JP2015108549A - 細胞検査装置および細胞検査方法 - Google Patents
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Abstract
Description
生細胞と死細胞を同時染色する蛍光試薬と、死細胞のみ染色する2種類の蛍光試薬を用いて、サンプルを染色することを特徴としている。複数の励起光源2と、異なる蛍光を検出するフィルタ6を備え、受光素子8から構成された検出装置(微生物計量装置1)により、蛍光が検出された粒子の波長特性から微生物とそれ以外を区別し、その微生物の生死を識別している。
米国特許第5701012号明細書に開示された技術では、空気中の浮遊微小粒子の測定において、微生物由来の粒子を検出するために、320〜420nmの範囲にある1つの波長のUVレーザーを励起光照射手段として用い、400〜540nmの蛍光を検出している。
フラビン類は7,8-ジメチルイソアロキサジンの10位に置換基を持つ誘導体の総称であり、リボフラビン(ビタミンB2)、FAD、FMNなどがある。
ヒト細胞に530nmの緑色の励起光を照射して、600〜700nmの赤色の自家蛍光を検出する。この帯域の自家蛍光は死細胞の方が生細胞より蛍光強度が大きいことを利用して、ヒト細胞の生死に関する状態を出力できるとしている。
435nmの青色の励起光を用いることによって、微細藻類・シアノバクテリアの生菌と死菌を識別している。生菌はクロロフィルの赤色の蛍光が検出され、死菌はFAD,フェルラ酸,ベタキサンチン,NAD(P)Hなどと想定される緑色の蛍光を検出している。
サンプルに励起光を照射する第1の励起光照射手段と、
前記サンプルに励起光を照射する第2の励起光照射手段と、
前記第1の励起光照射手段により照射された励起光により前記サンプルから発生する自家蛍光に基づく第1の蛍光画像を検出する第1の検出手段と、
前記第2の励起光照射手段により照射された励起光により前記サンプルから発生する自家蛍光に基づく第2の蛍光画像を検出する第2の検出手段と、
前記第1の検出手段により検出された前記第1の蛍光画像から前記第2の検出手段により検出された前記第2の蛍光画像を差し引いた第3の蛍光画像を出力する出力手段と、
を備え、
前記第1の蛍光画像には前記サンプルの状態を示す特定画像と背景光による背景画像とが含まれ、
前記第2の蛍光画像は前記背景画像であることを特徴とする。
本発明の細胞検査装置によれば、第1の検出手段により検出された第1の蛍光画像から第2の検出手段により検出された第2の蛍光画像を差し引いた第3の蛍光画像を出力するので、サンプルの状態を示す特定画像を背景画像から分離でき、染色を行わずに、微生物・細胞の生死などの状態を広く識別して検出できる。
サンプルに励起光を照射する第1の励起光照射ステップと、
前記サンプルに励起光を照射する第2の励起光照射ステップと、
前記第1の励起光照射ステップにより照射された励起光により前記サンプルから発生する自家蛍光に基づく第1の蛍光画像を検出する第1の検出ステップと、
前記第2の励起光照射ステップにより照射された励起光により前記サンプルから発生する自家蛍光に基づく第2の蛍光画像を検出する第2の検出ステップと、
前記第1の検出ステップにより検出された前記第1の蛍光画像から前記第2の検出ステップにより検出された前記第2の蛍光画像を差し引いた第3の蛍光画像を出力する出力ステップと、
をコンピュータが実行し、
前記第1の蛍光画像には前記サンプルの状態を示す特定画像と背景光による背景画像とが含まれ、
前記第2の蛍光画像は前記背景画像であることを特徴とする。
本発明の細胞検査方法によれば、第1の検出ステップにより検出された第1の蛍光画像から第2の検出ステップにより検出された第2の蛍光画像を差し引いた第3の蛍光画像を出力するので、サンプルの状態を示す特定画像を背景画像から分離でき、染色を行わずに、微生物・細胞の生死などの状態を広く識別して検出できる。
複数の波長帯の励起光を選択的にサンプルに照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段から互いに波長帯が異なる励起光をそれぞれ照射したときに前記サンプルから発生する、互いに波長帯が異なる複数の自家蛍光をそれぞれ検出する検出手段と、
前記検出手段により検出された前記複数の自家蛍光の強度、または前記検出手段により検出された前記複数の自家蛍光による複数の蛍光画像に基づいた演算により前記サンプルの状態を示す情報を取得して出力する出力手段と、
を備え、
前記出力手段は、前記検出手段の視野を区分して形成される複数の領域ごとに、互いに波長帯が異なる前記複数の自家蛍光の強度を算出し、これらの強度の組み合わせを各領域の状態を示す情報として出力することを特徴とする。
本発明の細胞検査装置によれば、検出手段により検出された複数の自家蛍光の強度、または前記検出手段により検出された複数の自家蛍光による複数の蛍光像に基づいた演算によりサンプルの状態を示す情報を取得するので、染色を行わずに、微生物・細胞の生死などの状態を広く識別して検出できる。
複数の波長帯の励起光を選択的にサンプルに照射する励起光照射ステップと、
前記励起光照射ステップから互いに波長帯が異なる励起光をそれぞれ照射したときに前記サンプルから発生する、互いに波長帯が異なる複数の自家蛍光をそれぞれ検出する検出ステップと、
前記検出ステップにより検出された前記複数の自家蛍光の強度、または前記検出手段により検出された前記複数の自家蛍光による複数の蛍光画像に基づいた演算により前記サンプルの状態を示す情報を取得して出力する出力ステップと、
をコンピュータが実行し、
前記出力ステップでは、前記検出ステップにおける視野を区分して形成される複数の領域ごとに、互いに波長帯が異なる前記複数の自家蛍光の強度を算出し、これらの強度の組み合わせを各領域の状態を示す情報として出力することを特徴とする。
本発明の細胞検査方法によれば、検出ステップにより検出された複数の自家蛍光の強度、または前記検出ステップにより検出された複数の自家蛍光による複数の蛍光像に基づいた演算によりサンプルの状態を示す情報を取得するので、染色を行わずに、微生物・細胞の生死などの状態を広く識別して検出できる。
ただし、 L:生細胞 D:死細胞
NADH、NADPH、リボフラビン、FAD、FMNなどは生物のエネルギー代謝に関わる物質であり、好気性の微生物および細胞内に豊富に存在している。
生物は生きていれば細胞内でエネルギー代謝を行っており、電子伝達系などで電子の授受を行いエネルギーであるATPを生産する。
すなわち、生細胞ではNAD+とNADH間、FADとFADH2間で電子の授受を行う、以下の反応が起こっていることが知られている。
NAD+ +還元物質(2e- +2H+) ⇔ NADH + H+ +酸化物質
FAD +還元物質(2e- +2H+) ⇔ FADH2 +酸化物質
エネルギー代謝を行っている生細胞では,NAD+→NADHとFAD→FADH2の反応が多く起こっており、生細胞内にはNADHとFADH2の量が多い状態になっていると考えられる。生細胞ではUV励起で蛍光を発するNADHの蛍光が主として検出されており、多量にあってもFADH2は蛍光性を持たないため検出されないと推定できる。すなわち、生細胞においてはNADHの蛍光が支配的であると推定できる。
生細胞: NAD+→NADH ,FAD→FADH2
死細胞: NADH→NAD+ ,FADH2→FAD
図6(a)はNADHの吸収スペクトルを示している。NADHは340nm付近に吸収のピークがあることがわかる。この340nmを励起波長として用いたNADHの蛍光スペクトルを図6(b)に示している。NADHは340nmの励起で460nm付近に蛍光のピークがあるスペクトルとなっていることがわかる。図6(c)は460nmの蛍光を検出して励起波長を掃引するNADHの励起スペクトルを示している。図6(c)からは460nmの蛍光を発する最も効果のある励起波長がわかるが、これは図6(a)の吸収スペクトルと同様に340nm付近にピークがある。以上より、NADHは典型的には340nm付近の励起で460nm付近の蛍光を発することがわかる。
NADHおびリボフラビンの蛍光スペクトル、励起スペクトルはともにブロードなスペクトルであるが、励起波長を変化させながら蛍光スペクトルを取得する励起蛍光マトリックスを測定することによって、その詳細を理解することができる。
この、検出されるのは蛍光性の物質であるNADH(生細胞)とFAD(死細胞)が主な成分であるという本発明における推定と、その物質としての波長特性を生かした測定方法により得られた図3〜図5の実験結果(生細胞・死細胞の識別)による知見は、よく一致している。
これに対して、図10(c)は加熱処理した出芽酵母(死細胞)のみが観察されている。これはフラビン類の情報のみの画像と考えられる。図10(d)は図10(a)から図10(c)を差し引いた画像であり、NAD(P)Hの情報が得られていると考えられる。
図10(a)と図10(b)がほとんど同一の画像となってしまう理由は、蛍光波長の重なりであるが、同時にNADHとフラビン類の蛍光強度の差も考慮する必要がある。波長(色)が異なれば両者を容易に分離し光量補正ができるが、同一波長帯の場合は光量補正が困難である。この2つの波長を考慮した光量の関係の詳細は後述する。
バイオ医薬品,抗体医薬などの生産における培養槽内の宿主細胞の状態を識別し、その生細胞と死細胞の数を計数することができる。また、発酵食品などのタンク内の酵母の状態とその数を、サンプリングしてタンク外で計数する。直挿型のプローブ光学系により、培養槽内を直接測定することも可能である。
投薬試験のように,染色すると悪影響を与えてしまう細胞の状態(生死)を迅速に測定できる。また、ディッシュ上で培養しているCHO,HeLa,iPS細胞などの生死の状態を識別して選別することも可能である。
迅速に生菌と死菌を計数できるので、微生物混入があった場合に迅速にアラームを発報できる。
内視鏡に搭載することによって、生体内の細胞に対して状態を識別することができる。(例えば、Villette S, Pigaglio-Deshayes S, Vever-Bizet C, Validire P, Bourg-Heckly G. "Ultraviolet-induced autofluorescence characterization of normal and tumoral esophageal epithelium cells with quantitation of NAD(P)H" Photochemical and Photobiological Science, Vol.5, 2006, pp.483-492.)
本来、UV励起で検出されるのはNAD(P)Hの情報が主であり、単一細胞を測定しているときは、その蛍光強度によってNAD(P)Hの量がわかり、細胞の活性等の状態を推定することができる。
単層を形成するまで増殖させた細胞であり、これ以上は増えない状態にある。
(2)グルタミン欠乏培地中の生細胞(*印)
培地中から細胞の栄養源であるグルタミンのみを除き、グルタミン飢餓状態で1日間培養した細胞である。
(3)死細胞(×印)
60℃の熱湯で処理し殺した細胞である。
(4)生細胞(プライマリー)(□印)
セルバンクから解凍したばかりの細胞であり、コンフルエントになるまで増え続ける。
(5)10mM NH4Cl 中(アンモニア過多)で培養した生細胞(△印)
培地中に10mM NH4Cl を加えて16時間培養した細胞である。高濃度老廃物蓄積環境を模倣した培養による細胞である。
さらに1点鎖線で示すような境界線を定めることで、生産工程における生細胞および死細胞の品質管理等の限界ラインを定めることもできる。この場合、光学的なゼロ点と光量(W/m2)のスパンの再現性が重要となるため、光学系としては絶対光量系(特許第4835730号公報に開示された構成など)が有用である。
なお、画像の背景の減算の演算は、両軸を対数で示すと除算の演算になる。
5 カメラ(検出手段、第1の検出手段、第2の検出手段)
6 試料(サンプル)
14 演算制御部(出力手段)
Claims (13)
- 自家蛍光に基づいて好気性の微生物または細胞を含むサンプルを測定する細胞検査装置であって、
サンプルに励起光を照射する第1の励起光照射手段と、
前記サンプルに励起光を照射する第2の励起光照射手段と、
前記第1の励起光照射手段により照射された励起光により前記サンプルから発生する自家蛍光に基づく第1の蛍光画像を検出する第1の検出手段と、
前記第2の励起光照射手段により照射された励起光により前記サンプルから発生する自家蛍光に基づく第2の蛍光画像を検出する第2の検出手段と、
前記第1の検出手段により検出された前記第1の蛍光画像から前記第2の検出手段により検出された前記第2の蛍光画像を差し引いた第3の蛍光画像を出力する出力手段と、
を備え、
前記第1の蛍光画像には前記サンプルの状態を示す特定画像と背景光による背景画像とが含まれ、
前記第2の蛍光画像は前記背景画像であることを特徴とする細胞検査装置。 - 前記第1の励起光照射手段により照射された励起光の波長と、前記第2の励起光照射手段により照射された励起光の波長とは同一であり、
前記特定画像はリポフスチンに基づき、前記背景画像はフラビン類に基づくことを特徴とする請求項1に記載の細胞検査装置。 - 前記第1の励起光照射手段により照射された励起光の波長と、前記第2の励起光照射手段により照射された励起光の波長とは互いに異なり、
前記特定画像はNADHに基づき、前記背景画像はフラビン類に基づくことを特徴とする請求項1に記載の細胞検査装置。 - 前記出力手段は、前記第2の検出手段により検出された前記第2の蛍光画像または前記出力手段により出力された前記第3の蛍光画像に含まれる特定物の数を算出して出力することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞検査装置。
- 自家蛍光に基づいて好気性の微生物または細胞を含むサンプルを測定する細胞検査方法であって、
サンプルに励起光を照射する第1の励起光照射ステップと、
前記サンプルに励起光を照射する第2の励起光照射ステップと、
前記第1の励起光照射ステップにより照射された励起光により前記サンプルから発生する自家蛍光に基づく第1の蛍光画像を検出する第1の検出ステップと、
前記第2の励起光照射ステップにより照射された励起光により前記サンプルから発生する自家蛍光に基づく第2の蛍光画像を検出する第2の検出ステップと、
前記第1の検出ステップにより検出された前記第1の蛍光画像から前記第2の検出ステップにより検出された前記第2の蛍光画像を差し引いた第3の蛍光画像を出力する出力ステップと、
をコンピュータが実行し、
前記第1の蛍光画像には前記サンプルの状態を示す特定画像と背景光による背景画像とが含まれ、
前記第2の蛍光画像は前記背景画像であることを特徴とする細胞検査方法。 - 前記出力するステップでは、前記第2の検出ステップにより検出された前記第2の蛍光画像または前記出力ステップにより出力された前記第3の蛍光画像に含まれる特定物の数を算出して出力することを特徴とする請求項5に記載の細胞検査方法。
- 自家蛍光に基づいて好気性の微生物または細胞を含むサンプルを測定する細胞検査装置であって、
複数の波長帯の励起光を選択的にサンプルに照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段から互いに波長帯が異なる励起光をそれぞれ照射したときに前記サンプルから発生する、互いに波長帯が異なる複数の自家蛍光をそれぞれ検出する検出手段と、
前記検出手段により検出された前記複数の自家蛍光の強度、または前記検出手段により検出された前記複数の自家蛍光による複数の蛍光画像に基づいた演算により前記サンプルの状態を示す情報を取得して出力する出力手段と、
を備え、
前記出力手段は、前記検出手段の視野を区分して形成される複数の領域ごとに、互いに波長帯が異なる前記複数の自家蛍光の強度を算出し、これらの強度の組み合わせを各領域の状態を示す情報として出力することを特徴とする細胞検査装置。 - 前記区分は個々の細胞に対応することを特徴とする請求項7に記載の細胞検査装置。
- 前記複数の自家蛍光のうちの一はリポフスチンからの蛍光であり、他はフラビン類からの蛍光であることを特徴とする請求項7または8に記載の細胞検査装置。
- 前記出力手段は、波長帯の異なる励起光を照射したときに得られる、異なる波長帯の蛍光画像の差分の演算をすることを特徴とする請求項9に記載の細胞検査装置。
- 前記励起光の波長帯域が 320〜400nmを含み、前記自家蛍光の波長帯域が 400〜500nmを含むことを特徴とする請求項1または7に記載の細胞検査装置。
- 前記励起光の波長帯域が 420〜500nmを含み、前記自家蛍光の波長帯域が 520〜610nmを含むことを特徴とする請求項1または7に記載の細胞検査装置。
- 自家蛍光に基づいて微生物または細胞を含むサンプルを測定する細胞検査方法であって、
複数の波長帯の励起光を選択的にサンプルに照射する励起光照射ステップと、
前記励起光照射ステップから互いに波長帯が異なる励起光をそれぞれ照射したときに前記サンプルから発生する、互いに波長帯が異なる複数の自家蛍光をそれぞれ検出する検出ステップと、
前記検出ステップにより検出された前記複数の自家蛍光の強度、または前記検出手段により検出された前記複数の自家蛍光による複数の蛍光画像に基づいた演算により前記サンプルの状態を示す情報を取得して出力する出力ステップと、
をコンピュータが実行し、
前記出力ステップでは、前記検出ステップにおける視野を区分して形成される複数の領域ごとに、互いに波長帯が異なる前記複数の自家蛍光の強度を算出し、これらの強度の組み合わせを各領域の状態を示す情報として出力することを特徴とする細胞検査方法。
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