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JP2015508762A - 骨髄細胞で発現されるトリガー受容体１（ｔｒｅｍ−１）に結合し、それを遮断する抗体 - Google Patents

骨髄細胞で発現されるトリガー受容体１（ｔｒｅｍ−１）に結合し、それを遮断する抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、単球、マクロファージおよび好中球で発現されるタンパク質であるTREM-1に特異的に結合し、TREM-1の活性化を妨げることができる抗体に関する。そのような抗体には、関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの炎症性疾患の個体の治療における有用性が見いだされる。

Description

本発明は、機能性TREM-1抗体を同定する方法に関する。本発明は、TREM-1に特異的に結合することができ、TREM-1活性(シグナル伝達および/または活性化)を低下させるまたは遮断することができる抗体にも関する。さらに、本発明は、そのような抗体の使用、例えば、治療への使用および薬学的使用などに関する。
骨髄細胞で発現されるトリガー受容体1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1)(TREM-1)は、単球、マクロファージおよび好中球で発現される受容体である。活性化されると、TREM-1はシグナル伝達タンパク質であるDAP12と会合し、それを発現する細胞からの炎症促進性サイトカインの放出のトリガーとなる(Bouchonら、J. Immunol. 2000; 164(10): 4991〜4995頁)。TREM-1のmRNAおよびタンパク質の発現は敗血症、関節リウマチ(RA)および炎症性腸疾患(IBD)の個体の骨髄細胞において上方制御されることが公知である。炎症を起こした領域に動員されるTREM-1陽性の単球および好中球により炎症が増悪するので、TREM-1が炎症性疾患の発生および進行に寄与するという理論を裏付ける科学的証拠が増加している(Bouchonら、Nature 2001; 410: 1103〜1107頁; Schenkら、Clin Invest. 2007; 117(10): 3097〜3106頁; Kuaiら、Rheumatology(Oxford). 2009; 48(11):1352〜1358頁)。
市販のTREM26およびTREM37(それぞれ、cat番号314902および316102、Biolegend、San Diego、CA 92121、USA)、MAB1278(Cat番号MAB1278、R&D Systems、Minneapolis、MN 55413、USA)、mAb 6B1(Cat番号HM2252、Hycult Biotech、Uden、Netherlands)および抗TREM-1 2E2(Cat番号HPA005563、Sigma-Aldrich、Denmark)を含めた、TREM-1に結合することができる抗体が公知である。公知のTREM-1抗体は全て、固定化した場合に作動性である、すなわち、単球、マクロファージおよび好中球からのサイトカインの放出を増加させる。公知のTREM-1抗体の別の特性は、カニクイザルまたはアカゲザルなどの霊長類由来のTREM-1と交差反応しないことであり、これは、公知の抗体をこれらの動物において試験することができないということを意味する。
WO2005040219 米国特許出願公開第20050238646号 米国特許出願公開第20020161201号 米国特許第5,677,425号
Bouchonら、J. Immunol. 2000; 164(10): 4991〜4995頁 Bouchonら、Nature 2001; 410: 1103〜1107頁 Schenkら、Clin Invest. 2007; 117(10): 3097〜3106頁 Kuaiら、Rheumatology(Oxford). 2009; 48(11):1352〜1358頁 Birdら、Science 1988年;242:42S〜426頁 Hustonら PNAS 1988年;85:5879〜5883頁 Illら. Protein Eng 1997年;10: 949〜57頁 HolligerおよびHudson、Nat Biotechnol 2005年;2S: 1126〜1136頁 Antibody Engineering、Methods in Molecular Biology、248巻、Benny K. C. Lo編 Angalら、Mol Immunol. 1995; 30: 105〜8頁 Kabatら、 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91〜3242頁 ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol 1987; 196: 901〜917頁 Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年 Davenportら、Internat. Immunopharmacol 2: 653〜672頁、2002年 Karttunen, J. & Shastri、N.(1991年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88、3972〜3976頁 Fiering, S.、Northrop, J. P.、Nolan, G. P.、Matilla, P.、Crabtree, G. R. & Herzenberg, L. A.(1990年) Genes Dev. 4、1823〜1834頁 AndersenおよびFaber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148頁(2011) Weisら、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17、1700頁(2006) Garcia、Pantazatos and Villareal、Assay and Drug Dev. Tech. 2、81頁(2004) Mandell、FalickおよびKomives、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95、14705頁(1998)
したがって、当技術分野において、TREM-1に結合し、その機能を遮断することができる抗体が必要とされている。当技術分野において、TREM-1が二量体/多量体を形成することを妨げることができるTREM-1抗体が必要とされている。当技術分野において、TREM-1活性化およびシグナル伝達を遮断することができるTREM-1抗体が必要とされている。当技術分野において、TREM-1とそのリガンドとの間の相互作用に干渉することができるTREM-1抗体が必要とされている。当技術分野において、骨髄細胞からのサイトカインの放出を遮断することができるTREM-1抗体が必要とされている。当技術分野において、可溶性であるまたは固定化した場合の作動性活性がわずかである、または全くないTREM-1抗体が必要とされている。当技術分野において、適切な動物モデルにおいて抗体の毒性調査を可能にし、薬物動態および薬力学的性質を評価するために、ヒトTREM-1および霊長類などの1つまたは複数の他の種由来のTREM-1のどちらにも結合することができる抗体も必要とされている。
本明細書には、医薬品として使用するために適したTREM-1抗体が開示されている。そのような抗体は、敗血症、または関節リウマチ、乾癬性関節炎および炎症性腸疾患などの慢性の炎症性疾患の個体の生活の質に実質的な影響を与えうる。
本発明は、機能性TREM-1抗体を同定する方法であって、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞をTREM-1改変剤と一緒にインキュベートした際の前記細胞の活性を測定する工程と、(c)(b)の共培養物をTREM-1抗体と接触させる工程と、(d)第1の細胞の活性が、(b)において測定された活性よりも低い、または高いことを測定する工程とを含む方法に関する。
方法は、抗体などの遮断性TREM-1分子を同定するように調整することができる。遮断性TREM-1抗体を同定する方法は、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞をTREM-1リガンドなどの活性化化合物、または活性化された好中球と一緒にインキュベートした際の前記細胞の活性を測定する工程と、(c)第1の細胞およびTREM-1リガンドなどの活性化化合物、または活性化された好中球の共培養物を、TREM-1抗体と接触させる工程と、(d)第1の細胞の活性が(b)において測定された活性よりも低いことを測定する工程とを含む。
方法は、刺激性TREM-1抗体を同定するように調整することができる。刺激性TREM-1抗体を同定する方法は、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞の活性を測定する工程と、(c)前記細胞をTREM-1抗体と接触させる/インキュベートする工程と、(d)第1の細胞の活性が(b)において測定された活性よりも高いことを測定する工程とを含む。
第1の細胞は造血起源のものであってよい。(b)の改変剤は、活性化された好中球またはTREM-1リガンドであってよい。シグナル伝達タンパク質は、DAP10、DAP12、TCRゼータ、FcガンマRIIIおよびFc受容体、またはその一部であってよい。シグナル伝達タンパク質は、NFATまたはNFκBなどの転写因子を介してシグナルを伝達することができる。レポーター遺伝子は、前記第1の細胞においてはネイティブに発現されない遺伝子であってよく、また、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼをコードする遺伝子であってよい。本発明は、本発明の方法によって同定することができる刺激性TREM-1抗体にも関する。
本発明は、TREM-1に特異的に結合することができ、TREM-1の機能を遮断することができる抗体に関する。前記抗体は、TREM-1の二量体化または多量体化を妨げることまたは低下させることができうる。前記抗体は、TREM-1とそのリガンドとの間の相互作用を遮断することができうる、または抗体は、TREM-1リガンドによって誘導されるTREM-1の機能を遮断することができうる。TREM-1は、ヒトTREM-1および/またはヒトとは別の種由来のTREM-1、例えば、ヒトとは別の霊長類由来のTREM-1などであってよい。
本発明の抗体は、ヒトTREM-1との結合についてmAb 0170と競合することができうる。本発明の抗体は、配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸D38〜F48を含むポリペプチドに特異的に結合することができうる。本発明の抗体は、HX-MSを使用して決定することができる、配列番号1(ヒトTREM-1)のD38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44およびL45からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは全部、ならびに配列番号1(ヒトTREM-1)のE46、K47およびF48からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、または全部を含むエピトープを有してよい。本発明の抗体は、TREM-1の変異体への抗体の結合を測定することによって決定することができる、配列番号1(ヒトTREM-1)のD42、E46、D92およびH93からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、3つまたは全部を含むエピトープを有してよい。
本発明の抗体は、カニクイザルTREM-1との結合についてmAb 0170と競合ことができる。本発明の抗体は、HX-MSを使用して決定することができる、カニクイザルTREM-1(配列番号12)のアミノ酸E19〜L26、または配列番号21の対応するアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合することができる。
本発明の抗体は、1つまたは複数の自己免疫疾患および/または慢性炎症の個体を治療するための医薬品として使用することができる。したがって、本発明は、1つまたは複数の自己免疫疾患および/または慢性炎症の個体の治療方法にも関する。
BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ細胞株(本明細書では「BWZ/hTREM-1レポーター細胞」とも称される)の活性化は、14F128および14F113などの抗体によって低下するが、市販の抗体であるMAB1278(R&D Systems、Minneapolis、MN 55413、USA: Cat番号MAB1278)、抗TREM-1 HPA(Sigma、USA: Cat番号HPA005563)、aTREM26(Biolegend、San Diego、CA 92121、USA: Cat番号314902)およびaTREM37(Biolegend、San Diego、CA 92121、USA: Cat番号316102)によっては低下しないことを示すグラフである。 単独で、またはTLRLで予備刺激した好中球と共培養したBWZ/hTREM-1レポーター細胞を示すグラフである。TLRLで活性化された好中球は、活性化されていない好中球と比較してシグナル(発光)の15倍の増加を誘導することができる(最後の2つの円柱を参照されたい)。陽性対照(プレートに結合させた作動性MAB1278(R&D Systems、Minneapolis、MN 55413、USA: Cat番号MAB1278)により、本実験では32倍の誘導がもたらされた(2番目の円柱を参照されたい)。データは平均±SEMとしてプロットされている(n=3)。 TREM-1をPGNで活性化された好中球で刺激する、正規化したレポーターアッセイを示すグラフであり、市販の抗体であるTREM-26(Cat番号314902、Biolegend、San Diego、CA 92121、USA)、TREM-37(Cat番号316102、Biolegend、San Diego、CA 92121、USA)、MAB1278(Cat番号MAB1278、R&D Systems、Minneapolis、MN 55413、USA)、および抗TREM-1 HPA(Cat番号HPA005563、Sigma、St Louis、MO、USA)が、レポーターアッセイにおいてTREM-1依存性発光シグナルを増強する(1を超えるシグナルを生じる)アゴニスト抗体であることを示す。5F27A1および14F69と識別される抗体が、最良の遮断薬(0.5未満のシグナルを生じる)であることが示されている。データは平均±SEM(n=3)としてプロットされている。アイソタイプ対照MAB002(Cat番号MAB002、R&D Systems、Minneapolis、MN 55413、USA)。抗体は全て1μg/mlで使用した。 BWZ/hTREM-1レポーターアッセイにおける活性を示すグラフである。x軸には、TREM-1遮断活性が、0.2μg/mlの抗体を、PGNで刺激した好中球を用いて予備活性化(pre-activate)したBWZ/hTREM-1レポーター細胞に加えた際に残存する活性として示されている。TREM-1抗体をプレートに結合させると、いくつか(市販のTREM-1抗体全てを含む)がTREM-1と交差結合(crossbind)し、それにより、TREM-1を活性化することができた。この活性がy軸に示されている。したがって、左下隅の枠内に点として示されている抗体は全て、公知の抗体と比較して異なる性質を示し、有利に遮断性であり、作動性ではない。 ヒトTREM-1抗体とアカゲザル由来のPBMCとの結合を示すグラフである。左上隅には、抗体の大部分がヒトTREM-1のみに結合したことが示されている(黒い点のそれぞれが1つの抗体を示す)。一部の抗体、例えば、mAb 0025および14F128、14F11、14F29、14F113および14F69などは、ヒトTREM-1およびアカゲザルTREM-1のどちらにも結合することができ、交差反応性が示されている。 抗ヒトTREM-1抗体とカニクイザル由来のPBMCとの結合を示すグラフである。左上隅では、大多数の抗体がヒトTREM-1のみに結合したことが示されている(黒い点のそれぞれが1つの抗体を示す)。一部の抗体、例えば、mAb 0025および14F128、14F11、14F29などはヒトTREM-1およびカニクイザルTREM-1のどちらにも結合することができ、交差反応性が示されている。14F69(mAb 0044)などの一部の抗体は、カニクイザルPBMC(図6B)およびヒトPBMC(図6C)に、同等に良好に結合することができる。 mAb 0023またはmAb 0026(A)、mAb 0024またはBiolegendクローン26(B)、mAb 0025(C)またはRnD BiosystemsのMAB1278(D)の存在下、および不在下で、HXで解析したhTREM-1のペプチドの配列包括度(coverage)を示す図である。HXで解析したペプチド(水平のバーとして示されている)の上に一次配列が示されている。mAbsの存在下、および不在下のどちらでも同様の交換パターンを示すペプチドが白色で示され、mAbが結合すると重水素の組み込みの減少を示すペプチドが黒く着色されている。枠に囲まれた配列領域はエピトープを定義する。 hTREM-1上のmAb 0025に関するエピトープの構造的マッピングを示す図である。hTREM-1(pdb1Q8M)の構造が示されており、二量体の一方の部分が黒いC-アルファワイヤーで示されている。hTREM-1二量体の他方の部分は黒色で示されている0025エピトープを伴う灰色のリボンで示されている。 TREM-1リガンド複合体と共培養したBWZ/hTREM-1レポーター細胞がTREM-1の機能性を反映し、TREM-1の機能性はTREM-1 mAb-0170によって用量依存的に阻害されたことを示すグラフである。 PGLYRP-1によって刺激されたM2マクロファージからのTNFアルファ放出がTREM-1抗体によって遮断されたことを示すグラフである。 ヒトTREM-1配列とカニクイザルTREM-1配列をアラインメントした図である。2つの間で異なるアミノ酸残基が太字で示されている。エピトープ内に存在することが示された残基(HX-MSおよび表面プラズモン共鳴を用いて決定して)が強調表示されている。
配列の簡単な説明
配列番号1は、野生型(wt)ヒトTREM-1のアミノ酸配列を示す。
配列番号2は、m14F69抗体の可変性重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、m14F69抗体の可変性軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、第1のヒト化TREM-1抗体(mAb 0170)の重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、第1のヒト化TREM-1抗体(mAb 0170)の軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号6は、第2のヒト化TREM-1抗体(mAb 0122)の重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、第2のヒト化TREM-1抗体(mAb 0122)の軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、m14F128抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、m14F128抗体の軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号10は、m14F113抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号11は、m14F113抗体の軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号12は、E.coli(大腸菌)において発現させた場合の野生型(wt)カニクイザル(c)TREM-1の細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号13は、K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6(構築物0222)のアミノ酸配列を示す。
配列番号14は、A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6(構築物0244)のアミノ酸配列を示す。
配列番号15は、A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6(構築物0245)のアミノ酸配列を示す。
配列番号16は、プライマーの核酸配列を示す。
配列番号17は、プライマーの核酸配列を示す。
配列番号18は、ヒト(h)TREM-1(1-134)-His6のアミノ酸配列を示す。
配列番号19は、cTREM-1-Cmyc2-His6(構築物0238)のアミノ酸配列を示す。
配列番号20は、hTREM-1-Cmyc2-His6(構築物0247)のアミノ酸配列を示す。
配列番号21は、全長cTREM-1のアミノ酸配列を示す。
配列番号22は、全長マウス(m)TREM-1のアミノ酸配列を示す。
配列番号23は、全長hPGLYRP1のアミノ酸配列を示す。
説明
TREM-1は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインおよび短い細胞質尾部を含む、234アミノ酸からなる膜貫通タンパク質であり、明らかなシグナル伝達モチーフを有さない。活性化されると、TREM-1はITAMを含有するシグナル伝達アダプタータンパク質、DAP12と会合する。下流のシグナル伝達は、炎症促進性サイトカイン産生の上方制御を引き起こすNFAT転写因子の活性化を含みうる。
本発明は、TREM-1に特異的に結合し、その機能を遮断することができる抗体に関する。本発明の抗体は、TREM-1活性化および下流のシグナル伝達を減少させる/遮断することによってTREM-1機能を遮断することができる。
本発明による抗体は、TREM-1を直接、または間接的に遮断するいくつかの異なる機構の1つまたは組合せのうちの1つによってTREM-1を遮断することができる。例えば、本発明の抗体は、TREM-1の天然のリガンドであるペプチドグリカン認識タンパク質1(PGLYRP1)がTREM-1と機能的な複合体を創出することを妨げることができ、かつ/または、本発明の抗体は、個々のTREM-1分子が二量体または多量体を形成することを妨げることによってTREM-1を遮断することができる。TREM-1の二量体化または多量体化は、そうでなければTREM-1二量体の境界面に存在するTREM-1の一部に結合し、したがって、個々のTREM-1分子が互いに会合することを妨げることができるTREM-1抗体によって減少させるまたは妨げることができる。TREM-1の二量体化または多量体化は、TREM-1とそのリガンドの相互作用に干渉するTREM-1抗体によって減少させるまたは妨げることができる。本発明による抗体は、PGLYRP1に誘導されるTREM-1の活性化を遮断することができる。高度に保存された、シグナルペプチドおよびペプチドグリカン結合ドメインからなる196アミノ酸長のタンパク質であるPGLYRP1は好中球において発現され、それらが活性化すると放出される。本発明による抗体は、骨髄細胞からの炎症促進性サイトカインの放出を下方制御することができる。本発明による抗体は、マクロファージ、好中球、滑液組織細胞および/または本明細書に開示されているレポーター細胞からのTNFアルファ、MIP-1ベータ、MCP-1、IL-1ベータ、GM.CSF、IL-6および/またはIL-8の放出を遮断することができる。
本発明の抗体は、ヒトTREM-1およびヒトとは別の種由来のTREM-1のどちらにも結合することができうる。したがって、「TREM-1」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の適切な生物体から得ることができるTREM-1の任意の天然に存在する形態を包含する。例えば、本明細書に記載のように使用するためのTREM-1は、脊椎動物のTREM-1、例えば、霊長類(例えば、ヒト、チンパンジー、カニクイザルまたはアカゲザルなど);げっ歯類(例えば、マウスまたはラットなど)、ウサギ類(例えば、ウサギなど)、または偶蹄類(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタまたはラクダなど)由来のTREM-1などの哺乳動物のTREM-1などであってよい。TREM-1は配列番号1(ヒトTREM-1)であることが好ましい。TREM-1は、適切な細胞内で翻訳後プロセシングを受けたTREM-1タンパク質などの成熟型のTREM-1であってよい。そのような成熟TREM-1タンパク質は、例えば、グリコシル化されていてよい。TREM-1は、全長TREM-1タンパク質であってよい。
本発明の抗体は、Bリンパ球の単一のクローンから直接、または間接的に得ることができるという意味で、モノクローナル抗体であってよい。TREM-1抗体は、例えば、実施例に記載の方法を用いて作製し、スクリーニングし、精製することができる。簡単に述べると、TREM-1ノックアウト(KO)マウスまたはTREM-1/TREM-3ノックアウト(KO)マウスなどの適切なマウスを、TREM-1、TREM-1を発現している細胞または両方の組合せを用いて免疫化することができる。
本発明の抗体は、本発明によるモノクローナル抗体の混合物であるという意味で、ポリクローナルであってよい。
ハイブリドーマの上清の一次スクリーニングを、直接ELISAまたはFMATを用いて実施することができ、二次スクリーニングを、フローサイトメトリーを用いて実施することができる。次いで、陽性ハイブリドーマの上清を、レポーター遺伝子アッセイにおいてスクリーニングすることができる。
抗体は、原核細胞または真核細胞において組換えによって発現させることができる。原核細胞は大腸菌であってよい。真核細胞は、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞、例えば、霊長類(例えば、ヒト、チンパンジー、カニクイザルまたはアカゲザルなど)、げっ歯類(例えば、マウスまたはラットなど)、ウサギ類(例えば、ウサギなど)または偶蹄類(ウシ、ヒツジ、ブタまたはラクダなど)である生物体に由来する細胞などであってよい。適切な哺乳動物の細胞株としては、これだけに限定されないが、HEK293細胞、CHO細胞およびHELA細胞が挙げられる。TREM-1抗体は、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイなどの当業者に公知の他の方法の手段によっても作製することができる。
作製されたら、抗体を、例えば全長TREM-1またはその突然変異体との結合について、実施例に記載の方法を用いてスクリーニングすることができる。
本発明の一実施形態は、機能性TREM-1抗体を同定する方法である。TREM-1に特異的に結合することができ、TREM-1活性化および下流のシグナル伝達に対する任意の効果を有する抗体は、本明細書では「機能性TREM-1抗体」と称される。「機能性」TREM-1抗体とは、本明細書では、TREM-1を遮断または刺激することができる抗体を指す。機能性TREM-1抗体を同定する方法は、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞をTREM-1改変剤と一緒にインキュベートした際の前記細胞の活性を測定する工程と、(c)(b)の共培養物をTREM-1抗体と接触させる工程と、(d)第1の細胞の活性が、(b)において測定された活性よりも低い、または高いことを測定する工程とを含む。
(a)の「第1の細胞」は、造血起源の細胞、例えば、骨髄細胞など、例えば、T細胞などであってよい。(a)のシグナル伝達タンパク質は、TREM-1と複合体を形成することができる任意のシグナル伝達タンパク質であってよい。適切なシグナル伝達タンパク質としては、DAP10、DAP12、TCRゼータ、FcガンマRIIIおよびFc受容体、またはその一部が挙げられる。(a)のレポーター構築物は、シグナル伝達タンパク質によって活性化され、認識できるシグナルを生成することができる任意の構築物であってよい。適切なレポーター構築物は、転写因子およびレポーター遺伝子を含む。シグナル伝達タンパク質は、NFATおよびNFkBからなる群から選択される転写因子を介してシグナルを伝達することができる。レポーター遺伝子は、前記第1の細胞においてはネイティブに発現されない遺伝子であり、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼをコードする遺伝子であってよい。前記第1の細胞に、当技術分野で周知の方法を用いて転写因子およびレポーター遺伝子をトランスフェクトすることができる。
実施例に記載の「BWZ/hTREM-1レポーター細胞」は「第1の細胞」の1つの例である。
(b)の改変剤は、TREM-1リガンドまたは活性化された好中球であってよい。(c)の「TREM-1抗体」は、TREM-1に特異的なハイブリドーマの上清または精製された抗体であってよい。(d)において測定される活性は、レポーター構築物によって生じるシグナルである。そのようなシグナル伝達の例は、NFATに駆動されるLacZ(β-ラクタマーゼルシフェラーゼ)産生によって引き起こされる発光である。
方法は、遮断性TREM-1抗体を同定するように調整することができる。遮断性TREM-1抗体を同定する方法は、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞を活性化された好中球と一緒にインキュベートした際の前記細胞の活性を測定する工程と、(c)第1の細胞および活性化された好中球の共培養物をTREM-1抗体と接触させる工程と、(d)第1の細胞の活性が(b)において測定された活性よりも低いことを測定する工程とを含む。
方法は、刺激性TREM-1抗体を同定するように調整することもできる。刺激性TREM-1抗体を同定する方法は、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞の活性を測定する工程と、(c)前記細胞をTREM-1抗体と接触させる/インキュベートする工程と、(d)第1の細胞の活性が(b)において測定された活性よりも高いことを測定する工程とを含む。
本発明は、本明細書において開示されている、遮断抗体を同定する方法によって同定することができる遮断性TREM-1抗体に関する。上記および実施例に記載の方法を用いて試験する場合、本発明による抗体は、100μg/ml未満、例えば、90μg/ml未満など、例えば、80μg/ml未満など、例えば、70μg/ml未満など、例えば、60μg/ml未満など、例えば、50μg/ml未満など、例えば、40μg/ml未満など、例えば、30μg/ml未満など、例えば、20μg/ml未満など、例えば、10μg/ml未満など、例えば、5μg/ml未満など、例えば、1μg/ml未満などの濃度で、前記第1の細胞の活性を50%、例えば、60%など、例えば、70%など、例えば、80%など、例えば、90%など、例えば、95%など、例えば、100%など低下させることができうる。本発明による抗体は、第1の細胞の活性を完全に消失させることができうる。上記および実施例に記載の方法を用いて試験する場合、本発明による抗体は、1μg/ml未満、例えば、0.9μg/ml未満など、例えば、0.8μg/ml未満など、例えば、0.7μg/ml未満など、例えば、0.6μg/ml未満など、例えば、0.5μg/ml未満など、例えば、0.4μg/ml未満など、例えば、0.3μg/ml未満など、例えば、0.2μg/ml未満などの濃度で第1の細胞の活性を消失させることができうる。
本発明は、本明細書において開示されている方法以外の手段によって同定することができる遮断性TREM-1抗体にも関する。
「抗体」という用語は、本明細書では、抗原(TREM-1)またはその一部に特異的に結合することができる、生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するタンパク質を指す。この用語は、任意のクラスまたはアイソタイプ(すなわち、IgA、IgE、IgG、IgMおよび/またはIgY)の全長抗体ならびに任意のその単鎖または断片を包含する。抗原またはその一部に特異的に結合する抗体は、排他的にその抗原またはその一部に結合することができる、または、限られた数の相同な抗原またはその一部に結合することができる。全長抗体は、通常は少なくとも4つのポリペプチド鎖を含む:ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含んでよい。特に薬学的に興味深い1つの免疫グロブリンサブクラスはIgGファミリーである。ヒトでは、IgGクラスは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて4つのサブクラス: IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に細分することができる。軽鎖は、それらの配列組成の差異に基づいてカッパおよびラムダの2つの種類に分けることができる。IgG分子は、2つ以上のジスルフィド結合によって連鎖した2つの重鎖、および、それぞれがジスルフィド結合によって重鎖に付着した2つの軽鎖で構成される。重鎖は、重鎖可変領域(VH)および最大3つの重鎖定常(CH)領域:CH1、CH2およびCH3を含んでよい。軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域(CL)を含んでよい。VH領域およびVL領域は、さらに、フレームワーク領域(FR)と称されるより保存された領域が散在する相補性決定領域(CDR)と称される超可変性の領域に細分することができる。VH領域およびVL領域は、一般には、3つのCDRおよび4つのFRで構成され、それらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置されている。重鎖および軽鎖の超可変領域は、抗原と相互作用することができる[結合]ドメインを形成し、一方、抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、これだけに限定されないが、種々の免疫系の細胞(エフェクター細胞)、Fc受容体および古典的補体系の第1の成分(Clq)を含めた宿主組織または因子の結合を媒介しうる。
本発明の抗体は単離することができる。「単離された抗体」という用語は、それが生じた環境中の他の成分から分離および/もしくは回収され、かつ/またはそれが生じた環境中に存在する成分の混合物から精製された抗体を指す。
抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって成されうることが示されているので、本発明に関しては抗体の特定の抗原結合性断片が適しうる。抗体の「抗原結合性断片」という用語は、本明細書に記載のTREM-1などの抗原に特異的に結合する能力を保持する1つまたは複数の抗体の断片を指す。抗原結合性断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab‘)2、F(ab)S、Fv(一般には、抗体の単一の腕のVLドメインおよびVHドメイン)、単鎖Fv(scFv;例えば、Birdら、Science 1988年;242:42S〜426頁;およびHustonら PNAS 1988年;85:5879〜5883頁を参照されたい)、dsFv、Fd(一般には、VHドメインおよびCHIドメイン)、およびdAb(一般には、VHドメイン)断片;VH、VL、VhH、およびV-NARドメイン;単一のVHおよび単一のVL鎖を含む一価の分子;ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびカッパボディ(例えば、Illら. Protein Eng 1997年;10:949〜57頁を参照されたい);ラクダIgG;IgNAR;ならびに1つまたは複数の単離されたCDRまたは機能性パラトープが挙げられ、単離されたCDRまたは抗原結合性の残基またはポリペプチドは、機能性抗体断片が形成されるように会合または連結し合わせることができる。種々の種類の抗体断片が、例えば、HolligerおよびHudson、Nat Biotechnol 2005年;2S:1126〜1136頁;WO2005040219、および米国特許出願公開第20050238646号および同第20020161201号に記載または概説されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を用いて得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングすることができる。
本発明の抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であってよい。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、フレームワーク領域の少なくとも一部分および/またはCDR領域の少なくとも一部分がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を包含するものとする。(例えば、ヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有してよい)。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroにおけるランダム突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発によってまたはin vivoにおける体細胞突然変異によって導入された突然変異)を含んでよい。
そのようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってよい。そのようなヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞と融合した、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得たB細胞を含むハイブリドーマによって作製することができる。
ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系配列の選択で築き、天然および合成の配列多様性によりさらに多様化した配列ライブラリーから単離することができる。
ヒト抗体は、ヒトリンパ球をin vitroにおいて免疫化し、その後、リンパ球を、エプスタイン・バーウイルスを用いて形質転換することによって調製することができる。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、任意の修飾された形態のヒト抗体、例えば、抗体と別の作用剤または抗体のコンジュゲートなどを指す。
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列(CDR領域またはその一部)を1つまたは複数含有するヒト/非ヒトキメラ抗体を指す。したがって、ヒト化抗体は、少なくともレシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、配列組成および機能性を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種由来の抗体(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのFR残基を対応する非ヒト残基で置き換える。そのような修飾の例は、一般にはドナー抗体に由来するアミノ酸残基である、いわゆる逆突然変異の1つまたは複数の導入である。抗体のヒト化は、当業者に公知の組換え技法を用いて行うことができる(例えば、Antibody Engineering、Methods in Molecular Biology、248巻、Benny K. C. Lo編を参照されたい)。軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方について、例えば、配列または構造的な相同性によって適切なヒトレシピエントフレームワークを同定することができる。あるいは、固定されたレシピエントフレームワークを、例えば、構造、生物物理学的性質および生化学的性質に関する知見に基づいて使用することができる。レシピエントフレームワークは、生殖細胞系由来であってよく、または成熟抗体配列に由来してもよい。ドナー抗体由来のCDR領域は、CDR移植によって移行することができる。CDR移植されたヒト化抗体は、例えば、親和性、機能性および生物物理学的性質について、ドナー抗体由来のアミノ酸残基の再導入(逆突然変異)がヒト化抗体の性質に有益な影響を及ぼす重大なフレームワークの位置を同定することによってさらに最適化することができる。ドナー抗体由来逆突然変異に加えて、ヒト化抗体は、CDR領域またはフレームワーク領域内の生殖細胞系残基を導入すること、免疫原性エピトープを排除すること、部位特異的突然変異誘発、親和性成熟化などによって遺伝子工学的に操作することができる。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。これらの修飾を行って、抗体性能をさらに洗練させる。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、FR残基の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFR残基である可変ドメインを少なくとも1つ、一般には2つ含む。ヒト化抗体は、場合によって、免疫グロブリン定常領域(Fc)、一般にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分も含む。
「ヒト化抗体誘導体」という用語は、任意の修飾された形態のヒト化抗体、例えば、抗体と別の作用剤または抗体のコンジュゲートなどを指す。
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、一般には、異なる種が起源である免疫グロブリンの可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から遺伝子工学によって構築されたものである抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変性セグメントをヒト定常セグメントにつなげることができる。
抗体の結晶化可能断片領域(「Fc領域」/「Fcドメイン」)は、抗体のN末端領域であり、定常CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。Fcドメインは、Fc受容体と称される細胞表面受容体、ならびに補体系のいくつかのタンパク質と相互作用することができる。Fc領域により、抗体が免疫系と相互作用することが可能になる。本発明の一態様では、抗体は、Fc領域内に修飾を含むように、一般には、とりわけ、血清半減期、補体結合、Fc-受容体結合性、タンパク質の安定性および/または抗原依存性細胞傷害性、またはその欠如などの、その機能的性質の1つまたは複数が変更されるように工学的に操作する。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することもでき(例えば、1つまたは複数の化学的部分を抗体に付着させることができる)、そのグリコシル化が変更されるように、さらに抗体の1つまたは複数の機能的性質が変更されるように修飾することもできる。修飾されたFcドメインを有しうるIgG1抗体は、それぞれ特定のFc受容体の親和性の低下をもたらす突然変異(L234A、L235E、およびG237A)およびC1qに媒介される補体結合の低下をもたらす突然変異(A330SおよびP331S)の1つまたは複数、あるいは全てを含む(EU指標による残基の番号付け)。
本発明の抗体のアイソタイプは、IgG、例えば、IgG1など、例えば、IgG2など、例えば、IgG4などであってよい。所望であれば、抗体のクラスは公知の技法によって「スイッチ」することができる。例えば、最初にIgM分子として作製された抗体をIgG抗体にクラススイッチすることができる。クラススイッチ技法を用いて、あるIgGサブクラスを別のIgGサブクラスに、例えば、IgG1からIgG2もしくはIgG4に、IgG2からIgG1もしくはIgG4に、またはIgG4からIgG1もしくはIgG2に変換することもできる。異なるIgGサブクラス由来の領域を組み合わせることによって定常領域キメラ分子を生成するための抗体の遺伝子工学的操作も実施することができる。
一実施形態では、CH1のヒンジ領域を、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変更される、例えば、増加または減少するように修飾する。この手法は、例えば、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号においてさらに説明されている。
定常領域は、抗体が安定化するように、例えば、二価の抗体が2つの一価のVH-VL断片に分離するリスクが低下するように修飾することができる。例えば、lgG4定常領域において、残基S228(EU指標による残基の番号付け)をプロリン(P)残基に突然変異させて、ヒンジにおける重鎖間のジスルフィド架橋形成を安定化することができる(例えば、Angalら、Mol Immunol. 1995; 30: 105〜8頁を参照されたい)。
抗体またはその断片は、それらの相補性決定領域(CDR)に関して定義することもできる。「相補性決定領域」または「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合性に関与するアミノ酸残基が位置している抗体の領域を指す。超可変性の領域またはCDRは、抗体可変ドメインのアミノ酸アラインメントにおいて変動性が最も高い領域として同定することができる。CDRを同定するために、Kabatデータベースなどのデータベースを使用することができ、例えば、CDRは軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)および89〜97(L3)、ならびに重鎖可変ドメインの31〜35(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3)を含むと定義される;(Kabatら、 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91〜3242頁)。あるいは、CDRは、「超可変ループ」(軽鎖可変ドメインの残基26〜33(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)、ならびに重鎖可変ドメインの26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3);ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol 1987; 196: 901〜917頁)由来の残基と定義することができる。一般には、この領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabatら、上記に記載の方法によって行われる。「Kabat位置」、「Kabat残基」、および「Kabatによる」などの句は、本明細書では、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについてのこの番号付け系を指す。Kabat番号付け系を使用して、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク(FR)またはCDRの短縮、またはそこへの挿入に対応する、より少ないまたは追加的なアミノ酸を含有してよい。例えば、重鎖可変ドメインは、CDR H2の残基52の後ろにアミノ酸挿入(Kabatによるによる残基52a、52bおよび52c)、および重鎖FR残基82の後ろに残基の挿入(例えば残基82a、82b、および82cなど、Kabatによる)を含んでよい。残基のKabat番号付けは、所与の抗体について、「標準の」Kabat番号を付した配列を有する抗体の配列と相同の領域においてアラインメントすることによって決定することができる。
「フレームワーク領域」または「FR」残基という用語は、本明細書で定義されているCDR内にはないVHまたはVLのアミノ酸残基を指す。
m14F69抗体は、配列配列番号2に示されている可変性重鎖および配列番号3に示されている可変性軽鎖配列を有する。本発明の抗体は、この可変性重鎖配列および/またはこの可変性軽鎖配列を含んでよい。m14F69抗体は、配列番号2のアミノ酸31〜35、50〜68および101〜110、ならびに配列番号3のアミノ酸24〜38、54〜60および93〜101に示されているCDR配列を有する。本発明の抗体は、これらのCDR配列の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ全てを含んでよい。本発明の抗体は、配列番号2のアミノ酸101〜110を含んでよい。
本発明による抗体の重鎖は、配列番号2のアミノ酸31〜35(TYAMH)のCDR1配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の重鎖は、配列番号2のアミノ酸50〜68(RIRTKSSNYATYYADSVKD)のCDR2配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つまたは3つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の重鎖は、配列番号2のアミノ酸101〜110(DMGQRRQFAY)のCDR3配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つまたは3つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の軽鎖は、配列番号3のアミノ酸24〜38(RASESVDTFDYSFLH)のCDR1配列を含んでよく、これらのアミノ酸の1つ、2つまたは3つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の軽鎖は、配列番号3のアミノ酸54〜60(RASNLES)のCDR2配列を含んでよく、これらのアミノ酸の1つまたは2つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の軽鎖は、配列番号3のアミノ酸93〜101(QQSNEDPYT)のCDR3配列を含んでよく、これらのアミノ酸の1つまたは2つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
mAb 0170抗体は、配列番号4に示されている重鎖配列および配列番号5に示されている軽鎖配列を有する。本発明の抗体は、この重鎖配列および/またはこの軽鎖配列を含んでよい。mAb 0170抗体は、配列番号4のアミノ酸31〜35、50〜68および101〜110、ならびに配列番号5のアミノ酸24〜38、54〜60および93〜101に示されているCDR配列を有する。本発明の抗体は、これらのCDR配列の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ全てを含んでよい。
mAb 0122抗体は、配列番号6に示されている重鎖配列および配列番号7に示されている軽鎖配列を有する。本発明の抗体は、この重鎖配列および/またはこの軽鎖配列を含んでよい。mAb 0122抗体は、配列番号6のアミノ酸31〜35、50〜68および101〜110、ならびに配列番号7のアミノ酸24〜38、54〜60および93〜101に示されているCDR配列を有する。本発明の抗体は、これらのCDR配列の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ全てを含んでよい。
本発明による抗体の重鎖は、配列番号4または配列番号6のアミノ酸31〜35(TYAMH)のCDRH1配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つは異なるアミノ酸残基で置換されていてよい。
本発明による抗体の重鎖は、配列番号4または配列番号6のアミノ酸50〜68(RIRTKSSNYATYYAASVKG)のCDRH2配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つまたは3つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の重鎖は、配列番号4のアミノ酸101〜110(DMGIRRQFAY)のCDRH3配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つまたは3つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の重鎖は、配列番号6のアミノ酸101〜110(DMGQRRQFAY)のCDRH3配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つまたは3つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の軽鎖は、配列番号5または配列番号7のアミノ酸24〜38(RASESVDTFDYSFLH)のCDRL1配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つまたは3つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の軽鎖は、配列番号5または配列番号7のアミノ酸54〜60(RASNLES)のCDRL2配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つまたは2つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
本発明による抗体の軽鎖は、配列番号5または配列番号7のアミノ酸93〜101(QQSNEDPYT)のCDRL3配列を含んでよく、これらのアミノ酸のうちの1つまたは2つは異なるアミノ酸で置換されていてよい。
m14F128抗体は、配列番号8に示されている重鎖および配列番号9に示されている軽鎖を有する。本発明の抗体は、この可変性重鎖配列および/またはこの可変性軽鎖配列を含んでよい。m14F128抗体は、配列番号8のアミノ酸31〜35、50〜68および101〜110、ならびに配列番号9のアミノ酸24〜38、54〜60および93〜101に示されているCDR配列を有する。本発明の抗体は、これらのCDR配列の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ全てを含んでよい。
m14F113抗体は、配列番号10に示されている重鎖および配列番号11に示されている軽鎖を有する。本発明の抗体は、この可変性重鎖配列および/またはこの可変性軽鎖配列を含んでよい。m14F113抗体は、配列番号10のアミノ酸31〜35、50〜68および101〜110、ならびに配列番号11のアミノ酸24〜38、54〜60および93〜101に示されているCDR配列を有する。本発明の抗体は、これらのCDR配列の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ全てを含んでよい。本発明の抗体は、配列番号10のアミノ酸101〜110を含んでよい。
「抗原」(Ag)という用語は、免疫適格性脊椎動物を免疫化して、Agを認識する抗体(Ab)を産生させるために使用される分子実体を指す。本明細書では、Agはより広範に称され、一般に、Abによって特異的に認識される標的分子を包含し、したがって、Abを生成するために用いられる免疫プロセス、または他のプロセス、例えばファージディスプレイにおいて使用される分子の断片または模倣物を包含するものとする。
「エピトープ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体(Ab)などの「抗原結合性ポリペプチド」と、その対応する抗原(Ag)との間の分子相互作用に関して定義される。一般に、「エピトープ」とは、Abが特異的に結合するAg上の区域または領域、すなわち、Abと物理的に接触する区域または領域を指す。物理的接触は、Ab分子およびAg分子内の原子についての種々の基準(例えば、距離のカットオフ2〜6Å、例えば、3Åなど、例えば、4Åなど、例えば、5Åなど;または溶媒露出度)を用いて定義することができる。タンパク質エピトープは、Abとの結合に直接関与するAg内のアミノ酸残基(エピトープの免疫優性成分とも称される)および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、Abによって有効に遮断されるAgのアミノ酸残基、すなわちAbの「溶媒排除表面(solvent-excluded surface)」および/または「フットプリント」内のアミノ酸残基などを含んでよい。
エピトープという用語は、本明細書では、TREM-1抗体に特異的に結合する、TREM-1の任意の特定の領域内の両方の種類の結合領域を含む。TREM-1は、いくつもの異なるエピトープを含んでよく、エピトープは、これだけに限定することなく、成熟TREM-1コンフォメーション内の互いと近くに位置する1つまたは複数の連続していないアミノ酸からなるコンフォメーションエピトープ、および、全部または一部において、TREM-1と共有結合により付着した分子構造、例えば、炭水化物基などからなる翻訳後エピトープを含んでよい。
所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)対に関するエピトープは、種々の実験的なエピトープマッピング方法およびコンピュータによるエピトープマッピング方法を用いて異なる詳細度のレベルで説明し、特徴付けることができる。実験的な方法としては、突然変異誘発、X線結晶構造解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、水素重水素交換質量分析(HX-MS)および種々の競合結合方法;当技術分野で公知の方法が挙げられる。各方法は独特の原理に依拠するので、エピトープについての説明は、それを決定した方法と密接に関連する。したがって、用いたエピトープのマッピング方法に応じて、所与のAb/Ag対に関するエピトープは違うように説明される。
最も詳細なレベルでは、AgとAbとの間の相互作用に関するエピトープは、Ag-Ab相互作用において存在する原子の接触を定義する空間的座標、ならびに結合の熱力学的性質へのそれらの相対的な寄与に関する情報によって説明することができる。より低い詳細度のレベルでは、エピトープは、AgとAbとの間の原子の接触を定義する空間的座標によって特徴付けることができる。さらに低い詳細度のレベルでは、エピトープは、それに含まれるアミノ酸残基によって、Ab:Ag複合体内の原子間の距離またはその溶媒露出度などの特定の基準によって定義される通り特徴付けることができる。さらに低い詳細度のレベルでは、エピトープは、機能によって、例えば他のAbとの競合結合によって特徴付けることができる。エピトープは、より一般的に、別のアミノ酸によって置換することによってAbとAgとの間の相互作用の特性が変更されるアミノ酸残基を含むと定義することもできる。
Ab、例えばFab断片とおよびそのAgとの間の複合体の空間的座標によって定義される、X線により得られる結晶構造に関しては、エピトープという用語は、本明細書では、別段の指定がある場合または文脈と矛盾する場合を除き、Ab内の重原子から、例えば4Åの距離内に重原子(すなわち、非水素原子)を有することを特徴とするTREM-1残基と明確に定義される。
用いるエピトープのマッピング方法に左右されるエピトープの説明および定義は異なる詳細度のレベルで得られるという事実から、同じAgに対する異なるAbについてのエピトープの比較も同様に異なる詳細度のレベルで行うことができることになる。
アミノ酸レベルで説明される、例えばX線構造から決定されるエピトープは、同じアミノ酸残基のセットを含有していれば、同一であると言える。エピトープは、少なくとも1つのアミノ酸がそれらのエピトープに共有されていれば、重複していると言える。エピトープは、それらのエピトープに共有されているアミノ酸残基がなければ、別々(独特)であると言える。
エピトープは、野生型ヒトTREM-1に対する抗体の結合カイネティクスと予測エピトープ内にアラニン突然変異を有するヒトTREM-1変異体に対する抗体の結合カイネティクスを比較することによって間接的に定義することもできる。アミノ酸残基がアラニン残基で置き換えられているヒトTREM-1の変異体に対する抗体の親和性が低下するまたは結合が抑止されることにより、突然変異したアミノ酸が前記抗体と野生型ヒトTREM-1との間の相互作用に寄与することが示される。この手法により、エピトープのネガティブアイデンティフィケーション(negative identification)がもたらされる。この方法は、タンパク質のミスフォールディングまたはアンフォールディングにより相互作用の抑止と同様の結果がもたらされるという事実によってエピトープを有効に定義することに妥協する。解析は、交差反応性抗体が存在する場合、オルソロガスな標的タンパク質(例えば、カニクイザルTREM-1)の機能突然変異解析の比較的増加によって補完することができる。比較により、例えばカニクイザルTREM-1と交差反応しない抗体と交差反応性抗体との間のエピトープの差異が定義される。
エピトープの間接的な同定は、野生型抗原(TREM-1)の変異体に対する抗体(または抗体断片)の結合を測定することによってももたらすことができる。抗体またはその断片が、例えば、ヒトTREM-1には結合するがカニクイザルTREM-1には結合せず、前記抗体またはその断片が部分的にヒト化されたカニクイザルTREM-1の変異体に結合することができる場合、この結合の回復により、置換アミノ酸残基が抗体と抗原の相互作用にとって重要であることが示される。同様に、カニクイザルTREM-1に対する結合がヒトTREM-1に対する結合と比較してより弱い抗ヒトTREM-1抗体(またはそのFab断片)の、カニクイザルTREM-1のヒト化変異体に対する親和性が増加することにより、結合性エピトープを構成する残基の同一性に関する情報がもたらされる。
任意の所与の交差反応性抗体に対する同じ突然変異の効果により、可能性のあるタンパク質ミスフォールディング(両方の抗体に対する結合の抑止)とヒトTREM-1における相互作用の喪失(一方の抗体との結合および他方の抗体との結合の抑止)を識別すると同時に、交差反応しない抗体と交差反応性抗体との間のエピトープの差異に関する情報をアミノ酸レベルで明確にもたらすことが可能になる。
本発明の抗体は、ヒトTREM-1の変異体に結合することができうる。本発明の抗体は、例えば表面プラズモン共鳴を用いて決定して、K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6(配列番号13)に結合することができうる。
本発明の抗体は、カニクイザルTREM-1の変異体に結合することができうる。本発明の抗体は、例えば表面プラズモン共鳴を用いて決定して、A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6(配列番号14)に結合することができうる。本発明の抗体は、例えば表面プラズモン共鳴を用いて決定して、A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6(配列番号15)に結合することができうる。
本発明の抗体は、TREM-1に特異的に結合することができえ、前記抗体は、ヒトTREM-1の(i)A21、T22、K23、L24、T25、E26からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、ならびに(ii)A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、I57、I58、R59、D60、G61、E62、M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、ならびに(iii)C113、V114、I115、Y116、Q117、P118およびP119からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に特異的に結合することができる。
本発明の抗体は、例えばHX-MSを用いて決定して、配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸D38〜F48を含むポリペプチドに特異的に結合することができうる。
本発明の抗体は、例えばHX-MSを用いて決定して、配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸残基D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44およびL45のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは全部、ならびに配列番号1(ヒトTREM-1)のE46、K47およびF48からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、または全部を含むエピトープを有してよい。
本発明の抗体は、TREM-1の変異体および表面プラズモン共鳴を用いて決定して、配列番号1(ヒトTREM-1)のD42、E46、D92およびH93からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、3つまたは全部を含むエピトープを有してよい。
本発明の抗体は、TREM-1の変異体および表面プラズモン共鳴を用いて決定して、少なくとも配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸残基E46および/またはD92を含むエピトープを有してよい。
本発明の抗体は、配列番号1(ヒトTREM-1)のL31、I86およびV101からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、または全部をさらに含んでよい。
本発明の抗体は、例えばHX-MSを用いて決定して、カニクイザルTREM-1(配列番号12)のアミノ酸残基E19〜L26、または配列番号21の対応するアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合することができうる。
本発明の抗体は、ヒトTREM-1に特異的に結合することができえ、前記抗体のエピトープは、配列番号1のV39、K40、C41、D42、Y43、L45、E46、K47、F48およびA49からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または全部を含む。
本発明の抗体は、ヒトTREM-1に特異的に結合することができえ、前記抗体のエピトープは、配列番号1のD42を含む。本発明の抗体は、ヒトTREM-1に特異的に結合することができえ、前記抗体のエピトープは、配列番号1のE46を含む。前記抗体のエピトープは、配列番号1のV39、C41、D42、Y43、L45を含んでよい。前記抗体のエピトープは、配列番号1のE46、K47およびA49を含んでよい。前記抗体のエピトープは、配列番号1のF48をさらに含んでよい。
用語「パラトープ」の定義は、上記の「エピトープ」の定義から、視点を逆にすることによって導かれる。したがって、「パラトープ」という用語は、Agと特異的に結合する、すなわちAgと物理的に接触する、Ab上の区域または領域を指す。
Fab断片などのAbとそのAgとの間の複合体の空間的座標によって定義される、X線により得られる結晶構造に関しては、パラトープという用語は、本明細書では、別段の指定がある場合または文脈と矛盾する場合を除き、TREM-1内の重原子から4Åの距離内に重原子(すなわち、非水素原子)を有することを特徴とするAg残基と明確に定義される。
所与の抗体(Ab)/抗原(Ag)対に関するエピトープおよびパラトープは、常套的な方法によって同定することができる。例えば、一般的なエピトープの場所は、異なる断片または変異体TREM-1ポリペプチドに結合する抗体の能力を評価することによって決定することができる。抗体と接触するTREM-1内の特定のアミノ酸(エピトープ)およびTREM-1と接触する抗体内の特定のアミノ酸(パラトープ)も、常套的な方法を用いて決定することができる。例えば、抗体および標的分子を組み合わせることができ、Ab:Ag複合体を結晶化することができる。複合体の結晶構造を決定し、抗体とその標的との間の相互作用の特定の部位を同定するために使用することができる。
同じ抗原に結合する抗体は、それらに共通する抗原に同時に結合するそれらの能力に関して特徴付けることができ、「競合結合」/「ビニング(binning)」に供することができる。この状況において、「ビニング」という用語は、同じ抗原に結合する抗体をグループ分けする方法を指す。抗体の「ビニング」は、表面プラズモン共鳴(SPR)、ELISAまたはフローサイトメトリーなどの標準の技法に基づくアッセイにおける、2つの抗体のそれらに共通する抗原への競合結合に基づいてよい。
抗体の「ビン」は、参照抗体を用いて定義する。第2の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができなければ、第2の抗体は、参照抗体と同じ「ビン」に属すると言える。この場合、参照抗体および第2の抗体は抗原の同じ部分に競合的に結合し、「競合抗体」という語が作られる。第2の抗体が、参照抗体と同時に抗原に結合することができれば、第2の抗体は、別の「ビン」に属すると言える。この場合、参照抗体および第2の抗体は抗原の同じ部分に競合的に結合せず、「非競合抗体」という語が作られる。
抗体「ビニング」では、エピトープに関する直接的な情報はもたらされない。競合抗体、すなわち同じ「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープを有する、重複しているエピトープを有する、または、別のエピトープを有することさえある。後者は、抗原上のそのエピトープに結合した参照抗体が、第2の抗体が抗原上のそのエピトープと接触するために必要な空間を占めている場合である(「立体的な障害」)。非競合抗体は、一般に別のエピトープを有する。
本発明の抗体は、ヒトTREM-1との結合についてmAb 0170と競合することができる。本発明の抗体は、カニクイザルTREM-1との結合についてmAb 0170と競合することができる。言い換えれば、本発明の抗体は、mAb 0170と同じ「ビン」に属してよい。
「結合親和性」という用語は、本明細書では、2つの分子、例えば抗体またはその断片と抗原の間の非共有結合性相互作用の強度の測定を指す。「結合親和性」という用語は、一価の相互作用(内因性の活性)を説明するために使用される。
2つの分子、例えば抗体またはその断片と抗原の間の、一価の相互作用による結合親和性は、平衡解離定数(KD)を決定することによって定量することができる。今度は、KDは、複合体の形成および解離のカイネティクスを、例えばSPR法によって測定することによって決定することができる。一価の複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ会合速度定数ka(またはkon)および解離速度定数kd(またはkoff)と称される。KDは、方程式KD=kd/kaによってkaおよびkdに関連付けられる。
上記の定義に従って、異なる分子相互作用に関連付けられる結合親和性、例えば、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較などを、個々の抗体/抗原複合体についてのKD値を比較することによって比べることができる。
本発明の抗体は、表面プラズモン共鳴を用いて決定して、1×10-7M以下、1×10-8M以下、または1×10-9M以下、または1×10-10M以下、1×10-11M以下、1×10-12M以下または1×10-13M以下の親和性(KD)でヒトTREM-1と結合することができる。本発明の抗体は、表面プラズモン共鳴を用いて決定して、1×10-7M以下、1×10-8M以下、または1×10-9M以下、または1×10-10M以下、1×10-11M以下、1×10-12M以下または1×10-13M以下の親和性(KD)でカニクイザルTREM-1と結合することができる。
「結合特異性」という用語は、本明細書では、抗体またはその断片などの分子と、単一の排他的な抗原との相互作用、または限られた数の高度に相同な抗原(またはエピトープ)との相互作用を指す。対照的に、TREM-1に特異的に結合することができる抗体は、似ていない分子には結合することができない。本発明による抗体は、Nkp44に結合することができなくてよい。
相互作用の特異性および平衡結合定数の値は、周知の方法によって直接決定することができる。リガンド(例えば、抗体など)の、それらの標的に結合する能力を評価するための標準のアッセイは当技術分野で公知であり、それらとしては、例えば、ELISA、ウエスタンブロット、RIA、およびフローサイトメトリー分析が挙げられる。抗体の結合カイネティクスおよび結合親和性も、SPRなどの当技術分野で公知の標準のアッセイによって評価することができる。
抗体と標的との結合を、その標的の別のリガンド、例えば、別の抗体などと標的との結合と比較する競合的結合アッセイを行うことができる。
別の態様では、本発明は、本発明の分子、例えば、本明細書に記載のTREM-1抗体、ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞などを含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された本発明の1つまたは複数のTREM-1抗体を含む医薬組成物を提供する。
したがって、本発明の目的の1つは、そのようなTREM-1抗体を0.25mg/ml〜250mg/mlの濃度、例えば、10〜200mg/ml濃度などで含み、pHが2.0〜10.0、例えば、4.0〜8.0のpHなどである医薬製剤を提供することである。製剤は、緩衝系、防腐剤、等張化剤(tonicity agent)、キレート化剤、安定剤、および/または界面活性物質、ならびにそれらのさまざまな組合せの1つまたは複数をさらに含んでよい。医薬組成物における防腐剤、等張剤(isotonic agent)、キレート化剤、安定剤および界面活性物質の使用は当業者に周知である。Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995年を参照することができる。
一実施形態では、医薬製剤は、水性製剤である。そのような製剤は、一般には、液剤または懸濁剤であるが、コロイド、分散剤、エマルション、および多相材料も包含しうる。「水性製剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む製剤と定義される。同様に、「水性液剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む液剤と定義され、「水を含む水性懸濁剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む懸濁剤と定義される。
別の実施形態では、医薬製剤は、凍結乾燥製剤であり、医師または患者は使用する前にそれに溶媒および/または希釈剤を加える。
別の態様では、医薬製剤は、そのような抗体の水性溶液、および緩衝剤を含み、抗体は、1mg/ml以上の濃度で存在し、前記製剤のpHは約2.0〜約10.0である。
本発明のTREM-1抗体およびそのような抗体を含む医薬組成物は、例えば、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、過敏性腸症候群、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、1型糖尿病、グレーブス病、多発性硬化症(MS)、自己免疫性心筋炎、川崎病、冠動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、強皮症、全身性硬化症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、アレルギー、喘息および急性炎症または慢性炎症のいずれかの結果である他の自己免疫疾患などの炎症性疾患を治療するために使用することができる。
本発明のTREM-1抗体は、炎症性腸疾患の個体の治療において使用するために適しうる。炎症性腸疾患(IBD)は、口から肛門までの胃腸管の任意の部分に影響を及ぼし、多種多様な症状を引き起こす可能性がある疾患である。IBDは、主に、腹痛、下痢(血性でありうる)、嘔吐、または体重減少を引き起こすが、胃腸管の外部の合併症、例えば、皮膚発疹、関節炎、眼の炎症、疲労、および集中力の欠如なども引き起こす可能性がある。IBDの患者は、2つの主要なクラス、潰瘍性大腸炎(UC)の患者とクローン病(CD)の患者に分けることができる。CDは一般に回腸および結腸に関与し、腸の任意の領域に影響を及ぼす可能性があるが、多くの場合、不連続である(疾患の病巣領域は腸中に拡散する)。UCは、常に、直腸(結腸)に関与し、より連続的である。CDでは、炎症は経壁性であり、膿瘍、瘻孔および狭窄が生じるが、UCでは、炎症は一般には粘膜に限局される。クローン病に対する公知の薬学的または外科的治癒法は存在しないが、UCの患者の一部は、結腸の外科的除去によって治癒することができる。治療の選択肢は、症状を制御すること、寛解を維持すること、および、再燃を予防することに制限される。診療所における炎症性腸疾患における有効性は、実験室試験および生活の質の質問票に基づくスコアリング尺度であるCDに対するクローン病活性指数(CDAI)スコアの低下として測定することができる。動物モデルでは、有効性は、大部分は体重の増加によって測定され、便の硬さ、重量および血便の組合せである疾患活性指数(DAI)によっても測定される。
本発明のTREM-1抗体は、関節リウマチの個体の治療において使用するために適しうる。関節リウマチ(RA)は、体の全てとは言わなくともそのほとんどに影響を及ぼす全身疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の1つである。RAは、疼痛、凝り、温感、発赤および腫脹を引き起こす関節の炎症を特徴とする。この炎症は、炎症細胞が関節に侵入し、これらの炎症細胞が骨および軟骨を消化することができる酵素を放出した結果である。結果として、この炎症により、重度の骨および軟骨損傷、ならびに他の生理的影響の中でも関節の悪化および重度の疼痛が導かれる。関与する関節は、その形状およびアラインメントを失い、その結果、疼痛および運動の喪失が生じる可能性がある。
当技術分野で公知の関節リウマチについての動物モデルがいくつか存在する。例えば、コラーゲン誘導関節炎(CIA)モデルでは、マウスにおいてヒト関節リウマチに似た炎症性関節炎が発生している。CIAはRAと同様の免疫学的特徴および病理学的特徴を共有するので、このことにより、このモデルは潜在的なヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための適切なモデルになる。このモデルにおける有効性は、関節の腫脹の減少によって測定する。診療所におけるRAにおける有効性は、関節の腫脹、赤血球沈降速度、C反応性タンパク質レベルおよび抗シトルリン化タンパク質抗体などの血清因子のレベルの組合せとして測定される、患者における症状を減少させる能力によって測定する。
本発明のTREM-1抗体は、乾癬の個体の治療において使用するために適しうる。乾癬は、かなりの不快感を引き起こす可能性があるT細胞に媒介される皮膚の炎症性障害である。乾癬は、現在は治癒法が存在せず、全ての年齢の人に影響を及ぼす疾患である。軽度の乾癬の個体は、多くの場合、局所用剤によってその疾患を制御することができるが、世界的に百万人を超える患者が紫外線治療または全身免疫抑制療法を必要としている。残念ながら、紫外線放射の不自由およびリスク、ならびに多くの療法の毒性により、それらの長期使用が制限される。さらに、患者は、通常、乾癬を再発し、いくつかの場合には、免疫抑制療法を停止した直後にリバウンドする。最近開発されたCD4+T細胞の移入に基づく乾癬のモデルは、ヒト乾癬の多くの態様を模倣し、したがって、乾癬の治療において使用するために適した化合物を同定するために用いることができる(Davenportら、Internat. Immunopharmacol 2: 653〜672、2002年)。このモデルにおける有効性は、スコアリングシステムを使用した皮膚病態の減少によって測定される。同様に、患者における有効性を皮膚病態の減少によって測定する。
本発明のTREM-1抗体は、乾癬性関節炎の個体の治療において使用するために適しうる。乾癬性関節炎(PA)は、乾癬の患者のサブセットにおいて起こる炎症性関節炎の一種である。これらの患者では、皮膚病態/症状は、関節リウマチにおいて見られるものと同様の関節の腫脹を伴う。PAは、スケーリングを伴う、斑状の隆起した赤色の皮膚炎症の領域を特徴とする。乾癬は、多くの場合、肘および膝の先端、頭皮、臍ならびに生殖器領域または肛門の周辺に影響を及ぼす。乾癬を有する患者のおよそ10%で、関連する炎症が関節にも発生する。
「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、それを必要とする任意のヒトまたは他の動物対象の医学療法を指す。前記対象は、医療実践者または獣医療実践者による身体検査を受けていると考えられ、前記実践者は、前記治療を用いることが前記ヒトまたは他の動物対象の健康に有益であると示しうる試験的または決定的な診断をしている。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康の現状などの多くの因子に応じて、個体によって変動しうる。したがって、前記治療は、予防的、待機的、対症的および/または治癒的であってよい。
本発明に関して、予防的治療、待機的治療、対症的治療および/または治癒的治療は、本発明の別々の態様を示しうる。
本発明の抗体は、例えば、静脈内など、例えば、筋肉内など、例えば、皮下など、非経口的に投与することができる。あるいは、本発明の抗体は、例えば、経口的、または局所的など、経口経路によって投与することができる。本発明の抗体は、予防的に投与することができる。本発明の抗体は、治療的に(要望に応じて)投与することができる。
例示的な実施形態
1.機能性TREM-1抗体を同定する方法であって、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞をTREM-1改変剤と一緒にインキュベートした際の前記細胞の活性を測定する工程と、(c)(b)の培養物をTREM-1抗体と接触させる工程と、(d)第1の細胞の活性が、(b)において測定された活性よりも低い、または高いことを測定する工程とを含む方法。
2.遮断性TREM-1抗体を同定する方法であって、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞を活性化された好中球と一緒にインキュベートした際の前記細胞の活性を測定する工程と、(c)第1の細胞および活性化された好中球の培養物をTREM-1抗体と接触させるステップと、(d)第1の細胞の活性が(b)において測定された活性よりも低いことを測定する工程とを含む方法。
3.(b)の改変剤が活性化された好中球またはTREM-1リガンドである、実施形態1から2のいずれか1つに記載の方法。
4.刺激性TREM-1抗体を同定する方法であって、(a)TREM-1、シグナル伝達タンパク質およびレポーター構築物を発現している第1の細胞を培養する工程と、(b)第1の細胞の活性を測定する工程と、(c)前記細胞をTREM-1抗体と接触させる/インキュベートする工程と、(d)第1の細胞の活性が(b)において測定された活性よりも高いことを測定する工程とを含む方法。
5.第1の細胞が造血起源のものである、実施形態1から4のいずれか1つに記載の方法。
6.造血起源の細胞が骨髄細胞である、実施形態5に記載の方法。
7.造血起源の細胞がT細胞である、実施形態5に記載の方法。
8.シグナル伝達タンパク質がDAP10である、実施形態1から7のいずれか1つに記載の方法。
9.シグナル伝達タンパク質がDAP12である、実施形態1から7のいずれか1つに記載の方法。
10.シグナル伝達タンパク質がTCRゼータである、実施形態1から7のいずれか1つに記載の方法。
11.シグナル伝達タンパク質がFcガンマRIIIである、実施形態1から7のいずれか1つに記載の方法。
12.シグナル伝達タンパク質がFc受容体である、実施形態1から7のいずれか1つに記載の方法。
13.レポーター構築物が転写因子およびレポーター遺伝子を含む、実施形態1から6のいずれか1つに記載の方法。
14.前記転写因子がNFATである、実施形態13に記載の方法。
15.前記転写因子がNFkBである、実施形態14に記載の方法。
16.前記レポーター遺伝子がβ-ガラクトシダーゼをコードする、実施形態13から15のいずれか1つに記載の方法。
17.前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコードする、実施形態13から15のいずれか1つに記載の方法。
18.前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする、実施形態13から15のいずれか1つに記載の方法。
19.前記レポーター遺伝子がクロラムフェニコールトランスフェラーゼをコードする遺伝子である、実施形態13から15のいずれか1つに記載の方法。
20.遮断性TREM-1抗体を同定する方法であって、(a) TREM-1、DAP12およびルシフェラーゼをコードする遺伝子を発現しているT細胞を培養する工程と、(b)T細胞を活性化された好中球と一緒にインキュベートした際のT細胞の発光を測定する工程と、(c)(b)の共培養物をTREM-1抗体と接触させる工程と、(d)T細胞の発光が、(b)において測定された活性よりも低いことを測定する工程とを含む方法。
21.前記細胞がBWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ T細胞株である、実施形態7に記載の方法。
22.実施形態1から3および実施形態5から21のいずれか1つに記載の方法によって同定される抗体。
23.TREM-1に特異的に結合することができ、TREM-1機能を遮断することができる抗体。
24.TREM-1の二量体化/多量体化を妨げるまたは減少させることができる、実施形態22から23のいずれか1つに記載の抗体。
25.TREM-1とそのリガンドとの間の相互作用を遮断することができる、実施形態22から24のいずれか1つに記載の抗体。
26.PGLYRP1に誘導されるTREM-1の機能を遮断することができる、実施形態22から25のいずれか1つに記載の抗体。
27.TREM-1がヒトTREM-1である、実施形態22から26のいずれか1つに記載の抗体。
28.ヒトとは別の種由来のTREM-1にも特異的に結合し、その機能を遮断することができる、実施形態27に記載の抗体。
29.別の種由来のTREM-1がカニクイザルTREM-1である、実施形態28に記載の抗体。
30.別の種由来のTREM-1がアカゲザルTREM-1である、実施形態28に記載の抗体。
31.K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6(配列番号13)に特異的に結合することができる、実施形態22から30のいずれか1つに記載の抗体。
32.A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6(配列番号14)に特異的に結合することができる、実施形態22から31のいずれか1つに記載の抗体。
33.A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6(配列番号15)に特異的に結合することができる、実施形態22から32のいずれか1つに記載の抗体。
34.ヒトTREM-1との結合についてmAb 0170と競合する、実施形態22から33のいずれか1つに記載の抗体。
35.カニクイザルTREM-1との結合についてmAb 0170と競合する、実施形態22から34のいずれか1つに記載の抗体。
36.例えばHX-MSを用いて決定して、配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸D38〜F48を含むポリペプチドに特異的に結合することができる、実施形態22から35のいずれか1つに記載の抗体。
37.例えばHX-MSを用いて決定して、配列番号1(ヒトTREM-1)のD38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44およびL45からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは全部、ならびに配列番号1(ヒトTREM-1)のE46、K47およびF48からなる群から選択されるアミノ酸残基の1つ、2つ、または全部を含むエピトープを有する、実施形態22から36のいずれか1つに記載の抗体。
38.例えばHX-MSを用いて決定して、カニクイザルTREM-1のアミノ酸残基E38〜L45を含むポリペプチドに特異的に結合することができる、実施形態22から37のいずれか1つに記載の抗体。
39.表面プラズモン共鳴を用いて決定して、少なくとも配列番号1(ヒトTREM-1)のD42、E46、D92およびH93からなる群から選択されるアミノ酸残基を含むエピトープを有する、実施形態22から38のいずれか1つに記載の抗体。
40.表面プラズモン共鳴を用いて決定して、少なくとも配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸残基E46および/またはD92を含むエピトープを有する、実施形態22から39のいずれか1つに記載の抗体。
41.ヒトTREM-1の(i)A21、T22、K23、L24、T25、E26からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、ならびに(ii)A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、I57、I58、R59、D60、G61、E62、M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、ならびに(iii)C113、V114、I115、Y116、Q117、P118およびP119からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に特異的に結合することができる、実施形態22から40のいずれか1つに記載の抗体。
42.(i)V39、K40、C41、D42、Y43、T44、L45、E46、K47、F48、A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、および(ii)T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、および(iii)C113、V114、I115、Y116、Q117、P118、P119からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基に特異的に結合することができる、実施形態22から40のいずれか1つに記載の抗体。
43.重鎖が、配列番号4のアミノ酸残基101〜110(DMGIRRQFAY)に対応するCDRH3配列であって、前記アミノ酸残基の1つ、2つまたは3つが異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRH3配列を含む、実施形態22から42のいずれか1つに記載の抗体。
44.重鎖が、配列番号6のアミノ酸残基101〜110(DMGQRRQFAY)に対応するCDRH3配列であって、1つ、2つまたは3つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRH3配列を含む、実施形態22から42のいずれか1つに記載の抗体。
45.配列番号4もしくは配列番号6のアミノ酸残基31〜35(TYAMH)に対応するCDRH1配列であって、これらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基で置換されていてよいCDRH1配列、および/または配列番号4または配列番号6のアミノ酸50〜68(RIRTKSSNYATYYAASVKG)に対応するCDRH2配列であって、前記アミノ酸の1つ、2つまたは3つが異なるアミノ酸残基で置換されていてよいCDRH2配列をさらに含む、実施形態43から44のいずれか1つに記載の抗体。
46.軽鎖が、配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基24〜38(RASESVDTFDYSFLH)に対応するCDRL1配列であって、これらのアミノ酸残基の1つ、2つまたは3つが異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRL1配列、および/または配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基54〜60(RASNLES)に対応するCDRL2配列であって、これらのアミノ酸残基の1つまたは2つが異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRL2配列、および/または配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基93〜101(QQSNEDPYT)に対応するCDRL3配列であって、これらのアミノ酸残基の1つまたは2つが異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRL3配列を含む、実施形態43から45のいずれか1つに記載の抗体。
47.配列番号4もしくは配列番号6および/または配列番号5もしくは配列番号7を含む、実施形態43から46のいずれか1つに記載の抗体。
48.表面プラズモン共鳴を用いて決定して、1×10-7M以下、1×10-8M以下、または1×10-9M以下、または1×10-10M以下、1×10-11M以下、1×10-12M以下または1×10-13M以下の結合親和性(KD)でヒトTREM-1に結合する、実施形態22から47のいずれか1つに記載の抗体。
49.前記結合親和性(KD)が1×10-10M以下である、実施形態48に記載の抗体。
50.表面プラズモン共鳴を用いて決定して、1×10-7M以下、1×10-8M以下、または1×10-9M以下、または1×10-10M以下、1×10-11M以下、1×10-12M以下または1×10-13M以下の結合親和性(KD)でカニクイザルTREM-1に結合する、実施形態22から49のいずれか1つに記載の抗体。
51.前記結合親和性が1×10-9M以下である、実施形態50に記載の抗体。
52.IgGである、実施形態22から51のいずれか1つに記載の抗体。
53.医薬として使用するための、実施形態22から52のいずれか1つに記載の抗体。
54.自己免疫疾患および/または慢性炎症を治療するための、実施形態22から53のいずれか1つに記載の抗体。
55.自己免疫疾患および/または慢性炎症を治療するための医薬を製造するための、実施形態22から52のいずれか1つに記載の抗体。
56.実施形態22から52のいずれか1つに記載の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、自己免疫疾患および/または慢性炎症を治療する方法。
57.前記自己免疫疾患が関節リウマチである、実施形態53から55までのいずれか1つに記載の使用または実施形態56に記載の方法。
58.前記自己免疫疾患がクローン病である、実施形態53から55のいずれか1つに記載の使用または実施形態56に記載の方法。
59.前記自己免疫疾患が潰瘍性大腸炎である、実施形態53から55のいずれか1つに記載の使用または実施形態56に記載の方法。
60.前記自己免疫疾患が乾癬性関節炎である、実施形態53から55のいずれか1つに記載の使用または実施形態56に記載の方法。
本発明は、さらに限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。全ての図面ならびに本出願全体を通して引用された全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、明白に参照により本明細書に組み込まれる。
(実施例)
(実施例1)
BWZ.36ヒトTREM-1:DAP12安定細胞株の生成
BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ細胞株(本明細書では「BWZ/hTREM-1レポーター細胞」とも称される)は、BW5147 T細胞(ハツカネズミ(Mus musculus)胸腺リンパ腫細胞株、ATCC TIB-47、LGC Standards、Middelsex、UK)に由来し、NFATプロモーターエレメントの4つのコピーによって調節されるLacZレポーター構築物を含有する(Karttunen, J. & Shastri、N.(1991年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88、3972-3976頁およびFiering, S.、Northrop, J. P.、Nolan, G. P.、Matilla, P.、Crabtree, G. R. & Herzenberg, L. A.(1990年)Genes Dev. 4、1823-1834頁を参照されたい)。TREM-1 cDNA(Gene Bank Ref. ID: NM_018643.2,Sino Biological Inc.、Beijing,China)を鋳型として、ならびにオリゴ5' TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG配列番号16)および5' TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC(配列番号17)をプライマーとして使用してpIREShygベクターGenBank受託番号U89672(Cat番号6061-1、Clontech Laboratories、CA、USA)にクローニングしたTREM/DAP12/pMX-IRESベクター(SmaI部位からBamHI部位までのTREM-1の786bpをコードする)を、Superfectトランスフェクション試薬(Cat番号301305、Qiagen Nordic、Denmark)を使用してPLAT-Eパッケージング細胞株(W. Yokoyama、Washington Universityにより提供された;あるいは、Cat番号RV-101、Cell Biolabs Inc、Bio-Mediator KY、Vantaa、Finland)にトランスフェクトした。TREM/DAP12/pMX-IRESウイルス粒子を含有するPLAT-E上清を使用して、BWZ.36細胞を以下の通り感染させた
: BWZ.36細胞2x105個を6ウェルプレートで培養し、培地を、ウイルス粒子を含有する上清+8mg/mlのポリブレン1.5mlと交換した。6〜8時間後、通常培地1.5mlをプレートに加え、細胞をさらに24時間インキュベートした。TREM-1を安定に発現しているBWZ.36細胞株を、抗TREM-1モノクローナル抗体(クローン21C7)を用いて染色し、細胞選別によって単離した。
(実施例2)
BWZ.36ヒトTREM-1:DAP12安定細胞株の培養(cultivation)
10%FCS(Cat番号16140-071、Gibco、New York、USA)、1%Pen/Strep(Cat番号15070-06、Gibco)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Cat番号11360、Gibco)、5μMの2ME(Cat番号31350-010、Gibco)および2mMのL-グルタミン(Cat番号25030、Gibco)を補充したフェノールレッド不含RPMI 1640(Cat番号11835、Gibco、Carlsbad CA、USA)中でBWZ/hTREM-1レポーター細胞を培養した。特別なプレートまたはコーティングは必要なかった。Versene(Cat番号15040、Gibco)10mlを加えて、細胞を剥離し、次いでそれをチューブに移し、1200rpmで5分遠心分離し、新鮮なフェノールレッド不含RPMI 1640中で洗浄した。次いで、これらの細胞について、アッセイに使用するための準備をし、またはさらに繁殖させるために再培養した。
(実施例3)
マウスの免疫化およびmAbの同定
ヒトTREM-1に結合する抗体を生成するために、野生型Balb/CマウスおよびTREM-1ノックアウト(KO)マウス(C57BL/6バックグラウンド)をどちらも、ヒト(h)TREM-1(配列番号1)、hTREM-1を発現している細胞(BWZ.36細胞)、または両方の組合せを用いて免疫化した。hTREM-1を発現しているBWZ.36細胞を使用し、hTREM-1タンパク質に対する直接ELISAによって、またはFMATによってのいずれかで一次スクリーニングを行った。HTREM-1を発現しているHEK293細胞に対するフローサイトメトリーによって二次スクリーニングを行った。次いで、陽性ハイブリドーマの上清を実施例4に記載のBWZ/hTREM-1レポーターアッセイにおいてスクリーニングした。
遮断抗体の最高数はhTREM-1タンパク質を用いて2週間の間隔で6回免疫化し、その後、追加免疫注射を行ったKOマウスから得られた。全部で、200超のhTREM-1抗体が単離され、その後、そのうちのおよそ70が遮断効果を有することが見いだされた。
TREM-1に特異的なハイブリドーマの上清を全て、BWZ/hTREM-1レポーターアッセイにおいてまず上清として試験し、その後に精製された抗体として試験し、どちらも可溶性抗体として、およびプレートに結合させた抗体としての両方で5000ng/mlから7ng/mlまで完全に力価決定した。さまざまな異なるドナー由来の血液を新鮮な好中球の供給源として使用した。例として、図4は、1つの融合物由来の抗体を示し、レポーターアッセイにおける活性が遮断活性としてx軸に示されており、抗体をプレートに結合させた際の作動性活性がy軸に示されている。
(実施例4)
好中球で発現されるTREM-1リガンドとしてのPGLYRP1の同定
免疫沈降と質量分析(IP-MS)を合わせて用いることによってPGLYRP1をTREM-1リガンドとして同定した。リガンドを同定するための親和性「ベイト」分子として可溶性TREM-1四量体を使用した。簡単に述べると、TREM-1-四量体-Fc(配列番号2)および別のCD83-Fc(配列番号5)をそれぞれ、100μg/mlの最終濃度で、上記の通りデキストラン沈降によって精製したヒト好中球27,000万個と一緒に、1mLのPBS中4℃で90分、軽く振とうしながらインキュベートした。これらの細胞をペレット化した後、細胞を、架橋剤3,3'-ジチオビス[スルホスクシンイミジルプロピオネート](DTSSP)(Thermo Scientific: 21578、Rockford、IL、USA)を2mMの濃度で含むPBS緩衝液1mLに再懸濁させ、室温で30分インキュベートした。細胞を、1mLのPBSを用いて3回洗浄し、その後、1mLのRIPA緩衝液中(Thermo Scientific、89901、Rockford、IL、USA)に溶解させた。溶解物を4℃、15,000×gで10分間遠心分離して不溶性材料を除去した。Protein A Mag Sepharose(商標)ビーズ(GE Healthcare Life Sciences、28-9670-56、Piscataway、NJ、USA)を使用して、Fcとカップリングしたプローブと架橋結合した好中球タンパク質を上清から免疫沈降させた。簡単に述べると、まずビーズ50μLをPBS 200μLで洗浄し、次いで、細胞溶解物1mLに再懸濁させ、4℃で60分インキュベートし、磁気によって捕捉し、RIPA緩衝液200μLで2回、次いでPBS 200μLで3回、逐次的に洗浄した。最終的な磁気捕捉物からPBSを除去したら、8Mの尿素、100mMのトリス(pH 8.0)、および15mMのTCEP(Thermo Scientific、77720、Rockford、IL、USA)を含有する緩衝液200μLを使用して磁気ビーズからタンパク質を溶出させ、室温で30分間インキュベートし、ビーズを捕捉し、上清をMicrocon Ultracel YM-30フィルター(Millipore、42410、Billerica、MA、USA)に移した。試料を20℃、14,000×gで30〜60分、濾過膜の上部に液体がなくなるまで回転させた。次いで、保持されたタンパク質を、8Mの尿素中50mMのIAA(ヨードアセトアミド)100μLを用いて、暗所、室温で30分にわたってアルキル化した。フィルターを50mMのNH4HCO3 100μLで2回洗浄し、次いで、新しい収集管に移した。50mMのNH4HCO3 60μL中トリプシン(Promega、V5111、Madison、WI)1μgを加え、その後、37℃で一晩インキュベートした。14,000×gで30分遠心分離し、その後、フィルターを50mMのNH4HCO3 50μLで洗浄することによってトリプシン消化物を収集した。消化物10μLを、LTQ-Orbitrap-XL質量分光計(Thermo Scientific、Waltham、MA、USA)を使用してLC/MS/MSによって分析した。データを、SEQUEST-Sorcerer engine(4.0.4 build)(SageN、Milpitas、CA、USA)を使用してIPIヒトデータベース(v3.81)と対照して検索し、次いで、Scaffold 3(PRoteome Software、Portland、OR、USA)を用いて後処理して、タンパク質IDをフィルタリングし、偽発見率は1%であった。陰性対照サブトラクション後、PGLYRP1は、hTREM-1四量体と特異的に会合する信頼度の高いタンパク質であることが見いだされた。好中球における免疫沈降により、同定されたタンパク質148種のうち、72種のタンパク質が単独の対照構築物(CD83)よって免疫沈降し、73種のタンパク質がTREM-1およびCD83と同一であり、3種のみがTREM-1特異的である(図3)ことが示された。その後、異なるドナー由来の好中球を使用して実験を繰り返し、再度、PGLYRP1がhTREM-1と特異的に相互作用すると同定された。
(実施例5)
大腸菌により発現されたヒトPGLYRP1のリフォールディングおよび精製
ヒトPGLYRP1を大腸菌(Escherichia Coli)BL21(DE3)細胞において封入体として発現させた。細菌を遠心分離によって採取し、50mMのトリス-HCl、pH8.0、500mMのNaCl、5mMのEDTA、0.5%トリトンX100に再懸濁させ、超音波処理によって破壊した。不溶性ペレットを50mMのトリス、pH8.0、1%トリトンX-100、2Mの尿素で3回、および50mMのトリス、pH8.0で1回洗浄し、次いで、50mMのトリス-HCl、6Mの塩酸グアニジン、pH7.4、1mMのDTT(最終的なタンパク質の濃度20mg/ml)に可溶化させた。in vitroにおいてフォールディングさせるために、可溶化されたヒトPGLYRP1封入体を50mMのトリス、pH8.0、2mMのEDTA、5mMのシステアミン、0.5mMのシスタミン、0.4Mのアルギニン(最終的なタンパク質の濃度1mg/ml)中に希釈した。4℃で一晩置いた後、フォールディング混合物を遠心分離/濾過によって清澄化し、次いで、10mMのMES、pH3.5中に12倍に希釈して、伝導率およびpHを低下させた(最終的なpH約5.8、伝導率約6mS/cm)。次いで、希釈したフォールディング混合物をHitrap SP HP 5mlカラム(17-1151-01 GE Healthcare、Uppsala、Sweden)に適用し、その後、50mMのMES、pH5.8を用いて5カラム体積の洗浄を行った。次いで、結合したヒトPGLYRP1を、50mMのMES、pH5.8、1MのNaClの0〜60%の直線勾配を20カラム体積で用いて溶出させた。リフォールディングしたヒトPGLYRP1を含有する画分をプールし、Amicon ultra 15遠心ユニット(UFC800324 3,000 kDa MWCO、Millipore、Hellerup、Denmark)によって4ml未満まで濃縮した。次いで、Hiload 26/60 Superdex 75 318mlカラム((17-1070-01 GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を使用してタンパク質を最終精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と交換した。大多数のリフォールディングしたヒトPGLYRP1タンパク質が単量体型であった。濃縮後、NANODROP UV分光計を用いて280nmの吸収を測定することによって最終的なタンパク質の濃度を決定した。タンパク質の純度をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって評価した。
(実施例6)
TREM-1応答性レポーターアッセイの創出
TREM-1レポーター細胞株を、BWZ.36細胞株をNFAT-LacZレポーター構築物、ならびにhTREM-1およびDAP12でトランスフェクトすることによって生成した(実施例1に記載の通り)。健康なドナーの好中球をデキストラン沈降によって精製した。50mlのチューブ中フィコール3部、血液4部の率で、FicollPaque(17-0840-03、GE Healthcare、Piscataway、NJ、USA)勾配で血液を層別化し、次いで、22℃、400×gで30分間、ブレーキなしで遠心分離した。中間のPBMCバンドを吸引によって穏やかに除去した。濃縮RBCの上に層別化された好中球を吸引し、50mlのポリプロピレンチューブに移した。好中球および混入RBCを1×PBSで40mlに希釈し、その後、PBS溶液中4%DEXTRAN500(Sigma、31392、St Louis、MO、USA)10mlを加えた。穏やかに反転させることによって混合した後、チューブを22℃で20〜30分間放置した。次いで、顆粒球に富む上清を新しいチューブに移し、22℃、250×gで5分遠心分離し、上清を吸引し、廃棄した。浸透圧溶解を用いて混入RBCを除去した。簡単に述べると、細胞ペレットを0.2%NaCl 7.5mlに再懸濁させ、55〜60秒間穏やかに混合し、1.2%NaCl溶液17.5mlを加えた。次いで、PBSを用いて体積を50mlにし、250×gで5分間回転させ、ペレットを0.2%NaCl 7.5ml中に再懸濁させて、2回目の溶解を繰り返した。最終的な顆粒球ペレットをRPMI/10%FBS中に再懸濁させた。これらの好中球をPGN(InVivogen、tlrl-pgnsa、SanDiego、CA、USA)を用いて一晩刺激して、TREM-1を刺激することができる活性化された好中球を生成した。次いで、BWZ/hTREM-1レポーター細胞を、PGNで活性化された好中球培養物にレポーター細胞:好中球の比率1:3で加えた。活性化された好中球の代わりに、PGLYRP1(配列番号23)およびPGNからなるTREM-1リガンド複合体を使用してTREM-1を刺激することができた。ポリ-D-リシンコーティングした黒色細胞培養プレート(no. 356640 from BD Biosciences、San Jose、CA、USA)でアッセイを実行した。24時間培養した後に、BetaGlo試薬(E4720 from Promega、Madison、WI、USA)を使用してTREM-1活性化を読み取り、Perkin ElmerのTopCount Luminescence counterを使用して発光を測定した。陽性対照として、プレートに結合させた、TREM-1を作動させることができるTREM-1抗体(R&D MAB1278、Minneapolis、MN、USA)によってTREM-1を活性化することができた。プレートを、アイソタイプ対照またはTREM-1抗体MAB1278(PBS中3μg/ml、100μl/ウェル)を用いて冷蔵庫内で一晩、または37℃、5%CO2で2時間コーティングした後、BWZ/hTREM-1レポーター細胞を加えた。6〜24時間インキュベートした後、BetaGlo試薬(E4720 from Promega、Madison、WI、USA)を使用してTREM-1活性化を読み取ることができ、Perkin ElmerのTopCount Luminescence counterを使用して発光を測定した。このBWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ細胞株(「BWZ/hTREM-1レポーター細胞」)は、抗体に媒介されるTREM-1の架橋結合に高度に応答することが示され、1〜10μg/mlのプレートに結合させた市販の抗TREM-1抗体を用いて刺激した際のNFATに駆動されるLacZ産生の誘導がアイソタイプ対照と比較して約40倍であった(図1)。toll様受容体カクテル(tlrl-kit2hm、Invivogen、Sigma-Aldrich Denmark)を単独で用いて刺激した場合(BWZ+TLR)、シグナルの増加は観察されなかった。さらに、活性化されていない好中球はTREM-1を刺激することができなかったが、TLRアゴニストカクテル(tlrl-kit2hm、Invivogen、Sigma-Aldrich Denmark)で活性化された好中球はBWZ/hTREM-1レポーター細胞を刺激することができた。
以下のTable 1(表1)には、そのようなBWZ/hTREM-1レポーター細胞アッセイにおいて、本明細書に開示されているTREM-1抗体がリガンドに誘導されるTREM-1活性化を遮断することができることが示されている。
試験した市販の抗体: MAB1278(Cat番号MAB1278、R&D Systems、Minneapolis、MN 55413、USA)、抗TREM-1 HPA(Cat番号HPA005563、Sigma、St Louis、MO、USA)、TREM26(Cat番号314902、Biolegend、San Diego、CA 92121、USA)およびTREM37(Cat番号316102、Biolegend、San Diego、CA 92121、USA)のいずれも、TREM-1シグナルを遮断することができなかった。
(実施例7)
HX-MSを用いたエピトープマッピング
材料
使用したタンパク質バッチ:
hTREM-1:ヒト組換えTREM-1、非グリコシル化型、大腸菌において産生(Cat番号PRO-457、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.、Rehovot、Israel)。
全てのタンパク質について、実験前にPBS、pH7.4に緩衝液を交換した。
方法: HX-MS実験
計測およびデータ記録
HX実験はLeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc.)によって作動するLeap robot(H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.)によって自動化し、重水素交換反応の開始、反応時間の制御、クエンチ反応、UPLCシステムへの注入および消化時間の制御を実施した。Leap robotは、それぞれ緩衝液の貯蔵およびHX反応のために20℃に維持されたもの、ならびにタンパク質およびクエンチ溶液の貯蔵のために2℃に維持されたものの2つの温度制御されたスタックを備えた。Leap robotは、プレカラムおよび分析カラムならびにペプシンカラム、LC管材料および切り換え弁が1℃で保持された、冷却したTrio VSユニット(Leap Technologies Inc.)をさらに含有した。Trio VSユニットの切り換え弁は、HPLCからMicrobore UHPLC切り換え弁(Cheminert、VICI AG)にアップグレードしておいた。インラインでペプシン消化するために、200pmolのhTREM-1を含有する、クエンチした試料100μLをローディングし、Poroszyme(登録商標)Immobilised Pepsin Cartridge(2.1×30mm(Applied Biosystems))を、200μL/分(0.1%ギ酸:CH3CN 95:5)の定組成流速を用いて通過させた。生じたペプチドをトラップし、VanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters Inc.))上で脱塩した。その後、弁を切り換えて、プレカラムを分析カラムUPLC-BEH C18 1.7μm(2.1×100mm(Waters Inc.))とインラインに置き、AQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から200μl/分で送達される15〜35%Bの9分の勾配を使用してペプチドを分離した。移動相は、A: 0.1%ギ酸およびB: CH3CN中0.1%ギ酸からなった。ESI MSデータ、および別のデータ依存性MS/MS取得(CID)および高エネルギー(MSE)実験を、Q-TOF Premier MS(Waters Inc.)を使用して、陽イオンモードで得た。ロイシン-エンケファリンをロックマス(lock mass)(m/z 556.2771における[M+H]+イオン)として使用し、データを連続モードで収集した(セットアップに関するさらなる説明については、AndersenおよびFaber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148頁(2011)を参照されたい)。
データ解析
別々の実験において、標準のCID MS/MSまたはMSE法(Waters Inc.)を用いて消化性ペプチドを同定した。MSEデータを、BiopharmaLynx 1.2(バージョン017)を使用して処理した。CIDデータ依存性MS/MS取得を、MassLynxソフトウェアおよび社内のMASCOTデータベースを使用して解析した。
HX-MSの生のデータファイルを連続的なロックマス補正に供した。データ解析、すなわち、重水素化されたペプチドの重心決定および交換曲線へのプロットを、プロトタイプカスタムソフトウェア(HDX browser、Waters Inc.)およびHX-Express((バージョンベータ);Weisら、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17、1700頁(2006))を使用して実施した。全てのデータを、視覚的にも評価して、分解されたペプチド同位体エンベロープのみが解析に供されたことを確実にした。
エピトープマッピング実験
hTREM-1をmAbの存在下または不在下で対応する重水素化緩衝液(すなわち、D2O中で調製したPBS、最終的に96%D2O、pH7.4(未補正値))中に6〜8倍に希釈することによってアミド水素/重水素交換(HX)を開始した。HX反応は全て、20℃で行い、4μMのmAbの不在下または存在下で4μMのhTREM-1を含有し、したがって、mAb結合部位の2倍モル過剰がもたらされた。10秒から10000秒までにわたる適切な時間間隔で、HX反応物の一定分量50μlを、氷冷したクエンチ緩衝液(1.35M TCEP)50μlによってクエンチし、最終的なpH2.5(未補正値)をもたらした。
結果および考察
この実験により、mAb 0023、0024、0025、0026および市販のmAb MAB1278(RnD Systems)およびクローン26(Biolegend)に対するhTREM-1上のエピトープがマッピングされる。hTREM-1の一次配列の94%を網羅する43ペプチドのHXの時間経過を8種の異なるmAbの不在下または存在下で10〜10000秒にわたってモニターした。
早い時点、例えば300秒未満で観察された交換からの保護は、表面に露出したアミドのプロトンに関連づけられ、したがって、タンパク質境界面にも関連づけられる。対照的に、時間経過の後期に観察された影響は、ゆっくりと交換されるアミドの水素に関連づけられ、したがって、タンパク質の構造コアに関連づけられる。したがって、エピトープの影響は早い時点に現れるが、構造安定化の影響は遅い時点に交換の減少として顕在化する(Garcia、Pantazatos and Villareal、Assay and Drug Dev. Tech. 2、81頁(2004); Mandell、FalickおよびKomives、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95、14705頁(1998))。
所与のmAbの存在下または不在下で、早い時点で観察された交換パターンは、2つの異なる群に分けることができ、一方の群は、ペプチドがmAb結合に影響されない交換パターンを示す。対照的に、他方の群のhTREM-1のペプチドは、mAbが結合すると交換からの保護を示した。例えば、D2Oでの交換の100秒時点で、mAb 0023の領域Y111〜F126内の約2アミドが交換から保護される。そのような保護効果を示す領域がエピトープ領域に割り当てられる。
mAb 0023および0026のエピトープマッピング
mAb 0023および0026はどちらもhTREM-1の交換プロファイルにおいて同一の変更を誘導し、ここで一緒に説明する。0023/0026が結合すると保護を示す領域は、残基T22〜L96およびY111〜D127にわたるペプチドを包含する。しかし、mAb 0023/0026が結合した際の各ペプチド内の、交換からの保護の相対量を比較すること、およびペプチドT25〜F48、R84〜Q112およびP118で始まるペプチドにおいてエピトープの影響がないことにより、エピトープを残基A21〜E26、A49〜I85およびC113〜P119に狭めることができる。これらの領域は、配列では遠いが、hTREM-1の3D構造では近くにある。
mAb 0024およびBiolegendクローン26のエピトープマッピング
mAb 0024およびBiolegendのクローン26はどちらも、hTREM-1の交換プロファイルにおいて同一の変更を誘導し、ここで一緒に説明する。mAb 0024が結合すると保護を示す領域は、残基V101〜Q112にわたるペプチドを包含する。mAb 0024が結合した際の各ペプチド内の、交換からの保護の相対量を比較すること、および周囲のペプチドにエピトープの影響がないことにより、エピトープを残基Q104〜Q112に狭めることができる(図7B)。
NNC mAb 0025のエピトープマッピング
0025が結合すると保護を示す領域は、残基D38〜M63、T70〜L96およびY111〜D127にわたるペプチドを包含する(図7C)。しかし、0254〜0025が結合した際の各ペプチド内の、交換からの保護の相対量を比較すること、および周囲の領域内のペプチドにエピトープの影響がないことにより、エピトープを残基V39〜Q56、T70〜I85およびC113〜P119に狭めることができる。これらの領域は、配列では遠いが、hTREM-1の3D構造では近くにある(図8)。
MAB1278のエピトープマッピング
MAB1278が結合すると保護を示す領域は、残基T70〜L96およびV101〜Q112にわたるペプチドを包含する(図7D)。しかし、MAB1278が結合した際の各ペプチド内の、交換からの保護の相対量を比較すること、および周囲の領域内のペプチドにエピトープの影響がないことにより、エピトープを残基T70〜I85およびQ104〜Q112に狭めることができる。これらの領域は、配列では遠いが、hTREM-1の3D構造では近くにある。
mAb 0023/0026およびmAb 0025のエピトープの構造上の位置が図7Aに示されている。mAb 0023および0026のエピトープは、主にhTREM-1結晶構造二量体の二量体境界面のβ-シートに存在すると思われる。これらのmAbの拮抗作用は、hTREM-1二量体化、したがってシグナル伝達が妨げられた結果でありうる。
(実施例8)
TREM-1とmAb 0170の間の相互作用の境界面の決定
組換え型のヒトTREM-1およびカニクイザルTREM-1(それぞれhTREM-1およびcTREM-1)の両方においてエピトープをマッピングした。本実施例において使用したhTREM-1構築物は残基M1-H140(配列番号18)を含み、cTREM-1構築物は(配列番号12)の残基M1-R180を含み、C末端に6つのヒスチジン残基が付加されており、野生型hTREM-1からのアミノ酸番号付けが使用されている。この実施例全体を通して、cTREM-1のアミノ酸は、図11において例示されているように、hTREM-1における類似の残基に応じて番号付けされている。本実施例で使用される番号付けは、残基番号が58以下であれば19を引くことによって、残基番号が60以上であれば20を引くことによって配列番号12における番号付けに変換することができる。例として、本実施例におけるcTREM-1の残基番号E46は、配列番号12の残基(46-19 = 27)E27に対応する。本実施例におけるcTREM-1の残基番号L96は、配列番号12の残基(96-20 = 76)L76に対応する。
TREM-1の溶液を、単独で、またはmAb 0170の存在下で、97%重水素化hepes緩衝液(20mMのhepes、150mMの塩化ナトリウム、pH7.4)中に25倍希釈した。通常水素(Protiated)hepes緩衝液中に希釈することによって非重水素化対照を調製した。試料の調製を自動化するためのHD-x PALオートサンプラー(LEAP Technologies Inc.、Carrboro、NC、USA)を含むwaters HDX nanoAcquity超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)システム(Waters Corporation、Milford、MA、USA)で水素交換実験を実施した。LC管材料、プレカラムおよび分析カラムならびに切り換え弁が0.3℃に冷却したチャンバー内に位置した。トリプシン消化カラムを15℃で保管した。水素交換反応を20℃で実施した。Waters SYNAPT G2 HDMS質量分光計を使用してオンラインで質量分析を実施した。
120pmolのmAb 0170を伴う、または伴わない、100pmolのヒトTREM-1またはカニクイザルTREM-1を含有する体積(1.54〜1.98μl)を重水素化hepes緩衝液中に希釈して最終的な体積を50μlにした。適切な時間間隔で、全体積をpH2.4に調整した1.35mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン50μl中に移し、クエンチし、3℃で保持した。クエンチした溶液99μlをすぐに注入し、Porozyme固定化ペプシンカラム(2.1mm×30mm)(Applied Biosystems、Life Technologies Corporation、Carlsbad、CA、USA)を通過させ、5%(vol/vol)メタノールおよび0.1%ギ酸移動相を使用し、100μl/分の流速でWaters VanGuard BEH C18 1.7μm(2.1mm×5mm)カラム上にトラップした。0.1%ギ酸を含有する10〜40%アセトニトリル勾配を40μl/分の流速で用いてペプチドをWaters UPLC BEH C18 1.7μm(1.0mm×100mm)カラム上に分離した。
質量分光計を陽イオンモードで作動させ、イオン移動度分離を可能にした。エレクトロスプレー条件は、3.2kV毛細管、25Vサンプルコーン、および4V抽出コーンオフセット、350℃に加熱した窒素脱溶媒和ガスの流れ850ml/分、およびコーンガスの流れ50ml/分であった。ソースブロックを120℃まで加熱した。ロイシン-エンケファリン(m/z 556.2771)の1+イオンを参照化合物として使用してロックマス補正データを取得し、データ解析の間に適用した。ペプチド同定のために、6V(低エネルギー)および50V(高エネルギー)のトラップ衝突オフセット(trap collision offset)を使用したMSE-型実験を実施した。6Vの低エネルギートラップ衝突オフセットのみを使用して重水素化試料を分析した。さらなる詳細については、Andersen, M.D.、Faber, J.H.、Int. J. Mass Spectrom.(2011)、302、139-148頁を参照されたい。
MSE-データを、Waters ProteinLynx Global Server 2.5を使用して解析し、タンパク質配列の80%を包含するhTREM-1のペプチドを同定し(Table 3(表3))、タンパク質配列の100%を包含するcTREM-1のペプチドを同定した(Table 4(表4))。HX-MSデータファイルを、ロックマス補正を自動的に適用するWaters DynamX 1.0を使用して解析し、各ペプチドへの重水素の組み込みの程度を決定した。さらに、全てのデータを手動で検査して、正しいピークの割り当ておよび重水素の組み込みの算出を確実にした。
結果
ペプチドおよびそれらの交換パターンの一覧がTable 3(表3)において提供されている。mAb 0170がhTREM-1に結合すると、A21〜L96由来の配列にわたるペプチドにおいて交換からの保護が観察され、したがって、エピトープがこの領域内にあることが決定された。mAb 0170の結合に際して交換からの保護を示さないペプチドを考慮に入れると、エピトープは、領域D38〜F48に狭めることができた。mAb 0170の存在下または非存在下でR84〜L96由来の領域の示した交換はわずかから全くなく、この領域がmAb 0170結合性エピトープの一部であるかどうかを結論づけることは不可能であった。ペプチドK47〜A68はmAb 0170の結合に際して交換からの保護を示さなかったが、ペプチドT44〜C69はmAb 0170を結合すると保護された。ペプチドの最初の2つの残基は直ちに逆交換され、これらの残基に関する交換情報は失われた。残基E46、K47、およびF48の少なくとも1つがmAb 0170の結合にとって重要であることが結論づけられた。
cTREM-1上のmAb 0170エピトープ
ペプチドおよびそれらの交換パターンの一覧がTable 4(表4)に示されている。mAb 0170がcTREM-1に結合すると、E38〜A68由来の配列にわたるペプチドにおいて交換からの保護が観察され、したがって、エピトープがこの領域内にあることが決定された。mAb 0170の結合に際して交換からの保護を示さないペプチドを考慮に入れると、エピトープは、領域E38〜L45に狭めることができた。このエピトープは、hTREM-1上のmAb 0170エピトープと良く対応したが、3つの残基が短縮されていた。hTREM-1内のペプチドC44〜T69はmAb 0170が結合すると保護されたが、cTREM-1内の対応する配列を包含するペプチドA44〜L67およびA44〜A68は保護されなかった。したがって、hTREM-1内の残基E46、K47、およびF48の少なくとも1つが結合性エピトープに寄与するが、対応する残基E46、K47、およびY48はmAb 0170とcTREM-1の結合に関与しない。
(実施例9)
表面プラズモン共鳴(SPR)による、ヒトTREM-1およびカニクイザルTREM-1に対する抗TREM-1抗体についての相互作用カイネティクスの試験
表面プラズモン共鳴によって分子相互作用をリアルタイムで測定するProteOn Analyzer(BioRad)で結合試験を実施した。実験は25℃で実行し、試料を試料コンパートメント中、15℃で保管した。ProteOnにより報告されるシグナル(RU、レスポンスユニット)は、並行する6つのフローセルにおける個々のセンサーチップ表面上の質量と直接相関する。BiacoreのヒトFc捕捉キットまたはマウスFc捕捉キットの抗ヒトFcモノクローナル抗体または抗マウスFcポリクローナル抗体を、製造者の説明書に従ってGLMセンサーチップのフローセル上、水平方向に固定化した。捕捉抗体の最終的な固定化レベルは、別々の実験においておよそ2600〜6000RUであった。精製されたモノクローナルマウス抗hTREM-1抗体または組換え発現させた抗hTREM-1抗体をランニング緩衝液(10mMのHepes 0.15MのNaCl、5mMのEDTA、0.05%界面活性物質P20、pH7.4)中5〜10nMに希釈し、30μl/分で60秒にわたって垂直方向に注入することによってこれらの抗体の捕捉を行い、同時に全てのフローセルに隣接し、抗Fc抗体のみが固定化された参照インタースポット(interspot)を創出した。この結果、一般には、試験抗体の最終的な捕捉レベルはおよそ100〜300RUであり、アナライトのRmax値は30〜90RUである。アナライト(抗原)をフローセルの上に水平方向に注入することによってhTREM-1タンパク質またはcTREM-1タンパク質の結合を行って、種々の捕捉された抗TREM-1抗体との結合を参照インタースポットとの結合と比較する比較分析を可能にした。hTREM-1タンパク質またはcTREM-1タンパク質を1.2〜100nMにまたは1:3に段階的にランニング緩衝液中に希釈し、100μl/分で250秒にわたって注入し、600秒にわたって解離させた。アナライトの各注入サイクル後に、10mMのグリシン、pH1.7および50mMのNaOHを100μl/分で2回、18秒にわたって注入することによってGLM表面を再生させた。この再生ステップにより、抗TREM-1抗体および任意の結合したTREM-1タンパク質が固定化された捕捉抗体表面から除去され、その後の、次の相互作用試料対の結合が可能になった。再生手順では、直接固定化された抗Fc捕捉抗体はチップ表面から除去されなかった。
抗体と抗原との間の結合親和性を、複合体の形成および解離のカイネティクスを測定することによって決定される平衡解離定数(KD)を決定することによって定量した。ka(会合速度)およびkd(解離速度)などの、一価の複合体の会合および解離に対応する速度定数を、データ解析用のProteOn評価ソフトウェアを使用してデータを1:1Langmuirモデルにフィッティングすることによって引き出した。KDは、方程式KD=kd/kaによってkaおよびkdに関連づけられる。データ解析の前に、結合曲線をダブルリファレンス(参照表面シグナルならびに捕捉された抗TREM-1抗体上に注入したブランク緩衝液のサブトラクション)によって処理した。これにより、試料注入の間の計器ノイズ、バルクシフトおよびドリフトに対する補正が可能になった。
(実施例10)
遮断性TREM-1 mAb 14F69のヒト化
2つのリード抗体の可変領域を、ハイブリドーマ14F128A1および14F113A1B1C1をクローニングすることによって得た。どちらの抗体もSMARTER-RACE技法(Clontech)を用いてクローニングした。ヒト化の取り組みを、ハイブリドーマから精製された抗体をベンチマークとして使用し、許容できる親和性が保持されるまで、CDR移植抗体についてまず親和性を評価し、次いで、再度工学的に操作して、さらなる逆突然変異を含める反復的なループとして実施した。CDR移植抗体はin silicoで設計し、商業的なベンダー(www.genscript.com)に注文した。その後の、抗体を再度工学的に操作することは、部位特異的突然変異誘発(Stratagene)を用いて実施した。親和性試験のために全ての抗体を調製物中のHEK293-6E細胞において発現させた。以下に適切なヒト生殖細胞系の選択および逆突然変異の試験についての主要な考察について説明する。本実施例で使用される可変領域の番号付けは全て、Kabat番号付けスキームを指す。
>m14F128A1_H(CDRが太字および下線で示されている)(配列番号8)
>m14F128A1_L(CDRが太字で示されている)(配列番号9)
>m14F113A1B1C1_H(CDRが太字で示されている)(配列番号10)
>m14F113A1B1C1_L(CDRが太字で示されている)(配列番号11)
配列の解析から、Kabats定義によるm14F128A1のCDRは以下の通りである。
m14F128A1とm14F113A1B1C1との間の差異が[m14F128A1/m14F113A1B1C1]としてもたらされる。
MOE [www.chemcomp.comから入手可能]において標準の技法を用いてm14F128A1の3Dモデルを築き、有効なCDR領域(VH: 31〜35B、50〜58、95〜102; VL: 24〜34、50〜56、89〜97)から4.5Å以内の全ての残基を遮蔽残基と定義した。遮蔽残基は全て、CDRにおける結合を持続させるために潜在的に重要である。
遮蔽残基は重鎖については1〜2位、4位、27〜37位、47位、49〜59位、69位、71位、73位、78位、92〜103位、および軽鎖については1〜5位、7位、23〜36位、46位、48〜56位、58位、62位、67〜71位、88〜98位を含んだ。
m14F128A1の生殖細胞系検索および手動の検査を用いて、重鎖についてはVH3_73およびJH4が適切なヒト生殖細胞系の組合せであることが同定され、軽鎖についてはVKIV_B3およびJKが適切なヒト生殖細胞系の組合せであることが同定された。
次いで、以下の規則を用いてヒト化を実施した:
- 遮蔽の外側の残基をヒトとして取った。
- 遮蔽の内側かつKabat CDRの内側の残基をマウスとして取った。
- マウス/生殖細胞系で一致する遮蔽の内側かつKabat CDRの外側の残基をコンセンサス配列として取った。
- マウス/生殖細胞系で異なる遮蔽の内側かつKabat CDRの外側の残基を潜在的な逆突然変異に供した。
m14F128A1の有効なCDR領域を生殖細胞系に移植することにより、m14F128A1、hz14F128A1の基本的なヒト化構築物が形成された。
マウスCDRと比較した唯一の差異がCDR_H2に存在した(太字で示されている)。遮蔽残基におけるm14F128A1とhz14F128A1との間のいかなる矛盾も、潜在的な逆突然変異を創出し、その一覧としては以下が挙げられる:
さらに、m14F128A1およびm14F113A1B1C1の密接な相同性を用いて、hz14F128A1の親和性に影響を与えうる残基を示した。
潜在的にヒト化されるmAbの全てを調査するために、上記の突然変異体の全ての組合せを作製し、試験した。
ハイブリドーマ14F113から得られる最終的なヒト化抗hTREM1抗体(mAb 0170)は、1つのLCフレームワーク-逆突然変異(M4L)および1つのHC CDR3突然変異(Q98I)を含有する。14F128と称される高度に相同な抗体を用いて親和性-相乗作用-試験に基づいてHC CDR3に突然変異を導入した。両方の突然変異を含めることについての理論的根拠は下に記載されている。
抗体14F128および14F113の親和性-相乗作用試験
ハイブリドーマ抗体14F128および14F113は高度に相同であり、同じ体細胞組換え事象に由来する。この2つの抗体は、hTREM1との結合について、親和性が最も高い14F113と競合する。全体で、この2つの抗体のCDR移植型は、それらのCDR組成がたった6アミノ酸(LC CDRにおいて4つ、およびHC CDRにおいて2つ)によって異なる。この6つの突然変異は、14F113と14F128を比較した場合、LC T27dS、D29G、Y30I、L33MおよびHC S54N、Q98Iである。CDR移植14F128の親和性はCDR移植14F113よりも劣るが、6つの突然変異のうちの1つまたは複数による有益な親和性の影響が、6つの突然変異の全てが存在する場合の全体的な影響に抑制されるかを調査した。したがって、6つの突然変異の全て(HC S54N以外)をCDR移植14F113抗体に個別に導入し、抗体を親和性によって順位づけた。2つの突然変異(LC L33MおよびHC Q98I)は、個別に、CDR移植14F113の親和性を改善することができた。Q98I位のHCの突然変異により、得られた抗体(mAb 0170)の親和性が特に良好になった。
フレームワーク逆突然変異親和性解析
14F113抗体のマウス型は、ヒト化の間に逆突然変異として含めることが潜在的に必要な7つの突然変異を有した。HCおよびLCにおける潜在的な逆突然変異は、それぞれS30N、G49A、A78LおよびT93V M4L、V58I、G68Rであった。7つの逆突然変異をCDR移植14F113に個別に導入し、次いで、親和性によって順位づけた。突然変異のいくつかが親和性を改善することができたが、LC突然変異M4LのみをmAb 0170のために選択した。突然変異を含める決定について発現力価(HEK293 6E)、親和性、および突然変異の総数に対して平衡させた。
(実施例11)
表面プラズモン共鳴(SPR)による、hTREM-1に対するTREM-1抗体についての相互作用カイネティクスの試験:mAb 0170と市販のTREM-1抗体の比較。
表面プラズモン共鳴によって分子相互作用をリアルタイムで測定するProteOn Analyzer(BioRad)において結合試験を実施した。実験は25℃で実行し、試料を試料コンパートメント中、15℃で保管した。ProteOnにより報告されるシグナル(RU、レスポンスユニット)は、並行する6つのフローセルにおける個々のセンサーチップ表面上の質量と直接相関する。市販の抗体は、Biolegend #314907、Biolegend #316102(Biolegend、USA)、Hycult Biotech HM2252(Hycult Biotech、Netherlands)、R&D #MAB1278(R&D Systems、United Kingdom)、SC98Z12(Santa Cruz Biotechnology、USA)、Sigma #WH0054210m4、Sigma #SAB1405121(Sigma-Aldrich Danmark A/S)を含んだ。
BiacoreのヒトFc捕捉キットまたはマウスFc捕捉キットの抗ヒトFcモノクローナル抗体または抗マウスFcポリクローナル抗体を、製造者の説明書に従ってGLMセンサーチップのフローセル上、水平方向に固定化した。捕捉抗体の最終的な固定化レベルは、別々の実験においておよそ2600〜6000RUであった。精製されたモノクローナルマウスヒト化抗hTREM-1抗体または組換え発現させたヒト化抗hTREM-1抗体をランニング緩衝液(10mMのHepes 0.15MのNaCl、5mMのEDTA、0.05%界面活性物質P20、pH7.4)中5〜10nMに希釈し、30μl/分で60秒にわたって垂直方向に注入することによってこれらの抗体の捕捉を行い、同時に全てのフローセルに隣接し、抗Fc抗体のみが固定化された参照インタースポットを創出した。この結果、一般には、試験抗体の最終的な捕捉レベルはおよそ100〜300RUであり、アナライトのRmax値は30〜90RUであった。アナライトを全フローセルの上に水平方向に注入することによってhTREM-1タンパク質またはcTREM-1タンパク質の結合を行って、種々の捕捉された抗TREM-1抗体との結合を参照インタースポットとの結合と比較する比較分析を可能にした。hTREM-1タンパク質またはcTREM-1タンパク質を1.2〜100nMまたはランニング緩衝液中に1:3に段階希釈し、100μl/分で210秒にわたって注入し、600秒にわたって解離させた。アナライトの各注入サイクル後に、10mMのグリシン、pH1.7および50mMのNaOHを100μl/分で2回注入することによってGLM表面を再生させた。この再生ステップにより、抗TREM-1抗体および任意の結合したTREM-1タンパク質が固定化された捕捉抗体表面から除去され、その後の、次の相互作用試料対の結合が可能になった。再生手順では、直接固定化された抗Fc捕捉抗体はチップ表面から除去されなかった。
抗体と抗原との間の結合親和性を、複合体の形成および解離のカイネティクスを測定することによって決定される平衡解離定数(KD)を決定することによって定量した。ka(会合速度)およびkd(解離速度)などの、一価の複合体の会合および解離に対応する速度定数を、データ解析用のProteOn評価ソフトウェア3.1.0.6を使用してデータを1:1Langmuirモデルにフィッティングすることによって引き出した。KDは、方程式KD=kd/kaによってkaおよびkdに関連づけられる。
データ解析の前に、結合曲線をダブルリファレンス(参照表面シグナルならびに捕捉された抗TREM-1抗体上に注入したブランク緩衝液のサブトラクション)によって処理した。これにより、試料注入の間の計器ノイズ、バルクシフトおよびドリフトに対する補正が可能になった。
(実施例12)
表面プラズモン共鳴による抗ヒトTREM-1モノクローナル抗体の競合結合試験
異なる結合部位(エピトープ)間を識別するために、モノクローナルマウスヒト化抗hTREM-1抗体または組換え発現させたヒト化抗hTREM-1抗体を用いてSPR結合競合試験を実施した。市販の抗体は、Biolegend #314907(Biolegend、USA)およびSC98Z12(Santa Cruz Biotechnology、USA)を含んだ。抗原上の同じまたは重複している結合部位(エピトープ)について競合する抗hTREM-1モノクローナル抗体は、抗原に同時に結合することができず、したがって、同じ「ビン」に割り当てられる。抗原上の同じまたは重複している結合部位について競合しない抗TREM-1モノクローナル抗体は、同時に結合することができ、したがって、異なる「ビン」に割り当てられる。抗原として可溶性ヒトTREM-1細胞外ドメインを用いて実験を実施した。
全ての試験を25℃で実行し、試料を試料コンパートメント中、15℃で保管した。個々の抗TREM-1モノクローナル抗体および無関係の対照モノクローナル抗体を、0.4MのEDAC[1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩]および0.1Mのスルホ-NHS[N-ヒドロキシスルホスクシンイミド]の1:1混合物を使用してGLCセンサーチップの別々のフローセル上に固定化した。各抗体を10mMの酢酸ナトリウム、pH5.0中に25または10(SC98Z12(80394))μg/mlの濃度まで希釈し、30μl/分で240秒にわたって個々のフローセルに固定化した。抗体をフローセルL1〜L6(対照を含む)に固定化した。抗体を固定化した後、フローセル上の活性部位を、1Mのエタノールアミンを用いてブロッキングした。固定化は、活性化および非活性化を伴って水平方向に実施し、固定化したタンパク質を伴わないインタースポット参照点を創出した。試験抗体の最終的な固定化レベルは、1つの実験では、390RUのみが固定化された1つの抗体(SC98Z12)以外はおよそ1100〜1300RUにわたった。組換えヒトTREM-1をランニング緩衝液(10mMのHepes 0.15MのNaCl、5mMのEDTA、0.05%界面活性物質P20、pH7.4)中に100nMまで希釈した。抗原を、固定化した抗体の上に水平方向に30μl/分で300秒にわたって注入し、インタースポット参照および固定化された対照抗体への潜在的な非特異的結合の制御を可能にし、その結果、4RUのみが捕捉された低固定化レベルの1つの抗体(SC98Z12)以外は、150〜600RUの捕捉されたTREM-1がもたらされた。
各抗体(固定化したものと同じ)を並行のフローセルの上に水平方向に注入して、一次抗体によって捕捉されたhTREM-1との結合をインタースポット参照および固定化された対照抗体との結合の両方と比較する比較分析を可能にした。各競合抗体を100nMまで希釈し、100μl/分で250秒にわたって注入した。アナライトの各注入サイクル後に、1Mのギ酸pH3.5、3MのMgCl2および50mMのNaOHを2回、100μl/分で18秒にわたって注入することによってGLCチップを再生した。この再生ステップにより、TREM-1抗原および任意の結合した二次抗体が固定化した抗体表面から除去され、その後の、次の試験試料の結合が可能になった。再生手順では、直接固定化された抗TREM-1試験抗体(一次抗体)はチップ表面から除去されなかった。ProteOn ManagerTM 3.1.0.6 Softwareを用いてデータ解析を実施した。捕捉レベルを評価して、再生ステップにより、一連の注入全体を通して一貫した結合表面がもたらされることを確実にした。インタースポット対照表面に対しても、固定化された対照抗体に対しても、ヒトTREM-1の有意な非特異的結合は観察されなかった。結合曲線をインタースポット対照表面シグナルのサブトラクションによって処理した。これにより、試料注入の間の計器ノイズおよびバルクシフトに対する補正が可能になった。
競合の結果は陽性結合または陰性結合のいずれかとして報告された(Table 8(表8))。陽性(+)結合は、競合抗体が、一次抗体と同時にhTREM-1に結合することができた(すなわち、それらが競合しない)ことを示し、したがって、一次抗体と競合抗体は異なるエピトープビンに割り当てられた。陰性結合は、競合抗体が一次抗体と同時にhTREM-1に結合することができなかった(すなわち、それらが競合する)ことを示し、したがって、一次抗体と競合抗体は同じエピトープビンに割り当てられた。これらの実験におけるレスポンス値は有意であり、抗TREM-1モノクローナル抗体のエピトープビンを明確に決定することが可能になった。
MAb 0170とmAb 0048(14F128と同一であるハイブリドーマ14F11から精製されたもの)は、ヒトTREM-1との結合について競合することが示された。Biolegend #314907およびSC98Z12は、これらのいずれとも、ヒトTREM-1との結合についてと競合しなかったが、互いに競合した。これらの所見により、最初の2つ(mAb 0048およびmAb 0170)が同じビン(Bin1)に属し、Biolegend #314907およびSC98Z12が別のビンに属する(Bin2)と結論づけられる。
(実施例13)
Fab 0011およびFab 0170の突然変異型のヒトTREM-1およびカニクイザルTREM-1との結合の間の相互作用のカイネティクス解析
相互作用試験をSPRによって実施して、ヒトTREM-1上の抗ヒトTREM-1抗体0011および0170のエピトープの差異を定義した。公知のエピトープにアラニン突然変異が導入されたヒトTREM-1変異体、ならびに、mAb 0170のみがカニクイザルTREM-1と交差反応するので部分的に「ヒト化された」カニクイザルTREM-1の変異体に対する結合カイネティクスを比較することによって、それぞれのエピトープに独特のアミノ酸残基を同定した。
この試験において使用したhTREM-1細胞外ドメインアラニン突然変異体構築物および部分的にヒト化されたカニクイザル突然変異体構築物がTable 9(表9)に要約されいる。使用した構築物は全て配列番号19(カニクイザルTREM-1変異体)または配列番号20(ヒトTREM-1変異体)のいずれかの変異体であり、SPR結合カイネティクスアッセイにおいて捕捉するためのC末端-cmyc2-His6タグを含んだ。別段の指定のない限り、本実施例において参照される配列は、図11に応じて番号付けされている。
表面プラズモン共鳴によって分子相互作用をリアルタイムで測定するProteOn Analyzerにおいて結合試験を実施した。実験は25℃で実行し、試料を試料コンパートメント中、15℃で保管した。ProteOnにより報告されるシグナル(RU、レスポンスユニット)は、並行する6つのフローセルにおける個々のセンサーチップ表面上の質量と直接相関する。抗Hisモノクローナル抗体を、0.4MのEDAC[1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩]および0.1Mのスルホ-NHS[N-ヒドロキシスルホスクシンイミド]の1:1混合物を使用してGLMセンサーチップの並行する6つのフローセル上に固定化した。抗体を10mMの酢酸ナトリウム、pH5.0中に25μg/mlの濃度まで希釈し、個々のフローセル上に30μl/分で240秒にわたって固定化した。抗体を固定化した後、フローセル上の活性部位を、1Mのエタノールアミンを用いてブロッキングした。固定化は、全てのステップを水平方向で実施した。捕捉抗体の最終的な固定化レベルは1つの実験ではおよそ8000RUであった。ヒトTREM-1 ECDまたはカニクイザルTREM-1 ECDの野生型または種々の突然変異体を発現しているHEK293細胞の細胞培養培地をランニング緩衝液(10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%界面活性物質P20、pH7.4)中に40〜60倍希釈した。TREM-1タンパク質を、固定化抗His捕捉抗体の上に垂直方向に30μl/分で60秒にわたって注入した。これにより、50〜250RUの捕捉されたTREM-1がもたらされ、また、固定化された捕捉抗体のみを有し、水平方向に捕捉されたTREM-1は有さないインタースポット参照が創出された。各Fabを並行のフローセルの上に水平方向に注入して、抗His抗体によって捕捉されたTREM-1変異体との結合のカイネティクス解析を可能にした。注入する前に、各Fabをランニング緩衝液中に0nM、5.5nM(1つの実験)、16.7nMおよび50nMまで希釈し、100μl/分で250秒にわたって注入した(会合時間)。これらの注入の後の解離時間を10分間モニターした。TREM-1とFabの相互作用サイクルのそれぞれの後に、10mMのグリシンおよび50mMのNaOHを2回、100μl/分で18秒にわたって注入することによってGLMチップを再生した。この再生ステップにより、TREM-1変異体および任意の結合したFabが抗His抗体表面から除去され、その後の、次の相互作用対の結合が可能になった。再生手順では、直接固定化抗His捕捉抗体はチップ表面から除去されなかった。
ka(会合速度)、kd(解離速度)およびKD(平衡解離定数)などのカイネティクスデータを得るために、ProteOn Manager(商標)3.1.0.6Softwareを使用してデータ解析を実施した。2連でまたは3連で実行した試料の捕捉および結合レベルを評価して、再生ステップにより、一連の注入全体を通して一貫した結合表面がもたらされたことを確実にした。固定化された捕捉抗体のみを有するインタースポット参照との有意な非特異的結合は観察されなかった。結合曲線をインタースポット対照表面シグナルのサブトラクション、ならびにランニング緩衝液の注入によって処理した。これにより、試料注入の間の計器ノイズおよびバルクシフトに対する補正が可能になった。0170 Fabおよび0011 Fabの種々のTREM-1 ECD変異体に対する親和性を野生型のヒトTREM-1 ECDまたはカニクイザルTREM-1 ECDに対する親和性と比較した。
結合が抑止されたまたは非常に低い突然変異型を同定するために、捕捉されたTREM-1変異体のレベルに対して正規化した、Fabの注入が終わってから10秒後の結合のレベルも評価した。親和性の減少と、正規化した結合レベルが有意により低いことの組み合わせたにより、導入された突然変異に起因するフォールディングの破壊が示されうる。しかし、カイネティクスの変化もこの値に影響を及ぼすことに留意すべきである。したがって、結論づけるために各結合曲線を視覚的に検査した(データは示していない)。
アラニン単一突然変異を伴うヒトTREM-1についての結果(Table 10(表10))により、2つの位置(E46およびD92)が、0170 Fabとの結合が2分の1未満に減少したという点で、独特であったことが示されている。
mAb-0170は、mAb -0011とは対照的に、カニクイザルTREM-1に結合することができた。カニクイザルTREM-1の選択されたエリアにおけるヒト化ではヒトTREM-1(0247)と比較して0177の親和性は回復せず、これにより、ヒトTREM-1およびカニクイザルTREM-1に対する親和性の差異には他の残基または残基の組合せが重要であることが示されている。
0243は、0170 Fabまたは0011 Fabとの結合を示さない。この構築物については、全体的な構造に影響を及ぼす突然変異を排除することはできず、したがって、Q52が試験したFabとヒトTREM-1の結合に関与するかどうかは結論づけられない。
(実施例14)
mAb 0170は、BWZ/hTREM-1レポーター細胞アッセイにおいてTREM-1活性化を効率的に遮断する
実施例6に記載のBWZ/hTREM-1レポーター細胞アッセイを用いて、TREM-1の遮断におけるmAb 0170の効力を算出した。BWZ/hTREM-1レポーター細胞をTREM-1リガンド複合体で刺激し、mAb 0170をさまざまな濃度で加えた。図9は、TREM-1シグナルの用量依存的な遮断を示し、0.2μg/ml超の濃度でシグナルの完全な遮断がもたらされる。IC50値は、GraphPad Prismソフトウェア、方程式:log(阻害剤)対応答--変動する傾きを使用して2.4nMであると決定された。
(実施例15)
市販のTREM-1抗体はBWZ/hTREM-1レポーター細胞アッセイにおいてTREM-1活性化を遮断しない
多数の用量の抗体を、以前に記載されているBWZ/hTREM-1レポーター細胞アッセイに含めた。SAB1405121(クローン3F5、Sigma Aldrich、St. Louis、MO、USA)、WH0054210M4(クローン2E2、Sigma Aldrich、St. Louis、MO、USA)、sc-80394(クローン98Z12、Santa Cruz、California、USA)、HM2252(クローン6B1、Hycult biotech、5405 PB UDEN、The Netherlands)、316102(クローンTREM-37、Biolegend、San Diego、CA 92121、USA)、および314907(クローンTREM-26、Biolegend、San Diego、CA 92121、USA)は、TREM-1活性を有意に遮断することができなかったが、本明細書に開示されているmAb 0170は0.3μg/mlでTREM-1活性を99%超遮断することができた。アイソタイプ対照は3μg/mlでさえも残存する反応性が95%超であった。
(実施例16)
mAb 0170はカニクイザルTREM-1を遮断した
他の種由来のTREM-1に対する機能性を試験するために、それぞれ、マウスTREM-1およびカニクイザルTREM-1をヒトDAP12およびマウスDAP12でトランスフェクトして、ヒトについてのものと同様にレポーター細胞アッセイを生成した。これは、基本的に、ヒト系について記載されている通り行ったが(実施例1、実施例2および実施例6)、ヒトTREM-1を全長マウス(m)TREM-1(配列番号22)または全長カニクイザル(c)TREM-1(配列番号21)で置き換えた。cTREM-1(配列番号22)をコードするcDNAをGeneArtで合成し、pHLEF38(CMC ICOSに認可されている)に、XhoI-XbaI方向にクローニングした。TEアルファNFAT Luc細胞をpHLEF38.cynoTrem1およびpNEF38.NFlag hDAP12で同時トランスフェクトした。各プラスミド10μgを使用し、総体積およそ500μl(成長培地400μlおよびDNA 100μl)中細胞8e6個を、BTX electoporator(260V、1050uF、720ohms;時定数は23ミリ秒であった)を使用して電気穿孔で導入した。細胞を10cmプレートにおいて、50%馴化培地10ml中で48時間プレーティングし、800μg/mlのG418および0.5mMのL-ヒスチジノールを含む30%馴化培地200μl/ウェル中、平底96Wプレート(5プレート)の8e3細胞/ウェルで選択に直接プレーティングした。2週間インキュベートした後、Genetix Clone Select Imagerを使用して40の単一コロニーを同定した。
カニクイザルTREM-1と交差反応することができた市販のTREM-1抗体は314907(クローンTREM-26、Biolegend、San Diego、CA 92121、USA)のみであった(実施例11を参照されたい)。実施例15において試験した市販の抗体はいずれも、カニクイザルTREM-1に結合することができたものでさえ、カニクイザルTREM-1機能を遮断することができなかった。
同様に、マウスTREM-1を有するレポーター細胞株を生成した。抗体はいずれも、ヒトTREM-1にもカニクイザルTREM-1にも結合することができず、ヒトTREM-1はマウスTREM-1と交差結合(cross-bind)することができた。したがって、マウスTREM-1に対する抗体を、基本的にヒトTREM-1抗体の生成について記載されている通り、しかし抗原としてマウスTREM-1を用いて生成した。これらの抗体をマウスTREM-1との結合および遮断機能についてマウスレポーター遺伝子アッセイにおいてスクリーニングした。そのような抗体の1つ(mAb 0174)がマウスTREM-1に結合し、その機能を遮断することができた。
(実施例17)
PGLYRP-1によって刺激されたM2マクロファージからのTNFアルファの放出はTREM-1抗体によって遮断された
したがって、都合のよい実験の反復をもたらす、多数のドナー由来の初代細胞のフリーザーバンク収集物を確立することの価値が当業者には理解されよう。in vitroで得られるマクロファージは末梢血単球から以下の通り作製される。負に濃縮された単球を、Research Blood Components(Brighton、MA、USA)から入手した末梢血「leukopak」から、Rosette Sepキット(cat番号15068) から入手したStem cell technologies(Vancouver BC、Canada)を製造者の説明書に従って使用して単離した。単離された単球を10%DMSO/FBS一定分量に50e6細胞/mlで懸濁させ、-80℃まで徐々に冷却した。マクロファージ細胞を作製するために、1つまたは複数の凍結した単球のバイアルを37℃のウォーターバス中で急速に解凍し、10%FBS(Fisher Scientific Cat番号03-600-511]を伴う成長培地[RPMI 1640(Gibco、Carlsbad CA、USA)Cat番号72400-047)を用いて10mlまで希釈し、250gで5分遠心分離した。細胞を、50ng/mlのヒトMCSF(Gibco Cat番号PHC9501)を補充した成長培地中に2e6細胞/mlまで懸濁させ、組織培養処理したペトリ式組織培養物プレートに入れ、5%CO2、2%O2の「低酸素」雰囲気が維持されるようにプログラミングした加湿インキュベーターに入れた。培養3日目に、細胞に、50ng/mlのヒトMCSFを補充した成長培地を等体積で加えた。6日培養した後に、単球がM0マクロファージに分化した。培地を、M1マクロファージに対しては50ng/mlのヒトIFNg(Gibco Cat番号PHC4031)、またはM2マクロファージに対しては40ng/mlのヒトIL-4(Gibco Cat番号PHC0045)を補充した成長培地に変えることによってM0細胞をさらに分化させ、インキュベーターに戻してさらに22時間置いた。7日目に、マクロファージがバイオアッセイにおいて使用するために適切に分化した。簡単に述べると、1×PBS、その後PBS中5mMのEDTAで洗浄することによってマクロファージをペトリプレートから回収した。次いで、プレートを37℃に戻して30分間置き、10mlのシリンジおよび22Gの針を使用して細胞をプレートから「パワー洗浄(power wash)」した。次いで、細胞を成長培地中に希釈し、250gで5分間遠心分離し、その後、細胞ペレットを懸濁させて最終濃度を1×106/mlにした。
上記の通り調製したマクロファージ細胞を、馴化培地においてTREM-1リガンドを用いた細胞の刺激に応答して産生されたTNF-アルファなどのサイトカインをELISAによって測定するバイオアッセイにおいて使用した。そのようなバイオアッセイを、TREM-1特異的抗体によるそのようなTREM-1リガンド刺激の遮断を測定するためにさらに利用した。TREMリガンドまたは陰性対照を4×濃度で調製し、成長培地中50マイクロリットル/ウェルを96ウェルマイクロタイターのディッシュに加えた。TREM-1リガンドの最終濃度は7.5ng/mlの組換えヒトPGLYRP1(実施例5を参照されたい)および3μg/mlのPGN-BS(Invivogen、tlrl-pgnbs、SanDiego CA、USA)からなった。細胞を上記の通り加湿した低酸素条件下で22時間培養した後、馴化培地を収集し、TNF-アルファレベルをELISAによって製造者の説明書に従って測定した(R&D Systems、catalogue DY210、Minneapolis MN、USA)。図10は、TREM-1抗体が、これらの刺激されたM2マクロファージからのTNFアルファ放出を減少させることを示す。
以下のTable 14(表14)には、そのような実験からのIC50値が示されており、それにより、本明細書に開示されている抗体が、TREM-1依存性サイトカインの放出の遮断において非常に効力が強いことが示されている。
(実施例18)
カニクイザルマクロファージからのTNFアルファ放出は、mAb 0170によって遮断することができる
末梢血由来マクロファージは、先天性免疫調節および活性化の試験において優れたinvitroモデルとして役立つ。TREM-1は、このプロセスの制御において重要な役割を果たすことが公知である。一般にカニクイザル(cynomolgus)として公知の非ヒト霊長類種のカニクイザル(Macaca fascicularis)の使用は、TREM1シグナル伝達の調節のin vivoにおける効果を理解するために重要である。本実施例では、抗TREM-1抗体を、カニクイザルM2マクロファージ培養物におけるサイトカインの産生を遮断するそれらの能力について試験する。
マクロファージ細胞を以下の通り生成した。健康な雄の成体動物(SNBL、Everett WA、USA)から、ナトリウムヘパリンバキュテナーチューブ(Cat番号3664870、Bectin Dickinson Franklin Lakes NJ、USA)を使用して静脈穿刺によって全血を採取した。全血をPBSで30%に希釈し、次いで、30mlを、50mlの円錐管中、PBSで96%に予め希釈したFicoll-Paque(Cat番号17-1440-03 GE Healthcare、Uppsala Sweden)15mlに慎重に積み重ねた。室温、400g、低加速およびブレーキなしで30分遠心分離した後、末梢血単核細胞(PBMC)をフィコール/血漿の相間から採取し、PBSで3倍希釈し、室温、200gで7分遠心分離した。混入血小板を含有する上清を吸引し、廃棄し、細胞ペレットをPBS+0.2%FBS(ウシ胎児血清)30mlに再懸濁させた。この細胞洗浄プロセスをさらに2サイクル繰り返し、その後、PBMC細胞ペレットをRPMI培養培地(Cat番号61870-036、Life Technologies、Grand Island NY、USA)プラス10%FBSに2E6細胞/mlで再懸濁させ、15cmのペトリ皿(Cat番号430599 Corning、Tewksbury MA、USA)に20ml/皿で分配した。37℃、5%CO2、100%湿度で一晩インキュベートすることによって単球をプラスチックに接着させ、その後、プレートを20秒間穏やかに旋回させ、ゆすることによって接着しなかった細胞を除去し、その後、吸引した。50ng/mlのhMCSF(Cat番号PHC9501、Life Technologies、Grand Island NY、USA)を補充した新鮮な成長培地20mlを各プレートに加え、37℃、5%CO2、2%O2、100%湿度の低酸素培養条件に7日間置いた。培養3日目に、細胞に、50ng/mlのヒトMCSFを補充した成長培地を等体積で加えた。6日培養した後に、単球がM0マクロファージに分化した。培地を、M1マクロファージに対しては50ng/mlのヒトIFNg(Gibco Cat番号PHC4031)、またはM2マクロファージに対しては40ng/mlのヒトIL-4(Cat番号PHC0045、Life Technologies、Grand Island NY、USA)を補充した成長培地に変えることによってM0細胞をさらに分化させ、インキュベーターに戻してさらに22時間置いた。7日目に、マクロファージがバイオアッセイにおいて使用するために適切に分化した。簡単に述べると、1×PBS、その後PBS中5mMのEDTAで洗浄することによってマクロファージをペトリプレートから回収した。次いで、プレートを37℃に戻して30分置き、10mlのシリンジおよび22Gの針を使用して細胞をプレートから「パワー洗浄(power wash)」した。次いで、細胞を成長培地中に希釈し、250gで5分間遠心分離し、その後、細胞ペレットを懸濁させて最終濃度を1×106/mlにした。
上記の通り調製したマクロファージ細胞を、馴化培地においてTREM-1リガンドを用いた細胞の刺激に応答して産生されたTNF-アルファなどのサイトカインをELISAによって測定するバイオアッセイにおいて使用した。そのようなバイオアッセイを、TREM-1特異的抗体によるそのようなTREM-1リガンド刺激の遮断を測定するためにさらに利用した。TREM-1リガンドまたは陰性対照を4×濃度で調製し、成長培地中、50マイクロリットル/ウェルを96ウェルマイクロタイターのディッシュに加えた。TREM-1リガンドの最終濃度は7.5ng/mlの組換えヒトPGLYRP1(実施例5に記載の通り生成した)および3μg/mlのPGN-BS(Cat番号tlrl-pgnbs、Invivogen SanDiego CA、USA)からなった。抗体を、成長培地の50マイクロリットル/ウェルで加え、その後、細胞をマクロファージの50マイクロリットル/ウェルを加えた。細胞を上記の通り加湿した低酸素条件下で22時間培養した後、馴化培地を収集し、TNF-アルファレベルをELISAによって製造者の説明書に従って測定した(Cat番号DY1070 R&D Systems、Minneapolis MN、USA)。以下の表には、対照抗体または抗TREM-1抗体の存在下でTREM-1リガンド(PGLYRP1+PGN)を用いて刺激したM2マクロファージ培養物のTNFα値が示されている。
この実施例により、抗TREM-1 Ab-0170が、カニクイザルに由来するマクロファージ細胞におけるTREM依存的なサイトカイン産生を有効に遮断することができることが例示されている。このAbの有効性により、in vivo毒性学および疾患治療モデルにおけるカニクイザルにおけるその使用が支持される。
(実施例19)
刺激された末梢血単核細胞からのTNFアルファ放出はTREM-1抗体によって遮断することができる
軟膜に由来し、RPMI 1640(Cat番号61870、Gibco、New York、USA)、20%FBS(Cat番号16140-071、Gibco、New York、USA、10%DMSO(Cat番号D2650、Sigma、Steinheim、Germany)中で凍結させたPBMCを解凍し、RPMI、10%FBS、1%Pen/Strep(Cat番号15070-06、Gibco、New York、USA)中で2回洗浄し、同じ培地に4×10E6個/mlで再懸濁させた。次いで、細胞を400,000細胞/ウェルで分布させた。細胞を刺激するために、10μg/mlのPGN-SA(Cat番号tlrl-pgnsa、Invivogen、San Diego、USA)および0.2μg/mlのPGLYRP1をウェルに加えた。その後、関連性のあるアイソタイプおよびTREM-1抗体をRPMI中に希釈し、それぞれ1.34nM、および0.167nMで加えた。37℃、5%CO2で20時間インキュベートした後、TNFアルファ放出をdiaplex(Cat番号880.090.001、Genprobe、Besancon、France)により、製造者のプロトコールに従って測定した。以下のTable 15(表16)に示されているように、本明細書に開示されているTREM-1抗体(mAb 0044、0070および0059)は全て、PBMC細胞からのTNFアルファ放出を減少させることができる。
遮断性TREM-1抗体を使用するとPBMCにおけるTNFアルファ放出がおよそ70%阻害されることにより、刺激された細胞培養物中のサイトカインレベルに対する有意な影響が示される。
(実施例20)
抗TREM-1 mAbは、正常酸素圧のマクロファージにおけるPGN+PGLYRP1に誘導されるTNFa産生を阻害することができる
TREM-1受容体の刺激薬としてPGN-BS+ヒトPGLYRP1を使用したマクロファージの刺激は、抗TREM-1抗体によって遮断することができる。
実施例15の場合と同様に単球をM2マクロファージに分化させた。細胞の分化および刺激のステップは全て、正常な大気中の酸素レベル(酸素正常状態)の下、37℃、5%CO2のインキュベーター内で行った。分化したM2マクロファージをRPMI/10%FBS中に再懸濁させ、3連の(特に断りのない限り)試験ウェルに5×10E5細胞/mlでプレートアウト(plate out)した。次いで、以下の刺激を用いて細胞を24時間にわたって刺激した:添加なし、PGLYRP1、PGN-BS(InVivogen、tlrl-pgnbs)(3連を2セット)、PGN-BS+PGLYRP1(3連を3セット)、または抗TREM-1またはアイソタイプ対照抗体の存在下でPGN-BS+PGLYRP1。次いで、上清を採取し、BioPlex(Bio-Rad、171-B5026M)を使用してTNFaについて分析した。TREM-1を対象とする抗体(0.1μg/ml)mAb-0122およびmAb-0170はTNF-アルファ放出を低減することができた。
この実施例により、抗TREM-1 mAb-0122およびmAb-0170が、正常酸素圧条件下で成長したマクロファージからのTNFa産生を阻害することができることが例示されている。
(実施例21)
TREM-1抗体は、関節リウマチ滑液に誘導される応答を特異的に阻害する。
関節リウマチに罹患している患者由来のRA滑液試料を、TREM-1リガンド活性について実施例6に記載のBWZレポーターアッセイにおいてアッセイした。簡単に述べると、滑液を解凍し、ボルテックスし、段階的に希釈し、10μg/mlのPGNECndi(Invivogen、SanDiego、CA、USA)を伴って、または伴わずに、TREM-1抗体または陰性アイソタイプ対照を加え、2連でアッセイした。関節リウマチ患者由来の滑液は、TREM-1依存的にBWZ/hTREM-1レポーター細胞アッセイのトリガーとなることができ、これはMAB1278(R&D Systems、Minneapolis、MN 55413、USA: Cat番号MAB1278))を加えることによってさらに増強されるが、本明細書に開示されている遮断性TREM-1抗体はこの活性化を減少させることができる。
抗体を、以下の2つの欄によって示される2つのアッセイにおいて試験し、各抗体の濃度は0.1〜10μg/mlにわたった。MAB1278はシグナルを明白に増強したが、mAb 0122および0170はアイソタイプ対照と比較してシグナルを減少させた。
(実施例22)
PGLYRP-1で刺激した際の関節リウマチ患者由来の滑液組織細胞からのサイトカインの放出はmAb 0170によって遮断することができる。
滑液組織試料をRA患者から人工膝関節全置換の間に得た。単一の滑液組織細胞の懸濁液を、4mg/mlのコラゲナーゼ(Cat番号11088793001、Roche、Mannheim、Germany)および0.1mg/mlのDNA分解酵素(Cat番号11284932001、Roche、Mannheim、Germany)によって37℃で1時間にわたって消化することによって単離した。
培養培地RPMI(Cat番号R0883,St Louis、MO、USA)+10%FCS(Cat番号. S0115、BioChrom AG、Grand Island、NY 14072、USA)中、1×105個/ウェルの滑液組織細胞を、低酸素条件下、さまざまな濃度のmAb 0170またはアイソタイプhIgG4対照の存在下または非存在下で、4μg/mlのPGLYRP1および1μg/mlのPGN-ECNDi(Cat番号tlrl-kipgn、Invivogen,San Diego、CA 92121、USA)で刺激した。24時間インキュベートした後、細胞の上清を採取し、サイトカインをELISA(TNFa(Cat番号DY210、R&D、Minneapolis、MN55413 USA)、IL-1b(88-7010-88、eBioscience、San Diego CA92121 USA)、GM-CSF(Cat番号88-7339-88、eBioscience)またはFlowcytomix(TNFa、IL-1b、MIP-1b、MCP-1、IL-6、およびIL-8(Cat番号BMS、eBioscience)のいずれかによって測定した。TREM-1リガンドで刺激すると滑液組織細胞からサイトカインが分泌され、TREM-1抗体mAb 0170によって特異的に遮断された。
以下は、そのような実験の例であり、4ng/mlまたは10ng/mlのmAbを使用した結果、TREM-1抗体mAb 0170を用いて処理した場合にサイトカインの放出が減少した。
この実施例により、関節リウマチ患者由来の滑液組織由来の細胞がTREM-1リガンドであるPGLYRP1による刺激に、mAb 0170によって阻害することができる多数のサイトカインを分泌することによって応答することが示される。
(実施例23)
関節リウマチ患者由来の滑液組織細胞におけるII型PGLYRP1に誘導されるTNFアルファ放出はTREM-1抗体mAb 0170によって遮断することができる
滑液組織試料をRA患者から人工膝関節全置換の間に得た。単一の滑液組織細胞の懸濁液を、4mg/mlのコラゲナーゼ(Cat番号11088793001、Roche、Mannheim、Germany)および0.1mg/mlのDNA分解酵素(Cat番号11284932001、Roche、Mannheim、Germany)によって37℃で1時間消化することによって単離した。滑液組織細胞(培養培地RPMI(Cat番号22400105、Gibco、NY 14072、USA +10%FCS(Cat番号S0115、BioChrom AG、Berlin,Germany)中、1×105個/ウェル))をさまざまな用量の、II型PGLYRP1を一過性にトランスフェクトしたHEK細胞と、低酸素条件下、1μg/mlのmAb 0170またはIgG4アイソタイプ対照の存在下または非存在下で共培養した。24時間インキュベートした後、細胞の上清を採取し、サイトカインをTNFa ELISA(Cat番号. DY210,R&D、Minneapolis、MN55413、USA)によって測定した。
この実施例により、TREM-1リガンド(II型細胞)が、対照細胞(偽トランスフェクトした)と比較して、関節リウマチ患者由来の滑液組織細胞におけるTNF-アルファ放出を用量依存的に誘導したことが示される。このTNFアルファ応答はmAb 0170によって遮断されたが、アイソタイプIgG4では遮断されなかった。対照細胞は影響を及ぼさなかった。
(実施例24)
プレートに結合させたMAB1278は、マクロファージにおけるIL-6およびTNFアルファ応答を誘導し、作動性特徴を示したが、mAb 0122および0170は示さなかった。
プレートに結合させた作動性抗TREM-1抗体上のマクロファージの刺激により、IL-6およびTNFaの産生が誘導された。健康なドナー軟膜からRosetteSep(StemCell Technologies、15068)を使用して単球を精製し、RPMI/10%FBS中、40ng/mlのヒトMCSFの存在下で6日間培養することによってマクロファージに分化させた。次いで、培地を、50ng/mlのヒトIL-4を補充した成長培地に変え、インキュベーターに戻してさらに24時間置くことによってマクロファージをM2マクロファージにさらに分化させた。7日目に、1×PBS、その後PBS中5mMのEDTAで洗浄することによって培養プレートからマクロファージを回収した。次いでプレートを37℃に戻して30分置いた後、マクロファージをプレートから洗い出した。マクロファージをRPMI/10%FBS中で洗浄した後、再懸濁させ、プレートアウトした。試験ウェルは、指定の抗体と一緒に、PBS中に希釈した抗体を用いて一晩インキュベートし、その後PBS中で3回洗浄することによってその抗体で予めコーティングしておいた。再懸濁させたマクロファージを、3連の試験ウェル中に5×10E5細胞/mlでプレートアウトし、その後、24時間インキュベートした。(細胞の分化および刺激のステップは全て、正常な大気中の酸素レベル(酸素正常状態)下、37℃、5%CO2のインキュベーターで行った)。次いで、上清を採取し、BioPlex(Bio-Rad、171-B5006Mおよび171-B5026M)を使用してIL-6およびTNFaについて分析した。
抗体mAb-0122およびmAb-0170は非常に低い作動性を示したが、MAB1278抗体(RnD Systems、MAB1278)はIL-6およびTNFaの両方の強力な誘導を示した。
この実施例により、mAb-0122およびmAb-0170はマクロファージにおいて非常に低い作動性活性のみを示すことが例示され、これらのmAbの真の遮断性の特徴が示されている。
(実施例25)
マウス関節炎モデルにおける遮断性TREM-1は疾患を軽減する。
Table 22(表23)に概説されている実験は、単一の足関節炎モデルであるDTH-関節炎モデルにおいて得られたものである。雌のC57BL/6マウスにおいて、免疫化し、その後、メチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)を用いて攻撃することによって、免疫化ステップと攻撃ステップの間にII型コラーゲンモノクローナル抗体(抗CII)のカクテルをIV投与するという改変を伴い、右後足に古典的な遅延型過敏(DTH)反応を引き出すことによって単一の足関節炎を誘導した。左後足はPBSによって攻撃し、動物内対照として機能した。マウス(マウス10匹/群)を、実施例6に記載のレポーターアッセイのマウス版を用いて決定して、マウスTREM-1に特異的に結合し、それを遮断するTREMモノクローナル抗体を用いて1週間当たり3回処置した。免疫化した日に最初の投薬を行った。対照として対照抗体またはPBSを用いてマウス(マウス9〜10匹/群)を処理した。関節炎を誘導した日以降11日間、足の腫脹を測定した。結果は平均曲線下面積(AUC)±SEMとして示されている。両側の対応のないt検定、95%信頼区間を用いることによって統計的有意性を検定した。
(実施例26)
活性化された好中球は、TREM-1 mAbによって遮断することができるIL-8を放出する
好中球は、TREM-1および好中球を発現し、TREM-1リガンドも発現する。TREM-1が好中球における自己分泌刺激ループに関与するかどうかを試験するために、単離された好中球をPGN-SA(InVivogen、tlrl-pgnsa)で刺激し、培養培地中へのIL-8の放出を測定した。TREM-1抗体mAb-0059、mAb-0067、mAb-0122、およびmAb-0170はPGN-SAに誘導されるIL-8放出を減少させることができた。好中球をヒト健康なドナーの全血から単離し、RPMI/10%FBSに1.5×10E6細胞/mlで再懸濁させ、フィブリノーゲンで予めコーティングした(PBS中1mg/mlのフィブリノーゲン(Sigma、F3879)50□lで37℃、2時間にわたって予めコーティングし、その後PBS中で3回洗浄した)3連の試験ウェル中にプレートアウトした。細胞を以下の条件下で試験した:刺激を加えない、10□g/mlのPGN-SAのみ、または0.25□g/mlのmAb-0059、mAb-0067、mAb-0122、mAb-0170もしくはアイソタイプ対照抗体の存在下で10□g/mlのPGN-SA。試料を37℃、5%CO2のインキュベーターで24時間培養した。次いで、上清を採取し、Bio-plex Pro Human Cytokine IL-8 set(BioRad、171-B5008M)を使用してIL-8について分析した。
この実施例により、細菌由来のPGNを用いた刺激によって誘導される好中球からのIL-8放出をTREM-1抗体によって減少させることができることが例示されている。したがって、TREM-1が好中球における自己分泌活性化ループに関与すること、およびTREM-1抗体が、好中球応答の下方制御において潜在的に有用であることが実証されている。
(実施例27)
活性化された好中球は単球を刺激することができ、これは抗TREM-1 mAbによって遮断することができる
活性化された好中球はTREM-1リガンドを発現する。活性化された好中球が他の免疫細胞をTREM-1依存的に刺激することができるかどうかを試験するために、活性化された好中球を使用して、単離された単球を刺激し、培養培地中へのTNFaの放出を測定した。TREM-1抗体mAb-0059およびmAb-0170は、好中球に誘導される単球からのTNFa放出を減少させることができた。
好中球をヒト健康なドナーの全血から単離し、RPMI/10%FBSに再懸濁させ、ポリ-D-リシンコーティングした組織培養96ウェルプレート(Corning、3841)中に1.5×10E5細胞/ウェルでプレーティングした。次いで、好中球を、1ng/mlのPMA(Sigma、P1585)+20□g/mlのPGN-SA(InVivogen、tlrl-pgnsa)を用いて37℃、5%CO2のインキュベーターで24時間にわたって刺激した。次いで、細胞を培地で3回穏やかに洗浄した後、新鮮に単離された単球に加えた。EasySepキット(Stem cell technologies、19059)を使用して健康なドナーの軟膜から単球を精製し、活性化し洗浄した好中球をすでに含有するウェルに、5×10E4細胞/ウェルでプレートアウトした。以下の抗体を1□g/mlで加えた:mAb-0059、mAb-0170、またはhIgG4アイソタイプ対照。次いで、細胞をさらに24時間培養した後、上清を採取した。上清をRPMI/10%FNS中に1:10希釈した後、TNFaをELISA(eBioscience、BMS223INST)によって測定した。
この実施例により、活性化された好中球が単球をTREM-1依存性的に刺激してTNFaを産生させることができること、およびこれはmAb-0059およびmAb-0170抗TREM-1抗体によって遮断することができることが例示されている。したがって、抗TREM-1抗体は、単球の応答を下方制御するために潜在的に有用である。
本明細書では本発明の特定の特徴が例示され、説明されているが、多くの改変、置換、変化および等価物がここで当業者に明らかになろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の主旨の範囲内に入るそのような改変および変化を全て包含することを意図していることが理解されるべきである。

Claims (15)

  1. TREM-1に特異的に結合し、それを遮断することができる抗体またはその断片。
  2. PGLYRP1に誘導されるTREM-1の活性化を遮断することができる、請求項1に記載の抗体またはその断片。
  3. 配列番号1(ヒトTREM-1)との結合についてmAb 0170と競合する、請求項1または2に記載の抗体またはその断片。
  4. 配列番号12または配列番号21(カニクイザルTREM-1)との結合についてmAb 0170と競合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  5. 配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸D38〜F48を含むポリペプチドに特異的に結合することができる、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  6. 配列番号12(カニクイザルTREM-1)のアミノ酸残基E19〜L26を含むポリペプチドに特異的に結合することができる、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  7. 配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸残基D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44およびL45のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは全部、ならびにアミノ酸残基E46、K47、F48のうちの1つ、2つ、または全部を含むエピトープを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  8. 配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸残基D42、E46、D92およびH93のうちの1つ、2つ、3つまたは全部を含むエピトープを有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  9. 配列番号1(ヒトTREM-1)のアミノ酸残基L31、I86およびV101のうちの1つ、2つ、または全部をさらに含むエピトープを有する、請求項7または8に記載の抗体またはその断片。
  10. 配列番号13(K20A-hTREM-1-Cmyc2-His6)に特異的に結合することができる、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 配列番号14(A24T/Y28F/N30S/R32Q/P70H-cTREM-1-Cmyc2-His6)に特異的に結合することができる、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 配列番号15(A24T/Y28F/N30S/R32Q/E54K-cTREM-1-Cmyc2-His6)に特異的に結合することができる、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 重鎖が、配列番号4もしくは配列番号6のアミノ酸残基31〜35(TYAMH)に対応するCDRH1配列であって、これらのアミノ酸残基の1つが異なるアミノ酸残基で置換されていてよいCDRH1配列;および/または配列番号4もしくは配列番号6のアミノ酸50〜68(RIRTKSSNYATYYAASVKG)に対応するCDRH2配列であって、前記アミノ酸の1つ、2つまたは3つが異なるアミノ酸残基で置換されていてよいCDRH2配列;および/または配列番号4のアミノ酸残基101〜110(DMGIRRQFAY)もしくは配列番号6のアミノ酸残基101〜110(DMGQRRQFAY)に対応するCDRH3配列であって、前記アミノ酸残基の1つ、2つまたは3つが異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRH3配列を含み;ならびに、軽鎖が、配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基24〜38(RASESVDTFDYSFLH)に対応するCDRL1配列であって、これらのアミノ酸残基の1つ、2つまたは3つが異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRL1配列;および/または配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基54〜60(RASNLES)に対応するCDRL2配列であって、これらのアミノ酸残基の1つまたは2つが異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRL2配列;および/または配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基93〜101(QQSNEDPYT)に対応するCDRL3配列であって、これらのアミノ酸残基の1つまたは2つが異なるアミノ酸で置換されていてよいCDRL3配列を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体。
  14. 重鎖が、配列番号4もしくは配列番号6のアミノ酸残基31〜35(TYAMH)に対応するCDRH1配列;および/または配列番号4もしくは配列番号6のアミノ酸50〜68(RIRTKSSNYATYYAASVKG)に対応するCDRH2配列;および/または配列番号4のアミノ酸残基101〜110(DMGIRRQFAY)もしくは配列番号6のアミノ酸残基101〜110(DMGQRRQFAY)に対応するCDRH3配列を含み:ならびに、軽鎖が、配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基24〜38(RASESVDTFDYSFLH)に対応するCDRL1配列;および/または配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基54〜60(RASNLES)に対応するCDRL2配列;および/または配列番号5もしくは配列番号7のアミノ酸残基93〜101(QQSNEDPYT)に対応するCDRL3配列を含む、請求項13に記載の抗体。
  15. 医薬として使用するための、請求項1から14のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
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