JP2014519609A - プロソマトスタチンの診断への使用 - Google Patents

Abstract

【課題】
患者におけるソマトスタチン産生腫瘍を除く消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の診断、予後、モニタリングおよびリスク評価のための方法を提供する。
【手段】
患者の体液の試料を準備するステップと；前記試料中のプロソマトスタチン１−６４またはその断片のレベルを計測するステップと；前記患者においてプロソマトスタチン１−６４またはその断片のレベルを、ソマトスタチン産生腫瘍を除く消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の診断、予後およびリスク評価と関係付けるステップと、を含み、前記断片が少なくとも６アミノ酸残基長を有する方法。また、抗体および少なくとも２つの抗体を含有するキット。
【選択図】図９

Description

本発明は、ソマトスタチン産生腫瘍を除く消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害をもつ患者の診断、予後、モニタリングおよびリスク評価のための、生体試料におけるプロソマトスタチン１−６４およびその断片の検出、ならびにプロソマトスタチン１−６４およびその断片を検出する使用に関する。

ソマトスタチン（ＳＳＴ、ＳＲＩＦとも呼ばれる）は、当初ヒト成長ホルモン分泌（ｈＧＨ）の強力な阻害剤として機能する視床下部の分泌産物として記載された（Ｓｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９７３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ３７：６３２−６３４）。その後、ソマトスタチンがいくつかの組織で、例えば、中枢および末梢神経系、膵臓、消化管内で、およびそれよりも少量ながら甲状腺、腎臓、副腎髄質、顎下腺、前立腺および胎盤で合成されることが発見された。

ヒト成熟ソマトスタチンは、それよりも大きい前駆体分子（プレプロソマトスタチン１−１１６（プレプロＳＳＴ１−１１６；配列番号１）；プロソマトスタチン１−９２（プロＳＳＴ１−９２；配列番号２）から誘導される。この配列は、３番染色体によってコードされる。シグナル配列（２４アミノ酸長）の切断の後、プロホルモンであるプロＳＳＴ１−９２は、生物活性ペプチドであるソマトスタチン−２８（ＳＳＴ−２８；２８アミノ酸長；プロＳＳＴ６５−９２）またはソマトスタチン−１４（ＳＳＴ−１４；１４アミノ酸長；プロＳＳＴ７９−９２）にさらにプロセシングされる。断片ＳＳＴ−２８（１−１２）は、ＳＳＴ−２８から推定される（Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ３９：２２−２５）。さらに、そのＣ末端にＳＳＴ−２８（１−１２）を含有するペプチドである、プロソマトスタチン１−７６が同定された（Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ３９：２２−２５）。

成熟ソマトスタチン、すなわちＳＳＴ−１４およびＳＳＴ−２８は、約１〜３分という非常に短い血漿中半減期期間を有する（Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９７９．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ４８：５０−５３；Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２４：５０−５６）。その不安定性に起因して、循環ＳＳＴ−１４およびＳＳＴ−２８の信頼できる測定は、達成することが非常に困難である。

ソマトスタチンの血清濃度は、食後に増加する（Ｐｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９８１．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８１：６９２−６９９；Ｐｏｌｏｎｓｋｖ ｅｔ ａｌ．１９８３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７１：１５１４−１５１８）。Ｅｎｓｉｎｃｋらは、ＳＳＴ−１４でなくＳＳＴ−２８は、混合食の経口摂取後に、ならびにタンパク質および脂肪の経口摂取後に増加するが、脂肪が主な刺激物であると予想されることを示した（Ｅｎｓｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９８：６３３−６３８；Ｅｎｓｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８３：１５８０−１５８９）。対照的に、ＳＳＴ−１４およびＳＳＴ−２８の濃度は、炭水化物の経口摂取後も変化がなかった（Ｅｎｓｉｎｃｋ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９８：６３３−６３８）。ＳＳＴ−２８は腸管粘膜の主な産物であり、一方ＳＳＴ−１４は膵臓において優勢であるので、混合食および純粋グルコースにより刺激されるこのＳＳＴ−１４およびＳＳＴ−２８の放出の違いは、胃、膵臓および腸管Ｄ細胞からの細胞の選択的刺激により誘導され得る（Ｂａｌｄｉｓｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．１９８５．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ８３８：１３２−１４３）。

ソマトスタチンは、胃内容排出の抑制によって胃腸運動を調節し、胆嚢の収縮を抑制し、中枢神経系内部の神経伝達物質としての機能を有する。ソマトスタチンは、インスリン、グルカゴン、ガストリン、グレリン（Ｎｏｒｒｅｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｏｘｆ．）５７：５３９−５４６）、セクレチン、コレシストキニンおよび血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、ノルエピネフリン、ＴＲＨ（ＴＳＨ放出ホルモン）、ＴＳＨ、ＡＣＴＨおよびＣＲＨ（コルチコトロピン放出ホルモン）、胃酸およびペプシンの抑制に関与する。

プロＳＳＴのＮ末端断片（プロソマトスタチン１−６４、ＮＴ−プロＳＳＴ）が、ラット（Ａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ １２４：４５０−４５６；Ａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８６．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１８：２１８−２２２）およびヒト（Ａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８６．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ６２：１２３７−１２４２）甲状腺髄様癌細胞に存在することが示された。その上、プロＳＳＴ１−６４は、ブタの膵臓、小腸粘膜および血漿において同定された（Ｂｅｒｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１０６３３−１０６３６；Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．１９８８．Ｐａｎｃｒｅａｓ ３：６５３−６６１；Ｓｋａｋ−Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ １９：１８３−１９５）。Ｒａｂｂａｎｉおよび同僚らは、ラットプロＳＳＴ１−６４を門脈血中の、および培養膵島腫瘍細胞由来の培地中の分泌産物として同定した（Ｒａｂｂａｎｉ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ １９９０．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２６：２０５４−２０６１）。ソマトスタチン産生腫瘍をもつ患者の血漿中でプロＳＳＴ１−６４は高濃度で見出され、そのためこの分子はソマトスタチン産生腫瘍の診断のための可能性のあるマーカーとして考察された（Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅ １２５−１５２）。ソマトスタチン産生腫瘍は、ソマトスタチンを産生する膵臓または十二指腸の悪性腫瘍である。

プロＳＳＴ分子のアミノ酸残基２０−３６と同一の合成ペプチドに対して産生された特徴のはっきりした抗血清を用いる、ラットにおける免疫組織化学的調査により、ラット脳の特定の部位での免疫反応性神経線維および神経終末の存在が明らかとなった（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ５４：４６９−４７６）。サイズ排除クロマトグラフィーおよびＲＰ−ＨＰＬＣ分析に供した健康なラット由来の下垂体後葉の抽出物は、プロＳＳＴ１−６４のサイズに相当する単一のプロＳＳＴ免疫反応性分子の存在を示した。著者らは、視床下部下垂体系でのその位置が、プロＳＳＴのプロセシングのこの最終産物が門脈とおそらく全身循環にも放出されていることを示唆していると述べた。プロＳＳＴ１−６４の公知の機能はない。プロＳＳＴ１−６４の断片も同定されている：プロＳＳＴ１−１０（アントリン（ａｎｔｒｉｎ）と呼ばれる）（Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１１２６−１１２９）およびブタの腸のプロＳＳＴ１−３２（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．１９８５．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９２：１４１−１４６）ならびにラットの胃および腸管粘膜および血漿の抽出物中のプロＳＳＴ１−３２（Ｒａｖａｚｚｏｌａ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８３：３６２−３６６）。さらに、ヒト膵腫瘍由来のＮ−末端プロＳＳＴ１−６３の存在が報告された（Ｃｏｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２４８：１２３−１２７）。その上、プロＳＳＴ１−６３またはプロＳＳＴ１−６４に等しいことが示唆される、プロＳＳＴ分子のＮ末端部分の７ｋＤａのペプチド断片が、ラット神経系において高い濃度で存在することが示された（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．１９８８．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：７４５−７５１；Ｒａｂｂａｎｉ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ １９９０．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２６：２０５４−２０６１）、さらに免疫組織化学的にＬｅｃｈａｎらは（Ｌｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２７８０−２７８４）、ラット脳において同じプロＳＳＴ断片を含有し得るプロＳＳＴ４３−５７−免疫反応性ニューロンを示した。さらに、ＯｄｕｍおよびＪｏｈｎｓｔｏｎは、そのＣ末端に全長の成熟ＳＳＴを含有する精液中のヒトプロソマトスタチン断片２９−９２を記載した（Ｏｄｕｍ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ １９９４．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３０３（Ｐｔ１）：２６３−２６８）。

プロＳＳＴ２０−３６免疫反応性の決定のためのラジオイムノアッセイは、Ｂｅｒｓａｎｉらに記載された（Ｂｅｒｓａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１０６３３−１０６３６）。そのアッセイで使用された抗血清を用いて、プロＳＳＴ１−６４は膵臓および腸管粘膜から単離された。Ａｒｏｎらは、ラットのプロＳＳＴの最初の１３アミノ酸を含有するテトラデカペプチドを合成して、プロソマトスタチンのアミノ末端部分に対するラジオイムノアッセイを開発した（Ａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｖｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ １２４：４５０−４５６）。

成熟ソマトスタチンの血漿レベルが消化管疾患において調査され、相矛盾する結果が得られたが、それは、おそらく上記のような成熟ソマトスタチンの不安定性に基づく不十分な検出方法に起因すると思われる。たとえこれらの結果が実際に評価されないとしても、本発明者らは該文献に記載される知見を簡単に要約する。通過の遅れた便秘の患者において、基礎ＳＳＴ濃度は変化しないが、血漿ＳＳＴの食後の増加が長引いている（Ｐｅｒａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ３４：２５−２８）。炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）の患者は、腸管粘膜組織におけるＳＳＴレベルの低下を示し、それと炎症の組織学的等級との間に相関関係がみられた（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ３１：５２５−５３２）。ＳＳＴ産生の低下が活動性潰瘍性大腸炎の患者由来の結腸粘膜の細胞培養において観察されたが、緩解期の患者の結腸粘膜によるソマトスタチンの産生は、対照のものとあまり異ならなかった（Ｅｌｉａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １００：Ａ５７８）。しかし、これらのＳＳＴ産生の変化は結腸粘膜に局在しているので、循環ＳＳＴ濃度への影響に関する結論を引き出すことはできない。それどころか、活動期の潰瘍性大腸炎の患者において、成熟血漿ソマトスタチンの概日（２４時間）周期性は、健康な被験体と比較して、より高い２４時間振幅、より高い平均レベル、およびより長いピークレベル期を有することが見出された（Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４１：５５２−５５３）。ＳＳＴを含有する内分泌粘膜および粘膜下細胞の数は、健康な対照と比較した場合に、クローン病および潰瘍性大腸炎の患者において大幅に低下し、それはまた炎症の程度にも関連した（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｄｉｓ Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ３５：４８８−４９４）。Ｋｏｃｈらは、クローン病および潰瘍性大腸炎の患者において、下行結腸の粘膜におけるＳＳＴの低下を実証した（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．１９８８．Ｄｉｓ Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ３１：１９８−２０３）。しかし、ＷａｔａｎａｂｅらもＫｏｃｈらもソマトスタチン血漿レベルを調査しなかった。血漿ＳＳＴの差異は、慢性膵炎の患者において見出されなかった（Ｅｌ−Ｅｒｙａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４７：８６９−８７４）が、急性膵炎の患者において濃度の増加が見出された（Ａｌｅｒｙａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｖｎｉｔｒ Ｌｅｋ ４３：７３３−７３７）。Ｍｉｌｕｔｉｎｏｖｉｃおよび同僚らは、ＳＳＴの血漿中濃度がヘリコバクター・ピロリに感染した胃炎患者において低下し、治療が成功すると、これらの患者においてＳＳＴ濃度が増加したことを実証した（Ｍｉｌｕｔｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １５：７５５−７６６）。２４時間ソマトスタチンレベルの有意な差が、胃潰瘍および非定型的な胃の状態の患者において明らかとなり、それは非定型状態の患者において高かった（Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｖｎｔｒ Ｌｅｋ ４１：３６７−３７０）。血漿ソマトスタチンの日内周期が、大腸ポリープに罹患している患者において調査され、有意な差（例えば、より高い２４時間振幅）が実証された（Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４２：７７５−７７７）。

ソマトスタチンは、癌の患者においても調査され、この場合も矛盾する結果が得られた。Ｗａｉｓｂｅｒｇらは、ＳＳＴの発現を示す神経内分泌胃癌（非常に悪性であるが、稀な種類の腫瘍）を記載した（Ｗａｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １２：３９４４−３９４７）。その上、血漿ＳＳＴの濃度の増加を伴うＳＳＴ産生島細胞腫瘍（膵腫瘍）の症例報告が記載された（Ｋａｒａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ４０：３２４−３３０；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｓｕｒｇｅｒｙ １０５：２２７−２２９：Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．１９８３．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｄ ５７：１０４８−１０５３：Ｐｅｒｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ．７９９７．Ｐａｎｃｒｅａｓ １５：６０−６８）。ＳＳＴは、甲状腺髄様癌の診断のための血漿マーカーとして文献において考察され、相矛盾する結果、すなわち、ＳＳＴの増加（Ｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．１９８１．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｄ ５２：１８７−１９４：Ｓａｉｔｏ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ １９８２．Ｈｏｒｍ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ １４：７１−７６；Ｐａｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｃａｎｃｅｒ ６３：１１８９−１１９５）、違いなし（Ｎｅｒａｄｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ４６：３７８−３８０）および軽度の有意でない低下（Ｇｒａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｔｈｙｒｏｉｄ ５：２８７−２９１）が得られた。Ｗｏｏｄおよび同僚らは、気管支癌の患者由来の一部の例においてＳＳＴの増加を報告したが、血漿においてＳＳＴ濃度は検出できなかった（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．１９８２．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ Ｍｅｔａｂ ５３：１３１０−１３１２）。肺小細胞癌患者において、ＳＳＴの血漿レベルはわずかに増加した（Ｎｏｓｅｄａ ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｔｈｏｒａｘ ４２：７８４−７８９）。Ｅｌ−Ｓａｌｈｙらは、ＳＳＴを産生するいくつかの細胞が、結腸癌の患者の結腸組織において減少することを実証した（Ｅｌ−Ｓａｌｈｙ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １０：５１７−５２２）。大腸癌に罹患している患者における２４時間にわたる血漿ＳＳＴレベルを、健康な被験体およびその他の大腸疾患（潰瘍性大腸炎、大腸ポリープ）に罹患している患者と比較し、２４時間ＳＳＴ分泌において患者群間で有意差がないことが示された（Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４４：７２−７７）。Ｈｏｉｓｔらは、高濃度のプロＳＳＴ１−６４をソマトスタチン産生腫瘍の患者の血漿中で検出し、この分子をソマトスタチン産生腫瘍の診断のための可能性のあるマーカーとして示唆した（Ｈｏｌｓｔ ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅ １２５−１５２）。これらの患者において高濃度のプロＳＳＴ１−６４が検出されたが、成熟ＳＳＴ−１４の濃度はわずかに上昇したに過ぎず、これはおそらくＳＳＴ−１４の極めて短い半減期が原因であると思われる。これらの結果は、成熟ＳＳＴの信頼できる測定は、実施が極めて困難であり、文献で報告されたソマトスタチン濃度は、慎重に評価されねばならないことを明確に示す。

日内周期も成熟ソマトスタチンについて記載されている（Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４４：７２−７７：Ｓｔｒａｚｚｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｃｈｒｏｎｏｂｉｏｌｏｅｉａ １７：２１９−２２５；Ｐａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４１：５５２−５５３）。

ソマトスタチンおよびソマトスタチン分泌細胞に対する自己抗体が、糖尿病およびＧＩ管疾患の患者について報告されている（Ｂｏｔｔａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．１９７６．Ｌａｎｃｅｔ ２：８７３−８７６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．１９８３．Ｇｕｔ ２４：４２７−４３２）。

国際公開第００／２２４３９号は、敗血症およびその他の感染の診断のためのプロソマトスタチンを開示している。

本発明の第一の主題は、患者における、ソマトスタチン産生腫瘍を除く消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の診断、予後、モニタリングおよびリスク評価のための方法であって、
ｉ）患者の体液の試料を準備するステップと、
ｉｉ）前記試料におけるプロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルを決定するステップと、
ｉｉｉ）前記患者において、ソマトスタチン産生腫瘍を除く、前記プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルを、消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の診断、予後、モニタリングおよびリスク評価と関係付けるステップとを含み、
前記断片が少なくとも６アミノ酸残基長を有する、方法である。

好ましい方法の変形形態は従属クレームに記載されている。本発明はまた、請求項１６に特許請求される抗体および請求項１７に特許請求される少なくとも２つの抗体を含有するキットにも関する。

本発明は、次に図面を参照してより詳細に説明される。

ポリクローナル抗体−組合せＡおよびＢの相関関係を示す図である。 ポリクローナル抗体−組合せＡおよびＣの相関関係を示す図である。 ポリクローナル抗体−組合せＢおよびＣの相関関係を示す図である。 モノクローナル抗体を用いるイムノアッセイの用量反応曲線を示す図である。 プロＳＳＴ分析物の生体外安定性を示す図である。 健康な絶食被験体由来のＥＤＴＡ血漿試料におけるプロＳＳＴの正規分布（ｎ＝２０１）を示す図である。 プロＳＳＴレベルと肥満度指数（ＢＭＩ）との間の相関関係を示す図である。 食物摂取（混合食）のプロＳＳＴレベルへの影響を示す図である。 消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害をもつ患者におけるプロＳＳＴ濃度を示す図である。

本発明の第一の主題は、患者における、ソマトスタチン産生腫瘍を除く消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の診断、予後、モニタリングおよびリスク評価のための方法であって、
ｉ）患者の体液の試料を準備するステップと、
ｉｉ）前記試料におけるプロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルを決定するステップと、
ｉｉｉ）前記患者において、ソマトスタチン産生腫瘍を除く、前記プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルを、消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の診断、予後、モニタリングおよびリスク評価と関係付けるステップとを含み、
前記断片が少なくとも６アミノ酸残基長を有する、方法である。

本明細書において、ヒトの消化（ＧＩ）管とは、口から肛門までのすべての構造をさす。ＧＩ管は、上部ＧＩ管および下部ＧＩ管からなる。上部消化管は、食道、胃、および十二指腸からなる。下部消化管には、小腸およびすべての大腸が含まれる。小腸は、十二指腸、空腸および回腸の３つの部分からなり、一方大腸は、盲腸、結腸および直腸に分けられる。

本発明の状況において、ヒトの消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害は、ＧＩ管の病理学的に変化した構造および／または機能あるいは栄養状態の病理学的変化の結果である。ＧＩ管の活性および／または機能に影響を及ぼすＧＩ管の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害には、炎症性、感染性、器質性および機能性ＧＩ管疾患が含まれる。

胃腸炎の最も一般的な形態を含む、消化管の感染症は、ウイルスによるか、細菌（例えばサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、または大腸菌など（Ｅ．Ｃｏｌｉ））によるか、または腸管寄生虫（例えばアメーバ症およびジアルジア症など）によって引き起こされ得る。

胃腸炎（胃インフルエンザ（ｇａｓｔｒｉｃ ｆｌｕまたはｓｔｏｍａｃｈ ｆｌｕ）としても公知であるが、インフルエンザとは無関係である）は、胃と小腸の両方を含む消化管の炎症であり、急性下痢および嘔吐をもたらす。それは汚染した食物および水との接触によって伝達され得る。炎症は、多くの場合、特定のウイルスからの感染によって引き起こされるか、あるいは、それほど多くはないが、細菌、それらの毒素（例えば、ＳＥＢ）、寄生虫、または食事または薬物中の何かに対する有害反応によって引き起こされる。食物経由の疾病に起因する胃腸炎の原因の少なくとも５０％がノロウイルスにより引き起こされる。原因の別の２０％、および小児の重篤の症例の過半数は、ロタウイルスに起因する。その他の重要なウイルス病原体には、アデノウイルスおよびアストロウイルスが含まれる。様々な種類の細菌が胃腸炎を引き起こし得、それにはサルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、およびその他のものが含まれる。胃腸炎は多くの場合、上部小腸の非炎症性感染、または結腸の炎症性感染によって、胃痛または痙攣、下痢および／または嘔吐を伴う。症状は通常急性発症性であり、通常１〜６日間続き、自己限定的である。

炎症性消化管疾患には、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；膵炎、虫垂炎およびセリアック病が含まれる。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、結腸および小腸の一群の炎症状態である。ＩＢＤの主な種類は、クローン病および潰瘍性大腸炎である。ＩＢＤのその他の形態には、コラーゲン大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、便流変更性大腸炎、ベーチェット病および分類不能大腸炎が含まれる。

クローン病は、限局性腸炎としても知られ、口から肛門までの消化管のどの部分も発症する可能性のある腸の炎症性疾患であり、幅広い種類の症状を引き起こす。それは主に腹痛、下痢（炎症が最悪の状態である場合には血性でありうる）、嘔吐、体重減少を引き起こすが、皮膚発疹、関節炎、目の炎症、疲労、および集中力の欠如などの消化管の外部の併発症も引き起こす可能性がある（Ｂａｕｍｇａｒｔ ａｎｄ Ｓａｎｄｂｏｒｎ．２００７．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３６９：１６４７−１６５７）。クローン病は、身体の免疫系が消化管を攻撃して炎症を引き起こす自己免疫疾患であると考えられている。それは一般に消化管に現れ、罹患している特定の管領域で分類され得る。回腸（大腸につながる小腸の最後の部分）と大腸の両方の疾患である、回結腸クローン病は、症例の５０パーセントを占める。

潰瘍性大腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）（潰瘍性大腸炎（Ｃｏｌｉｔｉｓ ｕｌｃｅｒｏｓａ））は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の一つの形態である。潰瘍性大腸炎は、腸、特に大腸または結腸の疾患である大腸炎の一つの形態であり、特徴的な潰瘍、または解放創を結腸に含む。活動性疾患の主症状としては、通常、徐々に発症して継続する血液の混じった下痢である。潰瘍性大腸炎は、クローン病との類似点を有し、症状の悪化する期間と比較的症状のない期間をもつ断続的な疾患である。潰瘍性大腸炎の症状は自然に減少する場合もあるが、この疾患は緩解状態にするための治療を通常必要とする。潰瘍性大腸炎の患者は結腸直腸癌の発症のリスクが高い（Ｋｕｌａｙｌａｔ ａｎｄ Ｄａｙｔｏｎ．２０１０．Ｊ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ １０１：７０６−７１２）。

膵炎は、膵臓の炎症であり、２つの非常に異なる形で発生し得る。急性膵炎は突発性であるが、慢性膵炎は、脂肪便や真性糖尿病伴うまたは伴わない再発性または持続性の腹痛を特徴とする。膵炎の診断基準は、以下の３つの特徴：１）急性膵炎に特有の腹痛、２）正常値の上限の３倍以上の血清アミラーゼおよび／もしくはリパーゼ、および３）ＣＴスキャンでの急性膵炎に特有の所見、のうちの２つである（Ｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ ２００６．Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １０１：２３７９−２４００）。

虫垂炎は、虫垂の炎症を特徴とする状態である。それは内科救急と分類され、多くの症例が開腹手術によるかまたは腹腔鏡検査による炎症虫垂の除去を必要とする。未処置の場合、主に腹膜炎およびショックにより死亡率は高い（Ｈｏｂｌｅｒ １９９８．Ｔｈｅ Ｐｅｒｍａｎｅｎｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ２：５−８）。

セリアック病は、乳児期中期以降のすべての年齢の遺伝的に素因のある人に起こる小腸の自己免疫障害である。症状には、慢性下痢、（小児における）成長障害、および疲労が含まれるが、これらがない場合もあり、その他の器官系の症状が記載されている。セリアック病は、小麦に見出されるグリアジン、プロラミン（グルテンタンパク質）、およびコムギ連の作物（それには大麦およびライ麦などのその他の一般的な穀物が含まれる）に見出される類似したタンパク質に対する反応により引き起こされる。グリアジン、および特にプロラミンに見出される３つのペプチドに触れると、酵素組織トランスグルタミナーゼがタンパク質を修飾して免疫系が小腸組織と交差反応し、炎症反応を引き起こす。それにより、小腸の内側を覆う絨毛の先端が切り詰められる（絨毛萎縮と呼ばれる）。腸管絨毛は吸収を担うので、これは栄養分の吸収を妨げる。唯一公知の効果的な治療は、生涯続けるグルテン除去食である（Ｓａｂａｔｉｎｏ ａｎｄ Ｃｏｒａｚｚａ ２００９．Ｌａｎｃｅｔ ３７３：１４８０−１４９３）。この疾患は小麦タンパク質に対する反応により引き起こされるが、小麦アレルギーとは異なる。この状態はいくつかの他の名前があり、セリアック病、セリアックスプルー、非熱帯性スプルー、地方性スプルー、グルテン腸疾患またはグルテン過敏性腸疾患、グルテン不耐症とも呼ばれる。

器質的障害は、ＧＩ管の部分が、憩室炎、消化性潰瘍および癌を含む器質的異常を表す障害である。

憩室炎は、特に大腸に見出される一般的な消化器疾患である。憩室炎は、憩室症から発症し、それは結腸の外側での嚢（憩室）の形成を伴う（Ｂｏｇａｒｄｕｓ ２００６．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ４０ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ１０８−Ｓ１１１）。憩室炎は、これらの憩室の１つが炎症を起こすと生じる。患者は多くの場合、左下腹部痛、熱、および白血球増多症（血液検査における白血球数の上昇）の伝統的な三徴候を示す。また、患者は悪心または下痢を訴えることもある；他の患者は便秘することもある。

消化管癌とは、食道、唾液腺、胃、肝臓、胆道系、腸、結腸および肛門を含む、消化管の悪性状態をさす。

ネオカルシノーマ（Ｎｅｏ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、既存の腫瘍の新しい増殖と定義される。

消化性潰瘍または消化性潰瘍疾患は、消化管の部位の潰瘍（０．５ｃｍ以上の粘膜のびらんと定義される）であり、この部分は通常酸性なので、極めて有痛性である、る。潰瘍の７０〜９０％もが、胃の酸性環境で生きる螺旋形の細菌であるヘリコバクター・ピロリに関連している；しかし、それらの症例の４０％しか病院に行かない。また、潰瘍は、アスピリン、プラビックス（クロピドグレル）、イブプロフェン、およびその他のＮＳＡＩＤなどの薬物によって引き起こされるかまたは悪化し得る。一般的に信じられていることとは逆に、消化性潰瘍は、胃よりも十二指腸（胃のすぐ後の小腸の最初の部分）でより多く生じる。胃潰瘍の約４％が悪性腫瘍により引き起こされるので、癌を排除するためには複数の生体検査が必要とされる。十二指腸潰瘍は通常良性である。

機能性ＧＩ管障害（ＦＧＩＤ）には、消化管の異なる部位を冒すいくつかの別個の特発性障害が含まれる。ＦＧＩＤＳは、原因となりうる器質的異常がない場合に起こる慢性腹部複合症状として定義される。ローマ基準によれば（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｍｅｃｒｉｔｅｒｉａ．ｏｒｇ；Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００６．Ｖｏｌｕｍｅ １３０（Ｎｏ．５）：１３７７−１５５２）、ＦＧＩＤには、成人において６つの主要な障害：機能性食道障害（例えば、機能性胸焼け、機能性嚥下障害）、機能性胃十二指腸障害（例えば、機能性ディスペプシア、げっぷ障害、悪心および嘔吐障害）、機能性腸障害（例えば、過敏性腸症状群［ＩＢＳ］）、機能性腹痛症候群、機能性胆嚢およびオディ括約筋障害、および機能性肛門直腸障害が含まれる。

過敏性腸症状群（ＩＢＳまたは痙攣性結腸）は、検出できる器質的原因のない場合に、慢性腹痛、不快感、腹部膨満、および排便習慣の変化を特徴とする機能性腸障害である（Ｍａｙｅｒ ２００８．ＮＥＩＭ．３５８：１６９２−１６９９）。一部の例では、これらの症状は便通により軽減される。下痢または便秘の一方が優勢でありうるが、それらが交互に現れる場合もある。ＩＢＳは、その他のどんな医学的指標がなくても、感染の後（感染後）、ストレスの多いライフイベント、または成人の発症も始まる可能性がある。

ディスペプシアは、胃不調または消化障害とも呼ばれ、消化不良の状態をさす。それは、上腹部の慢性または再発性疼痛、上腹部膨満および食事時の予想よりも早い満腹感を特徴とする医学的状態である。それには腹部膨満、げっぷ、悪心、または胸焼けが付随し得る。ディスペプシアはありふれた問題であって、しばしば胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）または胃炎に起因するが、ごく少数においてそれは消化性潰瘍疾患（胃または十二指腸の潰瘍）および時には癌の最初の症状でありうる。機能性ディスペプシアは、「症状を説明すると見られる器質性疾患の証拠のない」ディスペプシアであり、西洋諸国で母集団の約１５％を冒していると推定される（Ｓａａｄ ａｎｄ Ｃｈｅｙ ２００６．Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４：４７５−９２）。

嚥下障害は、飲み込み動作が困難な症状を示す医学用語である。機能性嚥下障害は、器質的な原因が見当たらない嚥下障害と定義される。

本発明の好ましい実施形態では、ソマトスタチン産生腫瘍を除く、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、憩室炎（ｄｉｖｅｒｃｕｌｉｔｉｓ）、胃腸炎、過敏性腸症状群、膵炎、虫垂炎、消化性潰瘍疾患、セリアック病およびＧＩ管癌の患者の診断、予後およびリスク評価は、生体試料におけるプロソマトスタチン１−６４およびその断片の検出により行われる。

栄養状態という用語は、栄養分の消費および利用ならびに正常な代謝の完全性を維持するためのそれらの栄養分の能力、に関する身体の状態と定義される。

ソマトスタチンは、消化管のいくつかの調節プロセス（例えば、いくつかのホルモンの抑制による胃腸運動の調節）と生理学的に関連している。正常以下のレベルのプロＳＳＴが測定された場合の病理は、ＧＩ管の活性および／または機能の低下という共通の特徴を有し、これは直接的にまたは間接的に該病理に引き起こされる可能性のあることが本発明者らによって立証された。驚くべきことに、ＧＩ管の活性および／または機能ならびに／あるいは栄養状態は、プロＳＳＴの血漿レベルが関連している唯一または少なくとも優勢なパラメータであり、さらにより驚くことに、プロＳＳＴレベルは、ＧＩ管の活性および／または機能ならびに／あるいは栄養状態が低下している場合に正常以下である。

本発明の一実施形態では、ＧＩ管に関連する少なくとも１つのさらなる前駆体ペプチドまたはその断片は、プロソマトスタチン１−６４またはその断片に加えて決定され、グレリン、コレシストキニン、ガストリン、モチリン、ペプチドＹＹ、膵ポリペプチド、セクレチン、グルカゴン、血管作用性小腸ペプチド、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、アミリン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）およびボンベシンからなる群から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、プロソマトスタチンは、絶食患者からの試料において測定される。ここで絶食とは、水以外のすべての飲食物を少なくとも８時間節制することと定義される。

本発明の特定の実施形態では、追加的に、年齢、性別、肥満度指数（ＢＭＩ）、真性糖尿病の存在および現在の喫煙習慣を含む群から選択される少なくとも１つの臨床パラメータが特定される。

肥満度指数（ＢＭＩ）は、個体の体重を該個体の身長の二乗で割ったものとして定義される。医学で一般に使用される式では、ｋｇ／ｍ^２の測定単位を生じる。ＷＨＯは、１８．５未満のＢＭＩを低体重であって栄養障害、摂食障害、またはその他の健康問題を示す可能性があると判断し、一方２５以上のＢＭＩを過体重とみなし、３０以上を肥満とみなし、４０以上の数はその人物が病的に肥満であることを示唆する（ＷＨＯ ２０００．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ ８９４ Ｇｅｎｅｖａ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．２０００）。

本発明の好ましい実施形態では、プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸１−６４（配列番号６）を含むＮ末端プロソマトスタチン断片が測定される。

プロソマトスタチンのようなプロホルモンの文脈において本明細書で言及されるように、用語「断片」とは、大型のタンパク質またはペプチドから誘導でき、そのため該大型のタンパク質またはペプチドの部分配列を構成する小型のタンパク質またはペプチドをさす。前記断片は、そのペプチド結合の１以上の鹸化により大型のタンパク質またはペプチドから誘導できる。そのような断片は、好ましくは本明細書に記載される免疫学的アッセイで検出できる。

生体試料中のプロソマトスタチン１−６４およびその断片のレベルの決定は、当技術分野で公知の任意の適した分析手法を用いて実行することができる。そのような方法としては、イムノアッセイ、質量分析、イムノブロット分析、免疫組織化学法、タンパク質マイクロアレイ法および電気泳動法が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸４３〜６４（配列番号５）を表すペプチドに含まれるエピトープと結合する抗体を包含し、さらに本発明は、プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸１〜２１（配列番号３）を表すペプチドに含まれるエピトープと結合する抗体；プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸２２〜４２（配列番号４）を表すペプチドに含まれるエピトープと結合する抗体；および、プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸４３〜６４（配列番号５）を表すペプチドに含まれるエピトープと結合する抗体からなる群から選択される少なくとも２つの抗体を含有する、プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルを決定するためのキット、を包含する。この抗体およびキットは本発明の方法において使用することができる。

本発明の好ましい実施形態では、検出法は、様々な形式のイムノアッセイ、例としてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘに基づくビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイなど、および急速な試験形式、例としてイムノクロマトグラフィーストリップテストなど、を含む。

アッセイは、同種もしくは異種アッセイ、競合および非競合アッセイであってよい。特に好ましい実施形態では、アッセイは、サンドイッチアッセイの形態でり、サンドイッチアッセイは、検出され、かつ／または定量されるべき分子が第１抗体および第２抗体と結合する非競合イムノアッセイである。第１抗体は、固相、例えば、ビーズ、ウェルまたはその他の容器の表面、チップまたはストリップに結合することができ、第２抗体は、例えば、染料で、放射性同位元素で標識される抗体、または反応性もしくは触媒活性部分である。次に、分析物と結合した標識抗体の量を適切な方法によって測定する。「サンドイッチアッセイ」に関連する一般的な組成物および手順は、確立されており、当業者に公知である（Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＬＴＤ，Ｏｘｆｏｒｄ；３ｒｄ ｅｄ．（Ｍａｙ ２００５），ＩＳＢＮ−１３：９７８−００８０４４５２６７；Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｆｅｂ；１０（１）：４−１０．ＰＭＩＤ：１６３７６１３４、参照により本明細書に援用）。

特に好ましい実施形態では、アッセイは、２つの捕捉分子、好ましくは両方とも抗体で液体反応混合物中の分散系として存在するもの、を含み、第１の標識成分は第１の捕捉分子に取付けられ、前記第１の標識成分は、蛍光もしくは化学発光クエンチングまたは増幅に基づく標識系の一部であり、前記マーキング系の第２の標識成分は第２の捕捉分子に取付けられる。そのため、両方の捕捉分子が分析物と結合すると、測定可能なシグナルが生成され、試料を含む溶液中で形成されたサンドイッチ複合体の検出が可能になる。

さらにより好ましい、前記標識系は、希土類クリプテートまたは希土類キレートと、蛍光染料または化学発光染料、特にシアニン型の染料との組み合わせを含む。本発明の文脈において、蛍光に基づくアッセイは、染料の使用を含み、その染料は、例として、ＦＡＭ（５−もしくは６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、シアニン染料、例えばＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７など、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−フルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ＢＯＤＩＰＹ染料、例えばＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲなど、オレゴングリーン、クマリン、例えばウンベリフェロンなど、ベンズイミド、例えばＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８など；フェナントリジン、例えばテキサスレッドなど、ヤキマイエロー、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＰＥＴ、臭化エチジウム、アクリジニウム染料、カルバゾール染料、フェノキサジン染料、ポルフィリン染料、ポリメチン染料、などを含む群から選択され得る。

本発明に関連して、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｅｄｉｔｏｒ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ；ｅｄｉｔｏｒ，Ｍ．Ｈｏｗｅ−Ｇｒａｎｔ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９３，ｖｏｌ．１５，ｐ．５１８−５６２は、pages 551 -562に記載された引用も含めて、参照することにより本書に組み込まれるが、本発明の化学発光に基づく分析では、この文献の化学発光材料について記載された物理的原理に基づいて染料を使用する。好ましい化学発光染料はアクリジニウムエステルである。さらにより好ましくは、前記標識系は、蛍光染料と希土類クリプテートまたは希土類キレートとの組み合わせを含む。

本明細書において言及されるように、「アッセイ」または「診断アッセイ」は、診断分野に適用されるいずれの種類のものであってもよい。そのようなアッセイは、１以上の捕捉プローブと検出される分析物との特定の親和性での結合に基づき得る。捕捉分子と標的分子または目的分子との間の相互作用に関して、親和性定数は、好ましくは１０^８Ｍ^−１よりも大きい。

本発明の状況において、「捕捉分子」とは、試料由来の標的分子または目的分子、すなわち分析物（すなわち、本発明の状況において心血管ペプチド（類））に結合させるために使用することのできる分子である。従って捕捉分子は、標的分子または目的分子に特異的に結合するために、表面電荷、疎水性、親水性、ルイスドナーおよび／またはアクセプターの有無など空間的および表面の特徴の点で適切に形作られねばならない。ここでは、結合は、例として、イオン性、ファンデルワールス、π−π、σ−π、疎水性または水素結合相互作用あるいは上述の捕捉分子と標的分子または目的分子との相互作用の２以上の組合せにより媒介され得る。本発明の状況において、捕捉分子は、例として、核酸分子、炭水化物分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、抗体、ペプチドまたは糖タンパク質を含む群から選択され得る。好ましくは、捕捉分子は抗体であり、それには前記抗体標的もしくは目的分子に対して十分な親和性をもつその断片が含まれ、また、組換え抗体または組換え抗体断片、ならびに前記抗体またはその少なくとも１２アミノ酸長の変異鎖から誘導される断片の化学的および／または生化学的に改変された誘導体が含まれる。

本発明のもう一つの実施形態では、プロソマトスタチン１−６４またはその断片のレベルは、質量分析法を用いて測定される。質量分析という用語は、イオンをそれらの質量対電荷比（または「ｍ／ｚ」）に基づいて選別、検出および測定する方法をさす。通常、質量分析は、１以上の目的分子を含有する試料をイオン化すること、および、次に、質量分析器、例えば四重極質量フィルタ、四重極イオントラップ、飛行時間型分析計、ＦＴ／ＩＣＲ分析計またはＯｒｂｉｔｒａｐなどで得られるイオン（またはそれから誘導される生成物イオン）をｍ／ｚ分離し検出して、異なる値のｍ／ｚで検出されたイオンの存在量を表す質量スペクトルを生成することを伴う。

好ましい実施形態では、試料は、質量分析の前に、分析物の親和性濃縮；担体タンパク質に結合したペプチド断片の濃縮；試料の還元、アルキル化および／または脱塩；一次元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動；トリプシンタンパク質分解；または液体クロマトグラフィーのうち１以上のステップに供される。

本発明の状況において、レベルという用語は、患者の試料から採取したマーカーペプチドの濃度（好ましくは重量／容積；ｗ／ｖで表される）に関する。

本明細書において、患者という用語は、疾患のために医療を受けているかまたは医療を受けるべきである、生きているヒトまたは非ヒト生物をさす。これには、病理の徴候について調査されている、確定された病気をもたないものが含まれる。従って本明細書に記載される方法およびアッセイは、ヒトと動物の両方の疾患に適用できる。

本発明の状況において、診断という用語は、被験体における疾患または臨床状態の認識および（早期）検出に関し、さらに、鑑別診断、リスク層別化、予後、患者の予防的および／または治療的な手段および／または管理を適用するための層別化、治療モニタリング、および疾患または臨床状態の治療ガイダンスを含む。

予後は、特定の疾患または臨床状態に罹患している被験体についての転帰または特定のリスクの予測に関する。これには、前記被験体についての回復の確率または有害な転帰の確率の推定が含まれ得る。

本発明において、リスク層別化という用語は、被験体をかれらのさらなる予後に従って異なるリスク群に分類することに関する。また、リスク層別化は、予防的および／または治療的手段を適用するための層別化にも関する。

本明細書において、試料という用語は、目的の被験体、例えば患者などの診断、予後、または評価のために得た体液試料をさす。好ましい試験試料には、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰、および胸水が含まれる。その上、当業者は、一部の試験試料が、分別または精製手順、例えば、全血の血清または血漿成分への分離の後により容易に分析されることを理解するであろう。
従って、本発明の好ましい実施形態では、試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、脳脊髄液試料、唾液試料および尿試料または上述の試料のいずれかの抽出物を含む群から選択される。好ましくは、試料は血液試料、より好ましくは血清試料、最も好ましくは血漿試料である。
適切な場合、試料は、液体試料を得るために本発明での使用の前に、均質化されるか、または溶媒で抽出される必要がありうる。液体試料は、ここでは溶液または懸濁液でありうる。液体試料は、本発明での使用の前に１以上の前処理に供してもよい。そのような前処理としては、希釈、濾過、遠心分離、濃縮、沈降、沈殿、透析が挙げられるが、これらに限定されない。また、前処理には、溶液への化学的物質または生化学的物質、例えば酸、塩基、緩衝液、塩、溶媒、反応性染料、洗浄剤、乳化剤、キレート剤などの添加も含まれ得る。

診断および／または予後試験の感度および特異性は、単に試験の分析上の「質」以上のものに依存し、それらは異常な結果の構成要素となるものの定義にも依存する。実際に、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）は、典型的には、「正常」集団（すなわち、見かけ上健康）と「疾患」集団（すなわち、糖尿病、インスリン抵抗性および／またはメタボリック症状群に罹患している患者）における変数対その相対頻度の値をプロットすることにより計算される。任意の特定のマーカーに関して、疾患をもつ被験体と疾患のない被験体についてのマーカーレベルの分布は、おそらく重なり合うことになる。そのような状況下では、試験は正常と疾患を１００％の正確さで完全に区別せず、重なり合った領域は、その試験が正常と疾患を区別することができないことを示す。閾値は、その値以上のとき（またはその値以下のとき；マーカーが病気によりどのように変化するかによる）試験が異常であると考えられ、その値以下のときテストが正常であると考えられるように、選択される。ＲＯＣ曲線の下側の面積は、認識された測定値が状態を正しく識別する可能性の尺度である。ＲＯＣ曲線は、たとえ試験結果が必ずしも正確な数を与えない場合でさえも使用することができる。結果をランク付けすることができる限り、ＲＯＣ曲線を作成することができる。例えば、「疾患」試料での試験の結果は、程度によってランク付けすることができ得る（例えば、１＝低、２＝正常、および３＝高）。このランク付けは、「正常」集団での結果に相関し、ＲＯＣ曲線が作成され得る。これらの方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．１９８２．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３：２９−３６参照）。好ましくは、ＲＯＣ曲線面積が約０．５よりも大きく、より好ましくは約０．７よりも大きく、さらにより好ましくは約０．８よりも大きく、一層より好ましくは約０．８５よりも大きく、最も好ましくは約０．９よりも大きくなるように、閾値は選択される。用語「約」は、この文脈において、所与測定値の＋／−５％をさす。
ＲＯＣ曲線の水平軸は、偽陽性の割合とともに増加する（１−特異性）を表す。曲線の垂直軸は、真陽性の割合とともに増加する感度を表す。従って、選択された特定のカットオフについて、（１−特異性）の値を決定することができ、対応する感度を得ることができる。ＲＯＣ曲線の下側の面積は、測定されたマーカーレベルが疾患または状態の正確な同定を許容する可能性の尺度である。従って、ＲＯＣ曲線下面積を、試験の有効性を決定するために使用することができる。

特定の実施形態において、マーカーおよび／またはマーカーパネルは、少なくとも約７０％の特異性、より好ましくは少なくとも約８０％の特異性、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の特異性、一層より好ましくは少なくとも約９０％の特異性、最も好ましくは少なくとも約９５％の特異性と合わせて、少なくとも約７０％の感度、より好ましくは少なくとも約８０％の感度、さらにより好ましくは少なくとも約８５％の感度、一層より好ましくは少なくとも約９０％の感度、最も好ましくは少なくとも約９５％の感度を示すように選択される。特に好ましい実施形態では、感度と特異性の両方が少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、一層より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％である。用語「約」は、この文脈において、所与測定値の＋／−５％をさす。

本方法によれば、患者は、前記の求めたプロソマトスタチンレベルが所定の閾値レベルよりも低い場合に、胃腸活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の可能性が高いと診断される。好ましくは、所定の閾値レベルは、４００ｐｍｏｌ／Ｌ未満、より好ましくは３００ｐｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｐｍｏｌ／Ｌの間、さらにより好ましくは２５０ｐｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｐｍｏｌ／Ｌの間、最も好ましくは２００ｐｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｐｍｏｌ／Ｌの間である。好ましい実施形態では、患者は、前記の求めたプロソマトスタチンレベルが４００ｐｍｏｌ／Ｌよりも低い、好ましくは３００ｐｍｏｌ／Ｌよりも低い、より好ましくは２５０ｐｍｏｌ／Ｌよりも低い、さらにより好ましくは２００ｐｍｏｌ／Ｌよりも低い、最も好ましくは１８０ｐｍｏｌ／Ｌよりも低い場合に、胃腸活性および／または機能の障害を有していると診断される。

プロストマトスタチン１−６４またはその断片の複数のアッセイについて互いに異なる校正が行われていた場合、上記の値はアッセイごとに異なる場合がある。該異なる校正がなされていたプロＳＳＴ１−６４の複数のアッセイに対しては、校正の違いを考慮して、上記各数値をあてはめるべきである。校正の違いを定量化する１つの可能性として、対象とするプロＳＳＴ１−６４アッセイと本発明で用いるプロＳＳＴ１−６４アッセイとの方法比較分析（相関）があり、これは、サンプル中のプロＳＳＴ１−６４またはその断片を両方の方法で測定することにより行う。他の可能性としては、対象とするプロＳＳＴ１−６４アッセイが十分な分析的敏感度を有する場合、このアッセイを用いて、代表的な正常母集団のプロＳＳＴ１−６４レベルの中央値を測定し、その測定値とここで述べるプロＳＳＴ１−６４レベルの中央値の結果同士と比較し、その比較により得られた差異に基づいて校正を再計算することである。

好ましくは、プロソマトスタチン１−６４またはその断片の所定の閾値レベルは、健康な絶食被験体の中央値の１１２％未満、より好ましくは８４％〜５０％の間、さらにより好ましくは７０％〜５０％の間、最も好ましくは５６％〜５０％の間である。好ましい実施形態では、患者は、プロソマトスタチン１−６４またはその断片の前記の求めたレベルが、健康な絶食被験体の中央値の１１２％よりも低い、好ましくは８４％よりも低い、より好ましくは７０％よりも低い、さらにより好ましくは５６％よりも低い、最も好ましくは５０％よりも低い場合に、胃腸活性および／または機能の障害を有していると診断される。

好ましくは、プロソマトスタチン１−６４またはその断片の所定の閾値レベルは、健康な絶食被験体の６３．５パーセンタイル未満、より好ましくは３０〜０．２５パーセンタイルの間、さらにより好ましくは１２．５〜０．２５パーセンタイルの間、最も好ましくは健康な絶食被験体の２および０．２５パーセンタイルである。好ましい実施形態では、患者は、プロソマトスタチン１−６４またはその断片の前記の求めたレベルが、健康な絶食被験体の６３．５パーセンタイルよりも低い、好ましくは３０パーセンタイルよりも低い、より好ましくは１２．５パーセンタイルよりも低い、さらにより好ましくは２パーセンタイルよりも低い、最も好ましくは０．２５パーセンタイルよりも低い場合に、胃腸活性および／または機能の障害を有していると診断される。

１．ペプチド
ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨにより、プロＳＳＴ１−６４に関連する４つのペプチドを化学的に合成し、精製し（ＨＰＬＣ；純度＞９０％）、品質管理した（Ｃ１８カラムによるＨＰＬＣおよび２２０ｎｍで測定される吸光度）：追加のシステイン残基をＣ末端に含むＰｒｏ−ＳＳＴ １−２１（ＰＡＫ２２；配列番号３）、追加のシステイン残基をＮ末端に含むＰｒｏ−ＳＳＴ ２２−４２（ＰＱＤ２２；配列番号４）、追加のシステイン残基をＮ末端に含むＰｒｏ−ＳＳＴ ４３−６４（ＰＡＲ２３；配列番号５）、およびＰｒｏ−ＳＳＴ １−６４（ＰＡＲ６４；配列番号６）。

２．ポリクローナル抗体
ペプチドＰＡＫ２２、ＰＱＤ２２およびＰＡＲ２３に対して作られたポリクローナル抗体を、標準的な手順に従って作成した。ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いて、ペプチドを担体タンパク質ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合させた（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）。ヒツジを、以下のスキームに従ってペプチド複合体で免疫化した：ヒツジを最初に１００μｇの複合体（質量は複合体のペプチド部分をさす）で免疫化し、その後４週間の間隔で各回５０μｇの複合体で追加免疫した。最初の免疫化の４ヵ月後、３００ｍｌの抗血清を各々のヒツジより採取した。ペプチドを、供給業者の説明書に従ってＰｉｅｒｃｅ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）製のＳｕｌｆｏｌｉｎｋ結合ゲルに共有結合させ、それぞれのポリクローナル抗体を、アフィニティー精製によりヒツジ抗血清から精製した。５０ｍｌの対応するヒツジ抗血清（抗ＰＡＫ２２抗血清ＣＦ０７８４、抗ＰＱＤ２２抗血清ＣＦ０７８８および抗ＰＡＲ２３抗血清ＣＦ０７８９）を、室温にて４時間バッチ的にこのゲルとともにインキュベートした。材料をカラム（空ＮＡＰ２５カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に移した。フロースルーを廃棄し、ゲルを１００ｍｌ洗浄緩衝液（１００ｍＭ リン酸カリウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．８）で洗浄し、特異的に結合した抗体を５０ｍＭ クエン酸、ｐＨ２．７で溶離した。溶出液を５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で透析した。

３．モノクローナル抗体
ペプチドＰＡＫ２２、ＰＱＤ２２およびＰＡＲ２３に対して作られたモノクローナル抗体を、標準的な手順に従って作成した（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，Ｌａｎｅ Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．１９８８；Ｌａｎｅ １９８５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：２２３−２２８．）。手短に言えば、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いることによりペプチドをＢＳＡに対してコンジュゲートした。これらの複合体でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化および追加免疫し、脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞株を産生した。細胞株を、固体ポリスチレン相の上に被覆された免疫原性ペプチドに結合する抗体を分泌するそれらの能力に応じてスクリーニングした。このアプローチで、モノクローナル抗体３１３／１Ｆ１１（対ＰＡＫ２２）、３１４／１Ａ１１（対ＰＱＤ２２）および３１５／１Ａ９（対ＰＡＲ２３）を分泌する細胞株を産生した。さらなる実験のために、モノクローナル抗体を、タンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製した。

４．抗体のコーティングおよび標識化
ポリスチレン製Ｓｔａｒｔｕｂｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、精製抗体（３００μＬの５０ミリモル／Ｌ トリス、１００ミリモル／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８中、チューブあたり２μｇの抗体）で、２２℃で一晩コーティングした。チューブを、３％カリオンＦＰ（Ｍｅｒｃｋ）、０．５％ＢＳＡプロテアーゼフリー（Ｓｉｇｍａ）を含有する１０ミリモル／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）でブロッキングし、凍結乾燥した。
精製抗体の濃度を１ｇ／Ｌに調節し、抗体を、室温で２０分間、化学発光標識ＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳ−エステル（１ｇ／Ｌ；ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と１：５のモル比でインキュベートすることにより標識した。１／１０容積の１モル／Ｌ トリスの１０分間の添加により、反応を停止させた。ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢｉｏ−Ｓｉｌ（登録商標）ＳＥＣ−４００−５ ＨＰＬＣカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、標識抗体を遊離標識から分離した。

５．ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でのイムノアッセイ
トレーサーは、２００μｌあたり１０^６相対発光量（ＲＬＵ）のＭＡＣＮ標識抗体を含有するアッセイ緩衝液（３００ミリモル／Ｌ リン酸カリウム、１００ミリモル／Ｌ ＮａＣｌ、１０ミリモル／Ｌ ＥＤＴＡナトリウム、５ｇ／Ｌ ウシ血清アルブミンプロテアーゼフリー（Ｓｉｇｍａ）、１ｇ／Ｌ 非特異的ヒツジＩｇＧ、１ｇ／Ｌ 非特異的ウシＩｇＧ、１ｇ／Ｌ 非特異的マウスＩｇＧ、０．９ｇ／Ｌアジ化ナトリウム、ｐＨ７．０）にそれぞれの標識抗体を希釈することにより作成した。
ペプチドＰＡＲ６４のヌル血清（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ製、Ｔ３／Ｔ４遊離血清、脂質ストリップなし（ｎｏｎ ｌｉｐｅｄ ｓｔｒｉｐｐｅｄ））への希釈は、それぞれ、２５６０、６４０、１６０、４０、１０ｐｍｏｌ／Ｌの濃度をもつ検量用試料として役立った。イムノアッセイは、５０μＬの検量用試料または患者試料と２００μＬのトレーサーを室温（１８〜２７℃）で２時間撹拌下インキュベートすることにより実施された。チューブを１ｍＬの洗浄液（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ）で４回洗浄し、結合した化学発光をＬＢ９５２Ｔ ルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）によってチューブあたり１秒間測定した。

結果
１．イムノアッセイとポリクローナル抗体の相関関係
３０の患者（健康な個体ならびにクローン病、膵炎および様々な癌腫に罹患している患者を含む）由来のＥＤＴＡ−血漿試料を、３つのイムノアッセイ変形形態（固相抗体抗ＰＱＤ２２＋標識抗ＰＡＲ２３抗体［組合せＡ］、固相抗体抗ＰＱＤ２２＋標識抗ＰＡＫ２２抗体［組合せＢ］および固相抗体抗ＰＡＫ２２＋標識抗ＰＡＲ２３抗体［組合せＣ］）で測定した。プロソマトスタチン免疫反応性は、すべての３つの抗体の組合せで検出できた。各々の２つの組合せ間の相関関係をそれぞれ分析した。相関関係は、それぞれ、組合せＡとＢの間でｒ＝０．９４（図１）、組合せＡとＣの間でｒ＝０．９１（図２）、および組合せＢとＣの間でｒ＝０．９４（図３）であった。

２．モノクローナル抗体を用いるイムノアッセイの技術的特徴付け
抗体の様々な組合せを用いる６つのサンドイッチイムノアッセイを、低および高プロＳＳＴ濃度で、高ＰＡＲ６４標準ペプチド濃度（５６００ｐｍｏｌ／Ｌ）および患者由来の２つのＥＤＴＡ−血漿プールを用いてそれぞれ試験した。最大測定値を含む組合せ（固相として抗ＰＡＫ２２ ３１３／１Ｆ１１および標識抗体として抗ＰＱＤ２２ ３１４／１Ａ１１）をすべてのさらなる実験に使用した。
Ｔ３／Ｔ４遊離血清、脂質ストリップなし（ｎｏｎ ｌｉｐｅｄ ｓｔｒｉｐｐｅｄ）（１０回の測定の平均相対発光量＋２ＳＤ）を用いて求められる検出下限（ＬｏＤ）は、４ｐｍｏｌ／Ｌであった。高用量フック効果が、８３００ｐｍｏｌ／Ｌよりも大きいＰＡＲ６４濃度について観察された。
アッセイの全体的な精度を、３０のヒトＥＤＴＡ−血漿試料を測定することにより決定した。これらのデータは、臨床検査標準協会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ＣＬＳＩ（前ＮＣＣＬＳ）により推奨されるプロトコールＥＰ−５Ａ２に従って１つのロットおよび２つのルミノメータを用い、１０回のアッセイについて５つの異なるオペレーターにより作成された。ＣＶは、測定した試料に対して２０％よりも小さく、プロＳＳＴ濃度は２５ｐｍｏｌ／Ｌよりも大きかった。精度は希釈実験により評価した。ヌル血清による線状希釈（最大１：１６、１：２希釈は等容積の試料および希釈剤を混合することにより調製し、１：４、１：８および１：１６希釈は、前の希釈の一部と等容積の希釈剤を混合することにより調製した）を、５つのＥＤＴＡ−血漿試料において試験した。測定濃度に希釈係数を掛け、未希釈試料の値と比較した。５つの試料のどれもが元の値の２０％よりも大きい希釈中の偏差を示さなかった。
合成ペプチドＰＡＲ６４を検量用試料として用いる典型的な用量応答曲線を図４に示す。

３．分析物の生体外安定性
本発明者らは、１０の異なる個体由来のＥＤＴＡ−血漿において２２℃および３７℃での天然分析物の安定性を評価した。２２℃で、分析物は７２時間安定し（免疫反応性の損失＜１０％）、３７℃で２４時間安定していた（図５参照）。（血清中の安定性は、それよりもかなり低い；データはここに示さず）。５のＥＤＴＡ−血漿試料中、４回の凍結融解は、プロＳＳＴの測定された濃度に影響を及ぼしていなかった（平均値、元の値の９９．１％［範囲、９３．８％〜１０４．３％］）。

４．臨床データ
プロＳＳＴを、健康な絶食被験体由来の２０１のＥＤＴＡ−血漿試料において測定し、濃度中央値は３５７ｐｍｏｌ／Ｌであった（範囲１９１〜６３７ｐｍｏｌ／Ｌ）（図６）。それぞれ、２．５パーセンタイルは、２０５ｐｍｏｌ／Ｌ、２５パーセンタイルは、２８８ｐｍｏｌ／Ｌ、７５パーセンタイルは４４５ｐｍｏｌ／Ｌ、９７．５パーセンタイルは６０９ｐｍｏｌ／Ｌであった。
絶食被験体において、プロＳＳＴレベルと肥満度指数（ＢＭＩ）の関連が観察された（スピアマン順位相関係数ｒ＝０．２３［Ｐ＜０．０５］）（図７）。
別の実験では、一晩の絶食期間（少なくとも８時間）の後に６名の健康な被験体が混合食を経口摂取した。ＥＤＴＡ−血漿試料を連続的に得て、プロＳＳＴを測定した。プロＳＳＴの濃度は、食物の経口摂取の後に大幅に増加した（クラスカル・ウォリス検定 Ｐ＜０．０００１）（図８）。
様々なＧＩ管疾患（例えば、クローン病などの炎症性腸疾患；膵炎；憩室炎（ｄｉｖｅｒｃｕｌｉｔｉｓ）；および様々なＧＩ管癌種）に罹患している絶食患者由来の試料を測定した。プロＳＳＴ濃度は健康な絶食対照と比較して大幅に低下した（クラスカル・ウォリス検定 Ｐ＜０．０００１）（図９）。受信者動作特性は、結果として、それぞれ、クローン病患者について１．０（９５％ＣＩ １．０〜１．０）、膵炎患者について０．８２（９５％ＣＩ ０．６９〜０．９５）、憩室炎（ｄｉｖｅｒｃｕｌｉｔｉｓ）患者について０．９４（９５％ＣＩ ０．８６〜１．０２）、膵臓癌の患者について０．９３（９５％ＣＩ ０．８７〜０．９９）、膵臓ネオカルシノーマの患者について０．９５（９５％ＣＩ ０．８７〜１．０２）、食道癌の患者について０．８６（９５％ＣＩ ０．７７〜０．９６）、胃癌の患者について０．６６（９５％ＣＩ ０．５２〜０．８０）、結腸癌の患者について０．９２（９５％ＣＩ ０．８８〜０．９６）、および結腸ネオカルシノーマの患者について０．９３（９５％ＣＩ ０．８７〜０．９９）の曲線下面積（ＡＵＣ）をもたらした。例となるカットオフ値を得られる特異性および感度とともに、様々な患者群について要約する（表１）。
正常以下のレベルのプロＳＳＴが検出された病理は、ＧＩ管の活性／機能の低下という共通する特徴を共有し、それは直接的にまたは間接的に該病理に引き起こされるものである。先行技術においてソマトスタチンの生理学的役割は、いくつかの調節プロセスと関連しているので、ＧＩ管の見かけ上の活性／機能が、プロＳＳＴの血漿レベルが関連している唯一または少なくとも優勢なパラメータであることは驚くべきことであり、ＧＩ管の活性／機能が低下している場合にプロＳＳＴレベルが正常以下であることは、さらにより驚くべきことである。

ソマトスタチンおよびソマトスタチン分泌細胞に対する自己抗体が糖尿病およびＧＩ管疾患の患者に存在するかもしれないと報告されたので（Ｂｏｔｔａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．１９７６．Ｌａｎｃｅｔ ２：８７３−８７６；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．１９８３．Ｇｕｔ ２４：４２７−４３２）、本発明者らは、ことによるとプロＳＳＴに対する自己抗体が存在するかもしれず、ことによると上に説明される実施例で得た測定値に影響を及ぼすかもしれないという問題に取り組んだ。ＧＩ管疾患、その他の疾患の患者および健康な個体由来の試料を分析した場合に、当業者に公知の希釈および回収実験により評価されるプロＳＳＴ測定値の精度は理想的であった。従って、上の実施例に示されるプロＳＳＴ測定値が損なわれているかまたは不正確であることは除外されることができ、実施されたプロＳＳＴ測定値に干渉する抗プロＳＳＴ自己抗体は明らかに存在しない。

配列
配列番号:1
10 20 30 40 50 60
MLSCRLQCAL AALSIVLALG CVTGAPSDPR LRQFLQKSLA AAAGKQELAK YFLAELLSEP
70 80 90 100 110
NQTENDALEP EDLSQAAEQD EMRLELQRSA NSNPAMAPRE RKAGCKNFFW KTFTSC

配列番号:2
10 20 30 40 50 60
APSDPRLRQF LQKSLAAAAG KQELAKYFLA ELLSEPNQTE NDALEPEDLS QAAEQDEMRL
70 80 90
ELQRSANSNP AMAPRERKAC CKNFFWKTFT SC

配列番号:3
10 20
APSDPRLRQF LQKSLAAAAG K

配列番号:4
10 20
QELAKYFLAE LLSEPNQTEN D

配列番号: 5
10 20
ALEPEDLSQA AEQDEMRLEL QR

配列番号:6
10 20 30 40 50 60
APSDPRLRQF LQKSLAAAAG KQELAKYFLA ELLSEPNQTE NDALEPEDLS QAAEQDEMRL ELQR

Claims (17)

1. 患者における、ソマトスタチン産生腫瘍を除く消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の診断、予後、モニタリングおよびリスク評価のための方法であって、
   ｉ）患者の体液の試料を準備するステップと、
   ｉｉ）前記試料におけるプロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルを決定するステップと、
   ｉｉｉ）前記患者において、ソマトスタチン産生腫瘍を除く、前記プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルを、消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害の診断、予後およびリスク評価と関係付けるステップと、を含み、
   前記断片が、少なくとも６アミノ酸残基長を有する、方法。
2. 前記体液試料が、少なくとも８時間の絶食期間の後に前記患者から採取される、請求項１に記載の方法。
3. 前記患者が、炎症性、感染性、器質性および機能性消化管疾患を含む群から選択される、消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害を特徴とする消化管疾患に罹患している、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記感染性消化管疾患が、ウイルス、細菌、または腸管寄生虫により引き起こされる、請求項３に記載の方法。
5. 前記炎症性消化管疾患が、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患；膵炎、虫垂炎、およびセリアック病を含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
6. 前記器質性消化管疾患が、癌、特に、食道、唾液腺、胃、肝臓、胆道系、腸、結腸および肛門の癌；憩室炎および消化性潰瘍疾患を含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
7. 前記機能性消化管疾患が、機能性食道障害（機能性胸焼け、機能性嚥下障害を含む）、機能性胃十二指腸障害（機能性ディスペプシア、げっぷ障害、悪心および嘔吐障害を含む）、機能性腸障害（過敏性腸症状群［ＩＢＳ］を含む）、機能性腹痛症候群、機能性胆嚢障害およびオディ括約筋障害、ならびに機能性肛門直腸障害を含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
8. 前記体液試料が、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿または唾液から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 消化管に関連する少なくとも１つのさらなるマーカーペプチドもしくは前駆体もしくはその断片が、好ましくは、グレリン、コレシストキニン、ガストリン、モチリン、ペプチドＹＹ、膵ポリペプチド、セクレチン、グルカゴン、血管作用性小腸ペプチド、胃抑制ペプチド（ＣＩＰ）、アミリン、ニューロテンシン、サブスタンスＰ、ガストリン放出ペプチド（ＣＲＰ）およびボンベシンを含む群から選択され、特定される、請求項１〜８に記載の方法。
10. その上に、少なくとも１つの臨床パラメータが、年齢、性別、肥満度指数（ＢＭＩ）、真性糖尿病の存在および現在の喫煙習慣を含む群から選択され、特定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害が、消化管活性および／または機能の障害ならびに／あるいは栄養状態の障害をもつ１名および／複数名の患者において診断および予測され、かつ、前記決定されたプロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルが所定の閾値レベルよりも低い場合に、リスクの増加に層別化される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片の所定の閾値レベルが、４００ｐｍｏｌ／Ｌよりも低い、好ましくは４００〜１８０ｐｍｏｌ／Ｌの間、より好ましくは３００〜１８０ｐｍｏｌ／Ｌの間、さらにより好ましくは２５０ｐｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｐｍｏｌ／Ｌの間、最も好ましくは２００ｐｍｏｌ／Ｌ〜１８０ｐｍｏｌ／Ｌの間である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片の所定の閾値レベルが、健康な絶食被験体の中央値の１１２％未満、より好ましくは８４％〜５０％の間、さらにより好ましくは７０％〜５０％の間、最も好ましくは５６％〜５０％の間である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片の所定の閾値レベルが、健康な絶食被験体の６３．５パーセンタイル未満、より好ましくは３０〜０．２５パーセンタイルの間、さらにより好ましくは１２．５〜０．２５パーセンタイルの間、最も好ましくは健康な絶食被験体の２および０．２５パーセンタイルである、請求項１１に記載の方法。
15. 前記プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）のレベルが決定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸４３〜６４（配列番号５）を表すペプチドに含まれるエピトープと結合する抗体。
17. −プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸１〜２１（配列番号３）を表すペプチドに含まれるエピトープと結合する抗体と、
    −プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸２２〜４２（配列番号４）を表すペプチドに含まれるエピトープと結合する抗体と、
    −プロソマトスタチン（配列番号２）のアミノ酸４３〜６４（配列番号５）を表すペプチドに含まれるエピトープと結合する抗体と、
    からなる群から選択される少なくとも２つの抗体を含有する、前記プロソマトスタチン１−６４（配列番号６）またはその断片のレベルを決定するためのキット。