQ8, A2QPC3, O74706, Q2UPQ4, Q1HFS8, A1DME8, A1CD22, B0XXF8, Q4WG16, A2QH21, Q2UUZ1, Q0C7P6, Q5AUT0, A1DJ47, A1C4H2, B0Y9G4, B8MXJ7, Q4WBU0, Q96WQ9, A2R5N0, Q2US83, Q0CEU4, Q5BCX8, A1DBS6, P46075, A1CRV0, B0XN12, B8N151, Q4WK60, A2RAR6, Q7Z9L3, Q0CR35, Q5B5X8, A1D4Q5, B0XRX9, B8NBJ4, Q4X1N4, Q2TZQ9, Q0C8Z0, Q5B6Q3, A1DGM6, 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Bacillus Subtilisセクレトーム
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Chrysosporiumセクレトーム
Q01738, P13860, Q6QWR1, Q02567, P78733, P19136, Q9URB1, Q9HEZ1, Q7LIJ0, Q0PQY8, G0ZCU2, Q9HEZ2, Q66NB7, Q9HEY9, O42639, A9CSH7, B7SIW2, H2ESB9, H3K419, Q7LHI2, Q66NB8, Q0PQY7, O42638, Q53UG9, Q02321, Q8NJI9, Q8TGC6, O74203, O42640, Q9HEZ0, Q9URP5, Q01763, B7SIW1, Q09431, G3FAQ8, G4XKN3, G3FAQ9, F2X2G0, G3FAR0, G4XKN6
Corynebacteriumセクレトーム
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Escherichia coliセクレトーム
P53516, P53517, P39180, P46005, P46004, P19926, Q03155, A7ZP70, B7UFR4, B7MG19, B7LAR7, Q8XDZ8, B5YX43, B7NNT1, B7MXD4, B7M5T4, C4ZU94, B1X8W5, A8A2B9, A1ADA4, Q0TFJ0, Q8FFM4, B1IXT5, P45565, B7N5L7, B6I7J5, B1LLK6, Q1R9G3, P39265, P36548, P26365, P63884, P63883, P75820, P46883, P00811, P25718, P0AE22, P02924, P09551, P30859, P30860, P25549, P28249, P00805, B7URT6, B7M9V0, B7L5E9, Q8X783, B7NUP2, B7MV44, B7LZY9, C4ZY59, B1XF62, Q0THN1, Q8CW15, B1IQZ3, P36560, B7NB47, B6IB31, A7ZHR7, B7UIM2, B7MBF8, B7LGN8, P0A942, B5Z0F6, B7NID9, B7MP37, B7M1Y0, C4ZRR9, B1XD46, A7ZWC3, A1A7M1, Q0TLF6, P0A941, B1IQG4, P0A940, B7N844, B6HZF1, B1LGX9, Q1RG12, P77774, P0A903, P0AC04, P0AC03, P0AC02, P0A938, P0A937, Q9S142, Q47068, A7ZTS5, B1X9U9, A8A6I1, A1AHQ2, Q0TAY9, Q8CVJ9, B1IX18, P26218, Q1R4L6, P33363, P0AB42, P0AB41, P0AB40, P0A902, P0A901, A7ZUI6, Q8X714, A8A774, A1AIE8, Q0TA90, Q8CVJ0, P06129, Q93SE0, Q1R3U1, P06610, Q8X8Z0, Q8CWD2, P37028, P0ABE8, Q8CVG7, P0ABE7, Q46668, Q46669, Q46670, Q47500, 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E1PF47, E1PJG8, E1PEJ9, E1PF98, E1PFK1, E1PIW4, E1P6H1, E1PHX3, E1PIL4, E1P728, E1PE11, E1PIJ3, E1PD21, E1PBG8, E1PBW6, E1PD40, E1PE01, E1PHW5, E1P9E8, E1PJB0, E1PEZ5, E1PHU3, E1PH73, E1PHJ3, E1PHN5, E1PHW9, E1PH47, E1P899, E1PES5, E1PJ06, E1PHP4, E1PHB3, E1PF82, E1PI14, E1P6M7, E1PC94, B7MEG4, B7MGA1, B7MMJ9, B7MN27, B7MBE1, B7LI14, B7MJS2, B7MJ89, B7MJ92, B7MCV3, B7MMK6, B7MMQ9, B7MNA5, B7MLT2, B7MAA4, B7MAC0, B7MAC1, B7MCU0, B7MB79, B7MBC2, B7MBC3, B7MBF9, B7MHN8, B7MIA6, B7MBD3, B7MJF6, B7MHE0, B7MIJ7, B7MB68, B7MDR1, B7MEG5, B7MCI9, B7MMK7, B7MAB4, B7MC91, B7LI65, B7MGA0, B7MDQ7, B7MIP2, B7MFC8, B7MGR3, B7MBQ5, B7MAH9, B7MMT5, B7MN59, B7MEK3, B7MF69, B7LIB9, B7MCP0, B7MN26, B7MEZ5, B7MD02, B7MK93, B7MHK3
Fusariumセクレトーム
Q4IN52, P83610, Q4IAJ1, P00590, Q96UT0, Q96US9, Q99174, C7YRS7, Q4IBU4, Q01745, Q4I2W2, P46236, P46239, P45699, P46238, C7Z6W1, C7Z3B7, Q07181, P35049, B3A0S5, Q14TX3, Q6XZE4, Q6JV41, Q14TL6, Q14TM3, Q14TR0, Q14TP0, Q96VZ3, Q6RYZ6, Q14TX5, Q53U79, A9U922, Q14TM9, Q14TI4, Q14TM1, Q14TR5, Q14TR9, Q14TM7, Q14TK3, Q14TR2, Q14TL1, Q14TY6, O00094, Q14TP7, Q14TQ5, Q14TK7, Q3LHX1, Q14U01, Q14TP2, Q14TQ8, Q14TJ8, Q14TN1, A9U918, A9U917, Q04701, Q14TN3, Q14TI8, A6N6J6, A9U929, A9U930, A9U928, A9U926, A9U925, A9U927, F9FV05, F9FSV2, F9F9C7, F9FW23, F9FV48, F9FNU8, F9F3D9, F9F9U7, F9F3L5, F9FAN0, F9G2N9, F9FP15, F9FVE9, F9FVQ1, F9GG41, F9F800, F9F8T0, F9FT26, F9F3K2, F9FMC5, F9FTM6, F9FVF1, F9FNV5, F9G3C3, F9FBF9, F9GC97, F9FP63, F9FRS3, F9F4K0, F9G5I4, F9FLC0, F9FSI0, F9FRS1, F9F9K8, F9FV47, F9G833, F9G6A7, F9G410, F9FV33, F9G5Z1, F9FQU6, F9GD06, F9GA13, F9GG38, F9F0Z2, F9GB84, F9FWH3, F9F4K6, F9FLQ1, F9G828, C6KF41, C6KF40, C0KDU8, Q14TL4, Q14TZ7, Q14TZ8, Q14TL5, Q14TY1, Q14TY2, Q9HF67, A9U934, Q14TW2, Q14TL9, Q14TM0, Q14TL8, Q14TR4, Q6YF29, Q6YD93, A9UDM4, Q14U05, Q14U06, Q14TR7, Q14TR8, Q96US4, A9U924, Q5W375, Q14TW7, Q14TW8, A9U920, A9U921, Q3ZNL9, Q14TZ9, Q14U00, B2BE50, Q14TJ6, Q14TJ7, A9U935, Q14TX9, Q14TY0, Q3ZNL7, D3VN12, Q14U03, Q14U04, O59937, O74255, Q3LHX0, O74244, Q3LHX3, O93877, Q14U08, Q14U07, Q14TM6, Q14TM5, A9U933, Q53U67, Q53U65, Q53U78, Q53U74, Q53U80, Q53U75, Q53U77, Q6RYZ5, Q53U73, Q50JF4, Q50JF2, Q53U68, Q14U10, Q14U09, Q14TI6, Q14TI7, Q14TK0, Q14TW9, Q14TX0, Q14TP5, Q14TK1, Q14TY4, Q14TY3, Q14TP4, C7YJQ8, C7YTS6, C7YZY2, C7Z055, C7YVK6, C7ZI42, C7YMB0, C7ZIQ7, C7Z2U0, C7Z309, C7YJ62, C7ZB89, C7YXF5, C7YH34, C7ZM38, C7ZMT2, C7ZL93, C7ZDN3, A9U931, C7ZC92, C7Z358, C7ZB71, C7ZIN9, C7Z4W8, C7Z935, C7ZE08, C7YWZ5, A9U932, C7ZJJ0, C7YJL1, C7ZHB6, C7ZGJ1, C7ZNK4, C7ZGL9, C7YR40, C7ZEY2, C7YW61, C7ZKN2, C7ZA31, C7ZG07, C7ZHU8, C7YVE4, C7YXY0, C7ZE90, C7Z9D8, C7ZNC0, A9NIV5, Q5MY21, A4UVN0, Q14TK2, Q14TN5, D3VMM2, Q14TP6, Q49S24, Q14TJ0, Q69F59, Q14TY5, Q69F60, Q14TJ1, Q14TX2, Q14TX1
Penicilliumセクレトーム
D0EXD3, B6GXZ8, O94221, Q8NJP6, O59893, B8QGZ3, Q700S9, B6GW04, B6QLF0, B6H5X9, B6QHA9, P83799, B6HLS9, B6H2E9, P48845, B6H9W0, B6QAR7, B8M072, Q9HE18, P81156, Q06886, B2CNY4, B6H3H1, P31723, B6HQ08, B6HR25, B6HL48, B6Q6B6, B8LYF6, B6HAR6, B6QAV0, B8M2V6, B6QIB3, B8MKT9, P24289, P24504, B6QHD2, B6HL60, P78735, Q01972, B8MF81, Q9HEZ3, Q9Y834, Q9Y833, Q9Y718, O59925, O93883, O42824, P37274, P39457, P29417, P56588, Q9UR16, B8MJZ6, B6Q8U3, Q5S1P9, G3KB94, G3KB93, F1CHI3, A9Z054, B6ZBT2, F1CHI4, B5AKD1, F1CHI2, B0FMT4, B5M079, C9EI49, Q9Y749, Q9UVL4, B8Q961, F5BU82, F2X0X8, B3GS64, E7EF85, B2ZFJ4, F6L7A1, C5MRS3, B6QN64, B6QQA6, B6QJ65, B6QVG7, B6QSG8, B6QKD0, B6QMV3, B6QH17, B6QNG2, B6Q9M4, B6QME0, B6QE76, B6QPN6, B6Q638, B6QIG2, B6QIG4, B6QEJ5, B6QMM6, B6QIP2, B6QNP7, B6Q4E1, B6Q9F5, B6QWD1, B6QG04, B6QHN4, B6Q8U2, B6QMY3, B6QPP0, B6QNP6, B6H6X7, B6HNS9, B6HE68, B6HPJ6, B6HVQ6, B6HNU6, B6HC67, B6HHN9, B6GZR5, B6HKM5, B6HGX5, B6HQT2, B6HE71, B6HV77, B6H7H9, B6HV40, B6H016, B6H3I0, B6HTS7, Q6PLK0, Q8NKG0, Q9URR2, A5JUY3, Q5NDC0, G9DBG4, B8M6W7, B8MH80, B8MG47, B8LUY9, B8MPA3, B8LXT3, B8MH72, B8MHF4, B8MMB5, B8LVS8, B8MK69, B8MM80, B8MQG1, B8MEU2, B8M618, B8M9W6, B8LT08, B8LY78, B8M101, B8LZT2, B8MCI9, B8MG28, B8MK67, B8LVS9, B8ML07, B8M5E1, B8LTI1, B8M9H9, B8LZP2, B8MLF2, B8M833, B8MS03, B8MB27, B8LWW0, B8MAG0, B8M540, B8LU57, Q68HC2, A7LH56, Q5ZNB1, Q8WZI7, B5TMG4, F1CYZ0, Q8WZJ4, Q8J0K5, G0XZD8, C0L2S4, Q12665, G3KB95, C5J4L7, Q5DNV8, F5CAQ8
Pichia Pastorisセクレトーム
C4QY17, C4QWJ4, C4R415, C4QYM9, F2QZG3, F2QUV5, F2QVN4, F2QYL8, F2QWQ8, F2QQI2, F2QXH5, F2QTT0, F2QW47, F2QNB4, F2QZG2, C4QXM2, C4R4V0, C4QZC5, C4R3H3, C4R5B1, C4R8H7, C4R635
Rhizopusセクレトーム
P29026, P29027, P83973, Q7M4U7, P61871, P61872, Q5W9U0, Q8J1L0, Q8J1L2, Q8J1L1
Saccharomyces Cerevisiaeセクレトーム
P31787, Q04401, P32323, P52923, P32454, P0CZ17, P0CX77, P0CX78, P0CX79, B3LTZ3, C7GUR3, B5VKG3, A6ZVD0, C8ZAW6, P40458, Q8TGE1, P12630, P15703, A6ZZZ8, P36130, P40202, Q12127, O13547, Q06350, P29029, B5VL27, A6ZQH4, P47001, B3LM82, C7GRF7, A6ZMQ6, C8ZF59, Q3E7A9, Q12287, Q3E731, P38824, P53301, P32623, P28319, P43497, P00175, P00044, P00045, P32898, P23285, P47178, P47179, P54861, B3LRE5, C7GX69, A7A031, C8ZCN3, P36152, P38844, C7GQJ1, B5VE42, A6ZL22, P38248, P42835, P53753, P27882, P23776, P25653, P40515, Q04433, Q08906, Q08907, P36170, P32768, P38894, P39712, P40008, P16892, P25585, P38297, P22146, Q03655, Q08193, P39722, Q04458, P36078, Q05164, B3LPW4, B5VL26, A6ZQH3, P32478, P10591, P10592, A6ZPP2, P47031, P10594, P10594-2, P00724, P00724-2, B3LG61, A6ZYI0, P07170, P39690, P50112, P17260, P39005, P14681, P01546, A6ZZH2, P36060, B3LUU7, B5VDL3, A7A0F9, P18409, B3LJ47, B5VRP4, A6ZNJ7, Q92328, B3LHR1, B5VIB8, A6ZTX2, P53083, O60200, A6ZQL5, P47025, P04824, P41945, P41946, P41947, P34165, P34166, P01149, P32435, P28321, Q04341, Q03667, Q08176, Q06324, P28737, P08640, A6ZVM6, P38626, P16603, P40215, Q07500, P36010, A6ZTA1, P38881, A6ZLG8, P38325, P16547, P35845, Q07987, P38155, P47180, B3LQU0, A6ZZG0, Q03178, B3LQU1, A6ZZG1, Q03180, B3LPW3, B5VL25, A6ZQH2, P46999, P06197, Q03674, Q08108, P00635, P35842, Q08931, P47032, P36110, P47033, P08456, A6ZY20, Q12355, Q12335, Q07807, Q02933, P20840, P14693, P50110, P53969, Q04951, P53189, P53334, Q01589, Q04675, P16658, P39707, Q02825, P40472, P00445, P40092, Q03029, P32603, Q08673, P53616, Q06510, Q06490, P27654, P10863, P33890, P40552, Q12218, P35180, P49334, P23644, P80967, P33448, A6ZRW3, P07213, P38825, P53507, P38288, B3LPD6, C7GS61, A6ZSH9, C8ZGM3, P48560, Q03327, Q08926, Q05776, P35200, Q04006, B3LRC2, B5VMJ0, A7A003, P36135, P04840, P40478, P39102, Q3E821, Q3E755, Q7LHD1, Q3E6R5, P38616, P32792, Q3E7A3, P36101, A6ZZY2, P36114, Q07988, Q07990, Q12282, Q12106, Q08912, Q06089, E7Q5C8, E7Q5I7, E7QA67, E7Q5V1, E7Q3T8, E7Q5I8, E7Q1N3, E7Q6A0, B3LQN3, B3LKP2, B3LUY4, B3LGU8, B3LQ34, B3LQ33, B3LR97, B3LPV0, B3LHF4, G2WCB1, G2WGK0, G2WGT8, G2WGT9, G2WHG0, G2WNZ7, G2WI44, G2W8I2, G2WE11, C8ZB45, E7KE89, E7KEM2, E7KF31, E7KJH1, C8ZBD4, C8ZBV3, C8ZBD3, C8ZIJ1, E7K927, E7KAJ3, C8ZCH8, E7KE90, C8Z3G3, C8Z8F9, E7KCG9, C8Z4M0, E7KE31, H0GG74, H0H1W1, H0GIZ3, H0GQS2, H0GDT4, H0GSF4, H0GJD5, H0GBV0, H0GII0, H0GWS4, H0GIB6, H0GWL3, H0GX83, E7NGJ0, E7NHM3, E7NJ69, E7NJL6, E7NJN6, E7KL32, E7KQB9, E7KQ44, E7KQQ4, E7KQB8, E7KVD9, E7KNF1, E7LUC1, E7LW80, E7LW81, E7LWK3, E7M106, E7LX13, E7LS74, E7LW67, B5VMG0, B5VDH2, E9P9W0, B5VL98, B5VL14, B5VFL7, B5VLA0, C7GR35, C7GW29, C7GR34, C7GJD5, C7GS01, C7GW87, C7GPI9, C7GNP5, A6ZPP5, A6ZQF9, A7A0B8, A6ZW67, A6ZPP6, A6ZXS5, A6ZZX7, A6ZU91, A6ZQB1, E7QEP9, E7QLP5, E7QHE4, E7QGI6, E7QGB8, E7QCL0, E7QGI5
Synechococcusセクレトーム
P42784, B7KL24, B7JW48, Q31QJ8, Q2JRS2, Q2JIT3, B1XLD0, Q5N3P4, A5GPE0, Q7U3T1, Q0I6K2, Q3AVW5, Q3AGS4, Q7Y4H2, Q6H956, Q0QZ08, Q6H952, Q55025, P27366, P27477, F5B3P0, F5B3P3, F5B3N3, E3SL31, Q8W6X4, F4YCN3, B4WN23, B4WV19, B4WQ59, B4WN11, B4WR07, B4WTH8, B4WK32, B4WN36, B4WT90, Q05VG5, A3Z3E1, A3Z3C6, A4CY13, A4CY28, A4CRK4, Q061Q6, A3YUA7, A3YU92, D0CN25, D0CIP9, C7QVD0, C7QXF7, C7QUJ6, C7QTE1, Q2JVN2, Q2JT39, Q2JVE6, Q2JSY5, Q2JVP0, Q3AX46, B7KDY6, B7KC45, B7KEX2, B7K9C0, B7KM01, B7K7C1, B7KEX1, B1XRF8, B1XJB7, B1XRF3, B1XRD6, B1XRM6, B1XQA0, Q31KD9, A5GPC5, Q2JP28, Q2JKD6, Q2JP24, Q2JLU8, Q2JIB0, B7JXR5, B7K647, B7JWH8, A5GWK7, A5GSD6, A5GRG2, Q3AJG8, Q5N1H4, B4WH30, B4WNH1, B4WH32, Q0QKW2, Q0QKW5, Q0QKW7, Q05X68, Q05X65, A3Z4I3, A3ZA35, A3ZA39, A3ZA37, Q05X59, A3ZA28, Q05RB6, A3ZA34, Q05X64, G4FPE6, G4FPF4, G4FPF5, G4FPF2, Q8GIS5, A4CWF2, A4CWF1, A4CWG0, Q061N0, Q061M9, A3Z0X2, C7QP81, C7QM96, C7QLM2, C7QUM4, Q2JXQ7, Q2JXQ6, Q2JXS3, Q2JXQ8, B7KFM8, B7KFM9, B7KID0, B7KAQ6, B7K8J5, B7KE09, B7KAQ9, Q0IDR2, Q0ICD8, Q0ICD1, Q0ICE7, Q0ICE5, Q0ICD7, Q0ICE1, B1XN63, B1XNR9, B1XN62, B1XJM7, B1XNR7, B1XNR6, B1XNR8, Q31KB0, Q31JZ 9, Q31S89, Q31S88, A5GMQ7, A5GMQ0, A5GMR0, A5GMQ1, A5GMQ6, A5GMQ9, Q2JM34, Q2JHN3, Q2JM35, Q2JM04, Q2JM33, B7JZR7, B7K3Z0, B7K1H1, B7JW69, A5GRF2, A5GRF5, A5GRF6, Q5N229, Q5N230, Q5N1K5, Q5N1W0
Synechocystisセクレトーム
Q55669, P74268, P77972, Q55835, P72780, P73354, Q01903, H0PH79, H0PH89, H0PNI9, H0PH82, H0PJG4, H0NZK8, H0P655, H0P2Q5, H0NZK1, H0NZJ8, H0PBW4, H0PBX4, H0P9I7, H0PF19, H0PBW7, F7UT77, F7UT80, F7UT87, F7UQN9, F7ULV4, P72609, P74189, P72602, P72599, P74465, F7URI0, F7ULL3, H0PPC9, H0NXX5, H0PAC7, H0PIR4, H0P204, H0PEB8, F7UP60, F7URJ6, F7UMS5, F7UMS3, F7UP61, P74480, P73704, P74549, P73235, P73703, P73237, H0PM11, H0P4M7, H0P809, H0PKM3, H0PKM5, H0PFC6, H0PM10, H0P391, H0P389, H0P4M6, H0NXZ1, H0P6J9, H0P808, H0PAE3, H0P6J7
Trametesセクレトーム
Q02497, D0VWU3, Q99044, Q12718, Q99046, Q99049, Q12719, Q99055, Q12717, Q99056, P59097, Q5G234, P79076, Q75UV6, Q9P8N1
Trichodermaセクレトーム
Q92457, Q92451, Q99024, Q03420, Q99034, P48827, P53626, Q4R1C4, C0LRA7, Q8J0I9, P07981, Q12714, P85218, P07982, O14405, P43317, Q7Z9M7, P62694, Q9P8P3, P62695, P19355, P07987, P52754, P79073, A4V8W0, P52755, Q7Z9M8, Q8TFB0, Q66PN1, Q7Z7X3, D6N0Z7, P79072, A3RJX1, B7ZEN3, A8QPD8, D7RF10, Q6S4S0, D9I7P5, Q7Z7X2, O93833, Q7Z7X0, D9I7P6, A3QVU7, A5Z0S4, G3KJ88, Q4F6W8, Q6UJX9, D5FY04, H2KXF9, Q6UJY1, D9IXC6, D0F0C2, G9MFS8, G9N8R7, G9MFN2, G9N0K7, G9MX23, G9MXB2, G9N3P9, G9MQW8, G9MR13, G9MXU9, G9MY26, G9MS02, G9N4S9, G9MEH6, G9MYN2, G9MYN8, G9MFJ5, G9MMA7, G9MMQ0, G9N0T9, G9N0U1, G9MGS4, G9MUP7, G9MV83, G9MPL1, G9MES4, G9MQ69, G9MUN0, G9N0F8, G9MXF0, G9N0G0, G9MFM8, G9NAU0, G9N0U0, G9MU86, G9N4X9, G9N351, G9MVE8, G9MK44, G9MN58, G9MY62, G9MTX9, G9N4W6, G9N068, G9MF11, G9MZG3, G9MRA0, G9N4X6, G9MY29, G9N3U1, G9N5V3, G9MX08, G9N2G7, Q1HCL5, Q7LSP2, Q0Z8U3, B6V6U5, A7LNW7, A7LNX2, A7LNW9, A7LNX0, Q0QBT2, A7LNX3, A7LNX1, A7LNW6, A7LNX4, B5ATG1, A7LNW8, B5TWC6, B5TWC7, D6N0Z8, D6N0X6, B3FRA5, B5TYI3, B5M4A3, B5TYI4, A2VEC5, A2VEC6, Q2F8H3, A2VEC3, Q99036, Q9HEY8, Q5BMS5, D3YNY1, E1AFV7, Q9P8D0, Q7Z9M9, Q7Z9N1, D3JTC4, G0RB67, G0RV49, G0RRS0, G0RVZ9, G0RTT0, G0RNJ5, G0RH85, G0RV93, G0RHN0, G0R6T7, G0R6T8, G0RVK3, G0RE98, G0RGA8, G0RFI5, G0RX52, G0RTX6, G0R949, G0RKH9, G0RTW7, G0RN38, G0RVE5, G0RB58, G0RTL0, G0RAF8, G0R6T6, G0RWB2, G0REY4, G0RP66, G0RBZ9, G0RVK1, G0RWB1, E2FZU3, D1MGM7, D1MGM6, F5BU83, F8U3U4, G9NSE8, G9NET4, G9NF15, G9NFW5, G9NP23, G9NWY0, G9NQL1, G9NWX8, G9NE01, G9NE62, G9NKD3, G9P3M0, G9NE75, G9NRZ0, G9P4V8, G9NSK4, G9NZ09, G9NSZ2, G9NTG9, G9NTN2, G9NTR5, G9P6M2, G9NUB8, G9NUV0, G9NHP9, G9P209, G9P387, G9NXA4, G9PB35, G9NRH9, G9P6B7, G9PAS1, G9NE20, G9NS05, G9NFV6, G9NQQ1, G9NV26, G9NXQ9, G9NTY2, G9PAN1, G9NTY1, G9NYE0, G9NFU8, G9NZ00, G9NS04, G9NMK3, G9P182, G9NFN9, G9PBZ9, G9P4J3, A7LNV8, A7LNW3, A7LNW4, A7LNW2, A7LNV9, A7LNW0, A7LNV7, A7LNW5, A7LNW1, A7LNV6, D6N0Z9
付録Ｂ
アンキリンリピート: PHA02635, PHA02730, PHA02736, PHA02743, PHA02791, PHA02792, PHA02795, PHA02798, PHA02859, PHA02874, PHA02875, PHA02876, PHA02878, PHA02884, PHA02917, PHA02989, PHA03095, PHA03100, cd00204, cd01250, cd01274, cd01438, cd03587, cd03716, cd03720, cd03721, cd03722, cd03723, cd03724, cd03725, cd03726, cd03727, cd03728, cd03729, cd03730, cd03731, cd04103, cd04385, cd05744, cd07603, cd07604, cd07606, cd07637, cd07638, cd07639, cd07640, cd07641, cd07642, cd07883, cd07884, cd07885, cd07886, cd07933, cd07934, cd07935, cd08317, cd08555, cd08578, cd08606, cd08782, cd08803, cd08804, cd08805, cd09517, cd09518, cd09519, cd09524, cd09586, cd09587, cd10347, cd10348, cd10423, cd10440, cd10454, cd11582, cl04295, cl15368, pfam03105, pfam03859, pfam07565, pfam07906, pfam08910, pfam09040, pfam09727, pfam10077, pfam10266, pfam11956, pfam14420, pfam14432, smart00248, smart01076, KOG0502, KOG0506, KOG0507, KOG0512, KOG0515, KOG0705, KOG0783, KOG1710, KOG2384, KOG4485, cd06746, cd07325.
ロイシンリッチリピート: COG4886, PLN00113, TIGR00864, TIGR02996, cd00116, cd01775, cd05724, cd05725, cd05726, cd06875, cd07693, cd07996, cd08305, cd08320, cd08324, cd08787, cd08788, cd09293, cd09914, cd11280, cd11288, cd11289, cd11290, cd11291, cd11292, cd11293, cl02423, cl15308, cl15309, cl15310, cl15697, pfam00560, pfam00646, pfam01462, pfam01463, pfam03382, pfam07723, pfam07725, pfam08191, pfam08263, pfam09738, pfam10473, pfam12468, pfam12534, pfam12799, pfam13306, pfam13504, pfam13516, pfam13553, pfam13855, smart00013, smart00082, smart00364, smart00365, smart00367, smart00368, smart00369, smart00370, smart00446, KOG0532, KOG0617, KOG0618, KOG1633, KOG1908, KOG4308, KOG4341, KOG4579, KOG4648, cd06701, cd06702, cd06703, cd06704, cd06749, cd09917.
テトラトリコペプチドリピート: COG0457, COG0790, COG4700, COG4783, COG4785, COG4941, COG4976, COG5010, COG5191, TIGR00756, TIGR00861, TIGR02505, TIGR02521, TIGR02795, TIGR02917, TIGR03142, TIGR03662, TIGR03939, cd00189, cd04165, cd04461, cd04724, cd05693, cd05694, cd05695, cd05696, cd05697, cd05698, cd05699, cd05700, cd05701, cd05702, cd05703, cd05704, cd05705, cd05706, cd05707, cd05708, cd05718, cd05719, cd05804, cd06469, cd06489, cd06580, cd07417, cd07955, cd09034, cd09239, cd09240, cd09241, cd09242, cd09243, cd09244, cd09245, cd09246, cd09247, cd09248, cd09249, cd09618, cl00200, cl02250, cl02429, cl02723, cl02779, cl03252, cl10302, cl11871, cl14649, pfam00515, pfam01365, pfam02071, pfam02184, pfam03704, pfam03937, pfam07719, pfam07720, pfam07721, pfam07926, pfam08238, pfam08321, pfam08558, pfam10131, pfam10300, pfam10516, pfam11651, pfam11701, pfam11817, pfam12098, pfam12688, pfam12753, pfam12770, pfam12856, pfam12862, pfam12895, pfam12966, pfam12968, pfam13174, pfam13176, pfam13181, pfam13283, pfam13371, pfam13374, pfam13414, pfam13424, pfam13428, pfam13429, pfam13431, pfam13432, pfam13512, pfam13525, pfam13877, smart00028, smart00386, smart00671, smart01043, KOG0551, KOG0553, KOG0624, KOG1125, KOG1127, KOG1128, KOG1129, KOG2002, KOG2003, KOG2396, KOG2471, KOG3617, KOG4014, KOG4234, KOG4507, KOG4555, KOG4642, cd06681, cd06682, cd06683, cd06684, cd06685, cd06686, cd06687, cd07324, cd07330, cd07333, cd07345.
アルマジロリピート: pfam04826, TIGR01438, cd00020, cd00256, cd00594, cd00798, cd00800, cd01667, cd01680, cd01681, cd01886, cd02948, cd03561, cd03562, cd03565, cd03567, cd03568, cd03569, cd04170, cd04416, cd05743, cd07439, cd07846, cd08647, cd09859, cd09898, cd11655, cl00886, cl02500, cl02788, pfam00165, pfam00239, pfam00514, pfam00550, pfam00637, pfam03259, pfam03730, pfam04443, pfam04666, pfam06098, pfam06719, pfam08347, pfam09003, pfam09015, pfam09197, pfam09203, pfam09494, pfam09759, pfam10408, pfam10411, pfam10458, pfam11564, pfam11701, pfam12856, smart00185, smart00823, smart00857, smart00889, smart00960, KOG1048, KOG2122, KOG4224, KOG4535, KOG4646, cd00391, cd02314, cd02315, cd06749.
フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン: COG3401, cd00063, cd02688, cd02847, cd02848, cd02850, cd02851, cd02853, cd02854, cd02855, cd02856, cd02857, cd02858, cd02860, cd02861, cd02871, cd04967, cd04968, cd04969, cd04970, cd04977, cd04978, cd05035, cd05047, cd05074, cd05075, cd05088, cd05089, cd05722, cd05723, cd05727, cd05728, cd05730, cd05731, cd05732, cd05733, cd05737, cd05738, cd05739, cd05747, cd05748, cd05773, cd05845, cd05848, cd05849, cd05850, cd05851, cd05852, cd05853, cd05854, cd05865, cd05866, cd05867, cd05868, cd05869, cd05870, cd05874, cd05875, cd05876, cd05891, cd05894, cd06596, cd07184, cd07475, cd11234, cd11294, cd11675, cl11960, cl15273, pfam00041, pfam01108, pfam07675, pfam09099, pfam09100, pfam09238, pfam09294, pfam12421, pfam12733, pfam13882, pfam14310, smart00060.
リポカリン様ドメイン: COG3040, cd07828, cd11673, cl01001, cl01150, cl01365, pfam00061, pfam04264, pfam04791, pfam07143, pfam08212, pfam09223, pfam10285, pfam12204, pfam12702, pfam13648, pfam13924, pfam13944, pfam13969, smart00867, KOG3722, KOG4824, cd00301, cd00743.
ノッチン: cd00107, cl11589, pfam08027, pfam10530, pfam11703, smart00505, pfam00451, pfam00537, pfam08099, pfam08119, pfam0913.
セルロース結合ドメイン: cd00005, cd00036, cd02795, cd06543, cd09618, cd09619, cd09620, cd09621, cd09622, cl02521, cl02709, cl03026, cl03918, pfam00553, pfam00734, pfam00942, pfam03067, pfam03173, smart00236, smart00606, smart01067, smart01081, cd00597, cd02723, cd02880, cd06026, cd06027, cd06037.
炭水化物結合ドメイン: d00005, cd00035, cd00036, cd00037, cd00161, cd00239, cd00241, cd02688, cd02795, cd02859, cd02860, cd02861, cd03602, cd03603, cd04078, cd04079, cd04080, cd04081, cd04082, cd04083, cd04084, cd04085, cd04086, cd05467, cd05806, cd05807, cd05808, cd05809, cd05810, cd05811, cd05813, cd05814, cd05815, cd05816, cd05817, cd05818, cd05820, cd06564, cd06921, cd06922, cd06923, cd07184, cd08546, cd08547, cd08548, cd08987, cd08990, cd09003, cd09214, cd09216, cd09220, cd09618, cd09619, cd09620, cd09621, cd09622, cd09625, cd09628, cd09629, cd09631, cd09838, cd10315, cd10316, cd10317, cd10318, cd10320, cd10909, cd10964, cd11234, cd11320, cd11618, cl02511, cl03918, cl04060, cl04227, cl05621, cl07060, cl11617, cl14880, cl15347, cl16916, pfam02018, pfam02839, pfam02922, pfam03173, pfam03370, pfam03422, pfam03423, pfam03424, pfam03425, pfam03426, pfam03427, pfam03442, pfam03627, pfam06204, pfam08305, pfam09212, pfam09478, pfam10564, pfam10633, pfam10645, pfam11606, pfam13201, smart00034, smart00231, smart00458, smart00776, smart01063, smart01066, smart01068, smart01081, cd02689, cd02719, cd02880, cd02881, cd06018, cd07745, cd07746, cd07747, cd07748.
プロテインＺフォールド: CHL00082, PRK02576, cd02055.
ＰＤＺドメイン: COG0265, COG3480, COG3975, TIGR00054, TIGR02037, TIGR02038, TIGR03900, cd00136, cd00986, cd00987, cd00988, cd00989, cd00990, cd00991, cd00992, cd01208, cd01255, cd01258, cd01260, cd01777, cd01781, cd01782, cd03600, cd03877, cd04028, cd04031, cd04395, cd04438, cd04439, cd04440, cd04441, cd04442, cd05579, cd05609, cd05610, cd05663, cd05709, cd06158, cd06159, cd06160, cd06162, cd06163, cd06567, cd06886, cd07354, cd07358, cd07560, cd07561, cd07659, cd09244, cd09360, cd09361, cd09362, cd09363, cd09364, cd09365, cd09448, cd09450, cd09451, cd09452, cd09453, cd09454, cd09455, cd09456, cd09457, cd09458, cd09459, cd09460, cd09461, cd09462, cd09463, cd09464, cd09465, cd09517, cd09586, cd09587, cd11261, cd11624, cd11633, cd11634, cl00117, cl11968, pfam00595, pfam02377, pfam04495, pfam10506, pfam10600, pfam12812, pfam13180, smart00049, smart00295, KOG1421, KOG2221, KOG3834, KOG3938, cd00646, cd06665, cd06667, cd06668, cd06669, cd06670, cd06671, cd06672, cd06673, cd06674, cd06675, cd06676, cd06677, cd06678, cd06679, cd06680, cd06681, cd06682, cd06683, cd06684, cd06685, cd06686, cd06687, cd06689, cd06691, cd06699, cd06700, cd06701, cd06702, cd06703, cd06704, cd06718, cd06720, cd06722, cd06723, cd06724, cd06726, cd06727, cd06728, cd06729, cd06730, cd06731, cd06732, cd06733, cd06734, cd06735, cd06736, cd06737, cd06738, cd06739, cd06740, cd06741, cd06742, cd06743, cd06744, cd06746, cd06749, cd06751, cd06755, cd06764, cd06765, cd06766, cd06767, cd06774, cd06775, cd06776, cd06777, cd06778, cd06779, cd06780, cd06781, cd06782, cd06783, cd06784, cd06785, cd06786, cd06787, cd06789, cd06791, cd06793, cd06795, cd06796, cd06798, cd06799, cd06806, cd10737, cd10740, cd10741, cd10742, cd10743, cd10744, cd10745, cd10746, cd10817, cd10819, cd10823, cd10824, cd10825, cd10826, cd10827, cd10828, cd10829, cd10830, cd10831, cd10832, cd10833, cd10834, cd10835, cd10836, cd10837, cd10838, cd10839, cd10840.
ＳＨ３ドメイン: COG3103, COG4991, PRK10884, TIGR03900, TIGR04211, cd00174, cd00379, cd01210, cd01212, cd01221, cd01223, cd01224, cd01225, cd01238, cd01249, cd01776, cd03030, cd04130, cd04383, cd04388, cd05040, cd05795, cd05796, cd05797, cd06647, cd06868, cd06882, cd06887, cd06888, cd07285, cd07588, cd07589, cd07592, cd07593, cd07594, cd07595, cd07602, cd07604, cd07605, cd07607, cd07610, cd07611, cd07612, cd07613, cd07614, cd07615, cd07616, cd07617, cd07620, cd07634, cd07635, cd07636, cd07640, cd07641, cd07642, cd07644, cd07645, cd07646, cd07647, cd07649, cd07651, cd07653, cd07654, cd07655, cd07656, cd07658, cd07671, cd07672, cd07675, cd07677, cd07678, cd07679, cd07680, cd07681, cd07682, cd07683, cd07684, cd07767, cd08375, cd08400, cd08592, cd08627, cd08628, cd08681, cd08694, cd08695, cd08771, cd09334, cd09359, cd09447, cd09525, cd09532, cd09533, cd09540, cd09560, cd09583, cd09912, cd09926, cd09930, cd09932, cd09933, cd09934, cd09937, cd09940, cd09941, cd09942, cd09943, cd10338, cd10341, cd10347, cd10348, cd10353, cd10354, cd10358, cd10359, cd10360, cd10362, cd10363, cd10364, cd10365, cd10366, cd10367, cd10368, cd10369, cd10370, cd10371, cd10395, cd10396, cd10397, cd10398, cd10399, cd10405, cd10406, cd10407, cd10408, cd10409, cd10418, cd10419, cd11281, cd11524, cd11525, cd11549, cd11550, cd11551, cd11552, cd11564, cd11568, cd11569, cd11570, cd11571, cd11619, cd11628, cd11629, cd11631, cd11632, cd11635, cd11637, cd11696, cd11697, cd11704, cd11705, cd11706, cd11707, cd11708, cl00838.
ＳＨ２ドメイン: cd00173, cd00934, cd01208, cd01209, cd01210, cd01211, cd01212, cd01213, cd01214, cd01216, cd01217, cd01223, cd01231, cd01238, cd01267, cd01268, cd01269, cd01270, cd01271, cd01272, cd01273, cd01274, cd01787, cd02340, cd03587, cd03717, cd03734, cd03735, cd03736, cd03737, cd03738, cd03739, cd03740, cd03741, cd04388, cd05034, cd05041, cd05067, cd05068, cd05069, cd05070, cd05071, cd05072, cd05073, cd05084, cd05085, cd05115, cd05148, cd07657, cd07685, cd07686, cd08400, cd09074, cd09091, cd09100, cd09101, cd09350, cd09356, cd09436, cd09491, cd09522, cd09551, cd09918, cd09919, cd09920, cd09921, cd09923, cd09925, cd09926, cd09927, cd09928, cd09929, cd09930, cd09931, cd09932, cd09933, cd09934, cd09935, cd09937, cd09938, cd09939, cd09940, cd09941, cd09942, cd09943, cd09944, cd09945, cd09946, cd10337, cd10338, cd10339, cd10340, cd10341, cd10342, cd10343, cd10344, cd10345, cd10346, cd10347, cd10348, cd10349, cd10350, cd10351, cd10352, cd10353, cd10354, cd10355, cd10356, cd10357, cd10358, cd10359, cd10360, cd10361, cd10362, cd10363, cd10364, cd10365, cd10366, cd10367, cd10368, cd10369, cd10370, cd10371, cd10372, cd10373, cd10374, cd10375, cd10376, cd10377, cd10378, cd10379, cd10380, cd10381, cd10382, cd10383, cd10384, cd10385, cd10386, cd10387, cd10388, cd10389, cd10390, cd10391, cd10392, cd10393, cd10394, cd10395, cd10396, cd10397, cd10398, cd10399, cd10400, cd10401, cd10402, cd10403, cd10404, cd10405, cd10406, cd10407, cd10408, cd10409, cd10410, cd10411, cd10412, cd10413, cd10414, cd10415, cd10416, cd10417, cd10418, cd10419, cd10420, cd10421, cd10718, cl03749, cl15255, pfam00017, pfam01017, pfam02762, pfam02864, pfam02865, smart00252, smart00964, KOG0790.
ＷＷドメイン: cd00201, cd01216, cd01271, cd01272, cd04021, cd04033, cd04403, cd05127, cd05131, cd05327, cd07649, cd08680, cd08691, cd09091, cd09101, cd09809, cl00157, cl02610, pfam00397, pfam09429, pfam10176, pfam11669, pfam12237, smart00441, smart00498, KOG3209, KOG3294, KOG4334, KOG4812.
チオレドキシン: COG0492, COG0526, COG0694, COG1331, COG2143, COG3118, COG4759, COG4802, COG5494, PHA02125, PHA02278, PHA02683, PRK09381, PRK09437, PRK10262, PRK10996, PRK14018, PTZ00051, PTZ00052, PTZ00443, TIGR00411, TIGR00412, TIGR00424, TIGR00434, TIGR01068, TIGR01126, TIGR01130, TIGR01292, TIGR01438, TIGR02055, TIGR02057, TIGR02098, TIGR02180, TIGR02181, TIGR02182, TIGR02183, TIGR02194, TIGR02689, TIGR02691, TIGR02738, TIGR02739, TIGR02740, TIGR03090, TIGR03143, TIGR04019, cd00207, cd00299, cd00350, cd00729, cd01659, cd01713, cd02949, cd02953, cd02954, cd02957, cd02969, cd02970, cd02973, cd02980, cd02986, cd02987, cd02988, cd02989, cd03003, cd03004, cd03008, cd03009, cd03011, cd03014, cd03015, cd03016, cd03017, cd03018, cd03021, cd03029, cd03033, cd03034, cd03035, cd03036, cd03037, cd03177, cd03178, cd03180, cd03181, cd03182, cd03183, cd03184, cd03185, cd03186, cd03187, cd03188, cd03189, cd03191, cd03192, cd03194, cd03195, cd03196, cd03197, cd03198, cd03199, cd03202, cd03203, cd03204, cd03205, cd03206, cd03207, cd03208, cd03209, cd03210, cd03419, cd04416, cd10002, cd10291, cd10292, cd10293, cd10295, cd10296, cd10297, cd10298, cd10299, cd10300, cd10301, cd10302, cd10303, cd10424, cd10450, cd10457, cd11378, cd11683, cl00388, cl00484, cl01729, cl01977, cl07951, cl17011, pfam00085, pfam01323, pfam01507, pfam02941, pfam02943, pfam04592, pfam06201, pfam06491, pfam07884, pfam07912, pfam07955, pfam07976, pfam08534, pfam08806, pfam09338, pfam10865, pfam13098, pfam13192, pfam13462, pfam13743, pfam13848, pfam13899, pfam13905, smart00756, KOG0191, KOG0404, KOG0907, KOG0908, KOG0910, KOG0912, KOG0913, KOG0914, KOG1730, KOG2244, KOG2501, KOG2640, KOG3780, KOG4277, KOG4716, cd09226, cd09230, cd10546.
ロイシンジッパー: COG5221, TIGR03057, cd00193, cd01047, cd06868, cd07601, cd07631, cd07632, cd08687, cd08875, cd09213, cd09521, cd09529, cd09768, cd09803, cd09920, cd09929, cd09940, cd10405, cd10406, cd10407, cl02576, cl02577, cl04407, pfam00170, pfam01056, pfam01665, pfam02183, pfam02344, pfam02536, pfam03131, pfam04618, pfam04782, pfam05712, pfam06818, pfam07188, pfam07334, pfam07716, pfam07888, pfam07990, pfam08383, pfam08618, pfam09728, pfam09766, pfam10259, pfam10815, pfam11569, pfam11725, pfam12329, pfam12330, pfam12498, pfam12624, pfam13007, pfam13011, pfam13324, pfam13339, pfam14389, KOG3119, KOG3613, KOG4074, KOG4721, cd11387, cd11388, cd11394, cd11395, cd11396, cd11397, cd11398, cd11399, cd11400, cd11401, cd11402, cd11403, cd11404, cd11405, cd11406, cd11456, cd11457, cd11458.
植物ホメオドメイン: COG4118, COG5034, COG5141, PHA02825, TIGR00568, TIGR01550, TIGR01552, TIGR03325, TIGR03343, cd01397, cd01797, cd02957, cd02987, cd02988, cd02989, cd03479, cd04710, cd05656, cd05839, cd05841, cd07107, cd09583, cd10449, cd10455, cd11598, cl00960, cl09153, pfam00628, pfam02318, pfam02604, pfam02661, pfam03660, pfam04683, pfam04698, pfam06001, pfam08073, pfam08074, pfam10503, pfam12998, pfam13341, pfam13771, pfam13831, pfam13832, pfam13836, pfam13922, smart00064, smart00249, smart00576, smart00583, smart00744, KOG0825, KOG0954, KOG0955, KOG0956, KOG0957, KOG1245, KOG1512, KOG1632, KOG1633, KOG1634, KOG1844, KOG1973, KOG3612, KOG4299, KOG4323, cd11122, cd11672, cd11725, cd11726, cd11727, cd11728, cd11729.
Ｔｕｄｏｒドメイン: cd04508, cd08824, cd09972, cd09973, cd09974, cd09975, cd09976, cd09985, cd09986, cl02573, pfam00567, pfam05641, pfam07039, pfam08605, pfam09465, pfam11717, pfam13861, smart00333.
ヒドロホビン: cl02451, pfam01185, pfam06766, smart00075
付録Ｃ
付録Ｃ
ＭＳＡ配列ＩＤ： 全てのＩＤ値はＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の特異的配列を識別するＧＩ番号である。
グルコシダーゼフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ａ．Ｎｉｇｅｒ）
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ヒドロホビン１（Ｔ．Ｒｅｅｓｅｉ）
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ヒドロホビン２（Ｔ．Ｒｅｅｓｅｉ）
6647555, 42543467, 126009705, 1708378, 289623350, 114793912, 154125591, 70930993, 1903321, 154125583, 154125595, 154125585, 154125593, 154125605, 322712535, 154125577, 25091421, 24474507, 154125601, 189188090, 154125589, 311326527, 1709966, 322692547, 302412419, 154125581, 154125607, 154125597, 289617808, 115396538, 289524984, 148888519, 1706154, 154125579, 164425836, 39950019, 39956960, 46109898, 310801153, 171685270, 154125603, 37724083, 68271221, 302408401, 156062196, 310800037, 302884573, 189192290, 311319579, 169600565, 169606818, 312222048, 148888523, 148888521, 154125587, 11359587, 209570340, 154125571, 37723315, 156045944, 154314570, 154125599, 311317189, 4499830, 12584528, 154321730, 89113187, 40644368, 262916, 1705756, 189190926, 769895, 1870028, 2065353, 302423794
炭水化物結合モジュール２０（Ａ．Ｎｉｇｅｒ）
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セルロース結合ドメイン１（Ａ．Ｎｉｇｅｒ）
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１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（Ａ．Ｎｉｇｅｒ）
Q9UVS8, 145230535, 70992391, 119472134, 115397177, 119483864, 67516425, 255943977, 70991503, 119468034, 169768818, 121699984, 121710012, 255943215, 66828465, 330799424, 317030164, 156048578, 242806894, 154300584, 115390801, 367046256, 317137671, 212538337, 238489939, 67538012, 336271674, 367023008, 367040043, 340376113, 39977899, 299749838, 85108032, 330925604, 156060391, 169859460, 302679174, 171676762, 154312003, 169870197, 302926345, 302886202, 169859458, 336265714, 299749836, 154292161, 367018964, 156055188, 302698659, 171696102, 46107376, 116181754, 238586042, 189206069, 189193473, 330943733, 169601100, 169611094, 301107289, 301111394, 39973029, 336258396, 85083281, 331238484, 331238500, 171683762, 169615761, 116200349, 367034450, 39971383, 302420813, 302418426, 331224959, 336268485, 331214672, 164425749, 331224953, 331247805, 169785739, 331247587, 121709349, 119488801, 70982500, 115402419, 302404451, 85079837, 367046192, 367028314, 367046755, 212545631, 116202581, 116191879, 242771362, 116208318, 336266533, 115402429, 70984781, 302412114, 171682802, 119467101, 67525921, 336262129, 330924660, 302886555, 189198277, 121704228, 145606094, 145610386, 299737892, 367030645, 46127751, 149209515, 171677538, 238602691, 340386176, 169619477, 116201181, 367038203, 238586207, 302407315, 367029571, 169620119, 301104938, 171678917, 302423818, 85086175, 238572985, 116202583, 238586720, 116196720
グルコアミラーゼ（Ａ．Ｎｉｇｅｒ）
145235763, 115395828, 169786471, 238507489, 255939424, 242807399, 119497739, 70988699, 212538175, 67900830, 121711038, 258567690, 303311341, 119194357, 156043229, 154316440, 367041103, 67903834, 242807252, 212538201, 39973515, 85082688, 336261549, 315042896, 242816072, 121707616, 327295390, 302658226, 119500486, 296808129, 295669328, 367035092, 302419163, 146323129, 119473591, 302498961, 255946924, 121704551, 169770097, 238487534, 121710130, 367054602, 46123801, 302915477, 46139623, 302412212, 115399138, 171688444, 156032806, 169624056, 156048857, 170090057, 242219173, 242211440, 299743826, 302681819, 169858289, 302422574, 299743452, 302679676, 116199623, 336267930, 171688680, 154287478, 19112700, 71019961, 330935371, 189205727, 296411825, 154303741, 213405046, 134112031, 241952697, 58267622, 331227455, 321259119, 68468461, 50552328, 294654787, 255725910, 254573816, 260949837, 150866757, 6322092, 363750810, 70993930, 254581134, 50310489, 169621632, 255718387, 149245556, 146420560, 331241398, 366995731, 331217231, 302307259, 50288105, 367000992, 289166127, 270159037, 154295473, 54296458, 367011971, 148360961, 365991914, 52840667, 54293416, 217976594, 323139503, 70988703, 121704316, 119497741, 119494507, 115385717, 167516610, 255937169, 312115413, 212531193, 242772202, 115386862, 83594632, 336260435, 239820200, 67538586, 115433526, 85110737, 302413077, 119473373, 171677225, 255939426, 238567909, 121708778, 67525889, 242775754, 121711036, 238581698, 150377998, 189198073, 330929361, 302895994, 149211031, 145603948, 384532264, 154319704, 169620405, 116205651, 190894999, 156046276, 367020310, 238580439, 86361172, 336264324, 367043532, 171687999, 271964823, 169620403, 330929359, 189198075, 336319885, 159038460, 383777497, 302868164, 256375271, 115378360, 72161389, 159900578, 357397893, 145594536, 383453749, 145595211, 254386884, 218672888, 294633263, 39969197, 330469520, 162449038, 357413794, 163849057, 383780964, 357393797, 344999242, 239826234, 297545348, 333896467, 297191407, 304406864, 386775152, 386850563, 357389266, 256393823, 261404817, 315645249, 329926183, 239987198, 354585628, 365863877, 167037093, 329934952, 182439073, 229826603, 359144947, 302562176, 253576539, 386855990, 289767560, 242779935, 308178229, 257386281, 218512838, 329116760, 282897853, 167838576, 218246954, 330832361, 83717267, 257141453, 167576698, 187934195, 288904962, 167571945, 167564778, 187933512, 134280814, 254182851, 167908510, 226198761, 374263473, 254264465, 217422876, 167722069, 167826636, 254189583, 76819424, 126457000, 237509634, 167896714, 126442408, 262195698, 53721180, 256394988, 167741067, 67926159, 297559906, 118396703, 302770775, 304408279, 386848634, 302784796, 332796624, 34498945
エンド−１，４−β−キシラナーゼＡ（Ａ．Ｎｉｇｅｒ）
P55329, 145250044, 367042760, 71024535, 242813893, 212546261, 156050325, 154295033, 242823859, 212539976, 330945789, 156043978, 242783405, 85111872, 189209652, 121700014, 238499219, 67526311, 67904756, 330470096, 115400988, 255930981, 169768392, 367031002, 121712323, 70985723, 39946360, 169778667, 169619301, 119473557, 145228427, 119472529, 70985697, 367028490, 116197072, 116182892, 336274588, 171694656, 254784655, 302417816, 119473525, 145604200, 367026235, 145231168, 70992503, 383778518, 302913666, 72161617, 367038111, 302410217, 330935383, 169621658, 189205741, 302543104, 39973321, 335433931, 386692939, 156059212, 357392833, 367036034, 367022650, 171691240, 154317376, 296268426, 90022703, 116205351, 294631969, 46138969, 115397059, 302890317, 46115564, 344997987, 192360336, 164424328, 297561656, 257053030, 302562162, 386849796, 336259513, 336264235, 330920925, 376262546, 335433930, 291435712, 367020944, 336322095, 116197274, 238063641, 269955550, 171689822, 171694490, 367049055, 171676497, 336255156, 257053029, 254787353, 383639508, 256833593, 376262547, 238062951, 162449235, 289771981, 312134125, 254785772, 189208412, 326203691, 192361681, 367037849, 254785774, 169624039, 256394078, 222528140, 116179002, 386843786, 374296413, 169613044, 256389703, 312621203, 21220761, 296128113, 384267197, 385266567, 154687778, 367039271, 290961613, 162453827, 206900912, 16078944, 386758641, 385777892, 375364102, 125975452, 281419413, 374988367, 121712541, 21218669, 374295860, 116197429, 350266226, 332668898, 251798633, 291436761, 220928199, 384159266, 366165189, 376261142, 157692596, 384175660, 359413649, 296128114, 194016749, 321311533, 150017882, 254785775, 329937157, 217966677, 357415502, 302410219, 385777893, 171680488, 337747607, 281419643, 315647281, 256389691, 261407336, 304406274, 116192729, 329926487, 326204845, 160880242, 300783316, 302868167, 302875153, 308173721, 169855830, 256378278, 15613462, 386758494, 315505437, 350266074, 116182700, 256006201, 302697575, 384159259, 374296749, 116182878, 169610990, 374297593, 296330972, 119470734, 296128112, 162451141, 110638770, 308067745, 330934375, 310644137, 169862294, 376261465, 375307307, 145250953, 367032696, 374322407, 253575092, 39977381, 317054805, 169865921, 333381704, 374297363, 325678570, 350548573, 242805021, 374324231, 238577851, 169864346, 220929285, 39946222, 162452278, 302882833, 350548575, 376262105, 268611604, 268609134, 268609130, 169774265, 238497225, 268609042, 268608616, 317055471, 317055601, 317057375, 325678158, 268608532, 319788763, 268608317, 169784562, 385837982, 116512302, 261414773, 169615415, 212544063, 299752600, 169860458, 182413934, 169615206, 325105266, 226958393, 261416586, 375146969, 238599616, 371989333, 162457604
エンド−β−１，４−グルカナーゼ（Ａ．Ｎｉｇｅｒ）
O74706, 145238644, 119468571, 169767984, 255943333, 70991583, 70992389, 119472132, 121699982, 115395858, 121699069, 119480833, 71001210, 67538088, 238493509, 169783678, 255943971, 121698987, 46115906, 317036259, 119483862, 336275715, 255950118, 115397179, 367019458, 67521656, 302883943, 85111901, 171695776, 115390701, 302908015, 116181120, 367053273, 212539271, 336273138, 367028833, 145230537, 189196560, 367048951, 242760467, 169603756, 330932055, 171678147, 156064897, 154322599, 46109478, 296421810, 170096418, 302683907, 386335167, 83745929, 116205840, 207744735, 17548383, 300696706, 300693149, 299749631, 300702563, 357416133, 145607780, 384417119, 346722972, 325926188, 84621910, 188579118, 380511663, 294627410, 289662252, 325915671, 289666988, 78045589, 325923247, 325923245, 21240803, 381169609, 294664403, 21240804, 294627411, 381169612, 325926189, 384425724, 346722971, 381169614, 21240802, 21229505, 330994214, 21229504, 325915672, 78045587, 380511664, 384425725, 78045585, 325926190, 188989426, 289666987, 384417122, 294627412, 289662255, 21229506, 84621911, 384425727, 188579117, 357416134, 58579906, 290975791, 384417120, 347761993, 223937220, 325915673, 349687963, 116250003, 209551780, 294664402, 325923249, 241207180, 28199922, 190889902, 71902214, 222084492, 170741588, 386084008, 71275297, 218680146, 209542955, 162148320, 116199039, 294146631, 154302933, 340776996, 289666986, 289662257, 15839297, 367037791, 307943024, 156048212, 381199500, 325923248, 380511665, 86355887, 338741731, 170739375, 383115436, 262405906, 160884641, 222106954, 333902034, 218673552, 171693139, 340787915, 359782430, 296446720, 338738598, 218459561, 119898527, 328545532, 302890203, 254503590, 170739385, 262405903, 160884643, 336412775, 331248817, 242222651, 336404117, 146282835, 386021200, 331248479, 339494471, 359783239, 170739796, 383115438, 171059025, 359782296, 359780995, 359783823, 156065761, 242222649, 242219310, 242222661, 154304809, 331248449, 302698219, 87309129, 238591848, 192360145, 253997153, 359781958, 367046270, 367051735, 331242703, 359780874, 331247714, 87306701, 331236431, 339493468, 386020105, 331248827, 331248437, 146281839, 39975069, 381200657, 169613088, 169605819, 238599923, 333898791, 326317168, 120611588, 209548758, 380509900, 169605817, 302419691, 242219324, 298244393, 78045914, 346723273
β−グルコシダーゼ（Ａ．Ｎｉｇｅｒ）
145254958, 238504016, 169764719, 115389440, 70990956, 119496635, 121702635, 67527650, 255942539, 242784870, 303316856, 119187681, 261197503, 212527864, 258576755, 296825494, 315055173, 327307602, 302666070, 212530388, 367050018, 116208256, 154301968, 336260980, 85078070, 156051478, 367028272, 171685516, 169617407, 330926566, 302508591, 46124455, 302893124, 156034641, 154284704, 145605453, 154311096, 295670726, 171679605, 119193977, 169609274, 302417172, 367047965, 303311641, 302914058, 258575187, 367034417, 85068386, 242780701, 46105076, 116194179, 330930775, 189198678, 296814480, 242818857, 367041576, 169769170, 261205350, 238501614, 212526374, 70984414, 116203589, 255932921, 70991821, 212531509, 302504737, 119469897, 336260484, 315053577, 154274626, 258570545, 327309212, 119173146, 156055358, 154302511, 295673792, 303324127, 242773185, 145609584, 115400413, 241959388, 295666169, 327306810, 261196329, 121703850, 347976383, 315055927, 154277554, 68479078, 189202078, 302654271, 67526893, 50421785, 121699673, 330929564, 119467514, 115386532, 67540964, 156051510, 317035636, 154301988, 302420455, 70986816, 238503674, 242208680, 321253479, 260950625, 317138559, 170096919, 134109735, 150951335, 336269473, 58264776, 50546815, 255946129, 46115456, 149210995, 296417445, 171693633, 50556144, 367024397, 119483068, 296823412, 302889355, 255945487, 302693222, 242808274, 50551019, 299740917, 115400904, 169624889, 115401928, 67524741, 212537781, 154293970, 331211567, 156050519, 164659066, 367037257, 331211569, 367028608, 299740913, 302694815, 39960393, 189206824, 255949368, 336267553, 169762594, 238488403, 169595060, 171676730, 330931652, 85097939, 85092449, 302694805, 336276438, 145242946, 238495624, 212546891, 71019897, 71003854, 367046594, 189210447, 50546819, 70996706, 302917221, 116197188, 154310381, 169784538, 169778323, 119494233, 169781420, 330919066, 169620942, 154305615, 67539612, 302911826, 71023985, 70982937, 46121149, 46115090, 302407187, 145251001, 302888467, 169619579, 367040803, 145615456, 119484954, 119485921, 317034648, 189188436, 115388771, 171681682, 46116032, 156056032, 67900818, 302418194, 171693827, 115449679, 115388958, 39953092, 39942856, 317030082, 255931379, 238498582, 46138201, 299755823, 302407425, 169781768, 302413403, 145609483, 302696291, 145604448, 317145011, 46140089, 145601539, 255955195, 238485216, 170094666, 242806819, 302422028, 169620592, 367038827, 302880422, 299754143, 169601170, 317031154, 238497998, 302499477, 146421590, 302653948, 317030185, 317141715, 255723026, 115449497, 145613684, 164426783, 296419180, 242806823, 242806828, 119483900, 116201761, 336262709, 154317655, 116197937, 296419182, 156031297, 121711663, 154302838, 167522437
付録Ｄ
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Claims (140)

  1. 単離された栄養ポリペプチドを含む製剤であって、前記栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質中における全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高く、前記栄養ポリペプチドが、栄養的量で前記製剤中に存在し、前記製剤が、非食用生産物を実質的に含まない、製剤。
  2. 前記１又は複数の必須アミノ酸が、栄養的量で前記製剤中に存在する、請求項１に記載の製剤。
  3. 前記栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する全必須アミノ酸の割合が、前記参照分泌タンパク質中における全アミノ酸に対する全必須アミノ酸の割合の割合より高い、請求項１に記載の製剤。
  4. 前記栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する単一必須アミノ酸の割合が、前記参照分泌タンパク質中における全アミノ酸に対する単一必須アミノ酸の割合より高い、請求項１に記載の製剤。
  5. 前記栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する２つの必須アミノ酸の割合が、前記参照分泌タンパク質中における全アミノ酸に対する２つの必須アミノ酸の割合より高い、請求項１に記載の製剤。
  6. 前記参照分泌タンパク質が、分泌酵素ポリペプチドを含む、請求項１に記載の製剤。
  7. 前記単離された栄養ポリペプチドが、前記分泌酵素ポリペプチドの主要な酵素活性のレベルが低減したものであることができる、請求項６に記載の製剤。
  8. 前記単離された栄養ポリペプチドが、宿主細胞から実質的に精製されている、請求項１に記載の製剤。
  9. 前記栄養ポリペプチドの溶解度がｐＨ７で約１０ｇ／ｌより大きい、請求項１に記載の製剤。
  10. 前記栄養ポリペプチドの溶解度が、前記参照分泌タンパク質の溶解度より大きい、請求項１に記載の製剤。
  11. 前記栄養ポリペプチドの消化率が、６０分未満の人工胃液消化半減期を有する、請求項１に記載の製剤。
  12. 前記栄養ポリペプチドの消化率が、前記参照分泌タンパク質の消化率を超える、請求項１に記載の製剤。
  13. 前記栄養ポリペプチドの熱安定性が、前記参照分泌タンパク質の熱安定性より高い、請求項１に記載の製剤。
  14. 前記栄養ポリペプチドの計算溶媒和スコアが−２０以下である、請求項１に記載の製剤。
  15. 前記栄養ポリペプチドの計算凝集スコアが０．７５以下である、請求項１に記載の製剤。
  16. 前記栄養ポリペプチドの溶解度及び消化率が、前記参照分泌タンパク質の溶解度及び消化率を超える、請求項１に記載の製剤。
  17. 前記栄養ポリペプチドの、公知のアレルゲンに対する相同性が約５０％未満である、請求項１に記載の製剤。
  18. 前記参照分泌タンパク質が、（ｉ）ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｑ４ＷＢＷ４、Ｑ９９０３４、Ａ１ＤＢＰ９、Ｑ８ＮＪＰ６、Ａ１ＣＵ４４、Ｂ０Ｙ８Ｋ２、Ｑ４ＷＭ０８、Ｑ０ＣＭＴ２、Ｑ８ＮＫ０２、Ａ１ＤＮＬ０、Ａ１ＣＣＮ４、Ｂ０ＸＷＬ３、Ｑ４ＷＦＫ４、Ａ２ＱＹＲ９、Ｑ０ＣＦＰ１、Ｑ５Ｂ２Ｅ８、Ａ１ＤＪＱ７、Ａ１Ｃ４Ｈ２、Ｂ０Ｙ９Ｇ４、Ｂ８ＭＸＪ７、Ｑ４ＷＢＵ０、Ｑ９６ＷＱ９、Ａ２Ｒ５Ｎ０、Ｑ２ＵＳ８３、Ｑ０ＣＥＵ４、Ｑ５ＢＣＸ８、Ａ１ＤＢＳ６、Ｑ９ＨＥ１８、Ｏ１４４０５、Ｐ６２６９４、Ｑ０６８８６、Ｐ１３８６０、Ｑ９Ｐ８Ｐ３、Ｐ６２６９５、Ｐ０７９８７、Ａ１Ｃ８Ｕ０、Ｂ０Ｙ９Ｅ７、Ｂ８ＮＩＶ９、Ｑ４ＷＢＳ１、Ｑ２Ｕ２Ｉ３、Ｑ５ＡＲ０４、Ａ１ＤＢＶ１、Ｂ０ＹＥＫ２、Ｂ８Ｎ７Ｚ０、Ａ４ＤＡ７０、Ａ２Ｒ２Ｓ６、Ｑ２ＵＩ８７、Ｑ０ＣＶＸ４、Ｑ５ＡＸ２８、Ａ１Ｄ９Ｓ３、Ａ１ＣＣ１２、Ｂ０Ｙ２Ｋ１、Ｑ４ＷＷ４５、Ｑ５ＡＱＺ４、Ｑ９９０２４、Ｐ２９０２６、Ｐ２９０２７、Ｐ６９３２８、Ｐ６９３２７、Ｐ３６９１４、Ｐ２３１７６、Ｐ２２８３２、Ａ２ＱＨＥ１、Ａ１ＣＲ８５、 Ｂ０ＸＰＥ１、Ｂ８ＮＲＸ２、Ｑ４ＷＪＪ３、Ｐ８７０７６、Ａ２ＲＡＬ４、Ｑ２ＵＵＤ６、Ｄ０ＶＫＦ５、Ｑ０ＣＴＤ７、Ｑ５Ｂ５Ｓ８、Ａ１Ｄ４５１、Ｂ８ＮＪＦ４、Ａ２ＱＰＫ４、Ｑ２ＵＮＲ０、Ｑ５ＡＵＷ５、Ｂ０Ｙ７Ｑ８、Ｂ８ＮＰ６５、Ｑ４ＷＭＵ３、Ｑ２ＵＮ１２、Ｑ０ＣＩ６７、Ｑ５Ｂ６Ｃ６、Ａ１ＤＭＲ８、Ｂ８ＮＭＲ５、Ｑ２Ｕ３２５、Ｑ０ＣＵＣ１、Ｑ５Ｂ０Ｆ４、Ａ１ＤＣ１６、Ａ１ＣＵＲ８、Ｂ０ＸＭ９４、Ｂ８ＮＰＬ７、Ｑ４ＷＬ７９、Ｑ２Ｕ９Ｍ７、Ｑ５Ｂ６Ｃ７、Ａ１ＤＰＧ０、Ａ１ＣＡ５１、Ｂ０Ｙ３Ｍ６、Ｂ８ＮＤＥ２、Ｑ４ＷＵ４９、Ａ２Ｒ９８９、Ｑ２Ｕ８Ｙ５、Ｑ０ＣＡＦ５、Ｑ５ＢＢ５３、Ａ１ＤＦＡ８、Ｂ０Ｙ８Ｍ８、Ｑ４ＷＬＹ１、Ｑ５ＡＶ１５、Ａ１ＤＮＮ８、Ｑ５ＢＡ１８、Ｂ０ＹＢ６５、Ｑ４ＷＧＴ３、Ｑ０ＣＥＦ３、Ｑ５Ｂ９Ｆ２、Ａ１ＤＣＶ５、Ｂ０ＸＰＢ８、Ｂ８Ｎ５Ｓ６、Ｑ４ＷＲ６２、Ａ５ＡＢＦ５、Ｑ２ＵＤＫ７、Ｑ０Ｃ７Ｌ４、Ｑ５ＡＷＤ４、Ａ１Ｄ１２２、Ｑ５Ｂ６８１、Ｑ５ＢＧ５１、Ａ１ＣＣＬ９、Ｑ０ＣＢ８２、Ｑ５ＡＴＨ９、Ｑ４ＡＥＧ８、Ｂ０ＸＰ７１、Ｂ８ＭＹＶ０、Ｑ４ＷＲＢ０、Ａ２ＱＡ２７、Ｏ０００８９、Ｑ２ＵＲ３８、Ｑ０ＣＭＨ８、Ｑ５ＢＡＳ１、Ｐ２９０２６、Ｐ２９０２７、Ｐ４８８２７、Ａ１ＣＩＡ７、Ｂ０Ｙ７０８、Ｐ３５２１１、Ｂ８Ｎ１０６、Ｐ２８２９６、Ｐ１２５４７、Ｑ００２０８、Ａ１ＣＷＦ３、Ｐ５２７５０、Ｐ５２７５４、Ｐ７９０７３、Ｐ５２７５５、Ｐ４１７４６、又はＰ２８３４６によって識別されるタンパク質から選択されるタンパク質、（ｉｉ）ＳＥＱＩＤ−４５００１、（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤ−４５０２９、又は（ｉｖ）長さが少なくとも５０アミノ酸の（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の断片である、請求項１に記載の製剤。
  19. 製剤１ｋｇ当たり少なくとも１００ｇの濃度で少なくとも１．０ｇの栄養ポリペプチドを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製剤。
  20. 前記製剤が、約５００ｍｌを超えない液体、半液体、若しくはゲルとして又は約２００ｇを超えない質量の固体若しくは半固体として存在する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製剤。
  21. 前記栄養ポリペプチドが組換え型生物中で生産される、請求項１に記載の製剤。
  22. 前記栄養ポリペプチドが、前記栄養ポリペプチドをコードする組換え型核酸配列を含む単細胞生物により生産される、請求項１に記載の製剤。
  23. 前記製剤が、タンパク質の基準１日摂取値の少なくとも約２％の栄養的利益を提供するか、ヒト対象に消費された時に満腹感を与えるのに充分な量で存在する、請求項１に記載の製剤。
  24. 前記製剤が、１又は複数の必須アミノ酸の基準１日摂取値の少なくとも約２％の栄養的利益を提供する、請求項１に記載の製剤。
  25. 前記製剤が、全必須アミノ酸の基準１日摂取値の少なくとも約２％の栄養的利益を提供する、請求項１に記載の製剤。
  26. 前記製剤が、少なくとも１０グラムの栄養ポリペプチドを提供する、請求項１に記載の製剤。
  27. 経腸投与用に製剤化されている、請求項１に記載の製剤。
  28. （ｉ）前記栄養ポリペプチドが、前記栄養ポリペプチド又は前記参照分泌タンパク質の全長にわたり、前記参照分泌タンパク質に対して少なくとも約９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の全体的配列同一性を有するか、（ｉｉ）前記栄養ポリペプチドが、前記参照分泌タンパク質のオルソログを含み、前記オルソログが、前記栄養ポリペプチド又は前記参照分泌タンパク質の全長にわたり、前記参照分泌タンパク質に対して少なくとも約７０％の全体的配列同一性を有する、請求項１に記載の製剤。
  29. 少なくとも約１グラムの請求項１に記載の製剤を含む食品。
  30. 前記製剤が、１００ｇ当たり、タンパク質の基準１日摂取値の少なくとも約２％以上の栄養的利益を提供する、請求項１に記載の製剤。
  31. ヒト対象に投与された時に、前記栄養ポリペプチドの有効量が、前記参照分泌タンパク質の有効量より少ない、請求項１に記載の製剤。
  32. 界面活性剤、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、非食用のポリ酸若しくはポリオール、脂肪アルコール、アルキルベンジルスルホナート、アルキルグルコシド、又はメチルパラベンを実質的に含まない、請求項１に記載の製剤。
  33. 味覚物質、ビタミン、ミネラル、又はその組合せを更に含む、請求項１に記載の製剤。
  34. 香味剤又は非栄養ポリオールを更に含む、請求項１に記載の製剤。
  35. 栄養炭水化物及び／又は栄養脂質を更に含む、請求項１に記載の製剤。
  36. 単離された栄養ポリペプチドをコードする組換え型核酸配列を含む組換え型単細胞生物であって、前記栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質における全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高い、組換え型単細胞生物。
  37. 前記単細胞生物から栄養ポリペプチドが分泌される、請求項３６に記載の組換え型単細胞生物。
  38. 栄養生産物を製剤化する方法であって、有効量の単離された栄養ポリペプチドを含む組成物を用意するステップであって、前記栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質における全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高く、前記栄養ポリペプチドが、前記組成物１グラム当たり少なくとも１ｍｇの栄養ポリペプチドの濃度で前記組成物中に存在するステップ及び前記組成物を少なくとも１つの食品成分と組み合わせることにより栄養生産物を製剤化するステップを含む、方法。
  39. 前記食品成分が、香味剤、味覚物質、農業由来食品、ビタミン、ミネラル、栄養炭水化物、栄養脂質、結合剤、充填剤、又はその組合せを含み、前記栄養生産物が、食用であり、前記栄養生産物が、少なくとも１．０ｇの栄養ポリペプチドを栄養生産物１ｋｇ当たり少なくとも１００ｇの濃度で含み、前記栄養生産物が、約５００ｍｌを超えない体積で液体、半液体、若しくはゲルとして又は約２００ｇを超えない質量で固体若しくは半固体として存在する、請求項３８に記載の方法。
  40. 栄養組成物の利益を受け得るヒト対象に投与するための栄養組成物を選択する方法であって、前記対象の最小必須アミノ酸栄養必要量を特定すること；前記最小必須アミノ酸栄養必要量を満たすのに必要な必須アミノ酸含有量スコアを計算すること；及び有効量の栄養ポリペプチドを含む栄養組成物を用意することを含み、前記栄養組成物が、少なくとも前記必要な必須アミノ酸含有量スコアを有する、方法。
  41. 栄養組成物の利益を受け得るヒト対象に投与するための栄養組成物を選択する方法であって、前記対象の最大必須アミノ酸栄養必要量を特定すること；前記最大必須アミノ酸栄養必要量を超えないために必要な必須アミノ酸含有量スコアを計算すること；及び有効量の栄養ポリペプチドを含む栄養組成物を用意することを含み、前記栄養組成物が前記必要な必須アミノ酸含有量スコアを超えることがない、方法。
  42. 処置を必要とするヒト対象において、タンパク質栄養不良を特徴とする又はそれにより悪化する疾患、障害、又は状態を処置する方法であって、そのような疾患、障害、又は状態を処置するのに充分な量で栄養製剤を前記ヒト対象に投与するステップを含み、前記栄養製剤が、栄養ポリペプチド及び農業由来食品を含み、前記栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質における全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高い、方法。
  43. 前記ヒト対象が高齢対象である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ヒト対象が１８歳未満の子供である、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記ヒト対象が、妊娠している対象又は授乳中の女性対象である、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記ヒト対象が、１８歳から約６５歳の成人である、請求項４２に記載の方法。
  47. 前記ヒト対象が、肥満、糖尿病、又は循環器疾患に苦しむ又はそれらを発症するリスクがある成人である、請求項４２に記載の方法。
  48. ヒト対象の栄養状態を改善する方法であって、農業由来食品及び単離された栄養ポリペプチドを含む有効量の栄養製剤を前記対象に投与することを含み、前記栄養ポリペプチドの全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質における全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高い、方法。
  49. 参照分泌タンパク質のアミノ酸配列と比べて変化したアミノ酸配列を含む少なくとも２０アミノ酸の配列を含む改変タンパク質であって、前記改変タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合が、前記参照分泌タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合より高い、改変タンパク質。
  50. 前記参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の少なくとも１つの必須アミノ酸残基置換を含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  51. （ｉ）前記参照分泌タンパク質中の非アルギニン（Ａｒｇ）又は非グルタミン（Ｇｌｕ）アミノ酸残基の少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）又はグルタミン（Ｇｌｕ）アミノ酸残基置換、（ｉｉ）前記参照分泌タンパク質中の非フェニルアラニン（Ｐｈｅ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＰｈｅアミノ酸残基置換、又は（ｉｉｉ）その組合せを含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  52. （ｉ）前記参照分泌タンパク質中の非ロイシン（Ｌｅｕ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＬｅｕアミノ酸残基置換、（ｉｉ）前記参照分泌タンパク質中の非イソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＩｌｅアミノ酸残基置換、又は（ｉｉｉ）その組合せを含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  53. 前記参照分泌タンパク質中の非バリン（Ｖａｌ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＶａｌアミノ酸残基置換を含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  54. 前記参照分泌タンパク質中の非スレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＴｈｒアミノ酸残基置換を含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  55. 前記参照分泌タンパク質中の非リジン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＬｙｓアミノ酸残基置換を含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  56. 前記参照分泌タンパク質中の非メチオニン（Ｍｅｔ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＭｅｔアミノ酸残基置換を含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  57. 前記参照分泌タンパク質中の非ヒスチジン（Ｈｉｓ）アミノ酸残基の少なくとも１つのＨｉｓアミノ酸残基置換を含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  58. 前記アミノ酸残基置換が、アミノ酸１個当たりの位置エントロピーが少なくとも１．５のアミノ酸位置である、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  59. 前記参照分泌タンパク質と前記改変タンパク質との間の全フォールディング自由エネルギーの差が０．５以下である、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  60. 位置エントロピーが少なくとも１．５の位置で参照分泌タンパク質中の非必須アミノ酸残基の少なくとも１つの必須アミノ酸残基置換を含む、改変タンパク質。
  61. 前記参照分泌タンパク質が天然タンパク質である、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  62. 前記改変タンパク質が、適合微生物中で発現された時にそれから分泌される、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  63. 前記微生物が、前記参照分泌タンパク質を天然に生じる微生物と同じ属である、請求項６２に記載の改変タンパク質。
  64. 前記微生物が従属栄養生物である、請求項６２に記載の改変タンパク質。
  65. 前記微生物が光合成微生物である、請求項６２に記載の改変タンパク質。
  66. 前記光合成微生物がシアノバクテリアである、請求項６５に記載の改変タンパク質。
  67. 参照分泌タンパク質のアミノ酸配列と比べて変化したアミノ酸配列を含む少なくとも２０アミノ酸の配列を含む単離された改変タンパク質であって、前記改変タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合が、前記参照分泌タンパク質中に存在する全アミノ酸に対する必須アミノ酸の割合より高い、単離された改変タンパク質。
  68. 栄養的量の請求項６７に記載の単離された改変タンパク質を含む製剤。
  69. 前記製剤が非食用生産物を実質的に含まない、請求項６８に記載の製剤。
  70. 前記改変タンパク質のアミノ酸配列が、前記参照分泌タンパク質と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％相同である、請求項６８に記載の製剤。
  71. 前記改変タンパク質のアミノ酸配列が、前記参照分泌タンパク質と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一である、請求項６８に記載の製剤。
  72. 前記参照分泌タンパク質中の少なくとも２個の非必須アミノ酸残基が必須アミノ酸残基で置換されている、請求項６８に記載の製剤。
  73. 前記参照分泌タンパク質中の約５〜約５０個の非必須アミノ酸残基が必須アミノ酸残基で置換されている、請求項６８に記載の製剤。
  74. 前記参照分泌タンパク質中の１又は複数の非必須アミノ酸残基の少なくとも約１％が１又は複数の必須アミノ酸残基で置換されている、請求項６８に記載の製剤。
  75. 前記参照分泌タンパク質中の１又は複数の非必須アミノ酸残基の少なくとも約１．５％が１又は複数の必須アミノ酸残基で置換されている、請求項６８に記載の製剤。
  76. 前記参照分泌タンパク質中の１又は複数の非必須アミノ酸残基の少なくとも約２％が１又は複数の必須アミノ酸残基で置換されている、請求項６８に記載の製剤。
  77. 前記参照分泌タンパク質中の１又は複数の非必須アミノ酸残基の少なくとも約３％が１又は複数の必須アミノ酸残基で置換されている、請求項６８に記載の製剤。
  78. 前記参照分泌タンパク質中の１又は複数の非必須アミノ酸残基の少なくとも約４％が１又は複数の必須アミノ酸残基で置換されている、請求項６８に記載の製剤。
  79. 前記参照分泌タンパク質が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、マイセリオフソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）から選択される属の生物に対して天然のものである、請求項６８に記載の製剤。
  80. 前記参照分泌タンパク質が、エスチェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の種、及びシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の種から選択される微生物に対して天然のものである、請求項６８に記載の製剤。
  81. 前記参照分泌タンパク質が、付録Ａに記載のタンパク質から選択されるタンパク質である、請求項６８に記載の製剤。
  82. 前記参照分泌タンパク質が、配列番号１〜９から選択される、請求項６８に記載の製剤。
  83. 前記参照分泌タンパク質が、セルロース結合ドメイン、炭水化物結合モジュール、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、及びヒドロホビンから選択されるフォールドのコンセンサス配列を含む、請求項６８に記載の製剤。
  84. 前記参照分泌タンパク質が、ＵｎｉＰｒｏｔ受け入れ番号Ｑ４ＷＢＷ４、Ｑ９９０３４、Ａ１ＤＢＰ９、Ｑ８ＮＪＰ６、Ａ１ＣＵ４４、Ｂ０Ｙ８Ｋ２、Ｑ４ＷＭ０８、Ｑ０ＣＭＴ２、Ｑ８ＮＫ０２、Ａ１ＤＮＬ０、Ａ１ＣＣＮ４、Ｂ０ＸＷＬ３、Ｑ４ＷＦＫ４、Ａ２ＱＹＲ９、Ｑ０ＣＦＰ１、Ｑ５Ｂ２Ｅ８、Ａ１ＤＪＱ７、Ａ１Ｃ４Ｈ２、Ｂ０Ｙ９Ｇ４、Ｂ８ＭＸＪ７、Ｑ４ＷＢＵ０、Ｑ９６ＷＱ９、Ａ２Ｒ５Ｎ０、Ｑ２ＵＳ８３、Ｑ０ＣＥＵ４、Ｑ５ＢＣＸ８、Ａ１ＤＢＳ６、Ｑ９ＨＥ１８、Ｏ１４４０５、Ｐ６２６９４、Ｑ０６８８６、Ｐ１３８６０、Ｑ９Ｐ８Ｐ３、Ｐ６２６９５、Ｐ０７９８７、Ａ１Ｃ８Ｕ０、Ｂ０Ｙ９Ｅ７、Ｂ８ＮＩＶ９、Ｑ４ＷＢＳ１、Ｑ２Ｕ２Ｉ３、Ｑ５ＡＲ０４、Ａ１ＤＢＶ１、Ｂ０ＹＥＫ２、Ｂ８Ｎ７Ｚ０、Ａ４ＤＡ７０、Ａ２Ｒ２Ｓ６、Ｑ２ＵＩ８７、Ｑ０ＣＶＸ４、Ｑ５ＡＸ２８、Ａ１Ｄ９Ｓ３、Ａ１ＣＣ１２、Ｂ０Ｙ２Ｋ１、Ｑ４ＷＷ４５、Ｑ５ＡＱＺ４、Ｑ９９０２４、Ｐ２９０２６、Ｐ２９０２７、Ｐ６９３２８、Ｐ６９３２７、Ｐ３６９１４、Ｐ２３１７６、Ｐ２２８３２、Ａ２ＱＨＥ１、Ａ１ＣＲ８５、 Ｂ０ＸＰＥ１、Ｂ８ＮＲＸ２、Ｑ４ＷＪＪ３ 、Ｐ８７０７６、Ａ２ＲＡＬ４、Ｑ２ＵＵＤ６、Ｄ０ＶＫＦ５、Ｑ０ＣＴＤ７、Ｑ５Ｂ５Ｓ８、Ａ１Ｄ４５１、Ｂ８ＮＪＦ４、Ａ２ＱＰＫ４、Ｑ２ＵＮＲ０、Ｑ５ＡＵＷ５、Ｂ０Ｙ７Ｑ８、Ｂ８ＮＰ６５、Ｑ４ＷＭＵ３、Ｑ２ＵＮ１２、Ｑ０ＣＩ６７、Ｑ５Ｂ６Ｃ６、Ａ１ＤＭＲ８、Ｂ８ＮＭＲ５、Ｑ２Ｕ３２５、Ｑ０ＣＵＣ１、Ｑ５Ｂ０Ｆ４、Ａ１ＤＣ１６、Ａ１ＣＵＲ８、Ｂ０ＸＭ９４、Ｂ８ＮＰＬ７、Ｑ４ＷＬ７９、Ｑ２Ｕ９Ｍ７、Ｑ５Ｂ６Ｃ７、Ａ１ＤＰＧ０、Ａ１ＣＡ５１、Ｂ０Ｙ３Ｍ６、Ｂ８ＮＤＥ２、Ｑ４ＷＵ４９、Ａ２Ｒ９８９、Ｑ２Ｕ８Ｙ５、Ｑ０ＣＡＦ５、Ｑ５ＢＢ５３、Ａ１ＤＦＡ８、Ｂ０Ｙ８Ｍ８、Ｑ４ＷＬＹ１、Ｑ５ＡＶ１５、Ａ１ＤＮＮ８、Ｑ５ＢＡ１８、Ｂ０ＹＢ６５、Ｑ４ＷＧＴ３、Ｑ０ＣＥＦ３、Ｑ５Ｂ９Ｆ２、Ａ１ＤＣＶ５、Ｂ０ＸＰＢ８、Ｂ８Ｎ５Ｓ６、Ｑ４ＷＲ６２、Ａ５ＡＢＦ５、Ｑ２ＵＤＫ７、Ｑ０Ｃ７Ｌ４、Ｑ５ＡＷＤ４、Ａ１Ｄ１２２、Ｑ５Ｂ６８１、Ｑ５ＢＧ５１、Ａ１ＣＣＬ９、Ｑ０ＣＢ８２、Ｑ５ＡＴＨ９、Ｑ４ＡＥＧ８、Ｂ０ＸＰ７１、Ｂ８ＭＹＶ０、Ｑ４ＷＲＢ０、Ａ２ＱＡ２７、Ｏ０００８９、Ｑ２ＵＲ３８、Ｑ０ＣＭＨ８、Ｑ５ＢＡＳ１、Ｐ２９０２６、Ｐ２９０２７、Ｐ４８８２７、Ａ１ＣＩＡ７、Ｂ０Ｙ７０８、Ｐ３５２１１、Ｂ８Ｎ１０６、Ｐ２８２９６、Ｐ１２５４７、Ｑ００２０８、Ａ１ＣＷＦ３、Ｐ５２７５０、Ｐ５２７５４、Ｐ７９０７３、Ｐ５２７５５、Ｐ４１７４６、及びＰ２８３４６によって識別されるタンパク質から選択されるタンパク質である、請求項６８に記載の製剤。
  85. 前記改変タンパク質が、アフィニティー精製のためのポリペプチドタグを更に含む、請求項４９に記載の改変タンパク質。
  86. 前記アフィニティー精製のためのタグが、ポリヒスチジンタグを含む、請求項８５に記載の改変タンパク質。
  87. 前記改変タンパク質のアミノ酸１個当たりの正味の絶対電荷が、ｐＨ７で少なくとも０．０５である、請求項６８に記載の製剤。
  88. 前記改変タンパク質のアミノ酸１個当たりの正味の絶対電荷が、ｐＨ７で少なくとも０．１０である、請求項６８に記載の製剤。
  89. 前記改変タンパク質のアミノ酸１個当たりの正味の絶対電荷が、ｐＨ７で少なくとも０．１５である、請求項６８に記載の製剤。
  90. 前記改変タンパク質のアミノ酸１個当たりの正味の絶対電荷が、ｐＨ７で少なくとも０．２０である、請求項６８に記載の製剤。
  91. 前記改変タンパク質のアミノ酸１個当たりの正味の絶対電荷が、ｐＨ７で少なくとも０．２５である、請求項６８に記載の製剤。
  92. 前記改変タンパク質が、ｐＨ７で正味正の電荷を有する、請求項６８に記載の製剤。
  93. 前記改変タンパク質が、ｐＨ７で正味負の電荷を有する、請求項６８に記載の製剤。
  94. 前記改変タンパク質が消化可能である、請求項６８に記載の製剤。
  95. 前記改変タンパク質が、ペプシン認識部位、トリプシン認識部位、及びキモトリプシン認識部位から選択されるプロテアーゼ認識部位を含むか、前記改変タンパク質のペプシン認識部位、トリプシン認識部位、及びキモトリプシン認識部位から選択されるプロテアーゼ認識部位の割合が参照分泌タンパク質より高い、請求項６８に記載の製剤。
  96. 請求項４９に記載の改変タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸。
  97. 改変タンパク質をコードする前記核酸配列に機能可能に連結した発現調節配列を更に含む、請求項９６に記載の単離された核酸。
  98. 請求項４９に記載の改変タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター。
  99. 改変タンパク質をコードする前記核酸配列に機能可能に連結した発現調節配列を更に含む、請求項９８に記載のベクター。
  100. （ａ）請求項９６及び９７のいずれか一項に記載の核酸並びに（ｂ）請求項９８及び９９のいずれか一項に記載のベクター、の少なくとも１つを含む、組換え型微生物。
  101. 請求項１００に記載の組換え型微生物を前記組換え型微生物による改変タンパク質の生産に充分な条件下で培養することを含む、改変タンパク質の作製方法。
  102. 前記培養から前記改変タンパク質を単離することを更に含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記改変タンパク質が可溶性である、請求項１０１に記載の方法。
  104. 前記改変タンパク質が、前記培養組換え微生物によって分泌され、前記改変タンパク質が、前記培養培地から単離される、請求項１０１に記載の方法。
  105. 請求項４９に記載の改変タンパク質及び少なくとも１つの第２の成分を含む、栄養組成物。
  106. 前記第２の成分が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、遊離アミノ酸、炭水化物、脂肪、ミネラル又はミネラル源、ビタミン、及び賦形剤から選択される、請求項１０５に記載の栄養組成物。
  107. 前記第２の成分がタンパク質である、請求項１０５に記載の栄養組成物。
  108. 前記タンパク質が改変タンパク質である、請求項１０７に記載の栄養組成物。
  109. 前記第２の成分が、必須アミノ酸から選択される１又は複数の遊離アミノ酸である、請求項１０５に記載の栄養組成物。
  110. 前記第２の成分が、分岐鎖アミノ酸から選択される１又は複数の遊離アミノ酸である、請求項１０５に記載の栄養組成物。
  111. 前記第２の成分がＬｅｕである、請求項１１０に記載の栄養組成物。
  112. 前記第２の成分が賦形剤である、請求項１０５に記載の栄養組成物。
  113. 前記賦形剤が、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、分散助剤、崩壊剤、香味剤、甘味剤、及び着色剤からなる群から選択される、請求項１１２に記載の栄養組成物。
  114. 前記栄養組成物が、液体溶液、スラリー、懸濁液、ゲル、ペースト、粉末、又は固体として製剤化される、請求項１０５に記載の栄養組成物。
  115. 栄養組成物の作製方法であって、請求項４９に記載の改変タンパク質を用意すること及び前記改変タンパク質を第２の成分と混合することを含む、方法。
  116. 前記第２の成分が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、遊離アミノ酸、炭水化物、脂肪、ミネラル又はミネラル源、ビタミン、及び賦形剤から選択される、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記第２の成分がタンパク質である、請求項１１５に記載の方法。
  118. 前記タンパク質が改変タンパク質である、請求項１１７に記載の方法。
  119. 対象における筋肉量、筋力、及び機能的パフォーマンスを維持又は増強する方法であって、充分な量の請求項４９に記載の改変タンパク質、請求項１０５に記載の栄養組成物、又は請求項１１５に記載の方法により作製された栄養組成物を前記対象に与えることを含む、方法。
  120. 対象において望ましい肥満度指数を維持又は達成する方法であり、充分な量の請求項４９に記載の改変タンパク質、請求項１０５に記載の栄養組成物、又は請求項１１５に記載の方法により作製された栄養組成物を前記対象に与えることを含む、方法。
  121. 前記対象が高齢者、医学的危篤状態、又はタンパク質エネルギー栄養不良に苦しんでいる、請求項１１９又は１２０に記載の方法。
  122. 請求項４９に記載の改変タンパク質、請求項１０５に記載の栄養組成物、又は請求項１１５に記載の方法により作製された栄養組成物が、運動の実行とともに前記対象により消費される、請求項１１９又は１２０に記載の方法。
  123. タンパク質エネルギー栄養不良である対象にタンパク質を与える方法であって、充分な量の請求項４９に記載の改変タンパク質、請求項１０５に記載の栄養組成物、又は請求項１１５に記載の方法により作製された栄養組成物を前記対象に与えることを含む、方法。
  124. 請求項４９に記載の改変タンパク質、請求項１０５に記載の栄養組成物、又は請求項１１５に記載の方法により作製された栄養組成物が、経口、経腸、又は非経口経路で前記対象によって消費される、請求項１２３に記載の方法。
  125. 改変タンパク質の作製方法であって、
    （ａ）参照分泌タンパク質を用意すること、（ｂ）前記タンパク質の栄養含有量を向上させるための変異のための、前記参照分泌タンパク質のアミノ酸位置のセットを特定すること、及び（ｃ）標的アミノ酸置換を含む改変タンパク質を合成すること、を含む方法。
  126. 前記アミノ酸置換が、（ｉ）複数の望ましいアミノ酸をコードできる又は（ｉｉ）１又は複数の望ましくないアミノ酸をコードしないことができる縮重コドンによってコードされる、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記複数の望ましいアミノ酸が、１又は複数のアミノ酸について濃縮されている、請求項１２６に記載の方法。
  128. （ｄ）前記アミノ酸置換を含む改変タンパク質を選択することを更に含む、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記参照分泌タンパク質が、（ｉ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、及びＲｈｉｚｏｐｕｓから選択される属のメンバーに対して天然のもの、（ｉｉ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの種、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ の種、及びＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓの種から選択される微生物に対して天然のもの、又は（ｉｉｉ）付録Ａに記載のタンパク質である、請求項１２５に記載の方法。
  130. 前記参照分泌タンパク質が、セルロース結合ドメイン、炭水化物結合モジュール、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、及びヒドロホビンから選択されるフォールドのコンセンサス配列を含む、請求項１２５に記載の方法。
  131. 前記タンパク質の栄養含有量を向上させるための変異のための参照分泌タンパク質のアミノ酸位置のセットを特定することが、前記参照分泌タンパク質の複数のアミノ酸位置のアミノ酸尤度（ＡＡＬｉｋｅ）、アミノ酸タイプ尤度（ＡＡＴＬｉｋｅ）、位置エントロピー（Ｓｐｏｓ）、アミノ酸タイプ位置エントロピー（ＳＡＡＴｐｏｓ）、相対的なフォールディングの自由エネルギー（ΔΔＧｆｏｌｄ）、及び二次構造アイデンティティー（ＬｏｏｐＩＤ）から選択される少なくとも１つのパラメーターを決定することを含む、請求項１２５に記載の方法。
  132. 前記参照分泌タンパク質の複数のアミノ酸位置の（Ａ）ＡＡｌｉｋｅ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｂ）ＡＡＴｌｉｋｅ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｃ）ＡＡｌｉｋｅ、ＡＡＴｌｉｋｅ、及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｄ）Ｓｐｏｓ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｅ）ＳＡＡＴｐｏｓ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｆ）ＬｏｏｐＩＤ及びΔΔＧｆｏｌｄ、（Ｇ）ＡＡｌｉｋｅ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ、（Ｈ）ＡＡｌｉｋｅ、ＡＡＴｌｉｋｅ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ、（Ｉ）ＡＡＴｌｉｋｅ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ、（Ｊ）Ｓｐｏｓ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤ、並びに（Ｋ）ＳＡＡＴｐｏｓ、ΔΔＧｆｏｌｄ、及びＬｏｏｐＩＤから選択されるパラメーターの組合せが決定される、請求項１２５に記載の方法。
  133. 前記パラメーターに基づいて前記参照分泌タンパク質の複数のアミノ酸位置を順位付けし、少なくとも閾値のパラメーター値を有する位置のアミノ酸を変異させることを更に含む、請求項１２５に記載の方法。
  134. 前記改変タンパク質がインビボで合成される、請求項１２５に記載の方法。
  135. 栄養ポリペプチド変異体をコードする複数の組換え型核酸配列を含むライブラリーであって、各前記栄養ポリペプチド変異体の全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合が、長さが少なくとも５０アミノ酸の参照分泌タンパク質における全アミノ酸に対する１又は複数の必須アミノ酸の割合より高い、ライブラリー。
  136. 請求項１３５に記載のライブラリーを含む組換え型単細胞生物の集団。
  137. 請求項１３６に記載の集団から分泌される、単離された栄養ポリペプチド変異体。
  138. 請求項１３７に記載の栄養ポリペプチド変異体の単離された断片であって、質量分析法による分析に適している、断片。
  139. 請求項１３６に記載の集団を含むデバイスであって、別個の異なるポリペプチド変異体を含む２つ以上の個々の組換え型単細胞生物が空間的に隔てられている、デバイス。
  140. 分泌栄養ポリペプチド変異体が特定可能である、請求項１３９に記載のデバイス。
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