JP2014110814A

JP2014110814A - Ａｄａｍ６マウス

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Publication number: JP2014110814A
Application number: JP2014057616A
Authority: JP
Inventors: Macdonald Lynn; マクドナルドリン; Stevens Sean; スティーブンズショーン; Andrew J Murphy; ジェイ．マーフィーアンドリュー
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2014-06-19
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: KR101387377B1; US9932408B2; PT2738258T; US20150201589A1; AU2020201279A1; CY1122459T1; DK2578688T1; HRP20150262T1; AU2012243291A1; CY1122820T1; US20120322108A1; RS53880B1; EP2738258B2; EP2738258B1; CN105861548B; EP2550363B1; RS59661B2; DK2550363T3; LT2738259T; SI4067496T1

Abstract

【課題】ＡＤＡＭ６マウスの提供。
【解決手段】内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座からのＡＤＡＭ６活性の低減もしくは欠失を含むマウス、またはマウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする内因性遺伝子座を欠いているマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、前記配列は、異所性ＡＤＡＭ６配列であるか、交配により子孫を産生する能力を雄マウスに付与する配列である。マウスＡＤＡＭ６またはその機能的断片もしくはホモログもしくはオルソログをコードする異所性ヌクレオチド配列を含む遺伝子改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスおよび細胞も提供する。
【選択図】なし

Description

機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座をコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウス、細胞、胚および組織を記載する。改変は、ヒトおよび／またはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む。機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているがＡＤＡＭ６機能を含むマウスを記載し、該マウスには、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列を含むマウスが含まれる。内因性免疫グロブリンＶ_Ｈ遺伝子座の改変を含む遺伝子改変雄マウスであって、該改変が、該マウスを機能的ＡＤＡＭ６タンパク質作製不能にし、その結果、妊性を喪失させる、および該雄マウスにおけるＡＤＡＭ６機能をさらに含むものである遺伝子改変雄マウスを記載し、該雄マウスには、該雄マウスに妊性を回復させる異所性核酸配列を含むマウスが含まれる。

ヒト抗体遺伝子を含有するマウスは、当該技術分野において公知である。過去二十年の間の抗体の薬学的適用は、ヒト治療薬としての使用に好適である抗体の作製の多大な研究を喚起した。ヒトへのマウス抗体の反復投与は、長期処置レジメンを混乱させ得る免疫原性を生じさせる結果となるので、マウス抗体に基づく初期抗体治療薬は、ヒト治療薬として理想的ではなかった。マウス抗体をよりヒトらしくし、あまりマウス様にしないようなマウス抗体のヒト化に基づく解決策が開発された。その後、抗体に使用するためのヒト免疫グロブリン配列を発現するための方法が続き、これらは、主として、ファージ、細菌または酵母におけるヒト免疫グロブリンライブラリのｉｎｖｉｔｒｏ発現に基づくものであった。最終的に、ヒト造血細胞を生着させたマウスにおいて、および内因性免疫グロブリン遺伝子座が無能化された染色体導入マウスまたはトランスジェニックマウスにおいて、ｉｎｖｉｔｒｏでヒトリンパ球から有用なヒト抗体を作製する試みがなされた。トランスジェニックマウスの場合、ランダムに組み込まれた完全ヒト導入遺伝子が、該マウスにおいて発現する免疫グロブリン配列の源として機能するために、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を無能化する必要があった。かかるマウスは、ヒト治療薬としての使用に好適なヒト抗体を作製できるが、該マウスの免疫系に関わる重大な問題を提示する。これらの問題は、（１）マウスに十分に多様な抗体レパートリーの産生を実行できなくさせる、（２）広範なリエンジニアリングフィックス（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｆｉｘｅｓ）の使用を必要とする、（３）おそらくヒト要素とマウス要素間の不適合性のため、最適以下のクローン選択過程をもたらす、および（４）これらのマウスを、ヒト治療薬の作製に真に有用であるために必要なヒト可変配列の大きな且つ多様な集団の信頼できない源にしてしまう。

ヒト抗体配列をはじめとする免疫グロブリン配列の生成に有用である改善された遺伝子改変マウスの作製が当該技術分野において依然として必要とされている。有用な再構成免疫グロブリン遺伝子を形成するように免疫グロブリン遺伝子セグメントを再構成できるマウス、または変更された免疫グロブリン遺伝子座からタンパク質を作製することができ、同時に、遺伝子改変の結果として生じ得る有害な変化を低減させるまたは消去することができるマウスも、依然として必要とされている。

１つの態様では、非機能的内因性マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはＡＤＡＭ６遺伝子（例えば、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子のノックアウトまたは内因性ＡＤＡＭ６遺伝子内での欠失）を生じさせる結果となる改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。

１つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。１つの実施形態において、前記内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり、前記改変は、雄マウスの細胞または組織のＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは消去する。

１つの態様では、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する；マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子改変を含むマウスも提供する。

１つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための方法を提供する。本発明によるマウスは、例えば本明細書に記載する方法によって得ることができる。

１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは、交配によって子孫を産生することができる。１つの実施形態において、前記雄マウスは、マウス子宮からマウス卵管を通って移行してマウス卵子を受精させることができる精子を産生できる。

１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは妊性の低減を示し、および該マウスは、その妊性低減を全部または一部回復させる遺伝子改変を含む。様々な実施形態において、前記妊性の低減は、雄マウスの精子が、マウス子宮からマウス卵管を通って移動してマウス卵子を受精させることができないことを特徴とする。様々な実施形態において、前記妊性の低減は、ｉｎｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を特徴とする。様々な実施形態において、前記妊性の低減を全部または一部回復させる遺伝子改変は、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列である。

１つの実施形態において、前記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の、別の種（例えば、非マウス種）の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座での置換を含む。１つの実施形態において、前記遺伝子改変は、オルソロガス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座への挿入を含む。特定の実施形態において、前記種はヒトである。１つの実施形態において、前記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部欠失を含み、該欠失は、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、前記内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連づけられる。

１つの態様では、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からのマウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは消去する改変を有する雄マウスが、内因性ＡＤＡＭ６機能の低減または消去に起因して、妊性低減（例えば、交配による子孫産生能力の高度低減）を示すまたは本質的に不妊性であるように、該改変を含み、さらに、異所性ＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む、マウスを提供する。１つの態様において、マウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは消去する改変は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変（例えば、挿入、欠失、置換など）である。

１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または喪失は、マウスが、マウス子宮からマウス卵管を通って進んでマウス卵子を受精させることのできる精子を産生できないことまたは実質的に産生できないこと含む。特定の実施形態において、前記マウスの射精体積中の産生された精子細胞の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、交尾後にｉｎｖｉｖｏで卵管を通って進むことができず、マウス卵子を受精させることができない。

１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または喪失は、前記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成できないことまたは実質的に形成できないことを含む。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雌マウスとの交尾によってマウス卵子を受精させることが実質的にできないことを含む。

１つの態様において、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能性を付与するタンパク質（またはタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列）を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、前記マウスは雄マウスであり、前記機能性は、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスと比較して強化された妊性を含む。

１つの実施形態において、前記タンパク質は、前記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。特定の実施形態において、前記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。もう１つの特定の実施形態において、前記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶ_Ｈ、少なくとも１つのヒトＤ_Ｈおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記異所性タンパク質は、前記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。１つの実施形態において、前記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、前記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。特定の実施形態において、前記転写活性遺伝子座は、組織特異的発現と関連づけられる。１つの実施形態において、前記組織特異的発現は、生殖組織に存在する。１つの実施形態において、前記タンパク質は、前記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入されたゲノム配列によってコードされている。

１つの実施形態において、前記マウスは、ヒトまたはキメラヒト／マウスまたはキメラヒト／ラット軽鎖（例えば、ヒト可変、マウスまたはラット定常）とキメラヒト可変／マウスまたはラット定常重鎖とを含む。特定の実施形態において、前記マウスは、転写活性プロモーター、例えばＲＯＳＡ２６プロモーター、に作動可能に連結されているキメラヒト可変／ラットまたはマウス定常軽鎖遺伝子を含む導入遺伝子を含む。さらなる特定の実施形態において、前記キメラヒト／マウスまたはラット軽鎖導入遺伝子は、前記マウスの生殖細胞系内に再構成ヒト軽鎖可変領域配列を含む。

１つの実施形態において、前記異所性ヌクレオチド配列は、前記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にある。特定の実施形態において、前記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、前記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶ_Ｈ、少なくとも１つのヒトＤ_Ｈおよび少なくとも１つのヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記異所性ヌクレオチド配列は、前記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にある。１つの実施形態において、前記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、前記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。１つの実施形態において、前記異所性ヌクレオチド配列は、前記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入された位置にある。

１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスであって、マウスＡＤＡＭ６機能の喪失を補う異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、前記異所性ヌクレオチド配列は、前記マウスに、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含有する対応する野生型マウスに匹敵する子孫産生能力を付与する。１つの実施形態において、前記配列は、前記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成する能力を、前記マウスに付与する。１つの実施形態において、前記配列は、前記マウスに、マウス子宮からマウス卵管を通ってマウス卵子へと進んで該卵子を受精させる能力を付与する。

１つの実施形態において、前記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、前記異所性ヌクレオチド配列を含む前記マウスは、同じ年齢および系統の野生型マウスが６ヶ月の期間に産生する同腹子の数の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の数の同腹子を産生する。

１つの実施形態において、前記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、前記異所性ヌクレオチド配列を含む前記マウスは、６ヶ月に期間にわたって交配させたとき、実質的に同じ期間にわたって実質的に同じ条件下で交配させた、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き該異所性ヌクレオチド配列を欠いている同じ年齢および同じまたは類似系統のマウスに比べて、少なくとも約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約４倍、約６倍、約７倍、約８倍または約１０以上後代を産生する。

１つの実施形態において、前記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、前記異所性ヌクレオチド配列を含む前記マウスは、４または６ヶ月の交配期間中に、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無い、同じ期間交配させたマウスより、同腹子あたり平均少なくとも約２倍、３倍、４倍多い数の子を産生する。

１つの実施形態において、前記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、前記異所性ヌクレオチド配列を含む前記マウスは雄マウスであり、該雄マウスは、交尾後約５〜６時間の時点で卵管から回収したとき、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無いマウスに比べて少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、１００倍、１１０倍または１２０倍以上である卵管移動を表わす精子を産生する。

１つの実施形態において、前記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、前記異所性ヌクレオチド配列を含む前記マウスは、雌マウスと交尾させたとき、野生型マウスからの精子にほぼ等しい効率で約６時間以内に子宮を通り抜けて卵管に入って卵管を通り抜けることができる精子を産生する。

１つの実施形態において、前記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、前記異所性ヌクレオチド配列を含む前記マウスは、該機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列が無いマウスに比べて、匹敵する期間内に約１．５倍、約２倍、約３倍または約４倍以上の同腹子を産生する。

１つの態様では、免疫グロブリンタンパク質をコードする非マウス核酸配列をその生殖細胞系内に含むマウスを提供し、前記非マウス免疫グロブリン配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片の挿入を含む。１つの実施形態において、前記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列を含む。１つの実施形態において、前記配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列を含む。１つの実施形態において、前記配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖配列を含む。１つの実施形態において、前記配列は、１つ以上のＶ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪ遺伝子セグメントを含む；１つの実施形態において、前記配列は、１つ以上のＶ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記１つ以上のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つ以上のＶおよびＪ遺伝子セグメントは、再構成されない。１つの実施形態において、前記１つ以上のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つ以上のＶおよびＪ遺伝子セグメントは、再構成される。１つの実施形態において、前記１つ以上のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つ以上のＶおよびＪ遺伝子セグメントの再構成後、前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再構成後、前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも２つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再構成後、前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、前記マウスは、前記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をＢ細胞内に含む。１つの実施形態において、前記マウスは、前記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を非Ｂ細胞内に含む。

１つの態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域またはその機能的断片を内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記雄マウスは、単一の未改変内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子またはそのオルソログもしくは（ｏｆ）ホモログもしくは機能的断片を内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座に含む。

１つの実施形態において、前記雄マウスは、ＡＤＡＭ６機能を付与するタンパク質をコードする異所性マウスＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。

１つの実施形態において、前記雄マウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６対立遺伝子の場所、例えば、最後のＶ遺伝子セグメント配列の３’および最初のＤ遺伝子セグメントの５’に近いマウスゲノム内の場所にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。

１つの実施形態において、前記雄マウスは、免疫グロブリン可変遺伝子セグメントをコードする核酸配列の（ＡＤＡＭ６配列の転写方向を基準にして）上流、下流、または上流および下流に隣接するＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、前記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、前記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントであり、マウスにおいて機能的なマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列は、ヒトＶ遺伝子セグメント間にある；１つの実施形態において、前記マウスは、２つ以上のＶ遺伝子セグメントを含み、前記配列は、前記最後のＶ遺伝子セグメントと最後から二番目のＶ遺伝子セグメントの間の位置にある。１つの実施形態において、前記配列は、前記最後のＶ遺伝子セグメントおよび前記最初のＤ遺伝子セグメントの次に来る位置にある。

１つの態様では、非機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子、または内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の欠失をその生殖細胞系内に含む雄マウスを提供し、該マウスの精子細胞は、雌マウスの卵管を通過することができ、卵子を受精させることができる。１つの実施形態において、前記マウスは、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片の染色体外コピーを含む。１つの実施形態において、前記マウスは、雄マウスにおいて機能的である異所性マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。

１つの態様において、内因性マウスＡＤＡＭ６機能を低減させる遺伝子改変を含むマウスであって、全部もしくは一部機能的である内因性未改変対立遺伝子（例えば、ヘテロ接合体）によってあるいは雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性配列からの発現によってもたらされる、少なくともいくらかのＡＤＡＭ６機能性を含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスは、機能的ＡＤＡＭ６を欠いている雄マウスと比較して、交配により子孫を産生する能力を雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡＭ６機能を含む。１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６機能は、マウスＡＤＡＭ６またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列の存在によって付与される。雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６ホモログもしくはオルソログまたはその断片としては、十分な内因性マウスＡＤＡＭ６活性が無い雄マウスにおいて観察される子孫産生能力の喪失、例えば、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスにおいて観察される能力の喪失を全部または一部回復させるものが挙げられる。この意味で、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスには、内因性遺伝子座またはその断片を含むが機能的でない、すなわち、ＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）をまったく発現しない、または野生型雄マウスの本質的に正常な子孫産生能力を支持するのに不十分であるレベルでＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）を発現するマウスが含まれる。機能の喪失は、例えば、前記遺伝子座の構造遺伝子（すなわちＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域）の改変、または前記遺伝子座の調節領域（例えば、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子に対して５’のまたはＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域の３’の配列であって、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写、ＡＤＡＭ６ＲＮＡの発現またはＡＤＡＭ６タンパク質の発現を全部または一部制御する配列）の改変に起因し得る。様々な実施形態において、雄マウスにおいて機能的であるオルソログもしくはホモログまたはその断片は、雄マウスの精子（または雄マウスの射精液中の大部分の精子細胞）がマウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることを可能にするものである。

１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン可変領域またはその機能的断片を発現する雄マウスは、雌マウスとの交配により子孫を産生する能力を該雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡＭ６活性を含み、１つの実施形態において、雌マウスと交配するとき、前記雄マウスは、１つまたは２つの内因性未改変ＡＤＡＭ６対立遺伝子を有するマウスの子孫産生能力の、１つの実施形態では少なくとも２５％、１つの実施形態では少なくとも３０％、１つの実施形態では少なくとも４０％、１つの実施形態では少なくとも５０％、１つの実施形態では少なくとも６０％、１つの実施形態では少なくとも７０％、１つの実施形態では少なくとも８０％、１つの実施形態では少なくとも９０％、および１つの実施形態では該マウスの子孫産生能力とほぼ同じである、子孫産生能力を示す。

１つの実施形態において、雄マウスは、該雄マウスからの精子細胞が雌マウス卵巣を通り抜けることおよびマウス卵子を受精させることを可能にするために十分なＡＤＡＭ６（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）を発現する。

１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６機能性は、マウス染色体配列に隣接する核酸配列によって付与される（例えば、前記核酸は、マウス染色体にランダムに組み込まれている；または例えば、前記核酸を特定の場所にターゲティングすることにより、例えば部位特異的リコンビナーゼ媒介（例えば、Ｃｒｅ媒介）挿入もしくは相同組換えにより、特定の場所に配置されている）。１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６配列は前記マウスの染色体とは異なる核酸上に存在する（例えば、前記ＡＤＡＭ６配列は、エピソーム上に、すなわち染色体外に、例えば、発現構築物、ベクター、ＹＡＣ、導入染色体などに存在する）。

１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該マウスは、免疫グロブリン重鎖配列の少なくとも一部分、例えば、ヒト配列の少なくとも一部分を発現し、該マウスは、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含む。１つの実施形態において、前記改変は、前記マウスのＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは根絶する。１つの実施形態では、前記マウスは、ＡＤＡＭ６活性をコードする両方の対立遺伝子が、不在であるように、または雄マウスにおいて正常交配を支持するように実質的に機能しないＡＤＡＭ６を発現するように、改変される。１つの実施形態において、前記マウスは、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性核酸配列をさらに含む。

１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該改変は、該遺伝子座のＡＤＡＭ６配列から発現するＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは消去するものであり、および該マウスは、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。様々な実施形態において、前記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片は、異所性ＡＤＡＭ６配列によってコードされている。様々な実施形態において、前記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片は、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から発現する。様々な実施形態において、前記マウスは、第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６の発現を低減させるまたは消去する第一の改変を含む第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子と、第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６の発現を実質的に低減させないまたは消去しない第二の改変を含む第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子とを含む。

１つの実施形態において、前記第二の改変は、最後のマウスＶ遺伝子グメントの（マウスＶ遺伝子セグメントの転写方向性を基準にして）３’にあり、およびマウス（またはキメラヒト／マウス）免疫グロブリン重鎖定常遺伝子またはその断片（例えば、ヒトおよび／またはマウス：Ｃ_Ｈ１および／またはヒンジおよび／またはＣ_Ｈ２および／またはＣ_Ｈ３をコードする核酸配列）の（定常配列の転写方向性を基準にして）５’にある。

１つの実施形態において、前記改変は、第一のＡＤＡＭ６対立遺伝子をコードする第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および前記ＡＤＡＭ６機能は、機能的ＡＤＡＭ６をコードする第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での内因性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生じ、前記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの少なくとも１つの改変を含む。特定の実施形態において、前記Ｖ、ＤおよびまたはＪ遺伝子セグメントの前記少なくとも１つの改変は、欠失、ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置換、ラクダ科動物Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置換、ヒト化またはラクダ化Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置換、重鎖配列の軽鎖配列での置換、ならびにその組み合わせである。１つの実施形態において、前記少なくとも１つの改変は、前記重鎖遺伝子座における１つ以上の重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの欠失ならびに１つ以上の軽鎖Ｖおよび／またはＪ遺伝子セグメント（例えば、ヒト軽鎖Ｖおよび／またはＪ遺伝子セグメント）での置換である。

１つの実施形態において、前記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子、および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、前記ＡＤＡＭ６機能は、前記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座での異所性ＡＤＡＭ６発現の結果として生ずる。特定の実施形態において、前記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。特定の実施形態において、前記非免疫グロブリン遺伝子座は、生殖組織において転写活性である。

１つの態様では、ＡＤＡＭ６のヘテロ接合またはホモ接合ノックアウトを含むマウスを提供する。１つの実施形態において、前記マウスは、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン配列またはラクダ科動物もしくはラクダ化ヒトもしくはマウス免疫グロブリン配列である、改変免疫グロブリン配列をさらに含む。１つの実施形態において、前記改変免疫グロブリン配列は、内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座に存在する。１つの実施形態において、前記改変免疫グロブリン配列は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にヒト重鎖可変遺伝子配列を含む。１つの実施形態において、前記ヒト重鎖可変遺伝子配列は、前記内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性マウス重鎖可変遺伝子配列を置換する。

１つの態様では、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座から機能的内因性マウスＡＤＡＭ６を発現できないマウスを提供する。１つの実施形態において、前記マウスは、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはその機能的断片をコードする異所性核酸配列を含む。特定の実施形態において、前記異所性核酸配列は、ＡＤＡＭ６ノックアウトに関してホモ接合性である雄マウスによって示される子孫産生能力の喪失をレスキューするタンパク質をコードする。特定の実施形態において、前記異所性核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。

１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能を付与する異所性核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、前記核酸配列は、内因性マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、前記内因性マウスＡＤＡＭ６配列は、野生型マウスにおける最も３’側の（ｔｈｅ３’−ｍｏｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント（Ｖ_Ｈ）と最も５’側の（ｔｈｅ５’−ｍｏｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｄ遺伝子セグメント（Ｄ_Ｈ）の間にあるＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂコード配列を含む。

１つの実施形態において、前記核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６ａもしくはその機能的断片をコードする配列、および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂもしくはその機能的断片をコードする配列を含み、該ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂまたはその機能的断片（単数もしくは複数）は、プロモーターに作動可能に連結されている。１つの実施形態において、前記プロモーターは、ヒトプロモーターである。１つの実施形態において、前記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。特定の実施形態において、前記ＡＤＡＭ６プロモーターは、最も５’側のマウスＤ_Ｈ遺伝子セグメントに最も近い第一のＡＤＡＭ６遺伝子の第一コドンと、最も５’側のＤ_Ｈ遺伝子セグメントの組換えシグナル配列との間にある配列を含み、この場合の５’は、マウス免疫グロブリン遺伝子の転写方向を基準にして示される。１つの実施形態において、前記プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態において、前記ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。１つの実施形態において、前記プロモーターは、ユビキチンプロモーターである。

１つの実施形態において、前記プロモーターは、誘導性プロモーターである。１つの実施形態において、前記誘導性プロモーターは、非生殖組織での発現を調節する。１つの実施形態において、前記誘導性プロモーターは、生殖組織での発現を調節する。特定の実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片（単数もしくは複数）の発現は、生殖組織において誘導性プロモーターによって発生調節される。

１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂは、配列番号１のＡＤＡＭ６ａおよび／または配列番号２（ｓｅｑｕｅｎｃｅＳＥＱＩＤＮＯ：２）のＡＤＡＭ６ｂから選択される。１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号３のプロモーターである。特定の実施形態において、前記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向を基準にして）直ぐ上流の配列番号３の核酸配列であって、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号３の端にわたる（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態において、前記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上上流にわたる断片である。

１つの実施形態において、前記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号３またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号３またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。

１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列の欠失と、内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換と、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列とを含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含む内因性免疫グロブリン遺伝子座ヌクレオチド配列の欠失を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含み、および前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にある、または該１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。

１つの実施形態において、前記マウスは、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列でのすべてのまたは実質的にすべての内因性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの置換を含み、前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にあるか、該１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。１つの実施形態において、前記マウスは、内因性Ｄ_Ｈ遺伝子遺伝子座における１つ以上の内因性Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、内因性Ｊ_Ｈ遺伝子遺伝子座における１つ以上の内因性Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性Ｖ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの置換、ならびに内因性Ｖ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子遺伝子座における、ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換を含み、この場合のマウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列を含む。特定の実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列は、存在するヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの最も３’側の末端から二番目のＶ_Ｈ遺伝子セグメントと、存在するヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの最終（ｕｌｔｉｍａｔｅ）３’Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントとの間に配置される。特定の実施形態において、前記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの欠失、およびすべてのまたは実質的にすべてのヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換を含み、前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子セグメントＶ_Ｈ１−２の下流かつヒト遺伝子セグメントＶ_Ｈ６−１の上流に配置されている。

特定の実施形態において、前記マウスは、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での、すべてのまたは実質的にすべての内因性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの置換を含み、前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド内にあるか、該１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチドに直接隣接する。

１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、前記マウスのゲノム内の導入遺伝子上に存在する。１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、前記マウスの染色体外に存在する。

１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むマウスであって、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列を含むＢ細胞を発現するマウスを提供し、該Ｂ細胞は、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする遺伝子をそのゲノム内（例えば、Ｂ細胞染色体上）に含む。１つの実施形態において、前記重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再構成免疫グロブリン配列は、ヒト重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；マウス重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；ヒトまたはマウス軽鎖Ｖおよび／またはＪ配列を含む。１つの実施形態において、前記重鎖定常領域遺伝子配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびその組み合わせからなる群より選択されるヒトまたはマウス重鎖配列を含む。

１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、機能的にサイレンシングされた免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含み、１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置換をさらに含み；機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウス提供する。

１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠き、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列の機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスであって、異性のマウスと交配して、該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む後代を産生することができるマウスを提供する。１つの実施形態において、前記マウスは雄である。１つの実施形態において、前記マウスは雌である。

１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座にヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含み；該内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座に内因性機能的ＡＤＡＭ６配列を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、染色体外のものである。１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、前記マウスのゲノム内の１つ以上の遺伝子座に組み込まれている。特定の実施形態において、前記１つ以上の遺伝子座は、免疫グロブリン遺伝子座を含む。

１つの態様では、ヒトＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖配列を改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスは、複数のヒトＶ遺伝子セグメント、複数のＤ遺伝子セグメント、および複数のＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記Ｄ遺伝子セグメントは、ヒトＤ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、前記Ｊ遺伝子セグメントは、ヒトＪ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、前記マウスは、ヒト化重鎖定常領域配列をさらに含み、該ヒト化は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびその組み合わせから選択される配列の置換を含む。特定の実施形態において、前記重鎖は、ヒトＶ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪ遺伝子セグメント、ヒトＣ_Ｈ１配列、ヒトまたはマウスヒンジ配列、マウスＣ_Ｈ２配列、およびマウスＣ_Ｈ３配列に由来する。もう１つの特定の実施形態において、前記マウスは、ヒト軽鎖定常配列をさらに含む。

１つの実施形態において、前記Ｄ遺伝子セグメントは、（該Ｄ遺伝子セグメントの転写方向を基準にして）５’が、前記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。

１つの実施形態において、前記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、前記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の（Ｖ遺伝子セグメントの転写の方向を基準して）最も５’側のＤ遺伝子セグメントの５’および最も３’側のＶ遺伝子セグメントの３’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。

１つの実施形態において、前記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、前記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座における２つのヒトＶ遺伝子セグメントの間にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。１つの実施形態において、前記２つのヒトＶ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントおよびＶ_Ｈ６−１遺伝子セグメントである。

１つの実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片、マウスＡＤＡＭ６ａ配列またはその機能的断片、およびその組み合わせから選択される配列を含む。

１つの実施形態において、前記２つのヒトＶ遺伝子セグメント間のヌクレオチド配列は、該ヒトＶ遺伝子セグメントを基準にして反対の転写配向に配置されている。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向を基準にして５’から３’へ、ＡＤＡＭ６ａ配列、続いてＡＤＡＭ６ｂ配列をコードする。

１つの実施形態において、前記マウスは、ヒトＶ遺伝子セグメントＶ_Ｈ１−２とＶ_Ｈ６−１の間のヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子配列の、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片での置換を含む。

１つの実施形態において、前記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片である。

１つの実施形態において、前記マウスは、内因性マウスＤＦＬ１６．１遺伝子セグメント（例えば、前記改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性のマウスの場合）またはヒトＤ_Ｈ１−１遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記マウスによって発現される免疫グロブリン重鎖のＤ遺伝子セグメントは、内因性マウスＤＦＬ１６．１遺伝子セグメントまたはヒトＤ_Ｈ１−１遺伝子セグメントに由来する。

１つの態様では、非再構成Ｂ細胞系列のＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むが、再構成免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞内に該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含まないマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、再構成Ｂ細胞系列のものではないすべてのまたは実質的にすべてのＤＮＡ保有細胞に存在する；１つの実施形態において、前記核酸配列は、前記マウスの生殖細胞系細胞には存在するが、再構成Ｂ細胞の染色体には存在しない。

１つの態様では、再構成免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞をはじめとするすべてのまたは実質的にすべてのＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、前記再構成免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸上にある。１つの実施形態において、前記再構成免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸は、染色体である。１つの実施形態において、前記染色体は、野生型マウスにおいて見出される染色体であり、該染色体は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含む。

１つの態様では、ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログをそのゲノムに含むＢ細胞を含む、遺伝子改変マウスを提供する。１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座にある。１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６配列は、異種プロモーターによって駆動される導入遺伝子上にある。特定の実施形態において、前記異種プロモーターは、非免疫グロブリンプロモーターである。特定の実施形態において、Ｂ細胞は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する。

１つの実施形態において、前記マウスのＢ細胞の９０％以上は、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはそのホモログまたはその断片をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態において、前記マウスは雄マウスである。

１つの実施形態において、前記Ｂ細胞ゲノムは、前記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子を含む。１つの実施形態において、前記Ｂ細胞ゲノムは、前記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子を含むが第二の対立遺伝子を含まない。

１つの態様において、１つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子での改変を含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記改変は、前記マウスを、前記１つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の少なくとも１つから機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できなくさせる。特定の実施形態において、前記マウスは、前記内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子のそれぞれから機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できない。

１つの実施形態において、前記マウスは、各内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できず、および該マウスは、異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。

１つの実施形態において、前記マウスは、各内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現できず、および該マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の（マウス重鎖遺伝子座の転写の方向を基準にして）上流１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０ｋｂ以内またはそれ以上上流にある異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。特定の実施形態において、前記異所性ＡＤＡＭ６配列は、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に（例えば、遺伝子間Ｖ−Ｄ領域内、２つのＶ遺伝子セグメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントとの間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間などに）ある。特定の実施形態において、前記異所性ＡＤＡＭ６配列は、最後のマウスＶ遺伝子セグメントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントの間の９０から１００ｋｂ遺伝子間配列内にある。もう１つの特定の実施形態では、前記内因性９０から１００ｋｂ遺伝子間Ｖ−Ｄ配列が除去され、前記異所性ＡＤＡＭ６配列が、最後のＶ遺伝子セグメントと最初のＤ遺伝子セグメントとの間に配置されている。

１つの態様では、２つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の欠失を含む、不妊性雄マウスを提供する。１つの態様では、雄性不妊形質の保有者である雌マウスであって、非機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子ノックアウトをその生殖細胞系に含む雌マウスを提供する。

１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントが無いマウスであって、該マウスのＢ細胞の大部分がＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスには、２つ以上のＶ遺伝子セグメント、２つ以上のＤ遺伝子セグメント、２つ以上のＪ遺伝子セグメントおよびその組み合わせから選択される内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが無い。１つの実施形態において、前記マウスには、少なくとも１つ、かつ８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４以下のＪ遺伝子セグメント、およびその組み合わせから選択される免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントが無い。１つの実施形態において、前記マウスには、約３メガ塩基の前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む染色体１２由来のゲノムＤＮＡ断片が無い。特定の実施形態において、前記マウスには、すべての機能的内因性重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントが無い。特定の実施形態において、前記マウスには、８９のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１３のＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび４つのＪ_Ｈ遺伝子セグメントが無い。

１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを生殖細胞系に有し、該免疫グロブリン重鎖遺伝子座への改変が、１つ以上のマウス免疫グロブリン可変領域配列の、１つ以上の非マウス免疫グロブリン可変領域配列での置換を含むものであるマウスであって、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列を含むマウスを提供する。好ましい実施形態において、前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ_ＨおよびＪ_Ｈ配列ならびに少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０のＶ_Ｈ配列は、非マウス免疫グロブリン可変領域配列によって置換されている。さらなる好ましい実施形態において、前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤ_Ｈ、Ｊ_ＨおよびすべてのＶ_Ｈ配列は、非マウス免疫グロブリン可変領域配列によって置換されている。前記非マウス免疫グロブリン可変領域配列は、再構成されていない場合がある。好ましい実施形態において、前記非マウス免疫グロブリン可変領域配列は、非マウス種の完全な非構成Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ領域ならびに少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０の非再構成Ｖ_Ｈ配列を含む。さらなる好ましい実施形態において、前記非マウス免疫グロブリン可変領域配列は、前記非マウス種の、Ｖ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ領域すべてを含む、完全可変領域を含む。前記非マウス種は、ホモサピエンスである場合があり、前記非マウス免疫グロブリン可変領域配列は、ヒト配列である場合がある。

１つの態様では、少なくとも１つのヒト可変ドメイン／非ヒト定常ドメイン免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体を発現するマウスであって、免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座からマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現するマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは、前記マウスのＢ細胞において発現され、該Ｂ細胞は、ヒト可変配列と非ヒト定常配列とを含む再構成免疫グロブリン配列を含む。

１つの実施形態において、前記非ヒト定常配列は、齧歯動物配列である。１つの実施形態において、前記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。

１つの態様では、不妊性雄マウスを作製するための方法を提供し、この方法は、ドナーＥＳ細胞の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にすること（または該対立遺伝子をノックアウトすること）、該ドナーＥＳ細胞を宿主胚に導入すること、代理母において該宿主胚を妊娠させること、および該ドナーＥＳ細胞に全部または一部由来する後代を該代理母に出産させることを含む。１つの実施形態において、前記方法は、後代を交配させて不妊性雄マウスを得ることをさらに含む。

１つの態様では、対象となる遺伝子改変を有するマウスであって、不妊性であるマウスを作製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）対象となる遺伝子改変をゲノム内で行う工程；（ｂ）前記ゲノムを改変して、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子をノックアウトするか、または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にする工程；および（ｃ）前記ゲノムをマウスの作製に用いる工程を含む。様々な実施形態において、前記ゲノムは、ＥＳ細胞からのものであり、または核移植実験で使用される。

１つの態様では、本明細書に記載のターゲティングベクター、ヌクレオチド構築物または細胞を使用して作製されるマウスを提供する。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスと、野生型マウスであるまたは遺伝子改変されている第二のマウスとの交配の後代を提供する。

１つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖配列の、一つ以上の異種免疫グロブリン重鎖配列での置換を含むマウス系統を維持するための方法を提供する。１つの実施形態において、前記１つ以上の異種免疫グロブリン重鎖配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列である。

１つの実施形態において、前記マウス系統は、１つ以上のマウスＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈおよび／またはＪ_Ｈ遺伝子セグメントの欠失を含む。１つの実施形態において、前記マウスは、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび／または１つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントをさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０のヒトＶ_Ｈセグメント、少なくとも２７のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および少なくとも６のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記マウスは、定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０のヒトＶ_Ｈセグメント、前記少なくとも２７のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび前記少なくとも６のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子である。１つの実施形態において、前記定常領域遺伝子は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３および／もしくはＣ_Ｈ４またはその組み合わせから選択されるマウス定常領域遺伝子配列を含む。

１つの実施形態において、前記方法は、前記マウス免疫グロブリン重鎖配列の置換に関してヘテロ接合性の雄マウスを産生する工程、および前記ヘテロ接合雄マウスを野生型雌マウスとまたはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌マウスと交配させる工程を含む。１つの実施形態において、前記方法は、ヘテロ接合雄と、野生型である雌またはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌とを繰り返し交配させることにより前記系統を維持する工程を含む。

１つの実施形態において、前記方法は、ヒト重鎖配列に関してホモ接合性またはヘテロ接合性の雄または雌マウスから細胞を得る工程と、これらの細胞をドナー細胞として、またはこれらの細胞からの核をドナー核として利用する工程と、宿主細胞を使用してならびに／または代理母において該細胞および／もしくは核を妊娠させて遺伝子改変動物を作製するために該細胞または核を使用する工程とを含む。

１つの実施形態では、重鎖遺伝子座における置換に関してヘテロ接合性である雄マウスのみを雌マウスに交配させる。特定の実施形態において、前記雌マウスは、置換される重鎖遺伝子座に関してホモ接合性、ヘテロ接合性または野生型である。

１つの実施形態において、前記マウスは、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるλおよび／またはκ軽鎖可変配列の、異種免疫グロブリン軽鎖配列での置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記異種免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒト免疫グロブリンλおよび／またはκ軽鎖可変配列である。

１つの実施形態において、前記マウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子をさらに含み、該導入遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に（非再構成配列については）作動可能に連結されているまたは（再構成配列については）融合されている、再構成または非再構成異種λまたはκ軽鎖配列（例えば、非再構成Ｖ_Ｌおよび非再構成Ｊ_Ｌ、または再構成ＶＪ）をコードする配列を含む。１つの実施形態において、前記異種λまたはκ軽鎖配列はヒトのものである。１つの実施形態において、前記定常領域配列は、齧歯動物、ヒトおよび非ヒト霊長類から選択される。１つの実施形態において、前記定常領域配列は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。１つの実施形態において、前記導入遺伝子は、前記軽鎖配列の発現を駆動する非免疫グロブリンプロモーターを含む。特定の実施形態において、前記プロモーターは、転写活性プロモーターである。特定の実施形態において、前記プロモーターは、ＲＯＳＡ２６プロモーターである。

１つの態様では、上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを含む核酸構築物を提供し、該上流ホモロジーアームは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、該下流ホモロジーアームは、ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む配列が、該上流ホモロジーアームと該下流ホモロジーアームの間に配置されている。特定に実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする配列は、野生型マウスの場合に該マウスＡＤＡＭ６が連結されているマウスプロモーターに作動可能と連結されている。

１つの態様では、（ａ）ヒト可変領域遺伝子セグメントヌクレオチド配列と同一または実質的に同一であるヌクレオチド配列と（ｂ）マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードするヌクレオチド配列とを含むターゲティングベクターを提供する。

１つの実施形態において、前記ターゲティングベクターは、前記マウスＡＤＡＭ６をコードする配列に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む。特定の実施形態において、前記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。

１つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を改変するためのヌクレオチド構築物であって、少なくとも１つの部位特異的リコンビナーゼ認識部位と、マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列とを含む構築物を提供する。

１つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む、ＥＳ細胞、多能性細胞および人工多能性（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞をはじめとする（しかしこれらに限定されない）マウス細胞およびマウス胚を提供する。ＸＸである細胞およびＸＹである細胞を提供する。本明細書に記載の改変、例えば、前核注入により細胞に導入される改変、を含有する核を含む細胞も提供する。ウイルス導入ＡＤＡＭ６遺伝子を含む細胞、胚およびマウス、例えば、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子を含む形質導入構築物を含む細胞、胚およびマウスも提供する。

１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いている遺伝子改変マウス細胞であって、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウス細胞を提供する。１つの実施形態において、前記細胞は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変をさらに含む。特定の実施形態において、前記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変は、マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの欠失、マウスＤ_Ｈ遺伝子セグメントの欠失、マウスＪ_Ｈ遺伝子セグメントの欠失およびその組み合わせから選択される欠失を含む。特定の実施形態において、前記マウスは、１つ以上のマウス免疫グロブリンＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈおよび／またはＪ_Ｈ配列の、ヒト免疫グロブリン配列での置換を含む。特定の実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン配列は、ヒトＶ_Ｈ、ヒトＶ_Ｌ、ヒトＤ_Ｈ、ヒトＪ_Ｈ、ヒトＪ_Ｌおよびその組み合わせから選択される。

１つの実施形態において、前記細胞は、全能性細胞、多能性細胞、または人工多能性細胞である。特定の実施形態において、前記細胞は、マウスＥＳ細胞である。

１つの態様では、再構成免疫グロブリン重鎖遺伝子を含むマウスＢ細胞であって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を該Ｂ細胞の染色体上に含むＢ細胞を提供する。１つの実施形態において、前記マウスＢ細胞は、前記核酸配列の２つの対立遺伝子を含む。

１つの実施形態において、前記核酸配列は、前記再構成マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に隣接する核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。

１つの実施形態において、前記核酸配列は、前記再構成マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む核酸分子とは異なる核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。

１つの実施形態において、前記マウスＢ細胞は、マウスまたはヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている再構成非マウス免疫グロブリン可変遺伝子配列を含み、この場合のＢ細胞は、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含む。

１つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列とを含む染色体を含む、マウス体細胞を提供する。１つの実施形態において、前記核酸配列は、前記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、前記核酸は、前記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座とは異なる染色体上にある。１つの実施形態において、前記体細胞は、前記核酸配列の単一のコピーを含む。１つの実施形態において、前記体細胞は、前記核酸配列の少なくとも２つのコピーを含む。特定の実施形態において、前記体細胞は、Ｂ細胞である。特定の実施形態において、前記細胞は、生殖細胞である。特定の実施形態において、前記細胞は、幹細胞である。

１つの態様では、マウス生殖細胞であって、マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を該生殖細胞の染色体上に含み、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列が、野生型マウス生殖細胞の染色体内の位置とは異なる染色体内の位置にあるマウス生殖細胞を提供する。１つの実施形態において、前記核酸配列は、マウス免疫グロブリン遺伝子座にある。１つの実施形態において、前記核酸配列は、前記生殖細胞の、マウス免疫グロブリン遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、前記核酸配列は、前記生殖細胞の、マウス免疫グロブリン遺伝子座とは異なる染色体上にある。１つの実施形態において、前記マウス免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つのマウス免疫グロブリン配列の、少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列での置換を含む。特定の実施形態において、前記少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列である。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスに由来する多能性細胞、人工多能性細胞または全能性細胞を提供する。特定の実施形態において、前記細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスに由来する組織を提供する。１つの実施形態において、前記組織は、本明細書に記載のマウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスに由来する核を提供する。１つの実施形態において、前記核は、Ｂ細胞ではない２倍体細胞からのものである。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列を提供する。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を提供する。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ）を提供する。１つの態様では、遺伝子改変マウスを作製するための方法を提供し、この方法は、該マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写を基準にして）上流の１つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントで置換する工程、および該マウスの該ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写を基準にして）下流の１つ以上の免疫グロブリン遺伝子セグメントを、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントで置換する工程を含む。１つの実施形態において、前記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、前記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＶおよびＤ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、前記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｊ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、前記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、前記１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。

１つの実施形態では、前記ＡＤＡＭ６遺伝子の上流および／または下流の前記１つ以上の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞中で置換して、遺伝子改変前駆細胞を形成し；該遺伝子改変前駆細胞を宿主に導入し；そして、該遺伝子改変前駆細胞を含む該宿主を妊娠させて、該遺伝子改変前駆細胞に由来するゲノムを含むマウスを形成する。１つの実施形態において、前記宿主は胚である。特定の実施形態において、前記宿主は、マウス前桑実胚（ｐｒｅ−ｍｏｒｕｌａ）（例えば８または４細胞期）、４倍体胚、胚性細胞の集合体、または胚盤胞から選択される。

１つの態様では、遺伝子改変マウスを作製する方法を提供し、この方法は、マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントとマウスＡＤＡＭ６（または雄マウスにおいて機能的なそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）ヌクレオチド配列とを含むマウスヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列で置換して、第一のキメラ遺伝子座を形成する工程、その後、マウスＡＤＡＭ６コード配列（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする配列）を、前記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列に挿入して、第二のキメラ遺伝子座を形成する工程を含む。

１つの実施形態において、前記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変（Ｖ_Ｈ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記第二のキメラ遺伝子座は、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントに作動可能に連結されているヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントまたはヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む。さらなる特定の実施形態において、前記第二のキメラ遺伝子座は、マウスＣ_Ｈ２＋Ｃ_Ｈ３配列と融合するヒトＣ_Ｈ１配列、またはヒトＣ_Ｈ１およびヒトヒンジ配列を含む第三のキメラ遺伝子座に作動可能に連結されている。

１つの態様では、妊性雄マウスを作製するための、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む異所性ヌクレオチド配列を含むマウスの使用を提供し、この使用は、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む前記異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠いているマウスと交配させること、および該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列を有する後代を産生できる雌である後代を得ること、または該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列を含む雄であって、野生型雄マウスによって示される妊性とほぼ同じである妊性を示す雄である後代を得ることを含む。

１つの態様では、免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。

１つの態様では、完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）_２を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。

１つの態様では、不死化細胞系を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。

１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。

１つの態様では、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含有するファージライブラリーを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。

１つの態様では、ヒト抗体を作製するための可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスからリンパ球を単離すること、（ｃ）前記リンパ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）前記対象となる抗原に結合できるリンパ球を同定すること、および（ｅ）前記リンパ球からの１つ以上の可変領域核酸配列を増幅し、それによって可変領域配列を生成することを含む。

１つの実施形態では、前記リンパ球を前記マウスの脾臓に由来する。１つの実施形態では、前記リンパ球を前記マウスのリンパ節に由来する。１つの実施形態では、前記リンパ球を前記マウスの骨髄に由来する。

１つの実施形態において、前記標識抗体は、蛍光団結合体化抗体である。１つの実施形態において、１つ以上の前記蛍光団結合体化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組み合わせから選択される。

１つの実施形態において、前記リンパ球は、Ｂ細胞である。

１つの実施形態において、前記１つ以上の可変領域核酸配列は、重鎖可変領域配列を含む。１つの実施形態において、前記１つ以上の可変領域核酸配列は、軽鎖可変領域配列を含む。１つの特定の実施形態において、前記軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域配列である。１つの実施形態において、前記１つ以上の可変領域核酸配列は、重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を含む。

１つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから脾臓を単離すること、（ｃ）前記脾臓からのＢリンパ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）前記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）前記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。

１つの実施形態において、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから１つ以上のリンパ節を単離すること、（ｃ）前記１つ以上のリンパ節からのＢリンパ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）前記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）前記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。

１つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから骨髄を単離すること、（ｃ）前記骨髄からのＢリンパ球を１つ以上の標識抗体に曝露すること、（ｄ）前記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）前記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。様々な実施形態において、前記１つ以上の標識抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組み合わせから選択される。

様々な実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、増幅重および軽鎖可変領域配列をヒト重および軽鎖定常領域配列に融合させること、融合した重および軽鎖配列を細胞において発現させること、および発現された重および軽鎖配列を回収し、それによってヒト抗体を産生させることをさらに含む。

様々な実施形態において、前記ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＧから選択される。様々な特定の実施形態において、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される。様々な実施形態において、前記ヒト重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、Ｃ_Ｈ４またはその組み合わせを含む。様々な実施形態において、前記軽鎖定常領域は、免疫グロブリンκ定常領域である。様々な実施形態において、前記細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ８７細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫）細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）およびＭＣ３Ｔ３細胞から選択される。特定の実施形態において、前記細胞は、ＣＨＯ細胞である。

１つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラマウス−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラマウス−ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該抗体を得る工程を含む。
１つの実施形態において、前記逆キメラマウス−ヒト抗体は、マウスまたはラット重鎖定常遺伝子と融合するヒト重鎖可変ドメイン、およびマウスまたはラットまたはヒト軽鎖定常遺伝子と融合するヒト軽鎖可変ドメインを含む。

１つの実施形態において、前記抗原に対して特異的な前記逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞の培養は、前記マウスから単離された少なくとも１つの細胞から産生された少なくとも１つのハイブリドーマ細胞で行う。

１つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な完全ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体に由来する完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を産生させる工程、および該完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該完全ヒト抗体を得る工程を含む。

様々な実施形態において、前記抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物−ヒト抗体を産生するマウスから単離される少なくとも１つの細胞は、脾細胞またはＢ細胞である。

様々な実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体である。

様々な実施形態において、前記対象となる抗原での免疫を、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発現する細胞を用いて行う。

１つの態様では、免疫グロブリン可変領域またはその断片をコードする核酸配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態では、前記核酸配列を使用して、ヒト抗体またはその抗原結合断片を作製する。１つの実施形態では、前記マウスを使用して、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ−ＮＡＲ、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_Ｌ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）_２、ＤＶＤ（すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃＴ−ｃｅｌｌｅｎｇａｇｅｒ：ＢｉＴＥ）から選択される抗原結合タンパク質を作製する。

１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６配列が無いマウスに異所性ＡＤＡＭ６配列を導入するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、本明細書に記載のマウスと、該機能的内因性マウスＡＤＡＭ６配列が無いマウスとを交配させることを含む。

１つの態様では、異所性ＡＤＡＭ６配列を有するマウスを作製するための、本明細書に記載のマウスからの遺伝子材料の使用を提供する。１つの実施形態において、前記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞の核を使用する核移植を含む。１つの実施形態において、前記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞を、該細胞に由来する動物を産生するためにクローングすることを含む。１つの実施形態において、前記使用は、前記異所性ＡＤＡＭ６配列を含むマウスを作製するためのプロセスにおける、本明細書に記載のマウスの精子または卵子の利用を含む。

１つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む妊性雄マウスを作製するための方法であって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む第一のマウス生殖細胞を、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む第二のマウス生殖細胞で受精させる工程；受精細胞を形成する工程；前記受精細胞を胚へと発生させる工程；および代理母において前記胚を妊娠させてマウスを得る工程を含む方法を提供する。

１つの実施形態において、前記受精は、雄マウスと雌マウスを交配させることによって達成される。１つの実施形態では、前記雌マウスが前記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。１つの実施形態では、前記雄マウスが前記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。

１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有するマウスの妊性を回復させるまたは強化するための、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログまたは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列の使用を提供し、この場合の改変は、内因性ＡＤＡＭ６機能を低減させるまたは消去する。

１つの実施形態では、前記核酸配列を前記マウスのゲノムの異所位置に組み込む。１つの実施形態では、前記核酸配列を前記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座に組み込む。特定の実施形態において、前記内因性免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施形態では、前記核酸配列を前記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に組み込む。

１つの態様では、ヒト疾患または障害の処置のために、薬物（例えば、抗原結合タンパク質）を製造するための、または薬物（例えば、抗原結合タンパク質）の可変配列をコードする配列を製造するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
マウスであって、該マウスは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有し、該改変は、内因性ＡＤＡＭ６機能の低減または消去を含み、そして該マウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログまたは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列をさらに含む、マウス。
（項目２）
前記核酸配列が、異所位置に位置する、項目１に記載のマウス。
（項目３）
前記核酸配列が、内因性免疫グロブリン遺伝子座にある、項目１または２に記載のマウス。
（項目４）
前記核酸配列が、前記マウスゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に組み込まれている、項目１または２に記載のマウス。
（項目５）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座の前記改変が、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列の配置を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載のマウス。
（項目６）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座の前記改変が、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の１つ以上の配列の、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列での置換を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載のマウス。
（項目７）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座の前記改変が、１つ以上の内因性重鎖Ｖ（Ｖ_Ｈ）遺伝子セグメントの、１つ以上のヒト重鎖Ｖ（Ｖ_Ｈ）遺伝子セグメントでの置換を含む、項目６に記載のマウス。
（項目８）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座の前記改変が、内因性重鎖可変遺伝子配列の、ヒト重鎖可変遺伝子配列での置換を含む、項目１に記載のマウス。
（項目９）
前記核酸配列が、マウスＡＤＡＭ６ａタンパク質および／もしくはＡＤＡＭ６ｂタンパク質、またはそのオルソログ、ホモログもしくは機能的断片をコードする、項目１〜８のいずれか一項に記載のマウス。
（項目１０）
マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座を改変するための方法であって、以下：
（ａ）雄マウスにおいて内因性マウスＡＤＡＭ６活性の低減または消去を結果としてもたらす、該マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第一の改変を行う工程；および
（ｂ）雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を該マウスに付与する核酸配列を付加するための該マウスに対する第二の改変を行う工程
を含む方法。
（項目１１）
前記工程（ｂ）の核酸配列が異所位置に付加される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第一の改変が、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列の配置を含む、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第一の改変が、前記マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座内の１つ以上の配列の、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列での置換を含む、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１４）
前記第一の改変が、１つ以上の内因性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記第一の改変が、内因性重鎖可変遺伝子配列の、ヒト重鎖可変遺伝子配列での置換を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記第一および前記第二の改変が同時に行われる、項目１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
項目１０〜１６のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるマウス。
（項目１８）
項目１〜９および１７のいずれか一項に記載のマウスからの単離細胞。
（項目１９）
項目１〜９および１７のいずれか一項に記載のマウスからの単離組織。
（項目２０）
ヒト−マウス逆キメラ抗体、完全ヒト抗体、完全ヒトＦａｂ断片および／または完全ヒトＦ（ａｂ）_２断片の産生のための、項目１〜９および１７のいずれか一項に記載のマウスの使用。
（項目２１）
抗原に対して特異的な逆キメラマウス−ヒト抗体を産生させるための方法であって、以下の工程：
ａ）項目１〜９および１７のいずれか一項に記載のマウスを該抗原で免疫する工程；
ｂ）該抗原に対して特異的な逆−キメラマウス−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程；および
ｃ）工程ｂ）の抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養し、そして該抗体を得る工程を含む方法。
（項目２２）
工程ｃ）における前記培養する工程が、工程ｂ）において得た前記少なくとも１つの細胞から産生された少なくとも１つのハイブリドーマ細胞で行われる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
抗原に対して特異的な完全ヒト抗体を産生させるための方法であって、以下の工程：
ａ）項目１〜９および１７のいずれか一項に記載のマウスを該抗原で免疫する工程；
ｂ）該抗原に対して特異的な逆−キメラマウス−ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程；
ｃ）工程ｂ）の該抗体に由来し、該抗原に対して特異な完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を産生させる工程；および
ｄ）工程ｃ）の抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該抗体を得る工程
を含む方法。
（項目２４）
工程ｂ）において得られる前記少なくとも１つの細胞が、脾細胞またはＢ細胞である、項目２１および２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
工程ａ）の前記抗原での免疫が、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または前記抗原を発現する細胞で行われる、項目２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
内因性ＡＤＡＭ６機能を低減させるまたは消去する免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有するマウスの妊性を回復または向上させるための、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログまたは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列の使用。
（項目２８）
前記核酸配列が、前記マウスの前記ゲノムの異所位置に組み込まれている、項目２７に記載の使用。
（項目２９）
前記核酸配列が、前記マウスの前記ゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座に組み込まれている、項目２７または２８に記載の使用。
（項目３０）
前記核酸配列が、前記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に組み込まれている、項目２７または２８に記載の使用。

図１Ａは、約１メガ塩基（Ｍｂ）のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座（白抜きの記号）での約３メガ塩基（Ｍｂ）のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座（黒塗りの記号）の直接ゲノム置換の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。図１Ｂは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の２つのほぼ同一のリピートのうちの約０．５メガ塩基（Ｍｂ）の第一のリピート、すなわち近位リピート（白抜きの記号）での約３メガ塩基（Ｍｂ）のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座（黒塗りの記号）の直接ゲノム置換の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。図２Ａは、すべてのマウスＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの欠失ならびに３つのヒトＶ_Ｈ、すべてのヒトＤ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての最初の３工程（Ａ〜Ｃ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの第一の挿入のためのターゲティングベクター（３ｈＶ_ＨＢＡＣｖｅｃ）が示されており、このターゲティングベクターは、６７ｋｂ５’マウスホモロジーアーム、選択カセット（白抜きの長方形）、部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）、１４５ｋｂヒトゲノム断片および８ｋｂ３’マウスホモロジーアームを有する。後続のターゲティングベクターから挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメント、追加の選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。図２Ｂは、７７の追加のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入および最後の選択カセットの除去を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての追加の６工程（Ｄ〜Ｉ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。最初のヒト重鎖遺伝子セグメント挿入物（３ｈＶ_Ｈ−ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子）への追加のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入のためのターゲティングベクター（１８ｈＶ_ＨＢＡＣｖｅｃ）が示されており、このターゲティングベクターは、２０ｋｂ５’マウスホモロジーアーム、選択カセット（白抜きの長方形）、１９６ｋｂヒトゲノム断片および６２ｋｂヒトホモロジーアームを有し、該ヒトホモロジーアームは、示されている最初のヒト重鎖遺伝子セグメント挿入物の５’端とオーバーラップしており、該ヒト遺伝子セグメントに対して５’に部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）がある。後続のターゲティングベクターによって挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメントならびに追加の選択カセット（白抜きの長方形）が示されている。図２Ｃは、すべてのマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの欠失（Ｉｇκ−ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子）を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての最初の３工程（Ａ〜Ｃ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。前記ターゲティングベクターから挿入される選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。図２Ｄは、前記近位リピートのすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの挿入および最後の選択カセットの欠失（４０ｈＶκｄＨｙｇハイブリッド対立遺伝子）を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての追加の５工程（Ｄ〜Ｈ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。後続のターゲティングベクターによって挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメントならびに追加の選択カセット（白抜きの長方形）が示されている。図３Ａは、標的胚性幹（ＥＳ）細胞におけるヒト重鎖遺伝子配列の挿入およびマウス重鎖遺伝子配列の喪失を検出するための定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プライマー／プローブセットの場所を含む、スクリーニング戦略の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。未改変マウス染色体（上部）および正しくターゲティングされた染色体（下部）上の欠失領域（「喪失」プローブＣおよびＤ）、挿入された領域（「ｈＩｇＨ」プローブＧおよびＨ）および隣接領域（「保持」プローブＡ、Ｂ、ＥおよびＦ）のためのｑＰＣＲプライマー／プローブセットを用いた、ＥＳ細胞およびマウスにおける第一のヒト重鎖遺伝子挿入についてのスクリーニング戦略が示されている。図３Ｂは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの第一の挿入についての、親ＥＳ細胞および改変ＥＳ細胞における実測プローブコピー数の代表的算定を示すものである。プローブＡからＦについての実測プローブコピー数は、２／２ΔΔＣｔと算定された。ΔΔＣｔは、ａｖｅ［ΔＣｔ（試料）−ｍｅｄΔＣｔ（対照）］として算定され、この式中のΔＣｔは、被験プローブと基準プローブ（アッセイに依存して４と６の間の基準プローブ）の間のＣｔの差である。用語ｍｅｄΔＣｔ（対照）は、親ＥＳ細胞からの多数（＞６０）の非標的ＤＮＡ試料の中央値ΔＣｔである。各改変ＥＳ細胞クローンを６つひと組（ｓｅｘｔｕｐｌｉｃａｔｅ）でアッセイした。親ＥＳ細胞におけるＩｇＨプローブＧおよびＨのコピー数を算定するために、これらのプローブが改変ＥＳ細胞では１のコピー数を有すると仮定し、増幅が観察されなかったとしても３５の最大Ｃｔを用いた。図３Ｃは、プローブＤおよびＨのみを使用して算定した各遺伝子型の４匹のマウスについてのコピー数の代表算定を示すものである。野生型マウス：ＷＴマウス；ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの最初の挿入物に関してヘテロ接合性のマウス：ＨＥＴマウス；ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの最初の挿入物に関してホモ接合性のマウス：Ｈｏｍｏマウス。図４Ａは、細菌相同組換え（ＢＨＲ）による３ｈＶ_ＨＢＡＣｖｅｃの構築に用いた３工程についての詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。ターゲティングベクターから挿入されたヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメント、選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。図４Ｂは、Ｎｏｔｌ消化後の３つのＢＡＣクローン（Ｂ１、Ｂ２およびＢ３）のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示すものである。マーカーＭ１、Ｍ２およびＭ３は、それぞれ、ローレンジ、ミドルレンジおよびラムダラダーＰＦＧマーカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）である。図５Ａは、漸増量のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の逐次的改変の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。重鎖ヒト化の３つの異なる段階それぞれからホモ接合型マウスを作製した。白抜きの記号はヒト配列を示し、黒塗りの記号はマウス配列を示す。図５Ｂは、漸増量のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の逐次的改変の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。κ軽鎖ヒト化の３つの異なる段階それぞれからホモ接合型マウスを作製した。白抜きの記号はヒト配列を示し、黒塗りの記号はマウス配列を示す。図６は、野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおけるＢ細胞集団のＦＡＣＳドットプロットを示すものである。野生型（ｗｔ）、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１（Ｖ１）、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２（Ｖ２）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３（Ｖ３）マウスの脾臓（最上段、上から三段目および最下段）または鼠蹊リンパ節（上から二段目）からの細胞を、表面ＩｇＭを発現するＢ細胞（最上段、および上から二段目）、κもしくはλ軽鎖のいずれかを含有する表面免疫グロブリン（上から三段目）または特定のハプロタイプの表面ＩｇＭ（最下段）について染色し、集団をＦＡＣＳによって分離した。図７Ａは、接合部の多様性およびヌクレオチド付加の証拠となる、Ｖ_Ｈ−Ｄ_Ｈ−Ｊ_Ｈ（ＣＤＲ３）接合部周辺のランダムに選択したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の代表重鎖ＣＤＲ３配列を示すものである。重鎖ＣＤＲ３配列をＤ_Ｈ遺伝子セグメント使用量（ｕｓａｇｅ）に従ってグループ分けし、その生殖細胞系を各グループの上に太字で提供する。各重鎖ＣＤＲ３配列についてのＶ_Ｈ遺伝子セグメントを各配列の５’端のカッコ内に記入する（例えば、３−７２は、ヒトＶ_Ｈ３−７２である）。各重鎖ＣＤＲ３についてのＪ_Ｈ遺伝子セグメントを各配列の３’端のカッコ内に記入する（例えば、３は、ヒトＪ_Ｈ３である）。示されている各配列についての配列番号は、上から下に進んで、次のとおりである：配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９。図７Ｂは、接合部の多様性およびヌクレオチド付加の証拠となる、Ｖκ−Ｊκ（ＣＤＲ３）接合部周辺のランダムに選択したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の代表軽鎖ＣＤＲ３配列を示すものである。各軽鎖ＣＤＲ３配列についてのＶκ遺伝子セグメントを各配列の５’端のカッコ内に記入する（例えば、１−６は、ヒトＶκ１−６である）。各軽鎖ＣＤＲ３についてのＪκ遺伝子セグメントを各配列の３’端のカッコ内に記入する（例えば、１は、ヒトＪκ１である）。示されている各配列についての配列番号は、上から下に進んで、次のとおりである：配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８。図８は、３８（非免疫ＩｇＭ）、２８（非免疫ＩｇＧ）、３２（ＩｇＧからの非免疫Ｉｇκ）、３６（免疫ＩｇＧ）または３６（ＩｇＧからの免疫Ｉｇκ）配列セットの中の各ヌクレオチド（ＮＴ；左縦列）およびアミノ酸（ＡＡ；右縦列）位置で変化した配列のパーセントとして（マッチする生殖細胞系配列へのアラインメント後に）スコアを付けたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の重鎖および軽鎖の体細胞超変異頻度を示すものである。陰影のあるバーは、ＣＤＲの場所を示す。図９Ａは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＭおよびＩｇＧアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。図９Ｂは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＡアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。図９Ｃは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＥアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。図１０Ａは、ＩＬ−６Ｒのエクトドメインでの２ラウンドの免疫後（採血試料（ｂｌｅｅｄ）１）または３ラウンドの免疫後（採血試料２）の７匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）および５匹の野生型（ＷＴ）マウスからの血清のインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対する抗原特異的ＩｇＧ力価を示すものである。図１０Ｂは、７匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）マウスおよび５匹の野生型（ＷＴ）マウスからの抗ＩＬ−６Ｒ特異的ＩｇＧアイソタイプ特異的力価を示すものである。図１１Ａは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて産生された抗インターロイキン−６受容体モノクローナル抗体の親和性分布を示すものである。図１１Ｂは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスにおいて産生された抗インターロイキン−６受容体モノクローナル抗体の抗原特異的遮断を示すものである。図１２は、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒト化内因性重鎖遺伝子座へのマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの挿入のために使用したターゲティングベクター（ｍＡＤＡＭ６ターゲティングベクター）が示されており、このターゲティングベクターは、５’および３’端に工学的に作製された制限酵素認識部位を含む部位特異的組換え部位（Ｆｒｔ）が隣接する選択カセット（ＨＹＧ：ハイグロマイシン）を有する。図１３は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント１−２（Ｖ_Ｈ１−２）と６−１（Ｖ_Ｈ６−１）の間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子（ｈＡＤＡＭ６Ψ）の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子を欠失させ、ヒト重鎖遺伝子座にユニークな制限酵素認識部位を挿入する細菌相同組換えのためのターゲティングベクター（ｈＡＤＡＭ６Ψターゲティングベクター）が示されており、このターゲティングベクターは、５’および３’端に工学的に作製された制限酵素認識部位を含む部位特異的組換え部位（ｌｏｘＰ）が隣接する選択カセット（ＮＥＯ：ネオマイシン）を有する。部位特異的組換え部位が隣接する選択カセットを含む、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードするゲノム断片を含有する、結果として得られる標的ヒト化重鎖遺伝子座の説明図（縮尺不定）が示されている。図１４Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の骨髄中のＩｇＭおよびＢ２２０の表面発現についてのシングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）でゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。未熟（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋）および成熟（Ｂ２２０^ｈｉｇｈＩｇＭ^＋）Ｂ細胞の百分率を各等高線図に記入する。図１４Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の大腿骨から単離した骨髄中の未熟（Ｂ２２０^ｉｎｔＩｇＭ^＋）および成熟（Ｂ２２０^ｈｉｇｈＩｇＭ^＋）Ｂ細胞の総数を示すものである。図１５Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の骨髄中のｃ−ｋｉｔおよびＣＤ４３の表面発現についてのＣＤ１９^＋ゲートＢ細胞のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。プロＢ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^＋ｃｋｉｔ^＋）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３⁻ｃｋｉｔ⁻）細胞の百分率を各等高線図のそれぞれ右上および左下象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）に記入する。図１５Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の大腿骨から単離した骨髄中のプロＢ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^＋ｃｋｉｔ^＋）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３⁻ｃｋｉｔ⁻）細胞の総数を示すものである。図１６Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の骨髄中のＣＤ１９およびＣＤ４３の表面発現についてのシングレットでゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。未熟Ｂ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３⁻）細胞、プレＢ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^ｉｎｔ）細胞およびプロＢ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^＋）細胞の百分率を各等高線図に記入する。図１６Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の骨髄中の未熟Ｂ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３⁻）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９^＋ＣＤ４３^ｉｎｔ）細胞のヒストグラムを示すものである。図１７Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の脾細胞におけるＣＤ１９およびＣＤ３の表面発現についてのシングレットでゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。Ｂ（ＣＤ１９^＋ＣＤ３⁻）細胞およびＴ（ＣＤ１９⁻ＣＤ３^＋）細胞の百分率を各等高線図に記入する。図１７Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の脾臓におけるＩｇλおよびＩｇκ軽鎖の表面発現についてのＣＤ１９^＋ゲートＢ細胞のＦＡＣｓ等高線図を示すものである。Ｉｇλ^＋（左上象限）Ｂ細胞およびＩｇκ^＋（右下象限）Ｂ細胞の百分率を各等高線図に記入する。図１７Ｃは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の脾臓におけるＣＤ１９^＋Ｂ細胞の総数を示すものである。図１８Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の脾臓におけるＩｇＤおよびＩｇＭの表面発現についてのＣＤ１９^＋ゲートＢ細胞のＦＡＣｓ等高線図を示すものである。成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＤ^ｈｉｇｈＩｇＭ^ｉｎｔ）の百分率を各等高線図に記入する。右の等高線図上の矢印は、ＩｇＭおよびＩｇＤ表面発現に関連したＢ細胞の成熟過程を図示するものである。図１８Ｂは、ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｈｉｇｈＩｇＤ^ｉｎｔからＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｉｎｔＩｇＤ^ｈｉｇｈに成熟する間の、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の脾臓におけるＢ細胞の総数を示すものである。図１９は、ヒト細胞表面受容体（抗原Ａ）で免疫した、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋；ｎ＝５）、ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋；ｎ＝５）からの、第１回および第２回採血試料についての抗体力価を示すものである。図２０は、ヒト受容体チロシン−プロテインキナーゼ（抗原Ｂ）に特異的なヒト抗体で免疫した、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋；ｎ＝５）、ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋；ｎ＝１０）からの、第１回および第２回採血試料についての抗体力価を示すものである。図２１は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する機能を果たす分泌ヒトタンパク質（抗原Ｃ）で免疫した、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋；ｎ＝１２）、ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋；ｎ＝１２）からの、第１回および第２回採血試料についての抗体力価を示すものである。図２２は、ヒト受容体チロシンキナーゼ（抗原Ｄ）で免疫した、マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋；ｎ＝１２）からの、第１回および第２回採血試料についての抗体力価を示すものである。

本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されない。かかる方法および条件は変わることがあるからである。本発明の範囲を特許請求の範囲によって定義するので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。

別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべての用語および句は、その用語または句が用いられている文脈から相反することが明確に指摘されるまたは明確に分かる場合を除き、その用語および句が当該技術分野において獲得している意味を含む。本明細書に記載するものに類似したまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、今は特定の方法および材料を記載する。言及するすべての出版物は、参照により本明細書に援用されている。

遺伝子セグメントの量を指すために用いるときの句「実質的な」または「実質的に」（例えば、「実質的にすべての」Ｖ遺伝子セグメント）は、機能的遺伝子セグメントと非機能的遺伝子セグメントの両方を含み、および様々な実施形態において、例えば、すべての遺伝子セグメントの８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上を含む；様々な実施形態において、「実質的にすべての」遺伝子セグメントは、例えば、機能的（すなわち、非偽遺伝子）遺伝子セグメントの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。

用語「置換」は、ゲノム内の配列を該ゲノム配列の遺伝子座において異種配列（例えば、マウスにおけるヒト配列）で置換するようなやり方でＤＮＡ配列を細胞のゲノムに配置する場合のものを含む。そのようにして配置されたＤＮＡは、そのようにして配置された配列を得るために使用した源ＤＮＡの一部である１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域、適切な組換えシグナル配列など）を含み得る。例えば、様々な実施形態において、前記置換は、そのように置かれた（ｐｌａｃｅｄ）ＤＮＡ配列（異種配列を含む）から遺伝子産物の産生をもたらす結果となる、異種配列に代えての内因性配列の置き換えであり、該内因性配列の発現ではない；前記置換は、内因性ゲノム配列の、該内因性ゲノム配列によってコードされているタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列での置換である（例えば、前記内因性ゲノム配列は、免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードしており、前記ＤＮＡ断片は、一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードする）。様々な実施形態において、内因性遺伝子またはその断片は、対応するヒト遺伝子またはその断片で置換される。対応するヒト遺伝子またはその断片は、置換される内因性遺伝子もしくは断片のオルソログである、置換される内因性遺伝子もしくは断片のホモログである、または置換される内因性遺伝子もしくは断片と構造および／もしくは機能の点で実質的に同一もしくは同じである、ヒト遺伝子または断片である。

遺伝モデルとしてのマウスは、トランスジェニックおよびノックアウト技術によって大きく向上され、これらの技術により特定の遺伝子の指向性過発現または欠失の効果の研究が可能になった。あらゆるその利点にもかかわらず、前記マウスは、マウスをヒト疾患についての不完全なモデルにならしめるおよびヒト治療薬を試験するまたはそれらを作製するための不完全なプラットホームにならしめる遺伝的障害をやはり提示する。第一に、ヒト遺伝子の約９９％はマウスホモログを有する（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎら、２００２、Ｉｎｉｔｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅｇｅｎｏｍｅ、Ｎａｔｕｒｅ４２０：５２０−５６２）が、可能性のある治療薬は、多くの場合、所期のヒト標的のマウスオルソログと交叉反応することができない、または不適切に交叉反応する。この問題を未然に防ぐために、選択標的遺伝子を「ヒト化」することができる、すなわち、マウス遺伝子を消去して、対応するオルソロガスヒト遺伝子配列により置換することができる（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号および同第７，１０５，３４８号明細書；これらは参照により本明細書に援用されている）。最初、「ノックアウト・プラス・トランスジェニックヒト化（ｋｎｏｃｋｏｕｔ−ｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」戦略によりマウス遺伝子をヒト化する努力は、前記内因性遺伝子の欠失（すなわち、ノックアウト）を保有するマウスとランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を保有するマウスとの交配を必要とした（例えば、Ｂｒｉｌら、２００６、ＴｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｆａｃｔｏｒＶＩＩＩｉｎａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｈｕｍａｎｆａｃｔｏｒＶＩＩＩｃＤＮＡｃａｒｒｙｉｎｇａｎＡｒｇ（５９３）ｔｏＣｙｓｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ９５：３４１−３４７；Ｈｏｍａｎｉｃｓら、２００６、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅ
ｍｏｄｅｌｓｏｆｃｌａｓｓｉｃａｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｍａｐｌｅｓｙｒｕｐｕｒｉｎｅｄｉｓｅａｓｅ、ＢＭＣＭｅｄＧｅｎｅｔ７：３３；Ｊａｍｓａｉら、２００６、ＡｈｕｍａｎｉｚｅｄＢＡＣｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ／ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｆｏｒＨｂＥ／ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８８（３）：３０９−１５；Ｐａｎら、２００６、ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｒｏｌｅｆｏｒｍｏｕｓｅａｎｄｈｕｍａｎＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｎｐｒｅＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐｒｅＴＣＲ）ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｈｕｍａｎＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｒｅｓｔｏｒｅｓｔｈｅｄｅｆｅｃｔｉｖｅｐｒｅＴＣＲｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎＣＤ３ｇａｍｍａ− ａｎｄＣＤ３ｇａｍｍａｄｅｌｔａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ、ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ４３：１７４１−１７５０参照）。しかし、これらの努力は、サイズ制限によって妨げられた；従来のノックアウト技術は、大きなマウス遺伝子を該遺伝子の大きなヒトゲノムカウンターパートで直接置換するのに十分なものではなかった。該マウス遺伝子の同じまさにその遺伝子の場所で（すなわち内因性マウス遺伝子座で）ヒトカウンターパート遺伝子により内因性マウス遺伝子を直接置換する直接相同置換の直接的なアプローチは、技術的な難しさのため、滅多に試みられない。今まで、直接置換に対する努力は手の込んだ厄介な手順を必要とし、それ故、取り扱うことができる遺伝子材料の長さおよび操作することができる精度が限定された。

外因的に導入されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、マウスの前駆体Ｂ細胞内で再構成する（Ａｌｔら、１９８５、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｇｅｎｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅ、ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ１：２３１−２３６）。この発見は、ヒト抗体を発現させるためにノックアウト・プラス・トランスジェニックアプローチを用いるマウスの工学的作製に活用された（Ｇｒｅｅｎら、１９９４、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍｍｉｃｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｗｉｔｈｈｕｍａｎＩｇｈｅａｖｙａｎｄｌｉｇｈｔｃｈａｉｎＹＡＣｓ、ＮａｔＧｅｎｅｔ７：１３−２１；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍｍｉｃｅｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇｆｏｕｒｄｉｓｔｉｎｃｔｇｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６−８５９；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７、ＦｒｏｍＸｅｎｏＭｏｕｓｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，ｔｈｅｆｉｒｓｔｆｕｌｌｙｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅ、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２５：１１３４−１１４３）。マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、これらのマウスにおいて、各内因性遺伝子座の小さいが重大な部分の標的欠失、続いて、上に記載したようなランダムに組み込まれた大きな導入遺伝子としての、またはミニ染色体としてのヒト免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活性化された（Ｔｏｍｉｚｕｋａら、２０００、Ｄｏｕｂｌｅｔｒａｎｓ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃｍｉｃｅ：ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｔｗｏｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｈｕｍａｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＩｇｈｅａｖｙａｎｄｋａｐｐａｌｏｃｉａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｕｌｌｙｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＰＮＡＳＵＳＡ９７：７２２−７２７）。かかるマウスは、遺伝子工学の重要な前進を象徴した；それらから単離された完全ヒトモノクローナル抗体は、様々なヒト疾患の処置に有望な治療的可能性をもたらした（Ｇｉｂｓｏｎら、２００６、ＲａｎｄｏｍｉｚｅｄｐｈａｓｅＩＩＩｔｒｉａｌｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ａｆｕｌｌｙｈｕｍａｎａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ、ＣｌｉｎＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＣａｎｃｅｒ６：２９−３１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７；Ｋｉｍら、２００７、Ｃｌｉｎｉｃａｌｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ４）：ｔｗｏＰｈａｓｅＩＩｓｔｕｄｉｅｓｉｎｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｃｕｔａｎｅｏｕｓＴ−ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｂｌｏｏｄ１０９（１１）：４６５５−６２；Ｌｏｎｂｅｒｇ、２００５、Ｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｎｉｍａｌｓ、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２３：１１１７−１１２５；Ｍａｋｅｒら、２００５、Ｔｕｍｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ４ｂｌｏｃｋａｄｅａｎｄｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２：ａｐｈａｓｅＩ／ＩＩｓｔｕｄｙ、ＡｎｎＳｕｒｇＯｎｃｏｌ１２：１００５−１０１６；ＭｃＣｌｕｎｇら、２００６、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂｉｎｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌｗｏｍｅｎｗｉｔｈｌｏｗｂｏｎｅｍｉｎｅｒａｌｄｅｎｓｉｔｙ、ＮｅｗＥｎｇｌＪＭｅｄ３５４：８２１−８３１）。しかし、上で論じたように、これらのマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたＢ細胞発生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する。前記不全は、（１）ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素の欠如に起因する結果としての不正確な発現（Ｇａｒｒｅｔｔら、２００５、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｎｅａｒａｐｏｔｅｎｔｉａｌ３’ｅｎｄｏｆｔｈｅ
ＩｇＨｌｏｃｕｓｉｎｖｏｌｖｅｓｍｏｄｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔｏｎｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｄｕｒｉｎｇＢ−ＣｅｌｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｉｎｖｉｖｏｏｃｃｕｐａｎｃｙａｔＣＴＣＦｓｉｔｅｓ、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２５：１５１１−１５２５；Ｍａｎｉｓら、２００３、Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆａｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｂｏｕｎｄａｒｙｏｆｔｈｅ３’ＩｇＨｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｅｇｉｏｎ、ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ３９：７５３−７６０；Ｐａｗｌｉｔｚｋｙら、２００６、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｃａｎｄｉｄａｔｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｗｉｔｈｉｎｔｈｅ５’ｆｌａｎｋｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅＩｇＨｌｏｃｕｓｄｅｆｉｎｅｄｂｙｐｒｏ−Ｂｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｂｉｎｄｉｎｇｏｆＰＵ．１，Ｐａｘ５，ａｎｄＥ２Ａ、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７６：６８３９−６８５１）；（２）Ｂ細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面のＢ細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の非効率的種間相互作用（Ｈｏｍｂａｃｈら、１９９０、ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅＢ−ｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏｍｐｌｅｘｏｆｔｈｅＩｇＭｃｌａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ３４３：７６０−７６２）；および（３）親和性選択（Ｒａｏら、２００２、ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙＩｇＧＦｃｒｅｃｅｐｔｏｒＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢｏｎｇｅｒｍｉｎａｌｃｅｎｔｅｒｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙＢｃｅｌｌｓ、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１６９：１８５９−１８６８）および免疫グロブリン血清濃度（Ｂｒａｍｂｅｌｌら、１９６４、ＡＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＭｏｄｅｌｏｆＧａｍｍａ−ＧｌｏｂｕｌｉｎＣａｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｎａｔｕｒｅ２０３：１３５２−１３５４；ＪｕｎｇｈａｎｓａｎｄＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９６、Ｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒ
ＩｇＧｃａｔａｂｏｌｉｓｍｉｓｔｈｅｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｎｅｏｎａｔａｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｎｓｐｏｒｔｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＰＮＡＳＵＳＡ９３：５５１２−５５１６；Ｒａｏら、２００２；Ｈｊｅｌｍら、２００６、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＳｃａｎｄＪＩｍｍｕｎｏｌ６４：１７７−１８４；ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎａｎｄＲａｖｅｔｃｈ、２００７、Ｆｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆｉｍｍｕｎｉｔｙ、ＡｄｖＩｍｍｕｎｏｌ９６：１７９−２０４）を低減させ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスＦｃ受容体の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不全は、内因性重および軽鎖遺伝子座におけるその天然の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域のみのｉｎｓｉｔｕヒト化によって修正することができる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメラ」（すなわち、ヒトＶ：マウスＣ）抗体を作製するマウスを有効に生じさせる結果となるであろう。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療のために完全ヒト抗体に容易に再配列することができる。

内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における置換と共に、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子（例えば、キメラ免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子もしくは完全ヒト完全マウスなど）と共に、前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における異種（例えば、別の種からの）免疫グロブリン配列による置換を含む遺伝子改変動物を作製することができる。前記異種免疫グロブリン重鎖配列が由来する種は多種多様であり得、免疫グロブリン軽鎖配列置換に利用される免疫グロブリン軽鎖配列、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子に関しても多種多様であり得る。

様々な実施形態において、免疫グロブリン可変領域核酸配列、例えば、Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントは、ヒトまたは非ヒト動物から得られる。Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントの供給に好適な非ヒト動物としては、例えば、硬骨魚、軟骨魚、例えばサメおよびエイ、両生類、爬虫類、哺乳類、鳥類（例えば、ニワトリ）が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ラクダ、フェレットおよび齧歯動物および非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、マーモセット、アカゲザル、ヒヒ）が挙げられる。好適な非ヒト動物は、ラット、マウスおよびハムスターを含む齧歯動物のファミリーから選択される。１つの実施形態において、前記非ヒト動物はマウスである。この文脈から明白であるように、様々な非ヒト動物（例えば、サメ、エイ、哺乳類（例えば、ラクダ、齧歯動物、例えばマウスおよびラット））を可変ドメインまたは可変領域遺伝子セグメントの源として使用することができる。

前記文脈によると、非ヒト動物は、可変配列またはセグメントと併用される定常領域配列の源としても使用される。例えば、ヒトまたは非ヒト可変配列に作動可能に連結される導入遺伝子（例えば、齧歯動物、例えばマウスもしくはラットもしくはハムスター、定常配列に作動可能に連結されたヒトまたは非ヒト霊長類可変配列）において齧歯動物定常配列を使用することができる。したがって、様々な実施形態において、ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪセグメントを齧歯動物（例えば、マウスまたはラットまたはハムスター）定常領域遺伝子配列に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、前記ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪセグメント（または１つ以上の再構成ＶＤＪもしくはＶＪ遺伝子）を、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座に組み込まれる導入遺伝子におけるマウス、ラットまたはハムスター定常領域遺伝子配列に作動可能に連結または融合させる。

特定の実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈセグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈセグメントでの置換を含み、該１つ以上のヒトＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈセグメントが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子に作動可能に連結されているものであるマウスを提供し、この場合のマウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、マウスまたはラットまたはヒト定常領域に作動可能に連結された非再構成または再構成ヒトＶ_ＬおよびヒトＪ_Ｌセグメントを含む。

子孫を産生するマウスの能力を維持しながら、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座でマウス生殖細胞系免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座を大規模にｉｎｓｉｔｕ遺伝子置換するための方法を記載する。具体的には、前記マウス定常領域をインタクトで残しながら、６メガ塩基のマウス重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座両方を該遺伝子のヒトカウンターパートでの正確に置換することを記載する。結果として、マウス定常領域を維持しながら、マウスの生殖細胞系免疫グロブリン可変レパートリーすべてが等価のヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変配列で正確に置換されたマウスを生み出した。前記ヒト可変領域をマウス定常領域に連結させて、再構成して生理的に適切なレベルで発現するキメラヒト−マウス免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現する抗体は、「逆キメラ」である。すなわち、それらはヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するヒト化免疫グロブリン可変領域を有するこれらのマウスは、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと呼ばれる。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、野生型マウスのものと本質的に区別できない完全機能的体液性免疫系を示す。前記ヒト化マウスは、Ｂ細胞発生の全ての段階で正常な細胞集団を提示する。前記ヒト化マウスは、正常なリンパ器官形態を示す。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの抗体配列は、正常なＶ（Ｄ）Ｊ再構成および正常な体細胞超変異頻度を示す。これらのマウスにおける抗体集団は、正常なクラススイッチ（例えば、正常なアイソタイプシススイッチ）の結果として生ずるアイソタイプ分布を表わす。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを免疫することにより、治療候補としての使用に好適なヒト免疫グロブリン可変ドメインを有する大量の多様な抗体レパートリーを産生する頑強な体液性免疫応答が得られる。このプラットホームは、薬学的に許容され得る抗体および他の抗原結合タンパク質を作製するための豊富な自然親和性成熟ヒト免疫グロブリン可変領域配列源を提供する。

マウス免疫グロブリン可変配列の、ヒト免疫グロブリン可変配列での正確な置換により、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを作製することができる。とはいえ、非常に大きな長さのヒト免疫グロブリン配列の逐次的リコンビニアリング（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）による、重および軽鎖遺伝子座における内因性マウス免疫グロブリン配列の、等価ヒト免疫グロブリン配列での正確の置換は、マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の分岐進化のため、一定の課題を提起し得る。例えば、免疫グロブリン遺伝子座内に散在する遺伝子間配列は、マウスとヒトの間で同一ではなく、一部の状況では、機能的に等価でないこともある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座におけるその相違は、特に内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一定の部分をヒト化または操作するとき、やはりヒト化マウスに異常を生じさせる結果となる場合がある。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座における一部の改変は有害である。有害な改変としては、例えば、改変されたマウスの交配および子孫産生能力の喪失を挙げることができる。
すべてのマウス定常鎖遺伝子および遺伝子座転写制御領域を含むハイブリッド遺伝子座内の隣接マウス配列をインタクトなままおよび機能的なまま、マウス重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座（Ｖ_Ｈ−Ｄ_Ｈ−Ｊ_ＨおよびＶκ−Ｊκ）の６メガ塩基可変領域の、対応する１．４メガ塩基ヒトゲノム配列での正確な大規模ｉｎｓｉｔｕ置換を行った（図１Ａおよび図１Ｂ）。具体的には、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号明細書およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅ
ｇｅｎｏｍｅｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２１：６５２−６５９参照）を用いて、ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、Ｊ_Ｈ、ＶκおよびＪκ遺伝子配列を、ヒト生殖細胞系可変遺伝子座のオーバーラップ断片を担持する１３のキメラＢＡＣターゲティングベクターの段階的挿入により、マウスＥＳ細胞に導入した。

マウス免疫グロブリン遺伝子のヒト化は、今日までのマウスゲノムへの最大の遺伝子改変を代表する。ランダムに組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子での以前の努力は、（上で論じた）ある程度の成果を上げたが、前記マウス免疫グロブリン遺伝子の、該遺伝子のヒトカウンターパートでの直接置換は、ほかの点では正常なマウスにおいて完全ヒト抗体を効率的に産生することができる効率を劇的に増加させる。さらに、かかるマウスは、無能化された内因性遺伝子座および完全ヒト抗体導入遺伝子を保有するマウスと比較して、実質的に任意の抗原での免疫後に得ることができる完全ヒト抗体の多様性の劇的増大を示す。様々な分化段階で有意に低減されたＢ細胞集団を示すランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を有するマウスとは対照的に、置換されヒト化された遺伝子座の多彩なバージョンが完全に正常な成熟および未熟Ｂ細胞レベルを示す。ヒト遺伝子導入マウスにおけるヒト遺伝子セグメント数を増加させる努力は、かかる欠陥を低減させたが、拡張されたそれらの免疫グロブリンレパートリーは、野生型マウスと比較してＢ細胞集団の低減を全部は修正しなかった。

免疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウス（すなわち、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス）において観察される野生型に近い体液性免疫機能にもかかわらず、ランダムに組み込まれた導入遺伝子を利用する一部のアプローチでは遭遇しない、免疫グロブリンの直接置換を利用すると遭遇する他の課題がある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子組成の相違は、免疫グロブリン遺伝子セグメントが置換されたマウスの繁殖にとって有益な配列の発見をもたらした。具体的には、前記内因性免疫グロブリン遺伝子座内にあるマウスＡＤＡＭ遺伝子は、妊性におけるその役割のため、免疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウスに最適に存在する。

マウスＡＤＡＭ６のゲノムの場所および機能
いずれかの機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力が無い雄マウスは、驚くべきことに、交配して子孫を産生する該マウスの能力の欠陥を示す。これらのマウスには、すべてのまたは実質的にすべてのマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントをヒト可変領域遺伝子セグメントで置換することによって機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力が無い。ＡＤＡＭ６遺伝子座が、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントの上流にあるＶ_Ｈ遺伝子セグメント遺伝子座の３’端の近位の、前記内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座の領域内にあるため、このＡＤＡＭ６機能の喪失が生ずる結果となる。すべてのまたは実質的にすべての内因性マウス重鎖可変遺伝子セグメントの、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントでの置換に関してホモ接合性であるマウスを交配させるために、それぞれが該置換に関してホモ接合性であり、生産的交配を待つ雄と雌を供給することは、一般に厄介なアプローチである。好結果の同腹子は、頻度が低く、サイズが小さい。その代り、前記置換に関してヘテロ接合性の雄を用いて、前記置換に関してホモ接合性の雌と交配させて、前記置換に対してヘテロ接合性の後代を産生し、その後、それらからホモ接合型マウスを繁殖させた。前記雄マウスの妊性の喪失についての可能性のある原因は、ホモ接合型雄マウスにおける機能的ＡＤＡＭ６タンパク質の不在であると本発明者らは決定した。

様々な態様において、損傷した（すなわち、非機能的またはわずかに機能的な）ＡＤＡＭ６遺伝子を含む雄マウスは、妊性の低減または消去を示す。マウス（および他の齧歯動物）ではＡＤＡＭ６遺伝子が免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあるため、本発明者らは、置換された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを繁殖させるために、または該マウスの系統を作り、維持するために、様々な改変交配または繁殖スキームを利用することを決定した。内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の置換に関してホモ接合性の雄マウスの低い妊性または不妊性は、マウス系統のかかる改変の維持を困難にする。様々な実施形態において、前記系統の維持は、前記置換に関してホモ接合性の雄マウスによって示される不妊問題の回避を含む。

１つの態様では、本明細書に記載のマウスの系統を維持するための方法を提供する。マウスの前記系統は、異所性ＡＤＡＭ６配列を含む必要がなく、様々な実施形態において、マウスの前記系統は、ＡＤＡＭ６のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト）に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。

前記マウス系統は、雄マウスにおいて妊性の低減または喪失を生じさせる結果となる内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む。１つの実施形態において、前記改変は、ＡＤＡＭ６遺伝子の調節領域および／またはコーディング領域の欠失を含む。特定の実施形態において、前記改変は、その改変を含む雄マウスの妊性を低減させるまたは消去する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子（調節領域および／またはコーディング領域）の改変を含む；特定の実施形態において、前記改変は、その改変に関してホモ接合性である雄マウスの妊性を低減させるまたは消去する。

１つの実施形態において、前記マウス系統は、ＡＤＡＭ６遺伝子のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト）または欠失に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。

１つの実施形態では、前記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから細胞を単離すること、および宿主胚において前記ドナー細胞を用いること、および代理母において前記宿主胚およびドナー細胞を妊娠させること、および前記遺伝子改変を含む後代を前記代理母から得ることによって、前記マウス系統を維持する。１つの実施形態において、前記ドナー細胞は、ＥＳ細胞である。１つの実施形態において、前記ドナー細胞は、多能性細胞、例えば導入多能性細胞である。

１つの実施形態では、前記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから、前記改変を含む核酸配列を単離すること、および前記核酸配列を宿主核に導入すること、および好適な動物において前記核酸配列および前記宿主核を含む細胞を妊娠させることによって、前記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、前記核酸配列を宿主卵母細胞の胚に導入する。

１つの実施形態では、前記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから核を単離すること、および前記核を宿主細胞に導入すること、および好適な動物において前記核および宿主細胞を妊娠させて、前記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である後代を得ることによって、前記マウス系統を維持する。

１つの実施形態では、前記遺伝子改変を含む雄マウスからの精液を用いる、雌マウス（野生型、前記改変に関してホモ接合性、または前記改変に関してヘテロ接合性）のｉｎｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を用いることによって、前記マウス系統を維持する。１つの実施形態において、前記雄マウスは、前記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である。１つの実施形態において、前記雄マウスは、前記遺伝子改変に関してホモ接合性である。

１つの実施形態では、前記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄マウスを雌マウスと交配させて、前記遺伝子改変を含む後代を得ること、前記遺伝子改変を含む雄および雌後代を同定すること、および前記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄を、野生型である、前記遺伝子改変に関してホモ接合性であるまたはヘテロ接合性である雌との交配に用いて、前記遺伝子改変を含む後代を得ることによって、前記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、前記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雄と、野生型雌、前記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雌、または前記遺伝子改変に関してホモ接合性の雌とを交配させる工程を繰り返して、前記マウス系統での前記遺伝子改変を維持する。

１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖配列での置換を含むマウス系統を維持するための方法であって、前記マウス系統を交配させて、ヘテロ接合型雄マウスを産生する工程を含み、前記ヘテロ接合性雄マウスを交配させて、前記系統において前記遺伝子改変を維持する方法を提供する。特定の実施形態において、前記系統は、ホモ接合性雄と野生型雌、または前記遺伝子改変に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性の雌とのいずれの交配によっても維持されない。

前記ＡＤＡＭ６タンパク質は、タンパク質のＡＤＡＭファミリーのメンバーであり、ＡＤＡＭは、ＡＤｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎＡｎｄＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）の頭文字である。タンパク質のＡＤＡＭファミリーは、大きく、多様であり、細胞接着をはじめとする多様な機能を有する。ＡＤＡＭファミリーの一部のメンバーは、精子形成および受精に関与する。例えば、ＡＤＡＭ２は、精子−卵子相互作用に関与するタンパク質ファーティリンのサブユニットをコードする。ＡＤＡＭ３、すなわちシリテスティンは、透明帯への精子の結合に必要であるようである。ＡＤＡＭ２またはＡＤＡＭ３いずれかの不在は不妊性を生じさせる結果となる。ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３およびＡＤＡＭ６は、マウス精子細胞の表面で複合体を形成すると仮定されている。ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントＶ_Ｈ１−２とＶ_Ｈ６−１の間で通常見出されるヒトＡＤＡＭ６遺伝子は、偽遺伝子であるようである（図１２）。マウスには２つのＡＤＡＭ６遺伝子−ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ−があり、これらは、マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントとＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域において見つけられ、前記マウスにおいて、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子およびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子は、周囲の免疫グロブリン遺伝子セグメントのものとは反対の転写配向に配向する（図１２）。マウスの場合、正常な受精には機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座が明らかに要求される。そこで、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が欠けているまたは非機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する雄マウスにおいて示される受精の徹底的低減を補うまたはレスキューすることができる、ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を指す。

ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードする、マウスにおける前記遺伝子間配列の位置が、内因性マウス重鎖を改変するとき該遺伝子間配列に改変を受けやすくさせる。Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、またはＤ_Ｈ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、結果として得られるマウスは重度の妊性欠損を示す確率が高い。この欠損を補償するために、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の改変に起因するＡＤＡＭ６活性の喪失を補うタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むようにマウスを改変する。様々な実施形態において、補足性ヌクレオチド配列は、妊性欠損をレスキューするマウスＡＤＡＭ６ａ、マウスＡＤＡＭ６ｂ、またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードするものである。

妊性をレスキューする前記ヌクレオチド配列を任意の好適な位置に配置することができる。前記配列を前記遺伝子間領域に配置することができ、またはゲノム内の任意の好適な位置に（すなわち、異所的に）配置することができる。１つの実施形態では、前記ヌクレオチド配列を、マウスゲノムにランダムに組み込む導入遺伝子に導入することができる。１つの実施形態では、前記配列をエピソームで、すなわちマウス染色体上ではなく別々の核酸上で、維持することができる。好適な位置としては、転写許容性または活性である位置、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、１９９７、ＰＮＡＳＵＳＡ９４：３７８９−３７９４）、ＢＴ−５遺伝子座（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９９、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８５：３５−４７）またはＯｃｔ４遺伝子座（Ｗａｌｌａｃｅら、２０００、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：１４５５−１４６４）が挙げられる。転写活性遺伝子座へのヌクレオチド配列のターゲティングは、例えば米国特許第７，４７３，５５７号明細書に記載されており、この参考文献は参照により本明細書に援用されている。

あるいは、妊性をレスキューする前記ヌクレオチド配列を誘導性プロモーターとカップリングさせて、適切な細胞および／または組織、例えば生殖組織、での最適な発現を促進することができる。例示的誘導性プロモーターとしては、物理的手段によって活性化されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および／または化学的手段によって活性化されるプロモーター（例えば、ＩＰＴＧもしくはテトラサイクリン）が挙げられる。

さらに、前記ヌクレオチド配列の発現を他の遺伝子に関連づけて、特定の発生段階または特定の組織内での発現を実現することができる。かかる発現は、前記ヌクレオチド配列を、特定の発生段階で発現する遺伝子のプロモーターと作動可能に連結させることによって実現することができる。例えば、宿主種のゲノムへと工学的に作製された１つの種からの免疫グロブリン配列を、その宿主種からのＣＤ１９遺伝子（Ｂ細胞特異的遺伝子）のプロモーター配列と作動可能に連結させる。免疫グロブリンが発現する正確な発生段階でのＢ細胞特異的発現が実現される。

挿入されたヌクレオチド配列の頑強な発現を実現するためのさらにもう１つの方法は、構成的プロモーターの利用である。例示的構成的プロモーターとしては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫおよびＣＡＧＧが挙げられる。同様に、所望のヌクレオチド配列を選択された構成的プロモーターと作動可能に連結させ、それにより、該ヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質（単数または複数）の高い発現レベルが得られる。

用語「異所性」は、自然界で通常は遭遇しない位置への転位または配置（例えば、核酸配列の、該核酸配列が野生型マウスにおいて見出されるのと同じ位置でない位置への配置）を含むことを意図したものである。様々な実施形態において、この用語は、その対象がその正常なまたは正しい位置外にあるという意味で用いられる。例えば、「．．．をコードする異所性ヌクレオチド配列」という句は、マウスでは通常遭遇しない位置に出現するヌクレオチド配列を指す。例えば、マウスＡＤＡＭ６タンパク質（または雄マウスに対して同じまたは同様の妊性の恩恵をもたらすそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）をコードする異所性ヌクレオチド配列の場合、該配列は、野生型マウスにおいて通常見出される位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に配置されることがある。かかる場合、野生型マウスにおける位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に前記配列を配置することにより、マウス配列の新規配列接合部を生み出すこととなる。マウスＡＤＡＭ６の機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６^−／−マウスにおいて観察される妊性喪失（例えば、交配により子孫を産生する雄マウスの能力の喪失）のレスキューをもたらす配列である。機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６ａのアミノ酸配列に対しておよび／またはＡＤＡＭ６ｂのアミノ酸配列に対して少なくとも約８９％以上の同一性、例えば９９％以下の同一性を有するタンパク質、ならびにＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂの欠失またはノックアウトを含む遺伝子型を有するマウスの首尾よく交配する能力を補うまたはレスキューすることができるタンパク質を含む。

前記異所位置は、（例えば、マウスＡＤＡＭ６配列を含有する導入遺伝子のランダム挿入の場合のように）どこでもよく、または例えば、野生型マウスにおける（例えば、改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座内だがその天然の位置の上流または下流のいずれか、例えば、改変免疫グロブリン遺伝子座内だが、異なる遺伝子セグメント間、またはマウスＶ−Ｄ遺伝子間配列内の異なる位置における）その場所に近い（しかし、正確に同じではない）位置であってもよい。異所性配置の一例は、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座内への配置である。例えば、１つ以上の内因性Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントの、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換であって、内因性ＡＤＡＭ６配列を除去する置換を含むマウスを、マウスＡＤＡＭ６配列がヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含有する配列内に配置されるように工学的に作製することができる。結果として得られる改変は、ヒト遺伝子配列内に（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列を生じさせることとなり、このヒト遺伝子配列内へのマウスＡＤＡＭ６配列の（異所性）配置は、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の位置（すなわち、２つのＶセグメント間）に近い場合もあり、またはマウスＡＤＡＭ６配列の位置（すなわち、Ｖ−Ｄ遺伝子間領域内）に近い場合もある。マウスの生殖細胞系内のヒト遺伝子配列（例えば、免疫グロブリン遺伝子配列）内にまたは該ヒト遺伝子配列に隣接した（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列の接合により作られる、結果として生ずる配列接合部は、野生型マウスのゲノム内の同じまたは同様の位置と比較して新しいものになる。

様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログが無い非ヒト動物を提供し、この欠如が該非ヒト動物を不妊性にするか、該非ヒト動物の妊性を実質的に低減させる。様々な実施形態において、前記ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログ欠如は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因する。妊性の実質的低減は、例えば、妊性（例えば、交配頻度、同腹子あたりの子、１年あたりの同腹子、など）の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％またはそれより多くの低減である。様々な実施形態では、非ヒト動物の雄において機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を前記非ヒト動物に補充し、この補充されたＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片により、妊性低減の全部または実質的部分がレスキューされる。妊性の実質的部分のレスキューは、例えば、前記非ヒト動物が、非改変（すなわち、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログへの改変を有さない動物）重鎖遺伝子座と比較して少なくとも７０％、８０％または９０％またはそれより多い妊性を示すような妊性の回復である。

様々な実施形態において、前記遺伝子改変動物（すなわち、例えば免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因して、機能的ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログが無い動物）に付与する配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログから選択される。例えば、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、１つの実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子の付加によってレスキューされる。１つの実施形態において、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、マウス、例えば齧歯動物、に対して近縁の種、例えば、異なる系統または種のマウス、任意の種のラット、齧歯動物、のオルソログまたはホモログを付加することによってレスキューされ、この場合、前記マウスのオルソログまたはホモログの付加により、ＡＤＡＭ６機能の喪失またはＡＤＡＭ６遺伝子の喪失に起因する妊性の喪失がレスキューされる。他の種からのオルソログおよびホモログは、様々な実施形態において系統発生的に関連した種から選択され、および様々な実施形態において、約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上または９７％以上である内因性ＡＤＡＭ６（またはオルソログ）との同一性パーセントを示し、およびＡＤＡＭ６に関連したまたは（非マウスの場合は）ＡＤＡＭ６オルソログに関連した妊性喪失をレスキューする。例えば、ＡＤＡＭ６機能が無い遺伝子改変雄ラット（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域で置換された内因性免疫グロブリン重鎖可変領域を有するラット、またはラット免疫グロブリン重鎖領域のノックアウトを有するラット）の場合、そのラットの妊性の喪失は、ラットＡＤＡＭ６の付加によって、または一部の実施形態ではラットＡＤＡＭ６のオルソログ（例えば、別のラット系統もしくは種からの、または１つの実施形態ではマウスからの、ＡＤＡＭ６オルソログ）の付加によってレスキューされる。

このように、様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログ）をコードする核酸配列、または該核酸配列と作動可能に連結された調節領域の改変に起因して妊性を示さないまたは妊性の低減を示す遺伝子改変動物は、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列を含み、この場合、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列は、同じ種の異なる系統からのものであるか、系統発生的に類縁の種からのものである。様々な実施形態において、前記補足性核酸配列は、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片である。様々な実施形態において、前記補足性ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、妊性の欠陥を有する遺伝子改変動物に近縁である非ヒト動物からのものである。例えば、前記遺伝子改変動物が特定の系統のマウスである場合、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片を、別の系統のマウスから得ることができ、類縁種のマウスから得ることができる。１つの実施形態において、前記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物が齧歯目（ｏｒｄｅｒＲｏｄｅｎｔｉａ）のものである場合、前記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の別の動物からのものである。１つの実施形態において、前記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物は、ネズミ亜目（ｓｕｂｏｒｄｅｒＭｙｏｍｏｒｏｐｈａ）（例えば、トビネズミ（ｊｅｒｂｏａｓ）、ジャンピングマウス（ｊｕｍｐｉｎｇｍｉｃｅ）、カンガルーハムスター、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ、純種のマウスおよびラット（ｔｒｕｅｍｉｃｅａｎｄｒａｔ）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ、キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス、トゲヤマネ、デバネズミ、タケネズミ、モグラネズミ）のものであり、前記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の動物、またはネズミ亜目の動物から選択される。

１つの実施形態において、前記遺伝子改変動物は、トビネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＤｉｐｏｄｏｉｄｅａ）からのものであり、前記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＭｕｒｏｉｄｅａ）からのものである。１つの実施形態において、前記遺伝子改変動物は、ネズミ上科からのものであり、前記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、トビネズミ上科からのものである。

１つの実施形態において、前記遺伝子改変動物は齧歯動物である。１つの実施形態において、前記齧歯動物は、ネズミ上科から選択され、前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科内の異なる種からのものである。１つの実施形態において、前記遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ）（例えば、カンガルーハムスター）、キヌゲネズミ科（Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ）（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ）およびメクラネズミ科（例えば、デバネズミ、タケネズミおよびモグラネズミ）から選択される科からのものであり；および前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、同じ科の異なる種から選択される。特定の実施形態において、前記遺伝子改変齧歯動物は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）から選択され、前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、アレチネズミ、トゲマウス、またはタテガミネズミから選択される種からのものである。１つの実施形態において、前記遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメンバーからのものであり、および前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ科の異なる種からのものである。特定の実施形態において、前記遺伝子改変齧歯動物は、ネズミ科のマウスであり、および前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ科のラット、アレチネズミ、トゲマウスまたはタテガミネズミからのものである。

様々な実施形態において、１つの科の中の齧歯動物の１つ以上の齧歯動物ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログが無い同じ科（例えば、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）；ネズミ科（例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ））の遺伝子改変齧歯動物に妊性を回復させる。

様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６オルソログ、ホモログおよびその断片を、該オルソログ、ホモログまたは断片が、ＡＤＡＭ６活性が無い遺伝子改変雄非ヒト動物（例えば、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログのノックアウトを含む齧歯動物、例えばマウスまたはラット）に妊性を回復させるかどうか確認することにより、機能性について評価する。様々な実施形態において、機能性は、内因性ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログが無い遺伝子改変動物の精子の、遺伝子改変動物の同じ種の卵管を移動して卵子を受精させる能力と定義される。

様々な態様において、マウスＡＤＡＭ６（例えば、雄マウスにおいて機能的であるそのオルソログまたはホモログまたは断片）に同様の妊性の恩恵をもたらすタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列を含有する、内因性重鎖可変領域遺伝子座またはその部分の欠失または置換を含むマウスを作製することができる。前記異所性ヌクレオチド配列としては、異なるマウス系統または異なる種、例えば異なる齧歯動物種、のＡＤＡＭ６ホモログまたはオルソログ（またはその断片）であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、妊性の恩恵、例えば、指定された期間にわたっての同腹子数の増加、および／または同腹子あたりの子の数の増加、および／またはマウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させる雄マウスの精子細胞の能力、を付与するヌクレオチド配列が挙げられる。

１つの実施形態において、前記ＡＤＡＭ６は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質と少なくとも８９％から９９％同一である（例えば、マウスＡＤＡＭ６ａまたはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％から９９％同一である）ホモログまたはオルソログである。１つの実施形態において、前記異所性ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ａと少なくとも８９％同一のタンパク質、マウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％同一のタンパク質、およびその組み合わせから独立して選択される１つ以上のタンパク質をコードする。１つの実施形態において、前記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるまたはマウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと約８９％以上同一であるように改変されているラット、ハムスター、マウス、またはモルモットタンパク質である。１つの実施形態において、前記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるか、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。

ヒト化重鎖マウスにおける異所性ＡＤＡＭ６
遺伝子ターゲティングの進展、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）の開発により、今や、比較的大きいゲノム断片の組換えが可能である。ＢＡＣ工学は、マウスＥＳ細胞に大きな欠失および大きな挿入を施すことをできるようにした。

ヒト抗体を作るマウスは、ここしばらくの間に利用可能になった。これらのマウスは、ヒト治療用抗体の開発の重要な前進の代表であるが、その有用性を制限する多数の重大な異常を提示する。例えば、これらのマウスは、損なわれたＢ細胞発生を提示する。この損なわれた発生は、トランスジェニックマウスと野生型マウスの間の様々な相違に起因し得る。

ヒト抗体は、成熟、増殖、またはクローン選択中の生存についてのシグナルを伝達するマウス細胞の表面のマウスプレＢ細胞受容体またはＢ細部受容体と最適に相互作用しない可能性がある。完全ヒト抗体は、マウスＦｃ受容体系と最適に相互作用しない可能性があるし、マウスは、ヒトＦｃ受容体との１対１の対応を提示しないＦｃ受容体を発現する。結局、完全ヒト抗体を作る様々なマウスは、野生型Ｂ細胞発生に要求され得るすべての真正マウス配列を含まない、例えば、下流エンハンサー要素および他の遺伝子座制御要素を含まない。

完全ヒト抗体を作製するマウスは、何らかの形で無能化されている内因性免疫グロブリン遺伝子座を一般に含み、可変および定常免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むヒト導入遺伝子が、そのマウスゲノム内のランダムな場所に導入される。内因性遺伝子座が、機能的免疫グロブリン遺伝子を形成するように遺伝子セグメントを再構成できないほど無能化されている限り、たとえＢ細胞発生が損なわれていたとしても、かかるマウスにおいて完全ヒト抗体を作製するという目的を達成することができる。

ヒト導入遺伝子遺伝子座から完全ヒト抗体を作製せざるを得ないのだが、マウスにおけるヒト抗体の産生は、好ましくない過程であるようである。一部のマウスでは、この過程は、トランススイッチの機序によりキメラヒト可変／マウス定常重鎖（軽鎖ではなく）が形成される結果をもたらすには好ましいものではない。この機序により、完全ヒト抗体をコードする転写産物は、ヒトアイソタイプからマウスアイソタイプへとトランスでアイソタイプスイッチされる。完全ヒト導入遺伝子は、マウス重鎖定常領域遺伝子の非損傷コピーを保持する内因性遺伝子座から離れた場所にあるため、この過程はトランスでの過程となる。かかるマウスではトランススイッチが容易に分かるが、この現象はＢ細胞発生のレスキューにやはり不十分であり、Ｂ細胞発生は明らかに害されたままである。いずれにせよ、トランススイッチ現象は軽鎖に関して起こらないので、かかるマウスにおいてトランススイッチされた抗体は、完全ヒト軽鎖を保持する；おそらく、トランススイッチは、シスでの正常なアイソタイプスイッチに（それとは異なるにせよ）用いられる内因性遺伝子座におけるスイッチ配列に依存する。したがって、完全ヒト抗体を作製するように工学的に作製されたマウスが、マウス定常領域を有する抗体を作製するためにトランススイッチ機序を選択する場合であっても、その戦略は、正常Ｂ細胞発生のレスキューにやはり不十分である。

抗体ベースのヒト治療薬の作製における主な関心事は、特定のエピトープを特異的に認識し、望ましい親和性で、通常は−常にではないが−高い親和性で、そのエピトープを結合する有用な可変ドメインを同定するために十分多様なヒト免疫グロブリン可変領域配列を作製することである。（本明細書に記載する）ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの開発前は、マウス定常領域と共にヒト可変領域を発現するマウスが、導入遺伝子からヒト抗体を作製するマウスとの何らかの有意差を示すことになるという指摘はなかった。しかし、その仮定は間違っていた。

内因性マウス遺伝子座におけるヒト免疫グロブリン可変領域でのマウス免疫グロブリン可変領域の正確な置換を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、Ｂ細胞発生に関して野生型マウスとの驚くべき、また注目すべき類似性を提示する。驚くべき、また実にすばらしい発生の点で、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、免疫に応答して産生される可変領域が完全ヒトのものであるという１つの重要な点のみが野生型マウスと異なる、本質的に正常な野生型応答を免疫に対して提示した。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、内因性遺伝子座におけるマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）および免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の生殖細胞系可変領域の、対応するヒト免疫グロブリン可変領域での正確な大規模置換を含有する。合計で約６メガ塩基のマウス遺伝子座が約１．５メガ塩基のヒトゲノム配列で置換される。この正確な置換により、結果として、ヒト可変領域とマウス定常領域を有する重および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。マウスＶ_Ｈ−Ｄ_Ｈ−Ｊ_ＨおよびＶ_κ−Ｊ_κセグメントの正確な置換は、隣接するマウス配列をインタクトなままおよび機能的なままハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座に残す。前記マウスの体液性免疫系は、野生型マウスのものと同様に機能する。Ｂ細胞発生はいずれの重要な点でも妨害されず、抗原チャレンジすると前記マウスにおいて多様性に富んだヒト可変領域が産生される。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、重およびκ軽鎖についての免疫グロブリン遺伝子セグメントがヒトおよびマウスにおいて同様に再構成するので実現可能であるのだが、その遺伝子座は同じまたはほぼ同じであるというわけではない――明らかにそれらはそうではない。しかし、その遺伝子座は、すべてのＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含有する約３００万塩基対の連続するマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの等価の配列を基本的にカバーする約１００万塩基の連続するヒトゲノム配列で置換することによって重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化を達成することができるほどに類似する。

一部の実施形態では、一定のマウス定常領域遺伝子配列の、ヒト遺伝子配列でのさらなる置換（例えば、マウスＣ_Ｈ１配列の、ヒトＣ_Ｈ１での置換、およびマウスＣ_Ｌ配列の、ヒトＣ_Ｌ配列での置換）により、結果として、例えば完全ヒト抗体断片、例えば完全ヒトＦａｂの作製に好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグメント再構成、正常な体細胞超変異頻度および正常なクラススイッチを示す。これらのマウスは、野生型マウスと区別できない体液性免疫系を示し、および、マウスにヒト可変領域遺伝子セグメントの完全レパートリーが無い場合でさえ、正常な細胞集団をすべてのＢ細胞発生段階で提示し、正常なリンパ器官構造を提示する。これらのマウスの免疫は、可変遺伝子セグメント使用量の広範な多様性を提示する頑強な体液性応答を生じさせる結果となる。

マウス生殖細胞系可変領域遺伝子セグメントの正確な置換により、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの作製が可能になる。部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、再構成し、超変異し、正常にクラススイッチするため、ヒト可変領域を含むマウスでは部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座により抗体が産生される。その可変領域をコードするヌクレオチド配列を同定し、クローニングして、選ばれた任意の配列、例えば、特定の用途に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと（例えばｉｎｖｉｔｒｏ系において）融合させ、その結果、全部がヒト配列に由来する抗体または抗原結合タンパク質を得ることができる。

リコンビニアリング法による大規模ヒト化を用いてマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を改変して、マウスＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含む３メガ塩基以下のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座を、いくつかのまたは本質的にすべてのヒトＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含有する１メガ塩基以下のヒトゲノム配列を有する等価のヒト遺伝子セグメントで正確に置換した。本質的にすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードする２つのリピートの一方を含むヒトゲノムの二分の一メガ塩基以下のセグメントを使用して、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含有するマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の３メガ塩基セグメントを置換した。

かかる置換免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最も３’側のＶ_Ｈ遺伝子セグメントと最も５’側のＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間で通常は見出される内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の破壊または欠失を含み得る。この領域の破壊は、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の機能性の低減または消去をもたらし得る。ヒト重鎖レパートリーの最も３’側のＶ_Ｈ遺伝子セグメントを置換に使用すると、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子であるように見える偽遺伝子を含有する遺伝子間領域がこれらのＶ_Ｈ遺伝子セグメント間、すなわち、ヒトＶ_Ｈ１−２とＶ_Ｈ１−６の間に存在する。しかし、このヒト遺伝子間配列を含む雄マウスは、妊性の低減を示す。

上記の置換遺伝子座を含み、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸配列も含むマウスであって、本質的に正常な妊性を示すマウスを記載する。１つの実施形態において、前記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座のヒトＶ_Ｈ１−２とヒトＶ_Ｈ６−１の間に配置されたマウスＡＤＡＭ６ａ配列および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、前記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座のヒトＶ_Ｈ１−２とヒトＶ_Ｈ６−１の間に配置された配列番号３である。配列番号３のＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向は、周囲のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの転写の方向に対して逆である。本明細書における例は、示されるヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント間に異所性配列を配置することによる妊性のレスキューを示すが、マウスゲノム内の任意の好適な転写許容遺伝子座への（またはさらには染色体外への）異所性配列の配置が雄マウスの妊性を同様にレスキューすると予想されることは、当業者であれば認める。

マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む異所性配列を有する機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスを補足する現象は、非機能的なまたは最小機能的な内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する任意のマウスのレスキューに適用できる一般的な方法である。それ故、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＡＤＡＭ６破壊改変を含む非常に多数のマウスを本発明の組成物および方法でレスキューすることができる。したがって、本発明は、内因性ＡＤＡＭ６機能を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多種多様な改変を有するマウスを含む。一部の（非限定的）例を本明細書に提供する。記載するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに加えて、ＡＤＡＭ６に関する組成物および方法を非常に多くの用途に、例えば、重鎖遺伝子座を多種多様な方法で改変するときに用いることができる。

１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスであって、Ｃ_Ｈ１領域および／またはヒンジ領域が無いマウスを提供する。１つの実施形態において、前記マウスは、（ａ）ヒトＶ_Ｈ−マウスＣ_Ｈ１−マウスＣ_Ｈ２−マウスＣ_Ｈ３；（ｂ）ヒトＶ_Ｈ−マウスヒンジ−マウスＣ_Ｈ２−マウスＣ_Ｈ３；および（ｃ）ヒトＶ_Ｈ−マウスＣ_Ｈ２−マウスＣ_Ｈ３から選択される免疫グロブリン鎖の二量体である単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する。

１つの態様では、１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶ_Ｈ、ｍＤ_Ｈおよび／またはｍＪ_Ｈ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶ_Ｈ、ｈＤ_Ｈおよび／またはｈＪ_Ｈ）での置換を有するマウスであって、１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶκおよび／またはｍＪκ）の、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよび／またはｈＪκ）での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性をレスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列内（例えば、ヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントとＶ_Ｈ１−６遺伝子セグメントの間）に配置する。

１つの実施形態において、前記１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、前記１つ以上のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも８９のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも１３のＤ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも４のＪ_Ｈ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。１つの実施形態において、前記１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、約１メガ塩基のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、前記１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも８０のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも２７のＤ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも６のＪ_Ｈ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。

１つの実施形態において、前記１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基のマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、前記１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも１３７のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。１つの実施形態において、前記１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約二分の一メガ塩基のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の（免疫グロブリンκ定常領域に関して）近位リピートを含む。１つの実施形態において、前記１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも４０のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。

１つの実施形態では、前記ヌクレオチド配列を２つのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの間に配置する。特定の実施形態において、前記２つのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態では、前記ヌクレオチド配列をＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントとヒトＶ_Ｈ１−６遺伝子セグメントとの間に配置する（米国特許第６，５９６，５４１号および同第７，１０５，３４８号明細書；これらは参照により本明細書に援用されている）。１つの実施形態において、そのように改変されたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、少なくとも８０のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、２７のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび６のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントの置換、および少なくとも４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび５のヒトＪκ遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントの置換を含む。

１つの態様において、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）は、内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントを置換するヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの中央に存在する。１つの実施形態では、少なくとも８９のマウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントを除去し、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置換し、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの３’端に直ぐ隣接して存在するか、２つのヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント間に存在する。特定の実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの３’末端の約２０キロ塩基（ｋｂ）から約４０キロ塩基（ｋｂ）以内の２つのＶ_Ｈ遺伝子セグメント間に存在する。特定の実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの３’末端の約２９ｋｂから約３１ｋｂ以内の２つのＶ_Ｈ遺伝子セグメント間に存在する。特定の実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの３’末端の約３０ｋｂ以内に存在する。特定の実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約３０，１８４ｂｐ以内に存在する。特定の実施形態において、前記置換は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントＶ_Ｈ１−２およびＶ_Ｈ６−１を含み、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、該Ｖ_Ｈ１−２遺伝子セグメントの下流かつ該Ｖ_Ｈ６−１遺伝子セグメントの上流に存在する。特定の実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、ヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントとヒトＶ_Ｈ６−１遺伝子セグメントの間に存在し、この場合、該マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の５’端は、該ヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントの３’末端から約１３，８４８ｂｐであり、および該ＡＤＡＭ６遺伝子座の３’端は、該ヒトＶ_Ｈ６−１遺伝子セグメントから約２９，７３７ｂｐ５’側に存在する。特定の実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号３またはその断片を含む。そこで、特定の実施形態において、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶ_Ｈ１−２−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶ_Ｈ６−１。特定の実施形態では、ヒトＶ_Ｈ１−２とヒトＶ_Ｈ６−１間のＡＤＡＭ６偽遺伝子をマウスＡＤＡＭ６遺伝子座で置換する。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つ以上の配向は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントについての配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントと最も５’側のＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に存在する。最も５’側のＤ_Ｈセグメントがマウスであろうと、ヒトであろうと、このとおりであるはずである。

同様に、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントを置換する、前記１つ以上のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント（例えば、ＶκまたはＶλセグメント）で改変されるマウスは、上に記載したように、例えばマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくはその機能的断片を含む下流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターを利用することにより、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を維持するように改変することができ、あるいは２つのヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメント間に、またはヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントとＤ_Ｈ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖλ＋ｍ／ｈＤ_Ｈ）もしくはＪ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖκ＋Ｊ_Ｈ）に位置する異所配列で損傷マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を置換するように改変することができる。１つの実施形態において、前記置換は、２つ以上のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、および前記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはその機能的断片は、２つの最も３’側のＶ_Ｌ遺伝子セグメント間に存在する。そこで、特定の実施形態において、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶ_Ｌ３’−１−マウスＡＤＡＭ６遺伝子座−ヒトＶ_Ｌ３’。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つ以上の配向は、ヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントの配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントと最も５’側のＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に存在する。最も５’側のＤ_Ｈセグメントがマウスであろうと、ヒトであろうとこのとおりであるはずである。

１つの態様では、１つ以上の内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの置換を有する、および少なくとも１つの内因性マウスＤ_Ｈ遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。かかるマウスにおいて、前記内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの改変は、最も５’側のＤ_Ｈ遺伝子セグメントではなく、最も３’側のＶ_Ｈ遺伝子セグメントの１つ以上についての改変を含み得、この場合、前記１つ以上の最も３’側のＶ_Ｈ遺伝子セグメントの改変が、前記内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を破壊しないようにまたは非機能的にしないように注意する。例えば、１つの実施形態において、前記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換を含み、および前記マウスは、１つ以上の内因性Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントおよび機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む。

もう１つの実施形態において、前記マウスは、最も３’側の内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの改変、および１つ以上の内因性マウスＤ_Ｈ遺伝子セグメントの改変を含み、該改変は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が機能的なままである程度まで該内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の完全性が維持されるように行う。一例では、かかる改変を二工程で行う：（１）上流ホモロジーアームと、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは部分を含む下流ホモロジーアームとを有するターゲティングベクターを利用して、最も３’側の内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントを１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置換する工程；（２）次に、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは機能的部分を含む上流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターで内因性マウスＤ_Ｈ遺伝子セグメントを置換する工程。

様々な態様において、改変が内因性マウスＡＤＡＭ６の機能を破壊する場合、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的ホモログをコードする異所性配列を含有するマウスの利用は有用である。内因性マウスＡＤＡＭ６機能を破壊する確率は、マウス免疫グロブリン遺伝子座への改変を行うとき、特に、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域および周囲の配列を改変するときに高い。したがって、かかるマウスは、全部もしくは一部が欠失している、全部もしくは一部がヒト化されている、または全部もしくは一部が（例えば、ＶκもしくはＶλ配列で）置換されている免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを作製するときに特に有益である。下に記載するマウスに対して記載の遺伝子改変を行うための方法は当業者に公知である。

マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列またはマウスＡＤＡＭ６タンパク質の妊性の恩恵をもたらす実質的に同一もしくは同様のタンパク質をコードする異所性配列を含有するマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６配列を破壊するかまたは欠失させるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座への改変に関連して特に有用である。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するマウスに関連して主として記載したが、かかるマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子を破壊する任意の遺伝子改変に関連して有用である。これが、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の改変を含有する多種多様な遺伝子改変マウスを包含することは、当業者であれば認める。これらには、例えば、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントのすべてまたは一部分の欠失または置換を、他の改変にかかわらず有するマウスが含まれる。非限定的な例を下に記載する。

一部の態様では、マウスにおいて機能的な異所性マウス、齧歯動物または他のＡＤＡＭ６遺伝子（またはオルソログもしくはホモログもしくは断片）と１つ以上のヒト免疫グロブリン可変および／または定常領域遺伝子セグメントとを含む遺伝子改変マウスを提供する。様々な実施形態において、マウスにおいて機能的である他のＡＤＡＭ６遺伝子オルソログまたはホモログまたは断片は、ウシ、イヌ、霊長類、ウサギまたは他の非ヒト配列を含み得る。

１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスは、マウスＣ_Ｈ１ヌクレオチド配列の、ヒトＣ_Ｈ１ヌクレオチド配列での置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、マウスヒンジヌクレオチド配列の、ヒトヒンジヌクレオチド配列での置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座（Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ）の、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座での置換をさらに含む。１つの実施形態において、前記マウスは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列の、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列での置換をさらに含む。特定の実施形態において、前記Ｖ_Ｌ、Ｊ_ＬおよびＣ_Ｌは、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。特定の実施形態において、前記マウスは、ヒトヒンジおよびヒトＣ_Ｈ１配列と融合したマウスＣ_Ｈ２およびマウスＣ_Ｈ３免疫グロブリン定常領域配列を含むので、該マウス免疫グロブリン遺伝子座が再構成して、（ａ）ヒト可変領域、ヒトＣ_Ｈ１領域、ヒトヒンジ領域ならびにマウスＣ_Ｈ２およびマウスＣ_Ｈ３領域を有する重鎖と、（ｂ）ヒト可変ドメインおよびヒト定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子とを含む結合タンパク質をコードする遺伝子を形成する。

１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントでの置換と、必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび／もしくはＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび／もしくはヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換と、または必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のＶ_Ｌ、１つ以上のＤ_Ｈ、および１つ以上のＪ遺伝子セグメント（例えば、ＪκまたはＪλ）での置換を含み、これらの遺伝子セグメントは、内因性マウスヒンジ領域に作動可能に連結されており、該マウスは、転写方向に５’から３’へと、ヒトＶ_Ｌ−ヒトまたはマウスＤ_Ｈ−ヒトまたはマウスＪ−マウスヒンジ−マウスＣ_Ｈ２−マウスＣ_Ｈ３を含有する再構成免疫グロブリン鎖遺伝子を形成する。１つの実施形態において、前記Ｊ領域は、ヒトＪκ領域である。１つの実施形態において、前記Ｊ領域は、ヒトＪ_Ｈ領域である。１つの実施形態において、前記Ｊ領域は、ヒトＪλ領域である。１つの実施形態において、前記ヒトＶ_Ｌ領域は、ヒトＶλ領域およびヒトＶκ領域から選択される。

特定の実施形態において、前記マウスは、マウスまたはヒト定常領域と、ヒトＶκ、ヒトＤ_ＨおよびヒトＪκ；ヒトＶκ、ヒトＤ_ＨおよびヒトＪ_Ｈ；ヒトＶλ、ヒトＤ_ＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤ_ＨおよびヒトＪ_Ｈ；ヒトＶκ、ヒトＤ_ＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤ_ＨおよびヒトＪκに由来する可変領域とを有する、単一可変ドメイン抗体を発現する。特定の実施形態では、列挙したＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント間でのまたは列挙したＶおよびＪ遺伝子セグメント間での生産的再構成の発生が可能になるように、組換え認識配列を改変する。

１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスであって、Ｃ_Ｈ１および／またはヒンジ領域が無いマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスにはＣ_Ｈ１ドメインをコードする配列が無い。１つの実施形態において、前記マウスにはヒンジ領域をコードする配列が無い。１つの実施形態において、前記マウスにはＣ_Ｈ１ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列が無い。

特定の実施形態において、前記マウスは、マウスＣ_Ｈ３ドメインに結合しているマウスＣ_Ｈ２ドメインに融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（λまたはκ）を含む結合タンパク質を発現する。

１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｌ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのマウスＤ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの、ヒトＪ_Ｌ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。

１つの実施形態において、前記マウスは、Ｃ_Ｈ１領域、ヒンジ領域、Ｃ_Ｈ１およびヒンジ領域、またはＣ_Ｈ１領域およびヒンジ領域およびＣ_Ｈ２領域をコードする免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列の欠失を含む。

１つの実施形態において、前記マウスは、以下のものから選択されるホモ二量体を含む単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する：（ａ）ヒトＶ_Ｌ−マウスＣ_Ｈ１−マウスＣ_Ｈ２−マウスＣ_Ｈ３；（ｂ）ヒトＶ_Ｌ−マウスヒンジ−マウスＣ_Ｈ２−マウスＣ_Ｈ３；（ｃ）ヒトＶ_Ｌ−マウスＣ_Ｈ２−マウスＣ_Ｈ３。

１つの態様では、無能化または欠失された内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む、無能化された内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスであって、ヒトまたはマウスまたはヒト／マウスもしくは他のキメラ抗体を発現する核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、前記核酸配列は、組み込まれた導入遺伝子上に存在し、該導入遺伝子は、マウスゲノムにランダムに組み込まれている。１つの実施形態において、前記核酸配列は、野生型マウスでは見出さないエピソーム（例えば、染色体）上にある。

１つの実施形態において、前記マウスは、無能化された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。特定の実施形態において、前記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖遺伝子座から選択される。特定の実施形態において、前記マウスは、無能化された内因性κ軽鎖遺伝子座および無能化されたλ軽鎖遺伝子座を含み、この場合のマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよびヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインを含む抗体を発現する。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインは、ヒトκ軽鎖ドメインおよびヒトλ軽鎖ドメインから選択される。

１つの態様では、キメラ抗体を発現する遺伝子改変動物であって、該遺伝子改変動物において機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する遺伝子改変動物を提供する。

１つの実施形態において、前記遺伝子改変動物は、マウスおよびラットから選択される。１つの実施形態において、前記遺伝子改変動物はマウスであり、前記ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは、該遺伝子改変動物とは異なる系統であるマウス系統からのものである。１つの実施形態において、前記遺伝子改変動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物（例えば、ハムスター、新世界ラットまたはマウス、ハタネズミ）であり、および前記ＡＤＡＭ６タンパク質オルソログまたはホモログは、ネズミ科の齧歯動物（例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）からのものである。１つの実施形態において、前記遺伝子改変動物は、ネズミ科の齧歯動物であり、前記ＡＤＡＭ６タンパク質オルソログまたはホモログは、キヌゲネズミ科の齧歯動物からのものである。

１つの実施形態において、前記キメラ抗体は、ヒト可変ドメインと齧歯動物の定常領域配列とを含む。１つの実施形態において、前記齧歯動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物およびネズミ科の齧歯動物から選択される。特定の実施形態において、前記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、マウスである。特定の実施形態において、前記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、ラットである。１つの実施形態において、前記キメラ抗体は、ヒト可変ドメインと、マウスまたはラットから選択される動物からの定常ドメインとを含む；特定の実施形態において、前記マウスまたはラットは、キヌゲネズミ科およびネズミ科から選択される。１つの実施形態において、前記キメラ抗体は、ヒト重鎖可変ドメインと、ヒト軽鎖可変ドメインと、マウスおよびラットから選択される齧歯動物由来の定常領域配列とを含み、この場合のヒト重鎖可変ドメインおよびヒト軽鎖は同種のものである。特定の実施形態において、同種のものとしては、ヒト重鎖およびヒト軽鎖可変ドメインが、該ヒト軽鎖可変ドメインと該ヒト重鎖可変ドメインを一緒に発現してその可変ドメインを個々のＢ細胞の表面に一緒に提示する単一Ｂ細胞からのものである、同種のものが挙げられる。

１つの実施形態では、前記キメラ抗体を免疫グロブリン遺伝子座から発現させる。１つの実施形態では、前記キメラ抗体の重鎖可変ドメインを再構成内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現させる。１つの実施形態では、前記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現させる。１つの実施形態では、前記キメラ抗体の重鎖可変ドメインおよび／または前記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成導入遺伝子（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の動物のゲノムに組み込まれている非再構成核酸配列から誘導された再構成核酸配列）から発現させる。１つの実施形態において、前記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再構成導入遺伝子（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の動物のゲノムに組み込まれている非再構成核酸配列から誘導された再構成核酸配列）から発現させる。

特定の実施形態では、前記導入遺伝子を転写活性遺伝子座、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、例えばネズミ（例えばマウス）ＲＯＳＡ２６遺伝子座から発現させる。

１つの態様では、非ヒト動物であって、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、該ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座が非ヒトＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、非ヒト動物を提供する。

１つの実施形態において、前記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される齧歯動物である。

１つの実施形態において、前記非ヒトＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、マウスＡＤＡＭ６配列とオルソロガスおよび／または相同性である配列であり、そのオルソログまたはホモログは、非ヒト動物において機能的である。

１つの実施形態において、前記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択され、前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、マウス、ラットおよびハムスターから選択される非ヒト動物からのものである。特定の実施形態において、前記非ヒト動物はマウスであり、前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるマウス種、ラットおよびハムスターから選択される動物からのものである。特定の実施形態において、前記非ヒト動物はラットであり、前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるラット種、マウスおよびハムスターから選択される齧歯動物からのものである。特定の実施形態において、前記非ヒト動物はハムスターであり、前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるハムスター種、マウスおよびラットから選択される齧歯動物からのものである。

特定の実施形態において、前記非ヒト動物は、ネズミ亜目からのものであり、前記ＡＤＡＭ６配列は、トビネズミ上科の齧歯動物およびネズミ上科の齧歯動物から選択される動物からのものである。特定の実施形態において、前記齧歯動物は、ネズミ上科のマウスであり、前記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科のマウスまたはラットまたはハムスターからのものである。

１つの実施形態において、前記ヒト化重鎖遺伝子座は、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび１つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、１つ以上のヒト、キメラおよび／または齧歯動物（例えば、マウスもしくはラット）定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。１つの実施形態において、前記定常領域遺伝子はマウスである。１つの実施形態において、前記定常領域遺伝子はラットである。１つの実施形態において、前記定常領域遺伝子はハムスターである。１つの実施形態において、前記定常領域遺伝子は、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、前記定常領域遺伝子は、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３配列を含む。

１つの実施形態において、前記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列に隣接する。１つの実施形態において、前記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列内に位置する。特定の実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントを含む。

１つの実施形態において、前記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、２つのＶ遺伝子セグメント間に位置する。１つの実施形態において、前記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントの間に並置されている。１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間に位置する。１つの実施形態において、前記マウスＡＤＡＭ６配列は、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間に並置されている。

１つの態様では、免疫グロブリン遺伝子座からヒトＶ_Ｌドメインと同種のヒトＶ_Ｈドメインを発現するＢ細胞を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、該免疫グロブリン遺伝子座から非免疫グロブリン非ヒトタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、前記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、ＡＤＡＭタンパク質である。特定の実施形態において、前記ＡＤＡＭタンパク質は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片である。

１つの実施形態において、前記非ヒト動物は、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）である。１つの実施形態において、前記齧歯動物は、ネズミ科のものである。１つの実施形態において、前記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、前記ネズミ上科の齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。

１つの実施形態において、前記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、齧歯動物タンパク質である。１つの実施形態において、前記齧歯動物は、ネズミ科のものである。１つの実施形態において、前記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、前記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。

１つの実施形態において、前記ヒトＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に直接またはリンカーによって結合する。特定の実施形態において、前記定常ドメイン配列は、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、前記ヒトＶ_Ｌドメインは、ＶκまたはＶλドメインから選択される。

１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、その生殖細胞系にヒト免疫グロブリン配列を含み、雄非ヒト動物の精子がｉｎｖｉｖｏ移動欠陥を特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、前記ｉｎｖｉｖｏ移動欠陥は、前記雄非ヒト動物の精子が同じ種の雌非ヒト動物の子宮から卵管を通って移動することができないことを含む。１つの実施形態において、前記非ヒト動物には、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列が無い。特定の実施形態において、前記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂタンパク質またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、前記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、前記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。

１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする非ヒト配列に隣接するヒト免疫グロブリン配列を含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、前記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、前記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。

１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン重鎖配列である。１つの実施形態において、前記免疫グロブリン配列は、１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン配列は、１つ以上のＤ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン配列は、１つ以上のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン配列は、１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

１つの実施形態において、前記免疫グロブリン配列は、天然ヒトレパートリーにおいて高頻度である１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、２つ以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、３つ以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、４つ以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、５つ以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、６つ以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、７つ以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、８つ以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、９つ以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１０以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１１以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１２以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１３以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１４以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１５以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１６以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１７以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１８以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、１９以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、２０以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、２１以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、２２以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメントまたは２３以下のＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

特定の実施形態において、前記１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、５つのＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、１０のＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、１５のＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記１つ以上のＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、２０のＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ６−１、Ｖ_Ｈ１−２、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１６、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ３−３５、Ｖ_Ｈ３−３８、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ１−６９、_ＶＨ２−７０、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ３−７３およびＶ_Ｈ３−７４から選択される。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ１−２、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ５−５１およびＶ_Ｈ６−１から選択される。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−５９およびＶ_Ｈ５−５１から選択される。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−５９およびＶ_Ｈ５−５１から選択される。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ４−３９およびＶ_Ｈ４−５９から選択される。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０およびＶ_Ｈ４−３９から選択される。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ３−２３およびＶ_Ｈ４−３９から選択される。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２３およびＶ_Ｈ３−３０から選択される。

様々な実施形態において、前記Ｖ_Ｈ遺伝子セグメントは、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−３０およびＶ_Ｈ４−３９から選択される。

特定の実施形態において、ヒト免疫グロブリン配列は、少なくとも１８のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、２７のＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび６のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン配列は、少なくとも３９のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、２７のＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび６のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン配列は、少なくとも８０のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、２７のＤ_Ｈ遺伝子セグメントおよび６のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。

１つの実施形態において、前記非ヒト動物はマウスであり、該マウスは、内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでの置換を含み、該ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントはマウスＣ_Ｈ領域遺伝子に作動可能に連結されているので、該マウスは、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを再構成し、およびヒトＶ_ＨドメインとマウスＣ_Ｈを含む逆キメラ免疫グロブリン重鎖を発現する。１つの実施形態では、非再構成マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントの９０〜１００％が、少なくとも１つの非構成ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置換されている。特定の実施形態では、前記内因性マウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、少なくとも１つの非再構成ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態において、前記置換は、少なくとも１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の非再構成ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態において、前記置換は、少なくとも１２の機能的非再構成ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的非再構成ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントまたは少なくとも４３の機能的非再構成ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態において、前記マウスは、すべてのマウスＤ_ＨおよびＪ_Ｈセグメントの、少なくとも１つの非再構成ヒトＤ_Ｈセグメントおよび少なくとも１つの非再構成ヒトＪ_Ｈセグメントでの置換を含む。１つの実施形態において、前記少なくとも１つの非再構成ヒトＤ_Ｈセグメントは、１−１、１−７、１−２６、２−８、２−１５、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５、５−１２、６−６、６−１３、７−２７およびその組み合わせから選択される。１つの実施形態において、前記少なくとも１つの非再構成ヒトＪ_Ｈセグメントは、１、２、３、４、５、６およびその組み合わせから選択される。特定の実施形態において、前記１つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントおよびその組み合わせから選択される。

様々な実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における定常領域と作動可能な連結状態にある。１つの実施形態において、前記定常領域は、ヒト、キメラヒト／マウスまたはキメラヒト／ラットまたはキメラヒト／ハムスター、マウス、ラットまたはハムスター定常領域である。１つの実施形態において、前記定常領域は、齧歯動物（例えば、マウスまたはラットまたはハムスター）定常領域である。特定の実施形態において、前記齧歯動物は、マウスまたはラットである。様々な実施形態において、前記定常領域は、少なくともＣ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを含む。

１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における非免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあり、この非重鎖遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、前記非重鎖遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。

様々な態様において、前記非ヒト動物は、該非ヒト動物の生殖細胞系にヒト免疫グロブリン軽鎖配列（例えば、１つ以上の非再構成軽鎖ＶおよびＪ配列、または１つ以上の再構成ＶＪ配列）をさらに含む。特定の実施形態において、前記免疫グロブリン軽鎖配列は、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＶ_Ｌ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つ以上のＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび１つ以上のＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも１６のＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも３０のＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも４０のＶκ遺伝子セグメントおよび５つのＪκ遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における定常領域と作動可能な連結状態にある。１つの実施形態において、前記定常領域は、ヒト、キメラヒト／齧歯動物、マウス、ラットまたはハムスター定常領域である。特定の実施形態において、前記定常領域は、マウスまたはラット定常領域である。特定の実施形態において、前記定常領域は、マウスκ定常（ｍＣκ）領域またはラットκ定常（ｒＣκ）領域である。

１つの実施形態において、前記非ヒト動物はマウスであり、該マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの、少なくとも６のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントでの置換を含む。１つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、少なくとも１６のヒトＶκ遺伝子セグメント（ヒトＶκ）および少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、少なくとも３０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態では、すべてのまたは実質的にすべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、少なくとも４０のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態において、前記少なくとも１つのＪκ遺伝子セグメントは、２、３、４または５つのヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。

１つの実施形態において、前記ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５およびＶκ１−６を含む。１つの実施形態において、前記Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５およびＶκ１−１６を含む。１つの実施形態において、前記ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９およびＶκ２−３０を含む。１つの実施形態において、前記ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９およびＶκ２−４０を含む。

特定の実施形態において、前記Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１からＶκ２−４０までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続したヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを含み、前記Ｊκ遺伝子セグメントは、Ｊκ１からＪκ５までのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にわたる連続した遺伝子セグメントを含む。

１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、前記非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、前記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、転写活性である非ヒト動物の生殖細胞系における非免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、前記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。

１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞にコードされている１つ以上の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含むヒト抗体の作製方法を提供する。

１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物から単離された１つ以上の可変領域核酸配列に由来する抗体または抗体断片を含むポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。１つの実施形態において、前記ポリペプチドは抗体である。１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、重鎖のみの抗体である。１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、一本鎖可変断片（例えば、ｓｃＦｖ）である。

１つの態様では、抗体を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。様々な実施形態において、前記抗体は、前記非ヒト動物から単離された１つ以上の可変領域核酸配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。特定の実施形態において、前記可変領域核酸配列は、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、前記可変領域核酸配列は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物の作製および使用の仕方を説明するために提供するものであり、本発明者らが自分達の発明とみなすものの範囲を限定することを意図したものではない。別の指示が無い限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧または近大気圧である。

実施例１
マウス免疫グロブリン遺伝子のヒト化
ヒトおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用して、マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化のための１３の異なるＢＡＣターゲティングベクター（ＢＡＣｖｅｃ）を工学的に作製した。表１および２は、マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化にそれぞれ利用したすべてのＢＡＣｖｅｃを構築するために行った工程の説明を示すものである。

ヒトおよびマウスＢＡＣの同定。ＢＡＣライブラリーを用いてスポットしたフィルターのハイブリダイゼーションにより、またはマウスＢＡＣライブラリーＤＮＡプールのＰＣＲスクリーニングにより、免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の５’および３’端にわたるマウスＢＡＣを同定した。対象となる領域に対応するプローブを使用して、標準条件下でフィルターをハイブリダイズした。対象となる標的領域に隣接するユニークなプライマーペアを使用してＰＣＲによりライブラリープールをスクリーニングした。同じプライマーを使用する追加のＰＣＲを行って、所与のウェルをデコンボリュートし、対象となる対応するＢＡＣを単離した。ＢＡＣフィルターとライブラリープールの両方を１２９ＳｖＪマウスＥＳ細胞（ＩｎｃｙｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓ／Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）から生成した。全免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座をカバーするヒトＢＡＣを、ＢＡＣライブラリー（ＣａｌｔｅｃｈＢ、ＣもしくはＤライブラリーおよびＲＰＣＩ−１１ライブラリー、ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスポットしたフィルターのハイブリダイゼーションとＰＣＲベースの方法によるヒトＢＡＣライブラリープール（Ｃａｌｔｅｃｈライブラリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のスクリーニングによるか、またはＢＡＣ末端配列データベース（ＣａｌｔｅｃｈＤｌｉｂｒａｔｙ、ＴＩＧＲ）の使用によるかの、いずれかによって同定した。
細菌相同組換えおよびライゲーションによるＢＡＣｖｅｃの構築。細菌相同組換え（ＢＨＲ）を記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３；Ｚｈａｎｇら、１９９８、ＡｎｅｗｌｏｇｉｃｆｏｒＤＮＡｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、ＮａｔＧｅｎｅｔ２０：１２３−１２８）とおりに行った。殆どの場合、ＰＣＲ生成ホモロジーボックスのクローン化カセットへのライゲーション、続いてライゲーション産物のゲル単離、そして標的ＢＡＣを保有するＢＨＲコンピテント細菌へのエレクトロポレーションによって線状断片を生成した。適切な抗生物質ペトリ皿での選択の後、正しく組換えられたＢＡＣを、両方の新規接合部にわたってのＰＣＲ、続いてパルスフィールドゲルでの制限酵素分析（ＳｃｈｗａｒｔｚａｎｄＣａｎｔｏｒ、１９８４、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆ
ｙｅａｓｔｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｉｚｅｄＤＮＡｓｂｙｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｃｅｌｌ３７：６７−７５）、そしてヒト配列全域にわたって分布するプライマーを使用するＰＣＲによるスポットチェックによって同定した。

３工程の逐次的ＢＨＲ工程を用いて、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最初のヒト化工程のための３ｈＶ_ＨＢＡＣｖｅｃを構築した（図４Ａおよび表１）。第一工程（工程１）では、ヒト親ＢＡＣのヒトＶ_Ｈ１−３遺伝子セグメントから上流に、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座と相同性の領域（ＨＢ１）と細菌にカナマイシン耐性をおよび動物細胞にＧ４１８耐性を付与する遺伝子（ｋａｎＲ）と部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ）とを含有するカセットを導入した。第二工程（工程２）では、最後のＪ_Ｈセグメントから直ぐ下流に、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座と相同性の第二の領域（ＨＢ２）と細菌にスペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（ｓｐｅｃＲ）とを含有する第二のカセットを導入した。この第二工程は、Ｊ_Ｈ６から下流のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座配列とＢＡＣベクタークロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍＲ）とを欠失させることを含んだ。次に、第三工程（工程３）では、最初の２工程の間に付加されたＩ−ＣｅｕＩ部位を使用して二重改変ヒトＢＡＣ（Ｂ１）を線形化し、２つの相同性領域（ＨＢ１およびＨＢ２）によるＢＨＲによってマウスＢＡＣ（Ｂ２）に組み込んだ。第一（ｃｍ／ｋａｎ）、第二（ｓｐｅｃ／ｋａｎ）および第三（ｃｍ／ｋａｎ）工程のための薬剤選択は、所望の産物に特異的であるように設計した。制限酵素での消化後にパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により改変ＢＡＣクローンを分析して、適切な構築物を決定した（図４Ｂ）。

同様に、重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化のために１２の追加のＢＡＣｖｅｃを工学的に作製した。場合によっては、選択マーカーの注意深い配置と共に、ＢＨＲによる両方の親ＢＡＣｖｅｃへの稀な制限酵素認識部位導入による、ＢＨＲの代わりにＢＡＣライゲーションを行って、２つの大きなＢＡＣを結合した。これにより、特定の薬剤マーカーの組み合わせでの選択の際に、所望のライゲーション産物の生残が可能になった。稀な制限酵素での消化後のライゲーションによって得た組換えＢＡＣを、ＢＨＲによって得たものと同様に（上に記載したように）同定し、スクリーニングした。

胚性幹（ＥＳ）細胞の改変およびマウスの産生。記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）ようなＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法を用いて、ＥＳ細胞（Ｆ１Ｈ４）ターゲティングを行った。胚盤胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）または８細胞注入（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、２００７、Ｆ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｍｉｃｅｆｕｌｌｙｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｌｌｏｗｉｎｇｉｍｍｅｄｉａｔｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｅｓ、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２５：９１−９９）のいずれかによる改変ＥＳ細胞からのマウスの誘導は、記載されているとおりであった。ＰＣＲベースのアッセイでプローブとプライマーのユニークなセットを用いてＥＳ細胞またはマウスからのＤＮＡをスクリーニグすることにより、標的ＥＳ細胞およびマウスを確認した（例えば、図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。すべてのマウス研究は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎの施設内動物管理使用委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）によって監督され、承認された。
核型分析および蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。核型分析は、ＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（ＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、ニュージャージー州カムデン）によって行われた。ＦＩＳＨは、標的ＥＳ細胞を用いて、記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）とおりに行った。マウスＢＡＣＤＮＡまたはヒトＢＡＣＤＮＡのいずれかに対応するプローブを、ニック翻訳（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により蛍光標識ｄＵＴＰヌクレオチドスペクトルオレンジまたはスペクトルグリーン（Ｖｙｓｉｓ）で標識した。

免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座。重鎖遺伝子座の可変領域のヒト化は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号明細書およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３参照）を用いて、９工程の逐次的工程で、すべてのＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含有する約３百万塩基対（Ｍｂ）の連続するマウスゲノム配列を、等価ヒト遺伝子セグメントを含有する約１Ｍｂの連続するヒトゲノム配列で直接置換することによって達成した（図１Ａおよび表１）。

Ｊ_Ｈ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子の間のイントロン（Ｊ−Ｃイントロン）は、転写エンハンサー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、１９８３、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄｃｅｌｌｓ、ＥＭＢＯ
Ｊ２：１３７３−１３７８）、その後にアイソタイプスイッチ中の組換えに必要な単純リピート領域（Ｋａｔａｏｋａら、１９８０、Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｇａｍｍａ１−ｃｈａｉｎｇｅｎｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎｃｌａｓｓｓｗｉｔｃｈ、ＰＮＡＳ
ＵＳＡ７７：９１９−９２３）を含有する。マウス内でのヒト化重鎖遺伝子座の効率的発現およびクラススイッチ両方を保存するために、マウス重鎖イントロンエンハンサーおよびスイッチドメインを維持するようにヒトＶ_Ｈ−Ｄ_Ｈ−Ｊ_Ｈ領域とマウスＣ_Ｈ領域の間の接合部（近位接合部）を選択した。合成オリゴヌクレオチドによって駆動される細菌相同組換えを用いるＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法（上記）の使用により、すべての置換においてこのおよび後続の接合部の正確なヌクレオチド位置が実現可能であった。このようにして、近位接合部を最後のＪ_Ｈ遺伝子セグメントから約２００ｂｐ下流に配置し、遠位接合部を、ヒト遺伝子座の最も５’側のＶ_Ｈ遺伝子セグメントの数百上流、かつＪ５５８．５５としても公知のマウスＶ_Ｈ１−８６遺伝子セグメントから約９ｋｂ下流に配置した。前記マウスＶ_Ｈ１−８６（Ｊ５５８．５５）遺伝子セグメントは最遠位重鎖可変遺伝子セグメントであり、このセグメントは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは偽遺伝子であるが、標的１２９対立遺伝子において不十分なＲＳＳ配列であるにもかかわらず潜在的に活性であると報告されている。前記マウス重鎖遺伝子座の遠位端は、報告によれば、遺伝子座発現および／または再構成を調節する制御要素を含有し得る（Ｐａｗｌｉｔｚｋｙら、２００６）。

ヒト免疫グロブリンＤＮＡ配列のマウスへの第一の挿入は、約７５ｋｂのマウスホモロジーアームを使用して、３つのＶ_Ｈ、２７すべてのＤ_Ｈおよび９つのＪ_Ｈヒト遺伝子セグメントを含有するヒト重鎖遺伝子座の１４４ｋｂの近位端をマウスＩｇＨ遺伝子座の近位端に挿入し、相伴って１６．６ｋｂのマウスゲノムを欠失させることによって達成した（工程Ａ、図２Ａ；表１および３、３ｈＶ_Ｈ）。この大きな１４４ｋｂ挿入および随伴する１６．６ｋｂ欠失を単一の工程（工程Ａ）で行い、この工程は０．２％の頻度で行われた（表３）。欠失マウス配列内のおよび欠失マウス配列に隣接するプローブならびに挿入ヒト配列内のプローブを使用する天然対立遺伝子の喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｎａｔｉｖｅ−ａｌｌｅｌｅ：ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）により、正しくターゲティングされたＥＳ細胞にスコアを付けし、全挿入にわたって複数のプローブを使用して大きなヒト挿入物の完全性を検証した（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。多ラウンドの逐次的ＥＳ細胞ターゲティングが予想されたので、この工程およびすべての後続の工程で標的ＥＳ細胞クローンを核型分析（上記）に付し、２０のうち少なくとも１７のスプレッドにおいて正常な核型を示すクローンのみを後続の工程に用いた。

工程Ａからの標的ＥＳ細胞をＢＡＣｖｅｃで再ターゲティングし、それにより、重鎖遺伝子座の遠位端に１９ｋｂ欠失を生じさせた（工程Ｂ、図２Ａ）。工程ＢのＢＡＣｖｅｃは、工程ＡのＢＡＣｖｅｃに含有されているネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）とは対照的にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）を含有した。これら２つのＢＡＣｖｅｃからの耐性遺伝子は、同じ染色体へのターゲティング成功により、該２つの耐性遺伝子ばかりでなくＶ_Ｈ１−８６以外のすべてのマウスＶ_Ｈ遺伝子セグメントおよびＤＱ５２以外のすべてのＤ_Ｈ遺伝子セグメントを含有するおおよそ３Ｍｂのマウス重鎖可変遺伝子遺伝子座をｌｏｘＰ部位に隣接させるように、ならびにＤＱ５２およびすべてのマウスＪ_Ｈ鎖遺伝子セグメントが工程Ａにおいて欠失されるように設計した。同じ染色体上に二重にターゲティングされたＥＳ細胞クローンを、３ｈＶ_Ｈ近位カセットを高Ｇ４１８においてホモ接合性にさせること（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎら、１９９２、ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｎｔＥＳｃｅｌｌｓｗｉｔｈａｓｉｎｇｌｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｃｏｎｓｔｒｕｃｔ、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１２：２３９１−２３９５）および遠位ｈｙｇカセットの運命を追跡することによって同定した。ｌｏｘＰ部位が隣接するような手法で改変された４Ｍｂ以下のサイズのマウスセグメントは、薬剤選択不在の場合でさえ、高効率（約１１％以下）でのＣＲＥリコンビナーゼの一過的発現によりＥＳ細胞において首尾よく欠失した（Ｚｈｅｎｇら、２０００、ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｍｏｕｓｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｗｉｔｈＣｒｅ−ｌｏｘＰ：ｒａｎｇｅ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ａｎｄｓｏｍａｔｉｃａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２０：６４８−６５５）。同様の手法で、本発明者らは、一過的ＣＲＥ発現後に８％のＥＳ細胞クローンにおいて３Ｍｂ欠失を実現した（工程Ｃ、図２Ａ、表３）。欠失マウス配列のいずれかの末端におけるプローブ、ならびにｎｅｏおよびｈｙｇの喪失、および唯一残存するｌｏｘＰ部位を含有する欠失点にわたるＰＣＲ産物の出現を用いるＬＯＮＡアッセイによって欠失にスコアを付けた。さらに、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって欠失を確認した（データを示さない）。

各工程が２１０ｋｂ以下のヒト遺伝子配列の正確な挿入を含む、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法を用いる一連の５工程（工程Ｅ〜Ｈ、図２Ｂ）で、ヒト重鎖可変領域の残部を３ｈＶ_Ｈ対立遺伝子に付加させた。各工程について、各新たなＢＡＣｖｅｃの近位端を前の工程の最遠位ヒト配列とオーバーラップするように設計し、各新たなＢＡＣｖｅｃの遠位端は、工程Ａにおいて使用したのと同じ遠位マウス相同領域を含有した。工程Ｄ、ＦおよびＨのＢＡＣｖｅｃはｎｅｏ選択カセットを含有したが、工程ＥおよびＧのものは、ｈｙｇ選択カセットを含有し、したがって、Ｇ４１８とハイグロマイシンの間で交互に選択した。工程Ｄにおけるターゲティングを、３ｈＶ_Ｈハイブリッド対立遺伝子の遠位ｌｏｘＰ部位にわたるユニークなＰＣＲ産物の喪失によってアッセイした。工程ＥからＩについてのターゲティングは、前の選択カセットの喪失によってアッセイした。最後の工程（工程Ｉ、図２Ｂ）では、Ｆｒｔ部位（ＭｃＬｅｏｄら、１９８６、ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｒｏｓｓｏｖｅｒｓｉｔｅｄｕｒｉｎｇＦＬＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｐｌａｓｍｉｄ２ｍｉｃｒｏｎｓｃｉｒｃｌｅ、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ６：３３５７−３３６７）が隣接するｎｅｏ選択カセットを、一過的ＦＬＰｅ発現（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、１９９８、ＩｍｐｒｏｖｅｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＦＬＰｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｅｖｏｌｖｅｄｂｙ
ｃｙｃｌｉｎｇｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１６：６５７−６６２）によって除去した。工程Ｄ、ＥおよびＧについてのＢＡＣｖｅｃのヒト配列は、２つの親ヒトＢＡＣ各々に由来したが、工程ＦおよびＨからのヒト配列は、単一のＢＡＣからのものであった。挿入ヒト配列にわたって複数のプローブを使用して、ヒト配列の保持を工程ごとに確認した（上記したとおり、例えば図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。各工程で、正常な核型および生殖細胞系の潜在力を有するクローンのみを次の工程に進めた。最後の工程からのＥＳ細胞は、９種の逐次的操作（表３）の後、依然として生殖細胞系に寄与することができた。重鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性のマウスは、生育可能であり、健常であるように見え、および本質的に野生型の体液性免疫系を実証した（実施例３参照）。

免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座。重鎖のものに類似した手法で、すべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する約３Ｍｂのマウス配列を、近位ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する約０．５Ｍｂのヒト配列で直接置換することにより、８工程の逐次的工程でκ軽鎖可変領域をヒト化した（図１Ｂ；表２および４）。

ヒトκ軽鎖遺伝子座の可変領域は、８００ｋｂスペーサーによって隔てられた２つのほぼ同一の４００ｋｂリピートを含有する（Ｗｅｉｃｈｈｏｌｄら、１９９３、Ｔｈｅｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｋａｐｐａｌｏｃｕｓｃｏｎｓｉｓｔｓ
ｏｆｔｗｏｃｏｐｉｅｓｔｈａｔａｒｅｏｒｇａｎｉｚｅｄｉｎｏｐｐｏｓｉｔｅｐｏｌａｒｉｔｙ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１６：５０３−５１１）。これらのリピートは非常に類似しているので、近位リピートを使用することによりマウスにおいてほぼすべての遺伝子座多様性を再現することができる。さらに、遠位リピートを欠くκ軽鎖遺伝子座の天然ヒト対立遺伝子が報告されている（Ｓｃｈａｉｂｌｅら、１９９３、Ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｋａｐｐａｌｏｃｕｓ：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｈａｐｌｏｔｙｐｅｓｏｆＣａｕｃａｓｏｉｄａｎｄｎｏｎ−Ｃａｕｃａｓｏｉｄｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ、ＨｕｍＧｅｎｅｔ９１：２６１−２６７）。本発明者らは、約３Ｍｂのマウスκ軽鎖可変遺伝子配列を約０．５Ｍｂのヒトκ軽鎖可変遺伝子配列で置換して、すべてのマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを近位ヒトＶκおよびすべてのヒトＪκ遺伝子セグメントで有効に置換した（図２Ｃおよび２Ｄ；表２および４）。重鎖遺伝子座について実施例１において記載する方法とは対照的に、任意のヒト配列を付加する前に３工程のプロセスですべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する全マウスＶκ遺伝子領域を欠失させた。最初、ｎｅｏカセットを可変領域の近位端に導入した（工程Ａ、図２Ｃ）。次に、ｈｙｇカセットをκ遺伝子座の遠位端に挿入した（工程Ｂ、図２Ｃ）。残存する３ＭｂのマウスＶκ領域と共に両方の耐性遺伝子の欠失がＣＲＥ処理により誘導されるように、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ）を各選択カセットの中に再び置いた（工程Ｃ、図２Ｃ）。

重鎖について用いた方法（実施例１参照）に類似した方法を用いて、１５０ｋｂ以下のヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列を１工程で挿入して、免全疫グロブリンκ軽鎖可変領域を含有する約４８０ｋｂサイズのヒトゲノム断片を４工程の逐次的工程（図２Ｄ；表２および４）で挿入した。最後のハイグロマイシン耐性遺伝子を一過的ＦＬＰｅ発現によって除去した。重鎖と同様に、いずれの工程後にも、標的ＥＳ細胞クローンを全ヒト挿入物の完全性、正常な核型および生殖細胞系の潜在性について評価した。κ軽鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性のマウスが産生され、健常であることおよび正常な外観のものであることが判明した。

実施例２
複数のヒト化免疫グロブリン対立遺伝子の組み合わせによる完全ヒト化マウスの産生
幾つかの箇所に、実施例１に記載したようなヒト免疫グロブリン重鎖またはκ軽鎖可変レパートリーの一部分を保有するＥＳ細胞を微量注射し、得られたマウスを交配させて、ヒト生殖細胞系免疫グロブリンレパートリーの徐々に大きな断片（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの複数のバージョンを生み出した（表５；図５Ａおよび５Ｂ）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１（Ｖ１）マウスは、１８のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントおよびすべてのヒトＤ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを、１６のヒトＶκ遺伝子セグメントおよびすべてのヒトκ遺伝子セグメントと併せて有する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２（Ｖ２）およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（Ｖ３）マウスは、合計３９のＶ_Ｈおよび３０のＶκおよび８０のＶ_Ｈおよび４０のＶκをそれぞれ保有する増加した可変レパートリーを有する。マウスＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメント、ならびにＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードするゲノム領域は完全に置換されたていたので、すべてのバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにより産生される抗体が、マウス定常領域に連結されたヒト可変領域を含有する。マウスλ軽鎖遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの様々な実施形態においてインタクトなままであり、様々なＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）κ軽鎖遺伝子座の発現効率についてのコンパレータとして役立つ。

免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖両方のヒト化について二重にホモ接合性のマウスを、実施例１で記載した対立遺伝子のサブセットから産生させた。二重ホモ接合型マウスを産生するための交配コースの間に観察されたすべての遺伝子型は、大体メンデル比で発生した。ヒト重鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性の雄後代は、妊性低減を実証し、これはマウスＡＤＡＭ６活性の喪失に起因した。マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座は、２つのはめ込んだ機能的ＡＤＡＭ６遺伝子（ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ）を含有する。マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化の間、挿入されたヒトゲノム配列は、ＡＤＡＭ６偽遺伝子を含有した。マウスＡＤＡＭ６は、妊性に要求され得、それ故、ヒト偽遺伝子の存在にもかかわらずヒト化重鎖可変遺伝子遺伝子座におけるマウスＡＤＡＭ６遺伝子の欠如が妊性の低減をもたらした可能性がある。実施例７〜１１は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子のヒト化重鎖可変遺伝子遺伝子座へのリエンジニアリング、およびヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスにおける野生型レベルの妊性の回復を記載する。

実施例３
ヒト化免疫グロブリン遺伝子を有するマウスにおけるリンパ球集団
３つの異なるバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおける成熟Ｂ細胞集団をフローサイトメトリーによって評価した。

簡単に言うと、標準的な方法を用いて、骨髄、脾臓および胸腺からの細胞懸濁液を作製した。ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＦＡＣＳ染色緩衝液中５×１０^５細胞／ｍＬで細胞を再懸濁させ、抗マウスＣＤ１６／３２（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でブロッキングし、適切な抗体カクテルで染色し、ＢＤＣＹＴＯＦＩＸ（商標）で固定し、これらの作業はすべて製造業者の指示に従って行った。最終細胞ペレットを０．５ｍＬ染色緩衝液に再懸濁させ、ＢＤＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）およびＢＤＣＥＬＬＱＵＥＳＴＰＲＯ（商標）ソフトウェアを使用して分析した。すべての抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を質量希釈／カクテルで調製し、０．５ｍｇ／１０^５細胞の最終濃度まで添加した。

骨髄（Ａ〜Ｄ）染色用の抗体カクテルは、次のとおりであった：Ａ：抗マウスＩｇＭ^ｂ−ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇＭ^ａ−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｂ：抗マウスＣＤ４３（Ｓ７）−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｃ：抗マウスＣＤ２４（ＨＳＡ）−ＰＥ；抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｄ：抗マウスＢＰ−１−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ。

脾臓および鼠蹊リンパ節（Ｅ〜Ｈ）染色用の抗体カクテルは、次のとおりであった：Ｅ：抗マウスＩｇＭ^ｂ−ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇＭ^ａ−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｆ：抗マウスＩｇ、λ１、λ２、λ３軽鎖−ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇκ軽鎖−ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＡＰＣ；Ｇ：抗マウスＬｙ６Ｇ／Ｃ−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）−ＰＥ、抗マウスＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ；Ｈ：抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）−ＰＥ、抗マウスＣＤ８ａ−ＡＰＣ。結果を図６に示す。

ホモ接合型ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの脾臓またはリンパ節から単離したリンパ球をマーカーＢ２２０およびＩｇＭの表面発現について染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した（図６）。試験したすべてのバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるＢ２２０^＋ＩｇＭ^＋成熟Ｂ細胞集団のサイズは、それらが含有するＶ_Ｈ遺伝子セグメントの数にかかわらず、実質的に野生型マウスのものと同一であった。加えて、ホモ接合性ハイブリッドヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有するマウスも、正常マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有するが３つしかＶ_Ｈ遺伝子セグメントを有さないマウス、またはホモ接合性ハイブリッドヒト化κ軽鎖と正常マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有するマウスでさえも、その末梢区画に正常な数のＢ２２０^＋ＩｇＭ^＋細胞を有した（示さず）。これらの結果は、ヒト可変遺伝子セグメントおよびマウス定常領域を有するキメラ遺伝子座が、成熟Ｂ細胞区画に十分に集合できることを示している。さらに、重鎖またはκ軽鎖遺伝子座のいずれかにおける可変遺伝子セグメントの数、およびしたがって抗体レパートリーの理論的多様性は、成熟Ｂ細胞の野生型集団を産生する能力と相関しない。対照的に、ランダムに組み込まれた完全ヒト免疫グロブリン導入遺伝子および不活性化マウス免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、これらの区画に低減数のＢ細胞を有し、その欠損の重度は、導入遺伝子に含まれている可変遺伝子セグメントの数に依存する（ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＢｃｅｌｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｖａｒｉａｂｌｅｇｅｎｅｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｉｎｍｉｃｅｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄｗｉｔｈｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｙｅａｓｔａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ、ＪＥｘｐＭｅｄ１８８：４８３−４９５）。これは、「ｉｎｓｉｔｕ遺伝子ヒト化」戦略が、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」アプローチで実現されるランダムに組み込まれる導入遺伝子とは基本的に異なる機能的帰結をもたらす結果となることの証拠となる。

対立遺伝子排除および遺伝子座選択
対立遺伝子排除を維持する能力を、異なるバージョンのヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性のマウスで調査した。

１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃおよびＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃヘテロ接合胚に由来するＦ１ＥＳ系列（Ｆ１Ｈ４、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）で免疫グロブリン遺伝子座のヒト化を行った。ヒト重鎖生殖細胞系可変遺伝子配列を１２９Ｓ６対立遺伝子にターゲティングする。この対立遺伝子はＩｇＭ^ａハプロタイプを保有するが、未改変マウスＣ５７６ＢＬ／６Ｎ対立遺伝子はＩｇＭ^ｂハプロタイプを有する。ＩｇＭのこれらの対立遺伝子形態は、ＩｇＭ^ａまたはＩｇＭ^ｂ対立遺伝子において見出される多型に特異的な抗体を使用してフローサイトメトリーにより区別することができる。図６（最下段）に示されているように、各バージョンのヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性のマウスにおいて同定されたＢ細胞は、単一の対立遺伝子、ＩｇＭ^ａ（ヒト化対立遺伝子）またはＩｇＭ^ｂ（野生型対立遺伝子）のいずれか、しか発現しない。これは、対立遺伝子排除に関与する機序が、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいてインタクトであることの証拠となる。加えて、ヒト化対立遺伝子（ＩｇＭ^ａ）について陽性のＢ細胞の相対数は、存在するＶ_Ｈ遺伝子セグメントの数に大体比例する。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座は、１８のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１ヘテロ接合体マウスではＢ細胞のおおよそ３０％において発現し、ならびに３９および８０のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントをそれぞれ有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２および３（示さず）ヘテロ接合体マウスではＢ細胞の５０％において発現する。注目に値することとして、ヒト化マウス対立遺伝子を発現する細胞の、野生型マウス対立遺伝子を発現する細胞に対する比（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１マウスについては０．５およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２マウスについては０．９）は、ヒト化遺伝子座に含有される可変遺伝子セグメント数の、野生型遺伝子座に含有される可変遺伝子セグメントの数に対する比（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１マウスについては０．２およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２マウスについては０．４）より大きい。これは、対立遺伝子選択の確率が、１つもしくは他の染色体のランダム選択と任意の特定のＶセグメントＲＳＳのランダム選択の間の中間であることを示している。さらに、一方の対立遺伝子が組み換えに利用できるようになり、その過程を完了し、組換えを遮断し、その後、他方の対立遺伝子が利用能になるＢ細胞が、すべてではないが、一部存在し得る。加えて、ハイブリッドヒト化重鎖遺伝子座または野生型マウス重鎖遺伝子座のいずれかに由来する表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）を有する細胞の一様な分布は、該ハイブリッド遺伝子座が正常レベルで動作している証拠である。対照的に、ランダムに組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、野生型マウス免疫グロブリン遺伝子座との競合が不十分である（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９８９、Ａｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈｈｕｍａｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎｓｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅ、ＰＮＡＳ８６：６７０９−６７１３；Ｇｒｅｅｎら、１９９４；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３、Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎｍｉｎｉｌｏｃｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅ：ｇｅｎｅ−ｓｅｇｍｅｎｔｕｓｅｉｎｍｕａｎｄｇａｍｍａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ、ＰＮＡＳＵＳＡ９０：３７２０−３７２４）。これは、さらに、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスによって産生される免疫グロブリンが、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」アプローチによって作製されるマウスにおけるランダムに組み込まれた導入遺伝子によって産生されるものとは機能的に異なることの証拠となる。

１２９Ｓ６またはＣ５７ＢＬ／６Ｎでは、非ヒト化κ軽鎖遺伝子座に対するヒト化κ軽鎖遺伝子座の対立遺伝子排除の調査にＣκ領域の多型を利用できない。しかし、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスすべてが野生型マウスλ軽鎖遺伝子座を有するので、ヒト化κ軽鎖遺伝子座の再構成および発現がマウスλ軽鎖発現を防止できるかどうかを観察することが可能である。マウスλ軽鎖を発現する細胞の数に対するヒト化κ軽鎖を発現する細胞の数の比は、κ軽鎖遺伝子座に挿入されたヒトＶκ遺伝子セグメントの数にかかわらず、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスでは野生型マウスと比べて比較的不変であった（図６、上から三段目）。加えて、二重陽性（κ＋λ）細胞数の増加は無く、このことから、ハイブリッドκ軽鎖遺伝子座での生産的組換えが、マウスλ軽鎖遺伝子座の組換えの適切な抑制をもたらす結果となることが示された。対照的に、ランダムに組み込まれたκ軽鎖導入遺伝子と−野生型マウスλ軽鎖遺伝子座ではなく−不活性化されたマウスκ軽鎖遺伝子座を含有するマウスは、λ／κ比の劇的増大を示す（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８）。これは、導入されたκ軽鎖導入遺伝子が、かかるマウスでは十分に機能しないことを意味する。これは、さらに、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」マウスによって作製されるものと比較してＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスによって作製される免疫グロブリンにおいて観察される異なる機能的帰結の証拠となる。

Ｂ細胞発生。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおける成熟Ｂ細胞集団は、（上に記載したように）野生型マウスのものと似ているため、早期Ｂ細胞分化の欠陥を成熟Ｂ細胞集団の増殖によって補償することが可能である。フローサイトメトリーを用いてＢ細胞集団を分析することによって、様々なＢ細胞分化段階を調査した。表６は、特定の細胞表面マーカーを使用して、野生型同腹子と比較したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおける、ＦＡＣにより定義した各Ｂ細胞系列の細胞の画分の比を示すものである。

早期Ｂ細胞発生は骨髄で起こり、異なるＢ細胞分化段階は、細胞表面マーカー発現のタイプおよび量の変化によって特徴づけられる。これらの表面発現における差異は、細胞内部の免疫グロブリン遺伝子座で起こる分子の変化と相関する。プロＢ細胞からプレＢ細胞への移行には機能的重鎖タンパク質の再構成および発現の成功が必要であるが、プレＢから成熟Ｂ期への移行は、κまたはλ軽鎖の正しい再構成および発現によって支配される。したがって、Ｂ細胞分化段階間の非効率的移行は、所与の段階のＢ細胞の関連集団の変化によって検出することができる。

いずれのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいてもＢ細胞分化に大きな欠陥は認められなかった。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて、ヒト重鎖遺伝子セグメントの導入はプロＢからプレＢへの移行に影響を及ぼすようには見えず、またヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの導入はプレＢからＢへの移行に影響を及ぼさない。これは、ヒト可変領域およびマウス定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ）を保有する「逆キメラ」免疫グロブリン分子が、Ｂ細胞シグナル伝達および共受容体分子に関連して正常に機能して、マウス環境で適切なＢ細胞分化をもたらすことを実証している。対照的に、ランダムに組み込まれた免疫グロブリン導入遺伝子および不活性化された内因性重鎖またはκ軽鎖遺伝子座を含有するマウスでは、Ｂ細胞分化中の異なる集団間のバランスが様々な程度に摂動される（ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８）。

実施例４
ヒト化免疫グロブリンマウスにおける可変遺伝子レパートリー
脾細胞およびハイブリドーマ細胞を含む複数の源からのヒト可変領域の逆転写酵素・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスのヒト化抗体レパートリーにおけるヒト可変遺伝子セグメントの使用量を分析した。可変領域配列、遺伝子セグメント使用量、体細胞超変異、および再構成可変領域遺伝子セグメントの接合部多様性を決定した。

簡単に言うと、ＴＲＩＺＯＬ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＱｉａｇｅｎＲＮＥＡＳＹ（商標）ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１×１０^７〜２×１０^７脾細胞または約１０^４〜１０^５ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩＯｎｅ−ＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウス定常領域特異的プライマーでプライミングした。重鎖とκ軽鎖の両方についてのヒト可変領域の各ファミリーのためのプールされたリーダープライマーとペアで上述の３’定常特異的プライマーを個々に使用して、各試料からの２〜５μＬのＲＮＡを用いて反応を行った。試薬およびプライマーの容量、およびＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ条件は、製造業者の指示に従って行った。プライマー配列は、複数の源の基づいた（ＷａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ、２０００、ＨｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｇｅｎｅａｎａｌｙｓｉｓｂｙｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌＲＴ−ＰＣＲ、ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２４４：２１７−２２５；Ｉｇ−ｐｒｉｍｅｒｓｅｔｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ）。適宜、プールされたファミリー特異的フレームワークプライマーと第一の反応で使用したのと同じマウス３’免疫グロブリン定常特異的プライマーとを用いて第二のネステッドＰＣＲ反応を行った。各反応からのアリコート（５μＬ）をアガロース電気泳動によって分析し、ＭＯＮＴＡＧＥ（商標）ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してアガロースから反応生成物を精製した。ＴＯＰＯ（商標）ＴＡＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製生成物をクローニングし、エレクトロポレーションによりＤＨ１０β大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。各形質転換反応から個々のクローンを選択し、２ｍＬのＬＢブロス培養液（ＬＢｂｒｏｔｈｃｕｌｔｕｒｅ）中で抗生物質選択しながら一晩３７℃で成長させた。キットベースアプローチ（Ｑｉａｇｅｎ）により細菌培養物からプラスミドＤＮＡを精製した。

免疫グロブリン可変遺伝子の使用量。ＡＢＩ３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、重鎖クローンとκ軽鎖クローン両方のプラスミドＤＮＡをＴ７リバースプライマーまたはＭ１３リバースプライマーのいずれかで配列決定した。生配列データをＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（ｖ４．５、ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ）にインポートした。各配列をコンティグに組み立て、ＩＭＧＴＶ−Ｑｕｅｓｔ（Ｂｒｏｃｈｅｔら、２００８、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ：ｔｈｅｈｉｇｈｌｙｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄａｎｄｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒＩＧａｎｄＴＲｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄＶ−ＪａｎｄＶ−Ｄ−Ｊｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３６：Ｗ５０３−５０８）検索機能を用いてヒト免疫グロブリン配列にアラインして、ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、Ｊ_ＨおよびＶκ、Ｊκセグメント使用量を同定した。体細胞超変異および組換え接合部分析のために配列を生殖細胞系配列と比較した。

ＲＡＧ相補性（Ｃｈｅｎら、１９９３、ＲＡＧ−２−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ａｎａｓｓａｙｏｆｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＰＮＡＳＵＳＡ９０：４５２８−４５３２）による最初の重鎖改変（３ｈＶ_Ｈ−ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子、図２Ａの最下部）を含有するＥＳ細胞からマウスを産生させ、脾細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。挿入されたヒト遺伝子セグメント内でのＶ（Ｄ）Ｊ組換えおよびその後のマウスＩｇＭ定常ドメインまたはＩｇＧ定常ドメインのいずれかへのスプライシングによって生ずることになる予測キメラ重鎖ｍＲＮＡに特異的なプライマーセット（上記）使用して、そのｃＤＮＡを増幅させた。これらのｃＤＮＡクローンに由来する配列（示さず）は、正しいＶ（Ｄ）Ｊ組換えがヒト可変遺伝子配列内で発生したこと、再構成されたヒトＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントがインフレームでマウス定常ドメインへと正しくスプライシングしたこと、およびクラススイッチ組換えが発生したことを実証した。後続のハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座のｍＲＮＡ産物のさらなる配列分析を行った。

同様の実験で、免疫していない野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからのＢ細胞をフローサイトメトリーによりＢ２２０およびＩｇＭまたはＩｇＧの表面発現に基づいて分離した。Ｂ２２０^＋ＩｇＭ^＋または表面ＩｇＧ^＋（ｓＩｇＧ^＋）細胞をプールし、ＲＴ−ＰＣＲ増幅およびクローニング（上記）の後にＶ_ＨおよびＶκ配列を得た。非免疫ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１マウス（表７）およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３マウス（表８）からの１セットのＲＴ−ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡにおける代表的な遺伝子使用量を記録した（^＊不完全ＲＳＳ（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅＲＳＳ）；†欠けているか偽遺伝子）。アステリスク：不完全ＲＳＳを有する遺伝子セグメント。†：遺伝子セグメントが欠けているまたは偽遺伝子である。

表７および８に示したように、機能的ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、Ｊ_Ｈ、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントのほぼすべてが利用される。この実験のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスでは検出されなかったが記載した機能的可変遺伝子セグメントのうちの幾つかは、不完全組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を保有すると報告されており、それ故、発現することは期待されないことになる（Ｆｅｅｎｅｙ、２０００、ＦａｃｔｏｒｓｔｈａｔｉｎｆｌｕｅｎｃｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＢｃｅｌｌｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ、ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ２１：１９５−２０２）。ナイーブレパートリーと免疫レパートリーの両方から単離された、様々なＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからの免疫グロブリン配列の幾つかの他のセットの分析は、これらの遺伝子セグメントの使用量を、より低い頻度においてではあるが示した（データを示さない）。集合体遺伝子使用量データは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスが含有するすべての機能的ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、Ｊ_Ｈ、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、様々なナイーブおよび免疫レパートリーにおいて観察されることを示した（データを示さない）。ヒトＶ_Ｈ７−８１遺伝子セグメントは、ヒト重鎖遺伝子座配列の分析で同定されている（Ｍａｔｓｕｄａら、１９９８、Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｌｏｃｕｓ、ＪＥｘｐＭｅｄ１８８：２１５１−２１６２）が、全ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３マウスゲノムの再配列決定により確認したところ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスには存在しない。

抗体の重および軽鎖の配列が、特に再構成可変ドメイン内の短鎖ポリペプチドセグメントにおいて、例外的な可変性を示すことは公知である。これらの領域は、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知であり、抗体分子の構造内に抗原の結合部位を作る。介在ポリペプチド配列は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖と軽鎖の両方に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）がある。１つのＣＤＲ、ＣＤＲ３、は、このＣＤＲがＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントとＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの両方の組換えによって作られ、抗原と遭遇する前に相当量のレパートリー多様性を生じさせる点でユニークである。この接合は、エキソヌクレアーゼ活性によるヌクレオチド欠失と末端デオキシヌクレオチヂルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）による非テンプレートコード付加（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｅｎｃｏｄｅｄａｄｄｉｔｉｏｎ）の両方のため正確ではなく、それ故、組換え過程の結果として新規配列を可能とする。ＦＲは、全体としては可変領域の高い変異性のため実質的な体細胞変異を示すことができるが、しかし、可変性は、可変領域全域に均等に分布されない。ＣＤＲは、抗原結合を可能にする、抗体分子の表面に集中および局在する高可変領域である。接合部多様性を実証する、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからの選択された抗体のＣＤＲ３接合部周囲の重鎖および軽鎖配列を、図７Ａおよび７Ｂにそれぞれ示す。

図７Ａに示すように、非テンプレートコードヌクレオチド付加（Ｎ−付加）が、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからの抗体におけるＶ_Ｈ−Ｄ_Ｈ接合とＤ_Ｈ−Ｊ_Ｈ接合の両方において認められ、これは、ヒトセグメントに関するＴｄＴの正しい機能を示している。Ｖ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈセグメントの、該セグメントの生殖細胞系カウンターパートと比較しての終点は、エンドヌクレアーゼ活性も発生したことを示している。重鎖遺伝子座とは異なり、ヒトκ軽鎖再構成は、ＶκおよびＪκセグメントの組換えによって形成されるＣＤＲ３でのＴｄＴ付加が殆どまたは全く示さない（図７Ｂ）。これは、プレＢ細胞からＢ細胞への移行のときの軽鎖再構成中にマウスにおけるＴｄＴ発現の欠如に起因すると予想される。再構成ヒトＶκ領域のＣＤＲ３で観察される多様性は、主として、組換え事象中にエキソヌクレアーゼ活性によって導入される。

体細胞超変異。体細胞超変異と呼ばれるプロセスにより、胚中心反応中に再構成免疫グロブリン遺伝子の可変領域にさらなる多様性が加えられる。体細胞変異可変領域を発現するＢ細胞は、濾胞樹状細胞によって提示される抗原への接近について他のＢ細胞と競合する。抗原に対してより高い親和性を有するこれらのＢ細胞は、末梢へと出ていく前にさらに増殖し、クラススイッチされる。それ故、スイッチされたアイソタイプを発現するＢ細胞は、典型的に抗原に遭遇し、胚中心反応を経たものであり、ナイーブＢ細胞に比べて増加した変異数を有する。さらに、主としてナイーブｓＩｇＭ^＋Ｂ細胞からの可変領域配列は、抗原選択を受けたｓＩｇＧ^＋Ｂ細胞からの可変配列より相対的に少ない変異を有すると予想されよう。

免疫していないＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからのｓＩｇＭ^＋もしくはｓＩｇＧ^＋Ｂ細胞または免疫したマウスからのｓＩｇＧ^＋Ｂ細胞からの、ランダムＶ_ＨまたはＶκクローンからの配列を、その生殖細胞系可変遺伝子セグメントと比較し、生殖細胞系配列に対する変化に注釈を付けた。得られたヌクレオチド配列をコンピュータで翻訳し、アミノ酸変化をもたらす変異にも注釈を付けた。すべての可変領域からデータを照合し、所与の位置での変化率を算定した（図８）。

図８に示すように、免疫していないＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからのｓＩｇＧ^＋Ｂ細胞に由来するヒト重鎖可変領域は、同じ脾細胞プールからのｓＩｇＭ^＋Ｂ細胞に比べてより多くのヌクレオチドを示し、免疫したマウスに由来する重鎖可変領域は、さらに多くの変化を示す。変化の数は、フレームワーク領域に比べて相補性決定領域（ＣＤＲ）において増えており、これは抗原選択を示す。ヒト重鎖可変領域からの対応するアミノ酸配列も、ＩｇＭに比べてＩｇＧのほうが有意に多い変異の数、および免疫したＩｇＧほうがさらにいっそう多い数を示す。これらの変異もまた、フレームワーク配列と比較してＣＤＲ内においてのほうが頻度が高いようであり、これは、抗体がｉｎｖｉｖｏで抗原選択されたことを示唆している。ヌクレオチド変異数とアミノ酸変異数の同様の増加が、免疫したマウスからのＩｇＧ^＋Ｂ細胞に由来するＶκ配列に見出される。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて観察された遺伝子使用量および体細胞超変異頻度は、これらのマウスにおいて、存在する本質的にすべての遺伝子セグメントが、完全機能性逆キメラ抗体を形成するように再構成できることを実証している。さらに、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体は、マウス免疫系内で、親和性選択および成熟に至るよう充分に関与して、その標的抗原を効果的に中和できる完全成熟ヒト抗体を作製する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、複数のクラスの抗原への頑強な免疫応答を開始することができ、その結果、高親和性でもあり治療使用に好適でもある広範なヒト抗体の利用がもたらされる（データを示さない）。

実施例５
リンパ系構造および血清アイソタイプの分析
Ｈ＆Ｅで染色した野生型またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからの組織試料の脾臓、鼠蹊リンパ節、バイエル板および胸腺の全体構造を光学顕微鏡法によって調査した。野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから採集した血清中の免疫グロブリンアイソタイプのレベルを、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）技術を用いて分析した。

リンパ系器官構造。リンパ系組織の構造および機能は、造血細胞の正しい発生に一部依存する。Ｂ細胞発生または機能の欠陥は、リンパ系組織の構造の変化として示され得る。染色組織切片の分析により、野生型マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの間に二次リンパ系器官の外観の有意差は特定認されなかった（データを示さない）。

血清免疫グロブリンレベル。各アイソタイプの発現レベルは、野生型マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスで類似している（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）。これは、可変遺伝子セグメントのヒト化が、クラススイッチまたは免疫グロブリン発現および分泌に明白な有害作用を及ぼさず、したがって、これらの機能に必要なすべての内因性マウス配列を明白に維持することを実証している。

実施例６
ヒト化免疫グロブリンマウスにおける免疫および抗体産生
異なるバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを抗原で免疫して、外来抗原攻撃に対する体液性応答を調査した。

免疫およびハイブリドーマ開発。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスをタンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または抗原を発現する細胞の形態の抗原で免疫することができる。典型的には、動物に３週間ごとに合計２から３回、追加免疫する。各抗原を追加免疫後、各動物から血清試料を採集し、血清力価決定により抗原特異的抗体応答について分析する。融合前に、必要に応じて５μｇのタンパク質またはＤＮＡの融合前最終追加免疫を、腹腔内注射および／または静脈内注射によってマウスに施した。脾細胞を回収し、電気融合チャンバ内で製造業者の提案プロトコル（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．、メリーランド州グレンバーニー）に従ってＡｇ８．６５３骨髄腫細胞に融合させる。培養の１０日後、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）を用いてハイブリドーマを抗原特異性についてスクリーニングする。あるいは、免疫したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから抗原特異的Ｂ細胞を直接単離し、本明細書に記載のものを含む標準的な技術を用いてスクリーニングして、対象となる抗原に特異的なヒト抗体を得る（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４５号Ａ１明細書参照（この参考文献はその全体が参照により本明細書に援用されている））。

血清力価決定。動物抗抗原血清応答をモニターするために、各追加免疫の約１０日後に血清試料を採集し、抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いてその力価を決定する。簡単に言うと、ＮｕｎｃＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）９６ウエルプレートを２μｇ／ｍＬの抗原で一晩、４℃で被覆し、それをウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）でブロッキングする。３倍希釈系列の血清試料を１時間、室温でプレートに結合させる。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでそのプレートを洗浄し、全ＩｇＧ力価についてはＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＦｃ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウエストグローヴ）をまたはアイソタイプ特異的力価についてはビオチン標識アイソタイプ特異的ポリクローナル抗体もしくは軽鎖特異的ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ
Ｉｎｃ．）をそれぞれ使用して結合ＩｇＧを検出する。ビオチン標識抗体については、プレート洗浄後、ＨＲＰ結合体化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を添加する。ＢＤＯＰＴＥＩＡ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）などの比色基質を使用してすべてのプレートを顕色させる。１Ｍリン酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍでの光吸収を記録し、ＧｒａｐｈＰａｄからのＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析する。バックグラウンドシグナルの２倍のシグナルを得るために必要な希釈度を力価と定義する。

１つの実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスをヒトインターロイキン−６受容体（ｈＩＬ−６Ｒ）で免疫した。ｈＩＬ−６Ｒで免疫したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスについての血清力価の代表セットを図１０Ａおよび１０Ｂに示す。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスは、同様の力価範囲でＩＬ−６Ｒに対する強い応答を開始した（図１０Ａ）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型コホートからの数匹のマウスは、単回抗原追加免疫後に最大応答に達した。これらの結果は、この抗原に対する免疫応答強度および動態は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスにおいて同様であったことを示す。これらの抗原特異的抗体応答をさらに分析して、血清中で見出される抗原特異的抗体の特定のアイソタイプを調査した。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）群と野生型群の両方が主としてＩｇＧ１応答を惹起した（図１０Ｂ）。これは、体液性応答中のクラススイッチが各タイプのマウスにおいて同様であることを示唆している。

溶液中の抗原への抗体結合の親和性決定。抗原に対する抗体結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡベースの溶液競合アッセイが典型的に設計される。

簡単に言うと、順化培地中の抗体を、０から１０ｍｇ／ｍＬの範囲の抗原タンパク質の希釈系列とプレミックスする。次に、その抗体と抗原の混合物の溶液を２から４時間、室温で、結合平衡に達するまでインキュベートする。次に、その混合物中の遊離抗体の量を、定量的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定する。ＰＢＳ溶液中の１μｇ／ｍＬの抗原タンパク質で一晩、４℃で９６ウェルＭＡＸＩＳＯＲＢ（商標）プレート（ＶＷＲ、ペンシルバニア州ウエストチェスター）を被覆し、その後、ＢＳＡでの非特異的ブロッキングを行う。次に、その抗体−抗原混合物溶液をこれらのプレートに移し、その後、１時間インキュベートする。次に、そのプレートを洗浄緩衝液で洗浄し、プレートに結合した抗体をＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体試薬（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂ）で検出し、ＢＤＯＰＴＥＩＡ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）などの比色基質を使用して顕色させた。１Ｍリン酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍでの光吸収を記録し、ＧｒａｐｈＰａｄからのＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析する。溶液中の抗原の濃度に対するシグナルの依存度を４パラメータフィット分析で分析し、ＩＣ_５０（溶液中に抗原が存在しない抗体試料からのシグナルの５０％低減を達成するために必要な抗原濃度）として報告する。

１つの実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスをｈＩＬ−６Ｒで免疫した（上記のとおり）。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスからの抗ｈＩＬ６Ｒ抗体についての親和性測定値の代表セットを示すものである。

免疫したマウスに３回目の抗原追加免疫を施した後、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて血清力価を決定する。選択した野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスコホートから脾細胞を単離し、Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成し、選択下で成長させた（上記のとおり）。産生された合計６７１の抗ＩＬ−６Ｒハイブリドーマのうち、２３６は、抗原特異的抗体を発現することが判明した。抗原陽性ウェルから回収した培地を使用して、溶液競合ＥＬＩＳＡを用いて抗原への結合の抗体親和性を決定した。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体は、溶液中の抗原への結合に関して広範な親和性を示す（図１１Ａ）。さらに、２３６の抗ＩＬ−６Ｒハイブリドーマのうちの４９は、ｉｎｖｉｔｒｏバイオアッセイにおいてＩＬ−６の受容体への結合を遮断することが判明した（データを示さない）。さらに、これらの４９の抗ＩＬ−６Ｒ遮断抗体は、野生型マウスの並行免疫に由来する遮断抗体のものと同様の範囲の高い溶液親和性を示した（図１１Ｂ）。

実施例７
マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの構築
マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の、ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座での置換のため、初期バージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにはマウスＡＤＡＭ６遺伝子の発現が無い。特に、雄ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、妊性の低減を明らかに示す。それ故、妊性の欠陥をレスキューするために、ＡＤＡＭ６を発現する能力をＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに再設計した。

ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（上記）を用いて、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子のヒト化重鎖遺伝子座への挿入のためのターゲティングベクターを構築して、Ｄｒ．ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＡｌｔ（ＨａｒｖａｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した細菌人工染色体（ＢＡＣ）９２９ｄ２４を改変した。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を含有するゲノム断片と、ヒト化重鎖遺伝子座のヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントとヒトＶ_Ｈ６−１遺伝子セグメントの間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子（ｈＡＤＡＭ６Ψ）の標的欠失のためのハイグロマイシンカセットとを含有するように、９２９ｄ２４ＢＡＣＤＮＡを工学的に作製した（図１２）。

先ず、マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子と約８００ｂｐの上流（５’）配列と約４８００ｂｐの下流（３’）配列とを含有するゲノム断片を９２９ｄ２４ＢＡＣクローンからサブクローニングした。マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子と約３００ｂｐの上流（５’）配列と約３４００ｂｐの下流（３’）配列とを含有する第二のゲノム断片を、別途、９２９ｄ２４ＢＡＣクローンからサブクローニングした。マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子およびＡＤＡＭ６ａ遺伝子を含有する２つのゲノム断片を、Ｆｒｔ組換え部位が隣接するハイグロマイシンカセットにライゲートして、ターゲティングベクター（マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクター、図１２；配列番号３）を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座へのライゲーションのためにマウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子に続いてそのターゲティングベクターの５’末端上およびマウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子に続いてその３’末端上に異なる制限酵素認識部位を工学的に作製した（図１２の下部）。

マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座の、ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座での置換を含有するＢＡＣクローンには、マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの後続のライゲーションのために、ヒト化遺伝子座のヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントとヒトＶ_Ｈ６−１遺伝子セグメントの間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子（ｈＡＤＡＭ６Ψ）を含む別の改変を施した（図１３）。

簡単に言うと、ｌｏｘＰ組換え部位が隣接するネオマイシンカセットを、ヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントの３’（ｈＡＤＡＭ６Ψに対して５’）およびヒトＶ_Ｈ６−１遺伝子セグメントの５’（ｈＡＤＡＭ６Ψに対して３’；図１３の中央参照）の位置に、ヒトゲノム配列を含有するホモロジーアームを含有するように、工学的に作製した。このターゲティング構築物の挿入部位の場所は、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の約１．３ｋｂ５’側かつ約３５０ｂｐ３’側であった。このターゲティング構築物にマウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターと同じ制限酵素認識部位も含めて、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の欠失を含有する改変ＢＡＣクローンとマウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの間での後続のＢＡＣライゲーションを可能にした。

両方の構築物に由来するＢＡＣＤＮＡの消化後、そのゲノム断片を互いにライゲートして、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂヌクレオチド配列を含む、異所に配置されたゲノム配列を含有するヒト化重鎖遺伝子座を含有する、工学的に作製したＢＡＣクローンを構築した。ヒト化重鎖遺伝子座内のヒトＡＤＡＭ６遺伝子の欠失と、ＥＳ細胞へのマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列の挿入のための最終のターゲティング構築物は、５’から３’へ、ヒトＶ_Ｈ１−２遺伝子セグメントの３’の約１３ｋｂのヒトゲノム配列を含有する５’ゲノム断片；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の下流の約８００ｂｐのマウスゲノム配列；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の上流の約４８００ｂｐのゲノム配列；５’Ｆｒｔ部位；ハイグロマイシンカセット；３’Ｆｒｔ部位；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子の下流の約３００ｂｐのマウスゲノム配列；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子の上流の約３４００ｂｐのマウスゲノム配列；そしてヒトＶ_Ｈ６−１遺伝子セグメントの５’の約３０ｋｂのヒトゲノム配列を含有する３’ゲノム断片を含有した（図１３の下部）。

工学的に作製したＢＡＣクローン（上記）を使用して、ヒト化重鎖遺伝子座を含有するマウスＥＳ細胞をエレクトロポレートして、ヒト化重鎖遺伝子座内にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む、異所に配置されたマウスゲノム配列を含む改変ＥＳ細胞を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座内に異所性マウスゲノム断片を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用する定量的ＰＣＲアッセイ（ＬｉｅおよびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、１９９８、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：５’ｎｕｃｌｅａｓｅａｓｓａｙｓ、ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ９（１）：４３−４８）によって同定した。ヒト化重鎖遺伝子座の改変部分の外側の上流および下流領域を、該改変領域内に配置したプライマーおよびプローブを使用してＰＣＲにより確認して、ヒト化重鎖遺伝子座内の異所性マウスゲノム配列の存在およびハイグロマイシンカセットの存在を確認した。上流挿入点にわたるヌクレオチド配列には、次のものが含まれ、これは、該挿入点の上流のヒト重鎖ゲノム配列と、該挿入点に存在するマウスゲノム配列に隣接して連結されている（下のカッコ内に入っている）Ｉ−ＣｅｕＩ制限酵素認識部位とを示すものである：（ＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＴＡＡＴＣＧＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＧ）ＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＧＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＡＣＴＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧ（配列番号４）。標的領域の３’端の下流挿入点にわたるヌクレオチド配列には、次のものが含まれ、これは、マウスゲノム配列と、該挿入点の下流のヒト重鎖ゲノム配列に隣接して連結されている（下のカッコ内に入っている）ＰＩ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位とを示すものである：（ＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＣＡＴＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴ）ＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＡＧ（配列番号５）。

上に記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスの工学的作製方法（例えば、米国特許第７，６５９８，４４２号、同第７，５７６，２５９号および同第７，２９４，７５４号参照）により８細胞期マウス胚に導入した。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム配列を含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスを、該ヒト化重鎖遺伝子座内のマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）の改良法を用いる遺伝子型解析によって同定した。

マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスをＦＬＰｅデリーターマウス系統（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、２０００、Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｄｅｌｅｔｅｒｍｉｃｅｓｈｏｗｔｈａｔＦＬＰｅｉｓａｎａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏＣｒｅ−ｌｏｘＰ．Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２５：１３９−１４０参照）と交配させて、例えばＥＳ細胞期でまたは胚で除去されないターゲティングベクターによって導入された一切のＦｒｔ’ｅｄハイグロマイシンカットを除去した。必要に応じて、ハイグロマイシンカセットをマウス内に保持した。

子を遺伝子型解析し、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有するヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子を、マウスＡＤＡＭ６遺伝子発現および妊性の特徴づけのために選択した。

実施例８
ＡＤＡＭ６レスキューマウスの特徴づけ
フローサイトメトリー。ヒト重およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）の２５週齢の３匹のマウスと、ヒト重鎖遺伝子座の両方の対立遺伝子内にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重およびヒトκ軽鎖についてホモ接合性（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）の１８〜２０週齢の３匹のマウスを、ＢＤＬＳＲＩＩＳｙｓｔｅｍ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でのＦＡＣｓによるリンパ球細胞集団の同定および分析のために屠殺した。リンパ球を特定の細胞系列についてゲートし、Ｂ細胞発生の様々な段階を経る発達について分析した。動物から採集した組織としては、血液、脾臓および骨髄が挙げられる。ＥＤＴＡが入っているＢＤマイクロテイナーチューブ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に血液を採集した。ウシ胎仔血清とピルビン酸ナトリウムとＨＥＰＥＳと２−メルカプトエタノールと非必須アミノ酸とゲンタマイシンとを補充した完全ＲＰＭＩ培地でフラッシュすることにより大腿骨から骨髄を採集した。血液、脾臓および骨髄調製物からの赤血球を塩化アンモニウム系溶解緩衝液（例えば、ＡＣＫ溶解緩衝液）で溶解し、その後、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。

細胞集団を染色するために、様々な組織源からの１×１０^６細胞を氷上で１０分間、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートし、その後、下記の抗体カクテルの１つまたは組み合わせで３０分間、氷上で標識した。

骨髄：抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ４３（１Ｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ−ｃｋｉｔ（２Ｂ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ａ７００−ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。

末梢血および脾臓：抗マウスＦＩＴＣ−κ（１８７．１、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−λ（ＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１、ＢＤ）、Ａ７００−ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ）、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。標識された抗体と共にインキュベートした後、細胞を洗浄し２％ホルムアルデヒドで固定した。データ収集をＬＳＲＩＩフローサイトメーターで行い、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で分析した。代表Ｈ^＋／＋κ^＋／＋およびＨ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスからの結果を図１４〜１８に示す。

結果は、Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスのＢ細胞が、骨髄および末梢区画においてＨ^＋／＋κ^＋／＋マウスと同様の様式でＢ細胞発生段階を経て発達すること、それらが末梢に入ると正常な成熟パターンを示すを実証している。Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスは、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスと比較して増大したＣＤ４３^ｉｎｔＣＤ１９^＋細胞集団を明示した（図１６Ｂ）。これにより、Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスにおける、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有するヒト化重鎖遺伝子座からＩｇＭ発現の促進を示すことができる。末梢では、Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスのＢおよびＴ細胞集団は、正常であり、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスと同様であるようである。

精巣の形態および精子の特徴づけ。ヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を有するマウスにおける不妊性が、精巣および／または精子産生の欠陥に起因するかどうかを決定するために、精巣の形態および精巣上体の精子含有量を調査した。

簡単に言うと、２群（１群につきｎ＝５；群１：ヒト重鎖およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋；群２：ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてヘテロ接合性およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス、Ｈ^＋／−κ^＋／＋）から精巣をインタクトな精巣上体と共に切開し、計量した。次に、その検体を固定し、パラフィンに包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色剤で染色した。精巣切片（マウス１匹につき２つの精巣、合計２０）を形態の欠陥および精子産生の証拠について調査し、一方、精巣上体切片を精子の存在について調査した。

この実験では、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスとＨ^＋／−κ^＋／＋マウスの間で精巣重量または形態の差は観察されなかった。すべての遺伝子型の精巣および精巣上体の両方において、精子が観察された。これらの結果は、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の不在が、精巣形態の検出可能な変化をもたらさないこと、ならびにマウスにおいてこれら２つの遺伝子の存在下および不在下で精子が産生されることを確証する。したがって、雄Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスの妊性の欠陥が低い精子産生量に起因する可能性は低い。

精子の運動能および移動。他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーが無いマウスは、精子の運動能または移動の欠陥に起因して不妊性である。精子の移動は、子宮から卵管に進む精子の能力と定義され、通常、マウスの受精に必要である。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの欠失がこのプロセスに影響を及ぼすかどうかを決定するために、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスにおける精子の移動および運動能を評価した。

簡単に言うと、（１）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてヘテロ接合性およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／−κ^＋／＋）；（２）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）；（３）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性および野生型κ軽鎖についてホモ接合性のマウス（Ｈ^＋／＋ｍκ）；および（４）野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）の精巣から精子を得た。検査により精子数または総合的精子運動能に重大な異常は認められなかった。すべてのマウスについて、卵丘細胞分散（ｃｕｍｕｌｕｓｄｉｓｐｅｒｓａｌ）が観察された。これは、各精子試料がｉｎｖｉｔｒｏで卵丘細胞に侵入して透明帯を結合できることを示していた。これらの結果は、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスが、卵丘に侵入して透明帯を結合し得る精子を有することを確証する。

ｉｎｖｉｔｒｏでのマウス卵子の受精（ＩＶＦ）を、上記のマウスからの精子を使用して行った。ＩＶＦの翌日にＨ^＋／＋κ^＋／＋マウスについてやや少ない数の卵割胚が観察され、卵子に結合した精子の低減数も観察された。これらの結果は、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスからの精子が、卵子に曝露されると、卵丘に侵入して透明帯を結合し得ることを確証する。

もう１つの実験では、子宮から卵管を通って移動するＨ^＋／＋κ^＋／＋マウスからの精子の能力を精子移動アッセイで決定した。

簡単に言うと、過排卵雌マウスの第一の群（ｎ＝５）をＨ^＋／＋κ^＋／＋雄（ｎ＝５）を用意し、過排卵雌マウスの第二の群（ｎ＝５）をＨ^＋／−κ^＋／＋雄（ｎ＝５）を用意した。これらの交配ペアを交尾について観察し、交尾の５から６時間後、分析のためにすべての雌から子宮および付属の卵管を除去し、フラッシュした。フラッシュ溶液を卵子について点検して排卵を検証し、精子数を得た。精子移動を２つの異なる方法で評価した。第一に、両方の卵管を子宮から除去し、食塩水でフラッシュし、確認された一切の精子を計数した。卵子の存在も排卵の証拠として書き留めた。第二に、卵管を子宮に付属したまま残し、両方の組織を固定し、パラフィンに包埋し、切片にして染色した（上記のとおり）。切片を子宮内の精子の存在についても、両方の卵管における精子の存在についても調査した。

５匹のＨ^＋／＋κ^＋／＋雄と交配させた雌については、卵管からのフラッシュ溶液中に精子が殆ど見つからなかった。Ｈ^＋／―κ^＋／＋雄と交配させた雌の卵管からのフラッシュ溶液は、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋雄と交尾させた雌の卵管からのフラッシュ溶液中に存在するものより約２５から３０倍多い精子レベル（平均、ｎ＝１０卵管）を示した。Ｈ^＋／＋κ^＋／＋およびＨ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスの代表交配比較を表９に示す。

子宮および卵管の組織学的切片を調製した。その切片を子宮および卵管（ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓｔｕｂａｒｉｕｓ）においての精子の存在について調査した。卵管および子宮の組織学的切片の検査により、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスと交配させた雌マウスについては子宮では精子を認めるが卵管では認められないことが明らかにされた。さらに、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスと交配させた雌からの切片により、精子が子宮卵管境界（ＵＴＪ）で認められないことが明らかになった。Ｈ^＋／−κ^＋／＋マウスと交配させた雌からの切片では、ＵＴＪおよび卵管において精子が同定された。

これらの結果は、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いているマウスがｉｎｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を作ることを確証する。すべての場合、精子が子宮内に観察された。これは、交配および精子放出は正常に行われたようであるが、精子数または組織学的観察のいずれかによって測定すると、交配後に卵管内で精子は殆どまたは全く観察されなかったことを示していた。これらの結果は、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いているマウスが、子宮から卵管への移動不能を示す精子を産生することを確証する。精子が子宮卵管境界（ｕｔｅｒｉｎｅ−ｔｕｂｕｌｅｊｕｎｃｔｉｏｎ）を越えて、卵子が受精する卵管へと移動することができないため、この欠陥は不妊性をもたらすようである。纏めると、これらの結果のすべてが、マウスＡＤＡＭ６遺伝子は、正常移動能を有する精子を子宮から出て子宮卵管境界および卵管を通って移動するように方向づけ、そうして卵子に近づいて受精事象を実現するという仮説の支持に向けられる。ＡＤＡＭ６がこれを実現する機序は、前記ＡＤＡＭ６タンパク質の一方もしくは両方によって方向づけられることもあり、または下に記載するような、精子細胞における他のタンパク質、例えば他のＡＤＡＭタンパク質、との協調発現により方向づけられることもある。

ＡＤＡＭ遺伝子ファミリー発現。ＡＤＡＭタンパク質の複合体が、成熟中の精子の表面に複合体として存在することは公知である。他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーが無いマウスは、精子が成熟するにつれてこの複合体を喪失し、成熟精子において複数のＡＤＡＭタンパク質の低減を示す。ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の欠如が、他のＡＤＡＭタンパク質に対して同様に影響を及ぼすかどうかを決定するために、精巣（未熟精子）および精巣上体（成熟中の精子）からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットを分析して、他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーの発現レベルを決定した。

この実験では、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋およびＨ^＋／−κ^＋／＋マウスの群（１群あたりｎ＝４）からのタンパク質抽出物を分析した。その結果は、ＡＤＡＭ２およびＡＤＡＭ３の発現が影響を受けないことを精巣抽出物中で示した。しかし、ＡＤＡＭ２とＡＤＡＭ３の両方が、精巣上体抽出物中では劇的に低減していた。これは、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスの精液中のＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの不在が、精子が成熟するにつれて他のＡＤＡＭタンパク質（例えば、ＡＤＡＭ２およびＡＤＡＭ３）の発現およびおそらく機能に対して直接影響を及ぼし得ることを明示する。これは、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂが、精子の表面にＡＤＡＭタンパク質複合体の部分として存在し、そのことが正しい精子移動にとって極めて重要であり得ることを示唆している。

実施例９
ＡＤＡＭ６レスキューマウスにおけるヒト重鎖可変遺伝子使用
ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用する定量的ＰＣＲアッセイ（上記のとおり）によりマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いている（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）か、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードする異所性ゲノム断片を含有する（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）かのいずれかの、ヒト重およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウスについて、選択ヒト重鎖可変遺伝子使用量を決定した。

簡単に言うと、マウスＣＤ１９Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用してＨ^＋／＋κ^＋／＋およびＨ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスの脾臓からのＣＤ１９^＋Ｂ細胞を精製し、ＲＮＥＡＳＹ（商標）Ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを精製した。ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅオンカラム処理剤（Ｑｉｇａｅｎ）を使用してゲノムＲＮＡを除去した。ＦｉｒｓｔＳｔａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して約２００ｎｇのｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、ＡＢＩ７９００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＴＡＱＭＡＮ（商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で増幅した。各遺伝子の相対発現をマウスκ軽鎖定常領域（ｍＣκ）の発現に正規化した。表１０は、この実験に使用したセンス／アンチセンス／ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＭＧＢプローブの組み合わせを示すものである。

この実験では、分析した試料において４つすべてのヒトＶ_Ｈ遺伝子の発現が観察された。さらに、発現レベルは、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスとＨ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスの間で類似するものであった。これらの結果は、改変部位に対して遠位にあるヒトＶ_Ｈ遺伝子（Ｖ_Ｈ３−２３およびＶ_Ｈ１−６９）および改変部位に対して近位にあるヒトＶ_Ｈ遺伝子（Ｖ_Ｈ１−２およびＶ_Ｈ６−１）の両方ともすべてが、機能的に発現するヒト重鎖を形成するように組み換えることができた。これらの結果は、ヒト重鎖ゲノム配列に挿入されたマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性ゲノム断片が、その遺伝子座内でのヒト重鎖遺伝子セグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換えに影響を及ぼさなかったこと、およびこれらのマウスが、通常の様式でヒト重鎖遺伝子セグメントを組換えて、機能的重鎖免疫グロブリンタンパク質を産生することができることを明示している。

実施例１０
ＡＤＡＭ６レスキューマウスにおける体液性免疫応答
マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いている（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）か、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードする異所性ゲノム断片を含有する（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）かのいずれかの、ヒト重およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウスについて、多価抗原免疫スキーム、続いて抗体単離および特徴づけにより、体液性免疫応答を決定した。結果を、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むＶ（Ｄ）Ｊ組換えに対する任意の作用の決定、血清力価の推移、ハイブリドーマによる抗体の産生および抗原に対する親和性の評価のために比較した。

免疫プロトコル。ヒト細胞表面受容体（抗原Ａ）、ヒト受容体チロシン・プロテインキナーゼに対して特異的なヒト抗体（抗原Ｂ）、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を調節する機能を果たす分泌ヒトタンパク質（抗原Ｃ）、およびヒト受容体チロシンキナーゼ（抗原Ｄ）を、マウスの群における比較免疫に利用した。上記抗原での免疫の前にマウスの群から血清を採集した。初回抗原刺激免疫では、アジュバントとして１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合して各抗原（各２．３μｇ）を投与した。マウス１匹につき２５μＬの容量の免疫原を足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）（ｆ．ｐ．）経由で投与した。その後、２．３μｇの抗原をアジュバントとしての１０μｇのＣｐＧおよび２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）と共に用いて、合計６回の追加免疫のために第３、６、１１、１３、１７および２０日にｆ．ｐ．経由でマウスに追加免疫した。４回目および６回目の追加免疫後、それぞれ第１５および２２日にマウスを交配させ、抗血清を各特異的抗原に対する抗体力価についてアッセイした。

ＥＬＩＳＡアッセイを用いて免疫したマウスの血清における抗体力価を決定した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のそれぞれの抗原（２μｇ／ｍＬ）で９６ウェルマイクロタイタープレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を一晩、４℃で被覆した。翌日、プレート洗浄機（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を使用して、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で４回、プレートを洗浄した。その後、ＰＢＳ中０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２５０μＬでプレートをブロッキングし、１時間、室温でインキュベートした。その後、４回、ＰＢＳ−Ｔでプレートを洗浄した。免疫したマウスからの血清および免疫する前の血清を、１：３００または１：１０００で開始して０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中で３倍段階希釈し、ブロッキングしたプレートに２つひと組で添加し、１時間、室温でインキュベートした。最後の２つのウェルは空のままにして、二次抗体対照として使用した。プレートをプレート洗浄機においてＰＢＳ−Ｔで再び４回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ−カッパ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）結合体化二次抗体の１：５０００／１：１０，０００希釈物をプレートに添加し、１時間、室温でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで８回、プレートを再び洗浄し、ＴＭＢ／Ｈ_２Ｏ_２を基質として使用して顕色させた。その基質を２０分間インキュベートし、２ＮＨ_２ＳＯ_４（ＶＷＲ）または１ＮＨ_３ＰＯ_４（ＪＴＢａｋｅｒ）で反応を停止させた。分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍでプレートを読み取った。ＧｒａｐｈｐａｄＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して抗体力価を算定した。

バックグラウンドより２倍上に相当する抗原結合のシグナルにおける、実験的滴定範囲内の血清希釈度として血清力価を算定した。体液性免疫応答についての結果を図１９（抗原Ａ）、図２０（抗原Ｂ）、図２１（抗原Ｃ）および図２２（抗原Ｄ）に示す。選択した免疫の各群からのマウスから単離した２つの脾臓を使用して作製したハイブリドーマの抗原陽性スコアを図１１に示す（抗原スコアは、２Ｘ／バックグラウンドに等しい）。

この実施例に示すように、Ａｄａｍ６レスキューマウス（Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）において産生された抗体の力価は、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂが無く、ヒト化重鎖を有するマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋）に匹敵した。さらに、Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスからの脾臓は、高親和性の抗体を含めて、試験したすべての抗原について抗原陽性ハイブリドーマをＨ^＋／＋κ^＋／＋マウスに匹敵するレベルで生じさせた。したがって、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有する高い親和性を有する抗体の産生にかんがみて、Ａｄａｍ６レスキューマウスにおいてヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換えの欠陥は存在しないと考えられる。

実施例１１
抗原結合親和性の決定
抗原Ｂへの特異的結合を示す抗体の結合親和性を、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ２０００）を使用してスクリーニングした。抗原Ｂで免疫した２系統のマウス（Ｈ^＋／＋κ^＋／＋およびＨ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋）から単離したハイブリドーマからの順化培地をＢＩＡｃｏｒｅスクリーニング中に使用した。ＢＩＡｃｏｒｅセンサー表面を、先ず、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体（ＧＥ）で誘導体化して、順化培地から抗抗原Ｂ抗体を捕捉した。全スクリーニング法の間、ＨＢＳＴ（０．０１ＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）をランニング緩衝液として使用した。抗原ＢのＦａｂ断片を５０μＬ／分の流量で、１００ｎＭ濃度で、抗抗原Ｂ抗体捕捉表面にわたって注入した。ＨＢＳＴランニング緩衝液中で、抗体−抗原会合を３分間モニターし、そして一方、捕捉された抗体からの抗原の解離を５分間モニターした。この実験を２５℃で行った。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０曲線フィッティングソフトウェアを使用する１：１結合モデルへの、データの処理およびフィッティングによって、会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）反応速度定数を決定した。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（Ｔ_１／２）をその反応速度定数から次のように算定した：Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびＴ１／２（分）＝（ｌｎ２／（６０^＊ｋｄ）。選択抗抗原Ｂ抗体の結果を表１２に示す。

同様の実験で、抗原Ａに結合するハイブリドーマ−順化培地に存在する異なるモノクローナル抗体の動態を、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ
４０００）アッセイを用いて決定した。このアッセイで使用したすべてのハイブリドーマクローンは、Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスにおいて産生された。

簡単に言うと、抗原Ａ特異的抗体を捕捉するために、先ず、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体（ＧＥカタログ＃ＢＲ−１００８−３８）をセンサーチップ上に固定した。２つの異なる緩衝液−ＰＢＳＰ、ｐＨ７．２およびＰＢＳＰ、ｐＨ６．０−で、ＢＩＡｃｏｒｅスクリーニングを行った。両方の緩衝液に０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを補充した。順化培地からの抗抗原Ａ抗体の捕捉後、１μＭの抗原Ａ単量体（それぞれのランニング緩衝液中で調製したもの）を、１．５分間、３０μＬ／分で捕捉抗体表面にわたって注入し、２５℃のそれぞれのランニング緩衝液で１．５分間、結合抗原Ａ単量体の解離をモニターした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０曲線フィッティングソフトウェアを使用する１：１結合モデルへの、データの処理およびフィッティングにより、会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）反応速度定数を決定した。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（Ｔ_１／２）をその反応速度定数から次のように算定した：Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびＴ_１／２（分）＝（ｌｎ２／（６０^＊ｋｄ）。ｐＨ７．２およびｐＨ６．０で抗原Ａ単量体に結合する選択抗抗原Ａ抗体についての結合動態パラメータを表１３に示す。ＮＢ：この実験条件下で結合が検出されなかった。

上に示したように、Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスとＨ^＋／＋κ^＋／＋マウスの両方から、類似する特徴の高親和性抗体を得た。表１２に提示した２５の抗体の中で、Ｈ^＋／＋Ａ６^ｒｅｓκ^＋／＋マウスにおいて産生された２０の抗体は、０．５ｎＭから１μＭの範囲の親和性を明白に示し、そして一方で、Ｈ^＋／＋κ^＋／＋マウスにおいて産生された５つの抗体は、１０ｎＭから１５０ｎＭの範囲の親和性を明白に示した。さらに、図１３に示した５５の抗体は、抗原Ａ単量体への結合について２０ｐＭから３５０ｎＭの範囲の親和性を明白に示した。

この実施例で実証されるように、マウスＡｄａｍ６遺伝子のヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座への再挿入は、工学的に作製された生殖細胞系から再構成されたヒト遺伝子セグメントに由来する、ナノモル濃度以下の範囲（ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒｒａｎｇｅ）の多様な親和性を有するヒト抗体のレパートリーを特徴とする複数の抗原に対する頑強な免疫応答を開始させるマウスの能力を害さない。

Claims

本願明細書に記載された発明。