JP2014530201A - 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体 - Google Patents

Abstract

ｃ−Ｍｅｔに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片が提供される。そのような抗体、またはその抗原結合断片は、ｃ−Ｍｅｔが病因に関与する腫瘍を有する患者における診断、予後および予測目的のため、ならびに治療レジメンを最適化するために細胞表面ｃ−Ｍｅｔ受容体レベルを検出するためのインビボ、エキソビボまたはインビトロでの免疫化学および他の画像検査法に有用である。【選択図】なし

Description

本発明は医薬の分野に関する。より特には、本発明は、高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現する腫瘍を有する患者を識別し、および／または抗ｃ−Ｍｅｔ治療を用いて彼らの治療反応を改善するのに役立つ画像化、予後もしくは予測適用などのｃ−Ｍｅｔを標識すること、マークすること、もしくは識別することを必要とする診断法に有用な検出可能なｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体複合体を形成するためにｃ−Ｍｅｔに結合する抗体に関する。

タンパク質ｃ−Ｍｅｔは、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリー、および分散因子（ＳＦ）としても知られている肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）についての受容体のメンバーである。成熟ｃ−Ｍｅｔタンパク質は、完全な細胞外アルファサブユニット、細胞外リガンド結合ドメインからなるベータサブユニット、単一膜貫通ドメイン、および細胞質チロシンキナーゼドメインから構成される。

ＨＧＦによるｃ−Ｍｅｔの活性化は、侵入性細胞表現型に関連する特性：増殖、移動、形態形成、生存（アポトーシスからの保護を含む）、およびプロテアーゼ合成を高めることが示されている。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路は、ヒトの癌において最も頻繁に異常調節される経路のうちの１つであり、実質的に全ての種類の固形腫瘍において発生する（非特許文献１）。ｃ−Ｍｅｔの刺激、過剰発現、または変異は、結腸、乳房、卵巣、肺、肝臓、前立腺、甲状腺、腎臓を含む、多くの種類の癌、ならびに黒色腫および肉腫において観察されている。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達軸のこれらの生化学および遺伝学的異常は、癌患者における不十分な臨床転帰および薬物耐性と相関する（非特許文献２）。

腫瘍形成の初期段階、およびその後の疾患伝播を調節する際のｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の役割に起因して、ｃ−Ｍｅｔは、発生におけるＨＧＦおよび／またはｃ−Ｍｅｔの低分子および抗体アンタゴニストを用いた癌治療についての魅力的な標的であるとみなされる。

非特許文献３および特許文献１は、ｃ−Ｍｅｔのβ鎖の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合するいくつかのモノクローナル抗体、ならびに正常および新生物ヒト組織においてｃ−Ｍｅｔの分布を検出するためのそれらの使用を開示している。

特許文献２は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織中でｃ−Ｍｅｔを染色できるＭＥＴ４と指定されているモノクローナル抗体を開示している。

癌患者の腫瘍細胞によるｃ−Ｍｅｔの発現のレベルを評価するために、ならびに／または１種以上の治療的抗ｃ−Ｍｅｔ剤を用いた患者の治療の結果、腫瘍細胞による低いレベルのｃ−Ｍｅｔ発現および／または少ない数のｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞が生じるかどうかを決定するために、特にｃ−Ｍｅｔが治療抗ｃ−Ｍｅｔ剤に既に結合した場合、膜に局在化したｃ−Ｍｅｔに特異的に結合できるｃ−Ｍｅｔ診断用抗体についての重要な要求が存在する。抗ｃ−Ｍｅｔ治療剤との本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体の二重結合は、所望の診断用の検出効果を損なうことなく、患者の処置前および後の両方の腫瘍組織の診断評価を可能とする。

国際公開第９２／２０７９２号 国際公開第２００９／０２９５９１号

Ｋｎｕｄｓｅｎら、（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １８：８７−９６ Ｌｉｕら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ、１７（７）：９９７−１０１１（２００８） Ｐｒａｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：５９５４−５９６２（１９９１）

したがって、本発明は、ヒトｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する代替の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を提供する。本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、比較的高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現する腫瘍細胞を有する癌患者を識別するのに役立つ診断用として有用であり得る。さらに、このような抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、国際公開第２０１０／０１１５３８号および米国特許出願公開第２０１２／００２８９８４号に記載されているｃ−Ｍｅｔの低分子アンタゴニストならびに国際公開第２０１０／０５９６５４号および／または米国特許第８，２１７，１４８号に記載されているものなどのｃ−Ｍｅｔの抗体アンタゴニストなどのｃ−Ｍｅｔ標的治療剤を用いた癌患者の治療をモニタおよび／または最適化するために使用されてもよい。

本発明の一態様は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片に関し、前記抗体、またはその抗原結合断片は、
アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号１）、ＧＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、およびＱＱＷＳＳＹＰＹＴ（配列番号３）をそれぞれ含む、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号４）、ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５）、およびＧＧＧＭＦＹＹ（配列番号６）をそれぞれ含む、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
を含む。

本発明の別の実施形態は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片であり、前記モノクローナル抗体は、
配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、および
配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）
を含む。

別の実施形態において、本発明は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を提供し、前記モノクローナル抗体は、
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。

別の実施形態において、本発明は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を提供し、前記モノクローナル抗体は２つの軽鎖および２つの重鎖を含み、各軽鎖は配列番号１１のポリペプチドであり、各重鎖は配列番号１３のポリペプチドである。

本発明の別の実施形態は、本発明の上述の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片のうちの１つと、診断的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む診断的に有用な組成物を提供する。１つのこのような実施形態において、ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、検出可能な部分に共有、非共有、または部分的に共有および部分的に非共有結合する。

別の実施形態において、本発明は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤを含むポリペプチドに結合した本発明の上述の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片のうちの少なくとも１つを含む組成物を含む。好ましくは、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、配列番号１５または１６に示されるアミノ酸配列内のエピトープにおいて配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤを含むポリペプチドに結合する。より好ましくは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤを含むポリペプチドに結合した本発明の上述の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体またはその抗原結合断片のうちの少なくとも１つを含む組成物は、診断的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。

他の実施形態において、本発明は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を含む容器を含む、キットを提供し、前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、
アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号１）、ＧＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、およびＱＱＷＳＳＹＰＹＴ（配列番号３）をそれぞれ含む、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号４）、ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５）、およびＧＧＧＭＦＹＹ（配列番号６）をそれぞれ含む、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
を含む。特定の実施形態において、キットは、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片に結合する二次抗体を含む第２の容器と、任意に、インビボ、エキソビボまたはインビトロでｃ−Ｍｅｔを検出するために、二次抗体と共に、または二次抗体を有さずにモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を使用するための指示書とを含んでもよい。一部の実施形態において、二次抗体は免疫学的検定法において使用されることが知られている酵素にコンジュゲートされてもよい。他の実施形態において、キットはさらに、上述の酵素の発色基質を含む別の容器を含んでもよい。好ましくは、本明細書に記載される方法は、ｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現を検出するためであり、インビトロ法である。同様に、本明細書に記載されるキットは、好ましくはインビトロでｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現を検出するために使用される。

他の実施形態において、本発明はまた、（ａ）前記モノクローナル抗体が細胞により発現されるｃ−ＭｅｔのＥＣＤに結合できる時間および条件下で、細胞を、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに特異的に結合する検出可能に標識されるモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片と接触させる工程であって、前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、
アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号１）、ＧＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、およびＱＱＷＳＳＹＰＹＴ（配列番号３）をそれぞれ含む、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号４）、ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５）、およびＧＧＧＭＦＹＹ（配列番号６）を含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
を含む、工程と、（ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合したモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を除去する工程と、（ｃ）任意の当該技術分野で公知の方法（例えばサイトメトリ技術）を使用してＥＣＤに特異的に結合する標識されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の量を検出および／または定量する工程と、を含む、哺乳動物細胞により発現または過剰発現されるｃ−Ｍｅｔを検出する方法を含む。好ましくは、ｃ−Ｍｅｔは、尿、腹水、リンパ液、髄液、気管支液、血清、または好ましくは血液などの癌患者由来の生物組織または体液中で検出される。

本発明はまた、尿、腹水、リンパ液、髄液、気管支液、血清、または好ましくは血液などの癌患者から得た哺乳動物生物組織または体液においてｃ−Ｍｅｔを発現または過剰発現する腫瘍細胞および／または循環腫瘍細胞を検出および／または定量する方法であって、その方法は、
検出可能なｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体複合体の形成を可能にする条件下で、組織を、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片と接触させる工程であって、前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、
アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号１）、ＧＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、およびＱＱＷＳＳＹＰＹＴ（配列番号３）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号４）、ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５）、およびＧＧＧＭＦＹＹ（配列番号６）を含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
を含む工程と、前記複合体（複数も含む）を検出および／または定量する次の工程とを含む、方法を提供する。種々の実施形態において、接触させる工程はインビトロで実施され得る。種々の実施形態において、接触させる工程はインビボで実施され得る。例えば、種々の実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、注射または注入により非経口で投与されてもよい。さらに、種々の実施形態において、抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、限定されないが、上述の標識を含む、少なくとも１つの検出可能な因子で標識される。検出は、限定されないが、ガンマカウンタ、シンチレーションカウンタ、陽電子放出断層撮影画像化剤、ならびに／または例えば、蛍光測定装置、生物発光測定装置、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）装置、磁気装置、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）装置、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）装置、超音波装置、光コヒーレンス断層撮影（ＯＣＴ）装置、および／もしくは単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）装置を含む装置を含む、特定の検出可能な標識に適している当該技術分野において公知の方法、技術および／または装置を使用してインビトロまたはインビボで実施され得る。

別の実施形態において、本発明は、
（ａ）ヒト細胞中または細胞上のヒトｃ−Ｍｅｔを検出および／または定量する工程、
（ｂ）患者におけるｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
（ｃ）患者の血液試料中のｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現循環腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
（ｄ）尿、腹水、リンパ液、髄液、気管支液、血清、または血液などの癌患者由来の体液中のｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
（ｅ）個体が、ｃ−Ｍｅｔが発現または過剰発現される組織または器官の癌を発症する危険性を有するか、または危険性があるかどうかを評価する工程、
（ｆ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療を用いる治療に適した腫瘍を有する患者を識別する工程、
（ｇ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いる治療に対する反応を決定する工程、ならびに／あるいは
（ｈ）癌を治療する工程
のための、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を含むキットの使用であって、前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、
アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号１）、ＧＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、およびＱＱＷＳＳＹＰＹＴ（配列番号３）をそれぞれ含む、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに
アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号４）、ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５）、およびＧＧＧＭＦＹＹ（配列番号６）を含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
を含む、使用を提供する。

好ましくは、上記の（ａ）〜（ｄ）に関して、検出または定量する工程はインビトロで実施される。より好ましくは、上記の（ａ）〜（ｄ）に関して、検出および定量する工程は各々インビトロで実施される。また、上記の（ｇ）および（ｈ）に関して、治療は好ましくは、例えば、国際公開第２０１０／０５９６５４号および／もしくは米国特許第８，２１７，１４８号に記載されている抗ｃ−Ｍｅｔ抗体などの抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体、ならびに／または国際公開第２０１０／０１１５３８号および米国特許出願公開第２０１２／００２８９８４号に開示されている化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩などの抗ｃ−Ｍｅｔ化学療法剤の投与を含む。より好ましくは、上記の（ｇ）および（ｈ）に関して、治療は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体、またはその抗原結合断片の投与を含み、該抗体またはその断片は、
配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４のそれぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに
配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７のそれぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
を含む。

さらにより好ましくは、上記の（ｇ）および（ｈ）に関して、治療は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、ならびに配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体、またはその抗原結合断片の投与を含む。

さらにより好ましくは、上記の（ｇ）および（ｈ）に関して、治療は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに配列番号３１または３２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体、またはその抗原結合断片の投与を含む。

さらにより好ましくは、上記の（ｇ）および（ｈ）に関して、治療は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体であって、軽鎖の各々は配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖の各々は配列番号３１もしくは３２に示されるアミノ酸配列からなる（抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体のヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４サブタイプのそれぞれは、国際公開第２０１０／０５９６５４号および／または米国特許第８，２１７，１４８号においてＣ８−Ｈ２４１と称される）、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または構造１および構造２として以下に示される化学療法剤もしくはその薬学的に許容可能な塩の投与を含む。

構造１：Ｎ−（３−フルオロ−４−（１−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルオキシ）フェニル）−１−（４−フルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド

構造２：６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−３−（２−メチル−２Ｈ−インダゾール−５−イルチオ）−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン

本発明の別の態様は、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体をコードする単離された核酸分子、その核酸分子を含む発現ベクター、およびその核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

図１は、異なる腫瘍細胞中の細胞表面ｃ−Ｍｅｔに対するｍＡｂ ＯｐｔＤ１１結合のＦＡＣＳ分析を示す。 図２は、グラフ形式において、ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体として抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）およびｃ−Ｍｅｔ検出抗体試薬としてビオチン化ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１（マウスＩｇＧ１サブタイプ）を使用した固相ＥＬＩＳＡによる安定なｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質についての結合曲線を示す。 図３は、表面プラズモン共鳴バイオセンサの使用により決定されるヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ融合タンパク質に対するｍＡｂ Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）およびＯｐｔＤ１１の同時であるが、非競合的結合を示す。

定義
本明細書で使用する場合、「ｃ−Ｍｅｔ」または「ヒトｃ−Ｍｅｔ」とは、他に示されない限り、任意のヒトｃ−Ｍｅｔ、およびその機能的に活性な変異型を指す。ｃ−Ｍｅｔの構造は以下に概略的に示される。

ＳＥＭＡ：セマ（Ｓｅｍａ）ドメイン
ＰＳＩ：プレキシン、セマホリン、およびインテグリンドメイン
ＩＰＴ：４つの免疫グロブリン、プレキシン、および転写因子ドメイン
ＴＭ：膜貫通領域
ＪＭ：膜近傍ドメイン
ＫＤ：キナーゼドメイン

ヒトｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ（配列番号１９）において、アミノ酸１〜２４はシグナル配列を含む。成熟タンパク質は配列番号１９のアミノ酸２５で開始する。セマ（ＳＥＭＡ）ドメインはｃ−ＭｅｔのＮ末端における約５００アミノ酸残基からなり、α鎖（配列番号１９のアミノ酸残基２５〜３０７、すなわち（配列番号２０）およびβ鎖（配列番号１９のアミノ酸残基３０８〜５１９、すなわち（配列番号２１））の一部を含有する。

本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、他に示されない限り、モノクローナル抗体を指す。「モノクローナル抗体」という用語、その略語「ｍＡｂ」、およびその文法的形態は、例えば、任意の真核性、原核性、またはファージクローンを含む、単一コピーまたはクローンに由来する抗体を指すことを目的とし、それが産生される方法ではない。本発明のモノクローナル抗体は好ましくは、均一または実質的に均一の集団中に存在する。完全なｍＡｂは２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。このようなモノクローナル抗体の「抗原結合断片」には、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、および一本鎖Ｆｖ断片が含まれる。本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えばＣＤＲグラフティング、またはそのような技術の組み合わせ、または当該技術分野における公知の他の技術により産生され得る。その抗原結合断片が特定されているかどうかに関わらず、本明細書で使用する場合、「抗体」および「モノクローナル抗体」という用語は、他に示されない限り、このような断片および一本鎖形態を含むと理解される。

モノクローナル抗体およびその抗原結合断片を産生および精製するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第５〜８および１５章、ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２に見出され得る。

本明細書に開示されるｃ−Ｍｅｔ抗体は、細胞中もしくは上、または組織、器官、体液中などの細胞中もしくは上、ならびに診断、予後、および／または患者をモニタリングする手順に存在するｃ−Ｍｅｔの発現、過剰発現、またはレベルを検出するのに有用である。「体液」という用語は、血液、血清、血漿、リンパ液、骨髄、尿、唾液、涙、脳脊髄液、乳、羊水、胆汁、尿、気管支液、腹水、膿汁、または任意の他の生物学的産生物などの正常または疾患被験体の身体由来の任意の流体または他の物質を指す。この用語の意味に含まれるものにはまた、器官または組織抽出物、および被験体由来の任意の細胞または組織調製物がインキュベートされる培養液がある。

本明細書で使用する場合、ヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤについてのｃ−Ｍｅｔ抗体の親和性に関して「特異的に結合する」という語句は、他に示されない限り、本明細書に実質的に記載されるＳＰＲバイオセンサの使用を含む、当該技術分野において公知の一般的な方法により決定される場合、約１×１０^−８未満、好ましくは約１×１０^−９Ｍ未満、より好ましくは約１×１０^−８Ｍから約１×１０^−１１Ｍの間、さらにより好ましくは約１×１０^−９Ｍから約５×１０^−１１Ｍの間、さらにより好ましくは約５×１０^−１０Ｍから約５×１０^−１１Ｍの間、さらにより好ましくは約０．１５ｎＭから約０．０５ｎＭの間、さらにより好ましくは約０．１５ｎＭから約０．０７５ｎＭの間、最も好ましくは約０．１０ｎＭのＫ_Ｄを意味することを目的とする。

「腫瘍」という用語は、悪性または良性、ならびに全ての前癌性および癌性細胞および組織であるかどうかに関わらず、全ての腫瘍性細胞成長および増殖を指す。

「癌」および「癌性」という用語は、典型的に異常な細胞成長／増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、または示す。例としては、限定されないが、癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれる。「癌」、「癌性」、および「腫瘍」という用語は、本明細書で使用する場合、相互排他的ではない。

本明細書で使用する場合、ヒトｃ−Ｍｅｔは、ヒトｃ−Ｍｅｔの量が正常なヒト細胞または非腫瘍ヒト組織中のヒトｃ−Ｍｅｔの量よりヒト細胞、ＣＴＣ、または腫瘍組織試料中で顕著に多いと決定される場合、ヒト細胞、ＣＴＣ、または腫瘍組織試料中または上で「過剰発現される」。

抗体組み合わせおよび方法
本発明のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体は、器官の組織に関わらず、腫瘍中でｃ−Ｍｅｔを標的とする。腫瘍細胞上でのｃ−Ｍｅｔの比較的多い発現のために、腫瘍を正常組織から識別することができる。また、腫瘍クラス（すなわち、異なる器官および器官の組織）にわたるｃ−Ｍｅｔの広範な発現のために、表面マーカーとしてのｃ−Ｍｅｔの画像化は、任意の特定の腫瘍種類に特異的ではないが、任意のｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍のために一般に使用され得る。

当業者が、安定で検出可能な抗原−抗体複合体を生成するために使用できる、当該技術分野において周知の方法が存在する（例えば、検出可能な抗原／抗体複合体の生成を可能にする条件について、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（現行版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。特に、国際公開第２０１０／０５９６５４号および／または米国特許第８，２１７，１４８号は、限定されないが、本明細書でＯｐｔＤ１１と称されるモノクローナル抗体を含む、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を可能にし得る例示的な条件を記載している。ｃ−ＭｅｔのＥＣＤに結合した本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体を含む組成物は、本明細書に教示される方法または限定されないが、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出または国際公開第２０１０／０５９６５４号に開示されているような方法を含む、当該技術分野において一般的に知られている方法を使用して検出、標識、および／または識別され得る。

本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体または本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体複合体は、任意の当該技術分野において公知の手段（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ２、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｒｏｌａｎｄ：Ｄｕｂｅｌ、Ｓｔｅｆａｎ（Ｅｄｓ．）を参照のこと）を使用して検出可能に標識され得る。標識は、例えば、限定されないが、発光または光吸収剤、発色団、色原体、磁性粒子または鉄粒子、色素、蛍光剤、フルオロフォア、リン光性剤、化学発光剤、生物発光剤、放射性核種、酵素、ポジトロン放出断層撮影画像化剤、磁性マイクロビーズ、強磁性流体ナノ粒子、二次抗体、および磁性共鳴画像化剤であってもよい。

限定されないが、ｃ−Ｍｅｔまたは検出可能に標識されたｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体複合体は、インビボ、エキソビボまたはインビトロのいずれかで細胞、またはその断片上にあってもよい。例えば、限定されないが、このような細胞またはその断片は、インサイチュで、その天然に存在する状態から、または例えば、細胞ペレット、異種移植片、組織（癌性または非癌性）、器官、体液、またはそれらの任意の濃縮、精製、高濃度形態などの試料中で単離されてもよい。これらの方法のいずれかにおいて、接触させる工程および検出する工程は各々インビトロで実施されてもよく、接触させる工程はインビボで実施されてもよく、検出する工程はインビトロで実施されてもよく（または逆も同様）、または接触させる工程および検出する工程は各々インビボで実施されてもよい。

「検出可能に標識された」という用語は、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、もしくはその抗原結合断片、またはｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体の複合体は共有または非共有結合のいずれかで有用な検出可能な標識に結合されることを意味する。直接的なコンジュゲート標識抗体方法において、例えば、補欠分子族複合体、発色団、色原体（色生成基質）、色素、蛍光化合物、蛍光性化合物、放射性同位体、常磁性同位体、ならびにポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）および磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）により画像化され得る化合物を含む多くの異なる有用な標識が利用されてもよい。他の適切な標識は当該技術分野で周知であるか、または慣用の実験により決定され得る。間接的な方法において、二次抗体は、例えば酵素とコンジュゲートされてもよい。次いで、標識抗原に結合される一次抗体に対する二次抗体の結合は、検出可能な信号を生じるのに適切な条件下での酵素の発色基質との反応により検出され得る。

高い吸光係数を有する発色団を有する、または生じ、それにより、容易に検出可能である発色化合物を利用する、比色検出が使用されてもよい。適切な反応条件下で、後でその基質に曝露される場合、酵素は、例えば、分光光度、蛍光定量的、または視覚手段により検出され得る化学部分を生成するために基質と反応する。

この目的のために一般に使用される酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。

適切な補欠分子族複合体の例には、限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。

一般的に使用される色原体には、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；強化剤とのＤＡＢ；３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；４−クロロ−１−ナフトール（４−ＣＮ）；Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ試薬；アルファ−ナフトールピロニン；３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ＢＢ；Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ；新フクシン；ＢＣＩＰ−ＮＢＴ；テトラゾリウム；テトラニトブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）；および銀強化剤との免疫金が含まれる。

それらを利用するアッセイは、臨床検査室において容易に実施され、それらの検査室において一般的に利用可能な機器を用いて病理学者により評価され得るので、色原体の使用が好ましい。

酵素にコンジュゲートされる本明細書における抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体もまた、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）において使用されてもよい。このようなアッセイは、例えば、Ｂｕｔｌｅｒ（１９９４）「ＥＬＩＳＡ」（第２９章）、ｖａｎ Ｏｓｓ、Ｃ．Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．７５９−８０３に詳細に記載されている。本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体はまた、細胞表面ｃ−Ｍｅｔのラジオイムノアッセイおよび蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析に使用されてもよい。

有用な蛍光標識には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ローダミン、ダンシル基、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、およびＣｙ５が含まれる（Ｈａｕｇｌａｎｄ（（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）。

本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、もしくはその抗原結合断片、またはｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体複合体はまた、^１５２Ｅｕ^＋などの蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のメンバーを使用して、それらをジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのこのような金属キレート基を使用して結合することにより検出可能に標識されてもよい。

本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、もしくはその抗原結合断片、またはｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体複合体はまた、それらを、化学反応の過程の間に生じるリン光または発光により後で検出され得るリン光性または化学発光性化合物に結合することにより検出可能に標識されてもよい。有用な化学発光化合物の例には、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが含まれる。同様に、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、またはエクオリンなどの生物発光化合物が、抗体ペプチドを標識するために使用されてもよい。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することにより決定される。

インビボまたはインビトロ画像化が、他の方法により観測できない不顕性転移を含む、患者におけるｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現腫瘍細胞（および／または循環腫瘍細胞）の増殖、移動または侵入を検出するために使用されてもよい。ｃ−Ｍｅｔの発現は癌患者における疾患進行と関連し得；後期癌を有する患者は通常、それらの原発性腫瘍および転移の両方において高いレベルのｃ−Ｍｅｔ発現を有する。ｃ−Ｍｅｔを標的とした画像化が、非侵襲的に腫瘍の病期を分類するため、または増加したレベルのｃ−Ｍｅｔの存在に関連する別の疾患を検出するために使用されてもよい。

本発明は、融合タンパク質を生成するためにポリペプチド（または好ましくは、ポリペプチドの少なくとも：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個の隣接アミノ酸を含むその一部）に組み換えて融合された、または化学的にコンジュゲートされた（共有および非共有コンジュゲーションの両方を含む）抗体を含む。融合は直接的であることを必ずしも必要とされないが、リンカー配列により行われてもよい。

ポリペプチドに融合またはコンジュゲートされる抗体はまた、公知の当該技術分野の方法を使用してインビトロ免疫学的検定法および精製法において使用されてもよい（例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出、および国際公開第９３／２１２３２号；欧州特許第４３９，０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９ ｌ−９；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２ＰＮＡＳ８９：１４２８−３２；Ｆｅｌｌら、１９９１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−５２を参照のこと）。

本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合またはコンジュゲートされるポリペプチド（またはその断片）を含む組成物を含む。ポリペプチド（またはその断片）を抗体または抗体部分に融合またはコンジュゲートする方法は公知である（例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；欧州特許第３０７，４３４号；欧州特許第３６７，１６６号；国際公開第９６／０４３８８号；国際公開第９１／０６５７０号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、（１９９１）ＰＮＡＳ８８：１０５３５−１０５３９；Ｚｈｅｎｇら、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００；およびＶｉｅら、（１９９２）ＰＮＡＳ８９：１１３３７−１１３４１を参照のこと）。

ポリペプチド、ポリペプチド断片は、インビボ半減期を増加させるために本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片に融合またはコンジュゲートされてもよい。さらに、ポリペプチド、ポリペプチド断片は、精製を促進するために抗体またはその抗原結合断片に融合またはコンジュゲートされてもよい。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ｐＱＥベクターに与えられるタグ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）などのヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、とりわけ、それらの多くは市販されている。ヘキサ−ヒスチジンはタンパク質の簡便な精製を提供する（Ｇｅｎｔｚら、（１９８９）ＰＮＡＳ８６：８２１−８２４）。精製に有用な他のペプチドタグには、例えば、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する、「ＨＡ」タグ（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８４）Ｃｅｌｌ３７：７６７−７７８を参照のこと）および「フラグ」タグが含まれる。

本発明はさらに、診断または治療剤にコンジュゲートされる抗体またはその断片を含む。抗体は、例えば、所与の治療レジメンの効果を決定するために臨床試験手順の一部として腫瘍の発生または進行をモニタするために診断的に使用されてもよい。検出は、抗体を検出可能な標識に結合することにより促進されてもよい。検出可能な標識は、抗体（またはその断片）に直接または確立された技術（例えば、本発明に係る診断として使用するために抗体にコンジュゲートされ得る金属イオンについて米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと）を使用して中間体（例えば当該技術分野において公知のリンカーなど）を介して間接に結合またはコンジュゲートされてもよい。

本発明のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片はまた、標的抗原の免疫学的検定法または精製に特に有用である、固体支持体に取り付けられてもよい。そのような固体支持体には、例えば、限定されないが、ガラス、セルロース、ポリ−アクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれる。治療部分を抗体にコンジュゲートするための技術は公知である。例えば、Ａｍｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、（ｅｄｓ．）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（ｅｄｓ．）、ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（ｅｄｓ．）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（ｅｄｓ．）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、ならびにＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。

ｃ−Ｍｅｔなどの特定のタンパク質は、例えば、限定されないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫学的検定法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、およびプロテインＡ免疫学的検定法などの技術を使用した、例えば、限定されないが、競合および非競合アッセイシステムを含む、種々の免疫学的検定法により測定され得る。一般的な免疫学および免疫学的検定手順の概説に関しては、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ（ｅｄｓ．）（１９９１）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第７版）を参照のこと。さらに、本発明の免疫学的検定法は、Ｍａｇｇｉｏ（ｅｄ．）（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｇｏｓｌｉｎｇ ＪＰ ２０００ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ Ｐｒｅｓｓ；Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＆ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ、１９９６ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｔｉｊａｎ（１９８５）「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｗｉｌｄ，Ｄ．（Ｅｄ．）、２００１ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂ Ｇｒｏｕｐ；Ｊａｍｅｓ Ｔ．Ｗｕ、２０００ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｓｓａｙ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ、Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ａｍｅｒ Ａｓｓｎ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ ＆ Ｂｅａｕｄｅｔ（Ｅｄｓ．）Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ；ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、前出において広範に概説されている多くの構成において実施されてもよい。また、Ｃｈａｎ（ｅｄ．）（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ；ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ（ｅｄｓ．）（１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ならびにＮｇｏ（ｅｄ．）（１９８８）Ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹも参照のこと。

測定するための免疫学的検定法は、種々の当該技術分野で公知の方法により実施されてもよい。つまり、ｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤを測定するための免疫学的検定法は、競合または非競合結合アッセイのいずれであってもよい。競合結合アッセイにおいて、分析される試料は、固体表面に結合した捕捉剤上の特異的結合部位について、標識された検体と競合する。好ましくは、捕捉剤は、本明細書に記載されるｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤと特異的に反応する抗体である。捕捉剤に結合した標識された検体の濃度は、試料中に存在する遊離検体の量と反比例する。

競合結合免疫学的検定法において、試料中に存在する標的タンパク質（すなわち、ｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ）は、本発明の抗体またはその抗原結合断片に対する結合について、標識されたタンパク質と競合する。本発明の抗体、またはその抗原結合断片は、未結合の標識タンパク質から結合標識タンパク質の分離をもたらすように固体表面に結合されてもよい。あるいは、競合結合アッセイは液相で行われてもよく、当該技術分野において公知の種々の技術が、未結合の標識タンパク質から結合標識タンパク質を分離するために使用されてもよい。分離後、結合標識タンパク質の量が決定される。試料中に存在するタンパク質の量は、結合している標識タンパク質の量に反比例する。

あるいは、分離工程が必要とされない均一の免疫学的検定法が実施されてもよい。これらの免疫学的検定法において、タンパク質における標識は、その特異的結合組成物に対するタンパク質の結合により変更される。標識タンパク質のこの変更は、標識により発せられる信号の減少または増加を生じるので、免疫学的検定法の終わりにおける標識の測定はタンパク質の検出または定量を可能とする。

競合アッセイはまた、細胞が接触し、^１２５Ｉ−抗体などのタンパク質に対する既知の結合親和性を有する標識抗体とインキュベートされる場合、特に有用であり、結合組成物に対する試験試料の結合親和性が測定される。次いで結合したおよび無標識の結合組成物がタンパク質結合の程度を評価するために分離される。結合した試験化合物の量は、既知の源に結合する標識された結合パートナーの量と反比例する。多くの技術のうちの任意の１つが、タンパク質結合の程度を評価するために遊離タンパク質からの結合を分離するために使用されてもよい。この分離工程は典型的に、フィルタに対する接着、続いて洗浄、プラスチックに対する接着、続いて洗浄、または細胞膜の遠心分離などの手順を含んでもよい。生存細胞もまた、ｃ−Ｍｅｔ媒介性機能に対する薬物の効果（例えば、第２のメッセンジャーレベル、例えば細胞増殖など；イノシトールリン酸プールの変化、ルシフェラーゼ−タイプアッセイを使用した転写など）についてスクリーニングするために使用されてもよい。一部の検出方法は、分離工程、例えば、近接高感度システムの除去を可能とする。

ｃ−Ｍｅｔの定性的または定量的分析もまた、本発明の抗体、またはその抗原結合断片を使用して種々の非競合的免疫学的検定法により決定されてもよい。例えば、２つの部位の固相サンドイッチ免疫学的検定法が使用されてもよい。この種のアッセイにおいて、抗体は固体支持体に結合される。抗体でもあり得、異なる部位にてタンパク質に結合する第２のタンパク質結合組成物が標識される。タンパク質が発生する両方の部位で結合した後、未結合の標識された結合組成物が除去され、固相に結合した標識された結合組成物の量が測定される。結合した標識された結合組成物の量は、試料中のタンパク質の量と正比例する。

特定の抗原を免疫沈降させる対象の抗体の能力は、例えばウェスタンブロット分析により評価されてもよい。当業者は、抗原に対する抗体の結合を増加させ、（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を予備洗浄することにより）バックグラウンドを減少させるためにパラメータが修飾可能であることを認識しているだろう。免疫沈降プロトコルのさらなる説明は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出され得る。

ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原を調製すること、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングすること、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートされた対象の抗体をウェルに添加すること、および一定時間インキュベートすること、および抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡにおいて、対象の抗体は、検出可能な化合物にコンジュゲートされなくてもよく、代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートされる二次抗体（対象の抗体を認識する）がウェルに添加されてもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされてもよい。この場合、検出可能な化合物にコンジュゲートされる二次抗体は、コーティングされたウェルへの対象の抗原の添加後に添加されてもよい。当業者は、例えば、信号を増加させるためにどのパラメータを調節するか、およびＥＬＩＳＡについてどの他の変更を使用すべきかについて過度の実験を必要とせずに決定できる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例えば、ＯｐｔＤ１１は、限定されないが、Ｃ８−Ｈ２４１（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＃１３６５２８７−９７−３を参照のこと）として当該技術分野において公知のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体を含む、当該技術分野において公知のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体などのｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ捕捉抗体と共に使用される場合、ヒト腫瘍、腫瘍溶解物、および血液などの体液中の全ｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤを測定するためのｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ検出抗体として有用であり得る。あるいは、ＯｐｔＤ１１は、限定されないが、Ｃ８−Ｈ２４１として当該技術分野において公知のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体を含む、当該技術分野において公知のｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体などのｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ検出抗体と共に使用される場合、ヒト腫瘍、腫瘍溶解物、または血液などの体液中の全ｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤを測定するためのｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ捕捉抗体として有用であり得る。さらに、ＯｐｔＤ１１は、ＨＲＰにコンジュゲートされる抗ホスホ−チロシン抗体（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；カタログ番号＃８４１４０３）または抗ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ ｐＹｐＹｐＹ１２３０／１２３４／１２３５ｃ−Ｍｅｔポリクローナル抗体（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ番号４４−８８８Ｇ）などの検出抗体と共に使用される場合、ヒト腫瘍、腫瘍溶解物、または血液などの体液中のリン光体−ｃ−Ｍｅｔを測定するためのｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ捕捉抗体として有用であり得る。

抗原に対する抗体の結合親和性ならびに抗体−抗原相互作用の会合および解離速度は、例えば、競合結合アッセイを使用することにより決定され得る。１つの非限定的な例は、増加した量の未標識の抗原の存在下で対象の抗体と共に（例えば、^３Ｈまたは^１２５Ｉを使用して）標識された抗原をインキュベートすること、次いで標識された抗原に結合した抗体の量を検出することを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原についての対象の抗体の親和性および結合解離速度は、例えば、スキャッチャードプロット分析によりデータから決定され得る。二次抗体との競合もまた、例えば、ラジオイムノアッセイを使用して決定されてもよい。

ガンマカウンタ、シンチレーションカウンタ、ＰＥＴ走査、またはオートラジオグラフィーにより簡単に検出される、有用な放射標識には、^３Ｈ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、および^１４Ｃが含まれる。インビボ診断に関して、放射性核種は、直接またはＤＴＰＡおよびＥＤＴＡなどのキレート剤を使用して間接のいずれかでｍＡｂまたは抗原結合断片に結合され得る。このような放射性核種の例には、^９９Ｔｃ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９７Ｒｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙおよび^２０１Ｔｌが含まれる。一般に、インビボ診断用途における検出可能性に必要とされる標識されるｍＡｂの量は、患者の年齢、病態、性別、疾患の程度、もしあれば禁忌、および他の可変物に応じて変化し、担当医または診断医により容易に調節され得る。好ましい診断方法は、好ましくは、連続した全身のガンマカメラ画像を生じ、定量的「関心領域」（ＲＯＩ）分析により局所活性の測定を可能にする様式で実施される放射免疫シンチグラフィーである。

別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するために使用されてもよい。ＣＴＣは、移動している間に血流内で生存し、別の部位で新たな成長を開始する腫瘍から取り除いた腫瘍細胞である。腫瘍が検出される前に、ＣＴＣは患者において見出され得るので、ＣＴＣを検出することは有用である。腫瘍細胞の循環はまた、癌が再発する場合、かなりの割合の患者で見られ、ＣＴＣは、一部の患者において、原発性腫瘍の除去後に生き残る。証拠により、ＣＴＣは、原発性腫瘍および転移性腫瘍におけるクローン由来であり、それらは腫瘍進行の全ての段階で負荷されている腫瘍を反映し得ることが示唆されている。したがって、早期診断および予後における潜在的な役割に加えて、ＣＴＣは、腫瘍進行に関する遺伝的および表現型変化を特徴付けるのに主要な役割を果たし得るので、標的療法を誘導するのに役立つ。より特に、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体は、例えば、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣ試験（Ｖｅｒｉｄｅｘ ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、磁性活性化細胞分類システム（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＭＡＣＳ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｙｎａｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｃａｎａｄａ）、ＣＴＣチップ（Ｏｎ−Ｑ−ｉｔｙ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、またはＳｌｅｉｊｆｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｉｔｓ ｗａｙ ｔｏ ｒｏｕｔｉｎｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ？ Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、４３（１８）：２６４５−５０（２００７）；Ｌａｃｒｏｉｘ Ｍ．、Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ．、１３（４）：１０３３−６７（２００６）；およびＰａｎｔｅｌら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、８（５）：３２９−４０（２００８））に記載されているものなどのＣＴＣを単離および検出するための当該技術分野において公知の任意の他の試験などのＣＴＣを捕捉、識別、および／または定量できるアッセイにおいて有用であり得る。現在、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＣＴＣが、循環腫瘍細胞を検出し、数え上げるための自動化試験としてＵＳＦＤＡにより承認されている唯一の診断試験である（Ｆｅｄ．Ｒｅｇ．６９（９１）：２６０３６−３８（２００４））。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）試験からの結果が、転移性前立腺癌（Ｄａｎｉｌａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１３（２３）：７０５３−５８（２００７））、結腸直腸癌（Ｃｏｈｅｎら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ６（２）：１２５−３２（２００６））、および乳癌（Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ，ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３５１（８）：７８１−９１（２００４））における疾患進行および治療効果をモニタするために使用されている。本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはその抗原結合断片、例えばＯｐｔＤ１１が、このような方法、例えばＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）試験に使用されてもよく、一部の場合、ｃ−Ｍｅｔ媒介性癌についての治療の開始および治療過程の間の任意の時間に実施される。好ましくは、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはその抗原結合断片は、限定されないが、ＥＰＣＡＭ、ＤＡＰＩ、ＣＤ４５、および／またはサイトケラチン（限定されないが、サイトケラチン７、８、１８および／または１９を含む）を含む、他のポリペプチドに特異的な抗体と共にこのような方法で使用され得る。このような試験から生成される情報は、例えば、疾患進行および治療効果のモニタリングを可能にすることにより、その予後値にとって有用であり得、早期（および継続中）の治療の決定を可能にできる。さらに、本発明の検出可能に標識された抗体および治療抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（国際公開第２０１０／０５９６５４号および／または米国特許第８，２１７，１４８号に開示されているものなど）の同時結合を可能にすることによって、治療用抗ｃ−Ｍｅｔ抗体での治療の中断、例えば、診断用抗体をｃ−Ｍｅｔに結合できる治療抗体の「洗い出し」が必要とされない。その結果、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、必要な場合、診断的モニタリングと同時に、中断せずに治療的治療を可能にする。

インビボでの適用に関して、検出可能に標識された、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、またはその抗原結合断片は、投与に簡便な形態で製剤化されてもよい。診断のために、検出可能に標識された、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、または抗原結合断片は、全身的に、例えば注射または注入により非経口的に投与されてもよい。このような注射または注入は、任意の公知の経路、好ましくは、静脈注射または注入、皮下注射、筋肉内、頭蓋内、または髄膜注射もしくは注入、または腹腔内投与であってもよい。注射物質は、溶液もしくは懸濁液として、または固体形態のいずれかとして従来の形態で調製されてもよい。このような組成物は当該技術分野において周知の方法により調製されてもよく（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、（１９９５）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏを参照のこと）、本明細書に開示される抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と、薬学的または診断的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む。

用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重で変更してもよい。診断的画像化のための適切な用量に関するさらなるガイドラインは、Ｓｍｉｔｈら（１９７７）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈａｂｅｒら、ｅｄｓ．、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３６５−３８９ページに見出され得る。

インビボでのｃ−Ｍｅｔ検出目的に関して、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片の「有効量」という用語は、患者への単回または複数回投与により、インビボでｃ−Ｍｅｔを検出する能力を与える抗体化合物の量を指す。

製造物品およびキット
本発明はまた、ｃ−Ｍｅｔ陽性腫瘍および非癌性細胞を診断、検出、定量、および／または画像化するのに有用な組成物を含有する製造物品およびキットを提供する。製造物品は標識を有する容器を含んでもよい。容器は、検出可能に標識された、または未標識である、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を含む組成物を保持できる。容器上の標識は、組成物が、癌を予後もしくはモニタリングするため、またはｃ−Ｍｅｔを発現する特定の種類の癌もしくは腫瘍を診断もしくはモニタリングするため、またはｃ−Ｍｅｔレベルもしくは代謝回転を予測するため、または治療についての効果的な標的を予想するために使用されることを示してもよい。別の実施形態において、標識は、組成物がｃ−Ｍｅｔを検出および／または定量するのに有用であることを示してもよく、また、インビボもしくはインビトロでのいずれかの使用についての指示を示してもよい。

本発明のキットはまた、二次抗体またはさらにｃ−Ｍｅｔ抗原を含む容器を含んでもよく、好ましくは、抗原は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。二次抗体は酵素でコンジュゲートされてもよい。酵素の発色性基質もまた、キットに含まれてもよい。キットはさらに、緩衝液、希釈剤、充填剤、注射針、注射器、およびインビボ、インビトロもしくはその両方での使用のための指示書を有するパッケージ挿入物を含む、市販および使用者の観点から望ましい他の物質を含んでもよい。

異常ＨＧＦおよび／またはｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は臨床転帰と逆相関し、広範囲のヒト悪性腫瘍において実証されている。ｃ−Ｍｅｔの不適切な発現は多くのヒト腫瘍における不十分な患者の予後と相関する。診断手順に有用なｃ−Ｍｅｔに結合する本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、癌患者を識別し、階層化するため、および慣用の標準物より回収される組織試料を使用することによってｃ−Ｍｅｔ標的治療に対する患者の反応をモニタリングするために使用されてもよく、これにより、患者の不快感を最小限にする。

したがって、本発明の方法は、腫瘍の原発組織に依存することなく、所与の腫瘍が後で侵入または転移する可能性が高いかまたは低いかを評価するために非侵襲性手段を使用する転移の危険性の階層化の形態を、新たに診断される癌患者に提供する。このような情報は、個々の患者に基づいて適切なモニタリングおよび治療プロトコルを設計する能力を改善する。

本発明のｃ−Ｍｅｔ抗体またはｃ−Ｍｅｔ／抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体複合体および本明細書に開示される方法は種々の哺乳動物種の診断に有用であり得、ヒトまたは獣医用医薬の実施に同様に適用可能である。したがって、これらの抗体、複合体、および方法は、家畜および市販の動物、最も好ましくはヒトに使用されてもよい。

本発明の別の態様は、上述の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のいずれかをコードする単離された核酸分子、その核酸分子を含む発現ベクター、およびその核酸分子を含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、上述抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のいずれかを精製する方法を提供する。

ベクターの形質転換および本発明の抗体の発現のための好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＮＳ０細胞（非分泌（０）マウス骨髄腫細胞）、２９３、ＳＰ２０およびＣＨＯ細胞ならびにリンパ腫、骨髄腫、またはハイブリドーマ細胞などのリンパ系起源の他の細胞株である。酵母などの他の真核生物宿主が代替として使用されてもよい。

抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に関して「単離された」抗体は、その天然環境の成分から識別および分離および／または回収されているものである。その天然環境の汚染成分は、抗体についての診断または治療的用途を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質を含んでもよい。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法により決定した場合、９５重量％超、より好ましくは９９重量％超の抗体に、（２）スピニングカップシークエネータの使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、あるいは（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一に精製される。本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に関して「単離された」という用語は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイチュでの抗体を含んでもよい。本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈殿、その後の生理食塩水に対する透析、イオン交換クロマトグラフィー、限定されないが、プロテイン−Ａアフィニティクロマトグラフィーを含む、アフィニティまたはイムノアフィニティクロマトグラフィー、およびゲル濾過またはゾーン電気泳動を含む、当該技術分野において公知の任意の方法により単離または精製されてもよい。

さらに、本発明は、発現配列、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列などの制御配列に作動可能に連結される、以前に記載されているポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを提供する。細菌などの原核細胞系ならびに限定されないが、酵母および哺乳動物細胞培養系を含む真核細胞系における抗体ポリペプチドの効果的な合成のための種々の発現ベクターが開発される。本発明のベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含んでもよい。

本発明はまた、以前に記載されている組換えベクターを含有する組換え宿主細胞を提供する。本発明の抗体はハイブリドーマ中以外の細胞株中で発現され得る。本発明に係る抗体をコードする配列を含む核酸が、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用されてもよい。

特定の好ましい細胞株は、対象のタンパク質の高レベルの発現、構成的発現および宿主タンパク質由来の最小の汚染物質に基づいて選択される。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野において周知であり、限定されないが、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などの多くの不死化細胞、ならびにリンパ腫、骨髄腫、またはハイブリドーマ細胞などのリンパ系起源の細胞株を含む多くの他のものを含む。

実施例１
抗体発現および精製
限定されないが、ＯｐｔＤ１１を含む、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、標準的なトランスフェクション手順を使用してＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）内で一過性に発現できる。トランスフェクト細胞は、トランスフェクション後、３７℃にて４８時間〜１２０時間、ジェネティシン（Ｇ４１８）およびトブラマイシンを含有する標準的な無血清培地中で培養する。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、製造業者の指示書に従って、６０ｍｌのｒプロテインＡセファロースカラム（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；カタログ番号１７−１２７９−０４）上で精製でき、さらに濃縮でき、移動相としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＸＫ５０／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製できる。次に、抗体調製物を、Ｍｉｌｌｅｖ−ＧＶ、ＰＶＤＦ膜、０．２２μｍ、３３ｍｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；＃ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を使用して濾過でき、４〜８℃で保存できる。

実施例２
抗体ＯｐｔＤ１１の結合キネティクスおよび親和性
ヒトおよびカニクイザルｃ−Ｍｅｔ配列の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１７および１８に示される、ＦｃのＣ末端においてフラグ−およびＨｉｓ−タグ（Ｆｌｉｓ−タグ）を有するＦｃ融合タンパク質として発現できる。これらのｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ Ｆｃ融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡにおいて別々に一過性に発現でき、実質的に実施例１に記載されているように精製できる。

ヒトおよび／またはカニクイザルｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤに対する本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体の結合キネティクスは、当該技術分野において公知の方法に従ってＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）などの表面プラズモン共鳴バイオセンサの使用により決定できる。示しているものを除いて、全ての試薬および材料はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）から購入でき、測定は２５℃で実施できる。

簡潔に記載すると、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４における１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤Ｐ−２０、および１０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；＃ＢＲ−１００１−８８）中に溶解できる。ヤギ抗マウスＦｃ抗体は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を捕捉するためにアミンカップリング化学を使用して４０００反応単位（ＲＵ）のレベルにおいてＣＭ５センサチップのフローセル１〜４上で固定する。

複数の分析サイクルを使用して結合は評価できる。各サイクルは５０μｌ／分の流速で実施し、以下のステップからなってもよい：４０〜１００ＲＵの捕捉を目的として１０μｇ／ｍｌにて抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体の約１０μｌの注入、２５０μｌのヒトまたはカニクイザルｃ−Ｍｅｔ−Ｆｌｉｓ−Ｆｃ ＥＣＤの注入（１００ｎＭで開始し、各サイクルについて２倍連続希釈を使用する）、続いて解離について２０分、および約３０μｌの１０ｍＭ塩酸グリシン、ｐＨ１．５を使用して再生。各サイクルについての会合および解離速度は、ＢＩＡ評価ソフトウェア４．１において「１：１（ラングミュア）結合」モデルを使用して評価できる。

本発明の抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体、ＯｐｔＤ１１を、配列番号１７および１８に示される、ＦｃのＣ末端においてフラグ−およびＨｉｓ−タグ（Ｆｌｉｓ−タグ）を有するＦｃ融合タンパク質として発現されるヒトおよびカニクイザルｃ−ＭｅｔのＥＣＤに対するその結合キネティクスについて試験した。表２に示すように、ＯｐｔＤ１１は、非常に高い結合親和性（Ｋ_ｄ）でヒトおよびカニクイザルｃ−Ｍｅｔ−Ｆｌｉｓ−Ｆｃ ＥＣＤに結合する。表２はまた、ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆデータを示す。

実施例３
ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１を使用したＦＡＣＳ分析による細胞表面上のｃ−Ｍｅｔの検出
細胞表面ｃ−Ｍｅｔ受容体を測定するように設計したインビトロアッセイは、ｃ−Ｍｅｔ抗体が、細胞表面上のヒトおよびカニクイザルｃ−Ｍｅｔの両方を染色できるかどうかを決定するために行うことができる。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識を有する二次抗マウスＩｇＧ１抗体を、蛍光活性化細胞表面（ＦＡＣＳ）分析により細胞表面ｃ−Ｍｅｔ受容体を検出するためにこのアッセイにおいて使用できる。

簡潔に記載すると、６ウェルの組織培養プレートに、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ；カタログ番号１１８３５）；１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１００８２）；２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号２５０３０）；１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧおよび１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１５１４０）中の１．５×１０^５細胞／ウェル／２ｍｌにてＭＫＮ４５細胞（ｃ−Ｍｅｔを過剰発現するヒト胃腫瘍細胞；Ｊａｐａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｂａｎｋ；＃ＪＣＲＢ０２５４）を播種できる。播種した細胞は、３７℃、９５％相対湿度、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２にて２４時間インキュベートできる。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ；＃ＣＲＬ−１６５８）は、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１１９９５）；１０％のウシ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号３０−２０３０）；２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号２５０３０）；１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧおよび１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１５１４０）中で培養できる。

カニクイザルｃ−Ｍｅｔはレトロウイルス媒介性遺伝子導入によりＮＩＨ３Ｔ３細胞中に組み込むことができ、カニクイザルｃ−Ｍｅｔを過剰発現するいくつかの安定なクローンを確立できる。ＮＩＨ３Ｔ３−ｃｙｎｏ−ｃ−Ｍｅｔ細胞は、８０％コンフルエンシーまで６ウェル組織培養プレート中で培養できる。１ｍｌの酵素を含まない細胞解離溶液（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；カタログ番号Ｓ−０１４−Ｂ）は各ウェルに加えることができ、細胞を分散させるために室温にて５分間そのままにできる。次に、細胞を上下にピペットで取ることができ、遠心分離管内に回収できる。その細胞を培地中で一度洗浄でき、続いて、結合緩衝液（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０１％アジ化ナトリウム）中でもう１回洗浄する。ｃ−Ｍｅｔ抗体は、製造業者の指示書に従ってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８モノクローナル抗体標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；カタログ番号Ａ−２０１８１）を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識できる。細胞表面ｃ−Ｍｅｔ受容体は、氷上で６０分間、２μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したｃ−Ｍｅｔ抗体を含有する１００μｌの結合緩衝液で染色できる。次に、細胞を結合緩衝液で１回洗浄でき、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；死細胞を染色するため）を含有するＤＰＢＳ中に再懸濁できる。生細胞上の細胞表面ｃ−Ｍｅｔ受容体はＦＡＣＳ分析により分析でき、各試料について１０，０００事象を獲得できる。データ分析のために、平均蛍光を使用して、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体で処理した試料を、ＩｇＧアイソタイプで処理した対照と比較できる。

実質的にこの実施例に記載したように実施した細胞表面上のｃ−Ｍｅｔ発現のＦＡＣＳ分析において、ＯｐｔＤ１１ ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ヒト腫瘍細胞上の細胞表面ｃ−ＭｅｔおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞上で発現されたカニクイザルｃ−Ｍｅｔを染色する。したがって、ＯｐｔＤ１１抗体を使用して腫瘍生検の流体由来の細胞表面ｃ−Ｍｅｔを染色でき、このような試料のＦＡＣＳ分析を可能にする。

これらのデータは、癌の治療についての診断および予後目的のため、ならびにｃ−Ｍｅｔを標的とした治療を最適化するために、ＯｐｔＤ１１ ｃ−Ｍｅｔ抗体を使用して、細胞表面ｃ−Ｍｅｔ受容体レベルを検出できることを示している。

実施例４
ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１を使用したヒトｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ ＥＬＩＳＡ
ヒトｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤに対するＯｐｔＤ１１ ｍＡｂのインビトロ結合は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）においてヒトｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤタンパク質に対する抗体の反応性を測定することにより決定できる。

簡潔に記載すると、９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートのウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ ＧｍｂＨ；カタログ番号６５５０８１）は、ｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤα鎖（例えば、配列番号２０）および／またはβ鎖（例えば、配列番号２１の残基１〜６７または１〜９２）内のエピトープに特異的に結合するｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体でコーティングできる。より特には、ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体は、１倍の市販のコーティング緩衝液（例えば、ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ ＩＶＤ（Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）製のＢｉｏＦＸカタログ番号ＣＯＡＴ−１０００−０１）中で２μｇ／ｍｌに希釈できる。およそ１１０μＬの希釈したｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体を９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えることができる。次いでプレート（複数も含む）を覆い、４℃にて一晩インキュベートできる。４℃での一晩のインキュベーション後、ウェルは吸引でき、自動プレート洗浄器を使用して２００μＬの洗浄緩衝液（ＢｉｏＦＸ；カタログ番号ＷＳＨ−１０００−０１）で２回洗浄できる。次に、およそ２００μｌの遮断緩衝液（１倍の洗浄緩衝液＋２％ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ａ７９７９）をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えることができ、室温にて１時間インキュベートできる。次に、プレートのウェルは、自動プレート洗浄器を使用しておよそ２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄できる。（例えば、配列番号１７に示すように）ＦｃのＣ末端においてフラグ−およびＨｉｓ−タグ（Ｆｌｉｓ−タグ）を有するＦｃ融合タンパク質として発現されるヒトｃ−Ｍｅｔの１００マイクロリットル（μＬ）の連続希釈した（許容可能な希釈液、例えば遮断緩衝液中）ＥＣＤはＥＬＩＳＡプレート（複数も含む）に加えることができ、室温にて振盪しながら２時間インキュベートできる。連続希釈は、例えば２０ｐｇ／ｍＬに下げた２倍希釈を用いて１２８０ｐｇ／ｍＬにて開始できる。次に、１００μＬの０．５μｇ／ｍＬのビオチン化ＯｐｔＤ１１ ｃ−Ｍｅｔ抗体（許容可能な希釈液、例えば遮断緩衝液中）は、ｃ−Ｍｅｔ検出抗体として加えることができ、室温にて振盪しながら２時間インキュベートできる。次いでプレートは吸引でき、自動プレート洗浄器を使用して洗浄緩衝液で４回洗浄できる。次に、希釈液中の１００μＬの８３ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼがコンジュゲートしたストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ；カタログ番号＃０１６−０３０−０８４）は全てのウェルに加えることができ、プレートは、室温にて振盪しながら２時間インキュベートできる。次に、プレートのウェルは吸引でき、自動プレート洗浄器を使用して洗浄緩衝液で６回洗浄できる。プレートを洗浄した後、１００μＬのＴＭＢ（ＢｉｏＦＸカタログ番号ＴＭＢＷ−１０００−０１）は各ウェルに加えることができ、プレートは室温にて１０分間インキュベートできる。反応を停止させるために、１００μＬの停止溶液を各ウェル（ＢｉｏＦＸ；カタログ番号ＬＳＴＰ−１０００−０１）に加えることができる。比色分析信号を発生でき、５７０ｎｍ補正を用いて４５０ｎｍにてプレートリーダーを使用して読み取ることができる。

モノクローナル抗体ＯｐｔＤ１１を、実質的に上記に記載したＥＬＩＳＡにおいて、Ｆｃに融合した組換えヒトｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤタンパク質に対する結合について試験した。より具体的には、ｃ−Ｍｅｔ捕捉抗体として抗ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）およびｃ−Ｍｅｔ検出抗体試薬としてビオチン化ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１を使用して、ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１は、高い感受性（可能な限り低い２０ｐｇ／ｍｌでｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤを検出する）および広範囲のｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ検出（すなわち、２０ｐｇ／ｍｌ〜１２８０ｐｇ／ｍｌ）を提供する（図２を参照のこと）。ＥＬＩＳＡ実験の結果は、ＯＰｔＤ１１が、組換えヒトｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤ融合タンパク質に結合し、診断、予後および予測目的のために、ｃ−Ｍｅｔ受容体のＥＣＤを検出するための、限定されないが、ＥＬＩＳＡを含む、インビトロ免疫化学的法において有用であり得ることを示す。

実施例５
ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１およびｍＡｂ Ｃ８−Ｈ２４１はヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに同時に結合する
本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（ＯｐｔＤ１１など）が、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体（例えば、国際公開第２０１０／０５９６５４号および／または米国特許第８，２１７，１４８号に開示されているＣ８−Ｈ２４１など）と同時にヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤに結合できるかどうかを決定するために、当該技術分野において公知の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）などの表面プラズモン共鳴バイオセンサを使用して結合実験を実施できる。示したものを除いて、全ての試薬および物質はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）から購入できる。全ての試薬および物質は、他に示されない限り、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）から購入できる。全ての測定は、ランニングおよび試料緩衝液の両方としてＨＢＳ−ＥＰ（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤Ｐ−２０、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を使用して２５℃にて実施できる。マウスＩｇＧ１抗ポリヒスチジン抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｂ０５０）は、アミン結合キットを使用して７０００反応単位（Ｒｕｓ）のレベルにてＣＭ５センサチップのフローセル１〜４上で固定できる。次に、ヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓをフローセル２に注入でき、次いでｍＡｂ Ｃ８−Ｈ２４１などの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（５００ｎＭ）を、フローセル１および２を介して注入できる（５分間、５０μＬ／分）。注入の終わりまでに、結合は飽和でき、結合反応単位を使用して結合化学量論を算出できる。

実質的にこの実施例５に記載されているように実施した実験において、各ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓ二量体は０．９ Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）抗ｃ−Ｍｅｔ抗体に結合する。ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１（マウスＩｇＧ１サブタイプ）の後の注入により、ｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓに対するさらなる結合が観測された（図３を参照のこと）。さらなる結合の化学量論もまた、およそ０．９であり、抗ｃ−Ｍｅｔ ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１（マウスＩｇＧ１サブタイプ）もまた、抗Ｃ−ｍｅｔ ｍＡｂ Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）により結合されるｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓに完全に結合することを示す。

ヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓに対する抗ｃ−Ｍｅｔ ｍＡｂ Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）およびＯｐｔＤ１１（マウスＩｇＧ１サブタイプ）の同時結合が結合順序に独立しているかどうかを決定するために、チップ表面を再生して、結合サイクルを反復する前にｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓおよび両方のｃ−Ｍｅｔ抗体を除去した。結合のさらなるサイクルは上記のように反復したが、抗体の結合順序は反対にした（すなわち、ｍＡｂ Ｃ８−Ｈ２４１の前にｍＡｂ ＯｐｔＤ１１）。同様の結果を得た（図３を参照のこと）。

これらのデータは、ｍＡｂ ＯｐｔＤ１１（マウスＩｇＧ１サブタイプ）およびｍＡｂ Ｃ８−Ｈ２４１（ヒトＩｇＧ４サブタイプ）が、ヒトｃ−Ｍｅｔ−ＥＣＤ−Ｆｃ−Ｆｌｉｓに同時結合できることを示す。さらに、そのデータは、これらの２つの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のエピトープが異なることを強く示唆している。

Claims (40)

1. 配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片であって、前記抗体、またはその抗原結合断片は、
   アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号１）、ＧＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、およびＱＱＷＳＳＹＰＹＴ（配列番号３）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに
   アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号４）、ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５）、およびＧＧＧＭＦＹＹ（配列番号６）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
   を含む、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
2. アミノ酸配列ＳＶＳＳＳＩＳＳＴＮＬＨ（配列番号１）、ＧＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、およびＱＱＷＳＳＹＰＹＴ（配列番号３）からそれぞれなる軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに
   アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＲＹＩＨ（配列番号４）、ＷＩＹＰＶＴＧＤＴＹＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５）、およびＧＧＧＭＦＹＹ（配列番号６）からそれぞれなる重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３
   を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
3. 配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
4. 配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
5. 検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
6. 前記検出可能な標識が、発色団、色原体、色素、蛍光剤、蛍光発生剤、リン光性剤、化学発光剤、生物発光剤、放射性核種、陽電子放出断層撮影画像化剤、および磁気共鳴画像化剤からなる群から選択される、請求項５に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
7. ２つの軽鎖および２つの重鎖を含み、前記軽鎖の各々は配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、前記重鎖の各々は配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
8. 検出可能な標識をさらに含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
9. 前記検出可能な標識が、発色団、色原体、色素、蛍光剤、蛍光発生剤、リン光性剤、化学発光剤、生物発光剤、放射性核種、陽電子放出断層撮影画像化剤、および磁気共鳴画像化剤からなる群から選択される、請求項８に記載のモノクローナル抗体。
10. 抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いて癌治療反応の診断、予後または予測に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片。
11. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片と、配列番号１９に示されるアミノ酸からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤを含むポリペプチドとを含む組成物であって、前記抗体、またはその抗原結合断片が前記ポリペプチドに結合する、組成物。
12. 前記抗体、またはその抗原結合断片が、配列番号１５または１６に示されるアミノ酸配列内のエピトープにおいてヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤを含むポリペプチドに結合する、請求項１１に記載の組成物。
13. 抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いて癌治療反応の診断、予後または予測に使用するための、請求項７〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
14. 請求項７〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃ−ＭｅｔのＥＣＤを含むポリペプチドとを含む、組成物であって、前記抗体は前記ポリペプチドに結合する、組成物。
15. 前記抗体が、配列番号１５または１６に示されるアミノ酸配列内のエピトープにおいてヒトＣ−ＭｅｔのＥＣＤを含むポリペプチドに結合する、請求項１４に記載の組成物。
16. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を含む容器と、任意に、細胞ペレット、異種移植片試料、組織試料、器官試料、または体液試料中のインビトロでｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現を検出するために前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を使用するための指示書と、を含むキット。
17. 前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片に結合する二次抗体を含む容器と、任意に、細胞ペレット、異種移植片試料、組織試料、器官試料、または体液試料中のインビトロでｃ−Ｍｅｔを検出するために前記二次抗体と共にまたは前記二次抗体なしで前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を使用するための指示書と、をさらに含む請求項１６に記載のキット。
18. 前記二次抗体が酵素にコンジュゲートされる、請求項１７に記載のキット。
19. 前記酵素の発色基質を有する容器をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
20. 請求項７〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む容器と、任意に、細胞ペレット、異種移植片試料、組織試料、器官試料、または体液試料中のインビトロでｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現を検出するためにモノクローナル抗体を使用するための指示書と、を含むキット。
21. 前記モノクローナル抗体に結合する二次抗体を含む容器と、任意に、細胞ペレット、異種移植片試料、組織試料、器官試料、または体液試料中のインビトロでｃ−Ｍｅｔを検出するために前記二次抗体と共にまたは前記二次抗体なしで前記モノクローナル抗体を使用するための指示書と、をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
22. 前記二次抗体が酵素にコンジュゲートされる、請求項２１に記載のキット。
23. 前記酵素の発色基質を有する容器をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
24. 哺乳動物細胞により発現または過剰発現されるｃ−Ｍｅｔを検出する方法であって、
    （ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片がＥＣＤに結合できる時間および条件下で、前記細胞を、前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片と接触させる工程と、
    （ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合したモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を除去する工程と、
    （ｃ）ＥＣＤに特異的に結合する前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の量を検出および／または定量する工程と、
    を含む、方法。
25. 抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いる治療に適した腫瘍を有する患者を識別する方法であって、
    （ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片がＥＣＤに結合できる時間および条件下で、前記腫瘍由来の少なくとも１つの細胞を、前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片と接触させる工程と、
    （ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合した前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を除去する工程と、
    （ｃ）ＥＣＤに特異的に結合する前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の量を検出および／または定量する工程であって、ＥＣＤに特異的に結合する前記抗体、またはその抗原結合断片の存在が、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いる治療に適した患者を識別する、工程と、
    を含む方法。
26. 哺乳動物細胞により発現または過剰発現されるｃ−Ｍｅｔを検出する方法であって、
    （ａ）請求項７〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体がＥＣＤに結合できる時間および条件下で、前記細胞を、前記モノクローナル抗体と接触させる工程と、
    （ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合したモノクローナル抗体を除去する工程と、
    （ｃ）ＥＣＤに特異的に結合するモノクローナル抗体の量を検出および／または定量する工程と、
    を含む、方法。
27. 抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いる治療に適した腫瘍を有する患者を識別する方法であって、
    （ａ）請求項７〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体がＥＣＤに結合できる時間および条件下で、前記腫瘍由来の少なくとも１つの細胞を、前記モノクローナル抗体と接触させる工程と、
    （ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合したモノクローナル抗体を除去する工程と、
    （ｃ）ＥＣＤに特異的に結合した前記モノクローナル抗体の量を検出および／または定量する工程であって、ＥＣＤに特異的に結合する前記モノクローナル抗体の存在が、前記抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いる治療に適した患者を識別する、工程と、
    を含む方法。
28. 前記細胞が単離細胞であるか、または細胞ペレット、異種移植片試料、組織試料、器官試料、もしくは体液試料中に存在する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記接触させる工程および前記検出する工程が各々、インビトロで実施される、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記接触させる工程がインビボで実施される、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記ｃ−Ｍｅｔが細胞膜に局在している、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記検出する工程が、ガンマカウンタ、シンチレーションカウンタを使用して、陽電子放出断層撮影画像化剤により、またはオートラジオグラフィーにより実施される、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記組織試料が組織生検により得られる、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. （ａ）細胞中または細胞上のｃ−Ｍｅｔを検出および／または定量する工程、
    （ｂ）患者におけるｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
    （ｃ）患者の血液試料中のｃ−Ｍｅｔ発現循環腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
    （ｄ）尿、腹水、リンパ液、髄液、気管支液、血清、または血液などの癌患者由来の体液中のｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
    （ｅ）個体が、ｃ−Ｍｅｔが発現または過剰発現される組織または器官の癌を発症する危険性を有するか、または危険性があるかどうかを評価する工程、
    （ｆ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療を用いる治療に適した腫瘍を有する患者を識別する工程、
    （ｇ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いる治療に対する反応を決定する工程、あるいは
    （ｈ）癌を治療する工程
    のための請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を含むキットの使用。
35. （ａ）細胞中または細胞上のｃ−Ｍｅｔを検出および／または定量する工程、
    （ｂ）患者におけるｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
    （ｃ）患者の血液試料中のｃ−Ｍｅｔ発現循環腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
    （ｄ）尿、腹水、リンパ液、髄液、気管支液、血清、または血液などの癌患者由来の体液中のｃ−Ｍｅｔ発現または過剰発現腫瘍細胞を検出および／または定量する工程、
    （ｅ）個体が、ｃ−Ｍｅｔが発現または過剰発現される組織または器官の癌を発症する危険性を有するか、または危険性があるかどうかを評価する工程、
    （ｆ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療を用いる治療に適した腫瘍を有する患者を識別する工程、
    （ｇ）抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤を用いる治療に対する反応を決定する工程、あるいは
    （ｈ）癌を治療する工程
    のための請求項７〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含むキットの使用。
36. 抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤の投与に対する反応を予測する方法であって、
    （ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ診断用の請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片がＥＣＤに結合できる時間および条件下で、腫瘍由来の少なくとも１つの細胞を、前記抗診断用のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片と接触させる工程と、
    （ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合した診断用モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を除去する工程と、
    （ｃ）ＥＣＤに特異的に結合する前記診断用モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片の量を検出および／または定量する工程であって、前記治療抗体または化学療法剤の個体への投与に対する反応が、ＥＣＤに特異的に結合する前記診断用抗体、またはその抗原結合断片の存在に基づいて予測される、工程と、
    を含む方法。
37. 抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤の投与に対する反応を予測する方法であって、
    （ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ診断用の請求項７〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体がＥＣＤに結合できる時間および条件下で、前記腫瘍由来の少なくとも１つの細胞を、前記診断用モノクローナル抗体と接触させる工程と、
    （ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合した診断用モノクローナル抗体を除去する工程と、
    （ｃ）ＥＣＤに特異的に結合する前記診断用モノクローナル抗体の量を検出および／または定量する工程であって、前記治療抗体または化学療法剤の個体への投与に対する反応が、ＥＣＤに特異的に結合する前記診断用抗体の存在に基づいて予測される、工程と、
    を含む方法。
38. 抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤の投与に対する反応を測定する方法であって、
    （ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ診断用の請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片がＥＣＤに結合できる時間および条件下で、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤の投与前（ｉ）および投与後（ｉｉ）に個体から得た腫瘍由来の少なくとも１つの細胞を、前記モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片と接触させる工程と、
    （ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合したモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片を除去する工程と、
    （ｃ）ＥＣＤに特異的に結合する前記診断用のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片の量を検出および／または定量する工程と、
    （ｄ）（ｃ）において検出または定量した前記診断用のモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片の量が（ｉｉ）と比較して（ｉ）において多い場合、治療抗体または化学療法剤の個体への投与に対する反応を測定する工程と、
    を含む方法。
39. 抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤の投与に対する反応を測定する方法であって、
    （ａ）抗ｃ−Ｍｅｔ診断用の請求項７〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体がＥＣＤに結合できる時間および条件下で、抗ｃ−Ｍｅｔ治療抗体または化学療法剤の投与前（ｉ）および投与後（ｉｉ）に個体から得た腫瘍由来の少なくとも１つの細胞を、前記モノクローナル抗体と接触させる工程と、
    （ｂ）任意選択に、任意の非特異的に結合したモノクローナル抗体を除去する工程と、
    （ｃ）ＥＣＤに特異的に結合する前記診断用のモノクローナル抗体の量を検出および／または定量する工程と、
    （ｄ）（ｃ）において検出または定量した前記診断用のモノクローナル抗体の量が（ｉｉ）と比較して（ｉ）において多い場合、治療抗体または化学療法剤の個体への投与に対する反応を測定する工程と、
    を含む方法。
40. 前記接触させる工程および前記検出する工程が各々インビトロで実施される、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。