JP2013543383A

JP2013543383A - ヒトｔｗｅａｋに対する抗体およびその使用

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Publication number: JP2013543383A
Application number: JP2013532140A
Authority: JP
Inventors: ベーナー，モニカ; クネットゲン，ヘンドリク; ニーヴェーナー，イェンス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-10-05
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2013-12-05
Anticipated expiration: 2031-09-30
Also published as: HK1186195A1; EP2625200A1; CN103154029A; EA201300418A1; JP5941049B2; AU2011311673A1; US9187564B2; CL2013000901A1; TW201219054A; MX2013003592A; BR112013007293A2; TWI482630B; KR101584416B1; US20120121583A1; CR20130108A; ECSP13012542A; SG188605A1; AR083336A1; WO2012045671A1; PH12013500506A1

Abstract

重鎖可変ドメインとして配列番号８、１６または２４からなる群より選択されるＣＤＲ３Ｈを含むことによって特徴付けられる、ＴＷＥＡＫに結合することによって特徴付けられる、ＴＷＥＡＫに結合する抗体は、癌または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置に有用である。

Description

本発明は、ヒトＴＷＥＡＫに対する抗体（ＴＷＥＡＫ抗体）、その産生法、前記抗体を含む薬学的組成物、およびその使用に関する。

発明の背景
ヒトＴＷＥＡＫ（UniProtKB O43508、ＴＮＦに関連した弱いアポトーシス誘導物質、配列番号６０）は、細胞表面に結合したＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＷＥＡＫは、Chicheportiche, Y., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 32401-32410; Marsters, S.A., et al., Curr. Biol. 8 (1998) 525-528; Lynch, C.N., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 8455-8459に記載されている。ＴＷＥＡＫの活性形は可溶性のホモトリマーである。ヒトおよびマウスＴＷＥＡＫは、レセプター結合ドメインにおいて９３％の配列同一性を示す。ＴＷＥＡＫレセプターＦｎ１４（線維芽細胞増殖因子誘導性の１４ｋＤａのタンパク質）は、リガンド結合ドメインにおいて単一のシステインリッチドメインからなる１２９アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＷＥＡＫのシグナル伝達はＮＦ−ΚＢ経路の活性化を介して起こる。ＴＷＥＡＫｍＲＮＡは多種多様な組織において発現され、そして大半の主要な臓器、例えば心臓、脳、骨格筋、および膵臓、免疫系に関連した組織、例えば脾臓、リンパ節および胸腺に見られる。Ｆｎ１４ｍＲＮＡは、心臓、脳、肺、胎盤、血管ＥＣおよび平滑筋細胞において検出されている。ＴＷＥＡＫヌルおよびＦｎ１４ヌルノックアウトマウスは生存可能で健康で繁殖性であり、そしてより多くのナチュラルキラー細胞を有し、そして増強された自然炎症応答を示す。ＴＷＥＡＫは、アポトーシス、増殖、血管新生、虚血半影、脳浮腫、多発性硬化症に関与している。

抗ＴＷＥＡＫ抗体は、ＷＯ１９９８／００５７８３、ＷＯ２０００／０４２０７３、ＷＯ２００３／０８６３１１、ＷＯ２００６／１３０４２９、ＷＯ２００６／１３０３７４、ＷＯ２００６／１２２１８７、ＷＯ２００６／０８９０９５、ＷＯ２００６／０８８８９０、ＷＯ２００６／０５２９２６に記載されている。

発明の要約
本発明は、重鎖可変ドメインとして配列番号８、１６または２４からなる群より選択されるＣＤＲ３領域（ＣＤＲ３Ｈ）を含むことを特徴とする、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体を含む。

本発明は、配列番号１の可変軽鎖および配列番号５の可変重鎖を含む抗体の、配列番号９の可変軽鎖および配列番号１３の可変重鎖を含む抗体の、または配列番号１７の可変軽鎖および配列番号２１の可変重鎖を含む抗体の、キメラ、ヒト化またはＴ細胞エピトープの欠失した変異体を含む。

１つの態様において、抗体は、配列番号６のＣＤＲ１Ｈ、配列番号７のＣＤＲ２Ｈ、および配列番号８のＣＤＲ３Ｈを含むことによって特徴付けられる。

１つの態様において、配列番号１４のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ、および配列番号１６のＣＤＲ３Ｈを含むことによって特徴付けられる。

１つの態様において、抗体は、配列番号２２のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ、および配列番号２４のＣＤＲ３Ｈを含むことによって特徴付けられる。

１つの態様において、抗体は、配列番号６のＣＤＲ１Ｈ、配列番号７のＣＤＲ２Ｈ、配列番号８のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号４のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる。

１つの態様において、抗体は、配列番号１４のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１６のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号１０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる。

１つの態様において、抗体は、配列番号２２のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２４のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる。

１つの態様において、抗体は、軽鎖可変ドメイン配列として、配列番号１、９、１７、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、５６または５８からなる群より選択される配列を含むことによって特徴付けられる。

１つの態様において、抗体は、重鎖可変ドメイン配列として、配列番号５、１３、２１、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５７または５９からなる群より選択される配列を含むことによって特徴付けられる。

１つの態様において、抗体は、軽鎖可変ドメイン配列として、配列番号１７、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６からなる群より選択される配列、および重鎖可変ドメイン配列として、配列番号２１、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７または４８からなる群より選択される配列を含むことによって特徴付けられる。

好ましいのは、１／５、９／１３、１７／２１、２５／３７、２６／３８、２７／３９、２８／４０、２９／４１、３０／４２、３１／４３、３２／４４、３３／４５、３４／４６、３５／４７、３６／４８、５６／５７、５８／５９からなる群より選択される可変軽鎖および重鎖の組合せである（例えば、１７／２１は、配列番号１７の可変軽鎖および配列番号２１の可変重鎖を含む抗体を意味する）。

本発明の１つの態様は、配列番号６のＣＤＲ１Ｈ、配列番号７のＣＤＲ２Ｈ、配列番号８のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号４のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体である。

本発明の１つの態様は、配列番号１４のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１６のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号１０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体である。

本発明の１つの態様は、配列番号２２のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２４のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体である。

本発明の１つの態様は、ａ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、ｂ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４４の可変重鎖、ｃ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４５の可変重鎖、ｄ）配列番号２６の可変軽鎖および配列番号４７の可変重鎖、ｅ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４４の可変重鎖、ｆ）配列番号３１の可変軽鎖および配列番号４５の可変重鎖、またはｇ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖を含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体である。

本発明の１つの態様は、ａ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、ｂ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４４の可変重鎖、ｃ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４５の可変重鎖、ｄ）配列番号２６の可変軽鎖および配列番号４７の可変重鎖、ｅ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４４の可変重鎖、ｆ）配列番号３１の可変軽鎖および配列番号４５の可変重鎖、ｇ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、またはｈ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号３９の可変重鎖を含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体である。

これらの抗体は、本出願において以下のように呼称される。

本発明の１つの態様は、ａ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、ｂ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４５の可変重鎖、ｃ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４４の可変重鎖、ｄ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、またはｅ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号３９の可変重鎖を含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体である。

１つの態様において、ＴＷＥＡＫに結合し、そして前記のアミノ酸配列およびアミノ酸配列フラグメントによって特徴付けられる抗体は、１つの態様において突然変異Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１アイソタイプである。１つの態様において、ＴＷＥＡＫに結合し、そして前記のアミノ酸配列およびアミノ酸配列フラグメントによって特徴付けられる抗体は、好ましくは突然変異Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４アイソタイプである。

本発明による抗体は、ヒトＴＷＥＡＫに特異的に結合し、そしてビアコアによって測定したところ、２５℃において１５分間以上の可溶性マウスＴＷＥＡＫ（配列番号６１のアミノ酸８１〜２２５）と抗体との間の複合体の半減期を好ましくは示し、そしてマウスＴＷＥＡＫに結合し、そして４．９ng/ml以下のＩＣ_５０値でマウスＴＷＥＡＫとＦｎ１４との間の相互作用を阻害する。

好ましくは、本発明による抗体は、ビアコアによって測定したところ、２５℃において１００分間以上、好ましくは１１０分間以上の可溶性ヒトＴＷＥＡＫ（配列番号６０のアミノ酸９９〜２４９）と抗体との間の複合体の半減期を示す。このような半減期を示す抗ＴＷＥＡＫ抗体は、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置に使用するために特に好ましい。

好ましくは、本発明による抗体は、３．５ng/ml以下、好ましくは２．５ng/ml以下のＩＣ_５０値でヒトＴＷＥＡＫとＦｎ１４との間の相互作用を阻害する。本明細書において使用するＩＣ_５０は、ヒトＴＷＥＡＫとＦｎ１４との間の相互作用の５０％を遮断する抗体の量を意味する。

抗体は、１つの態様において突然変異Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａを有する、１つの態様においてヒトＩｇＧ１アイソタイプである。１つの態様において、本発明による抗体は、好ましくは突然変異Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを有する、ヒトＩｇＧ４アイソタイプである。好ましくは、抗体はヒト化またはヒト抗体である。

本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む薬学的組成物である。

本発明のさらなる態様は、薬学的組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。

本発明のさらなる態様は、癌、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置用の医薬品の製造のための本発明による抗体である。

本発明のさらなる態様は、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置用の医薬品の製造のための本発明による抗体である。

本発明のさらなる態様は、大腸癌、肺癌または膵臓癌の処置用の医薬品の製造のための本発明による抗体である。

本発明のさらなる態様は、癌、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置用の医薬品の製造のための本発明による抗体の使用である。

本発明のさらなる態様は、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置用の医薬品の製造のための本発明による抗体の使用である。

本発明のさらなる態様は、大腸癌、肺癌または膵臓癌の処置用の医薬品の製造のための本発明による抗体の使用である。

本発明のさらなる態様は、本発明による抗体をコードする核酸である。

本発明のさらなる態様は、本発明による抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。

本発明はさらに、原核または真核宿主細胞において本発明による核酸を発現することのできる前記核酸を含む発現ベクター、およびこのような抗体の組換え産生のためのこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明はさらに、本発明によるベクターを含む原核または真核宿主細胞を含む。

本発明はさらに、原核または真核宿主細胞において本発明による核酸を発現し、そして前記細胞または細胞培養上清から前記抗体を回収することによって特徴付けられる、本発明による組換えヒトまたはヒト化抗体の産生法を含む。本発明はさらに、このような組換え法によって得ることのできる抗体を含む。

本発明による抗体は、ＴＷＥＡＫ標的化療法の必要性がある患者に利点を示す。本発明による抗体は、癌疾患を患う、特に大腸癌、肺癌または膵臓癌を患う、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷を患う患者に利点をもたらす新規かつ発明的な特性を有する。

本発明はさらに、癌、特に大腸癌、肺癌または膵臓癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷を患う患者を処置するための方法を提供し、これは、このような疾患を有すると診断され（それ故、このような療法の必要性がある）患者に有効量の本発明によるＴＷＥＡＫに結合する抗体を投与することを含む。抗体は、好ましくは、薬学的組成物で投与される。

本発明のさらなる態様は、患者に本発明による抗体を投与することによって特徴付けられる、癌、特に大腸癌、肺癌または膵臓癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷を患う患者の処置法である。

本発明はさらに、癌、特に大腸癌、肺癌または膵臓癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷を患う患者の処置のための、および本発明による薬学的組成物の製造のための、本発明による抗体の使用を含む。さらに、本発明は、本発明による薬学的組成物の製造法を含む。

本発明はさらに、薬学的目的のための抗体の製剤化に有用な緩衝剤および／またはアジュバントを場合により一緒に含む、本発明による抗体を含む薬学的組成物を含む。

本発明はさらに、薬学的に許容される担体中に本発明による抗体を含む薬学的組成物を提供する。１つの態様において、薬学的組成物は、製造品またはキットに含まれ得る。

本発明による抗体による、関節リウマチのマウスモデルであるコラーゲン誘発性関節炎の阻害。

発明の詳細な説明
「抗体」という用語は、抗体全体、二重特異性抗体および抗体フラグメントを含むがそれらに限定されない、種々の形の抗体構造を包含する。本発明による抗体は好ましくは、本発明による特徴的な特性が保持されている限り、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはさらに遺伝子工学された抗体である。

「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、または少なくともその抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例としては、ジアボディ、一本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。さらに、抗体フラグメントは、すなわちＶ_Ｌドメインと一緒に機能的抗原結合部位を構築することのできるＶ_Ｈドメインの、またはすなわちＶ_Ｈドメインと一緒に機能的抗原結合部位を構築することのできるＴＷＥＡＫに結合するＶ_Ｌドメインの、特徴を有する一本鎖ポリペプチドを含む。

本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。

「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンと比較して異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変されている抗体を指す。好ましい態様において、ウサギＣＤＲがヒト抗体のフレームワーク領域に移植されることにより、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270参照。

「キメラ抗体」という用語は、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される、マウス由来の可変領域（すなわち結合領域）と、異なる起源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む、モノクローナル抗体を指す。例えばマウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体。このようなマウス／ヒトキメラ抗体は、ラット免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む、免疫グロブリン遺伝子発現産物である。本発明によって包含される他の形の「キメラ抗体」は、クラスまたはサブクラスが元の抗体のそれから改変または変化したものである。このような「キメラ」抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体の産生法は、当技術分野において現在では周知である従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術を含む。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent Nos. 5,202,238および5,204,244参照。

「Ｔ細胞エピトープの欠失した抗体」という用語は、ヒトＴ細胞エピトープ（ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するタンパク質内のペプチド配列）を除去することによって免疫原性を除去または低下させるように改変された抗体を指す。この方法によって、ペプチドのアミノ酸側鎖と、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝を有する特異的結合ポケットとの間の相互作用が同定される。同定された免疫原性領域を突然変異させることにより、免疫原性が除去される。このような方法は、一般に、例えば、WO 98/52976に記載されている。

本発明による「抗ＴＷＥＡＫ抗体」および「ＴＷＥＡＫに特異的に結合する抗体」という用語は、抗体が本発明によるＴＷＥＡＫを標的化する上で治療剤として有用であるような十分な親和性でＴＷＥＡＫに結合することのできる抗体を指す。ＴＷＥＡＫに特異的に結合する抗体は、１０^−９Ｍ以下、例えば１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する。

本明細書において使用する「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）、重鎖の可変ドメイン（Ｖ_Ｈ））は、抗原への抗体の結合に直接関与している軽鎖および重鎖ドメインの対の各々を示す。可変軽鎖および重鎖ドメインは同じ一般的な構造を有し、そして各々のドメインは、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲｓ）によって接続された、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシートコンフォメーションをとり、そしてＣＤＲｓはβシート構造を接続するループを形成し得る。各々の鎖におけるＣＤＲｓは、フレームワーク領域によってその３次元構造が保持され、そして他の鎖からのＣＤＲｓと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、そしてそれ故、本発明のさらなる目的を提供する。

本明細書において使用する場合の「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原との結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲｓ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書において定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それ故、抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原との結合に最も寄与する領域であり、そして抗体の特性を規定する。ＣＤＲおよびＦＲ領域および／または「超可変ループ」からの残基は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定される。

「ＣＤＲ１Ｈ」という用語は、Kabatに従って計算された重鎖可変領域のＣＤＲ１領域を示す。ＣＤＲ２Ｌ、ＣＤＲ３Ｈなどは、重鎖（Ｈ）または軽鎖（Ｌ）からのそれぞれの領域を意味する。例えば、配列番号６のＣＤＲ１Ｈを含むことによって特徴付けられる抗体は、抗体が、その可変重鎖において重鎖可変鎖ＣＤＲ１領域としてこのアミノ酸配列を含むことを意味する。例えば、配列番号６のＣＤＲ１Ｈ、配列番号７のＣＤＲ２Ｈ、配列番号８のＣＤＲ３Ｈを含むことによって特徴付けられる抗体は、抗体が、その重鎖において、ＣＤＲ１の配列として配列番号６を、ＣＤＲ２の配列として配列番号７を、そしてＣＤＲ３の配列として配列番号８を含むことを意味する。

本明細書において使用する「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意味する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、しかし好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

本出願内で使用する「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を示す。

核酸は、別の核酸と機能的関係に配置されている場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されている場合、ポリペプチドのためのＤＮＡと作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されており；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合にはコード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結」は、連結されているＤＮＡ配列が同一線上にあり、そして分泌リーダーの場合、隣接し、そしてリーディングフレーム内にある。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要はない。連結は、簡便な制限酵素部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、従来の慣行に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。

本明細書において使用する「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現は同義語として使用され、そして全てのこのような名称は子孫を含む。従って、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という語句は、初代の対象の細胞および継代数に関係なくそれから誘導された培養物を含む。全ての子孫は、計画的または偶発性の突然変異に因り、ＤＮＡ含有物が正確に同一ではない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫も含まれる。

抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接的に関与していないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は、当業者には周知の用語であり、そして抗体のパパインによる切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンは以下のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分類され、そしてこれらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ：「アイソタイプ」または「サブクラス」という表現は本明細書において同義語として使用される）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分類され得る。重鎖定常領域に従って、異なるクラスの免疫グロブリンは、α、δ、ε、γおよびμとそれぞれ呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑへの結合およびＦｃレセプターへの結合に基づいたＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接的に関与している。補体活性化（ＣＤＣ）は、殆どのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合によって開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分における規定の結合部分によって引き起こされる。このような結合部位は当技術分野において公知であり、そして例えばBoackle, R.J. et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J. et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R. et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E. et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A. et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434によって記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９である（KabatのＥＵインデックスに従うナンバリング、以下参照）。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化およびＣ１ｑおよびＣ３への結合を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、そしてＣ１ｑおよびＣ３に結合しない。

１つの態様において、本発明による抗体は、ヒト起源に由来するＦｃ部分および好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。本明細書において使用する「ヒト起源に由来するＦｃ部分」という用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスからのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラスからの突然変異したＦｃ部分（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ上に突然変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラスからのＦｃ部分、またはヒトＩｇＧ４サブクラスからの突然変異したＦｃ部分（好ましくはＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ上に突然変異を有する）のいずれかである、Ｆｃ部分を示す。最も好ましいのは、配列番号５１または配列番号５２（ヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号５３（突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号５４（ヒトＩｇＧ４サブクラス）、または配列番号５５（突然変異Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４サブクラス）のヒト重鎖定常領域である。

好ましくは、本発明による抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスまたはヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。１つの態様において、本発明による抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。１つの態様において、本発明による抗体はヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。

本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源のものであることを特徴とする。このような定常鎖は当技術分野において周知であり、そして例えばKabat (例えばJohnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218参照)によって記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は配列番号５１または２８のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号４９のカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。抗体はウサギ起源であり、そしてKabat (例えばSequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E.A. et al., 5^th edition, DIANE Publishing (1992)参照)に従ってウサギ抗体の抗体可変配列フレームを含むことがさらに好ましい。

本発明は、患者に治療有効量の本発明による抗体を投与することによって特徴付けられる、治療を必要とする患者の処置法を含む。

本発明は、治療のための本発明による抗体の使用を含む。

本発明は、癌、特に大腸癌、肺癌または膵臓癌の処置用の、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置用の医薬品の調製のための本発明による抗体の使用を含む。

本発明は、癌または炎症疾患の処置のための、好ましくは、大腸癌、肺癌または膵臓癌の処置のための、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置のための本発明による抗体の使用を含む。

本発明のさらなる態様は、本発明による抗体の重鎖をコードする核酸配列および前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列を１または２つの発現ベクター（群）に挿入し、前記ベクター（群）を真核宿主細胞に挿入し、コードされた抗体を発現させ、そして宿主細胞または上清から回収することを特徴とする、ＴＷＥＡＫに対する抗体の産生法である。

本発明による抗体は好ましくは組換え手段によって産生される。このような方法は当技術分野において広く知られており、そしてこれは原核細胞および真核細胞におけるタンパク質の発現、その後の抗体ポリペプチドの単離、および通常、薬学的に許容される純度までの精製を含む。タンパク質の発現のために、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸を、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、適切な原核または真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞において行なわれ、そして抗体は細胞から回収される（上清からまたは細胞溶解後）。

抗体の組換え産生は当技術分野において周知であり、そして、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Arzneimittelforschung (Drug Res.) 48 (1998) 870-880のレビュー記事に記載されている。

抗体は、細胞全体中に、細胞溶解液中に、または部分的に精製された形態、または実質的に純粋な形態で存在し得る。他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質を排除するために、カラムクロマトグラフィーおよび当技術分野において周知のその他の技術を含む標準的な技術によって精製が行なわれる。Ausubel, F. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。

ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M. et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270によって記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y. et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87によって記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J. and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83によって、およびSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199によって記載されている。

モノクローナル抗体は、培養培地から、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、透析またはアフィニティクロマトグラフィーなどの慣用的な免疫グロブリン精製手順によって適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、慣用的な手順を使用して容易に単離およびシークエンスされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡの入手源として作用し得る。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、その後これを別様に免疫グロブリンタンパク質を産生しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションすることにより、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得ることができる。

抗ＴＷＥＡＫ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、または以前に調製した変異体形または非変異体形のヒト化抗ＴＷＥＡＫ抗体のオリゴヌクレオチドにより媒介される（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による調製が挙げられるがそれらに限定されない。

本発明による重鎖および軽鎖可変ドメインを、プロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳領域配列、ポリアデニル化配列および転写終結配列と合わせることにより、発現ベクター構築物を形成する。重鎖および軽鎖発現構築物を１つのベクターに合わせるか、宿主細胞に同時トランスフェクションするか、連続的にトランスフェクションするか、または別々にトランスフェクションし、これをその後、融合して、両方の鎖を発現する１つの宿主細胞を形成することができる。

別の局面において、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の１つまたは組合せを含む、組成物、例えば薬学的組成物を提供する。

本明細書において使用する「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収／再吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は注射または点滴に適している。

本発明の組成物は、当技術分野において公知の種々の方法によって投与され得る。当業者によって理解されているように、投与経路および／または形態は所望の結果に依存して変更される。

薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において公知である。水の他に、担体は、例えば、等張緩衝食塩水溶液であり得る。

選択した投与経路に関係なく、本発明の化合物（適切な水和形で使用してもよい）および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の慣用的な方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。

本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルを変更することにより、患者に毒性を及ぼすことなく、特定の患者、組成物、および投与形態に対して所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分の量（有効量）を得ることができる。選択された投与量レベルは、使用する本発明の具体的な組成物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時刻、使用する具体的な化合物の排泄速度、使用する具体的な組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および病歴、および医学分野において周知の同様な因子を含む、多種多様な薬物動態因子に依存する。

本発明は、癌、特に大腸癌、肺癌または膵臓癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷を患う患者を処置するための本発明による抗体の使用を含む。

本発明はまた、このような疾患を患う患者の処置法も含む。

本発明はさらに、薬学的に許容される担体と一緒に本発明による抗体の有効量を含む薬学的組成物の製造法、および、このような方法のための本発明による抗体の使用を提供する。

本発明はさらに、癌、特に大腸癌、肺癌または膵臓癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷を患う患者の処置のための、好ましくは薬学的に許容される担体と一緒に、医薬品製剤を製造するための有効量の本発明による抗体の使用を提供する。

本発明はまた、癌、特に大腸癌、肺癌または膵臓癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷を患う患者の処置のための、好ましくは薬学的に許容される担体と一緒に、医薬品製剤を製造するための有効量の本発明による抗体の使用も提供する。

配列の記載

以下の実施例および配列表は本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の精神から逸脱することなく示された手順に改変を行なうことができることが理解される。

実施例１
免疫化の説明
ヒト／マウスＴＷＥＡＫを用いてのウサギの免疫化
ニュージーランドホワイトウサギ（アナウサギ、Oryctolagus cuniculus）に、完全フロイントアジュバントと共に４００μgの組換えヒトＴＷＥＡＫを用いて０日目に、不完全フロイントアジュバントと共に２００μgのヒトＴＷＥＡＫを用いて２１、４３および６５日目に、そして不完全フロイントアジュバントと共に２００μgのマウスＴＷＥＡＫを用いて８５日目に免疫化した。全ての免疫化をいくつかの部位に皮下に行なった。力価決定のために７７および９８日目に血清を調製した。最終ブーストは、２００μgのヒトおよび２００μgのマウス可溶性ＴＷＥＡＫの静脈内注射によって実施され、そして抗体を、ヒトおよびマウスＴＷＥＡＫに結合するその能力（実施例２）、ヒトおよびマウスＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４相互作用を中和するその能力（実施例４および５）、およびＩＬ８分泌を阻害するその能力（実施例６）に基づいて選択した。さらに、抗体−ＴＷＥＡＫ複合体の半減期も調べた（実施例３）。抗体の抗腫瘍効力を、Ｂ１６ＢＬ６（マウスメラノーマ；Ｂ１６の転移性肺亜系統）、ＳＪＳＡ（骨肉腫、ＡＴＣＣＣＲＬ−２０９８）およびＨＣＴ−１１６（大腸、ＡＴＣＣＣＣＬ−２４７）異種移植片モデルにおいて試験した。

実施例２
ヒトおよびマウスＴＷＥＡＫへの結合（ＥＬＩＳＡ）
ヒトおよびマウスＴＷＥＡＫへの抗ＴＷＥＡＫ抗体の結合はＥＬＩＳＡによって決定された。ヒトまたはマウス組換えＴＷＥＡＫを、３８４ウェルNunc Maxisorpプレート上に、ｐＨ９．５の０．５Ｍ炭酸コーティングバッファー中１μg/ml、２５μl/ウェルで、２〜８℃で一晩かけてインキュベーションすることによって固定した。プレートをＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて室温で１時間かけて遮断した後、２回の洗浄工程を行ない（ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、そして、遮断バッファー中の種々の濃度の抗ＴＷＥＡＫ抗体または前記抗体のハイブリドーマ上清と共に室温で１時間かけてインキュベーションした。さらに４回洗浄した後、抗体を、遮断バッファーで１：５０００に希釈した抗ウサギ−ＨＲＰ抗体を用いて室温で１時間かけて検出した。さらに４回の洗浄工程の後、１０〜３０分間かけてＡＢＴＳ（登録商標）（Roche Diagnostics GmbH）の添加によってシグナルを発達させた。４０５nmにおける吸光度を解読した。

実施例３
ビアコアを使用した抗体−ＴＷＥＡＫ複合体の半減期の決定
ビアコア２０００装置を、システムに積載されたビアコアのストレプトアビジンでコーティングされたセンサーと共に使用した。システムバッファーＨＢＳ−ＥＴ（１０mM ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を１００μl／分の流速で使用した。サンプルバッファーはシステムバッファーであった。ビオチニル化ヒト可溶性ＴＷＥＡＫ（配列番号６０のアミノ酸９９〜２４９）およびビオチニル化マウス可溶性ＴＷＥＡＫ（配列番号６１のアミノ酸８１〜２２５）を、各々１５０ＲＵで、ＳＡセンサー上の異なるフローセル上に固定した。フローセルＦＣ１をブランクのリファレンスセルとして使用した。各抗体を、１００nMの分析物として１００μl/分で２分間の結合時間かけてシステムに注入した。免疫複合体の解離を５分間かけてモニタリングした。センサー表面を１０秒間かけてＨＢＳ−ＥＴを用いて洗浄し、そして１０mMグリシン（ｐＨ２．２５）を用いての２回の２分間の注入を使用して再生した。この手順を２５℃で実施した。［２４０秒〜３００秒］の区間における複合体の解離期の動力学的律速段階を取得することにより、解離速度ｋｄ［１／ｓ］を計算した（ビアコア評価ソフトウェア４．０）。式ｔ１／２解離＝ｌｎ（２）／（６０×ｋｄ）により、免疫複合体の半減期（分）を計算した。結果を表５ａおよび５ｂ、並びに表６ｂに示す。

さらなる実験において、キメラＴＷ−３０５キメラおよびＷＯ２００６／１３０３７４のキメラ形のＰ２Ｄ１０の抗体−ＴＷＥＡＫ複合体の半減期（２５℃におけるｔ／２解離［分］）を決定した（両方のキメラ抗体は、ヒト定常領域として、配列番号４９のヒトカッパ軽鎖定常領域および配列番号５１のヒトＩｇＧ１定常領域を有する）。

本発明による抗体は、ビアコアによって測定したところ、２５℃において１００分間以上、好ましくは１１０分間以上の可溶性ヒトＴＷＥＡＫ（配列番号６０のアミノ酸９９〜２４９）と抗体との間の複合体の半減期のような価値ある特性を示す。このような半減期を示す抗ＴＷＥＡＫ抗体は、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置に使用するのに特に好ましい。

実施例４
ＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４相互作用（ヒト）の中和
ヒトＴＷＥＡＫ／ヒトＦｎ１４相互作用の遮断はレセプター相互作用ＥＬＩＳＡによって示された。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート（Nunc）を、１ウェルあたり１００μlの１μg/mlヒトＦｎ１４：Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したヒトＦｎ１４の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜７５））のＰＢＳ溶液を用いて１．５時間かけて室温でコーティングし、そして５％ＦＢＳのＰＢＳ溶液を用いて３０分間かけて室温で振とう下で遮断した。一方、遮断溶液中２．５ng/mlのヒトＦｌａｇタグ化可溶性ＴＷＥＡＫ（アミノ酸１０６〜２４９）を、種々の濃度の抗ＴＷＥＡＫ抗体またはハイブリドーマ上清と共に２時間かけて室温で振とう下でインキュベーションした。Ｆｎ１４でコーティングされたプレートを、一度、洗浄バッファー（ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて洗浄した後、１００μlのＴＷＥＡＫ−抗体溶液を各ウェルに移し、そしてプレートを１時間かけて室温でインキュベーションし、その後、洗浄バッファーを用いて４回洗浄した。ウェルを、遮断バッファー中で１：５０００に希釈した１００μlの抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ検出抗体を用いて充填し、そして１時間かけて室温でインキュベーションした。４回のさらなる洗浄工程の後、約１０分間かけて１００μlの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液の添加によってシグナルを発達させた。反応を１００μlの１ＮＨＣｌの添加によって停止し、そして４５０nmにおける吸光度を測定した（リファレンス波長６２０nm）。結果を表６に示す。

実施例５
ＴＷＥＡＫ−Ｆｎ１４相互作用（マウス）の中和
マウスＴＷＥＡＫ／マウスＦｎ１４相互作用ＥＬＩＳＡは、ヒトタンパク質について記載したのと類似した原則に従ったが、異なる検出システムを使用したので、マウス可溶性ＴＷＥＡＫをタグ化しなかった。簡潔に言うと、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、ヒトＦｎ１４：Ｆｃについて前記したようにマウスＦｎ１４：Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合したマウスＦｎ１４の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜７５））を用いてコーティングし、その後、遮断および洗浄を行なった。４ng/mlのマウス可溶性ＴＷＥＡＫを、遮断バッファー中の抗ＴＷＥＡＫ抗体またはハイブリドーマ上清と共にプレインキュベーションし、そして１００μlの混合物をＦｎ１４でコーティングされたプレートの１ウェルあたりに加えた。室温で１時間のインキュベーションおよび４回の洗浄後、遮断バッファー中１２５ng/mlのビオチニル化抗マウスＴＷＥＡＫ抗体を１時間かけて室温で加え、さらに４回の洗浄工程を行なった。ＴＷＥＡＫ抗体を、遮断バッファー中で１：５０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰと共に３０分間かけて室温でインキュベーションすることによって検出した。シグナルを発達させ、そして上記のように吸光度を測定した。結果を表６ａおよび６ｂに示す。

実施例６
ＩＬ−８分泌のＥＬＩＳＡ
細胞系における抗ＴＷＥＡＫ抗体によるＴＷＥＡＫ活性の遮断を、Ａ３７５メラノーマ細胞を使用したＩＬ−８分泌アッセイにおいて示した。９６ウェル細胞培養プレートの１ウェルあたり１０，０００個のＡ３７５細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６１９）を、１００μlの増殖培地（４．５ｇ/Ｌのグルコース、ピルビン酸およびＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）／１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に播種し、そして３７℃／５％ＣＯ_２で４８時間かけてインキュベーションした。ヒト組換え可溶性ＴＷＥＡＫを、３００ng/mlで、増殖培地中の種々の濃度の抗ＴＷＥＡＫ抗体と共に３０分間かけて室温でプレインキュベーションした。その後、５０μlの混合物を細胞プレートの各ウェルに加え、その後、さらに４８時間インキュベーションを行なうことにより、ＩＬ−８の分泌を可能とした。２００×ｇで５分間かけてプレートを遠心分離にかけた後に２０μlの細胞上清を取り出し、そして「ＣＸＣＬ８ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ」キット（R&D Systems）からの９８０μlのＲＤ５Ｐキャリブレーター希釈剤と混合した。ＩＬ−８を、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡによって検出した。結果を表６ａおよび６ｂに示す。

実施例７
ＴＷ−３０１、ＴＷ−３０４、ＴＷ−３０５のエピトープ領域の決定
ビアコア２０００装置を、ビアコア評価ソフトウェア４．０と一緒に使用した。サンプルおよびシステムバッファーはＨＢＳ−ＥＴｐＨ７．４であった。センサー表面へのＴＷＥＡＫ分析物の強力な非特異的結合に因り、個々の抗体のエピトープマッピングを、Johne, B. et al., J. Immun. Meth. 160 (1993) 191-198に記載のようなビアコア交差競合実験によって通常のように実施することができなかった。

ＴＷＥＡＫタンパク質の個々の生化学的特性のために、リガンドとしてＴＷＥＡＫを使用して別の方法を開発しなければならなかった。ビオチニル化ＴＷＥＡＫを、ストレプトアビジンでコーティングされたチップ表面上に固定し、そして連続的に注入された抗体（抗体１）のエピトープカバー度を測定した。目的は、すでに結合した一次抗体の存在下における二次抗体（抗体２）の相対的結合レベルを検出することであった。これらの相対的な結合レベルから、指数を計算した（Ａｂ２／Ａｂ１、モル比は％で与えられる、表７）。

５nMのビオチニル化ＴＷＥＡＫを、２０μl/分で１分間かけて、ストレプトアビジンでコーティングされたセンサーフローセル上に固定した。一次および二次ｍＡｂを、それぞれのＴＷＥＡＫエピトープの飽和が達成されるまで、１０μl/分で４分間かけてシステム中に１００nMで連続的に注入した。リファレンスとしてＳＡでコーティングされたフローセルを使用した。

システムを、ＨＢＳ−ＥＴを用いて２０秒間かけて３０μl/分で洗浄し、その後、１分間の３０μl/分の６ＭＧｕａｄＨＣｌおよび１００mM ＨＣｌを用いて２回の再生工程を行なった。これらの再生工程は、結合したｍＡｂｓをセンサー表面から取り除き、そして固定されたビオチニル化ＴＷＥＡＫは不可逆的に変性した。ストレプトアビジンセンサー表面がビオチニル化ＴＷＥＡＫによって完全に飽和されるまで、プロセスを、同じフローセル上への天然のビオチニル化ＴＷＥＡＫタンパク質の固定（フィードバッチモード）により繰り返した。

交差遮断実験は、１０％未満のそれぞれの抗体の近づき易さの数値を示し、これはこのアッセイのノイズの範囲内である。ＴＷ−３０１キメラ、ＴＷ−３０４キメラおよびＴＷ−３０５キメラは同じエピトープ領域に結合することが明らかに示される。

実施例８
コラーゲン誘発性関節炎（関節リウマチのマウスモデル）のin vivoにおける阻害−抗体３０５（キメラ；ＴＷ３０５）は、関節リウマチのマウスモデルであるコラーゲン誘発性関節炎を阻害する
６〜８週令の雄ＤＢＡ１／Ｊマウス（Jackson Laboratory, Bal Harbor, Maine）に、完全フロイントアジュバント中のＩＩ型ウシコラーゲンおよび再度３週間後に不完全フロイントアジュバント中のＩＩ型ウシコラーゲン（ブースト、０日目）を用いて免疫化した。マウスに、ブーストの前日から開始して１日おきに、キメラ抗体３０５（＝ＴＷ３０５、図１参照）（１０mg/kg、ｎ＝１２）、エンブレル（１０mg/kg、ｎ＝１２）またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ｎ＝１２）を投与した。マウスを、ブースト後の０日目、２日目、５日目、７日目、９日目、１２日目および１４日目に関節炎について調べた。関節炎の重度を、以下の基準に基づいてスコアリングした：１＝１つの指の膨潤および／または発赤；２＝２つ以上の関節における膨潤；３＝２つより多くの関節が関与する足の全体の膨潤；４＝全部の足および指の重度の関節炎。ビヒクルと比較して、ＴＷ−３０５は、ＴＮＦブロッカーのエンブレルと類似した程度で、臨床スコアを有意に減少させた（ｐ＜０．０５、１４日目）。結果を図１に示す。

Claims

重鎖可変ドメインとして、配列番号８、１６または２４からなる群より選択されるＣＤＲ３Ｈを含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体。
ａ）配列番号１の可変軽鎖および配列番号５の可変重鎖を含む抗体の、
ｂ）配列番号９の可変軽鎖および配列番号１３の可変重鎖を含む抗体の、または
ｃ）配列番号１７の可変軽鎖および配列番号２１の可変重鎖を含む抗体の
キメラ、ヒト化またはＴ細胞エピトープの欠失した変異体。
ａ）配列番号６のＣＤＲ１Ｈ、配列番号７のＣＤＲ２Ｈ、配列番号８のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号４のＣＤＲ３Ｌを含むことによって、または
ｂ）配列番号１４のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１６のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号１０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌを含むことによって、または
ｃ）配列番号２２のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２４のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌを含むことによって
特徴付けられる、請求項１記載の抗体。
配列番号６のＣＤＲ１Ｈ、配列番号７のＣＤＲ２Ｈ、配列番号８のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号２のＣＤＲ１Ｌ、配列番号３のＣＤＲ２Ｌ、配列番号４のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体。
配列番号１４のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１５のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１６のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号１０のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１のＣＤＲ２Ｌ、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体。
配列番号２２のＣＤＲ１Ｈ、配列番号２３のＣＤＲ２Ｈ、配列番号２４のＣＤＲ３Ｈおよび配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる、ヒトＴＷＥＡＫに結合する抗体。
ａ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、ｂ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４４の可変重鎖、ｃ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４５の可変重鎖、ｄ）配列番号２６の可変軽鎖および配列番号４７の可変重鎖、ｅ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４４の可変重鎖、ｆ）配列番号３１の可変軽鎖および配列番号４５の可変重鎖、ｇ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、またはｈ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号３９の可変重鎖を含むことによって特徴付けられる、請求項６記載の抗体。
ａ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、ｂ）配列番号２７の可変軽鎖および配列番号４５の可変重鎖、ｃ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４４の可変重鎖、ｄ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号４１の可変重鎖、またはｅ）配列番号２９の可変軽鎖および配列番号３９の可変重鎖を含むことによって特徴付けられる、請求項６記載の抗体。
配列番号１／配列番号５、９／１３、１７／２１、２５／３７、２６／３８、２７／３９、２８／４０、２９／４１、３０／４２、３１／４３、３２／４４、３３／４５、３４／４６、３５／４７、３６／４８、５６／５７、５８／５９からなる群より選択される可変軽鎖配列／可変重鎖配列の組合せによって特徴付けられる、請求項６記載の抗体。
配列番号１７、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、５６、５８、２１、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５７または５９の可変重鎖または軽鎖の群から選択される可変重鎖または可変軽鎖を含むことによって特徴付けられる、請求項６記載の抗体。
請求項１〜１０記載の抗体を含むことによって特徴付けられる薬学的組成物。
薬学的組成物の製造のための請求項１〜１０記載の抗体の使用。
癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置のための、請求項１〜１０記載の抗体。
大腸癌、肺癌または膵臓癌の処置のための請求項１〜１０記載の抗体。
癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷の処置用の医薬品の製造のための請求項１〜１０記載の抗体の使用。
大腸癌、肺癌または膵臓癌の処置用の医薬品の製造のための請求項１〜１０記載の抗体の使用。
請求項１〜１０記載の抗体をコードする核酸。
原核または真核宿主細胞におけるＴＷＥＡＫに結合する抗体の発現のための請求項１７記載の核酸を含むことによって特徴付けられる発現ベクター。
請求項１８記載のベクターを含む原核または真核宿主細胞。
原核または真核宿主細胞において請求項１７記載の核酸を発現し、そして前記細胞または細胞培養上清から前記抗体を回収することによって特徴付けられる、請求項１〜１０記載の組換え抗体の産生法。
請求項１〜１０記載の抗体を患者に投与することによって特徴付けられる、癌、または自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、例えば筋ジストロフィー、多発性硬化症、慢性腎疾患、骨疾患、例えば多発性骨髄腫における骨変性、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および血管損傷を患う患者の処置法。