JP2015525071A5

JP2015525071A5 -

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Publication number: JP2015525071A5
Application number: JP2015516160A
Authority: JP
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2016-07-21

Description

本明細書に記載される実施形態および態様のいずれも、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、互いに一緒に用いることができる。他の実施形態は、後に続く記載の概観から当業者にとって明らかになる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
二重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、単一のヒト軽鎖可変ドメインおよび複数のヒト重鎖可変ドメインを発現する、同じマウスまたは別のマウスから単離された２つの異なるＢ細胞に由来する２つの異なるヒト重鎖可変領域遺伝子配列を得る工程、ならびに、
前記２つのヒト重鎖可変領域遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列を含有している２つのヒト重鎖と、前記ヒト軽鎖可変ドメインを含有している１つのヒト軽鎖を有している二重特異性抗原結合タンパク質を作製する工程
を含む、方法。
（項目２）
前記同じマウスまたは別のマウス中で発現された前記単一のヒト軽鎖可変ドメインが、単一の再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖセグメントおよび単一の再構成されたヒト生殖細胞系列Ｊセグメント由来のヌクレオチド配列によりコードされる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記単一の再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖセグメントが、再構成されたヒトＶκ１−３９または再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記単一の再構成されたヒト生殖細胞系列Ｊセグメントが、再構成されたヒトＪκ５または再構成されたヒトＪκ１遺伝子セグメントである、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記同じマウスまたは別のマウスが、１つ以上の非ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の再構成されていないヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメント、１つ以上の再構成されていないヒトＤ _Ｈ遺伝子セグメント、および１つ以上の再構成されていないヒトＪ _Ｈ遺伝子セグメントを含有している重鎖遺伝子座を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記重鎖遺伝子座が、１つ以上のマウス重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された８０の再構成されていないヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメント、２７の再構成されていないヒトＤ _Ｈ遺伝子セグメント、および６の再構成されていないヒトＪ _Ｈ遺伝子セグメントを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記１つ以上のヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントが、ヒトＶ _Ｈ１−２、Ｖ _Ｈ１−８、Ｖ _Ｈ１−２４、Ｖ _Ｈ１−６９、Ｖ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−７、Ｖ _Ｈ３−９、Ｖ _Ｈ３−１１、Ｖ _Ｈ３−１３、Ｖ _Ｈ３−１５、Ｖ _Ｈ３−２０、Ｖ _Ｈ３−２３、Ｖ _Ｈ３−３０、Ｖ _Ｈ３−３３、Ｖ _Ｈ３−４８、Ｖ _Ｈ３−５３、Ｖ _Ｈ４−３１、Ｖ _Ｈ４−３９、Ｖ _Ｈ４−５９、Ｖ _Ｈ５−５１、Ｖ _Ｈ６−１、またはこれらの組み合わせを含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記同じマウスまたは別のマウスが、軽鎖可変ドメインをコードする遺伝子を形成するように再構成することができる内因性の軽鎖可変遺伝子セグメントを含まない、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記２つのヒト重鎖可変領域遺伝子配列のそれぞれが、前記同じまたは異なるＶ _Ｈセグメントに由来する配列を含み、ここでは、前記Ｖ _Ｈセグメントが、Ｖ _Ｈ１−２、Ｖ _Ｈ１−８、Ｖ _Ｈ１−２４、Ｖ _Ｈ１−６９、Ｖ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−７、Ｖ _Ｈ３−９、Ｖ _Ｈ３−１１、Ｖ _Ｈ３−１３、Ｖ _Ｈ３−１５、Ｖ _Ｈ３−２０、Ｖ _Ｈ３−２３、Ｖ _Ｈ３−３０、Ｖ _Ｈ３−３３、Ｖ _Ｈ３−４８、Ｖ _Ｈ３−５３、Ｖ _Ｈ４−３１、Ｖ _Ｈ４−３９、Ｖ _Ｈ４−５９、Ｖ _Ｈ５−５１、およびＶ _Ｈ６−１より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記２つのヒト重鎖が：
２つの異なる抗原、または
同じ抗原の２つの異なるエピトープ
に結合する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
二重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって：
単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列に由来する核酸配列によりコードされる単一の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび複数のヒト重鎖可変ドメインを発現する第一のマウスを、第一のエピトープを含有する目的の第一の抗原に対して暴露する工程、
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列に由来する核酸配列によりコードされる単一の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび複数のヒト重鎖可変ドメインを発現する第二のマウスを、第二のエピトープを含有する目的の第二の抗原に対して暴露する工程、
前記第一および第二のマウスが、それぞれ目的の前記抗原に対する免疫応答を惹起することを可能にする工程、
目的の前記第一の抗原の前記第一のエピトープに結合する前記第一のマウスの第一のヒト重鎖可変ドメインを同定する工程、
目的の前記第二の抗原の前記第二のエピトープに結合する前記第二のマウスの第二のヒト重鎖可変ドメインを同定する工程、
前記第一のヒト重鎖可変ドメインを含有する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子、および前記第二のヒト重鎖可変ドメインを含有する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、
前記第一および第二の重鎖遺伝子を、前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列を含有する単一の完全ヒト型軽鎖遺伝子を含有する細胞に導入する工程、
前記完全ヒト型重鎖遺伝子によりコードされる前記第一および第二の完全ヒト型重鎖と、前記単一の完全ヒト型軽鎖遺伝子によりコードされる完全ヒト型軽鎖とを、細胞中で発現させて、二重特異性抗原結合タンパク質を形成させる工程、ならびに、
前記細胞から前記二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程
を含む、方法。
（項目１２）
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＪκ１またはＪκ５遺伝子セグメントをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記第一の抗原と前記第二の抗原とが同一ではない；または
前記第一の抗原と前記第二の抗原とが同一であり、かつ前記第一のエピトープと前記第二のエピトープとが同一ではない
項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記完全ヒト型軽鎖は、前記第一の完全ヒト型重鎖と対を形成すると、前記第一の抗原の前記第一のエピトープに特異的に結合し、前記完全ヒト型軽鎖は、前記第二の完全ヒト型重鎖と対を形成すると、前記第二の抗原の前記第二のエピトープに特異的に結合する、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
両方ではなく、前記第一または第二の完全ヒト型重鎖が、プロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸改変を保有する、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記改変が、９５Ｒ（ＥＵＲ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵＲ４３６Ｆ）、およびこれらの組み合わせより選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が生殖細胞系列配列である、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
前記第一および第二のマウス中の前記複数のヒト重鎖可変ドメインが、１つ以上の非ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の再構成されていないヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメント、１つ以上の再構成されていないヒトＤ _Ｈ遺伝子セグメント、および１つ以上の再構成されていないヒトＪ _Ｈ遺伝子セグメントを含有している重鎖遺伝子座によりコードされる、項目１１に記載の方法。
（項目２０）
前記第一または第二のマウス中の前記重鎖遺伝子座が、１つ以上のマウス重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された８０個の再構成されていないヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメント、２７個の再構成されていないヒトＤ _Ｈ遺伝子セグメント、および６個の再構成されていないヒトＪ _Ｈ遺伝子セグメントを含有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記１つ以上のヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントが、ヒトＶ _Ｈ１−２、Ｖ _Ｈ１−８、Ｖ _Ｈ１−２４、Ｖ _Ｈ１−６９、Ｖ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−７、Ｖ _Ｈ３−９、Ｖ _Ｈ３−１１、Ｖ _Ｈ３−１３、Ｖ _Ｈ３−１５、Ｖ _Ｈ３−２０、Ｖ _Ｈ３−２３、Ｖ _Ｈ３−３０、Ｖ _Ｈ３−３３、Ｖ _Ｈ３−４８、Ｖ _Ｈ３−５３、Ｖ _Ｈ４−３１、Ｖ _Ｈ４−３９、Ｖ _Ｈ４−５９、Ｖ _Ｈ５−５１、Ｖ _Ｈ６−１、またはこれらの組み合わせを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
二重特異性抗原結合タンパク質において使用するための２つのヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する方法であって：
第一のマウスを目的の第一の抗原で免疫して、前記第一の抗原に結合する第一のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを得る工程であって、ここでは、前記第一のマウスが、単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列に由来する単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインとを発現する、工程、および
第二のマウスを目的の第二の抗原で免疫して、前記第二の抗原に結合する第二のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを得る工程であって、ここでは、前記第二のマウスが、前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列に由来する単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインとを発現する、工程
を含む、方法。
（項目２３）
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメントを含有する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＪκ１またはＪκ５遺伝子セグメントをさらに含有する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第一のマウスおよび前記第二のマウスが、免疫グロブリン軽鎖を形成するように再構成することができる内因性の軽鎖可変遺伝子セグメントを含まない、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記第一の抗原および前記第二の抗原が
異なる；または
同じであり、かつ前記第一の重鎖可変ドメインおよび前記第二の重鎖可変ドメインが異なるエピトープに結合する、
項目２２に記載の方法。
（項目２７）
（ａ）第一の抗原に結合する第一のヒト免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸配列であって、ここでは、前記第一のヒト重鎖が、第一のヒト重鎖可変ドメインの配列を含有し、前記第一のヒト重鎖可変ドメインの前記配列が、前記第一の抗原で免疫された第一のマウスから得られたヌクレオチド配列によりコードされる、第一の核酸配列；
（ｂ）第二の抗原に結合する第二のヒト免疫グロブリン重鎖をコードする第二の核酸配列であって、ここでは、前記第二のヒト重鎖が、第二のヒト重鎖可変ドメインの配列を含有し、前記第二のヒト重鎖可変ドメインの前記配列が、前記第二の抗原で免疫された第二のマウスから得られたヌクレオチド配列によりコードされ、
ここでは、前記第一および第二のマウスはそれぞれ、単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によりコードされる単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインとを発現する、第二の核酸配列；
ならびに、
（ｃ）前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含有する第三の核酸配列であって、ここでは、前記第三の核酸はヒト免疫グロブリン軽鎖をコードする、第三の核酸配列；
を含有する宿主細胞であって、
ここでは、前記第一の核酸配列、前記第二の核酸配列、および前記第三の核酸配列は、前記第一および第二の抗原に結合する抗原結合タンパク質を作製するように発現する、
宿主細胞。
（項目２８）
前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメントを含有する、項目２７に記載の宿主細胞。
（項目２９）
前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＪκ１またはＪκ５遺伝子セグメントをさらに含有する、項目２８に記載の宿主細胞。

Claims

二重特異性抗原結合タンパク質の作製方法であって、前記方法は、
（ａ）培養宿主細胞において、第一のエピトープを含む目的の第一の抗原で免疫された第一の遺伝子操作マウスのＢ細胞に由来する第一のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域によってコードされるヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む第一のヒト免疫グロブリン重鎖を発現する工程であって、前記第一の遺伝子操作マウスは、
（ｉ）Ｖκ１−３９／ＪκまたはＶκ３−２０／Ｊκ配列である単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列についてホモ接合性またはヘテロ接合性である生殖細胞系列を有し、ここで、前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ネズミＣκ領域に作動可能に連結されており；
（ｉｉ）１つまたは複数の再構成されていないヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメント、１つまたは複数の再構成されていないヒトＤ遺伝子セグメント、および１つまたは複数の再構成されていないヒトＪ _Ｈ遺伝子セグメントを含む生殖細胞系列を有し、前記１つまたは複数の再構成されていないヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントは、ネズミＣ _Ｈ領域配列に作動可能に連結されており、かつＶ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−２３およびＶ _Ｈ３−３０からなる群より選択されるヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントを含み；および
（ｉｉｉ）前記第一抗原での免疫後のＢ細胞の集団を含み、ここで前記集団における各Ｂ細胞は、前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現し、前記Ｂ細胞集団は、Ｖ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−２３およびＶ _Ｈ３−３０からなる群より選択されるヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する少なくとも１つのＢ細胞を含む、工程；
（ｂ）培養宿主細胞において、第二のエピトープを含む目的の第二の抗原で免疫された第二の遺伝子操作マウスのＢ細胞に由来する第二のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域によってコードされるヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む第二のヒト免疫グロブリン重鎖を発現する工程であって、前記第二の遺伝子操作マウスは、
（ｉ）Ｖκ１−３９／ＪκまたはＶκ３−２０／Ｊκ配列である単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列についてホモ接合性またはヘテロ接合性である生殖細胞系列を有し、ここで、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、前記第一の遺伝子操作マウスの前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列と同じＶκ遺伝子セグメントおよび同じＪκ遺伝子セグメントを含み、ここで前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ネズミＣκ領域に作動可能に連結されており；
（ｉｉ）１つまたは複数の再構成されていないヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメント、１つまたは複数の再構成されていないヒトＤ遺伝子セグメント、および１つまたは複数の再構成されていないヒトＪ _Ｈ遺伝子セグメントを含む生殖細胞系列を有し、前記１つまたは複数の再構成されたヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントは、ネズミＣ _Ｈ領域配列に作動可能に連結されており、かつＶ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−２３およびＶ _Ｈ３−３０からなる群より選択されるヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントを含み；および
（ｉｉｉ）前記第二抗原での免疫後のＢ細胞の集団を含み、ここで前記集団における各Ｂ細胞は、前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現し、そして前記Ｂ細胞集団は、Ｖ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−２３およびＶ _Ｈ３−３０からなる群より選択されるヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する少なくとも１つのＢ細胞を含み；
ここで、前記第一および第二のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の一方または両方は、Ｖ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−２３およびＶ _Ｈ３−３０からなる群より選択されるＶ _Ｈ遺伝子セグメントを含む、工程：ならびに
（ｃ）発現された前記第一のヒト免疫グロブリン重鎖を、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域Ｖκ１−３９／ＪκまたはＶκ３−２０／Ｊκ配列に由来するヒト免疫グロブリン軽鎖と、および再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域κ１−３９／ＪκまたはＶκ３−２０／Ｊκ配列に由来するヒト免疫グロブリン軽鎖とも対を形成する発現された前記第二のヒト免疫グロブリン重鎖と対を形成させ、それにより二重特異性抗原結合タンパク質を作製する工程
を包含する、方法。
前記第一の遺伝子操作マウスおよび前記第二の遺伝子操作マウスの各々の前記生殖細胞系列における前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、ヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０遺伝子セグメントのいずれかである、同じ再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖセグメントに由来する、請求項１に記載の方法。
前記第一の遺伝子操作マウスおよび前記第二の遺伝子操作マウスの各々の生殖細胞系列における前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、同じ再構成されたヒト生殖細胞系列Ｊセグメントに由来する、請求項１または請求項２に記載の方法。
前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、前記第一の遺伝子操作マウスおよび前記第二の遺伝子操作マウスの両方において、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ配列であり、前記同じ再構成されたヒト生殖細胞系列ＪセグメントがＪκ５であるか、または
前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、前記第一の遺伝子操作マウスおよび前記第二の遺伝子操作マウスの両方において、前記再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ配列であり、前記同じ再構成されたヒト生殖細胞系列Ｊセグメントは、Ｊκ１である、請求項３に記載の方法。
前記第一の遺伝子操作マウスおよび／または前記第二の遺伝子操作マウスは、再構成して免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする遺伝子を形成することができる内因性免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の第一の抗原および前記目的の第二の抗原が、
２つの異なる抗原であるか；または
同じ抗原であり、前記第一のヒト免疫グロブリン重鎖および前記第二のヒト免疫グロブリン重鎖が、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記第一の遺伝子操作マウスの生殖細胞系列が、ヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントＶ _Ｈ２−５を含み、前記第二の遺伝子操作マウスの生殖細胞系列が、ヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントＶ _Ｈ３−３０を含むか；または
前記第一の遺伝子操作マウスの生殖細胞系列が、ヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントＶ _Ｈ３−２３を含み、前記第二の遺伝子操作マウスの生殖細胞系列が、ヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントＶ _Ｈ３−３０を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記第一のヒト免疫グロブリン重鎖の前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、前記ヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントＶ _Ｈ２−５に由来し、前記第二のヒト免疫グロブリン重鎖の前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、前記ヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントＶ _Ｈ３−３０に由来するか；または
前記第一のヒト免疫グロブリン重鎖の前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、前記ヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントＶ _Ｈ３−２３に由来し、前記第二のヒト免疫グロブリン重鎖の前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインが、前記ヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントＶ _Ｈ３−３０に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の第一の抗原および前記目的の第二の抗原が、同じ抗原であり、前記二重特異性抗体の前記同じ抗原に対する結合応答は、前記第一のヒト免疫グロブリン重鎖のみを有する単一特異性抗体および／または前記第二のヒト免疫グロブリン重鎖のみを有する単一特異性抗体の結合応答よりも少なくとも２倍高い、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記第一の遺伝子操作マウスおよび／または前記第二の遺伝子操作マウスが、Ｖ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−２３およびＶ _Ｈ３−３０の各々を含む生殖細胞系列を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記二重特異性抗原結合タンパク質の、両方ではなく、前記第一のヒト免疫グロブリン重鎖または前記第二のヒト免疫グロブリン重鎖は、プロテインＡへのその親和性を低減するアミノ酸改変を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記改変は、９５Ｒ（ＥＵＲ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵＲ４３６Ｆ）およびそれらの組合せから選択される、請求項１１に記載の方法。
前記第一の遺伝子操作マウスおよび／または前記第二の遺伝子操作マウスの前記ネズミＣκが、マウスＣκまたはラットＣκであり、ならびに／あるいは
前記第一の遺伝子操作マウスおよび／または前記第二の遺伝子操作マウスの前記ネズミＣ _Ｈが、マウスＣ _ＨまたはラットＣ _Ｈである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
前記第一の遺伝子操作マウスおよび前記第二の遺伝子操作マウスは、同じマウスまたは別のマウスである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法にしたがって生成された二重特異性抗原結合タンパク質。
培養宿主細胞であって、
（ａ）目的の第一の抗原に結合する第一のヒト免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸配列であって、前記第一のヒト免疫グロブリン重鎖は、第一のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの配列を含み、前記第一のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの配列は、Ｖ _Ｈ２−５、Ｖ _Ｈ３−２３およびＶ _Ｈ３−３０からなる群より選択されるヒトＶ _Ｈ遺伝子セグメントに由来する核酸配列によってコードされ、かつ前記目的の第一の抗原で免疫された第一の遺伝子操作マウスから得られる、第一の核酸配列；
（ｂ）目的の第二の抗原に結合する第二のヒト免疫グロブリン重鎖をコードする第二の核酸配列であって、前記第二のヒト免疫グロブリン重鎖は、第二のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの配列を含み、前記第二のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの配列は、前記目的の第二の抗原で免疫された第二の遺伝子操作マウスから得られた核酸配列によってコードされ、
前記第一の遺伝子操作マウスおよび前記第二の遺伝子操作マウスは、各々、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ配列または再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ配列のいずれかである、同じ単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列に由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、および複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現する、第二の核酸配列；および
（ｃ）再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ配列または再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ配列に由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む第三の核酸配列であって、前記第三の核酸配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖をコードする、第三の核酸配列；
を含み、
ここで、前記第一の核酸配列、前記第二の核酸配列および前記第三の核酸配列は、前記培養宿主細胞において発現して、前記目的の第一の抗原および前記目的の第二の抗原に結合する二重特異性抗原結合タンパク質を生成する、培養宿主細胞。